PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI 2016 MODUL III KULTIVASI MIKROBA PJ: Miranti Fitri Khairunissa & Ramadini Aini TUJUAN:
1. Menentukan fungsi dari medium Nutrient Broth, Nutrient Agar dan Potato Dextrose Agar. 2. Mempelajari fungsi autoklaf untuk sterilisasi medium atau peralatan laboratorium. 3. Menentukan pengaruh penambahan alkohol 70%, antifungi dan antibiotik terhadap pertumbuhan mikroba dari sampel air kolam. 4. Menentukan karakteristik pertumbuhan mikroba dari kultur campuran ( Bacillus cereus, Serratia marcescens, Sarcina lutea) yang di isolasi dengan metode gores (four way streak), metode tuang
(pour) dan metode sebar (spread). 5. Menentukan karakteristik pertumbuhan Bacillus cereus yang diinokulasi dengan metode gesek dan metode tusuk serta Rhizopus oligosporus yang diinokulasi dengan metode tanam. 3.1 PENYIAPAN MEDIUM Prinsip Dasar
Pertumbuhan mikroorganisme sangat bergantung pada kandungan nutrisi yang terdapat dalam lingkungan sekitarnya. Pengkulturan mikroba di dalam lab dilakukan di dalam medium. Medium dapat dibagi menjadi beberapa kelompok berdasarkan fasa dan fungsinya. Berdasarkan fasanya, medium dibagi menjadi medium padat, semipadat, dan cair. Medium padat dan semipadat dibuat dengan penambahan solidifying agent , sedangkan medium cair tidak. Medium padat digunakan dalam proses isolasi, pengamatan koloni, penyimpanan, dan pengamatan reaksi biokimia tertentu. Medium semipadat digunakan untuk mengamati pergerakan mikroba. Medium cair digunakan untuk panen metabolit dan uji berbagai proses biokimia. Berdasarkan fungsinya, medium dibagi menjadi medium umum, pengaya, selektif, dan diferensial. Medium umum digunakan untuk mengkultur mikroba secara umum (contoh : NA, NB, PDA). Medium pengaya digunakan untuk meningkatkan pertumbuhan mikroba tertentu; terkadang dapat bersifat selektif. Medium selektif digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroba tertentu sehingga mikroba lain dapat tumbuh. Medium diferensial digunakan untuk membedakan mikroba dengan sistem fisiologi dan/atau morfologi tertentu serta memungkinkan untuk karakteriasi mikroba yang ditumbuhkan di dalamnya. PROSEDUR KERJA Medium kaldu nutrisi (nutrient (nutrient broth) broth)
1. Dengan menggunakan neraca analitik, kertas timbang atau kertas aluminium serta gelas ukur, siapkan 0,5 g pepton; 0,5 g NaCl; 0,2 g ekstrak ragi; r agi; 0,1 g ekstrak daging, dan 100 ml akuades.
2. Larutkan semua zat bahan medium satu per satu ke dalam 75 ml akuades pada erlen 250 ml, aduk sambil dipanaskan hingga semua melarut. 3. Tambahkan dengan sisa akuades hingga volume medium me ncapai 100 ml. 4. Tuangkan medium ke dalam labu erlenmeyer, tutup dengan alumunium foil dan plastik tahan panas (apabila medium akan diautoklaf) atau sumbat dengan kapas lemak yang telah dibalut kassa (apabila medium akan digunakan untuk kultur). Medium agar nutrisi (nutrient agar )
1. Ulangi langkah-langkah pembuatan medium kaldu nutrisi cair. 2. Medium kaldu nutrisi cair tersebut ditambahkan 2 g bubuk agar, aduk-aduk sambil dipanaskan hingga agar benar-benar larut (warna medium menjadi jernih). 3. Tuangkan masing-masing 3 ml medium ke dalam 10 tabung reaksi bersih, tutup dengan kapas lemak. 4. Medium agar nutrisi siap untuk dister ilkan dengan autoklaf.
Medium agar kentang dekstrosa ( potato dextrose agar )
1. Siapkan 25 gram kentang yang telah bersih dan dipotong-potong dadu; 2 g glukosa; 2 g bubuk agar, dan 100 ml akuades. 2. Rebuslah kentang dalam 100 ml akuades selama 2 jam sejak mendidih, volume akuades dijaga supaya tetap. 3. Ambil air rebusan kentang dengan menyaring potongan-potongan kentang menggunakan lap bersih atau kain kasa. 4. Tambahkan air rebusan kentang dengan glukosa dan asam tartarat, aduk hingga merata. 5. Tambahkan 2 g bubuk agar, sambil diaduk dan dipanaskan hingga agar melarut sempurna dan medium berwarna bening. 6. Tuangkan medium ke dalam labu erlenmeyer bersih, tutup dengan aluminium foil dan plastik tahan panas. 7. Medium siap untuk disterilkan dengan autoklaf.
3.2 STERILISASI
Sterilisasi merupakan proses yang dilakukan untuk membunuh bakteri, jamur, dan agen-agen kontaminasi lainnya dari suatu permukaan, area, peralatan, larutan, dan medium kultur. Berdasarkan proses yang dilakukan, sterilisasi dapat dibagi menjadi sterilisasi fisika dan kimia. A. Sterilisasi Fisika Sterilisasi secara fisik dengan panas
Panas kering untuk alat-alat gelas dan pipet dengan suhu 160 oC sampai 180oC selama 30 menit-3 jam
Panas basah untuk bahan media, dengan perebusan hingga 100 oC (pasteurisasi)
Autoklaf untuk sterilisasi alat dan media yakni pemanasan suhu tinggi (121 oC) disertai tekanan uap yang tinggi.
Sterilisasi secara fisik dengan filtrasi
Sterilisasi dengan cara penyaringan untuk memisahkan mikroba dari larutan medium cair yang biasanya mengandung bahan yang tidak tahan panas. Filtrasi dapat menggunakan membran milipore. Sterilisasi secara fisik dengan radiasi
Sterilisasi terhadap medium padat yang tidak tahan panas. Dalam menumbuhkan mikroba diperlukan penambahan substrat alami seperti bagian jaringan tumbuhan yang tidak boleh rusak karena pemanasan atau reaksi bahan kimia sehingga diperlukan cara radiasi seperti menggunakan sinar Gamma. B. Sterilisasi Kimia
Sterilisasi ini dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia yang bersifat antimikroba ke alatalat yang disterilisasi. Medium selektif pada dasarnya dibuat steril dari mikroba non target dengan menambahkan bahan kimia seperti anti bakteri (antibiotik) atau anti fungi. Di samping itu, sterilisasi kimiawi terutama ditunjukkan untuk alat yang tidak tahan panas dengan menggunakan bahan-bahan desinfektan seperti alkohol 70%, natrium hipoklorit, formalin dsb.
PROSEDUR KERJA Sterilisasi medium menggunakan autoklaf Autoklaf manual
1. Isilah autoklaf dengan akuades hingga batas yang ditentukan 2. Masukkan medium atau peralatan yang akan disterilkan. 3. Tutup autoklaf rapat-rapat 4. Biarkan klep uap terbuka, nyalakan autoklaf.
5. Bila dari klep uap terdapat cairan yang menetes, berarti ruangan dalam autoklaf telah jenuh dengan uap air. Tutup klep uap tersebut. 6. Biarkan autoklaf menyala hingga mencapai suhu 121 oC dan tekanan uap 15 lbs. Bila tekanan 15 lbs telah tercapai, pertahankan selama 15-20 menit (bila tekanan berlebih gunakan tombol pengatur pada bagian bawah autoklaf). 7. Setelah 15-20 menit pada tekanan uap lbs, matikan autoklaf, tunggu tekanan menurun selama 510 menit. Buka klep uap perlahan-lahan, keluarkan uap hingga tekanannya kembali nol. 8. Buka autoklaf dan ambil barang-barang yang telah steril di dalamnya. Jangan sekali-kali membuka tutup autoklaf bila tekanan uap belum turun mencapai angka nol. Untuk meyakinkan tekanan sudah mencapai nol dapat dicek dari suhu sudah di bawah 100 oC. Autoklaf otomatis
1. Isilah autoklaf dengan akuades hingga batas yang ditentukan 2. Periksa juga tempat air buangan di luar autoklaf, jangan sampai isinya berlebih atau kurang. 3. Masukkan medium atau peralatan yang akan disterilkan. 4. Tutup autoklaf rapat-rapat, periksa tombol penutup agar benar pada posisi batas akhir ‘close’. 5. Nyalakan autoklaf, atur suhu, tekanan, dan waktu sterilisasi yang diinginkan. Sterilisasi yang umum adalah 121oC, pada tekanan 15 lbs, selama 15 menit. 6. Tekan tombol start, biarkan hingga tanda bunyi kedua yang menunjukkan bahwa kondisi sterilisasi telah tercapai dan tekanan uap dalam autoklaf kembali nol. 7. Buka autoklaf dan ambil barang-barang yang telah steril di dalamnya. Jangan sekali-kali membuka tutup autoklaf bila tekanan uap belum turun mencapai angka nol. Untuk meyakinkan tekanan sudah mencapai nol dapat dicek dari suhu sudah di bawah 100 oC. Sterilisasi dengan bahan kimia (alkohol 70%)
1. Siapkan medium NA dalam cawan pet ri. Bagilah cawan petri menjadi 2 bagian, bagian positif (+) untuk perlakuan dengan alkohol dan bagian negatif (-) untuk perlakuan tanpa alkohol. 2. Isi 1 mikrotube dengan alkohol 70% dan isi 1 mikrotube lain dengan larutan fisiologis (NaCl 0,85%), beri label. 3. Masukkan kultur campuran ( Bacillus cereus, Serratia marcescens, Sarcina lutea) ke dalam masingmasing mikrotube tersebut. 4. Secara aseptik celupkan kawat Oose ke dalam mikrotube berisi alkohol 70% selama 5 detik 5. Gesekkan kawat Oose tersebut ke permukaan medium bertanda (+), simpan, tandai 6. Panaskan kawat oose (hingga menyala), dinginkan beberapa saat dan masukkan ke dalam alkohol 70% pada jar/botol selai masing-masing 7. Secara aseptik celupkan kawat Oose ke dalam mikrotube berisi larutan fisiologis selama 5 detik 8. Gesekkan kawat Oose tersebut ke permukaan medium bertanda (-), simpan, tandai 9. Panaskan kawat oose (hingga menyala), dinginkan beberapa saat dan masukkan ke dalam alkohol 70% pada jar/botol selai masing-masing, simpan 10. Inkubasi plat agar tersebut pada suhu ruang selama 2x24 jam lalu amati ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba pada kedua bagian.
Sterilisasi dengan penambahan antibiotik dan antifungi.
1. Siapkan medium NA yang mengandung 1 g/L antifungi dan medium PDA yang mengandung antibiotik 1 g/L antibiotik. (antibiotik yang digunakan dalam praktikum ini adalah penisilin dan antifungi yang digunakan dalam praktikum ini adalah nystatin). 2. Pada masing-masing medium tambahkan 0,1 ml air selokan dan disebar menggunakan batang L steril. 3. Inkubasi kedua plat pada suhu ruang selama 2x24 jam untuk medium NA dan 3x24 jam untuk PDA. 4. Amati jumlah koloni dan bandingkan jumlah bakteri dan jamur yang tumbuh pada kedua jenis medium. 3.3 ISOLASI MIKROBA
Di alam populasi mikroorganisme tidak terpisah menjadi spesies-spesies tersendiri, melainkan hidup secara bersama. Di laboratorium populasi campuran tersebut dapat dipisahkan menjadi kultur murni yang mengandung hanya satu jenis mikroorganisme saja. Teknik pemisahan tersebut dikenal sebagai teknik isolasi mikroba. Teknik isolasi mikroba bertujuan untuk menghasilkan koloni tunggal dari satu mikroorganisme. Koloni merupakan hasil pertumbuhan mikroorganisme yang dapat terlihat secara makroskopis pada permukaan medium padat. Masing-masing koloni merupakan hasil multiplikasi dari satu jenis mikroorganisme. Jika telah diperoleh koloni-koloni yang terpisah, maka melalui transfer secara aseptis dapat menjadi kultur atau biakan murni. PROSEDUR KERJA Metode gores (4-way streak))
1. Siapkan medium NA pada cawan petri. 2. Panaskan jarum Oose hingga pijar. 3. Buka tabung kultur bakteri campuran cair (Bacillus cereus, Serratia marcescens, Sarcina lutea), dinginkan jarum inokulasi yang telah dipanaskan dengan menempelkannya ke dinding tabung. Ambilah kultur menggunakan jarum Oose. 4. Goreskan (4 goresan) kultur campuran dari jarum Oose tersebut pada salah satu tepi permukaan agar nutrisi secara aseptis. 5. Gesek goresan yang pertama tadi dengan menggunakan jarum Oose yang telah dipijarkan ke arah tegak lurus yang baru dari goresan sebelumnya. Pijarkan kembali jarum inokulasi. 6. Lakukan goresan yang sama dari hasil goresan yang baru tersebut ke arah tegak lurus yang baru. Ujung jarum tidak boleh lagi menyentuh daerah inokulasi pertama. 7.
Dengan cara yang sama, buat goresan keempat sehingga membentuk 16 garis inokulasi yang semakin sedikit jumlah bakterinya, mengelilingi cawan petri.
8. Inkubasi pada suhu ruang selama 24 jam.
9. Amati pertumbuhan koloni bakteri yang terjadi pada masing-masing daerah inokulasi. Metode tuang ( pour plate method )
1. Cairkan 12 ml medium agar nutrisi dalam tabung steril, diamkan hingga suhunya mencapai 4050oC. 2. Tuangkan 0,1 ml inokulum suspensi bakteri ( Bacillus cereus, Serratia marcescens, Sarcina lutea)ke dalam cawan petri steril. 3. Tuangkan agar nutrisi yang telah dicairkan ke dalam cawan petri berisi inokulum, putar cawan perlahan membentuk angka 8 hingga medium tercampur rata. 4. Inkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Metode sebar (spread plate method )
1. Siapkan medium NA pada cawan petri. 2. Tuangkan 0,1 ml inokulum suspensi bakteri ( Bacillus cereus, Serratia marcescens, Sarcina lutea)ke atas permukaan agar secara aseptik. 3. Celupkan batang L ke dalam alkohol 70% dan bakar sebentar dengan bunsen. 4. Dinginkan batang L dengan menempelkannya sebentar ke bagian dalam tutup cawan petri, lalu sebarkan inokulum bakteri hingga merata menggunakan batang L sambil memutar-mutar caw an. 5. Lakukan hingga diperoleh permukaan agar yang kering dan merata ole h inokulum. 6. Inkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. 3.4 INOKULASI KULTUR
Inokulasi merupakan suatu teknik untuk menumbuhkan mikroba pada suatu medium pertumbuhan. Sumber inokulasi dapat berasal dari kultur murni maupun hasil isolasi kultur campuran. Teknik ini merupakan teknik dasar yang dikerjakan secara rutin untuk memelihara dan mempersiapkan pengaktifan simpanan kultur murni. Subkultur perlu dikerjakan secara aseptis dan hati-hati, agar kultur murni tidak tercemar oleh mikroba yang ada di lingkungan atau terkontaminasi. PROSEDUR KERJA Metode gesek
1. Ambil kultur murni bakteri Bacillus cereus menggunakan jarum Oose secara aseptis 2. Gesekkan ujung jarum Oose ke permukaan agar nutrisi miring membentuk zigzag rapat secara aseptis. Arah menggesek dari dasar kemiringan ke puncaknya. 3. Inkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. 4. Amati pola pertumbuhan bakteri yang terjadi. Metode tusuk
1. Ambil kultur murni bakteri Bacillus cereus menggunakan jarum inokulasi secara aseptis. 2. Tusukkan jarum inokulasi tegak lurus ke dalam agar nutrisi tegak.
3. Inkubasi pada suhu ruang selama 24 jam 4. Amati pola pertumbuhan bakteri yang terjadi. Metode tanam
1. Siapkan kultur murni jamur Rhizophus oligosporus pada cawan petri 2. Sterilkan ujung spatula dengan mencelupkannya ke dalam alkohol 70% dan membakarnya sebentar. 3. Congkel sedikit medium yang mengandung miselium jamur menggunakan spatula steril secara aseptis 4. Tempelkan potongan medium yang ditumbuhi miselium pada medium PD A miring. 5. Inkubasi pada suhu ruang selama 48 jam lalu amati pertumbuhan yang terj adi. Alat dan bahan yang harus dibawa tiap kelompok: 1. Batang L 2. Oose lurus (untuk inokulasi tusuk) dan Oose bulat 3. Spatula 4. Membawa plastik untuk limbah padat, limbah tips, dan limbah cair 5. Label 6. Air Selokan (Tempat yang akan digunakan untuk mengambil dan menyimpan air selokan diusahakan bersih) 7. Plastic wrap yang telah dipotong-potong untuk seal
LATAR BELAKANG
Latar belakang harus memuat:
Apa itu kultivasi mikroba
Mengapa praktikum ini penting untuk dilakukan
POIN-POIN LITERATUR
Isi kolom literatur dengan informasi yang menjelaskan Cara Kerj a dan dapat membantu Anda mendapatkan Perkiraan Hasil Eksperimen dengan benar. Berikut adalah poin literatur yang dijadikan standar:
Fungsi NA, NB, PDA
Fungsi komposisi NA: Pepton, NaCl, ekstrak daging, ekstrak yeast, agar
Fungsi komposisi PDA: kentang, asam tartarat, glukosa
Fungsi, Prinsip dan gambar sistem kerja Autoclave
Fungsi alkohol 70 % dan NaCl 0,85%
Fungsi Nystatin
Fungsi Penisilin
Fungsi Teknik Isolasi : gores, tuang, sebar
Fungsi Teknik inokulasi : gesek, tusuk, tanam
Karakteristik koloni bakteri dan jamur yang digunakan dalam praktikum ini (min. warna dan bentuk)
MSDS
Penisilin, Nystatin, Nutrient Agar, Nutrient Broth, Potato Dextrose Agar
HASIL PENGAMATAN
