HPLC
Iswandi S.Si., M. Farm. Apt. Fakultas Farmasi USB
HPLC
High Performance Liquid Chromatography High Pressure Liquid Chromatography Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Atau dapat disingkat LC Chromatography teknik pemisahan Liquid Fase gerak berupa cairan High Pressure digunakan tekanan tinggi untuk mengalirkan fase gerak melalui kolom
HPLC • Dike Dikemb mban angk gkan an pad padaa awa awall 1970 1970-a -ann • De Dewas wasaa ini ini meru merupak pakan an tek teknik nik pal paling ing ban banyak yak digunakan untuk pemisahan dan analisis dari berbagai bidang seperti farmasi, bioteknologi, lingkungan, polimer dan makanan. • Me Merup rupaka akann “meth “method od of choi choice ce for for the the analy analysis sis of of a wide variety compounds”
Keunggulan dan Kelemahan HPLC
Keunggulan
Kelemahan
• Dilakukan pada suhu kamar • Analisis kuantitatif yang cepat dengan presisi dan akurasi yang tinggi • Dapat dioperasikan secara otomatis • Sensitivitas detektor yang tinggi • Dapat diaplikasikan untuk berbagai analit dalam jenis sampel yang lebih luas
• Sulit ditemukan detektor yang universal • Efisiensi pemisahan lebih rendah daripada GC • Lebih rumit dalam pelaksanaannya • Lebih mahal
Klasifikasi HPLC Berdasarkan Mekanisme
• Kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography) • Kromatografi Partisi (partition chromatography) • Kromatografi Pertukaran ion (ion exchange Chromatography) • Size exclusion chromatography (SEC) – Kromatografi Permeasi Gel – Kromatografi Filtrasi Gel
Fase normal dan Fase terbalik
Normal Phase (Fase normal) Fase diam polar dan fase gerak non polar Contoh Fase gerak: Chloroform, heksana dll.
• Reversed Phase (Fase terbalik) • Fase diam non polar dan fase gerak polar
• Contoh fase gerak: air, metanol, asetonitril dll.
Kromatografi Fase Normal • Disebut juga kromatografi cair-padat atau kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography) • Pemisahan didasarkan atas adsorpsi/desorpsi analit pada fase diam polar (silika atau alumina) • Analit polar lebih tertahan daripada analit non polar karena gugus silanol pada silika.
Kromatografi Fase terbalik • Pemisahan didasarkan atas koefisien partisi analit dalam fase diam dan fase gerak • Urutan elusi: analit polar terelusi lebih dahulu, analit non plar terelusi terakhir • Cocok untuk analisis zat-zat yang larut dalam air, semipolar atau beberapa senyawa non polar. • Untuk analit berupa ion dapat dianalisis dengan RP-HPLC menggunakan dapar dan teknik pasangan ion (ion-pair).
Instrumentation
Gradient Controller •
Column
Pump Mobile Phases
Detector Injector
Instrumentation
Instrumentation Degasser 70 mbar A
A
B
B
C
C
Pump
A
A
B
C
A
B
C
B C Eluent
Detector
Gradient mixer Column
Fase Gerak • Fase gerak diletakkan dalam botol-botol reservoir.
Fase Gerak • Zat cair yang digunakan sebagai fase gerak harus saling campur.
HPLC Mobile Phase • • • •
High solubility for the sample components Non corrosive to HPLC system components High purity, low cost, UV transparency Others: low viscosity, low toxicity, non flammability
Reversed!hase mobile !hases • • • • • •
Water Methanol Acetonitrile THF Additives, salts, acids, bases Ion pairing
Kemurnian Fase gerak • Diperlukan solvent dengan kemurnian tinggi • Adanya pengotor (impurities) pada solvent dapat menimbulkan gangguan analisis. • Gunakan HPLC grade • Air sebagai fase gerak: digunakan water for injection
Solvent
UV Cutoff (nm)
Acetonitrile Water Cyclohexane Hexane Methanol Ethanol Diethyl Ether Dichloromethane Chloroform Carbon Tetrachloride Tetrahydrofuran
190 190 195 200 210 210 220 220 240 265 280 (220)
Toluene
285
Isocratic and Gradient Elution Isocratic elution: Constant mobile phase composition during run
Gradient elution: Programme a changing (stepwise or continuous) mobile phase composition during the run For more complex mixtures
Gradient "nal#sis Advantages: • Better suited for complex samples • Better resolution of early and late eluting peaks • Better sensitivity of late eluting peaks • Higher peak capacity (fit more peaks in the chromatogram) Disadvantages • More complex HPLC instrument • Method development, implementation and transfer are more difficult • Typically longer analysis times since column must be calibrated with initial mobile phase
$egasser • Menghilangkan udara (gas nitrogen dan oksigen) yang terlarut. • Adanya udara dapat menimbulkan variasi tekanan pada pompa atau timbulnys noise pada detektor tertentu (RID, FLD dan Amperometric Detector) • Cara: vacuum degassing, pengaliran gas helium atau ultrasonikasi.
Pom!a HPLC • Pompa Pencampur untuk menarik solvent fase gerak dari botol reservoir • Pompa Analisis mengalirkan fase gerak ke dalam kolom • Sistem Pompa: – Tekanan Tinggi – Tekanan rendah
van Deemter Equation H = A + B/ u +(Cs + Cm)u
•
H = A + B/ u + Cu A = 2 λ d p λ depends on particle size distribution, the narrower the distribution the smaller the λ
•
dp = particle size Independent of mobile phase flow rate Also known as eddy diffusion
Skoog and Leary: Principals of Instrumental Analysis, 5 th ed. Suanders, 1998
Longitudinal Diffusion (B)
H = A + B/u B/u + + Cu Cu B/u = 2 γ γ D M /u 1.
= constant depending on quality of packing
2.
DM is the mobile phase diffusion coefficient
3.
Inversely related to mobililee phase flow rate
γ
Mass Transfer (Cs + Cm)
H = A + B/u B/u + + (Cs + Cm)u CS = fS(k’)df2 / DS CM = fM(k’)dp2 / DM
• • • • •
DM is the mobile phase diffusion coefficient DS is the stationary phase diffusion coefficient df is film thickness dp is particle size Directly re related to to mo mobile ph phase flow rate
Skoog and Leary: Principals of Instrumental Analysis, 5th ed. Suanders, 1998
Pada % HPLC Menga!a !erlu tekanan tinggi& • Pada Pada HPLC HPLC digu diguna nakan kan ukur ukuran an part partike ikell packin packingg kolom kolom (silika) yang sangat kecil, umumnya 3-10um. • Fak Faktor tor C pada pada huku hukum m van van Deemt Deemter er seba sebandi nding ng deng dengan an dp2 • Uk Ukur uran an pa part rtik ikel el ma maki kinn kec kecilil luas permukaan makin besar transfer massa dari fase gerak ke fase diam atau sebaliknya makin besar kolom semakin efisien dan resolusi peak semakin baik. • Pe Peng nggu guna naan an uk ukur uran an pa part rtike ikell keci kecill diperlukan tekanan tinggi • Pad Padaa kecep kecepata atann alir alir 0.5 0.5 samp sampai ai 5 ml/ ml/men menit, it, pan panjan jangg kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm (1000 – 6000 psi)
Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)
Pressure =
Force Area
(force = mass x acceleration)
Units of Pressure 1 pascal (Pa) = 1 N/m2 1 atm = 760 mmHg = 760 torr 1 atm = 101,325 Pa 1 atm = 1,013 bar = 14,7 psi (Pound-force per square inch) si = lb/in2 = 6894.757 Pa
Barometer
5.2
'am!le In(e)tion – Load and Inject -Position
Load – Inject Position
'am!le In(e)tion – Load and Inject -Position
HPLC Columns Column: the key part of the separation
HPLC Column Categories • Column Hardware: Standard or Cartridge, stainless, PEEK, titanium • Chromatographic Modes: Normal-phase (NPC), reversed-phase (RPC), ion-exchange (IEC), size exclusion (SEC) • Dimensions (: Prep, semi-prep, analytical, fast LC, micro, nano • Support Types: Silica, polymer, zirconia, hybrid
HPLC Column% '!e)ifi)ation
CS-Chromatographie Service Multospher 120 RP-18 HP 5µ
Length x ID
HPLC-column 250x3 mm Multospher 120 RP-18 HP-5 Art.-Nr. xxxx
Ch. 70801 Column-Nr. 0103-01
Particle size in µm
Flow --------
Modification of silicagel Pore size (Angström) Producer of silica gel Flow direction
HPLC Columns • Column Dimensions – Length and internal diameter of packing bed Short (30-50mm) - short run times, low backpressure Long (250-300mm) - higher resolution, long run times Narrow (≤ 2.1mm) - higher detector sensitivity Wide (10-22mm) - high sample loading
• Particle Shape – Spherical or irregular – Spherical particles reduced back pressures and longer column life
HPLC Columns • Particle Size
– The average particle diameter, typically 3-20µm – Smaller particles offer higher efficiency but also cause higher backpressure < 2µm UPLC
• Surface Area
– Sum of particle outer surface and interior pore surface, in m2 /gram – High surface area generally provides greater retention, capacity and resolution – Low surface area packings generally equilibrate quickly, especially important in gradient analyses.
Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms )
Particle Size and Column Performance
(300 psi) (1300 psi) (10,000 psi) (34,000 psi)
HPLC Columns: Particle Physical Characteristics
•Pore Size – Average size of pores or cavities in particles, ranging from 60-10,000Å – Larger pores allow larger solute molecules to be retained longer through maximum exposure to the surface area of the particles. – Choose a pore size of 150Å or less for sample MW ≤ 2000.
Chromatogra!h# 'tationar# Phases
Silica Gel
Derivatized Silica Gel
O O O | | | −O−Si−O−Si−O−Si−O−H | | | O O O | | | −O−Si−O−Si−O−Si−O−H | | | O O O
O O O | | | −O−Si−O−Si−O−Si−O−R | | | O O O | | | −O−Si−O−Si−O−Si−O−R | | | O O O
bulk (SiO2)x
surface
relatively polar surface “normal phase”
bulk (SiO2)x
surface
relatively nonpolar surface “reversed phase”
Where R = C18H37 hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv. silica or “C18”)
Bonded Phases • C-2
• C-8 • C-18 • CN
Ethyl Silyl
Octyl Silyl Octadecyl Silyl Cyanopropyl Silyl
-Si-CH2-CH3
-Si-(CH2)7-CH3 -Si-(CH2)17-CH3 -Si-(CH2)3-CN
HPLC Columns: Particle Physical Characteristics
•Carbon Load
– Amount of bonded phase attached to base material, expressed as %C
– Higher carbon loads generally offer greater resolution and longer run times. – Low carbon loads shorten run times and many show a different selectivity.
•Endcapping – “Capping” of exposed silanols with short hydrocarbon chains after the primary bonding step
Protection of Siloxane Bonds With Bulky Alkyl Groups
Recommended starting conditions for RP-HPLC
Column: C18 or C8, endcapped Particle Size: 3 - 5 µm Dimensions: 50-100 mm x 4.6 mm i.d for simple samples (e.g. assays of the main component) 100-150
mm x 3.0-4.6 mm i.d for purity testing or Component of complex samples
20-150mm
x 2.0mm i.d for LC/MS
Pemeliharaan kolom • Kolom umumnya tahan 3-24 bulan atau 1000-3000 x injeksi tergantung jenis fase gerak dan sampel • Tutup ujung kolom bila tidak dipakai • Cuci kolom sebelum dan sesudah digunakan • Gunakan guard column (jika bekerja dengan sampel-sampel kotor) • Untuk kolom silika, jangan bekerja di luar pH yang diperbolehkan • Hindari bekerja pada temperatur tinggi
HPLC Detectors • To detect the separated analytes
An ideal Detector: • UNIVERSAL (i.e. detects everything) • SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of analytes) • LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between intensity of response and amount of analyte). • give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the analyte is, even if you didn’t know beforehand).
HPLC $ete)tors • • • • • • • •
UV-Vis Detector Photodiode array Detector (PDA = DAD) Refractive Index Detector (RID) Fluorescence Detector (FLD) Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) Electrochemical Detector (ECD) Conductivity Detector Radiometric Detector
Hyphenated Systems • LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR
HPLC $ete)tors • UV-Vis – Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 10 5) – Can be used with gradient elution – Requires chromophore • Refractive Index – Poor detection limits (100-1000 ng; linear range 10 2) – Isocratic only – Nearly universal detection • Evaporative Light Scattering – Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 10 5); – Non-linear calibration required – Can be used with gradient elution – Nearly universal detection Pilihan pertama UV/Vis atau DAD Untuk analit non chromophor RID atau ELSD
*++is $ete)tor • Paling banyak digunakan • Tersusun dari Lampu deuterium, monokromator dan flow cell • Monokromator terdiri dari grating atau prisma yang dapat bergerak dan dapat memilih panjang gelombang spesifik yang masuk melalui celah (slit) • 190 – 600nm • Ditambah lampu tungsten untuk meningkatkan sensitivitas pada daerah visibel. • Macam UV-Vis: – – – –
Fixed wave length Variable wave length Multiple variable wave length Photo diode-array
*++is $ete)tor Lamp
Cut-off filter Holmium oxide filter
Slit Sample diode Mirror 1
Grating
Flow cell
Mirror 2
Reference diode
UV-VIS Diode Array Detector
P$" • Disebut juga diode array detector • Untuk mengukur spektrum UV dari peak yang terelusi • Mampu melakukan identifikasi peak • Sensitivitas detektor lebih rendah pada model terdahulu tetapi pada model terkini memiliki sensitivitas tinggi • PDA umumnya menggunakan charge coupled diode-array with 512-1,024 diode (or pixels) mampu resolusi spektro 1 nm.
P$" • Dengan software pengevaluasi spektra dapat menampilkan kromatogram dan spektra sampel • Dapat mengenali panjang gelombang maksimum, peak matching (menghitung match factor atau MF), library search dan evaluasi kemurnian peak (peak purity) • Dapat menampilkan 3-D spektra dan countor maps.
,verla# s!e)tra
200
250
300
350
400
n
Peak Purit# test% HPLC • Spektra UV/Vis analit dan zat standar (authentic reference material) dengan diode array detector overlay Evaluasi korelasinya (r, MF, FTIR, MS) • Pengukuran spektra pada “upslope, apex dan down slope” • Peak harus “pure”
Mat)h Fa)tor • • • •
MF = 1000 r = 1 100% pure peak MF > 990 pure MF < 900 not pure 900 < MF < 950 contaminated
Pure and Impure HPLC peaks
• Peak purity tests can also be evaluated with – The 3D-spectra of Photodiode array detectors – Mass spectrometry
Comparison by 3 Point Spectrum
Acetyl Salicylic Acid
up slope, peak top down slope
Refra)tive inde• Mengukur perubahan indeks refraksi antara sel sampel yang mengandung analit yang terelusi dengan sel pembanding. • Sensitivitas lebih rendah (0,01-0,1 ug) • Dapat mendeteksi hampir semua senyawa dan digunakan umumnya untuk analit yang memiliki gugus kromofor lemah seperti gula, trigliserida, asam-asam organik dll. • Detektor standar untuk GPC • Tidak dapat digunakan untuk gradien
Refractive Index Detector
Evaporative Light Scattering Detector
Memilih Pan(ang Gelombang $etektor *+
Pemilihan Panjang Gelombang (UV)
?
