The book is divided into three parts. The first describes the setting-up of a peripheral health laboratory and general laboratory procedures, including use of a microscope and laboratory balances, centrifugation, measurement and dispensing of liquids, and cleaning, disinfection and sterilization of laboratory equipment. Methods of disposal of laboratory waste, dispatch of specimens to reference laboratories and laboratory safety are also discussed. The second part describes techniques for the examination of different specimens for helminths, protozoa, bacteria and fungi. Techniques for the preparation, fixation and staining of smears are also discussed. The third and final part describes the examination of urine, cerebrospinal fluid and blood, including techniques based on immunological and serological principles. For each technique, a list of materials and reagents is given, followed by a detailed description of the method and the results of microscopic examination. Numerous illustrations are used throughout the book to clarify the different steps involved. A summary of the reagents required for the various techniques and their preparation is provided in the annex.
MANUAL OF BASIC TECHNIQUES FOR A HEALTH LABORATORY – 2nd edition
This manual provides a practical guide to the safe and accurate performance of basic laboratory techniques. Intended for use by laboratory technicians working in peripheral-level laboratories in developing countries, the book emphasizes simple, economical procedures that can yield accurate results where resources, including equipment, are scarce and the climate is hot and humid.
M A N U A L DE TÉCNICAS BÁSICAS
PARA UN LABORATORIO DE SALUD 2 ª EDICIÓN
ISBN 92-4-154530-5
9 789241 545303
WHO
ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD GINEBRA
Selected WHO publications of related interest Basic laboratory methods in medical parasitology. 1991 (122 pages) Basic laboratory methods in clinical bacteriology. 1991 (128 pages) Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. Van Dyck E, Meheus AZ, Piot P. 1999 (146 pages) Maintenance and repair of laboratory, diagnostic imaging, and hospital equipment. 1994 (164 pages) Safe management of wastes from health-care activities. Prüss A, Giroult E, Rushbrook P, eds. 1999 (244 pages) Safety in health-care laboratories. (document WHO/LAB/97.1) 1997 (157 pages) La Organización Mundial de la Salud se fundó en 1948 como organismo especializado de las Naciones Unidas que actúa como autoridad directiva y coordinadora de los aspectos internacionales de la salud y la salud pública. Una de las funciones constitucionales de la OMS es la de proporcionar información fiable y objetiva y asesoramiento en el campo de la salud humana, la responsabilidad que cumple en parte gracias a su extenso programa de publicaciones. La Organización busca a través de sus publicaciones apoyar las estrategias nacionales de salud y atender los problemas más acuciantes de salud pública de las poblaciones de todo el mundo. Para responder a las necesidades de los Estados Miembros en todos los niveles de desarrollo, la OMS publica manuales prácticos guías de referencia y material de capacitación para determinadas categorías de trabajadores de la salud; las directrices aplicables a escala internacional y las normas, los exámenes y análisis de políticas, programas e investigaciones sobre salud; y los informes de consenso de vanguardia que ofrecen asesoramiento técnico y recomendaciones para la toma de decisiones. Estos libros están estrechamente vinculados a las actividades prioritarias de la Organización, que abarca el control y prevención de enfermedades y el desarrollo de sistemas de salud equitativos basados en la atención primaria de la salud y la promoción de la salud de los individuos y las comunidades. Avanzar hacia la mejora de la salud para todos exige también la difusión mundial y el intercambio de información que se basa en el conocimiento y la experiencia de todos los países miembros de la OMS y la colaboración de los líderes mundiales en salud pública y el campo de las ciencias biomédicas. Para asegurar la más amplia disponibilidad de información autorizada y orientación en materia de salud, que fija la amplia difusión internacional de sus publicaciones y alienta a la traducción y adaptación. Al contribuir a la promoción y protección de la salud y la prevención y el control de las enfermedades en todo el mundo, los libros de la OMS favorecen a la consecución de los objetivos principales de la Organización: El logro que todas las personas tengan el mayor nivel posible de salud.
Laboratory biosafety manual, 2nd ed. 1993 (133 pages) Basics of quality assurance for intermediate and peripheral laboratories, 2nd ed. El-Nageh MM et al. WHO Regional Publications, Eastern Mediterranean Series, No. 2 2002 (256 pages)
Further information on these and other WHO publications can be obtained from Marketing and Dissemination, World Health Organization, 1211 Geneva 27, Switzerland.
Contents
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Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud Segunda edición
Organización Mundial de la Salud Ginebra 2003
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Manual of basic techniques for a health laboratory
OMS Catalogación por la Biblioteca de Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud. - 2ª ed. 1.Técnicas de laboratorio clínico - Manuales 2.Tecnología, Médica - Guías 3.Manuales ISBN 92 4 154530 5 (clasificación NLM: QY 25)
© Organización Mundial de la Salud 2003 Todos los derechos reservados. Las publicaciones de la Organización Mundial de la Salud pueden obtenerse de Comercialización y Difusión, Organización Mundial de la Salud, 20 Avenue Appia, 1211 Ginebra 27, Suiza (tel.: +41 22 791 2476; fax: +41 22 791 4857; correo electrónico:
[email protected]). Las solicitudes de autorización para reproducir o traducir las publicaciones de la OMS, ya sea para su venta o distribución no comercial - deben dirigirse a la Oficina de Publicaciones, a la dirección indicada más arriba (fax: +41 22 791 4806; e-mail:
[email protected] ) .Las denominaciones empleadas y la presentación del material en esta publicación no implica la expresión de opinión alguna por parte de la Organización Mundial de la Salud relativa a la situación jurídica de ningún país, territorio, ciudad o zona o de sus autoridades, ni respecto de la delimitación de sus fronteras o límites. Las líneas discontinuas representan de manera aproximada fronteras respecto de las cuales puede que no haya pleno acuerdo. La mención de empresas específicas o de ciertos productos no implica que estén respaldados ni recomendados por la Organización Mundial de la Salud con preferencia a otros de naturaleza similar que no se mencionan. Salvo error u omisión, los nombres de los productos patentados se distinguen por una letra inicial mayúscula. La Organización Mundial de la Salud no garantiza que la información contenida en la presente publicación sea completa y correcta, y no será responsable de los daños que puedan resultar de su uso.
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Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud
PREFACIO. . ........................................................................................................................................................ X 1.INTRODUCCIÓN. ............................................................................................................................................. 1 1.1 OBJETIVO DE ESTE MANUAL . .............................................................................................................................2 1.2 REACTIVOS Y EQUIPO. ..................................................................................................................................... 2 1.2 .1 Reactivos............................................................................................................................................... 2 1.2.2 Equipo. ................................................................................................................................................... 2 1.3 LA RESPONSABILIDAD DE LOS TRABAJADORES DEL LABORATORIO..............................................................................2 1.4 UNIDADES DE MEDIDA. ....................................................................................................................................2 1.4.1 Magnitudes y unidades en el laboratorio clínico. .............................................................................. 2 1.4.2 Unidades SI y nombres para las cantidades. ..................................................................................... 2 PARTE 1. ........................................................................................................................................................... 10 2. MONTAJE DE UN LABORATORIO DE SALUD PERIFÉRICO…………………………………………………………………11 2.1 PLANO DE UN LABORATORIO MÉDICO PERIFÉRICO . . ........................................................................................... 11 2.1.1 El laboratorio de una sola habitación...............................................................................................11 2.1.2 Laboratorio de dos habitaciones. .....................................................................................................12 2.2 ELECTRCIDAD………………………………………………………………………………………………………………………………12 2.2.2 Instalación de un equipamiento eléctrico simple................................................................................. 15 2.2.3 Que hacer en caso de falla eléctrica. ....................................................................................................17 2.3 Fontanería: procedimientos sencillos. .....................................................................................................20 A. Materiales. ................................................................................................................................................20 B. El grifo de agua. ....................................................................................................................................... 20 C. El sifón del fregadero………………………………………………………………………………………………………………………..21 2.4 Agua para uso del laboratorio. . ............................................................................................................. 23 2.4.1 Agua limpia. . ...................................................................................................................................... 23 2.4.2 Agua destilada. . .................................................................................................................................. 24 2.4.3 Agua desmineralizada. . .......................................................................................................................26 2.4.4 Agua amortiguada. ............................................................................................................................. 28 2.5 Equipamiento. ........................................................................................................................................ 30 2.5.1 Instrumentos de laboratorio esenciales. ............................................................................................. 30 2.5.2 Artículos adicionales. .......................................................................................................................... 30 2.5.3 Equipos y suministros. ......................................................................................................................... 31 2.5.4 Manufactura de utensilios de vidrio. . ..................................................................................................31 2.5.5 Recipientes para muestras. . ............................................................................................................... 40 2.5.6 Almacenamiento, y pedido de suministros. . ....................................................................................... 42 2.6 REGISTRO DE LAS MUESTRAS, REGISTROS DEL LABORATORIO E INFORMES MENSUALES. ............................................ 43 2.6.1 Registro de las muestras. ................................................................................................................ 44 2.6.2 Preparación del informe mensual.................................................................................................... 44 3 PROCEDIMIENTOS GENERALES DE LABORATORIO. . ................................................................................... 48 3.1 USO DE UN MICROSCOPIO. ............................................................................................................................ 48 3.1.1 Componentes de un microscopio. .................................................................................................... 48 3.1.2 Configuración y preparación del microscopio...................................................................................53 3.1.3 Enfoque del objetivo. . ......................................................................................................................56 3.1.4 Uso de un micrómetro ocular. . ....................................................................................................... 57 3.1.5 Microscopía de campo oscuro. ........................................................................................................ 58 3.1.6 Mantenimiento rutinario. ................................................................................................................58 3.2 PESAJE: EL USO DE BALANZAS DE LABORATORIO. . ............................................................................................. 60 3.2.1 Sensibilidad de la balanza. . ............................................................................................................ 60
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Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud
3.2.2 Balanza abierta de dos platillos................................................................................................... 60 3.2.3 Balanza analítica.........................................................................................................................62 3.2.4 Balanza de dispensario................................................................................................................63 3.3 CENTRIFUGACIÓN................................................................................................................................... 63 3.3.1 Principio......................................................................................................................................63 3.3.2 Diferentes tipos de centrífugas.................................................................................................... 64 3.3.3 Instrucciones para usar la centrífuga eléctrica............................................................................. 66 3.4 Medición y dispensación de líquidos............................................................................................... 67 3.4.1 Pipetas........................................................................................................................................68 3.4.2 Matraces volumétricos................................................................................................................ 72 3.4.3 Buretas....................................................................................................................................... 72 3.5 LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN...................................................................................................74 3.5.1 Limpieza de los utensilios de vidrio y de las jeringas y agujas reutilizables.................................... 74 3.5.2 Limpieza de los recipientes no desechables.................................................................................. 77 3.5.3 Limpieza y mantenimiento de otros equipos de laboratorio......................................................... 78 3.5.4 Desinfectantes............................................................................................................................ 78 3.5.5 Esterilización............................................................................................................................... 80 3.6 Eliminación de residuos de laboratorio........................................................................................... 85 3.6.1 Desecho de muestras y materiales infectados.............................................................................. 85 3.6.2 Incineración de los materiales de desecho................................................................................... 86 3.6.3 Entierro de los desechos.............................................................................................................. 86 3.7 ENVÍO DE MUESTRAS A UN LABORATORIO DE REFERENCIA................................................................................ 86 3.7.1 Empaquetado de las muestras para su envío............................................................................... 87 3.7.2 Fijación y envío de material de biopsias para estudios de histopatología......................................90 3.8 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO................................................................................................................ 92 3.8.1 Precauciones para evitar accidentes............................................................................................ 93 3.8.2 Primeros auxilios en accidentes de laboratorio............................................................................ 93 3.9 GARANTÍA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO................................................................................................. 95 3.9.1 Recolección de la muestra........................................................................................................... 96 PARTE 2...................................................................................................................................................... 93 4. PARASITOLOGÍA..................................................................................................................................... 98 4.1 INTRODUCCIÓN......................................................................................................................................98 4.2 EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE HECES PARA PARÁSITOS................................................................................... 99 4.2.1 Colección de muestras.................................................................................................................99 4.2.2 Examen visual............................................................................................................................. 99 4.2.3 El examen microscópico............................................................................................................ 100 4.2.4 Envío de heces para la detección de parásitos............................................................................102 4.3 PROTOZOOS INTESTINALES......................................................................................................................103 4.3.1 Identificación de formas móviles (trofozoítos)............................................................................103 4.3.2 Identificación de los quistes....................................................................................................... 109 4.4 HELMINTOS INTESTINALES...................................................................................................................... 123 4.4.1 Identificación de los huevos....................................................................................................... 123 4.4.2 Identificación de los helmintos adultos...................................................................................... 142 4.5 TÉCNICASPARACONCENTRARLOSPARÁSITOS………………………………………………………………………………………………….144 4.5.1 Técnica de flotación utilizando una solución de cloruro de sodio (Willis)..................................... 144 4.5.2 Técnica de sedimentación formaldehido-éter.............................................................................147 4.5.3 Técnica de sedimentación formaldehido-detergente.................................................................. 152 4.5.4 Técnica de sedimentación para las larvas de strongyloides stercoralis (Harada-Mori).................154 4.6 PRUEBA QUÍMICA PARA SANGRE OCULTA EN MATERIA FECAL (SOMF).............................................................. 156 4.6.1 Principio....................................................................................................................................156
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Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud
4.6.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 156 4.6.3 Método..................................................................................................................................... 156 4.6.4 Resultados................................................................................................................................ 157 4.7 LOS PARÁSITOS DE LA SANGRE Y DE LA PIEL .................................................................................................158 4.7.1 Filariae......................................................................................................................................158 4.7.2 Plasmodium spp........................................................................................................................171 4.7.3 Trypanosoma spp...................................................................................................................... 189 4.7.4 Leishmania spp......................................................................................................................... 200 5. BACTERIOLOGÍA....................................................................................................................................203 5.1 INTRODUCCIÓN.................................................................................................................................... 203 5.2 PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DE LOS FROTIS.................................................................................................... 203 5.2.1 Principio....................................................................................................................................203 5.2.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 203 5.2.3 Preparación del frotis................................................................................................................ 203 5.2.4 Fijación de los frotis...................................................................................................................204 5.3 TÉCNICAS DE TINCIÓN............................................................................................................................205 5.3.1 Tinción de Gram........................................................................................................................ 205 5.3.2 Tinción con colorante de Albert (para la detección de Corynebacterium diphtheriae)................. 208 5.3.3 Tinción con Ziehl-Neelsen (para la detección de bacilos ácido-alcohol resistentes)...................... 209 5.3.4 Tinción con el colorante de Wayson (para la detección de Yersinia pestis).................................. 215 5.3.5 Tinción con azul de metileno de Loeffler (para la detección de Bacillus anthracis).......................216 5.4 EL EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO Y FROTIS DE GARGANTA................................................................... 217 5.4.1 Materiales y Reactivos.............................................................................................................. 217 5.4.2 Método..................................................................................................................................... 217 5.4.3 Examen microscópico................................................................................................................ 220 5.4.4 Envío de muestras para cultivo.................................................................................................. 220 5.5 EXAMEN DE MUESTRAS UROGENITALES PARA LA GONORREA........................................................................... 221 5.5.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 221 5.5.2 Método..................................................................................................................................... 221 5.5.3 Examen microscópico................................................................................................................ 223 5.5.4 Envío de muestras para cultivo.................................................................................................. 224 5.6 EL EXAMEN DE MUESTRAS GENITALES DE LA SÍFILIS....................................................................................... 226 5.6.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 226 5.6.2 Método..................................................................................................................................... 226 5.6.3 Examen Microscópico................................................................................................................227 5.7 EXAMEN DE MUESTRAS DE SEMEN............................................................................................................228 5.7.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 228 5.7.2 Método..................................................................................................................................... 228 5.7.3 El examen macroscópico........................................................................................................... 228 5.7.4 Examen Microscópico...............................................................................................................228 5.8 EXAMEN DE LA SECRECIÓN VAGINAL..........................................................................................................230 5.8.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 231 5.8.2 Método..................................................................................................................................... 231 5.8.3 Examen microscópico................................................................................................................ 231 5.9 EL EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE HECES ACUOSAS....................................................................................... 231 5.9.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 231 5.9.2 Método..................................................................................................................................... 231 5.9.3 El examen microscópico............................................................................................................ 231 5.9.4 Envío de muestras para cultivo.................................................................................................. 231 5.10 EXAMEN DE ASPIRADOS, EXUDADOS Y DERRAMES.......................................................................................233
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Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud
5.10.1 Materiales y reactivos................................................................................................................. 233 5.10.2 Método...................................................................................................................................... 233 5.10.3 EXAMEN MICROSCÓPICO................................................................................................................... 233 5.11 EXAMEN DE PUS DE BACILLUS ANTHRACIS................................................................................................ 234 5.11.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 234 5.11.2 Método................................................................................................................................... 234 5.11.3 Examen microscópico.............................................................................................................. 234 5.12 EL EXAMEN DE FROTIS DE PIEL Y RASPADOS NASALES PARA MYCOBACTERIUM LEPRAE......................................... 234 5.12.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 234 5.12.2 Método................................................................................................................................... 234 5.12.3 Examen microscópico.............................................................................................................. 238 6. MICOLOGÍA...........................................................................................................................................240 6.1 EVALUACIÓN DE LA PIEL Y EL CABELLO PARA LOS HONGOS.............................................................................. 240 6.1.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 240 6.1.2 Método..................................................................................................................................... 240 6.2 EXAMEN DE PUS PARA MICETOMA............................................................................................................241 6.2.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 242 6.2.2 Método..................................................................................................................................... 242 6.3 EXAMEN DE LA PIEL PARA LA PITIRIASIS VERSICOLOR..................................................................................... 243 6.3.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 243 6.3.2 Método..................................................................................................................................... 243 PARTE 3.................................................................................................................................................... 246 7. EXAMEN DE ORINA............................................................................................................................... 247 7.1 RECOGIDA DE MUESTRAS DE ORINA.......................................................................................................... 247 7.1.1 Tipos de muestra de orina......................................................................................................... 247 7.1.2 Preservación de las muestras de orina....................................................................................... 247 7.2 EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE ORINA....................................................................................................... 247 7.2.1 Apariencia.................................................................................................................................247 7.2.2 Pruebas para la presencia de sangre......................................................................................... 247 7.2.3 Medición del pH........................................................................................................................ 248 7.2.4 Detección de la glucosa............................................................................................................. 249 7.2.5 Detección y estimación de proteínas en orina............................................................................ 250 7.2.6 Detección de cuerpos cetónicos en orina....................................................................................251 7.2.7 Detección de elementos anormales........................................................................................... 252 7.2.8 Detección de la infección producida por Schistosoma haematobium......................................... 263 7.2.9 Detección de bacterias en la orina............................................................................................. 265 8. EXAMEN DEL LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)................................................................................. 268 8.1 LAS RAZONES MÁS COMUNES PARA LA INVESTIGACIÓN DE LCR....................................................................... 268 8.2 RECOGIDA DE MUESTRAS DE LCR.............................................................................................................268 8.3 EL EXAMEN DE MUESTRAS DEL LCR.......................................................................................................... 268 8.3.1 Precauciones............................................................................................................................. 268 8.3.2 Examen directo......................................................................................................................... 269 8.3.3 Examen microscópico................................................................................................................ 270 8.3.4 Determinación de la concentración de glucosa en el LCR............................................................275 8.3.5 Determinación de la concentración de proteínas en el LCR......................................................... 275 8.3.6 Resumen................................................................................................................................... 277 8.4 ENVÍO DE LAS MUESTRAS DE LCR PARA CULTIVO ......................................................................................... 277 8.4.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 277
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Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud
8.4.2 Método del medio de transporte Stuart (para el aislamiento de Neisseria meningitidis)............. 277 9. HEMATOLOGÍA..................................................................................................................................... 285 9.1 TIPOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS ............................................................................................................... 285 9.1.1 Eritrocitos................................................................................................................................. 285 9.1.2 Leucocitos................................................................................................................................. 285 9.1.3 Trombocitos.............................................................................................................................. 285 9.2 RECOGIDA DE MUESTRAS DE SANGRE........................................................................................................ 286 9.2.1 Principio....................................................................................................................................286 9.2.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 286 9.2.3 Método..................................................................................................................................... 288 9.3 ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA................................................................................ 293 9.3.1 Método fotométrico de la Cianmetahemoglobina...................................................................... 293 9.3.2 método de hematina alcalina D................................................................................................. 296 9.4 ESTIMACIÓN DE LA FRACCIÓN DE VOLUMEN DE ERITROCITOS.......................................................................... 298 9.4.1 Método de la Microescala......................................................................................................... 299 9.4.2 Método de la Macroescala........................................................................................................ 304 9.5 ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL NÚMERO DE ERITROCITOS................................................................. 305 9.6 ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL NÚMERO DE LEUCOCITOS.................................................................. 310 9.6.1 Principio....................................................................................................................................310 9.6.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 310 9.6.3 Método..................................................................................................................................... 310 9.6.4 Resultados................................................................................................................................ 313 9.7 MEDICIÓN DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN DE LOS ERITROCITOS (VSE).................................................... 315 9.7.1 Principio....................................................................................................................................315 9.7.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 315 9.7.3 Método..................................................................................................................................... 315 9.7.4 Resultados................................................................................................................................ 316 9.8 MEDICIÓN DEL TIEMPO DE SANGRADO: MÉTODO DE DUKE............................................................................ 318 9.8.1 Principio....................................................................................................................................318 9.8.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 318 9.8.3 Método..................................................................................................................................... 319 9.8.4 Resultados................................................................................................................................ 319 9.9 OBSERVACIÓN DE LA RETRACCIÓN DEL COÁGULO Y LA MEDICIÓN DEL TIEMPO DE LISIS.......................................... 320 9.9.1 Principio....................................................................................................................................320 9.9.2 Materiales................................................................................................................................ 320 9.9.3 Método..................................................................................................................................... 320 9.9.4 Resultados................................................................................................................................ 320 9.10 PREPARACIÓN Y TINCIÓN DE EXTENSIONES SANGUÍNEAS FINAS.......................................................................323 9.10.1 Principio..................................................................................................................................323 9.10.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 323 9.10.3 Método................................................................................................................................... 326 9.10.4 Examen microscópico.............................................................................................................. 331 9.11 PRUEBA DE LA ANEMIA DE CÉLULAS FALCIFORMES...................................................................................... 343 9.11.1 Principio..................................................................................................................................343 9.11.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 343 9.11.3 Método................................................................................................................................... 343 9.11.4 Examen microscópico.............................................................................................................. 344 9.12 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN / FRACCIÓN DEL NÚMERO DE RETICULOCITOS.......................................345 9.12.1 Principio..................................................................................................................................345 9.12.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 345
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9.12.3 Método................................................................................................................................... 345 9.12.4 Examen microscópico.............................................................................................................. 345 9.13 DETERMINACIÓN DE LA FRACCIÓN NÚMERO DE TIPO DE LEUCOCITOS.............................................................. 347 9.13.1 Principio..................................................................................................................................347 9.13.2 Materiales...............................................................................................................................347 9.13.3 Examen microscópico.............................................................................................................. 347 9.14 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL NÚMERO DE TROMBOCITOS....................................................... 349 9.14.1 Materiales...............................................................................................................................349 9.14.2 Examen Microscópico..............................................................................................................349 10. QUÍMICA SANGUÍNEA……………………………………………………………………………………………………………………..355 10.1 VALORACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE: MÉTODO DE LA O-TOLUIDINA1............................. 355 10.1.1 Principio..................................................................................................................................355 10.1.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 355 10.1.3 Método................................................................................................................................... 356 10.1.4 Resultados.............................................................................................................................. 358 10.2 ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE UREA EN LA SANGRE: MÉTODO DE LA DIACETIL MONOXIMA /TIOSEMICARBACIDA ............................................................................................................................................................. 359 10.2.1 Principio..................................................................................................................................359 10.2.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 359 10.2.3 Método................................................................................................................................... 359 10.2.4 Resultados.............................................................................................................................. 360 11. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS Y SEROLÓGICAS..................................................................................... 368 11.1 INTRODUCCIÓN A LA INMUNOLOGÍA........................................................................................................368 11.1.1 Anticuerpos.............................................................................................................................368 11.1.2 Antígenos................................................................................................................................369 11.1.3 Interacciones antígeno-anticuerpo.......................................................................................... 369 11.2 PRINCIPIO DE LAS TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS......................................................................................... 369 11.2.1 Ensayos de unión primaria.......................................................................................................370 11.2.2 Ensayos de unión secundaria................................................................................................... 372 11.3 DETERMINACIÓN DE LOS FACTORES REUMATOIDES MEDIANTE LA TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN DE LÁTEX................... 375 11.3.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 375 11.3.2 Método................................................................................................................................... 375 11.4 PRUEBAS PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-ESTREPTOLISINA O.................................................. 375 11.4. 1 Prueba para la Anti-estreptolisina O (ASO, AELO)....................................................................375 11.4.2 Aglutinación en látex...............................................................................................................377 11.5 DETERMINACIÓN DE -GONADOTROFINA CORIÓNICA HUMANA (-HCG) EN LA ORINA CON LA TÉCNICA DE INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN...................................................................................................................................... 377 11.5.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 377 11.5.2 Método................................................................................................................................... 377 11.6 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ANTICUERPOS IGA, IGG E IGM POR INMUNODIFUSIÓN RADIAL........................377 11.6.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 377 11.6.2 Método................................................................................................................................... 378 11.7 PRUEBAS PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA EL VIH............................................................ 378 11.7.1 ELISA.......................................................................................................................................378 11.7.2 Tira reactiva............................................................................................................................ 379 11.8 PRUEBAS PARA LA INFECCIÓN POR VIRUS DE LA HEPATITIS ............................................................................ 381 11.8.1 ELISA para el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg)..................................................381 11.8.2 Tira reactiva para el antígeno de superficie de la hepatitis B.................................................... 381 11.9 TIRA REACTIVA PARA P. FALCIPARUM...................................................................................................... 382 11.9.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 382
VII
Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud
11.9.2 Método................................................................................................................................... 383 11.10 PRUEBAS PARA LA INFECCIÓN POR SÍFILIS............................................................................................... 384 11.10.1 Prueba RPR........................................................................................................................... 385 11.10.2 Prueba TPHA......................................................................................................................... 386 ANEXO: REACTIVOS Y SU PREPARACIÓN...................................................................................................425
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Manual of basic techniques for a health laboratory
Prefacio
Este libro es una edición revisada del Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud (OMS, 1980), revisiones importantes que se han llevado a cabo por el Dr. K. Engbaek, el Dr. C. C. Heuck y el Sr. A. H. Moody. La revisión es necesaria debido a nuevos procedimientos y tecnología que se han desarrollado desde la edición anterior y que han demostrado ser útiles para los pequeños laboratorios de países en desarrollo. Los procedimientos han sido incluidos en las secciones correspondientes del manual, y algunos procedimientos obsoletos se han sustituido por técnicas actualizadas. El objetivo original del manual no ha cambiado. Se destina principalmente a la utilización de personal de laboratorio en los países en desarrollo durante su formación y, posteriormente, en sus trabajos. En la selección de técnicas, se ha prestado especial atención al bajo costo, fiabilidad y sencillez de los métodos y a la disponibilidad de recursos en pequeños laboratorios. La OMS expresa su agradecimiento a todos aquellos que han ayudado en la revisión de este manual.
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Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud
OMS 1. Introducción
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1.1 OBJETIVO DE ESTE MANUAL ste manual está destinado principalmente a los laboratorios médicos en los países en desarrollo. Está diseñado especialmente para su uso en los laboratorios periféricos en tales países (es decir, en laboratorios pequeños o de tamaño medio adjuntos o conectados a los hospitales regionales) y en los dispensarios y centros de salud rurales donde el técnico de laboratorio1 a menudo tiene que trabajar solo. Se ha procurado utilizar el lenguaje más sencillo posible. Sin embargo, cuando ha sido necesario, se han empleado términos técnicos de uso común. El manual describe procedimientos de examen que pueden ser realizados con un microscopio u otro aparato sencillo. Tales procedimientos incluyen los siguientes: - El examen de las heces fecales para la búsqueda de parásitos intestinales (examen microscópico para buscar huevos de helmintos parásitos – nematelmintos, platelmintos-, quistes y trofozoítos de protozoos parásitos); - El examen de sangre para la búsqueda de parásitos del paludismo; - El examen de esputo para la búsqueda de los bacilos de la tuberculosis; - El examen de pigmentos biliares en la orina; - El examen de sangre para la determinación de los glóbulos blancos (leucocitos) tipo, número, fracción (recuento diferencial leucocitario) (también conocido como “Fórmula Leucocitaria”); - El examen de sangre para la determinación de la concentración de glucosa. - Envío de heces fecales a laboratorios especializados para detectar vibriones del cólera. La intención es la de proporcionar un determinado número de técnicas básicas de laboratorio que son útiles para los laboratorios periféricos y que pueden llevarse a cabo con una limitada gama de equipo básico. Algunos laboratorios pueden no ser capaces de realizar todos los procedimientos descritos. Por ejemplo, un laboratorio de un centro de salud rural no puede ser capaz de llevar a cabo determinadas pruebas de química sanguínea o pruebas serológicas.
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1.2 REACTIVOS Y EQUIPO 1.2 .1 REACTIVOS A Cada reactivo se le ha asignado un número. Los reactivos necesarios y sus números se indican en la descripción de cada técnica. Una lista alfabética de todos los reactivos utilizados, con los números asignados a ellos, su composición y los métodos de preparación y los requisitos de almacenamiento aparece en el anexo al final del manual. Por ejemplo, uno de los reactivos necesarios para la tinción de Gram es el cristal violeta, modificado por Hucker (reactivo no. 18). La composición del cristal violeta y el método de preparación de éste aparecen en la lista por orden alfabético de los reactivos (véase el anexo). 1.2.2 EQUIPO Los elementos necesarios para cada técnica se enumeran al principio de la sección correspondiente. Una lista de los aparatos necesarios para equipar un laboratorio capaz de llevar a cabo todos los exámenes descritos en este manual se puede encontrar en la sección 2.5. Cuando algunos de los artículos no están disponibles, el técnico debe encontrar un sustituto adecuado; por ejemplo, los recipientes o frascos vacíos que contenían antibióticos para la inyección por vía parenteral ("frascos de penicilina"), asimismo, pueden ser guardados los recipientes de otras drogas; soportes para tubos de ensayo (gradillas) y los portaobjetos pueden hacerse o construirse en el mismo lugar; también las latas vacías se pueden utilizar para hacer baños maría. 1.3 LA RESPONSABILIDAD DE LOS TRABAJADORES DEL LABORATORIO Los trabajadores del laboratorio realizan exámenes de laboratorio para proporcionar información al personal clínico con el fin de beneficiar a los pacientes. Por lo tanto, desempeñan un importante papel ayudando a que los enfermos mejoren. Al mismo tiempo, en el curso de su trabajo, ellos ganan y obtienen mucha información sobre los pacientes y sus enfermedades. Los trabajadores del laboratorio, como el personal clínico, deben considerar esta información como estrictamente confidencial; y solamente el personal clínico que solicita los exámenes debe recibir los informes sobre ellos. Cuando los pacientes solicitan información sobre los resultados de las pruebas se les debe decir que pidan o pregunten acerca de los resultados al personal clínico. En la mayoría de los países del mundo existen rigurosas normas morales y profesionales de conducta entre los médicos y el personal capacitado de laboratorio. Todos los trabajadores del laboratorio que manipulan materiales clínicos deberán ceñirse a esas normas. 1.4 UNIDADES DE MEDIDA En el laboratorio usted trabajará frecuentemente con magnitudes y unidades de medición, y es importante que se comprenda la diferencia que hay entre ambas. Se denomina magnitud toda propiedad física mensurable. Tómese nota que la palabra "magnitud” posee dos significados: el científico que se acaba de indicar y el de uso común, o sea "cantidad". En el terreno científico, altura, longitud, velocidad, temperatura y corriente eléctrica son magnitudes y se miden en unidades. 1.4.1 MAGNITUDES Y UNIDADES EN EL LABORATORIO CLÍNICO Una gran parte de su trabajo en el laboratorio consistirá en hacer mediciones de magnitudes y utilizar unidades para comunicar los resultados de tales mediciones. Puesto que la salud y aún la vida del paciente pueden depender del cuidado con que usted efectúe las mediciones y de la forma en que comunique los resultados, usted deberá conocer cabalmente: a) las magnitudes que mida; b) los nombres que se dan a esas magnitudes, y c) las unidades que se emplean para medirlas. 1.4.2 UNIDADES SI Y NOMBRES PARA LAS CANTIDADES Un conjunto simple y estandarizado de unidades de medida ha sido el objetivo de los científicos durante casi dos siglos. El sistema métrico decimal fue introducido en 1901. Desde entonces, este sistema se ha ido ampliando, y en 1960 se le dio el nombre de "Système International d'Unités" (Sistema Internacional de Unidades) y la abreviatura internacional "SI". 1
“Laboratorista”, también un Bioquímico Clínico; NDT.
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Las unidades de medida que forman parte de este sistema se denominan "Unidades SI". Estas unidades se han utilizado de manera creciente en las ciencias, especialmente la química y la física, desde 1901 (mucho antes de que ellas fueran llamadas unidades SI), pero la mayoría de ellas se introdujeron en la medicina sólo después de 1960. Para acompañar la introducción de las unidades del SI, los especialistas en ciencias médicas prepararon una lista sistemática de los nombres para las magnitudes. Algunos de estos nombres eran los mismos que los tradicionales, en otros casos, sin embargo, los nombres tradicionales eran inexactos, engañosos o ambiguos, y se introdujeron nuevos nombres para reemplazarlos. Este manual utiliza las unidades del SI y los nombres actualmente aceptados para magnitudes. Sin embargo, puesto que las unidades tradicionales y los nombres tradicionales para cantidades todavía se utilizan en algunos laboratorios, estos también están incluidos, y la relación entre los dos es explicada. En la sección siguiente se describen brevemente las unidades SI y la nueva nomenclatura de las magnitudes según se usan en este manual. UNIDADES SI USADAS EN ESTE MANUAL Todas las unidades del SI se basan en siete unidades básicas del SI. Sólo cuatro de ellas se utilizan en este manual, que se indican en la Tabla 1.1. Tabla 1.1 Unidades SI básicas utilizadas en este manual Cantidad Nombre de la Unidad Símbolo Longitud metro m Masa kilogramo kg Tiempo segundo s Cantidad de sustancia mol mol Las primeras tres de estas unidades serán familiares para usted, aunque los nombres de cantidad denominados "masa" y "cantidad de sustancia" y el nombre de la unidad "mol" pueden necesitar una explicación. Masa es el término correcto para lo que comúnmente se llama "peso". (Hay un sentido técnico del término "peso": es una medida de la fuerza con la que la gravedad de la Tierra atrae a una dada masa. La Masa, por otra parte, es independiente de la atracción gravitacional de la Tierra, los dos términos son confundidos en el uso cotidiano; además, se habla de la medición de una masa como "pesar o pesaje". "Cantidad de sustancia" y su unidad, mol, son términos importantes en medicina y afectarán su trabajo en el laboratorio más que cualquier otras cantidades o unidades SI. Cuando dos o más sustancias químicas reaccionan entre sí, no lo hacen en relación con su masa. Por ejemplo: Bicarbonato de Sodio + Ácido Clorhídrico Cloruro de Sodio + Dióxido de Carbono + Agua En esta reacción 1 kg (1 kilogramo) de Bicarbonato de Sodio no reacciona con 1 kg de Ácido Clorhídrico; de hecho, 1 mol de Bicarbonato de Sodio reacciona con 1 mol de Ácido Clorhídrico. Cuando las sustancias químicas interactúan, lo hacen en relación a su masa molecular relativa (el nuevo nombre para lo que solía ser llamado "peso molecular"). El uso del mol, que se basa en la masa molecular relativa, por lo tanto, da una medida de cantidades equivalentes de dos o más sustancias diferentes (el uso de unidades de masa no lo hace). La mayoría de las unidades SI son llamadas unidades derivadas del SI o unidades SI derivadas. Estas se obtienen mediante la combinación de las unidades SI básicas (por multiplicación o división) según sea apropiado. Mediante esta denominación se hace referencia a las unidades utilizadas para expresar magnitudes físicas que son resultado de combinar magnitudes físicas básicas. No se debe confundir este concepto con los de múltiplos y submúltiplos, que se utilizan tanto en las unidades básicas como en las derivadas, sino que siempre se le ha de relacionar con las magnitudes expresadas. Si éstas son longitud, masa, tiempo, intensidad de corriente eléctrica, temperatura, cantidad de substancia o intensidad luminosa, se trata de una magnitud básica. Todas las demás son derivadas. Algunas unidades comunes derivadas del SI se muestran en la Tabla 1.2. Tabla 1.2 Unidades SI derivadas utilizadas en este manual Cantidad Nombre de la Unidad Símbolo Área metro cuadrado m2 Volumen metro cúbico m3 Velocidad metro por segundo m/s o ms-1 La unidad de área es metro x metro = metro cuadrado; la unidad de volumen es metro x metro x metro = metro cúbico; y la unidad de velocidad es metro dividido en segundo = metro por segundo. Todas las unidades SI derivadas se obtienen de esta manera simple. En algunos casos, sin embargo, es necesario multiplicar y dividir varias veces, y la expresión resultante llega a ser muy engorrosa, por ejemplo, la unidad de presión es kilogramo dividido en (metro x segundo x segundo.) Para evitar esta dificultad, a estas unidades se les da nombres especiales. Por ejemplo, la unidad de presión es llamada Pascal. Si las unidades SI básicas y las unidades derivadas fueran las únicas disponibles, las mediciones serían difíciles de llevar a cabo debido a que estas unidades son demasiado grandes o demasiado pequeñas para muchos propósitos. Por ejemplo, el metro es demasiado grande y poco conveniente para la medición del diámetro de un glóbulo rojo (eritrocito). Para superar esta dificultad, el SI incorpora una serie de prefijos, llamado prefijos SI, que cuando se añaden al nombre de una unidad se multiplica o divide esa unidad por un determinado factor, dando múltiplos o submúltiplos decimales de la unidad. Los prefijos del SI utilizados en este manual se muestran en la Tabla 1.3. Tabla 1.3 Prefijos SI Factor Prefijo Símbolo mega M Multiplicado por 1000000 o 1 millón (× 106) kilo k Multiplicado por 1000 (× 103) Dividido por 100 (x 0,01 o 10-2) centi c Dividido por 1000 (x 0,001 o 10-3) mili m Dividido por 1000000 (x 0,000001 o 10-6) micro µ -9 Dividido por 1000 millones (x 0,000 000 001 o 10 ) nano n Por ejemplo, a 1 kilómetro (1 km) = 1000 metros (1000 m); 1 centímetro (1 cm) = 0,01 metros (0,01 m o 10-2m); 1 milímetro (1 mm) = 0,001 metros (0,001 m o 10-3 m), y 1 micrómetro (1 µm) = 0,000 001 metros (0,000 001 m o 10-6 m). Estos prefijos tienen el mismo significado cuando se aplican a cualquier otra unidad.
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NOMBRES PARA MAGNITUDES UTILIZADOS EN ESTE MANUAL Algunos nombres para las magnitudes fueron introducidas para acompañar el cambio a unidades del SI. La mayoría de estos nombres se utilizan para describir concentración y cantidades afines. AGREGADO: TABLA DE MÚLTIPLOS Y SUBMÚLTIPLOS El separador decimal debe estar alineado con los dígitos, mediante una coma (,), salvo en textos en inglés, en los cuales se emplea punto (.). No se ha de usar otro signo entre los números. Para facilitar la lectura, los guarismos pueden agruparse en grupos de tres, de derecha a izquierda, sin utilizar comas, ni puntos, en los espacios entre grupos. Ejemplo: 123 456 789 987 546. Para este efecto, en algunos países se acostumbra separar los miles con un punto. (Ejemplo: 123.456.789.987.546). Esta notación es desaconsejable y ajena a la normativa establecida en el Sistema Internacional de Unidades.13 En escritos referentes a fechas se exceptúan las cifras relativas a años: 2012 en vez de 2 012. Artículo principal: Prefijos del Sistema Internacional. Símbol Equivalencia decimal en los Prefijos del Sistema 1000n 10n Prefijo Escala corta Escala larga Asignación o Internacional 10008
1024
yotta
Y
Septillón
Cuatrillón
10007
1021
zetta
Z
Sextillón
Mil trillones
10006
1018
exa
E
Quintillón
Trillón
10005
1015
peta
P
Cuatrillón
Mil billones
10004
1012
tera
T
Trillón
Billón
10003
109
giga
G
Billón
Mil millones / Millardo
10002
106
mega
M
Millón
10001
103
kilo
k
Mil / Millar
10002/3
102
hecto
h
10001/3
101
deca
da
10000
100
ninguno
1 000 000 000 000 000 000 000 000
1991
1 000 000 000 000 000 000 000
1991
1 000 000 000 000 000 000
1975
1 000 000 000 000 000
1975
1 000 000 000 000
1960
1 000 000 000
1960
1 000 000
1960
1 000
1795
Cien / Centena
100
1795
Diez / Decena
10
1795
Uno / Unidad
1
1000−1/3 10−1
deci
d
Décimo
0,1
1795
1000−2/3 10−2
centi
c
Centésimo
0,01
1795
0,001
1795
0,000 001
1960
0,000 000 001
1960
0,000 000 000 001
1960
0,000 000 000 000 001
1964
0,000 000 000 000 000 001
1964
1000−1
10−3
mili
m
Milésimo
1000−2
10−6
micro
µ
Millonésimo
1000−3
10−9
nano
n
Billonésimo
Milmillonésimo
1000−4 10−12
pico
p
Trillonésimo
Billonésimo
1000−5 10−15
femto
f
Cuatrillonési mo
Milbillonésimo
1000−6 10−18
atto
a
Quintillonési mo
Trillonésimo
1000−7 10−21
zepto
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Sextillonésim o
Miltrillonésimo
0,000 000 000 000 000 000 001
1991
1000−8 10−24
yocto
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Septillonésim o
Cuatrillonésimo
0,000 000 000 000 000 000 000 001
1991
PREFIJOS DEL SISTEMA INTERNACIONAL Los prefijos del SI para nombrar a los múltiplos y submúltiplos de cualquier unidad del Sistema Internacional (SI), ya sean unidades básicas o derivadas. Estos prefijos se anteponen al nombre de la unidad para indicar el múltiplo o submúltiplo decimal de la misma; del mismo modo, los símbolos de los prefijos se anteponen a los símbolos de las unidades. Los prefijos pertenecientes al SI los fija oficialmente la Oficina Internacional de Pesos y Medidas (Bureau International des Poids et Mesures), de acuerdo con el cuadro siguiente: Ejemplos: 7 cm = 7 × 10-2 m = 7 × 0,01 m = 0,07 m
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3 MW = 3 × 106 W = 3 × 1 000 000 W = 3 000 000 W Estos prefijos no son exclusivos del SI. Muchos de ellos, así como la propia idea de emplearlos, son anteriores al establecimiento del Sistema Internacional en 1960; por lo tanto, se emplean a menudo en unidades que no pertenecen al SI. REFERENCIAS 13 ↑ Bureau International des Poids et Mesures. «Resolution 10 of the 22 nd meeting of the CGPM (2003) » (en inglés). Consultado el 2 de marzo de 2009. ↑ The International System of Units (SI) (8 edición). International Bureau of Weights and Measures (BIPM). 2006. p. 133. ↑ «NIST Guide to SI Units — Rules and Style Conventions ». National Institute of Standards and Technology (July 2008). Consultado el 29 de diciembre de 2009. Centro Español de Metrología. http://www2.cem.es:8081/cem/es_ES/documentacion/generales/SIU8edes.pdf Consultado el 15 de mayo de 2011.
ÁMBITO DE LA QUÍMICA CLÍNICA: Consideraciones importantes a tener en cuenta en el área de la química clínica: En el nombre “cantidad de sustancia”, las palabras “de sustancia” podrían reemplazarse por otras palabras que especificasen la sustancia o materia en cuestión para cada aplicación particular; así por ejemplo se podría decir “cantidad de ácido clorhídrico, ClH” o “cantidad de benceno, C6H6”. Es importante precisar la entidad en cuestión (como recomienda el segundo párrafo de la definición del mol), preferentemente indicando la fórmula química empírica del material en cuestión. Aunque la palabra “cantidad” tiene una definición más general en el diccionario, dicha abreviatura del nombre completo “cantidad de sustancia” se usa a veces por brevedad. Ello se aplica también a las magnitudes derivadas como la “concentración de cantidad de sustancia”, que puede denominarse simplemente “concentración de cantidad”. Sin embargo, en el campo de la química clínica, el nombre “concentración de cantidad de sustancia” se abrevia generalmente como “CONCENTRACIÓN DE SUSTANCIA”.
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Fuente: Extracto del Centro Español de Metrología. http://www2.cem.es:8081/cem/es_ES/documentacion/generales/SIU8edes.pdf Consultado el 15 de mayo de 2011.
UNIDADES PARA LA MEDICIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Ya se señaló que para acompañar al cambio a unidades SI se introdujeron algunos nuevos nombres de magnitudes. No son muchos; nombres como longitud, altura, área, volumen y velocidad siguen siendo los mismos. La mayoría de la nueva nomenclatura se refiere a la concentración y otras magnitudes relacionadas con ella. En relación con la concentración, existe la dificultad de que se puede expresar de varias maneras distintas. Por lo común, todas se englobaban en el término "concentración" lo que daba origen a confusiones, En la actualidad, cada manera diferente de decirla posee un nombre particular. Antes de describir los nuevos nombres es muy conveniente explicar acerca de la unidad de volumen llamada "litro", Lo más probable es que ya la conozca y le haya extrañado no encontrarla en la relación de las unidades SI derivadas. Esto obedece a que el litro, en rigor, no es una unidad SI. La unidad SI (derivada) de volumen es el metro cúbico, excesivamente grande para que convenga a la medición de los líquidos del organismo. Por esta razón se emplea un submúltiplo: el decímetro cúbico. Puesto que no se emplea en este manual, el prefijo "deci" no se incluyó en el cuadro correspondiente; indica una división entre 10 (o una multiplicación por 0,1, ó 10-1). Por lo tanto, un decímetro es 0,1 m, y un decímetro cúbico es 0,1 x 0,1 x 0,1 m3 = 0,001 m3 (ó 10-3 m3; es decir, la milésima parte de un metro cúbico). Aunque no forma parte del SI, la palabra "litro" se ha aceptado para utilizarla como nombre especial del decímetro cúbico. El litro y sus submúltiplos, como el mililitro (ml), se emplean para medir volúmenes relativamente pequeños de líquidos y, algunas veces, gases; por lo general, los volúmenes de cuerpos sólidos y los grandes volúmenes de gases y líquidos se miden en metros cúbicos o en uno de sus múltiplos o submúltiplos. El litro es una unidad sumamente importante, ya que se emplea en el laboratorio clínico para notificar todas las concentraciones y magnitudes conexas. Sin embargo, es posible que usted encuentre (por ejemplo, en los artículos de vidrio marcados con escalas de medición material de vidrio graduado-) volúmenes que se indican en submúltiplos del metro cúbico. Los submúltiplos equivalentes del metro cúbico y del litro se recogen en la Tabla 1.4. En ésta tabla figura un cuadro de equivalencias de los dos sistemas. Tabla 1.4 Unidades SI Derivadas para el Volumen Submúltiplos equivalentes del metro cúbico y el litro Nombre de Símbolo Equivalente Nombre de Símbolo Equivalente Equivalente la Unidad en metros la Unidad en litros (l) en mililitros cúbicos (m3) (ml) 3 Decímetro dm 0,001 litro l 1 1000 cúbico -------100 cm3 0,0001 decilitro* dl 0,1 100 ------10 cm3 0,000 01 Centilitro* cl 0,01 10 3 Centímetro cm 0,000 001 mililitro ml 0,001 1 cúbico Milímetro mm3 0,000 000 microlitro µl 0,000 001 0,001 cúbico 001 *Rara vez se utiliza en el laboratorio Después de estas explicaciones acerca del litro podemos volver a los nombres que se aplican a las distintas maneras de expresar la concentración. En primer lugar suponga que tenemos una solución salina. La masa de sal disuelta, dividida entre el volumen de la solución, recibe el nombre de concentración de masa. Se suele definir ésta como "la masa de un componente dado (por ejemplo, una sustancia disuelta) dividida entre el volumen de la solución". La unidad con que se
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mide es el gramo (o miligramo, microgramo, etc.) por litro. En el sistema SI es raro que se emplee la concentración de masa; se aplica únicamente a sustancias cuya masa molecular relativa ("peso molecular") es dudosa, como en el caso de las proteínas cuya masa molecular relativa es incierta. Suponga ahora que tenemos otra solución salina, pero esta vez la cantidad de sal disuelta se expresa como "cantidad de sustancia". La cantidad de sustancia salina (o sea el número de moles de sal) contenido en la solución y dividida entre el volumen de esta se denomina concentración de cantidad de sustancia o, más brevemente, concentración de sustancia. Se acostumbra definirla como "la cantidad de sustancia de un componente determinado (por ejemplo, una sustancia disuelta) dividida entre el volumen de la solución". La unidad con que se mide es el mol (o milimol, micromol, etc.) por litro. Cuando se utilizan unidades SI todas las concentraciones se expresan, siempre que es posible, como concentración de sustancia. El uso de concentración de sustancia en lugar de concentración de masa es la diferencia más importante entre el empleo de las unidades SI y las unidades tradicionales. En el sistema tradicional, concentración de masa se usaba de modo casi exclusivo (si bien no se denominaba "concentración de masa", que es un nombre relativamente nuevo). Sin embargo, en el sistema tradicional no siempre se expresaba la concentración de masa "por litro". Algunas veces se utilizaba esta expresión, y otras, "por 100 ml" (es decir, por 100 mililitros, ó 1/10 de litro) o "por mililitro". Países distintos (y aún laboratorios distintos, en el mismo país) adoptaban prácticas diferentes, creando serias confusiones. Con las partículas o entidades que no se disuelven no es posible usar la concentración de masa ni la concentración de sustancia; se debe emplear otra magnitud. Por ejemplo, el torrente sanguíneo contiene varias clases de células. Todas se encuentran suspendidas en la sangre y es necesario disponer de una manera de expresar el número de células que hay en cada litro de sangre. En este caso el nombre de la magnitud es concentración de número, y se define como "el número de partículas o entidades especificadas en una mezcla, dividido entre el volumen de ésta". La unidad con que se mide la concentración de número es el número por litro. En el sistema tradicional la concentración de número se denominaba "recuento" y se expresaba mediante la unidad conocida como "número por milímetro cúbico". Algunas veces la magnitud que interesa no es el número real de células por litro (concentración de número), sino la proporción de un tipo determinado de ellas, o sea la fracción del número total formada por las células de ese tipo, Esta magnitud se denomina fracción de número y la unidad con que se mide es 1 (unidad, "uno"). A primera vista esto puede parecer relativamente confuso, pero en verdad es muy sencillo. La unidad, que es el número "uno", es el todo; 0,5 es la mitad, 0,2 la quinta parte, 0,25 la cuarta parte, 0,1 la décima parte y así sucesivamente. Por ejemplo, en la sangre hay cinco tipos de leucocitos (glóbulos blancos). Sus respectivas fracciones de número podrían ser 0,45, 0,35, 0,10, 0,08 y 0,02. (Si usted suma estas fracciones observará que el resultado es 1,0, es decir, el todo.) En el sistema tradicional esta magnitud carecía de nombre y los resultados se expresaban como porcentajes y no como fracciones. Por ejemplo, una fracción de número de 0,5 era 50% y una de 0,08 era 8%. Usted advertirá en esto que el porcentaje dividido entre 100 corresponde a la fracción de número. Otra magnitud que se mide por la unidad "uno" es la fracción de volumen. Se define como el volumen de un componente especifico en una mezcla, dividido entre el volumen total de ésta. En otras palabras, si todo el volumen que ocupan los eritrocitos (glóbulos rojos) en 1 litro (1000 ml) de sangre es 450 ml, la fracción de volumen de los eritrocitos será 450/1000 = 0,45. La fracción de volumen de los eritrocitos es importante para el diagnóstico de numerosas enfermedades y usted habrá de medirla frecuentemente en el laboratorio. Por esta explicación se deberá de percatar que la fracción de número es "número por un número" y la fracción de volumen es "volumen por un volumen"; es decir que ambas son proporciones. Por conveniencia se dice que la unidad que expresa una proporción es "uno". En las páginas siguientes se muestra un cuadro de nombres de magnitudes nuevos y tradicionales, y de unidades SI y tradicionales, con factores de conversión de unas a otras. (Tabla 1.5). Tabla 1.5 nueva Nomenclatura de Magnitudes, Unidades SI, equivalentes tradicionales y Factores de Conversión Nomenclatura Nueva nomenclatura de Unidades Factores de conversión y Unidades SI tradicional de magnitudes tradicionales ejemplos*a magnitudes Sin factor de conversión: Concentración de número de número de eritrocitos 12 3 no. x 10 /l Recuento de eritrocitos millones/mm eritrocitos (véase sección 9.5) 4,5 millones/mm3 = 4,5 x 1012/l; 5,0 x 1012/l = 5,0 millones/mm3 Volumen de sedimentación globular Volumen de 38% x 0,01 = Fracción de volumen Fracción de volumen de 1 sedimentación globular % de eritrocitos = 0,38; eritrocitos (véase sección 9.4) o hematocrito Fracción de volumen de eritrocitos = 0,40 x 100 = 40% Concentración de número de Recuento de leucocitos 8000/mm3 x 0,001 = 8,0 x 109/l; leucocitos (sangre) (véase no. x 109/l no./mm3 (sangre) 7,5 x109/l x 1000 = 7500/mm3 sección 9.6) Concentración de número de Sin factor de conversión: Recuento de leucocitos leucocitos (LCR) (véase no. x 106/l no./mm3 27/mm3 = 27 x 106/l; (LCR) sección 8.3.3) 25 x 106/l = 25/mm3 Fracción de número del tipo Linfocitos 33% x 0,01 = fracción de de leucocitos (sangre y LCR) Recuento diferencial de número de linfocitos 0,33 (p. ej., fracción de número de 1 leucocitos (p. ej., % Fracción de número de linfocitos linfocitos) (véanse secciones linfocitos) 0,33 x 100 = linfocitos 33% 9.13 y 8.3.3) Concentración de número de Recuento de 86000/mm3 x 0,001 = 86,0 x 109/l; reticulocitos (véase sección no. x 109/l no./mm3 reticulocitos 91,5 x 109/l x 1000 = 91500/mm3 9.12) 0,50% x10 = 5 x 10-3; Fracción de número de 12 x 10-3 x 0,1 = 1,2%; Recuento de reticulocitosb (véase sección no. x 10-3 % ó‰ ó reticulocitos 9.12) 5‰ = 5 x 10-3 12 x 10-3 = 12 ‰ 9 3 Concentración de número de no. x 10 /l Recuento de no./mm 220000/mm3 x 0,001 = 220 x 109/l;
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trombocitos (plaquetas) (véase sección 9.14)
trombocitos o recuento de plaquetas Glucosa, concentración de masac (sangre y LCR)
Glucosa, concentración de sustancia (sangre y LCR) (véase sección 9.14)
mmol/l
Hemoglobina (Fe), concentración de sustancia (véase sección 9.3)
mmol/l
Hemoglobina, concentración de masa (véase sección 9.3)
g/l
Hemoglobina (Fe) media en eritrocitos, concentración de sustancia (véase sección 9.4)
mmol/l
Hemoglobina media en eritrocitos, concentración de masa (véase sección 9.4)
g/l
Proteínas, concentración de masa LCR) (véase sección 8.3.5)
g/l
Proteínas, concentración de masac
mmol/l
Urea, concentración de masac Nitrógeno de ureae, concentración de masa
Urea, concentración de sustancia (sangre) (véase sección 10.2)
hemoglobina, concentración de masac hemoglobina, concentración de masac Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media (v.g., concentración de masa)d Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media (v.g., concentración de masa)
250 x 109/l x 1000 = 250000/mm3
mg/100ml
g/100ml
81 mg/100ml x 0,0555 = 4,5 mmol/l; 4,2 mmol/l x 18,02 = 75,7 mg/100ml Hb 13,7 g/100ml x 0,621 = Hb (Fe) 8,5 mmol/l; Hb (Fe) 9mmol/l x 1,61 = Hb 14,5 g/100ml
g/100ml
14,8 g/100 ml x 10 = 148 g/l; 139 g/l x 0,1 = 13,9 g/100ml
%e
35% x 0,621 = 21,7 mmol/l; 22 mmol/l x 1,611 = 35,4%
%e
35% x 10 = 350 g/l 298 g/l x 0,1 = 29,8%
mg/100ml g/l mg/100ml mg/100ml
25 mg/100ml x 0,01 =0,25 g/l; 0,31 g/l x 100 =31 mg/100ml Sin cambio 15 mg/100 ml x 0,167 = 2,5 mmol/l; 2.9 mmol/l x 6,01 = 17,4 mg/100ml Nitrógeno de urea, 7 mg/100ml x 0,357 = urea 2,5 mmol/l
LCR: Líquido Cefalorraquídeo *a En estos ejemplos se indica primeramente la conversión de valores numéricos reales, en unidades tradicionales, a valores en unidades SI, y seguidamente la conversión de unidades SI a unidades tradicionales. Los factores de conversión se han subrayado. b En este caso la fracción de número no se anota como fracción de 1, sino de 1000, a fin de evitar valores numéricos demasiado pequeños e inconvenientes. c Se acostumbraba medir efectivamente la concentración de masa, aunque por lo general no se empleaba esta denominación. d La concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) se expresaba algunas veces como fracción decimal en vez de porcentaje; por ejemplo, 0,35 en lugar de 35%. En este caso cada uno de los factores de conversión anotados se debe multiplicar por 100 o dividir entre 100, como se indica en los ejemplos siguientes: 0,35 x 62,1 =21,7 mmol/l 22 mmol/l x 0,01611 = 0,354 0,35 x 1000 =350 g/l 298 g/l x 0,001 =0,298 e En el sistema tradicional unas veces se hacía referencia a la urea como tal y otras como nitrógeno de urea (es decir, el contenido de nitrógeno de la urea). En el cuadro se incluye una conversión de ambos sistemas.
-----------------------------------------------------------------------------AGREGADO: LITRO El litro (símbolo l o L) es una unidad de volumen equivalente a un decímetro cúbico (1000 cm³). Su uso es aceptado en el Sistema Internacional de Unidades (SI), aunque ya no pertenece estrictamente a él. Fue adoptado por la Oficina Internacional de Pesos y Medidas en 1879. En 1901 fue descrito como el volumen ocupado por una masa de 1 kg de agua pura en su máxima densidad y a presión normal (a 4 °C y 1 atm respectivamente). Esta definición fue derogada en 1964 porque el litro difería del decímetro cúbico en aproximadamente 28 partes por millón, induciendo a error en las mediciones que requieren bastante precisión. Actualmente sólo es usado como un nombre especial del decímetro cúbico. Es la única unidad que posee doble símbolo reconocido (l o L). El símbolo original es "l", debido a que los símbolos de las unidades se escriben en minúscula (excepto aquellas que provienen de nombre propio). No obstante, en el año 1979 se adoptó el símbolo alternativo "L" para disminuir el riesgo de confusión entre la letra l y el número 1 en ciertas tipografías. Antes de 1979 se usaba ℓ que todavía está presente en el uso, aunque no en la norma. PREFIJOS DEL SI APLICADOS AL LITRO El litro puede ser usado con cualquier prefijo del SI. El más frecuentemente usado es el mililitro, definido como la milésima parte del litro (un centímetro cúbico). Otras unidades pueden verse en la tabla, las más frecuentes en negrilla. Múltiplos del Sistema Internacional para litro (l) Submúltiplos Múltiplos Valor Símbolo Nombre Valor Símbolo Nombre 10−1 l dl decilitro 101 l dal decalitro −2 2 10 l cl centilitro 10 l hl hectolitro mililitro o centímetro 10−3 l ml 103 l kl kilolitro o metro cúbico cúbico 10−6 l µl microlitro 106 l Ml megalitro −9 9 10 l nl nanolitro 10 l Gl gigalitro 10−12 l pl picolitro 1012 l Tl teralitro −15 15 10 l fl femtolitro 10 l Pl petalitro −18 18 10 l al attolitro 10 l El exalitro −21 21 10 l zl zeptolitro 10 l Zl zettalitro 10−24 l yl yoctolitro 1024 l Yl yottalitro Prefijos comunes de unidades están en negrita.
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REFERENCIAS Non-SI units accepted for use with the SI by the CIPM http://physics.nist.gov/Pubs/SP811/sec05.html#table6 ------------------------------------------------------------------------------
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Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud
OMS PARTE 1
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2. MONTAJ E DE UN LABORATORIO DE SALU D PERIF ÉRICO 2.1 PLANO DE UN LABORATORIO MÉDICO PERIFÉRICO 2.1.1 EL LABORATORIO DE UNA SOLA HABITACIÓN
L
a figura 2.1 presenta la posible distribución del espacio de un laboratorio médico periférico anexo a un centro de salud. Se muestra un laboratorio adecuado para llevar a cabo todas o algunas de las técnicas descritas en el manual. El plano se limita a una habitación, ya que, con frecuencia, éste es todo el espacio que está disponible para el laboratorio. La habitación deberá medir, por lo menos, 5 m x 6m. La figura 2.2 Indica otra posible distribución para la instalación de un laboratorio periférico. Es obvio que puede ser modificado para adaptarse a las diferentes circunstancias.
Figura 2.1 Plano para un laboratorio de una sola habitación. En esta imagen aparecen las distintas áreas con sus respectivos nombres en inglés provenientes de la versión inglesa del manual de la OMS. Explicación en castellano de cada una de las áreas: A) Sala de espera; 1) Asientos para los pacientes ubicados en la sala de espera; 2) Área de registro de los datos; 3) Autoclave; 4) Área para el lavado de los utensilios de vidrio del laboratorio; 5) Recibo de las muestras; 6) Cubo de basura; 7) Fregaderos; 8) Área para la realización de los exámenes de las muestras de orina; 9) Área para la realización de los exámenes de las muestras de materia fecal; 10) Microscopio (área destinada para la observación microscópica); 11) Ventana; 12) Frigorífico; 13) Área destinada para la extracción de las muestras de sangre; 14) Área destinada para las tinciones; 15) Armario. (A los fregaderos se los denomina también "Bachas” en Hispanoamérica, término que no aparece en el DRAE); Al frigorífico también se lo denomina refrigerador, nevera o heladera en los países hispanoamericanos. La ventana es esencial para la luz y el aireamiento, la luz cuando en el laboratorio trabajan con un microscopio óptico sin lámpara de luz eléctrica incorporada (con espejo). Las flechas señalan el trayecto por donde los pacientes ingresarán y se dirigirán hacia el lugar en donde se practica la flebotomía. DRAE: Diccionario de la Real Academia Española.
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Figura 2.2 Plan alternativo para un laboratorio de una sola habitación. A) Asientos para los pacientes. 1) Mesa para los pacientes externos ambulatorios; 2) Centrífuga manual; 3) Microscopios; 4) Área de hematología; 5) Colorímetro; 6) Baño maría; 7) centrífuga eléctrica; 8) Área de serología de la sífilis y bioquímica; 9) Frigorífico para reactivos; 10) Estante para los reactivos 11) Estante para los utensilios de vidrio; 12) Balanza; 13) Cubeta para tinciones; 14) Área para el examen de las muestras de esputo; 15) Mechero Bunsen; 16) Fregaderos; 17) Vertedero de desechos; 18) Cama para los pacientes; 19) Área de registro de los datos; 20) Área para la preparación de las muestras de materia fecal para su posterior examen; 21) Área para la preparación de las muestras de orina para su posterior examen; 22) Área de recepción de las muestras; 23) Cilindro de gas. (En la figura, el cilindro de gas se muestra conectado al mechero Bunsen). La cama para los pacientes en algunos lugares puede ser usada para eventuales donadores de sangre. Con respecto al cilindro de gas, el recipiente contenedor llamado cilindro también es denominado garrafa o bombona (Arg., Bol. y Ur.) la cual designa a una "vasija metálica muy resistente, de forma cilíndrica o acampanada y cierre hermético. Sirve para contener gases a presión y líquidos que, por ser muy volátiles, originan grandes presiones si se impide la salida del vapor” (DRAE). Colorímetro: En la actualidad, varios lugares ya cuentan con espectrofotómetros capaces de leer en el espectro visible y el ultravioleta, aunque a veces, aún persiste el uso de los fotocolorímetros. 2.1.2 LABORATORIO DE DOS HABITACIONES En algunos lugares alejados también se realizan transfusiones sanguíneas en un laboratorio, es decir, el espacio físico del laboratorio es aprovechado en estos casos cuando no hay otro lugar al cual recurrir. Si se cuenta con dos habitaciones se recomienda que el servicio de transfusión sanguínea se organice en la segunda habitación. En otros lugares, el paciente a ser transfundido es derivado hacia un centro de mayor complejidad para realizarle la transfusión, por ende, no se realiza en el laboratorio periférico. Si no existe este servicio de transfusión, y si éste laboratorio cuenta con dos habitaciones, y si éstas dos habitaciones están disponibles, se recomienda que la segunda se use para el lavado y la esterilización. Los materiales sucios y/o contaminados se deberán eliminar del lugar de trabajo del laboratorio con toda la rapidez posible con el fin de proteger la salud de los operadores, esto es, para su seguridad, y asimismo, evitar confusiones (errores) o contaminaciones cruzadas. 2.2 ELECTRICIDAD Un suministro de energía fiable debe estar disponible para asegurar la continuidad de los trabajos en el laboratorio. La energía puede ser proporcionada por las siguientes fuentes: -Red eléctrica -Grupos electrógenos -Sistema de suministro de energía solar (energía lumínica). Los laboratorios ubicados en lugares remotos a menudo tienen problemas a la hora de asegurar un suministro continuo
de energía eléctrica y pueden generar electricidad mediante el uso de un generador local (grupo electrógeno) o un 13 sistema de suministro de energía solar (véase ilustración anexa A). 2.2.1 FUENTES DE ELECTRICIDAD GENERADORES La energía eléctrica puede ser proporcionada por un generador que funcione con combustible (grupo electrógeno a gasolina, keroseno, gas propano/butano.) Es posible utilizar el motor de combustión del motor de un automóvil o un sistema generador de electricidad diseñado exclusivamente para ello (construido expresamente para generar energía eléctrica, como los grupos electrógenos.) Un generador de electricidad construido exclusivamente para producir electricidad produce una corriente alterna de 110 voltios (V) o 220 V y normalmente puede generar más energía que el motor de un vehículo. El motor de un vehículo proporciona una corriente continua de 12 V o 24 V, que puede ser introducida o inyectada en las baterías recargables (véase más adelante). El tipo de corriente disponible limitará la selección de equipos de laboratorio, por ejemplo, un instrumento que requiere corriente continua puede ser alimentado con energía a partir de: -Baterías -Una red de corriente continua con un transformador -Una red de corriente alterna con un convertidor. La instalación de una red de corriente continua es simple, de funcionamiento fiable y seguro de utilizar. Sin embargo, para los instrumentos que requieren una baja tensión (6 V, 12 V o 24 V) de corriente continua, la alta tensión producida por la red de corriente continua debe ser convertida por medio de un transformador. Alternativamente, para los instrumentos que requieren corriente alterna (110 V, 220 V o 240V), la corriente continua debe ser convertida en corriente alterna por medio de un inversor u ondulador. Los inversores u onduladores son pesados y caros y se producen pérdidas significativas de energía en el proceso de conversión. Por tanto, es preferible utilizar cualquiera de los aparatos de corriente continua o alterna, dependiendo de su oferta y suministro, y evitar la necesidad de la conversión. Si no hay ningún generador disponible o si una fuente de alimentación de red eléctrica está accesible, pero la corriente eléctrica suministrada por esta red fluctúa o es propensa a las averías frecuentes, puede ser preferible escoger un suministro de energía solar (véase más adelante). SISTEMAS DE SUMINISTRO DE ENERGÍA SOLAR (SISTEMAS FOTOVOLTAICOS) Un laboratorio que cuenta con unos pocos instrumentos con bajos requerimientos de energía puede funcionar con un pequeño suministro de energía. Para los laboratorios ubicados en áreas remotas, un sistema de abastecimiento de energía solar puede ser más conveniente que un generador, puesto que no hay problemas de abastecimiento de combustible y puede ser fácil de mantener. Un sistema de suministro de energía solar tiene tres componentes: - Un panel solar (o varios paneles solares) - Un regulador de carga electrónico - Baterías. PANELES SOLARES Dos tipos diferentes de paneles solares están disponibles comercialmente: -Paneles con células de silicio cristalino -Paneles con células de silicio amorfo. Los paneles de silicio amorfo son menos costosos, pero producen energía solar con menos eficiencia que los paneles de silicio cristalino. Los paneles solares deben ser instalados de tal manera que estén expuestos a la luz directa, ya que ubicados en un lugar con sombra reducen la eficiencia de la producción de energía. Deben ser inclinados con un ángulo de 15°. La parte inferior del panel debe estar libremente ventilada. La distancia mínima de la parte inferior del panel a partir de la superficie de la construcción de soporte debe ser mayor a 5 cm para evitar el calentamiento del panel, porque este calentamiento reduce la eficacia de la producción de energía. REGULADORES DE CARGA ELECTRÓNICOS Un regulador de carga controla la carga y descarga de las baterías de forma automática. Cuando el voltaje de la batería cae por debajo de un valor umbral durante la descarga, el instrumento de laboratorio se desconecta de la batería. Por otra parte, si el voltaje aumenta por encima de un valor umbral (por ejemplo, cuando la batería se recarga), el panel solar se desconecta de la batería. Un buen regulador de carga adapta la tensión máxima de la batería para el cambio en la temperatura del medio ambiente. Esto evita la pérdida de agua de la batería por evaporación. Es importante tener un regulador de carga de repuesto en stock en caso de avería. El regulador de carga elegido debería ser estable en condiciones tropicales. Es aconsejable elegir un regulador de carga con una pantalla digital integrada que permite que la carga de la batería sea monitorizada fácilmente.
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5 Ilustración anexa A. Grupos electrógenos portátiles. 1) Grupo electrógeno a gas; 2) Grupo electrógeno a gasolina. Paneles solares. 3) Una instalación de 24 paneles solares en una zona rural de Mongolia; 4) Un panel solar o módulo fotovoltaico está compuesto de células fotovoltaicas individuales. Este panel de silicio cristalino tiene un marco de aluminio y vidrio en la parte delantera; 5) Diagrama esquemático que explica el uso de la energía solar la cual es captada por un panel solar que la transforma en energía eléctrica; la electricidad generada es usada para diversos fines como se aprecia en la ilustración. BATERÍAS BATERÍAS DE PLOMO Los sistemas de energía solar requieren baterías recargables, que pueden ser o bien de plomo o de níquelcadmio (Ni-Cd). Las baterías de plomo son las preferidas y muchos tipos están disponibles comercialmente (véase la Tabla 2.1). Las baterías de alta eficiencia tienen ventajas prácticas, aunque son más caras que las baterías normales. Al adquirir baterías, elija baterías de 12 V con la más alta capacidad (1000 amperios-hora (Ah)). Existen varios tipos de baterías de plomo libres de mantenimiento que están disponibles comercialmente, pero son caras y menos eficientes que las que requieren mantenimiento. El desarrollo de este tipo de batería todavía está en marcha, pero no ha sido probado a fondo en los climas tropicales. Por lo tanto, las baterías libres de mantenimiento no se recomiendan. TRANSPORTE DE BATERÍAS DE PLOMO Las baterías de plomo deben ser vaciadas antes de ser transportadas. Es importante recordar que si las baterías de plomo se van a transportar por aire deben estar vacías de solución de electrolitos, que debe ser reemplazado cuando lleguen al destino. Tabla 2.1 Especificaciones de las baterías usadas para el suministro de energía solar Tipo de batería Especificación
NíquelCadmio
Plomo- calcio antimonio (2%)
Plomo-calcio antimonio (6%)
Plomo-calcio
Tipo de electrolito
Líquido
Líquido
Líquido
Líquido
Máximo de descarga
100%
80%
80%
50%
Descarga durante el funcionamiento normal
20%
20%
20%
20%
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Tensión / celda
1,2 V
2V
2V
2V
Tasa de Auto-descarga
Elevada
Baja
Media
Baja
Rellenado requerido
Mínimo
Infrecuente
Frecuente
Infrecuente
Costos de capital
Alto
De valor medio
De valor medio
Bajo
Aptitud para el uso fotovoltaico
Altamente recomendada
Altamente recomendada
Recomendada
No recomendada
MANTENIMIENTO DE LAS BATERÍAS DE PLOMO La descarga diaria de las baterías de plomo no debe exceder del 20% de la capacidad de las baterías, de lo contrario la vida útil de las baterías (normalmente de unos 1100 ciclos de recarga), se acortará. Si las baterías se descargan repetidamente a 40% de su capacidad, tendrán una duración de sólo alrededor de 600 ciclos. (Hay disponibles algunas baterías especiales de plomo que pueden ser descargadas en un 40%, pero tendrán una duración de alrededor de 3000 ciclos de recarga.) Para el mantenimiento del nivel de fluido deben ser revisadas periódicamente y cuando sea necesario rellenarlas con agua destilada de la que se utiliza para las baterías de automóvil. Las baterías de alta eficiencia no pueden ser reemplazadas por las baterías de automóvil normales en caso de una avería. Cuando sólo estén disponibles baterías de automóvil para reemplazar una batería de alta eficiencia defectuosa, todas las baterías en el sistema de almacenamiento de energía deben ser reemplazadas con baterías de vehículo. BATERÍAS DE NÍQUEL - CADMIO (Ni-Cd) Las baterías de Ni-Cd pueden recargarse mediante un panel solar. Algunas baterías de Ni-Cd son del mismo tamaño, pero tienen diferentes capacidades. El tamaño de batería AA de Ni-Cd está disponible con una capacidad de 0,5 Ah hasta 0,7 Ah. Elija las baterías con mayor capacidad. En cuanto a las baterías pequeñas de Ni-Cd, tipo AAA hasta la D, para su uso en instrumentos de laboratorio, se deben recargar con antelación para permitir la operación continua en un laboratorio. La vida útil de las baterías de Ni-Cd puede ser de 1000 ciclos de recarga, en función de su calidad. MANTENIMIENTO DE LAS BATERÍAS DE Ni-Cd Las baterías de Ni-Cd parecen funcionar de forma poco fiable en los países tropicales. Esta aparente falta de fiabilidad es causada por un aumento de la frecuencia de descarga en lugar de una recarga ineficiente de la batería a temperaturas ambiente elevadas (ver más abajo). Tales problemas pueden superarse parcialmente como sigue: ● La batería de Ni-Cd debe recargarse a una temperatura ambiente baja (por ejemplo, en el frigorífico o en una caja especialmente construida para la recarga) poco antes de ser utilizada. (Por ejemplo, sólo el 62% de la energía puede estar disponible a partir de una batería de Ni-Cd que se cargó a 40 ºC) ● Las baterías de Ni-Cd recargadas se deben almacenar en un lugar fresco y seco para reducir al mínimo la tasa de autodescarga. (Por ejemplo, una batería de Ni-Cd almacenada durante 2 semanas a 40 °C tendrá una capacidad residual de sólo 32%.) La alta humedad también acelerará la auto-descarga de la batería. 2.2.2 INSTALACIÓN DE UN EQUIPAMIENTO ELÉCTRICO SIMPLE Si el laboratorio tiene un suministro de electricidad, de los siguientes equipos se pueden utilizar: -Una lámpara eléctrica para el microscopio (una iluminación estable hace que el ajuste sea más fácil); -Centrifuga eléctrica (mucho más rápida que la del tipo de accionamiento manual o centrífuga manual); -Una centrífuga de microhematocrito (para la detección de la anemia); -Un espectrofotómetro o colorímetro (permite la estimación exacta de la hemoglobina); -Un baño maría, un frigorífico, un esterilizador eléctrico, etc. Puede que tenga que realizar conexiones simples o reparaciones a este equipamiento en el laboratorio. Las explicaciones dadas a continuación están destinadas a ayudar al técnico de laboratorio para hacer esto y se limitan a los pasos a seguir en cada caso. Las personas sin experiencia deben comenzar por la realización de los procedimientos en presencia de un instructor. El contador de corriente eléctrica (Fig. 2.3) Un medidor mide la electricidad y registra la cantidad de electricidad utilizada. Indica: -La tensión, medida en voltios (220 V, 110 V, etc.); -La fuerza de la corriente, medida en amperios (A); -La frecuencia de la corriente alterna, por ejemplo 50 Hertz (Hz) (ciclos por segundo). Algunos tipos de medidores tienen interruptores o botones: - Un interruptor que gira el cual puede ser girado en un sentido para cortar el suministro de electricidad a todo el edificio (fusible principal de la red eléctrica) y girado en el otro sentido para restaurar el suministro; - Un botón rotulado "OFF" (apagado) que se puede presionar para cortar el suministro de electricidad; - Un botón rotulado "ON" (encendido) que se puede presionar para restablecer el suministro eléctrico. El interruptor de giro u botón "OFF" también actúa como un interruptor de circuito, automáticamente corta la corriente cuando el circuito está sobrecargado. Cuando esto sucede, en primer lugar se debe encontrar y corregir la falla que causó el corte, y a continuación, pulse el botón "ON" o active el interruptor para restablecer la corriente. INSTALACIÓN DE EQUIPAMIENTO ELÉCTRICO NUEVO
VOLTAJE Compruebe que la tensión indicada en el instrumento es la misma que la de su suministro de electricidad. El instrumento tiene una etiqueta que indica la tensión con la que debe ser utilizado. El voltaje de la corriente eléctrica está marcado en el medidor de electricidad. EQUIPO DE DOBLE VOLTAJE Los instrumentos de doble voltaje se pueden usar con dos fuentes de voltaje diferentes. Hay un dispositivo en el instrumento que le permite seleccionar el voltaje adecuado, es decir, el voltaje marcado en el contador de corriente eléctrica. Dependiendo del instrumento, este dispositivo puede ser: -Una palanca o interruptor que puede ser movido a la posición de 110 V o a la posición de 220 V (Fig. 2,4 (a)); -Un enchufe sin cables que se puede transferir desde la posición 110 V a la posición 220 V (Fig. 2,4 (b)); -Un tornillo que se puede girar a la posición de 110 V o a la posición de 220 V (Fig. 2,4 (c)).
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Figura 2.3 Un contador o medidor de corriente eléctrica
Figura 2.4 Instrumentos de doble voltaje
LA POTENCIA ELÉCTRICA DEL INSTRUMENTO La energía eléctrica se mide en vatios (W) y está marcado en la placa que indica la tensión correcta para su instrumento. Cada pieza del equipo eléctrico en el laboratorio utiliza una cierta cantidad de energía. La potencia total utilizada en un momento dado no debe exceder la potencia de la fuente de electricidad. Usted puede calcular la cantidad de energía disponible a partir de las cifras que aparecen en el medidor: multiplicar el voltaje (V) por la corriente (A). Por ejemplo, si el voltaje es de 220 V y la corriente es 30 A, la energía eléctrica suministrada será 220 x 30 = 6.600 vatios o 6,6 kW. (kW= kilovatios.) USO DE UN TRANSFORMADOR Si un instrumento se ha construido para emplearlo con una tensión diferente a la del circuito del laboratorio, éste instrumento se deberá usar con un transformador. Por ejemplo, si una centrífuga adquirida sólo funciona a 110 V y la tensión de la corriente eléctrica es de 220 V, pida un transformador de 110-220 V, indicando la potencia de la centrífuga. Conecte la centrífuga en la conexión de 110 V del transformador suministrado, a continuación, conecte el cable de 220 V del transformador a la red eléctrica de laboratorio (toma de pared). APAGADO DE LOS EQUIPOS ELÉCTRICOS Una vez que se ha apagado un instrumento eléctrico se debe desenchufar del contacto de pared. Si se deja enchufado puede causar un incendio.
1 2 Imágenes de transformadores. 1) Transformador Elevador De Tensión 100 W Entrada 110 V Salida 220 V con botón; 2) Transformador 110 V- 220 V, otro modelo; 3) Ilustración de un transformador de 110 V a 220 V, donde por un extremo se enchufa el aparato que funciona con 110 V y por el otro se enchufa el cable del transformador a una toma de pared (220 V). Ambos voltajes están indicados en la figura. 3
17 2.2.3 QUE HACER EN CASO DE FALLA ELÉCTRICA Si uno de los instrumentos eléctricos deja de funcionar, examínense: Los fusibles El enchufe que se encuentra en el extremo del cable El cable El contacto de pared La tensión del instrumento y la de la fuente de electricidad. ANTES DE HACER ALGO, CORTE LA CORRIENTE: Oprimiendo el botón del interruptor que indica "OFF” (apagado) en el medidor de electricidad o jalando la palanquita del interruptor hacia OFF en otros modelos, o bien, Quitando el fusible del suministro de corriente (Figura 2.5) HERRAMIENTAS ÚTILES (Figura 2.6) ● Destornillador ● Pinzas para cortar cable o alambre ● Alicates de picos chatos o piramidales ● Alambre para fusible ● Piezas de repuesto: enchufes, interruptores, etc.
Figura 2.5 Figura 2.6 Figura 2.5 Quitar el fusible de red Figura 2.6 Herramientas para el trabajo eléctrico CAMBIO DE FUSIBLE Levántese la tapa de la caja del fusible. Si el fusible es de tornillos, el alambre se encontrará extendido entre dos de ellos. Si el alambre se ha roto o fundido la corriente eléctrica no podrá pasar; el fusible se ha quemado. Aflójense los dos tornillos (Fig. 2.7). Quítese el alambre averiado. Sustituya el alambre averiado con alambre nuevo para fusible, del mismo calibre (grosor), o más delgado si no se consigue alambre del mismo grosor. Monte el alambre dándole forma de "S", con una vuelta en cada extremo. Si el fusible es de tornillos, el alambre deberá pasar debajo de las pequeñas arandelas protectoras. Si el fusible es de dos clavijas, móntese el alambre en la base de éstas y apriétense las clavijas con alicates (Fig. 2.8). Después de arreglar el fusible revísese todo el circuito antes de conectar nuevamente la corriente eléctrica. EL ENCHUFE COMPROBACIÓN DEL ENCHUFE Desmonte el enchufe que se encuentra en el extremo del cable si sospecha que de ahí proviene la falla. Existen muchos tipos diferentes de enchufes. Algunos tienen un tornillo externo que se puede aflojar. ENCHUFE DE DOS CLAVIJAS (Figura 2.9) Dentro del enchufe las dos líneas del cable se montan en las terminales (T) de las clavijas (C). Compruebe que los tornillos de las terminales estén suficientemente apretados. A veces esto es todo lo que se necesita hacer para arreglar un enchufe. INSTALACIÓN DE UN NUEVO ENCHUFE Para montar un nuevo enchufe, sepárese 1 - 1,5 cm del material aislante de cada uno de los dos cordones que componen el cable. Para lograrlo raspe con una navaja, aunque con el debido cuidado de no averiar los alambres que se encuentran dentro de las envolturas de material aislante. (También, en lugar de una navaja se puede usar un cúter o un pelacables.) Tuerza el extremo de cada alambre desprovisto de su envoltura aislante, formando en cada uno un cabo compacto que entre sin dificultad en la terminal correspondiente con el tornillo aflojado. (Fig. 2.10.) Introduzca cada extremo expuesto de los alambres en la respectiva terminal del enchufe. Apriete los tornillos y coloque las terminales en su sitio (Fig. 2.11). Los tornillos en las terminales deberán retener los alambres con firmeza; compruebe si están bien fijados tirando de los alambres suavemente. ENCHUFE DE TRES CLAVIJAS (Figura 2.12) Dos de las clavijas de estos enchufes se conectan a la corriente eléctrica; una es "viva” y la otra "neutral”. La tercera, que generalmente se encuentra en medio, se conecta a la "tierra”. Es sumamente importante que cada uno de los tres alambres del cable se conecte a la clavija apropiada y habitualmente con el enchufe vienen instrucciones que se deben cumplir estrictamente. A la menor duda, consúltese un electricista. El alambre de tierra del cable está envuelto en material aislante de color verde o verde y amarillo (T). Proporciona un escape a la corriente eléctrica en caso que haya un aislamiento defectuoso, evitando que pase por el cuerpo humano. VERIFICACIÓN DEL CABLE Y DEL INTERRUPTOR
EL CABLE (CONDUCTOR ELÉCTRICO PRINCIPAL) Si el cable se quema o se rompe, éste debe ser reemplazado. En todo caso, pídase al electricista que haga la conexión según los reglamentos de seguridad vigentes. INTERRUPTORES Existen muchos tipos diferentes de interruptores. Si se desea confirmar que funcionen adecuadamente se deben desatornillar y abrir. Cerciórese que los dos alambres del cable de entrada y los dos de salida se encuentren firmemente montados en sus respectivas terminales por medio de los tornillos 1, 2, 3 y 4 (Fig. 2.13). EXTENSIÓN ELÉCTRICA Una extensión eléctrica es un cable provisto de un enchufe macho (M) en un extremo y una entrada hembra (H) en el
otro. La entrada hembra se conecta al cable principal por medio de dos terminales que posee en su interior, exactamente 18 igual que el enchufe macho normal. La extensión eléctrica también recibe distintos nombres en varios países de habla hispana. Ejemplos de esto se tiene alargador eléctrico, prolongador eléctrico, extensión eléctrica o alargue. Cuba, y México Alargador (pieza para alargar) (DRAE). En Argentina, alargador, prolongador, alargue; España, prolongador. En varios de estos países casi no hay confusión sobre su significado. De todas maneras, Un alargador eléctrico, prolongador eléctrico, extensión eléctrica o alargue es un trozo de cable eléctrico flexible, con un enchufe en uno de sus extremos y una o varias tomas de corriente en el otro (normalmente del mismo tipo que el enchufe). El término se usa habitualmente para extensiones de cable eléctrico para uso doméstico, pero también es válido para referirse a otro tipo de extensiones de cable (de red, telefónico, cable USB,...). Si el enchufe o conector de uno de los extremos es de un tipo diferente al del los otros extremos, más que un alargador debe llamarse un cable adaptador. COMPROBACIÓN DE LA TOMA DE CORRIENTE CONTACTOS DE PARED Para revisar un contacto de pared enchúfese una lámpara que se encuentre en buenas condiciones de funcionamiento. Algunos contactos están provistos de un pequeño fusible que se puede sustituir. En caso contrario conviene conseguir un electricista para reparar el contacto de pared. PRECAUCIONES ALGUNAS COSAS QUE NUNCA SE DEBEN HACER 1. Nunca desarme los aditamentos eléctricos sin cortar antes la corriente. 2. Nunca toque los equipos eléctricos con las manos húmedas (el agua es un conductor excelente de la electricidad). 3. Nunca enchufe una pieza nueva de equipo eléctrico en los contactos de pared sin haber leído antes la laminilla correspondiente para tener la seguridad de que el voltaje que se indica en ella es igual al del circuito del laboratorio (110 V, 220 V, etc.). 4. Nunca desconecte un enchufe tirando del cable. 5. Nunca sustituya el alambre para fusible que esté fundido con alambre de mayor grosor.
Figura 2.7 Extracción del alambre de un fusible quemado. Figura 2.8 Cambio de un fusible de dos clavijas.
Ilustración anexa A Ilustración anexa A Existen muchos tipos diferentes de enchufes. Algunos tienen un tornillo externo que se puede aflojar con un destornillador. Figura 2.9 Un enchufe de dos clavijas. T: Tornillos, C: Clavijas.
Ilustración anexa B Remoción del material aislante del cable con un cúter o un pelacables dejando al descubierto a los alambres.
Figura 2.10 Tuerza los extremos expuestos de los alambres de ambos cables. Figura 2.11 Después de insertar los cables en las terminales del enchufe, apriete los tornillos de las terminales y coloque estas terminales en su sitio.
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Figura 2.12 Un enchufe de tres clavijas. Se señala el alambre de tierra del cable (T) con color verde.
Figura 2.12
Figura 2.13 Ilustraciones que representan a un interruptor, en este caso a dos tipos de interruptores. Se señalan los tornillos 1, 2, 3 y 4. Figura 2.14 Extensión eléctrica. Macho (M); Hembra (H).
Arreglando un enchufe de tres clavijas. Nótese el cable a tierra cubierto con el material aislante de color verde y amarillo.
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5 Herramientas utilizadas para estos arreglos eléctricos. 1) Set de destornilladores. 2) Alicate con bordes cortantes (ideal para trabajar con cables). 3) Cúter sencillo de cuchilla segmentada. 4) Pelacables. 5) Navaja común. 6) Hoja de afeitar. En este caso se puede usar cuando ya no se encuentra a mano ninguna herramienta apropiada, pero debe ser manipulada con cuidado para no dañar los cables ni a la persona. La misma advertencia se contempla para con cualquier instrumento cortante.
1 2 Extensiones eléctricas. 1) Extensión con una hembra. 2) Extensión múltiple con cuatro hembras.
2.3 FONTANERÍA: PROCEDIMIENTOS SENCILLOS Los defectos en la fontanería del laboratorio (un grifo que gotea, un vertedero obstruido, etc.) pueden afectar el trabajo considerablemente. A continuación se describen algunos procedimientos simples para resolver estos problemas cuando no se pueda conseguir fácilmente un fontanero. A. MATERIALES (Fig. 2.15) * Una llave inglesa * Una llave para tubería * Un juego de destornilladores * Un cepillo para botellas * Arandelas de goma para grifos de agua. Tapones de goma como los que se usan en los frascos de penicilina. Un succionador para destapar cañerías obstruidas. Fibra y pegamento, si es posible. Importante: Antes de iniciar todo trabajo de fontanería córtese el suministro de agua. B. EL GRIFO DE AGUA COMPONENTES DEL GRIFO El grifo consta de dos partes (Fig. 2.16): El cuerpo (C) por el que fluye el agua La llave (L) que regula el flujo de agua por medio de una arandela de goma (A). Entre el cuerpo y la llave existe una juntura (J) de goma o fibra. 1. si el grifo continúa goteando después de cerrarlo Se debe cambiar la arandela. (a) Desatornillar la llave del grifo empleando la llave inglesa (gírese en sentido contrario a las manecillas del reloj). (Fig. 2.17). (b) Quite la arandela gastada de la base de la llave (B) (Fig. 2.18 (a)). Si la arandela es del tipo que se calza, tírese de ella. Si está atornillada, desatorníllela (Fig. 2.18 (b)). (c) Sustituya la arandela con otra, nueva, del mismo tipo. (d) Si el grifo sigue goteando después que se ha cambiado la arandela, es probable que el asiento (A) que la recibe
tenga algún defecto (Fig. 2.19 (a)). En este caso colóquese un tapón de goma en el orificio (Fig. 2.19 (b)). Este 21 funcionará temporalmente como sello, hasta que se consigan los servicios de un fontanero. 2. Si el agua escapa por la llave del grifo la juntura se debe cambiar (a) Destornille la llave del resto del grifo empleando la llave inglesa. (b) Sustituya la juntura por otra nueva del mismo tipo. Si la juntura está hecha de fibra: (a) Quite la juntura vieja, raspe la cuerda del tornillo con un instrumento punzante (Fig. 2.20). (b) Enrolle la fibra nueva sobre la cuerda del tornillo comenzando por arriba y siguiendo el sentido de las manecillas del reloj (Fig. 2.21 (a)). (c) Aplique el pegamento sobre la fibra (Fig. 2.22 (b)). (d) Coloque de nuevo en su sitio la llave del grifo y atorníllela hasta que no dé más vuelta. 3. Cambio de todo el grifo Destornille el grifo defectuoso utilizando una llave para tubería (dele vuelta en sentido contrario a las manecillas del reloj). Tenga a mano el nuevo grifo; el cuerpo termina en un tornillo amplio (T) (Fig. 2.23 (a)). Enrolle fibra de fontanería sobre la cuerda de este tornillo y aplíquese pegamento como se ha indicado anteriormente. Atornille el grifo nuevo en el tubo de suministro de agua que se encuentra en la pared (Fig. 2.23 (b)). Apriete el grifo con la llave inglesa. C. EL SIFÓN DEL FREGADERO Componentes del sifón (Fig. 2.24) El sifón del fregadero o vertedero consta de: * El cuerpo, que se fija al escape del fregadero mediante la juntura J1 * El cuello del sifón, que tiene forma de "U" y se fija al cuerpo mediante la juntura J2. Todo el sifón se encuentra montado en el tubo de desagüe mediante la juntura J3. El agua de desecho entra en el sifón, que se halla permanentemente lleno de agua; esto funciona como tapón sellador. Así se impide que el aire fétido de los tubos de desagüe y las cañerías entre en el sifón. Cuando los sifones se obstruyen, los vertederos o fregaderos no eliminan el aguade desecho. Empleo del succionador para destupir el sifón Coloque el succionador sobre el orificio de desagüe del fregadero. Deje que fluya cierta cantidad de agua a su alrededor, de modo que el succionador se adhiera (Fig. 2.25). Presione hacia abajo con el mango de madera para aplanar el succionador. A continuación tire hacia arriba y presione hacia abajo. Repita estos movimientos varias veces, con toda la rapidez posible. Con la succión que se produce es muy probable que el sifón se destupa. Empleo de agentes químicos para destupir el sifón Utilice uno de los productos comerciales que se elaboran con ese propósito. Si no hay, emplee 250 g de cristales de hidróxido sódico. Colóquelos en el fondo del vertedero o fregadero, sobre el orificio de desagüe. Vierta dos litros de agua hirviendo sobre los cristales de hidróxido sódico (no eche el agua bruscamente). Deje que los cristales actúen durante 5 minutos. (Véase ilustración anexa A). A continuación abra el agua fría del grifo y déjela correr un rato. Vaciamiento del sifón para destupirlo Coloque un balde bajo el sifón. Destornille la juntura J2 con la llave inglesa. Limpie el sifón con un cepillo para botellas o un trozo de alambre. Saque todos los desechos (Fig. 2.26). Si existe un depósito blanquecino (piedra caliza) en el sifón, desármelo completamente. Caliente sus componentes en ácido acético diluido (20 ml de ácido por cada litro de agua). Vuelva a montar el sifón. Si el agua escapa por el sifón Si por el orificio de desagüe salen olores fétidos, es probable que el depósito permanente de agua del sifón (que hace las veces de tapón) tenga un escape a causa de un defecto de la juntura J2. Atorníllela firmemente o cambie la juntura por una nueva (Fig. 2.27). Importante: Nunca derrame ácidos fuertes en el fregadero o vertedero porque pueden causar corrosión.
Figura 2.15 Herramientas y materiales para las reparaciones de fontanería.
Figura 2.16 Los componentes de un grifo: C: cuerpo; L: llave; J: juntura; A: arandela. Figura 2.17 Extracción de la llave de un grifo con una llave inglesa.
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Figura 2.18 Extracción de la arandela. B: base de la llave.
Figura. 2.19 Reparación del asiento de la arandela. A: Asiento. b) Colocación de un tapón de goma en el orificio. Este funcionará temporalmente como sello, hasta que se consigan los servicios de un fontanero.
Figura. 2.20 Extracción de la juntura alrededor de la rosca de tornillo con un instrumento punzante.
Figura 2.21 (a) Enrollando la fibra nueva sobre la cuerda del tornillo. Figura 2.22 (b) Aplicando el pegamento sobre la fibra.
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Figura 2.23 Sustitución de un grifo. T: Tornillo. Luego de remover el grifo dañado, coloque el nuevo y apriételo con la llave inglesa.
Figura 2.24 Componentes del sifón de un fregadero. J1, J2, J3: Junturas. Figura 2.25 Desobstrucción de un fregadero con un succionador o desatascador de fregaderos colocado sobre el orificio de desagüe.
Ilustración anexa A Empleo de agentes químicos para destupir el sifón.
Ilustración anexa A
Figura 2.26 Vaciamiento del sifón para destupirlo usando un cepillo para botellas. Figura 2.27 Substitución de la juntura en la parte inferior de un sumidero.
2.4 AGUA PARA USO DEL LABORATORIO El laboratorio médico necesita un suministro de agua adecuado para su labor. Se requiere: * Agua limpia * Agua destilada * Agua desmineralizada (si es posible) * Agua tamponada (si es posible). En algunas áreas el agua es escasa y está sumamente contaminada. ¿Cómo se puede obtener agua limpia? 2.4.1 AGUA LIMPIA A. Inspección de la calidad 1. Llene una botella con agua. 2. Déjela reposar durante 3 horas. 3. Examine el fondo de la botella. Si hay un sedimento será necesario filtrar el agua. (Véase ilustración anexa A). B. FILTRADO 1. Filtro de porcelana no vidriada, o de vidrio calizo (vidrio sinterizado) (a) Este filtro se puede ajustar al grifo. (b) De lo contrario, se puede conservar sumergido en el agua que se va a filtrar, en un recipiente amplio. (Véase Fig. 2.28). Importante: Los filtros de este tipo se deben desarmar una vez al mes y lavarlos en agua hirviendo previamente filtrada. 2. Filtro de arena (Véase Fig. 2.29) Este filtro se puede fabricar en el laboratorio. Se necesitan: (a) Un depósito (que puede ser un recipiente amplio como un barril metálico, una olla grande de barro o una cubeta perforada) (b) Arena (c) Grava. Nota: El agua que se ha filtrado a través de un filtro de arena es casi libre de partículas, pero puede contener compuestos químicos solubles en el agua y bacterias. C. ALMACENAMIENTO DEL AGUA Si el agua es escasa o proviene de un tanque o pozo, consérvese siempre una reserva abundante, de preferencia, en depósitos de vidrio o material plástico. Antes de filtrarla decante el agua almacenada. D. Suministro de agua
Si en el laboratorio no se dispone de agua corriente prepare un distribuidor de la manera siguiente (Véase Fig. 2.30): 24 1. Coloque el depósito de agua en un anaquel alto. 2. Ponga un tubo de goma al depósito, de manera que el agua descienda por él. 3. Mantenga cerrado el tubo de goma con una grapa de Mohr o una pequeña pinza de tornillo.
Ilustración anexa A
Ilustración anexa A. Se observa una botella con agua la cual es dejada reposar durante 3 horas, para averiguar si hay sedimento o no, así se procede a realizar la filtración del agua en caso que haya sedimento en el fondo. Figura 2.28 Filtrado de agua utilizando una porcelana sin esmaltar porosa o un filtro de vidrio sinterizado.
Figura 2.29 Filtrado de agua utilizando un filtro de arena. G: grava, A: Arena Figura 2.30 Un distribuidor de agua 2.4.2 AGUA DESTILADA El agua destilada es libre de compuestos no volátiles (como, por ejemplo, minerales) pero puede contener compuestos orgánicos volátiles. A. Preparación El agua destilada se prepara por medio de una retorta en que: — Se caliente agua normal hasta el punto de ebullición — El vapor que se produce se enfría al pasar por un serpentín (tubo de refrigeración) y se condensa formando agua destilada. Para este fin existen los aparatos siguientes: 1. Retortas de cobre (alambiques) 2. Retortas de vidrio. 3. Destilador solar. Se calientan con gas, queroseno, electricidad o energía solar dependiendo del tipo de retorta. 1. ALAMBIQUES DE COBRE O ACERO INOXIDABLE (Fig. 2.31) Uno de los modelos más simples es el alambique que proporciona la UNICEF (ref: 01.680.02). (a) Llene el depósito (D) con el agua que se va a destilar. (b) Conecte el tubo de agua fría (T) a un grifo. (c) Caliente el depósito con: — Un mechero de Bunsen (B), o — Un calentador de queroseno (tipo Primus). Este alambique puede producir 1 ó 2 litros de agua destilada por hora, dependiendo de la calidad del sistema de calentamiento. 2. RETORTAS DE VIDRIO (Fig. 2.32) Estas retortas son más frágiles, pero casi siempre producen agua más pura. El procedimiento de destilación es el mismo. Cerciórese que el agua corriente circule con libertad alrededor del condensador (C). El agua se puede calentar en la retorta por medio de un aditamento eléctrico (E). Importante: (a) Almacénese el agua destilada en un recipiente de vidrio o material plástico que se encuentre protegido de la atmósfera. (b) No destile el último % del agua que se ha calentado.
DESTILADORES SOLARES (Fig. 2.33) 25 Para los laboratorios ubicados en áreas remotas y con recursos limitados, un destilador simple que utilice energía solar para destilar agua se puede crear fácilmente usando un contenedor plástico limpio con dos compartimientos (uno grande y uno pequeño) y una gran área de superficie, en el que se coloca una tapa de cristal en una posición inclinada. El agua se vierte sobre el compartimento grande a partir del cual el agua vertida es evaporada por el sol. Esta se condensa en la cubierta de vidrio y cae en el compartimiento pequeño. El compartimiento pequeño tiene una salida en la parte inferior a través de la cual el agua destilada puede pasar a un recipiente de cristal colocado debajo del contenedor. En los climas tropicales, alrededor de 2-7 litros de agua destilada puede ser producida diariamente en un alambique solar con una superficie de 1 m2. B. inspección de la calidad del agua destilada (Control de Calidad) Normalmente el pH del agua destilada es entre 5,0 y 5,5 (ácido). Utilice una solución acuosa de nitrato de plata (AgN03) (véase sección de reactivos, para conocer la composición) en proporción de 17 g/l (17 g en 1 litro de la solución) (1,7%). Esto es para evaluar la ausencia de compuestos de cloruro (Por ejemplo, cloruro de calcio). (Ilustración anexa C). Ponga en un vaso de precipitados: — 10 ml de agua destilada — 2 gotas de ácido nítrico — 1 ml de la solución de nitrato de plata. El agua deberá continuar completamente clara. Si aparece una ligera turbidez blanquecina indicará que la calidad del agua destilada es deficiente. C. USOS El agua destilada se utiliza para: 1. Preparar reactivos 2. Enjuagar algunos utensilios de vidrio antes de secarlos. Importante: 1. No use agua destilada comercial (del tipo empleado para llenar las baterías acumuladoras de los automóviles) en la preparación de reactivos para el laboratorio. 2. Es preferible el agua destilada que se ha preparado recientemente; si no es posible disponer de esta, guárdese el agua destilada en recipientes de vidrio o material plástico que se lavarán periódicamente. Es conveniente guardar el agua destilada en estos tipos de recipientes. 3. Utilice siempre agua destilada preparada en la misma semana. 4. No destilar la última cuarta parte del agua que se calienta, ya que contiene residuos.
Ilustración anexa B. Ilustración que representa un destilador de agua de vidrio con todos sus componentes.
Figura 2.31 Ilustración anexa C Ilustración anexa C. Equipo para agua destilada. Retorta de vidrio, mechero calentador, condensador recipiente colector, entrada y salida del agua. Nótese el sentido de ingreso del agua (flechas) de abajo hacia arriba para
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inundar el condensador y refrigerarlo, facilitando de esta forma la condensación del vapor de agua. Figura 2.31 Componentes de un alambique de cobre o acero inoxidable B: Mechero Bunsen; C: Columna de refrigeración; R: Reservorio; T: Tubo para el agua.
Figura 2.32 Componentes de un aparato de destilación de vidrio. C: Condensador; D: Destilado; E: Aditamento eléctrico.
Figura 2.32
Figura 2.33. Componentes de un destilador solar. Botella con agua (recolecta el agua destilada); Salida del agua; Dispositivo de recolección; Barra del condensador; Contenedor de agua; Cubierta de vidrio; Entrada del agua.
Ilustración anexa D
Destilador 2/4 eléctrico Ilustración anexa D Inspección de la calidad del agua destilada con Nitrato de Plata. Destilador 2/4. Tipo Hongo. Caldera, tapa, condensador y trampa de vapor en acero inoxidable. Para la producción de agua destilada exenta de Pirógenos. Calefacción eléctrica blindada en vaina de acero inoxidable. Rendimiento de 2 a 4 litros/hora según modelo. Este tipo de destiladores de agua, existía desde la década de los 1970, continuando hasta hoy. Era usado y sigue usándose en algunos laboratorios de hospitales regionales y distritales de ciertos países, que tengan acceso a la red eléctrica. (Fuente: http://www.rolcosrl.com) 2.4.3 AGUA DESMINERALIZADA PRINCIPIO El agua desmineralizada está libre de iones pero no necesariamente libre de compuestos orgánicos. El agua desmineralizada se prepara haciendo pasar el agua ordinaria por una columna de resinas de intercambio iónico. El aparato que se utiliza consiste en un tubo largo (cartucho) lleno de gránulos de resinas de intercambio iónico. El agua se filtra a través de la columna de gránulos, que retienen todos los iones minerales (sales minerales disueltas). Esta agua, desprovista de iones, se llama agua desmineralizada. A. PREPARACIÓN (Fig. 2.34)
1. Compruebe que el tubo está completamente lleno de gránulos de la resina de intercambio iónico. Algunos aparatos 27 desmineralizadores tienen dos tubos (cartuchos) por los que pasa el agua sucesivamente. 2. Conecte el tubo de la entrada del aparato al suministro de agua (el grifo o un pequeño tanque colocado en un plano alto, por encima del aparato). En algunos modelos el agua entra por la parte superior de la columna y en otros lo hace por el fondo. 3. Deje que el agua entre despacio. 4. Recoja el agua desmineralizada en un recipiente cerrado. B. Inspección de la calidad del agua desmineralizada (Control de Calidad) 1. Aparatos con cuadrante regulador En este cuadrante se mide la conductividad del agua. Mientras más completa sea la desmineralización menor será la conductividad eléctrica del agua. (a) Compruebe que el sistema regulador esté provisto de una pila eléctrica que funcione adecuadamente. (b) Para comprobar que la pila está cargada apriete el botón "prueba en cero". La aguja del cuadrante deberá oscilar hasta el cero. (c) Deje entrar agua en el cartucho (Fig. 2.35 (a)). (d) Cuando el agua desmineralizada comience a salir por el otro extremo, apriete el botón "prueba de agua". La aguja deberá marcar una resistencia superior a 2 megaohms/cm (2 M Ω/cm) (Fig. 2.35 (b)). (e) Si la aguja se detiene antes de la línea 2 o permanece en 0, indicará que el cartucho de resinas de intercambio iónico se ha usado demasiado tiempo y se debe reemplazar o reactivar. La graduación del aparato puede estar hecha en términos de resistencia (MΩ/cm) o el valor recíproco, la conductancia (cm/MΩ o Siemens, S). La mayor parte de los aparatos modernos fabricados en Europa tiene la graduación marcada en siemens. 2. APARATOS SIN CUADRANTE REGULADOR Con un papel indicador determine: — El pH del agua normal que se introduce en el aparato — El pH del agua desmineralizada que sale por el otro extremo. Si el pH es el mismo (generalmente inferior a 6,5), la resina ya no está activa. El agua desmineralizada de buena calidad debe tener un pH de 6 ,6 a 7,0. Se puede comprobar de nuevo empleando una solución de nitrato de plata (AgN03), en proporción de 17g/l (1,7%). Haga pasar por la resina una solución débil de cloruro sódico (sal de mesa) y a continuación efectúe la misma prueba que se ha descrito anteriormente para inspeccionar la calidad del agua destilada (sección 2.4.2). Si se forma una ligera turbidez blanquecina es necesario sustituir la resina. 3. CAMBIO DE COLOR DE LA RESINA En algunas resinas cambia el color (se suelen ennegrecer) cuando están gastadas y se deben sustituir. Consulte las instrucciones para el uso de las resinas que proporcione el fabricante. 4. Sustitución o reactivación de las resinas de intercambio iónico Dependiendo del modelo, se puede hacer de las maneras siguientes: (a) El cartucho se sustituye por otro que se haya llenado con resina y se encuentre listo para usarse. (b) La columna del aparato se llena nuevamente con una resina o una mezcla de 2 resinas. (c) La resina gastada se puede usar otra vez, reactivándola, lo que se consigue haciendo pasar por el aparato una solución de amoníaco. Síganse las instrucciones que proporcione el fabricante para usar el aparato. C. Usos del agua desmineralizada El agua desmineralizada es un poco menos pura que el agua destilada, ya que puede contener vestigios de materias orgánicas. Sin embargo, es lo suficiente pura como para: — Enjuagar los utensilios de vidrio antes de secarlos — Preparar casi todos los reactivos que se usan en los laboratorios médicos, incluso las tinciones. Se puede ahorrar agua destilada preparando en el laboratorio agua desmineralizada (especialmente para enjuagar los utensilios de vidrio).
Ilustración anexa F Ilustración anexa E Ilustración anexa E e Ilustración anexa F. Columnas de resinas de intercambio iónico. Como se muestra, el aparato que se utiliza consiste en un tubo (cartucho) lleno de resinas de intercambio iónico. El agua es filtrada a través del pasaje por la columna. Esta agua saliente es llamada agua desmineralizada (libre de iones).
28 Figura 2.34 Diagrama de un desmineralizador. Water inlet: Entrada de agua; Cation Exchange resin: Resina de intercambio catiónico; Anion Exchange resin: Resina de intercambio aniónico; Deionized water outlet: Salida del agua desmineralizada; Conductivity meter: Medidor de Conductividad.
Ilustración anexa G
Figura 2.35 Medición de la resistividad del agua desmineralizada. Ilustración anexa G En algunas resinas cambia el color (se suelen ennegrecer) (véase la flecha) cuando están gastadas y se deben sustituir. 2.4.4 AGUA AMORTIGUADA Por lo general el agua destilada es ácida y el agua desmineralizada se acidifica cuando se expone al aire. Para algunos procedimientos de laboratorio (preparación de colorantes, etc.) el pH del agua debe ser de 7,0, aproximadamente (agua neutra) y conservarse en estas condiciones. Esto se logra, cuando es posible, disolviendo sales amortiguadoras en el agua (agua amortiguada). * Materiales * Probetas de 10 ml y 1000 ml * Un matraz volumétrico de 1000 ml * Papeles universales indicadores del pH, (para medición del pH de 1 hasta 10) * Papeles indicadores del pH de rango limitado: Para un rango de 5.0 a 7.0 y para el rango de 6.0 a 8.0 * Agua destilada (o desmineralizada) * Solución de Ácido Acético al 5% (véase sección de reactivos para el número correspondiente), diluido 1/10 con agua destilada * Hidrofosfato disódico (Na2 HP04: 2H2O), hidratado * Fosfato de potasio y dihidrógeno (KH2P04), anhidro * Rojo Fenol, solución al 1% (véase sección de reactivos para el número correspondiente) * Carbonato de Sodio solución al 0,2% (véase sección de reactivos para el número correspondiente) B. MÉTODO 1. Pese con precisión 3,76 g del fosfato disódico. 2. Páselo a un matraz volumétrico de 1000 ml con un embudo (Fig. 2.36). 3. Enjuague con agua varias veces el recipiente donde se pesó el hidrofosfato disódico y vierta el agua por el embudo en el matraz volumétrico. 4. Pese con precisión 2,1 g del fosfato de potasio y dihidrógeno y repita la operación indicada en los puntos 2 y 3. 5. Añada un poco más de agua y mezcle la solución hasta que las dos sustancias químicas se disuelvan (Ilustración anexa G). 6. Vierta agua en el matraz hasta la marca de 1 litro. 7. Ponga el tapón en el matraz y mezcle completamente la solución. 8. Pase la solución a un frasco para reactivos, de vidrio blanco, y guárdela en el frigorífico. 9. Sumerja una tira de papel indicador universal en la solución tampón y comparar el color obtenido con la que se muestra en la cartilla estándar (Fig. 2.37). Leer la unidad de pH dada por el color obtenido y compárelo buscando que coincida con el color más cercano de la cartilla de colores.
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10. De acuerdo con el resultado obtenido, seleccione una tira de papel indicador para la gama limitada correspondiente. Por ejemplo, si el pH es 6, use papel indicador para la gama 5,0-7,0. Si el pH es de 7,5, use papel indicador para la gama 6,0-8,0. 11. Repita la prueba, usando el papel para la gama limitada correspondiente. Leer el pH de la solución tampón en la tabla estándar. 12. Si el pH está entre 7,0 y 7,2, el agua tamponada es satisfactoria. Si es inferior a 7,0, el agua es ácida. Si el agua es ácida, preparar una solución fresca, usando agua destilada que haya sido hervida durante 10 minutos en un matraz redondo descubierto, sin tapón, (esto elimina el dióxido de carbono) (Véase Ilustración anexa H). 13. Si el agua es ácida aún después de la ebullición: - Agregar cinco gotas de solución de rojo fenol por cada litro de agua; - Neutralizar mediante la adición de una solución de carbonato de sodio al 0,2%, una gota a la vez, hasta que el agua se vuelve rosa (Fig. 2.38). 14. Si el agua es alcalina (pH superior a 7,2): - Agregar cinco gotas de solución de rojo fenol por cada litro de agua; - Neutralizar mediante la adición de una solución de ácido acético 0,5%, una gota a la vez, hasta que el agua se vuelve de color naranja (Fig. 2.39). Si no se dispone de los compuestos fosfatados: Si no hay disponible Hidrofosfato disódico ni Fosfato de potasio y dihidrógeno, neutralizar agua destilada o desmineralizada directamente, como se muestra en los pasos 12-14 anteriores. Nota: El pH también puede corregirse mediante la adición de pequeñas cantidades de las sales amortiguadas: * El Hidrofosfato disódico se puede utilizar para aumentar el pH si el agua es ácida (pH inferior a 7,0). * El Fosfato de potasio y dihidrógeno puede ser añadido para reducir el pH si el agua es alcalina (pH por encima de 7,2).
Figura 2.36 Transferencia de Hidrofosfato disódico a un matraz volumétrico aforado.
Ilustración anexa H Ilustración anexa H Añada un poco más de agua y mezcle la solución hasta que las dos sustancias químicas se disuelvan. Vierta agua en el matraz hasta la marca de 1 litro. Figura 2.37 Controlar el pH usando papel indicador universal.
Ilustración anexa I Si el agua es ácida, preparar una solución fresca, usando agua destilada que haya sido hervida durante 10 minutos en un matraz redondo descubierto, sin tapón, (esto elimina el dióxido de carbono).
Ilustración anexa I
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Figura 2.38 Corrección del pH ácido del agua tamponada con Carbonato de Sodio 0,2% y usando Rojo Fenol como indicador. Figura 2.39 Corrección del pH alcalino del agua tamponada con Ácido Acético 0,5% y usando Rojo Fenol como indicador.
RELACIÓN DE APARATOS NECESARIOS PARA EQUIPAR UN LABORATORIO PERIFÉRICO 2.5 EQUIPAMIENTO A continuación se presenta una relación de los aparatos necesarios para equipar un laboratorio que sea capaz de efectuar todos los ensayos que se describen en este manual. Por lo general este tipo de laboratorio se instalará en un hospital rural pequeño (hospital de distrito) que tenga entre 60 y 100 camas. Las cantidades de los diferentes artículos que se proponen bastan para que un laboratorio que cuente con uno o dos técnicos realice 20-50 ensayos por día en lapsos de 6 meses. 2.5.1 INSTRUMENTOS DE LABORATORIO ESENCIALES MICROSCOPIOS1 El laboratorio debería estar equipado con dos microscopios. Un microscopio con tubo binocular inclinado, platina mecánica, 3 objetivos (x 10, x 40, x 100), oculares (x 5, x 10), condensador y espejo planocóncavo. Si existe suministro de electricidad o una batería, una lámpara eléctrica de microscopio, que se usará en los ensayos de hematología. (Microscopio binocular con luz incorporada). El segundo microscopio es para uso en otros procedimientos del laboratorio (parasitología, análisis de orina, bacteriología, etc.) y debería ser binocular, es decir, con un tubo binocular inclinado y los accesorios que se han indicado anteriormente. Si el laboratorio se encuentra en un centro de salud, un microscopio binocular será suficiente. CENTRÍFUGAS2 Es útil tener dos centrífugas: Una centrífuga eléctrica con aditamento especial para microhematocrito en el cabezal y cuadrante indicador. (Centrífuga para microhematocrito con un lector o ábaco para la lectura de los capilares de microhematocrito). Una centrífuga manual con cuatro cubetas o una eléctrica con cuatro cubetas. BALANZA3 Si los reactivos se han de elaborar en el laboratorio, se necesitará una balanza analítica. Accesorios: un juego de pesas. Si en el laboratorio se necesita preparar una amplia gama de reactivos, es de utilidad tener una balanza analítica de dos platos con su correspondiente juego de pesas (véase sección 3.2.2). En la actualidad, se puede usar una balanza electrónica de precisión de un solo plato la cual funciona con energía eléctrica o con pilas. Este tipo de balanzas ya se encuentran disponibles en los comercios y son de fácil acceso. FRIGORÍFICOS Siempre que se establezca un laboratorio se deberá contar con un frigorífico exclusivo para tal servicio. Existen reactivos que necesitan mantenerse refrigerados (VDRL, pruebas de embarazo, etc.) así como ciertos materiales (algunos medios de transporte, muestras, etc.). Estos se podrán conservar en un compartimiento del frigorífico del hospital o centro de salud. BAÑO MARÍA REGULADO POR TERMOSTATO (37 °C - 56 C) Un baño maría equipado con un termostato regulador de la temperatura es requerido cuando las muestras o materiales deban ser mantenidos a una cierta temperatura y cuando las mediciones deben ser realizadas a una dada temperatura. En otras palabras, trabajos en que se requieren temperaturas constantes durante un tiempo relativamente prolongado. CONTADOR DIFERENCIAL Si bien se puede utilizar un contador manual para hacer los recuentos (llamado también “cuenta personas o cuenta ganado”) o un sistema de ábaco manual escribiendo en un papel, con un contador diferencial se ahorra tiempo y se logra mayor eficiencia. FOTÓMETRO O COLORÍMETRO Es necesario tener un fotómetro o un colorímetro para la medición de las pruebas de química sanguínea y para la determinación precisa de los niveles de hemoglobina. Existen modelos comerciales disponibles que funcionan con pilas. En la actualidad, también se usan los espectrofotómetros por su accesibilidad tanto los modelos con cubeta como aquellos semiautomáticos. 1 Para obtener más información, consulte la sección 3.1. 2 Para obtener más información, consulte la sección 3.3. 3 Para obtener más información, consulte la sección 3.2.3. 2.5.2 ARTÍCULOS ADICIONALES AUTOCLAVE Si el laboratorio se encuentra instalado en un hospital, se podrá utilizar el servicio de esterilización de éste. Si se halla en un centro de salud, se necesitará uno de los esterilizadores siguientes:
— una olla de presión 31 — un autoclave pequeño (eléctrico o calentado en estufa de aceite o gas butano). HORNO DE AIRE CALIENTE Si el laboratorio es relativamente grande será provechoso que cuente con un pequeño horno de aire caliente que es muy útil para secar los utensilios de vidrio y esterilizar materiales conjuntamente con el autoclave. DESIONIZADOR O RETORTA PARA PREPARAR AGUA DESTILADA El desionizador es un aparato para desmineralizar agua por medio de cartuchos de resinas de intercambio iónico (véase la sección 2.4.3). En lugar de un desmineralizador se puede utilizar una retorta. Si todos los reactivos que se obtienen están listos para usarse o se cuenta con agua destilada, este tipo de artículo se puede excluir de esta relación. 2.5.3 EQUIPOS Y SUMINISTROS Una lista de equipos y suministros para un laboratorio periférico de salud está indicada en la Tabla 2.2. Las cantidades propuestas son suficientes como para permitir que un laboratorio con uno o dos técnicos realicen 20-50 exámenes al día durante un período de 6 meses. En la Fig. 2.40, se muestra material de vidrio y pequeños artículos de equipamiento de laboratorio de uso frecuente. 2.5.4 MANUFACTURA DE UTENSILIOS DE VIDRIO El vidrio se produce por la fusión, a temperaturas muy elevadas, de una mezcla de arena y potasio (o sodio). De este modo se forma un silicato (vidrio ordinario, de cal y soda).Cuando se agrega ácido bórico a estos ingredientes se produce vidrio de borosilicato (Pyrex, etc.), que es menos quebradizo y más resistente al calor. En el laboratorio se pueden manufacturar ciertas piezas del equipo que se suele usar, calentando vidrio ordinario. MATERIALES 1. Tubos huecos de vidrio: — diámetro externo: 4-8 mm — espesor de la pared: 0,9-1,0 mm 2. Varillas de vidrio: — diámetro: 4-8 mm 3. Cortador de vidrio: lápiz de diamante o sierra. 4. Una pieza de tela 5. Un mechero de Bunsen (o, aún mejor, una lámpara de soplete pequeña, de gas o petróleo). MANUFACTURA DE UNA PIPETA DE PASTEUR 1. Utilice tubos de vidrio de 4-6 mm de diámetro. Marque con la sierra la longitud de los tubos que necesita: — 14 a 15 cm para las pipetas pequeñas — 18-25 cm para las pipetas largas. Haga las marcas alrededor de cada tubo, formando un círculo (Fig. 2.41).
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34 TABLA 2.2 EQUIPO Y SUMINISTROS PARA UN LABORATORIO DE SALUD PERIFÉRICO CANTIDAD ARTÍCULO REQUERIDA EQUIPO PARA LA OBTENCIÓN DE MUESTRAS EQUIPO ESENCIAL Según sea Jeringas, graduadas, desechables, 20 ml necesario Según sea Jeringas, graduadas, desechables, 10 ml necesario Según sea Jeringas, graduadas, desechables, 5 ml necesario Según sea Agujas desechables, calibre 18 (1,2 mm) x 40 mm necesario Según sea Agujas desechables, calibre 19 (1.0-1.1 mm) x 40 mm necesario Según sea Agujas desechables, calibre 20 (0,9 mm) x 40 mm necesario Según sea Agujas desechables, calibre 22 (0,7 mm) x 40 mm necesario Según sea Agujas desechables, calibre 23 (0,6 mm) x 32 mm necesario Según sea Agujas desechables, calibre 23 (0,6 mm) x 90 mm necesario Tubo de goma para aplicar torniquetes, 2-5 mm de diámetro 2 piezas Según sea Lancetas para extraer sangre capilar necesario Algodón hidrófilo, blanco, absorbente 2x500 g Algodón hidrófilo, no absorbente 2x500 g Para tantos como Frascos vacíos de inyecciones, que anteriormente contenían antibióticos, reactivos, etc. sea posible EQUIPO ADICIONAL Bisturí con cuchillas desechables para cortar y tomar muestras cutáneas para hacer frotis (para 1 la lepra) Pinzas (fórceps) de cierre curvo sin dientes para la toma de muestras cutáneas para hacer frotis 1 (para la lepra) Cajas, de plástico o de cartón, desechables, para la recolección de heces 50 Aplicadores de madera de (12 cm x 1mm) (pueden fabricarse en el mismo laboratorio) 50 Frascos de 2,5 ml y 5 ml, preferiblemente de material plástico 50 Frascos de vidrio blanco, de boca amplia, de 50 ml, con tapa de rosca metálica y arandela de 25 goma, para recoger muestras de esputo Frascos de vidrio blanco, de 25 ml, con tapa de rosca y arandela de goma, para recoger diversas 25 muestras Frascos de boca amplia, de todas variedades, para recoger orina 20-40 Pinzas de sacabocado para biopsias de piel (para oncocercosis) 1 Depresor lingual de madera (abatelenguas) 50 UTENSILIOS DE VIDRIO ARTÍCULOS ESENCIALES Varillas de vidrio, sólidas, 6 mm de diámetro 3 Vasos para análisis (beackers), de fondo plano, de material plástico, de 50 ml 4 Vasos para análisis (beackers), de fondo plano, de material plástico, de 100 ml 4 Vasos para análisis (beackers), de fondo plano, de material plástico, de 250 ml 4 Cubetas para tinción, rectangulares, para 20 portaobjetos 4 Embudo de vidrio, de 60 mm de diámetro 1 Embudos de vidrio, de 90 mm de diámetro 2 Embudo de material plástico, de 200 mm de diámetro 1 Probetas graduadas, de vidrio, con tapón, de 25 ml 3 Probetas graduadas, de vidrio, con tapón, de 100 ml 3 Probetas graduadas, de vidrio, con tapón, de 250 ml 2 Probetas graduadas, de vidrio, con tapón, de 500 ml 1 Probetas graduadas, de vidrio, con tapón, de 1000 ml 1 Matraces de Erlenmeyer, de boca amplia, vidrio Pyrex (resistente al calor), 250 ml 3 Matraces de Erlenmeyer, de boca amplia, vidrio Pyrex (resistente al calor), 500 ml 3 Matraces de Erlenmeyer, de boca amplia, vidrio Pyrex (resistente al calor), 1000 ml 3 Frascos goteros de material plástico o vidrio, de 100 ml 12 Frascos goteros de vidrio color ámbar, 100 ml 3 Frascos para reactivos, de material plástico o vidrio de 100 ml 20 Frascos para reactivos, de material plástico o vidrio de 500 ml 10 Frascos para reactivos, de material plástico o vidrio de 1000 ml 10 Matraces volumétricos de vidrio, con tapón: — de 100 ml 4 — de 250 ml 2 — de 500 ml 2 — de 1000 ml 1 Portaobjetos de (25 x 75) mm (1,1 a 1,3 mm de espesor) 2x1000 Cubreobjetos cuadrados de (20 x 20) mm (0,13 a 0,16 mm de espesor) 20x100 Frascos de lavado (pisetas), de material plástico, de 500 ml 2 Frascos de lavado (pisetas), de material plástico, de 1000 ml 2 Cristales cóncavos de reloj (vidrios de reloj), de 50 mm de diámetro 2
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Pipetas graduadas desde el extremo superior, pero no hasta el inferior: — de 1 ml (divididas en 0,01 ml) — de 2 ml (divididas en 0,01 ml) — de 5 ml (divididas en 0,1 ml) — de 10 ml (divididas en 0,1 ml) Pipetas Pasteur Tubos de ensayo de vidrio Pyrex, de 150 x 16 mm Tubos de ensayo de vidrio Pyrex, de 85 x 15 mm (tubos de Kahn) Tubos de ensayo de vidrio Pyrex, de 50 x 6 mm (para estudios de compatibilidad) Tubos para centrífuga, cónicos, de 15 ml Tubos para centrífuga, cónicos, de 15 ml, graduados divididos en 0,1 ml Tubos de vidrio; grosor de la pared, 1 a 1,5mm; diámetro, 7 a 8 mm OTROS ARTÍCULOS Placas de Petri, de vidrio: — de 112 mm de diámetro — de 156 mm de diámetro Platos para evaporación, de 75 mm (75 ml) Desecador
12 10 10 6 2 x 144 50 100 20 40 6 1 kg 4 4 2 1
UTENSILIOS PARA HEMATOLOGÍA
Pipetas de Sahli, de 0,02 ml, con tubos de goma Pipetas para sangre, de 0,05 ml Cámaras de recuento: — de Neubauer mejorada (con línea brillante si es posible) — de Fuchs y Rosenthal Cubreobjetos, ópticamente planos, para cámaras de recuento (“Cubrecámaras”) Contador manual (“Cuenta ganado”) Tubos (pipetas) de Westergren para medir la velocidad de sedimentación de los eritrocitos (Eritrosedimentación, Velocidad de Sedimentación Globular: VSG) Soportes para los tubos de Westergren Centrífuga para microhematocrito Tubos capilares para microhematocrito, con heparina Sellador de tubos para microhematocrito (cera, plastilina)
30 20 3 1 12 1 30 2 1 1000 1 juego (10 bandejas)
EQUIPO PARA BACTERIOLOGÍA Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Alambre de aleación de Níquel y Cromo (Nicromo), de 1 mm de diámetro Mangos para asas de alambre Bloque de madera para los mangos Tubos estándar para proteínas Gradillas grandes para 12 tubos de ensayo Gradillas pequeñas para 12 tubos de ensayo Portatubos de madera Pinzas de acero inoxidable, para portaobjetos Mechero Bunsen para gas butano Depósitos de gas butano (garrafas de gas) Trípode con gasa de amianto Espátulas de diversos tamaños, para pesar reactivos
1 metro 4 1 1 juego 4 4 2 2 1 los necesarios 1 33
REGISTROS E INFORMES DEL LABORATORIO
Cuadernos para registro, de cubierta dura, grandes Cuaderno para registro, de cubierta dura, pequeño (para donadores de sangre) Lápices de cera para marcar vidrio, de color rojo Lápices de cera para marcar vidrio, de color azul Marcadores “permanentes” con tinta al solvente para marcar vidrios (diversos colores, de preferencia, rojo, azul, negro, verde) Marcador de vidrio con punta de diamante Lápices de grafito Estilográficas, bolígrafo, tinta azul o negra Estilográficas, bolígrafo, tinta roja (para anotar resultados positivos) Resaltadores fluorescentes (diversos colores, por ej., amarillo, naranja, verde) para resaltar resultados positivos) Cinta de celofán Cinta adhesiva blanca Etiquetas para los frascos de los pacientes Planillas preparadas con solicitudes al laboratorio (de preferencia estandarizada por oficinas centrales) Gomas de borrar Almohadilla para sellos Tinta para sellos Sello Portasello Reglas Sujetapapeles (clips) Pisapapeles EQUIPOS VARIOS Microscopios Colorímetro (Espectrofotómetro) Baño maría Frigorífico Horno de aire caliente Centrífuga Balanza Desmineralizador o destilador de agua
6 1 12 12 12 1 12 3 2 2 3 rollos 3 rollos 1000 Las necesarias 5 1 1 1 1 3 Tantos como sea necesario 2 2 1 1 1 1 1 2 1
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Temporizador (timer), de 0 – 60 minutos con alarma Lámpara de alcohol Martillo Alicate Alicate de electricista Destornillador pequeño Destornillador mediano Destornillador grande Sierra metálica obtusa, de 5 mm Sierras pequeñas, para ampolletas Cacerola de 30 cm, de fondo plano, con tapa Placa caliente Mortero y mano (10 cm de diámetro) Tazones de material plástico, de 50 x 30 cm Cubeta de material plástico de 12 litros Propipeta de goma Micropipeta de 20 µl Micropipeta de 50 µl Micropipeta de 100 µl Micropipeta de 200 µl Micropipeta de 500 µl Tips (puntas) para micropipeta de 20 µl de plástico desechables Tips (puntas) para micropipeta de 50 µl de plástico desechables Tips (puntas) para micropipeta de 100 µl de plástico desechables Tips (puntas) para micropipeta de 200 µl de plástico desechables Tips (puntas) para micropipeta de 500 µl de plástico desechables Tijeras (mediana, grande) Bomba de vacío, metálica Termómetro 0 – 100 ºC Tapones de goma Tapones de corcho Sacacorchos Cepillos para limpiar tubos de ensayo y frascos (varios tamaños) Papel de filtro de 15 cm de diámetro (tipo Whatman No. 1 o equivalente) Papel para pH, de graduación estrecha (6,8-7,2) Papel para pH, de graduación amplia (0 - 12) Papel para lentes Pincel fino, cepillo de pelo de camello suave (para limpiar lentes) Pera de goma pequeña sopladora (para la limpieza de lentes) Esta pera de goma puede tener un cepillo de pelo de camello suave incorporado, o puede retirarse el cepillo para usar solo el bulbo de goma para soplar el polvo y la pelusa Papel higiénico Toallas y trapos limpios Aceite de inmersión Calorífero portátil de gas Pera de goma (para limpiar las pipetas)
Ilustración anexa A
1 1 1 1 par 1 par 1 1 1 1 12 1 1 1 3 1 4 1 1 1 1 1 Las necesarias Las necesarias Las necesarias Las necesarias Las necesarias 1 de cada una 1 1 1 juego 1 juego 1 6 4 cajas 6 cuadernos 6 cuadernos 2 paquetes 1 1 10 rollos Los necesarios 6 frascos (de 10 ml cada uno) 1 1
Ilustración anexa B
Ilustración anexa A Tubos huecos de vidrio, varillas de vidrio y sierra. Ilustración anexa B Colocación de los tubos de vidrio en un beaker para dejarlos enfriar. Ilustración anexa C Lavado y enjuague de los tubos de vidrio recién preparados.
Ilustración anexa C
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Figura 2.41 Marcando la longitud necesaria del tubo de vidrio utilizando una sierra Figura 2.42 Rompiendo el tubo de vidrio a mano Figura 2.43 Redondeo de los extremos del tubo de vidrio por flameado a la llama del mechero 2. Envuelva con una pieza de tela la parte del tubo que va a partir. Sostenga el tubo con ambas manos, colocando las yemas de los pulgares a cada lado de la marca (Fig. 2.42). Rompa el tubo ejerciendo presión con los pulgares. 3. Redondee el extremo de las dos piezas resultantes, de la manera siguiente como se muestra en la Fig. 2.43: — caliente el extremo del tubo, sosteniéndolo en posición casi vertical inmediatamente arriba de la llama azul del mechero — vaya girándolo lentamente — deténgase cuando el vidrio se ponga al rojo vivo. 4. Coloque los tubos en un vaso de precipitado o en un pote abierto, con los extremos calientes hacia arriba, y déjense enfriar. Lave todas las piezas que se han preparado (siga las instrucciones que figuran en la sección 3.5.1). Enjuáguelas y séquelas. 5. Estire el tubo para formar la pipeta del modo siguiente: — caliente el tubo a la mitad de su longitud en la llama azul (Fig. 2.44); — haga girar el tubo hasta que el vidrio enrojezca. En este momento la llama se pondrá color amarillo. 6. Retire el tubo de la llama sin dejar de girarlo continuamente y tire con lentitud de ambos extremos conservando las dos manos exactamente en el mismo nivel (Fig. 2.45). El tubo se estirará. Continúe tirando de los extremos hasta lograr la longitud requerida (10-20cm). 7. Espere que enfríe. Corte por la porción estirada exactamente a la longitud que se necesite. Redondee los bordes cortantes sosteniéndolos algunos segundos al calor de la llama (Fig. 2.46). Separe y selle las dos pipetas calentándolas en la parte alta de la llama.
Figura 2.44 Calentamiento del tubo de vidrio antes de estirar la pipeta.
Figura 2.45 Estirando la pipeta. Figura 2.46 Redondeo de los extremos.
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Figura 2.47 Redondeo de los extremos de la varilla de vidrio por flameado.
MANUFACTURA DE UN AGITADOR 1. Procúrese una varilla de vidrio sólido, de unos 5 mm de diámetro. Con una sierra córtese la varilla en trozos de 15, 20 ó 25 cm, según sean las necesidades (véase Fig. 2.41). El procedimiento para cortar es el mismo que se usa para los tubos de vidrio. 2. Redondee los extremos haciéndolos girar sobre la llama azul del mechero hasta que se pongan al rojo vivo en una porción de 1 cm, aproximadamente (Fig. 2.47). 3. Con una pesa de 500 g ó 1 kg aplane los extremos calientes contra el mosaico o azulejo (seco) de la superficie de trabajo (Fig. 2.48). 4. Caliente cada uno de los otros extremos y aplástelos presionándolos suavemente contra un azulejo (Fig. 2.49). Las nuevas varillas se pueden utilizar también para decantar líquidos o verterlos con lentitud (véase Fig. 3.52).
Figura 2.48 Aplanar el extremo caliente de la varilla de vidrio con un peso. Figura 2.49 Presionando el extremo caliente de la varilla de vidrio hacia abajo sobre la superficie de un mosaico. Figura 2.50 Calentado el tubo de vidrio antes de doblarlo. Figura 2.51 Curvando el tubo de vidrio para hacer un ángulo recto.
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Ilustración anexa D Figura 3.52 e Ilustración anexa D Las nuevas varillas se pueden utilizar también para decantar líquidos o verterlos con lentitud.
Figura 2.52 Problemas comunes con el curvado del tubo de vidrio doblado.
DOBLADO DE UN TUBO DE VIDRIO 1. Caliente la parte por donde quiere doblar el tubo haciéndolo girar sobre la llama hasta que el vidrio tome un color rojo pálido y se haga maleable (Fig. 2.50). 2. Dóblelo muy despacio hasta formar un ángulo recto (use como guía el ángulo de un azulejo; Fig. 2.51). Doblados defectuosos (Fig. 2.52) a) El vidrio se calentó demasiado. b) El vidrio no se calentó suficientemente. PREPARACION DE UN MATRAZ DE LAVADO Materiales Se necesitan: — un matraz redondo o un matraz Erlenmeyer de 1000 ml — dos trozos de tubo de vidrio — un tapón de corcho o goma. Método Perfore el tapón con una broca o perforador de corcho. Humedezca los extremos de los tubos con algunas gotas de agua (cuando se use tapón de corcho) o glicerol (si se usa tapón de goma) antes de insertarlos en las perforaciones (Fig. 2.53). Protéjase las manos con una pieza de tela.
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Figura 2.53 Componentes de un frasco de lavado Figura 2.54 Recipientes para muestras de heces
2.5.5 RECIPIENTES PARA MUESTRAS En el laboratorio se emplean distintos recipientes para recolectar muestras de heces fecales, sangre, orina y esputo. RECIPIENTES PARA HECES FECALES Los siguientes tipos de contenedores son adecuados para la recogida de muestras de heces (Fig. 2.54): - Caja de cartón encerado o parafinado - Lata vacía con tapa - Frasco de plástico liviano -Frasco de vidrio especialmente diseñado para la recogida de heces, con una cuchara unida al tapón. FRASCOS Y TUBOS PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE SANGRE SANGRE SIN ANTICOAGULANTES — Use tubos limpios y secos con capacidad para 5-20 ml, según las necesidades. — Separe el suero después de que la sangre se haya coagulado y centrifugado. — Si las muestras de suero se van a enviar a otro laboratorio esterilice los tubos y frascos. El mejor tipo de tubos es el que se puede centrifugar; se evita así la manipulación excesiva de las muestras. SANGRE CON ANTICOAGULANTES Anticoagulantes para ensayos de hematología Solución salina bipotásica EDTA EDTA: Ácido Etilendiaminotetraacético; también conocido como Ácido Edético. Coloque 0,5 ml de esta solución al 10% (reactivo No. 22) en una serie de frascos de 5 ml (Fig. 2.55) (o bien 0,2 ml en frascos de 2 ml). Deje secar los frascos abiertos a la temperatura ambiente o colóquelos en una incubadora a 37°C, si está disponible. Utilícense para: — recuentos de células sanguíneas — cálculos de hemoglobina — identificación de grupos sanguíneos. Tubos con heparina Este anticoagulante es costoso y poco estable en los climas cálidos. Los tubos con heparina se pueden obtener en el comercio o prepararse en laboratorios centrales; tienen marcas indicadoras del nivel hasta donde se deben llenar con sangre. Citrato trisódico al 3,2% (a veces se usa al 3,8%) Preparación: véase el reactivo No. 60. Se usa para determinar la velocidad de sedimentación de los eritrocitos. Empléese 1 ml de solución de citrato trisódico por cada 4 ml de sangre (ó 0,4 ml por cada 1,6 ml de sangre). Importante: Nunca se hagan recuentos de células sanguíneas con citrato. Anticoagulante para efectuar ensayos bioquímicos Generalmente se emplea fluoruro sódico (NaF). Use 10 mg de polvo de fluoruro por cada 10 ml de sangre, ó 2 mg por cada 2 ml de sangre. Se utiliza para: — calcular la glucosa sanguínea — calcular la urea sanguínea (con ciertas técnicas). Advertencia: El fluoruro sódico es venenoso. Precauciones que se deben tomar al usar anticoagulantes
o Mézclese inmediatamente después de recolectar la sangre, invirtiendo el recipiente varias veces con 41 suavidad y uniformidad. No se agite el contenido. o Utilice recipientes limpios. Séquense antes de añadir el anticoagulante. Advertencia: Los residuos de detergente disuelven los glóbulos rojos. Asegúrese que los recipientes se enjuaguen abundantemente antes del secado. o Guarde los frascos que contengan anticoagulantes en un lugar seco. La solución de sal dipotásica de EDTA y el fluoruro sódico son estables a la temperatura ambiente, pero el citrato trisódico y la heparina se deben conservar en el frigorífico. o Utilice las proporciones correctas. Use recipientes y tubos graduados o coloque etiquetas en ellos de modo que el borde superior de estas quede al nivel de la cantidad de sangre que se requiera (2 ml ,5 ml, etc.) RECIPIENTES PARA RECOLECTAR OTRAS MUESTRAS El procedimiento mejor para los análisis de orina consiste en que los pacientes las recojan cerca del laboratorio. Use matraces de boca ancha de Erlenmeyer limpios y secos, con capacidad para 250 ml, o frascos limpios de boca amplia para efectuar los exámenes directos y los ensayos bioquímicos habituales. Recolección de agua para examen bacteriológico. Frascos para recolectar líquido cefalorraquídeo (véase sección 8.2). CAJAS Y TARROS PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE ESPUTO Se pueden utilizar tarros de vidrio con tapón de rosca o tarros desechables de material plástico con tapa, o bien se pueden fabricar pequeñas cajas en el propio laboratorio con piezas de cartón que se arman con grapas, es decir, usando cartón y una grapadora. Estas cajas solo se pueden usar una vez, y nada más que para el esputo que se recolecta en el propio laboratorio. 1. Corte las piezas de cartón en cuadros de 18 cm y dóblelos como se indica en la ilustración (Fig. 2.56): • primero, de esquina a esquina • a continuación, en nueve cuadros iguales. 2. Dóblense hacia adentro los pliegues diagonales del cuadro de cada esquina (Fig. 2.57). 3. Doble dos de las esquinas hacia atrás, sobre un lado de la caja, y las otras dos sobre el otro lado (Fig. 2.58). 4. Fíjense con grapas las dos esquinas que se han doblado sobre cada lado de la caja (Fig. 2.59), que de este modo quedará lista para recibir la muestra. 5. Incinere las cajas de cartón y los tarros de plástico después de usarlos, como se explica en la sección 3.6.2.
Figura 2.55 Dispensación de solución de EDTA en frascos (tubos) para la recogida de muestras de sangre.
42
Figura 2.56 Plegando cartón para hacer cajas de cartón para la recogida de esputo Figura 2.57 Doblando las esquinas hacia adentro Figura 2.58 Doblando dos de las esquinas hacia atrás, sobre un lado de la caja, y las otras dos sobre el otro lado Figura 2.59 Asegurando las esquinas dobladas con grapas
Ilustración anexa A Tarro plástico y caja para la recogida de esputo.
2.5.6 ALMACENAMIENTO, INVENTARIO Y PEDIDO DE SUMINISTROS ALMACENAMIENTO UTENSILIOS DE VIDRIO Guárdense los utensilios de vidrio en los anaqueles de un armario, protegidos del polvo. Los matraces de Erlenmeyer y los de fondo redondo se deban taponar con algodón no absorbente o cubrir con papel de estraza (o, de preferencia, con hojas delgadas de parafina encerada o material plástico adherente, como Parafilm o Saran, si se cuenta con ellos) y ordenarlos por tipos y tamaños. Las pipetas graduadas se guardarán en gavetas (cajones) divididas en secciones.
Ilustración anexa A Cajón donde se guardan las pipetas graduadas en secciones.
AGENTES QUÍMICOS Y REACTIVOS Deben colocarse en estricto orden alfabético. Los ácidos y las sustancias químicas inflamables y peligrosas (que se identificarán por medio de etiquetas de colores apropiados) se deben guardar por separado en una sección especial. Los frascos que no se han abierto se conservarán en cajas rellenas de aserrín. Los venenos se deben guardar aparte, en un armario con candado, con etiquetas de colores diferentes que los identifiquen. INSTRUMENTOS PESADOS Algunos instrumentos, como los espectrofotómetros, se conservarán en una habitación provista de un sistema de enfriamiento de aire si el clima es cálido y húmedo. Para guardar los microscopios consúltense la sección 3.1.6. ORGANIZACIÓN DEL ALMACÉN E INVENTARIO FICHAS DE REGISTRO DE EXISTENCIAS Se deberá elaborar una ficha de registro de existencias para cada sustancia química, tinción, utensilio de vidrio, etc. Una forma de ficha sencilla se muestra en la tabla 2.3. Cuando se pida un artículo, indíquese: — En la columna encabezada "Pedido a" — dónde se envió el pedido — En la columna encabezada "Pedido" — la fecha y la cantidad pedida. Cuando se reciba un artículo, indíquese:
— En la columna encabezada "Recibido" — la fecha de recibo y la cantidad recibida 43 — En la columna encabezada "Existencia" — el total en existencia en el laboratorio después de que el artículo se haya recibido. Cuando un artículo se haya usado (o roto), indíquese: — En la columna encabezada "Despachado" -- la fecha y la cantidad salida del almacén — En la columna encabezada "Existencia" — el total que ha quedado en existencia después de que el artículo ha salido del almacén. Clasifíquense las fichas de existencias en orden alfabético estricto y consérvense en una caja o un archivero. Se asignará un número a cada artículo que se anotará en la ficha de existencias, junto a "Artículo No.". Tabla 2.3 Muestra de una ficha de existencias Artículo Artículo: Tinción de Giemsa (frasco con 250 ml) No. 29 En Pedido a Pedido Recibido Despachado existencia Fecha Cantidad Fecha Cantidad Fecha Cantidad 2 frascos Compañía 01 /08/ 01 2 frascos 20 /08/ 01 2 frascos 4 frascos A 10 /10/ 01 1 frasco 3 frascos 03 /12/ 01 1 frasco 2 frascos Compañía 15/11/01 2 frascos 10/12/01 2 frascos 4 frascos A INVENTARIO Cada 6 meses se hará un inventario de todos los suministros del laboratorio. Deberá contarse la cantidad o los números de los artículos que se tengan en existencia y se comprobará que la cifra corresponde a la que figura en la columna "Existencia" de la ficha. PEDIDO DE SUMINISTROS Un laboratorio adecuadamente organizado hará un pedido de suministros a los expendios centrales cada 3 meses. Para elaborar cada pedido examínense las fichas de existencias, una por una. Es más fácil calcular las cantidades que se necesitan por mes (véase tabla 2.4) si en la parte inferior de cada ficha de existencias se añade un cuadro como el siguiente: Tabla 2.4 Estimación de la cantidad de suministros requeridos Año Cantidad usada por mes Enero
Febrero
Marzo
Abril
Mayo
Junio
Julio
Agosto
Septiembre
Octubre
Noviembre
Diciembre
2000 2001 2002 2003
En el caso de las sustancias químicas, las tinciones y los reactivos, pídanse las cantidades que se suelen usar en 3 meses, tomando en cuenta cualesquiera aumentos o disminuciones recientes en tales cantidades. Por ejemplo: — En un año se han usado 8 frascos de tinción de Giemsa — Esto equivale a una medida de 2 frascos cada 3 meses — Pídanse 2 frascos cada 3 meses (ó 4 frascos cada 6 meses si los pedidos se elaboran dos veces al año). FECHAS DE VENCIMIENTO Algunos reactivos (antisueros para grupos sanguíneos, antígenos, etc.) se deben emplear antes que se cumplan sus fechas de vencimiento. Anótense las fechas de vencimiento en las fichas de existencias.
Tabla 2.5 Registro de Hematología a Fecha
Muestra no.
Pacien te
En Eritrocitos viado Concentración b Concentración Fracción VSG Morfología de Hb (g/l) por de No. de (mm/h) Volumen
2.1.01
1
Sr R
Dr M
117
—
23
—
ANS ++ POIQ + PMN ++
2.1.01
2
Sra L
Dr H
58
0.21
52
—
ANS ++ POIQ ++ HC ++ PMN +
Fracción deosc no. de Reticulocitos 124 ¥ 10
-3
CHCMd (g/l)
Leucocitos
Paludismo
Concentración Fracción de número de los tipos
Otras Resultados pruebas enviados
en (fecha)
de No. N 9
—
4.2 ¥ 10
276
5.7 ¥ 109
L
M
E
O
0.48 0.35 0.13 0.04 — Numerosos. trofozoítos de
—
2.1.01
—
2.1.01
P. falciparum 0.071 ¥ 10 -3
0.32 0.56 0.04 0.08 — Moderado no de trofozoítos de P. falciparum
Hb: Hemoglobina; VSG: Velocidad de Sedimentación Globular; ANS: Anisocitosis; POIQ: Poiquilocitosis; PMN: Eritrocitos polimorfonucleares (¿?); HC: Hematíes hipocrómicos; CHCM: Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media ; N: Neutrófilos; L: Linfocitos; M: Monocitos; E: Eosinófilos; O: Otros. a Para explicación de los encabezados de columna, consulte las secciones pertinentes del texto. b La hemoglobina también puede ser expresada en función de la concentración de la sustancia, el título de la columna sería entonces “Hb (Fe), concentración de la sustancia (mmol / l)”. En ese caso, los valores citados en los dos ejemplos serían 7,3 y 3,6 mmol / l, respectivamente. c En este ejemplo los reticulocitos se expresan como fracción de número. También se pueden expresar como concentración de número, o sea su número por litro. A sí, el encabezado de la columna sería “concentración de número de reticulocitos (x 109/l)” y las cifras dependerían de las concentraciones de número de los eritrocitos (que no se indican en los ejemplos puestos en este cuadro).
“
d La concentración media de hemoglobina en los eritrocitos también se puede expresar como concentración de sustancia; de este modo el encabezado de la columna sería “Concentración de Hemoglobina (Fe) Corpuscular media CHCM (Fe) (mmol/l)”. En este caso, el ejemplo que se cita (No. 2) tendría un valor de 17.1.
Tabla 2.6 Registro de química sanguínea Fecha Muestra no.
Paciente
Enviado por
Urea, concentración de sustancia (mmol/l)
Concentración de Glucosa (mmol/l)
Otras pruebas (especificar)
Resultados enviados en (fecha)
2.1.01
1
Sra W
Sala 1
12.8
—
—
2.1.01
2.1.01
2
Sr G
Dr 1 W
—
5.3
—
2.1.01
Tabla 2.7 Registro de análisis de orina Fecha Muestra no.
pH Paciente Enviado por
Cetonas
Pruebas químicas para sangre
NR
NR
NR
NR
2.1.01
NR
+
NR
Prueba de embarazo: positiva
2.1.01
Examen microscópico directo
Prueba de glucosa
Proteínas
Pigmentos biliares
Urobilinógeno
Leucocitos (20–30 por campo de alta resolución), escasos cilindros hialinos
Negativo
Negativo
NR
+++
Negativo
NR
2.1.01
1
Sr C
Dr R
7.0
2.1.01
2
Sra E
Dr A
6.8 Leucocitos (5–10 por campo de alto aumento), escasas células epiteliales
NR: Prueba no realizada; —: negativo; +: positivo débil; ++: moderadamente positivo +++: fuertemente positivo.
Otras pruebas Resultados (especificar) enviados en (fecha)
Tabla 2.8 Examen del LCR (en el registro de análisis de orina o por separado) Fecha
Paciente Envia do por
Muestra no.
Apariencia Examen microscópico Concentración del no. de macroscópica directo leucocitos
2.1.01
1
Srta W Dr G
Turbio
Gram: Abundantes leucocitos Escasos diplococos intracelulares Gram negativos
17.1.01
2
Sr L
Claro
NR
Dr C
Concentración de Glucosa (mmol/l)
Concentración de Proteínas totales (g/l)
Prueba de Pandy de las globulinas
30
1.5
0.45
+
4
3.3
0.25
Negativo
Otras pruebas (especificar)
Leucocitos tipo, no., fracción: neutrófilos 0.94, linfocitos 0.06
NR
Resultados enviados en (fecha) 2.1.01
17.1.01
Tabla 2.9 Registro de bacteriología Fecha
Muestra no.
Paciente
2.1.01
1
Sr J
2.1.01
2
Sra A
3.1.01
3
Sr L
3.1.01
4
Sra R
Enviado por Dr R
Sala Médica 2
Dr M
Sala Médica 1
Muestra
Examen solicitado
Resultados
Resultados enviados en (fecha)
Esputo
Examen microscópico de frotis para tuberculosis
No se observan BAAR (bacilos ácido - alcohol resistentes
2.1.01
Pus de herida
Examen microscópico de frotis teñido con Gram
Abundantes leucocitos; escasos hematíes; escasas células epiteliales; cantidad moderada de bacilos Gramnegativos
2.1.01
Pus uretral
Examen microscópico de frotis teñido con Gram
Cantidad moderada de diplococos Gramnegativos intracelulares, incluyendo cocos gonocócicos
3.1.01
LCR
Examen microscópico de frotis teñido con Gram
Muy escasos leucocitos y células epiteliales; no se observan hematíes ni microorganismos
3.1.01
Tabla 2.10 Registro de parasitología Fecha Muestra no.
Enviado Muestra provista por
Paciente
Examen solicitado
Resultados
Resultados enviados en (fecha)
2.1.01
1
Sr F
Dr A
Heces
Parásitos intestinales
Microscopia directa: Se observa cantidad moderada de huevos de Ascaris lumbricoides
2.1.01
2.1.01
2
Srta M
Dr C
Heces
Parásitos intestinales
Microscopia directa: No se observan huevos ni parásitos. Técnica de concentración: No se observan huevos ni parásitos.
2.1.01
2.1.01
3
Sra L
Sala Cortes de Médica 1 piel
Oncocercosis
No se observan parásitos
3.1.01
3.1.01
4
Sr S
Dr R
Parásitos
Sangre oculta: Positivo Microscopia directa: Se observan numerosos trofozoítos de Entamoeba histolytica y algunos huevos de Ancylostoma duodenale
3.1.01
Heces
Tabla 2.11 Registro de serología Fecha
Enviado por Muestra no.
3.1.01
1
Muestra
Examen solicitado
Resultados
Resultados enviados en (Fecha)
No reactivo
3.1.01
Reactivo, 1 : 8
3.1.01
Paciente Sra P
Clínica prenatal
Sangre
ELISA para la determinación de Ac anti-HIV
3.1.01
2
Sra T
Dr M
Sangre
ELISA para la determinación de Ac anti-HIV
ELISA: Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas; HIV: Virus de la Inmunodeficiencia humana; Ac: Anticuerpos
47
Tabla 2.12 Muestra del informe mensual para un laboratorio de salud Nombre del laboratorio: Informe de fin de mes: REGISTRO DE LABORATORIO Número de exámenes realizados Hematología (general) 1235 Química sanguínea 27 Análisis de orina: Examen directo 287 43 Química 17 Pruebas de embarazo Exámenes del LCR: Examen directo 3 3 Química Parasitología: 162 Examen de heces 802 Examen de sangre Otros exámenes (por ej., examen de glándulas linfáticas para tripanosomas) 2 Bacteriología: 63 Tinciones de Gram 41 Tinciones ácido-alcohol resistentes 11 Tinciones de Wayson Micología 3 Serología 114 Cualitativa 16 Cuantitativa Número de muestras enviadas a laboratorios especializados Agua para análisis bacteriológico 8 Muestras para cultivo bacteriológico 32 Suero para serología 0 Biopsias de tejidos 2 Otras muestras 0 REGISTRO DE ENFERMEDADES TRANSMISIBLES a Número de casos informados Exámenes bacteriológicos Gonorrea 11 Lepra 0 Plaga 0 Tuberculosis 7 Exámenes parasitológicos Amebiasis 14 Ascaridiasis 22 Filariosis 1 Ancilostomiasis 80 Paludismo 253 Oncocercosis 0 Esquistosomiasis 2 a La lista de enfermedades de notificación obligatoria, varía de un país a otro. Las autoridades centrales de salud pública la formulan teniendo en cuenta: Los reglamentos internacionales para la notificación de enfermedades transmisibles Las enfermedades prevalecientes en el área
48
3 PROCEDIMIENTOS GENERALES DE LABORATORIO Muchas enfermedades prevalecientes en los climas cálidos son transmisibles y se propagan por gérmenes que a menudo se pueden observar por medio del microscopio en muestras obtenidas de pacientes. Por lo tanto, la microscopia directa es indispensable en los laboratorios de los países tropicales. Un laboratorio clínico sin microscopio, o con un microscopio que no se conserva de manera adecuada, no se puede considerar equipado con propiedad. 3.1 Uso de un microscopio El microscopio es un instrumento esencial para el diagnóstico de una enfermedad. Es un instrumento de precisión que requiere un mantenimiento cuidadoso para evitar daños en las partes mecánicas y oculares y también para detener los hongos que producen oscurecimiento de las lentes. 3.1.1 COMPONENTES DE UN MICROSCOPIO Los diversos componentes del microscopio se pueden agrupar en cuatro sistemas: - El sistema de soporte - El sistema de aumento - El sistema de iluminación - El sistema de ajuste. SISTEMA DE SOPORTE (Fig. 3.1) Este consiste en: - El pie (1) - El bastidor o brazo (2) - Portaobjetivo revólver giratorio (cambiador de objetivos) (3) - La platina (4) - La platina mecánica (5), que imprime un movimiento lento y regulado al portaobjeto. SISTEMA DE AUMENTO (Fig. 3.2) Consiste en un conjunto de lentes. Las lentes del microscopio se encuentran montadas en dos grupos, uno en cada extremo de un tubo relativamente largo, o tubo del microscopio, — el primer grupo de lentes se halla en el extremo inferior del tubo, inmediatamente arriba de la preparación que se va a examinar (el objeto), y se denomina objetivo — el segundo grupo se encuentra en el extremo superior del tubo, por donde mira el microscopista, y se llama ocular. LOS OBJETIVOS (a) Aumento El poder de aumento de cada objetivo se indica por un número grabado en la manga de la lente (Fig. 3.3): — el objetivo x 10 aumenta 10 veces — el objetivo x 40 aumenta 40 veces — el objetivo x 100 aumenta 100 veces. (El objetivo x 100 generalmente se encuentra marcado con un anillo rojo para indicar que se debe usar con aceite de inmersión.) Algunos microscopios están equipados con un objetivo x 3 o x 5 en lugar de un objetivo x 10. (b) La abertura numérica (AN) La AN también se halla grabada en la manga de la lente, junto a la indicación del poder de aumento (Fig. 3.4); por ej. — 0,30 en el objetivo x 10 --- 0,65 en el objetivo x 40 — 1,30 en el objetivo x 100 A medida que aumenta la AN es mayor el poder de resolución (capacidad de hacer perceptibles detalles adyacentes muy cercanos, separándolos y aclarándolos) (véase a continuación). (Además, a medida que aumenta la AN disminuyen las dimensiones de la lente frontal montada en la base del objetivo. La lente frontal del objetivo x 100 tiene el tamaño de una cabeza de alfiler, por lo que se debe manejar con cuidado.) (c) En la manga del objetivo puede haber varios números: La longitud recomendada en mm para el tubo del microscopio (entre el objetivo y el ocular), es generalmente de 160 mm El grosor recomendado en mm para el cubreobjetos utilizado para tapar el portaobjetos, por ej., 0,16 o 0,17. Las roscas para atornillar todos los objetivos son uniformes, de manera que estos se pueden intercambiar en el revólver. (d) Distancia de operación del objetivo Esta es la distancia que hay entre la lente frontal del objetivo y el portaobjetos cuando la imagen se encuentra enfocada. A medida que el poder de aumento del objeto es mayor disminuye la distancia de operación (Fig. 3.5). — objetivo x 10: la distancia de operación es de 5 - 6 mm — objetivo x 40: la distancia de operación es de 0,5 -1,5 mm — objetivo x 100: la distancia de operación es de 0,15 - 0,20 mm (e) Poder de resolución Cuanto mayor sea el poder de resolución del objetivo será más clara la imagen y aumentará la capacidad de poner de manifiesto detalles adyacentes muy cercanos, separándolos y aclarándolos.
49
El poder de resolución máximo de un buen microscopio de laboratorio médico es, aproximadamente, de0,25 µm (el poder de resolución del ojo humano normal es de 0,25 mm). El aceite de inmersión aumenta el poder de resolución al hacer que se conserven muchos rayos luminosos que se perderían por refracción al usar un objetivo seco.
Ilustración anexa A
Ilustración anexa A Los componentes del microscopio óptico, básicamente, pueden ser agrupados en 4 sistemas a) El sistema de soporte; b) El sistema de aumento; c) El sistema de iluminación; d) El sistema de ajuste. Figura 3.1 Componentes del sistema de soporte de un microscopio: El pie o base (1); El bastidor o brazo (2); Portaobjetivo revólver giratorio (cambiador de objetivos) (3); La platina (4); La platina mecánica (5), que imprime un movimiento lento y regulado al portaobjeto.
50
Figura 3.2 Componentes del sistema de aumento de un microscopio.
Figura 3.3 Objetivos. Se muestran uno de x 10, otro de x 40 y uno de x 100. El objetivo de x 100 genralmente se encuentra marcado con un anillo rojo para indicar que se debe usar con aceite de inmersión. Figura 3.4 Apertura numérica (AN). La an también se halla graba en la manga de la lente, junto a la indicación del poder de aumento, en este caso, en la figura es 1.30 (AN) en el objetivo x 100.
Figura 3.5 Distancia de operación o trabajo del objetivo entre la lente frontal del objetivo y el portaobjetos. Esta distancia indica la longitud en la cual la imagen ya está enfocada. Nótese en la figura que a mayor aumento menor es la distancia con el portaobjetos.
51
Ilustración anexa B Cuanto mayor sea el poder de resolución del objetivo será más clara la imagen y aumentará la capacidad de poner de manifiesto detalles adyacentes muy cercanos, separándolos y aclarándolos. El poder de resolución máximo de un buen microscopio de laboratorio médico es, aproximadamente, de 0,25 µm (el poder de resolución del ojo humano normal es de 0,25 mm). El agregado de aceite de inmersión aumenta el poder resolutivo. Obsérvese los puntos dentro de los círculos, la distancia de separación entre ambos puntos que puede ser percibida a distintos poderes resolutivos. Con uno menor a 0,25 µm los puntos aparecen muy cercanos, casi juntos, sin apreciarse separación entre ellos. EL OCULAR Aumento El poder de aumento se encuentra marcado en el ocular (Fig. 3.6): — Un ocular x 5 aumenta 5 veces la imagen que produce el objetivo — Un ocular x 10 aumenta la imagen 10 veces. Si la imagen del objeto se hace aumentar 40 veces mediante el objetivo x 40 y en seguida 5 veces mediante el ocular x 5, el aumento total será de 5 x 40 = 200. Para calcular el aumento total de la imagen del objeto que se observa, multiplíquese el poder de aumento del objetivo por el del ocular. El poder de aumento de los microscopios utilizados en los laboratorios médicos oscila entre 50 y 1000. Ciertos oculares tienen una retícula calibrada. Estos oculares se utilizan para medir el tamaño de un objeto bajo el microscopio (por ejemplo, los quistes de protozoarios). Microscopios binoculares Los microscopios binoculares (que poseen dos oculares, pero solo se usa un objetivo en cada ocasión) fatigan menos los ojos cuando se deben realizar exámenes prolongados. Sin embargo, la iluminación eléctrica es esencial para el objetivo x 100. EL SISTEMA DE ILUMINACIÓN 1. La fuente luminosa De preferencia se empleará luz eléctrica, pues es más fácil de ajustar. Puede proporcionarla una lámpara contenida en el microscopio por debajo de la platina o mediante una lámpara exterior colocada frente al microscopio. De lo contrario se podrá utilizar la luz del día. El microscopio nunca se debe utilizar ni debe permanecer bajo la luz directa del sol. Deberá estar bien iluminado, pero se usará una luz amortiguada. Si la luz del sol es excesivamente brillante se colocará frente al microscopio una botella o redoma de vidrio claro, llena de agua, a fin de reducir la intensidad de la luz. 2. El espejo El espejo refleja los rayos de la fuente luminosa sobre el objeto. Por un lado su superficie es plana y cóncava por el otro (Fig. 3.7). El lado cóncavo constituye un condensador de escaso poder y no se debe usar si ya se cuenta con un condensador propiamente dicho. 3. El condensador El condensador (Fig. 3.8) lleva los rayos luminosos a un foco común sobre el objeto que se habrá de examinar. Se encuentra colocado entre el espejo y la platina. Se puede elevar (iluminación máxima) y bajar (iluminación mínima). Se debe centrar y ajustar adecuadamente. 4. El diafragma El diafragma (Fig. 3.9), que se encuentra dentro del condensador, se utiliza para reducir o ampliar el ángulo, y, por lo tanto, también la cantidad de luz que entra en el condensador. Cuanto más se abre el diafragma más se amplía el ángulo y en consecuencia aumenta la AN y se pueden observar detalles más pequeños. Sin embargo, al mismo tiempo se reduce el contraste. Filtros En algunos microscopios se ajustan filtros de colores (principalmente azules) debajo del condensador. Se pueden dejar en su sitio o quitarlos, según el tipo de preparación que se vaya a observar. EL SISTEMA DE AJUSTE (Figs. 3.10 y 3.11) Este sistema comprende:
52
La cremallera de avance rápido o tornillo macrométrico El tornillo micrométrico de avance lento El tornillo de ajuste del condensador Los tornillos para centrar el condensador El elevador del diafragma iris Reguladores de la platina mecánica 1. La cremallera de avance rápido Es el tornillo mayor. Se utiliza primero para lograr la aproximación del enfoque. También, es llamado Macrométrico. 2. El tornillo micrométrico de avance lento Hace que el objetivo se desplace más lentamente. Se emplea para conseguir un enfoque perfecto del objeto. 3. El tornillo de ajuste del condensador Se utiliza para elevar el condensador y aumentar la iluminación o descenderlo y reducir la iluminación. 4. Los tornillos para centrar el condensador Puede haber tres tornillos colocados alrededor del condensador: uno al frente, uno a la izquierda y uno a la derecha. Se usan para centrar el condensador exactamente en relación con el objetivo. 5. El elevador del diafragma iris Este es un pequeño elevador que se encuentra fijo al condensador. Se puede mover para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o aumentando así el ángulo y la intensidad de la luz. 6. Reguladores de la platina mecánica Se utilizan para desplazar el portaobjetos sobre la platina (véase Fig. 3.11): 1 tornillo lo desplaza hacia atrás y hacia adelante 1 tornillo lo desplaza a la izquierda o la derecha.
Figura 3.6 Un ocular.
Figura 3.7 Un espejo de microscopio.
Figura 3.8 Un condensador.
Figura 3.9 Un diafragma.
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Fig. 3.11 Figura 3.10 Sistema de ajuste del microscopio. 1) Tornillo de avance rápido o tornillo macrométrico; 2) Tornillo micrométrico de avance lento; 3) Tornillo de ajuste del condensador; 4) Tornillos para centrar el condensador; 5) Elevador del diafragma iris. Figura 3.11 6) Reguladores de la platina mecánica Se utilizan para desplazar el portaobjetos sobre la platina. Un tornillo lo desplaza hacia atrás y hacia delante, un tornillo lo desplaza a la izquierda o la derecha (véanse las flechas). 3.1.2 CONFIGURACIÓN Y PREPARACIÓN DEL MICROSCOPIO Cuando se recibe un nuevo microscopio en el laboratorio es importante saber cómo prepararlo. 1. Posición del microscopio Coloque el microscopio sobre una mesa firme, de nivel uniforme (compruebe con un nivel de burbuja) y tamaño adecuado, pero no demasiado alta. Si se va a usar iluminación eléctrica el microscopio deberá estar a la sombra, lejos de las ventanas. Debajo del microscopio coloque una pieza cuadrada de fieltro. Si no se dispone de fieltro utilice una pieza de tela gruesa. MONTAJE DE UNA LÁMPARA PARA EL MICROSCOPIO Si se dispone de un microscopio con espejo se podrá armar una lámpara que le proporcione iluminación. En una base de madera se montará un soporte de porcelana para bombillas incandescentes y se encerrará este conjunto en una caja de madera u hojalata con una abertura para que salga la luz (Fig. 3.12). Ábranse ranuras en la tapa de la caja a fin de evitar que la bombilla se caliente demasiado, y al mismo tiempo se facilita su enfriamiento. También se puede fijar una hoja plegadiza encima de la abertura de la caja, que sirva de postigo (Fig. 3.13). Úsese una bombilla opaca del tipo "luz de día" (azul-blanco): — de 60 vatios para microscopios monoculares — de 100 vatios para microscopios binoculares. 2. Colocación de los accesorios — Atornille los objetivos en el revólver en el sentido de las manecillas del reloj y en el siguiente orden: — (objetivo x 3 ó x 5) -- objetivo x 10 — objetivo x 40 — objetivo x 100 (para inmersión en aceite). Las roscas para atornillar los objetivos son estándar. — Coloque en su sitio el ocular o los oculares. — Fije el condensador debajo de la platina. — Fije el espejo en el pie del microscopio. 3. Posición de la lámpara Si se va a usar iluminación eléctrica ponga la lámpara a una distancia de 20 cm al frente del microscopio, por delante del espejo, que se colocará en un ángulo de 45°. Cubra el espejo con una pieza de papel. Ajuste la posición de la lámpara de manera que la luz brille en el centro del espejo (Fig. 3.14). Si la lámpara está provista de una lente, los filamentos del bombillo se proyectan sobre la pieza de papel con que se ha cubierto el espejo. Esto permite centrar el haz luminoso con mayor precisión. En algunos modelos se hace girar el bombillo hasta que se obtiene una imagen clara del filamento 4. Ajuste preliminar del espejo Utilice el lado plano del espejo. Quite, si los hay, los filtros de colores. Abra el diafragma iris hasta el máximo. Eleve el condensador. Coloque una pieza de papel blanco de poco espesor sobre la lente de la cúpula del condensador. En esta pieza de papel se deberá observar una imagen del bombillo eléctrico, rodeada por un círculo de luz (Fig. 3.15).
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Ajuste el espejo de manera que la imagen del bombillo quede exactamente en el centro del círculo luminoso (Fig. 3.16), (o bien, si se utiliza la luz del día, que quede en el centro la porción más brillante). 5. Pasos a seguir para centrar el condensador (cuando existe el mecanismo pertinente) Es muy importante centrar correctamente el condensador. Este aspecto se descuida con frecuencia. a) Coloque en la platina una preparación en su correspondiente portaobjetos, sin cubreobjetos. Haga descender el condensador. Abra el diafragma iris. Examine con el objetivo de menos poder (x 3, x 5 ó x 10). Observe la preparación a través del ocular y enfóquese. b) Cierre el diafragma. En el campo microscópico aparecerá un círculo borroso de luz rodeado por un anillo oscuro (Fig. 3.17). c) Eleve el condensador lentamente hasta que los bordes del círculo luminoso estén claramente enfocados (Fig. 3.18). d) Ajuste, si es necesario, la posición del espejo, de manera que el círculo luminoso quede centrado exactamente o sobrepuesto al área clara que está rodeada por la zona oscura (Fig. 3.19). e) Por medio de los tornillos para centrar el condensador haga los ajustes necesarios hasta que el círculo luminoso se halle exactamente en el centro del campo microscópico (Fig. 3.20). Repita esta operación con los demás objetivos. 6. Ajuste del diafragma Abra el diafragma completamente. Retire el ocular y observe directamente a través del tubo del microscopio; la lente superior del objetivo aparecerá llena por un círculo luminoso. Cierre el diafragma lentamente hasta que este círculo luminoso ocupe solo 2 /3 de la superficie (Fig. 3.21). Repita esta operación al usar cada objetivo. 7. Ajuste de los oculares Elección del ocular Los oculares x 5 ó x 10 proporcionan resultados satisfactorios en el laboratorio médico. Si se utilizan oculares de mayor poder se intensificará el aumento, pero es probable que no se observen mejor los detalles. El ocular que se use dependerá de la elección que se haga. Ajuste binocular En los microscopios binoculares la distancia interpupilar (distancia entre las pupilas de los ojos) se puede ajustar según la conveniencia del operador. Enfoque de los ojos derecho e izquierdo Uno de los soportes de los oculares (casi siempre el izquierdo) está provisto de un anillo para enfoques (Fig. 3.22). Si este anillo se encuentra en el soporte del ocular izquierdo, cierre el ojo izquierdo y, empleando el objetivo x 40, enfoque la imagen para el ojo derecho por el ocular derecho. A continuación cierre el ojo derecho y observe con el ojo izquierdo a través del ocular izquierdo. Si la imagen se encuentra enfocada no se necesitará ajuste alguno. Si la imagen no es clara, haga girar el anillo de enfoque hasta aclararla. En este momento el microscopio habrá quedado ajustado de acuerdo con la visión binocular propia del operador.
Figura 3.12 Montando una lámpara para el microscopio. Figura 3.13 Fuente alternativa de luz para el microscopio.
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Figura 3.14 Ajustando la posición de la fuente de luz
Figura 3.15 Ajuste del espejo. Figura 3.16 Imagen de la fuente de luz, como se ve a través del condensador.
Figura 3.17 Para centrar el condensador, primero cierre el diafragma. Figura 3.18 Eleve el condensador hasta los bordes del círculo de luz están en foco. Figura 3.19 Ajuste la posición del espejo al centro de la fuente de luz. Figura 3.20 Use los tornillos de centrado del condensador al centro de la fuente de luz.
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Figura 3.21 Ajuste del diafragma. Figura 3.22 Enfoque de los oculares. 3.1.3 ENFOQUE DEL OBJETIVO 1. Empleo de un objetivo de bajo poder (x 10) Descienda el condensador completamente. Descienda el objetivo hasta que se encuentre inmediatamente por arriba de la preparación que se encuentra en el portaobjetos. Utilizando la cremallera de avance rápido eleve el objetivo hasta que observe una imagen clara a través del ocular. En algunas ocasiones no se puede lograr una imagen clara a pesar de que el objetivo se ha bajado todo lo posible. Esto obedece a que el tornillo micrométrico de avance lento se ha girado completamente hacia la derecha. Gire este tornillo hacia la izquierda hasta donde sea posible y a continuación busque el enfoque subiendo el objetivo. Si la iluminación es insuficiente suba el condensador ligeramente. 2. Empleo de un objetivo de gran poder (x 40) Baje el condensador hasta la mitad de la distancia que recorre. Descienda el objetivo hasta colocarlo inmediatamente por arriba de la preparación que se encuentra en el portaobjetos (la distancia de operación es muy corta: aproximadamente 0,5 mm). Por medio de la cremallera de avance rápido eleve el objetivo muy lentamente hasta que aparezca una imagen borrosa en el campo microscópico. Busque el enfoque por medio del tornillo micrométrico de avance lento. Eleve el condensador para obtener suficiente iluminación. Si el microscopio no tiene condensador utilice el lado cóncavo del espejo. 3. Empleo del objetivo de inmersión en aceite (x 100) Se deben utilizar preparaciones teñidas completamente secas. Ponga una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la porción que se va a examinar (de preferencia use aceites sintéticos que no se secan, en vez de aceite de madera de cedro, que se seca rápidamente). Eleve el condensador hasta donde pueda llegar y abra completamente el diafragma iris. Descienda el objetivo x 100 hasta que se ponga en contacto con el aceite. Acerque el objetivo al portaobjetos hasta donde sea posible, pero evite que presione la preparación (los objetivos modernos están provistos de un amortiguador). Observe a través del ocular y gire hacia arriba, muy despacio, el tornillo micrométrico de avance lento hasta que la imagen se encuentre enfocada. Si la iluminación es inadecuada utilice el lado cóncavo del espejo como se ha recomendado para el objetivo x 40. Importante: En la mayoría de los microscopios actuales no se sube o baja el soporte del objetivo, sino la platina que se mueve por medio de la cremallera de avance rápido y el tornillo micrométrico de avance lento. En este caso los tornillos se deben girar en dirección opuesta para enfocar la imagen. Profundidad del campo microscópico Cuando se usa un objetivo de escaso poder se puede observar la profundidad de la imagen. En estas condiciones la profundidad del enfoque es pequeña y la impresión que se obtiene de ella aumenta al emplear objetivos de mayor poder (x 40, x 100); se debe usar el tornillo micrométrico de avance lento para examinar todos los detalles del objeto observado, de arriba abajo del enfoque (por ejemplo, los diferentes núcleos de un quiste amebiano esférico). 4. Imágenes que se observan mediante el microscopio Recuerde que el círculo luminoso que se observa a través del ocular se denomina "campo microscópico". Cómo determinar la posición de los objetos observados
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Los objetos que se observan en el campo microscópico se pueden localizar en relación con las manecillas del reloj. Por ejemplo, en la ilustración se ha colocado un huevo de esquistosoma "a las 2" (Fig. 3.23). Inversión de las imágenes Las imágenes son invertidas por las lentes: — los objetos que aparecen en el fondo del campo microscópico se encuentran realmente en la parte más alta — los objetos que aparecen en el lado izquierdo del campo microscópico se encuentran realmente en el lado derecho. Desplazamiento del objeto Si mueve el portaobjetos hacia la derecha, el objeto examinado se desplazará hacia la izquierda. Si mueve el portaobjetos hacia usted, el objeto examinado se alejará (Fig. 3.24). Cambio de los objetivos Los microscopios modernos están construidos de tal manera que cuando se cambia de un objetivo de escaso poder a otro de mayor poder para examinar el mismo objeto, éste permanece más o menos enfocado. Si no ocurre así, suba el revólver antes de hacer el cambio aun objetivo de mayor poder y enfoque nuevamente. Antes de cambiar los objetivos cerciórese de que el objeto examinado se encuentra en medio del campo microscópico, a fin de no perderlo después del cambio.
Figura 3.23 El establecimiento de la posición de las imágenes vistas bajo el microscopio. Nótese que se dispone el campo microscópico como un reloj de agujas, con “las horas” para indicar la posición de un determinado elemento que se quiere ubicar para orientarse. Por ej., en la imagen se observa un huevo de esquistosoma a “las 2 horas”. En el campo no existen estos números sino que Ud. los tiene que imaginar. Figura 3.24 Al mover el objeto hacia el operador el objeto se aleja, si lo mueve hacia la derecha, éste se mueve a la izquierda. Además, los objetos que aparecen en el fondo del campo microscópico se encuentran realmente en la parte más alta. 3.1.4 USO DE UN MICRÓMETRO OCULAR El tamaño de los microorganismos o las subestructuras de los organismos puede ser medido por microscopía utilizando un ocular con un disco micrómetro calibrado. El disco micrómetro tiene una escala que se suele dividir en 0,1 -mm y 0,01 -mm de subdivisiones (Fig. 3.25). Un micrómetro de platina se utiliza para calibrar el micrómetro ocular.
Figura 3.25 Un disco micrómetro ocular Figura 3.26 Calibraciones de un micrómetro ocular con un micrómetro de platina
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Materiales Microscopio Binocular Ocular con un aumento de x 10 Disco micrométrico ocular Micrómetro de platina Papel lente Aceite de inmersión. MÉTODO 1. Desenroscar la lente del ojo del ocular. 2. Coloque el micrómetro con escala grabada con la cara hacia abajo en el ocular. Utilice papel de lente para manejar el disco. 3. Vuelva a colocar el lente con cuidado. 4. Coloque el ocular con el micrómetro en el tubo ocular del microscopio. 5. Ponga el micrómetro calibrado sobre la platina del microscopio y se centran en la escala. Usted debe ser capaz de distinguir claramente las subdivisiones 0,1-mm y 0,01 mm. 6. Ajustar el micrómetro de platina de manera tal que la línea 0-mm coincida con la línea 0-mm del micrómetro ocular. 7. Mire para otro conjunto de líneas, donde la escala del micrómetro de platina coincida con la de la micrómetro ocular. Este conjunto de líneas debe estar lo más lejos de la línea 0-mm como sea posible (Fig. 3.26). La distancia entre los dos conjuntos coincidentes de las líneas varía, dependiendo del aumento del objetivo del microscopio. 8. Contar el número de subdivisiones en 0,1-mm de la escala del micrómetro de platina entre la línea 0 y el segundo conjunto de líneas coincidentes. 9. Cuente el número de subdivisiones de la escala del micrómetro ocular entre el 0-línea y el segundo conjunto de líneas coincidentes. 10. Calcular la proporción de un milímetro que se mide por una unidad ocular sola utilizando la siguiente fórmula: lectura de la platina (mm) x 1000 µm unidades ocular (µm) lectura del ocular x 1 mm Ejemplo Para un microscopio con un objetivo de alta potencia (40 aumentos), el cálculo es como sigue: 0,1 mm x 1000 µm 2 µm 50 unidades x 1 mm Importante: los objetivos correspondientes no deben ser cambiados por un objetivo calibrado, sino que deben ser calibrados por separado. El ocular que contiene el disco micrómetro debe almacenarse hasta que se necesite. Cada microscopio que se va a utilizar para medir el tamaño de los organismos debe ser calibrado individualmente. 3.1.5 MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO Para obtener un campo oscuro se utiliza un condensador especial con un centro oscuro. Si esto no está disponible, es posible obtener un campo oscuro bajo los objetivos x10 y x40 mediante la inserción de un disco o un tope en el soporte del filtro por debajo del condensador. Los topes deben estar hechos de un material a través del cual la luz no puede pasar y deben ser del tamaño correcto para el objetivo en uso. Si el tope es demasiado pequeño, demasiada luz pasará al objetivo y un campo oscuro no se obtendrá. Si el tope es demasiado grande, estará disponible una luz insuficiente para iluminar la muestra. 3.1.6 MANTENIMIENTO RUTINARIO Los Microscopios deben ser instalados en un entorno limpio, alejado de productos químicos. Los lugares de trabajo deben estar bien ventilados o en lugar con aire acondicionado permanente (el uso intermitente de los acondicionadores de aire produce agua condensada). El microscopio requiere atención diaria para mantenerlo en buen estado de funcionamiento y de esta manera garantizar resultados confiables de laboratorio. Los instrumentos ópticos no deben mantenerse durante largos períodos en compartimentos cerrados ya que estas condiciones también favorecen el crecimiento de hongos que pueden corroer las superficies ópticas. Se requiere especial cuidado en climas cálidos y húmedos. LIMPIEZA DEL MICROSCOPIO Los microscopios se utilizan para investigar los tejidos y fluidos biológicos y por lo tanto deben ser descontaminados a intervalos regulares. Materiales 1. Piezas de trapos viejos y un pañuelo fino, de lino, que estén limpios 2. Papel de seda especial para lentes o, en su defecto, papel blanco absorbente (papel de tocador) 3. Si es posible, una pieza de piel de gamuza (de lo contrario, un trapo que no desprenda pelusa) 4. Un frasco pequeño de solución de limpieza (véase después) 5. Una cubierta de material plástico 6. Una pequeña pera de goma y, si es posible, un pincel fino de pelo de camello (o una brocha especial para limpiar lentes o un soplador para limpiar lentes) 7. En los climas cálidos y húmedos, En laboratorios que cuentan con electricidad: — un armario que esté templado, se calienta mediante uno o dos bombillos incandescentes de 40 vatios En los laboratorios que no cuentan con electricidad:
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— si es posible, un secador de 15 - 20 cm de diámetro, con no menos de 250 g de gel de sílice azul (que indica la existencia de humedad al tomar un color rojizo). Método Limpieza de las superficies ópticas Las superficies ópticas (condensador, los objetivos y oculares) debe mantenerse libre de polvo con un pincel fino, un pincel suave de pelo de camello (Fig. 3.27) o un soplador. Si el polvo se encuentra dentro del ocular, desenroscar la lente superior y limpie el interior. Los residuos de aceite en las lentes deben eliminarse con papel especial para lentes, papel absorbente o algodón de grado médico. Las superficies ópticas pueden ser finalmente limpiadas con una solución especial, que consiste en lo siguiente: - 80% de éter de petróleo (punto de ebullición 60-80 °C) - 20% de 2-propanol. Nota: No utilizar 95% de etanol, xileno o tolueno para la limpieza de las lentes, ya que estas sustancias disuelven el cemento. Ellos pueden, sin embargo, utilizarse para la limpieza de espejos. Limpieza del instrumento La contaminación en exceso puede ser eliminada con soluciones jabonosas suaves. La grasa y el aceite se pueden eliminar con la solución de limpieza especial descritos anteriormente. El instrumento debe ser limpiado con una mezcla 50:50 de agua destilada y 95% de etanol. Esta mezcla no es adecuada para la limpieza de las superficies ópticas. Las partes mecánicas (tornillo de ajuste grueso o macrométrico, tornillo de ajuste fino o micrométrico, enfoque del condensador y la platina mecánica) deberán ser periódicamente limpiadas y lubricadas con aceite de máquina para que funcionen libremente. Mantenimiento del microscopio Al llevar a cabo los procedimientos de Figura 3.27 Limpieza de los objetivos usando un reparación y mantenimiento, tenga cuidado de pincel suave de pelo de camello. no confundir los tornillos del centrado del condensador con los tornillos de sujeción del condensador. Para mantener el microscopio proceder de la siguiente manera: Verifique la platina mecánica. Compruebe el mecanismo de enfoque. Retire el crecimiento de hongos. Revise el diafragma. Limpie todas las piezas mecánicas. Lubricar el microscopio de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Compruebe la carga del resorte de la pinza que sujeta los portaobjetos. Un exceso de tensión puede provocar la rotura de los portaobjetos y dañar la pinza. Compruebe la alineación óptica. Un aspecto oscuro de la muestra es a menudo debido a una mala alineación de las piezas ópticas, más que la falta de luz. Precauciones Nunca sumergir los objetivos en xileno o etanol, ya que esto puede provocar que las lentes se desprendan. Nunca use papel ordinario para limpiar las lentes. Nunca toque las lentes con los dedos. Nunca limpie el soporte o la platina con xileno o acetona. Nunca limpie las lentes del interior de los oculares y objetivos con tela o papel (esto puede quitar la capa anti-reflectante), el uso de un pincel suave de pelo de camello, un pincel fino o un soplador en su lugar. Nunca deje el microscopio sin los oculares a menos que las aberturas están tapadas. Nunca mantenga el microscopio en una caja cerrada de madera en los países húmedos y calientes. No pulse nunca el objetivo al portaobjeto, ya que tanto el portaobjeto y el objetivo se puede romper. Tenga cuidado al enfocar el microscopio. Mantenga limpia la platina mecánica. No desmonte los componentes ópticos, ya que esto puede causar desalineación. Las superficies ópticas deben limpiarse con papel para lentes de limpieza o un pañuelo de papel suave. Nunca ponga el microscopio alejado con aceite de inmersión sobre el objetivo. Quite todo el aceite todos los días. Una solución de jabón suave es adecuada para la mayor parte de la limpieza. Utilizar disolventes orgánicos sólo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Nunca lleve el microscopio por el brazo con una mano; utilice ambas manos, una en el pie, la otra sosteniendo el brazo o bastidor. Al cambiar una lámpara, evite tocar la lente con los dedos, ya que las huellas dactilares reducen la intensidad de la iluminación. (A veces, en algunos microscopios modernos con luz
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incorporada, la lámpara viene con dos electrodos que se colocan directamente, pero éstos así como la lámpara, si son tocados con los dedos de la mano pueden quemarse directamente debido a que los afecta la grasa de los dedos, entonces, deben ser acarreados envueltos en un papel absorbente y manipulados con guantes de goma). Para maximizar la vida útil de las lámparas, ajustar el voltaje con un regulador de intensidad para dar la menor intensidad de luz requerida. Si la tensión de la red varía excesivamente, utilizar un estabilizador de tensión. Precauciones adicionales que deben tomarse en climas cálidos Los climas secos En climas cálidos y secos, el principal problema es el polvo. Las partículas finas se abren camino en las roscas de los tornillos y en las lentes. Esto se puede evitar del siguiente modo: Siempre mantenga el microscopio bajo una cubierta de plástico herméticamente cerrada cuando no esté en uso. Al final de la jornada de trabajo, limpie a fondo el microscopio soplando aire sobre ella con una perilla de goma. Terminar la limpieza de las lentes con un pincel suave de pelo de camello, un pincel fino o un soplador. Si las partículas de polvo permanecen en la superficie del objetivo, se limpia con un papel especial para lentes. Climas húmedos En climas calientes y húmedos y durante la temporada húmeda en climas cálidos y secos, los hongos pueden crecer en el microscopio, particularmente en la superficie de las lentes, en las ranuras de los tornillos y debajo de la pintura, y el instrumento pronto será inútil. Esto se puede evitar, como se describe a continuación. Siempre mantenga el microscopio bajo una cubierta de plástico herméticamente cerrada cuando no esté en uso, junto con un plato lleno con sílice azul para secar el aire debajo de la tapa. (La sílice se vuelve rojo cuando se ha perdido su capacidad de absorber la humedad del aire. Puede ser simplemente regenerado mediante calentamiento en un horno de aire caliente o sobre un fuego.) El microscopio debe ser limpiado diariamente para eliminar el polvo. Estos procedimientos deben llevarse a cabo con regularidad, y son esenciales en relación con los procedimientos de reparación y mantenimiento. 3.2 PESAJE: EL USO DE BALANZAS DE LABORATORIO Las balanzas pueden ser eléctricas o manuales. Todos los tipos se deben colocar en una mesa firme y nivelada lejos de las vibraciones, corrientes de aire y la luz solar directa. La balanza se utiliza para pesar productos químicos para la producción de reactivos, y la limpieza es esencial si se desea obtener resultados precisos: ● Quite el polvo soplando o con un cepillo suave. ● Elimine los tintes o los productos químicos con un cepillo suave. ● Utilice una cápsula de pesaje de plástico o un papel de filtro para pesar los productos químicos en la balanza, nunca coloque directamente productos químicos en el plato. Importante: Si ha utilizado agua para limpiar la balanza, asegúrese de que esté completamente seco antes de pesar. Siempre poner la balanza a cero antes de pesar. Compruebe la precisión de la balanza regularmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Maneje las pesas sueltas con pinzas. 3.2.1SENSIBILIDAD DE LA BALANZA La sensibilidad de la balanza corresponde a la masa más pequeña que desplace el fiel una división en la escala de medición. Por ejemplo, si la sensibilidad de la balanza es de 1 mg se necesitará por los menos una masa de 1 mg para desplazar el fiel. Para los fines habituales del laboratorio se puede considerar que la sensibilidad de una balanza es la masa más pequeña que esa balanza puede pesar con precisión. 3.2.2 BALANZA ABIERTA DE DOS PLATILLOS (Fig. 3.28) Esta balanza cuenta con dos platillos que reposan en sendas columnas. Puede estar construida para usarse con pesos separados, como la balanza que figura en la ilustración (Fig. 3.29), o tener un astil graduado en que se coloca una pesa corrediza (balanza suelta de Harvard). Se emplea para pesar cantidades grandes (hasta varios kg) cuando no se necesita una gran precisión; por ejemplo: 22,5 g, 38 g, 8,5 g, 380 g. Sensibilidad: 0,5 g (500 mg). Si los platillos han sido fabricados con un material que se pueda rayar o corroer fácilmente, protéjanse con discos recortados en piezas de material plástico resistente o películas para rayos X usadas, que tengan pesos iguales.
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Figura 3.28 Una balanza abierta de dos platillos. Figura 3.29 Juego de pesas (en gramos) para usar con una balanza abierta de dos platillos. PROCEDIMIENTO PARA PESAR CON LA BALANZA DE DOS PLATILLOS ABIERTA
1. Coloque a la izquierda de la balanza el recipiente que contenga la sustancia que va a pesar. 2. Coloque en el platillo izquierdo el receptáculo (papel doblado o plato pequeño) en que se pesará la sustancia. 3. Coloque en el platillo derecho las pesas equivalentes al peso del receptáculo más el de la cantidad de sustancia que se va a pesar. 4. Para medir la sustancia que se va a pesar: — con la mano izquierda sosténgase el recipiente inclinado hacia abajo (con la etiqueta hacia arriba) — con la mano derecha golpéese muy suavemente el cuello del recipiente de modo que el polvo o los cristales que se van a pesar caigan poco a poco en el receptáculo (Fig. 3.30). — utilice una espátula limpia cuando se pesan pequeñas cantidades de las sustancias. 5. Inmediatamente después de que se haya pesado la sustancia coloque el recipiente a la derecha de la balanza (Fig. 3.31). De este modo: — las sustancias que se han pesado quedarán a la derecha de la balanza — las sustancias que no se han pesado estarán a la izquierda. Esto evita confusiones. 6. Lea la etiqueta tres veces: — antes de retirar el recipiente de su anaquel — mientras se pesa la sustancia (la etiqueta deberá estar hacia arriba) — después de pesar la sustancia, ponga el recipiente a la derecha de la balanza
Ilustración anexa A Colocar a la izquierda el frasco con la droga a pesar. En el platillo izquierdo poner el pael doblado o receptáculo donde se pondrá la sustancia a pesar. En el platillo derecho se colocan las pesas.
Ilustración anexa A
Figura 3.30 Medición de la sustancia a ser pesada. Colocando la droga en un papel de filtro. Figura 3.31 Mantenga las sustancias pesadas y sin pesar aparte separadas para evitar la confusión.
Ilustración anexa B Lea la etiqueta tres veces durante todo el proceso: antes, durante y después de pesar.
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Ilustración anexa C Imágenes que muestran cápsulas de pesaje plásticas usadas para colocar las drogas a pesar. 3.2.3 BALANZA ANALÍTICA Esta balanza consta de dos platillos suspendidos de un astil (viga transversal) dentro de un estuche de vidrio. La balanza analítica se emplea: — para pesar cantidades pequeñas (hasta 20 ó 200 g, dependiendo del modelo) — cuando se requiere gran precisión; por ejemplo, 3,85 g, 0,220 g, 6,740 g. Sensibilidad: 0,5 mg - 0,1 mg, dependiendo del modelo COMPONENTES DE LA BALANZA ANALÍTICA (Fig. 3.32) A= astil. Esta es la estructura de que se suspenden los platillos. AC = aristas de los cuchillos (AC1, AC2, AC3). Sostienen el astil en el fulcro durante el tiempo que se determina el peso y proporcionan sensibilidad a la balanza. Las aristas que se encuentran en el astil sostienen los platillos suspendidos. E = estribos (El, E2). F= fiel. P = platillos. T = tornillo liberador del astil (o sujetador de los platillos). Detiene el movimiento de los platillos de modo que la adición súbita de pesas o de sustancias químicas no dañe las delicadas aristas de los cuchillos. TA = tornillos de ajuste (TA1, TA2). Solo se usan para ajustar inicialmente la balanza al cero sin carga.
Fig. 3.32 Figura 3.32 Componentes de la balanza analítica. AC1, AC2, AC3: Aristas de los cuchillos; A: Astil; E1, E2: Estribos; TA1, TA2: Tornillos de ajuste; F: Fiel; P: Platillos; T: Tornillo liberador del astil (o sujetador de los platillos). Figura 3.33 La figura muestra un juego de pesas para usar con la balanza analítica. INSTRUCCIONES PARA USAR LA BALANZA ANALÍTICA 1. El astil siempre se deberá encontrar en descanso (con el tornillo liberador apretado) antes de que se coloquen en los platillos las pesas y la sustancia que se va a pesar. 2. El astil siempre deberá quedar nuevamente inmóvil antes de retirar de los platillos las pesas y la sustancia que se ha pesado. 3. Coloque siempre la sustancia que va a pesar sobre una pieza de papel doblada cuatro veces, o bien en un cristal cóncavo (de reloj) o un platillo de porcelana. 4. Utilice siempre pinzas para recoger las pesas.
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5. Compruebe que los platillos se encuentran equilibrados aflojando el tornillo liberador del astil después de cerrar el estuche de vidrio. 6. Use los tornillos de ajuste TA1 y TA2 para lograr un equilibrio perfecto compensando el peso del receptáculo en que se ha colocado la sustancia que se va a pesar. — Cuando estos tornillos se giran hacia afuera del soporte central aumenta el peso. — Cuando se giran hacia adentro del soporte central el peso disminuye. 3.2.4 BALANZA DE DISPENSARIO (Fig. 3.34) Esta balanza también está provista de dos platillos suspendidos, pero carece de estuche de vidrio y el astil no tiene brazo de soporte. Sensibilidad: 5 -1 0 mg La balanza de dispensario es más exacta que la balanza abierta de dos platillos, pero solo puede pesar hasta 50 g. (Después de usarla, guarde la balanza en una alacena cerrada.) Juego de pesas para usarse en la balanza analítica. Pesas sueltas: 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 y 500 g. Pesas fraccionarias sueltas: 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 y 500 mg
Figura 3.34 Una balanza de dispensario.
AGREGADO: BALANZAS ELECTRÓNICAS DE PRECISIÓN En la actualidad también se usan estas balanzas electrónicas de un solo plato abiertas o adicionalmente se les puede colocar un estuche protector de vidrio o plástico transparente para evitar la acción del aire. Funcionan con electricidad, y en algunos modelos a pilas. Han avanzado en el terreno del pesaje ganando lugar por su practicidad, bajo costo, y fácil funcionamiento. Quizás en algunos lugares todavía no esté al alcance, pero en muchos otros ya lo está, especialmente en centros de salud periféricos de algunos países hispanoamericanos que disponen de acceso a la red eléctrica. Si no hay electricidad se usan las pilas en los modelos que permiten usarlas. Alcanzan sensibilidades bastante buenas, la suficiente como para pesar las cantidades usadas habitualmente en los laboratorios. Si bien, una balanza analítica de precisión electrónica tiene mayor sensibilidad, no está al alcance de todos por el precio abultado. En estas condiciones, estas balanzas como las mostradas en las figuras, cumplen y suplen la función de una balanza analítica aunque con limitaciones de sensibilidad, pero prácticas para las necesidades básicas de un laboratorio de salud periférico.
3.3 CENTRIFUGACIÓN 3.3.1 PRINCIPIO Fuerza centrífuga La fuerza centrífuga hace que un cuerpo se ponga en movimiento circular a gran velocidad (Fig. 3.35). De este modo se genera una fuerza que aleja este cuerpo del centro del círculo; se llama fuerza centrífuga (g) o fuerza centrífuga relativa (FCR). Al usar una centrífuga se deben respetar las instrucciones del fabricante.
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Para calcular la fuerza centrífuga relativa (FCR) o (g) de una centrifuga individual, medir el radio (r) del brazo del rotor (en cm) y el número de revoluciones por minuto (rpm) y utilizar la fórmula siguiente: Para calcular la fuerza centrífuga relativa (FCR) de una centrifuga individual: 2 g ó FCR 1.118 10 6 r rpm Por ejemplo, si el radio es de 25 cm y las rpm son de 1300 r/min, la FCR o g es aproximadamente de 50 g. Las centrífugas vienen con indicaciones de las rpm a las cuales podemos usar. Generalmente, una perilla para las rpm y otra perilla para el tiempo (temporizador), algunas más modernas traen una pantalla donde se indica las rpm utilizadas. Componentes de una centrífuga (Fig. 3.36) Las centrífugas constan de: — un eje o árbol central (A) que gira a gran velocidad — un cabezal (E) fijo al árbol y provisto de cubetas para sostener los tubos de centrifugación — los tubos (T) que contienen el líquido que se va a centrifugar, que se montan en el cabezal. Cuando el árbol gira ejerce sobre los tubos la fuerza centrífuga. Los tubos oscilan hasta colocarse en posición horizontal y las partículas en suspensión en los líquidos que contienen los tubos se impulsan hacia el fondo de cada uno. Las partículas que hay en los líquidos se comprimen en el fondo de los tubos de centrifugación y se forman los sedimentos centrifugados. Los sedimentos se pueden separar del líquido flotante y es posible examinarlos. Pueden contener: — corpúsculos sanguíneos huevos de parásitos (cuando se han centrifugado heces fecales diluidas) — células de los conductos urinarios (en la orina), etc.
Figura 3.35 Principio de centrifugación
Ilustración anexa B Ilustración anexa A Ilustración anexa A La acción de la fuerza centrífuga sobre los tubos hace que estos oscilen hasta que se coloquen en posición horizontal y las partículas se van ubicando en el fondo de los tubos. Ilustración anexa B Luego de un tiempo las partículas se depositan en el fondo de los tubos y se produce el sedimento centrifugado (véase el círculo). 3.3.2 DIFERENTES TIPOS DE CENTRÍFUGAS Centrífuga manual (Fig. 3.37) Esta centrífuga se hace girar por medio de un manubrio. Contiene de 2 a 4 tubos. Usos 1. Para examinar sedimentos en la orina 2. Para concentrar ciertos parásitos en las heces fecales. Su velocidad no es suficiente para separar en la sangre los glóbulos rojos y el plasma. Importante: 1. Con la prensa de sujeción de la centrífuga de mano fije ésta firmemente en un punto de apoyo estable (el borde de una mesa). 2. Equilibre completamente los dos tubos que se hallan diametralmente opuestos, como se indica en las instrucciones para el uso de esta clase de centrífuga, en la sección 3.3.3. 3. Manténgase a cierta distancia mientras efectúa la centrifugación. 4. Para detener la centrífuga no reduzca lentamente la velocidad del manubrio. Separe el manubrio de la máquina con un movimiento brusco. 5. Saque los tubos lenta y cuidadosamente (para no agitar los sedimentos). 6. Lubrique con regularidad el árbol de la centrífuga. Advertencia: La centrífuga manual puede causar serias lesiones físicas, por tanto, siga estas instrucciones minuciosamente.
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Ilustración anexa C
Figura 3.36 Componentes de una centrífuga. Un eje o árbol central (A) que gira a gran velocidad; un cabezal (E) fijo al árbol y provisto de cubetas para sostener los tubos de centrifugación; los tubos (T) que contienen el líquido que se va a centrifugar, que se montan en el cabezal. Figura 3.37 Centrífuga manual. Ilustración anexa C Algunos modelos de centrífuga cuentan con un cronómetro (C) o temporizador que detiene la centrífuga automáticamente cuando se cumple el tiempo (por ejemplo, 5 ó 10 minutos), un contador de revoluciones (CR) que es un cuadrante provisto de una aguja que indica la velocidad de la máquina durante la centrifugación en rpm. Centrífugas eléctricas En algunos sitios se pueden usar centrífugas que funcionan con pilas eléctricas. Las centrífugas eléctricas se construyen con dos tipos de cabezal. 1. Cabezal oscilante Este cabezal está diseñado para que durante la centrifugación los tubos adopten una posición horizontal. Este es el tipo de cabezal que se necesita con más frecuencia (Fig. 3.38). 2. Cabezal oblicuo Sostiene los tubos en un ángulo de 45°, aproximadamente, durante la centrifugación. Es útil en la aplicación de ciertas técnicas, como en los ensayos de aglutinación para determinar grupos sanguíneos por el método del tubo de ensayo. Sin embargo, no es esencial para las técnicas que se describen en este manual (Fig. 3.39). Accesorios de las centrífugas eléctricas Cubetas (para sostener los tubos) Existen varios tipos, según sea el modelo de la centrífuga (Fig. 3.40): (a) Cubetas diseñadas para sostener un solo tubo de fondo redondo o cónico (b) Cubetas para dos tubos de fondo redondo o cónico (c) Cubetas para nueve tubos pequeños (para precipitinas) etc. Algunos modelos de centrífuga cuentan con: — un cronómetro (C) o temporizador que detiene la centrífuga automáticamente cuando se cumple el tiempo (por ejemplo, 5 ó 10 minutos) — una cámara de enfriamiento que evita el calentamiento de la muestra durante la centrifugación; — un contador de revoluciones (CR) que es un cuadrante provisto de una aguja que indica la velocidad de la máquina durante la centrifugación (es útil para aplicar algunos métodos de concentración de parásitos). Centrifuga operada a baterías Centrifugas eléctricas pequeñas que funcionan con pilas se utilizan a veces para medir el volumen de células empaquetadas en hematología.
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Figura 3.38 Una centrífuga con cabezal oscilante. Figura 3.39 Una centrífuga con cabezal oblicuo. Figura 3.40 Tipos de cubetas porta tubos para una centrífuga. 3.3.3 INSTRUCCIONES PARA USAR LA CENTRÍFUGA ELÉCTRICA Equilibrio de las cubetas (Fig. 3.41) Si las cubetas están numeradas colóquense de la manera siguiente: — el tubo 1 frente al tubo 2 — el tubo 3 frente al tubo 4. Equilibre los tubos que se encuentran frente a frente pesándolos en sus cubetas en la balanza abierta de dos platillos. Para hacerlo puede: — agregar al tubo de menor peso cierta cantidad del líquido que va a centrifugar (Fig. 3.42), o — verter agua en la cubeta que contenga el tubo de menor peso (utilizando un frasco de lavado, Fig. 3.43). Si solamente se va a centrifugar un tubo que contenga líquido, equilíbrelo con un tubo idéntico lleno de agua. Para evitar que los tubos se rompan Cubra siempre el fondo de las cubetas con los cojincillos de goma que vienen con la centrífuga, para proteger el fondo de los tubos. Con un frasco de lavado vierta una pequeña cantidad de agua entre las paredes de cada tubo y la cubeta Arranque y detención de la centrífuga (a) Encienda el motor y aumente gradualmente la velocidad girando con lentitud la perilla hasta lograr la velocidad deseada. (b) Detenga la centrífuga gradualmente (algunos modelos tienen freno para este propósito). (c) Retire los tubos lenta y cuidadosamente. (d) Nunca abra la centrífuga hasta que se haya detenido completamente. (e) Nunca trate de reducir la velocidad de la centrífuga con la mano. Limpieza y lubricación Consérvese la olla de la centrífuga muy limpia. Enjuague las cubetas después de usarlas. Limpie todos los residuos de sangre, etc. La lubricación deberá hacerla un experto de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Importante: Si se acostumbra a centrifugar sin equilibrar primero los tubos, la centrífuga se romperá muy pronto. Para obtener información detallada de limpieza y mantenimiento de centrifugas, véase sección 3.5.3.
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Figura 3.41 Equilibrando las cubetas porta tubos. Figura 3.42 Equilibre los tubos que se encuentran frente a frente pesándolos en sus cubetas en la balanza abierta de dos platillos. Adicionar líquido en la cubeta que contenga el tubo de menor peso (utilizando un frasco de lavado o piseta). Figura 3.43 Equilibrando los tubos añadiendo agua en la cubeta que contiene el tubo de menor peso (usando una piseta).
Centrífuga de mesada. Tapa a bisagra y cierre a presión. Motor flotante, protegido contra derrames, con eje de acero inoxidable. Reloj interruptor automático de 0 a 30 minutos. Variador Electrónico de Velocidad. Múltiples rotores intercambiables. web: www.rolcosrl.com
3.4 MEDICIÓN Y DISPENSACIÓN DE LÍQUIDOS Muchos de los líquidos manipulados en el laboratorio son bien infecciosos, corrosivos o tóxicos. Es importante para la prevención de accidentes que los procedimientos correctos para la medición y la distribución de estos líquidos sean claramente comprendidos y sean seguidos concienzudamente. Muchos de los nuevos métodos para análisis requieren volúmenes muy pequeños de líquido y están disponibles diversos dispositivos de pipeteado y dispensación de esos volúmenes pequeños para permitir que estos sean medidos con gran precisión. Los volúmenes grandes pueden medirse mediante una probeta o un matraz aforado. Una probeta mide diferentes volúmenes de líquido pero no es muy precisa. Un matraz aforado mide
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un único volumen de líquido, por ejemplo, 1 litro, con mucha precisión. Pequeñas cantidades de líquido (0,1 - 10ml) puede ser dispensado con rapidez y precisión usando uno de los siguientes métodos: Un dispensador de volumen fijo o variable conectado a un recipiente de vidrio o polipropileno. Varios volúmenes de 0,1 a 1,0 ml y de 2,0 a 10,0 ml pueden ser dispensados. Una pipeta calibrada que usa un bulbo de goma de seguridad. En el laboratorio se emplean los utensilios siguientes para medir volúmenes: 1. Cilindros graduados (probetas) 2. Pipetas 3. Matraces volumétricos 4. Buretas 5. Pipetas cuentagotas graduadas 6. Vasos cónicos para análisis, graduados 1. CILINDROS GRADUADOS (PROBETAS ) Con ellos se pueden medir diversos volúmenes, aunque sin gran precisión. Úsense probetas cuya capacidad se aproxime al volumen requerido. Por ejemplo: — para medir 45 ml úsese una probeta de 50 ml — para medir 180 ml úsese una probeta de 200 ml — para medir 850 ml úsese una probeta de 1000 ml. LECTURA DEL NIVEL En los tubos delgados de vidrio se forma un menisco cóncavo (M) en la superficie del agua (y la mayor parte de otros líquidos). La lectura se debe hacer en la línea de graduación (G) correspondiente a la parte más baja del menisco. Para evitar errores en la lectura colóquese la probeta en posición vertical sobre una mesa y ajústese el nivel de la visión a la superficie del líquido.
Ilustración anexa A Ilustración anexa B Ilustración anexa A Utensilios para medir volúmenes usados en el laboratorio. 1) Probeta; 2) Pipeta; 3) Matraz volumétrico; 4) Bureta; 5) Pipeta cuentagotas graduada; 6) Vaso cónico para análisis, graduado. Ilustración anexa B Probetas de distintos tamaños.
Ilustración anexa C En los tubos delgados de vidrio se forma un menisco cóncavo (M) en la superficie del agua (y la mayor parte de otros líquidos). La lectura se debe hacer en la línea de graduación (G) correspondiente a la parte más baja del menisco.
3.4.1 PIPETAS TIPOS DE PIPETAS PIPETAS GRADUADAS En el extremo de estas pipetas se encuentran las siguientes indicaciones (Fig .344): — el volumen total que se puede medir con ellas — el volumen que hay entre dos líneas de graduación Existen varios tipos de pipetas graduadas (en especial 2 tipos) (Fig. 3.45): 1. Pipetas cuyas graduaciones llegan hasta el extremo inferior (A). El volumen total que se puede medir es el que hay entre la línea 0 y el extremo inferior de la pipeta. 2. Pipetas con graduaciones que no llegan hasta el extremo inferior (B). En estas pipetas el volumen total es el que hay entre la línea 0 y la última línea antes del extremo inferior (este tipo de pipeta se recomienda para ensayos químicos cuantitativos). Con las pipetas graduadas se pueden medir varios volúmenes. Por ejemplo: — se puede usar una pipeta de 10 ml para medir 8,5 ml — se puede usar una pipeta de 5 ml para medir 3,2 ml — se puede usar una pipeta de 1 ml para medir 0,6 ml. PIPETAS VOLUMÉTRICAS Sirven para medir un volumen exacto con gran precisión (pipetas A y B). Las pipetas B son mucho
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menos costosas que las pipetas A y, sin embargo, son lo suficientemente precisas para los análisis clínicos. Existen otros dos tipos de pipetas (Fig. 3.46): 1. Pipetas con una sola línea de graduación, que se deben llenar hasta esta línea. Después de vaciarlas de su contenido se deja que estas pipetas escurran de 15 a 45 segundos (de acuerdo con su tamaño, que se indica en el bulbo) y que la última gota se deslice contra la pared del recipiente. No se debe soplar dentro de estas pipetas. 2. Pipetas con 2 líneas de graduación. En manos expertas estas pipetas pueden ser más precisas, aunque no lo son tanto para las personas menos expertas, pues es fácil pasar de la línea inferior de graduación al vaciarlas. Sujetar la pipeta en posición vertical para asegurarse que el líquido alcance la marca de la graduación deseada (G en la Fig. 3.47). Esta marca debe estar al nivel de la parte inferior del menisco formado por el líquido. La punta de la pipeta debe mantenerse en el lateral del receptáculo mientras que el líquido se descarga.
Figura 3.44 Pipeta graduada. Figura 3.45 Pipetas cuyas graduaciones llegan hasta el extremo inferior (A). Pipetas con graduaciones que no llegan hasta el extremo inferior (B). Figura 3.46 A: Pipetas con una sola línea de graduación, que se deben llenar hasta esta línea. B: Pipetas con 2 líneas de graduación.
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Ilustración anexa E
Fig. 3.47 Figura 3.47 Cómo sostener la pipeta. Sostenga la pipeta en posición vertical para confirmar que el líquido llegue a la línea de graduación deseada (G). Esta línea deberá encontrarse al mismo nivel de la parte más baja del menisco formado por el líquido. La punta (P) de la pipeta deberá sostenerse contra la pared del receptáculo. Ilustración anexa E Para manejar líquidos peligrosos. Utilice una pipeta con bulbo de seguridad (S) cerca de la boquilla. Tapone la pipeta con algodón (no absorbente) (C), o Aspire la solución con una pipeta provista con pera de goma (propipeta de goma) (éste es, con mucho, el mejor procedimiento).
Ilustración anexa G Ilustración anexa F Ilustración anexa F Propipeta de goma. Ilustración anexa G Pipetas Pasteur de plástico (pipetas plásticas con bulbo) PIPETAS DE PLÁSTICO CON BULBO (PIPETAS PASTEUR DE PLÁSTICO) Las pipetas de plástico con bulbo son baratas y muy útiles para transferir volúmenes de líquido tal como suero o desinfectante. Están disponibles con diferentes puntas y se puede conseguir con calibraciones indicadas en el vástago. Ellas pueden ser reutilizadas después de la desinfección y lavado, pero no pueden ser sometidas al autoclave. Las pipetas de plástico con bulbo también son llamadas pipetas Pasteur de plástico. Las pipetas Pasteur de plástico, también se hace referencia a estas como pipetas de transferencia, tienen sus tallos y bulbos en forma de una sola pieza de plástico. Existen diferentes tamaños. Los volúmenes están marcados en el tallo, aunque las marcas son bastante groseras y no son especialmente precisas. Las pipetas Pasteur de plástico se utilizan a menudo en biología, donde la mayoría de los medios de comunicación son acuosos, y la resistencia a los disolventes no es importante. La mayoría de disolventes orgánicos, tales como hexano y acetona, no se pueden utilizar en pipetas Pasteur de plástico. Estos disuelven el plástico, haciéndolos inadecuados para muchos tipos de aplicaciones. Las pipetas son también difíciles de lavar, y se desechan con los residuos de riesgo biológico después de cada uso. Las pipetas de plástico con bulbo generalmente no son lo suficientemente precisas como para ser utilizadas para las mediciones exactas, mientras que sus homólogas de vidrio pueden ser extremadamente precisas. Generalmente son desechables, pero con mucho cuidado pueden ser lavadas, desinfectadas pero no esterilizadas con autoclave.
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MICROPIPETAS Las micropipetas con puntas desechables se utilizan con frecuencia para medir pequeños volúmenes. Están disponibles en una variedad de volúmenes, que van de 5 ml a 1000 ml. También hay volúmenes menores partiendo por ejemplo desde 10 µl hasta 200 µl. Las puntas usadas se desechan directamente en un desinfectante utilizando un mecanismo eyector. Las micropipetas tienen dos posiciones del émbolo operado por el pulgar (Fig. 3.48). La primera posición se utiliza para recoger la muestra y la segunda para expulsar la muestra de la punta en un tubo o pocillo. Las micropipetas deben ser calibradas y mantenidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PIPETAS GOTEROS CALIBRADAS Las pipetas goteras calibradas del tipo usual suelen dar 20 gotas de agua destilada por cada ml, de manera que una gota = 0,05 ml. Sostenga la pipeta gotera en posición completamente vertical para contar las gotas (Fig. 3.49). Cerciórese que no contengan burbujas de aire. CALIBRACIÓN DE LAS PIPETAS GOTERAS (Fig. 3.50) Por medio de una pipeta volumétrica (véase antes) mida 1 ml de agua y coloque en un tubo de ensayo pequeño. Aspire el agua con la pipeta gotera que se va a calibrar. Cuente el número de gotas que se obtienen del ml de agua. Repita este procedimiento 3 veces para confirmar su precisión. El pipeteo con la boca es peligroso y no se debe hacer. Puede causar lo siguiente: -Infección -Quemaduras -Envenenamiento - Cortes. Siempre use una propipeta de goma (véanse ilustración anexa F y Fig. 3.50) con la pipeta en su lugar.
Figura 3.48 Una micropipeta con punta descartable. Figura 3.49 Usando una pipeta gotero. Sostenga la pipeta gotera en posición completamente vertical para contar las gotas. Cerciórese que no contengan burbujas de aire.
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Figura 3.50 Calibración de las pipetas goteras. B: Bulbo de goma. (Alternativamente una propipeta de goma).
Fig. 3.50 3.4.2 MATRACES VOLUMÉTRICOS Estos matraces están graduados para medir ciertos volúmenes cuando se llenan hasta la línea de graduación correspondiente. Tienen varias capacidades: - 2000 y 1000 ml 500 ml - 250 y 200 ml 100 ml - 50 y 25 ml Los matraces volumétricos son más precisos que las probetas. Se deben utilizar en la preparación de reactivos. Por ejemplo: 1 litro de solución de cloruro sódico (reactivo No. 53) se prepara colocando 8,5 g de cloruro sódico que se haya disuelto en agua en un vaso, en un matraz de 1000 ml por medio de un embudo, diluyéndolo nuevamente (a medida que mezcla) hasta alcanzar la línea de los 1000 ml (Fig. 3.51). la solución debe ser sacudida antes de usarla. También las sustancias se pueden disolver en un receptáculo y vaciar la solución en el matraz usando como guía una varilla de vidrio (Fig. 3.52). Enjuáguese el recipiente varias veces, vaciando el líquido en el matraz a lo largo de la varilla de vidrio cada vez. Llénese el matraz hasta la línea de graduación correspondiente. (Este método se recomienda para preparar reactivos químicos titulados). TEMPERATURA DE LOS LÍQUIDOS La temperatura a la que se deben medir los líquidos se índica en el matraz (junto a la cifra indicadora de la capacidad; Fig. 3.53). Por ejemplo: - 200 ml: 20°C. Los líquidos se dilatan con el calor y se contraen con el frío. Nunca se deben medir líquidos calientes ni líquidos fríos recién sacados del frigorífico. Tapones Los matraces volumétricos deben acompañarse de tapones de material plástico (de preferencia) o de vidrio esmerilado. Se debe tener cuidado de no extraviarlos, así pues átense al cuello del matraz con un trozo de hilo. Costo Los matraces volumétricos suelen ser sumamente costosos, por lo que se deben usar con mucho cuidado. 3.4.3 BURETAS Las buretas son tubos de vidrio graduado que tienen una espita de vidrio en el extremo inferior. Se llenan por el extremo superior con el líquido que se quiere medir (Fig. 3.54). Su capacidad puede ser de 10 ml, 20 ml, 25 ml y 50 ml. Mantenimiento de las buretas Espita y canilla (A) La espita y la canilla se deben conservar adecuadamente lubricadas. Para lubricar con propiedad una espita limpia, aplique con la yema del dedo una capa de vaselina tan delgada como sea posible, hacia abajo, a ambos lados de la espita, sin llegar al orificio capilar. A continuación inserte la espita en la bureta y gírela hasta lograr que quede untada toda la espita con una capa de vaselina fina y uniforme. Conserve el extremo superior de la bureta (B) taponado o cubierto (Fig. 3.55). Vasos cónicos graduados de vidrio para análisis Estos vasos no son muy exactos. Se debe evitar usarlos en análisis de laboratorio. EXACTOS MENOS EXACTOS INEXACTOS Pipetas Probetas Vasos cónicos para análisis
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Matraces volumétricos Pipetas goteras calibradas ALGUNAS COSAS QUE NO DEBEN HACERSE 1. Nunca mida el volumen de los líquidos cuando están calientes (se encuentran dilatados). 2. Nunca caliente en una llama los utensilios de vidrio graduados. 3. Nunca deje los utensilios de vidrio graduados en remojo en soluciones alcalinas (hidróxido sódico o potásico, amoníaco).
Figura 3.51 Preparando una solución de Cloruro de Sodio en un matraz volumétrico. Figura 3.52 Métodos alternativos para preparar reactivos usando un matraz volumétrico (obsérvese el uso de una varilla de vidrio para hacer verter el líquido).
Figura 3.53 La temperatura a la que se deben medir los líquidos se indica en el matraz (junto a la cifra indicadora de la capacidad). Por ejemplo: 200 ml : 20°C. Figura 3.54 Llenando una bureta.
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Figura 3.55 Conserve el extremo superior de la bureta taponado o cubierto. Figura 3.56 Vaso cónico de vidrio para análisis graduado.
3.5 LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN 3.5.1 LIMPIEZA DE LOS UTENSILIOS DE VIDRIO Y DE LAS JERINGAS Y AGUJAS REUTILIZABLES PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR
1. Recipientes de vidrio (matraces de Erlenmeyer, vasos de precipitados, tubos) 2. Pipetas 3. Portaobjetos 4. Cubreobjetos 4. Jeringas y agujas reutilizables RECIPIENTES DE VIDRIO UTENSILIOS DE VIDRIO NUEVOS Los utensilios de vidrio que nunca se utilizaron son ligeramente alcalinos. Con objeto de neutralizarlos deben seguirse los procedimientos siguientes: — ponga en una cubeta 3 litros de agua con 60 ml de ácido clorhídrico (es decir, una solución de este ácido al 2%) — sumerja completamente en esta solución durante 24 horas los utensilios de vidrio sin usar — después enjuáguelos dos veces con agua corriente y una vez con agua desmineralizada. — séquelos. UTENSILIOS DE VIDRIO SUCIOS Descártense los recipientes de muestras (véase más adelante). PRIMER ENJUAGUE Enjuague los utensilios dos veces con agua fría o tibia (los tu b o s con residuos de sangre nunca se deben enjuagar con agua caliente). Jamás deje que se sequen los utensilios que se han usado con líquidos que contienen proteínas; es imprescindible enjuagarlos primero y lavarlos de inmediato. REMOJO EN SOLUCIÓN DETERGENTE En una palangana prepare agua con detergente para lavar en polvo o en líquido. Coloque en ella los utensilios de vidrio y límpielos por dentro con un cepillo para tubos de ensayo (Fig. 3.57). Déjelos en remojo durante 2 - 3 horas. ENJUAGUE Saque de la palangana los utensilios, uno a uno. Enjuague cada uno detenidamente con el chorro de agua del g rifo y a continuación coloque todos en una palangana con agua durante 30 minutos. Enjuague de nuevo cada uno bajo el chorro de agua limpia. (Se debe recordar que las partículas de detergente que queden en los utensilios de vidrio pueden causar resultados falsos en el laboratorio). PARA ESCURRIRLOS Coloque los recipientes (vasos, matraces, probetas) en las clavijas de una gradilla de pared para secado. Ponga los tubos con las bocas hacia abajo en una canastilla de alambre. 6. Secado Ponga los utensilios en canastillas de alambre y séquelos en un horno de aire caliente a 60°C. De lo contrario coloque las canastillas con los utensilios en un sitio soleado del laboratorio y cúbralos con una pieza de tela delgada. TAPONAMIENTO El material de vidrio limpio y seco se deberá guardar en una alacena para preservarlo del polvo. Se recomienda que los recipientes se taponen con algodón no absorbente, guata, o se les cubra la boca con pequeñas tapas hechas de papel de periódico (Fig. 3.58) o, de preferencia, con hojas delgadas de parafina o material plástico adherente (por ejemplo, Parafilm o Saran), si se encuentran disponibles.
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Figura 3.57 Lavando utensilios de vidrio sucios. Figura 3.58 Tapone o cubra el material de vidrio para protegerlo del polvo. PIPETAS ENJUAGUE INMEDIATO Tan pronto como se haya usado una pipeta se debe enjuagar con un chorro de agua fría para limpiarla desangre, orina, suero, reactivos, etc. REMOJO EN AGUA Después de enjuagarlas coloque las pipetas en una probeta grande, de material plástico (o una palangana) llena de agua. Si las pipetas se han utilizado para medir material infeccioso déjelas en una probeta llena de solución desinfectante (algún compuesto cuaternario de amonio, o fenol al 2%) durante 24 horas. REMOJO EN DETERGENTE Y ENJUAGUE Siga las instrucciones dadas anteriormente acerca de los utensilios de vidrio del laboratorio. PIPETAS OBSTRUIDAS (a) Ponga en un cilindro lleno con una solución limpiadora de bicromato (reactivo No. 20), depositándolas con suavidad. Déjelas 24 horas en esta solución. (b) Al día siguiente traslade la solución de bicromato a otro cilindro (se puede usar 4 veces). (c) Coloque el cilindro que contiene las pipetas bajo el chorro de agua del grifo y enjuáguelas minuciosamente. (d) Saque las pipetas, una a una. Verifique que se han eliminado las obstrucciones. A continuación enjuáguense nuevamente. (e) Remoje las pipetas en agua limpia durante 30 minutos, cambie el agua y vuélvalas a remojar otros 30 minutos. Advertencia: La solución de bicromato es sumamente corrosiva y se debe emplear con cuidado extremo. Si se derrama accidentalmente sobre la piel, los ojos o la ropa, lávese inmediatamente con cantidades copiosas de agua. SECADO Seque las pipetas de vidrio Pyrex en el horno de aire caliente a 60°C y las de vidrio ordinario en la incubadora a 37°C o al aire. USO DE LA BOMBA AL VACÍO Este es un pequeño aparato de metal o vidrio (frágil) que se anexa al grifo. (a) Abra el grifo bastante de manera que produzca un chorro vigoroso que pase a través de la bomba y el tubo de goma anexo. (b) Ajuste el tubo de goma al extremo superior de la pipeta. (c) Sumerja el otro extremo de la pipeta en el líquido para enjuagar, que será succionado a través de la pipeta y descargado en el vertedero (Fig. 3.59).
Figura 3.59 Usando una bomba de vacío para enjuagar una pipeta.
PORTAOBJETOS PORTAOBJETOS NUEVOS
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REMOJO EN SOLUCIÓN DETERGENTE En una palangana prepare agua con detergente para lavar en polvo o en líquido, empleando la cantidad que recomienda el fabricante. Coloque en la palangana los portaobjetos uno a uno y déjelos en remojo toda la noche. ENJUAGUE EN AGUA Enjuague cada portaobjetos con agua del grifo y luego remojar en agua limpia durante 15 minutos. LIMPIEZA Y SECADO Limpie los portaobjetos, uno a uno, con una tela suave, que no desprenda pelusa. Colóquelos separados, en una hoja de papel de filtro, uno a uno. Deje que se sequen. Posteriormente, examine cada portaobjeto. Descarte los portaobjetos que estén teñidos o raspados y los que tengan un color amarillento o porciones opacas, y tratar de limpiarlos de nuevo. ENVOLTURA Junte los portaobjetos en montoncitos de 10 ó 20 y envuélvalos con hojas pequeñas de papel. NUMERACIÓN En algunos laboratorios se acostumbra numerar los portaobjetos por anticipado en grupos de cinco paquetes, de 1 a 100, con un lápiz de diamante (de esta manera los paquetes contienen portaobjetos del 1 al 20, del 21 al 40, del 41 al 60, del 61 al 80 y del 81 al 100). PORTAOBJETOS SUCIOS PORTAOBJETOS CON RESIDUOS DE ACEITE DE INMERSIÓN Tome los portaobjetos uno a uno y frótelos con papel de periódico para limpiarlos del aceite hasta donde sea posible. PORTAOBJETOS CON CUBREOBJETOS Separe los cubreobjetos de los portaobjetos con la punta de una aguja o el extremo de una pinza, también una varilla de vidrio, y colóquense en un vaso para análisis lleno de agua (Fig. 3.60) (para la limpieza de los cubreobjetos véase más adelante). REMOJO EN SOLUCIÓN CONCENTRADA DE DETERGENTE Prepare una palangana con: Agua fría o tibia Detergente (en la cantidad que recomiende el fabricante). Déjense en remojo los portaobjetos durante 24 horas. Los detergentes que contienen enzimas son excelentes para limpiar los residuos de sangre. Nota: Si los portaobjetos se han usado con muestras infectadas (orina, heces fecales) se deben colocar en una solución desinfectante. LIMPIEZA DE LOS PORTAOBJETOS Prepare otra palangana, que contenga una solución débil de detergente (15 ml de detergente de uso doméstico por cada litro de agua). Saque los portaobjetos, uno a uno, de la solución detergente fuerte. Frote cada portaobjetos con algodón humedecido en la solución detergente fuerte y colóquense en la palangana que contiene la solución detergente débil. Déjense en remojo durante 1 a 2 horas en la palangana con solución detergente débil. ENJUAGUE DE LOS PORTAOBJETOS Tome los portaobjetos uno a uno usando de preferencia una pinza. Si se utilizan los dedos cójalos por los bordes. Enjuáguelos por separado bajo el chorro de agua y a continuación pónganse en remojo durante 30 minutos en una palangana llena de agua. Este es el mejor procedimiento. MÉTODO RÁPIDO Vacíese la palangana de solución detergente débil y llénese con agua limpia. Cámbiese el agua 3 veces agitando vigorosamente la palangana cada vez. LIMPIEZA, SECADO Y ENVOLTURA Síganse las instrucciones que se han dado para los portaobjetos nuevos. CUBREOBJETOS Después de usarlos, los cubreobjetos se pueden recobrar, limpiar y usar nuevamente. Para limpiarlos: 1. Remójense en una solución débil de detergente a la que se haya agregado un desinfectante preparado en un vaso grande de precipitado como se indica a continuación: - 200 ml de agua - 3 ml de detergente - 15 ml de lejía o 5 ml de un desinfectante cuaternario derivado del amonio (véase más adelante). Déjense en remojo durante 2 - 3 horas, moviéndolos suavemente de vez en cuando. 2. Enjuague cuatro veces el vaso donde estaban con agua del grifo, agitándolo suavemente. 3. Lávese por último con agua desmineralizada. 4. Escurra los cubreobjetos colocándolos cuidadosamente de punta sobre una pieza de gasa doblada. 5. Si es posible, séquense en el horno de aire caliente a 60°C. 6. Consérvense en una placa de Petri pequeña. Para sacarlos utilice una pinza especial para portaobjetos si se dispone de ella.
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Figura 3.60 Removiendo los cubreobjetos de un portaobjeto para lavarlos usando una pinza o una varilla de vidrio. Figura 3.61 Limpiando una jeringa reutilizable tapada con Ácido Acético al 50%. JERINGAS Y AGUJAS REUTILIZABLES Inmediatamente después de tomar una muestra quite el émbolo de la jeringa y enjuague éste y el cilindro. Llene el cilindro con agua y coloque el émbolo en su lugar; impulse con fuerza el agua a través de la jeringa. Por último, quite la aguja y enjuague la cavidad de su enchufe. JERINGA CON EL ÉMBOLO ADHERIDO Para aflojar el émbolo se puede proceder de varias maneras: Ponga en remojo la jeringa durante 2 horas en agua caliente (a 70 ºC aproximadamente). O bien, con una pipeta Pasteur delgada introduzca solución de Ácido Acético al 50% (reactivo Nº 3) por la boquilla de la jeringa (Fig. 3.61). Coloque la jeringa sobre su extremo posterior, con el émbolo hacia abajo. Téngala así durante 10 minutos. Ponga la jeringa en remojo durante varias horas en un recipiente con peróxido de hidrógeno a 10 vol. ENJUAGUE Y REMOJO DE LAS AGUJAS Inmediatamente después que se haya usado una aguja enjuáguese mientras continúa colocada en la jeringa y póngase en remojo de la misma manera que ésta. AGUJAS OBSTRUIDAS Utilice un hilo de nylon remojado en Ácido Acético al 50%(reactivo Nº 3). De lo contrario, emplee un estilete. 3.5.2 LIMPIEZA DE LOS RECIPIENTES NO DESECHABLES Este procedimiento es más difícil (por lo tanto, siempre que sea posible úsense recipientes desechables). Los frascos (tarros) y matraces pueden contener: — materias sumamente infecciosas (heces fecales, esputo, pus, líquido cefalorraquídeo) — otras muestras (sangre, orina). RECIPIENTES CON HECES FECALES Llene los tarros que contengan heces fecales con una solución de fenol al 5% u otro desinfectante similar (como el cresol). Déjelos en reposo 24 horas. A continuación vacíelos en el fregadero. Si este se encuentra conectado a un tanque séptico no se deberá agregar fenol ni otro antiséptico a las heces. Limpie los tarros con detergente y agua (como se indica más adelante). RECIPIENTES CON ESPUTO Y TUBOS CON PUS O LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Existen varios procedimientos: USO DEL AUTOCLAVE Este es el procedimiento más conveniente. 1. Coloque los recipientes en el autoclave tal como se encuentren y esterilícelos durante 30 minutos a 120°C para destruir todos los microorganismos. 2. Una vez que se hayan enfriado vacíelos en el vertedero o el fregadero. 3. Límpielos con agua y detergente. Para mejor información, véase la sección 3.55. EBULLICIÓN EN SOLUCIÓN DETERGENTE (FIG. 3.62). Disponga de un recipiente amplio, especial para este propósito. Hierva los recipientes de esputo: — durante 30 minutos — en agua que contenga polvos para lavar en solución fuerte (o, de preferencia, cristales de carbonato sódico), a razón de 60 ml por cada litro de agua. Empleo de la solución de formaldehido o fenol Coloqúense en cada recipiente de esputo: — 10 ml de solución de formaldehido sin diluir, o — 5 ml de fenol al 5%. Déjense en reposo durante 24 horas.
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Figura 3.62 Limpiando frascos con esputo hirviendolos en solución detergente MATRACES CON ORINA Vacíense los matraces en el fregadero. A continuación, llénense con: — una solución de lejía comercial al 10%, o — una solución de fenol al 2%. Déjense en reposo durante 24 horas. TUBOS CON SANGRE Los tubos con sangre fresca extraída el mismo día deberán: — enjuagarse con agua fría — remojarse en una solución detergente (véase más adelante). Los tubos con sangre "vieja” que han permanecido varios días a la temperatura ambiente, en que los microorganismos se pueden multiplicar, deberán: — llenarse con una solución de lejía comercial al 10% — dejarse en reposo durante 12 horas y enjuagarse y limpiarse en seguida. 3.5.3 LIMPIEZA Y MANTENIMIENTO DE OTROS EQUIPOS DE LABORATORIO CENTRÍFUGAS Limpie el tazón de la centrífuga diariamente o después que ocurra cualquier derrame. Utilice etanol al 70% para recipientes de metal y 1% de lavandina (véase más adelante) para las de plástico. (No utilice Hipoclorito de sodio para recipientes de metal, ya que puede provocar corrosión.) Enjuagar las cubetas de la centrífuga después de su uso y eliminar cualquier rastro de sangre, etc. Compruebe a intervalos regulares el cableado por desgaste y conexiones sueltas. Si la centrífuga está encendiendo o corriendo irregularmente, las escobillas (bloques de carbón) deben reemplazarse. La lubricación de la centrífuga debe ser realizada por un especialista, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (Para mayor información véase la sección 3.3.3) BAÑOS MARÍA Si es posible llenar el baño maría con agua destilada o agua de lluvia para evitar la formación de depósitos en el interior. Un cristal de timol ayudará a prevenir el crecimiento de algas. Cambie el agua y limpie el interior del baño maría por lo menos una vez al mes o cada vez que se ve sucia. Use un termómetro para verificar la temperatura del agua cada vez que se cambia el agua como escala en el elemento de calentamiento, esto puede hacer que el termostato no funcione correctamente. INCUBADORAS (ESTUFAS DE CULTIVO) Las estufas de cultivo o incubadoras son utilizadas para el cultivo de bacterias por los laboratorios que trabajan en microbiología. La incubadora debe mantener una temperatura promedio constante de 35 °C (rango de 33-37 °C). La temperatura real debe corresponder a la posición del termostato cuando se utiliza el instrumento. En las estufas de cultivo de dióxido de carbono utilizado para cultivo microbiano, la concentración de dióxido de carbono se debe mantener en un 5-10% y la humedad en el 50-100%. La temperatura en las estufas de cultivo debe ser registrada diariamente. Al igual que todos los instrumentos de laboratorio, las estufas de cultivo deben limpiarse a intervalos regulares (por lo menos cada quince días) y también después del derrame de cualquier material, ya sea infeccioso o no infeccioso. PIPETAS DE WESTERGREN Enjuague con agua y luego dejar en remojo en agua limpia durante 12 horas. Secar completamente (en una estufa de cultivo a 37 ° C, si es posible). No utilice detergentes, ácidos o etanol. (Pipetas de Westergren para eritrosedimentación). 3.5.4 DESINFECTANTES Hay muchos desinfectantes que tienen diversas acciones químicas diferentes agentes infecciosos. La Tabla 3.1 enumera los desinfectantes que se usan más comúnmente en los laboratorios de salud.
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CRESOLES Los cresoles pueden ser sólidos o líquidos, que son menos solubles en agua que el fenol, pero una solución acuosa al 5% se puede mantener como una solución madre. Los cresoles emulsionan bien en soluciones de jabón. LISOL El Lisol es una emulsión al 50% de cresol en una solución acuosa de jabón. El cresol puede ser sustituido por fenol, pero puesto que el fenol es un desinfectante menos potente el tiempo de exposición del material a la solución de fenol debe ser más largo que para el cresol. Soluciones de fenol y cresol causan irritación de la piel y los ojos. HIPOCLORITO DE CALCIO Y DE SODIO Las soluciones de hipoclorito de sodio y de calcio (blanqueadores domésticos) son desinfectantes muy fuertes. Se utilizan en muchos laboratorios, tienen aplicaciones domésticas e industriales. Los hipocloritos son inactivados rápidamente por las partículas de polvo y los materiales orgánicos y cada día deben prepararse a partir de soluciones madre. Los hipocloritos causan irritación de la piel, los ojos y los pulmones. Las soluciones perfectas, sin diluir deben contener un 10% de cloro disponible. Para preparar las diluciones de trabajo, se recomiendan las diluciones siguientes: ● Para los frascos y envases en que se descartan pipetas, portaobjetos y otros objetos de vidrio usados y para frotar las superficies de las mesadas de trabajo: 10 ml de solución de hipoclorito concentrado en 990 ml de agua (0,1% de cloro disponible). Colocar el material de vidrio utilizado en los frascos de solución de hipoclorito y dejar durante al menos 12 horas. No llene los recipientes. Cambiar los recipientes diariamente. ● Para la descontaminación de los derrames de sangre y otras muestras con alto contenido de proteínas: 40 ml de solución de hipoclorito concentrada en 360 ml de agua (1% de cloro disponible). Las soluciones fuertes de hipoclorito son corrosivas y pueden causar quemaduras. Maneje las soluciones de lejía con cuidado: usar guantes de goma para protegerse las manos y protectores oculares para evitar salpicaduras en los ojos. El hipoclorito de calcio está disponible en su forma sólida como polvo o gránulos. Se descompone a un ritmo más lento que el hipoclorito de sodio. Una solución de 1% de cloro disponible se obtiene por disolución de 14 g de hipoclorito de calcio en 1 litro de agua. CLORAMINA La cloramina (tosilcloramida sódica) es un polvo cristalino que, como los hipocloritos, libera cloro como agente desinfectante activo, aunque a un ritmo más lento. También se utiliza para la desinfección de agua: El agua clorada tiene una concentración de 0,05% de cloramina. Tenga en cuenta que el agua tratada con cloro puede interferir con las pruebas de laboratorio. Por lo tanto, debe ser utilizada el agua destilada. HIDRÓXIDO DE CALCIO La solución de hidróxido de calcio se prepara a partir de cal viva (óxido de calcio) en polvo o gránulos disueltos en agua (1 parte: 3 partes p / v). La solución de hidróxido de calcio no es adecuada para la desinfección de heces de pacientes con tuberculosis. COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO Los compuestos de amonio cuaternario (CAC) son eficaces contra bacterias vegetativas y algunos hongos. No son eficaces contra las esporas, virus y micobacterias, no son tóxicos y son inofensivos para la piel. ALCOHOLES Los alcoholes (por ejemplo etanol, isopropanol, n-propanol) son de acción rápida, pero son desinfectantes relativamente caros que se utilizan generalmente para la desinfección de la piel. Se matan las bacterias y algunos virus, pero no los hongos. YODO El yodo es un excelente desinfectante de acción rápida con una amplia gama de acción. Mata a las bacterias, muchas esporas, virus y hongos. A bajas temperaturas, el yodo es más activo que otros desinfectantes. Algunas personas son hipersensibles al yodo y sufren una erupción en áreas de la piel que han sido expuestas a la solución de yodo. Su sensibilidad es mucho menor cuando se utilizan yodóforos (soluciones de polímeros que ligan yodo), tales como polividona yodada o povidona yodada.
Objetos de desinfección
Sangre
Heces fecales
Tabla 3.1 Desinfectantes de uso común Dilución recomendada Duración mínima Desinfectante para desinfectar del tratamiento (v/v) Solución de cresol 2:1 6 hs. al 5% Solución de hipoclorito de 2:1 6 hs. Calcio (1% de cloro disponible) Solución de cresol 2:1 6 hs. al 5% Solución de 3:1 6 hs. hipoclorito de
Preparación de reservas de desinfectante Cristales o líquido Polvo Cristales o líquido Polvo
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Calcio y de Sodio (1% de cloro disponible) Solución de Hidróxido de 2:1 6 hs. Polvo Calcio al 20% Cloramina (4% de Sin diluir 6 hs. Polvo cloro disponible) Solución de cresol Orina 1:1 4 hs. Cristales o líquido al 5% Solución de cresol Esputo 1:1 4 hs. Cristales o líquido al 5% Solución de cresol 50% de cresol en Sin diluir 2 min. al 50% solución jabonosa Solución de etanol Sin diluir 2 min. Solución al 95% al 80% Solución de Yodo Sin diluir 2 min. Solución al 5% al 1% Solución de Yodo Sin diluir 2 min. Pura povidona al 1% Piel Solución de Sin diluir 2 min. Pura Isopropanol al 70% Solución de n – Sin diluir 2 min. Pura propanol al 60% Cloramina (1% de Sin diluir 2 min. Polvo cloro disponible) Compuestos de Amonio Sin diluir 2 min. Solución Cuaternario Agua potable, agua Solución de Sin diluir 16 min. Polvo de beber Cloramina al 0,25% Solución de cresol 50% de cresol en Sin diluir 4 hs. al 50% solución jabonosa Solución de cresol Sin diluir 4 hs. Cristales o líquido al 5% Mesadas de trabajo Cloramina (5% de Sin diluir 4 hs. Polvo cloro disponible) Hipoclorito de Sodio (1% de cloro Sin diluir 4 hs. Polvo disponible) Hipoclorito de Instrumentos de Solución: 5%, 10%, Sodio (0,1% de Sin diluir 4 hs. laboratorioa 15% cloro disponible) Hipoclorito de Solución: 5%, 10%, Utensilios de vidrio Sodio (1% de cloro Sin diluir 12 hs. 15% disponible) aLa desinfección química para instrumentos invasivos y de corte de la piel deben emplearse sólo como último recurso, si no, no es posible la esterilización ni la desinfección de alto nivel por ebullición, y sólo si la concentración adecuada de la sustancia química está disponible y si los instrumentos se han limpiado a fondo para eliminar la contaminación excesiva antes de sumergirse en el desinfectante químico. 3.5.5 ESTERILIZACIÓN Esterilizar significa eliminar de un objeto o una sustancia todas las formas de vida, cualesquiera que éstas sean. En consecuencia, el equipo de laboratorio que se ha esterilizado queda libre de microorganismos vivos. En el laboratorio médico los materiales se esterilizan con tres propósitos principales: 1. Prepararlos para la recolección de muestras (deberán estar estériles agujas, jeringas, tubos, etc.). 2. Desinfectar los materiales contaminados. 3. Preparar los utensilios que se emplean en los cultivos bacterianos (cajas de Petri, pipetas Pasteur, tubos, etc.). En el laboratorio médico la esterilización se logra por medio de calor húmedo (autoclave, ebullición) o calor seco (horno de aire caliente, flameado). ESTERILIZACIÓN CON VAPOR EL AUTOCLAVE Las muestras clínicas y otros materiales residuales contaminados se colocan en un recipiente para autoclave o en un cubo de plástico o metal para esterilización. Utilice los indicadores de esterilización del autoclave para controlar el ciclo de esterilización. PRINCIPIO En un recipiente cerrado se calienta agua. Esto produce una saturación de vapor a presión, con temperatura superior a 100 °C. Toda clase de gérmenes mueren al calentar los utensilios durante 20 minutos a 120°C en este vapor a presión. COMPONENTES DEL AUTOCLAVE (FIG. 3.63)
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CALDERA Consiste en un cilindro amplio y profundo en que se colocan los utensilios para esterilizar. CANASTA Es una canasta amplia de alambre donde se ponen los materiales que se esterilizarán. SOPORTE DE LA CANASTA Se encuentra en el fondo del autoclave y sostiene la canasta por encima del nivel del agua. DRENAJE Espita colocada en la base de la caldera, por donde sale el exceso de agua. TAPA La tapa cubre y cierra herméticamente la caldera; se ajusta mediante una arandela de goma. SUJETADORES DE LA TAPA Estos sujetadores, junto con la arandela de goma, cierran herméticamente la tapa e impiden que escape el vapor. VÁLVULA DE SALIDA DEL AIRE Esta válvula, que se encuentra en la parte superior de la caldera o en la tapa, se emplea para dejar que salga el aire cuando empieza el agua a calentarse. VÁLVULA DE SEGURIDAD Se halla en la parte superior de la caldera o en la tapa, y deja escapar el vapor cuando la presión se eleva demasiado, evitando así que ocurra una explosión. INSTRUMENTO INDICADOR DE LA TEMPERATURA O DE LA PRESIÓN Se encuentra en la parte superior de la caldera o en la tapa e indica la presión, la temperatura, o ambas. Graduaciones del indicador Todos los indicadores señalan la temperatura en grados Celsius (°C); algunos también tienen una segunda escala, en que se lee la presión. Calentamiento del autoclave El sistema de calentamiento puede estar construido dentro del autoclave en forma de: — dispositivos eléctricos, o — quemadores de gas. De lo contrario, el autoclave se calentará sobre: — un quemador de gas butano, o — una estufa de aceite de parafina. INSTALACIÓN Los autoclaves deben ser instalados fuera de la principal área de trabajo, ya que son muy ruidosos. Si los gases o un aceite de parafina se utilizan para calentar, deben ser mantenidos lejos de materiales inflamables y de productos químicos. Cómo usar el autoclave Preparación de los materiales para la esterilización Jeringas reutilizables Los émbolos y los cilindros se colocarán por separado en tubos de vidrio amplios (Fig. 3.64), taponados con algodón no absorbente o guata, o se envolverán con gasa y se colocarán en bandejas metálicas. Agujas reutilizables Es preferible colocar las agujas por separado en tubos de ensayo pequeños que se taponarán inmediatamente después (véase Fig. 3.64). Colóquese por anticipado una pieza de algodón no absorbente o guata en el fondo de cada tubo para proteger las puntas de las agujas. De lo contrario, dispónganse las agujas en bandejas metálicas, hundiendo las puntas en una pieza de gasa doblada (Fig. 3.65). Las bandejas metálicas se colocarán sin tapa en el autoclave. Material de vidrio Los tubos para muestras, las cajas de Petri, etc., se envolverán en papel de estraza y se atarán con cordeles. Pipetas Pasteur de vidrio Se colocarán en tubos amplios y largos, que se taponarán inmediatamente después. También se pueden envolver con varias hojas de papel de estraza. PROCEDIMIENTOS PARA LA ESTERILIZACIÓN (a) Llene con agua el fondo del autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cerciórese de que el agua no toque la canasta. Si es necesario, elimine el exceso de agua abriendo la espita de drenaje. (b) Introduzca en el autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar. (Se pueden añadir indicadores de la esterilización, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.) (c) Cierre la tapa del autoclave, cerciorándose de que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretar demasiado. (d) Abra la válvula de salida del aire. (e) Inicie el calentamiento del autoclave. (f) Vigile la válvula de salida del aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3 - 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo. Esto indicará que todo el aire se ha expulsado del autoclave. (g) Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense los sujetadores de la tapa del autoclave y redúzcase la temperatura ligeramente. (h) Observe el indicador. Cuando se obtenga la temperatura deseada (p. ej. 120°C) se deberá
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regular el calor para conservarla. Redúzcase el calor hasta que la aguja del indicador permanezca en el grado de temperatura escogido. Tiempos de esterilización (i) En este momento empiece a medir el tiempo de la manera siguiente: — Utensilios para recolectar muestras (jeringas y agujas reutilizables, tubos): 20 minutos a 120°C. — Recipientes de materias infectadas (vasos que han contenido esputo, tubos que han contenido pus): 30 minutos a 120°C. — Medios de cultivo bacterianos: Síganse las instrucciones del bacteriólogo o el técnico principal del laboratorio. REDUCCIÓN TOTAL DEL CALOR (a) Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido. (b) Cuando la temperatura descienda a menos de 100°C abra la válvula de salida del aire para igualar las presiones dentro y fuera del autoclave. (c) Cuando cese el silbido afloje los sujetadores de la tapa del autoclave. Quite la tapa. Deje enfriar el autoclave y, a continuación, retire cuidadosamente la canasta con los utensilios estériles. Si se han formado gotas de agua y se dispone de una incubadora, séquelos en ella, a 37°C. LIMPIEZA Limpie el interior del autoclave cada día o cada vez que ocurran derrames. PRECAUCIONES Algunas cosas que no se deben hacer 1. Nunca se deben maniobrar la espita de drenaje ni la válvula de salida del aire mientras se esté efectuando el calentamiento a presión. 2. Nunca se debe maniobrar la válvula de seguridad mientras se esté efectuando el calentamiento a presión. 3. Nunca se debe hacer un calentamiento demasiado rápido para aumentar la presión una vez que la válvula de salida se ha cerrado. 4. Nunca se debe descuidar el autoclave mientras la presión esté aumentando. 5. Nunca se debe permitir que el autoclave se enfríe durante demasiado tiempo. Si el aparato se deja varias horas sin abrir la válvula de salida, se forma un vacío y los utensilios estériles se pueden romper.
Figura 3.63 Componentes de un autoclave 1: Caldera; 2: Canasta; 3: Soporte de la canasta; 4: Drenaje; 5: Tapa; 6: Sujetadores de la tapa; 7: Válvula de salida del aire; 8: Válvula de seguridad; 9: Instrumento indicador de la temperatura o de la presión. Figura 3.64 Autoclavando jeringas y agujas reutilizables.
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Figura 3.65 Método alternativo para autoclavar agujas reutilizables. Figura 3.66 Autoclavando pipetas Pasteur de vidrio.
USO DE LA OLLA A PRESIÓN Las ollas de presión son cacerolas amplias, construidas para cocinar alimentos con gran rapidez empleando vapor a presión. En algunos laboratorios pequeños se utilizan para esterilizar los utensilios con que se recolectan las muestras. Modelo de válvula giratoria 1. Llene con agua el fondo de la olla. Coloque los materiales que se van a esterilizar en la canastilla que se sostendrá arriba del nivel del agua por medio de un soporte. Los utensilios envueltos se deberán poner en posición vertical (nunca en posición horizontal; Fig. 3.67). 2. Ajuste la tapa de la olla. Atorníllese por medio de su perilla. Colóquese la válvula giratoria (V1) en su eje, que se encuentra sobre la tapa (Fig. 3.68). 3. Caliente la olla sobre una estufa. La válvula comenzará a girar en poco tiempo, dejando escapar un chorro de vapor. 4. Espere hasta que el chorro de vapor sea continuo y a continuación disminúyase el calor de modo que la válvula gire lentamente. Consérvese la olla con un calor moderado durante 20 minutos. 5. Reduzca completamente el calor. Deje enfriar la olla (o enfríela bajo el chorro de agua del grifo). Quite la válvula giratoria de manera que pueda entrar el aire. Retire la tapa. Saque los utensilios estériles y déjelos secar. 6. Precaución: Nunca toque la válvula de seguridad (V2 en la Fig. 3.68) que se encuentra fija a la tapa. Modelo de válvula fija 1. Coloque en la olla el agua y los utensilios que se van a esterilizar, como se ha indicado anteriormente. 2. Abra la válvula que se halla en la tapa. Inicie el calentamiento. 3. Tan pronto como comience a escapar un chorro continuo de vapor por la válvula, ciérrela. 4. Espere hasta que la válvula comience a silbar. Cuando lo haga redúzcase el calor. Déjese la olla con un calor moderado durante 20 minutos. 5. Reduzca completamente el calor. Deje enfriar la olla (o enfríela bajo el chorro de agua del grifo). 6. Abra la válvula de modo que pueda entrar el aire. Saque los utensilios estériles, etc. 7. Precaución: Nunca toque la válvula de seguridad. ESTERILIZACIÓN POR EBULLICIÓN Este procedimiento solo se debe usar cuando no hay alternativa. Utilice un recipiente especial para esterilizar por ebullición o, si no se dispone de éste, una cacerola. Llene con agua (de preferencia, desmineralizada). Caliéntese en la estufa. Los utensilios de vidrio (jeringas) se colocarán en el recipiente mientras el agua esté aún fría. Los artículos metálicos (agujas, pinzas) se colocarán en el recipiente cuando el agua esté hirviendo. Hierva durante 30 minutos los utensilios para recolectar muestras (agujas, jeringas). ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO ESTERILIZACIÓN POR EL HORNO DE AIRE CALIENTE El procedimiento de esterilización por aire caliente solo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal (jeringas, agujas, pipetas, etc.) cuando no se dispone de autoclave. No debe utilizarse para medios de cultivo utilizados en microbiología, que deben ser autoclavados (véase antes). Prepare el material para esterilizar, del mismo modo que para el método del autoclave. Los tapones de algodón no deberán ser demasiado gruesos, de modo que pueda entrar el aíre. Levántense ligeramente las tapas de los estuches metálicos y dispónganse de modo que miren a la parte posterior del homo. Ponga el termostato a 175°C y encienda el horno. Si hay un ventilador, verifique que esté funcionando. Vigile el termómetro. Cuando la temperatura llegue a 175°C sígase calentando durante 60 minutos más. Si los materiales son pesados o voluminosos, o si hay polvos, aceites, vaselina, etc., caliéntese a
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175°C durante dos horas. Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 40°C. Abra la puerta del horno. Cierre las tapas de los estuches metálicos. Saque los materiales estériles. El papel empleado para envolverlos deberá haber tomado un color marrón oscuro. Si el color del papel es amarillo pálido indicará que el horno no se ha calentado bastante; si el papel se ha ennegrecido indicará que el horno se ha calentado demasiado. ESTERILIZACIÓN POR FLAMEADO Este método solo se deberá utilizar con artículos metálicos como pinzas y bisturíes. No es conveniente para uso general. 1. Coloque los artículos en una bandeja metálica. 2. Añada unas 10 gotas de etanol y encienda fuego. 3. Durante el flameado incline la bandeja de un lado a otro (Fig. 3.69). Las asas para siembras bacterianas, las agujas de vacunación y las lancetas para extracción de muestras de sangre capilar se deben calentar en la llama de un quemador de gas o una lámpara de alcohol hasta que se pongan al rojo vivo.
A
B
Figura 3.67 Esterilizando equipo usando una olla a presión. Figura 3.68 Componentes de una olla a presión. Ilustración anexa A Esterilización por ebullición. Ilustración anexa B Esterilización por el horno de aire caliente.
Nota: Desde hace mucho tiempo y en la actualidad se utilizan jeringas y agujas descartables. Las jeringas están hechas de plástico así como el émbolo; las agujas están fabricadas de metal con el estuche de plástico que se pone en el cono de la jeringa. Completa todo el conjunto un capuchón de plástico que recubre toda la aguja para evitar pinchazos accidentales, y de esta manera, lesiones y transmisiones de enfermedades. Estas jeringas con aguja desechables desde hace bastante tiempo están a disposición en muchos hospitales tanto los de mayor complejidad como aquellos de menor complejidad dentro de los cuales se encuentran los centros de salud periféricos anexos. Se resalta el hecho porque son prácticas, seguras y su costo es muy barato. Prácticamente han reemplazado a las jeringas y agujas tradicionales de vidrio y metal por lo que no necesitan ser lavadas ni esterilizadas. Si bien este manual de la
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OMS no las incluye, será quizás porque piensa en un laboratorio con los mínimos recursos, por ende, coloca el proceso de lavado y esterilización de las jeringas y agujas tradicionales. Es menester recalcar que solo se usan una vez y luego se descartan en recipientes adecuados, como el descartador de agujas y algún recipiente dispuesto para tal fin para las jeringas desechables. Respetando lo publicado por la OMS en este manual de Técnicas básicas para un laboratorio de salud 2ª edición se deja la explicación sobre el lavado y la esterilización de las jeringas de vidrio y de las agujas metálicas.
Imágenes de jeringas y agujas descartables
Imágenes de dos modelos de recipientes descartadores de agujas desechables y elementos cortopunzantes. 3.6 ELIMINACIÓN DE RESIDUOS DE LABORATORIO 3.6.1 DESECHO DE MUESTRAS Y MATERIALES INFECTADOS Importante: Las muestras examinadas en el laboratorio (heces fecales, pus, esputo, orina, etc.) frecuentemente son infectantes. Después de examinarlas se deben destruir de manera que se evite todo riesgo de contaminación (Véase la sección 3.8). Estas muestras se pueden desechar en: — cajas de cartón o recipientes de material plástico que se pueden destruir (heces fecales, esputo) — frascos (tarros) de vidrio y matraces que se puedan limpiar, esterilizar y usar nuevamente. Todos los recipientes desechables se usan solo una vez. Cajas desechables para heces fecales o esputo Estas cajas se pueden quemar (incinerar) o enterrar.
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La incineración es el procedimiento más fácil y efectivo. 3.6.2 INCINERACIÓN DE LOS MATERIALES DE DESECHO FABRICACIÓN DE UN INCINERADOR (FIG. 3.70) 1. Disponga de un barril o latón metálico grande, usado. 2. Fije con firmeza una rejilla de metal resistente (R) aproximadamente a un tercio de la altura del barril. 3. Corte en el metal una abertura amplia o ventanilla (V) abajo del nivel que ocupa la rejilla. 4. Procure una tapa suelta (T) para el barril. Cómo incinerar 1. Al terminar el trabajo de cada mañana y cada tarde colóquense en la rejilla del incinerador todas las cajas usadas con heces fecales y esputo (Fig. 3.71). 2. El barril metálico deberá estar siempre firmemente cerrado (por medio de la tapa y la ventanilla) excepto durante la incineración. 3. Incinérelo una vez por semana o más frecuentemente si es necesario. Llene el fondo del barril con papeles, palos, virutas, etc. 4. Quite la tapa. Encienda el fuego y aliméntelo hasta que todos los materiales infectados se hayan reducido a cenizas. 5. Estas cenizas no son peligrosas y se pueden arrojar al basurero. 3.6.3 ENTIERRO DE LOS DESECHOS (a) Abra un foso de 4 - 5 m de profundidad y 1- 2 m de anchura en una ubicación donde ni las aguas subterráneas ni agua de superficie pueden entrar y donde la lixiviación de los residuos líquidos hasta las aguas subterráneas no puede ocurrir (Fig. 3.72). Un foso nunca debe ser construido cerca de una fuente de agua. (b) Fabrique una tapa que se ajuste con firmeza a la boca del foso. Es conveniente reforzar el borde de la boca del foso con un revestimiento de ladrillos o piedras. (c) Dos veces al día arroje en el foso las cajas usadas con heces fecales, esputo u otras materias infectadas. Coloque inmediatamente la tapa en su lugar. (d) Una vez por semana cubra los desechos con una capa (de 10 cm de espesor, aproximadamente) de hojas secas. (e) Si es posible, en vez de hojas secas deposite una capa de cal viva una vez por semana.
Figura 3.70 Componentes de un incinerador. T: Tapa; R: Rejilla de metal resistente; V: Ventanilla. Figura 3.71 Usando un incinerador.
Figura 3.72 Entierro de los desechos
3.7 ENVÍO DE MUESTRAS A UN LABORATORIO DE REFERENCIA Los laboratorios periféricos suelen enviar muestras a los laboratorios de referencia o a otros más especializados con el fin que efectúen exámenes que ellos no están en condiciones de realizar. Por ejemplo: — análisis serológicos de treponematosis o tifoidea; cultivos de heces fecales para detectar el
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vibrión del cólera; exámenes histológicos de materiales obtenidos en biopsias. La tabla 3.2 siguiente indica, para cada tipo de muestra y cada examen: — el recipiente y el preservativo (cuando sea necesario) que se deben usar — la cantidad de muestra que se debe enviar — el tiempo que se pueden conservar las muestras 3.7.1 EMPAQUETADO DE LAS MUESTRAS PARA SU ENVÍO Respete siempre los reglamentos en vigor en el país. Coloque las muestras en empaques dobles. Las muestras se meterán en frascos o tubos cerrados herméticamente (fijando el tapón con cinta adhesiva, véase Fig. 3.73). Compruebe que el recipiente tenga una etiqueta con el nombre del paciente. Ponga el recipiente sellado en un tubo de aluminio con tapa de rosca. Rellene el espacio existente entre la muestra y el tubo con algodón absorbente. Envuelva el tubo con la solicitud de exámenes de laboratorio (Fig. 3.74). En esta solicitud se deberán indicar: — el NOMBRE del paciente (escrito con letras mayúsculas), el sexo, la edad y la fecha de nacimiento — la naturaleza de la muestra — los exámenes que se solicitan (con el diagnóstico del médico, cuando sea pertinente) — la fecha de recolección de la muestra — la dirección del centro de salud donde la muestra fue recogida. También debe ser firmado por el médico. Coloque el tubo metálico en una caja de cartón grueso o en una de madera para enviarlo. Rellene el espacio vacío con algodón no absorbente. En el exterior de la caja escriba: URGENTE, FRÁGIL y si es pertinente, MATERIAL INFECCIOSO (Fig. 3.75).
Figura 3.73 Embalaje de las muestras para su transporte.
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Figura 3.74 Envuelva el formulario de solicitud en torno al tubo de metal que contiene la muestra. Figura 3.75 Etiquetar la caja que contiene la muestra con Urgente, Frágil, Material Infeccioso cuando sea pertinente. Urgent: Urgente; Fragile: Frágil; Infectious material: Material Infeccioso.
Tipo de muestra
Esputo
Tabla 3.2 Envío de muestras a un laboratorio de referencia Cantidad de Recipiente y Tipo de examen de laboratorio muestra que se preservativo envía Frasco de 45 ml con 25 ml Cultivo de bacilo tuberculoso de solución de -------(véase sección 5.4) bromuro de cetilpiridinio al 0,6% Cultivo de otros microorganismos Sin preservativo ---------Cultivo de bacilos de la difteria (véase sección 5.4)
Exudado faríngeo
Tubo con suero coagulado Hisopo de algodón
Cultivo de meningococos Líquido cefalorraquídeo (LCR) (véase sección 8)
Frasco especial con medio de Stuart modificado (reactivo Nº 56) (véase sección 8.4.2) LCR en un frasco estéril y hermético que se envía en un matraz al vacío, relleno con agua a 37°C
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2 ml
Duración
10 días
2 horas 24 horas
4 horas
24-48 horas
12 horas
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Cultivo de otros microorganismos
Frasco estéril
Ensayos químicos (glucosa, proteínas, cloruros, etc., véanse secciones 8.3.4 y 8.3.5)
Frasco estéril
Pus uretral
Cultivo de gonococos (véase sección 5.5)
Pus de otros sitios
Cultivo de bacterias (véase sección 5) Recuento de células leucocitos y hematíes (véanse secciones 9.5 y 9.6)
Pruebas serológicas para sífilis (véase sección 11 -10)
Pruebas serológicas para virus HIV y hepatitis B (véanse secciones 11.7 y 11.8)
Sangre (véase sección 9-11)
Pruebas para glucosa (véase sección 10.1) Otros ensayos bioquímicos: bilirrubina colesterol hierro sérico lípidos séricos proteínas funcionamiento hepático uremia Determinaciones de enzimas: amilasa, fosfatasas, transaminasas
Cultivo de sangre
Todos los cultivos bacterianos, incluso el vibrión del cólera (véase sección 5.9) Heces fecales
Todos los cultivos bacterianos, excepto el vibrión del cólera Huevos, larvas y quistes de parásitos (véase sección
2 ml
2 horas
2 - 4 ml
2 horas
1 hisopo con pus
24 horas
1 ml
2 horas
5 ml
12 horas
10 ml
3 días
5 ml
24 horas
5 ml
2 horas
Frasco sin anticoagulante Envíese suero
10 ml
48 horas
Frasco sin anticoagulante
5 ml
2 horas
5 ml
24 horas
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4 semanas
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2 semanas
Aproximadamente 5 ml
Casi por tiempo
Frasco especial con medio de Stuart modificado (reactivo Nº 56) 1 tubo estéril Solución de sal dipotásica EDTA, solución al 10% (reactivo Nº 22) Tubo estéril sin anticoagulante; enviar suero o gotas de sangre secas lo que se considere apropiado Enviar sucesivas muestras de suero: ● tomadas en el inicio de la enfermedad ● tomadas después de 2 a 4 semanas (para detectar aumento de anticuerpos) 5 mg de Fluoruro de Sodio
Frasco estéril especial con 50 ml de caldo de cultivo al que se haya elevado la temperatura a 37°C tan pronto como sea posible después de añadirle la muestra Medio de transporte Cary – Blair (reactivo Nº 17) Solución salina amortiguada de glicerol (reactivo Nº 14) Frasco de 30 ml con 15 ml
4.2.4)
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Amebas: Formas vegetativas (véase sección 4.2.4)
Análisis bioquímicos: glucosa, proteínas, acetona, etc.; véase sección 7.2.4 y 7.2.6)
Sedimentos (véase sección 7.2.7)
Orina (véase sección 7)
de solución de formaldehido al 10% (reactivo Nº 28) Tubo de 10 ml con solución de tiomersal, yodo y formal dehido (TIF) fijador (reactivo No 58), o alcohol polivinílico (APV, reactivo No.44) Frasco seco y limpio (cerrado herméticamente) Frasco seco y limpio o frasco con 8 gotas de solución de formaldehido al 10% (reactivo No. 28)
indefinido
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Casi por tiempo indefinido
20 -50 ml (según el número de análisis)
2 horas
30 ml
2 horas
30 ml
2 días
Para concentración: 2 ml de lejía comercial y 1 ml de ácido clorhídrico
100 ml
Cultivo de bacterias(véase sección 5)
Frasco estéril
20 ml
1 hora
Prueba de embarazo (véase sección 11.5)
Frasco estéril
20 ml (la primera micción del día)
12-24 horas (o 4 días en frigorífico)
Huevos de Esquistosomas
Casi por tiempo indefinido
Se usan los fijadores siguientes: Tejidos de — solución salina órganos Exámenes histológicos (véase de obtenidos para sección 3.7.2) formaldehido ------------------biopsias (reactivo No. 27) — fijador de Zenker (reactivo No. 66) Sobre de papel o frasco con tapa Búsqueda de hongos de rosca (no se por lo Pelos, uñas, (micosis) (véanse secciones 6.1 y usen menos una ---------tejido cutáneo 6.3) tubos con tapón semana (a de caucho ni veces, más) taponados con algodón) 3.7.2 FIJACIÓN Y ENVÍO DE MATERIAL DE BIOPSIAS PARA ESTUDIOS DE HISTOPATOLOGÍA BIOPSIA Para diagnosticar algunas enfermedades de los órganos el médico extrae un fragmento de tejido con una pinza o un bisturí especiales. Esta pieza de tejido se llama muestra de biopsia. Se examina al microscopio después de cortar una porción delgada y tratarla con una tinción especial. HISTOPATOLOGÍA Las células de los tejidos y las muestras de biopsias de los órganos se pueden estudiar con el microscopio. El examen microscópico de las células se llama histopatología. La patología es el estudio de las modificaciones y deformidades de las células causadas por diversas enfermedades. Los exámenes de este tipo pueden ser sumamente importantes, especialmente para el diagnóstico del cáncer. El técnico de laboratorio deberá ser capaz de fijar la muestra de biopsia, y asegurar que se envíe
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de la manera apropiada y llegue al laboratorio de patología en condiciones de conservación satisfactorias. FIJACIÓN DE MUESTRAS DE BIOPSIAS
El fragmento de tejido se sumerge en un líquido fijador. Este procedimiento deberá permitir que se conserve hasta donde sea posible en condiciones semejantes a las del tejido vivo, protegiéndolo de la acción de las bacterias, la autolisis, el encogimiento, etc. El recipiente más adecuado para esta clase de muestras es un frasco de material plástico, de boca ancha, con tapa (frasco para tabletas). Se puede obtener en tamaños de 60 ml, 45 ml, 30 ml y 15 ml. FIJADORES Los fijadores que se preparan más fácilmente son: — Solución salina de formaldehido (reactivo No. 27) — Fijador de Zenker (reactivo No. 66). Inmediatamente antes de usar este fijador añada 5 ml de ácido acético glacial por cada 100 ml de la solución de Zenker. TÉCNICA PARA LA FIJACIÓN Cantidad del fijador El volumen de fijador necesario es aproximadamente 50 veces mayor que el volumen del tejido de la biopsia. Normalmente éste deberá tener un espesor de 3-5 mm (cuando es más grueso, la fijación se dificulta o se hace imposible). Sin embargo, el área de la muestra puede variar y esto determinará la cantidad de fijador que se usará (véase Tabla 3.3). Cantidad de fijador: Tabla 3.3 Cálculo de la cantidad de fijador para usar en el material de biopsia Dimensiones de la muestra (cm) Cantidad de fijador (ml) muestra de 0,5 x 0 ,5 cm 6-10 ml muestra de 0,5 x 1 cm 10-15 ml muestra de 1 x 1 cm 20-25 ml muestra de 2 x 1 cm 30-40 ml muestra de 2 x 2 cm 90 ml Preparación Es esencial actuar rápidamente al recibir una muestra de biopsia. Nunca se deje para después. Primero vierta el fijador en un recipiente. A continuación coja la muestra de biopsia con un pedazo de papel duro (cartulina) (no use pinzas, pueden dañar el tejido). Deposite la muestra en el recipiente. Etiquetado Corte un rectángulo pequeño (aproximadamente de 3 x 1 cm) de papel duro. Con un lápiz de plomo escriba en el papel el nombre del paciente, la fecha en que se ha obtenido la muestra, etc. Pegue la pieza de papel en el recipiente que contiene el fijador. Tiempo de fijación El tiempo varía según el fijador que se utilice. Con los dos fijadores que se han mencionado pueden transcurrir de 24 a 48 horas antes de que la muestra se corte y tiña, aunque se puede dejar en el líquido por lo menos durante una semana. El material ya fijado se debe enviar al laboratorio de patología sin tardanza, aunque un transporte prolongado no dañará a las muestras. Envío Asegure la tapa o el tapón del recipiente con cinta adhesiva. Coloque el recipiente en un tubo o una caja de metal, junto con el informe correspondiente (nombre, fecha, enfermedad sospechada, tipo de tejido que se envía, investigación que se solicita) (véase sección 3.7.1). A continuación ponga el tubo o la caja con el informe en un estuche pequeño de madera o cartón, rellene el espacio vacío con algodón no absorbente y envíelo inmediatamente. TÉCNICA DEL EXAMEN HISTOLÓGICO: GENERALIDADES 1. FIJACIÓN DE LA MUESTRA (véase antes) 2. INCLUSIÓN DEL TEJIDO Después de tratarlo con varias sustancias para deshidratarlo y clarificarlo, el tejido se debe incluir en un bloque sólido de parafina. 3. CORTE El bloque en que se ha incluido el tejido se corta en secciones suficientemente delgadas para poderlas examinar con el microscopio. El instrumento que se utiliza para hacer estos cortes se llama "micrótomo" y con él se pueden obtener las secciones sumamente delgadas que se necesitan. El espesor promedio de los cortes es de 3-5 µm (micrómetros). 4. TINCIÓN Los cortes se colocan en portaobjetos y se secan la parafina se desprende aplicando un solvente (por ejemplo, xilol). A continuación los cortes se deshidratan y tiñen. Existen varios tipos de tinción; el patólogo elige, según la naturaleza de la muestra y la enfermedad que se sospecha. 5. PROCEDIMIENTO SUSTITUTO: CORTES CONGELADOS Con objeto de efectuar un diagnóstico rápido el tejido se trata con un micrótomo congelador utilizando gas líquido, y al mismo tiempo que congela la muestra fresca no fijada hace los cortes. Este procedimiento se emplea durante las operaciones quirúrgicas.
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ENVÍO DE UN ÓRGANO O TUMOR Se utilizan los mismos fijadores. Sumerja completamente el órgano o tumor en un recipiente grande en donde previamente se ha colocado el fijador.
A
B
C
D
E
F
G
H Ilustraciones anexas A, B, C, D, E, F, G, H, I Técnica histológica: A) Cantidad del fijador. B) Preparación. C) Etiquetado. D) Tiempo de fijación. E) Envío. F) Inclusión del tejido. G) Corte. H) Tinción. I) Procedimiento sustituto: cortes congelados.
I 3.8 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO ● Cada laboratorio debe disponer de un manual escrito de las prácticas de seguridad en el laboratorio que se deben seguir en todo momento. ● El laboratorio debe tener un botiquín de primeros auxilios (ver sección 3.8.2) y al menos un miembro del personal entrenado en primeros auxilios. ● El laboratorio debe ser un área de trabajo solamente, los visitantes deben ser restringidos. ● Ningún alimento o bebida debe ser consumida en el laboratorio. ● Usar ropa protectora y sacársela o en últimos casos eliminarla antes de salir del laboratorio. ● Siempre se debe considerar cualquier muestra de laboratorio como potencialmente infeccioso y manejarlo con cuidado, usar guantes protectora. ● Coloque todas las muestras de manera segura en una mesa o en un estante para evitar que se derrame o rompa. ● Tenga mucho cuidado en la recogida y procesamiento de muestras de sangre, ya que pueden albergar agentes infecciosos (por ejemplo, virus de la hepatitis B, parásitos, etc.) ● Cubra todos los cortes con un apósito impermeable (tirita, parche). ● Deseche las agujas y lancetas usadas con seguridad en una "objetos punzantes" contenedor. (Sharps contenedores se pueden hacer a partir de botellas de plástico con tapón de rosca en la que se hace un agujero.) Una vez llenos, los contenedores deben ser esterilizados en autoclave o empapado en desinfectante antes de quemar o enterrar en una fosa profunda (ver secciones 3.6.2 y 3.6.3 ). ● Cubra cualquier material derramado o tubos rotos de cultivo con un paño empapado en desinfectante (véase la sección 3.5.4) y dejar actuar durante 30 minutos. A continuación, utilice un cepillo duro o una hoja de cartón para barrer en un recipiente para muestras desechable. ● Al final del día, limpie las mesadas con un paño empapado en desinfectante (véase la sección
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3.5.4) ● Lávese bien las manos después de manipular material infeccioso y antes de abandonar el laboratorio. Las muestras pueden ser eliminadas: En cajas de cartón o recipientes de plástico que pueden ser destruidos (heces, esputo); En frascos de vidrio y botellas que se puedan limpiar, esterilizar y volver a usar (ver secciones 3.5.1, 3.5.2 y 3.5.5). Los recipientes desechables no deben reutilizarse. 3.8.1 PRECAUCIONES PARA EVITAR ACCIDENTES MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS Y ÁLCALIS Dilución del ácido sulfúrico con agua Añada siempre el ácido sulfúrico al agua, gota a gota, agitando la mezcla después de cada gota. Haga esta operación de preferencia dentro del fregadero. Nunca vierta el agua en el ácido sulfúrico (para evitar el peligro de salpicaduras debido a la evaporación explosiva del agua mientras se mezcla). Frascos con ácidos y álcalis Consérvense en los anaqueles inferiores de los armarios. Cuando se coja un frasco del armario, sosténgalo firmemente en posición vertical con la mano seca. No se guarden ácidos o álcalis en frascos con tapones de vidrio esmerilado (se pueden adherir). Uso de las pipetas Siempre que sea posible utilice probetas pequeñas para medir ácidos y álcalis. Si se requiere una medición más precisa use una pipeta con una propipeta de goma conectada en la punta. Aspírese lentamente, observando siempre el nivel del líquido. CALENTAMIENTO DE UTENSILIOS DE VIDRIO Y LÍQUIDOS Tubos de ensayo Nunca caliente el fondo de un tubo de ensayo. El líquido que contenga puede borbotear. Caliente el tubo por la mitad, agitándolo suavemente. La boca del tubo se deberá orientar en sentido opuesto al operador o cualesquiera otras personas, dirigiéndolo hacia un espacio vacío o un fregadero. Vidrio ordinario y Pyrex Solamente los utensilios de vidrio Pyrex y los receptáculos de porcelana se pueden calentar en la llama del mechero Bunsen. El vidrio corriente se rompería. Líquidos inflamables En el laboratorio solo se deben conservar cantidades reducidas de líquidos inflamables, como éter, etanol, acetona, benceno, tolueno y bisulfuro carbónico, ADVERTENCIA: El éter puede incendiarse aunque se encuentre a varios metros de distancia de una llama. Nunca coloque un frasco con éter sobre una mesa de trabajo en que haya una llama descubierta (mechero Bunsen, lámpara de alcohol, etc.). El bisulfuro carbónico es aún más peligroso. Gas butano o propano Para encender un mechero de gas préndase primeramente un fósforo y aplíquese al mechero, abriendo a continuación la llave del gas. Cada noche se cerrarán las válvulas principales de todos los depósitos de gas butano. Se cambiarán las conexiones de goma una vez al año. 3.8.2 PRIMEROS AUXILIOS EN ACCIDENTES DE LABORATORIO En el laboratorio médico los accidentes pueden ser causados por: 1. Ácidos ó 2. Álcalis — que salpican la piel — que salpican los ojos — que se ingieren involuntariamente. 3. Sustancias tóxicas 4. Calor — llamas descubiertas — líquidos calientes — líquidos inflamables — explosiones. 5. Vidrios rotos Además de estos accidentes pueden ocurrir heridas debidas a materiales infectados, lesiones en el organismo por choques eléctricos, etc. EQUIPO ÚTIL PARA PRIMEROS AUXILIOS — Solución acuosa de carbonato sódico al 5% (reactivo Nº 52) — Solución acuosa de bicarbonato sódico al 2%(reactivo Nº 50) (en frasco gotero para uso oftálmico) — Acido acético al 5% (reactivo Nº 1) — Solución saturada de ácido bórico (reactivo Nº 12) (en frasco gotero para uso oftálmico) — Solución de polvos de jabón: 5 g porcada litro de agua — Algodón y gasa — Mercurocromo y tintura de yodo. Estos artículos deberán estar en lugares de fácil acceso en el laboratorio. No se deben guardar en alacenas cerradas. Las soluciones se conservarán en frascos de plástico.
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QUEMADURAS POR ÁCIDOS Ácidos tales como ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido crómico, ácido clorhídrico, ácido acético y el ácido tricloroacético pueden causar lesiones corrosivas. Por tanto, es esencial tomar medidas inmediatas en caso de accidente. En todos los casos: Lavar la zona afectada inmediatamente con grandes cantidades de agua. Salpicaduras de ácido en la piel (a) Lávese profusa y repetidamente con agua. (b) Lave la porción de piel afectada con un pedazo de algodón empapado en solución acuosa de carbonato sódico al 5% Salpicaduras de ácido en el ojo (a) Lávese el ojo inmediatamente con agua abundante aplicada con un frasco de lavado (o una pera de goma) por 15 minutos (Fig. 3.76); dirija el agua hacia el ángulo interno del ojo, cerca de la nariz. También puede poner la cabeza Inclinada bajo el grifo, de modo que el chorro de agua le caiga sobre el ojo (Fig. 3.77). Pida al paciente que cierre el ojo que no se ve afectado. (b) Después de haber lavado el ojo, ponga en él 4 gotas de solución acuosa de bicarbonato sódico al 2%. (c) Procúrese la atención de un médico. Siga aplicando la solución de bicarbonato al ojo mientras se consigue el auxilio médico. Ingestión de ácidos A l usar una pipeta se pueden ingerir ácidos accidentalmente: (a) Llámese un médico. (b) Haga que el paciente beba inmediatamente cierta cantidad de la solución jabonosa al 5% o leche (o bien haga que ingiera dos claras de huevo mezcladas con 500 ml de agua o leche). Si no se cuenta con estos recursos el paciente deberá beber agua corriente. (c) Indíquese al paciente que haga gárgaras con la solución jabonosa o con leche. (d) Adminístrense al paciente 3 ó 4 vasos de agua corriente. (e) Si el ácido ha quemado los labios y la lengua: — enjuáguense profusamente con agua — humedézcanse con solución acuosa de bicarbonato sódico al 2%. Nota: Siempre pipetear ácidos usando una propipeta de goma, nunca con la boca. Quemaduras por álcalis (Hidróxido de sodio, de potasio o de amonio) En todos los casos: Lávese inmediatamente con abundante cantidad de agua. Importante: Las quemaduras por álcalis son tan peligrosas o más que las producidas por ácidos. Salpicaduras de álcalis en la piel (a) Lávese profusa y repetidamente con agua. (b) Humedézcase la parte afectada de la piel con un pedazo de algodón empapado con ácido acético al 5%, (o vinagre sin diluir, o con jugo de limón). Salpicaduras de álcalis en el ojo (a) Lávese inmediatamente con abundante cantidad de agua por medio de un frasco de lavado (o una pera de goma); diríjase el agua hacia el ángulo interno del ojo, cerca de la nariz (véase Fig. 3.76). Alternativamente, lave el ojo con agua corriente del grifo (véase fig. 3.77). (b) A continuación lávese el ojo con solución saturada de ácido bórico, aplicando repetidas veces gotas de esa solución. (c) Lleve inmediatamente el paciente a un médico. Continuar aplicando solución de ácido bórico en el ojo hasta que el médico llegue. Ingestión de álcalis Al usar una pipeta se pueden deglutir álcalis accidentalmente: (a) Búsquese un médico. (b) Hágase que el paciente beba inmediatamente: — solución de ácido acético al 5% (o bien, zumo de limón o vinagre diluido, a razón de una parte de vinagre por cada tres partes de agua). (c) Indíquese al paciente que haga gárgaras con la misma solución de ácido acético. (d) Adminístrense al paciente tres o cuatro vasos de agua corriente. (e) Si el álcali ha quemado los labios y la lengua: — enjuáguense profusamente con agua — humedézcanse con ácido acético al 5%. Intoxicaciones Las intoxicaciones pueden ocurrir por: — inhalar vapores o gases tóxicos (por ejemplo, cloroformo) — deglutir accidentalmente una solución tóxica que se esté aspirando con una pipeta. En todos los casos: (a) Solicítense los servicios de un médico o una enfermera experta, especificando la sustancia tóxica de que se trate. (b) Colóquese la víctima al aire libre mientras se espera al médico. Quemaduras causadas por calor Estas son de dos tipos: 1. Quemaduras graves que afectan porciones extensas de la piel (por ejemplo quemaduras producidas al derramarse sobre la víctima éter en combustión o agua hirviendo). 2. Quemaduras menores, que afectan una porción reducida de la piel (por ejemplo, quemaduras
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causadas por utensilios de vidrio calientes o la llama de un mechero Bunsen). Quemaduras graves (a) Si la víctima está envuelta en llamas (por ejemplo, cuando se ha salpicado con éter u otro solvente inflamable que se encuentre en combustión), cúbrase rápidamente con una frazada (manta, cobertor) o un sobretodo para aminorar el fuego. (b) Infórmese inmediatamente al médico que se encuentre de guardia en el departamento de urgencias, explicando con claridad que hay un paciente con quemaduras graves que debe ser atendido. (c) Acuéstese la víctima en el suelo. No se quiten sus ropas. Cúbrase la víctima si siente frío. (d) No se aplique tratamiento alguno a las quemaduras; esto deberá quedar a cargo del médico. Quemaduras menores (a) Sumérjase la parte afectada en agua fría o helada para mitigar el dolor. (b) Aplíquese mercurocromo (o tintura de yodo) a la quemadura. (c) Colóquese un vendaje de gasa seca, sin apretarlo. (d) Si la quemadura se infecta o no cura, envíese el paciente a un médico. Nunca se rompan las ampollas que se forman en las quemaduras. Nota: ¡Nunca arrancar las ampollas que se forman sobre quemaduras! HERIDAS CAUSADAS POR VIDRIOS ROTOS Vidrios limpios (a) Desinféctese la piel de la manera habitual (con mercurocromo, tintura de yodo, etc.). (b) Cúbrase la herida con un vendaje adhesivo (del tipo listo para usarse). (c) Si la herida sangra profusamente, deténgase la hemorragia presionando con una compresa (estéril si es posible). Envíese el paciente al departamento de urgencias. (d) Si la herida sangra intensamente y la sangre brota a intervalos, inténtese detener la hemorragia con una compresa y solicítese un médico o una enfermera experta. (e) Continúese ejerciendo presión sobre la herida mientras se espera al médico o la enfermera. Ellos decidirán si deben aplicar un torniquete. Vidrios con materiales infectantes Si los trozos de vidrio contienen heces fecales, pus, cultivos bacterianos, etc.: (a) Obsérvese si la herida sangra; si no es así, exprímase la herida con fuerza para hacerla sangrar durante varios minutos. (b) Báñese toda el área (los bordes y el interior de la herida) con tintura de yodo o un antiséptico quirúrgico (véase Tabla 3.1). (c) Lávese profusamente con agua jabonosa. (d) Báñese nuevamente con tintura de yodo. (e) Si se sabe que hay materias sumamente infecciosas (cultivos bacterianos, pus, etc.) envíese la víctima a un médico. Lesiones orgánicas por choque eléctrico En el laboratorio se suele usar una corriente eléctrica alterna de bajo voltaje (120 ó 220 V) y los choques eléctricos son raros. Estos pueden ocurrir cuando se maneja equipo defectuoso, particularmente con las manos húmedas. Los síntomas son pérdida del conocimiento y asfixia. (a) Como primera medida, interrumpa la corriente eléctrica. (b) Llame al médico. (c) Aplíquese inmediatamente respiración artificial (de boca a boca) y masaje externo al corazón si es necesario (véase la Ilustración anexa A).
Figura 3.76 Enjuagar el ojo con un frasco de polietileno Figura 3.77 Enjuague los ojos bajo el grifo
Ilustración anexa A Aplíquese inmediatamente respiración artificial (de boca a boca) y masaje externo al corazón si es necesario.
3.9 GARANTÍA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO
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La garantía de calidad en el laboratorio incluye todos los aspectos del trabajo analítico, desde la correcta identificación y preparación del paciente para asegurarse que el resultado del laboratorio vuelva al médico. El objetivo principal de la garantía de calidad es garantizar que el laboratorio proporciona resultados que son correctos y relevantes para la situación clínica del paciente. Las etapas en las que se debe aplicar la garantía de calidad incluyen: -La preparación del paciente -Recolección de la muestra -La manipulación y envío de la muestra (ver secciones 2.6.1 y 3.7) -El control de métodos y reactivos (véase métodos individuales) -La calibración de los equipos (ver sección 2.5) -La presentación de los resultados (véase la sección 2.6.2). 3.9.1 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA La apropiada colección de muestras es de suma importancia si los resultados de laboratorio han de ser relevante para la situación clínica de un paciente. Cuando el material se recoge con fines de vigilancia y control del tratamiento de los pacientes, los siguientes factores deben ser considerados: -El estado fisiológico del paciente (por ejemplo, los rangos de referencia de determinados indicadores varían con la edad y el sexo); -La preparación apropiada de los pacientes para la recogida de muestras (por ejemplo, en sangre, para la medición de la glucosa y los lípidos se debe tomar por la mañana de un paciente que se ha mantenido en ayunas durante 12 horas, debido a que sus concentraciones son elevadas después de una comida); -Las herramientas adecuadas para la recogida de muestras (por ejemplo, en sangre, para el recuento celular se deben recoger en tubos que contienen sales de EDTA dipotásico para evitar la coagulación del plasma y la agregación plaquetaria); -El sitio adecuado para la recogida de muestras (por ejemplo, la concentración de glucosa es diferente en la sangre arterial y en la venosa). Los aspectos específicos de la recogida de muestras, incluyendo aquellas para la detección de microorganismos infecciosos (bacterias y parásitos), se describen en las secciones pertinentes de este manual. Para asegurarse que se obtiene la muestra más útil, se recogerán siempre en el momento oportuno. La recolección aleatoria debe limitarse a las situaciones de emergencia. Por ejemplo, las muestras de esputo para la detección de bacilos de la tuberculosis deben ser recogidas por la mañana temprano, mientras que la orina para el diagnóstico de la esquistosomiasis y otras condiciones se deben recoger como una muestra de orina "terminal" (ver sección 7.2.8).
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Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud
OMS PARTE 2
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4. PARASITOLOGÍA 4.1 INTRODUCCIÓN El estudio de los parásitos que causan enfermedades al ser humano se llama parasitología médica. Parásito es un organismo que habita en el interior o sobre otro organismo vivo de una especie diferente, y se alimenta de éste produciéndole daño. El organismo del que se alimenta el parásito se llama huésped. Los parásitos que, como las garrapatas, viven sobre un huésped se llaman ectoparásitos. Los parásitos que, como los nematodos o las amebas viven en el interior del huésped se conocen como endoparásitos. Muchas enfermedades son causadas por la infección producida por parásitos. Ellos constituyen una causa importante de diarrea (ver Tabla 4.1), la cual constituye un importante problema de salud en los países en desarrollo. Si la diarrea aguda es causada por infección parasitaria, esto se puede determinar mediante el examen de una muestra de heces. Es útil para los técnicos de laboratorio entender las formas en que las personas pueden infectarse con parásitos intestinales (ver Tabla 4.2). A continuación, pueden darse consejos sobre higiene a los miembros de la comunidad y cómo ellos pueden evitar la infección por sí mismos, sobre todo en el laboratorio. Tabla 4.1 Causas más comunes de enfermedades diarreicas Tipo de causa Causa específica Infecciosa Protozoo Amebas Giardia spp. Balantidium coli Isospora belli Cryptosporidium spp. Plasmodium spp. Bacteria Salmonella spp. Shigella spp. Escherichia coli Vibrio chloreae Staphylococcus spp. Campylobacter spp. Virus Rotavirus Helmintos Fasciolopsis spp. Strongyloides stercoralis Trichuris trichura Hymenolepis nana Heterophyes heterophyes No infecciosa Síndromes de mala absorción Esprue tropical Enfermedad de Crohn Enfermedad de Whipple Intoxicaciones Intoxicación alimenticia Químicos Drogas Errores innatos del metabolismo Intolerancia a los carbohidratos Enteropatía por gluten Enfermedades metabólicas Enfermedad adrenal
Nombre Científico Helmintos
Tabla 4.2 Vías de transmisión de los parásitos intestinales Nombre común ¿Cómo se contrae la infección?
Ancylostoma duodenale
Anquilostoma, Uncinaria; “Uncinaria del viejo mundo”
Ascaris lumbricoides
Lombrices intestinales, áscaris
Clonorchis sinensis
Duela hepática china
Dicrocoelium dendriticum, D. hospes
Duela hepática lanceolada
Diphyllobothrium latum
Tenia de los peces
Dipylidium caninum
Tenia del perro
Enterobius vermicularis
Oxiuro
Fasciola gigantica Fasciola hepatica
Duela hepática gigante Duela del hígado
Caminar descalzo en el suelo contaminado con heces, jugando en suelo contaminado (niños) Comer verduras crudas sin lavar y ensaladas, jugando en terreno contaminados con heces (niños) Comer carne poco cocida infectada Tragar las hormigas infectadas (en ensalada sin lavar o jugando en la hierba (niños)) Comer pescado de agua dulce crudo o poco cocinado Tragar pulgas del perro (niños) Caminar descalzo en el suelo contaminado por heces fecales; autoinfección, el contacto con personas infectadas con las manos sucias; la inobservancia de las normas de seguridad relativas a la limpieza en el laboratorio Comer ensaladas sin lavar Comer ensaladas sin lavar
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Fasciolopsis buski Heterophyes heterophyes Hymenolepis diminuta
Duela intestinal gigante Duela enana Tenia de la rata
Hymenolepis nana
Tenia enana
Metagonimus yokogawai
Duela japonesa
Necator americanus
Uncinaria; “Uncinaria americana”
Paragonimus westermani
Duela oriental del pulmón
Schistosoma haematobium
Esquistosoma (vesical)
Schistosoma intercalatum
Esquistosoma (rectal)
Schistosoma japonicum
Esquistosoma (asiático u oriental)
Schistosoma mansoni
Esquistosoma (intestinal)
Taenia saginata Taenia solium:
Tenia de la vaca; lombriz solitaria Tenia del cerdo
Adultos Forma larvales (cisticercos) Trichostrongylus spp.
-------------------
Trichuris trichiura
Tricocéfalo
Comer ensaladas sin lavar Comer carne poco cocida infectada Tragar pulgas de la rata Comer vegetales contaminados; autoinfección Comer carne poco cocida infectada Caminar descalzo en el suelo contaminado por heces, jugando en suelo contaminado (niños) Comer cangrejos de agua dulce infectados poco cocidos Bañarse en los ríos o estanques contaminados con orina o heces infectadas Bañarse en los ríos o estanques contaminados con orina o heces infectadas Bañarse en los ríos o estanques contaminados con orina o heces infectadas Bañarse en los ríos o estanques contaminados con orina o heces infectadas Comer carne poco cocida infectada Comer carne poco cocida infectada Comer verduras crudas sin lavar; autoinfección Comer ensaladas sin lavar (Asia) Comer verduras crudas sin lavar y ensaladas
Protozoos Balantidium coli
-------------------
Entamoeba histolytica
-------------------
Giardia intestinalis
-------------------
Comer verduras sin lavar, ponerse en contacto con cerdos infectados (en las granjas) Beber agua contaminada, comer verduras crudas sin lavar y ensaladas, ponerse en contacto con personas infectadas con las manos sucias, la inobservancia de las normas de seguridad relativas a la limpieza en el laboratorio Beber agua contaminada, comer verduras crudas sin lavar y ensaladas, ponerse en contacto con personas infectadas con las manos sucias; la inobservancia de las normas de seguridad relativas a la limpieza en el laboratorio
4.2 EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE HECES PARA PARÁSITOS 4.2.1 COLECCIÓN DE MUESTRAS La confiabilidad de los resultados depende considerablemente del cuidado que se ejerza al recolectar las heces fecales. Se deben tomar las precauciones que se exponen a continuación para los análisis de heces fecales en busca de parásitos Recoja aproximadamente 100 g de heces en un recipiente limpio, seco y sin conservantes. Un recipiente con tapa de rosca es el más adecuado (véase la sección 2.5.5). Asegúrese de que los gusanos adultos o los segmentos (proglótides) están incluidos. Para la recogida de muestras de heces para examen bacteriológico (por ejemplo, para el cultivo del cólera y otras bacterias que causa la disentería), ver sección 5.9.4. Precauciones ● Nunca deje las muestras de heces expuestas al aire en recipientes sin tapa. ● Nunca acepte muestras de heces mezcladas con orina (por ejemplo, en un orinal o chata). ● Nunca examinar las muestras de heces sin antes ponerse los guantes. ● Siempre examine las muestras de heces dentro de 1-4 horas después de la recolección. Si se reciben varias muestras al mismo tiempo, examinar las heces líquidas y las que contienen moco o sangre primero, ya que pueden contener amebas móviles (que mueren rápidamente). ● Nunca coloque el recipiente que contiene la muestra de heces sobre la plantilla de solicitud de examen. 4.2.2 EXAMEN VISUAL Las muestras fecales se describen mejor por su color, la consistencia y la presencia o ausencia de sangre macroscópica o exudado. Color El color se puede describir como: - Negro (sangre oculta) - Marrón, amarillo pálido (grasa) - Blanco (ictericia obstructiva). Consistencia (Fig. 4.1) La consistencia se puede describir como: - Formada (forma normal) - Formada blanda - uniforme o líquida (acuosa).
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La presencia de sangre o moco externa, que suele presentarse en forma de líneas de color rojo o negro, hay que señalar. La sangre puede estar presente en ciertas condiciones médicas (por ejemplo, colitis ulcerosa, esquistosomiasis,).
Figura 4.1 Evaluación de la consistencia de las muestras fecales. F: Formada; B: Blanda; A: (acuosa). 4.2.3 EL EXAMEN MICROSCÓPICO El examen microscópico de las heces en suspensión salina o de yodo es útil por las razones siguientes: - Para detectar trofozoítos móviles; - Para detectar huevos y quistes presentes en cantidades moderadas; - Para detectar eritrocitos, restos celulares o exceso de grasa. Seleccione las heces no formadas o líquidas cuando se utiliza la microscopía directa para la detección de trofozoítos. Las heces formadas rara vez contienen trofozoítos móviles. También se realizará un examen directo de cualquier sangre o moco externo. Materiales y reactivos (Fig. 4.2) ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Aplicadores de madera o asas de alambre (0,45 mm, alambre de aleación de níquel-cromo) ● Lápices de grasa o cera; alternativamente, marcadores permanentes ● cloruro de sodio, solución al 0,85% (no reactivo. 53) ● Solución yodada de lugol, solución al 0,5% (no reactivo. 37) ● Ácido acético, solución al 50% (no reactivo. 3), se diluyó 1:1 con agua destilada ● Solución de azul de metileno (no reactivo. 39) ● Eosina, 2% en solución salina (no reactivo. 24).
Figura 4.2 Materiales y reactivos para el examen microscópico directo de las heces para la búsqueda de parásitos. Figura 4.3 Añadiendo una gota de solución salina y una gota de la suspensión de yodo al portaobjeto.
Figura 4.4 Muestreo de un espécimen fecal para búsqueda de huevos de parásitos. La ilustración muestra en este caso que la materia fecal está bien formada, entonces, tómese esta porción de una parte profunda de la muestra (puede haber huevos de parásitos) y de la superficie.
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A
B Ilustraciones anexas A, B, C. A) Cuando las heces contienen moco o son líquidas, tómese la porción indicada del moco sanguinolento de la superficie o del líquido que las rodea (puede haber amebas). B) Mezcle la porción tomada de la muestra con la gota de solución de cloruro sódico que se ha depositado en el portaobjetos. C) Con el aplicador o el asa de alambre tómese otra porción de la muestra y mézclela con la gota de solución yodada.
C Método 1. Preparar una mezcla 1:1 de solución de yodo de Lugol y solución de ácido acético (diluido como se expuso anteriormente). Diluir la mezcla con cuatro volúmenes de agua destilada y agítela. 2. Tome un portaobjetos seco y la etiqueta con el nombre o número del paciente. 3. Ponga: - Una gota de solución de cloruro sódico calentado a 37 °C en el medio de la mitad izquierda del portaobjeto; y - Una gota de la solución de yodo- ácido acético en el medio de la mitad derecha del portaobjeto (Fig. 4.3). 4. Con el aplicador o el asa de alambre tómese una pequeña porción (aproximadamente 2-3mm de diámetro) de las heces. (a) Si las heces están bien formadas, tómese esta porción de una parte profunda de la muestra, en especial y si es posible, del centro de la muestra (Fig. 4.4) y de la superficie en busca de huevos de parásitos. (b) Si las heces contienen moco o son líquidas, tómese la porción indicada del moco sanguinolento de la superficie o del líquido que las rodea (puede haber amebas). 5. Mezclar la muestra con la gota de solución de cloruro de sodio en el portaobjeto. 6. Usando el aplicador o asa de alambre, tomar una segunda porción de la muestra de heces como se describió anteriormente y se mezcla con la gota de solución de yodo-ácido acético. Tire el aplicador (o queme el asa de alambre en un mechero de Bunsen) después de su uso. 7. Colocar un cubreobjetos sobre cada gota (aplicar los cubreobjetos tal como se muestra en la Fig. 4.5 para evitar la formación de burbujas de aire). 8. Examine la preparación en el microscopio. Para la preparación salina utilizar los objetivos x 10 y x 40 y un ocular de x 5. Como los huevos y quistes son incoloros, reducir la cantidad de luz usando la abertura del condensador o bajar el condensador para aumentar el contraste. Para la preparación con solución yodada emplee un objetivo x 40 (es decir, primero observar con un objetivo x 10 y luego pasar a uno de x 40). Examinar la primera preparación con el objetivo x10, comenzando en la esquina superior izquierda, como se indica en la figura. 4.6. Enfoque sobre el borde de un cubreobjetos utilizando el objetivo x 10 y examinar toda el área bajo cada cubreobjetos para investigar la presencia de huevos y larvas de Strongyloides stercoralis. Con el objeto de asegurar que ninguna parte del campo microscópico se deja de observar, escoja un objeto que se halle en la orilla del campo visual y mueva el portaobjetos a través de la platina del microscopio, examinando el campo hasta que el objeto escogido se encuentre en la orilla contraria. Repita este procedimiento en todo el campo microscópico. Después de examinar cada campo use por lo menos una vez el objetivo x 40 para investigar la presencia de protozoarios, que son sumamente pequeños. Esto es, cambiar al objetivo x 40 y de nuevo examinar toda el área del cubreobjetos de la solución salina para la búsqueda de los trofozoítos móviles y haga lo mismo para el área del cubreobjetos con solución yodada para la búsqueda de los quistes. La solución yodada puede inmovilizar a los trofozoítos, es por esto que se aconseja observar los quistes en la preparación con lugol. Si bien con la solución salina aparte de poder detectar a los trofozoítos móviles también se puede llegar a observar las formas quísticas de los protozoos, pero esto precisa mayor experiencia por parte del observador. 9. La solución de yodo de Lugol - ácido acético hace que las formas de trofozoitos se vuelvan inmóviles. El núcleo del protozoo aparece claramente teñido con el lugol, pero puede ser difícil distinguir entre las formas de trofozoitos y quística. 10. Usando una pipeta Pasteur delgada, deje una gota de solución de azul de metileno para que se escurra bajo el cubreobjetos de la preparación salina (Fig. 4.7). Esto teñirá los núcleos de cualquier célula presente y permitirá distinguir el núcleo lobulado de los polimorfos de los grandes núcleos solitarios de las células de la mucosa. 11. Si se añade una gota de solución de eosina, todo el campo se tiñe con excepción de los protozoos (amebas en particular), que siguen sin color y por lo tanto fácilmente reconocibles.
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D
E
Figura 4.5 Técnica para la aplicación de un cubreobjetos para evitar la formación de burbujas de aire. Figura 4.6 Examine la primera de las dos preparaciones con el objetivo x 10, comenzando en el ángulo superior izquierdo y siguiendo el camino para la búsqueda de huevos y larvas de parásitos, como se indica en la ilustración. Figura 4.7 tinción de la preparación salina con azul de metileno. Ilustraciones anexas D, E, F. D) Con un lápiz de cera o graso o con un marcador permanente marque el número de la muestra en el portaobjetos. E) Examine las preparaciones con el microscopio. Preparación con solución salina (SS). Preparación con lugol. F) escoja un objeto que se halle en la orilla del campo visual y mueva el portaobjetos a través de la platina del microscopio, examinando el campo hasta que el objeto escogido se encuentre en la orilla F contraria. Repita este procedimiento en todo el campo microscópico. 4.2.4 ENVÍO DE HECES PARA LA DETECCIÓN DE PARÁSITOS Las heces pueden ser enviadas a un laboratorio especializado para la identificación de parásitos raros que son difíciles de reconocer. En tales casos, un conservante, debe añadirse a las muestras antes que se envíen para su examen. Se utilizan los siguientes conservantes: -Formaldehido, solución al 10% (reactivo n º 28.), para montaje en fresco; - Yodo de Lugol solución, 0,5% (reactivo no 37.); - Alcohol de polivinilo (PVA) fijador (no reactivo 44.); - Fijador Tiomersal-yodo-formaldehido (TIF) (no reactivo. 58), para montaje en fresco. - Fijador Tiomersal-yodo-formaldehido (TIF) (no reactivo. 58), para montaje en fresco. USO DE SOLUCIÓN DE FORMALDEHIDO AL 10% 1. Preparar una mezcla que contiene alrededor de una parte de la materia fecal a tres partes de solución de formaldehido (Fig. 4.8). 2. Machacar las heces a fondo con una varilla de vidrio (Fig. 4.9). El Formaldehido en solución conserva huevos y quistes de parásitos indefinidamente si el recipiente de la muestra está bien cerrado. No preserva las formas vegetativas de protozoos, que son destruidas después de unos días. USO DE FIJADOR DE ALCOHOL POLIVINÍLICO (PVA) En un frasco 1. Verter aproximadamente 30 ml de PVA fijador en un frasco de 40 ml. 2. Añadir heces frescas en cantidad suficiente como para llenar el último cuarto del frasco. 3. Mezclar bien con una varilla de vidrio. El fijador PVA conserva todas las formas de parásitos indefinidamente. En un portaobjetos 1. Para examinar amebas y flagelados, colocar una pequeña porción de la materia fecal en un extremo del portaobjetos. 2. Agregue tres gotas de fijador PVA a las heces. 3. Utilizando una varilla de vidrio, cuidadosamente extienda la muestra sobre aproximadamente la mitad del portaobjetos (Fig. 4.10). Dejar secar durante 12 horas (preferiblemente a 37 °C).
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Los especímenes conservados de esta forma se puede mantener durante aproximadamente 3 meses. Estos se pueden teñir a su llegada al laboratorio especializado. USO DE FIJADOR TIOMERSAL1-YODO-FORMALDEHÍDO (TIF) 1 También conocido como timerosal y mercuriotiolato (Merthiolate). 1. Justo antes de su envío, mezclar 4,7 ml de fijador TIF y 0,3 ml de solución de yodo de Lugol en un tubo o un frasco pequeño. 2. Añadir aproximadamente 2 ml (2 cm3) de las heces y aplastar bien con una varilla de vidrio. La mezcla anteriormente mencionada preserva todas las formas de parásitos indefinidamente, incluyendo las formas vegetativas de amebas (las de los flagelados se deterioran ligeramente).
Figura 4.8 Preservando una muestra fecal en una solución de formaldehido. Figura 4.9 Trituración de la muestra fecal con una varilla de vidrio. Figura 4.10 Extensión de una muestra fecal en un portaobjeto. Tabla 4.3 Patogenicidad de los protozoos intestinales Especies Patogenicidad Amebas Única ameba que es comúnmente patógena para los seres humanos. Puede causar disentería o abscesos Entamoeba coli No patógena, pero muy común Entamoeba hartmanni, Endolimax nanus, Iodamoeba No patogénicas. La diferenciación es difícil, pero no es butschlii, realmente necesaria; es suficiente como para ser capaz Dientamoeba fragilis de distinguir estas especies de Entamoeba histolytica Flagelados Giardia intestinalis Patógeno Trichomonas hominis No patogénica Chilomastix mesnili No patogénica Ciliados Balantidium coli Patógeno 4.3 PROTOZOOS INTESTINALES Los protozoos son microorganismos que consisten en una sola célula (unicelulares). Los protozoos intestinales se pueden encontrar en las heces en su forma móvil (trofozoítos) o como quistes. Algunos protozoos intestinales son patógenos (ver Tabla 4.3), mientras que otros son inofensivos. Todos estos protozoos se encuentran en todo el mundo. 4.3.1 IDENTIFICACIÓN DE FORMAS MÓVILES (TROFOZOÍTOS) Los trofozoítos de los protozoos son móviles (Fig. 4.11): -Ya sea a causa de movimientos lentos de la célula (amebas); -O porque avanzan rápidamente debido a los flagelos (hilos largos como látigos) o a los cilios (numerosos pelos cortos). Los trofozoítos se encuentran principalmente en: -Heces acuosas -Heces que contienen moco -Heces formadas blandas. Las siguientes características son útiles para la identificación de formas móviles de protozoos intestinales (Fig. 4.12): -Tamaño -Citoplasma Entamoeba histolytica
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-Pseudópodos -Núcleos -Ectoplasma -Endoplasma -Vacuolas -Cuerpos de inclusión que contienen eritrocitos, bacterias, células de levadura, restos (detritus), etc. -Membrana nuclear (cromatina) - Cariosoma nuclear -Flagelos -Membrana ondulante.
Figura 4.11 Formas móviles de protozoos A: ameba, F: flagelado; C: ciliados.
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Identificación de formas móviles de amebas Entamoeba histolytica (Figs. 4.13 y 4.14) (Ameba de la disentería) Tamaño: varía entre 12 y 35 µm (generalmente tiene igual longitud que 3 ó 4 glóbulos rojos) Forma: cuando está en movimiento se alarga y cambia de forma; de lo contrario es redonda Movilidad: se mueve en una sola dirección; emite un seudópodo que la hace avanzar y el endoplasma entra rápidamente en él, y lo llena Citoplasma: el ectoplasma es transparente y se puede distinguir claramente del endoplasma, que tiene una composición granulosa fina (gris, con matices verdes amarillentos), en la que puede haber vacuolas Núcleo: no es visible en la forma móvil, pero al teñir el parásito con solución de yodo se observa claramente que posee una membrana uniforme y un cariosoma central, pequeño y denso (punto negro). En las heces fecales líquidas o diarreicas se pueden encontrar dos formas móviles de E. histolytica: Una forma invasiva y una forma no invasiva. (a) la forma invasiva, que mide 20-35 µm, con vacuolas que contienen eritrocitos más o menos digeridos (de 1 a 20, de diferentes tamaños) que ponen de manifiesto su actividad hematófaga (es decir, que se alimenta con sangre) y, por lo tanto, su capacidad patógena (ver Fig. 4.13); (b) la forma no invasiva, no patógena, que prolifera en la cavidad intestinal, donde se alimenta de bacterias u otras materias locales que se pueden observar en el interior de las vacuolas; mide 1220/µm (ver Fig. 4.14). Entamoeba coli (Fig. 4.15) Tamaño: 20-40 µm (generalmente es mayor que E. histolytica) Forma: oval o alargada, y más bien irregular Movilidad: con frecuencia se encuentra inmóvil o se desplaza con suma lentitud, emitiendo seudópodos romos en todas direcciones, a tientas Citoplasma: es difícil diferenciar el ectoplasma del endoplasma granuloso Cuerpos de inclusión: son numerosos y variados (bacterias, levaduras, residuos de diferentes clases), pero nunca glóbulos rojos Núcleo: visible en preparaciones frescas, sin tinción. La membrana es irregular y granulosa (semeja un collar de cuentecillas); el cariosoma es grande y excéntrico. La Tabla 4.4 resume las características utilizadas para el diagnóstico diferencial de Entamoeba histolytica y E. coli. Si un trofozoíto se mueve rápidamente en una dirección y proyecta pseudópodos rápidamente, es probable que sea Entamoeba histolytica. Otras especies de amebas no suelen moverse de esta manera. Si el trofozoíto se mueve como se ha descrito y si los eritrocitos están presentes en el citoplasma, se puede suponer que se trata de E. histolytica. Si es necesario, se puede utilizar azul de metileno tamponado para teñir el núcleo para su confirmación.
Figura 4.13 y figura 4.14 En las heces fecales líquidas o diarreicas se pueden encontrar dos formas móviles de E. histolytica: Una forma invasiva y una forma no invasiva.
Figura 4.15 Trofozoíto de Entamoeba coli. Las flechas indican las direcciones de los seudópodos.
Tabla 4.4 Características para el diagnóstico diferencial de Entamoeba histolytica y E. coli E. histolytica (Ameba de la Entamoeba coli (Ameba del Característica disentería) colon) Desplazamiento En dirección definida Al azar Movilidad Medianamente móvil Poco móvil o inmóvil Ectoplasma Transparente, muy Diferenciación escasa o nula
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diferente del endoplasma Cuerpos de inclusión
Eritrocitos si es hematófaga
Núcleo (preparaciones frescas)
Invisible
Núcleo (después de teñirlo con la solución de Yodo)
Membrana uniforme Cariosoma central, denso y pequeño
con el endoplasma Bacterias, levaduras y diversos residuos, pero no eritrocitos Visible (membrana nuclear que semeja un collar de cuentecillas) Membrana irregular Cariosoma voluminoso y excéntrico
Otras amebas Entamoeba hartmanni (Fig. 4.16) Tamaño: pequeña; siempre menos de 10 pm (aproximadamente el mismo tamaño de un glóbulo rojo) Todas sus características son semejantes a las de E. histolytica, pero nunca contiene glóbulos rojos. Puede haber vacuolas claramente visibles. Endolimax nana (Fig. 4.17) Tamaño: pequeña; 6-10 µm Movilidad: numerosos seudópodos pequeños y romos que se mueven lentamente en todas direcciones Citoplasma: sumamente granuloso, con vacuolas pequeñas Cuerpos de inclusión: diversos (principalmente bacterias) Núcleo: (Con solución de yodo) cariosoma que semeja una mancha de tinta. lodamoeba butschlii (Fig. 4.18) Tamaño: mediana; 10-15 µm Forma: compacta, semejante a una hoja vegetal Movilidad: sumamente lenta; seudópodos claros, romos o semejantes a dedos Cuerpos de inclusión: bacterias, vacuolas grandes Núcleo: (con solución de yodo) cariosoma oval y voluminoso junto a un grupo de gránulos. I. butschlii raras veces se encuentra en las heces fecales. Dientamoeba fragilis (Fig. 4.19) Tamaño: pequeña, redonda, de 6-15 µm Movilidad: Inmóvil (casi siempre) o sumamente móvil (en heces fecales líquidas muy frescas), con seudópodos que semejan las hojas de un ventilador eléctrico; se inmoviliza rápidamente bajo el cubreobjetos. Citoplasma: Ectoplasma claro Cuerpos de inclusión: bacterias Núcleo: (con solución de yodo) 1 ó 2 núcleos; cariosomas divididos en 46 gránulos (membrana difícilmente visible). Identificación de formas móviles de flagelados Todos estos parásitos, exceptuando Trichomonas hominis, se pueden encontrar en su forma vegetativa, flagelada y activa, o como quistes Inactivos. Los quistes se describen más adelante. Giardia lamblia intestinalis (el flagelado de mayor longitud) (Fig. 4.20) Tamaño: 10-18 µm (el tamaño de 2 glóbulos rojos) Forma: más bien alargada: Vista frontal: piriforme Vista lateral: forma de cuchara Movilidad: se puede desplazar hacia adelante con pequeños tirones rápidos, en dirección definida, o bien dando giros (cuando se encuentra en heces líquidas) en tanto que otras veces se halla casi inmóvil. Contenido: 2 grandes núcleos ovalados, tenuemente visibles. Importante: — el movimiento característico de este flagelado solo se observa en heces fecales líquidas y frescas — en las heces líquidas los depósitos de moco frecuentemente contienen grupos numerosos de G. lamblia intestinalis — en las heces fecales blandas es frecuente encontrar juntas las formas vegetativa y quística del parásito. Trichomonas hominis (Fig. 4.21) Tamaño: 10-15 µm (ligeramente menos que G. lamblia intestinalis) Forma: oval, con 2 polos adelgazados Movilidad: gira y se vuelve en todos sentidos, pareciendo vibrar Membrana solo se encuentra en un lado; es sumamente ondulante: móvil (efectúa rápidos movimientos ondulatorios) Núcleo: un núcleo, difícil de identificar Flagelos: generalmente 4. Trichomonas es el flagelado más resistente. Conserva su movilidad aún en las heces fecales "viejas". Chilomastix mesnili (Fig. 4.22) Tamaño: 10-15 µm Forma: triangular y adelgazada en un extremo, pareciendo que tuviera una torsión
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Movilidad: se desplaza en una dirección definida, en espiral Citoplasma: verde grisáceo con: — una línea clara, en espiral, alrededor de la cual gira este flagelado (forma de "8"), cerca del extremo adelgazado — una hendidura semejante a una boca (el citostoma, que es débilmente visible), cerca del extremo redondeado Núcleo: un núcleo, que se observa con facilidad en las preparaciones no teñidas.
Figura 4.20 Trofozoíto de Giardia (lamblia) intestinalis. Se observan claramente los flagelos, así como el movimiento que hace la Giardia.
Figura 4.21 Trofozoíto de Trichomonas hominis. Se observan claramente los flagelos, así como el movimiento. Figura 4.22 Trofozoíto de Chilomastix mesnili. Se observan claramente los flagelos, así como el movimiento. Identificación de formas móviles de ciliados Balantidium coli (raro) (Fig. 4.23) Tamaño: sumamente voluminoso: 50 µm (con frecuencia es tan voluminoso o mayor que un huevo de Áscaris) Forma: oval, con un polo más redondeado que el otro; transparente Cilios: cubierto por numerosos cilios pequeños, que se mueven agitadamente Movilidad: se desplaza con suma rapidez en las heces fecales, atravesando el campo microscópico en dirección definida y, otras veces, se mueve en círculos Núcleo: un gran núcleo reniforme junto a otro núcleo pequeño y redondo "Boca": un citostoma, especie de boca que se contrae y relaja dando entrada a diversos materiales como restos celulares. Importante: Si las heces fecales se dejan expuestas al aire en un recipiente sin tapa pueden caer en ellas microorganismos de la atmósfera, como los infusorios. Estos son muy semejantes a Balantidium coli.
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Figura 4.23 Trofozoíto de Balantidium coli. Se observa en el círculo, la ilustración de su movilidad característica. También se logra percibir los cilios que rodean todo el cuerpo del protozoo.
Tinción rápida de campo para trofozoítos fecales Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Soporte para portaobjetos ● Tinción de campo (no reactivo 25): -Tinte de campo A (sin diluir) -Tinte de campo B (diluido una parte de tinte en cuatro partes de agua destilada) ● Solución de cloruro de sodio, 0,85% (no reactivo 53) ● Metanol. Método 1. Preparar un frotis fecal fino en solución de cloruro de sodio sobre un portaobjetos limpio. 2. Una vez que el frotis está seco, fijar cubriendo el portaobjeto con metanol durante 3 minutos. 3. Incline el metanol. No se olvide de tapar el frasco con metanol puesto que es un reactivo tóxico. 4. Pipetear 1 ml del tinte de campo diluido B sobre el portaobjetos, seguido de 1 ml del A. 5. Mezclar bien mediante la inclinación del portaobjetos y deje actuar el tinte durante 1 minuto. 6. Lave el portaobjetos en agua y deje que se seque al aire. 7. Examinar el portaobjetos usando el objetivo x 100 con aceite de inmersión. Busque en el frotis teñido, en particular alrededor de los bordes. El citoplasma y los flagelos de los trofozoítos de Giardia intestinalis se tiñen de azul y sus núcleos se tiñen de rojo. Los quistes de G. intestinalis también se tiñen de azul y sus núcleos se tiñen de rojo. Nota: ● Deje las tinciones recién preparadas durante 3 días antes de su uso. ● Utilizar el agua de lluvia para preparar las tinciones si el suministro de agua de pozo local es demasiado salada. ● cubrir los frascos que contienen las soluciones de tinción para evitar la evaporación y la absorción de polvo. ● Evite llevar una solución de tinción a otra. Eosina para trofozoítos y quistes fecales Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● soporte para portaobjetos ● Cubreobjetos ● Eosina, 1% de solución (no reactivo. 23). Método 1. Emulsionar una pequeña porción de las heces en solución de eosina al 1% en un portaobjetos limpio. Esparcir en un área de aproximadamente 2 cm x 1 cm. 2. Coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos y colocarlo en la platina del microscopio. 3. Use el objetivo x10 para examinar el frotis sistemáticamente para encontrar trofozoítos y quistes no teñidos. Examinar con más detalle con el objetivo x40. La eosina proporciona un fondo de color rosa contra el que los trofozoítos y quistes no teñidos son claramente visibles. Nota: Si la solución de eosina al 1% no está disponible, utilizar una gota del tinte de campo B (ver más arriba). 4.3.2 IDENTIFICACIÓN DE LOS QUISTES Los quistes son las formas resistentes de ciertas amebas intestinales, los flagelados y ciliados. Son pequeños, redondos y no móviles y pueden tener uno o varios núcleos. El estudio de los quistes es útil para la correcta identificación de las especies. Importancia de los quistes (a) Importancia clínica
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La importancia clínica de los quistes varía de un país a otro. Lo esencial es encontrar y reconocer quistes de Entamoeba histolytica, Giardia lamblia y Balantidium coli, aunque su presencia en las heces fecales posee menor significado inmediato que la de las formas vegetativas. Individuos saludables pueden ser portadores de quistes. (b) Importancia para la salud pública Los quistes son la forma infectante de los parásitos que aquí se tratan. Por lo tanto, los portadores de quistes significan un riesgo para la salud pública. La detección de los quistes también puede ser de provecho para la epidemiología. Algunas de las características utilizadas en la identificación de estos quistes y los de otros protozoos intestinales se ilustran en la figura 4.24.
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Tipos de heces fecales con quistes Por lo general, los quistes se encuentran en heces blandas y duras por igual. Examen en portaobjetos 1. Preparación en solución de cloruro sódico Los quistes se pueden observar como glóbulos transparentes que refractan la luz y se distinguen claramente contra el fondo de color gris. Poseen envolturas bien definidas. 2. Preparación en solución de yodo (solución yodada diluida 5 veces) Al teñirse los núcleos, examínense con el objetivo x 40. 3. Recuento de los núcleos Gírese el tornillo de ajuste lento del microscopio. 4. Identificación Nunca es suficiente reconocer un solo quiste; la identificación depende de que se observen varios quistes sucesivamente. 5. Concentración Si es necesario, úsese el método de concentración de formaldehido y éter (véase la página 165) para observar un número mayor de quistes y lograr una identificación más firme. En la misma muestra de heces fecales se pueden encontrar quistes de especies diferentes. Identificación de quistes de amebas Entamoeba histolytica (Fig. 4.25) Esta ameba causa disentería Tamaño: 12-15pm (1- 2 glóbulos rojos) Forma: redonda Núcleos: 1- 4 núcleos: — membrana delgada, uniforme, circular — cariosoma pequeño, compacto, central (semejante a una mancha negra) Citoplasma:(con solución de yodo) gris amarillento y granuloso; parece "sucio" Cuerpos cromatoides: oblongos, redondeados en los extremos (forma de salchicha); no se encuentran en todos los quistes Vacuola: a veces hay una vacuola de glucógeno voluminosa.(teñida de pardo rojizo por la solución yodada) en los quistes jóvenes con 1 ó -2 núcleos. Quistes de otras amebas que no causan enfermedades Su identificación es difícil. Ante todo se debe distinguir entre estos quistes y los de E. histolytica. Entamoeba coli (Fig. 4.26) Tamaño: 12-20 µm (2-2% glóbulos rojos; un poco mayor que el quiste de E. histolytica) Forma: redonda o ligeramente oval; algunas veces es irregular Núcleos: 1-8 núcleos: — membrana irregular, engrosada en algunas partes; no forma un círculo perfecto — cariosoma voluminoso, difuso, frecuentemente excéntrico Citoplasma:(con solución de yodo) amarillo pálido, brillante (en comparación con el de E. histolytica) Cuerpos cromatoides: extremos agudos o mellados (en forma de cuchillo o aguja); no se encuentran en todos los quistes Vacuola: algunas veces existe una vacuola sumamente voluminosa (teñida de rojo pardo por la solución de yodo) que comprime dos núcleos, uno en cada polo. Entamoeba hartmanni (Fig. 4.27) Tamaño: quiste pequeño, de 4 -8 µm (% diámetro de un glóbulo rojo) Núcleos: 1- 4, idénticos a los de E. histolytica. Endolimax nana (Fig. 4.28) Tamaño: muy pequeña; 8-10 µm Forma: más o menos oval Núcleos: 1- 4 — membrana: no es visible — cariosoma: voluminoso, de contorno irregular Citoplasma: claro, sin gránulos; la solución de yodo lo tiñe de amarillo intenso. lodamoeba butschlii (Fig. 4.29) Tamaño: quiste pequeño, de 8-10 µm Forma: variable (redonda, oval o irregular) Núcleo: casi siempre un solo núcleo: — membrana: no es visible — cariosoma: sumamente voluminoso, oval, comprimido contra un hacinamiento de gránulos Vacuola: una vacuola de glucógeno sumamente voluminosa (teñida de rojo pardo por la solución yodada, de donde proviene el nombre de lodamoeba), que con frecuencia ocupa la mitad del quiste. Dientamoeba fragilis No se observa en forma quística.
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Figura 4.25 Quistes de Entamoeba hitolytica. Figura 4.26 Quistes de Entamoeba coli.
Figura 4.27 Quistes de Entamoeba hartmanni. Figura 4.28 Quistes de Endolimax nanus (o Endolimax nana). Figura 4.29 Quistes de Iodamoeba butschlii. Identificación de quistes de flagelados Giardia lamblia intestinalis (Fig. 4.30) Tamaño: 8-12 µm Forma: oval, con un polo más redondeado que otro; con frecuencia se observa una gruesa envoltura de pared doble; en realidad, la pared es la membrana citoplásmica Núcleos: 2-4 núcleos ovales: — membrana: sumamente delgada — cariosoma: pequeño, central, de color tenue Citoplasma: claro, refracta la luz cuando no se ha teñido; verde amarillento o azulado al aplicar la solución de yodo Fibrilla: refracta la luz; semeja un cabello; es plegada o toma forma de S; recorre el quiste a lo largo, por el centro (ajústese el microscopio). Chilomastix mesnili (Fig. 4.31) Tamaño: quiste pequeño, de 6-8 µm Forma: redonda, con un polo adelgazado (piriforme) Núcleo: un solo núcleo voluminoso: — membrana: se observa con claridad; engrosada en algunas partes — cariosoma: pequeño y central Fibrilla: semeja un bucle. Identificación de quistes de ciliados Balantidium coli (Fig. 4.32) Tamaño: quiste sumamente voluminoso, de 50-70 µm (del mismo tamaño que un huevo de Áscaris) Forma: redonda Envoltura: delgada, con pared doble Núcleos: 1 núcleo voluminoso, reniforme; 1 núcleo pequeño que semeja una mancha gruesa, junto al anterior Citoplasma: granulosos, verdoso, lleno de cuerpos de inclusión. Con frecuencia se puede observar en el interior, con líneas tenues, el trofozoíto ciliado, organizado y ligeramente móvil de Balantidium (véase antes). Conclusión Es en extremo importante que se logre identificar; - los quistes de Entamoeba histolytica - los quistes de Giardia (lamblia) intestinalis
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- y los quistes de Balantidium coli.
Figura 4.30 Quistes de Giardia (lamblia) intestinalis. Figura 4.31 Quistes de Chilomastix mesnilii. Figura 4.32 Quistes de Balantidium coli. Coccidios (Fig. 4.33) Los coccidios son protozoarios que pueden parasitar al ser humano (sin causar efectos patógenos importantes) o encontrarse de paso en las heces fecales consecutivamente a la ingestión de alimentos contaminados (peces, conejos, etc.). Aparecen en las heces con formas semejantes a quistes (se denominan ooquistes o esporoquistes). Tamaño: 15-20 µm, dependiendo de la especie Forma: óvalo alargado que a veces se adelgaza en uno de los polos Color: incoloros y transparentes o, a veces, amarillentos Envoltura: una línea doble, que refracta ligeramente la luz y se puede distinguir claramente; algunas veces se observa cierto tipo de opérculo en uno de los polos Contenido: es de tres tipos (véase Fig. 4.33): (a) 4 esporozoitos (bastoncillos de extremos redondeados) que contienen pequeños núcleos esféricos; a veces se encuentran algunos gránulos voluminosos en uno de los polos; (b) una célula voluminosa, redonda y granulosa; (c) gránulos que refractan la luz y llenan completamente el interior del protozoario.
Figura 4.33 Tipos de coccidios a: que contiene cuatro esporozoitos y ocasionalmente un número reducido de grandes gránulos agrupados en uno de los polos; b: que contiene una gran ronda de células granulares; c: que contiene gránulos de refracción llenando completamente el interior El examen microscópico de los quistes Preparación en fresco en solución salina Los quistes pueden ser vistos como glóbulos brillantes transparentes que destacan claramente contra un fondo gris. Tienen bien definidas las cápsulas. Usando el objetivo x40, buscar objetos redondos brillantes con un diámetro aproximadamente igual a 1-3 eritrocitos. Cuerpos cromatoides Busque también los cuerpos cromatoides (estructuras en forma de bastón). Los cuerpos cromatoides son más evidentes en las preparaciones salinas que en las preparaciones de yodo. Estos cuerpos son característicos en apariencia y aparecen en los quistes de Entamoeba histolytica y E. coli. Los cuerpos cromatoides en forma de bastón de E. histolytica tienen extremos redondeados romos, los de E. coli tienen extremos puntiagudos. Estos cuerpos cromatoides se ven con menor frecuencia en los quistes de E. coli que en los de E. histolytica. Núcleos Los núcleos no son fácilmente visibles en las preparaciones salinas pero se ven claramente en las preparaciones de yodo.
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La apariencia del núcleo es importante para diferenciar entre especies de amebas. Por lo tanto, si los quistes (o cuerpos semejantes a los quistes) se ven en el preparado salino, también examinar una preparación con yodo. Medición La medición y evaluación exacta de los quistes es esencial para su correcta identificación. Mida cualquier quiste que encuentre, si es posible utilizar una retícula calibrada en el ocular (ver sección 3.1.1). Preparación en fresco con solución yodada Las preparaciones de yodo se utilizan para detectar quistes de amebas y flagelados. Los quistes pueden ser detectados con el objetivo x10. Use el objetivo x40 para ver las características de los quistes y medir su alcance para lograr una correcta identificación. El yodo tiñe el citoplasma de los quistes de color amarillo o marrón claro; los núcleos se tiñen de marrón oscuro. Cuando los quistes de Entamoeba spp. se tiñen con yodo, puede ser vista o verificada la disposición de la cromatina periférica y la posición del cariosoma. (Si la cromatina periférica está ausente, el quiste no es una especie de Entamoeba.) Estos cuerpos cromatoides periféricos se tiñen de color amarillo claro y pueden no ser muy claros. A veces, los quistes jóvenes contienen glucógeno, lo que hace que se tiñan de color marrón oscuro con yodo. La tinción con yodo de los quistes de los flagelados permite a las fibrillas (filamentos) que sean visibles. Los quistes de varias especies diferentes se pueden encontrar en la misma muestra de heces. Concentración Si es necesario, utilice la técnica de sedimentación con formol-éter (ver sección 4.5.2) para examinar un mayor número de quistes y tener una identificación más certera. Eosina para trofozoítos y quistes fecales Consulte la sección 4.3.1. Ziehl-Neelsen Modificado para la tinción de ooquistes de Cryptosporidium spp. Las infecciones por Cryptosporidium spp., causan fiebre, calambres abdominales, diarrea y pérdida de peso, con una eosinofilia asociada. En casos severos, se puede desarrollar un síndrome de malabsorción. La criptosporidiosis causa una diarrea autolimitada en niños. Es una causa reconocida de diarrea crónica en adultos con baja inmunidad, por ejemplo, pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La criptosporidiosis se debe sospechar en pacientes con diarrea crónica y pérdida de peso, en los cuales no se puede encontrar ninguna otra causa. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Soporte para portaobjetos ● Placa de Petri ● Algodón ● Solución de cloruro de sodio al 0,85% (no reactivo. 53) ● Solución de formaldehído al 37% (formalina) ● Carbolfucsina de Ziehl-Neelsen (reactivo no. 16) ● Ácido-etanol para Ziehl-Neelsen (reactivo no. 5) ● Verde de malaquita, solución al 1% (véase el reactivo no. 31) ● Metanol. Método 1. Emulsionar una pequeña cantidad de heces en solución salina en un portaobjetos limpio. Esparcir en un área de aproximadamente 2 cm x 1 cm. 2. Permitir que el frotis se seque antes de la fijación en metanol absoluto durante 5 minutos. Si el paciente se sabe que es, o se sospecha de ser, positivo para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), fijar el frotis en vapor de formalina durante 15 minutos, colocando el portaobjetos en una placa de Petri con una bola de algodón empapado en formalina. 3. Inundar el portaobjetos con carbolfucsina durante 5 minutos. Lave la tinción con agua. 4. Inundar el portaobjetos con una solución de ácido-etanol para decolorar hasta rosa pálido. Lave el portaobjetos en agua. 5. Contrateñir el portaobjetos con solución de verde de malaquita durante 2 minutos. Lavar con agua y colocar en un estante deslizante para drenar y secar. Examinar el portaobjetos bajo el microscopio usando el objetivo x40. Los ooquistes de Cryptosporidium spp. teñidos por este método puede mostrar una variedad de reacciones de tinción yendo desde el color rosa pálido al rojo oscuro. La medida de los ooquistes está entre 4-6 µm. Los esporozoitos en los ooquistes tienen un borde exterior de material muy teñido con un centro pálido (Fig. 4.34). Esto diferencia ooquistes procedentes de algunas levaduras que podrían teñirse de rojo, pero tienen una apariencia uniforme y homogénea. Nota: Cryptosporidium spp. pertenecen a un grupo de parásitos llamado coccidia. Otros parásitos de este grupo son: -Isospora belli -Toxoplasma gondii -Plasmodium spp. Los ooquistes de Cryptosporidium spp. son altamente resistentes a los agentes desinfectantes.
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Figura 4.34 Ooquistes de Cryptosporidium spp.
AGREGADO TÉCNICA ALTERNATIVA PARA TINCIÓN DE COCCIDIOS COLORACIÓN DE KINYOUN Técnica utilizada para: identificación de ooquistes de coccidios: Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora en muestras fecales (fijadas o frescas), aspirado duodenal, raspados de mucosa intestinal, esputo o lavado broncoalveolar. Representa una modificación de la técnica de Ziehl – Neelsen realizada en frío muy práctica y útil. Materiales: Metanol Carbol-fucsina Ácido sulfúrico al 10% o 1 % (en agua destilada) Azul de metileno Portaobjetos Aceite de inmersión Preparación de soluciones: Procedimiento: 1. Realizar una impronta con una gota de sedimento 2. Dejar secar a temperatura ambiente durante 24 horas 3. Fijar con metanol y dejar secar al aire 4. Cubrir la impronta con carbol-fucsina durante 5 minutos, (sin calentar) a temperatura ambiente 5. Lavar suavemente con agua destilada 6. Decolorar con ácido sulfúrico al 10% durante 1 a 2 segundos. También se puede decolorar con ácido sulfúrico al 1% durante 1 a 2 minutos 7. Contracolorear con azul de metileno durante 1 minuto 8. Lavar y dejar secar 9. Observar con inmersión Comentarios: 1. La coloración de Ziehl-Neelsen es un procedimiento ácido-alcohol resistente (las células coloreadas con el colorante fucsina resisten la decoloración con la solución acida. 2. Desventajas: Los ooquistes de Cyclospora presentan gran variabilidad tintorial lo cual puede arrojar resultados falso-negativos. Los ooquistes de Cryptosporidium también pueden presentar afinidad tintorial variable; en un mismo campo se pueden observar ooquistes bien coloreados y otros que se impregnan levemente con el colorante. 3. Interpretación: Los ooquistes de Cryptosporidium aparecen como estructuras esféricas u ovoides se ven de color rojo vinoso (fucsia) y su tamaño es de 4 a 6 micrones (más chicos que un glóbulo rojo). Alguno de los 4 esporozoítos puede ser observado en el ooquiste de Cryptosporidium. Algunos de los ooquistes inmaduros de lsospora (ooquistes enteros) se tiñen, mientras que otros que están maduros aparecen generalmente con dos esporoquistes con la pared del ooquiste coloreada de rosado a rojo intenso y un área clara entre los esporozoítos teñidos y la pared del ooquiste. El fondo se tiñe de azulado. Fuente: Henriksen SA, Pohlenz JFL. 1981. Staining of Cryptosporidia by a modified Ziehl- Neelsen technique. Acta Vet. Scand. 22:594-596. Modificación: Current WL. 1990. Techniques and laboratory maintenance of Cryptosporidium. In: Dubey JP, Speer CA, Fayer R (eds.), Cryptosporidiosis of Man and Animals. CRC Press Boca Raton, Fla, pp 31-49. Objetos que no deben ser confundidos con quistes Objetos: otras cosas, vivas o artificiales, que se encuentran en las heces que no son parásitos y pueden confundir al laboratorista. Blastocystis hominis (levadura) (Fig. 4.36) Tamaño: varía entre 5 y 20 µm (promedio 10 µm). Forma: redonda u oval; algunas veces poseen bordes angulosos e irregulares Contenido: una vacuola voluminosa que ocupa casi toda la célula; el citoplasma, comprimido, forma un anillo granuloso alrededor de ella Color: refractan intensamente la luz cuando no se encuentran teñidos; la solución de yodo no tiñe la vacuola, pero la periferia adquiere un color amarillo pálido Algunos médicos solicitan que se comunique la presencia de los Blastocystis hominis, particularmente en heces fecales de niños. Hongos (Fig. 4.35) Levaduras Tamaño: pequeñas (5-8 µm)
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Forma: oval, frecuentemente con brotes Contenido: con frecuencia un grupo de 3-6 gránulos en posición excéntrica Color: (con solución de yodo) rojo pardo. Algunas otras formas de hongos son rectangulares, con un citoplasma oval sumamente claro; se denominan artrosporas. Aparte de las levaduras se contemplan otros elementos fúngicos. Leucocitos (Fig. 4.37) Tamaño: 10-20 µm Forma: redonda o ligeramente alargada, de contorno irregular Contenido: citoplasma que refracta la luz, claro y granuloso, con vacuolas pequeñas Núcleo: escasamente notable; algunas veces contiene un "falso cariosoma" con forma de estrella. Pus (Fig. 4.38) El pus se puede observar a simple vista y tiene el aspecto de vetas opacas, de color grisáceo (no transparente, como el moco). Con el microscopio se observa como una masa de leucocitos más o menos degenerados (comuníquese su presencia ya que representa un signo de infección).
Figura 4.35 Hongos y levaduras. Figura 4.36 Blastocystis hominis. Figura 4.37 Leucocitos. Figura 4.38 Pus.
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Figura 3.
Clava para i d e n t i f i c a r h ue v es d e h e l mi n to s
Fig. 4.40
Longit Jd del huevo < 1 0 0 p m — Espicula laleral muy pequeña(a m enudo ir.vrsiole). Eri ias heces. (68-100 pm • 45-80 firn)
Sin capsula ¿Dos lapones polares9
s tapones polares
Con capsula (30-50 jim 27-50 |im )
• D ifiylidm m cjn iñ u in O 1_ h.crinicapsilci sp
Espolon laleral prom inente.------cubierta transparente (114-180 |
Con espicula
• Nu op u íco la ü o s---------- ¿.Con o sin espíenla?-
¿Con o sin o p e ic u lo s ? -
Opisthorchis felineus (extremo posterior cori boíort terminal puntiagudo)
Alargado, sin resalle _ (25-35 |tm 8-12 |im) — L o fu jiliid del huevo
35 jím — —Resalte menos p ro n u n c ia d o ----opérculo ancho (28 30 jim • 15 17 jun)
Espoión terminal ¿Sin espicula cubierta lina o gruesa?
-O voide, amarillo d u ra d o ------------ DiphyUcbothrunn taluni Cubierta gruesa. tan embrión (58 76 jirri 4Ü 51 jim)
- C u b ie rta
i— Strongyloidos stercoratis ■Sin blastomeros, la rv a s ----O parcialmente desarrolladas !— Sirongyloidos tullo borní (50-76 |im • 35-47 jim)
! m a _ ---------
y* usa. ¿con o sin blastomeros? jierta gruesa. ¿rugosa o lisa?
r Ovoidai con 2 - 8 ---------olastómeros (64-80 jun • 36-40 jun)
- Con blastom eros.— ¿ovoiaal o en elipse alargada?
•Si-
w t s ie r m a n i
- N o-
(68-118 jun • 40 51 jnn) _ .Echmostoma sp. {83-120 jim -.58 90 jirn) - Fasciola nepanca (130-145 jirrT x 70 50 jirn)
'C ubierta gruesa y lisa, ¿huevo simétrico o asimétrico?
. t aSClOlOpSIS CilSr.1 (125-140 |im 70 SO jim) -T apones muy prom iutM tios---------(4'J 65 jun - 20 30 jun)
-F o im a de limón, sin tajiones prom ín enles--------------------(36-45 jim • 21 jun) - Torma de limón, con ligero uslruch.iii.iunlu en el Ce ilio (36 45 |in i
r o U O jiu .)
—
¡ rtc h u r is tn c h m ra
- Asear¡s ¡untüiiCúíJvS
- Cubierta gruec?. y ru g o s a .----------------------------huavo con c a lila sin segmentar con gránelos gruesos (45-70 jim • 35-45 jim)
Huevo marron (38-45 jun - jim
• A sim é trico ----------(un lado convexo, el otro achatado)
-L ongitu d dui huuvu . • 120 j n n ________ ovoiual.. cubierta lina, (M ido amarillento
Nücator arnuncanus Ancy/ostorna duodenale Jormdens o^unnutus
{
Cubieria con una membrana.- Inchostrongytus sp. elipse alargada simétrica (75-115 jim • 40-50 jun)
- M a n o n dorado, sin embrión ¿cuOior ta (jiuuSu, uvoidal. con opérculo í c h a t a d o ! * ------------------------ C : ---------------------- P a ra g o n i m u s
Extremo anterior re d o n d e a d o .-Schistoso.na haemotobium por lo general en la orina o (rararnen’ e en las heces) en biopsia de vejiga (112-170 jjm • 40-70 ym) Extremo anterior puntiagudo, — Scgistosoma intéfcalalum espolón largo alilado con (espolon mas largo que en S. haem ) punta doblada Sólo en heces (140-240 |im • 50-85 jim )
Heierophyes hetcropriyes {botón pequeño en el extremo posterior)
— Sin re h a lle --------------- —_______ Mclagorumus yúko
— Longitud del huevo 3 íj 118 jnn
- Schistosoma niansont
Longitud del huevo 110 pm —
. Prolongación anular ue l a _______Cionorc.his sinensis ènvoltura ( - resalle pronunciado) (extremo posterior encho y (25-35 |im 1 1 -l2 |n n ) redondeado)
Opci colados ¿ longitud máxima del huevo9
O - Schistosoma mekongi (raras veces)
Huevos do Schistosoma -
Sin tapones
. Schistosoma ¡apomcum
L Huevo in c o lo ro .----------cubierta de 4 capas. tjO C0 jirn • 20-32 jim)
S im étrico
Hueve redondo c casi redondo, envoltura cor. dos membranas, ¿con o sm em bnoforo? — -------
■. D /c r o c o tiiu m ¿ a n co a tu m • 22-30 j»m) (contiene rriiracidio)
•
E n te r o b iu s vo rrm c u J a n s
(contiene larva) T ó e n la so h u m ,
Con em bnoforo-------------amarillo claro o ’m jrron. envoltura con oos membranas (diámetro: -44-77 jin«)
O Tao nia s a g i.ia ta
—
(se distingue examinar.' Jo |¿5 progions)
- Capillana hopanca r- Con Mamemos polares?-
C a p illa ri j p h i l h p p m ü n s i s
Sin e m b rio fo ro ._____ ¿con o sin filamentos polares?
—
-
H y m o n o lo p s is n a n a
(40-60 y m • 30 ¿0 jim )
L Sin filamentos polare? — (70-86 jim - 60-80 jrm)
• H ym onoieput diminuta
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Fig. 4
Identificación de parásitos intestinales: helmintos
Fig. 4.41
T A M A Ñ O S R E L A T IV O S DE L O S H U E V O S DE H E L M IN T O S *
M otagoninxjs Halarvphyes C pisthorchls Clononzhis yokogaw ai hoterophyes tohnous sin 6 nsi s
Taenia
Hym snolepis nana
Enterobius verm icdans
Trichuris irichiura
Ascaris kjm bricoidas 'ecunoc
Anquik>s:«nA
D'pnyl.'obothnum latum
Hym onotopsis dimiiKita
15 0
l 50
120
120
Paraçonimus westermani
Tricfioslrongytus Ascaris kjmùricotdes infecundo
Schistosoma Japorucum
Se han om ilido Schistosom a m ekongi y Sctirslosom n intcrcalalum
Schistosom a
Schistosoma
haematobium
manspju
Fosada ' fi&patica
ía s d o lo p s is , bushi
WhO 91544
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4.4 HELMINTOS INTESTINALES Las infecciones por helmintos causan una variedad de síntomas clínicos incluyendo calambres abdominales, fiebre, pérdida de peso, vómitos, apendicitis, pérdida de sangre, anemia y eosinofilia. Hay tres grupos de helmintos de importancia médica: -Nematodos (gusanos redondos) -Cestodos (tenias) -Trematodos (duelas). Las infecciones por helmintos suelen diagnosticarse mediante la detección de huevos y larvas. Con menor frecuencia, las infecciones son diagnosticadas mediante la detección de gusanos adultos (por ejemplo, Ascaris lumbricoides y Enterobius vermicularis) o proglótides (segmentos) de los gusanos adultos (por ejemplo, Taenia saginata y T. solium). Sin embargo, para la mayoría de las infecciones por helmintos, los huevos se utilizan para la identificación. 4.4.1 IDENTIFICACIÓN DE LOS HUEVOS Características de los huevos Los huevos que depositan los helmintos parásitos y se encuentran en las heces fecales se identifican por su: — tamaño — forma — envoltura — contenido y en algunas ocasiones por su: — color — y caracteres externos. Tamaño La longitud y anchura se miden y generalmente están dentro de un rango específico. Forma Cada especie tiene su forma particular. Etapas de desarrollos por el que transcurren los huevos Los huevos de algunas especies consisten de una sola célula, algunos huevos tienen varias células, y algunos huevos son embrionados, esto es, contienen una larva. En ocasiones, si las muestras fecales son de 1 a 2 días, los huevos pueden desarrollarse a etapas más avanzadas en ese tiempo. En el caso de Ascaris lumbricoides, los huevos por lo general tienen una sola célula cuando están en las heces, sin embargo, la única célula puede dividirse y en la muestra de más de 12 horas de obtenida, los huevos con dos o cuatro células pueden ser vistos. Los huevos Ancylostoma duodenale o Necator americanus (Uncinarias) presentes en muestras que tienen varias horas de obtenidas pueden contener 16, 32 o más células. Después de 12-24 horas, los huevos pueden estar embrionados, y aún más tarde las larvas pueden eclosionar. Al observar el grado de desarrollo de los huevos de helmintos, asegúrese que la muestra de materia fecal está recién obtenida. Si se trata de varias horas o un día de obtenida, se espera ver cambios en el grado de desarrollo de algunas especies. Lo ideal sería que sólo las muestras frescas deban ser aceptadas para el diagnóstico. Grosor de la cubierta del huevo Los huevos de algunas especies, como el Ascaris lumbricoides tienen una cubierta gruesa, mientras que otros, tales como Ancylostoma duodenale o Necator americanus tienen cubiertas finas. Color Los huevos de algunas especies, como Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Enterobius vermicularis son incoloros, mientras que otros como el Ascaris lumbricoides y Trichuris trichiura son de color amarillo o marrón. Otras características La presencia de características como opérculos (tapas), espinas, tapones, ganchitos o capas externas mamelonadas también pueden servir de ayuda para la identificación. Si se encuentra un huevo o un objeto que se parece a un huevo, las características mencionadas anteriormente deben ser observadas cuidadosamente con el fin de hacer una identificación específica. Medición de los huevos ● 1 micrómetro (1μm) = 0,001 mm. El tamaño en μm de este manual es del lado largo del huevo. El tamaño puede ser estimado por comparación con el de un eritrocito, que mide 7,5-8 μm. ● El tamaño puede ser evaluado en relación con el campo del microscopio: -Si se utiliza un objetivo x10, el huevo ocupa alrededor de una décima parte del campo -Si se utiliza un objetivo x40, el huevo ocupa aproximadamente un tercio del campo. ● El huevo se puede medir mediante la inserción de un portaobjetos de escala del micrómetro en el ocular del microscopio. Una división de la escala con el objetivo x10 y el ocular x10 = 1μm. ● Otro método de medición es comparar el huevo con uno de otras especies comunes en la localidad, cuyo tamaño bajo el microscopio se conoce (por ejemplo Ascaris lumbricoides). Como reconocer huevos El método recomendado es: ● Establecer la identidad probable del huevo desde su aspecto general. ● Hacer un estudio sistemático de todas las características del huevo para confirmar su identidad. Con el fin de ganar experiencia (si es posible, bajo la guía de un instructor): -Estudiar los diferentes huevos que se encuentran en su localidad;
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-Identificar, uno por uno, todas las características de cada huevo que se describen en este manual. La tabla 4.5 lista las especies de helmintos cuyos huevos se encuentran en las heces. Los términos utilizados para la identificación de los huevos de helmintos y una clave para su identificación se dan en las Figs. 4.39 y 4.40, respectivamente. La figura. 4.41 muestra los tamaños relativos de los huevos de helmintos. Ancylostoma duodenale Tamaño: 50-80 µm Forma: oval, con polos redondos y ligeramente aplanados (con frecuencia, un polo es más plano que el otro) Envoltura: sumamente delgada; se observa como una línea oscura Color: las células que hay en su interior son de color gris pálido (la solución de yodo las tiñe de pardo oscuro) Contenido: varía según el grado de maduración. Tipo A (en heces fecales frescas) (Fig. 4.42) 4, 8 ó 16 células granulosas de color gris, claras, aunque no refractan la luz (blastómeras). Tipo B (en heces fecales de algunas horas) (Fig. 4.43) Masa uniforme compuesta por numerosas células granulosas de color gris. Tipo C (en heces fecales de 12-48 horas) (Fig. 4.44) Todo el huevo se encuentra lleno por una pequeña larva (el futuro nematodo), replegada sobre sí misma. Este tipo de huevo se llama "embrionado". Ascaris lumbricoides Existen cuatro tipos de huevos de áscaris: A. Huevos fecundados, con envoltura doble B. Huevos no fecundados, con envoltura doble C. Huevos semidecorticados, fecundados (menos frecuentes) D. Huevos semidecorticados, no fecundados (sumamente raros). A. Huevos fecundados, con envoltura doble (Fig. 4.45) Tamaño: aproximadamente 45–70µm Forma: oval o, a veces, redonda Envoltura: las dos envolturas se distinguen claramente: — la envoltura externa es áspera, parda, cubierta por pequeñas protuberancias (mamelonada) — la envoltura interna es lisa, gruesa e incolora Color: la envoltura externa es parda y el contenido de los huevos es incoloro o amarillo pálido Contenido: una sola masa central, redonda y granulosa. B. Huevos no fecundados, con envoltura doble (Fig. 4.46) Tamaño: aproximadamente 45-90 µm (mayores que los del tipo A) Forma: más alargados (elípticos o irregulares) Envoltura: las dos envolturas no se pueden distinguir con claridad: — la envoltura externa es parda y bollonada, con protuberancias melladas — la envoltura interna es sumamente delgada (algunas veces se pueden observar una o dos líneas) Contenido: el huevo se encuentra lleno de gránulos voluminosos y redondos que refractan intensamente la luz (son brillantes). C. Huevos semidecorticados, fecundados (Fig. 4.47) Son similares a los del tipo A, pero carecen de envoltura externa. Envoltura: única, lisa, gruesa e incolora (o de color amarillo muy pálido) Contenido: una sola masa granulosa central, redonda e incolora. D. Huevos semidecorticados, no fecundados (Fig. 4.48) Envoltura: una sola envoltura lisa, delgada e incolora (línea doble) Contenido: gránulos voluminosos, redondos e incoloros, que refractan la luz. Advertencia: No se confunda el tipo D con los huevos de Ancylostoma, Fasciola spp. o los de Fasciolopsis buski.
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Figura 4.42 Huevos de Ancylostoma duodenale en heces fecales frescas. (Tipo A). Figura 4.43 Huevos de Ancylostoma duodenale en heces fecales de algunas horas (Tipo B). Figura 4.44 Huevos de Ancylostoma duodenale en heces fecales de 12-48 horas (Tipo C). Figura 4.45 Huevos de Ascaris lumbricoides fecundados, con envoltura doble (A). Figura 4.46 Huevos de Ascaris lumbricoides no fecundados, con envoltura doble (B). Figura 4.47 Huevos de Ascaris lumbricoides semidecorticados, fecundados (C.) Figura 4.48 Huevos de Ascaris lumbricoides semidecorticados, no fecundados (D).
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Figura 4.49 Huevos de Clonorchis sinensis. Giba: pequeño botón situado en el extremo ancho del huevo (P). Figura 4.50 Huevos de Dicrocoelium spp. (varias especies). Opérculo fácilmente visible (O); Huevos en tránsito* (la forma que se encuentra con mayor frecuencia) (A). Figura 4.51 Huevos de Dicrocoelium spp. de pacientes infectados (sumamente raros) (B). Figura 4.52 Huevos de Diphyllobothrium latum. O: Opérculo; B: Botón o giba sumamente pequeña, situada en el extremo opuesto al del opérculo.
Figura 4.53 Huevo de Dipylidium caninum. Figura 4.54 Huevos de Enterobius vermicularis (Oxiuro). Contenido: puede ser una masa granulosa pequeña (A) de forma oval irregular, o el embrión del helminto (B), que es una pequeña larva enroscada.
Tabla 4.5 Especies de helmintos cuyos huevos se encuentran en las heces Nombre científico Distribución geográfica Ancylostoma duodenale Mundial Ascaris lumbricoides Mundial Clonorchis sinensis Sureste de Asia Dicrocoelium dendriticum, Dicrocoelium hospes Mundial Diphyllobothrium latum Mundial Dipylidium caninum Mundial Enterobius vermicularis Mundial Fasciola gigantica Mundial Fasciola hepatica Mundial
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Fasciolopsis buski Heterophyes heterophyes Hymenolepis diminuta Hymenolepis nana Metagonimus yokogawai Necator americanus Opisthorchis felineus Paragonimus westermania Schistosoma haematobiumb Schistosoma intercalatum Schistosoma japonicum Schistosoma mansoni
Asia oriental y meridional Asia Sudoriental, el Mediterráneo Oriental Mundial Mundial Asia oriental y meridional, Europa central y oriental Mundial Asia oriental y meridional, Europa central y oriental África Central, América del Sur, Asia oriental y meridional África, el Mediterráneo Oriental África Asia oriental y meridional África (al sur del Sahara), América Central y del Sur, el Caribe Sureste de Asia Mundial Mundial Mundial Asia Mundial
Schistosoma mekongi Strongyloides stercoralisc Taenia saginata Taenia solium Trichostrongylus (varias especies) Trichuris trichiura a Se encuentra principalmente en el esputo. b Se encuentra principalmente en la orina c Se encuentra principalmente en forma de larvas en las heces Clonorchis sinensis (Fig. 4.49) Tamaño: 25–45µm. Forma: característica (véase la ilustración) Envoltura: lisa y suave, aunque sumamente gruesa (línea doble) Opérculo: fácilmente visible en el extremo delgado del huevo, ajustado dentro de un engrosamiento anular de la envoltura Giba: pequeño botón situado en el extremo ancho del huevo (P) Contenido: un embrión ciliado, bien organizado Color: la envoltura es parda, ligeramente amarilla, y el contenido es amarillo pálido Dicrocoelium spp. (Varias especies) Tamaño: 35–50µm. Forma: oval, más bien asimétrica Envoltura: gruesa y lisa, de color amarillo, anaranjado o ligeramente pardo Opérculo: fácilmente visible (O). A. Huevos en tránsito*(la forma que se encuentra con mayor frecuencia; Fig. 4.50): El color de la envoltura es variable; puede ser amarillo, anaranjado o ligeramente pardo. El huevo contiene una masa oval poco diferenciada, de color amarillo oscuro, en que frecuentemente se hallan 1 a 4 glóbulos que refractan la luz. B. Huevos de pacientes infectados (sumamente raros; Fig. 4.51): La envoltura es de color uniforme, pardo oscuro. El huevo contiene un embrión ciliado. *Huevos en tránsito: El paciente ha ingerido hígado de carnero o res infectado por el parásito. Los huevos no se digieren y, a pesar que se encuentren en las heces fecales, el paciente no se infecta. Repita el examen 8 días después, e indique al paciente que, mientras tanto, no coma hígado o productos derivados de éste Diphyllobothrium latum (Fig. 4.52) Tamaño: 55–80 µm. Forma: oval, uniforme Envoltura: lisa y delgada Opérculo: difícilmente visible cuando no se encuentra levantado Giba: sumamente pequeña, situada en el extremo opuesto al del opérculo Contenido: una masa de células pequeñas ordenadas alrededor de una célula central voluminosa Color: amarillo pálido. Dipylidium caninum (Fig. 4.53) Los huevos se encuentran apiñados en racimos de 6-20, envueltos por una membrana delgada. Tamaño: del racimo de huevos: 150-300 µm de cada huevo: 30-40 µm Forma: redonda Envoltura: gruesa, ligeramente granulosa, sin estrías Contenido: una sola masa granulosa uniforme con tres pares de garfios que forman una especie de abanico y refractan la luz Color: amarillo o gris pálido. Enterobius vermicularis (Fig. 4.54) Tamaño: 50-60 µm Forma: oval, aunque claramente asimétrica (plana en un lado y redonda en el otro) Envoltura: lisa y delgada, pero se puede observar una línea doble Contenido: puede ser una masa granulosa pequeña (A) de forma oval irregular, o el embrión del helminto (B), que es una pequeña larva enroscada Color: incoloro, transparente Este huevo se encuentra más fácilmente en los pliegues de la piel que rodea el ano que en las heces (véase más adelante). Técnica para la recogida y el examen de los huevos Técnica especial para huevos de oxiuros
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Principio Los huevos de oxiuros (Enterobius vermicularis) se suelen recoger (en especial en niños) en los pliegues de la piel que rodea el ano. Raras veces se hallan en las materias fecales. Materiales — Cinta adhesiva de celofán transparente (“cinta Scotch”) — Una cucharilla de 10cm de longitud o, mejor aún, un abatelenguas de madera — Un portaobjetos — Microscopio ● Microscopio ● Tubos de ensayo ● Pipeta Pasteur ● Algodón ● Solución de cloruro de sodio al 0,85% (no reactivo. 53). Método 1. Coloque una cinta de celofán, con el lado adhesivo hacia abajo, sobre un portaobjetos, como se indica en la figura 4.55. 2. Coloque el lado plano de la cucharilla debajo del portaobjetos (Fig. 4.56). 3. Separe la cinta adhesiva del portaobjetos con suavidad y dóblela sobre el extremo del mango de la cucharilla figura 4.57. 4. Sostenga el hisopo formado con la mano derecha, presione firmemente el portaobjetos contra el mango de la cucharilla. 5. Separe con la mano izquierda las posaderas del paciente. Aplique presionando, el extremo de la cucharilla cubierto con la cinta adhesiva en varios sitios de la piel que rodea el ano (Fig. 4.58). 6. Coloque de nuevo la cinta de celofán sobre el portaobjetos, con el lado adhesivo hacia abajo (Fig. 4.59). 7. Para estar seguro de que la cinta se adhiere uniformemente al portaobjetos presione con un trozo de algodón (Fig. 4.60). 8. Observe con el microscopio, con abertura reducida del condensador y utilizando objetivo x 10, en busca de los huevos de E. vermicularis, que tienen las características siguientes: Forma: oval, aunque asimétrica (aplanada en un lado y redonda en el lado opuesto) Tamaño: 50-60 µm Envoltura: lisa y delgada, aunque con una línea doble visible Contenido: puede ser una masa granulosa (1) o un embrión del helminto, plegado sobre sí mismo (2) Color: transparente, incoloro Véanse fotografías de estos huevos en las figuras correspondientes (ver fig. 4.54). Método: Según el método de Melvin, D. y Brooke, M. Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal parasites, Atlanta, Secretaría de Salud y Servicios Humanos de los EE UU, Centros para el Control de Enfermedades, 1969, pág. 138. Método alternativo Si no se cuenta con cinta de celofán 1. Úsese un hisopo de algodón 2. Aplíquese alrededor del ano (pero no dentro) (Fig. 4.61). 3. Sumerja el hisopo en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 0,5 ml (10 gotas) de solución de cloruro sódico y enjuáguelo bien es esta solución (Fig. 4.62). 4. Aspire el líquido con una pipeta Pasteur. Páselo a un portaobjetos, ponga un cubreobjetos y examínelo como se indica en el paso 8 del método anterior (Figura 4.63).
AGREGADO: FROTIS ANALES PARA LA DETECCIÓN DE OXIUROS Los frotis anales se usan para detectar la presencia de oxiuros (Enterobius vermicularis). Los oxiuros son más corrientes en los niños que en los adultos, y a menudo el niño parasitado infecta a otros miembros de la familia. Así pues, si se observa que un niño está infectado, conviene examinar muestras de todos sus familiares, especialmente de sus hermanos. Los huevos de oxiuro suelen encontrarse en los pliegues cutáneos que rodean al ano, raras veces aparecen en las heces. La enterobiosis es considerada enfermedad de las “4 F” (del inglés: Food, Fingers, Faeces and Flies) lo que significa en castellano Food: Comida, Fingers: Dedos, Faeces: Heces fecales, Flies: Moscas. Esto hace referencia al tipo de infección y transmisión de enfermedades de este tipo, ya que en ellas participan estos cuatro elementos, por ejemplo, un niño infectado contiene huevos en la zona perianal, la hembra del oxiuro cuando los coloca en ésta zona y no en las heces, “muerde” y se produce sensación de comezón, el niño se rasca para mitigar la molestia del comezón, al hacerlo toca sin querer los huevos depositados en la zona perianal con sus dedos y por debajo de sus uñas lo que llevará a que transporte y transmita la enfermedad hacia otros miembros de su especie, por lo general, su familia. Los huevos también pueden quedar en la ropa que cubre el trasero. Éste niño, toca la comida, supongamos un mendrugo de pan, y otras zonas en la casa. El pan tocado tiene huevos de oxiuro, que si tiene hermanitos, padres y tocan ese pan u otros alimentos contaminados por el niño infectado también se infectarán a través de la comida. Siempre hay que tener en cuenta que el lavado de manos y la higiene son fundamentales para mermar las posibilidades de infección. A su vez, el niño lleva ese pan a su boca y se produce auto infección. Hasta aquí van la comida y los dedos, ¿Y las heces fecales y las moscas?, ¿Cuál es su papel en todo esto? En esta enfermedad parasitaria por Oxiuro, las heces no son determinantes, pero hay que tener en cuenta que el oxiuro es un parásito intestinal y si bien no deposita en las heces directamente los huevos, lo hace en los pliegues que rodean al ano, por esto, junto con otras enfermedades consideradas dentro de esta clasificación (“4 F”, “contaminación mano, ano, boca”), casi todas ellas por enteroparásitos, las heces fecales si juegan un papel
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fundamental en la transmisión de otras enfermedades por enteroparásitos ya que conjuntamente al oxiuro puede existir coinfección con otros parásitos intestinales. Siempre quedan restos pequeños en la zona perianal con materia fecal. Moscas y enfermedades En humanos, la mosca doméstica puede ser la causante de la transmisión de cerca de 20 enfermedades como amebiasis, diarreas, disentería biliar, poliomielitis y parásitos intestinales. Además de contaminar la comida con huevos y gusanos, las moscas pueden diseminar bacterias y parásitos que causan enfermedades intestinales. Pueden viajar de materia fecal a nuestra comida de forma muy sencilla cargando bacterias o quistes y huevos de parásitos en su cuerpo o sus patas. Cuando se alimentan, las moscas excretan saliva y heces que pueden contener bacterias. Algunas veces dejarán sus huevos o gusanos en la piel o heridas de humanos y animales (Miasis). La "mosca domestica", un típico parásito antihigiénico cosmopolita, sigue al ser humano, desde su lugar de origen, hasta todos los rincones del mundo, incluyendo las zonas templadas. Se establece en cualquier lugar en el que haya residuos orgánicos en estado de descomposición, excrementos de mamíferos o similares que le ofrezcan las condiciones de vida necesarias. También los basureros, los cubos de basuras en grandes cocinas y granjas dedicadas a la cría de ganado ofrecen un hábitat ideal para estos insectos. La mosca doméstica no daña directamente al ser humano ni a los animales. No obstante, debido a la gran abundancia de alimentos y su rápida reproducción, la mosca tiende a la multiplicación desmesurada y se convierte en un insecto muy molesto. Además, se han encontrado aprox. 100 agentes patógenos en la mosca doméstica. Por ello, no se debe subestimar el riesgo de transmisión de enfermedades a través de las moscas, especialmente por la contaminación de alimentos. La mosca doméstica es un transmisor de enfermedades infecciosas como, por ejemplo, el tifus, el cólera, la salmonella, la poliomielitis o la fiebre aftosa entre otras enfermedades incluyendo a las parasitarias por enteroparásitos. Las moscas como transportadoras accidentales de parásitos, también tienen su importancia ya que se posan en la comida, o sobrevuelan el trasero del niño y se posan también en éste, llevando o acarreando en sus patas a los huevos que se adhieren a ellas, transportando los huevos a la comida y continuando el ciclo. En resumen, es muy probable que la familia entera esté infectada. En el manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud 2ª Edición se hace mención a dos técnicas orientadas para la búsqueda de oxiuros, la técnica de la cinta adhesiva transparente de celofán y la técnica alternativa del hisopado anal. Las descripciones de ambas técnicas se explican y se dejan como aparece en el manual, haciendo una salvedad aquí de agregar unas técnicas similares con variación en el nombre pero esencialmente las mismas. Se adosa una explicación sobre una variante que emplea gasas en vez de hisopos para frotar en la zona perianal. Fuentes: Métodos Básicos de Laboratorio en Parasitología Médica, OPS/OMS 1992 versión castellana. IV Curso de metodología en el diagnóstico de enteroparásitos ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Argentina, INEI (Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas), ANLIS (Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud). Observación: Estas técnicas son específicas para el hallazgo de huevos de Enterobius vermicularis (Oxiuro), pudiéndose hallar en algunos casos huevos de Ascaris lumbricoides, Tenia spp., H. nana. Los huevos de estos otros parásitos distintos a E. vermicularis se debe a contaminación fecal de la zona perianal. Siempre quedan pequeños restitos de materia fecal en los pliegues que rodean al ano (falta de higiene) que pueden contener huevos de los helmintos mencionados. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS DE LA ZONA PERIANAL TEST DE GRAHAM GARAGUSO O MÉTODO DE LA CINTA ADHESIVA TRANSPARENTE (CINTA SCOTCH) (Equivalente al método de la cinta adhesiva de celofán del manual) NOTA: (Este método de recolección se realiza en pacientes de edad pediátrica. Ocasionalmente en adultos) Materiales: 5 ó 6 portaobjetos con cinta adhesiva transparente (tipo cinta scotch) de 2 cm de ancho colocada a lo ancho de los mismos. Bajalenguas de madera ó cuchara de plástico de aproximadamente 10 cm de largo Microscopio Portaobjetos Cinta Scotch transparente Procedimiento: 1. Realizar la toma de muestra por la mañana al despertar el paciente previo a que defeque o efectúe su higiene. 2. Despegar la cinta adhesiva transparente del portaobjetos y enrollarla en el extremo del mango de la cuchara o en el depresor lingual con la parte engomada hacia afuera. 3: Separar las nalgas del paciente y hacer presión con el extremo de la cuchara cubierto con la cinta en la zona perianal. 4. Colocar nuevamente la cinta con la parte adhesiva sobre el portaobjetos. 5. Repetir esta operación durante 4 o 5 días más) con los portaobjetos testantes. 6. Una vez efectuada la recolección enviar las muestras al laboratorio para su examen. 7. Coloque la cinta con la parte adhesiva hacia adentro. Antes de examinar éste, se puede levantar la cinta adhesiva y dejar caer una gota de aceite de inmersión en el centro del trozo de cinta y vuelva a colocar ésta en su sitio. Esto mejorará la transparencia de la cinta. El agregado de aceite de inmersión es opcional, porque si se quiere ver la cinta adherida al portaobjetos se puede hacer directamente sin aceite de inmersión. Para aumentar la probabilidad de recoger huevos, la toma debe hacerse entre las 22 hs y las 24 hs, ó a primera hora de la mañana antes que el paciente orine, defeque o se bañe. En algunos casos es necesario tomar varias muestras antes de llegar a un diagnóstico positivo. El agente de salud debe lavarse las manos después de tomar la muestra; de otro modo, los huevos que tal vez hayan contaminado las manos entrarán en la boca y producirán una infección. HISOPADO O ESCOBILLADO ANAL NOTA: Se puede escoger para trabajar entre los hisopos y/o las gasas, cualquiera de las dos técnicas dan buenos resultados.
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Materiales: 5 ó 6 hisopos o gasas (de 10 x 10 cm') frasco de boca ancha con tapa a rosca Solución salina formolada al 5% Gasas Embudos Varillas de vidrio Tubos de centrífuga Tubos de ensayo Pipetas Pasteur con perilla de goma Portaobjetos Cubreobjetos. Centrífuga Microscopio Procedimiento: 1. Realizar la toma de muestra por la mañana al despertar el paciente previo a que defeque o efectúe su higiene. 2. Separar las nalgas del paciente y frotar suavemente con el hisopo de algodón o la gasa sobre la superficie y en los pliegues perianales, colocando el hisopo en tubos de ensayo y las gasas en un frasco con solución salina formolada al 5%. 3. Repetir esta operación en días consecutivos con los hisopos o gasas restantes. 4. Una vez efectuada la recolección enviar la muestra al laboratorio para su examen. Homogeneizar con varilla de vidrio las gasas o los hisopos contenidos en el frasco de recolección con (solución salina formolada al 5%) (esto hace despegar los huevos del hisopo y de las gasas). Filtrar a través de un embudo con una doble gasa en un tubo de centrífuga Centrifugar durante 5 minutos a 1000-1500 rpm Eliminar el sobrenadante. Observar el sedimento entre portaobjetos y cubreobjetos en microscopio óptico con bajo aumento (10X).
A
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Figura 4.55 Preparación del portaobjeto para la recolección de huevos de oxiuro Figura 4.56 Coloque el lado plano de la cucharilla debajo del portaobjetos Figura 4.57 Separe la cinta adhesiva del portaobjetos con suavidad y dóblela sobre el extremo del mango de la cucharilla. Figura 4.58 Técnica de recogida de los huevos de oxiuro a un infante. Separe con la mano izquierda las posaderas del paciente. Aplique presionando, el extremo de la cucharilla cubierto con la cinta adhesiva en varios sitios de la piel que rodea el ano. A) Sostenga el hisopo formado con la mano derecha, presione firmemente el portaobjetos contra el mango de la cucharilla.
Figura 4.59 Transferencia de la muestra al portaobjetos. Coloque de nuevo la cinta de celofán sobre el portaobjetos, con el lado adhesivo hacia abajo. Figura 4.60 Asegurarse que la cinta esté firmemente pegada al portaobjetos con un trozo de algodón.
B) Observación al microscopio de los huevos de oxiuro. Contenido: se puede encontrar un material granuloso (1) o un embrión del oxiuro plegado sobre sí mismo (2).
B
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Figura 4.61 Técnica alternativa para recoger huevos de E. vermicularis. Hisopado anal y escobillado anal con gasas.
Figura 4.62 Transferencia de la muestra a un tubo de ensayo. Sumerja el hisopo en un tubo de ensayo y enjuáguelo bien en la solución que contiene el tubo. Figura 4.63 Transferencia de la muestra a un portaobjetos. Fasciola hepática (Fig. 4.64) Tamaño: 130145 µm Forma: Oval, con polos redondeados Envoltura: Lisa y suave, con una línea doble Contenido: Una masa de células voluminosas, difíciles de distinguir, cuyos núcleos son claros y granulosos (ajústese el tornillo del microscopio para cambiar el enfoque) Color: Varía entre el amarillo y el pardo oscuro Otros Caracteres: Opérculo (O) claramente delineado en uno de los polos; en esta región la envoltura puede estar visiblemente retraída. En el polo contrario hay un engrosamiento (E) de una pequeña porción de la envoltura. Los huevos se suelen encontrar en cantidad reducida en las heces fecales (en los casos de duda se pueden hacer estudios ulteriores mediante aspiración duodenal). Los casos transmitidos por los huevos son raros. Fasciolopsis buski (Fig. 4.65) Tamaño: 125–140 µm Forma: oval Opérculo: ligeramente menor (O) que el de Fasciola hepatica. El huevo es muy semejante al de Fasciola hepatica (Fig. 4.64), aunque tiene las diferencias siguientes: a) Envoltura: más delgada, de una sola línea, con notable engrosamiento (E) en el polo contrario al que ocupa el opérculo b) Opérculo: ligeramente menor c) Contenido: puede estar formado por células que refractan la luz, con una célula clara en el centro del huevo d) Cantidad: con frecuencia hay abundantes huevos en las heces fecales. Heterophyes heterophyes (Fig. 4.66)
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Huevo semejante al de Clonorchis sinensis (Fig. 4.49) Tamaño: 2530 µm Forma: más ovalada; el opérculo no se traslapa Color: varía entre amarillo y pardo oscuro Envoltura: ligeramente más gruesa que la de C. sinensis Giba: pequeña, con forma de verruga, situada en el extremo ancho del huevo; no siempre es visible Contenido: una masa de células, que a veces contienen grandes gránulos que refractan la luz (en el huevo no fecundado) o un embrión ciliado. Hymenolepis diminuta (Fig. 4.67) Especia rara (se encuentra en heces fecales de niños) Tamaño: 7090 µm (considerablemente mayor que H. nana) Forma: redonda Color: transparente o amarillo pálido Envoltura: sumamente gruesa: — la envoltura externa es delgada, con líneas transversales — la envoltura interna es muy gruesa, sin filamentos Contenido: un embrión redondo, con 6 garfios dispuestos en forma de abanico. Hymenolepis nana (Fig. 4.68) Tamaño: 4560 µm Forma: oval, casi redonda Envoltura: doble; membrana externa delgada y membrana interna frecuentemente más gruesa en los polos, con filamentos que se extienden a partir de éstos (redúzcase la iluminación para poderlos observar), mezclados con gránulos que ocupan el espacio que hay entre las dos membranas Color: gris muy pálido Contenido: una masa redonda (el embrión) con 6 garfios que refractan la luz, dispuestos en forma de abanico y, con frecuencia, algunos gránulos claramente definidos en el centro. Importante: Anótese en el registro si los huevos encontrados son abundantes o escasos. Metagonimus yokogawai (Fig. 4.69) Huevo semejante a los de Clonorchis sinensis y Heterophyes heterophyes (véase las Figs. 4.49 and 4.66). Tamaño: 25–30 µm. Forma: oval, sin salientes notables Envoltura: sumamente gruesa (la más gruesa de los 3 huevos) Opérculo: Más redondo que el de H. heterophyes, se traslapa menos que el de C. sinensis Giba: Sumamente pequeña o invisible; situada en el polo contrario al del opérculo Contenido: un embrión ciliado. Necator americanus (Fig. 4.70) El huevo es casi idéntico al de Ancylostoma duodenale (Fig. 4.42) Tamaño: un poco mayor (60–80 µm) al de A. duodenale Forma: los polos son más aplanados Contenido: siempre contiene por lo menos 8 células (como A. duodenale en heces fecales frescas). Opisthorchis felineus (Fig. 4.71) Similar to the eggs of Clonorchis sinensis Huevo también semejante al de Clonorchis sinensis (véase Fig. 4.49). Tamaño: idéntico (2535 µm) Contenido: un embrión ciliado Algunas diferencias: (a) Forma: ligeramente menos amplio y protuberante en la base; algunos huevos son asimétricos (b) Opérculo: se traslapa menos (c) Giba: raras veces es visible. Es sumamente difícil distinguir los huevos de los cuatro parásitos lanceolados orientales: Clonorchis sinensis: redondeado, con opérculo que se traslapa claramente Heterophyes heterophyes: redondeado, de color más oscuro Metagonimus yokogawai: envoltura más gruesa Opisthorchis felineus: delgado, frecuentemente asimétrico, sin giba visible. Paragonimus westermani (Fig. 4.72) Los huevos se encuentran principalmente en el esputo (si se degluten también se pueden observar en las heces fecales). Tamaño: 65–120 µm (menor que el huevo de F. buski) Forma: oval, frecuentemente aplanado por un lado Opérculo: sumamente característico, con un anillo notable (semeja una tapa plana) Envoltura: engrosamiento acusado en el extremo contrario al del opérculo Color: pardo dorado Contenido: espacio central claro, rodeado de células cuadrangulares. Schistosoma bovis (Fig. 4.73) Los huevos se hallan en las heces fecales de pacientes que han comido carne de res infectada. Tamaño: muy voluminoso (200 µm) Forma: fusiforme, con extremos delgados que se extienden hasta cierta distancia del embrión Espolón: largo espolón terminal Contenido: pequeño embrión redondo que se encuentra en el centro del huevo sin llenarlo completamente.
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Este helminto no causa enfermedades al ser humano. Schistosoma haematobium (Fig. 4.74) Los huevos se encuentran en la orina (véase el procedimiento para detectarlos en la sección 7.2.8) y ocasionalmente en las heces fecales. Tamaño: 110150 µm Forma: oval, con un polo notablemente redondeado Espolón: terminal, situado en el polo opuesto Envoltura: lisa, sumamente delgada Color: gris o amarillo pálido Contenido: un embrión ciliado, bien formado, envuelto por una membrana (membrana interna). Schistosoma intercalatum (Fig. 4.75) Huevos de aspecto semejante a los de S. haematobium (véase Fig. 4.74), que se encuentran en las heces fecales. Existen algunas diferencias: Tamaño: ligeramente mayor (140180 µm) al de S. haematobium Espolón: terminal, más largo y delgado que el de S. haematobium Forma: fusiforme; menos ancho que el de S. haematobium (particularmente aplanado por los lados, hacia el polo redondo) Contenido: un embrión ciliado envuelto por una membrana con dos depresiones (d) o melladuras, una a cada lado, cerca de la parte media. Schistosoma japonicum (Fig. 4.76) Tamaño: 70100 µm Forma: oval, casi redonda Color: transparente o amarillo pálido Espolón: difícil de descubrir, lateral y sumamente pequeño; puede estar oculto por gránulos (P) que frecuentemente se encuentran en la superficie del huevo Contenido: un embrión ciliado muy amplio. Schistosoma mansoni (Fig. 4.77) Tamaño: 110–180 µm (= 3 huevos de Ancylostoma) Forma: oval, con un polo claramente redondeado y el otro casi cónico Espolón: Lateral, cercano al polo redondeado; voluminoso y triangular (si está oculto bajo el huevo ajústese el enfoque del microscopio) Envoltura: lisa, sumamente delgada Color: amarillo pálido Contenido: un embrión ciliado voluminoso, envuelto por una membrana (envoltura interna) como en todas las especies de Schistosoma.
Fig. 4.66
Fig. 4.67
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Figura 4.64 Huevo de F. hepatica Figura 4.65 Huevo de F. buski E: Engrosamiento; O: Opérculo Figura 4.66 Huevos de Heterophyes heterophyes Figura 4.67 Huevo de H. diminuta Figura 4.68 Huevos de H. nana Figura 4.69 Huevo de Metagonimus yokogawai
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Figura 4.70 Huevo de Necator americanus Figura 4.71 Huevo de Opisthorchis felineus Figura 4.72 Huevo de Paragonimus westermani Figura 4.73 Huevo de Schistosoma bovis Figura 4.74 Huevo de Schistosoma haematobium. S: Espolón
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Figura 4.75 Huevo de Schistosoma intercalatum D:Depresión; S: Espolón Figura 4.76 Huevo de Schistosoma japonicum G: Gránulos; S: Espolón Figura 4.77 Huevo de Schistosoma mansoni S: Espolón Frotis-fecal en capa gruesa con celofán para el diagnóstico de la esquistosomiasis intestinal (técnica de Kato-Katz) La técnica de examen de frotis fecales gruesos con celofán ha demostrado su eficacia en el diagnóstico de la esquistosomiasis y la helmintiasis intestinales, en especial S. mansoni. Este tipo de frotis puede prepararse sobre el terreno, conservarse en cajas para portaobjetos y enviarse a grandes distancias para que sean examinadas en un laboratorio central en caso necesario. La técnica no sirve para examinar larvas, quistes o huevos de ciertos parásitos intestinales. La técnica no es adecuada para el diagnóstico de estrongiloidiasis o infecciones con protozoos o Enterobius vermicularis. Material y reactivo Palillos aplicadores de madera Rejilla de acero inoxidable, nailon o plástico (malla 60105) Plantilla de acero inoxidable, plástico o cartón Portaobjetos Celofán, 4050 mm de grosor, tiras de 25 x 30 ó 25 x 35 mm Tarro de fondo plano Pinzas Papel higiénico secante Papel de periódico Solución de glicerolverde de malaquita (reactivo nº 31) (o azul de metileno) (reactivo n° 39). Microscopio Técnica La manipulación de muestras fecales debe hacerse siempre con mucha precaución. Siempre deben llevarse guantes para evitar la contaminación de los dedos. 1. Sumérjanse las tiras de celofán en la solución de glicerol verde de malaquita (o azul de m etileno) al 50 % durante al menos 24 horas antes de usarlas. 2. Transfiérase una pequeña parte del excremento a un trozo de papel viejo de periódico 3. Colóquese la rejilla sobre la muestra fecal y presiónese. 4. Con una espátula o un palillo aplicador que tenga un lado plano, raspe la superficie superior de la rejilla para que pase al material fecal (Fig. 4.78). 5. Colóquese una plantilla sobre un portaobjetos limpio. 6. Transfiérase una pequeña cantidad de material fecal tamizado al agujero de la plantilla y llénese cuidadosamente. Alísese la superficie con la espátula (Fig. 4.79). 7. Retírese cuidadosamente la plantilla de modo que todo el material fecal quede sobre el portaobjetos y no haya material adherido a ella. 8. Cúbrase la muestra fecal del portaobjetos con una tira de celofán empapada en glicerol (Fig. 4.80). 9. Si hay un exceso de glicerol en la parte superior del celofán retírese con un trozo de papel higiénico o secante. 10. Inviértase el portaobjetos y apriétese la muestra fecal contra el celofán sobre una superficie lisa (lo más adecuado es un pedazo de azulejo o una piedra plana) para extender la muestra uniformemente. 11. Levántese cuidadosamente el portaobjetos; de lo contrario el celofán puede desprenderse. Deslícese suavemente el portaobjetos hacia un lado sujetando el celofán. Con esto termina la preparación del portaobjetos. Tal vez haya que retirar el exceso de glicerol con un trozo de papel higiénico para asegurarse que el celofán permanece en su sitio. Con un poco de práctica, las preparaciones serán perfectas. Las diversas etapas de la preparación de la extensión en capa gruesa se muestran en la figura 2. Muestras fecales espesas o duras El principal problema de la técnica de extensión en capa gruesa es la imposibilidad de ver los huevos de helmintos en algunos excrementos de consistencia dura. En esos casos: después de la preparación por el método normal, espérense 2448 horas antes de contar los huevos en los portaobjetos: la preparación puede tardar bastante tiempo en aclararse; prepárese otro par de muestras en un portaobjetos grande (5 x 7,6 cm) y utilícese un fragmento de celofán ligeramente mayor (35 x 35 mm); a continuación, presiónese con fuerza para aplastar la muestra tanto como sea posible; cuando se utiliza el portaobjetos grande, el excremento puede ablandarse con solución salina o glicerol antes de tamizarlo. Observación de las preparaciones La preparación debe conservarse a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes del examen microscópico (véase más adelante en la parte relativa a los huevos de anquilostomas). Si se coloca el portaobjetos en una incubadora (40°C) o bajo una intensa luz fluorescente o incandescente en el laboratorio, o a la luz del sol sobre el terreno, puede examinarse al cabo de pocos minutos. Para facilitar el examen microscópico, pueden ponerse una o dos gotas de eosina en solución salina (1:100) sobre la parte superior del celofán, dejarse durante 35 minutos, y a continuación retirar el exceso con un trozo de papel higiénico o secante. Con ello es más fácil observar los huevos de Schistosoma.
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Fig. 2. Técnica de examen de extensiones fecales en capa gruesa con celofán (Kato) para el diagnóstico de la esquistosomiasis intestinal y las infecciones gastrointestinales por helmintos 1. Se dispone de distintos materiales. En esta fotografía se observa la espátula de plástico, la plantilla de plástico y la rejilla de nailon en un estuche KatoKatz que puede encontrarse en el comercio. Los dos primeros artículos y los portaobjetos pueden volver a utilizarse; la rejilla de nailon es desechable. Pueden encargarse varios estuches para disponer de plantillas normalizadas reutilizables. 2. La rejilla de nailon y el celofán necesarios para la técnica de frotis en capa gruesa pueden comprarse a granel. El celofán del rollo se corta en tiras de 2530 mm que se colocan en un tarro de boca ancha y fondo plano que contenga una solución al 50 % (o más) de glicerina con verde de malaquita o azul de m etileno (100 ml de agua, 100 ml de glicerol, 1 ml de solución acuosa al 3 % de verde de malaquita o azul de metileno). 3. El procedimiento para esta técnica es el mismo cualquiera que sea el material utilizado. La muestra fecal se hace pasar por la rejilla utilizando la espátula para separar el material fecal de los residuos más grandes. 4. El material fecal pasado por la rejilla se transfiere a la plantilla que se coloca en posición horizontal en el centro de un portaobjetos. El agujero de la plantilla queda completamente lleno de material fecal pasado por la rejilla y al ras de la superficie de la plantilla. La plantilla de KatoKatz que aparece en la imagen puede contener 41,7 mg de heces. El número de huevos observado se multiplica por 24 para obtener el número de huevos por gramo de excremento. Fig. 2 (Continuación) 5. El cuadrado de celofán inmerso durante por lo menos 24 horas se coloca sobre la muestra fecal. 6. El portaobjetos se pone boca abajo sobre un cristal u otro portaobjetos y la muestra se reparte uniformemente bajo el celofán como se observa en la fotografía. Una vez preparado el portaobjetos, puede ponerse otra gota de glicerol en el celofán y alisar los bordes de éste para que la preparación se conserve bien. Si se forman burbujas de aire bajo el celofán mientras se conserva la preparación, pueden eliminarse poniendo un par de gotas de glicerol en el celofán y dejando reposar la preparación durante la noche. Los frotis en capa gruesa con celofán pueden prepararse en el terreno, guardarse en cajas para portaobjetos y enviarse a largas distancias, lo que permite su examen en un laboratorio central en caso necesario al cabo de varios días o semanas de su preparación. 7. Los huevos de Ascaris (izquierda) y Trichuris (derecha) pueden verse en cualquier momento. Los huevos de anquilostomas (no aparecen en la fotografía) son visibles durante los 30 primeros minutos a partir de la preparación. 8. El momento ideal para observar los huevos de S.mansoni, S. intercalatumo S. japonicum es a las 24 horas de su preparación. En luz solar directa los portaobjetos se aclaran rápidamente y a veces no es necesario esperar 24 horas.
Figura 4.78 Usando un palillo aplicador, raspar a través de la superficie superior de la rejilla para tamizar la muestra fecal Figura 4.79 Llenado de la plantilla con la muestra fecal tamizada (véase figura 2 anexa)
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Figura 4.80 Cubrir la muestra fecal con una tira de celofán empapado en glicerol
TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DE LAS MUESTRAS
Fig. 2.
Técnica de examen de extensiones fecales en capa gruesa con celofán (Kato) para el diagnóstico de la esquistosomiasis intestinal y las infecciones gastrointestinales por helmintos
1. Se dispone de distintos materiales. En esta fotogra fía se observa la espátula de plástico, la plantilla de plás tico y la rejilla de nailon en un estuche Kato-Katz que puede encontrarse en el comercio. Los dos primeros ar tículos y los portaobjetos pueden volver a utilizarse; la re jilla de nailon es desechable. Pueden encargarse varios estuches para disponer de plantillas normalizadas reutilizables.
2. La rejilla de nailon y el celofán necesarios para la técnica de frotis en capa gruesa pueden compararse a gra nel. El celofán del rollo se corta en tiras de 25-30 mm que se colocan en un tarro de boca ancha y fondo plano que contenga una solución al 50 % (o más) de glicerina con verde de malaquita o azul de metileno (100 mi de agua, 100 mi de glicerol, 1 mi de solución acuosa al 3 % de verde de malaquita o azul de metileno).
3. El procedimiento para esta técnica es el mismo cual quiera que sea el m aterial utilizado. La muestra fecal se hace pasar por la rejilla utilizando la espátula para sepa rar el m aterial fecal de los residuos más grandes.
4. El material fecal pasado por la rejilla se transfiere a la plantilla que se coloca en posición horizontal en el centro de un portaobjetos. El agujero de la plantilla que da completamente lleno de material fecal pasado por la rejilla y al ras de la superficie de la plantilla. La plantilla de Kato-Karz que aparece en la imagen puede contener 41,7 mg de heces. El número de huevos observado se multiplica por 24 para obtener el número de huevos por gramo de excremento.
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MUESTRAS FECALES
Fig. 2 (Continuación)
/ 5. El cuadrado de celofán inmerso durante por lo me nos 24 horas se coloca sobre la muestra fecal.
6. El portaobjetos se pone boca abajo sobre un cristal u otro portaobjetos y la muestra se reparte uniformemen te bajo el celofán como se observa en la fotografía. Una vez preparado el portaobjetos, puede ponerse otra gota de glicerol en el celofán y alisar los bordes de éste para que la preparación se conserve bien. Si se forman bur bujas de aire bajo el celofán mientras se conserva la pre paración, pueden elim inarse poniendo un par de gotas de glicerol en el celofán y dejando reposar la prepara ción durante la noche. Los frotis en capa gruesa con ce lofán pueden prepararse en el terreno, guardarse en ca jas para portaobjetos y enviarse a largas distancias, lo que permite su examen en un laboratorio central en caso ne cesario al cabo de varios días o semanas de su prepara ción.
7. Los huevos de Ascaris (izquierda) y Trichuris (dere cha) pueden verse en cualquier momento. Los huevos de anquilostomas (no aparecen en la fotografía) son visibles durante los 30 primeros minutos a partir de la prepara ción.
8. El momento ideal para observar los huevos de S. mansoni, S. intercalatum o S. japonicum es a las 24 horas de su preparación. En luz solar directa los portaobjetos se acla ran rápidamente y a veces no es necesario esperar 24 ho ras.
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Strongyloides stercoralis (Fig. 4.81) Larva Las larvas tienen gran movilidad en las heces fecales. Tamaño: 200300 µm de longitud y 15 µm de grosor Cola: relativamente delgada Boca: pequeña Tubo digestivo: fácilmente visible; consta de un esófago (0) con dos ensanchamientos en un extremo y un poro anal en el otro (A) Primordio genital: espacio redondo y claro, próximo a la parte media de la larva (E) Huevos Es raro encontrar huevos de S. stercoralis en heces formadas, ya que maduran antes de la evacuación y producen las larvas descritas anteriormente. Sin embargo, se pueden hallar en heces líquidas (y ocasionalmente en heces formadas de los portadores de ciertas variedades). Estos huevos son muy semejantes a los de Ancylostoma duodenale (véase Fig. 4.42). Tamaño: 50 80 µm (ligeramente menores a los de Ancylostoma duodenale) Forma: similar a los huevos de Ancylostoma Envoltura: similar a la de los huevos de Ancylostoma Color: similar al de los huevos de Ancylostoma. Gris pálido, de color marrón oscuro después de la tinción con solución de yodo. Contenido: una larva gruesa, plegada sobre sí misma una o dos veces y provista algunas veces de movilidad. Tenia (Fig. 4.82(a)) Taenia saginata Taenia solium* Los huevos** de estos dos cestodos son casi idénticos. Se pueden encontrar en las heces fecales y los de T. saginata también se recogen de la piel que rodea el ano (véase la página 136). Tamaño: 30–80 µm Forma: redonda Envoltura: sumamente gruesa y lisa, con líneas transversales (redúzcase la iluminación) Color: — de la envoltura: amarillo oscuro o pardo — del contenido: amarillo pálido o gris Contenido: una masa granulosa redonda con tres pares de ganchos que refractan la luz (ajústese el enfoque) Saco externo: algunas veces el huevo se encuentra encerrado en un saco transparente, en cuyo interior flota (Fig. 4.82 (b)). *Las parasitosis por Taenia solium se restringen principalmente a regiones de escaso desarrollo socioeconómico del centro y el sur de África, América Latina y el sur de Asia. ** La denominación adecuada para estos huevos es "embrióforos", es decir, huevos embrionados desprovistos del saco externo. Trichostrongylus (varias especies) (Fig. 4.83) Huevos muy semejantes a los de Ancylostoma duodenale (véase Fig. 4.42). Tamaño: 75–115m µm (ligeramente mayores que los huevos de A. duodenale) Forma: oval, asimétrica: — uno de los polos es redondo — el polo opuesto es más delgado Envoltura: sumamente delgada, como la de Ancylostoma Contenido: en heces fecales frescas: una masa con no menos de 20 pequeñas células granulosas y redondas. El huevo se transforma rápidamente en embrión. Trichuris trichiura (Fig. 4.84) Tamaño: 50–65 µm. Forma: elipsoidal Envoltura: más bien gruesa y lisa, con dos capas Color: envoltura anaranjada; contenido amarillo Otros caracteres: un tapón redondo y transparente en cada polo Contenido: una masa granulosa uniforme (que en las heces "viejas" a veces se halla dividida). Importante: especifique si se observan huevos abundantes o escasos.
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B
A
C Figura 4.81 Strongyloides stercoralis A) Larva; B) y C) Huevos.
Figura 4.82 Huevos de Taenia spp. a: huevo normal; b: huevo encerrado en un saco transparente flotante.
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Figura 4.83 Huevos de Trichostrongylus sp. Figura 4.84 Huevos de Trichuris trichiura
NO CONFUNDIR CON HUEVOS DE PARÁSITOS Gránulos de almidón de origen vegetal (Fig. 4.85) Tamaño: 50100 µm Forma: redonda u oval y alargada; el contorno siempre es accidentado, con melladuras bruscas Color: blanquecino o amarillo grisáceo; la solución de yodo lo vuelve violáceo Contenido: masas apretadas de almidón. Estos gránulos son residuos de alimentos que contienen almidón, como las patatas, las judías, el ñame y la yuca. Fibras de carne digerida (Fig. 4.86) Tamaño: 100200 µm Forma: oval o rectangular, con ángulos redondeados Color: amarillo Contenido: transparente, sin gránulos o líneas (puede haber líneas cuando la carne no se ha digerido adecuadamente). Jabones (Fig. 4.87) Tamaño: 20100 µm Forma: redonda, ovalada o irregular (semejante al corte de un tronco de árbol) Color: pardo amarillento o incoloro Contenido: líneas que irradian desde el centro, visibles cerca de los bordes; centro vacío. Burbujas y gotas de grasa (Figs. 4.88 y 4.89) Tamaño: variable (pueden ser de cualquier tamaño) Forma: perfectamente redonda Falsa envoltura: anillo que refracta la luz intensamente (varios anillos en las gotas de grasa) Contenido: ninguno. Obsérvense las grandes diferencias de tamaño en la preparación que se ¡lustra. Pelos vegetales (Fig. 4.90) Tamaño: sumamente variable (50300 µm) Forma: generalmente rígida y a menudo curva; ancha y trunca en un extremo, delgada en el otro Color: amarillo pálido Contenido: un conducto central, estrecho y vacío, entre dos capas transparentes que refractan la luz. Granos de polen y esporas de hongos (Fig. 4.91) Varían mucho según el lugar del mundo y la alimentación. Sus formas diferentes y características y otras particularidades (salientes dentadas o redondas, formas geométricas distintivas, etc.) ayudan a diferenciarlas de los huevos de parásitos.
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Fig. 4.85
Fig. 4.86 y Fig. 4.87
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Figura 4.85 Gránulos de almidón de origen vegetal. Figura 4.86 Fibras de carne digerida. Figura 4.87 Jabones. Figura 4.88 Burbujas de aire. Figura 4.89 Gotas de grasa. Figura 4.90 Pelos vegetales. Figura 4.91 Granos de polen y esporas de hongos.
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4.4.2 IDENTIFICACIÓN DE LOS HELMINTOS ADULTOS Los helmintos adultos llevados al laboratorio para su identificación pueden haber sido encontrados en las heces, en ropa de vestir o de cama, o durante una operación quirúrgica. Lo que hay que examinar: — su longitud — su forma — si son planos y segmentados — si son cilíndricos (redondos) o no. — su estructura interna. HELMINTOS COMUNES Helmintos redondos frecuentes Ascaris lumbricoides: Helmintos redondos grandes (Fig. 4.92) Color: rosáceo Grosor: 0,30,5 cm Longitud: macho: aproximadamente 15cm, con cola formando un bucle, Hembra: 20 25 cm, con cola recta. Enterobius vermicularis (Oxiuros): Helmintos redondos pequeños (Fig. 4.93) Color: blanco Longitud: hembra: 1 cm, con cola muy puntiaguda; macho: 0,5 cm (los machos son menos frecuentes). Los oxiuros se suelen encontrar en cantidades abundantes, especialmente en las heces fecales de los niños, y son móviles. También se pueden hallar en los pliegues de la piel que rodea el ano, de donde se obtienen por medio de una cinta adhesiva de celofán (véase sección 4.4.1). Tenias. Helmintos planos segmentados Color: marfil o azul pálido Longitud: todo el helminto: 310 m; sin embargo, por lo general se envían para su examen los segmentos maduros separados (longitud: 13cm) o fragmentos de la cadena, cuya longitud es sumamente variable. Importante Si hay tardanza en realizar el examen las piezas separadas se pueden secar y enrollar, tomando el aspecto de helmintos redondos. Humedézcanse para devolverles su forma. Examen Materiales y reactivos ● Microscopio o lupa ● Portaobjetos ● Placa de Petri ● Pinzas. 1. Examine una cadena de segmentos para observar el orden de los poros laterales (Fig. 4.94) 2. Examine un solo segmento aplanado suavemente entre dos portaobjetos (Fig. 4.95). Sostenga el portaobjetos contra la luz para observar y contar las ramificaciones uterinas a simple vista. 3. Para examinar la cabeza (escólex): — coloque todo el helminto en una caja de Petri o un plato llenos de agua — por medio de una pinza traslade el helminto poco a poco a otro plato (Fig. 4.96); desenróllese comenzando por el extremo más grueso — Si al final de una porción sumamente estrecha (cuello) se encuentra un ensanchamiento del tamaño de una cabeza de alfiler pequeña, examine con una lupa o con microscopio (con objetivo x 10). La cabeza solo se encuentra raras veces. La Figura 4.97 muestra cómo diferenciar entre T. saginata y T. solium y dos tenias menos comunes, Hymenolepis nana y Dipylidium caninum.
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Figura 4.95 Segmentos de un adulto de Taenia spp. Figura 4.95 Aplanamiento suave de un segmento entre dos portaobjetos de microscopio
A) Sostenga el portaobjetos contra la luz para observar y contar las ramificaciones uterinas a simple vista.
A
Figura 4.96 Con unas pinzas para transferir una Tenia.
144 B) Observación del escólex. Examine con una lupa o con microscopio (con objetivo x 10). La cabeza solo se encuentra raras veces.
B
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OTROS HELMINTOS ENCONTRADOS EN LA MATERIA FECAL Raras veces se observan en las heces fecales. Ocasionalmente se hallan en los órganos del paciente durante una operación quirúrgica. En el hígado y los intestinos puede haber distomas y los quistes hidatídicos se observan en el hígado y los pulmones. Ancylostoma duodenale y Necator americanus (uncinarias) (Fig. 4.98) Pequeño helminto redondo (semejante a un trozo de hilo). Longitud: 11,5cm Color: blanco o rojo si contiene sangre. Se asemeja al oxiuro (véase Fig. 4.93). Examínese la cabeza (escólex) con el microscopio (con objetivo x 10) Trichuris trichiura (tricocéfalo) (Fig. 4.99) Pequeño helminto delgado, semeja un pequeño látigo; le tercera parte de su cuerpo es relativamente gruesa y el resto es filiforme. Este helminto habita en la pared del ciego o bien, ocasionalmente, en el recto Longitud: 35 cm Color: blanco. Distoma (Fig. 4.100) Helminto plano provisto de dos ventosas; semeja una hoja. Distoma grande: de 23 cm de longitud, relativamente ancho, de color rojo pardo o blanco opaco (DG) Distoma pequeño: de 0,51 cm de longitud, menos ancho, transparente, de color rojo sucio (dp). Schistosoma spp. (Trematodos sanguíneos) (Fig. 4.101) Pequeño helminto delgado Longitud: 0,51,5 cm Color: blanco. El macho, que es plano, se enrolla en la hembra filiforme, que es ligeramente más larga. Cada helminto posee dos ventosas cerca de la cabeza. Echinococcus granulosus (quiste hidatídico) Los helmintos de Echinococcus granulosus se encuentran en los perros. Los especímenes adultos tienen de 36 mm de largo. Los humanos y los animales se pueden infectar por la ingestión accidental de los huevos, que luego se convierten en quistes hidatídicos en el hígado o los pulmones (Fig. 4.102). Tamaño: alrededor de 150 µm. Forma: redonda, ovalada o irregular, con un polo ligeramente aplanada. Contenido: gránulos finos y un anillo distinguible de 1030 ganchitos (corona de ganchos). Color: incoloro y transparente. La hidatidosis se produce preferentemente en las zonas donde se crían ovejas, como África del Norte y Oriental, América del Sur, la península de Arabia, Australia y Nueva Zelanda. Diphyllobothrium latum (tenia del pescado) Diphyllobothrium latum se encuentra principalmente en los climas fríos. La infección se produce por ingestión de pescado crudo o insuficientemente cocido y puede resultar en obstrucción intestinal, anemia, dolor y pérdida de peso. Duración: hasta 20 m
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Figura 4.98 Ejemplares adultos de A. doudenale y de N. americanus (uncinarias) Figura 4.99 Ejemplares adultos de Trichuris trichiura mostrando en el círculo los extremos del macho y la hembra.
Figura 4.100 Distoma adulto. Distoma grande (DG), Distoma chico (DC).
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Figura 4.101 Esquistosomas. Se observa en el círculo un macho y una hembra juntos. Figura 4.102 Quiste hidatídico. Se observan los elementos que contiene el quiste, escólex, corona de ganchos, ganchos (“arenilla hidatídica”)
4.5 TÉCNICAS PARA CONCENTRAR LOS PARÁSITOS ELECCIÓN DEL MÉTODO DE CONCENTRACIÓN DE PARÁSITOS Técnica de concentración Si la muestra de heces contiene pocos microorganismos, es posible que no se detecten parásitos en una preparación húmeda directa. Así pues, siempre que sea posible, debe concentrarse la muestra. Los huevos y larvas de gusanos y los quistes de protozoos pueden recuperarse por concentración, pero los trofozoítos de protozoos no se verán ya que este procedimiento suele destruirlos. Por ese motivo es imprescindible el examen de la preparación húmeda directa como fase inicial del estudio microscópico. El procedimiento de concentración está indicado cuando el examen preliminar de la preparación húmeda dé resultado negativo a pesar de los síntomas clínicos que indican la infección por parásitos del paciente, y para la detección de Schistosoma y Tenia. El procedimiento de concentración que se recomienda es el método formalinaéter (o formalina acetato etílico)1. Aparte de otros métodos recomendados de concentración como el método de Willis de flotación, por ejemplo. Por este método pueden recuperarse todos los tipos de larvas y huevos de gusanos (áscaris, tenias, esquistosomas y otros huevos de trematodos), así como quistes de protozoos. 1 Si no se dispone de éter ni acetato etílico, puede usarse gasolina ordinaria en idénticas proporciones que el éter. El acetato etílico no es tan inflamable ni tan explosivo como el éter, por lo que resulta menos peligroso en el laboratorio. Además, debe tenerse en cuenta que la recolección seriada de la materia fecal durante varios días (6 a 8 días) aumenta más la probabilidad de encontrar los parásitos a través de sus formas (quistes, huevos, larvas). BENEFICIOS DE LA CONCENTRACIÓN DE PARÁSITOS El empleo de los métodos de concentración hace posible que: — se examine una cantidad mayor de heces fecales en menor volumen — se detecten parásitos que están presentes en número reducido. Importante: Antes de preparar una concentración de parásitos se debe realizar invariablemente un examen microscópico directo de las heces fecales. (En las preparaciones concentradas no se encuentran formas móviles de protozoarios.) Cuatro técnicas de concentración diferentes se describen en este libro: 1. La técnica de flotación utilizando una solución de cloruro de sodio (Willis) 2. La técnica de sedimentación formaldehídoéter (Allen & Ridley), (técnica del formaldehido con éter, método formalinaéter (o formalina acetato etílico), (Telemann modificado)) 3. La técnica de sedimentación formaldehídodetergente 4. La técnica de sedimentación para las larvas de Strongyloides stercoralis (HaradaMori). 4.5.1 TÉCNICA DE FLOTACIÓN UTILIZANDO UNA SOLUCIÓN DE CLORURO DE SODIO (WILLIS) Método de concentración por el uso de solución de cloruro sódico (Willis) Se recomienda este método para la detección de huevos de Ancylostoma duodenale y Necator americanus (es el mejor método para detectar la presencia de Ancylostoma y Necator), Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Taenia spp. y Trichuris trichiura. No es adecuado para la detección de huevos de trematodos y Schistosoma spp., larvas de Strongyloides stercoralis, o quistes de protozoarios o trofozoítos. PRINCIPIO
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Las heces fecales se mezclan con una solución saturada de cloruro sódico (aumentando la gravedad específica). El peso de los huevos es menor y flotan en la superficie, de donde se pueden recoger (Fig. 4.103).
Figura 4.103 Principio de la técnica de flotación.
Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Frasco de boca ancha, 10 ml, frascos de 10 ml (de penicilina) ● Aplicadores de madera ● Gasa ● Placas de Petri ● Etanol al 95% ● Éter ● Solución de Willis (reactivo no. 64) ● Vaselina ● Cera MÉTODO Preparación de cubreobjetos desgrasados (a) Mézclese en una probeta: — 10 ml de etanol al 95% y 10 ml de éter (b) Vierta esta mezcla en una placa de Petri y coloque en ella 30 cubreobjetos, uno por uno; agite la placa y a continuación déjela reposar durante 10 minutos (c) Saque los cubreobjetos, uno por uno, y séquelos con gasa (d) Guarde los cubreobjetos en una placa de Petri seca. Los pasos anteriores se resumen en la figura 4.104.
Figura 4.104 Preparación de cubreobjetos desgrasados.
Concentración de parásitos 1. Coloque aproximadamente 0.5 g de heces en un frasco de boca ancha. Llene la botella hasta la marca de 2,5 ml con solución de Willis. Otra forma alternativa: Coloque una porción de la muestra de heces, de 2 ml (2cm3) aproximadamente, en un frasco de penicilina. Llene una cuarta parte del frasco con solución de Willis. También, se puede cubrir el fondo del frasco con un volumen de muestra fecal previamente homogeneizada en un recipiente aparte. 2. Por medio de un aplicador o una varilla de vidrio disgregue la porción tomada de la muestra y mézclela minuciosamente con la solución. Acto seguido llene el frasco completamente con solución de Willis. La suspensión deberá ser completamente uniforme. Además, la película superficial superior del frasco debe hacer contacto con el cubreobjetos. 3. Coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la boca del frasco. Recuerde que el cubreobjetos debe “tapar” la boca del frasco para poder recibir a los huevos que flotan, por ende, la boca del frasco no debe ser muy ancha como para que el cubreobjetos no logre posarse sobre ella. 4. Compruebe que el cubreobjetos está en contacto con el líquido y no existen burbujas. Déjelo reposar durante 10 minutos. Puede dejar también de 10 minutos a una hora, tiempo óptimo: 20 minutos (Fuente: Willis HH. 1921. A simple levitation method for the detection of hookworm ova. Med J Australia 29 Oct: 375 – 376.) 5. Levante el cubreobjetos con cuidado; deberá quedar en él una gota del líquido. Levante el cubreobjetos rápida y verticalmente sin invertir sobre el portaobjetos.
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Coloque el cubreobjetos sobre un portaobjetos y examínelo con el microscopio inmediatamente (con el objetivo x10), ya que esta preparación se seca con suma rapidez. De lo contrario, proteja la gota del cubreobjetos bañándolo (sellar el cubreobjetos) con vaselina y cera. Utilice el ajuste lento del microscopio para observar todos los objetos visibles que se encuentren en el campo (los huevos suelen adherirse al cubreobjetos y no se pueden distinguir inmediatamente). Nota: Si quiere, en la zona donde colocará el cubreobjetos puede colocar previamente una gota de lugol con una pipeta Pasteur fina, esto es a elección del operador y depende de su experiencia; en su defecto, coloque sin esto y observe como se describió antes sin coloración. Fuente: Willis HH. 1921. A simple levitation method for the detection of hookworm ova. Med J Australia 29 Oct: 375 – 376.
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7 1) Materiales necesarios. 2) Colocación de la materia fecal en el frasco, también se contempla el agregado de un volumen de muestra previamente homogeneizado, y el agregado de la solución sobresaturada de Cloruro de Sodio (Solución de Willis) 3) Trituración de la materia fecal en el frasco con una varilla de vidrio, mezcla de ésta con la solución de Willis y luego llenado del frasco con la solución sobresaturada de Cloruro de Sodio hasta el borde. Obsérvese la película superficial superior ( menisco de forma convexa) que se forma en la boca del frasco. La suspensión deberá ser completamente uniforme. 4) Coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la boca del frasco. 5) Compruebe que el cubreobjetos está en contacto con el líquido y no existen burbujas de aire. Déjelo reposar durante 10 minutos. (Tiempo óptimo. 20 minutos) 6) luego del tiempo de espera, Levante el cubreobjetos con cuidado; deberá quedar en él una gota del líquido. Levante el cubreobjetos rápida y verticalmente sin invertir sobre el portaobjetos. Coloque el cubreobjetos sobre un portaobjetos y examínelo con el microscopio inmediatamente (con el objetivo x10), ya que esta preparación se seca con suma rapidez. 7) Utilice el ajuste lento del microscopio (micrométrico) para observar todos los objetos visibles que se encuentren en el campo (los huevos suelen adherirse al cubreobjetos y no se pueden distinguir inmediatamente).
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Diagrama esquemático que ilustra a grandes rasgos la técnica de Willis. Fuente: Gobierno de Santa Fe (Argentina), Ministerio de Salud, Secretaría de salud Pública Municipalidad de Rosario. Dirección de Servicios de Laboratorio y Análisis Clínicos, Bioq. Carlos Gómez. 4.5.2 TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN FORMALDEHIDO-ÉTER (Allen & Ridley) Principio La muestra de heces se trata con formaldehido, que preserva los parásitos presentes. Los residuos grumosos se eliminan por filtración. Los elementos grasos de la suspensión fecal se separan por extracción con éter (o acetato de etilo), seguido por centrifugación, lo que sedimenta los parásitos presentes. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Centrífuga ● Tubos de ensayo ● Gradilla ● Tubos de centrífuga ● Aplicadores de madera ● Filtro de alambre de latón, malla 40 (425 mm), 7,2 cm de diámetro (los coladores de café de nylon ofrecen una alternativa de bajo costo) ● Pequeño plato de porcelana o acero inoxidable o vaso de precipitados ● Pipeta Pasteur Método Preparación de cubreobjetos libres de grasa 1. Mezclar en un cilindro: 10 ml de etanol al 95% y 10 ml de éter. 2. Vierta la mezcla en una placa de Petri y se colocan 30 portaobjetos, uno por uno, agitar y dejar actuar durante 10 minutos. 3. Tome los cubreobjetos uno a uno y séquelos con una gasa. 4. Manténgalos en una placa de Petri seca. Los pasos anteriores se resumen en la figura. 4.104 (véase antes). ●, solución de formalina 10% (100 ml de formaldehido, solución al 37% en 900 ml de agua destilada) ● Éter (o acetato de etilo). Método 1. Mediante el uso de un aplicador de madera, extraer una pequeña cantidad (aproximadamente 0,5 g) de heces de la superficie y el interior de la muestra de heces. 2. Colocar la muestra en un tubo de centrífuga que contiene 7 ml de formalina al 10%.
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3. Emulsionar las heces en la formalina y filtrar en el plato. 4. Lave el filtro (con agua y jabón) y deseche los residuos con grumos. 5. Transferir el filtrado a un gran tubo de ensayo. Añadir 3 ml de éter (o acetato de etilo). 6. Tapar el tubo y mezclar bien. Sacudirlo mediante agitación. 7. Transferir la suspensión resultante de nuevo al tubo de centrífuga y se centrifuga a 2000 g durante 1 minuto. 8. Afloje el tapón graso con un aplicador y vierta el sobrenadante lejos de forma rápida invirtiendo el tubo (Fig. 4.105). 9. Colóquese de nuevo el tubo en la gradilla y déjese que el líquido de los lados del tubo escurra hasta el sedimento. Mézclese bien y transfiérase una gota con una pipeta Pasteur a un portaobjetos para examinarlo bajo un cubreobjetos. Hágase también una preparación teñida con yodo. 10. Utilícense los objetivos x10 y x40 para examinar la totalidad del cubreobjetos para los huevos y los quistes. Ahora es una práctica común llevar a cabo todos los pasos anteriores en una cabina de seguridad biológica. Si el sistema de extracción de la cabina no es a prueba de fuego, los pasos que involucran éter se deben hacer fuera del armario. El Acetato de etilo proporciona una alternativa menos inflamable al éter. PRECAUCIÓN El éter es un producto sumamente inflamable que se prende y explota rápidamente si hay una llama o una chispa en sus proximidades. Guárdense las latas o frascos abiertos en un estante abierto en la parte más fresca del laboratorio. Hay que cerciorarse de que las latas o las botellas estén tapadas. Nunca debe ponerse un recipiente abierto de éter dentro del frigorífico: los vapores se acumulan en el interior de éste, incluso cuando el recipiente está cerrado, y pueden explotar cuando se abre la puerta. No deben colocarse recipientes abiertos en un armario. Es preferible dejar el recipiente en un estante abierto de modo que los vapores puedan dispersarse sin dificultad.
Figura 4.105 Después de centrifugar la suspensión, afloje el tapón graso y descarte el sobrenadante.
AGREGADO: Los métodos de concentración para parásitos que se agregan a continuación constituyen una alternativa también usada en varios laboratorios de América Latina. MÉTODO FORMALINA-ÉTER (O FORMALINA ACETATO ETÍLICO) El procedimiento de concentración que se recomienda es el método formalinaéter (o formalina acetato etílico)1. Por este método pueden recuperarse todos los tipos de larvas y huevos de gusanos (áscaris, tenias, esquistosomas y otros huevos de trematodos), así como quistes de protozoos. Se recomienda para: No es adecuado para formas móviles de amebas y flagelados, puesto que son lábiles. 1 Si no se dispone de éter ni acetato etílico, puede usarse gasolina ordinaria en idénticas proporciones que el éter. El acetato etílico no es tan inflamable ni tan explosivo como el éter, por lo que resulta menos peligroso en el laboratorio. MATERIAL Y REACTIVOS 1. Varillas aplicadoras de madera. 2. Frascos, distribuidores o de plástico «exprimible», de 250 ml o 500 ml. Estos frascos son muy cómodos para añadir formalina a los tubos de la centrifugadora. Puede usarse también cualquier tipo de frasco o botella pequeña. 3. Centrifugadora, con cabezal y cubetas para alojar tubos cónicos de 15 ml. Deben usarse cubetas herméticamente cerradas. 4. Tubos de centrifugadora, 15 ml, cónicos (hágase una marca a 7 ml y 10 ml con un lápiz graso). 5. Torundas de algodón.
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6. Cubreobjetos. 7. Embudo. 8. Gasa quirúrgica. 9. Portaobjetos. 10. Pipetas Pasteur con perilla de goma. 11. Gradilla o soporte para los tubos. 12. Formalina, 10 %. Para el uso cotidiano, viértase parte de la solución en un frasco «exprimible». El frasco debe ir etiquetado. 13. Éter o acetato etílico. (Léase antes aclaración sobre otros líquidos que se pueden usar). 14. Yodo de Lugol, solución al 1 %, en un frasco distribuido con pipeta. 15. Solución salina, isotónica. TÉCNICA 1. Añádase 10 ml de formalina al 10 % a aproximadamente 1 g de heces y remuévase utilizando un palillo aplicador hasta obtener una suspensión ligeramente turbia. 2. Ajústese un filtro de gasa al embudo y colóquese éste sobre un tubo de centrifugadora. 3. Hágase pasar la suspensión fecal por el filtro dentro del tubo de centrifugadora hasta alcanzar la marca de los 7 ml. 4. Retírese el filtro o y tírese junto con el residuo sólido. 5. Añádanse 3 ml de éter o de acetato etílico y mézclese bien durante un minuto. 6. Vuélvase a verter en el tubo de centrifugadora y centrifúguese durante un minuto. El tubo debe presentar el mismo aspecto que en la ilustración. 7. Despéguese el tapón graso (residuo) con un palillo aplicador, y tírese el sobrenadante invirtiendo rápidamente el tubo. 8. Colóquese de nuevo el tubo en la gradilla y déjese que el líquido de los lados del tubo escurra hasta el sedimento. Mézclese bien y transfiérase una gota a un portaobjetos para examinarlo bajo un cubreobjetos. Hágase también una preparación teñido con yodo. 9. Utilícense los objetivos X10 y X40 para examinar todo el material que queda bajo el cubreobjetos en busca de huevos, quistes y larvas. EXAMEN DEL SEDIMENTO Las preparaciones de material concentrado deben examinarse del mismo modo que se ha descrito para las preparaciones húmedas directas. La preparación con solución salina (o sin teñir) debe examinarse de modo sistemático en busca de huevos, larvas y quistes. Si se observan quistes o estructuras que lo parecen, debe examinarse la preparación con yodo para hallar más detalles. Los microorganismos tendrán el mismo aspecto que se ha descrito en el caso de las preparaciones húmedas directas. En las preparaciones con solución salina concentradas con formalinaéter (o acetato etílico), los núcleos de los quistes quedan fijados y pueden resultar visibles. No obstante, las preparaciones húmedas con yodo deben examinarse para alcanzar una identificación más fiable.
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13 y 14 1) Materiales y reactivos utilizados. 2) Añádase 10 ml de formalina al 10 % a aproximadamente 1 g de heces y remuévase utilizando un palillo aplicador hasta obtener una suspensión ligeramente turbia. O agregue en el fondo del frasco un volumen de muestra previamente homogeneizada en otro frasco. 3) Filtre a través de dos capas de gasa en un tubo para centrifugación graduado. Retire el filtro de gasas junto con el residuo sólido que queda en ella luego de haber filtrado. Los pasos 4), 5) y 6) son alternativos y opcionales. 4) Centrifugue el tubo con el filtrado y luego de centrifugado sáquelo y descarte el sobrenadante dejando el sedimento en el fondo del tubo 5) Añada de solución de formaldehido al sedimento. 6) Revuelva bien la mezcla y déjela reposar 5 minutos. 7) Añádanse 3 ml de éter o de acetato etílico (en últimos casos, gasolina) y mézclese bien durante un minuto. Importante: Cerciórese de que en laboratorio no hay ningún aparato con llama encendido. 8) Tapone el tubo. Vuélvalo sobre un lado y agítelo vigorosamente durante 30 segundos. 9) Vuélvase a verter en el tubo de centrifugadora y centrifúguese durante un minuto. El tubo debe presentar el mismo aspecto que en la ilustración. Retire el tapón con cuidado. Centrifugue durante 1 minuto a baja velocidad. En el interior del tubo se formarán cuatro capas: — 1a capa: éter — 2a capa: residuos — 3a capa: solución de formaldehido — 4a capa: el sedimento, con huevos y quistes de parásitos. (Véase también la figura 10, donde se observan claramente las capas). 11) Fig. 4.105 anterior, siga los mismos procedimientos: Después de centrifugar la suspensión, afloje el tapón graso y descarte el sobrenadante. Es decir, despéguese el tapón graso (residuo) con un palillo aplicador, y tírese el sobrenadante invirtiendo rápidamente el tubo. Colóquese de nuevo el tubo en la gradilla y déjese que el líquido de los lados del tubo escurra hasta el sedimento. 12) Mezcle muy bien el líquido restante con el sedimento golpeando suavemente el tubo (resuspender). 13) Deposite dos gotas del sedimento en un portaobjetos. Añada una pequeña gota de solución yodada únicamente a la segunda gota del sedimento. 14) Coloque cubreobjetos sobre ambas gotas. Examínelas con el microscopio. Preparación 1 (sin tinción): utilice objetivos x 10 y x 40 (para buscar huevos y larvas). Preparación 2 (teñida): utilice el objetivo x 40 (para buscar quistes). Utilícense los objetivos X10 y X40 para examinar todo el material que queda bajo el cubreobjetos en busca de huevos, quistes y larvas. MÉTODO DE CONCENTRACIÓN DE TELEMANN MODIFICADO Es una técnica de sedimentación en la cual se utiliza una solución salina de menor densidad mayor a la de los parásitos para que estos se concentren en el sedimento. La presencia de parásitos hace que este método sea de elección, pues es de menor costo, mayor rendimiento y de rápido procedimiento. • Este examen parasitológico de deposiciones puede ser seriado o de solo una muestra. • Se utiliza para el diagnostico de urgencia, frente a cuadros diarreicos y disentéricos en niños y adultos, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Materiales Solución salina formolada al 5 % • Gasas • Embudo • Frasco tapa rosca. • Tubos de centrifuga • Pipetas Pasteur • Portaobjetos • Cubreobjetos • Varillas de vidrio. • Éter • Solución de lugol. • Microscopio. • Centrifuga Preparación de soluciones
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Solución salina formolada al 5 % • Cloruro de sodio 8.5 9.0 g • Formol 40 % 50 ml. • Agua destilada 1000 ml. Solución de lugol • Ioduro de potasio 10g • Iodo metálico bisublimado 5.0 g • Agua destilada 100ml. Procedimiento • Homogeneizar con varilla de vidrio las heces fijadas en solución formolada. • Filtrar a través de un embudo con una doble gasa en tubo de centrifuga. • Agregar aprox. 2 ml de éter. • Centrifugar a 1000 1500 rpm durante 3 a 5 min. • Eliminar con golpe seco el sobrenadante. • Tomar con pipeta Pasteur una pequeña cantidad del sedimento y colocar en portaobjeto. • Agregar una gota de lugol y sellar con un cubreobjeto. Fuente: Telemann W. Eine methode zur erleichterung der auffindung von parasiteneiern in den faeces. Deutsche Medizinische Wochenschrift 35:1510 – 1511. MÉTODO DE TELEMAN ORIGINAL FUNDAMENTO En 1908, Telemann describe su método, el cual es modificado por Rivas en 1928, quien cambio el ácido clorhídrico por ácido acético. En esta sección se describirá el original. La utilidad es para concentración de huevos, quistes y larvas, sobre todo aquellas muestras que tienen elevadas concentraciones de grasas neutras y ácidos grasos libres. MATERIAL Reactivos · Éter etílico · Ácido clorhídrico concentrado · Agua destilada Soluciones · Solución de ácido clorhídrico al 15% Vidriería · Vaso de precipitado · Tubos cónicos · Pipeta Pasteur · Portaobjetos · Cubreobjetos Aparatos · Microscopio compuesto · Centrifuga Otros · Aplicadores · Tapón de goma o caucho · Gasa o algodón · Bulbo de goma · Gradilla MÉTODO 1. Se coloca un fragmento de heces del tamaño de un fríjol (aprox. 1 g) 2. Se le agrega en el vaso de precipitados ácido clorhídrico al 15%, y se homogeneiza con el aplicador cuidadosamente 3. Se pasa la suspensión por dos capas de gasa o algodón previamente humedecido. 4. Se añade éter en cantidades iguales y se coloca un tapón de caucho o se tapa con el pulgar. 5. Se agita vigorosamente y se afloja el tapón o el dedo para disminuir la presión y se destapa. 6. Se centrifuga a 1500 rpm durante 1 minuto. 7. Se saca de la centrifuga y se observan cuatro capas: 1) Éter; 2) Tapón de restos fecales; 3) Capa de ácido; 4) Sedimento inferior que contiene la forma parasitaria. 8. Se mantiene en el tubo horizontal y con un aplicador de madera y con un movimiento circular, se despega el tapón de restos fecales. 9. Rápidamente, pero con cuidado se vierten el éter, tapón y capa de asido, de manera que quede el sedimento en el tubo. 10. Se mantiene el tubo en posición horizontal, para evitar que los restos de extracto graso y de tapón fecal bajen por las paredes al sedimento. 11. Se introduce un aplicador con hisopo de algodón y se limpian las paredes del tubo. 12. Con el tubo vertical, se toma parte del sedimento con una pipeta. 13. Se coloca en un portaobjetos y se coloca encima el cubreobjetos. 14. Se examina con el microscopio con los objetivos 10X y 40X. 4.5.3 TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN FORMALDEHIDO-DETERGENTE Principio La técnica de sedimentación formaldehidodetergente es un método de sedimentación cuantitativo barato, seguro y simple en el que una cantidad medida de heces se mezcla en una solución de formaldehidodetergente de baja gravedad específica. La suspensión se tamiza y se deja inalterada
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para permitir que los huevos sedimenten bajo su propio peso. El detergente "borra" los desechos fecales en un corto tiempo. Después de la sedimentación y del borrado de los desechos fecales, la pequeña cantidad de sedimento fino que se forma se examina bajo el microscopio en busca de huevos, y los huevos se cuentan para dar un resultado cuantitativo. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Kit comercial de ensayo, que consiste en un recipiente de base cónica, un colador de plástico, una Pipeta Pasteur, un vaso de precipitados y un detergente comercial, diluido 1:50 con agua destilada ● Solución de formalina al 2% (preparada mediante la dilución de formaldehido, solución al 37% 1:50 con agua destilada). Método Los detalles del método que se suministra con el kit son los siguientes: 1. Llene el recipiente de base cónica en la marca de 10 ml con 2% de detergente en el 2% de formalina. 2. Use la cuchara unida a la tapa del recipiente, transfiera aproximadamente 350 mg de heces al recipiente y mezclar bien en la solución de formaldehidodetergente. 3. Usando el filtro de plástico, colar la suspensión en el vaso de precipitados suministrado con el kit (fig. 4.106). Enjuague el recipiente y luego añadir al filtrado. 4. Coloque el recipiente en posición vertical en el bastidor provisto y dejar actuar durante 1 hora (no centrifugar). En condiciones de campo, las heces emulsionadas pueden ser transportadas al laboratorio para su análisis. Los huevos de esquistosomas son fijados y no se distorsionan. 5. Retire cuidadosamente y deseche el fluido sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento que se ha formado en la base del recipiente (fig. 4.107). 6. Añadir 10 ml de la solución de formaldehidodetergente; mezclar y dejar sedimentar durante 1 hora más. Además, se lleva a cabo la limpieza de los restos fecales. 7. Retire y deseche el líquido sobrenadante, dejando aproximadamente 0,5 ml de sedimento fino. 8. Usando la pipeta Pasteur, transferir todo el sedimento a un portaobjetos y cubra con un cubreobjetos de 22 mm x 40 mm (suministrado con el kit) (fig. 4.108). 9. Examine toda la preparación en el microscopio, utilizando el objetivo x10 con el diafragma del condensador cerrado lo suficiente como para dar un buen contraste. Contar todos los huevos presentes y multiplicar el número por 3 para obtener el número aproximado por gramo de heces. Nota: Si no se retira el líquido sobrenadante después de 1 hora, pero en su lugar se añaden 10 ml de reactivo y la suspensión se vuelve a mezclar y se deja sedimentar durante la noche, los huevos, quistes y larvas de otros parásitos se sedimentan. La técnica es especialmente útil en los laboratorios sin las instalaciones para llevar a cabo la técnica de sedimentación formaldehido-éter. La formalina conserva los parásitos sin distorsionar su morfología.
Figura 4.106 Agotar la suspensión. Figura 4.107 Extracción del sobrenadante.
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Figura 4.108 Transferir el sedimento a un portaobjetos.
4.5.4 TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN PARA LAS LARVAS DE STRONGYLOIDES STERCORALIS (HARADA-MORI) PRINCIPIO Las larvas de Strongyloides que se encuentran en las heces fecales se desplazan contra la corriente de agua que, por movimiento capilar, asciende por una tira de papel de filtro que se ha sumergido parcialmente en un tubo de ensayo que contiene agua, y se acumulan en el fondo del tubo. El método de Harada y Mori se basa en la identificación microscópica de larvas de nematodos que emergen de muestras fecales cultivadas en papel de filtro en tubos de ensayo. El procedimiento es especialmente útil en el diagnóstico de infecciones humanas por S. stercoralis, Necator americanus, A. duodenale y Trychostrongylus sp., así como para identificación específica. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Cinta adhesiva ● Tubos de ensayo (de 20 x 200 mm ó 18 x 180 mm) ● Gradilla ● Tiras de papel de filtro (30 mm x 150 mm) ● Espátula ● Yodo Lugol, solución al 0,5% (reactivo. N º 37). ● Agua destilada o hervida ● Pipeta capilar Método (a) Extienda con la espátula una pequeña cantidad de la muestra de heces a lo largo de una tira de papel de filtro (que previamente se habrá doblado a lo largo para mantenerla recta), dejando limpios los últimos 4 ó 5 cm para sumergirlos en agua. (b) Introduzca la tira de filtro de papel, por el extremo limpio, en un tubo de ensayo que contenga 2,53 cm de agua filtrada, destilada o hervida; el extremo de la tira no deberá tocar el fondo del tubo (doble la tira en la parte superior para que el fondo no toque el fondo del tubo). (c) Marque en el tubo el número o el nombre del paciente en forma indeleble. (d) Conserve el tubo durante 78 días a la temperatura ambiente, protegido con un tapón de algodón o, aún mejor, sellado con cinta adhesiva. (e) Busque las larvas que pueda haber en el fondo del tubo y examínelas después de tratarlas con solución yodada para poder distinguir las de Strongyloides y las de Ancylostoma. Teñir con solución de yodo durante 1 minuto y luego examinar bajo el microscopio, con el objetivo x10. Nota: Las larvas de Strongyloides pueden llegar a la etapa infectante en estas condiciones, produciendo larvas filariformes, o convertirse en helmintos adultos. Las larvas que generalmente se observan en las muestras de heces frescas son las larvas rabditiformes de S. stercoralis (primera etapa). Sin embargo, si se pasa la materia fecal más de 12 horas antes, las larvas pueden haber nacido en larvas filariformes (etapa infecciosa). Estos deben estar de diferenciarse de las larvas de Ancylostoma duodenale y Necator americanus (anquilostoma, uncinaria), que también puede eclosionar en las heces 1224 horas después del pasaje. La aparición de larvas filariformes de S. stercoralis puede indicar una hiperinfección sistémica. El primordio genital será más visible en las preparaciones teñidas con yodo. El yodo mata las larvas y hace que las características morfológicas de éstas sean más fáciles de ver. Usted tendrá que utilizar el objetivo de x40 para ver estas estructuras. ● Si usted ve una larva con una apertura bucal corta y un primordio genital prominente (claramente visible), es S. stercoralis. ● Si usted ve una larva con una apertura larga de la boca y no ve un primordio genital, es A. duodenale o N. americanus. Las principales características distintivas de las larvas de S. stercoralis y A. duodenale o N. americanus se resumen en la Tabla 4.6 y se ilustra en la figura. 4.109. Comentarios: 1. Si las larvas son demasiado activas para observar al microscopio pueden ser matadas por calentamiento, Lugol o formol. 2. Los huevos de Necator americanus en las heces mueren en 24 horas al ser conservados a 0 ºC. Por este motivo las muestras fecales para ser examinadas por este método deben ser
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mantenidas hasta el momento del examen a 10 – 25 ºC en condiciones óptimas de humedad. 3. Un extendido fecal grueso en la cinta de papel puede resultar en una disminución en la media de eclosión. 4. Si los extendidos quedan inmersos en el agua, aunque sea parcialmente, proliferan bacterias y levaduras, con una consecuente deficiencia de oxígeno disuelto. Las larvas emergentes mueren y la detección resulta imposible. 5. Si se usan pequeñas cantidades de agua, emergen pocas larvas debido a la desecación.
AGREGADO TÉCNICA ALTERNATIVA Esta técnica alternativa es la misma que la anterior pero con modificaciones pequeñas. 1. Preparar una cinta de papel de filtro. 2. Esparcir 0,5 g de heces frescas en el papel de filtro, formando un extendido fecal fino y uniforme en uno de los lados de la cinta, excepto en las áreas de 4 cm distante de ambas extremidades. 3. Introducir la cinta de papel de filtro en un tubo de ensayo de 18 x 180 mm conteniendo 4 a 5 ml de agua destilada, de manera que el agua no entre en contacto con las heces. 4. Cerrar el tubo con un tapón de goma, conservándolo en posición vertical durante 10 a 14 días a temperatura de 25 – 30 ºC. 5. Agregar agua para mantener el nivel original. Chequear diariamente el fluido del fondo del tubo. 6. Al final del período de incubación colectar con una pipeta capilar larga el agua del fondo del tubo con el fin de observar si existen larvas filariformes, o examinar en microscopio invertido. 7. En caso positivo, retirar la tapa y el papel de filtro del tubo y examinar el fluido con objetivo de 10 X. 8. Examinar la movilidad y las características morfológicas de las larvas para determinar la especie. Fuentes: Harada U, Mori OA. 1955 A new method for culturing hookworm. Yonago Acta Med 1: 177 – 179. IV Curso de Metodología en el Diagnóstico de Enteroparásitos Tabla 4.6 Características de las larvas de Strongyloides stercoralis y Ancylostoma duodenale o Necator americanus Etapa larval S. stercoralis A. duodenale o N. americanus Cavidad bucal corta Cavidad bucal larga (15 µm) (4 µm) (½ eritrocito) Esófago de un tercio de la Esófago de un tercio de la longitud longitud corporal con 2 corporal con 2 ensanchamientos ensanchamientos Rabditiforme o rabditoide Primordio genital grande y notable Primordio genital pequeño (7 µm) (22 µm) Poro anal a 50 µm del extremo Poro anal a 80 µm del extremo posterior posterior Tamaño 200-500 µm x 15-20 µm Tamaño 200-500 µm x 14-20 µm Desenvainada Envainada Filariforme Cola bifurcada o roma cola afilada (aguda) Extremo posterior ligeramente agudo Extremo posterior agudo Esófago de un tercio de la Esófago de la mitad de la longitud longitud corporal sin corporal sin ensanchamiento ensanchamiento Cuando existen dos ensanchamientos esofágicos, las larvas se denominan rabditoides
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Figura 4.109 Características para la identificación de las larvas de Strongyloides stercoralis y Ancylostoma duodenale o Necator americanus M: boca, O: esófago; GR: rudimento genital; AP: poro anal 4.6 PRUEBA QUÍMICA PARA SANGRE OCULTA EN MATERIA FECAL (SOMF) Esta prueba se utiliza para el tamizado y la detección de infección por parásitos, por ejemplo la esquistosomiasis intestinal, o para la detección de la hemorragia en el intestino causada por pólipos, tumores o inflamación. Originalmente fue desarrollado utilizando bencidina. Sin embargo, ya no se recomienda el uso de bencidina, ya que se ha demostrado que es cancerígena. Nota: Precauciones para el paciente Durante un día entero, antes del examen, el paciente no deberá: Comer cualquier tipo de carne; Tomar ningún medicamento que contienen compuestos a base de hierro; Cepillar sus dientes con fuerza. Precauciones de laboratorio Los utensilios de vidrio deben estar limpios (sin residuos de sangre). Se debe observar el resultado antes de que transcurran 5 minutos. Se pueden realizar ensayos testigos: — negativos: con agua destilada — positivos: con agua que contenga 1% de sangre. 4.6.1 Principio Cuando la hemoglobina de la sangre se pone en contacto con peróxido de hidrogeno se libera oxígeno. Este oxígeno liberado reacciona con aminofenazona (aminopirina) y se forma una coloración azul. 4.6.2 Materiales y reactivos — Una centrífuga — Tubos cónicos para centrifugación — Aplicadores — Una probeta de 20 ml — Tubos de ensayo — Acido acético al 10% (reactivo No. 2) — Peróxido de hidrógeno (solución fresca, de 10 vol.) — Etanol al 95% — Aminofenazona cristalina. — Gradilla — Tubo de control positivo (que contiene una solución al 1% de la sangre en agua) — Tubo de control negativo (con agua destilada) Nota: El material de vidrio utilizado para la prueba debe estar limpia, sin rastros de sangre (ver sección 3.5.1). 4.6.3 Método 1. Inmediatamente antes de llevar a cabo el ensayo prepare una solución de aminofenazona como se indica a continuación: — ponga alrededor de 0,25 g de aminofenazona en el fondo de un tubo de ensayo — añada 5 ml de etanol al 95%.
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2. Coloque una porción de la muestra de heces fecales de 4 ml (4 cm3) aproximadamente en un tubo para centrifugación. 3. Agregue 7 ml de agua destilada y mézclela completamente (Fig. 4.110). 4. Centrifúguese a baja velocidad (1000g) aproximadamente durante 5 minutos, o hasta que se precipiten los sólidos (se puede emplear una centrífuga manual). 5. Decante el líquido flotante en otro tubo de ensayo y consérvelo. 6. Añada al tubo de ensayo que contiene el líquido flotante, sin mezclar: — 10 gotas de ácido acético al 10% — 5 ml de la solución de aminofenazona. Para evitar que se mezclen ponga la solución de aminofenazona con una pipeta deslizándola por la pared interior del tubo de ensayo. 7. A continuación agregue: — 10 gotas de la solución de peróxido de hidrógeno de 10 vol. No se mezcle. Déjela reposar un minuto. Se debe observar el resultado antes de que transcurran 5 minutos luego de la adición de la solución de peróxido de hidrógeno. 4.6.4 Resultados Reacción positiva Entre las dos capas de líquido aparece una coloración azul (Fig. 4.111). Informe los resultados como sigue: — azul pálido = reacción positiva + — azul oscuro = reacción positiva intensa ++ — azul negruzco = reacción positiva sumamente intensa +++. Reacción negativa No ocurre cambio alguno en el color.
A
B
C
D
E
F
G
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Ilustraciones anexas A, B, C, D, E, F, G. A) Materiales y reactivos. B) Preparación una solución de aminofenazona. C) Coloque una porción de la muestra de heces fecales de 4 m (4 cm3) aproximadamente en un tubo para centrifugación. Figura 4.110 La mezcla de la muestra de las heces con agua destilada. D) Centrifugar. E) Decante el líquido flotante en otro tubo de ensayo y consérvelo. F) Añada al tubo de ensayo que contiene el líquido flotante, sin mezclar: 10 gotas de ácido acético al 10%, 5 ml de la solución de aminofenazona. Para evitar que se mezclen ponga la solución de aminofenazona con una pipeta deslizándola por la pared interior del tubo de ensayo. G) Agregue: 10 gotas de la solución de peróxido de hidrógeno de 10 vol. Figura 4.111 Análisis químico de la sangre oculta en las heces a: Reacción positiva; b: reacción negativa. 4.7 LOS PARÁSITOS DE LA SANGRE Y DE LA PIEL Los parásitos que pasan toda o parte de su ciclo vital en la sangre o los tejidos se conocen como hemoparásitos. Ellos incluyen: Las especies pertenecientes a los géneros Brugia, Dirofilaria, Loa, Mansonella, Meningonema, Onchocerca y Wuchereria responsable de la filariasis; Trypanosoma spp. responsable de la tripanosomiasis; Plasmodium spp. responsable de la malaria. La infección por estos parásitos y Borrelia spp. se puede diagnosticar mediante un examen de las muestras de sangre teñidas bajo el microscopio. 4.7.1 FILARIAE Hay muchas especies de filarias, pero la mayoría son parásitos de animales y raramente afectan a los seres humanos. Sólo ocho especies de filarias se han adaptado a seres humanos, y son transmisibles entre ellos. De éstos, el más importante es subperiódica Brugia malayi. Las filarias habitan en el sistema linfático. Las larvas de los gusanos adultos las microfilarias invadir la sangre, y pueden ser identificados en un frotis de sangre. Las microfilarias de Onchocerca volvulus están normalmente limitadas a la piel (ver más abajo), pero a veces migran a los ojos (que pueden dar lugar a ceguera), las que también se pueden encontrar en la sangre. Las principales manifestaciones clínicas de la filariasis linfática son linfadenopatía y linfangitis. Los ataques de linfadenopatía que duran varios días se producen a intervalos regulares, con dolor de cabeza, náuseas, tumefacción de una pierna, abscesos hidrocele y abcesos estériles. En los casos avanzados, la elefantiasis de las extremidades inferiores puede ocurrir debido a la obstrucción de la circulación linfática. La elefantiasis del escroto, tal como se ve en la filariasis de Bancroft (causada por Wuchereria bancrofti), es poco común en la filariasis por Brugia (causada por Brugia malayi). Las infecciones en las poblaciones en las regiones donde la filariasis de Bancroft y Brugia son endémicas pueden permanecer asintomáticas. Las microfilarias de las siguientes especies se encuentran en la sangre humana: Brugia malayi, Brugia timori, Loa loa, Mansonella perstans1, Mansonella ozzardi y Wuchereria bancrofti. 1Anteriormente conocido como Dipetalonema perstans. Las infecciones por Loa loa entre las poblaciones de las zonas donde es endémica a menudo son asintomáticos. Los no residentes que visitan estas áreas son susceptibles a la infección sintomática. La infección inicial se caracteriza por una tumefacción transitoria, localizada, subcutánea, conocida como un "tumefacción de Calabar". Los gusanos adultos pueden migrar a través de la conjuntiva de los ojos, causando la inflamación, pero la infección no causa ceguera. La infección crónica puede llevar a complicaciones como la enfermedad renal, encefalopatía y cardiomiopatía. Las infecciones con Mansonella perstans generalmente parecen ser asintomáticas, pero se han asociado con prurito, dolor abdominal, tumefacción tipo Calabar y urticaria (véase más arriba). Las infecciones con Mansonella ozzardi también son generalmente asintomáticas, pero se han asociado con linfadenopatía, prurito, fiebre y dolores en las rodillas y los tobillos. Las microfilarias son transmitidas por mosquitos comunes, moscas y jejenes, que se alimentan de la sangre de los seres humanos infectados. Las microfilarias se desarrollan en larvas que invaden las piezas bucales de los insectos. ONCOCERCOSIS La oncocercosis (ceguera de los ríos) es una enfermedad parasitaria causada por el helminto Onchocerca volvulus. Los machos y las hembras de este parásito habitan en los tejidos subcutáneos del hombre, apiñados en nódulos. Las hembras depositan larvas (microfilarias) que emigran por debajo de la piel. La oncocercosis prevalece en las regiones tropicales de África y diversas partes de Arabia, Mesoamérica y Sudamérica. La transmite una pequeña mosca negra, Simulium. EL EXAMEN DE LA PIEL DE MICROFILARIAS DE ONCHOCERCA VOLVULUS
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Se utiliza una muestra sumamente pequeña de la piel del paciente. Para observar las microfilarias, que se encuentran dotadas de gran movilidad, se examinan en una preparación húmeda, entre un portaobjetos y un cubreobjetos, por medio del microscopio. MATERIALES Y REACTIVOS ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Pipeta Pasteur ● Aguja (para inyección intramuscular o subcutánea), de calibre 22 ● Bisturí u hoja de afeitar ● cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53) ● Etanol al 70%
Especies Brugia malayi Brugia timori Loa loa Mansonella ozzardi Mansonella perstans Onchocerca volvulus Wuchereria bancrofti
Tabla 4.7 Distribución geográfica de las filarias Distribución geográfica Asia Partes de Indonesia África occidental y central América del Sur, Central y el Caribe África Occidental, América del Sur y Central África tropical, América Central y del Sur, partes de Arabia Endémica en muchos países tropicales
MÉTODO SITIOS DE DONDE SE DEBE OBTENER LA MUESTRA Búsqueda de nódulos (ver Fig. 4.112): a) En pacientes con nódulos Búsquense los nódulos: — en el tórax (sobre las costillas) (1); — en las caderas (2); — en las piernas (tibia) (3); — en la espalda (sobre los omoplatos) (4). Los nódulos son redondos y duros, de 1—5 cm de diámetro; cuando se empujan con la yema del dedo se deslizan por debajo de la piel. Tómese la muestra de piel en el centro del nódulo. b) En pacientes que no presenten nódulos: Tómese la muestra de piel de: — la parte alta de las posaderas (el área superior externa, donde se aplican las inyecciones intramusculares, (1 en la Fig. 4.113); Si los resultados del examen son negativos, tómense muestras de: — la pantorrilla (área superior externa), (2 en la Fig. 4.113); — la espalda (en el centro de los omoplatos) (3 en la Fig. 4.113); Se recomienda que se examinen 6 muestras (2 de las posaderas, 2 de las pantorrillas y 2 de los omoplatos) antes de notificar un resultado negativo. OBTENCION DE LA MUESTRA a) Preparativos 1. Flamee en etanol el bisturí (o la hoja de afeitar) y la aguja. 2. Coloque una gota de solución de cloruro sódico en un portaobjetos. 3. Desinfecte la piel del área escogida con un cojincillo de gasa humedecido con etanol. b) Método 1. Con la mano izquierda perfore la piel introduciendo la punta de la aguja hasta una profundidad de 2 ó 3 mm. 2. Estire la piel separándola de los demás tejidos con la punta de la aguja (Fig. 4.114). 3. Con la mano derecha coloque el filo de la hoja del bisturí o de la hoja de afeitar sobre la piel estirada, por arriba de la punta de la hoja (véase Fig. 4.115). 4. Corte, con un golpe rápido, la pieza de piel estirada por la punta de la aguja, tan cerca de ésta como sea posible (Fig. 4.116). La muestra deberá tener aproximadamente este tamaño: (2 3 mm) La muestra deberá quedar adherida a la punta de la aguja. No deberá estar manchada con sangre; en la biopsia no se deberá encontrar sangre alguna. 5. Deposite el fragmento de piel en la gota de solución de cloruro sódico que se encontrará en el portaobjetos (utilizando el bisturí o la hoja de afeitar, si es necesario). No aplaste la muestra; si solo hay una microfilaria se puede dañar. 6. Proteja la muestra con un cubreobjetos. Si alguna parte de ella no está en contacto con el líquido añada más solución introduciéndola por debajo del cubreobjetos con una pipeta de Pasteur hasta que toda el área que abarque el cubreobjetos esté bañada por el líquido. 7. Espere de 2—3 minutos. Mientras tanto limpie con etanol el área de donde se ha tomado la muestra. Aplique un apósito adhesivo. Toma de muestras en el campo Si no se dispone de microscopio, o durante los estudios epidemiológicos masivos: 1. Coloque el trozo de piel en un pequeño frasco que contiene 2 ml de solución de cloruro de sodio. 2. Espere 15 minutos para que las microfilarias dejen la piel.
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3. Fijar la muestra mediante la adición de 2 ml de solución al 10% de formaldehido (Reactivo. N º 28). Mezclar y colocar la tapa en el frasco. 4. Cuando regrese al laboratorio, agite bien el envase. Centrifugar el líquido (después de retirar la pieza de piel) a velocidad media (2000 g) durante 5 minutos. 5. Transferir el depósito del tubo de centrífuga a un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos. Examen microscópico Utilice el objetivo x 10 con escasa abertura del condensador. Examine las orillas de la muestra de piel. Se observarán las microfilarias tratando de salir al líquido de cloruro de sodio (Fig. 4.117). Poseen gran movilidad. Las microfilarias de Onchocerca volvulus tienen las siguientes características: Longitud: 200—315 µm Anchura: 5 9 µm (la misma de un eritrocito) Curvatura del cuerpo: casi angular Extremo anterior: ligeramente más ancho Cola: curva y delgada. Cuando la muestra contenga muy escasas microfilarias o si no surgen microfilarias espérese 10 minutos. Si no aparecen las microfilarias véase dentro del fragmento de piel; observando a través de este se podrá ver una microfilaria en movimiento. Si tiene alguna duda, tome una muestra de sangre fresca en el dedo del paciente y preparar un frotis en un portaobjetos. Cubrir con un cubreobjetos y examinarlo bajo el microscopio. Si ve alguna microfilaria, preparar un frotis teñido de piel (ver abajo) y un frotis de gota gruesa de sangre teñida (véase más adelante) para identificar la especie. Si las microfilarias están presentes, serán claramente visibles. La tinción no es necesaria en este caso, ya que las microfilarias se pueden identificar por sus curvas angulares características. Procedimiento para teñir la muestra En un portaobjetos se prepara un frotis macerando la muestra de piel. Se fija por medio de metanol y se tiñe con colorante de Giemsa (véase más adelante).Las microfilarias de Onchocerca volvulus poseen las características siguientes (Fig. 4.118): — carecen de envoltura — su extremo anterior es ancho — las curvas del cuerpo son rígidas — la cola se afila gradualmente y termina en una curva señalada — contienen grandes núcleos ovales, que se alargan y se tiñen de negro azulado; se encuentran claramente separados y no llegan hasta la punta de la cola. Otra microfilaria que se puede encontrar en biopsias de piel Mansonella streptocerca causa una dermatitis con picor en la zona infectada. Este helminto, sumamente raro, puede no ser patógeno. Sus microfilarias se encuentran en la piel y difieren de las de Onchocerca volvulus en las siguientes características (Fig. 4.119): — es menos ancha (5 6 µm, equivalente a 1/2 eritrocito) es menos larga (180–240 µm); — el extremo anterior no está ensanchado; — la cola termina en un gancho romo; — los núcleos son más pequeños y llegan hasta la punta de la cola
A
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C
B
D
E
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F
A) Materiales y reactivos. Figura 4.112 Sitios para la recolección de muestras de piel mediante hendidura de pacientes con nódulos 1: tórax (sobre las costillas); 2: caderas; 3: piernas (tibia); 4: espalda (sobre los omóplatos). Figura 4.113 Sitios para la recolección de muestras de piel mediante hendidura de los pacientes sin nódulos 1: parte superior de las nalgas; 2: pantorrillas (parte superior externa); 3: espalda (en el centro de los omóplatos). B) Flamee en etanol el bisturí (o la hoja de afeitar) y la aguja. Coloque una gota de solución de cloruro sódico en un portaobjetos. C) Con la mano izquierda perfore la piel introduciendo la punta de la aguja hasta una profundidad de 2 ó 3 mm. Figura 4.114 Elevación de la piel con una aguja. Figura 4.115 Coloque la hoja por encima del punto de la aguja. Figura 4.116 La toma de una muestra de piel mediante hendidura. D) Deposite el fragmento de piel en la gota de solución de cloruro sódico que se encontrará en el portaobjetos. E) Proteja la muestra con un cubreobjetos. Si alguna parte de ella no está en contacto con el líquido añada más solución introduciéndola por debajo del cubreobjetos con una pipeta de Pasteur hasta que toda el área que abarque el cubreobjetos esté bañada por el líquido. F) Espere de 2—3 minutos. Figura 4.117 Microfilarias de Onchocerca volvulus en preparación húmeda. Figura 4.118 Microfilarias de Onchocerca volvulus en frotis teñido con Giemsa. Figura 4.119 Microfilaria de Mansonella streptocerca en preparación húmeda. Recolección de muestras en el campo
A
B
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C D A) Cuando no se disponga de un microscopio o se esté llevando a cabo una encuesta epidemiológica amplia: 1. Coloque la muestra de piel en un pequeño frasco de penicilina que contenga 2 ml de solución de cloruro sódico. 2. Espere 15 minutos a que las microfilarias salgan de la muestra de piel. B) Cuando hayan transcurrido los 15 minutos fije la preparación añadiendo 2 ml de solución de formaldehido al 10%. Mezcle y cambie el tapón del frasco. Esta preparación se puede conservar durante varios meses. C) Al volver al laboratorio agite bien el frasco. Centrifugue el liquido (después de haber sacado de éste la muestra de piel) a velocidad media (o utilice una centrífuga manual). D) Examine con el microscopio el sedimento que se haya formado en el tubo para centrifugación, entre un portaobjetos y un cubreobjetos. Las microfilarias muertas son claramente visibles sin tinción, con sus curvas angulosas características. PROCEDIMIENTOS RECOMENDADOS PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE MICROFILARIAS EN LA SANGRE
Las microfilarias de algunas especies (por ejemplo, Loa loa) y la cepa más común de Brugia malayi aparece en la sangre con una periodicidad nocturna o diurna notable (Tabla 4.8). Otras especies y cepas de B. malayi no muestran el mismo grado de periodicidad, son subperiódicas nocturnas o subperiódicas diurnas (por ejemplo Wuchereria bancrofti). Otras especies no muestran periodicidad (por ejemplo, Mansonella ozzardi). Los tiempos para la recogida de muestras de sangre deben ser seleccionados de acuerdo con los síntomas clínicos del paciente y el historial de viajes. La Tabla 4.9 muestra los tiempos recomendados para la recogida de muestras de sangre para la prueba de las especies periódicas y subperiódicas de microfilarias. Nota: A pesar que las microfilarias no son directamente infecciosas para los seres humanos, todos los especímenes patológicos deben ser tratados como potencialmente peligrosos. Un mínimo de un espécimen de "sangre de día" (tomado alrededor de las 13:00) y una muestra de "sangre de noche" (tomada alrededor de las 24:00) deben ser examinados. Esto suele ser suficiente para detectar infecciones e infecciones mixtas con cepas subperiódicas. Una muestra de sangre para microfilarias se examina mejor inmediatamente. Si una muestra de "sangre de noche" no será examinada hasta la mañana siguiente, déjela a temperatura ambiente. Para cada muestra, recoger 510 ml de sangre en una solución de 2% de citrato trisódico en solución salina (reactivo. 59) o heparina como anticoagulante. Las muestras directas por punción digital pueden dar resultados adecuados en las zonas donde la filariasis es endémica. EL EXAMEN MICROSCÓPICO DE LA SANGRE CAPILAR Este examen se debe llevar a cabo a la hora que resulta más conveniente. Algunas especies de microfilarias solo aparecen en la sangre durante la noche y otras lo hacen en el día. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Lancetas para extraer sangre ● Hisopos de algodón ● cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53) ● Etanol al 70%. Método 1. Desinfecte con etanol el dedo que se va a puncionar. Escoja el dedo cordial. Séquese completamente. Puncione con la lanceta. 2. Recoja la primera gota de sangre (contiene más microfilarias) directamente en la porción media del portaobjetos (Fig. 4.120). 3. Añada una gota igual de solución de cloruro sódico. 4. Mezcle la sangre y la solución de cloruro sódico con la esquina de un cubreobjetos. Coloque este sobre la preparación. 5. En otro portaobjetos prepare dos gotas gruesas de sangre empleando otras 2 gotas más de sangre que servirán para identificar ¡as microfilarias teñidas. Examine en el microscopio el frotis fresco, de manera ordenada y minuciosa (usando el objetivo x 10 con escasa abertura del condensador). El primer indicio de la presencia de microfilarias es un rápido movimiento entre los glóbulos rojos.
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6. Para identificar las especies de microfilarias, preparar dos frotis en otro portaobjetos con dos gotas más de sangre y tíñalos como se indica más adelante.
Características
B. malayi
B. timori
L. loa
M. ozzardi
Distribución geográfica
Asia sudoriental, India Subcontinente indio
Islas,Lesser Sunda Timor
África Central y Occidental
Vectores
Mosquitos (Anopheles y Mansonia spp.)
Mosquitos (Anopheles spp.)
Tábanos jejenes penetrantes jejenes penetrantes jejenes penetrantes (Chrysops spp.) (Culicoides spp.) (Culicoides (Culicoides spp.) y moscas negras spp.) (Simulium spp.)
Sistema linfático
Sistema linfático
Sangre
Sangre
Sangre
Sangre
Nocturnaa
Nocturna
Diurna
Aperiódica
América del Sur, Centrall y el Caribe
M. perstans África Central y Occidental, Suramérica
M. streptocerca África Central y Occidental
O. volvulus África, América Central y del Sur
W. bancrofti Países Tropicales y Subtropicales
Moscas negras (Simulium spp.)
Mosquitos (Culex, Aedes, Anopheles y Mansonia spp.)
Dermis
Tejidos subcutáneos
Sistema linfático
Sangre
Piel
Piel
Sangre
Aperiódica
NA
NA
Nocturnab
4. Parasitology
Tabla 4.8 Características de los parásitos de filarias humanas comunes
Hábitat Adultos Microfilarias Periodicidad de microfilarias
Tejidos subcutáneos Tejidos subcutáneos Mesenterio órbita
Morfología de las microfilarias Vaina
Presente
Presente
Presente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Presente
175–230 en frotis; 240–300 en 2% formalina
265–325 en frotis; 330–385 en 2% formalina
230–250 en frotis; 270–300 en 2% formalina
160–205 en frotis; 205–250 en 2% formalina
190–200 en frotis; 180–225 en 2% formalina
180–240 en cortes de piel
300–315 en cortes de piel
240–300 en frotis; 275–320 en 2% formalina
Ancho (mm)
5.0–6.0
4.4–6.8
5.0–7.0
3.0–5.0
4.0–5.0
5.0–6.0
5.0–9.0
7.5–10.0
Cola
Ahusada; núcleo subterminal y terminal ampliamente separado
Ahusada; Ahusada; núcleo núcleo subterminal irregularmente y terminal espaciado ampliamente separado
Largo, delgado, puntiaguda; anucleada
claramente claramente redondeado, Normalmente flexionada; Cónica; anucleada redondeado doblada en forma de gancho; cónica en punta; núcleo al final núcleo al final anucleada
Longitud (mm)
Características principales
b
Tamaño pequeño, Espacio de cabeza larga; Vaina Tamaño pequeño; de cola larga y delgada; cola roma y llena vaina no se tiñe no se tiñe en en Giemsa; núcleo Giemsa; una hilera aperiodica con núcleo; terminal y de núcleos al final aperiodica de la cola subterminal
Subperiódica nocturna en Indonesia, Malasia, partes de las Filipinas y Tailandia. Subperiódica diurna en Nueva Caledonia y la Polinesia; subperiódica nocturna en zonas rurales de Tailandia.
forma delgada; cola doblada; cola de gancho llenada ocurre en la piel y con núcleo; de vez en cuando en ocurre en la piel orina o sangre después del tratamiento
Espacio de cabeza corto; vaina no se tiñe en Giemsa; cuerpo en curvas suaves; núcleos dispersos
165
a
Espacio de cabeza larga; vaina tiñe rosada en Giemsa; núcleo terminal y subterminal
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A
C
B
D
A) Desinfecte con etanol el dedo que se va a puncionar, use una lanceta. Figura 4.120 La toma de una muestra de sangre capilar (primera gota). B) Añada una gota igual de solución de cloruro sódico. C) Mezcle la sangre y la solución de cloruro sódico con la esquina de un cubreobjetos. Coloque este sobre la preparación. D) En otro portaobjetos prepare dos gotas gruesas de sangre. Examine en el microscopio el frotis fresco, de manera ordenada y minuciosa (usando el objetivo x 10 con escasa abertura del condensador). El primer indicio de la presencia de microfilarias es un rápido movimiento entre los glóbulos rojos. Figura 4.121 Una microfilaria patógena. Longitud: 250-300 µm; espesor: 6-8 µm (diámetro de un eritrocito). Por ejemplo Wuchereria bancrofti, Loa loa, Brugia malayi. Figura 4.122 Una microfilaria de patogenicidad dudosa. Longitud: cerca de 150 µm; espesor: aproximadamente 4 µm (mitad del diámetro de un eritrocito). Por ejemplo Mansonella ozzardi, M. perstans. Microfilarias en frotis de sangre frescos Las microfilarias se identifican en frotis de sangre teñidos. Sin embargo, en los frotis frescos se pueden obtener algunos datos acerca de la especie observada y de su capacidad patógena (figs. 4.121 y 4.122). La tinción se requiere generalmente para identificar microfilarias en frotis de sangre. Es posible, sin embargo, para obtener una indicación de las especies vistas y su patogenicidad de un frotis en fresco. Tabla 4.9 Tiempos recomendados para la recogida de muestras de sangre para pruebas de microfilarias Especiesa Tiempo de recogida recomendado Periódico (nocturna) 23:00-01:00 (pico 24:00) Periódico (diurna) 12:00-14:00 (pico 13:00) Subperiódica (nocturna) 20:00-22:00 (pico 21:00) Subperiódica (diurna) 15:00-17:00 (pico 16:00)
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Aperiódica cualquier momento (día o noche) Tabla 4.8 Examen microscópico de la sangre venosa concentrada por centrifugación Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Jeringas (5 ml o 10 ml) ● Agujas para punción venosa ● Centrífuga o centrífuga para microhematocrito ● Tubos de centrífuga cónicos o tubos capilares microhematocrito ● Plastilina plástica ● Cinta adhesiva ● Anticoagulante: citrato sódico, solución al 2% en solución salina (reactivo no. 59) ● Solución de formalina al 2% (preparada diluyendo solución de formaldehído al 37% 1/50 con agua destilada) o saponina, solución al 1% (reactivo no. 48) ● Éter ● Etanol al 70%. Método 1. Recoger 4 ml de sangre venosa. Expulsar en una botella que contiene 1 ml de solución de citrato trisódico. Mezclar. 2. Medir en un tubo de centrífuga cónico de 10 ml de solución de 2% de formaldehído. Añadir 1 ml de sangre con citrato. Mezclar. Espere 5 minutos para que se produzca la lisis de los eritrocitos. 3. Centrifugar durante 5 minutos a 10 000 g. Vierta el líquido sobrenadante. Toque (golpee ligeramente) el tubo para mezclar el depósito. 4. Coloque una gota del depósito en un portaobjetos. Extienda la gota para formar una capa delgada y deje secar al aire. 5. Fijar el frotis utilizando una mezcla 1:1 de etanol y éter. Dejar secar durante 2 minutos, a continuación, colorear inmediatamente (como se describe más adelante) para identificar las especies de microfilarias. Método alternativo utilizando una centrífuga de microhematocrito 1. Recoger 4 ml de sangre venosa. Expulsar en una botella que contiene 1 ml de solución de citrato trisódico. Mezclar. 2. Llenar un tubo capilar de microhematocrito en unas tres cuartas partes con la sangre con citrato. Sellar un extremo del tubo con la arcilla de modelado plástico o por calentamiento. 3. Se centrifuga en una centrífuga de microhematocrito a 10 000 g durante 2 minutos. 4. Colocar el tubo capilar en un portaobjetos y fijar los dos extremos con cinta adhesiva. 5. Examine la línea divisoria entre las células de la sangre y el plasma bajo el microscopio (Fig. 4.123), con el objetivo x10 con la apertura del condensador reducida. Las microfilarias móviles se verán en la parte inferior de la columna de plasma, justo por encima de la capa de leucocitos y eritrocitos (Fig. 4.124). El tubo se puede encajar en la parte inferior de la columna de plasma (véase la fig. 4.124). Utilice la primera gota de cada pieza del tubo roto para preparar una película espesa. Teñir la película como se describe más adelante para identificar la especie. La sangre capilar también puede ser examinada por este método. Recoger dos gotas de sangre capilar del dedo sobre un porta y se mezcla con una gota de solución de citrato trisódico 2%. aVéase
Figura 4.123 Examinando el tubo capilar de microhematocrito bajo el microscopio. Figura 4.124 Movilidad de las microfilarias. Se observarán microfilarias móviles en el fondo de la columna de plasma, inmediatamente arriba de la capa de leucocitos. E: eritrocitos; L: leucocitos; P: plasma. Método alternativo utilizando solución lisante de saponina
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1. Añadir 10 ml de sangre con citrato (véase más arriba) a 10 ml de solución lisante de saponina. 2. Mezclar la sangre con cuidado y dejar actuar durante 15 minutos para permitir la lisis de los eritrocitos. 3. Centrifugar a 2000g por 15 minutos. 4. Eliminar el sobrenadante con una pipeta y desecharlo en un recipiente con desinfectante. 5. Transferir el depósito a un portaobjetos y colocar un cubreobjetos. 6. Examinar la totalidad del depósito para ver las microfilarias móviles con el objetivo x10. (Las microfilarias seguirán siendo móviles en una muestra examinada de "sangre nocturna" a la mañana siguiente.) 7. Cuente el número de microfilarias en la preparación y dividir por 10 para obtener el número de microfilarias por ml de sangre. Se requiere una experiencia considerable para identificar microfilarias sin teñir. Se recomienda que la identificación se lleve a cabo en preparaciones teñidas (ver más adelante en tinciones). El examen microscópico de sangre venosa concentrada por filtración Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● jeringa, 15 ml ● Soporte del filtro de tipo Swinnex ● Filtro de membrana de policarbonato (25 mm de diámetro, tamaño de poro 5 µm)1 ● Almohadillas de filtros de papel (25 mm de diámetro) ● Plato llano, 15 ml, con tapa ● Pinzas romas ● Cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53) ● Metanol absoluto ● Agua destilada. 1En zonas endémicas de Mansonella perstans, se debe utilizar un filtro de membrana con un tamaño de poro de 3 µm. Método 1. Extraiga 10 ml de agua destilada en una jeringa. 2. Extraiga 1 ml de sangre fresca o de sangre con citrato en la jeringa (Fig. 4.125). Gire suavemente para mezclar el contenido. Espere 23 minutos, para la lisis de los eritrocitos. 3. Humedezca la almohadilla de papel de filtro con unas gotas de agua destilada y cubrir con el filtro de membrana. Coloque el filtro en el soporte del filtro. 4. Conecte la jeringa al soporte del filtro. Empuje suavemente la sangre a través del filtro dentro del plato que contiene una solución desinfectante (Fig. 4.126). 5. Retire la jeringa del soporte del filtro (teniendo cuidado de no perturbar el filtro) y extraiga 10 ml de agua destilada. 6. Vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y empuje suavemente el agua a través del filtro dentro del plato que contiene la solución desinfectante, para eliminar los restos del filtro (Fig. 4.127). 7. Retire la jeringa del soporte del filtro y extraiga aproximadamente 5 ml de aire. 8. Vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y empuje el aire a través del filtro sobre el plato con desinfectante, para eliminar el exceso de agua del filtro. Deseche la solución desinfectante en un fregadero. 9. Retire la jeringa del soporte del filtro. Desmonte el soporte del filtro y retire el filtro de membrana con las pinzas. 10. Coloque el filtro, con la parte superior de la membrana hacia arriba, en un portaobjetos. Añadir una gota de solución de cloruro de sodio y cubrir con un cubreobjetos. 11. Examine toda la membrana para buscar microfilarias móviles, utilizando el objetivo x10. (Las microfilarias seguirá siendo móviles en una muestra examinada de "sangre nocturna" a la mañana siguiente. 12. Cuente el número de microfilarias en la preparación y se divide por 10 para obtener el número aproximado de microfilarias por ml de sangre. Se requiere una experiencia considerable para identificar microfilarias sin teñir. Se recomienda que la identificación se lleve a cabo en preparaciones teñidas (ver más abajo). Para realizar una preparación teñida, siga el método descrito anteriormente, con las siguientes modificaciones: 8. Vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y empuje el aire a través del filtro sobre el plato con desinfectante, para eliminar el exceso de agua del filtro. 9. Retire la jeringa del soporte del filtro y extraiga aproximadamente 7 ml de aire y 3 ml de metanol. 10. Vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y empuje el metanol y el aire a través del filtro sobre el plato con desinfectante, para fijar las microfilarias y eliminar el exceso de metanol del filtro, respectivamente. 11. Retire la jeringa del soporte del filtro. Desmonte el soporte del filtro y retire el filtro de membrana con las pinzas. 12. Coloque el filtro, con la parte superior de la membrana hacia arriba, en un portaobjetos. Deje que se seque al aire. 13. Teñir con Giemsa como para gota gruesa (ver más adelante) y examinar toda la membrana del filtro con el objetivo x10.
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Figura 4.125 Extracción de sangre con citrato en una jeringa Figura 4.126 Filtrado de la muestra de sangre Figura 4.127 Enjuague del filtro Técnica para tinción de microfilarias Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Giemsa (reactivo. Nº 29) ● Colorante hematoxilina de Delafield (reactivo. Nº 19) ● Metanol ● Agua tamponada (reactivo no. 15). Método 1. Preparar un frotis de gota gruesa del depósito como se describe más adelante. Permitir que el frotis se seque al aire. 2. Fijar en metanol durante 1 minuto. 3. Teñir con tinción de Giemsa (diluido 1 en 20 con agua tamponada, pH 6,8) durante 30 minutos.
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4. Examine la preparación en el microscopio con el objetivo x10. Si es difícil distinguir los núcleos de las microfilarias, devuelva el portaobjetos a la solución de tinción de Giemsa durante otros 510 segundos. 5. Teñir con Colorante hematoxilina de Delafield (diluido 1 en 10 con agua tamponada, pH 6,8) durante 5 minutos. Lave en agua tamponada, pH 6,8. (Se requiere este segundo colorante porque el Giemsa solo no tiñe la cubierta (o vaina) de Loa loa muy bien.) 6. Examine la preparación en el microscopio. Utilice el objetivo x10 primero para localizar las microfilarias y luego identificar las especies de filarias utilizando los objetivos x40 y x100. Resultados Bajo el microscopio de luz las microfilarias aparecen (tras la tinción adecuada) como organismos primitivos, en forma de serpentina, a menudo envueltos con una cubierta y llenos de núcleos de muchas células (Fig. 4.128). No todas las especies tienen una vaina. En las que lo hacen, la cubierta se puede extender a una distancia corta o larga más allá de cualquier extremidad. En algunas especies, en función del colorante que se utiliza, la vaina muestra una calidad de tinción única que ayuda en la identificación de las especies. Los núcleos de las células que llenan el cuerpo suelen estar oscuramente teñidas y pueden estar juntos y muy aglomerados o dispersos (ver Fig. 4.128). La extremidad anterior está característicamente desprovista de núcleos y se llama espacio cefálico o cabeza, ya que puede ser corto o largo. Al mirar desde la parte anterior al extremo posterior del cuerpo se verán espacios y las células que sirven como puntos de referencia anatómicos adicionales. Estos incluyen el anillo nervioso, poro excretor, célula excretora y poro anal. En algunas especies puede ser vista una masa amorfa llamada cuerpo interior y cuatro células pequeñas (conocidas como células rectales). Algunas de estas estructuras y sus posiciones son útiles en la identificación de la especie. Otras características útiles incluyen la forma de la cola y la presencia o ausencia de núcleos dentro de ella. La Tabla 4.8 resume las características de los parásitos filarias humanos comunes que se utilizan para su identificación. Nota: ● A veces las microfilarias de la cepa periódica de Brugia malayi pierden su envoltura. ● La identificación de especies puede ser difícil y se cometen errores con frecuencia. Las directrices para la identificación de microfilarias dada anteriormente y los que aparecen en la mayoría de los libros de texto hacen que la identificación parezca engañosamente simple. A veces es difícil ver la vaina. En otras ocasiones, los núcleos no aparecen en su posición característica en la punta de la cola. Es una buena práctica para examinar varios microfilarias cuidadosamente, antes de decidir sobre su especie. Si un estudio sistemático está hecho de todas las características mencionadas anteriormente, debe ser posible identificar con certeza las especies observadas. La identificación no se debe basar en una sola característica, pero si en todas las características tomadas en conjunto.
Fig.Fig. 4.12814. M icrofilarias que ap arec en en el ser hum ano
E s p a c io c e fá lic o
p o r o an al
sin cubierta PARASITOS SANGUINEOS
CD CO
i en la sangre
con cubierta
sin cubierta
I los núcleos llegan hasta el extremo caudal
I--------- -------------- 1
en la piel
los núcleos no llegan al extremo caudal, espacio cefálico tan largo como ancho
sin cubierta
I---------- ---------- 1 I----------------------- 1----------- ----------- 1 los núcleos llegan al extremo caudal, cola achatada
los núcleos no llegan al extremo caudal, filarías pequeñas, finas
los núcleos llegan al extremo caudal, filarías pequeñas, finas, cola ganchuda
los núcleos no llegan al extremo caudal, filaría gruesa
cola engrosada con dos cola uniforme, núcleos bien diferenciados, espacio cefálico tan espacio cefálico dos veces largo como ancho más largo que ancho
W uchereria bancrofti
M ansonella perstan s
M ansonella ozzardi
Onchocerca volvulus WHO 91553
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Posibles causas de error en la identificación 1. Cola Cola rota o doblada. Si la cola de Wuchereria bancrofti se encuentra rota o enrollada (Fig. 4.129), parecerá que los núcleos llegan hasta la punta, como los de Loa loa. 2. La envoltura Envoltura rota o incolora. A veces la envoltura se ha roto o es casi incolora. Por ejemplo, en Loa loa solo se observa como un espacio incoloro entre la cola y las células de la sangre. 3. El tamaño Microfilarias inusualmente grandes o pequeñas. Algunos especímenes de Mansonella perstans son sumamente largos (por ejemplo, 200 µm), y algunos de Wuchereria bancrofti y Loa loa son pequeños (por ejemplo, 250 µm). 4. Las curvas Frotis mal realizados. Si se dañan durante la preparación del frotis de sangre Wuchereria bancrofti puede aparecer retorcida y Loa loa sufrir una disminución en el número de curvas. 5. La distribución geográfica Origen geográfico del paciente. Tenga en cuenta invariablemente del lugar de donde proviene el paciente o cuales países visitó recientemente. Si el paciente es de: — la cuenca del río Zaire, Nigeria Oriental, Camerún o de la República Democrática del Congo (de la cuenca del río), es probable que el parásito sea Loa loa; — Senegal, Ghana, las Antillas Menores o la India, es probable que sea Wuchereria bancrofti; — Tailandia, el parásito puede ser Brugia malayi; — Guyana, puede ser Mansonella ozzardi. 6. Extensiones sanguíneas El examen de las extensiones delgadas. No se recomienda intentar la identificación de las microfilarias en extensiones sanguíneas teñidas; los parásitos se suelen encoger y deformar, de modo que es difícil reconocerlos.
Figura 4.129 Posible causa del error en la identificación de Wuchereria bancrofti: Cola rota o doblada
PARÁSITOS DEL PALUDISMO 4.7.2 Plasmodium spp. El paludismo, el cual es causado por la infección con protozoos del género Plasmodium, es la enfermedad parasitaria más importante en los países tropicales. Se transmite a los humanos a través de la inoculación de esporozoitos de Plasmodium por la hembra del mosquito Anopheles o por transfusión sanguínea. Los esporozoitos viajan a través de la sangre hacia el hígado, donde se transforman en grandes esquizontes tisulares que contienen un número considerable de merozoitos (esquizogonia en el tejido). Estos comienzan a la ruptura después de 520 días, según la especie, y los merozoitos liberados invaden los eritrocitos circulantes. El ciclo de replicación se repite a intervalos regulares. Síntomas clínicos Los primeros síntomas clínicos de la infección son fiebre leve, dolor de cabeza, dolores musculares y malestar general. Estos síntomas a menudo son mal interpretados como el resultado de una infección viral de la influenza. Los síntomas de parecidos a los de influenza son seguidos por ataques recurrentes y periódicos de fiebre alta y escalofríos. Si altas temperaturas se acompañan de trastornos mentales caracterizados por alucinaciones y excitación cerebral, esto puede indicar el paludismo cerebral, el cual es a menudo fatal. En las zonas donde el paludismo es endémico y donde la población ha desarrollado una inmunidad parcial a la enfermedad, los síntomas clínicos pueden ser más moderados. Especies de Plasmodium infecciosas para los seres humanos Hay cuatro especies diferentes de Plasmodium infeccioso para los seres humanos. Estos son P. falciparum, P. malariae, P. ovale y P. vivax. La distribución geográfica de estas especies se resume en la Tabla 4.10. Tabla 4.10 Distribución geográfica de Plasmodium spp. infecciosos para los seres humanos País o zona P. falciparum P. malariae P. ovale P. vivax África Central Predominante Raro Raro Raro África del Este Predominante Raro Raro Común África del Norte Muy raro Muy raro Ausente Predominante África Occidental Predominante Raro Raro Muy raro América Central Común Raro Ausente Predominante
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América del Sur Suroeste de Asia y Asia Central Sudeste de Europa Subcontinente indio Indochina Indonesia Madagascar, Océano Índico Islas del Pacífico
Común
Común
Ausente
Predominante
Común
Común
Ausente
Predominante
Muy raro Común Predominante Predominante
Muy raro Raro Raro Muy raro
Ausente Muy raro Raro Muy raro
Predominante Predominante Común Común
Predominante
Raro
Raro
Común
Predominante
Muy raro
Raro
Común
Identificación de Plasmodium spp. en el frotis de sangre Los parásitos del paludismo suelen detectarse en frotis de sangre teñidos con coloración de Field o de Giemsa. Ellos también pueden ser detectados utilizando un procedimiento inmunológico conocido como una prueba con tira reactiva (véase la sección 11.9). Es importante para el pronóstico y el tratamiento de la enfermedad que las especies implicadas sean identificadas en el laboratorio. Si usted no puede identificar la especie, siempre informe la presencia de parásitos del paludismo que se ven. No confunda a los trombocitos que se superponen sobre los eritrocitos con parásitos del paludismo. Esto puede constituir una causa de error frecuente. PREPARACIÓN DE LAS EXTENSIONES SANGUÍNEAS 1. Cuando se debe obtener la muestra Por lo general los parásitos son más numerosos en la sangre al final de un ataque de fiebre. La recolección de sangre se debe hacer invariablemente antes que se administren medicamentos antipalúdicos. 2. Para pacientes individuales Prepare: — 1 portaobjetos con una extensión sanguínea en que se efectúe el examen minucioso por especies si se requiere, y — 1 portaobjetos con una gota gruesa para la detección de los parásitos. 3. Para encuestas Prepare: — solo 1 portaobjetos por cada individuo con una gota gruesa y una extensión sanguínea en el mismo portaobjetos. 4. Conservación de los frotis No se recomienda conservar los frotis sin tinción durante más de 4 días. La coloración de Field se recomienda para los frotis que se deben teñir inmediatamente y la de Giemsa para los que se teñirán algunos días después
B A A) Preparación de dos portaobjetos para pacientes individuales. En uno de ellos se realiza una extensión fina para luego teñirla convenientemente y realizar en esta extensión un examen minucioso por especies. En el otro portaobjeto, se realiza una gota gruesa para la detección de los parásitos palúdicos. B) Preparación de un solo portaobjetos para cada paciente, donde en éste portaobjeto se realiza la extensión sanguínea y la gota gruesa, como se observa en la figura. Se realiza, por lo general, en estudios de encuestas, por cuestiones de operatividad y practicidad. Preparación de una gota gruesa y una extensión fina de sangre en el mismo portaobjeto Para la microscopía de rutina del paludismo, una extensión fina y una gruesa se hacen en el mismo portaobjetos. La extensión gruesa (gota gruesa) se utiliza para la detección de parásitos, mientras que la extensión fina se utiliza en la identificación de la especie de parásito. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos de vidrio limpios (véase la sección 3.5.1) ● Lancetas estériles ● Algodón ● Lápiz graso ● Metanol ● Etanol al 70% Método La sangre a ser examinada para los parásitos del paludismo es usualmente recogida en un centro de salud.
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El tiempo más adecuado para la recogida está en el pico de un episodio de fiebre, cuando los parásitos son más numerosos en la sangre. Los especímenes de sangre siempre deberían ser recolectados antes que se administren las drogas antipalúdicas. 1. Con la palma de la mano izquierda del paciente hacia arriba, seleccionar el tercer o cuarto dedo. (El dedo gordo del pie puede ser usado con bebés. El pulgar nunca debería ser usado con adultos o niños.) Use algodón absorbente ligeramente embebido en etanol para limpiar el dedo – apretando y sacudiendo con golpes firmes para remover la suciedad y la grasa de la yema del dedo (Fig. 4.130). Seque el dedo con un pedazo limpio de algodón absorbente. 2. Con una lanceta estéril, pinche la yema del dedo (Fig. 4.131), usando una acción de balanceo rápida. Aplicando una presión suave en el dedo, exprima la primera gota de sangre y sáquela con el algodón seco. Asegúrese que ningún hilo del algodón permanezca en el dedo. 3. Trabajando rápidamente y manejando los portaobjetos limpios sólo por los bordes, recoja la sangre como sigue: Aplique una presión suave sobre el dedo y recoja una sola y pequeña gota de sangre, aproximadamente de este tamaño ●, sobre el medio del portaobjeto. Esto es para la extensión fina. Aplique una presión adicional para sacar más sangre y recoger dos o tres gotas más grandes, aproximadamente de este tamaño ●, sobre el portaobjeto cerca de 1 cm de distancia de la gota sacada para la extensión fina (ver Fig. 4.132). Limpie la sangre restante con el algodón. 4. Extensión fina. La utilización de otro portaobjeto limpio como una "extensor", y con el portaobjeto con las gotas de sangre apoyado en una superficie firme y plana, toque la pequeña gota con el extensor y permita que la sangre se extienda a lo largo de su borde. Firmemente empuje el extensor a lo largo del portaobjeto, lejos de las gotas más grandes, manteniendo el extensor en un ángulo de 45° (Fig. 4.133). Asegúrese que el extensor esté en contacto con la superficie del portaobjeto todo el tiempo en que la sangre está siendo extendida. De esta manera saldrá bien el extendido. 5. Gota gruesa. Siempre maneje los portaobjetos por los bordes, o por una esquina, para hacer la gota gruesa como sigue: Usando la esquina del extensor, rápidamente junte las gotas más grandes de sangre y extiéndalas para hacer una gota gruesa mayor (cada vez más para hacer una gota mayor) (Fig. 4.134). 6. Permita que la gota gruesa se seque en posición horizontal en un lugar plano protegida de moscas, polvo y calor extremo. Etiquete el extendido seco con un lápiz graso escribiendo a través de la parte más gruesa de la extensión fina el nombre del paciente o número y fecha (como se muestra en la Fig. 4.135).
Figura 4.130 Limpiando el dedo antes de recoger una muestra de sangre capilar. Figura 4.131 Usando una lanceta para pinchar la yema del dedo.
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Figura 4.132 Recogiendo la muestra de sangre. Figura 4.133 Preparando una extensión de sangre fina. Figura 4.134 Preparando la gota gruesa. Figura 4.135 Etiquetando el extendido. Tinción de los extendidos sanguíneos con el colorante de Giemsa Principio Durante la coloración de la extensión de sangre, la hemoglobina en los hematíes se disuelve (deshemoglobinización) y es quitada por el agua en la solución de tinción. Todo lo que permanece son los parásitos y los leucocitos, que pueden ser vistos bajo el microscopio. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Probetas de 10, 50 y 100 ml ● Vasos de precipitados de 50 y 250 ml ● Cubetas para tinción ● Varillas de vidrio ● Pisetas o frascos lavadores ● Pinzas para portaobjetos ● Soportes deslizantes para portaobjetos (Bastidores deslizantes) ● Temporizador ● Colorante de Giemsa (reactivo núm. 29) ● Metanol en un gotero ● Agua tamponada, pH 7.2 (reactivo núm. 15) o agua destilada. Método de rutina para teñir extensiones sanguíneas finas y gota gruesa de sangre Idealmente, para una tinción óptima, la extensión fina y la gota gruesa deberían ser realizadas en portaobjetos separados. Esto a menudo no es posible y el extendido fino y la gota gruesa son generalmente realizados en el mismo portaobjetos. Cuando se procede así, la coloración de buena calidad de la gota gruesa tiene la importancia primaria. Los mejores resultados se obtienen si los frotis de sangre se han secado durante la noche. Este método es conveniente para teñir 20 o más portaobjetos. 1. Fijar la extensión fina mediante la adición de tres gotas de metanol, o por inmersión en un recipiente de metanol durante unos pocos segundos. Con la fijación prolongada puede ser difícil detectar puntos de Schüffner y hendiduras de Maurer. Para permitir la deshemoglobinización, la gota gruesa no debe fijarse, por lo tanto evitar la exposición de la gota gruesa a metanol o a vapor de metanol. 2. Con unas pinzas, coloque los portaobjetos espalda con espalda en una cubeta de tinción (Fig. 4.136). 3. Preparar una solución de Giemsa al 3% en agua tamponada o destilada, pH 7,2, en cantidad suficiente para llenar el número de cubetas de tinción a ser utilizadas. Mezclar bien el colorante. 4. Vierta el colorante suavemente en la cubeta de tinción, hasta que todos los portaobjetos estén totalmente cubiertos. Colorear durante 3045 minutos fuera de la luz solar.
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5. Vierta agua limpia suavemente en la cubeta para eliminar el depósito en la superficie de la solución de tinción (Fig. 4.137). 6. Verter suavemente el colorante restante (Fig. 4.138), y aclarar de nuevo con agua limpia durante unos segundos. Vierta el agua. En algunos laboratorios con suministros limitados se vuelve a utilizar la tinción de Giemsa diluida; en tales casos, debe ser utilizado en el mismo día. 7. Usando pinzas, remueva los portaobjetos de uno en uno. Colóquelos en un soporte para portaobjetos deslizante para drenar y secar, con el lado de la extensión hacia abajo, asegurándose que la extensión no toque la parrilla deslizante para portaobjetos.
Figura 4.136 Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción Figura 4.137 Verter agua limpia en la pila de tinción para eliminar el depósito Figura 4.138 Volcar el colorante restante en un fregadero Método rápido para la tinción de gota gruesa y extendido fino Este método es adecuado para la tinción rápida de gotas gruesas cuando se requieren resultados urgentes. Utiliza mucho más colorante que el método regular. 1. Permita que la gota gruesa se seque por completo, y si los resultados se necesitan con urgencia, el secado puede ser acelerado por ventilación (agitar al aire) o exposición breve del portaobjeto a fuego lento, como también al calor proveniente de una lámpara de microscopio. Se debe tener cuidado para evitar el sobrecalentamiento, de lo contrario la gota gruesa se fijará con el calor. 2. Fijar la extensión fina mediante la adición de tres gotas de metanol, o por inmersión en un recipiente de metanol durante unos pocos segundos. Para permitir la deshemoglobinización, la gota gruesa no debe fijarse, por lo tanto evitar la exposición de la gota gruesa a metanol o vapor de metanol. 3. Preparar una solución de Giemsa al 10% en agua tamponada o destilada, pH 7,2; si se utiliza una pequeña cantidad, tres gotas de colorante por ml de agua tamponada darán la concentración correcta de solución de Giemsa. Un frotis requiere de unos 3 ml de colorante fabricado. Mezclar bien la tinción con una varilla de vidrio. 4. Vierta suavemente el colorante en los portaobjetos o usar una pipeta. Teñir durante 510 minutos. 5. Enjuague suavemente la tinción de los portaobjetos mediante la adición de gotas de agua limpia. No incline la tinción; y luego lavar, ya que le dejarán un depósito de basura en los frotis. 6. Colocar los portaobjetos en el soporte deslizante para portaobjetos para drenar y secar, con el lado de la extensión hacia abajo, asegurándose que la extensión no toque el soporte deslizante para portaobjetos.
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En gota gruesa Los glóbulos rojos casi han desaparecido. Las manchas rosáceas de Schüffner aún se pueden observar alrededor del parásito. Los leucocitos se conservan sin modificaciones.
GLOBULOS ROJOS INFECTADOS En extensiones sanguíneas: Los glóbulos rojos infectados pueden no sufrir modificación alguna, o bien pueden cambiar de color o forma, o contener puntos rosáceos (manchas de Schüffner). Tinción del frotis de sangre con el colorante de Field La tinción con el colorante de Field permite la rápida detección de parásitos del paludismo (pero no siempre tiñe el moteado de Schüffner). Materiales y reactivos ● Microscopio ● Frascos de vidrio ● Soporte deslizante para portaobjetos ● Metanol ● Colorante de Field (reactivo no. 25) ● Agua tamponada, pH 7,2 (reactivo no. 15). Método para la tinción de la gota gruesa 1. Sumergir la extensión no fijada en un frasco que contiene solución de colorante de Field A durante 3 segundos. 2. Lave suavemente por inmersión (una vez) en una jarra de agua limpia durante 5 segundos. 3. Sumergir el portaobjetos en un frasco que contiene la solución de tinción de Field B durante 3 segundos. 4. Lavar el portaobjetos suavemente como en el paso 2. 5. Colocar el portaobjetos en posición vertical en un soporte deslizante para portaobjetos para que se seque al aire. Método para la tinción de extensiones finas 1. Fijar la extensión en metanol durante 1 minuto. 2. Lavar el metanol con agua tamponada. 3. Con una pipeta, cubra la extensión con la solución de tinción de Field B diluida (un volumen de colorante más cuatro volúmenes de agua tamponada). 4. Inmediatamente después, añadir un volumen igual de una solución de de Field A y mezclar bien mediante inclinación del portaobjetos. 5. Deja actuar 1 minuto. 6. Lavar la tinción con agua limpia. 7. Colocar el portaobjetos en posición vertical en un soporte deslizante para portaobjetos para secar al aire. El examen microscópico Examinar el portaobjetos bajo el microscopio con el objetivo de x 100. Los parásitos del paludismo que se encuentran en la sangre se encuentran en diferentes etapas de desarrollo (Fig. 4.139). Algunos parásitos del paludismo tienen gránulos de pigmentos en su citoplasma (Fig. 4.140). Frotis de sangre En las películas finas de sangre, los eritrocitos infectados pueden permanecer sin cambios o tener un color o una forma diferente, o pueden contener puntos rosados (moteado) ("Schüffner") o puntos rojos ("James") (véase el cuadro 4.11). Las extensiones finas se pueden utilizar para identificar las especies de parásitos del paludismo (véase la Tabla 4.12). Nota: En los pacientes que han estado sufriendo de paludismo durante mucho tiempo, los monocitos pueden ser vistos en la extensión fina de sangre, el citoplasma contiene a menudo cuerpos marrones o negro verdosos (siderófilos). En pacientes que han recibido recientemente una
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inyección de un medicamento contra el paludismo, los parásitos se tiñen mal y aparecen distorsionados y confusos. Gota gruesa En el frotis de sangre, el fondo debe estar limpio y libre de restos, ya que los eritrocitos infectados se lisan. Los parásitos del paludismo deben tener la cromatina de color rojo oscuro y el citoplasma azul pálido o de color púrpuraazul. En las gotas gruesas teñidas con Giemsa, los núcleos de los leucocitos deben estar teñidos de color púrpura oscuro. El moteado de Schüffner se puede ver alrededor de los parásitos del paludismo. Las gotas gruesas de sangre se utilizan para la estimación de la densidad de parásitos, como se describe a continuación. Densidad de parásitos La densidad de parásitos es el número de parásitos contadas en cada campo microscópico. Por lo general, varía de acuerdo con la especie. Dos métodos se pueden utilizar para contar parásitos del paludismo en gotas gruesas de sangre: determinación del número de parásitos por microlitro (µl) de la sangre, y el sistema adicional (el sistema plus o más donde se usan cruces para simbolizar resultados positivos, de 1 a 4 cruces). 1. La determinación del número de parásitos/µl de sangre se lleva a cabo mediante el recuento del número de parásitos en relación con un número estándar de leucocitos/µl (8000). Inicialmente, la extensión de sangre se examina para la presencia de especies de parásitos y sus etapas de desarrollo. Usando dos contadores manuales (“cuenta ganados”), uno para contar los leucocitos y el otro para los parásitos, siga uno de estos dos procedimientos: (I) Si, después de contar 200 leucocitos, se encuentran 10 o más parásitos, registrar los resultados en el formulario de registro en términos del número de parásitos/200 leucocitos; (Ii) si, después de contar 200 leucocitos, el número de parásitos es de 9 o menos, seguir contando hasta llegar a 500 leucocitos y luego registrar el número de parásitos/500 leucocitos. Después de los procedimientos (i) o (ii), utilizar una simple fórmula matemática, multiplicando el número de parásitos por 8000 y luego dividiendo esta cifra por el número de leucocitos (200 o 500). El resultado es el número de parásitos/µl de sangre. Es una práctica normal para contar todas las especies presentes y para contar y registrar por separado los gametocitos de P. falciparum y los parásitos asexuales. Esto es particularmente importante en el seguimiento de la respuesta a los medicamentos antipalúdicos que son activos contra la etapa de esquizontes, que no se espera que tengan efectos sobre los gametocitos. número de parásitos contados Número de parásitos / µl de sangre número de leucocitos Ejemplo: Si se cuentan 200 leucocitos: (50 parásitos x 8000/200 leucocitos) = 2000 parásitos /µl de sangre Si se cuentan 500 leucocitos: (5 parásitos x 8000/500 leucocitos) = 80 parásitos /µl de sangre 2. Un método más sencillo de contar parásitos en frotis de sangre es utilizar el sistema “más” usando cruces. Este sistema es menos satisfactorio, sin embargo, se debe usar sólo cuando no es posible llevar a cabo el recuento más aceptable de parásitos /µl de sangre. En este sistema, se utiliza un código de entre uno y cuatro signos más (cruces): + = 110 parásitos por 100 campos de gota gruesa + + = 11 a 100 parásitos por 100 campos de gota gruesa + + + = 1 a 10 parásitos por solo campo gota gruesa + + + + = Más de 10 parásitos por solo campo de gota gruesa. Recuerde: Para la correcta identificación y el recuento de parásitos fiable, utilice portaobjetos limpias y gotas gruesas bien hechas y bien teñidas. Nota: Los pacientes con muy alta densidad de parásitos (más de 10 parásitos por campo gota gruesa) requieren tratamiento urgente. Por lo tanto, si usted encuentra una alta densidad de parásitos, indicar el resultado claramente en su informe y lo remitirá de inmediato al médico del paciente.
178
Informe de los resultados Si el resultado del examen de los frotis de sangre es positivo, especifique: La especie de parásito que se encuentra; La etapa de desarrollo del parásito; La densidad de parásitos. Los extendidos de sangre que contienen P. ovale y P. vivax pueden contener pocos parásitos y por lo tanto tener más tiempo para examinarlos bajo el microscopio. Sin embargo, es necesario diferenciar las dos especies, ya que pueden volver a aparecer en la sangre sin la reinfección. Los pacientes infectados con P. ovale o P. vivax requieren tratamiento adicional para erradicar las etapas hepáticas de estos parásitos. Un paciente puede albergar más de una especie de parásito del paludismo a la vez (por ejemplo, P. falciparum y P. malariae o P. falciparum y P. vivax). Si el resultado es negativo, informe como "no se encontraron parásitos". A continuación en las páginas siguientes se colocan ilustraciones que corresponden a las figuras 4.139 y 4.140. En el manual original en inglés no aparecen estas figuras, por lo tanto, se colocarán figuras reemplazantes similares. Figura 4.139 Etapas del desarrollo de los parásitos del paludismo Figura 4.140 Parásitos del paludismo que contienen pigmento
lU tlM IIM U A U U IM U t K A H A iSITO S ü t L P A LU D IS M O
P A R A SIT O D E L PALU DISM O (teñido)
1 ó más núcleos que contienen cromatina roja citoplasma azul granulos ocasionales de pigmento negro o pardo eritrocito infectado (color de rosa)
Figura 4.139 ET A P A S DE D E S A R R O L L O
2. Esquizonte
Trofozoito maduro con núcleo dividido en otros 8-24 núcleos. Llena la mayor parte del glóbulo rojo.
Los parásitos que se encuentran en la sangre tienen distintas etapas de desarrollo.
núcleos frecuentemente ordenados en circulo, formando una roseta
cada núcleo se encuentra envuelto por cierta cantidad de citoplasma formando un merozolto
COMPARACION DE CELULAS INFECTADAS EN EXTENSIONES DE SANGRE
Tabla 4.11 P. faiciparum
P. malariae
P. vivax
P. ovale
1/5 a 1/3 del diámetro
1/4 a 2/3 del diá metro, aunque fre cuentemente se observa una forma en banda
1/4 a 2/3 del diámetro
1/4 a 2/3 del diámetro
TAMAÑO del trofozoito joven en compara ción con el diá metro de un gló bulo rojo (en la misma etapa de desarrollo)
ASPECTO del glóbulo rojo infectado
Sin cambios o empequeñecido y algunas veces teñido con mayor intensidad
Crecido y fre cuentemente te ñido con palidez
Crecido, oval, con bordes rasgados y mellados
Con frecuen cia, ninguna*
Ninguna
Manchás~de Schüffner, pe queñas y rosáceas
Siempre existen grandes manchas de James
Trofozoitos o gametocitos o ambos juntos; en una sola célula se pueden encontrar numerosos tro fozoitos
Se observan todas las formas en el mismo frotis
Se observan todas las formas en el mismo frotis
Se observan todas las formas en el mismo frotis
Sin cambios MANCHAS que se encuen tran en el glóbu lo rojo infectado
ETAPAS que se suelen observar
NOTA: Aspecto de los m onocitos (en casos de paludismo de larga duración): — con frecuencia el citoplasma contiene cuerpos de color castaño o negro verduzco (siderófilos) Aspecto de los parásitos del paludismo después de inyectar un medicamento antipalúdico: — los parásitos se tiñen débilmente, se hallan deformes y son difíciles de diferenciar. * En algunos glóbulos rojos Infectados con tro fozoito s adultos de P. faiciparum se puede encontrar cierta cantidad de gránulos rosáceos, más bien voluminosos, denominados "hendiduras de M aurer".
202
Tabla 4.12 Identificación de Plasmodium spp. infecciosos para el ser humano en extensiones de sangre
IDENTIFICACION DE LAS CUATRO ESPECIES DE PARASITOS PLASMO DIUM M A LA R IA E
<3 (Se detecta frecuentemente en esta etapa) Citoplasma: anillo delgado y pequeño, de color azul pálido Cromatina: 1 ó 2 manchas rojas, pequeñas
(Se detecta frecuentemente en esta etapa) Citoplasma: anillo más bien delgado azul, también con forma de coma o signo de admiración Cromatina: 1 ó 2 manchas rojas, tamaño mediano
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(Se detecta frecuentemente en esta etapa)
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Citoplasma: puede ser 1) redondo, compacto, azul oscuro, con muchas partículas de pigmento negro, o 2) en forma de banda (sólo en ex tensiones sanguíneas) Cromatina: 1 mancha redonda o 1 banda roja
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gránulos escasos de color negro azulado en el centro del citoplasma o disemi nados en él
GLOBULOS ROJOS
Pigmento:
De tamaño normal Muchos pueden ser dentados y con tener trofozoitos maduros; a menudo presentan algunas manchas rojas de tamaño y forma irregulares
Con frecuencia la densidad es muy elevada
8 i¡)
(Se detecta con bastante frecuencia) M erozoitos: 8-10 Cada uno con una gran mancha roja rodeada de citoplasma pálido; las 8 manchas pueden estar distribuidas de forma irregular (formas jóvenes) o formar una roseta Pigmento: siempre visible
Muy d ifícil de encontrar en exten siones sanguíneas (excepto en casos muy graves) M erozoitos: 18-32 Pigmento: oscuro, negro pardusco
(Se detecta con bastante frecuencia) Forma: parece un plátano o una hoz C olor: azul (macho), azul fuerte (hembra) Núcleo: rojizo
fe
(Se detecta frecuentemente en esta etapa) Citoplasma: anillo grueso y denso, de color azul, con algunos granulos de pigmento negro Cromatina: 1 gran mancha roja
?
(Sumamente raro)
•DENSIDAD PARASITOS
GAMETOCITO
ESQUIZONTE
TROFOZOITO MADURO
TROFOZOITO JOVEN
PLASMODIUM FALCIPARUM
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1
I W 1
i
i
(Se detecta con bastante frecuencia) Forma: voluminosa, oval o redondeada C olor: azul intenso (hembra) azul pálido (macho) Núcleo: una mancha redonda de cromatina roja situada en uno de los bordes Pigmento: gránulos negros grandes repartidos en el cito plasma
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De tamaño y forma normales Por lo general no se observan manchas rojas en ellos
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Densidad reducida
o
* En cualquier región la densidad de los parásitos depende principalmente de que el paludismo ocurra en algunas estaciones del año o sea endémico. Los individuos adultos en especial suelen desarrollar inmunidad en las regiones endémicas y, en conse cuencia, se reduce la densidad de los parásitos.
200
Tabla 4.12 (Cont.)
DEL PALUDISMO EN EXTENSIONES SANGUINEAS
PLASMODIUM O VALE
TROFOZOITO JOVEN
(No se detecta con frecuencia) Citoplasma: grande azul, irregular (dividido a veces en 2, 3 ó 4); par tículas de pigmento castaño anaranjado
DENSIDAD PARASITOS
GLOBULOS ROJOS
GAMETOCITO
ESQUIZONTE
(Se detecta frecuentemente en esta etapa)
TROFOZOITO MADURO
PLASMODIUM V IV A X
[
Citoplasm a: anillo deforme, muy grueso, de color azul C rom atina: una mancha roja más bien grande
La identidad del 1[ 0%2Ma se debe co n firm a r m ediante examen de una extensión sanguínea
Citoplasma: anillo uniforme y denso, de color azul Crom atina: una mancha roja, tamaño mediano
$
Citoplasma: redondo, compacto, azul muy intenso con algunas par tículas de pigmento castaño Crom atina: 1 gran mancha roja
C rom atina: 1 mancha roja
(Se detecta muy frecuentemente)
M erozoitos: 8-14 gránulos rojos grandes, forman una roseta que rodea un conglomerado central de partículas de pigmento castaño
M erozoitos; 12-18 gránulos rojos, voluminosos y compactos, que se observan sobre el fondo del cito plasma, azul pálido
(Se detecta frecuentemente) Hembra: oval o redondeada, azul intenso Un núcleo triangular rojo intenso, con frecuencia situado en un ex tremo; muchas partículas de pig mento anaranjado en el citoplasma Macho: redondeado, azul pálido Un núcleo central redondo rojo pálido; algunas partículas de pig mento anaranjado en el citoplasma
Form a:
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Crecidos, a menudo pálidos des pués de la tinción. Manchas de Schüffner, especial mente alrededor de los trofozoitos maduros
Densidad mediana
voluminosa, oval o redonda, azul intenso Núcleo: 1 mancha redonda y roja Pigmento: algunas partículas de color castaño en el citoplasma Se distingue de: — P. vivax por su pigmento castaño — P. malariae por la presencia de manchas de Schüffner
Pueden ser ovales, con extremos mellados Se observan fácilmente grandes manchas rojas de James
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Densidad mediana
*
0° ° at e • ce
° o ° a0 a 0* o
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PARASITOS SANGUINEOS
Cuadro 7.
Identificación d e esp ec ies de parásitos palúdicos en preparacion es d e sangre de gota gruesa teñ id as con G iem sa F a s e d el p arásito en la s a n g re p eriféric a
E sp ecie E sq u izo n te
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Tamaño: p e q u e ñ o a m ed ian o ; número: p or lo g e n e ra l ab u n d a n te s ; forma: fre c u e n te s , fo rm a s a n u la re s y en co m a; cromatina: a m en u d o d o s m an ch as; citoplasma: u n ifo r m e, d e fino a g rueso; formas maduras: a m en u d o p re s e n te s e n c a s o s g ra v e s d e p a ludism o, c o m p a c ta s co n el p ig m en to en p o c o s g rán u lo s g ru e s o s o e n m a s a única.
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N o rm a lm e n te a s o c ia d o s , con m u ch a s fo r m as a n u la re s jó v e n e s . Tamaño: p eq u eñ o , c o m p a c to ; número: e s c a s o s , p o c o fre c u e n te s , p o r lo g en era l e n c a s o s graves; formas maduras: 1 2 -3 0 o m ás m e ro zo ito s en a g lo m e ra d o c o m p a cto ; pigmento: m asa o sc u ra ú n ic a ..
F o r m a s in m a d u r a s p u n tia g u d a s p o c o co rrie n te s . Formas maduras: en fo rm a de b a n a n a o re d o n d e a d a s ; cromatina: única, b ien d e fin id a ; pigmento: d e s p e rd ig a d o , g ru e s o , riciform e; a v e c e s se o b s e rv a ó r g a n o d e e x tru sió n d e c o lo r ro sa. C o n fre cu e n cia, fo rm a s e ro s io n a d a s só lo con c ro m a tin a y p ig m en to .
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Tamaño: g ra n d e ; número: e s c a s o a m o d e rado; formas maduras: 1 2 -2 4 m ero zo ito s , g e n e ra lm e n te 16, en c o n g lo m e ra d o irre gular; pigmento: m a s a su elta.
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F o rm a s in m ad u ras difíciles d e distingu ir de los tro fo zo íto s m a d u ro s . Formas madu ras: re d o n d a s , g ran d es ; cromatina: única, b ien d e fin id a ; pigm ento: d e s p e rd ig a d o , fino. F o rm a s e ro s io n a d a s con c ito p la s m a e s c a s o o a u s e n te y só lo c ro m a tin a y pig m ento.
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Tamaño: pu e d en se r m e n o re s q u e P. vivax; número: en g en era l es c a s o ; forma: an u la r a re d o n d e a d a , fo rm a s co m p a c ta s ; croma tina: única, p ro m in e n te; citoplasma: b a s ta n te re gular, gru eso ; pigmento: d e s p e rd i g a d o , ru goso.
Tamaño: p a re c id o a P. m alariae ; número: es caso ; formas maduras: 4-12 merozoitos, generalmente 8, conglomerado laxo pig mento: m a s a co n c e n tra d a .
F o rm a s in m a d u ra s difíciles d e distingu ir d e tro fo z o íto s m a d u ro s . Formas maduras: re d o n d a s , p u e d en s e r m e n o re s q u e P. vi vax; cromatina: única, b ien d efin id a ; p ig mento: d e s p e r d ig a d o , ru g o s o . F o rm a s e ro s io n a d a s co n c ro m a tin a y p ig m e n to s o lam en te.
Tamaño: peq u eñ o ; número: g e n e ra lm e n te e s c a s o ; forma: a n u la r o re d o n d e a d a , fo r m as c o m p a cta s; cromatina: única, g ran d e; citoplasma: re g u lar, den so ; pigmento: d e s p e rd ig a d o , ab u n d a n te , con to n o am a rille n to en las fo rm a s m ás viejas.
Tamaño: p e q u e ñ o , c o m p a c to ; número: g e n e ra lm e n te es caso ; formas maduras: 6 -1 2 m e ro zo ito s , h ab itu a lm e n te 8, en co n g lo m e ra d o laxo; alg u n o s a p a re n te m e n te sin c ito p lasm a; pigmento: c o n c e n tra d o .
F o rm a s in m ad u ras y a lg u n a s m a d u ra s di fíciles d e distingu ir d e los tro fo zo íto s m a d u ro s . Formas maduras: re d o n d e a d a s , c o m p a c ta s ; cromatina: única, bien d efin i d a; pigmento: d e s p e rd ig a d o , ru g o so , p u e d e e s ta r d istribuido en la p eriferia . Las fo r m as e ro s io n a d a s só lo tien en c ro m a tin a y p ig m en to .
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IDENTIFICACION DE ESPECIES PARASITAS
Fig. 9.
Plasm odium falciparum
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E S Q U IZO N TE S
G A M E TO C ITO S Extensión sanguinea fina
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PARASITOS SANGUINEOS
Fig. 10.
Plasm odium vivax
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G A M E TO C ITO S Extensión sanguínea fina
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Preparación de gota gruesa
IDENTIFICACION DE ESPECIES PARASITAS
Fig. 11.
Plasm odium m alariae
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E S Q U IZO N TE S
G A M E TO C ITO S Extensión sanguínea fina
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PARASITOS SANGUINEOS
Fig. 12.
Plasm odium ovale
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T R O FO ZO ITO S
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G A M E TO C ITO S Extensión sanguínea fina
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Preparación de gota gruesa
IDENTIFICACION DE ESPECIES PARASITAS
Fig. 13.
A sp ecto de los elem en to s celulares en extensiones sanguín eas y preparacion es d e gota gruesa teñ id as con G iem sa: e fe cto del pH en la tinción d e los parásitos palúdicos con G iem sa
LE U C O C ITO S Extensión sanguínea fina
Preparación de gota gruesa
N = Neutrófilos, e = Eosinófilos, M = M onocitos, L = Linfocitos, P = Plaquetas
E R ITR O C ITO S
Extensión sanguínea
Preparación de gota gruesa
NC = N orm ocitos, M C = Microcitos, PM = M acrocitos policrom áticos, Pe = Poiquilocitos, PB = Basofilia puntuada, CR = Anillo de C abot, HJ = C uerpos de Howeii-Jolly, RC = «Nubes» reticulares y órganos crom atoides en anem ia aguda
PH
6-8
6-4
72
T IN C IO N PALU D IC A Y pH
90
7-6
189
TRIPANOSOMIASIS 4.7.3 TRYPANOSOMA SPP. 4.7.3 Trypanosoma spp. La tripanosomiasis es causada por la infección con protozoos parásitos del género Trypanosoma. Se produce en el sur y el oeste de África, donde se le conoce como enfermedad del sueño o Tripanosomiasis Africana, y en América Central y del Sur, donde se le llama enfermedad de Chagas1 o Tripanosomiasis Sudamericana. 1La enfermedad de Chagas también es llamada enfermedad de Chagas – Mazza o Tripanosomiasis Americana, porque hasta donde se sabe, la enfermedad de Chagas está confinada al hemisferio occidental y se la encuentra en el continente americano. Fue descubierta en Brasil por el Dr. Carlos Chagas, después se descubrió que su distribución es mucho más extensa. Además de Brasil se informaron casos autóctonos en toda Suramérica, América Central y México. También, el agente etiológico fue encontrado hasta en Corpus Christi, Texas, EE UU. Fuente: Ernest Carroll Faust, Paul Farr Russell, Rodney Clifton Jung Parasitología Clínica Salvat Editores 1974, reimpresión 1982. Páginas 107 - 122. La Tripanosomiasis Africana La tripanosomiasis africana ocurre en tres fases: -La fase aguda -La fase de parasitemia -La fase neurológica. Dos o 3 días después de la picadura de una mosca tse-tsé infectada, el chancro aparece en el sitio de la inoculación, que desaparece a las 2-3 semanas. Desde el sitio del chancro, los tripanosomas invaden el torrente sanguíneo, dando lugar a episodios ocasionales de fiebre intermitente. Los síntomas más comunes de la primera fase o fase aguda son dolor de cabeza, insomnio, dolor en las articulaciones y los ganglios linfáticos posterior del cuello, hinchazón de los párpados y articulaciones, pérdida de peso y picazón intensa generalizada, especialmente en la región del esternón. La invasión del sistema nervioso central provoca irritabilidad, parestesia, insomnio y dolores de cabeza severos y finalmente la visión borrosa, así como los ataques epilépticos, los fenómenos psicóticos, somnolencia, letargo mental, y coma. La tripanosomiasis causada por Trypanosoma brucei gambiense generalmente tiene un curso lento y crónico. Entre la primera y segunda fases, semanas o meses pueden pasar, y meses o años pueden transcurrir entre la segunda y tercera fases. La tripanosomiasis causada por T. b. rhodesiense sigue un curso más agudo y las fases son menos marcadas. Puede causar la muerte en pocos meses. Las complicaciones cardíacas son más frecuentes en la tripanosomiasis causada por T.b. rhodesiense, y algunos pacientes mueren antes de llegar a la fase neurológica. Las fuentes de infección y los modos de transmisión La tripanosomiasis africana es transmitida por moscas tse-tsé (Glossina spp.) y los seres humanos son el principal reservorio de la infección. Los cerdos, perros y posiblemente otras especies de animales pueden también hospedar el parásito, pero su papel en la propagación de la enfermedad es secundario. La transmisión ocurre cuando las moscas tse-tsé ingieren la sangre de personas o animales infectados. Examen del líquido de los nódulos linfáticos para Trypanosoma brucei gambiense y T.b. rhodesiense En diversos casos de tripanosomiasis africana del hombre (llamada también "enfermedad del sueño") se encuentran tripanosomas en los ganglios linfáticos (en infecciones por T. gambiense) durante las primeras etapas de la enfermedad, es decir, 2-3 semanas después de que la mosca tsetsé (Glossina spp.) ha inoculado al paciente con los parásitos. Los tripanosomas desaparecen de los ganglios en 2-6 meses. En una etapa posterior los parásitos pueden infectar el sistema nervioso central. El método estándar para el diagnóstico de la tripanosomiasis africana en la primera etapa es la búsqueda de tripanosomas en los aspirados de los ganglios linfáticos cervicales agrandados por la inflamación. Principio del examen Por medio de una aguja se extrae una gota de líquido de un ganglio linfático. Esta gota se examina inmediatamente en preparación húmeda colocada entre un portaobjetos y un cubreobjetos. Los tripanosomas, que son protozoarios móviles y flagelados, se observan fácilmente con el microscopio. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Una aguja (para inyección subcutánea) de calibre 25 (0,5 mm) x 16 mm ● Jeringa, 5 o 10 ml (tanto jeringa y aguja deben estar perfectamente secas) ● Tintura de yodo ● Etanol al 70% ● Cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53). Método Localización de un ganglio afectado Entre los ganglios cervicales se suelen encontrar los que se hallan afectados. Pálpense ambos lados del cuello, desde la base hasta la oreja.
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Los ganglios afectados se inflaman y originan protuberancias de 2-4 cm (Fig. 4.141). Son elásticos y se deslizan bajo la piel, ofreciendo escasa resistencia a la presión. No suelen endurecerse (excepto en los casos crónicos). Obtención de la muestra Preparativos Prepare la jeringa tirando el émbolo hacia atrás, hasta donde sea posible. Prepare asimismo 3 portaobjetos, colocando una gota de la solución de cloruro sódico en cada uno. Lávese las manos con agua y jabón. Haga que el enfermo se siente. 1. Desinfecte el sitio escogido del cuello con tintura de yodo* o etanol. Tome el ganglio afectado entre el pulgar y el índice de la mano izquierda. Sostenga el ganglio con firmeza, haciéndolo sobresalir al mismo tiempo (Fig. 4.142). Mantenga su mano firme. *La solución de yodo se debe limpiar después con etanol para evitar quemaduras. También se pueden emplear otros desinfectantes, como el tiomersal. 2. Sujetando la aguja entre el pulgar y el índice, Introduzca la aguja en ángulo recto en el centro del ganglio, en dos pasos (Fig. 4.143): — primeramente perfore la piel — a continuación haga penetrar la aguja en el ganglio. (Cerciórese de evitar la vena yugular y las arterias cercanas) 3. Con La mano izquierda: — exprima y suelte el ganglio en movimientos sucesivos, con suavidad. Con la mano derecha: — haga girar la aguja en ambas direcciones (Fig. 4.144). El líquido del ganglio saldrá por la aguja. La operación deberá durar aproximadamente un minuto y medio (Fig. 4.145). 4. Extraiga la aguja con un movimiento rápido, tapando la entrada con el pulgar. A continuación aplique un algodón humedecido con tintura de yodo en el sitio perforado. (Nunca se aplique el algodón con tintura de yodo antes de extraer la aguja, ya que cierta cantidad de este antiséptico puede llegar a la punta de la aguja, entrar en el líquido que se ha obtenido del ganglio e inmovilizar los tripanosomas.) Si el ganglio se encuentra endurecido, aspírese el líquido directamente por medio de una jeringa. Preparación de los portaobjetos 1. Ponga la aguja en la jeringa (que deberá tener el émbolo hacia atrás). Coloque la punta de la aguja en la gota de solución de cloruro sódico del primer portaobjetos. Empuje el émbolo suavemente hasta la mitad del cilindro de la jeringa para expulsar sobre el portaobjetos el líquido contenido en la aguja. 2. Repita este procedimiento en el segundo portaobjetos, empujando el émbolo hasta el fondo del cilindro para expulsar el resto del líquido. 3. Aspire la gota de solución de cloruro sódico del tercer portaobjetos al interior de la aguja. Expulse y aspire el líquido sucesivamente varias veces para enjuagar la aguja completamente y recoger los últimos residuos del líquido extraído del ganglio. El examen microscópico Examine el primer portaobjeto con el objetivo x10, cambie al objetivo x40 para examinar los parásitos con mayor detalle. Cierre el diafragma condensador suficientemente para dar una imagen nítida. Coloque cubreobjetos sobre cada una de las tres preparaciones. Examínense inmediatamente con el microscopio (con objetivo x 40). Espere hasta que se detenga el movimiento del líquido provocado por el calor (corrientes de convección). Es imposible ver el movimiento de los tripanosomas entre células que se mueven. Empiece examinando la periferia de la primera preparación, cerca de los bordes del cubreobjetos, hacia donde tienden a dirigirse los tripanosomas (figura 4.146). A continuación observe minuciosamente el resto de la preparación. Repita este procedimiento con las otras dos preparaciones. En la preparación se encontrarán eritrocitos, leucocitos y células linfáticas. Si se nota algún movimiento entre las diferentes células observe con cuidado extremo para determinar si es causado por un tripanosoma. Este parásito mide aproximadamente 20 µm de longitud y con frecuencia lo ocultan las diversas células, que se agitan ligeramente por los movimientos del flagelo.
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A) Materiales y reactivos. B) Zona del cuello donde se suelen ubicar los ganglios linfáticos cervicales. Entre los ganglios cervicales se suelen encontrar los que se hallan afectados. Pálpense ambos lados del cuello, desde la base hasta la oreja. Figura 4.141 Encontrar un ganglio linfático infectado con tripanosomas. Los ganglios afectados se inflaman y originan protuberancias de 2-4 cm. C) Prepare la jeringa tirando el émbolo hacia atrás, hasta donde sea posible. Prepare asimismo 3 portaobjetos, colocando una gota de la solución de cloruro sódico en cada uno. Figura 4.142 Hacer sobresalir el ganglio linfático sosteniéndolo con firmeza. Figura 4.143 La introducción de una aguja en el ganglio linfático. Figura 4.144 Haga girar la aguja en ambas direcciones. Figura 4.145 La toma de una muestra de líquido de los ganglios linfáticos.´ D) Extraiga la aguja con un movimiento rápido, tapando la entrada con el pulgar. A continuación aplique un algodón humedecido con tintura de yodo en el sitio perforado. E) Ponga la aguja en la jeringa que deberá tener el émbolo hacia atrás, vea la flecha). Coloque la punta de la aguja en la gota de solución de cloruro sódico del primer portaobjetos. F) Repita este procedimiento en el segundo portaobjetos, empujando el émbolo hasta el fondo del cilindro para expulsar el resto del líquido (vea la flecha). G) Aspire la gota de solución de cloruro sódico del tercer portaobjetos al interior de la aguja. Expulse y aspire el líquido sucesivamente varias veces para enjuagar la aguja completamente y recoger los últimos residuos del líquido extraído del ganglio. Figura 4.146 Examen de una muestra de los ganglios linfáticos bajo el microscopio. Empiece examinando la periferia de la primera preparación, cerca de los bordes del cubreobjetos, hacia donde tienden a dirigirse los tripanosomas. A continuación observe minuciosamente el resto de la preparación. Repita este procedimiento con las otras dos preparaciones. Siga el sentido indicado en la figura. Figura 4.147 Aspecto de los tripanosomas en una preparación de líquido de los ganglios linfáticos. Se observan también hematíes y leucocitos, así como células de los ganglios linfáticos. El tripanosoma tamaño: 15 - 25 µm (2-3 veces la longitud de un eritrocito) Forma: semeja un pez ondulante Aspecto:(en preparaciones húmedas) claro; refracta la luz muy intensamente. Flagelo y membrana undulante En preparaciones húmedas se observan principalmente los movimientos del flagelo, que se encuentra situado en el extremo anterior del parásito. El tripanosoma se desplaza entre las células con trayectorias serpenteantes. H) En la preparación se encontrarán eritrocitos, leucocitos y células linfáticas. Si se nota algún movimiento entre las diferentes células observe con cuidado extremo para determinar si es causado por un tripanosoma. Examen de frotis de sangre para Trypanosoma brucei gambiense y Tb rhodesiense
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Principio Los tripanosomas que pertenecen a la especie de Trypanosoma brucei se detectan en la sangre: -En preparaciones húmedas -En gotas gruesas después de la tinción -Concentración por centrifugación repetida -En las pruebas serológicas. Importante: En la tripanosomiasis africana los tripanosomas aparecen en la sangre a intervalos durante un período de unos pocos días, principalmente durante los primeros 3 meses de la enfermedad y, especialmente, durante los episodios de fiebre. Examen microscópico de la sangre capilar Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Lancetas para punción capilar ● Filtro de papel ● cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53) ● Giemsa (reactivo. N º 29) o Colorante de Field (reactivo. N º 25) ● Agua tamponada, pH 7,2 (reactivo no. 15) ● Etanol al 70%. Método 1. Esterilizar la yema del dedo anular y luego pinchar con la lanceta para punción. Limpie la primera gota de sangre con papel de filtro. Recoja dos gotas de sangre (Fig. 4.148): -Una gota en un portaobjeto -Una gota en un segundo portaobjeto. 2. Recoja dos gotas de sangre en un pedazo de papel de filtro (Fig. 4.149). Dejar secar. 3. En el primer portaobjeto, coloque una gota de solución de cloruro sódico al lado de la gota de sangre. Mezclar, usando la esquina de un portaobjeto (fig. 4.150). Cubrir con un cubreobjetos. 4. En el otro portaobjeto, extienda la sangre para producir un extendido grueso (gota gruesa) (véase antes). Teñir con Giemsa (véase antes) o colorante de Field (ver antes). Nota: Los frotis de sangre deben ser teñidos y examinados inmediatamente después de la recogida de muestras de sangre, ya que los tripanosomas se lisan y desaparecen a las pocas horas.
Figura 4.148 Toma de una muestra de sangre capilar en cada uno de dos portaobjetos. Figura 4.149 Toma de una muestra de sangre capilar en papel de filtro. Figura 4.150 Usando un portaobjetos, con una de sus esquinas mezclar la muestra de sangre con solución salina. Figura 4.151 Aspecto de los tripanosomas en una preparación húmeda. El examen microscópico
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Preparación húmeda. Examinar el primer portaobjeto (con la preparación húmeda) bajo el microscopio, utilizando el objetivo x40 y la reducción de la apertura del condensador. Examine primero los bordes del preparado. Busque movimiento entre los eritrocitos; los tripanosomas se desplazarán con su flagelo a medida que avanzan. Asegúrese que los organismos son tripanosomas: Longitud: 15-25 µm (2-3 eritrocitos). Anchura: 3 µm (media de eritrocitos). Forma: como una pez alargado. Motilidad: Los tripanosomas suelen moverse rápidamente, avanzando y contrayéndose como una serpiente, y tienen una membrana ondulante que se extiende desde un flagelo móvil en el extremo anterior (Fig. 4.151). No se debe confundir los tripanosomas con las microfilarias, que son mucho más grandes (100-300 µm o 10 a 40 eritrocitos). Gota gruesa. Las gotas gruesas siempre deben ser examinadas, incluso si el examen de la preparación húmeda parece ser positiva, para asegurarse que los organismos móviles vistos son tripanosomas. Los tripanosomas de T.B. gambiense y T. B. rhodesiense son idénticos en apariencia, en preparaciones teñidas (Fig. 4.152): Longitud: 15-25 µm. Citoplasma: Azul claro. Núcleo: Núcleo grande central, teñido de color rojizo-púrpura. Gránulos: Un cuerpo compacto rojo en el extremo posterior: el cinetoplasto. Membrana ondulante: Rojo-rosa, empezando por el cinetoplasto. Flagelo: Rosa, que se extiende 5 µm más allá de la membrana ondulante. Si ambos portaobjetos son negativos, repita las pruebas hasta un máximo de 7 días. Enviar las gotas secas de sangre en la tira de papel de filtro a un laboratorio de referencia para la prueba inmunológica de inmunoglobulina M (IgM) y los anticuerpos específicos.
Figura 4.152 Aspecto de los tripanosomas en una gota gruesa teñida. F: flagelo; K: cinetoplasto; M: membrana ondulante
Examen microscópico de sangre venosa concentrada por centrifugación (Método similar al de Strout) Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Centrífuga o centrífuga para microhematocrito ● Tubos cónicos de centrífuga con una marca a 10 ml o tubos capilares para microhematocrito ● Pipeta Pasteur ● Citrato trisódico, solución al 3,2% (reactivo no. 60). Método 1. Vierta 1 ml de solución de citrato trisódico en un tubo cónico de centrífuga. 2. Recoger 9 ml de sangre venosa y añadirlo al citrato trisódico (es decir, llenar el tubo hasta la marca de 10 ml). 3. Mezclar y centrifugar inmediatamente a 3000 g durante 3 minutos. 4. Extraiga todo el plasma sobrenadante y la capa de leucocitos por encima del depósito de los eritrocitos. Expulsar a este líquido sobrenadante en otro tubo (tubo 2). Centrifugar a 3000 g durante 5 minutos. 5. Extraiga todo el líquido sobrenadante (pero mantenga el depósito del tubo de 2). Expulsar el líquido sobrenadante en un tercer tubo (tubo 3). Centrifugar a 3000 g durante 10 minutos. 6. Examinar los depósitos de los tubos 2 y 3 entre un portaobjetos y un cubreobjetos bajo el microscopio.
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Los tripanosomas aparecerán en el depósito desde el tubo 3 (existen ocasiones en que aparecen a partir del tubo 2). Nota: Este método es similar al método de la triple centrifugación de Strout, el cual también suele ser utilizado para investigar la presencia de T. cruzi en casos sospechosos de enfermedad de Chagas agudo.
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E F A) Tome un tubo cónico para centrifugación graduado hasta 10 ml. Mida en este tubo: 1 ml de la solución de citrato. B) Extraiga: 9 ml de sangre venosa y deposítelos en el tubo con el citrato (hasta la marca de 10 ml). C) Mézclese y centrifúguese inmediatamente a velocidad media durante 3 minutos. D) Extraiga todo el plasma flotante y la capa de leucocitos que se encontrará sobre el sedimento de eritrocitos. Deposite este líquido en otro tubo (tubo 2). Centrifúguese a velocidad media durante 5 minutos. E) Extraiga del tubo 2 todo el líquido flotante, dejando el sedimento en su sitio. Deposite este líquido en un tercer tubo (tubo 3). Centrifúguelo a alta velocidad durante 10 minutos. F) Examine con el microscopio, entre un portaobjetos y un cubreobjetos, los sedimentos que se han formado en los tubos 2 y 3. Se observarán tripanosomas en el sedimento del tubo 3 (y ocasionalmente también en el del tubo 2). Se encontrarán microfilarias en el sedimento del tubo 2. Método alternativo Si una centrífuga de hematocrito está disponible, la sangre venosa (o capilar) con anticoagulante se puede recoger en un tubo capilar de microhematocrito. El método de recogida y el examen es el de microfilarias (ver antes). Los tripanosomas móviles, si están presentes, se encuentran en el plasma justo por encima de la capa de leucocitos. En primer lugar utilizar el objetivo x10 con menor apertura del condensador para detectar cualquier movimiento, a continuación, utilizar el objetivo x40 para ver los tripanosomas con mayor claridad. Nota: Este método es similar al método del Strout en capilares de microhematocrito (“MicroStrout”), el cual también suele ser utilizado para investigar la presencia de T. cruzi en casos sospechosos de enfermedad de Chagas agudo. La diferencia con el método de Strout convencional, consiste en el uso de microhematocritos en vez de tubos cónicos de centrífuga y en que no hay una triple centrifugación. Prueba de la aglutinación en placa (CATT) para la tripanosomiasis africana La prueba de la aglutinación en placa (CATT) para la tripanosomiasis africana es una prueba serológica que se utiliza para el diagnóstico de la tripanosomiasis. Materiales y reactivos ● Frasco ● Papel de seda (papel de tissue) o tela ● Cristal varillas agitadoras ● Frasco gotero dispensador ● Bulbo o perilla de goma para tubos de microhematocrito ● Jeringas, 2,5 ml, con agujas ● Lancetas para punción capilar de sangre ● Tubos de microhematocrito heparinizados ● Placas de prueba ● Soportes para tubos de microhematocrito con tapa ● Rotador manual o eléctrico (12/220 V) con tapa ● Antígeno liofilizado ● Suero control positivo liofilizado ● Suero control negativo liofilizado ● Buffer para reconstituir los reactivos. Los materiales y reactivos descritos anteriormente están disponibles comercialmente como un kit de prueba. Las cantidades aportadas son suficientes para llevar a cabo 250 pruebas. Antes de realizar
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la prueba, preparar sus materiales y reconstituir la cantidad de reactivos necesarios para el trabajo del día. Lea y siga cuidadosamente las instrucciones incluidas en el kit. Método Recogida de muestras 1. Usando una lanceta para punción capilar, hacer una pequeña herida de punción en el primero, segundo o tercer dedo del paciente. Recoger la sangre en un tubo de microhematocrito heparinizado (Fig. 4.153) hasta que esté tres cuartos de su capacidad con sangre. 2. Girar inmediatamente el tubo suavemente de modo que la sangre se extienda desde un extremo del tubo al otro (fig. 4.154). Repetir el movimiento dos veces. Esto asegura que la sangre y la heparina se mezclen entre sí, y evita que la muestra se coagule en el tubo. 3. Coloque el tubo de hematocrito en el soporte especial (suministrado con el kit; Fig. 4.155). Mantener el soporte cubierto tanto como sea posible para evitar el polvo y para evitar que la muestra de sangre se seque en el tubo. Los soportes de tubos de microhematocrito tienen 10 ranuras numeradas. Asegúrese de colocar el primer tubo en la primera ranura, etc. Una vez que el soporte está lleno, pasarlo a la persona que realiza la prueba. Realización de la prueba 1. Preparar dos placas de prueba. Coloque una gota del antígeno reconstituido en los pocillos 1 y 2 de la primera placa y en todos los pocillos de la segunda tarjeta. Mantenga el vial verticalmente para tener gotas calibradas constantes (Fig. 4.156). 2. Usando la primera placa, compruebe la calidad del reactivo. Coloque una gota de control positivo reconstituido en el pocillo 1 y una gota de control negativo reconstituido en el pocillo 2 (Fig. 4.157). Nota: Sólo es necesario hacerlo una vez al comienzo de cada día en un estudio de campo. 3. Usando la segunda placa, probar la sangre recogida. Ponga una gota de sangre del primer tubo de hematocrito en el pocillo 1, a partir del segundo tubo en el pocillo 2, etc. (Fig. 4.158). Deseche el tubo de hematocrito en un frasco que contiene agua con detergente. 4. Usando una varilla de agitación, mezclar los reactivos en cada pocillo de la primera placa y los reactivos y muestras de sangre en cada pocillo de la segunda placa. Extender la mezcla de manera que cubra el pocillo (fig. 4.159). Usar una varilla de agitación separada para cada pocillo o limpiar la varilla con un trozo de papel de seda o una tela entre cada pocillo para evitar la contaminación de las muestras. 5. Coloque las dos tarjetas en el rotador, tapar, y ajustar el temporizador a 5 minutos. Si se trata de un aparato rotatorio manual, comprobar el tiempo con su reloj. La velocidad de rotación debe ser lenta, aproximadamente 100 g. Si la velocidad de rotación es demasiado rápida, las aglutinaciones se depositan en el borde de los pocillos; si es demasiado lenta, la reacción será débil. 6. Después de 5 minutos, examinar las placas y registrar las reacciones en cada pocillo. No permita que las muestras se sequen. Si las muestras se han secado, la prueba debe repetirse. Resultados Reacciones fuertemente positivas (Fig. 4.160) Pequeños o grandes aglutinaciones de partículas son visibles sobre todo el pocillo o las aglutinaciones forman un círculo alrededor del borde del pocillo. Reacciones positivas débiles (Fig. 4.161) Muy pequeñas aglutinaciones de partículas se extienden por todo el pocillo o forman un círculo alrededor del borde del pocillo. Repita la prueba usando suero o plasma. Reacciones negativas (Fig. 4.162) No hay aglutinación visible. La reacción se mantiene uniforme u ocasionalmente ligeramente más densa en el centro. Reacciones inespecíficas (Fig. 4.163) Un anillo reseco se observa alrededor del borde del pocillo o se ven pequeños puntos o hilos finos. Este tipo de reacción es por lo general negativo. Si tiene alguna duda al respecto, repita la prueba usando suero o plasma. Nota: Deseche todos los reactivos reconstituidos no utilizados al final del día, a menos que hayan sido refrigerados. Estos no van a mantenerse y pueden dar falsos resultados si se utiliza al día siguiente. Otras pruebas de diagnóstico para la tripanosomiasis africana Además de los ensayos descritos anteriormente, la tripanosomiasis africana también se diagnostica en el laboratorio por: El examen del liquido aspirado de los ganglios linfáticos para buscar tripanosomas (ver antes); Pruebas de sangre seca recolectada en papel filtro para anticuerpos IgM y anticuerpos específicos (véase antes); Inoculación de las ratas o ratones con muestras de sangre heparinizada (sólo en laboratorios especializados); Examen de las muestras de LCR para buscar tripanosomas (ver sección 8.3.3, más adelante).
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Figura 4.153 Toma de una muestra de sangre usando un tubo de hematocrito. Figura 4.154 Girar el tubo para mezclar la muestra. Figura 4.155 Soporte para tubos de hematocrito. Figura 4.156 Aplicación de antígeno a la tarjeta o placa de prueba. Figura 4.157 Preparación de los controles para la CATT. Figura 4.158 Aplicación de las muestras de ensayo a la tarjeta de prueba Figura 4.159 Mezclar las muestras en cada pocillo de la tarjeta de prueba Figura 4.160 Reacción positiva fuerte en la CATT. Figura 4.161 Reacción positiva débil en la CATT. Figura 4.162 Reacción negativa en la CATT. Figura 4.163 Reacción no específica en la CATT.
ENFERMEDAD DE CHAGAS La enfermedad de Chagas afecta principalmente a los niños y se caracteriza por fiebre alta intermitente o continua. Alrededor del 50% de los niños manifiestan inflamación unilateral de los párpados (signo de Romaña). En otras áreas de la cara o el cuerpo, se producen cerca del punto de inoculación lesiones cutáneas (chagomas) que se asemejan a los forúnculos. Puede haber edema generalizado de todo el cuerpo. El agrandamiento del hígado (hepatomegalia) es común en los niños, pero no se ve a menudo en los adultos. La fiebre puede ir acompañada de miocarditis y meningitis. La infección del tracto digestivo provoca vómitos y diarrea. Las infecciones primarias pueden a menudo pasan inadvertidas, pero las infecciones severas pueden causar la muerte.
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Después de la fase aguda, sigue un período latente de la infección (fase indeterminada); esta fase se caracteriza por un bajo nivel de parasitemia y la ausencia de síntomas clínicos. O bien puede persistir indefinidamente o puede dar lugar a la forma crónica de la enfermedad. La fase indeterminada se caracteriza por la presencia de anticuerpos específicos que pueden ser detectados por las pruebas serológicas, pero no por los síntomas clínicos. Los pacientes que padecen la forma crónica de la enfermedad muestran signos de insuficiencia cardíaca. Las anormalidades en el electrocardiograma son a menudo evidentes, aunque los síntomas clínicos están ausentes. Los pacientes con la forma crónica de la enfermedad pueden negar haber experimentado alguna vez la forma aguda, posiblemente debido a que fue asintomática o porque ocurrió en la infancia y se han olvidado. Fuentes de infección y modos de transmisión En la enfermedad de Chagas, el parásito (Trypanosoma cruzi) es transmitido por insectos del género Triatoma que se infectan por la ingestión de la sangre de personas o animales infectados (animales domésticos infectados o animales reservorios naturales). El parásito se multiplica en el intestino de los insectos triatomíneos. Los humanos se infectan cuando la herida en el lugar de la picadura de triatominos está contaminada con las heces infectadas de los insectos vectores. Hay un grave riesgo que la enfermedad de Chagas pueda ser transmitida a través de la transfusión de sangre si no se toman las precauciones adecuadas. Exámenes de diagnóstico para la enfermedad de Chagas El Trypanosoma rangeli infecta a los seres humanos en casi las mismas áreas que T. cruzi. Aunque T. rangeli no es patógeno, este debe ser identificado y distinguido de T. cruzi para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Importante: Los tripanosomas móviles se encuentran en la sangre durante la fase aguda de la enfermedad, y rara vez después de ésta (es decir, en la fase indeterminada o de latencia o en la fase crónica). Durante la fase crónica el diagnóstico se basa esencialmente en métodos inmunológicos. Los tripanosomas que causan la enfermedad de Chagas son difíciles de encontrar en la sangre. Las mismas técnicas se utilizan como para la tripanosomiasis africana: Examen de una preparación húmeda (véase antes; raramente positivo en la fase crónica de la enfermedad); Examen de gota gruesa (véase antes) repetida varios días seguidos; Examen de frotis de sangre preparados a partir de muestras de sangre centrifugada (ver páginas anteriores); Examen de muestras de sangre seca para anticuerpos IgM y anticuerpos específicos (véase antes). Identificación de Trypanosoma cruzi en gota gruesa (Fig. 4.164) Descripción de T. cruzi teñido: Forma: ancha, semejante a una "C "; otras veces puede ser más delgada, generalmente parecida a una "S" Longitud: formas anchas: aproximadamente 15µm; formas delgadas: 20 µm Citoplasma: azul pálido Núcleo: voluminoso, central, de color rojo Cinetoplasto: gránulo voluminoso y redondo, rojo oscuro o morado, situado cerca del extremo posterior Membrana ondulante: delgada, de color rosáceo o rojo Flagelo: color de rosa; se extiende hacia atrás de la membrana ondulante Identificación de Trypanosoma rangeli en gota gruesa (Fig. 4.165) Descripción de T. rangeli teñido: Forma: solo existen formas delgadas con extremos agudos Longitud: 25 - 35 µm Núcleo: rojo, situado cerca del centro del cuerpo celular Cinetoplasto: pequeño; semeja una mancha de color rojo oscuro; situado lejos del extremo posterior Membrana ondulante: visible, delgada Flagelo: se extiende hacia atrás de la membrana ondulante.
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Figura 4.164 Aspecto de Trypanosoma cruzi en gota gruesa
Figura 4.165 Aspecto de Trypanosoma rangeli en gota gruesa.
4.7.4 LEISHMANIA SPP. La leishmaniosis es un grupo de enfermedades causadas por la infección por protozoos parásitos del género Leishmania. Puede afectar la piel (leishmaniosis cutánea), las membranas mucosas (leishmaniosis mucocutánea) y el sistema retículo endotelial (leishmaniosis visceral o kala-azar). El período de incubación es generalmente de 2 a 6 meses, pero puede variar de 10 días a varios años. En algunos pacientes con una lesión primaria se forma varios meses antes que aparezcan los otros síntomas. Los amastigotes de Leishmania spp. se multiplican lentamente en los macrófagos cerca del sitio de la inoculación. Algunos macrófagos infectados entran al torrente sanguíneo y llegan a las vísceras, donde los amastigotes se multiplican rápidamente. Clínicamente, las primeras fases de la leishmaniosis visceral se caracterizan por la fiebre crónica irregular, tos, diarrea y sangrado de las membranas mucosas y las infecciones secundarias. Más tarde, en ocasiones, se produce la ampliación progresiva del bazo, el hígado y los ganglios linfáticos, pérdida de peso y, en algunos pacientes, hipopigmentación en parches de la piel. La leishmaniosis cutánea se caracteriza por úlceras en la piel, que pueden ser simples o múltiples. En ciertas formas de leishmaniosis cutánea pueden aparecer en diferentes partes del cuerpo placas, pápulas o nódulos. Los síntomas clínicos de leishmaniosis pueden ser similares a los encontrados en la esquistosomiasis, paludismo crónico y leucemia crónica. Fuentes de infección y modos de transmisión La epidemiología de la enfermedad tiene características únicas en cada región y varía de una zona geográfica a otra. ● En las Américas, la infección se transmite a los humanos por la picadura del flebótomo Lutzomyia longipalpis (mosca de la arena). El vector se alimenta de perros, animales salvajes y, con menor frecuencia, los seres humanos; este se puede encontrar tanto en el exterior, en el campo, y el interior de las viviendas. La enfermedad se presenta principalmente en las zonas rurales. ● En la India, los seres humanos son el reservorio principal. ● En la cuenca del Mediterráneo y la zona del Golfo, los perros son el principal reservorio y los vectores son diversas especies del género Phlebotomus. ● En el Sudán, se han encontrado roedores salvajes y carnívoros como reservorios. La transmisión puede tener lugar en el interior de las viviendas, que constituyen microfocos de infección. El examen del frotis de un corte de piel para el diagnóstico de la leishmaniosis cutánea Principio La leishmaniosis cutánea se diagnostica mediante la demostración de la etapa de amastigote típica del organismo a partir de frotis de cortes de piel de las úlceras.
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Las úlceras típicas de la leishmaniosis cutánea son cráteres con un borde levantado. Muestras de cortes de piel se recogen desde el borde de la úlcera. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Bisturí ● Gasa ● Soporte deslizante para portaobjetos ● Lápiz de diamante ● Etanol al 70% ● Metanol ● Giemsa (reactivo. N º 29) ● Agua tamponada con fosfato, pH 6,8 (reactivo. N º 43). Para su uso, diluir el colorante de Giemsa en agua tamponada con fosfato (1 volumen del colorante con 19 volúmenes de agua tamponada). Método Colección de muestras 1. Limpiar el borde de la úlcera con un hisopo empapado en etanol. Usando la gasa comprimir el borde de la úlcera tan firmemente como sea posible para presentar un área sin sangre. 2. Utilice el bisturí para realizar una incisión superficial a lo largo del borde de la úlcera aproximadamente 0,5 cm de largo y 2-3 mm de profundidad. Sin dejar de apretar, gire el bisturí en el lado plano y raspar suavemente la base de la incisión con la punta de la hoja. Recoger las células del tejido, pero evitar la extracción de sangre. 3. Extienda el material recogido desde la punta del bisturí sobre un portaobjeto con un movimiento circular para cubrir un área de 5-7 mm de diámetro. Permitir que el frotis se seque al aire y etiquetar el portaobjeto con un lápiz de diamante. Tinción de frotis 1. Fijar los frotis secados al aire inundando el portaobjeto con metanol durante 2 minutos. 2. Volcar el metanol e inunde el portaobjeto con la tinción de Giemsa diluida durante 20 minutos. 3. Enjuague el portaobjetos en agua tamponada con fosfato y colocarlo boca abajo en un soporte deslizante para portaobjetos para drenar y secar. El examen microscópico Examinar el portaobjetos en el microscopio utilizando el objetivo de inmersión en aceite x100. Los amastigotes de Leishmania spp. pueden encontrarse intracelularmente en las células de macrófagos o situados por separado entre las células. Miden 2-4 µm y tienen un núcleo prominente y un cinetoplasto en forma de bastoncillo (Fig. 4.166). Tanto el núcleo y el cinetoplasto se tiñen de rojo y el citoplasma se tiñe de azul pálido. Reportar el resultado como "amastigotes de Leishmania spp. Presentes "o" no encontrado".
Figura 4.166 Amastigotes de Leishmania spp.
Prueba del formol gel para la leishmaniosis visceral Esta prueba es un indicador no específico para el aumento de los niveles séricos de gammaglobulina que se observan en la mayoría de pacientes con leishmaniosis visceral. Materiales y reactivos ● Tubos de ensayo ● Gradilla ● Centrífuga ● Tubos de centrífuga ● Formalina (formaldehido al 37%). Método 1. Recoger 2-5 ml de sangre en un tubo de centrífuga y permitir que se coagule. 2. Separe el suero por centrifugación del tubo durante 3 minutos a 5000 g, o al dejar el tubo durante la noche en un frigorífico o en la mesada. 3. Pipetear 1 ml de suero transparente en un tubo de ensayo. 4. Añadir dos o tres gotas de formalina al suero. Permita que el tubo permanezca de pie durante 30 minutos. Resultados Un resultado positivo se muestra por gelificación del suero: Se convierte en sólido y se vuelve blanco, por lo general después de aproximadamente 5 minutos.
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Un resultado negativo se registra cuando no hay gelificación o blanqueamiento del suero. Nota: El aumento de las concentraciones de gamma globulina en suero también se observan después de la infección con hepatitis B (véase la sección 11.8) y en ciertas enfermedades malignas, tales como mieloma múltiple y macroglobulinemia de Waldenström.
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5. BACTERIOLOGÍA 5.1 INTRODUCCIÓN El examen directo de frotis bacterianos generalmente no basta para identificar una especie de bacterias; la identificación precisa solo se puede lograr por medio de cultivos. Esto pone de relieve la importancia de enviar a los laboratorios de referencia las muestras obtenidas. Sin embargo, el examen microscópico directo de frotis teñidos constituye una manera eficiente de estudiar la presencia de bacterias en medios biológicos que normalmente son estériles, como los líquidos cefalorraquídeo (LCR) y pleural, y en muestras de otros orígenes. Este procedimiento puede aportar información sumamente útil para el diagnóstico, el tratamiento inmediato y el control de una enfermedad. Por ejemplo: — en muestras de casos de uretritis masculina en etapa inicial se puede diagnosticar con un grado razonable de seguridad una infección por gonococos (en la mujer esto es considerablemente más difícil) — se considera que la microscopía directa de esputo es una técnica práctica y efectiva para detectar casos infecciosos de tuberculosis y, por lo tanto, es de gran importancia para la epidemiología. — el examen microscópico del líquido cefalorraquídeo, de frotis de éste debidamente teñidos y de la morfología de cualesquiera bacterias que se encuentren en ellos puede ayudar a que se reconozca una meningitis (meningocócica, neumocócica o por M. tuberculosis), también los casos de hongos que producen meningitis (véase la sección 8.3.3). El diagnóstico de algunas enfermedades también es posible por medio de la serología; un ejemplo es la sífilis (véase el apartado 11.10). Las técnicas serológicas también son importantes para la vigilancia epidemiológica y la detección temprana de las enfermedades causadas por bacterias que son difíciles de cultivar (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis). 5.2 PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DE LOS FROTIS 5.2.1 Principio La muestra a ser examinada (pus, esputo, centrifugado orina, LCR, etc.) se prepara como sigue: ● La muestra se extiende en una capa fina sobre un portaobjetos de vidrio. Portaobjetos de vidrio: Previamente antes de proceder báñense con una mezcla de etanol y éter y límpiense con gasa. ● Se deja secar por completo. ● Se fija con metanol al 70% o por calentamiento antes de ser teñido.
A) Portaobjetos de vidrio: Previamente antes de proceder báñense con una mezcla de etanol y éter y límpiense con gasa.
5.2.2 Materiales y reactivos ● Asa para siembra: consiste en un alambre (generalmente fabricado con una aleación de níquel y cromo) que por un extremo se fija a un mango que lo sostiene y por el otro se dobla formando un pequeño círculo. Hágase esta asa utilizando una pinza y cuidando que quede centrada (Fig. 5.1). El tamaño del diámetro real del asa deberá ser de 2 mm. La muestra se extiende en una capa fina sobre un portaobjetos de vidrio. ● Microscopio ● Portaobjetos de vidrio ● Cubreobjetos de vidrio ● Mechero Bunsen o lámpara de alcohol ● Metanol al 70%.
Figura 5.1 Fabricación de un asa de siembra en aro, doblar la punta del asa con una pinza; el círculo deberá tener 2 mm de diámetro.
5.2.3 PREPARACION DEL FROTIS 1. Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo: — sostenga el asa inmediatamente arriba de la porción azul de la llama — ponga el asa tan cerca de la posición vertical como sea posible (Fig. 5.2).
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Déjela enfriar (cuente hasta 20). 2. Tome una porción de la muestra que se va a examinar por si hay pus, colocando el asa en posición plana en la superficie del líquido (Fig. 5.3). 3. Coloque el asa sobre el portaobjetos y aplánese ligeramente en el centro de éste (el portaobjetos deberá estar numerado) (Fig. 5.4). 4. Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjetos muévala trazando una espiral del centro a la periferia (Fig. 5.5). Deje cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos. Deje secar la muestra completamente al aire. 5. Repita el paso 1. Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella. A veces se reciben en el laboratorio muestras de procedencia externa sin las marcas correspondientes en los portaobjetos. Para saber en cuál lado de un portaobjetos sin marcas se encuentra la muestra: — coloque el portaobjetos de manera que refleje la luz que entra por la ventana — el lado donde no se halla la muestra brillará — el lado donde está la muestra no reflejará la luz.
B C B) Repita el paso 1. Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella. C) Para saber en cuál lado de un portaobjetos sin marcas se encuentra la muestra: — coloque el portaobjetos de manera que refleje la luz que entra por la ventana — el lado donde no se halla la muestra brillará — el lado donde está la muestra no reflejará la luz. 5.2.4 FIJACIÓN DE LOS FROTIS Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre. Cuando el frotis se ha secado completamente, fijarlo al cubrir el portaobjetos con unas pocas gotas de 70% de metanol durante 2 minutos o pase el portaobjetos tres veces a través de la llama del mechero Bunsen, con la muestra hacia arriba (Fig. 5.6). El frotis fijado puede ser teñido como se describe en la sección 5.3. Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción. Algunas veces es útil dibujar un círculo alrededor del frotis con un lápiz graso, a fin de que se pueda ver más fácilmente.
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D Figura 5.6 Pase el portaobjetos tres veces a través de la llama del mechero Bunsen, con la muestra hacia arriba. D) Algunas veces es útil dibujar un círculo alrededor del frotis con un lápiz graso, a fin de que se pueda ver más fácilmente. 5.3 Técnicas de tinción 5.3.1 Tinción de Gram La Tinción de Gram permitirá que el frotis a ser examinado por microscopía para determinar la presencia de bacterias, células de pus, bacilos de Vincent y Candida albicans. Las bacterias comensales, que siempre están presentes, no son importantes. No necesitan ser considerados para un examen más detenido o notificado. Ventajas Gracias a la tinción de Gram las bacterias se pueden clasificar en dos grupos: — grampositivas, que se tiñen de morado oscuro — gramnegativas, que se tiñen de color de rosa. Esto hace más fácil su identificación. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Soporte deslizante para portaobjetos ● Cristal violeta, modificación de Hucker (reactivo no. 18) ● Yodo de Lugol, solución al 0,1% (reactivo no. 36) ● Decolorante acetona-etanol (reactivo no. 4) ● Solución de carbol fucsina para la tinción de Ziehl-Neelsen (reactivo. Nº 16) (diluido 10 veces con etanol al 95%), rojo neutro, solución de 0,1% (reactivo Nº 40) o una solución de safranina (reactivo Nº 47). ● Agua corriente. Principio ● El cristal violeta tiñe a todas las bacterias de color violeta oscuro (Fig. 5.7). ● El Solución de yodo fija el color violeta más o menos fuertemente en la bacteria (fig. 5.8). ● Etanol al 95%: -Decolora ciertas bacterias cuando el cristal violeta no está fuertemente fijado por la solución de yodo (Fig. 5.9 (a)); -No decolorar otras bacterias cuando el cristal violeta está fuertemente fijado por la solución de yodo (figura 5.9 (b)). ● La carbolfucsina, rojo neutro o una solución de safranina (rosa): - Vuelve a teñir (rosa) a las bacterias decoloradas por el etanol (Fig. 5.10 (a)) - No tiene ningún efecto sobre las otras bacterias, que permanecen de color violeta oscuro (Fig. 5.10 (b)). TÉCNICA 1. Fije el frotis (como se describe en la sección 5.2.4) y déjelo enfriar. 2. Cristal de violeta: 1 minuto Vierta el cristal de violeta en el portaobjetos. Extiéndalo por el portaobjetos completamente. Déjelo reposar 1 minuto. Enjuáguelo con agua corriente y déjelo escurrir. 3. Solución de yodo de Gram: 1 minuto Bañe el portaobjetos con solución de yodo de Gram y déjelo reposar un minuto. Escurra la solución y enjuague el portaobjetos con agua corriente. 4. Etanol a l 95%: 1 minuto Bañe completamente el portaobjetos. Déjelo reposar 1 minuto. Enjuague con agua corriente y déjelo escurrir. Examine el frotis: — si quedan algunas zonas de color violeta aplique nuevamente etanol durante 15 - 30 segundos. Enjuáguelo bien con agua y escúrralo. Otra opción es decolorar la solución de yodo rápidamente con acetona – etanol. Sólo se necesitan 2 a 3 segundos. 5. Solución de safranina: 10 segundos. Vierta la solución de safranina en el portaobjetos y déjela reposar 10 segundos. En seguida lávela con agua, brevemente. Póngase a escurrir y déjela secar al aire libre.
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Otra opción es cubrir el frotis con carbolfucsina durante 2 minutos. 6. Lavar el frotis con agua limpia y coloque el portaobjetos en posición vertical en un soporte para portaobjetos para escurrir y secar al aire. SE DEBERAN BUSCAR: Bacterias = teñidas de violeta oscuro, o grampositivas, como estafilococos, estreptococos, micrococos, neumococos, enterococos, bacilos de la difteria y bacilos del ántrax. Bacterias = teñidas de color de rosa, o gramnegativas, como gonococos, meningococos, bacilos coliformes, shigelas, salmonelas o vibriones del cólera.
En las figuras siguientes se indican los pasos de la tinción y el aspecto de las bacterias. Las designadas con la letra (a) corresponden a las Gram negativas y las que aparecen con la letra (b) a las Gram positivas. Figura 5.7 Reacción de tinción Gram: Tinción con violeta cristal a: las bacterias Gram-negativas; b: las bacterias Gram-positivas. Figura 5.8 Reacción de tinción Gram: Fijación con yodo a: las bacterias Gram-negativas; b: las bacterias Grampositivas. Figura 5.9 Reacción de tinción Gram: Decoloración con etanol a: las bacterias Gram-negativas; b: las bacterias Gram-positivas. Figura 5.10 Reacción de tinción Gram: Tinción con carbolfucsina, rojo neutro o una solución de safranina a: las bacterias Gram-negativas; b: las bacterias Gram-positivas. B
A D
C TÉCNICA: Primero fije el frotis y déjelo enfriar (como se describe en la sección 5.2.4). A) cristal de violeta: 1 minuto. Vierta el cristal de violeta en el portaobjetos. Extiéndalo por el portaobjetos completamente. Déjelo reposar 1 minuto. Enjuáguelo con agua corriente y déjelo escurrir. B) Solución de
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yodo de Gram: 1 minuto. Bañe el portaobjetos con solución de yodo de Gram y déjelo reposar un minuto. Escurra la solución y enjuague el portaobjetos con agua corriente. C) Etanol al 95%: 1 minuto. Bañe completamente el portaobjetos. Déjelo reposar 1 minuto. Enjuague con agua corriente y déjelo escurrir. Otra opción es usar acetona – etanol. Sólo se necesitan 2 a 3 segundos. D) Solución de safranina 10 segundos. Vierta la solución de safranina en el portaobjetos y déjela reposar 10 segundos. Enseguida lávela con agua, brevemente. Póngase a escurrir y déjela secar al aire libre. Otra opción es cubrir el frotis con carbolfucsina durante 2 minutos.
Foto que muestra las bacterias Gram positivas teñidas de púrpura o violeta a la izquierda y a las Gram negativas a la derecha teñidas de rosado rojo. Foto de la derecha: Imagen microscópica de una bacteria Gram Negativa Pseudomonas aeruginosa (los puntos rosas-rojos).
Bacterias Gram-positivas Bacillus anthracis (bastones púrpuras) en una muestra de fluido cerebroespinal. Las otras células son leucocitos.
CAUSAS DE ERROR Puede ocurrir una reacción gram positiva falsa porque: — el frotis se ha fijado antes de que estuviera seco — el frotis ha sido demasiado grueso — quedaron sedimentos en el frasco de cristal de violeta (fíltrese antes de usarlo) — la solución de yodo de Gram no se escurrió completamente — no se dejó que el etanol actuara suficiente tiempo — la solución de safranina fue demasiado fuerte o se dejó demasiado tiempo en el portaobjetos. Puede ocurrir una reacción gramnegativa falsa porque: — no se dejó actuar suficiente tiempo la solución de yodo de Gram — el etanol (o acetato – etanol) se dejó demasiado tiempo en el portaobjetos y no se lavó adecuadamente. Examen microscópico En primer lugar examinar el portaobjeto con el objetivo x40 para ver cómo se distribuye el frotis y luego usar el objetivo de inmersión en aceite x100. Microorganismos Gram-positivos Aparecen microorganismos Gram-positivos de color púrpura oscuro (fig. 5.11) (por ejemplo, estafilococos, estreptococos, micrococos, neumococos, enterococos, bacilos de la difteria, bacilos del ántrax). Microorganismos Gram-negativos Aparecen microorganismos Gram-negativos de color rojo o fucsia (Fig. 5.12) (por ejemplo, gonococos, meningococos, bacilos coliformes, Shigella, Salmonella, Vibrio cólera). Identificación de microorganismos específicos Candida albicans aparece tan grande (2-4 µm de diámetro) en formas ovales o como esporos Gram positivos redondos (células brotadas o con blastosporos) (Fig. 5.13 (a)) con filamentos semejantes a un micelio de longitud variable con extremos redondeados (seudomicelios o seudohifas) (Fig. 5.13 (b)). Los "Actinomicetos" son vistos como gránulos grandes, a veces visibles a simple vista (color de blanco a amarillo). El centro es Gram-negativo, con una periferia grampositiva (Fig. 5.14). Se encuentran en la piel de pus, esputo, etc. Los bacilos de Vincent son vistos como espiroquetas Gram-negativas y bastoncillos fusiformes (Fig. 5.15). Ninguna otra bacteria debería ser informada, debido a que hay muchas bacterias comensales que pueden ser confundidas con agentes patógenos.
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Figura 5.12 Microorganismos Gram-negativos Figura 5.11 Microorganismos Gram-positivos
5.3.2 TINCIÓN CON COLORANTE DE ALBERT (para la detección de Corynebacterium diphtheriae) Si se sospecha de difteria un frotis de esputo debe ser teñido con el colorante de Albert. Este colorante se utiliza para mostrar los gránulos volutin teñidos de oscuro que aparecen en los bacilos de Corynebacterium diphtheriae (ver Fig. 5.16). Materiales y reactivos ● Microscopio ● Soporte para portaobjetos ● Colorante de Albert (reactivo. Nº 7). Método 1. Fije el frotis como se describe en la sección 5.2.4. 2. Cubrir el frotis con tinción de Albert durante 3-5 minutos. 3. Lavar la tinción con agua limpia y coloque el portaobjetos en posición vertical en un soporte para portaobjetos deslizante para escurrir y secar al aire. El examen microscópico En primer lugar examinar el portaobjeto con el objetivo x40 para ver cómo se distribuye el frotis y luego usar el objetivo de inmersión en aceite x100. Corynebacterium diphtheriae aparece como bastoncillos verdes (fig. 5.16) que contienen gránulos volutin verde-negro. Los bastoncillos pueden estar dispuestos en filas (a) o en formación en V (b), o unidas en ángulos, dando la apariencia de los caracteres chinos (c). La presencia de bastoncillos delgados que contienen gránulos volutin es prueba suficiente para iniciar el tratamiento de la difteria. Si se sospecha de difteria, una muestra debe ser enviada al laboratorio de bacteriología para la el cultivo (véase la sección 5.4.4).
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Figura 5.16 Corynebacterium diphtheriae Los bastoncillos de C. diphtheriae pueden estar dispuestos en filas (a) o en formación en V (b) o unidas en ángulo, dando la apariencia de los caracteres chinos (c).
Corynebacterium diphtheriae teñidos con coloración de Albert. 5.3.3 TINCIÓN CON ZIEHL-NEELSEN (PARA LA DETECCIÓN DE BACILOS ÁCIDOALCOHOL RESISTENTES) El Ziehl-Neelsen se utiliza para identificar micobacterias y ooquistes de Cryptosporidium spp. (Ver sección 4.3.2). Principio Cuando las micobacterias y los ooquistes de Cryptosporidium spp. se tiñen con una solución fuerte caliente de carbolfucsina, se resisten a la decoloración con una solución de ácido o ácido-etanol y se tiñen de rojo. Otros microorganismos y los tejidos se decoloran por la solución de ácido-etanol y se ponen de manifiesto por una tinción de contraste como el azul de metileno, que se tiñe de azul. Mycobacterium leprae and ooquistes de Cryptosporidium spp. sólo resistir la decoloración con soluciones débiles de ácido o ácido-etanol. Ellos se ponen de manifiesto mediante la técnica de Ziehl-Neelsen modificada (Tabla 5.1). Mycobacterium spp. y ooquistes de Cryptosporidium spp. se conocen como "ACIDFast" debido a su resistencia a la decoloración con solución de ácido. Ellos no se tiñen bien con manchas de tinción de Gram o simples como el azul de metileno. Mycobacterium leprae y los ooquistes de Cryptosporidium spp. sólo resisten la decoloración con soluciones débiles de ácido o ácido-etanol. Ellos se ponen de manifiesto mediante la técnica de Ziehl-Neelsen modificada (Tabla 5.1). Mycobacterium spp. y los ooquistes de Cryptosporidium spp. se conocen como “Ácido Alcohol Resistentes” debido a su resistencia a la decoloración con solución de ácido. Ellos no se tiñen bien con los colorantes de la tinción de Gram o colorantes simples como el azul de metileno. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Lámpara de alcohol o mechero Bunsen ● Soporte para portaobjetos ● Pinzas ● Solución de carbolfucsina para la tinción Ziehl-Neelsen (reactivo. Nº 16) (filtrada antes de su uso) ● Ácido-etanol de Ziehl-Neelsen (reactivo. Nº 5) ● El verde de malaquita, solución al 1% (véase el reactivo no. 31), se diluyó 1:1 con agua destilada, o con solución de azul de metileno (reactivo no. 39). ● Portaobjetos de vidrio (si es posible, nuevos, que no estén rayados) ● Asa para siembra ● Taco de algodón colocado en un alambre para flamear ● Temporizador Método 1. Fije el frotis como se describe en la sección 5.2.4.
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2. Cubrir el frotis con el colorante filtrado carbolfucsina. Usando pinzas, calentar suavemente el portaobjetos sobre una lámpara de alcohol o mechero Bunsen hasta que el colorante comience a evaporarse (a aproximadamente 60 ° C-no recalentar). 3. Dejar el colorante sobre el portaobjetos durante 5 minutos. 4. Lavar el colorante con agua limpia y cubra el frotis con ácido-etanol durante 5 minutos o hasta que el frotis sea de color rosa pálido. 5. Lavar bien el portaobjetos en agua limpia y cubrir el frotis de verde malaquita o azul de metileno durante 1-2 minutos. 6. Lavar la tinción con agua limpia y coloque el portaobjetos en posición vertical en un soporte para portaobjetos deslizante para escurrir y secar al aire. No seque el frotis (con papel secante u otro material). El examen microscópico Examinar el portaobjetos bajo el microscopio, primero use el objetivo de x40 para ver cómo se distribuye el frotis. A continuación, examinar sistemáticamente el frotis con el objetivo de inmersión en aceite x100 para buscar bacilos ácido-alcohol resistentes (bacilos rojos). Examinar el portaobjetos de extremo a extremo en pasos hasta que todo el frotis está cubierto. Cuente el número de bacilos ácido-alcohol resistentes presentes por campo microscópico (o por 100 campos microscópicos, si muy pocos bacilos ácido-alcohol resistentes están presentes). Antes de pasar a otro portaobjeto, limpie el objetivo con papel para lentes para evitar la transferencia de bacilos ácido-alcohol resistentes a otro portaobjeto. Si se pueden ver bacilos rojos, informar como "bacilos ácido-alcohol resistentes presentes". Informe el número de bacilos ácido-alcohol resistentes presentes como se describe en la Tabla 5.2. Si no se ven bacilos ácido-alcohol resistentes, informar como "no se encontraron bacilos ácidoalcohol resistentes". Tabla 5.1 Microorganismos teñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen Muestra Microorganismo Esputo M. tuberculosis M. bovis Piel M. leprae M. ulcerans Orina M. tuberculosis M. bovis Materia fecal Cryptosporidium spp. Lavado gástrico M. tuberculosis M. bovis Tabla 5.2 Informar sobre el número de bacilos ácido-alcohol resistentes presentes Número de bacilos ácido-alcohol resistentes Resultado presentes por campo de microscopio Especifique el número presente por cada 100 < 0,1 (< 10 por 100 campos) campos 0,1-1 (10-100 por 100 campos) + 1-10 ++ > 10 +++
AGREGADO: Se muestra una variante de la técnica de Ziehl – Neelsen, es decir una variante significaría no una modificación establecida pero si una forma para realizar la misma técnica de tinción. La técnica que se describe más adelante se basa en: Smithwick, R.W. Laboratory manual for acid -fast microscopy, 2a. ed., Atlanta, Secretaría de Salud y Servicios Humanos de los EUA, Centros para el Control de Enfermedades, 1976. Véase también: Unión Internacional contra la Tuberculosis, Technical guide for collection, storage and transport of sputum specimens and examination for tuberculosis by direct microscopy, París IUAT, 1976. El bacilo de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, es resistente a los ácidos y se tiñe de rojo con la coloración de Ziehl y Neelsen, en tanto que casi todos los demás microorganismos se tiñen de azul. Recolección del esputo La calidad de la muestra es sumamente importante; véase antes, donde figura el método de recolección para exámenes directos, y si la muestra se debe enviar a otro laboratorio para realizar un cultivo. MATERIALES Portaobjetos de vidrio (si es posible, nuevos, que no estén rayados) Asa para siembra Taco de algodón colocado en un alambre para flamear Temporizador con alarma Microscopio Lámpara de alcohol o mechero Bunsen Soporte para portaobjetos Pinzas REACTIVOS Fucsina fenicada para tinción de Ziehl y Neelsen Mezcla de ácido y etanol Azul de metileno acuoso Alcohol metílico (para quemar) Frasco de lavado con agua destilada
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PREPARACION DEL FROTIS DE ESPUTO 1. Prepare dos portaobjetos. Tome una porción purulenta del esputo para cada portaobjetos, usando un asa estéril para siembra o dos asas, para hacer una tenaza. 2. Haga los frotis: — tan delgados como sea posible — de manera que abarquen el área más extensa que se pueda, trazando con el asa círculos concéntricos bien separados, aunque sin llegar a las orillas del portaobjetos. Importante: Cuando haya terminado de preparar los frotis sumerja las asas para siembra en un antiséptico líquido y sacúdalas dentro para quitar los residuos de esputo. A continuación coloque las asas junto a la llama, espere a que se sequen y, acto seguido, las pasa a través de ésta. Así se evitará que el esputo infectado se disemine en el aire al exponerlo a la llama. 3. Fijación Deje secar los frotis al aire y enseguida los fija pasando los portaobjetos tres veces a través de la llama. 4. Numere los portaobjetos y colóquelos a través de dos varillas de vidrio sobre el fregadero. 5. Tinción con fucsina fenicada: 5 minutos al calor Cubra los portaobjetos con fucsina fenicada, que deberá filtrarse antes de usarla. Moje el taco de algodón con alcohol metílico, enciéndalo y pásese lentamente por debajo de los portaobjetos para calentarlos. 6. Tan pronto como los portaobjetos comiencen a emanar vapor ponga el cronómetro a marcar 5 minutos. Siga calentando durante 5 minutos de modo que se vea el vapor, aunque sin llegar al punto de ebullición. Si la fucsina filtrada comienza a secarse durante este calentamiento añada cierta cantidad inmediatamente para evitar que se seque por completo. 7. Lavado con agua destilada Deje enfriar los portaobjetos. A continuación lávelos suavemente con agua hasta que éste no arrastre color alguno. 8. Decoloración con la mezcla de ácido y etanol Cúbranse los portaobjetos con la mezcla de ácido y etanol. Déjense reposar 3 minutos. Lávense con agua corriente y escúrranse. Examínense; si se han decolorado completamente tíñanse con azul de metileno como se indica más adelante, en el punto 10. Si aún se pueden apreciar residuos de fucsina (en frotis gruesos) aplique nuevamente ácido con etanol y déjelo reposar 1 minuto. 9. Lavado con agua Compruebe que los portaobjetos se decoloran completamente. 10. Tinción con azul de metileno: 30 segundos Cubra los portaobjetos con este colorante. Déjelos reposar 30 segundos. Lávelos con agua corriente durante 1 minuto. Escúrralos y déjelos secar en una gradilla para portaobjetos. EXAMEN DE LAS PREPARACIONES Utilice el objetivo de inmersión en aceite. Los bacilos de la tuberculosis: — son de color rojo fuerte: destacan sobre un fondo azul — tienen forma recta o ligeramente curva — son muy pequeños (1 - 4 µm) — son frecuentemente granulosos — se disponen en grupos de 3 - 10 bacilos que semejan trozos de hilo o parecen formar letras torcidas (con frecuencia se encuentran cerca de los hilos de fibrina). En lugar de la solución de azul de metileno se puede emplear una solución de verde de malaquita al 0,2% en agua destilada. El procedimiento es Igual. El verde de malaquita tiñe de este color el fondo del campo; los bacilos se tiñen de rojo. No se confundan con bacilos de la tuberculosis: 1. Las levaduras, que se tiñen más o menos de rojo. Al calentarlas frecuentemente se rompen y forman conglomerados de gránulos voluminosos de color rojo. 2. Manchas de colorante (cuando el portaobjetos no se ha decolorado adecuadamente). Importante: Otro bacilo patógeno resistente a los ácidos es el causante de la lepra (véase la página 262). En la naturaleza, Incluso el agua corriente, se suelen encontrar diversos bacilos que son más o menos resistentes a los ácidos. Algunas veces provocan resultados Incorrectos en el laboratorio.
A A) Bacilos tuberculosos. B) 1) Levaduras; 2) Manchas de colorante. CÓMO EXAMINAR LAS PREPARACIONES
B
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Haga un examen completo del primer portaobjetos empleando el objetivo de inmersión en aceite (con iluminación máxima y sin filtro de color), procediendo como se indica en la figura. Portaobjetos positivo Una vez que se hayan examinado aproximadamente 10 bacilos resistentes a los ácidos en el primer portaobjetos, examine el segundo para confirmar este resultado. Portaobjetos negativo Examine el primer portaobjetos minuciosamente (10 minutos) y a continuación haga lo mismo con el segundo portaobjetos (10 minutos).
A
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K J TÉCNICA: A) Materiales y reactivos. B) Preparación del frotis de esputo. C) Haga los frotis lo más delgados posibles trazando con el asa círculos concéntricos bien separados, aunque sin llegar a las orillas del portaobjetos. Figura 5.6 Fijación del frotis a la llama con el lado de la muestra hacia arriba. D) Numere los portaobjetos y colóquelos a través de dos varillas de vidrio sobre el fregadero. E) Tinción con fucsina fenicada: 5 minutos al calor. Cubra los portaobjetos con fucsina fenicada. F) Moje el taco de algodón con alcohol metílico, enciéndalo y pásese lentamente por debajo de los portaobjetos para calentarlos. Tan pronto como los portaobjetos comiencen a emanar vapor ponga el cronómetro a marcar 5 minutos. Siga calentando durante 5 minutos de modo que se vea el vapor, aunque sin llegar al punto de ebullición. G) Lavado con agua destilada hasta que no quede color alguno. H) Decoloración con la mezcla de ácido y etanol. Cúbranse los portaobjetos con la mezcla de ácido y etanol. Déjense reposar 3 minutos. Lávense con agua corriente y escúrranse. I) Lavado con agua corriente. Compruebe decoloración completa. J) Tinción con azul de m etileno: 30 segundos. Luego de esto Lávelos con agua corriente durante 1 minuto. Escúrralos y déjelos secar en una gradilla para portaobjetos. K) Cómo examinar las preparaciones: con objetivo x100 en aceite de inmersión, proceda como se indica en la figura. Método de los Centros para el Control de Enfermedades y la OMS, en: Smithwick, R.W. Laboratory manual for acid-fast microscopy, 2a. ed., Atlanta, Secretaría de Salud y Servicios Humanos de los EUA, Centros para el Control de Enfermedades, 1976 Resumen Principio del método de tinción de ziehl y neelsen El bacilo causante de la tuberculosis en el ser humano es Mycobacterium tuberculosis: — tipo humano — tipo bovino y aviario (raro). Estos bacilos son resistentes a los ácidos; es decir, una vez que se han teñido de rojo con fucsina fenicada no se pueden decolorar por medio de ácidos o etanol.
Fucsina fenicada: — tiñe de rojo todos los microorganismos que se encuentran en el esputo.
Mezcla de ácido y etanol: — decolora todos los microorganismos y elementos celulares, exceptuando los bacilos resistentes a los ácidos (bacilos de la tuberculosis). NO BAAR
BAAR Azul de metileno: — tiñe de azul todos los microorganismos y elementos decolorados por la mezcla de ácido y etanol, pero los bacilos acidorresistentes se conservan teñidos de rojo.
NO BAAR BAAR BAAR: Bacilos Ácido Alcohol Resistentes. Otros microorganismos patógenos que se encuentran en el esputo Invariablemente se necesitan cultivos para identificar estos microorganismos. Sin embargo, la presencia de algunas especies se puede sospechar en los exámenes directos (con tinción de Gram). (a) Neumococos: Son diplococos grampositivos. Cada par se encuentra rodeado por una cápsula que se conserva incolora. (b) Hongos: Son levaduras o filamentos de micelio provistos de esporas o sin ellas. Pueden ser patógenos (es necesario que se haga su identificación en un laboratorio especializado) o saprofitas que se han multiplicado en la muestra después de obtenerla. (c) Actinomicetos (gránulos)
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Asimismo es posible encontrar parásitos en las preparaciones sin tinción; por ejemplo, huevos del distoma pulmonar y, muy raras veces, huevos de esquistosomas y Syngamus.
a) Neumococos; b) Hongos.
Visualización de Mycobacterium tuberculosis usando la tinción de Ziehl-Neelsen.
Fuente: www.telmeds.org Panamá PESTE: BÚSQUEDA DE BACILOS Principio Para confirmar que existe un caso de peste infecciosa se requiere que se aislé e identifique el bacilo causante, Yersinia pestis. Con frecuencia, durante las epidemias o epizootias es posible elaborar un diagnóstico por presunción basado en la presencia de bacilos de la peste, que se colorean característicamente por su forma bipolar con la tinción de Wayson (reactivo No 63) en muestras obtenidas de bubas por aspiración. Obtención de las muestras Materiales — Una jeringa de 10 ml ó 20 ml con aguja de calibre 18 (1,2 mm) o calibre 19 (1,0 - 1,1 mm) — Tintura de yodo — Etanol al 70% — Solución de cloruro sódico — Portaobjetos de vidrio. Método Esto sólo puede ser realizado por un médico con experiencia ya que hay riesgo de infección. En todo caso siempre es bueno conocer como se realiza la obtención de la muestra y la manipulación y descarte de ésta. 1. Desinfecte la piel de la buba con tintura de yodo. 2. Aspire con la aguja y la jeringa algunos ml (metros de solución de cloruro sódico. 3. Sosteniendo la jeringa entre el índice y el pulgar de la
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mano derecha introduzca la aguja en la buba. 4. Con la mano izquierda tire lentamente del émbolo de la jeringa. Deberá entrar en ésta un líquido que puede ser sanguinolento. En el caso de que no entre líquido alguno en la jeringa inyecte la solución de cloruro sódico en la buba, empuje suavemente el émbolo con el pulgar. Imprímase a la aguja introducida en la buba un movimiento circular. A continuación tire nuevamente del émbolo hasta que se llene, si es posible, la mitad de la jeringa. 5. Retire la jeringa y limpie con una pieza de algodón impregnada de etanol el sitio donde se hizo la punción. 6. Sostenga la jeringa en posición vertical, con la aguja hacia abajo, y deje que escurran por ésta una o dos gotas sobre un portaobjetos para preparar un frotis como se indica en la página 232. 7. Si el líquido de la buba se va a enviar a un laboratorio especializado para realizar cultivos se deberán depositar algunos mililitros en medio de transporte de Cary y Blair y despachar el frasco, con la tapa enroscada herméticamente, en un empaque doble. 8. Sumerja la jeringa y la aguja en fenol al 5%, extrayendo suavemente el émbolo (véase la página en cuanto al desecho de los materiales infectados). Importante: Al manejar el material extraído de las bubas se debe tener sumo cuidado para evitar que se dispersen en el aire gotas minúsculas que pueden causar accidentalmente la infección de otras personas y la propagación de la peste neumónica. 5.3.4 TINCIÓN CON EL COLORANTE DE WAYSON (PARA LA DETECCIÓN DE YERSINIA PESTIS) La tinción con el colorante de Wayson se utiliza para identificar Yersinia pestis en aspirados de bubas (ver sección 5.10). Materiales y reactivos ● Microscopio ● Soporte deslizante para portaobjetos ● 70% metanol ● Colorante de Wayson (reactivo. N º 63). Método Fijación 1. Fije el frotis con metanol durante 2 minutos. También, puede proceder de esta forma: Coloque durante 5 minutos los frotis, que se habrán dejado secar previamente al aire, en una cubeta para tinción llena con metanol químicamente puro. Luego saque los portaobjetos de la cubeta y déjelos secar al aire antes de proceder a teñirlos. Tinción 2. Después de haberlos fijado de la manera descrita, cubra los frotis con colorante de Wayson durante 10 -20 segundos (promedio 15 segundos). 3. Lavar el portaobjetos en agua limpia y colocarlo en posición vertical en un soporte deslizante para portaobjetos y secado al aire. El examen microscópico En primer lugar examinar el portaobjeto con el objetivo x40 para comprobar la distribución del material y luego usar el objetivo de inmersión en aceite x100 observando las porciones delgadas de los frotis teñidos en busca de los bacilos característicos de la peste. Yersinia pestis aparece como organismos bipolares que se tiñen de azul con los extremos de color rosa. Es decir, en otras palabras, con el colorante de Wayson los cuerpos polares de Y. pestis se tiñen de azul y el resto del frotis toma un color rojizo.
A
B
C D A) Fijación con metanol. B) Saque los portaobjetos de la cubeta y déjelos secar al aire antes de proceder a teñirlos. C) Cubra los frotis con colorante de Wayson durante 15 segundos. D) Lave los portaobjetos cuidadosamente con agua corriente.
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Bacteria bipolar, cuerpos polares teñidos
A
B A) Tinción de Wayson en Yersinia pestis. Note la característica apariencia de alfiler de seguridad de bacteria. B) Las tinciones bipolares obscuras de Yersinia pestis pueden observarse claramente en esta fotomicrografía de sangre de una víctima de plaga (Tinción de Wright). Fuente: http://pathmicro.med.sc.edu/spanish/chapter17.htm CDC 5.3.5 TINCIÓN CON AZUL DE METILENO DE LOEFFLER (PARA LA DETECCIÓN DE BACILLUS ANTHRACIS) Azul de metileno de Loeffler se usa para teñir el Bacillus anthracis, que causa ántrax (ver sección 5.11). Nota: El Ántrax es una enfermedad altamente contagiosa. Por lo tanto, deben ser utilizados los guantes y ropa protectora cuando los especímenes sospechosos de estar infectados con ántrax son manejados. El procedimiento de tinción debe llevarse a cabo en un gabinete de seguridad. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Soporte para portaobjetos ● Permanganato de potasio, solución al 4% (reactivo no. 46) ● Azul de metileno de Loeffler (reactivo. N º 35). Método 1. Cubrir el portaobjetos con permanganato de potasio durante 10 minutos. 2. Lavar el portaobjetos en agua limpia y cubra el frotis con azul de metileno de Loeffler durante 1 minuto. 3. Lavar el frotis con agua limpia y coloque el portaobjetos en posición vertical en un soporte para portaobjetos deslizante para escurrir y secar al aire. Examen microscópico En primer lugar examinar el frotis con el objetivo de x40 y luego usar el objetivo de inmersión en aceite x100. Los bacilos de Bacillus anthracis aparecen como grandes bacilos azules rodeados por una cápsula de color purpúreo o púrpura pálido azulado, los bacilos aparecen en cadenas (Fig. 5.17).
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A Figura 5.7 Bacillus anthracis. A) Bacillus anthracis, tinción con azul de metileno de un frotis de tejido, observado con gran aumento. Nótese la intensa coloración roja o púrpura de la gran cápsula de este microorganismo y el gran número de bacterias. La demostración de la cápsula distingue al B. anthracis de la contaminación postmortem por un Clostridium. Fuente: http://www.merckmanuals.com/vet/generalized_conditions/anthrax/overview_of_anthrax.html 5.4 EL EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO Y FROTIS DE GARGANTA La presencia de microorganismos patógenos se pone de manifiesto mediante el examen microscópico de muestras de esputo e hisopados de garganta. Los microorganismos incluyen: ● Las bacterias: Bacilos ácido-alcohol resistentes Gram-positivas y Gram-negativas. ● Los hongos o levaduras: Filamentos de micelio con o sin poros. Ellos pueden ser patógenos o saprófitos que se han multiplicado en la muestra después de la recogida (Es necesaria la identificación correcta por parte de un laboratorio especializado). ● Actinomicetos: Gránulos (véase antes). ● Los parásitos: Huevos de trematodos pulmonares y, muy raramente, huevos de esquistosomas y los gusanos adultos de Mammomonogamus laryngeus. El cultivo es a menudo necesario para la identificación de los agentes infecciosos. 5.4.1 Materiales y Reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Contenedores a prueba de fugas para las muestras de esputo, de cuello ancho, como frascos o cajas de papel rígido (véase la sección 2.5.5) ● Hisopos estériles de algodón ● Depresor lingual (abatelenguas) o espátula ● Tubos de ensayo ● Cristales de cloruro de sodio ● N-cloruro de cetilpiridinio ● Agua destilada. ● Reactivos para elaborar la tinción de Gram Si es posible, los hisopos de algodón estériles deben ser preparados en un laboratorio de nivel central, de lo contrario, la siguiente técnica se puede utilizar. 1. Preparar unos palos delgados de madera (o alambre de aluminio), de 18 cm de largo y 2 mm de diámetro. Prepare tiras de lana de algodón, de 6 cm de largo por 3 cm de ancho y tan delgado como sea posible. 2. Enrolle la ronda de algodón en un extremo de la barra (o cable). 3. Moldee el hisopo en una forma cónica. 4. Colocar en un tubo de ensayo de vidrio. Taponar los tubos con tapones de algodón no absorbente. Esterilizar (ver sección 3.5.5). 5.4.2 Método Colección de muestras Muestras de esputo Obtención de la muestra Las muestras de esputo deben recogerse temprano en la mañana. La enfermera o el técnico de laboratorio deberán estar presentes y se empleará el procedimiento siguiente: 1. Si es posible, el paciente deberá estar de pie. 2. Hará un movimiento inspiratorio sumamente profundo, llenando de aire los pulmones. 3. Vaciará los pulmones con una sola aspiración, tosiendo al mismo tiempo tan fuerte y profundamente como pueda (Fig. 5.18). 4. Escupirá en el interior del tarro para muestras el material que haya expectorado. 5. Asegure la parte superior del tarro y coloque una etiqueta en el tarro, en que se lean claramente el nombre o número del paciente y la fecha (ver sección 3.7.1). Verifique que se haya producido una cantidad suficiente de esputo. Tarros y cajas para recolectar esputo Para recolectar muestras en el sitio donde se encuentre el paciente empléense tarros que se puedan usar nuevamente o cajas de papel rígido fabricadas en el propio laboratorio (véase antes). Para la limpieza y desinfección de los receptáculos véase antes.
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En la actualidad, se pueden conseguir en los comercios o bien proveer a los laboratorios periféricos por parte del Ministerio de Salud Pública de cada país, frascos estériles de plástico, seguros, bien protegidos con envoltorios que son fabricados para este tipo de recolección de esputo, o bien, frascos estériles de plástico adaptados para la recogida de este material y también que sirven para recoger otros materiales biológicos. Estos frascos estériles de plástico son desechables y de un solo uso, lo que facilita su descarte y evita manipular el frasco para su reutilización ahorrando tiempo y prescindiendo cualquier posible contacto con material infeccioso. Después de obtener la muestra Compruebe que se ha recogido una cantidad suficiente de esputo. El esputo de un individuo infectado suele contener: — moco denso con burbujas — hilos de fibrina — porciones de pus — algunas vetas de sangre. Importante: La saliva espumosa líquida y las secreciones nasales y faríngeas no son expectoraciones aceptables para el examen bacteriológico. Debe obtenerse otra muestra del esputo del paciente.
A
B
C D
E A) El técnico o enfermera, si es posible, deben pedirle al paciente que se ponga de pie (véase flecha). Esto facilitará la recolección del esputo. B) El paciente debe hacer un movimiento inspiratorio sumamente profundo, llenando de aire los pulmones (flecha). C) El paciente debe vaciar los pulmones con una sola aspiración, tosiendo al mismo tiempo tan fuerte y profundamente como pueda (vea los movimientos de la cabeza en la ilustración). D) El paciente debe escupir en el interior del tarro para muestras el material que haya expectorado. E) Tape el frasco y coloque una etiqueta en el tarro, en que se lean claramente el nombre o número del paciente y la fecha. Remisión del esputo Si la muestra se va a enviar a un laboratorio para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis (véase la sección 5.4.4), pida al paciente que expectore directamente en un frasco de boca ancha, con tapa de rosca que contiene 25 ml de la siguiente solución (medio de transporte líquido): Cloruro de N-cetilpiridinio 5 g Cloruro de sodio 10 g Agua destilada hasta 1000 ml. En este caso, el paciente deberá expectorar directamente en el líquido contenido en el frasco (es decir, el medio de transporte líquido). Atornille la tapa y efectúe la remisión de la muestra. Esta preparación se conserva por lo menos durante 10 días.
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B A A) Medio de transporte líquido en un frasco de boca ancha y tapa a rosca. B) El paciente deberá expectorar directamente en el líquido contenido en el frasco. Atornille la tapa y efectúe la remisión de la muestra. El diagnóstico de tuberculosis pulmonar también se puede hacer por: 1. Examen directo (y cultivo) de líquidos obtenidos por lavado del estómago (especialmente en niños): Centrifúguense estos líquidos a alta velocidad durante 20 minutos, hágase un frotis con el sedimento y tíñase del mismo modo que el esputo. 2. Cultivo de exudados laríngeos. Para investigar otros sitios de infección se intenta detectar los bacilos en: 1. La orina (tuberculosis renal); 2. El pus de abscesos cerrados (tuberculosis ósea). 3. El líquido cefalorraquídeo (meningitis tuberculosa, especialmente en niños); 4. Líquidos aspirados de glándulas. No se recomienda examinar heces fecales en busca de bacilos de la tuberculosis. MUESTRAS OBTENIDAS EN LA GARGANTA Ventajas Los exámenes microscópicos de frotis teñidos que se han preparado con muestras obtenidas en la garganta proporcionan a veces indicios de los microorganismos que causan una infección. Para determinar con certeza la identidad de estos microorganismos se necesita efectuar cultivos bacterianos. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Idealmente la obtención de la muestra la debería efectuar un médico o una enfermera capacitada, aunque es posible que se solicite al técnico del laboratorio que lo haga. 1. El paciente debe permanecer sentado frente a la luz (se puede usar también una linterna eléctrica). 2. Indique al paciente que abra la boca sin sacar la lengua y diga "Ahhhh...". Mire cuidadosamente en busca de signos de inflamación y cualquier exudado, pus, depósitos membranosos o úlceras. 3. Mientras el paciente dice "Ahhhh", deprima los 2/3 anteriores de la lengua con el abatelenguas, empleando la mano izquierda (Fig. 5.19). De este modo se deberá poder observar las amígdalas (A) y el fondo de la faringe enmarcado por los pilares (P). 4. Introduzca el hisopo estéril con la mano derecha. Evite tocar la lengua, que se encuentra cubierta de microorganismos. Tenga cuidado de no contaminar el hisopo con la saliva. Devolver el hisopo para el tubo de ensayo estéril. 5. Localice la porción infectada (inflamada) de la garganta. Estará sumamente enrojecida o blanca, dependiendo del caso. Por lo general la infección se descubrirá en las amígdalas o las fauces. 6. Frote el hisopo con firmeza en la parte inflamada, haciéndolo girar y, si existen membranas, recójalas con el hisopo. 7. Si no se encuentran anormalidades pase el hisopo por las amígdalas, las fauces y la parte posterior del paladar blando. Preparación de los frotis Frote el hisopo sobre 2 ó 3 portaobjetos haciéndolo girar al mismo tiempo para formar frotis amplios y suficientemente gruesos. Prepare dos frotis de cada una de las muestras (véase la sección 5.2.3). Teñir un frotis con tinción de Albert (ver sección 5.3.2) y el otro con Ziehl-Neelsen (ver sección 5.3.3). Si el material obtenido se va a sembrar en un medio de cultivo o se va a enviar sembrado en un medio de transporte, tome dos muestras: — la primera, para los medios de cultivo o transporte — la segunda, para preparar frotis que se examinarán directamente.
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A
A) Materiales necesarios. Figura 5.19 Examinar la parte posterior de la garganta. A: Amígdalas; P: Pilares. B) Frote el hisopo sobre 2 ó 3 portaobjetos haciéndolo girar al mismo tiempo para formar frotis amplios y suficientemente gruesos. B
5.4.3 EXAMEN MICROSCÓPICO Examine el esputo con el ojo desnudo y luego por microscopía. El esputo de una persona que sufre de una infección bacteriana generalmente contiene: Mucosidad espesa con burbujas de aire -Hilos de fibrina -Placas de pus -Rayas de color marrón ocasionales de sangre. Después de la inspección visual de informar la apariencia del esputo como: -Purulento verdoso, que contienen pus; -Mucopurulento: verdoso, que contiene tanto pus y moco; -Mucoide: contiene principalmente mucus; -Mucosalival: moco que contiene una pequeña cantidad de saliva. Si hay sangre, esto también debe ser informado. Una muestra de esputo compuesto en su mayoría de la saliva no será útil ya sea para el cultivo o para el examen directo. Examinar la tinción con la tinción de Albert como se describe en la sección 5.3.2. Si se ven las barras verdes que contienen gránulos volutin negro - verduzcos (ver fig. 5.16), informar como "Corynebacterium diphtheriae presente". Examinar el frotis teñido con Ziehl-Neelsen como se describe en la sección 5.3.3. Si se pueden ver bacilos rojos, informar como "bacilos ácido-alcohol resistentes presentes". Informe el número de bacilos ácido-alcohol resistentes presentes como se describe en la Tabla 5.2. Si no se ven bacilos ácido-alcohol resistentes, informar como "sin bacilos ácido-alcohol resistentes encontrados". 5.4.4 ENVÍO DE MUESTRAS PARA CULTIVO1 Muestras de esputo 1Véase también la sección 3.7.1. Los Especímenes de esputo se envían a un laboratorio de bacteriología para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis, para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana y la inoculación en cobayos. La muestra debe ser recogida en un medio de transporte, tal como se describe en la sección 5.4.2 y enviado de inmediato al laboratorio. Tiempo de conservación máximo: 10 días. Muestras de garganta Para la investigación de rutina Tan pronto como se haya recogido la muestra, reemplace el hisopo en el tubo de ensayo estéril (véase la sección 5.4.2) y envíelo inmediatamente al laboratorio de bacteriología. Para la confirmación de la infección por Corynebacterium diphtheriae Si se sospecha de difteria, la muestra debe ser enviada en un tubo estéril con suero coagulado (que se deben almacenar en un refrigerador). Frote el hisopo sobre la superficie inclinada del suero, comenzando a partir de la parte inferior del tubo y no aplicar presión (fig. 5.20). Envíe el mismo día. Tiempo de conservación máximo: 24 horas. Para la detección de meningococos
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Esto rara vez es necesario, excepto para los estudios epidemiológicos dirigidos a identificar a los portadores de meningococos. Si es posible, utilice un medio de transporte como el medio de transporte de Stuart, modificado (reactivo. N º 56). Frote el hisopo sobre la superficie del medio de un lado del tubo al otro, comenzando a partir de la parte inferior del tubo (fig. 5.21). Envía el mismo día. Tiempo de conservación máximo: 3 días.
Figura 5.20 Despacho muestras faríngeas en suero coagulado Figura 5.21 Envío de muestras de garganta en medio de transporte de Stuart GONORREA El gonococo, Neisseria gonorrhoeae, es el causante de la gonorrea, una enfermedad de transmisión sexual sumamente frecuente. Su término de Incubación es de 4 - 8 días. Exudado genitourinario Pus amarillo y denso: ¿gonococos? Líquido claro, blanquecino: Trichomonas* Exudado blanco y denso: ¿hongos?* Otros tipos de exudado: uretritis inespecífica (no identificable por examen directo). * Véase lo relativo a Trichomonas y los hongos en la página correspondiente. Principio Los frotis de pus uretral toman la tinción de Gram. Los gonococos se pueden reconocer por tres características: 1. Son diplococos (se agrupan en pares) 2. Son gramnegativos 3. Son intracelulares (se hallan dentro de los leucocitos).
Leucocito con diplococos gramnegativos intracelulares.
5.5 EXAMEN DE MUESTRAS UROGENITALES PARA LA GONORREA 5.5.1 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Frasco, 100 ml ● Pipeta Pasteur ● Algodón ● Medio de transporte Amies (reactivo. N º 9). ● Asa de siembra 5.5.2 Método Colección de muestras Obtención de muestras de los pacientes varones 1. Si es posible, tómese la muestra a primera hora de la mañana, antes de que el paciente haya orinado. Cuando sea necesario límpiese el meato con un hisopo de algodón humedecido con solución de cloruro sódico estéril. 2. Aplíquese al pene una ligera presión, de manera que salga una gota de pus por el meato, si no aparece pus, masajear suavemente la uretra desde arriba hacia abajo. 3. Tómese el pus con asa estéril para siembra o directamente en un portaobjetos limpio. 4. Si la gota de pus no aparece, introdúzcase el asa estéril en el conducto uretral, hasta una profundidad de 2,5 cm aproximadamente para obtener la muestra. 5. Se recoge una muestra del pus con un hisopo de algodón estéril con palo largo (ver sección 5.4.1). Inserte el hisopo en un pequeño frasco con medio de transporte Amies. Corte la porción excedente de la varilla del hisopo con tijeras estériles (flameadas) esto es para que la parte
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superior pueda ser descartada y permita cerrar herméticamente el frasco (Fig. 5.22). Luego enrosque la tapa en el frasco inmediatamente. 5. Utilice otro hisopo para recoger una gota de pus para la tinción de Gram (véase la sección 5.3.1). Nota: Se puede utilizar el asa estéril para siembra para recoger el pus o usar un hisopo de algodón estéril de palo largo. El asa de siembra debe estar estéril pero ¡No al rojo vivo!, es decir, previamente esterilizada con calor y luego dejada enfriar para que esté apta para recoger la muestra de pus o cuando se quiera introducir en el conducto uretral. Muchas veces no se tiene un hisopo estéril comercial, entonces se usa el asa de siembra. En la actualidad ya se dispone de asas de siembra en punta y en aro desechables de plástico de poliestireno estériles muy útiles como para estos casos. La disponibilidad en varios países es todavía incierta, dado que no se sabe su difusión para uso en centros de salud complejos y en los laboratorios periféricos de los países latinoamericanos, asiáticos y africanos. Estas asas descartables de plástico son seguras como para recoger las muestras de pus del meato urinario o para introducirlas en el conducto uretral ya que no deben ser previamente flameadas en mechero y son descartables, de un solo uso, seguras y prácticas. Usadas también para la inoculación de medios de cultivo. El material muy flexible permite una aplicación suave sin dañar la superficie del medio de cultivo. fabricados de poliestireno con lazo en una extremidad y aguja (punta) en la otra o con aro solo y asa en punta sola esterilizadas por radiación gamma desechables en bolsitas de 20 piezas, 50 bolsitas por cartón
Fuente: http://www.ictsl.net/productos/plastico/asasdesiembraplasticoesterilessterilin.html www.marienfeld-superior.com El uso del hisopo estéril facilita la recogida y es a menudo más práctico para colocar el hisopo en un medio de transporte como el de Amies así el contenido extraído con este hisopo luego es cultivado en medios de cultivo especiales. Se usa otro hisopo para sacar material y colocarlo en un portaobjetos limpio en el cual se efectuará la tinción de Gram. 6. Prepare dos frotis: — tan finos como sea posible — que abarquen la mayor extensión que se pueda en el portaobjetos.
B A A) Obtención de muestras del varón. Aplíquese al pene una ligera presión, de manera que salga una gota de pus
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por el meato. Tómese el pus con asa estéril para siembra o directamente en un portaobjetos limpio. También se puede usar un hisopo de algodón estéril para recoger la gota de pus del meato. B) Prepare dos frotis: tan finos como sea posible y que abarquen la mayor extensión que se pueda en el portaobjetos.
Figura 5.22 Transferencia de una muestra urogenital a un medio de transporte Amies. Se observa además, el corte con una tijera del palo sobrante así queda en el frasco del medio de transporte el hisopo con un pedazo pequeño del palo, este frasco debe ser tapado de inmediato.
Obtención de muestras en la mujer La muestra debe ser tomada del conducto cervical por un médico o una enfermera especialista. En los casos de gonorrea crónica se deberá tomar inmediatamente antes o inmediatamente después del periodo menstrual. GONOCOCOS: EXAMEN DIRECTO DEL PUS URETRAL Preparación de los frotis Preparar un frotis de cada uno de los especímenes. Deje que los frotis se sequen al aire y luego se tiñen con la tinción de Gram (véase la sección 5.3.1). Prepare dos frotis: — tan finos como sea posible — que abarquen la mayor extensión que se pueda en el portaobjetos. 5.5.3 Examen microscópico El examen directo es de gran valor para el diagnóstico de la gonorrea en el hombre; en la mujer su utilidad es considerablemente menor. Por lo tanto, el cultivo es necesario para aislar e identificar los gonococos en muestras obtenidas de mujeres. Examine los portaobjetos utilizando el objetivo de inmersión en aceite x100. Preste atención especial a las orillas del frotis, donde los elementos se extienden en una capa más delgada, son más fáciles de reconocer y la tinción se concentra menos. Pus: (Observe si hay numerosas acumulaciones de leucocitos degenerados. Los núcleos son de color rosa fuerte y el citoplasma es incoloro.) Gonococos: Ovales, con formas que semejan riñones, gramnegativos (color rosa pálido) agrupados en pares. Gonococos intracelulares: Aglomerados dentro del citoplasma de los leucocitos (1). (Fig. 5.23, 1) Gonococos extracelulares: Agrupados en racimos entre leucocitos o cerca de leucocitos rotos (2). (Fig. 5.23, 2) Informar como: - Diplococos Gram-negativos intracelulares presentes; - Diplococos Gram-negativos extracelulares presente; -No se encontraron diplococos Gram-negativos.
Figura 5.23 Células de pus y gonococos 1: Gonococos intracelulares, 2: Gonococos extracelulares. También se señala el citoplasma y el núcleo de un leucocito.
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Frotis 1. Neisseria gonorrhoeae Esta tinción de Gram del exudado uretral revela varios diplococos gramnegativos en numerosos neutrófilos. Cuando los diplococos gram-negativos están sólo fuera de los neutrófilos, los cultivos de muestras de varones, usualmente son positivos para Neisseria gonorrhoeae; en las muestras de secreciones cervicales, sin embargo, un predominio de los organismos extracelulares indica que muchos de ellos son especies de Neisseria no patógenas en lugar de N. gonorrhoeae. Observar los círculos. Fuente. http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/3089-examination-of-gram-stains-of-cervical-andurethral-discharges
En la fotomicrografía se muestran diplococos intracelulares de N. gonorrhoeae en leucocitos y extracelulares (círculos). Fuente: www.seimc.org
Evaluación de resultados del examen bacteriológico directo del pus uretral Posibles casos encontrados en un frotis teñido: Abundantes leucocitos. Abundantes leucocitos. Abundantes leucocitos. Escasos eritrocitos. Escasos eritrocitos. Escasos eritrocitos. Escasas células epiteliales. Escasas células epiteliales. Escasas células epiteliales. Cantidad moderada de No se observan diplococos No se observan diplococos diplococos intracelulares Ó intracelulares gramnegativos. Ó intracelulares gramnegativos. gramnegativos. Escasos diplococos No se observan diplococos extracelulares gramnegativos. extracelulares gramnegativos. CONCLUSIÓN Gonococos: positivo. Gonococos: sospechoso. Gonococos: negativo. Otras bacterias que causan infecciones uretrales En el hombre Ocasionalmente se observan en frotis de pus uretral diversas cantidades de: — Cocos grampositivos (por Ej.: estafilococos) — Bacilos grampositivos (por Ej.: difteroides) — Bacilos gramnegativos (por Ej.: bacilos coliformes). Estos microorganismos se describen en la sección 5.3.1. Nunca se haga un examen directo en busca de gonococos en un frotis de sedimento urinario. En la mujer Se suele encontrar toda clase de microorganismos en los frotis de la mujer, particularmente: — Bacilos grampositivos — Cocos gramnegativos (saprófitos). Por esta razón el cultivo es esencial. 5.5.4 Envío de muestras para cultivo1 Uso de medio de transporte de Stuart
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El envío de la muestra en medio de transporte de Stuart, modificado (reactivo. N º 56) es el mejor método, si el medio se puede obtener en un laboratorio especializado. Por lo general se suministra en frascos planos (semejantes a tubos largos) de 30 ml que contienen 8 ml de medio sólido (ubicado a lo largo de un lado del frasco, es decir, inclinado) y esta rellenados con una mezcla de aire (90%) y dióxido de carbono (10%). También se pueden usar alternativamente frascos redondos. El frasco debe permanecer abierto durante el menor tiempo posible para evitar el escape de gas. Nota: Por conveniencia, este medio se suele suministrar en frascos planos, aunque también se pueden emplear frascos redondos como el que figura en la ilustración. 1Véase también la sección 3.7.1. Método 1. Coloque el frasco del medio de transporte en posición vertical. Recoger la muestra de pus con un hisopo de algodón sostenido con una pinza estéril (flameada), como se describe en la sección 5.5.2. Desenrosque la tapa del frasco. 2. Sosteniendo el frasco lo más vertical posible (para evitar que el gas se escape), frotar el hisopo de pus sobre toda la superficie del medio sólido, de un lado del frasco al otro, a partir de la parte inferior (véase la fig. 5.22). Es decir, hisope desde el fondo siguiendo un camino en zigzag haciendo estrías. 3. Vuelva a colocar el tapón del frasco de inmediato. Envíe el frasco (a temperatura ambiente) inmediatamente. Tiempo máximo de conservación: 3 días. Sin embargo, es conveniente que se envíe cuanto antes. Es decir, es mejor cuanto más corta sea la demora. Este medio de transporte también es adecuado para los meningococos.
A
B
C
D
E A) Frasco con el medio de transporte de Stuart. Por conveniencia, este medio se suele suministrar en frascos planos, aunque también se pueden emplear frascos redondos como el que figura en la ilustración A. B) Recoger la muestra de pus con un hisopo de algodón sostenido con una pinza estéril (flameada). C) Coloque el frasco en posición vertical. Recoja la muestra de pus con un hisopo de algodón. Desenrosque la tapa del frasco. D) Sosteniendo el frasco tan verticalmente como sea posible (para evitar que escape el gas) frote el hisopo con pus en toda la superficie del medio sólido, de un extremo del frasco al otro, comenzando por el fondo (estriado). Figura 5.22 Transferencia de una muestra urogenital a un medio de transporte de Stuart. Se observa además, el corte con una tijera del palo sobrante así queda en el frasco del medio de transporte el hisopo con un pedazo pequeño del palo, este frasco debe ser tapado de inmediato. E) Coloque la tapa en el frasco Inmediatamente. Envíe el frasco, a la temperatura ambiente.
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Figura 5.24 Remisión de muestras urogenitales en una pipeta Pasteur.
5.6 EL EXAMEN DE MUESTRAS GENITALES DE LA SÍFILIS La sífilis es una infección de transmisión sexual causada por el Treponema pallidum y se produce en tres etapas clínicas. El periodo de incubación es, aproximadamente, un mes. Al cumplirse el periodo de incubación suele aparecer el primer signo de la enfermedad, generalmente en los órganos genitales: un chancro redondo u ovalado, de 1 - 2 cm de diámetro, rojo, con bordes endurecidos La etapa primaria se caracteriza por una úlcera genital indolora (chancro sifilítico), a veces con inflamación de los ganglios linfáticos en ciertas regiones del cuerpo. El chancro cura espontáneamente, incluso sin tratamiento. En algunos pacientes, la enfermedad progresa a la etapa secundaria. La etapa secundaria resulta en: -Erupciones en la piel -Úlceras de la boca -Verrugas genitales -Agrandamiento generalizado de los ganglios linfáticos. La etapa terciaria es muy rara y se caracteriza por la afectación del sistema nervioso central y las enfermedades cardíacas. La sífilis secundaria o terciaria puede ser transmitida a un feto en el útero (sífilis congénita). Pian El pian o frambesia es causado por un treponema no venéreo (Treponema pertenue) y ocurre en los climas tropicales húmedos. Se caracteriza por papilomas granulares en la piel. T. pallidum y T. pertenue son espiroquetas delicadas, fuertemente enrolladas miden 6-12 µm x 0,2 µm. Ambos son indistinguibles bajo el microscopio. Es necesario inspeccionar las muestras sospechosas de estar infectadas con espiroquetas por microscopía de campo oscuro, ya que no se tiñen fácilmente para su visualización con luz transmitida. 5.6.1 Materiales y reactivos ● Microscopio con accesorio de campo oscuro ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Guantes ● Gasa ● Lanceta estéril o un bisturí ● cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53). 5.6.2 Método Colección de muestras Este examen se puede llevar a cabo solo por personal experto, en un laboratorio provisto de un microscopio con condensador para campo oscuro. El examen carece de valor si el paciente ha tratado la lesión con algún ungüento. En este caso se deben esperar tres días para efectuar el examen. Importante: ● Use guantes protectores para este procedimiento. ● El área del chancro debe estar libre de cualquier pomada antes de tratar de recoger las muestras. 1. Recoger la muestra del chancro con una gasa humedecida con solución de cloruro de sodio. 2. Si no hay líquido seroso obvio, raspar suavemente el borde de la úlcera con una lanceta estéril o el borde plano de una hoja de bisturí (fig. 5.25). No extraer la sangre. 3. Comprimir la úlcera suavemente con una gasa. 4. Usando un cubreobjetos, se recoge una gota del exudado seroso y se invierte inmediatamente en un portaobjeto. También se puede hacer lo siguiente: Retire la gasa y espere durante unos
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minutos a que aparezca un líquido seroso de color rosáceo. Aspírese ese líquido con una pipeta de Pasteur provista de una perilla de goma. 5. Deposite una gota del líquido en un portaobjetos de vidrio delgado (del tipo fabricado especialmente para microscopía en campo oscuro).
A
C
B
D
A) Limpie el chancro con gasa humedecida en solución estéril de cloruro sódico; séquelo bien. Figura 5.25 La toma de una muestra de chancro. Raspe los bordes del chancro varias veces con la hojilla de una lanceta estéril colocada en posición plana. Evite provocar la salida de sangre. B) Presione con gasa estéril seca. Comprimir la úlcera suavemente con una gasa. C) Retire la gasa y espere durante unos minutos a que aparezca un líquido seroso de color rosáceo. Aspírese ese líquido con una pipeta de Pasteur provista de una perilla de goma. D) Deposite una gota de líquido en un portaobjetos de vidrio delgado (del tipo fabricado especialmente para microscopía en campo oscuro). Figura 5.26 Observación de los treponemas en microscopio de campo oscuro. Examínese con el microscopio empleando un condensador para campo oscuro. Los treponemas de la sífilis y la frambesia (Pian) se podrán distinguir de los treponemas saprófitos de la piel por sus cuerpos sumamente delgados y sus movimientos característicos. 5.6.3 Examen Microscópico Examínese el portaobjetos con el microscopio empleando un condensador para campo oscuro. Los treponemas de la sífilis y la frambesia se podrán distinguir de los treponemas saprofitas de la piel por sus cuerpos sumamente delgados y sus movimientos característicos y el número típico de espirales (fig. 5.26). El técnico de laboratorio necesitará capacitación especial para reconocerlos. Examen de frotis secos y teñidos
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No se recomienda este procedimiento, ya que en la piel y las membranas mucosas suelen existir treponemas saprofitas. 5.7 EXAMEN DE MUESTRAS DE SEMEN El Semen es investigado en pacientes para excluir la infertilidad. Esto se realiza mediante la evaluación de las características funcionales de los espermatozoides en el líquido seminal. 5.7.1 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Pipeta de Sahli para Sangre ● Probeta graduada, 10 ml ● Papel indicador de pH ● Cámara de recuento Neubauer mejorada ● Bicarbonato de sodio ● Fenol o formalina (formaldehído al 37%) ● Agua destilada ● Vaselina. Antes de la recogida de la muestra de semen, preparar el líquido diluyente para semen de la siguiente manera: -Bicarbonato de sodio 5 g -Fenol o formalina 1 ml Agua destilada hasta 100 ml. 5.7.2 Método Colección de muestras El semen es recogido por el paciente en un frasco limpio y seco y se lleva al laboratorio tan pronto como sea posible después de la recolección, de preferencia dentro de los 30 minutos. No puede ser examinado inmediatamente como semen es un fluido muy viscoso y debe "licuar o hacer licuefacción". Esta labor se realiza en 15 a 30 minutos y se debe examinar a la mayor brevedad posible, una vez haya tenido lugar licuefacción. La muestra de semen debe ser colectada mediante masturbación y nunca recoger en un profiláctico o practicar sexo antes de recolectar la muestra. Preparación de los portaobjetos Después que la licuefacción ha tenido lugar, hacer un frotis del semen en un portaobjetos (similar a un frotis de sangre), deje que se seque al aire y luego se calienta muy suavemente para fijar. Retire el moco (lo que puede interferir con la tinción) mediante lavado del portaobjeto con líquido diluyente para semen (véase más arriba). A continuación, lavar el portaobjetos suavemente con agua destilada tamponada. Teñir el esperma con tinción de Leishman o tinción de Giemsa (ver sección 9.10.3, más adelante). 5.7.3 El examen macroscópico Volumen Medir el volumen en una pequeña probeta graduada, la cantidad varía de sólo unas pocas gotas hasta 10 ml. El volumen normal es de 4-5 ml. Menos de 1,5 ml se considera anormal. Viscosidad El Semen recién eyaculado debe estar completamente licuado dentro de los 30 minutos. La Ausencia de licuefacción puede interferir con la motilidad del esperma y la fertilización. Color El semen es normalmente de un color gris opaco. Después de un largo periodo de abstinencia de la actividad sexual puede parecer ligeramente amarillo. pH El pH se observa por lo general, aunque es de poca importancia. El semen es siempre alcalino; con un pH medio de aproximadamente 7,6 (rango de 7,02 a 8,09). 5.7.4 Examen Microscópico Los espermatozoides normales tienen de 50-70 µm de longitud, con una gran cabeza ovalada, un pequeño cuello y una cola larga y delgada; la cola representa aproximadamente el 90% de la longitud total (fig. 5.27). La cabeza es de 3 a 6 µm x 2-3 µm Las alteraciones de la morfología que se buscan incluyen: -Cabezas de forma anormal (Fig. 5.28); - cabezas de tamaño Anormalmente gigantes o diminutas (Fig. 5.29); -Dobles cabezas (Fig. 5.30); - Colas en espiral o enrolladas (Fig. 5.31); - Cuellos ausentes, bifurcados o aumentados (hinchados) (sección central) (Fig. 5.32); - Colas dobles, rudimentarias o ausentes (Fig. 5.33). En una prueba normal, no debe haber más de 20% de formas anormales. Durante el examen de semen se toma en cuenta la presencia de otras células, tales como: -Eritrocitos; -Leucocitos polimorfonucleares; -Células epiteliales; -Células inmaduras de los testículos, etc. Varios cristales también pueden ser vistos; su presencia también debe tenerse en cuenta. Motilidad
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Para comprobar la motilidad, coloque una gota de semen en un portaobjetos, cubra la gota con un cubreobjetos y el borde de la punta con vaselina para evitar la evaporación. Examinar bajo el objetivo del microscopio x40. Calcule aproximadamente la proporción de espermatozoides móviles a formas no móviles en varios campos microscópicos diferentes. Normalmente alrededor del 80% de los espermatozoides son activamente móviles y aproximadamente 20% son lentos o no se mueven en absoluto. Observe el portaobjeto después de 3 y 6 horas, y si lo estima conveniente, también después de 12 y 24 horas. Para un máximo de 3 horas no debe haber poca o ninguna reducción en la motilidad, y después de esto hay una creciente pérdida de la movilidad, que a temperatura ambiente se completa a menudo por 12 horas. La disminución de la motilidad de los espermatozoides puede ser un factor en la infertilidad. El conteo de espermatozoides 1. Después que la licuefacción ha ocurrido, agite suavemente la muestra para mezclar. 2. Usando una pipeta de Sahli, extraer el semen hasta la marca de 0,5 µl y, a continuación aspirar en el líquido diluyente para semen hasta la marca de 11 µl y colocar la pipeta en un rotador para mezclar el contenido. 3. Cargar en una cámara de recuento de Neubauer mejorada (ver fig. 9.40), permitir que el esperma se asiente y luego contar en las cuatro esquinas, como un recuento de leucocitos (véase la sección 9.6.3). La fórmula para el cálculo es similar a la utilizada para los leucocitos, excepto que el recuento de esperma es por ml en lugar de por mm3, por lo que es necesario un factor de multiplicación adicional de 1000. n 10 20 1000 Número de espermatoz oides / ml 4 Donde n = número de espermatozoides contados. El recuento normal de esperma está entre 60 millones y 150 millones por ml (100-500 millones/ml, según algunas fuentes). Los pacientes con recuentos de espermatozoides inferiores a 60 millones por ml definitivamente tienen recuentos bajos, a pesar que todavía pueden ser fértiles.
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Figura 5.27 Espermatozoide normal. Figura 5.28 Espermatozoide con una cabeza de forma anormal. Figura 5.29 Espermatozoide con una cabeza anormalmente pequeña. Figura 5.30 Espermatozoide con doble cabeza. Figura 5.31 Espermatozoide con la cola enrollada. Figura 5.32 Espermatozoide con el cuello hinchado. Figura 5.33 Espermatozoide con colas dobles o rudimentarias. Fuente: Image House Medical, Sperm MORPH system. Usado con permiso.
5.8 EXAMEN DE LA SECRECIÓN VAGINAL
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El flujo vaginal es examinado por microscopía para excluir infecciones por gonococos, Candida albicans y Trichomonas vaginalis, que causan la vaginosis bacteriana, la candidiasis vulvovaginal y la tricomoniasis, respectivamente. 5.8.1 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53). 5.8.2 Método Colección de muestras La muestra debe ser recogida por un médico o enfermera especialista. Preparación de los portaobjetos 1. Hacer un frotis del flujo vaginal en un portaobjetos y dejar que se seque al aire. Teñir el frotis con tinción de Gram (véase la sección 5.3.1) y examinar para Candida albicans. 2. Transferir una pequeña muestra de la secreción vaginal a un segundo portaobjetos, añadir una gota de solución salina y cubra con un cubreobjetos. Busque gonococos y trofozoítos de Trichomonas vaginalis en esta preparación. 5.8.3 Examen microscópico Examinar el portaobjetos con tinción de Gram con el objetivo x40 y el objetivo de inmersión en aceite x100. Candida albicans aparece como grandes levaduras Gram-positivas, a menudo con brotación o con filamentos cortos de micelio (ver fig. 5.13). Examine la preparación salina tan pronto como sea posible con los objetivos x10 y x40. Utilice un microscopio con el diafragma cerrado para dar un buen contraste. No permita que la muestra se seque. Los gonococos son Gram-negativos y aparecen como pequeños puntos (ver fig. 5.12). Los trofozoítos de Trichomonas vaginalis aparecen como flagelados muy móviles, miden de 8-20 µm, con una membrana ondulante y un núcleo prominente.
5.9 EL EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE HECES ACUOSAS Microscopía de campo oscuro se utiliza para identificar a Vibrio cholerae y Campylobacter spp. en las muestras de heces acuosas. 5.9.1 Materiales y reactivos ● Microscopio con accesorio de campo oscuro ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Asa de siembra ● cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53). 5.9.2 Método 1. Suspender 0,2 g de heces en 5 ml de solución de cloruro de sodio. Permitir que las partículas grandes sedimenten. 2. Mediante el uso de un asa de inoculación (esterilizada por flameado), preparar un frotis muy delgado sobre un portaobjetos. Retire con cuidado cualquier partícula grande. 3. Cubrir con un cubreobjetos. Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio. 4. Abra el diafragma iris totalmente y coloque el accesorio de campo oscuro en su posición. 5.9.3 El examen microscópico Utilice el objetivo x10 para el enfoque. El fondo aparece en negro, y todos los objetos en suspensión en la solución salina aparecen más brillantes. Usa el objetivo x40 para buscar bacterias con formas características y motilidad (ver más abajo). El Vibrio cholerae aparece como bastoncillos móviles, que pueden ser cortos, curvos, rectos o involutivos (fig. 5.34). Campylobacter spp. son bastoncillos espirales Gram-negativos que giran rápidamente sobre un eje central. 5.9.4 Envío de muestras para cultivo1 A menudo es necesario el envío de muestras de heces a un laboratorio de bacteriología para su cultivo: -Para la detección de vibriones del cólera -Para la detección de otras bacterias que causan disentería (especies de Salmonella, Shigella, etc.) Se puede utilizar para ambos propósitos la misma forma de transporte, en el medio de Cary y Blair 1 Véase también la sección 3.7.1.
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Uso del medio de transporte de Cary-Blair El medio de transporte de Cary-Blair (reactivo Nº 17) conservará muchos tipos de bacterias entéricas (vibriones del cólera, otros vibriones, salmonella, shigella, etc.) hasta un máximo de 4 semanas. El medio inoculado se puede almacenar en un frasco sellado a temperatura ambiente durante 8-12 semanas. 1. Sumerja un hisopo de algodón estéril en la muestra de heces fecales (Fig. 5.35). 2. Para los bebés, niños u otros pacientes que no pueden producir una muestra de heces, tome un hisopo rectal. Humedecer el hisopo con una solución de cloruro de sodio e introducir el hisopo en el recto. Gire el hisopo dentro del recto varias veces con un movimiento circular (Fig. 5.36). 3. Coloque el hisopo en un frasco con medio de Cary-Blair (tres cuartos de su capacidad) y enviarlo al laboratorio de bacteriología. Si usted no puede enviar el hisopo inmediatamente, guárdelo a temperatura ambiente. Importante: ● No guarde nunca el hisopo en la incubadora. ● No guarde nunca el hisopo en el refrigerador. Uso de solución salina tamponada de glicerol. Cuando se deben enviar a otros laboratorios muestras para efectuar cultivos de microorganismos entéricos, aparte de vibriones del cólera, y no se dispone del medio de transporte de Cary y Blair, se puede emplear solución salina amortiguada de glicerol (reactivo No. 14). Nota: Si en su pequeño frasco la solución salina amortiguada de glicerol cambia de color de rosa al amarillo, deséchese y prepárese una solución fresca. 1. Se recomienda utilizar un frasco pequeño, con capacidad para 7,5 ml. Llénese hasta 2 cm de distancia de la boca con solución salina tamponada de glicerol. 2. Deposite en este medio de transporte el hisopo que se ha introducido en las heces fecales o en el recto y envíese directamente al laboratorio bacteriológico.
A B Figura 5.34 Aspecto de Vibrio cholerae al microscopio. Figura 5.35 Toma de una muestra de heces acuosas. Sumerja un hisopo de algodón estéril en la muestra de heces fecales. Figura 5.36 Toma de una muestra de heces de un bebé. En el caso de niños u otros pacientes que no hayan presentado esta muestra, obténgala directamente introduciendo en el recto un hisopo, previamente embebido en solución de cloruro sódico, y una vez que el hisopo está dentro del recto hágalo girar varias veces. A) Deposite el hisopo en un frasco que contenga medio de
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Cary y Blair (hasta 3/4 de su capacidad). B) Nunca guarde la preparación en la incubadora o en el frigorífico.
C) Tinción de Gram. Microscopía óptica. 1000 aumentos. V. cholerae se presenta como típicos bacilos pequeños, curvados o no, Gram negativos. Fuente: www.microbe-edu.org ©
C 5.10 EXAMEN DE ASPIRADOS, EXUDADOS Y DERRAMES Los aspirados, los exudados y los derrames son recogidos mediante la inserción de una aguja estéril en la cavidad apropiada. Esto sólo puede ser realizado por un médico con experiencia ya que hay un riesgo de introducir infección. Las cavidades de la cual se pueden recoger los derrames son las siguientes: -Pleural (pecho) -Peritoneal (abdominal) -Pericárdica -Sinovial -Bolsa (Bursa). Los aspirados de los bubas se examinan para Yersinia pestis, que causa la peste bubónica. El microorganismo es transportado desde los sitios de inoculación a los ganglios linfáticos en las axilas, la ingle y el cuello, lo que provoca inflamaciones localizadas o bubas. 5.10.1 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Centrífuga ● Tubos de centrífuga ● Recipientes de muestras (ver sección 3.7) ● Asa de siembra ● Metanol al 70% ● Reactivos para: -Giemsa (ver sección 9.10.3) -Tinción de Gram (véase la sección 5.3.1) -Tinción de Wayson (véase la sección 5.3.4) -Ziehl-Neelsen (ver sección 5.3.3). 5.10.2 Método Colección de muestras Fluido aspirado de una cavidad El fluido aspirado de una cavidad se recoge en recipientes estériles, limpios y secos. Informe la aparición del fluido. El fluido de una cavidad es normalmente de color pajizo (amarillo), pero puede aparecer turbio o manchado con sangre. Preparación de los portaobjetos Fluido aspirado de una cavidad 1. Usando una técnica aséptica (estéril), transferir 10 ml del fluido a un tubo de centrífuga y se centrifuga a una velocidad moderada (2000g) por varios minutos. 2. Eliminar el sobrenadante, resuspender el depósito y use un asa de inoculación (esterilizada con un mechero) para preparar tres frotis. Extienda el líquido finamente sobre cada portaobjetos (ver sección 5.2.3). 3. Permitir que los frotis se sequen al aire y fijar con metanol. 4. Teñir los frotis con: -Tinción de Gram (véase la sección 5.3.1) -Ziehl-Neelsen (véase la sección 5.3.3) -Tinción de Giemsa (ver sección 9.10.3). Aspirados de bubas 1. Preparar un frotis del aspirado de líquido como se describe en la sección 5.2.3. 2. Fije el frotis con metanol durante 2 minutos y se tiñe con la coloración de Wayson (ver sección 5.3.4). 5.10.3 Examen microscópico Fluido aspirado de una cavidad Examine cada frotis con el objetivo de x40 y el objetivo de inmersión en aceite x100. Busque cualquier bacteria presente en los portaobjetos teñidos con la tinción de Gram.
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Busque bacilos ácido-alcohol resistentes (micobacterias) en el portaobjetos teñido con ZiehlNeelsen. Al examinar el portaobjetos teñido con tinción de Giemsa, identificar el tipo predominante de célula de la sangre presentes: leucocitos, linfocitos o células mesoteliales (provenientes del revestimiento de la cavidad) y la presencia de células atípicas, que pueden sugerir células cancerosas. Si hay más de unas pocas células presentes o si el líquido está manchado con sangre, enviar el portaobjetos a un laboratorio de bacteriología para su cultivo. Aspirados de bubas En primer lugar examinar el portaobjetos con el objetivo x40 para comprobar la distribución del material y luego usar el objetivo de inmersión en aceite x100 para buscar Yersinia pestis. Yersinia pestis es observado como microorganismos bipolares que se tiñen de azul con los extremos de color rosa. 5.11 EXAMEN DE PUS DE BACILLUS ANTHRACIS El Bacillus anthracis es un patógeno de varios tipos de animales. Es responsable del ántrax cutáneo donde se muestra en su forma temprana como una ampolla en la piel que a menudo es llamado pústula maligna. 5.11.1 Materiales y reactivos ● Ropa de protección ● Guantes ● Microscopio ● Portaobjetos ● Asa de siembra o hisopos de algodón estériles (véase la sección 5.4.1) ● Azul de metileno de Loeffler (reactivo no. 35) ● Permanganato de potasio, solución al 4% (reactivo. N º 46). 5.11.2 Método Colección de muestras Advertencia: El Ántrax es altamente contagioso. Por lo tanto, los guantes y ropa de protección deben ser usados cuando se recogen muestras. Mediante el uso de un asa de inoculación o un hisopo de algodón, recoger unas pocas gotas de pus o líquido de las pústulas malignas. Deje que el frotis se seque al aire en una cabina de seguridad. Preparación de los portaobjetos 1. Preparar un frotis de pus o líquido como se describe en el apartado 5.2.3. 2. Fije el frotis con permanganato de potasio durante 10 minutos, y luego se tiñe con azul de metileno de Loeffler (ver sección 5.3.5). 5.11.3 Examen microscópico En primer lugar examinar el frotis con el objetivo x40 para comprobar la distribución del material y luego usar el objetivo de inmersión en aceite x100 para buscar Bacillus anthracis. Bacillus anthracis es visto como grandes bacilos azules rodeados por una cápsula de color purpúreo; los bacilos se disponen en cadenas (véase la figura 5.17.). LEPRA 5.12 EL EXAMEN DE FROTIS DE PIEL Y RASPADOS NASALES PARA MYCOBACTERIUM LEPRAE La lepra o enfermedad de Hansen es una infección de los tejidos nerviosos periféricos producida por la bacteria Mycobacterium leprae también llamada bacilo de Hansen. Los bacilos pueden estar presentes en un gran número en las lesiones lepromatosas (multibacilar), pero generalmente es muy escaso o no se observa en las lesiones tuberculoides (lepra paucibacilar). Desde el punto de vista terapéutico la lepra se clasifica en paucibacilar y multibacilar. Paucibacilar: Se define en pacientes sin bacilos demostrados desde un punto de vista histopatológico. El diagnóstico se realiza mediante el examen de los frotis de la piel de cortes tomados de diferentes sitios en el cuerpo, o a partir de raspados nasales tomados desde el tabique de la nariz. Después de la fijación, los frotis se tiñen con el método de Ziehl-Neelsen modificado. Los frotis de piel de los cortes se recogen normalmente de seis sitios, que se eligen de las áreas donde los nervios se encuentran cerca de la superficie de la piel. Estos sitios deben incluir nódulos o manchas en la cara o el cuerpo. 5.12.1 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Bisturí ● Si es posible, una pinza de puntas romas, sin dientes, o una pinza curva sin dientes, o una pinza para tejidos ● Lápiz de diamante ● Gasa ● Pequeñas hojas de plástico o guantes ● Hisopos estériles de algodón (véase la sección 5.4.1) ● Lámpara de alcohol o mechero de Bunsen ● Reactivos para la tinción de Ziehl-Neelsen (véase la sección 5.3.3) ● Etanol al 95% ● Cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53). ● Una placa de Petri grande
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● Formaldehido al 37% 5.12.2 Método Colección de muestras Muestras de las lesiones de la oreja y de la piel 1. Examinar cada oreja y la piel con una buena iluminación, colocada en forma conveniente y busque las lesiones, que son pequeños engrosamientos (infiltración) de superficie lustrosa y tamaños variados. (Fig. 5.37). De cada oreja seleccione la lesión más congestionada o nódulo. Si no hay ninguna lesión visible, use los bordes del lóbulo de la oreja. A partir de la lesión de la piel elegir un área justo dentro del borde de un parche de área despigmentada. 2. Limpie y desinfecte el área con una pieza de gasa humedecida con etanol. Flamee la pinza y el bisturí. Los bisturíes se pueden esterilizar por anticipado en tubos de vidrio taponados con algodón no absorbente. No se use yodo. 3. Apriete firmemente con la pinza el lóbulo de la oreja para detener la irrigación sanguínea del área (Fig. 5.38), esto cuando están disponibles las pinzas, si no hay, utilizar el dedo índice y el pulgar para detener el flujo de sangre. 4. Sosteniendo con firmeza las pinzas haga una incisión superficial de arriba abajo con el bisturí, aproximadamente de 0,5 cm de largo y 2-3 mm de profundidad a lo largo en el centro de la lesión. 5. Sin dejar de apretar con la pinza, raspe suavemente el fondo y los bordes de la incisión con la punta y la hoja del bisturí (fig. 5.39). Recoja con el bisturí el material seroso, incoloro o rosáceo, de la lesión. No provoque la salida de sangre y evitar la extracción de sangre.
A
B
A) Materiales. Figura 5.37 Lesiones de lepra en la oreja. Al examinar las orejas busque las lesiones, que son pequeños engrosamientos (infiltración) de superficie lustrosa y tamaños variados. Escoja la lesión o nódulo más congestionado. B) Limpie el área con una pieza de gasa humedecida con etanol. Figura 5.38 Exprimir el lóbulo
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de la oreja para detener el flujo de sangre. Figura 5.39 Toma de una muestra de una lesión del oído. Sosteniendo con firmeza las pinzas haga una incisión superficial de arriba abajo, a la mitad de la lesión. Muestras de la cara y el cuerpo Examine la cara y el cuerpo en busca de: A) Lesiones semejantes a las que se han encontrado en la oreja, aunque frecuentemente mayores (fig. 5.40); B) Pápulas, manchas planas (máculas), placas de color pálido o zonas infiltradas de la piel (fig. 5.41), que son similares en apariencia a la piel de naranja. También se pueden obtener muestras de zonas de la piel en que se comiencen a observar signos de infiltración leprosa. Escoja una lesión en que se observe la infiltración más acusada y seleccione el lugar de donde se obtendrá la muestra. Este sitio deberá estar situado: — inmediatamente dentro del borde de la placa, donde sea evidente que la piel se está alterando con mayor rapidez. (Esto es importante para estar seguros de que se detecten los bacilos.) Una muestra puede ser extraída de una zona de la piel que muestra los primeros signos de infiltración leprosa. 1. Desinfecte el área con una pieza de gasa embebida en etanol. Flamee la pinza sin dientes y el bisturí. Pellizque vigorosamente con una pinza sin dientes el sitio de donde se obtendrá la muestra. 2. Continúe sosteniendo firmemente. Con la punta del bisturí haga una incisión (fig. 5.42): — de 0,5 cm de longitud — de 2 - 3 mm de profundidad 3. Con la misma punta del bisturí raspe el fondo y los bordes de la incisión. Recoja cierta cantidad de pulpa y material seroso. (Siga apretando para evitar que sangre.)
A
B
Figura 5.40 Lesiones de lepra en el brazo. Figura 5.41 Lesiones de lepra en la cara. A) Escoja una lesión en que se observe la infiltración más acusada y seleccione el lugar de donde se obtendrá la muestra. B) Desinfecte el área
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con una pieza de gasa embebida en etanol. Pellizque vigorosamente con una pinza sin dientes el sitio de donde se obtendrá la muestra. Figura 5.42 Toma de una muestra de una lesión cutánea. Muestras de la nariz (exudado nasal) Las muestras se preparan mejor con el contenido de la cavidad nasal que se expulse por primera vez en el día, a hora temprana de la mañana. El paciente deberá proporcionar este material "sonándose la nariz" completamente en una hoja limpia y seca de celofán o material plástico. Preparación de los frotis Preparación de los frotis de muestras de las lesiones de la oreja y de la piel 1. Con el lado plano de la hoja del bisturí extienda, con un movimiento circular, el material seroso sobre un área de 5-7 mm de diámetro en un portaobjetos que esté numerado con lápiz de diamante. Se pueden colocar 2-4 muestras del mismo paciente en un solo portaobjetos (Fig. 5.43). 2. Deje secar el portaobjetos en un lugar donde no haya polvo. Cuando los frotis se encuentren completamente secos fíjense con vapores de formaldehido en una caja de Petri atravesada por dos varillas de vidrio. Utilice la cantidad suficiente de solución de formaldehido de manera que cubra solamente el fondo de la caja. Coloque el portaobjetos sobre las varillas de vidrio. Tape la caja y déjela reposar 3 minutos. También se puede fijar los frotis pasando la parte de atrás del portaobjetos (no del lado de la muestra) a través de la llama de una lámpara de alcohol o mechero Bunsen varias veces (véase la Fig. 5.6). 3. Teñir los frotis mediante la técnica de Ziehl-Neelsen modificada (véase la sección 5.3.3). Tinción de los frotis: — Bañe cada portaobjetos con fucsina fenicada recientemente filtrada y déjese reposar 20 minutos. — Lávense los portaobjetos suavemente con agua del grifo (deposítense en un vaso para análisis con el frotis vuelto hacia el lado contrario del chorro); se pueden dejar en el vaso hasta que se proceda a decolorarlos. — Decolore los portaobjetos, uno por uno, haciendo correr suavemente sobre ellos la mezcla de ácido y etanol hasta que ésta sea clara e incolora. — Lávense nuevamente los portaobjetos con agua del grifo y déjense secar hasta que se aplique el siguiente colorante. — Tíñanse con solución de azul de metileno durante 1 minuto. Nota: Para la descripción de Mycobacterium leprae véase más adelante.
A
B
Figura 5.43 Transferencia de la muestra a un portaobjetos. Con el lado plano de la hoja del bisturí extienda la muestra sobre un portaobjetos de vidrio numerado con lápiz de diamante en un área de 5 - 7 mm de diámetro por
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medio de movimientos circulares. A) Deje secar el portaobjetos en un lugar donde no haya polvo. Cuando los frotis se encuentren completamente secos fíjense con vapores de formaldehido en una caja de Petri atravesada por dos varillas de vidrio. También, se puede hacer como en la figura 5.6 secar el portaobjetos a la llama de un mechero del lado opuesto al lado del frotis. B) En la tinción lávense nuevamente los portaobjetos con agua del grifo y déjense secar hasta que se aplique el siguiente colorante. Preparación de los frotis de las muestras de la cara y el cuerpo 1. Con el lado plano de la hoja del bisturí extienda la muestra sobre un portaobjetos de vidrio numerado con lápiz de diamante en un área de 5-7 mm de diámetro por medio de movimientos circulares. En el mismo portaobjetos se podrán colocar 3 - 6 muestras de diferentes lesiones. 2. Seque los frotis y fíjense como se indica en la preparación de los frotis de muestras de las lesiones de la oreja y de la piel (véase antes). 3. Teñir los frotis mediante la técnica de Ziehl-Neelsen modificada (véase la sección 5.3.3). Aplique la tinción de acuerdo a lo explicado antes en la preparación de los frotis de muestras de las lesiones de la oreja y de la piel. Limpie la incisión con éter y etanol y, si sangra, aplique una compresa. Preparación de los frotis de las muestras de la nariz 1. Con un pequeño hisopo de algodón ligeramente humedecido con solución de cloruro sódico traslade cierta cantidad de la sustancia opaca que ha expulsado el paciente, de la hoja de material plástico a un portaobjetos marcado anticipadamente. 2. Extienda la muestra en el portaobjeto con toda la uniformidad que sea posible. En un solo portaobjetos se pueden preparar dos o tres frotis del mismo material. 3. Deje secar los frotis. 4. Cuando se encuentren completamente secos, fije los frotis con vapores de formaldehido. Otra alternativa es fijar los frotis a la llama de una lámpara de alcohol o mechero Bunsen varias veces pasando la parte de atrás del portaobjetos (la que no tiene el frotis) rápidamente por la llama. 5. Tiña el portaobjetos por la técnica de Ziehl-Neelsen modificada (véase la sección 5.3.3). 6. Examínelos con el microscopio y registre los resultados como se indica en lo relativo al examen de los bacilos en nódulos y lesiones de la piel (Tabla 5.3). 5.12.3 Examen microscópico Descripción del bacilo de la lepra Examinar el portaobjetos con el objetivo de inmersión en aceite x100. Mycobacterium leprae es un bacilo ácido-alcohol resistente, por lo tanto, se asemeja al bacilo de la tuberculosis. Así pues, también es resistente a los ácidos y se tiñe de rojo sobre un fondo azul con la técnica modificada de Ziehl y Neelsen. Tamaño: 1 - 8 µm Forma: bastoncillo alargado, recto o ligeramente curvo, con extremos romos. Granulación: frecuentemente granuloso; los gránulos, voluminosos y de color rojo fuerte, se hallan separados por espacios incoloros Disposición: (a) Se puede encontrar en grupos de 2-5 bacilos dispuestos paralelamente (fig. 5.44 (a). o (b) En grupos, o racimos mayores (Fig. 5.44 (b)), o (c) En gran número, formando conglomerados circulares llamados "globi" (fig. 5.44 (c)). Nota: Los frotis nasales contienen a veces bacilos ácido-alcohol resistentes no patógenos que no son M. leprae.
Figura 5.44 Mycobacterium leprae. a) Se puede encontrar en grupos de 2-5 bacilos dispuestos paralelamente, b) En grupos, o racimos mayores, c) En gran número, formando conglomerados circulares llamados "globi".
Registro de los resultados Registre los resultados de la siguiente manera: — Muestra obtenida de: placas o nódulos de la oreja, etc. -Bacilos ácido-alcohol resistentes presentes o -No se observaron bacilos ácido-alcohol resistentes.
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También se le puede agregar o informar por ej.: — se observaron bacilos ácido-alcohol resistentes (Especifíquese si se encontraron en globos, ("globi")). O bien, — se examinó con el objetivo x 100 y el ocular x 6; no se observaron bacilos ácido-alcohol resistentes. Los resultados del examen pueden ser clasificados como se muestra en la Tabla 5.3. Importancia del examen de placas o nódulos Empiece invariablemente examinando muestras de placas o nódulos, si es que existen. Índices bacteriológico y morfológico Estos índices se pueden calcular si el médico lo solicita. (a) Índice bacteriológico. El índice bacteriológico (IB) es una guía de la carga bacteriana. Súmense todos los resultados positivos de todos los sitios del cuerpo de donde se han obtenido muestras y divídase el total entre el número de estos sitios. Por ejemplo: sitio 1 = oreja derecha +++ sitio 2 = oreja izquierda ++ sitio 3 = brazo izquierdo ++ Sitio 4 = espalda + Total 8+ (El número total de muestras positivas es 8 +) Índice bacteriológico 8 /4 = 2 (o 2+) (b) Índice morfológico. El índice morfológico proporciona un indicador de la viabilidad de los bacilos. Se determina de la siguiente manera: Examínense 100 bacilos de las preparaciones hechas en los portaobjetos. Cuéntese el número de bacilos que se ha teñido uniformemente de rojo en toda su longitud ("bacilos viables"). Si el número de bacilos viables es, por ejemplo, 8, el índice morfológico será 8%. Este índice se emplea para elaborar el diagnóstico inicial, la historia clínica y la observación y el seguimiento ulterior de pacientes con bacilos abundantes (lepra multibacilar). Cultivo No hay ningún método disponible para el cultivo in vitro de Mycobacterium leprae. Sin embargo, el microorganismo puede cultivarse in vivo en las almohadillas de las patas de ratones o en el armadillo. Tabla 5.3 Informe de los resultados de los exámenes de Mycobacterium leprae Número de bacilos por campo microscópico Resultado Ninguno (<1 por cada 100 campos) 0 0,01-0,1 (1-10 por 100 campos) 1+ 0,1-1 (1-10 por cada 10 campos) 2+ 1 - 10 3+ 10-100 4+ 100-1000 5+ > 1000 6+
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6. MICOLOGÍA1 6.1 EVALUACIÓN DE LA PIEL Y EL CABELLO PARA LOS HONGOS La tiña es una infección fúngica de la piel. Se puede encontrar en la superficie del cuerpo, el cuero cabelludo y las uñas y entre los dedos de los pies. Con frecuencia se produce la infección cruzada entre los seres humanos y la infección también puede ser adquirida a partir de animales infectados o en el suelo. Las lesiones circulares en la piel consisten en una masa de hifas ramificadas, el pelo y las uñas infectadas también pueden contener esporas de hongos. 1Una descripción del método utilizado para la identificación de Candida albicans en la secreción vaginal se proporciona en la sección 5.8. 6.1.1 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos (o papel oscuro) ● Cubreobjetos ● Bisturí ● Pinzas ● Placa de Petri ● Mechero de Bunsen o lámpara de alcohol ● hisopo de algodón ● Algodón ● Etanol al 70% ● Solución de montaje de azul de lactofenol (reactivo no. 33) ● Hidróxido de potasio, solución al 20% (reactivo no. 45). 6.1.2 Método2 Colección de muestras 1. Limpie la zona afectada con un hisopo de algodón empapado en etanol. 2. Utilice un bisturí estéril para raspar suavemente el borde de una lesión y recoger algunas escamas de piel a un portaobjetos de vidrio o sobre un trozo de papel oscuro en el que las escamas pueden ser vistas más fácilmente. También recoja algunos pelos rotos o dañados de las áreas infectadas del cuero cabelludo utilizando unas grandes y amplias pinzas y colocarlos en el portaobjetos. 3. Coloque una gota de solución de montaje de azul de lactofenol y una gota de hidróxido de potasio al 20% a las escamas y el pelo (Fig. 6.1). Cubrir con un cubreobjetos. El álcali fuerte disolverá la queratina en el tejido, lo que permite que se puedan ver hifas y esporas. Nota: El hidróxido de potasio es un fluido corrosivo y no se debe permitir que toque la piel. 4. Colocar el portaobjetos en una placa de Petri cubierta con un poco de algodón húmedo para evitar que la muestra se seque. Dejar la muestra para aclarar durante 5-30 minutos, dependiendo del grosor. Como alternativa, aclarar la muestra mediante la sujeción del portaobjeto por encima de la llama de un mechero de Bunsen o una lámpara de alcohol durante 1 minuto (Fig. 6.2). Advertencia: El colorante y especialmente el hidróxido potásico pueden hervir súbitamente y borbotear. Tenga el rostro convenientemente alejado del portaobjetos durante el calentamiento. 2 La infección por tiña también se puede identificar examinando al paciente en una habitación oscura iluminada con luz ultravioleta. Los pelos infectados con tiña aparecerán fluorescentes. Generalmente, se usa la lámpara de Wood la cual se puede definir como un tipo de iluminación que utiliza luz ultravioleta de onda larga. Cuando se ve un área del cuero cabelludo infectada con tiña bajo la lámpara de Wood, el hongo puede brillar (fluorescente). Esta prueba se puede hacer para detectar la presencia de una infección micótica en el cuero cabelludo o en la piel. Examen microscópico Examine la muestra limpiado utilizando los objetivos x10 y x40. Ajuste el diafragma del condensador para dar un buen contraste. Pueden observarse hifas ramificadas y cadenas de artrosporas redondeadas angulares. Las hifas fúngicas pueden ser diferenciadas de otras estructuras tisulares por su ramificación y los tabiques o septos que presentan. Se tiñen de azul con el azul de lactofenol. Las esporas (gránulos grandes redondos con membranas transparentes) pueden ser vistas alrededor del exterior de los pelos (fig. 6.3). Estas esporas se conocen como ectothrix. Las esporas que se encuentran dentro de los pelos se llaman endothrix (Fig. 6.4). Informar como "hifas o esporas de hongos presentes" o "no encontrado". Importante: Estos exámenes pueden ser difíciles, especialmente en las primeras etapas de la enfermedad. En caso de duda tome un pelo aparentemente normal, de la misma longitud que el pelo enfermo, y colóquelo sobre el portaobjetos al lado del pelo infectado, para compararlos. Solamente por medio de cultivos se puede determinar con exactitud la especie de hongo que causa la infección.
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A
B
D C A) Lesiones de tiña en el cuero cabelludo. La tiña es una infección del cuero cabelludo, causada por diferentes hongos, que afecta principalmente a los niños. Los pacientes pierden el pelo en placas redondas de tamaño variable. En el laboratorio se pueden detectar los hongos por el examen directo del pelo con el microscopio. También es posible cultivar e identificar los hongos en laboratorios especializados (cultivos micológicos). B) Materiales y reactivos. C) Obtención de la muestra: Escoja un pelo conveniente, que se encuentre dentro de las placas de calvicie, pero cerca de! borde. El pelo infectado es corto, quebradizo, se halla retorcido y es más opaco que los demás; a veces existe cierto tipo de pus seco en la raíz. Ponga las pinzas precisamente en la base del pelo. Tire con firmeza, pero gradualmente. El pelo afectado generalmente se fija con escasa firmeza en su folículo y es fácil extraerlo. D) Coloque el pelo en el centro del portaobjetos. Conviene tomar pelos de varias placas (aproximadamente 10 pelos en total). En el mismo portaobjetos se pueden colocar 3 ó 4 pelos.
Figura 6.1 Preparación de los portaobjetos para el examen microscópico de la piel y el cabello para la observación de los hongos. Figura 6.2 Aclaración de la muestra sobre una llama calentándola. Pase el portaobjetos rápidamente 4 veces a través de la llama del mechero Bunsen para calentarlo (o sosténgalo sobre la llama de una lámpara de alcohol durante un minuto). Figura 6.3 Ectothrix a: esporas inmaduras; b: esporas maduras. Figura 6.4 Endothrix a: esporas inmaduras; b: esporas maduras. 6.2 EXAMEN DE PUS PARA MICETOMA El Micetoma es una enfermedad granulomatosa crónica del tejido subcutáneo y profundo. El sitio más comúnmente infectado es el pie, donde se le llama " Pie de Madura”. Otros sitios posibles de infección incluyen las manos, la cabeza y la pared torácica. El Micetoma produce pequeños gránulos que son descargados a través de los senos a la superficie. Estos gránulos se utilizan en el diagnóstico de la enfermedad.
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6.2.1 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● agujas estériles ● Agua destilada ● Metanol al 70% ● Cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53) ● Hidróxido de potasio, solución al 20% (reactivo no. 45) ● Reactivos para la tinción de Gram (ver sección 5.3.1). 6.2.2 Método Colección de muestras 1. Use una aguja estéril para levantar la costra superficial sobre un seno. 2. Retire con cuidado algunos de los puses que supuran sobre un portaobjeto. 3. Añadir una gota de solución salina o agua, extender el pus con cuidado y buscar gránulos. Los gránulos varían en color, tamaño, forma y grado de dureza. 4. Machacar unos gránulos en un poco de agua destilada y colocar en dos portaobjetos. 5. Permitir que un portaobjetos se seque al aire, fijar con metanol durante 2-3 minutos y teñirlo con la tinción de Gram (véase la sección 5.3.1). 6. Ponga unas gotas de hidróxido de potasio al 20% en el segundo portaobjetos y colocar un cubreobjetos. Dejar la muestra para aclarar durante 10 minutos. Examen microscópico Examine la muestra limpiado utilizando los objetivos x10 y x40. Ajuste el diafragma del condensador para dar un buen contraste. Busque las ramificaciones e hifas retorcidas o filamentos fragmentados. Los Gránulos teñidos con Gram pueden mostrar filamentos Gram-positivos finos o fragmentados. Informar como: ● "pus del seno que contiene gránulos de… [Especificar el color y el tamaño del gránulo] presente"; ● "La tinción de Gram muestra hifas delgadas Gram-positivas" o "La tinción de Gram no muestra hifas delgadas Gram-positivas".
B A A) Formación de abcesos en la dermis profunda mostrando bacterias filamentosas gram +. La flecha señala unos de los filamentos. Tinción de Gram magnificación original 400 (Ziehl Neelsen y PAS negativos). Se observan bacterias filamentosas pero no hongos. B) Examen directo con KOH 20% (400x).
C
D
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E F C) Lesiones en tórax posterior. D) Nódulo drenando material purulento. E) y F) Tumefacciones en los miembros inferiores. En F) Paciente con Pie de Madura en el Complejo King Saud Medical Complex. Riyadh. Saudia Arabia.
c
d .c) Grano de Madurella. grisea (200X), de color oscuro y gran tamaño comparado con el grano de Nocardia (no mostrado); d) Grano de M. grisea (400 X) en el que se aprecian los filamentos micóticos que lo constituyen. Imágenes: Dr. Luis J. Méndez Tovar. Fuente: Micetoma, Dr. Luis J. Méndez Tovar, Unidad de investigación médica, hospital de especialidades C.M.N. siglo XXI. 6.3 EXAMEN DE LA PIEL PARA LA PITIRIASIS VERSICOLOR La pitiriasis versicolor es una enfermedad común de la piel en climas cálidos, sino que es causada comúnmente causada por especies de hongos del género Malassezia, aunque antiguamente a los agentes causales se les conocía con los nombres de Pityrosporum orbiculare y Pityrosporum ovale. La pitiriasis versicolor es producida por las siguientes especies del género Malassezia: Malassesia globosa Malassesia sympodialis Malassesia restricta Malassesia furfur (el hongo Pityrosporum furfur hoy es llamado Malassesia furfur) Malassesia ovalis Malassesia pachydermatis Malassesia obtusa Malassesia sloffiae La investigación reciente ha demostrado que la mayoría de pitiriasis versicolor es causada por el hongo Malassezia globosa, aunque Malassezia furfur es responsable de un pequeño número de casos. Esta infección es cutánea, superficial, se caracteriza por manchas en la piel (máculas hipo o hiperpigmentadas) y suele ser por demás asintomática. La cara y el cuerpo están cubiertos de manchas, que aparecen: -Pálidas y descoloridas en pacientes de piel oscura; -Color marrón amarillento en los pacientes de piel blanca. 6.3.1 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● cinta de celofán adhesiva ● Abatelenguas o varilla de vidrio ● Pinzas ● Gasa ● Eosina, solución al 1% (sin reactivo. 23), si es posible (de lo contrario, examinar sin tinción). 6.3.2 Método Colección de muestras 1. Escoja una placa de piel Infectada que se esté extendiendo rápidamente. Humedezca la parte que va a examinar con la gasa empapada en la solución de eosina (Fig. 6.5). Déjese secar durante 1 minuto. (Si se ha espolvoreado talco en la piel, no tome la muestra sin lavarla primero.) 2. Corte una tira de la cinta adhesiva de celofán, aproximadamente de 5 cm de longitud. Colóquela sobre la placa cutánea de manera que sobrepase uno de los bordes (Fig. 6.6). 3. Pegue la cinta de celofán a la piel y presione con firmeza de un extremo al otro haciendo pasar varias veces sobre la cinta un abatelenguas o una varilla de vidrio (Fig. 6.7). Quite de la piel la cinta adhesiva con una pinza. Colóquela inmediatamente sobre un portaobjetos con el lado adherente hacia abajo (Fig. 6.8). Examen microscópico
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Examine con el microscopio todo el portaobjetos (empleando el objetivo x 40) hasta que vea un racimo de gránulos voluminosos (esporas) (fig. 6.9). Si la piel se ha tratado con eosina estos gránulos serán blancos sobre un fondo rosáceo; también son visibles en preparaciones no teñidas. Coloque el objetivo de inmersión en aceite para examinar los detalles (Fig. 6.10): (a) Esporas: — se encontrarán en conglomerados o racimos — son redondas o ligeramente rectangulares — miden 3 – 8 µm de diámetro — sus paredes son más bien gruesas — algunas veces se hallan en proceso de producir brotes visibles. (b) Filamentos de micelio (más difíciles de observar): — son bastoncillos largos, doblados y torcidos — miden 20 – 40 µm de longitud — miden 5 µm de anchura — semejan dedos y poseen ramificaciones. COMUNICACION DE LOS RESULTADOS Examen directo de pitiriasis versicolor: Se observaron racimos de esporas (y, cuando así sea, filamentos de micelio).
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Figura 6.5 Tiñendo las placas cutáneas de pitiriasis versicolor infectadas con eosina. Escoja una placa de piel Infectada que se esté extendiendo rápidamente. Humedezca la parte que va a examinar con la gasa empapada en la solución de eosina. Figura 6.6 Aplicación de una cinta adhesiva a una placa de piel infectada. Figura 6.7 Toma de una muestra de piel. Figura 6.8 Transferencia de una muestra de piel a un portaobjetos. Figuras 6.9 y 6.10 Malassesia spp. Vistas con los objetivos x 40 y x 100 (con aceite de inmersión). (No se puede afirmar la especie, entonces se expresa como “spp.”: Varias especies).
Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud
OMS PARTE 3
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7. EXAMEN DE ORINA El examen de la orina constituye una investigación fundamental en los pacientes en quienes se sospecha trastornos renales o infecciones del tracto urinario. También hay muchos pacientes que no presentan síntomas clínicos, pero en los que las infecciones del tracto urinario no reconocidas anteriormente se pueden diagnosticar por el examen de la orina. 7.1 Recogida de muestras de orina Los contenedores (recipientes) para la recogida de la orina deben ser de boca ancha, limpios y secos. Si la muestra de orina tiene que ser transportada y debe almacenarse por un cierto tiempo para su transporte debe contener un conservante adecuado para prevenir el sobrecrecimiento bacteriano o la eclosión de los huevos viables. 7.1.1 Tipos de muestra de orina Primera muestra de orina de la mañana La primera muestra de orina de la mañana bien temprano proporciona la muestra más concentrada. Muestra de orina aleatoria Una muestra de orina al azar, tomada en cualquier momento del día, permitirá al laboratorio la detección de sustancias que son indicadores de infección de los riñones. Muestra de orina de 24 horas (solicitadas ocasionalmente) La orina se reúne en un frasco de vidrio claro, de 2 litros, con tapa. El paciente deberá orinar en la mañana, al levantarse; esta orina no se recoge. Posteriormente toda la orina que se produzca durante el resto del día se reunirá en el frasco, así como toda la que se produzca en el curso de la noche. Al día siguiente, cuando el paciente se levante, deberá depositar en el frasco la primera orina de la mañana. El frasco se llevará inmediatamente al laboratorio. Ahí se determinará el volumen de la orina con una probeta y se hará el registro correspondiente. Muestra de orina (chorro medio) Mientras está orinando, el paciente coloca en un recipiente abierto el chorro medio de orina, es decir, recoger la muestra a la mitad de la micción en un recipiente abierto y luego el recipiente debe ser cubierto inmediatamente. Se recoge alrededor de 20 ml de orina. Los órganos genitales se deberán limpiar anticipadamente. Muestra de orina terminal El paciente orina la última porción de la orina en un recipiente abierto. Muestras de orina recolectados a través de un catéter La obtención de orina mediante un catéter debe ser llevada a cabo por un médico o enfermera calificados. El procedimiento se utiliza para ciertas pruebas bacteriológicas, principalmente en las mujeres. Por lo general, sin embargo, un espécimen recogido en la forma normal después de una limpieza completa del área genital es aceptable para este propósito. Las muestras de orina de los bebés y niños Las muestras de orina de los bebés y niños “que no avisan” (no controlan esfínteres): La orina puede ser recolectada en una bolsa de plástico con una boca adhesiva. La bolsa se fija alrededor de los genitales del niño y deja en su lugar durante 1-3 horas, dependiendo del examen solicitado. Se pueden utilizar las bolsas de colostomía. 7.1.2 PRESERVACIÓN DE LAS MUESTRAS DE ORINA ● La orina producida recientemente que se procesará en el día y se examina inmediatamente no requiere preservación. ● Si la orina que ha sido recogida para comprobar la presencia de huevos de Schistosoma haematobium pero no puede ser examinada por varias horas, debe ser acidificada con unas pocas gotas de ácido acético al 10% (reactivo no. 2). 7.2 EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE ORINA 7.2.1 Apariencia ● La orina normalmente es transparente de color amarillo pajizo. La orina más concentrada puede aparecer de color amarillo oscuro. ● La presencia de células de la sangre o el exceso de sales puede hacer que la orina aparezca turbia. ● Los pigmentos de sustancias biliares pueden hacer que la orina aparezca de color amarillo oscuro o marrón. ● La orina puede aparecer ocasionalmente incolora. Informe la apariencia como: -Límpida o turbia; -Incolora, amarillo claro, amarillo oscuro o marrón. 7.2.2 Pruebas para la presencia de sangre Recuento de eritrocitos elevados y niveles de hemoglobina aumentados pueden aparecer en la orina: -Después de un ejercicio físico intenso; -En las infecciones del tracto vaginal; -En las infecciones parasitarias (por ejemplo, esquistosomiasis); -En la glomerulonefritis aguda; -En la cistitis aguda o uretritis; -En los pacientes que sufren de ciertos tumores. Las células sanguíneas se ven fácilmente por examen microscópico después de la centrifugación (véase la sección 7.2.7).
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Los eritrocitos lisados pueden ser detectados utilizando una tira reactiva de orina que tiene un segmento o almohadilla para la detección de sangre. Las tiras reactivas de orina están disponibles para la detección de una sola sustancia (por ejemplo, sangre, glucosa o proteína) o para la detección de varias sustancias (por ejemplo, nitritos y esterasa leucocitaria). Método Las tiras reactivas se colocan en la orina y se retiran inmediatamente. A continuación, se comparan con una tabla de comparación después de un tiempo adecuado que también se especifica en la carta. Generalmente, la tabla de comparación o carta viene con diferentes colores, de acuerdo con los colores que se podrían observar en las orinas. Los cambios de color observados en la tira darán una estimación semi-cuantitativa de la cantidad de sustancia presente. Este puede ser reportada como negativa, positiva con cruces a diferentes grados (1 a 4 cruces simbolizadas con el signo más”+”): +, + +, + + +, + + + + o como un valor aproximado de la concentración de la sustancia de ensayo. (Dicho valor aparece en la cartilla de colores de comparación). Las tiras reactivas deben almacenarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 7.2.3 Medición del pH La orina normal producida recientemente es ligeramente ácida, con un pH de 6,0 aproximadamente. En ciertas enfermedades el pH de la orina puede aumentar o disminuir. Principio ● Se sumergen en la orina piezas de papel indicador de colores(o se coloca en un vidrio de reloj y unas gotas de orina se añade a la misma). ● El color cambia según el pH. ● Los papeles se comparan entonces con un cuadro testigo estandarizado en el que figuran las cifras correspondientes. Materiales (Fig. 7.1) ● Vidrios de reloj ● Gotero ● Pinzas o tenacillas ● Papeles indicadores de tipo universal (para medir pH de 1 a 10) ● Papeles indicadores de graduación limitada: para el intervalo de 5,0 — 7,0 y el intervalo de 6,0 8,0. La orina en que se haga el ensayo deberá ser fresca. La muestra de orina debe ser examinada dentro de 1 hora desde la recogida. Método 1. En un vidrio de reloj ponga una tira de papel indicador de tipo universal (pH 1 — 10). Deposite en el papel indicador algunas gotas de orina fresca (Fig. 7.2). Alternativamente, sumergir el papel de prueba directamente en la orina contenida en el recipiente. 2. Con la tenacilla tome la tira de papel indicador. Compare el color que se ha producido con los que figuran en el cuadro estandarizado (Fig. 7.3). Vea la cifra del pH en la unidad cuyo color corresponda más estrechamente al de la tira de papel. 3. Según el resultado obtenido tómese una tira de papel de graduación limitada que sea adecuada para el caso. Ejemplo: — pH 6: papel indicador con intervalo de 5,0 — 7,0 — pH 8: papel indicador con intervalo de 6,0 — 8,0. 4. Repita el ensayo en otro vidrio de reloj, utilizando papel indicador de graduación limitada. Coteje el pH de la orina por medio del cuadro estandarizado (fig. 7.4). Ejemplo: pH = 6,0, o pH = 7,5. El papel indicador también se puede sumergir directamente en la orina, dentro del recipiente, para calcular el pH. Resultados pH normal aproximadamente 6,0 (límite del intervalo normal, de 5,0 a 7,0 durante el día). Se observan valores de pH ácidos (4,5 — 5,5) (si persiste, puede obedecer a algunas formas de diabetes, fatiga muscular, o acidosis). Valores de pH alcalino 7,8 — 8,0 (son comunes en pacientes con infecciones del aparato urinario; alimentación vegetariana). pH y depósitos de cristales La determinación del pH de la orina es útil para identificar depósitos de cristales (véase sección 7.2.7, más adelante). Algunos cristales se depositan solo en la orina ácida; otros lo hacen solamente en la orina alcalina. Por ejemplo: — Orina ácida: oxalatos, ácido úrico. — Orina alcalina: fosfatos, carbonatos, biurato de amonio. Salvo en enfermedades muy raras, los depósitos cristalinos en la orina no tienen importancia diagnóstica. Recordatorio: Los líquidos ácidos tienen un pH de 0 — 7 (0 es el más ácido). Los líquidos alcalinos tienen un pH de 7 — 14 (14 es el más alcalino)
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Figura 7.1 Materiales para medir el pH de la orina Figura 7.2 Aplicación de la muestra de orina al papel indicador universal Figura 7.3 Comprobación del pH usando papel indicador universal Figura 7.4 Comprobación del pH usando papel indicador de pH de rango limitado.
7.2.4 Detección de la glucosa Principio La glucosa es el “azúcar” (hidrato de carbono, monosacárido) más comúnmente encontrada en la orina, especialmente en pacientes diabéticos y pacientes que sufren de insuficiencia renal crónica. La glucosa es una sustancia reductora: Reduce el sulfato cúprico, de color azul, de la solución de Benedict, a óxido cúprico rojo, que es insoluble. La lactosa es también un azúcar reductor y se observa ocasionalmente en la orina de mujeres embarazadas. Materiales y reactivos ● Tubos de ensayo de vidrio Pyrex ● Un portatubos de madera ● Gradilla ● Un vaso para análisis o un tarro ● Mechero de Bunsen o lámpara de alcohol ● Gotero ● Pipeta graduada de 5 ml ● Solución de Benedict (cualitativa) (reactivo no. 10). ● Frascos para penicilina Método 1. Pipetear 5 ml de solución de Benedict en un tubo de ensayo. 2. Añadir ocho gotas de orina y mezclar bien. 3. Hierva durante 2 minutos en el mechero Bunsen o en una lámpara de alcohol (fig. 7.5), o sostenga el tubo dentro de un vaso para análisis o un tarro con agua hirviendo durante 5 minutos. 4. Colocar el tubo de ensayo en la gradilla y se deja enfriar a temperatura ambiente. Examine la mezcla para saber si hay cambios de color o precipitados. El resultado se muestra en la Tabla 7.1. La glucosa en la orina también se puede detectar utilizando una tira reactiva de orina (ver sección 7.2.2). Tabla 7.1 Informe de los resultados del método de Benedict para la detección de sustancias reductoras en la orina
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Color Azul Verde Verde con precipitado amarillo Desde amarillo hasta verde oscuro Castaño Desde anaranjado hasta rojo ladrillo
Resultado Negativo Trazas (situados al límite de la normalidad) + ++ +++ ++++
A
B
C A) Materiales. B) Con una pipeta deposite 5 ml de solución de Benedict en un tubo de ensayo. C) Agregue 8 gotas de orina y mézclelas completamente. Figura 7.5 Método de Benedict para la detección de sustancias reductoras en la orina. Hierva durante 2 minutos en el mechero Bunsen o en una lámpara de alcohol, o sostenga el tubo dentro de un vaso para análisis o un tarro con agua hirviendo durante 5 minutos. 7.2.5 Detección y estimación de proteínas en orina Los niveles de proteína elevados son observados en la orina de pacientes con: -Esquistosomiasis urinaria Enfermedad renal crónica -Pielonefritis -Diabetes mellitus -Trastornos sistémicos (lupus eritematoso) -Mieloma múltiple. Sin embargo, la proteinuria ortostática, una forma de proteinuria funcional que generalmente se observa en hombres jóvenes, que se produce al ponerse de pie y desaparece al acostarse, no tiene ningún significado patológico. Principio1 Cuando se añade ácido tricloroacético a la orina que contiene proteína, se forma un precipitado, que se mide por turbidimetría. Esta reacción se produce con casi todas las proteínas, incluyendo albúmina y globulinas. 1Otros detalles del método descrito aquí se dan en las siguientes referencias: Shahangian S, Brown PI, Ash KO. Turbidimetric measurement of total urinary proteins: a revised method. American journal of clinical pathology, 1984, 81:651–654; Tietz NW, ed. Textbook of clinical chemistry, 2nd ed. Philadelphia, WB Saunders, 1994. Materiales y reactivos ● Espectrofotómetro ● Tubos de ensayo ● Gradilla ● Centrífuga ● Rotador mecánico ● Albúmina de suero bovina o humana ● Ácido tricloroacético, solución al 5% (Ver reactivo n º 62), diluida 1: 4 con agua destilada ● Cloruro de sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53) ● Controles positivos y negativos ● Estándar de trabajo de albúmina, solución al 0.005% (preparada a partir de estándar de reserva de albúmina, solución al 5,0%, diluida 1:100 con cloruro de sodio, solución al 0.85% (reactivo no. 53)). El estándar de trabajo de albúmina se puede dividir en alícuotas y almacenado a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Si el estándar de reserva de albúmina no está disponible, los estándares comerciales a base de suero que contienen tanto a la albúmina y la globulina se pueden utilizar para preparar una solución estándar de trabajo de albúmina de la concentración apropiada. Al igual que con el
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estándar de albúmina, el estándar de trabajo de albúmina también se puede dividir en alícuotas y almacenarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Método Colección de muestras Se deben utilizar muestras aleatorias, o las muestras de orina de 24 horas (véase la sección 7.1.1). No deben añadirse conservantes a las muestras. Las muestras de 24 horas que se recogen deben ser almacenadas a 4-8 °C durante el período de recolección, para evitar el crecimiento bacteriano. Las muestras recogidas deben mantenerse a 4 °C hasta su análisis. Si es probable que el análisis se retrase por más de 24 horas, las muestras deben ser almacenadas a -20 °C. Técnica 1. Añadir 1,6 ml de la muestra de orina a cada uno de dos tubos de ensayo (al blanco de muestra y al desconocido). Repetir el proceso con el estándar de trabajo y el de control. 2. Añadir 0,4 ml de solución de ácido tricloroacético a todos los tubos de ensayo y mezclar bien. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos. 3. Centrifugar los blancos a 2000 g durante 10 minutos. 4. Usando el espectrofotómetro, medir y registrar la densidad óptica de las pruebas y los blancos a 620 nm. El espectrofotómetro debe ajustarse a cero con agua destilada antes de tomar cualquier medida. También debe ser calibrado, como se describe a continuación. El intervalo analítico de medición utilizando este método es de 100-1000 mg/l. Cálculo Calcular la concentración de proteína en la muestra de orina utilizando la siguiente fórmula: (OD T OD TB ) C (OD R OD RB ) Donde: C = concentración de la solución de calibración ODR = Densidad óptica del estándar de trabajo ODRB = Densidad óptica del blanco del estándar de trabajo ODT = Densidad óptica de la muestra de ensayo ODTB = Densidad óptica del blanco de la muestra de ensayo. Nota: ● Si se utiliza un control basado en suero para fines de calibración, un material independiente debe ser utilizado para el propósito de control de calidad. ● Debido a que la cantidad de proteína excretada en la orina puede variar en gran medida, los resultados positivos deben confirmarse siempre mediante la repetición de la prueba en una o más muestras independientes. ● Si se utiliza este método para la detección de microproteinuria (que se puede correlacionar con microalbuminuria en ausencia de daño tubular, las infecciones urinarias y el tratamiento con ciertos fármacos) en poblaciones de alto riesgo, como los pacientes con diabetes, las siguientes modificaciones deben aplicarse a los pasos 2 y 4: 2. Deje todos los tubos en reposo a temperatura ambiente durante 35 minutos después de la mezcla. 4. Usando el espectrofotómetro, medir y registrar la densidad óptica de los problemas y de los blancos a 405 nm. El intervalo analítico de este método modificado es 25-700 mg /l. La proteína en la orina también se puede detectar utilizando una tira reactiva para proteínas (véase la sección 7.2.2). 7.2.6 Detección de cuerpos cetónicos en orina La orina normal no contiene cuerpos cetónicos. La acetona y otros cuerpos cetónicos pueden aparecer en la orina: -En la diabetes severa o no tratada; En otras condiciones (deshidratación, vómitos, desnutrición, hambre prolongado y después del ejercicio extenuante). Principio Cuando se añade el nitroprusiato de sodio (nitroferrocianuro sódico o pentacianonitrosilferrato sódico (III)) a la orina que contiene cuerpos cetónicos, se produce un color púrpura. Materiales y reactivos ● Tubos de ensayo ● Gradilla ● Probetas, 10 ml ● Pipeta gotera ● Cristales de nitroprusiato de sodio ● Ácido acético ● Amoníaco. Método 1. Justo antes de la realización de la prueba, colocar un número suficiente de cristales de nitroprusiato de sodio en un tubo de ensayo para cubrir la parte inferior (fig. 7.6). 2. Añadir 5 ml de agua destilada. Agitar bien hasta que los cristales están casi disueltos. (No se espera que todos los cristales se disuelvan ya que la solución está saturada.) 3. Medir 10 ml de orina en otro tubo de ensayo. 4. Añadir cuatro gotas de ácido acético a la orina, seguido de 10 gotas de solución de nitroprusiato de sodio recién preparada. Mezclar bien.
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5. Sujetando la punta de la pipeta contra el lado del tubo, dejar que 20 gotas (1 ml) de solución de amoníaco fluyan sobre la superficie del líquido (fig. 7.7). Esperar durante 5 minutos antes de la lectura-un resultado positivo puede ser evidente antes de este tiempo. Si el resultado es positivo (Fig. 7.8), un anillo de color púrpura aparece en la parte superior de la orina. Si el resultado es negativo, no se produce ningún cambio de color. Informar el resultado como se muestra en la Tabla 7.2. Los cuerpos cetónicos en la orina también se pueden detectar utilizando una tira reactiva de orina (ver sección 7.2.2).
Figura 7.6 Preparación de la solución de nitroprusiato de sodio Figura 7.7 Adición de una solución de amoníaco a la superficie de la solución de nitroprusiato de sodio Figura 7.8 Prueba para sustancias cetónicas en la orina a: Reacción positiva; b: reacción negativa
Tabla 7.2 Informe de los resultados de la prueba para la detección de cuerpos cetónicos en la orina Cambio de color Resultado Ninguno Negativo Anillo rosado + Anillo rojo ++ Anillo púrpura +++ 7.2.7 Detección de elementos anormales Principio La orina contiene células y cristales en suspensión que pueden ser recogidos por centrifugación o por acción gravitatoria directa que permite que la orina permanezca estable y quieta y las partículas en suspensión formen un sedimento cuando el tubo es colocado en posición vertical en una gradilla. Como todos estos elementos en suspensión se sedimentan en la orina, si ésta se deja en reposo durante algunas horas, se les llama sedimentos urinarios. El depósito urinario resultante (sedimento urinario) puede ser examinado bajo el microscopio. La centrifugación es el método más usual para formar un sedimento por su rapidez. En ciertas enfermedades de las vías urinarias, los depósitos o sedimentos de orina se alteran considerablemente. Los siguientes elementos anormales se pueden encontrar: -Leucocitos -Números anormales de eritrocitos -Cristales anormales (muy raramente) -Trofozoítos parasitarios (por ejemplo, Trichomonas vaginalis) o los huevos de parásitos (por ejemplo Schistosoma haematobium1, Enterobius vermicularis2) -Bacterias -Hongos - Cilindros anormales. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Centrífuga ● Tubo cónico de centrífuga de 15 ml ● Pipeta Pasteur ● Cubreobjetos ● Formaldehido ● Agua destilada.
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Véase también la sección 7.2.8. Enterobius vermicularis: Se observan los huevos no por ser eliminados por orina sino por contaminación fecal o mejor dicho ya que son colocados en la zona perianal y algunos huevos pasan o se pueden encontrar, por ejemplo, en la ropa interior, en el perineo, pueden, cuando se produce la micción para recoger la muestra, pasar al frasco de recolección y contaminarlo. Generalmente, se pueden observar en orinas de mujeres, niñas, o bebés. Método Colección de muestras La orina para examinarla bajo el microscopio debe estar recién obtenida para recogerla en un recipiente limpio y seco. Una muestra de orina de chorro medio (ver sección 7.1.1) es la más útil. La orina almacenada en un frigorífico puede contener un exceso de sales precipitadas y no será adecuada para microscopía. La muestra se puede preservar para el examen microscópico del depósito mediante la adición de 8-10 gotas de solución de formaldehido al 10% (reactivo no. 28) por cada 300 ml de orina. La orina conservada de esta forma no es adecuada para otras pruebas. Preparación del sedimento 1. Mezcle la muestra de orina suavemente y vierta aproximadamente 11 ml en un tubo de centrífuga. También puede llenar 3/4 de su capacidad (75%). 2. Centrifugar la muestra a velocidad media (2000 g) durante 5 minutos. 3. Retirar el sobrenadante de forma rápida invirtiendo el tubo sin agitación. (El sobrenadante puede ser utilizado para las pruebas de bioquímica.) 4. Resuspender el sedimento en agua destilada y mezclar agitando el tubo. También, puede agitar el tubo a fin de que el sedimento forme nuevamente una suspensión sin agregarle agua destilada. 5. Transfiera una gota del depósito sobre un portaobjetos con una pipeta Pasteur y cubrir con un cubreobjetos. 6. Etiquetar el portaobjetos con el nombre del paciente o número de identificación. Examen microscópico Examínela inmediatamente con el microscopio: — primero, con el objetivo x 10 — a continuación, con el objetivo x 40 — sin filtro de color — descendiendo el condensador suficientemente (o reduciendo la abertura de este) a fin de que los elementos transparentes se hagan visibles. Con el objetivo x10 y con el condensador bajo, examine todo el cubreobjetos por todas partes en busca de huevos de Schistosoma haematobium cuando esté indicado. Con el objetivo x40 y con el condensador bajo o la abertura reducida, examinar el área del cubreobjetos otra vez e informe cualquier hallazgo como un valor cuantitativo para cada campo de alto aumento. A continuación se puede encontrar en la orina: -Eritrocitos -Leucocitos -Células epiteliales -Cilindros -Hongos -Cristales -Huevos de parásitos y larvas de parásitos -Trichomonas vaginalis -Espermatozoides. Eritrocitos (Fig. 7.9) Los eritrocitos en la orina pueden estar: (a) intactos: pequeños discos amarillentos, más oscuros en los bordes (8 µm) (b) festoneados o crenados: con bordes espinosos y diámetro reducido (5 — 6 µm); (c) henchidos: círculos de poco espesor y diámetro aumentado (9 — 10 µm). Normalmente hay muy pocos eritrocitos en la a orina. de mujeres si las muestras se obtienen durante Nota: Se pueden encontrar eritrocitos en l el período menstrual. La forma de las células a menudo cambia durante el almacenamiento de la orina y no tiene ninguna importancia diagnóstica.
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Figura 7.9 Eritrocitos a: células intactas; b: células crenadas, c: células henchidas.
Leucocitos (fig. 7.10) Los leucocitos que se encuentran en la orina pueden estar: (a) intactos: discos claros y granulosos de 10 – 15 µm (los núcleos pueden ser visibles) (b) degenerados: deformes, encogidos, menos granulosos (c) como pus: racimos de numerosas células degeneradas. La existencia de abundantes leucocitos, especialmente en racimos, denota generalmente una infección de los conductos urinarios. Cómo expresar la cantidad de eritrocitos y leucocitos encontrados en los sedimentos urinarios Es importante que se indique la cantidad de los diversos elementos que se observen. También es importante que se use un solo método para expresar las cantidades halladas. Coloque una gota de sedimento urinario en un portaobjetos y colocar un cubreobjetos. Usando el objetivo x40, examinar el sedimento y contar el número de eritrocitos y leucocitos por campo microscópico. Informe los resultados como se describe en las Tablas 7.3 y 7.4.
Figura 7.10 Leucocitos a: Las células intactas; b: células degeneradas, c: pus. Figura 7.11 células de la pelvis renal y el uréter Tabla 7.3 Informe de los resultados del examen microscópico de la orina para los eritrocitos Número de eritrocitos por campo microscópico Resultado 0-10 Escasos eritrocitos (normal) 10-30 Cantidad moderada de eritrocitos > 30 Abundantes eritrocitos Tabla 7.4 Informe de los resultados del examen microscópico de la orina para los leucocitos Número de leucocitos por campo microscópico Resultado 0-10 Escasos leucocitos (normal) 10-20 Cantidad moderada de leucocitos 20-30 Abundantes leucocitos 20-30 (degenerados) en grupos o racimos (racimos de Se observan numerosos leucocitos en más de 20 leucocitos degenerados hasta 30 racimos aproximadamente) > 30 (degenerados) en grupos o racimos (racimos de campo lleno de leucocitos (campo leucocitos y numerosos leucocitos degenerados) cubierto) Células del uréter y pelvis renal (Fig. 7.11)
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Ovales, de tamaño mediano, con núcleos claramente visibles. Si son abundantes y se encuentran junto con leucocitos y filamentos, es probable que provengan del uréter. Si son escasas y no se acompañan de leucocitos pueden ser células de la pelvis renal. Células renales (Fig. 7.12) Las células renales son más pequeñas que las células renales pélvicas. Las células renales son pequeñas: — Su tamaño es el de 1 - 2 leucocitos (L) — Son sumamente granulosas. Los núcleos refractan la luz y son claramente visibles. Casi siempre se encuentran junto con las proteínas urinarias.
Figura 7.12 Células renales. Se observan e la figura las células renales hacia la izquierda y hacia la derecha dos leucocitos (L), para comparar su tamaño.
Levaduras No se deben confundir con eritrocitos. Tamaño: 5 — 12 µm Forma: cuerpos redondeados u ovales de varios tamaños, que se hallan juntos. Se pueden observar brotes. No son solubles en ácido acético. Las levaduras se observan ocasionalmente en muestras de orina que contienen glucosa. Verifique que la orina sea fresca. También pueden ser encontradas en otros casos. Trichomonas Tamaño: 15 µm (equivalente a 2 eritrocitos) Forma: redonda, globular Movilidad: móviles en la orina fresca (giran y se vuelven) Membrana ondulante: lateral Flagelos: 4 flagelos más o menos visibles. Los trofozoítos de T. vaginalis muestran contaminación de la orina, con flujo vaginal en la mujer, cuando sucede en el varón, denota infección y mala higiene previa. A pesar que aparecen en la orina y su presencia indica infección, y por ende, son consideradas patológicas, hubo una mala recolección de la muestra con la consecuente contaminación de la orina. Espermatozoides Cabeza: muy pequeña (5 µm) Flagelo: largo y flexible (50 µm) Movilidad: móviles en la orina muy fresca. Se encuentran ocasionalmente en la orina de hombres. También en la orina de mujeres en edad fértil, esto implica que tuvieron coito vaginal con un varón fértil previo a la recolección, lo que denota una contaminación con flujo vaginal y debería pedirse una nueva muestra, previa higiene de la zona, recogida con tapón vaginal. Células epiteliales 1. Células epiteliales escamosas Grandes y rectangulares; provienen de la descamación (desprendimiento de células del epitelio de los conductos y órganos urinarios). Se originan en: — el uréter, o — la vagina 2. Células de la vejiga urinaria Voluminosas, frecuentemente con formas romboidales y un núcleo claramente visible. 3. Células de la pelvis renal De tamaño mediano (equivalente al de 3 leucocitos), granulosas, con cierta especie de cola. Fueron explicadas antes. 4. Células del uréter y pelvis renal Fueron explicadas antes. 5. Células renales Fueron explicadas antes.
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A
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F E A) Levaduras. B) T. vaginalis, obsérvese el movimiento. C) Espermatozoides. D) Células epiteliales escamosas. E) Células de la vejiga urinaria. F) Células de la pelvis renal. Cilindros Los cilindros son cilíndricos y alargados, y cruzan casi todo el campo cuando se examinan con el objetivo x 40. Se forman durante las enfermedades de los túbulos renales, que se pueden llenar de sangre, de otras células y de depósitos de sustancias químicas. Cilindros hialinos Son transparentes y refractan ligeramente la luz; los extremos pueden ser redondeados o delgados (Fig. 7.13). (Se suelen encontrar en individuos sanos después de esfuerzos musculares intensos.) Cilindros granulosos Estos cilindros son más bien cortos, llenos de gránulos voluminosos, de color amarillento y extremos redondeados (Fig. 7.14). Los gránulos provienen de células epiteliales degeneradas de los túbulos renales. Cilindros de gránulos finos (Fig. 7.15) Los gránulos de estos cilindros son más pequeños y no llenan el molde o matriz completamente. No se deben confundir con los cilindros hialinos, que se hallan cubiertos parcialmente por cristales de fosfatos amorfos. Cilindros sanguíneos (o hemáticos) Estos cilindros se encuentran llenos de eritrocitos más o menos degenerados, de color acastañado (Fig. 7.16). Se encuentran en la enfermedad renal aguda. Cilindros de pus (leucocitarios) (Fig. 7.17) Contienen leucocitos degenerados. Los verdaderos cilindros de pus se llenan completamente de leucocitos (a). Se encuentran en los pacientes que sufren de infección renal. Los cilindros hialinos pueden contener algunos leucocitos (b). Cilindros de células epiteliales Se encuentran llenos de células epiteliales de color amarillo pálido (Fig. 7.18). (Para distinguir estas células con mayor facilidad agregue una gota de ácido acético al 10% (reactivo Nº 2) al sedimento.) Los cilindros de células epiteliales no poseen significancia diagnóstica. Cilindros grasos (raros) Refractan intensamente la luz; son de color amarillento, bordes mellados y claramente visibles, y extremos redondeados (Fig. 7.19). Los cilindros grasos son solubles en éter e insolubles en ácido acético. (Se encuentran en casos de enfermedades renales graves.) ANEXO Cilindros céreos Éstos poseen un índice de refracción muy elevado, son amarillos, grises o incoloros y tienen un aspecto uniforme y homogéneo (Figs. 3-48, 3-49). Con frecuencia aparecen como cilindros anchos y cortos de extremos romos o cortados, y a menudo sus bordes son serrados o de aspecto resquebrajado. Se ha postulado que pueden formarse a partir de la degeneración de cilindros granulosos. Los céreos se observan en orinas de pacientes con insuficiencia renal crónica grave, hipertensión
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maligna, amiloidosis renal y nefropatía diabética. También se ven en casos de enfermedad renal aguda, inflamación y degeneración tubular y en el rechazo del aloinjerto de riñón (véanse figuras anexas). Fuente: Sister Laurine Graff Análisis de Orina Atlas Color (1987) Cilindros grasos Son aquellos que incorporaron gotitas de grasa libre o bien cuerpos ovales grasos (consúltese la sección correspondiente a cuerpos ovales grasos). Pueden contener sólo unas pocas gotitas de grasa o estar formados casi totalmente por gotitas de grasa de diferente tamaño. En la figura 3-50 se muestra un típico cilindro graso con gotitas grasas de gran tamaño en una de sus mitades y otras más pequeñas de color amarillo castaño en la otra. Si la grasa es colesterol, las gotitas serán anisotrópicas, y bajo luz polarizada presentan la característica formación en cruz de Malta. Las gotitas isotrópicas son formadas por triglicéridos, no polarizan la luz, pero se tiñen con Sudan III o con Oil Red O. Los cilindros grasos se ven cuando existe degeneración grasa del epitelio tubular, como en la enfermedad tubular degenerativa. Se observan con frecuencia en el síndrome nefrótico y pueden aparecer en la glomeruloesclerosis diabética, en la nefrosis lipoidea, en la glomerulonefritis crónica, en el síndrome de Kimmelstiel Wilson, en el lupus y en la intoxicación renal (véanse figuras anexas). Fuente: Sister Laurine Graff Análisis de Orina Atlas Color (1987) Falsos cilindros (Fig. 7.20) No se deben confundir con cilindros: — las acumulaciones de cristales de fosfatos, que son pequeñas y claramente delimitadas (a) — las acumulaciones de moco translúcido, cuyos extremos se adelgazan hasta tomar forma de hilos (b). Diversas sustancias extrañas Si se usan recipientes o portaobjetos sucios, o las muestras de orina se dejan expuestas al aire, se podrán encontrar las siguientes sustancias extrañas (véase Fig. 7.21): (a) gotas pequeñas de aceite (refractan la luz) (b) gránulos de almidón (se tiñen de negro azulado con la solución yodurada de Lugol) (c) granos de polen (d) pelos (e) fibras de algodón (f) burbujas.
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Figura 7.13 Cilindros hialinos. Figura 7.14 Cilindros granulosos. Figura 7.15 Cilindros granulosos finos: a: Los verdaderos cilindros granulosos finos; b: cilindros hialinos parcialmente cubiertos por cristales de fosfato amorfo. Figura 7.16 Cilindros hemáticos. Figura 7.17 Cilindros de pus. a: cilindros de pus verdaderos; b: cilindros hialinos que pueden contener algunos Leucocitos. Figura 7.18 Cilindros epiteliales. Figura 7.19 Cilindros grasos. Figura 7.20 Falsos cilindros: a: cristales de fosfato; b: mucus transparente. Figura 7.21 Sustancias extrañas: a: gotitas de aceite, b: gránulos de almidón; c: granos de polen, d: pelos, e: fibras de algodón, f: burbujas de aire.
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Figura 3 -50 Cilindro graso (400 x)
Figura 6-49 Cilindro graso que muestra la adherencia de las gotas de grasa a la matriz del cilindro (400).
Figura 3 -48 Cilindros céreos y leucocitos (200 x)
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Figura 3 -49 Cilindros céreos, leucocitos y bacterias (400 x)
Figura 6–58 Cilindro céreo amplio teñido con Figura 6-55 Cilindro granular degenerándose en un KOVA(x 400). cilindro céreo (x 400) Fuentes: Susan King Strasinger, D.A., M.T. (A.S.C.P.) Marjorie Schaub Di Lorenzo, M.T. (A.S.C.P.) SH Urinalysis and Body Fluids Fourth Edition (figuras 6 – 49, 6 – 58, 6 – 55). Sister Laurine Graff Análisis de Orina Atlas Color (1987) (figuras 3 -48, 3 -49, 3 -50). CRISTALES (fig. 7.22) Los cristales tienen formas geométricas uniformes (a), a diferencia de los residuos amorfos, que consisten en acumulaciones de gránulos pequeños sin forma definida (b). Excepto en las enfermedades raras, los cristales en la orina no tienen importancia diagnóstica. SEDIMENTOS NORMALES DE CRISTALES Depósitos cristalinos normales Oxalato cálcico (en orina ácida) (Fig. 7.23) (a) Forma: semejan sobres de correo (Cristal de Oxalato cálcico dihidratado) Tamaño: 10 - 20 µm (equivalente a 1 – 2 eritrocitos) O bien: (b) Forma: semejante a cacahuetes enteros (Cristal de Oxalato cálcico monohidratado) Tamaño: aproximadamente 50 µm; refractan intensamente la luz. Color: incoloro, muy brillante. Acido úrico (en orina ácida) (Fig. 7.24) Forma: variada (cuadros, rombos, cubos o forma de "rosas") Tamaño: 30 - 150 µm Color: amarillo o rojo parduzco Fosfatos triples (en orina neutra o alcalina) (Fig. 7.25) Forma: rectangulares (“forma de tapa de ataúd”) (a), o semejantes a hojas de helecho o estrellas (b) Tamaño: 30 - 150 µm Color: incoloros; refractan la luz Biurato de amonio (en orina alcalina) (Fig. 7.26) Forma: semejan cactos (a) o haces de agujas (b) Tamaño: aproximadamente 20 µm (2 - 3 eritrocitos) Color: amarillo; refractan la luz. (Frecuentemente se encuentran junto con los fosfatos.) Depósitos cristalinos normales; Cristales menos frecuentes Fosfato cálcico (en orina neutra o alcalina) (fig. 7.27) Forma: estrellada Tamaño: 30 - 40 µm Color: ninguno. Carbonato cálcico (en orina neutra o alcalina) (fig. 7.28) Cristales: sumamente pequeños; agrupados en pares; semejan granos de mijo o maíz
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Color: ninguno. (Si se añade ácido acético al 10%(reactivo no. 2) se disuelven, produciendo burbujas de gas). Sulfato cálcico (en orina ácida) (fig. 7.29) Forma: prismas alargados u hojillas, separados o formando haces Tamaño: 50 - 100 µm. (Se pueden diferenciar de los cristales de fosfato cálcico midiendo el pH de la orina.) Residuos amorfos Fosfatos amorfos (en orina alcalina) (Fig. 7.30) Gránulos pequeños, blanquecinos, frecuentemente dispersos. Estos gránulos son solubles en una solución de ácido acético al 10% (reactivo no. 2) (1 gota por cada gota de sedimento). Uratos amorfos (en orina ácida) (Fig. 7.31) Gránulos muy pequeños, de color amarillento, agrupados en racimos compactos. No se disuelven en ácido acético al 10% (reactivo no. 2), pero lo hacen si la orina se calienta suavemente. (En la orina que se ha conservado en el frigorífico se suelen encontrar gruesos precipitados de uratos.)
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Figura 7.22 Cristales: a) Cristales, b) Residuos amorfos. Figura 7.23 Cristales de oxalato de Calcio: a) Cristales en forma de sobres de correo (Cristal de Oxalato cálcico dihidratado), b) Cristales en forma semejante a cacahuetes enteros (Cristal de Oxalato cálcico monohidratado). Figura 7.24 Cristales de ácido úrico. Figura 7.25 Cristales de Fosfato triple (Fosfato Amónico magnésico) rectangulares (“forma de tapa de ataúd”) (a), o semejantes a hojas de helecho o estrellas (b) Figura 7.26 Cristales de biurato de amonio: a: cristales en forma de cactus, b: cristales en forma de aguja formando haces. Figura 7.27 Cristales de fosfato de calcio. Figura 7.28 Cristales de carbonato de calcio. Figura 7.29 Cristales de sulfato de calcio. Figura 7.30 Fosfatos amorfos. Figura 7.31 Uratos amorfos. Figura 7.32 Cristales de Cistina. Figura 7.33 Cristales de colesterol. Obsérvese el aspecto de “vidrio roto”. Figura 7.34 Cristales de bilirrubina. Figura 7.35 Hongos levaduriformes. Figura 7.36 Schistosoma haematobium. OTROS DEPÓSITOS CRISTALINOS (OTROS SEDIMENTOS DE CRISTALES) Los siguientes se encuentran raras veces en la orina. Sin embargo, cuando existen se suelen observar en grandes cantidades. Cistina (en orina ácida) (fig. 7.32) Forma: laminillas hexagonales Tamaño: 30 - 60 µm Color: incoloras; refractan intensamente la luz. Estos cristales solo se encuentran en orina fresca, ya que son solubles en amoníaco. (Se suelen observar en la cistinuria, una enfermedad hereditaria.) Colesterol (en orina ácida) (Fig. 7.33) Forma: laminillas cuadradas con escotaduras en un lado (semejan un “vidrio roto”) Tamaño: 50 - 100 µm Color: incoloras; refractan la luz. Solubles en éter.
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Bilirrubina (muy rara) (Fig. 7.34) Forma: diversos cristales sumamente pequeños, cuadrados, esféricos o en agujas Tamaño: 5µm (aproximadamente 1/2 eritrocito) Color: castaño. (El ensayo químico de pigmentos biliares resulta positivo.) Sulfonamidas acetiladas (en orina neutra o ácida) Se observan en pacientes que están siendo tratados con sulfonamidas. Los cristales de sulfonamidas tienen formas variadas, aunque suelen formar ruedecillas o agujas. Si se observan en la orina cantidades importantes de cristales no identificados, averígüese si el paciente se está tratando con sulfonamidas. Se debe notificar la existencia de estos cristales, ya que pueden causar lesiones renales. Hongos (fig. 7.35) Tamaño: 5-12 µm. Forma: cuerpos redondos u ovales de diversos tamaños encontrados juntos. No debe confundirse con los eritrocitos. Se pueden observar brotes. No son solubles en ácido acético. Los hongos y las levaduras se observan ocasionalmente en muestras de orina que contienen glucosa. Verifique que la orina sea fresca. Huevos y larvas de parásitos A continuación se puede encontrar: Huevos de Schistosoma haematobium: se acompañan de eritrocitos(Fig. 7.36); Microfilarias de W. bancrofti (ver Fig. 4.121.): la orina es blanquecina y turbia. 7.2.8 DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN PRODUCIDA POR SCHISTOSOMA HAEMATOBIUM En los países en donde la esquistosomiasis es endémica, las muestras de orina se examinan para buscar huevos de Schistosoma haematobium. Los trofozoítos de Trichomonas vaginalis también pueden ser encontrados. Las microfilarias de Wuchereria bancrofti y Onchocerca volvulus también se pueden encontrar en el sedimento urinario centrifugado, proveniente de la orina de pacientes de países en los que la filariasis es endémica. La primera evidencia indirecta de la infección por Schistosoma haematobium es la hematuria y/o proteinuria, que se puede detectar mediante una tira reactiva de orina (ver sección 7.2.2). La hematuria macroscópica indica una fuerte infección. Los dos métodos usados para la detección de huevos de Schistosoma haematobium son los de sedimentación y filtración. El método de sedimentación es menos sensible pero es más barato y más simple de realizar. La técnica de filtración se utiliza cuando se necesita información cuantitativa para fines de vigilancia epidemiológica. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Centrífuga (método de sedimentación) ● Tubos de centrífuga cónicos, 15 ml (método de sedimentación) ● Soporte para filtro, 13 o 25 mm de diámetro (método de filtración) ● Filtro de membrana, tamaño de poro 12-20 µm (nylon o policarbonato) o papel de filtro tipo Whatman N º 541 (o equivalente) (método de filtración) ● Frasco cónico para la recolección de orina ● Pipetas Pasteur (método de sedimentación) ● Jeringa de plástico, 10 ml (método de filtración) ● Yodo Lugol, solución al 0,5% (reactivo no. 37) (método de filtración) ● Formaldehido, solución al 37%. Método Recogida de muestras de orina El número de huevos en la orina varía a lo largo del día, es más alto en la orina obtenida entre 10:00-14:00. Por consiguiente, la muestra debe ser recogida entre estos tiempos y debe consistir en una sola muestra de orina terminal (véase la sección 7.1.1) de al menos 10 ml. Alternativamente, puede hacerse una colección de 24 horas de la orina terminal (ver sección 7.1.1). Toda la muestra debe ser examinada, ya que puede contener sólo unos pocos huevos. Pida al paciente que recoja la orina en un recipiente limpio o frasco. Examine la muestra de inmediato. Si la orina no puede ser examinada por una hora o más, añadir 1 ml de formalina diluida (solución al 37% de formaldehido) por cada 100 ml de orina. Esto conservará los huevos que pudieran estar presentes. Nota: Si la formalina no está disponible, se puede añadir 2 ml de lejía de uso doméstico ordinario por cada 100 ml de orina. Advertencia: La formalina y la lejía son corrosivas y no deben ser ingeridas. Método de sedimentación 1. Agite la muestra de orina bien y verter en el frasco cónico. 2. Deje que la orina sedimente durante 1 hora. Eliminar el sobrenadante y transferir el sedimento a un tubo de centrífuga. Centrifugar a 2000 g durante 2 minutos. 3. Examine el sedimento bajo el microscopio para detectar la presencia de huevos. No aumente el tiempo de centrifugación y no exceda 2000g ya que esto puede alterar los huevos y la liberación de los miracidios. Importante: -Procesar la muestra tan pronto como sea posible;
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-Agitar el envase antes de verter la muestra de orina en el frasco cónico; -etiquetar los portaobjetos y tubos con cuidado. Método de filtración 1. Colocar un filtro en el soporte del filtro. 2. Agite la muestra de orina con cuidado y sacar 10 ml en la jeringa (Fig. 7.37). Conecte la jeringa al soporte del filtro. 3. Expulsar la orina desde la jeringa a través del filtro sobre un cubo o un fregadero (fig. 7.38). 4. Desconecte la jeringa del soporte del filtro. Introduzca aire en la jeringa (Fig. 7.39), vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y expulsar el aire a través del filtro (Fig. 7.40). 5. Desconecte la jeringa del soporte del filtro. Con unas pinzas, retire con cuidado el filtro de membrana o el papel de filtro y colocarlo en un portaobjetos. La membrana de nylon y papel de filtro se deben colocar boca arriba, mientras que la membrana de policarbonato debe colocarse boca abajo. 6. Añadir una gota de solución de Yodo de Lugol para mejorar la visibilidad de los huevos. 7. Examine el filtro entero bajo el microscopio en x10 o x40. Registrar los resultados como el número de huevos por 10 ml de orina.
Figura 7.37 Extraer orina en la jeringa. Figura 7.38 Expulsando la orina a través del filtro. Figura 7.39 Extraer aire en la jeringa.
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Figura 7.40 Expulsión de aire de la jeringa Figura 7.41 Schistosoma haematobium a: miracidio; b: células de llama La reutilización de los filtros Si ha utilizado un filtro de plástico, retire inmediatamente después de utilizar y sumergirlo toda la noche en una solución de hipoclorito al 1% (lejía doméstica). Después de remojar el filtro, lavarlo a fondo con una solución de detergente y luego enjuague varias veces con agua limpia. Revise el filtro bajo el microscopio para asegurarse que está libre de parásitos antes de volver a usarlo. El examen microscópico Los huevos de Schistosoma haematobium son grandes, alrededor de 120 a 150 µm de largo, y tienen un espolón terminal en un extremo (fig. 7.41 (a)). Un embrión (el miracidio) se puede ver en el interior del huevo. A veces es necesario determinar si los huevos son viables. Esto se puede hacer si la muestra es fresca y si no se han añadido conservantes. Mire cuidadosamente los huevos para ver si los embriones se están moviendo. Este es el mejor indicador de la viabilidad. Si no se observa movimiento, busque las "células de llama" (Fig. 7.41 (b)). Hay cuatro células de llama, uno en cada esquina del embrión. Utilice un objetivo x100 con ligera reducción de la iluminación para buscar el rápido movimiento de los cilios (pelos cortos) en las células de llama. Informe de los resultados Cuando se utiliza la técnica de filtración de jeringa, los resultados pueden ser reportados de acuerdo a las categorías para recuento de huevos: ● Infección liviana: 1- 49 huevos por 10 ml de orina. ● Infección pesada:> 50 huevos por 10 ml de orina. Una tercera categoría, tales como > 500 huevos por 10 ml de orina, o > 1.000 huevos por 10 ml de orina, puede ser apropiada en las zonas donde la intensidad de la infección con frecuencia alcanza este nivel (es decir, en más de 10% de los casos). 7.2.9 DETECCIÓN DE BACTERIAS EN LA ORINA En personas sanas, la orina no contiene prácticamente ningún microorganismo. Las bacterias se pueden encontrar en pacientes que tienen una infección de alguna parte del tracto urinario (por ejemplo, uretritis, cistitis o nefritis), o donde las bacterias de una infección en otra parte del cuerpo se excretan en la orina. La orina se centrifuga a alta velocidad y el sedimento resultante se examina bajo el microscopio (como se describe en la sección 7.2.7). Esta es la parte más importante del análisis. Sin embargo, el sedimento también puede ser usado para hacer frotis que se colorean con la tinción de Gram y con la tinción de Ziehl-Neelsen y se examinan bajo el microscopio. El cultivo es siempre esencial para la determinación precisa de la identidad de los microorganismos que se encuentran y la cantidad presente. Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Matraz Erlenmeyer estéril de 250 ml con tapón ● Centrífuga ● Tubos de centrífuga cónicos estériles con tapón ● Asa de siembra ● Mechero Bunsen o lámpara de alcohol ● Etanol al 70% ● Los reactivos necesarios para la tinción de Gram (véase la sección 5.3.1) y la tinción de ZiehlNeelsen (ver sección 5.3.3). Método Colección de muestras
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Los genitales se deben limpiar de antemano, utilizando agua y jabón. Se recoge una muestra de chorro medio (ver sección 7.1.1) en el matraz estéril. Examínese lo más rápido posible. (Otra forma es recoger la orina es en un tubo cónico enjuagado sólo con agua hirviendo y examinar de inmediato.) Preparación de los portaobjetos 1. Verter 10 ml de orina fresca en un tubo de centrífuga estéril. Sellar el tubo, ya sea con una tapa a rosca o con un tapón de algodón estéril que se fijará en su sitio con gasa y un hilo. 2. Centrifugar la muestra a 1500 g durante 10 minutos. Si se sospecha de la tuberculosis, se centrifuga una muestra adicional de 10 ml a 5000 g durante 20 minutos. 3. Retirar el sobrenadante de los dos tubos (fig. 7.42). Usando un asa de inoculación (esterilizada por flameado) (Fig. 7.43), mezclar el sedimento con agua destilada hasta obtener una suspensión homogénea.
Figura 7.42 Vertiendo el líquido sobrenadante. Figura 7.43 Mezcla del sedimento urinario. Figura 7.44 Preparación de un frotis del sedimento urinario.
4. Usando un asa de inoculación (esterilizada por flameado), preparar un frotis de cada una de las dos suspensiones (fig. 7.44). Deje que los portaobjetos se sequen al aire. 5. Fije los frotis anegándolos con etanol y flameándolos, o por calentamiento. 6. Teñir el primer portaobjetos con coloración de Gram (véase la sección 5.3.1) y el segundo con Ziehl-Neelsen (ver sección 5.3.3). El examen microscópico Examine los portaobjetos bajo el microscopio con el objetivo x100. Examinar el portaobjetos teñido con tinción de Gram para lo siguiente (véase la sección 5.3.1): ● Pus (muchos leucocitos teñidos de rojo o fucsia por la tinción de Gram) ● Bacilos Gram-negativos (Fig. 7.45 (a)) ● Cocos Gram-positivos (Fig. 7.45 (b)) ● Bacilos difteroides Gram-positivos (Fig. 7.45 (c)) ● Levaduras Gram-positivas (Fig. 7.45 (d)). Examine el portaobjetos teñido con Ziehl-Neelsen para buscar bacilos de Koch, o en este caso, BAAR. Los bacilos aparecen de color rojo oscuro y se disponen en filas (Fig. 7.46).
Figura 7.45 Examen bacteriológico de la orina a: bacilos Gram-negativos, b: cocos grampositivos, c: bacilos difteroides Gram-positivos, d: levaduras Gram-positivas. Figura 7.46 Bacilo de la tuberculosis (bacilo de Koch). Informe de los resultados
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Indique si se han observado pus o leucocitos presentes. Haga una descripción precisa de los microorganismos que se encuentran. Ejemplo Organismos que se encuentran: -Abundantes leucocitos -Escasos eritrocitos -Escasas células epiteliales -Abundantes cocos grampositivos en racimos. O bien, Organismos que se encuentran: -Escasos leucocitos -Muy pocos eritrocitos -Escasas células epiteliales -Escasos bacilos Gram-negativos. Gonococos Nunca diagnosticar una infección gonocócica sobre la base de un examen del sedimento urinario. Los gonococos se deben localizar en el pus uretral (ver sección 5.5). Tiras reactivas para orina Las bacterias en la orina también se pueden detectar usando tiras reactivas para orina (ver sección 7.2.2). Una tira de medición disponible en el mercado con reactivos para la detección de nitrito (que es producido por ciertas bacterias patógenas) y esterasa de leucocitos se ha demostrado que tienen una alta especificidad y una alta sensibilidad para la detección de bacterias en la orina. Cultivos de orina Los cultivos de orina se indican cuando muy altos niveles de bacterias se detectan por microscopía o el uso de tiras reactivas de orina. En tales casos, una muestra de orina debe ser enviada al laboratorio de bacteriología sin demora por un cultivo semi-cuantitativo de los microorganismos patógenos y para la determinación de su sensibilidad a los antimicrobianos. Este procedimiento es esencial para: — identificar la especie de las bacterias — determinar el número de bacterias presentes (si éstas provienen de la contaminación de la muestra posterior a su recolección, serán sumamente escasas) — aislar microorganismos que se encuentren en escasa cantidad — decidir cuál será el antibiótico más efectivo en el tratamiento de la infección (ensayos de susceptibilidad a los antimicrobianos).
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8. EXAMEN DEL LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR) El LCR se halla contenido en la cavidad que rodea al encéfalo en el cráneo y la médula espinal en la columna vertebral (fig. 8.1). Baña los tejidos del sistema nervioso central y ayuda a proteger el encéfalo y la médula espinal de lesiones. El volumen del LCR en los adultos es de 100-150 ml. El volumen es menor en los niños y varía en función de la longitud del cuerpo. 8.1 Las razones más comunes para la investigación de LCR Las razones más comunes para la investigación de LCR son las de excluir: - Meningitis - Hemorragia en el sistema nervioso central - Ciertos tipos de cáncer. La meningitis es una inflamación de las meninges, las membranas que recubren el cráneo y que cubre el cerebro y la columna vertebral. A menudo es causada por una infección (véase la Tabla 8.1). La leucemia, los tumores con manifestaciones en el cerebro y el envenenamiento por plomo también se han demostrado que producen meningitis. Nota: La investigación de laboratorio inmediata del LCR puede salvar la vida si se sospecha de meningitis. 8.2 Recogida de muestras de LCR Las muestras de LCR deben ser recogidos únicamente por un médico o una enfermera especialmente entrenada. 1. La aguja para punciones lumbares se introduce entre la cuarta y la quinta vértebras lumbares hasta una profundidad de 4 - 5 cm. Se retira el mandril y el líquido fluye por la aguja (Fig. 8.2). 2. Entre 6 y 7 ml de LCR se recogen en cada uno de dos tubos, numerados 1 y 2. El tubo 1 se utiliza para la inspección visual, microscópica y análisis químico. El tubo 2 se utiliza para cultivo bacteriano. 3. Otra opción de recolección: El LCR se recoge en dos tubos, que se numeran 1 y 2: — tubo 1: esterilizado; sirve para recoger algunas gotas — tubo 2: en este tubo se recogen 6 - 7 ml. El tubo 1 se desecha si contiene abundantes eritrocitos. El tubo 2 se usa para: — observar el aspecto del líquido — estudiar la concentración de leucocitos — calcular la cantidad de glucosa — efectuar ensayos del total de proteínas — llevar a cabo el ensayo de globulinas con el método de Pandy — examinar con el microscopio: (a) preparaciones húmedas, en busca de tripanosomas (b) preparaciones con tinción de Gram, en busca de otros microorganismos (c) preparaciones con tinción de Ziehl y Neelsen, en busca de bacilos resistentes a los ácidos. 8.3 El examen de muestras de LCR 8.3.1 Precauciones ● No se demore en la prueba del LCR. Las células y los tripanosomas se lisan rápidamente en las muestras de LCR. La glucosa también se destruye rápidamente, a no ser conservada con oxalato de flúor (reactivo n º 26, Ver sección 10.1). ● Trabajar con cuidado y económicamente. A menudo, sólo una pequeña cantidad de líquido cefalorraquídeo está disponible para su examen. El espécimen es difícil de reunir así que no pierda nada de eso. ● El LCR puede contener microorganismos virulentos. Usar pipetas taponadas con algodón no absorbente, o utilice una propipeta de goma en la pipeta para la aspiración del líquido. Nunca pipetear LCR por vía oral.
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Figura 8.1 Localización del LCR Figura 8.2 La toma de una muestra de LCR (punción lumbar, en este caso). Tabla 8.1 Las causas más comunes de la meningitis Tipo de infección Microorganismo específico Bacteriana Neisseria meningitidis Streptococcus spp., especialmente S. pneumoniae Staphylococcus spp. Haemophilus influenzae Escherichia coli Listeria monocytogenes Leptospira spp. Mycobacterium tuberculosis Treponema pallidum Pseudomonas spp. Por protozoos Plasmodium spp. Viral Virus Coxsackie arbovirus Echoviruses Poliovirus Virus de las paperas Arenavirus Herpesvirus humanos Virus de la hepatitis Fúngica Candida albicans Cryptococcus neoformans 8.3.2 Examen directo Aspecto del LCR Describe el aspecto de la muestra de LCR en el informe del laboratorio, y se debe indicar en éste. LCR Claro El LCR normal es transparente e incoloro (Fig. 8.3 (a)). LCR turbio Cuando el LCR es ligeramente turbio o blanco grisáceo denota la presencia de pus (Fig. 8.3 (b)). LCR sanguinolento El LCR puede ser turbio y de color rosáceo o rojizo (Fig. 8.3 (c)): — porque se hayan lesionado vasos sanguíneos al efectuar la punción (en este caso habrá más sangre en el tubo 1 que en el tubo 2) — porque exista una hemorragia subaracnoidea (si es así, ambos tubos tendrán el mismo color). Si solo se cuenta con un tubo con LCR, espere a que se asienten los eritrocitos (o centrifúguese) y examine el líquido flotante. 1. Si el líquido flotante es claro (Fig. 8.4), la presencia de sangre obedecerá a la lesión accidental de un vaso sanguíneo. 2. Si este líquido es sanguinolento (Fig. 8.5), la sangre provendrá de una hemorragia subaracnoidea. Xantocromía Coloración amarilla del LCR (Fig. 8.6). La pueden causar: — una hemorragia antigua — ictericia grave — una compresión vertebral.
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Figura 8.3 Examen del aspecto del LCR: LCR claro (normal); b: LCR turbio, c: LCR sanguinolento. Figura 8.4 LCR de un paciente con una lesión de los vasos sanguíneos. Figura 8.5 LCR de un paciente con una hemorragia subaracnoidea. Figura 8.6 LCR de un paciente con xantocromía. Formación de coágulos Indique en el informe si existen coágulos. Examine los tubos que contienen LCR 10 minutos después de haber obtenido las muestras para determinar si se han formado coágulos: 1. LCR normal: no contiene coágulos. 2. Se producen coágulos en algunas enfermedades: — meningitis tuberculosa: un solo coágulo, o bien numerosos coágulos pequeños y delgados cuya presencia fácilmente puede quedar inadvertida — meningitis purulenta: un solo coágulo voluminoso — compresión vertebral: el LCR se coagula completamente. 8.3.3 El examen microscópico El examen microscópico del LCR incluye: o Examen de una preparación húmeda para las células sanguíneas; o Examen de una preparación húmeda para tripanosomas en las zonas donde se produce la tripanosomiasis africana; o Examen de un frotis con tinción de Gram para los organismos que causan la meningitis, como la Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenza (véase la Tabla 8.1); o Examen de un frotis teñido con Ziehl-Neelsen si se sospecha de meningitis tuberculosa; o Examen de hongos como Cryptococcus neoformans y Candida albicans, si sospecha. Los exámenes anteriores se realizan utilizando el sedimento de un LCR centrifugado. Células de la sangre en el LCR El LCR puede contener células sanguíneas en cantidades variables en ciertas enfermedades. El LCR se examina: -Para detectar eritrocitos; -Para determinar el número total de leucocitos (concentración del número de leucocitos); -Para determinar los tipos de leucocitos presentes (recuento diferencial de leucocitos).
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Importante: La investigación de los eritrocitos debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible después de la recogida de la muestra, ya que se lisan rápidamente. Determinación de la concentración del número de leucocitos Materiales y reactivos (Fig. 8.7) ● Microscopio ● Cámara de recuento de Fuchs-Rosenthal (si no está disponible, se puede usar en su lugar una cámara de recuento Neubauer mejorada) ● Pipeta Pasteur con perilla de goma ● Cubreobjetos (suministrado con la cámara de recuento) ● Frasco, 2-5 ml ● Solución de Türk (reactivo no. 61).
Figura 8.7 Materiales para la determinación de la concentración del número de leucocitos. Figura 8.8 Cubriendo la cámara de recuento con un cubreobjetos. Figura 8.9 Llenado de la cámara de recuento con LCR. Figura 8.10 Uso de la cámara de recuento Fuchs-Rosenthal. Método 1. Tape la cámara para recuento con la laminilla de vidrio que la acompaña (cubrecámara) (Fig. 8.8). 2. Mezcle el LCR con suavidad (Fig. 8.9). Llene la cámara con el líquido: — sin diluir, si el LCR es claro — diluido, si el LCR es turbio. Prepare una dilución de 1 x 20 empleando 0,05 ml de LCR y 0,95 ml de solución de Türk. Aspire con la pipeta, traslade a un frasco pequeño y mézclese. 3. Deje reposar la cámara para recuento en la mesa de trabajo durante 5 minutos, a fin de que las células se asienten. A continuación coloque la cámara en la platina del microscopio.
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4. Cuente las células que haya en 1 mm3 de LCR, utilizando el objetivo x 10. Al notificar los resultados en unidades SI informe como "número x 106/l” el valor no cambia. Ejemplo: 150 células por mm3 se notifican como “150 x 106/l”. Importante: Si se emplea LCR sin diluir, examine las células con el objetivo x 40 para cerciorarse de que se trata efectivamente de leucocitos. Si hay eritrocitos haga el recuento utilizando el objetivo x 40. Uso de la cámara de recuento Fuchs-Rosenthal La cámara cuadriculada de Fuchs y Rosenthal para recuento tiene un área de 9 mm2 (cámara modificada), o de 16 mm2. Su profundidad es de 0,2 mm. Cuente las células en 5 mm2 empleando los cuadros 1, 4, 7, 13 y 16 (Fig. 8.10). Si se usa LCR sin diluir no se necesita hacer cálculo alguno; el número de células que se haya contado dará el número correspondiente por milímetro cúbico de LCR. Si se emplea LCR diluido, el número de células contadas multiplicado por 20 dará el número de células por mm3 de LCR. Es decir, dicho de otro modo, si se utiliza una dilución de 1 en 20 de LCR, el número de células contadas se multiplica por 20 para obtener el número de células por mm3 de LCR. Uso de la cámara de recuento Neubauer mejorada Al emplear la cámara de Neubauer mejorada cuente las células que haya en toda el área cuadriculada, que es de 9 mm2. Si se usa LCR sin diluir multiplique las células contadas por 10 y divida entre 9 para obtener el número de células por mm3 de LCR. Si se emplea LCR diluido multiplique las células contadas por 20 y divida entre 9 para obtener el número de células por mm3 de LCR (si se utiliza una dilución de 1 en 20 de LCR). Resultados El LCR normal contiene menos de 5 x 106 leucocitos por litro (menos de 5 por mm3). Un aumento del número de leucocitos se puede encontrar en: ● La meningitis bacteriana (meningocócica, Haemophilus influenzae, neumocócica): principalmente neutrófilos. ● Meningitis tuberculosa y la meningitis viral: en su mayoría linfocitos ● Tripanosomiasis africana: principalmente linfocitos, pero las células de Mott se pueden ver, así como también tripanosomas. Determinación de la fracción del número de tipo de leucocitos (Recuento diferencial de leucocitos) Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Centrífuga ● Tubos de centrífuga ● Pipetas ● Tinción de Romanowsky (ver sección 9.10.1) ● Metanol. Método Si el LCR no contiene muchas células (menos de 200 x 106/l): 1. Se centrifuga el LCR en 3000 g durante 10 minutos. Retirar el líquido sobrenadante a otro tubo (para ser utilizado para otras pruebas). 2. Mezcle el sedimento tocando el extremo del tubo. Extienda la mezcla sobre un portaobjetos limpio y dejar secar. 3. Fijar con metanol y colorear con la tinción de Romanowsky como se describe en la sección 9.10.3. Se examinan las células bajo el microscopio utilizando el objetivo x40. Si hay numerosas células en el LCR: 1. Pipetear una gota de LCR sin centrifugar, mezcle el LCR sobre un portaobjetos. 2. Hacer un frotis delgado y dejar secar. 3. Fijar con metanol y colorear con la tinción de Romanowsky como se describe en la sección 9.10.3. Preparación húmeda para examen directo en busca de tripanosomas Deposite una gota de sedimento de de LCR en un portaobjetos y ponga un cubreobjetos sobre ella. Examine con el objetivo x 40. Resultados El descubrimiento de tripanosomas móviles en el LCR indica que la enfermedad ha llegado a su etapa tardía en que el sistema nervioso se encuentra infectado (véase la sección 4.7.3). Por medio de la prueba de Pandy se determina si existe un aumento en las proteínas del LCR. La concentración de proteína del LCR se eleva y la prueba de Pandy es positiva (véase la sección 8.3.5). Asimismo el líquido contiene una cantidad mayor de leucocitos. En una preparación teñida con la coloración de Romanowsky se puede determinar si los leucocitos observados son linfocitos (L) y con frecuencia también se identifican las células de Mott (M). Estas células son voluminosas, con vacuolas y una cantidad abundante de inmunoglobulina M (Ig M) que toma un color oscuro con la eosina de la tinción de Romanowski (ver sección 9.10.4).
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Figura 8.11 Tripanosomas en una preparación húmeda teñidas con tinción de Romanowsky L: linfocitos, M: células de Mott, T: tripanosomas
Tinción de Gram para reconocer casos de meningitis Prepárese un frotis con el sedimento del LCR y déjese secar al aire. Tíñase con el método de Gram, como se indica en la sección 5.3.1. Resultados La presencia de cualesquiera microorganismos que se observen en el frotis con la tinción de Gram se deberá notificar, indicando: — su reacción al método de Gram: positiva o negativa — su morfología: cocos, diplococos, bacilos, etc. — la cantidad observada. No es posible identificar con claridad las especies empleando solamente el frotis teñido. Se necesita cultivar los microorganismos. Entre los microorganismos que causan meningitis figuran: Neisseria meningitidis (meningococos) (Fig. 8.12) — gramnegativos — diplococos que se sitúan uno al lado de otro — intracelulares; se hallan en el interior de los neutrófilos. Nota: Ocasionalmente se observan afuera de los leucocitos en cantidad reducida. Streptococcus pneumoniae (neumococos) (fig. 8.13) - grampositivos - diplococos que se juntan por los extremos - se rodean de una cápsula que no es visible con la tinción de Gram - generalmente son numerosos — no son intracelulares. Haemophilus influenzae (especialmente en niños pequeños) (Fig. 8.14) — gramnegativos — bacilos pequeños (cocobacilos) — no son intracelulares — suelen ser numerosos. En todas estas formas de meningitis los leucocitos que se observan son neutrófilos. Bacilos grampositivos Se observan raras veces. Pueden pertenecer al grupo de Listeria. Su cultivo es esencial.
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Preparación de Ziehl y Neelsen para reconocer la meningitis tuberculosa Método Si se sospecha que existe una meningitis tuberculosa, la muestra de LCR se debe dejar en reposo. Generalmente se forma un coágulo frágil. Este coágulo se debe extraer, extenderlo en un portaobjetos y tratarlo con el método de Ziehl y Neelsen, como se indica en la sección 5.3.3. Resultados Si se observan microorganismos (Fig. 8.15), informe que en el frotis se han encontrado "bacilos resistentes a los ácidos” (“BAAR”). HONGOS EN EL LCR En los frotis teñidos con el método de Gram se pueden observar hongos (muy raras veces) (Cryptococcus neoformans y Candida albicans). Cryptococcus neoformans puede ser encontrado en un LCR turbio, con linfocitos Método En un portaobjetos agregue y mezcle: — una gota de sedimento de LCR centrifugado — una gota de tinta china. Examine esta mezcla entre un portaobjetos y un cubreobjetos. Los hongos se reconocerán de la manera siguiente: Cryptococcus neoformans aparece de la siguiente manera (Fig. 8.16): — esporas redondeadas con gemas que contienen granulaciones grisáceas — cada grupo de 1 - 3 esporas se rodean de una cápsula incolora Candida albicans se pueden encontrar en una preparación húmeda no teñida del sedimento de LCR. Aparece como sigue (fig. 8.17): Candida (LCR claro, con escasos leucocitos) - Esporas ovales, con gemas - Filamentos micelares cortos
Figura 8.15 BAAR (Bacilos Ácido Alcohol Resistentes).
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8.3.4 Determinación de la concentración de glucosa en el LCR Las concentraciones de glucosa en el LCR son normalmente de aproximadamente el 60% de los de la sangre, es decir, 2.5 a 4.2 mmol / l (45-75 mg/100 ml). En la meningitis (especialmente la meningitis purulenta o bacteriana, y en cierto grado en la meningitis tuberculosa) se reduce considerablemente la cantidad de glucosa en el LCR. Importante: Ya que la glucosa del LCR se descompone rápidamente una vez que se ha recogido el líquido, es importante que esta determinación se efectúe tan pronto como sea posible. Método Para la determinación de las concentraciones de glucosa en el LCR, todos los métodos que se utilizan para la determinación de las concentraciones de glucosa en la sangre se pueden aplicar. Cuando se utiliza el método de la ortotoluidina (véase la sección 10.1), se necesita cuatro veces más LCR que en el ensayo en sangre. Nota: Desde hace varios años y hasta la actualidad, se utiliza el método enzimático para glucosa, el método colorimétrico de la glucosa oxidasa, el cual está extendido ampliamente y ya resulta de fácil acceso. (Léase página anexa sobre la técnica de la glucosa oxidasa.) Importante: A medida que la glucosa en el LCR se destruye rápidamente una vez que se recoge el líquido, es importante para llevar a cabo la estimación de la concentración de glucosa tan pronto como sea posible. Si existe la posibilidad de una tardanza, el LCR se deberá preservar con oxalato de flúor (véase el reactivo No. 26). 8.3.5 Determinación de la concentración de proteínas en el LCR Principio La concentración total de proteínas en el LCR se mide mediante la dilución de la LCR en Ácido Sulfosalicílico (ASS) y la comparación de la turbidez producida con la de un conjunto de tubos que contienen estándares de proteína. Un nivel de globulina elevada en el LCR se muestra mediante la adición del LCR a una solución de fenol en la prueba de Pandy (ver más abajo). Materiales y reactivos (fig. 8.18) ● LCR: centrifugar el LCR a 2000 g durante 5 minutos y usar el líquido sobrenadante ● Pipetas graduadas ● Pipetas goteras (goteros) ● Tubos de ensayo ● Gradilla ● Cartón Negro ● Ácido sulfosalicílico, solución al 3% (sin reactivo. 57) ● Reactivo de Pandy (reactivo no. 41) ● Estándares de proteínas (véase la sección 7.2.5). Método para la determinación de proteínas totales Con una pipeta coloque 3 ml de la solución al 3% de ácido sulfosalicílico en un tubo de ensayo igual que los de las proteínas estandarizadas. 2. Añada 1 ml del LCR sobrenadante claro, y mézclelo. Déjelo reposar 5 minutos. 3. Compare la turbidez resultante con la del juego de proteínas estandarizadas (Fig. 8.19). Anote las proteínas del LCR en términos de g/l. Resultados La concentración normal de proteínas en el LCR es de 100-450 mg/l (0,1 - 0,45 g/l). La concentración de proteína se incrementa en: — en la meningitis, las hemorragias subaracnoideas y las compresiones vertebrales; — en la tripanosomiasis africana.
276
Figura 8.18 Materiales y reactivos para la determinación de la concentración de proteínas del LCR. Figura 8.19 Comparación de una muestra de prueba con de los estándares de proteínas.
Nota: Las concentraciones de proteínas en el LCR son muy bajas en comparación con otros líquidos orgánicos, por lo que no pueden utilizarse técnicas convencionales, como el método de Biuret, que es adecuada para la medición de proteínas séricas, pero de baja sensibilidad para el LCR. Las proteínas, a diferencia de los elementos formes, son bastante estables en el LCR, por lo que puede enviarse a un laboratorio externo para su determinación sin necesidad de emplear métodos de conservación especiales. Para la determinación cuantitativa de proteínas del LCR no pueden utilizarse las técnicas convencionales empleadas para las muestras de sangre. Los laboratorios clínicos utilizan técnicas modificadas de la reacción de Biuret, u otras como el método turbidimétrico de Meulemans. Como métodos cuantitativos resaltan el método descrito (ASS), el método de Meulemans (turbidimétrico cuantitativo con ASS más el agregado de Sulfato de Sodio que ayuda a precipitar y estabilizar a las globulinas (producir turbidez), el ASS lo hace más con la albúmina.) Los métodos recomendados que están ganando terreno en la determinación cuantitativa de proteínas totales en el LCR por su sensibilidad y gran reproducibilidad son los métodos de unión al colorante como el método de Bradford que usa Azul Brillante de Coomasie G-250 descrito por algunos como caro; y el método del Rojo de Pirogalol más barato y de fácil acceso actual. La gran sensibilidad de estos métodos los torna adecuados como para la medición de las cantidades de proteínas totales del LCR y de orina que se encuentran en mucha menos cantidad que en el suero. Por esto, el método de Biuret, muy exacto, y reproducible en suero, pero con una sensibilidad pobre para medir las cantidades en LCR u orina no puede ser usado en estos materiales biológicos, salvo que se haga algún tipo de concentración para llegar a la magnitud que puede detectar y cuantificar en estos líquidos, por ej., hacer una diálisis para concentrar las proteínas lo que resulta muy engorroso y poco práctico para medirlo de manera rutinaria. (Léase anexo de la técnica del Rojo de Pirogalol para LCR). Prueba de Pandy para las globulinas En un tubo de ensayo pequeño mida: — 1 ml de reactivo de Pandy. 2. Coloque el tubo frente a una pieza de cartón negro. 3. Con la pipeta gotera agregue lentamente: — 3 gotas de LCR (Fig. 8.20). Examine la solución después de agregar cada gota. 4. Analice los resultados inmediatamente. Resultados Resultado positivo Se forma una zona blanca a medida que las gotas de LCR se mezclan con el reactivo (Fig. 8.21 (a)). Resultado negativo No se forma la zona blanca al mezclarse las gotas de LCR con el reactivo, o bien solo se produce una ligera turbidez que se disuelve en seguida (Fig. 8.21 (b)). Notifique los resultados como: "prueba de Pandy positiva", o "prueba de Pandy negativa".
277
Figura 8.20 Adición de LCR al reactivo de Pandy. Figura 8.21 Prueba de Pandy para las globulinas a: Resultado positivo; b: resultado negativo. 8.3.6 Resumen La tabla 8.2 resume los hallazgos típicos en el examen del LCR. 8.4 ENVÍO DE LAS MUESTRAS DE LCR PARA CULTIVO Antes de ser enviadas mantener el LCR en la incubadora a 37 °C. No las ponga en el refrigerador. 8.4.1 Materiales y reactivos ● Frascos planos que contienen un medio de transporte adecuado, como el medio de transporte de Stuart, modificado (reactivo. N º 56). 8.4.2 Método del medio de transporte Stuart (para el aislamiento de Neisseria meningitidis) Este es el mejor método. El medio se suministra en frascos de 30 ml que contienen 8 ml de medio sólido (a lo largo de un lado de la botella plana). Las botellas se llenan con una mezcla de aire (90%) y dióxido de carbono (10%). Siga las instrucciones dadas para gonococos en la sección 5.5.4. Si es posible, siembre en el medio el sedimento del LCR centrifugado (Fig. 8.22); de lo contrario, utilice el LCR sin tratar. Período de conservación: hasta 4 días a temperatura ambiente.
Figura 8.22 Envío de muestras de LCR para cultivo usando medio de transporte Stuart.
Enfermedad o condición Meningitis purulenta (bacteriana) Meningitis tuberculosa
Meningitis viral
Paludismo Tripanosomiasis africana
Tabla 8.2 Hallazgos típicos en el examen del LCR Concentración Concentración Concentración Aspecto de células de de proteínas de glucosa la sangre > 3000 células / Turbio, µl, Muy elevada, Muy reducida amarillenta principalmente 1-10 g/l granulocitos 30 – 300 células Claro o casi / µl, Elevada Muy reducida claro principalmente linfocitos 10 – 300 células Normal o / µl, Claro ligeramente Normal principalmente elevada linfocitos Elevada, Ligeramente principalmente Elevada Reducida turbio granulocitos Claro o 5 células / µl, ligeramente Elevada Reducida principalmente turbio linfocitos
Hemorragia subaracnoidea
Rojo
No es interpretable
No es interpretable
No es interpretable
Compresión de
Claro, de color
Normal o
Muy elevada
Normal
Otros hallazgos Bacterias Bacterias, proteínas coaguladas ------
-----Tripanosomas, células de Mott Después de la centrifugación, rojo ------
278
la columna vertebral
amarillento
ligeramente elevada
Fuente de las técnicas: www.wiener-lab.com.ar
Glicemia
C
enzimática AA
Para la determinación de glucosa en suero, plasma, orina o líquido cefalorraquídeo
SIGNIFICACION CLINICA La patología más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono es la diabetes mellitus. El diagnóstico precoz y el control de los pacientes diabéticos, tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones resultantes de la hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado. Dado que existen múltiples factores causales de hiper o hipoglicemia, debe considerarse en cada caso la condición fisiológica y/o la patología presente en el paciente. FUNDAMENTOS DEL METODO El esquema de reacción es el siguiente: glucosa + O2 + H2O
GOD
2 H2O2 + 4-AF + 4-hidroxibenzoato
> ácido glucónico + H2O2 POD
> quinonimina roja
REACTIVOS PROVISTOS S. Standard: solución de glucosa 100 mg/dl (1 g/l). A. Reactivo A: viales conteniendo glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa (POD) y 4-aminofenazona (4-AF). B. Reactivo B: buffer fosfatos pH 7,0 conteniendo 4-hidroxibenzoato. Concentraciones finales GOD (microbiana) .................................................. ≥ 10 kU/l POD (rábano) .......................................................... ≥ 1 kU/l 4-AF ................................................................... 0,5 mmol/l Fosfatos ................................................ 100 mmol/l, pH 7,0 4-Hidroxibenzoato ................................................. 12 mmol/l REACTIVOS NO PROVISTOS Calibrador A plus de Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Standard: listo para usar. Reactivo de Trabajo: reconstituir el contenido de un vial de Reactivo A con una parte de Reactivo B. Transferir al frasco de Reactivo B, enjuagando varias veces el vial con el mismo. Mezclar hasta disolución completa. Homogeneizar y fechar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química clínica. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No mantener a temperaturas elevadas durante lapsos prolongados. Reactivo de Trabajo: en refrigerador (2-10oC) es estable 60 días a partir de la fecha de su preparación. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Durante el uso, el Reactivo de Trabajo puede desarrollar un ligero color rosado que no afecta su funcionamiento siempre que se procese un Blanco con cada lote de determinaciones y un Standard por lo menos una vez por semana. Desechar cuando las lecturas del Blanco sean superiores a 0,160 D.O. MUESTRA Suero, plasma, orina o líquido cefalorraquídeo (LCR) a) Recolección: - Suero o plasma: se debe obtener suero de la manera usual o plasma recolectado con anticoagulantes comunes. - Orina: si se trata de una muestra aislada, utilizar preferentemente orina fresca. En caso de no poder realizar el ensayo de forma inmediata, conservar la muestra en refrigerador (2-10oC). Puede realizarse el ensayo en orina de 24 horas. En este caso, recolectar la muestra en un recipiente oscuro conteniendo 5 ml de ácido acético glacial y conservarlo en hielo. - LCR: en caso de utilizar LCR, el ensayo debe realizarse en forma inmediata a la obtención de la muestra. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda el uso de heparina o Anticoagulante G (EDTA/fluoruro) para su obtención. c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por: bilirrubina hasta 10 mg/dl, triglicéridos hasta 500 mg/dl, ni hemoglobina hasta 350 mg/dl. El ácido ascórbico interfiere en la determinación en orina en cualquier concentración. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la destrucción enzimática de la glucosa sanguínea (glucólisis) por hematíes y leucocitos es proporcional a la temperatura a la que se conserva la sangre, siendo máxima a 37oC. Este proceso no se inhibe aún en estado de congelación, por lo que la sangre debe centrifugarse dentro de las 2 horas de la extracción. El sobrenadante límpido se transfiere a otro tubo para su conservación. De esta forma la gluco870570000 / 01
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sa es estable 4 horas a temperatura ambiente o 24 horas refrigerada. En caso de no poder procesarse la muestra de la forma indicada, deberá adicionarse un conservador en el momento de la extracción. El LCR puede contaminarse con bacterias y otras células por lo que la determinación debe realizarse de inmediato. En caso de no poder procesarse de esta manera, centrifugar el LCR y conservarlo 3 días a 2-10oC o 5 horas a 2025oC.
VALORES DE REFERENCIA Se analizaron con Glicemia enzimática AA, 120 muestras de individuos en ayunas, de ambos sexos, con edades comprendidas entre 20 y 45 años, provenientes de la ciudad de Rosario (Argentina), sin síntomas de diabetes o cualquier otra enfermedad aparente. Se encontró que el 95% de los resultados cubrieron el siguiente rango: Suero o plasma: 70 a 110 mg/dl En la literatura (Tietz, N.W.) se menciona el siguiente rango de referencia:
MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotómetro o fotocolorímetro. - Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados. - Tubos o cubetas espectrofotométricas de caras paralelas. - Baño de agua a 37oC. - Reloj o timer.
Suero o plasma Adultos: 74 - 106 mg/dl (4,11 - 5,89 mmol/l) Niños: 60 - 100 mg/dl (3,33 - 5,55 mmol/l) Neonatos: 1 día: 40 - 60 mg/dl (2,22 - 3,33 mmol/l) mayor a 1 día: 50 - 80 mg/dl (2,78 - 4,44 mmol/l)
CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 505 nm en espectrofotómetro o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). - Temperatura de reacción: 37oC - Tiempo de reacción: 5 minutos - Volumen de muestra: 10 ul - Volumen de Reactivo de Trabajo: 1 ml - Volumen final de reacción: 1,01 ml Los volúmenes de Muestra y de Reactivo pueden variarse proporcionalmente (Ej.: 20 ul Muestra + 2 ml Rvo. de Trabajo).
Orina de 24 horas < 0,5 g/24 hs (< 2,78 mmol/24 hs)
PROCEDIMIENTO En tres tubos marcados B (Blanco) S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B
S
D
Standard
-
10 ul
-
Muestra
-
-
10 ul
1 ml
1 ml
1 ml
Reactivo de Trabajo
Incubar 5 minutos en baño de agua a 37oC o 25 minutos a 15-25oC. Luego leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el aparato a cero con el blanco. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de reacción final es estable 30 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de este lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS 100 mg/dl glucosa (mg/dl) = D x f f= S METODO DE CONTROL DE CALIDAD Procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con concentraciones conocidas de glucosa, con cada determinación. (*)
Marca registrada de Ciba Corning Diagnostics
Orina aislada fresca 1 - 15 mg/dl (0,06 - 0,83 mmol/l)
LCR Niños: 60 - 80 mg/dl (3,33 - 4,44 mmol/l) Adultos: 40 - 70 mg/dl (2,22 - 3,89 mmol/l) Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia, teniendo en cuenta sexo, edad hábitos alimenticios y otros factores. CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI Glucosa (mg/dl) x 0,0555 = Glucosa (mmol/l) Glucosa (g/24 horas) x 55,5 = Glucosa (mmol/24 hs) LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. PERFORMANCE Los ensayos fueron realizados en analizador automático Express Plus(*). a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en 5 días diferentes se obtuvo: Precisión intraensayo (n = 20) Nivel 90,7 mg/dl 278 mg/dl
D.S. ± 1,26 mg/dl ± 3,08 mg/dl
C.V. 1,39 % 1,11 %
Precisión interensayo (n = 20) Nivel 90,1 mg/dl 299 mg/dl
D.S. ± 1,73 mg/dl ± 4,86 mg/dl
C.V. 1,92 % 1,62 %
b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de glucosa a distintos sueros, se obtuvo una recuperación entre 99 y 101%. c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 500 mg/dl. Para valores superiores, diluir la muestra con solución salina y repetir el ensayo, multiplicando el resultado final por el factor de dilución. d) Correlación: se determinó el valor de glucosa en 154 muestras de suero en un rango comprendido entre 23 y 870570000 / 01
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503 mg/dl, con Glicemia enzimática AA de Wiener lab. y un kit comercial basado en el mismo principio, obteniéndose el siguiente coeficiente de correlación: r = 0,9997; pendiente b = 1,0257; intersección a = 1,9485 e) Sensibilidad: el mínimo límite de detección es 0,54 mg/dl y la sensibilidad analítica es de 4,2 mg/dl.
SIMBOLOS Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Para las instrucciones de programación debe consultarse el Manual del Usuario del Analizador en uso. Para la calibración, se puede utilizar un calibrador con base de suero (Calibrador A plus de Wiener lab.).
P Representante autorizado en la Comunidad Europea V
Uso diagnóstico "in vitro"
X
Contenido suficiente para
ensayos
PRESENTACION - 1 x 250 ml (Cód. 1400106). - 4 x 250 ml (Cód. 1400107).
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
BIBLIOGRAFIA - Henry, R.J. et.al. - Clinical Chemistry, Principles and Techniques, 2nd. ed., Harper and Row Pub. Inc. N.Y. p. 1288 (1974). - Lott, J.A. and Turner, K. - Clin. Chem. 21:1754-1760 (1975). - Trinder, P. - Ann. Clin. Biochem. 6/24 (1969). - Ziegenhorn, J. - J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15/1:13 (1977). - Caraway - Stand. Meth. Clin. Chem. 4:240 (1963). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001. - Burtis - Ashwood. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B. Saunders Co., fifth edition, United States of America, 2001.
?
No congelar
F
Riesgo biológico Volumen después de la reconstitución
Cont.
Contenido
g
Número de lote
M
Elaborado por:
Xn
Nocivo Corrosivo / Caústico
Xi
i Calibr.
b b c h
Irritante Consultar instrucciones de uso Calibrador Control Control Positivo Control Negativo Número de catálogo
MWiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº: 1978/97
Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina 870570000 / 01
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Proti
C
Método colorimétrico cuantitativo para la determinación de proteínas en orina y líquido cefalorraquídeo
SIGNIFICACION CLINICA Proteínas en orina Una cantidad de proteínas plasmáticas de pequeño peso molecular son filtradas normalmente en forma libre a través del glomérulo renal y luego son, en parte, reabsorbidas por los túbulos renales. Hay condiciones fisiológicas o benignas donde se puede observar un aumento en la excreción urinaria de proteínas como en el ejercicio violento, fiebre, hipotermia, embarazo. La medición de las proteínas urinarias es importante en la detección de patología renal. La proteinuria en la enfermedad renal puede resultar de una disfunción glomerular o tubular. En el primer caso se da por un aumento en el pasaje a través de los capilares del glomérulo y caracterizada por la pérdida de proteínas plasmáticas de igual o mayor tamaño. En el segundo caso se da por una disminución en la capacidad de reabsorción de proteínas por los túbulos. Entre las patologías en las que se produce un aumento en la excreción de proteínas urinarias se encuentran: síndrome nefrítico, síndrome nefrótico, hipergammaglobulinemia monoclonal, nefropatía diabética, infecciones del tracto urinario. Proteínas en líquido cefalorraquídeo (LCR) La determinación de proteínas en LCR es útil para evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en muchas enfermedades inflamatorias o infecciosas del SNC, como ocurre en las meningitis bacterianas, virales o de otros orígenes, encefalitis, poliomielitis, neurosífilis, esclerosis múltiple, hemorragia cerebral, tumores cerebrales o espinales. Otros desórdenes ocasionan una producción anormal de proteínas dentro del SNC como las enfermedades desmielinizantes. La sensibilidad del presente método lo hace apropiado para ser usado en líquidos biológicos tales como orina y líquido cefalorraquídeo donde la concentración de proteínas con respecto a la del plasma es demasiado baja como para determinarla por métodos empleados habitualmente para suero. FUNDAMENTOS DEL METODO Las proteínas presentes en la muestra reaccionan en medio ácido con el complejo Rojo de Pirogalol-Molibdato originando un nuevo complejo coloreado que se cuantifica espectrofotométricamente a 600 nm. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: solución estabilizada de Rojo de Pirogalol 0,1 mmol/l, molibdato de sodio 0,1 mmol/l en buffer succinato 50 mmol/l. S. Standard: solución de albúmina 100 mg/dl (1,0 g/l).
REACTIVOS NO PROVISTOS - Agua destilada. - Solución fisiológica. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivos Provistos: listos para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. El Reactivo A debe protegerse de la luz. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada, lecturas de absorbancia a 600 nm del Reactivo A superiores a 0,250 D.O. o inferiores a 0,030 D.O. son indicio de deterioro del mismo. MUESTRA Orina o líquido cefalorraquídeo a) Recolección: obtener orina ocasional o de 24 horas. Medir la diuresis. En caso de que las muestras sean turbias, es conveniente centrifugarlas. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: - la hemólisis puede ser causa de resultados falsamente aumentados tanto en orina como en LCR; - los conservantes para orina tales como ácido clorhídrico, ácido benzoico o timol pueden ser causas de resultados falsamente disminuidos; - algunas drogas o medicamentos pueden interferir en la reacción. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la orina puede conservarse refrigerada (2-10oC) hasta 8 días o congelada (-20oC) hasta 3 meses. El LCR puede conservarse 3 días refrigerado (2-10oC) o 3 meses congelado (-20oC).
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MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotómetro o fotocolorímetro para lecturas a 600 nm (580-620 nm). - Baño de agua a 37oC. - Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados.
PROCEDIMIENTO Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar el ensayo. En tres tubos o cubetas espectrofotométricas marcados B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar:
Standard Muestra Reactivo A
B
S
D
-
20 ul
-
-
-
20 ul
1 ml
1 ml
1 ml
Mezclar e incubar los tubos durante 10 minutos a 37oC. Leer en fotocolorímetro entre 580-620 nm o en espectrofotómetro a 600 nm, llevando a cero el aparato con el Blanco.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reacción es estable durante 30 minutos por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS 1) Proteínas en orina de 24 horas D mg de proteínas /24 horas = x V x 1000 S siendo: V = volumen de la diuresis expresado en litros /24 horas 1000 = mg/l del Standard
CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI Proteínas (mg/dl) x 10 = Proteínas (mg/l) LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Proteger el Reactivo A de la luz. El material empleado debe estar libre de tensioactivos, caso contrario se obtendrán valores discordantes. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvo: Nivel 14 mg/dl 100 mg/dl
D.S. ± 0,66 mg/dl ± 2,30 mg/dl
C.V. 4,7 % 2,3 %
b) Sensibilidad: en espectrofotómetro a 600 nm, un Standard de 100 mg/dl proporciona una lectura de aproximadamente 0,200 D.O., lo que significa que para 0,001 D.O. el mínimo cambio de actividad detectable será de 0,5 mg/dl. c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 150 mg/dl de proteínas. Para valores superiores, diluir la muestra 1:2 ó 1:4 con solución fisiológica y repetir la determinación. Corregir los cálculos multiplicando por el factor de dilución empleado. Si se desea aumentar la sensibilidad analítica en muestras normales o levemente aumentadas, pueden emplearse 50 ul de muestra. En este caso, es preferible diluir el Standard 1:2 (1+1) con agua destilada, y usar este standard de 50 mg/dl en la prueba, de tal manera de ajustar la calibración a los valores normales bajos. PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso. PRESENTACION - 1 x 100 ml (Cód. 1690007). - 4 x 20 ml (Cód. 1009317). - 4 x 20 ml (Cód. 1009282). - 2 x 60 ml (Cód. 1009631).
2) Proteínas en orina ocasional D mg/dl proteínas = x 100 S 3) Proteínas en líquido cefalorraquídeo D mg/dl proteínas = x 100 S METODO DE CONTROL DE CALIDAD Procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Proti U/LCR Control 2 niveles) con concentraciones conocidas de proteínas, con cada determinación. VALORES DE REFERENCIA Orina de 24 horas: 30-140 mg/24 horas (hasta 160 mg/24 horas en embarazadas) Orina ocasional: 25 mg/dl LCR: 15-45 mg/dl en personas sanas. En personas de más de 60 años, este rango se extiende hasta 60 mg/dl. Estos valores son orientativos. Es conveniente que cada laboratorio establezca sus propios rangos, dado que pueden variar de acuerdo a la población de pacientes y a las condiciones del laboratorio.
BIBLIOGRAFIA - Watanabe, N.; et al. - Clin. Chem. 32:1551, 1986. - Fujita, Y.; Mori, I.; Kitano, S. - Benseki Kagaku 32:379, 1983. - Watson, M.; Scott, M. - Clin Chem. 41/3:343, 1995. - Killingsworth, L. - Clin. Chem. 28/5:1093, 1982. - Orsonneau, J.; Douet, P.; Massoubre, C; Lustenberger, P.; Bernard, S. - Clin. Chem. 35/11:2233, 1989. - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.
864126022 / 01 p. 2/9
Símbolos Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C P V X
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
M
Elaborado por:
Xn
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Nocivo
Uso diagnóstico "in vitro" Corrosivo / Caústico
Contenido suficiente para ensayos Xi
Irritante
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
G
No congelar
F
Riesgo biológico
Volumen después de la reconstitución
Cont.
g
Contenido
Número de lote
i
Consultar instrucciones de uso
Calibr.
Calibrador
b b c h
Control
Control Positivo
Control Negativo
Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº: 1128/95
864126022 / 01 p. 3/9
Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina UR120903
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9. HEMATOLOGÍA Hematología es el estudio de las células que se encuentran en la sangre y los factores que afectan a su funcionamiento. Volumen de sangre del cuerpo humano Un adulto que pese 60 kilogramos posee aproximadamente 4,5 litros de sangre. Por lo tanto, no existe peligro alguno en que se extraiga medio litro (0,5 l o 500 ml) de sangre para efectuar una transfusión, ni en llenar dos o más tubos de ensayo de 10 ml para su estudio. Se debe explicar esto a los pacientes que se muestren atemorizados al extraerles sangre. Volemia: Volumen total de sangre. 9.1 TIPOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS Tres clases principales de células sanguíneas se pueden distinguir bajo el microscopio: glóbulos rojos (eritrocitos), glóbulos blancos (leucocitos) y plaquetas (trombocitos). 9.1.1 Eritrocitos (Fig. 9.1) Sinonimia: Glóbulos rojos, Hematíes. Aspecto: células redondas o ligeramente ovaladas, llenas de hemoglobina. Después de la tinción con Romanowsky (véase la sección 9.10.4), aparecen de color rosa con un área central pálida. Al observarlos por un lado, los eritrocitos semejan discos bicóncavos; no poseen núcleo. Tamaño: 7-8 µm. Concentración de número: aproximadamente 4- 5 x 1012 por litro (4 000 000 -5 000 000 por mm3, es decir, 4 -5 x 106 por mm3) de sangre. Función: Los eritrocitos transportan la hemoglobina, que se combina con el oxígeno y lo lleva desde los pulmones hasta los tejidos. También llevan el dióxido de carbono de los tejidos a los pulmones, efectuándose así la eliminación del material más importante al que se degradan por los procesos metabólicos casi todas las sustancias orgánicas que se encuentran en el cuerpo. 9.1.2 Leucocitos (Fig. 9.2) Sinonimia: Glóbulos blancos. Aspecto: células redondas; contienen un núcleo y gránulos en el citoplasma. Tamaño: 9 - 20 µm Concentración de número: aproximadamente 8 x 109 por litro (8000 x mm3) de sangre. Función: defensa del organismo contra las infecciones (desempeñan un papel importante en el sistema de defensa o inmune). La presencia de un núcleo permite a los leucocitos a diferenciarse fácilmente de los eritrocitos en el microscopio. Hay cinco tipos de leucocitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos) que difieren en tamaño, forma del núcleo, el color de los gránulos en el citoplasma y otros factores. Estos pueden ser identificados por microscopía después de la tinción con la coloración de Romanowsky (véase la sección 9.10.4). 9.1.3 Trombocitos (Fig. 9.3) Los trombocitos o plaquetas son fragmentos de megacariocitos que se encuentran en la sangre periférica, en los que están involucrados en la formación de coágulos. Aspecto: fragmentos de células de formas variadas (triangulares, estrelladas, ovales, etc.), con gránulos Tamaño: 2 - 5 µm Citoplasma: muy poco visible, contiene gránulos. Concentración de número: En adultos sanos, la sangre contiene alrededor de 150 a 300 x 109 plaquetas por litro de sangre (150 000-300 000 por mm3). Función: son importantes para la coagulación de la sangre; forman el tapón plaquetario primario mediante la agregación plaquetaria de unos con otros. La coagulación de la sangre1 1Véase la sección 9.9. Cuando la sangre se coloca en un tubo de vidrio se solidifica en 5 - 10 minutos, formando un coágulo; en otras palabras, la sangre se ha coagulado. ¿Qué ocurre a la sangre coagulada? Después de varias horas la sangre coagulada se separa en dos componentes (Fig. 9.4): 1. el suero, un líquido amarillo 2. el coágulo, una masa sólida de color rojo. Si se añade a la sangre un anticoagulante especial tan pronto como se extraiga, se evitará que se coagule y seguirá siendo líquida. Entre otros anticoagulantes se encuentran el oxalato de flúor (reactivo n º 26.), el citrato trisódico solución al 3,2% (reactivo n º 60), la solución salina bipotásica de EDTA solución al 10% (reactivo n º 22). ¿Qué ocurre a la sangre que no se coagula? La sangre tratada con un anticoagulante se separa en dos componentes líquidos (Fig. 9.5): 1. el plasma, un líquido amarillo 2. las células sanguíneas, que se sedimentan y forman: — una capa delgada de leucocitos y un precipitado de eritrocitos. (Dejando sedimentar con el tiempo o después de la centrifugación). Diferencia entre el plasma y el suero ● El plasma contiene una proteína soluble llamada fibrinógeno, además de un gran número de otras proteínas.
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● El suero no contiene fibrinógeno, pero todas las otras proteínas están presentes. El fibrinógeno se convierte en fibrina insoluble, que junto con los eritrocitos forma el coágulo.
Volumen total de sangre del cuerpo humano para un adulto de 60 kg: 4,5 litros. Comparación gráfica de los volúmenes, 4,5 l (4 ½ l), 500 ml (1/2 l), y 10 ml.
9.2 Recogida de muestras de sangre 9.2.1 Principio Se recoge sangre venosa de una vena en el brazo con una aguja y una jeringa, como se describe a continuación. La sangre capilar puede ser recogida desde el dedo, el oído o el talón (en recién nacidos), tal como se describe en la sección 9.4.1. 9.2.2 Materiales y reactivos ● Para la desinfección de la piel: - Algodón -Etanol al 70%, o tintura de yodo ● Para la punción venosa (Fig. 9.6): -Guantes -un torniquete hecho con un tubo de goma blanda de 2-5 mm de diámetro -agujas, 30-40 mm de longitud, diámetro o calibre: calibre 20, calibre 19, calibre 18, bisel mediano (Los tamaños de las agujas se indican generalmente por su longitud y diámetro). Para extraer sangre de niños menores de cinco años se usan agujas de calibre 23 (0,6 mm) ó 25 (0,5 mm) ● Para la recolección de la sangre:
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-Jeringas (con capacidad para 2, 5, 10 ó 20 ml) Verifique que la desembocadura de cada jeringa se ajuste adecuadamente a la entrada de las agujas -Frascos o tubos Los frascos o tubos (Fig. 9.7) deberán estar vacíos o contener un anticoagulante (véase la sección 9.1.3), y deberán tener marcas que correspondan a la cantidad requerida de sangre (por ejemplo, 5 ml). Conserve cierta cantidad de agujas estériles en tubos de vidrio pequeños; las puntas de las agujas deberán descansar en cojincillos de algodón no absorbente y los tubos se taponarán con el mismo material. En la actualidad, en muchos rincones del planeta, en especial en los países en vías de desarrollo, ya se utilizan agujas y jeringas descartables, lo que no quita la explicación anterior dada para agujas reutilizables que se lavan y esterilizan para volverlas a usar.
A
B A) Bisel mediano. B) Conserve cierta cantidad de agujas estériles en tubos de vidrio pequeños; las puntas de las agujas deberán descansar en cojincillos de algodón no absorbente y los tubos se taponarán con el mismo material.
C
D
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F C) Código de colores internacionales para las agujas desechables y su calibre. Cada color señala el calibre. Gauge: Calibre; diámetro en mm; color de cada una. D) Jeringas descartables de diferentes volúmenes. En la foto se muestran las jeringas graduadas junto con su envoltorio protector respectivo. Vale decir que estas jeringas, así como las agujas, son esterilizadas con distintos métodos, por ej., óxido de etileno; se usan una sola vez y después se descartan en recipientes apropiados para agujas (descartadores), las jeringas plásticas desechables se descartan en otro recipiente adaptado para tal fin. F) Agujas descartables. Se muestra en la foto las agujas, sus capuchones protectores de seguridad, y atrás el envoltorio en el que vienen estas agujas. También se observa el color (vea el código de colores antes en C)). 9.2.3 MÉTODO Preparación 1. Léase cuidadosamente la planilla de solicitud del paciente: — Decida la cantidad de sangre que se necesitará — Prepare el frasco o el tubo adecuado, que se usará en el ensayo correspondiente. La planilla o formulario de solicitud del paciente es el “pedido” del médico en donde coloca o escribe los análisis solicitados. 2. Si la sangre se va a utilizar para diferentes investigaciones de laboratorio, planificar la secuencia en la que se deben tomar muestras de sangre. (Por ejemplo, se debe desechar el primer 1 ml de sangre cuando se toma la sangre para ensayos de coagulación.) 3. Antes de tomar la sangre, lávese las manos con agua y jabón. Séquese las manos, y recuerde que antes de extraer debe ponerse guantes desechables de un solo uso. Si el paciente se encuentra en el laboratorio Haga que se siente de manera que quede colocado paralelamente a la mesa de trabajo donde se hará la extracción de sangre. Ponga el brazo del paciente sobre la mesa de trabajo apoyándolo en un pequeño cojín dispuesto bajo el codo, con la palma de la mano vuelta hacia arriba (Fig. 9.8). Si el paciente se encuentra en cama Extienda el brazo del paciente en una posición descansada (Fig. 9.9). Puntos para la extracción de sangre El sitio más adecuado es la vena que se encuentra en el pliegue anterior del codo, en el punto donde sea más gruesa y fácilmente visible (Fig. 9.10), aprovechando, de preferencia, una de las ramas que forman una Y inmediatamente arriba del lugar donde se juntan (1). Si fuera necesario se pueden usar los puntos 2, 3 ó 4 como alternativas.
A B
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A) Lavado previo de las manos. B) Colocación de los guantes desechables.
Figura 9.10 Los sitios para tomar muestras de sangre venosa 1: Sitio preferido, 2, 3, 4: Sitios alternativos.
Procedimiento Uso de la jeringa 1. Monte la aguja en la jeringa, sin tocar más que la base de la aguja. Pruebe aguja y jeringa para cerciorarse de que no está obstruida y la jeringa es hermética. Cubra el extremo de la aguja con el tubo estéril hasta que se use. En el caso de las agujas descartables que vienen con un cubreagujas protector, se les debe sacar primero el cubreagujas para poder puncionar la vena. Pero debe dejarlas así con el cubreagujas puesto y sin sacar del envoltorio antes de extraer (recuerde que están esterilizadas). El envoltorio se saca, se extrae el cubreagujas con la aguja dentro, se saca la aguja protegida dentro del cubreagujas, la aguja se coloca en la jeringa recién extraída de su envoltorio respectivo, todo esto antes de extraer la sangre, es decir, una vez que ya tiene todo listo para puncionar. 2. Aplique el torniquete. Con la mano derecha coloque firmemente el torniquete alrededor del brazo y sujete los extremos. 3. Con la mano izquierda tire de un extremo, cruzándolo (Fig. 9.11). 4. A continuación introduzca este extremo por debajo de la parte principal del torniquete (Fig. 9.12). El torniquete se deberá ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de sangre por las arterias. 5. Pida al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatación de las venas. 6. Con el dedo índice de la mano izquierda palpe la vena en que introducirá la aguja (Fig. 9.13). 7. Desinfecte la piel con una pieza de algodón embebida en tintura de yodo o etanol. 8. Tome la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo índice sobre la base de la aguja (Fig. 9.14). 9. Coloque la aguja sobre la vena, con el bisel hacia arriba. Introduzca la aguja en el centro de la vena (Fig. 9.15), sin titubeos. Importante: Nunca se intente puncionar una vena por un lado (Fig. 9.16). Nunca se introduzca la aguja con el bisel hacia abajo. Se sentirá que la aguja atraviesa: (a) la piel, que es resistente (b) Inmediatamente después, la pared de la vena, que es menos resistente (más elástica).
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10. Haga entrar la aguja a lo largo de la vena a una profundidad de 1,0 a 1,5 cm. 11. Con la mano izquierda tire hacia atrás el émbolo de la jeringa muy lentamente. Deberá entrar sangre en la jeringa (Fig. 9.17). 12. Retire el torniquete tirando del extremo doblado. Siga tirando el émbolo hacia atrás hasta llenar la jeringa con la cantidad de sangre que necesite (Fig. 9.18). 13. Aplique una pieza seca de algodón sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Saque la aguja con un movimiento rápido por debajo de la pieza de algodón (Fig. 9.19). 14. Pida al paciente que presione firmemente la pieza de algodón durante 3 minutos, con el brazo extendido (Fig. 9.20 (a)). En la actualidad no se recomienda que se flexione el brazo sobre la pieza de algodón (a causa del riesgo de que se forme un hematoma) (figura 9.20 (b)). 15. Separe la aguja de la jeringa. Llene los tubos o frascos con la muestra de sangre hasta la marca correspondiente (Fig. 9.21). Invierta varias veces los frascos que contengan anticoagulante. 16. Coloque en los frascos etiquetas en que se lean claramente: — el nombre del paciente — la fecha — el número del paciente en el servicio de consulta externa o el hospital, si tal número existe. Enjuague inmediatamente jeringa y aguja con agua fría, luego enjuague con desinfectante (véase la sección 3.5.4). Coloque las agujas y jeringas enjuagados en pequeños tubos de vidrio taponadas con algodón no absorbente y esterilizar en autoclave o esterilizador de calor seco (véase la sección 3.5.5). Nunca use una aguja o jeringa a otra persona antes de que sean reesterilizados. Las agujas y jeringas desechables sólo deben usarse una vez, ya que no pueden volver a esterilizarse. Para trabajar con agujas y jeringas desechables el procedimiento antes mencionado es el mismo, salvo que estas se descartan en los correspondientes recipientes de descarte.
B A A) Monte la aguja en la jeringa, sin tocar más que la base de la aguja. Pruebe aguja y jeringa para cerciorarse de que no está obstruida y la jeringa es hermética. Cubra el extremo de la aguja con el tubo estéril hasta que se use. B) Aplicando el torniquete con la goma de ligar. Con la mano derecha coloque firmemente el torniquete alrededor del brazo y sujete los extremos.
Figura 9.11 Con la mano izquierda tire de un extremo, cruzándolo. Figura 9.12 A continuación introduzca este extremo por debajo de la parte principal del torniquete. El torniquete se deberá ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de sangre por las arterias.
C
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C) Pida al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatación de las venas. Figura 9.13 Con el dedo índice de la mano izquierda palpe la vena en que introducirá la aguja.
D
D) Desinfecte la piel con una pieza de algodón embebida en tintura de yodo o etanol. Figura 9.14 Tome la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo índice sobre la base de la aguja.
E F E) Posición incorrecta para la venopunción. Nunca se intente puncionar una vena por un lado. Nunca se introduzca la aguja con el bisel hacia abajo. F) Se sentirá que la aguja atraviesa: (a) la piel, que es resistente, (b) Inmediatamente después, la pared de la vena, que es menos resistente (más elástica).
G
G) Haga entrar la aguja a lo largo de la vena 1-1,5 cm. Figura 9.17 Con la mano izquierda tire hacia atrás el émbolo de la jeringa muy lentamente. Deberá entrar sangre en la jeringa. Siga tirando el émbolo hacia atrás hasta llenar la jeringa con la cantidad de sangre que necesite.
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Figura 9.18 Una vez extraída la cantidad de sangre que se necesita retire el torniquete tirando del extremo doblado. Figura 9.19 Aplique una pieza seca de algodón sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Saque la aguja con un movimiento rápido por debajo de la pieza de algodón.
H H) Este procedimiento para tapar la aguja sin colocarla con la mano como describe la figura, es válido tanto para el comienzo (véase ilustración anexa A) antes de la extracción, como para después de extraer sangre para tapar con el capuchón y evitar pinchaduras accidentales (la sangre es un material potencialmente infeccioso).
Figura 9.20 Pida al paciente que presione firmemente la pieza de algodón durante 3 minutos, con el brazo extendido. En la actualidad no se recomienda que se flexione el brazo sobre la pieza de algodón (a causa del riesgo de que se forme un hematoma).
I
Figura 9.21 Transferencia de la sangre a un tubo para muestras. Separe la aguja de la jeringa. Llene los tubos o frascos con la muestra de sangre hasta la marca correspondiente. I) Coloque en los frascos etiquetas en las cuales se lean claramente los datos.
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9.3 ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA La hemoglobina es el pigmento rojo contenida en los eritrocitos. Se compone de cadenas de proteínas y moléculas que contienen hierro. Transporta oxígeno a las células de los tejidos del organismo. Unidades de medición Estrictamente, la unidad SI para expresar las concentraciones de hemoglobina es el milimol por litro (mmol/l). Cuando se usa esta unidad se necesita especificar la estructura química a la que se aplica. En la práctica esto significa que se debe emplear el término "hemoglobina (Fe)" en vez de la palabra "hemoglobina" sola. Sin embargo, como medida temporal antes de hacer el cambio a mmol/l, algunos laboratorios utilizan la unidad "gramo por litro" (g/l). Cuando se usa esta unidad basta el término simple "hemoglobina" y no se necesita decir "hemoglobina (Fe)". Los valores en gramos por litro se pueden convertir en valores expresados en mmol/l multiplicándolos por 0,062. Ejemplo: Hemoglobina, 150 g/l x 0,062 = hemoglobina (Fe) 9,3 mmol/l En este manual los cálculos y valores se expresan generalmente en ambas formas. Tómese nota de que si se usa la unidad "gramo por litro" los valores son 10 veces mayores que cuando se usa la unidad tradicional "gramo por 100 ml". Por ejemplo, 150 g/l = 15,0/100 ml. 9.3.1 Método fotométrico de la Cianometahemoglobina Principio La sangre se diluye en líquido de Drabkin, que destruye los eritrocitos (hemólisis) y convierte la hemoglobina en Cianometahemoglobina. La solución que se produce se examina por medio de un espectrofotómetro o un colorímetro. Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre. El método fotométrico de la Cianometahemoglobina permite hacer los cálculos más precisos de la cantidad de hemoglobina existente. Se debe usar siempre que sea posible. Materiales y reactivos ● Espectrofotómetro1 (o fotocolorímetro) 1Algunos espectrofotómetros funcionan bien en la red eléctrica o con corriente de una batería de automóvil. Un modelo es suministrado por la UNICEF: Número de referencia 09.309.98 (batería de 110 V) o 09.310.00 (batería de 220 V); estos se pueden pedir en la siguiente dirección: UNICEF, UNICEF Plads, Freeport, DK 2100 Copenhague, Dinamarca. ● Cubetas para espectrofotómetro (o fotocolorímetro) ● Tubos de ensayo ● Gradilla ● Pipetas de sangre (Sahli), 0,2 ml graduada hasta 0,02 ml (20 µl), con tubo de goma y boquilla. ● Micropipeta de 20 µl (alternativa a la pipeta de Sahli) ● Líquido de dilución de Drabkin (reactivo N º 21) ● Una pipeta graduada, de 5 ml. ● Una pipeta graduada, de 10 ml. ● Solución de referencia, que puede ser: -La solución de referencia de Cianometahemoglobina fresca utilizada para calibrar el instrumento, -Una solución de referencia previamente calibrada contra la solución de referencia de Cianometahemoglobina, o -Una muestra de sangre de concentración de hemoglobina conocida. Líquido de Drabkin para dilución (reactivo N º 21) Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1 litro de agua destilada. Si se dispone de una balanza analítica, la preparación se puede hacer en el laboratorio (véase el reactivo Nº 21). Esta solución se puede conservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro. Deséchese si se enturbia. El líquido de Drabkin no debe enfriarse demasiado, pues puede causar una descoloración con reducción del ferricianuro. — Referencia para Cianometahemoglobina (estandarizada) Esta solución se puede adquirir en el comercio o en un laboratorio de referencia. En las soluciones de referencia comerciales casi siempre se indica la concentración en miligramos por 100 ml (generalmente en mg%) Nota: Lea la técnica anexa comercial Antes de usar el espectrofotómetro (o colorímetro) para calcular la hemoglobina se debe elaborar una curva de calibración. Con esta curva se pueden preparar un gráfico y una tabla de valores de la hemoglobina. Importante: Al comienzo de cada día: ● Limpie las cubetas del espectrofotómetro (o colorímetro). ● Llenar uno de los tubos limpios con líquido de Drabkin fresco, que se utiliza para poner a cero el espectrofotómetro (o colorímetro). ● Leer una solución de referencia (véase más arriba). Calibración del fotocolorímetro o espectrofotómetro Calibración del espectrofotómetro (o colorímetro) usando solución de referencia de Cianometahemoglobina (o una solución de referencia previamente calibrada contra una solución de referencia de Cianometahemoglobina)
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Como se mencionó antes, antes de usar el espectrofotómetro (o colorímetro) para calcular la hemoglobina se debe elaborar una curva de calibración. Con esta curva se pueden preparar un gráfico y una tabla de valores de la hemoglobina. 1. Calcule la concentración de hemoglobina de la solución de referencia en gramos por litro empleando la fórmula siguiente: concentración en mg / 100 ml x 10 x 251 1000 (Nota: 10 es el factor que convierte 100 ml en 1 litro; 1000 es el factor que convierte miligramos en gramos y 251 es el factor de dilución cuando 0,02 ml de sangre se diluyen con 5 ml del líquido de Drabkin). Ya que 10 x 251/1000 es casi 2,5, la fórmula anterior se puede simplificar de la manera siguiente:* Contenido de hemoglobina de la solución de referencia en gramos por litro = concentración en mg/100 ml x 2,5 Ejemplo Concentración de la solución de referencia = 60 mg/100 ml Valor de la hemoglobina = 60 x 2,5 = 150 g/l * Si se emplea una dilución de 1 x 200 (por ejemplo, 0,02 ml de sangre y 4 ml de líquido de Drabkin), multiplique por 2,0 en vez de 2,5. 2. Haga diluciones sucesivas de la solución estandarizada: — prepare cuatro tubos y numérelos del 1 al 4 (Fig. 9.22). — por medio de pipetas deposite en cada tubo las cantidades mencionadas en la Tabla 9.1. 3. Mezclar el contenido de los tubos y dejar reposar durante 5 minutos (Fig. 9.23). 4. Lea las diluciones en el espectrofotómetro (o colorímetro): (A) Establecer la longitud de onda de 540 nanómetros (nm) o coloque un filtro verde en el espectrofotómetro (o colorímetro). (B) Llenar una cubeta igualados con líquido de Drabkin y colóquelo en el aparato (en el espectrofotómetro o colorímetro). (C) Poner a cero el espectrofotómetro. (D) leer el contenido de los tubos 1 a 4, utilizando una cubeta. Asegúrese de que la aguja vuelve a cero entre cada lectura hecha con líquido de Drabkin. Si el aparato usa un display o pantalla digital vea los números y observe el cero. 5. Prepare un gráfico trazando las líneas correspondientes a las soluciones estandarizadas diluidas perpendicularmente a las líneas de sus concentraciones. (Tabla 9.2 y Fig. 9.24). 6. Con el gráfico que se ha preparado: Elabore una tabla de valores de la hemoglobina, que abarque desde 20 g/l hasta 180 g/l. Tabla 9.1 Preparación de diluciones seriadas de la solución de referencia Volumen de la solución Volumen del líquido de Número del tubo Dilución de referencia (ml) Drabkin (ml) 1 4.0 0.0 Sin diluir 2 2.0 2.0 1:2 3 1.3 2.7 1:3 4 1.0 3.0 1:4 Tabla 9.2 Lecturas espectrofotométricas para diferentes diluciones de la solución de referencia Dilución Concentración de hemoglobina (g/l) Absorbancia a 540 nm Sin diluir 150 35.0 1:2 1:3 1:4
150/2 = 75 150/3 = 50 150/4 = 37.5
17.5 11.5 8.5
Figura 9.22 Preparando diluciones seriadas de solución de referencia de cianometahemoglobina.
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Figura 9.23 Después de mezclar las diluciones de la solución de referencia, déjelos reposar durante 5 minutos. Figura 9.24 Curva estándar para la determinación de la concentración de hemoglobina de muestras de sangre. Calibración del espectrofotómetro (o colorímetro) utilizando una muestra de sangre de concentración de hemoglobina conocida 1. Obtener una muestra de sangre de concentración de hemoglobina conocida (por ejemplo, 168 g/l). 2. Encender el espectrofotómetro (o colorímetro) y ajustar la longitud de onda a 540 nm. 3. Pipetear 8 ml de líquido de Drabkin en un tubo de ensayo. Añadir 0,04 ml de sangre bien mezclada. Asegúrese de limpiar la parte exterior de la pipeta de antemano para evitar la adición de exceso de sangre. Mezclar la solución de Cianometahemoglobina invirtiendo varias veces. Dejar reposar durante 10 minutos. 4. Poner a cero el espectrofotómetro con líquido de Drabkin. 5. Leer y registrar la absorbancia de la solución de Cianometahemoglobina preparada anteriormente. 6. Preparar una serie de diluciones de la solución de Cianometahemoglobina en cuatro tubos de ensayo (numeradas del 1 al 4), como se muestra en la Tabla 9.3. 7. Lea y registre las absorbancias de las soluciones diluidas. 8. Trazar una curva de absorbancia versus la concentración de hemoglobina, utilizando papel cuadriculado común. Trace una línea recta a partir del origen pasando tan cerca de cada punto como sea posible. Extienda la línea de tal forma que pueda leer absorbancias para los valores de hemoglobina superiores a 168 g/l. Se prepara una tabla de referencia de los valores usando los gráficos obtenidos a partir de cualquiera de los métodos anteriores: ● Elaborar una tabla de lecturas de absorbancia a partir de 0.00, 0.01, 0.02 y terminando en 1,50. ● Determinar las concentraciones de hemoglobina para cada una de las absorbancias de la gráfica. Tabla 9.3 Preparación de diluciones seriadas de solución de Cianometahemoglobina Volumen de solución de Volumen de líquido de Concentración de Número del tubo Cianometahemoglobina (ml) Drabkin (ml) hemoglobinaa (g/l) 1 4.0 1.0 13.4 2 3.0 2.0 10.1 3 2.0 3.0 6.7 4 1.0 4.0 3.4 a En este ejemplo, se supone que la concentración de hemoglobina de la solución de Cianometahemoglobina es 168 g/l. Precauciones ● El cianuro de potasio es muy venenoso. Hay que tenerlo guardado en un armario cerrado con llave en todo momento cuando no esté en uso. Lávese las manos inmediatamente después de su manipulación. ● Guarde el líquido de Drabkin en un frasco para reactivo marrón (“color caramelo”) porque se descompone al exponerse a la luz. Si un frasco para reactivo marrón no está disponible, utilice un frasco de vidrio transparente cuidadosamente envuelto en papel de plata. ● El líquido de Drabkin debe ser de color amarillo claro y pálido. Si se vuelve turbio, o pierde su color, debe ser desechado. La claridad del líquido de dilución se puede comprobar mediante la medición de su absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm frente a agua como blanco. La absorbancia debe indicar cero. ● Una vez que la solución de Cianometahemoglobina se ha preparado, la medición de la hemoglobina debe llevarse a cabo dentro de las 6 horas. ● El líquido de Drabkin es estable durante varios meses si se conserva a temperaturas frías. Si la temperatura ambiente supera los 30 °C, guárdela en el refrigerador a 4-6 °C. No congele, ya que esto puede causar la descomposición del compuesto. Siempre permita que el líquido de dilución se caliente a temperatura ambiente antes de su uso. Método 1. Pipetear 5 ml de líquido de Drabkin en un tubo. Aspire sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 ml de una pipeta de Sahli. Evite la entrada de burbujas. Si se usa sangre venosa asegúrese que se mezcle adecuadamente invirtiendo el frasco en que se ha depositado junto con el anticoagulante varias veces, aproximadamente durante un minuto, inmediatamente antes de
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aspirarla con la pipeta. Como alternativa a la pipeta de Sahli, se puede usar una micropipeta de 20 µl. 2. Limpie el exterior de la pipeta. Verifique que la sangre continúa en el mismo nivel (en la marca de 0,02 ml) (Fig. 9.25). Deposite la sangre en el líquido de Drabkin y enjuague la pipeta varias veces aspirando y expulsando tres veces el líquido del tubo. 3. Mezcle el contenido del tubo y déjelo reposar durante 5 minutos (véase la Fig. 9.23). 4. Ponga el colorímetro en cero con líquido de Drabkin. Lea en el tablero la absorbencia de la sangre diluida del paciente usando la cubeta para colorímetro. Si se forma turbidez en la sangre diluida, puede obedecer a la existencia de proteínas anormales en el plasma o a una concentración elevada de leucocitos. Se centrifuga la sangre diluida a 2000 g durante 5 minutos antes de tomar una lectura. Utilizando la tabla preparada a partir de la curva de calibración, registrar la concentración de la hemoglobina en g/l. La Tabla 9.4 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad.
Tabla 9.4 Concentraciones normales de hemoglobina, por grupo de edad Concentración de hemoglobina Concentración de hemoglobina Grupo de edad (Fe) (mmol/l) (g/l) Recién nacidos 8.4 a 12.1 136 - 196 Niños (1 año) 7.0 a 8.1 113 - 130 Niños (10-12 años) 7.4 a 9.2 115 - 148 Mujeres 7.4 a 9.9 120 - 160 Hombres 8.1 a 11.2 130 - 180 9.3.2 MÉTODO DE HEMATINA ALCALINA D Principio Cuando se añade una muestra de sangre a una solución alcalina que contiene un detergente no iónico, la hemoglobina se convierte en hematina alcalina D-575, que es un compuesto de color estable. La absorbancia de la hematina alcalina D-575 se mide usando un colorímetro o hemoglobinómetro. El espectrofotómetro y hemoglobinómetro determinan directamente la concentración de hemoglobina (Hb) de la muestra de sangre, mientras que con un colorímetro, se obtiene la concentración de hemoglobina de la muestra de sangre a partir de la absorbancia usando una curva de calibración preparada o tabla de valores. El método hematina alcalina D (HAD) ofrece varias ventajas sobre el método de la cianmetahemoglobina: ● Es muy preciso, pero menos costoso. ● El procedimiento de calibración utiliza Cloruro de hematina (o Cloruro de hemina), un compuesto cristalino estable que está disponible comercialmente. Cloruro de hematina; cristales de color marrón rojizo insolubles formados por la acción del ácido clorhídrico en hematina en un ensayo para la presencia de sangre ● El reactivo HAD no incluye cianuro de potasio, que es altamente tóxico, en contraste con el líquido de Drabkin para el método de la cianmetahemoglobina. ● El reactivo de HAD se puede preparar usando los productos químicos que están generalmente disponibles a nivel local. Materiales y reactivos ● Espectrofotómetro, hemoglobinómetro o colorímetro ● Tubos de ensayo ● Gradillas ● Tapone de goma o de corcho ● Cubetas ● Lápiz graso o un marcador permanente ● Algodón o gasa
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● Estándar HAD (suministrado por el laboratorio central) ● Reactivo HAD (reactivo no. 8). Calibración del espectrofotómetro o hemoglobinómetro 1. Tenga en cuenta la concentración del patrón de HAD se indica en la etiqueta, por ejemplo, 160 g/l, en una dilución de 1:150. 2. Pipetear 20 µl del estándar HAD en un tubo de ensayo limpio que contiene 3 ml de reactivo de HAD. 3. Tapar el tubo de ensayo usando un corcho limpio o tapón de goma y se mezcla por inversión. Deje el tubo en reposo durante 2-3 minutos. 4. Llenar una cubeta limpia con el reactivo de HAD sin diluir. Seque el exterior de la misma con un algodón o gasa y colóquela en la cámara de la cubeta. Ajustar el espectrofotómetro o hemoglobinómetro para leer el cero (blanco). 5. Reemplace el reactivo HAD sin diluir en la cubeta con la solución diluida HAD, repetir el procedimiento de medición, y ajuste el espectrofotómetro o hemoglobinómetro para leer la concentración de hemoglobina correcta indicado en la etiqueta, por ejemplo, 160 g/l. Calibración del colorímetro 1. Encienda el colorímetro y fije la longitud de onda en 540 nm. Deje que el colorímetro se caliente durante el tiempo recomendado por el fabricante. 2. Organizar seis tubos de ensayo en una gradilla. Etiquetar la tubos de prueba con los siguientes números y letras: 1, 2, 3, 4, B y N. 3. Pipetear 5 ml de reactivo de HAD en el tubo de ensayo marcado B. 4. Pipetear 3 ml de reactivo de HAD y 20 µl de estándar HAD en el tubo de ensayo marcados N. 5. Diluir la solución de referencia en el tubo de ensayo N como se describe en la Tabla 9.5. 6. Pipetear los volúmenes indicados de reactivo HAD y solución de referencia en los tubos de ensayo numerados del 1 al 4. Tapar cada tubo y mezclar por inversión. 7. Calcular las concentraciones de hemoglobina en los tubos de ensayo de la siguiente manera: Concentración de hemoglobina = concentración de la solución de referencia x factor de dilución Por ejemplo: Tubo N: 160 g/l Hb Tubo 1: 160 g/l Hb x 4/5 = 128 g/l Hb Tubo 2: 160 g/l Hb x 3/5 = 96 g/l Hb Tubo 3: 160 g/l Hb x 2/5 = 64 g/l Hb Tubo 4: 160 g/l Hb x 1/5 = 32 g/l Hb Tubo B: 0 g de g/l Hb 8. Vierta el reactivo HAD del tubo de ensayo B en una cubeta limpia. Secar el exterior de la cubeta con un algodón o gasa. Colocar la cubeta en la cámara de la cubeta, cerrar la cámara de la cubeta y ajustar el colorímetro para leer absorbancia cero (blanco). 9. Reemplace el reactivo HAD en la cubeta con la solución de referencia de tubo de ensayo 4. Leer la absorbancia. Vierta la solución en el tubo de ensayo numerado 4. 10. Repetir el procedimiento utilizando tubos de ensayo 3, 2, 1 y N, respectivamente, en secuencia. 11. Trazar la curva de los valores de absorbancia contra la concentración de hemoglobina (g/l) para las muestras estándar y de prueba (N y tubos 1 al 4, respectivamente) (Fig. 9.26). Desde el origen, trace una línea recta que una a su paso la mayor cantidad de puntos posibles. Nota: Siempre prepare una nueva curva de calibración cada vez que se utiliza un colorímetro diferente, el tipo de cubeta, o método para la medición de la hemoglobina. Tabla 9.5 Preparación de diluciones seriadas de solución de referencia HAD para la calibración de un colorímetro Tubo de ensayo 1 2 3 4 Reactivo HAD (ml) 1 2 3 4 Solución de referencia 4 3 2 1 HAD (ml) Volumen total (ml) 5 5 5 5
Método
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Método utilizando un espectrofotómetro o hemoglobinómetro 1. Encender el espectrofotómetro o hemoglobinómetro. Deje que se caliente durante el tiempo recomendado por el fabricante (generalmente 10 minutos). 2. Colocar los tubos de ensayo en una gradilla: Uno para cada muestra a analizar, uno para el blanco y dos para las muestras de control. 3. Usando un lápiz graso o un marcador permanente, etiquete los tubos de ensayo con los números de laboratorio correspondientes a las muestras a medir, B para el blanco, y C1 y C2 de las muestras de control. 4. Pipetear 3 ml de reactivo de HAD en cada tubo de ensayo. 5. Pipetear 20 µl de sangre recogida en EDTA de un paciente en el reactivo de HAD del tubo correspondiente. Enjuague la pipeta cuidadosamente cinco veces con el reactivo de HAD. 6. Pipetear 20 µl del estándar HAD en los tubos de ensayo C1 y C2. 7. Tapone todos los tubos de ensayo con un corcho limpio o tapón de goma y mezclar por inversión. Deje los tubos en reposo durante 2-3 minutos. 8. Vierta la solución HAD del tubo B en una cubeta limpia. Secar el exterior de la cubeta con un algodón o gasa. Asegúrese que no haya burbujas de aire en la solución. Colocar la cubeta en la cámara de la cubeta y ajustar el espectrofotómetro o hemoglobinómetro para leer el cero. 9. Repetir el procedimiento con la solución en los tubos de ensayo C1 y C2, respectivamente. Si las lecturas de los dos controles difieren en menos de 2,5%, medir la concentración de hemoglobina de todas las muestras de ensayo. Registre todos los resultados. Método utilizando un colorímetro El método HAD también es aplicable usando un colorímetro. El procedimiento de medición es el mismo que el descrito para un espectrofotómetro o hemoglobinómetro. Sin embargo, la absorbancia en un colorímetro no aumenta linealmente con la hemoglobina a concentraciones elevadas. Por lo tanto, una curva de calibración debe ser utilizada para relacionar las lecturas de absorbancia a la concentración de hemoglobina, como se describe anteriormente. Resultados Reportar los resultados en g/l. Ejemplo: "hemoglobina = 89 g/l". Errores en la estimación de la hemoglobina Errores en la toma de muestras : -Flujo inadecuado de sangre de los pinchazos en los dedos; -Exprimir en exceso el dedo después del pinchazo; -El uso prolongado de un torniquete en la recogida de sangre venosa, que conduce a la concentración de células de la sangre; -Una mezcla insuficiente de la sangre venosa, que se ha sedimentado después de la recogida; -Pequeños coágulos en la sangre venosa debido a la mezcla inadecuada con EDTA después de la recolección; -Agregado de muy poca o un exceso de sangre al líquido de Drabkin; -Burbujas de aire atrapadas en las pipetas. Equipo defectuoso o sucio, como por ejemplo: - Pipetas rotas o astilladas; - Pipetas sucias; - Cubetas sucias; -Filtros sucios; -Un espectrofotómetro, hemoglobinómetro o colorímetro defectuoso. Falla en la técnica: -El uso de un factor de dilución diferente de aquel para el cual se calibró el espectrofotómetro, hemoglobinómetro o colorímetro; -Inadecuada mezcla del reactivo; -Colocar la cubeta en la cámara con los lados esmerilados enfrentando la trayectoria de la luz; -Burbujas de aire en la cubeta; -El uso de un filtro estándar de otro espectrofotómetro o hemoglobinómetro para el ajuste; -Uso de un filtro incorrecto para el colorímetro. Nota: Si el espectrofotómetro, colorímetro o hemoglobinómetro requiere recalibración frecuente, por ejemplo, cada 2-3 días, sustituir la lámpara y repetir el procedimiento de control de calidad interno. Si el problema de la recalibración frecuente persiste, se debe devolver el equipo a un agente de servicio. 9.4 ESTIMACIÓN DE LA FRACCIÓN DE VOLUMEN DE ERITROCITOS El volumen total que ocupan los eritrocitos (glóbulos rojos) en un volumen dado de sangre, dividido entre el volumen de sangre, se denomina fracción de volumen de eritrocitos. Por ejemplo, si el volumen de los eritrocitos en 1 litro (1000 ml) de sangre es de 450 ml, la fracción de volumen de eritrocitos será 450 ml/1000 ml = 0,45 (ya que la fracción consiste en mililitros divididos entre mililitros, la unidad "ml" se cancela y el resultado es una fracción decimal simple, sin unidad). El resto de la sangre se compone casi completamente de plasma, junto con una reducida cantidad de glóbulos blancos (leucocitos). Si estos se pasan por alto, la fracción de volumen del plasma de este ejemplo será 550 ml/1000 ml = 0,55 (obsérvese que 0,45 + 0,55 = 1,0 o sea que la fracción de volumen de eritrocitos más la fracción de volumen de plasma = 1). Por lo tanto, la fracción de volumen de eritrocitos es una forma de medir la proporción de éstos en el plasma. Se usa para calcular la concentración media de hemoglobina en los eritrocitos y se aprovecha también para elaborar el diagnóstico en pacientes que sufren de deshidratación, choque o quemaduras.
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Antes de la introducción de las unidades SI, la fracción de volumen de eritrocitos se denominaba "hematocrito" o "volumen de sedimentación globular" (Volumen de células empaquetadas) y se notificaba como un porcentaje, y no como una fracción decimal. Según el sistema tradicional, el "hematocrito" correspondiente al ejemplo dado sería de 45%. Tómese nota de que al emplear las unidades SI el valor numérico no cambia, pero se convierte en 0,45 en vez de 45%. 9.4.1 Método Microescala Principio La sangre (mezclada con anticoagulante) se deposita en un tubo capilar largo y se centrifuga empleando un "cabezal para microhematocrito". A continuación se mide el nivel de la columna de eritrocitos por medio de una escala especial. Se debe preferir este método que el uso de una macroescala; es más rápido y se puede emplear sangre extraída de un dedo. Materiales y reactivos (Fig. 9.27) Una centrífuga (eléctrica) para "microhematocrito", con cabezal plano para girar a alta velocidad Una escala especial para medir los resultados (generalmente se suministra junto con la centrífuga) Tubos capilares con heparina: o de 75 mm de longitud, o y de 1,5 mm de diámetro interior (Estos tubos contienen un depósito de heparina seca como anticoagulante), (si se utiliza sangre capilar). Si se usa sangre venosa mezclada con sal bipotásica de EDTA solución al 10% (reactivo n º 22), no será necesario que los tubos capilares contengan heparina; los tubos heparinizados no son necesarios. Se pueden emplear tubos capilares sin heparina. Cera blanda o arcilla plástica para modelar (o un mechero de Bunsen o una lámpara de alcohol) Una lanceta estéril para sangre y etanol al 70%, para la extracción de sangre capilar. Pipetas Pasteur capilares largas y finas (lo suficientemente largas como para llegar a la parte inferior de los tubos) con perilla de goma. Papel de filtro
Figura 9.27 Materiales para la estimación de la fracción de volumen de eritrocitos utilizando la microescala.
Si no se cuenta con una escala u otro tipo de utensilio para efectuar la medición se puede preparar uno utilizando papel milimétrico de 15 - 20 cm de anchura. En la orilla izquierda del papel, comenzando desde abajo, marque 10 puntos con una distancia de 4 mm entre uno y otro. En la orilla derecha marque 10 puntos con espacios de 6 mm. Con una regla trace 10 líneas que unan cada punto de la orilla izquierda con el punto correspondiente de la orilla derecha. En la orilla izquierda, junto al punto donde comience la línea horizontal más inferior, escriba "0". Continúe hacia arriba por la orilla izquierda, numerando cada línea trazada en el siguiente orden: 0,1, 0,2, 0,3, etc.; la línea más alta tendrá por número 1,0. En la orilla derecha escriba los mismos números junto al extremo de las líneas trazadas. A continuación, nuevamente con una regla trace una sucesión de líneas horizontales mucho más tenues que las primeras. Cada una de estas líneas tenues se deberá trazar precisamente a la mitad de la distancia entre dos líneas gruesas. Por último, siguiendo las líneas impresas en el papel milimétrico trace líneas verticales gruesas, separadas por espacios de unos 3 cm. La escala resultante deberá ser similar a la de la figura 9.28. (Si se desea, en vez de elaborar una escala se puede usar la que se ha impreso en esta página, para determinar las fracciones de volumen de eritrocitos.) (Cubrirla con una lámina de plástico, es decir, puede meterla en un folio de plástico para protegerla de la suciedad, líquidos derramados, etc.) IMPORTANTE : LA ESCALA REPRESENTADA AQUÍ EN ESTA TRADUCCIÓN NO ES RECOMENDABLE USARLA COMO REEMPLAZO COMO APARECE EN EL TEXTO. En su lugar podría utilizarla como un modelo para la construcción de una escala a mano en papel, como se indica en la explicación anterior. (N del T.)
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Obtención de sangre capilar Provoque la salida de sangre puncionando con una lanceta: — el dedo cordial o el anular (Fig. 9.29) — o bien, el lóbulo de la oreja — o el talón (en niños pequeños), Después de haber desinfectado el área con etanol. La sangre deberá brotar libremente o después de exprimir muy suavemente el área. Recoja la primera gota de sangre con un papel de filtro. 1. Aplique el extremo delgado (que se hallará marcado con un círculo rojo) del tubo capilar con heparina sobre la gota de sangre (Fig. 9.30). La sangre entrará en el tubo por capilaridad. Llene aproximadamente tres cuartas partes (75%) del tubo. 2. Tapone el extremo contrario del tubo (el extremo que no ha estado en contacto con la sangre). Verifique que el taponamiento es hermético y llega a unos 2 mm de profundidad dentro del tubo. Si no se puede obtener la cera o la arcilla plástica para modelar, cierre este extremo del tubo calentándolo cuidadosamente sobre la llama de una lámpara de alcohol o la de un mechero de Bunsen (Fig. 9.31 y Fig. 9.32). Déjelo enfriar en posición horizontal. 3. Es conveniente disponer de una gradilla numerada en que se haya colocado arcilla plástica para modelar, de manera que el tubo de cada paciente se pueda fijar en posición vertical junto al número correspondiente. Muestras de sangre venosa 1. Se recoge una muestra de sangre venosa, como se describe en la sección 9.2 y agregarlo a un tubo de ensayo que contiene solución de EDTA dipotásico. 2. Usando una pipeta capilar, rellenar alrededor de tres cuartas partes de un tubo capilar con la sangre. 3. Selle el tubo como se describe en el paso 2 anterior.
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A A) Es conveniente disponer de una gradilla numerada en que se haya colocado arcilla plástica para modelar, de manera que el tubo de cada paciente se pueda fijar en posición vertical junto al número correspondiente. Técnica para la medición 1. Coloque los tubos capilares en las ranuras numeradas del cabezal de la centrífuga, vigilando que el número de la ranura corresponda al número de la muestra. El extremo del tubo que se ha taponado con cera (o cerrado sobre la llama) deberá apuntar hacia afuera, lejos del centro (Fig. 9.33). 2. Centrifúguese a alta velocidad (3000 g) (durante el período de tiempo recomendado por el fabricante de la centrífuga, generalmente 10 minutos). Al terminar la centrifugación cada uno de los tubos tendrá en su interior tres capas (Fig. 9.34): — en la parte superior, una columna de plasma (P) — a la mitad, una capa sumamente delgada de glóbulos blancos (GB) — en la parte inferior y hasta el fondo, una columna de glóbulos rojos (GR). La determinación de la fracción de volumen de eritrocitos se hace precisamente al nivel del tope de la columna de glóbulos rojos. 3. Mantener el tubo en contra de la escala de manera que la parte inferior de la columna de eritrocitos (no la parte inferior del tubo) está alineado con la línea horizontal en cero (véase Fig. 9.35). 4. Mueva el tubo a través de la escala hasta que la línea marcada 1.0 pasa a través de la parte superior de la columna de plasma. Compruebe para asegurarse que la parte inferior de la columna de eritrocitos sigue en la línea de cero, compruebe también (a través de las líneas verticales gruesas) que el tubo esté vertical. 5. La línea que pasa a través de la parte superior de la columna de eritrocitos da la fracción de volumen de eritrocitos (0,4 en la figura 9.35). Las líneas intermedias finas representan intervalos de 0,05; si la parte superior de la columna de eritrocitos no está en una línea, pero entre una línea gruesa y una línea fina, su posición se puede estimar al 0.01 más cercano. Nota: Si el laboratorio todavía no ha cambiado las unidades a las del sistema SI y se sigue utilizando el sistema tradicional, el mismo gráfico se puede utilizar. Basta con leer los números como porcentajes en lugar de fracciones. Por ejemplo, en lugar de "fracción de volumen de eritrocitos: 0.4" presentamos el resultado como "hematocrito: 40%".
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Tabla 9.6 Fracciones de volumen de eritrocitos y hematocritos normales, por grupo de edad Grupo de edad Fracción de volumen de eritrocitos Hematocrito (%) Recién nacidos 0,50-0,58 50-58 Bebés (3 meses) 0,35-0,40 35-40 Niños (5 años) 0,38 - 0,44 38-44 Mujeres 0,37-0,43 37-43 Hombres 0,40-0,50 40-50 Resultados Rango de referencia La Tabla 9.6 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Valores bajos Los valores bajos se encuentran en pacientes que sufren de anemia. En los hombres con anemia de la fracción de volumen de eritrocitos es inferior a 0,4 y en las mujeres es inferior a 0,37 (hematocrito de 40% y 37%, respectivamente). Valores altos
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Los valores altos se encuentran en los casos de pérdida de plasma, quemaduras graves, deshidratación (como en las enfermedades diarreicas) y también (raramente) en policitemia. Relación entre la concentración del número de eritrocitos y la fracción de volumen de eritrocitos Normalmente, existe una relación lineal entre la concentración del número de eritrocitos y la fracción de volumen de eritrocitos. Si la concentración del número de eritrocitos es C x 1012 por litro, la fracción de volumen de eritrocitos estará normalmente en el intervalo (C - 0,2)/10 a (C -0.4)/10. Ejemplo: Si la concentración del número de eritrocitos es 5 X1012/l, la fracción de volumen de eritrocitos estará normalmente en el intervalo (5 - 0,2)/10 a (5 -0,4)/10, es decir, 0,48 hasta 0,46. En unidades tradicionales, la relación es similar, pero la fórmula para el cálculo es ligeramente diferente: si C es el recuento de eritrocitos, el hematocrito, como un porcentaje, estará normalmente en el rango de (C x10) - 2 a (C x10) - 4. Relación entre la fracción de volumen de eritrocitos y la concentración de hemoglobina Normalmente, existe una relación lineal entre la fracción de volumen de eritrocitos y la concentración de hemoglobina. La fracción de volumen de eritrocitos es aproximadamente 0.003 veces la concentración de hemoglobina cuando esta última se expresa en gramos por litro. Si la concentración de hemoglobina se expresa en términos de milimoles de hemoglobina (Fe) por litro, la fracción de volumen de eritrocitos es aproximadamente 0.05 veces la cifra de gramos por litro. Ejemplo: Una persona con una concentración de hemoglobina de 130 g/l tendrá normalmente una fracción de volumen de eritrocitos de 130 x 0.003 = 0,39. En términos de la hemoglobina (Fe), la concentración es de aproximadamente 8,0 mmol/l, y la fracción de volumen de eritrocitos será de aproximadamente de 8,0 x0.05 = 0,4. Información adicional que proporciona el ensayo de la fracción de volumen de eritrocitos Leucocitos (Glóbulos blancos) Examine la capa que forman los leucocitos inmediatamente arriba de la columna de glóbulos rojos (ver Fig. 9.34). En condiciones normales es sumamente delgada; cuando aparentemente sea gruesa, determine la concentración de número de leucocitos (ver sección 9.6). Esta capa será anormalmente gruesa si la concentración de número de leucocitos es superior a 20 x 109/l (20000 mm3). En casos de leucemia, en que la concentración de número de leucocitos puede ser de 100200 x 109/l (100 000-200 000 mm3), esta capa tendrá varios milímetros de espesor. Concentración media de hemoglobina en los eritrocitos La concentración media de hemoglobina en los eritrocitos es una medida del contenido promedio de esta sustancia en los glóbulos rojos. Se expresa en gramos de hemoglobina por litro o en milimoles de hemoglobina (Fe) por litro,* y se calcula dividiendo la concentración de hemoglobina de la sangre entre la fracción de volumen de eritrocitos. *Véase la nota sobre la forma de expresar la concentración de hemoglobina antes. Ejemplos (1) Si la hemoglobina se expresa en gramos de hemoglobina por litro: hemoglobina = 150 g/l; fracción de volumen de eritrocitos = 0,43 concentración media de hemoglobina en los eritrocitos = 150/0,43 = 349 g/l o (34,9%). (2) Si la hemoglobina se expresa en milimoles de hemoglobina (Fe) por litro: hemoglobina (Fe) = 9,3 mmol/l; fracción de volumen de eritrocitos = 0,43 concentración media de hemoglobina en los eritrocitos = 9,3/0,43 = 21,6 mmol/l (Nota: para convertir valores en g/l a valores en mmol/l multiplique por 0,062 06. Así, empleando el ejemplo anterior, 349 g/l x 0,062 06 = 21,6 mmol/l.) RESULTADOS Normalmente la concentración media de hemoglobina en los eritrocitos se encuentra entre los límites siguientes: (a) límite inferior: hemoglobina, 322 g/l o hemoglobina (Fe), 20 mmol/l; (b) límite superior: hemoglobina, 371 g/l o hemoglobina (Fe), 23 mmol/l. Cuando la cifra se halla entre estos límites se dice que los glóbulos rojos son "normocrómicos" (de color normal). Si los valores descienden debajo del límite inferior de los márgenes normales indicarán que los eritrocitos son "hipocrómicos" (de color menos intenso que el de los eritrocitos normales), como ocurre en las anemias hipocrómicas. Si los valores son más altos que el límite superior de los márgenes normales deberán despertar sospechas y se habrá de determinar nuevamente la concentración media de hemoglobina en los eritrocitos. La hemoglobina forma aproximadamente el 95% de la masa de eritrocitos. Los glóbulos rojos nunca son "hipercrómicos" (de color más intenso que el normal), pero pueden aumentar de tamaño y, en estas condiciones, contener mayor cantidad de hemoglobina que los eritrocitos normales; en este caso la concentración media de hemoglobina puede ascender hasta 380 g/l (hemoglobina (Fe) = 23,6 mmol/l), aunque nunca es superior a esta cifra. Unidades tradicionales En el sistema tradicional la concentración media de hemoglobina en los eritrocitos se denominaba "concentración de hemoglobina corpuscular media" (abreviándola generalmente como CHCM) y se expresaba por un porcentaje. Se calculaba dividiendo la concentración de hemoglobina de la sangre expresada en gramos por 100 ml entre el hematocrito expresado como un porcentaje y multiplicando por 100. Ejemplo: concentración de hemoglobina, 15,0 g/100 ml; hematocrito, 43%; concentración de hemoglobina corpuscular media = (15,0/43) x 100 = 34%. En este sistema los márgenes normales
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son de 32-37 % y los valores nunca ascienden a más de 38%. Si se obtiene un resultado así, la prueba debe repetirse. 9.4.2 Método de la Macroescala Principio La sangre (mezclada con anticoagulante) se coloca en un tubo graduado y se centrifuga para empaquetar a los eritrocitos. El nivel de la columna de eritrocitos se lee directamente en el tubo graduado (Fig. 9.36). Materiales y reactivos (Fig. 9.37) ● Centrífuga ● Tubos graduados especiales (tubos Wintrobe), 9,5 cm de largo con un diámetro interior de 0,6 cm, calibrados de 0 a 100 ● Pipeta Pasteur capilar fina larga (con una longitud suficiente como para llegar a la parte inferior del tubo) con perilla de goma ● Anticoagulante EDTA dipotásico, solución al 10% (reactivo. N º 22) o una solución Wintrobe (reactivo. N º 65). Método Colección de muestras 1. Se recoge una muestra de sangre venosa, como se describe en la sección 9.2 y se la agrega a un tubo graduado que contiene anticoagulante ((sal bipotásica de EDTA o solución de Wintrobe). 2. Usando la pipeta Pasteur capilar, llenar el tubo graduado con sangre hasta la marca de 100, asegurándose que no se formen burbujas de aire (Fig. 9.38). Técnica de medición 1. Colocar los tubos graduados en la centrífuga y centrifugar durante 30 minutos con una fuerza centrífuga de 2300 g. Si la longitud del brazo del rotor de la centrífuga (medida desde el eje de rotación hasta la base de la cubeta donde se aloja el tubo) es de 15 cm, se necesitarán 3600 rpm para lograr esta fuerza centrífuga; si el brazo es de 20 cm se necesitarán 3100 rpm. Importante: una fuerza centrífuga inferior a 2300 g producirá resultados falsos. 2. Mida el nivel en que la columna de eritrocitos se encuentra con la capa de leucocitos. Verifique que se usan las unidades de graduación adecuadas, que deberán llegar, ascendiendo, hasta el número 100. La cifra que se obtenga será un porcentaje ("hematocrito"); divídala entre 100 para obtener la fracción de volumen de eritrocitos. Resultados Consulte antes lo explicado para el método de la microescala. Los valores normales son iguales a los que se han indicado al tratar el método de microescala.
Figura 9.36 Principio de la macroescala para estimar la fracción de volumen de eritrocitos
Figura 9.37 Materiales para la estimación de la fracción de volumen de eritrocitos mediante la macroescala. Figura 9.38 Usando una pipeta Pasteur capilar de vidrio para llenar un tubo graduado con sangre.
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Figura 9.39 Medición del hematocrito.
9.5 ESTIMACIÓN DE
LA CONCENTRACIÓN DEL NÚMERO DE ERITROCITOS
El número de los eritrocitos contenidos en 1 litro de sangre se denomina concentración del número de eritrocitos. (En unidades tradicionales, que se expresa como el número de eritrocitos por milímetro cúbico y se le llama "recuento" de eritrocitos o glóbulos rojos.) Los métodos precisos para contar eritrocitos requieren de un sistema contador electrónico. Por desgracia, dichos instrumentos a menudo no están disponibles en los laboratorios periféricos. Es decir, para contar hematíes de manera más precisa se requiere de los automatizadores o contadores hematológicos automáticos y/o semiautomáticos. Un método simple pero mucho menos preciso utiliza una cámara de recuento en el que los eritrocitos se cuentan bajo el microscopio. Sin embargo, este método es de tan baja precisión que no se debe utilizar. Es difícil lograr determinaciones precisas de la concentración de número de eritrocitos con una cámara para recuento, y se recomienda que en vez de intentarlas se determinen la fracción de volumen de eritrocitos (hematocrito) (ver sección 9.4) y la concentración de hemoglobina (ver sección 9.3). Rango de referencia La Tabla 9.7 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Los valores altos Los pacientes que están deshidratados o tienen policitemia tendrán altas concentraciones número de eritrocitos. Valores bajos Los pacientes con anemia causada por la producción insuficiente, pérdida o hemólisis de los eritrocitos tendrán concentraciones de número de eritrocitos bajas. Nota: La anemia es un síndrome clínico que tiene muchas causas subyacentes. El cuadro clínico se determina por el grado y la duración de la anemia. Los síntomas van desde leve palidez y fatiga, dolor de cabeza, mareos e irritabilidad, al comportamiento incontrolado e incluso shock e insuficiencia cardíaca. La anemia puede deberse a: -Pérdida de sangre -Disminución de la producción de eritrocitos -Aumento de la destrucción de los eritrocitos. La causa más común de la anemia es la deficiencia de hierro. Otras causas comunes tales como la infección, la malaria, la malnutrición y las deficiencias vitamínicas generalmente contribuyen a la anemia en asociación con deficiencia de hierro. Otras causas de anemia son los siguientes: -Trauma -Infecciones parasitarias -Enfermedades del sistema endocrino -Enfermedades crónicas Errores innatos del metabolismo -Intoxicación. Tabla 9.7 Concentraciones número de eritrocitos normales, por grupo de edad Concentración del número de eritrocitos Grupo de edad Unidades del SI (por litro) Unidades tradicionales (por mm3) 12 Recién nacidos 5.0-7.0 x10 5.0–7.0 x106 12 Bebés (1-6 meses) 3.8–5.9 x10 3.8–5.9 x106 Niños (4 años) 3.8–5.4 x1012 3.8–5.4 x106 Mujeres 4.0-5.4 x1012 4.0-5.4 x106 12 Hombres 4.5–6.2 x10 4.5–6.2 x106
AGREGADO: A pesar de que el recuento de hematíes no se aconseja, se describe el recuento de glóbulos rojos considerando que existen lugares donde no es posible determinar la fracción de volumen o hematocrito.
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Fuentes: Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud 1ª edición 1980 Manual de Procedimientos de Laboratorio en Técnicas Básicas de Hematología, Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Salud Pública, República del Perú, Elaboración: T. M. María Muñoz Zambrano, Dra. Cecilia Morón Cortijo Principio La sangre se diluye por medio del líquido para diluir eritrocitos. Los eritrocitos se cuentan con el microscopio en una cámara para recuento y se calcula el número por litro de sangre. MATERIALES — Pipetas: (a) Una pipeta para sangre (conocida también como pipeta de Sahli) graduada hasta 0,02 ml (20 mm3 ó 20 µl), con tubo de goma y boquilla. No se recomienda el uso de pipetas con perilla, y a que son imprecisas, difíciles de emplear y limpiar, y más costosas. (b) Una pipeta de 5 ml, graduada. — Una cámara para recuento. Se pueden emplear diversos tipos de cámara; aquí se describe el uso de la cámara cuadriculada de Neubauer mejorada. — Líquido para dilución: solución de citrato y formaldehido. (También pueden usarse los líquidos diluyentes para recuento de Hayem, de Gower, etc.) — Un contador manual para recuento, si es posible. (“Cuenta ganado”) Método 1. Con la pipeta de 5 ml graduada deposite 4,0 ml (o 3,8 ml) del líquido para dilución en un frasco pequeño. 2. Aspire sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 ml de la pipeta para sangre. Evítese la entrada de burbujas. Si se emplea sangre venosa asegúrese que se mezcle adecuadamente con el anticoagulante del frasco, invirtiendo este varias veces durante 1 minuto inmediatamente antes de aspirarla con la pipeta. Limpie el exterior de la pipeta con papel absorbente. Verifique que la sangre continúa en el mismo nivel. También se puede usar una micropipeta de 20 µl en lugar de la pipeta de Sahli para aspirar la sangre. Asimismo, se debe limpiar el exterior del tip (punta) de la micropipeta. 4. Deposite la sangre en el frasco que contiene el líquido para dilución. Enjuague la pipeta aspirando y expulsando este líquido 3 veces. La dilución de la sangre será de 1 x 200. Ponga una etiqueta en el frasco, con el nombre o el número del paciente. 5. Ajuste el cubrecámara de vidrio en la cámara para recuento. Mezcle completamente la sangre diluida. Con una pipeta Pasteur llene las dos áreas cuadriculadas de la cámara. Evite llenar excesivamente las áreas cuadriculadas a fin de que la sangre no se derrame. 6. Deje reposar la cámara para recuento en la mesa de trabajo durante 3 minutos, de modo que las células se asienten. 7. Coloque la cámara en la platina del microscopio. Utilice el objetivo x 10, localice el cuadro central de la cámara y cambie en seguida al objetivo x 40 para contar los eritrocitos. Recuento de eritrocitos Por medio de una cámara de Neubauer mejorada: Cuente las células en un área de 0,2 mm2, empleando los cuadros A, B, C, D y E. Incluya en este recuento las células que se encuentren sobre las líneas de dos lados de cada cuadro revisado, como se indica a continuación: Este cuadro representa uno de los cinco en que se ha hecho el recuento, que son los cuadros A, B, C, D y E. (véase figura J). Calcule el número de células en un litro de sangre: — Multiplique por 0,01 el número de células que se han contado en los primeros cinco cuadros. — Haga lo mismo con el número de células que se han contado en los segundos cinco cuadros. — Obtenga el promedio de las dos cifras. — Notifique el resultado como "número x 1012/l” Ejemplo: Número de células contadas en (a) la primera cámara cuadriculada = 390 Número de células contadas en (b) la segunda cámara cuadriculada = 370 Células por litro en (a) = (390 x 0,01) x 1012 = 3,9 x 1012 Células por litro en (b) = (370 x 0,01) x 1012 = 3,7 x 1012 Promedio (resultado que se notifica) = 3,8 x 1012/l Explicación del cálculo Cada uno de los cinco cuadros en que se cuentan las células tiene un área de 0,04 mm2; por lo tanto, el área total es de 0,2 mm2. La profundidad de la cámara es de 0,1 mm; en consecuencia, el volumen en que se cuentan las células es de 0,2 x 0,1 = 0,02 mm3. De este modo, dividiendo entre 2 y multiplicando por 100 (o bien multiplicando por 50) se obtiene el número de células por mm3 de sangre diluida. Puesto que la dilución es de 1 x 200, al multiplicar por 200 se obtiene el número de células en 1 mm3 de sangre no diluida. Por último, en un litro hay un millón (106) de mm3, de manera que si la multiplicación se hace por 106 se obtiene el número de células en un litro de sangre sin diluir. Esto se puede resumir como se indica en seguida: Células por milímetro cúbico = células contadas x 50 x 200 = células contadas x 10000 Ya que la concentración de células es tan elevada, resulta más fácil expresarla en millones. células contadas x 10 000 Células por milímetro cúbico millones (células contadas x 0,01) millones (células contadas x 0,01) x 106 1 000 000 El número de células en un litro será 106 veces este número; por lo tanto: Células por litro = células contadas x 0,01 x 106 x 106 = células contadas x 0,01 x 1012 Ejemplo:
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En los primeros cinco cuadros se cuentan 390 células. Por lo tanto, el número de células en 1 mm3 de sangre sin diluir es 390 x 0,01 x 106 = 3,9 millones. La concentración por litro de sangre sin diluir es 390 x 0,01 x 1012, ó 3,9 x 1012 /l. USO DE LA PIPETA DE THOMA PARA EL RECUENTO DE HEMATÍES PIPETA DE GLÓBULOS ROJOS (DE THOMA) Presenta cerca del extremo superior una marca de 101, inmediatamente continúa una dilatación (bulbo) que contiene una perla roja mezcladora, luego sigue el tallo (extremo más largo), el cual está dividido en 10 partes con 2 marcas: 1 acabando el bulbo y 0,5 a la mitad del tallo. Se requiere igual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar. Con esta pipeta de Thoma para glóbulos rojos (que ya tiene la dilución 1/200) se hace el procedimiento sin necesidad de hacer una dilución en un tubo aparte con una pipeta graduada. Representa una alternativa al método anterior. Procedimiento 1 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar. 2 Llenar la pipeta de glóbulos rojos con sangre hasta la marca de 0,5 para realizar una dilución de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilución será 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. 3 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem) y llenar de líquido de dilución hasta la marca de 101. 4 Se coloca en un rotador automático o se hace rotar manualmente de 2 a 3 minutos. 5 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequeña cerca de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente. 6 Hacer el recuento con objetivo de 40x Cálculo de los resultados
A.1 SOLUCIÓN DE GOWER A.1.1 Reactivos Sulfato de sodio 12,5 g Ácido acético glacial 33,3 ml Agua destilada c.s.p 200 ml A.1.2 Procedimiento A.1.2.1Disolver el sulfato de sodio y el ácido acético glacial en el agua destilada. Guardar en lugar fresco. A.2 SOLUCIÓN DE HAYEM A.2.1 Reactivos Bicloruro de mercurio 0,5 g Sulfato de sodio 5,0 g Cloruro de sodio 1,0 g Agua destilada 200 ml A.2.2 Procedimiento A.2.2.1 Se mezclan todos los reactivos y se guarda en frasco de vidrio en lugar fresco.
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C
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F
E
G
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L A) Materiales y reactivos. B) Con la pipeta de 5 ml graduada deposite 4,0 ml (o 3,8 ml) del líquido para dilución en un frasco pequeño o en tubo. C) Aspire sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 ml de la pipeta para sangre (Sahli). D) Limpie el exterior de la pipeta con papel absorbente. Verifique que la sangre continúa en el mismo nivel. E) Deposite la sangre en el frasco que contiene el líquido para dilución (la dilución de la sangre será de 1 x 200.) F) Con una pipeta Pasteur llene las dos áreas cuadriculadas de la cámara. G) Coloque la cámara en la platina del microscopio. H) Por medio de una cámara de Neubauer mejorada: Cuente las células en un área de 0,2 mm2, empleando los cuadros A, B, C, D y E. I) Áreas donde se cuentan los hematíes (5 cuadros en rojo). En la ilustración se observa la ampliación de un cuadro para su mejor compresión. J) Este cuadro representa uno de los cinco en que se ha hecho el recuento, que son los cuadros A, B, C, D y E. Incluya en este recuento las células que se encuentren sobre las líneas de dos lados de cada cuadro revisado, como se indica en la ilustración (véase las flechas). K) Sentido de conteo de los hematíes (véase la flecha). Este camino recorrido para el recuento de los hematíes es el sugerido, ya que el operador puede escoger otra forma. L) Foto que muestra un cuadro para el recuento de hematíes.
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3 1) Ilustración que muestra las pipetas de Thoma para leucocitos (arriba) y hematíes (abajo). Nótese las marcas (graduación), en la de leucocitos la marca 0,5 y 11 (dilución 1/20), en la de hematíes 0,5, 1 y 101 (dilución 1/200). Dentro del bulbo de cada una contienen una perla mezcladora, en la de leucocitos es de color azul y en la de hematíes es de color rojo. 2) Ilustración que muestra la pipeta de Thoma para hematíes con sus marcas. 3) Foto que muestra una pipeta de Thoma para hematíes (arriba) donde se nota el bulbo con la perla roja mezcladora; una pipeta de Thoma para leucocitos (al medio, 3ª posición contando desde abajo); una pipeta de Sahli (en donde se logra apreciar la marca correspondiente a los 20 µl en color azul) (al medio); y una cámara de recuento de Neubauer mejorada (abajo). 9.6 Estimación de la concentración del número de leucocitos La concentración de número de leucocitos (glóbulos blancos) es el número de ellos que se encuentra en un litro de sangre. (En unidades tradicionales se expresa como el número de leucocitos por milímetro cúbico y se llama "recuento" de leucocitos o glóbulos blancos.) En ciertas enfermedades se modifica el número de leucocitos en la sangre. Por ejemplo, en la mononucleosis infecciosa y en las infecciones bacterianas hay un marcado aumento, mientras que en la fiebre tifoidea hay una marcada disminución. 9.6.1 Principio La sangre se deposita en un líquido para diluir leucocitos, que: — destruye los eritrocitos (hemólisis) — deja intactos los glóbulos blancos. A continuación se cuentan los leucocitos (glóbulos blancos) en una cámara para recuento, por medio del microscopio, y se calcula el número que existe en cada litro de sangre. 9.6.2 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Cámara de Neubauer mejorada, de preferencia con "línea brillante" (Fig. 9.40). Se pueden utilizar diferentes tipos de cámaras cuadriculadas, como la cámara Bürker pero la cámara Bürker rara vez se utiliza. Tape la cámara con la laminilla de vidrio especial que la acompaña. ● Pipeta para sangre (Sahli), graduada a la marca 50 µl (0,05 ml) con tubo de goma y boquilla. Puede usarse como alternativa una micropipeta de 50 µl. No se recomienda el uso de pipetas con perilla, que son imprecisas, difíciles de usar y limpiar, y más costosas. ● Pipeta graduada de 1 ml ● Pipeta Pasteur o un tubo capilar ● Contador manual (“cuenta ganado”) o contador con abalorios. Si es posible, use un contador manual. ● El líquido de dilución (preparado mediante la adición de 2 ml de ácido acético glacial en 1 ml de violeta de genciana, solución acuosa al 1%, y ajustando el volumen a 100 ml con agua destilada). Como alternativa se puede usar el líquido de Türk (reactivo Nº 61). Las dimensiones de la cámara de Neubauer mejorada son las siguientes: -Área = 9 mm2; -Profundidad = 0,1 mm. 9.6.3 Método 1. Con la pipeta graduada de 1 ml traslade 0,95 ml del líquido para dilución de leucocitos a un frasco pequeño. 2. Aspire sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,05 ml de la pipeta para sangre (Sahli). Evite la entrada de burbujas. Si la sangre es venosa asegúrese que se mezcle completamente invirtiendo el frasco que contiene esta sangre y el anticoagulante varias veces durante un minuto, inmediatamente antes de aspirarla con la pipeta. 3. Limpie el exterior de la pipeta con papel absorbente. Verifique que la sangre continúa en el mismo nivel (la marca de 0,05 ml) (Fig. 9.41). 4. Deposite la sangre en el frasco que contiene el líquido para dilución. Enjuague la pipeta aspirando y expulsando este líquido 3 veces. La dilución de esta sangre será de 1 en 20. Coloque en el frasco una etiqueta con el nombre o el número del paciente.
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5. Monte la laminilla de vidrio (cubrecámara) en la cámara para recuento, presionándola cuidadosamente para colocarla en su sitio. Cuando la laminilla se ha montado adecuadamente, entre las dos superficies de vidrio se observan unas bandas de color, llamadas anillos de Newton. 6. Mezcle bien la sangre diluida. Por medio de una pipeta Pasteur o un tubo capilar llene la cámara para recuento (fig. 9.42). Evite llenarla más allá del área cuadriculada. Importante: Si el líquido se derrama en el canal que se encuentra entre las dos cámaras, la operación se deberá repetir: quite y limpie la laminilla de vidrio; limpie también la cámara para recuento y llénela con otra gota. 7. Deje reposar la cámara para recuento sobre la mesa de trabajo durante 3 minutos a fin de que las células se asienten. 8. Coloque la cámara en la platina del microscopio. Utilice el objetivo x 10 (con ocular x 10). Reduzca la cantidad de luz que entre en el condensador, ajustando el diafragma iris. Enfoque la cuadrícula de la cámara y los leucocitos. No se confundan los leucocitos con partículas de polvo. Cuente las células en un área de 4 mm2 de la cámara utilizando los cuadros numerados de las esquinas 1, 3, 7 y 9, como se indica en la figura 9.43. Incluya en este recuento las células que se observen sobre las líneas de dos lados de cada cuadro revisado, como se indica a continuación en la figura 9.44: Este cuadro representa uno de los cuatro revisados, es decir, los cuadros 1,3, 7 y 9. 9. Calcule el número de células en un litro de sangre: * — Multiplique el número de células contadas en los cuatro cuadros por 0,05 — Notifique el resultado como "número x 109/l” Ejemplo: Número de células contadas = 188 Células que hay en un litro = (188 x 0,05) x 109 Resultado que se notifica: 9,4 x 109/l Explicación del cálculo Cada uno de los cuatro cuadros en que se cuentan las células tiene un área de 1 mm2; por lo tanto, toda el área mide 4 mm2. La profundidad de la cámara es de 0,1 mm; en consecuencia, el volumen en que se cuentan las células es 4 x 0,1 = 0,4 mm3. De este modo, la división entre 4 y la multiplicación por 10 dará el número de células que haya en 1 mm3 de sangre diluida. Ya que la dilución es de 1 en 20 (1/20), la multiplicación por 20 dará el número de células en 1 mm3 de sangre sin diluir. Por último, en un litro hay un millón (106) de milímetros cúbicos, de manera que la multiplicación por 106 dará el número de células por litro de sangre sin diluir. Esto se puede resumir como se indica a continuación: Ejemplo: Un total de 188 leucocitos se cuentan en los cuatro cuadros. Por lo tanto, el número de leucocitos por milímetro cúbico de sangre sin diluir es: 188 x 10 x 20 ( 188 x 50 9400) 4 Y el número por litro es: 9400 x 10 6 9,4 x 10 9
Fig. 9.41
A
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B
C
D
Figura 9.40 Cámara de recuento de Neubauer mejorada. Figura 9.41 Comprobación de que la sangre todavía está en la marca. Se observa la flecha indicando el sentido de aspiración y la comprobación de la marca. A) Colocando el cubrecámara en la cámara de Neubauer. Figura 9.42 Llenado de la cámara de recuento. Figura 9.43 Uso de la cámara de Neubauer mejorada. En una esquina (la 1) se indica el sentido de conteo. En 1, 3, 7 y 9 se realizan el conteo de leucocitos, es decir, en las 4 esquinas. B) Imagen del retículo de la cámara de Neubauer en donde se muestra en celeste las áreas de conteo de leucocitos, y en rojo las áreas de recuento de hematíes. C) Otra imagen del retículo de Neubauer donde se indica las áreas de conteo de leucocitos (L). D) Ilustración que muestra una de las esquinas del retículo de la cámara de Neubauer y al lado una foto de los leucocitos en esta esquina
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(cuadrado). Figura 9.44 Contando leucocitos con la cámara de Neubauer mejorada. Se muestra una esquina con los leucocitos dentro, además se señalan con flechas los leucocitos que deben ser contados y los que deben obviarse cuando están sobre la línea. Incluya en este recuento las células que se encuentren sobre las líneas de dos lados de cada cuadro revisado, como se indica en la ilustración (véase las flechas). 9.6.4 Resultados Rango de referencia Los rangos de referencia para los diferentes grupos de edad se presentan en la Tabla 9.8. Valores elevados El aumento del número total de leucocitos circulantes se llama leucocitosis. Se observa en el curso de algunas infecciones bacterianas piógenas. En la leucemia se pueden encontrar concentraciones de número de leucocitos que varían desde 50 x 109/l hasta 400 x 109/l (50000/mm3 a 400 000/mm3) y aún más. Por lo tanto, se necesita emplear una dilución mayor de sangre para determinar la concentración de número; por ejemplo, 0,05 ml de sangre y 1,95 ml del líquido para dilución, de modo que se obtenga una dilución de 1 en 40. Si se emplea esta dilución el número de células contadas se deberá multiplicar por 0,1 en vez de 0,05 para obtener el número por 109 por litro (si se usan unidades tradicionales, multiplique por 100 en vez de 50 para obtener el número por mm3). Valores reducidos La disminución del número total de leucocitos circulantes se denomina leucopenia. Se observa en algunas infecciones como la tifoidea y el paludismo, y después de usar durante cierto tiempo algunos medicamentos. Cuando la concentración de número de leucocitos es muy reducida, el grado de dilución de la sangre deberá ser menor; por ejemplo, 0,05 ml de sangre y 0,45 ml del líquido para dilución, con lo que se obtendrá una dilución de 1 en 10. Si se emplea esta dilución, el número de células contadas se deberá multiplicar por 0,25 en vez de 0,05 para obtener el número por 109 por litro (si se usan unidades tradicionales multiplique por 25 en vez de 50 para obtener el número por mm3). Tabla 9.8 concentraciones número de leucocitos normales, por grupo de edad Concentración del número de leucocitos Grupo de edad (por litro)a Recién nacidos 10-20 x109 Bebés (3-9 meses) 4-15 x109 Niños (de 3 años) 4-11 x109 Niños (10 años) 4-10 x109 Adultos 4-10 x109 a La referencia puede ser diferente en ciertas poblaciones autóctonas Corrección de valores para restar eritrocitos nucleados Los glóbulos rojos nucleados, o normoblastos (específicamente se denomina eritroblasto ortocromatófilo) (véase la Fig. 9.90), no se encuentran normalmente en la sangre, son precursores de los hematíes. Sin embargo, pueden aparecer en ella durante ciertas enfermedades como la anemia falciforme y otras anemias hemolíticas. Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el líquido para dilución y, por lo tanto, se suelen contar junto con los leucocitos. Los elementos nucleados no son lisados, los elementos formes anucleados (hematíes, plaquetas) sí sufren la lisis por los lisantes del método manual, y los de los contadores hematológicos automáticos y semiautomáticos. Es más correcto hablar de precursores eritropoyéticos nucleados (recuerde que el reticulocito y el hematíe ya no tienen núcleo) que en el caso de la eritropoyesis son todos nucleados hasta el inmediato anterior al reticulocito. En humanos, el proceso de producción de eritrocitos o glóbulos rojos pasa por varios estados eritroblásticos. En la línea de eritropoyesis el primer eritroblasto presente en humanos, que proviene del proeritroblasto, se denomina eritroblasto basófilo. Del eritroblasto basófilo se diferencia el eritroblasto policromatófilo. El siguiente estado en la transformación es el eritroblasto ortocromático, eritroblasto ortocromatófilo o normoblasto. El normoblasto sufre la pérdida del núcleo (que es fagocitado por macrófagos) dando lugar al reticulocito o eritrocito inmaduro. Tras unos días de maduración en la médula ósea finalmente la abandona entrando en el torrente sanguíneo y pasando a ser un eritrocito maduro. Dicho esto, entonces, es más apropiado hablar de corrección del recuento de leucocitos por la presencia de Eritroblastos en sangre periférica, detectados en un frotis sanguíneo teñido con Romanowski o May Grünwald – Giemsa. Recuerde que cualquiera de estos eritroblastos puede llegar a aparecer en sangre periférica en ciertos estados patológicos y no solamente el Normoblasto. Los normoblastos y otros precursores eritroides nucleados son detectados por el examen microscópico de una extensión sanguínea teñida con los métodos de tinción apropiados (Romanowski, May Grünwald – Giemsa). Luego estos eritoblastos son contados e informados en el mismo papel o informe que en el de la “fórmula leucocitaria” y se los coloca como dentro de las alteraciones observadas en la serie roja y no forman parte de la fórmula leucocitaria porque no pertenecen a la serie blanca. Ahora, sí son tenidos en cuenta en el recuento de leucocitos porque no se lisan como estos y pasan a formar parte del recuento total de los glóbulos blancos. Esto lleva a la corrección del número de leucocitos porque se cuentan como leucocitos más eritroblastos, y las máquinas y el recuento manual no están preparados para distinguirlos y diferenciarlos. Es decir, no discriminan y los cuenta a los dos como “iguales” aunque no lo sean. Cuando la cantidad de normoblastos es elevada y los leucocitos se contaron usando un contador de células completamente automatizado (automático) o semi-automatizado (y también por conteo manual en cámara), la concentración de número de leucocitos se debe corregir como se indica en seguida:
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Examine una extensión sanguínea teñida con el método de Romanowski (véase la sección 9.10) y cuente el número de normoblastos que se observe por cada 100 leucocitos. Nota: Este cálculo de corrección también es válido para cuando se observan Eritroblastos (precursores de los hematíes) ya que estos también son nucleados. Cálculo: La concentración de número de normoblastos (por litro) es: número de normoblastos contados x Concentración de N º de leucocitos 100 N º de normoblastos contados Ejemplo Si se cuentan 50 normoblastos y la concentración de número de leucocitos es 16 x 109/l, la concentración de número de normoblastos será: 50 x16 5.3x10 9 / l 100 50 y la concentración de número de leucocitos corregida será: (16 5.3) x 10 9 / l 10.7 x10 9 / l En unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitos se expresan por milímetro cúbico. En tales unidades el cálculo correspondiente al ejemplo que se ha dado sería: 50 x16 000 5300 / ml 100 50 Recuento corregido de leucocitos: (16 000 – 5300) = 10 700/ mm3.
AGREGADO: Fuentes: Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud 1ª edición 1980 Manual de Procedimientos de Laboratorio en Técnicas Básicas de Hematología, Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Salud Pública, República del Perú, Elaboración: T. M. María Muñoz Zambrano, Dra. Cecilia Morón Cortijo MÉTODO ALTERNATIVO USANDO LÍQUIDO DE TÜRK El recuento de leucocitos manual también se puede hacer usando líquido diluyente de Türk (reactivo Nº 61) en vez del mencionado anteriormente (con violeta de genciana). Este líquido también usa ácido acético y como colorante azul de metileno. El ácido acético produce la lisis de los hematíes pero preserva intactos a los leucocitos. El método es similar al anterior, también se hace una dilución de 1/20, pero con la excepción que aquí se puede usar otra proporción de volúmenes: 20 µl para 0,38 ml (1/20). El resto de la técnica es similar, asimismo el conteo. A los 20 µl se los puede cargar con una pipeta de Sahli para 20 µl o usando una micropipeta de 20 µl; el volumen de 0,38 ml puede ser medido con una pipeta graduada de 1 ml. De cualquier manera, se hace la dilución en un tubo de Khan, de hemólisis o en un tubo de ensayo corto. Solución de Türk (núm. 61) Ácido acético glacial 4 ml Solución de azul de metileno (N º 39) 10 gotas Cantidad suficiente de agua destilada 200 ml También se puede hacer el recuento manual con una pipeta de Thoma para leucocitos, ya que en la misma pipeta se produce la dilución 1/20. USO DE LA PIPETA DE THOMA PARA EL RECUENTO DE LEUCOCITOS PIPETA DE GLÓBULOS BLANCOS (DE THOMA) Presenta cerca del extremo superior una marca de 11, inmediatamente continúa una dilatación (bulbo) que contiene una perla que funciona como mezcladora, luego sigue el extremo más largo de la pipeta (tallo) que está dividida en 10 partes, con 2 marcas: 1 (parte final del bulbo) y 0,5 (a la mitad del tallo). Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombilla para aspirar. Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar del dedo, se procede a aspirar la sangre con la pipeta de glóbulos blancos hasta la marca de 0,5 y a limpiar la punta con papel absorbente. Introducir la pipeta en el tubo que contenga solución de Türk y absorber hasta la marca de 11 (no debe haber burbujas). Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en un rotador automático por 2 ó 3 minutos. Monte la laminilla de vidrio en la cámara para recuento que debe estar limpia y seca. Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocar una gota pequeña de esta solución en la cámara. Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las células se sedimenten. Enfocar con objetivo de 10 x y contar en 4 cuadrados grandes angulares. Uso de una micropipeta semiautomática Cuando se usa la micropipeta semiautomática, se toma 20 µl (0,02 ml) de sangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante y se diluye en un tubo que contenga 0,38 ml de solución de Türk (aquí tenemos una dilución 1:20). Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar del dedo, se procede a aspirar la sangre con la pipeta de glóbulos blancos hasta la marca de 0,5 y a limpiar la punta con papel absorbente.
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4 3 Varias imágenes que representan a la pipeta de Thoma para glóbulos blancos. 1) Pipetas de Thoma para hematíes y leucocitos. La pipeta de Thoma para leucocitos se encuentra abajo. Nótese la marca 11 y 0,5. 2) Ilustración de pipetas de Thoma para leucocitos (arriba) y hematíes (abajo). Nótese la marca 11 y 0,5 en la pipeta de leucocitos. 3) Las pipetas de Thoma para leucocitos se ubican a la izquierda de la figura, a la derecha las de glóbulos rojos. 4) La pipeta de Thoma para leucocitos se ubica abajo. Nótese la goma y la boquilla. 9.7 MEDICIÓN DE
LA
VELOCIDAD
DE SEDIMENTACIÓN DE LOS ERITROCITOS
(VSE)
9.7.1 Principio La sangre recogida en un recipiente que contiene un anticoagulante se deposita en un tubo largo y graduado, que se mantiene en posición vertical. Los eritrocitos se sedimentan en el fondo del tubo y sobre este sedimento se forma una columna de plasma. La altura de la columna de plasma, medida después de una hora, indica la velocidad de sedimentación de los eritrocitos (glóbulos rojos). La velocidad de sedimentación de los eritrocitos también es llamada velocidad de sedimentación globular y eritrosedimentación. Se los considera sinónimos. 9.7.2 Materiales y reactivos (Fig. 9.45) ● Un tubo o “pipeta” de Westergren para medir la VSE: -de 2,5 mm de diámetro interior, graduado de 0 a 200 mm (con frecuencia, la graduación es de 1 a 20, en que 1 equivale a 10, 2 a 20, etc.) ● Soporte para pipeta o tubo de Westergren ● Soporte para pipeta o tubo de Westergren ● Tubos de ensayo ● Jeringa graduada, 5 ml ● Pipeta graduada, 5 ml ● Temporizador ● Anticoagulante: citrato sódico, solución de 3,2% (reactivo n º 60) (conservar en el frigorífico) o la sal EDTA dipotásico, solución al 10% (reactivo n º 22.). En varios países de Hispanoamérica se utiliza la solución de citrato trisódico en proporción de 38 g/l (3,8%), la que también se deberá conservar en el frigorífico. 9.7.3 Método 1. En un tubo o frasco deposite: - 0,4 ml de la solución de citrato trisódico 2. Extraiga sangre venosa (ver sección 9.2).* Ponga el torniquete tan flojo como sea posible puncione le vena inmediatamente y suelte el torniquete. Aspire con la jeringa: - 2 ml de sangre. *En este ensayo también se puede emplear sangre que se haya recogido anteriormente en un frasco que contenga sal bipotásica de EDTA. 3. Desmonte la aguja de la jeringa y deposite 1,6 ml de sangre en el frasco con anticoagulante (este frasco tendrá una marca al nivel de los 2,0 ml) (Fig. 9.46). Agite con suavidad. La medición de la VSE se deberá efectuar menos de dos horas después de que se haya obtenido la sangre. 4. Aspire la sangre con citrato y deposítela en el tubo de Westergren (si es posible, empleando una propipeta de goma) hasta la línea 0 (Fig. 9.47). 5. Coloque el tubo en la gradilla de Westergren, asegurándose de que se encuentre en posición completamente vertical (Fig. 9.48). Confirme que no hay burbujas en el interior del tubo.
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Verifique que el soporte se halle en un plano completamente horizontal. 6. Dejar el soporte con el tubo de Westergren en una mesa alejado de las vibraciones (por ejemplo, no ponerlo en la misma mesa de la centrífuga), libre de corrientes de aire, también que no esté cerca de un radiador de calefacción central y no dejar en la luz solar directa. 7. Espere durante una hora (ajuste el temporizador para ese tiempo (1 hora) y esperar que suene la campanilla o alarma) y a continuación tome nota de la altura de la columna de plasma según la graduación milimétrica del tubo a partir de la línea 0, del extremo superior (Fig.9.49). 9.7.4 Resultados El resultado se expresa en milímetros por hora (mm/h). Rango de referencia La Tabla 9.9 muestra los valores de referencia para adultos. Nota: Si el paciente está deshidratado, la medición del ESR tiene poco valor. Valores altos Cualquier enfermedad que produzca cambios en las proteínas plasmáticas aumentará la VSE. Estas incluyen a las infecciones agudas y crónicas, infartos de miocardio y la artritis reumatoide. La ESR también es mayor en los pacientes que sufren de anemia (ver páginas anteriores). Asimismo, se encuentran valores muy altos de VSE en la tuberculosis, la tripanosomiasis y las enfermedades malignas. La VSE también está elevada en el embarazo. Temperatura del ensayo La VSE aumenta con la temperatura (a partir de 23°C). En los países cálidos se debe vigilar que la gradilla de Westergren no se coloque en un lugar caluroso del laboratorio (por ejemplo, bajo la luz del sol). Lavado de los tubos de Westergren Enjuague los tubos con agua y a continuación déjelos en remojo en agua limpia durante 12 horas. Déjelos secar completamente (si es posible, en una incubadora, a 37 °C). No utilice polvos para lavar, ácidos o etanol. Tabla 9.9 Velocidad de sedimentación de eritrocitos (VSE)a, por grupo de edad Grupo de edad VSE (mm/hora) Adultos (<50 años) Hombres <15 Mujeres < 20 Adultos (> 50 años) Hombres ≥ 20 Mujeres ≥ 30 a A una temperatura ambiente de 25 ° C.
Fig. 9.45
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Fig. 9.49 Figura 9.45 Materiales para la medición de la VSE. Figura 9.46 Adición de una muestra de sangre a la solución de citrato trisódico. Figura 9.47 Aspirando sangre citratada hasta la marca de 0 mm del tubo de Westergren. Figura 9.48 Colocando el tubo de Westergren en el soporte. Figura 9.49 Medición de la altura de la columna de plasma.
B
A
C
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E D A) y B) Soportes para tubos de Westergren. Dos diferentes modelos. C) y D) Tubos o pipetas de Westergren. E) Propipeta de goma.
AGREGADO: SISTEMA COMERCIAL DE VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN DE ERITROCITOS El Kit Eritub es un sistema de eritrosedimentación semicerrado que consta de 100 pipetas regladas (WESTERGREN) y 100 tubos preparados con de Citrato de Na a 3,8 g% para un volumen de muestra de 1,0 ml. Este es un sistema comercial que usa tubos plásticos en vez de vidrio para la eritrosedimentación. Se lo plantea como de un solo uso. Quizás no está extendido su uso hacia lugares distantes como en centros de salud periféricos, pero es una opción para la determinación de la eritrosedimentación. FORMA DE USO
Tubo con tapón troquelado (Fig. 1). Introduzca el cono de la jeringa con muestra a través del tapón (Fig. 2). Dispense hasta el nivel adecuado (Fig. 3). Mezclar invirtiendo suavemente el tubo para impedir la formación de espuma (Fig. 4). Una vez que la muestra llega al Laboratorio, homogeneizar; introduzca la pipeta firmemente en el tubo atravesando el tapón (Fig. 5); una vez hecho esto, la columna de sangre ascenderá hasta alcanzar el “0” (Fig. 6). El exceso de muestra se descargará en el rebalsador de seguridad (Fig. 7), el cual cumple la doble función de enrasar correctamente dicha muestra y evitar salpicaduras. Por último coloque el conjunto en la gradilla-soporte (Fig. 8). Lea luego de pasada 1 hora. Fuente: http://www.dvs.com.ar 9.8 MEDICIÓN DEL
TIEMPO DE SANGRADO :
MÉTODO
DE
DUKE
9.8.1 Principio Con una lanceta se hace una pequeña incisión en el lóbulo de !a oreja. La sangre fluye por esta incisión y se mide el tiempo que transcurre hasta que se detiene el sangrado. Este ensayo se lleva a cabo: - para diagnosticar ciertos padecimientos hemorrágicos; - antes de realizar operaciones quirúrgicas; - antes de efectuar una punción del hígado o el bazo. 9.8.2 Materiales y reactivos ● Lancetas estériles ● Portaobjetos ● Papel de filtro (o papel absorbente)
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● Cronómetro, si está disponible, de lo contrario un reloj con segundero ● Éter. 9.8.3 Método 1. Limpie suavemente el lóbulo de la oreja con un algodón y éter (Fig. 9.50). No frote. Deje que se seque. 2. Perforar el lóbulo de la oreja (Fig. 9.51). La sangre debe fluir libremente, sin ninguna necesidad de apretar el lóbulo de la oreja. Inicie el cronómetro. 3. Después de 30 segundos recoja la primera gota de sangre en una esquina del papel de filtro (o papel absorbente) (Fig. 9.52). No toque la piel con el papel. 4. Espere 30 segundos más. Recoger la segunda gota de sangre de la misma manera, un poco más lejos a lo largo de la tira de papel (Fig. 9.53). 5. Continuar para recoger una gota más de sangre cada 30 segundos. Las gotas se vuelven progresivamente más pequeñas (Fig. 9.54). 6. Cuando no aparezca más sangre, detener el cronómetro (o anote el tiempo transcurrido en el reloj). Otro método consiste en contar el número de gotas sobre el papel de filtro (o papel secante) y se multiplica por 30 segundos (Fig. 9.55). Por ejemplo: hay siete gotas. El tiempo de sangrado es de 7 x 30 segundos = 3,5 minutos. 9.8.4 Resultados Comunique el tiempo de sangrado redondeándolo al medio minuto más cercano. Mencionar también el rango de referencia para el método utilizado. Ejemplo: tiempo de sangrado 3,5 minutos (rango normal, Método de Duke: 1-5 minutos). Si el tiempo de sangrado se prolonga examine una extensión de sangre teñida según el método de Romanowski (véase la sección 9.10) para observar si las plaquetas son escasas (se debe usar sangre venosa).
Figura 9.50 Limpieza del lóbulo de la oreja con éter. Figura 9.51 Haciendo una incisión en el lóbulo de la oreja con una lanceta estéril.
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Figura 9.52 Después de 30 segundos, recoger la primera gota de sangre. Figura 9.53 Después de 1 minuto, recoger la segunda gota de sangre. Figura 9.54 Continuar para recoger una gota más de sangre cada 30 segundos. Figura 9.55 Cálculo del tiempo de sangrado. 9.9 OBSERVACIÓN DE
LA RETRACCIÓN DEL COÁGULO Y LA MEDICIÓN DEL TIEMPO DE LISIS
9.9.1 Principio Los tubos de ensayo que contienen la sangre se utilizan para: - observar la retracción del coágulo - medir el tiempo en que el coágulo se disuelve (lisis). Estas observaciones se hacen para establecer el diagnóstico de ciertos padecimientos hemorrágicos. 9.9.2 Materiales ● Tubos de ensayo de vidrio, 75 mm x 10 mm, marcados para alojar a 1 ml ● Temporizador ● Gradilla metálica ● Baño maría ● Los materiales para la realización de la punción venosa (ver sección 9.2.2). 9.9.3 Método Colección de muestras Se recoge una muestra de sangre venosa de pacientes como se describe en la sección 9.2. No agregue anticoagulante para los tubos en los que usted recoge la sangre. 1. Coloque en el baño maría los tubos que contienen la sangre a 23 °C (o déjelos a la temperatura ambiente). Examine el coágulo: - a la hora - a las 2 horas - a las 3 horas - a las 4 horas. Normalmente el coágulo sigue siendo sólido durante las primeras 4 horas, si bien comienza a retraerse por lo general desde la primera hora. 2. Examine el coágulo cuando hayan transcurrido 4 horas. Después de 4 horas, el coágulo se retrae completamente, y la masa de glóbulos rojos se hallará separada del suero amarillo (Fig. 9.56). 9.9.4 Resultados (a) Retracción normal El coágulo rojo se separa completamente y en su parte más alta se adhiere a la superficie interior del tubo de ensayo (Fig. 9.58).
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En el fondo del tubo se suele formar un pequeño sedimento de glóbulos rojos; su espesor no debe ser mayor de 5 mm. (b) Retracción anormal Sangre deficiente en fibrinógeno 1. En el fondo del tubo se forma un pequeño coágulo rojo que solo algunas veces se adhiere a la superficie interior. Se rodea de glóbulos rojos y por arriba lo cubren el plasma y el suero (Fig. 9.59). - En este caso existe en la sangre una deficiencia de fibrinógeno. Sangre deficiente en trombocitos 2. Se forma un coágulo rojo que se adhiere casi completamente a la superficie interior del tubo y a veces se retrae un poco. El exudado de suero es sumamente reducido (Fig. 9.60). - Existe una deficiencia de plaquetas en la sangre. (Prepare una extensión sanguínea venosa, teñida con la técnica de Romanowski y examínela como se ha indicado en la sección 9.10). Proteínas plasmáticas anormales 3. Puede que se produzca un coágulo amarillo, es plasma coagulado. Inmediatamente debajo se observa un coágulo rojo ligeramente retraído (Fig. 9.61). - La coagulación del plasma obedece a la presencia de proteínas plasmáticas anormales. Hemofilia 4. Puede ocurrir que no se forme coágulo alguno, o bien se produzca muy lentamente un coágulo amarillo sobre el sedimento de glóbulos rojos (Fig. 9.62). - Si es así, existe una grave deficiencia del factor de coagulación, como se observa en la hemofilia. La hemofilia en una enfermedad hemorrágica hereditaria que solo afecta individuos de sexo masculino. Notifique la retracción del coágulo de la manera siguiente: - normal, o -anormal, con una descripción completa del coágulo. Tiempo en que sobreviene la lisis Examine el coágulo: - después de 12 horas - después de 24 horas - después de 48 horas - después de 72 horas Hasta que ocurra la lisis; es decir, hasta que el coágulo se disuelva completamente y los glóbulos rojos se sedimenten en el fondo del tubo de ensayo. Tiempo normal de lisis del coágulo: 12 horas o más. Disminución del tiempo de lisis del coágulo: 1 - 48 horas. En algunas afecciones fibrinolíticas agudas el coágulo se puede disolver en 1 - 4 horas. Comunique en horas el tiempo transcurrido hasta que sobrevino la lisis del coágulo.
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Figura 9.56 Después de 4 horas, examinar el coágulo. Figura 9.57 Lisis. Figura 9.58 Retracción normal del coágulo. Figura 9.59 Sangre deficiente en fibrinógeno. Figura 9.60 sangre deficiente en trombocitos. Figura 9.61 sangre que contiene proteínas plasmáticas anormales. Figura 9.62 Hemofilia.
AGREGADO: TIEMPO DE COAGULACIÓN DE LA SANGRE ENTERA: (Método de Lee y White) Principio Se recoge sangre venosa en un tubo de ensayo. Se toma nota del tiempo que tarda la sangre para coagularse. La utilidad de este ensayo es limitada, ya que solo sirve para detectar deficiencias graves del factor de coagulación. Materiales Dos tubos de ensayo limpios, de 75 x 10 mm, del mismo calibre, marcados en el nivel de 1 mm Un cronómetro Un baño maría a 37°C, o un matraz al vacío, con agua a la misma temperatura Utensilios y materiales para punción venosa. Método 1. Mediante una jeringa de material plástico extraiga poco más de 2 ml de sangre venosa. Puncione la vena rápidamente, de la manera adecuada. Póngase a funcionará cronómetro tan pronto como la sangre comience a entrar en la jeringa. 2. Llene con esta sangre cada uno de los dos tubos de ensayo hasta la marca de 1 ml. Tapone ambos tubos con algodón no absorbente. Coloque los tubos en el baño maría a 37°C (o en el matraz al vacío, con la misma temperatura). 3. Después de 3 minutos saque el primer tubo del baño maría. Incline el tubo hasta un plano de 45º para observar si la sangre se ha coagulado. 4. Si la sangre no se ha coagulado coloque el tubo otra vez en el baño maría y examínelo cada 30 segundos hasta que sobrevenga la coagulación. 5. Examine el segundo tubo inmediatamente después que se haya coagulado la sangre del primero. Por lo general, la sangre del segundo tubo se coagula muy rápidamente después que lo ha hecho la sangre del primero. Detenga el cronómetro o tome nota del tiempo transcurrido. Se notifica como tiempo de coagulación de la sangre el correspondiente al segundo tubo. Resultados Registre el tiempo de coagulación en minutos, redondeándolo al medio minuto más cercano. Márgenes normales 5 – 12 minutos. Si el tiempo de coagulación se prolonga, envíe al paciente a un centro especializado a fin de que se amplíe la investigación.
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6 5 1) Materiales. 2) Mediante una jeringa de material plástico extraiga poco más de 2 ml de sangre venosa. Puncione la vena rápidamente, de la manera adecuada. Póngase a funcionará cronómetro tan pronto como la sangre comience a entrar en la jeringa. 3) Llene con esta sangre cada uno de los dos tubos de ensayo hasta la marca de 1 ml. Tapone ambos tubos con algodón no absorbente. Coloque los tubos en el baño maría a 37°C (o en el matraz al vacío, con la misma temperatura). 4) Después de 3 minutos saque el primer tubo del baño maría. 5) Incline el tubo hasta un plano de 45º para observar si la sangre se ha coagulado. Si la sangre no se ha coagulado coloque el tubo otra vez en el baño maría y examínelo cada 30 segundos hasta que sobrevenga la coagulación. 6) Examine el segundo tubo inmediatamente después que se haya coagulado la sangre del primero. Por lo general, la sangre del segundo tubo se coagula muy rápidamente después que lo ha hecho la sangre del primero. Detenga el cronómetro o tome nota del tiempo transcurrido. Se notifica como tiempo de coagulación de la sangre el correspondiente al segundo tubo. 9.10 PREPARACIÓN Y TINCIÓN DE EXTENSIONES SANGUÍNEAS FINAS 9.10.1 Principio a) Preparación de extensiones de sangre Principio La extensión se prepara repartiendo uniformemente una gota pequeña de sangre sobre un portaobjetos de manera que solo se deposite una capa de células. Después de teñirlas, las extensiones de sangre se usan: Para determinar las fracciones de número de los tipos de leucocitos (ver sección 9.13) Para detectar glóbulos rojos anormales (ver sección 9.10.4) Para identificar ciertos parásitos (ver sección 4.7) La estimación del número de trombocitos (véase la sección 9.14). b) Tinción de extensiones de sangre Principio Las extensiones de sangre se colorean con las tinciones de Romanowski, que contienen azul de metileno, azur B esencial y eosina. Entre las tinciones de Romanowski más ampliamente usadas figuran: — La de Leishman y la de Wright, que proporcionan resultados similares y se emplean como tinciones individuales — La de May-Grünwald y la de Jenner, cuyos resultados son semejantes y se emplean con la tinción de Giemsa — La de Giemsa, que se puede usar como tinción individual o junto con la de May-Grünwald o la de Jenner — Las de Field, A y B, que se preparan con agua a diferencia de las otras tinciones mencionadas, que se elaboran con metanol. Las tinciones de Field se usan por igual en extensiones de sangre y de gota gruesa. El colorante de Romanowski con metanol se puede utilizar para fijar las extensiones antes de diluirlo en los portaobjetos para la tinción. Los mejores resultados se obtienen haciendo primero la fijación con metanol y coloreando a continuación con colorantes diluidos, preparados anticipadamente como se indica más abajo. 9.10.2 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos (Los portaobjetos que se habrán de usar para extensiones sanguíneas se lavarán minuciosamente y, si es necesario, se limpiarán con una pieza de tela suave embebida en una mezcla de etanol y éter (Fig. 9.63)). ● Lámpara de alcohol o mechero Bunsen ● Extensor de vidrio (véase más adelante) ● Lanceta estéril para sangre ● Dos varillas de vidrio, ya sea en un fregadero o en una cubeta de tinción ● Probetas, 50 ml o 100 ml ● Vasos de precipitados y frascos que contengan agua limpia del grifo ● Pisetas con agua tamponada (reactivo. N º 15) ● Un temporizador para marcar los intervalos (ya sea mecánico o digital electrónico a baterías) ● Soporte para portaobjetos deslizante para secar las extensiones teñidas ● Tinción de Field (reactivo no. 25) ● Giemsa (reactivo. N º 29) ● Tinción de Leishman (reactivo. Hay 34) ● Tinción de May-Grünwald (reactivo. N º 38) ● sal dipotásica de EDTA, solución al 10% (reactivo no. 22) ● Metanol ● Etanol al 70% o éter. Cómo hacer un instrumento para extender el frotis (Extensor) (Fig. 9.64)
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1. Seleccione un portaobjetos cuyos bordes estén completamente lisos. 2. Con una sierra pequeña marque diagonalmente hasta cierta profundidad dos esquinas de uno de los extremos del portaobjetos. 3. Corte estas dos esquinas.
A
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B
C
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D Figura 9.63 Limpiando los portaobjetos para ser usados en extensiones finas de sangre. Figura 9.64 Haciendo un extensor de vidrio. A) Obtenga La sangre: del dedo cordial o el anular; en una cara lateral de estos dedos. Figura 9.65 Recolectando una gota de sangre en un portaobjetos. Figura 9.66 Coloque el extensor frente a la gota de sangre. Figura 9.67 Mueva el extensor hacia atrás hasta que toque la gota de sangre. Figura 9.68 Permitir que la sangre corra a lo largo del borde del extensor. Figura 9.69 Empuje el extensor hasta un poco antes del final del portaobjetos con un movimiento deslizante suave (debe quedar un extendido no muy largo ni muy grueso, hay que regular el ángulo que debe ser de 45º) (vea la dirección de la flecha). Figura 9.70 Extendidos de sangre: Preparado correctamente (a) y uno incorrectamente preparado (b). C) Es esencial que la extensión se seque de manera adecuada para conservar su calidad, en especial en climas húmedos. Agitarla al aire. Figura 9.71 El secado del extendido de sangre sobre una lámpara de alcohol. D) Marque la extensión ya seca con el nombre o el número del paciente. Escriba ésta con un lápiz de grafito en la porción gruesa de la extensión sanguínea que no se utilizará para el examen. 9.10.3 Método Obtención de las muestras de sangre Obtenga la sangre (Fig. 9.29): — del dedo cordial o el anular — en una cara lateral de estos dedos. Deje que la sangre salga libremente. Recoja primero las muestras en que se determinarán las concentraciones de número de las células sanguíneas (si se han solicitado) (ver secciones 9.5 y 9.6). Importante. No se extraiga sangre de: el dedo índice o el pulgar un dedo infectado (paroniquia, etc.) la oreja (contiene demasiados monocitos). Uso de anticoagulantes Utilice solamente solución salina bipotásica de EDTA seca; otros anticoagulantes alteran la conformación de los leucocitos. No se debe dejar la sangre con el anticoagulante en reposo antes de preparar el frotis. Preparación de la extensión 1. Recoja una gota de sangre aproximadamente de este tamaño: tocándola ligeramente con una cara del portaobjetos, cerca del extremo de este (Fig. 9.65). 2. Sostenga el portaobjetos con una mano. Con la otra mano coloque el borde del portaobjetos que se ha recortado exactamente frente a la gota de sangre (Fig. 9.66). 3. Desplace el portaobjetos recortado hacia atrás, hasta que toque la gota de sangre (Fig. 9.67). 4. Deje que la gota de sangre se extienda por el borde del portaobjetos recortado (Fig. 9.68). 5. A continuación, deslice el portaobjetos recortado hacia el extremo opuesto del portaobjetos que contiene la gota de sangre con un movimiento suave (se deberá agotar toda la gota de sangre antes de llegar al extremo del portaobjetos) (Fig. 9.69). Extienda con mayor rapidez la sangre de los pacientes anémicos. 6. Confirme que la extensión esté bien hecha (véase Fig. 9.70 (a)): — no deberá haber líneas a lo ancho ni a lo largo del frotis — el extremo de la extensión deberá terminar suave y gradualmente, sin desgarros ni vetas como los que se observan en la Fig. 9.70 (b). — la extensión no deberá ser demasiado larga — tampoco deberá ser demasiado gruesa — no deberá tener espacios vacíos (debido a que se ha usado un portaobjetos con grasa). La preparación de una extensión distribuida adecuadamente es sumamente importante. Una extensión preparada mal producirá errores en la determinación de las fracciones de número de los tipos de leucocitos y hará imposible que se reconozca la morfología de los glóbulos rojos. Secado de la extensión Es esencial que la extensión se seque de manera adecuada para conservar su calidad, en especial en climas húmedos. Durante la estación de lluvias (en los trópicos): Seque la extensión con rápidos movimientos de vaivén a unos 5 cm de distancia, a un lado y ligeramente arriba (pero nunca encima) de la llama de una lámpara de alcohol (Fig. 9.71). Si es necesario, proteja la preparación de las moscas. Marque la extensión ya seca con el nombre o el número del paciente. Escriba ésta con un lápiz de grafito en la porción gruesa de la extensión sanguínea que no se utilizará para el examen. Fijación Si la extensión se ha preparado para determinar fracciones de número de los tipos de leucocitos se deberá fijar con metanol, o directamente por medio de la tinción de May-Grünwald (véase más abajo).
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Para la detección de parásitos (empleando las tinciones de Giemsa o Field, la extensión se fijará con metanol (ver más abajo). Fijación del extendido Si el extendido está destinado a la determinación de fracciones de número de tipo de leucocitos, este debe fijarse con metanol antes de la tinción con colorante May-Grünwald (ver más abajo). Si el extendido se destina a la detección de parásitos, este debe fijarse con metanol antes de la tinción con Giemsa o tinción de Field (ver más abajo). Entonces, en estos casos fije las extensiones con metanol. Conservación para hacer el trabajo en otro momento: Envuélvanse por separado una vez que estén secas, con hojas de papel blanco. Esto evita a las moscas que se posarían en el extendido seco de sangre. Tinción del extendido Tinción de Leishman Materiales — Dos varillas de vidrio colocadas a través del fregadero o sobre una cubeta para tinción — Una probeta de 50 ml ó 100 ml — Un frasco de lavado (piseta) con agua amortiguada — Un temporizador para marcar los intervalos — Un soporte deslizante para secar los portaobjetos — Tinción de Leishman (reactivo No. 34) — Metanol. Método 1. Fije la extensión de sangre con metanol durante 2 -3 minutos. 2. Prepare una dilución del colorante de Leishman al 1 en 3 (1/3), mezclando una parte de los colorantes con 2 partes de agua amortiguada. Mézclese. Ejemplo: Utilice 10 ml de los colorantes y 20 ml de agua amortiguada. Prepare solo la cantidad suficiente para un día, ya que el colorante diluido no se conserva bien. 3. Cubra el portaobjetos con el colorante diluido durante 7 -10 minutos Importante: Es posible que se necesite cambiar el tiempo de tinción, especialmente si se ha recibido en el laboratorio un nuevo lote de colorantes o bien si han estado guardados durante algún tiempo. 4. Lave el colorante con una corriente de agua amortiguada. No escurra el colorante porque dejaría un depósito sobre la extensión. 5. Vierta agua limpia sobre el portaobjetos y déjela durante 2 - 3 minutos para la diferenciación de la extensión. El tiempo necesario para la diferenciación dependerá de la tinción y del pH del agua que se use. El pH es de importancia definitiva para diferenciar los diferentes tipos de leucocitos con la tinción de Leishman. Este pH deberá ser de 6,8 y 7,2 y preferiblemente entre 7,0 y 7,2. 6. Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte deslizante para portaobjetos hasta que se seque. Resultados En una extensión adecuadamente teñida, las células parecen como se describe en la Tabla 9.10: Tabla 9.10 Aspecto de las células de la sangre en extensiones finas teñidas con la coloración de Leishman Tipo de célula Aspecto El citoplasma se tiñe de color rosáceo y en su interior se observan gránulos pequeños de Neutrófilos color malva. El citoplasma se tiñe de color rosáceo y en su interior se observan gránulos voluminosos Eosinófilos de color rojo. Basófilos Numerosos gránulos de color azul malva oscuro llenan la célula. Monocitos El citoplasma se tiñe de color azul grisáceo. Linfocitos Grandes El citoplasma se tiñe de color azul claro. Pequeños El citoplasma se tiñe de color azul oscuro. Eritrocitos Se tiñen de color rojo pálido. Plaquetas Se tiñen de color malva rosáceo.
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B A
C
D
E
F
G A) Materiales para las tinciones. B) Fijación. Fije la extensión de sangre con metanol durante 2 -3 minutos. C) Dilución del colorante. Prepare una dilución (1/3) del colorante de Leishman, mezclando una parte de los colorantes con 2 partes de agua amortiguada. Mézclese. Use la dilución en el día porque no se conserva bien. D) Cubra el portaobjetos con el colorante diluido durante 7 -1 0 minutos. E) Lave el colorante con una corriente de agua amortiguada (usando una piseta). No escurra el colorante porque dejaría un depósito sobre la extensión. F) Vierta agua limpia sobre el portaobjetos y déjela durante 2 - 3 minutos para la diferenciación de la extensión. G) Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte para portaobjetos deslizante hasta que se seque. Tinciones de May – Grünwald y de Giemsa Materiales Los mismos que se usan para la tinción de Leishman. — Tinción de May-Grünwald (reactivo No. 38) — Tinción de Giemsa (reactivo No. 29) — Agua amortiguada. Método 1. Fije la extensión con metanol durante 2 - 3 minutos. 2. Prepare los colorantes de la manera siguiente: — Diluya el colorante de May-Grünwald al 1 en 2 (1/2); use volúmenes iguales de los colorantes y agua amortiguada. Mézclese. Ejemplo: utilice 10 ml de los colorantes y 10 ml de agua amortiguada. — Diluya el colorante de Giemsa al 1 en 10 (1/10) empleando un volumen de los colorantes y 9 volúmenes de agua amortiguada. Mézclese con suavidad. Ejemplo: utilice 2 ml de los colorantes y 18 ml de agua amortiguada. Prepare solo las cantidades suficientes para un día, ya que los colorantes diluidos no se conservan bien. 3. Cubra el portaobjetos con el colorante diluido de May-Grünwald durante 5 minutos. 4. Escurra el colorante y sustitúyalo con colorante diluido de Giemsa durante 10 minutos. Importante: Es posible que se necesite cambiar los tiempos de tinción, especialmente si se ha recibido en el laboratorio un lote nuevo de colorantes o bien éstos han permanecido guardados durante algún tiempo. 5. Lave el colorante con una corriente de agua amortiguada. No se escurra el colorante porque dejaría un depósito en la extensión.
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6. Deposite agua limpia sobre el portaobjetos y déjela durante 2 - 3 minutos para que se afirmen las diferencias dentro de la extensión. El tiempo necesario para la diferenciación dependerá de la tinción y del pH del agua que se use. El pH deberá ser de 6,8 - 7,0. 7. Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte deslizante para portaobjetos hasta que se seque. Resultados Similares a los que se obtienen con la tinción de Leishman (véase antes).
B
A
D C
E
F
H G A) Materiales para las tinciones. B) Fijación. Fije la extensión de sangre con metanol durante 2 -3 minutos. C) Dilución del colorante. Prepare los colorantes de la manera siguiente: Diluya el colorante de May-Grünwald (1/2); use volúmenes iguales de los colorantes y agua amortiguada. Mézclese. Diluya el colorante de Giemsa al (1/10) empleando un volumen de los colorantes y 9 volúmenes de agua amortiguada. Mézclese con suavidad. D) Cubra el portaobjetos con el colorante diluido de May-Grünwald durante 5 minutos. E) Escurra el colorante y sustitúyalo con colorante diluido de Giemsa durante 10 minutos. F) Lave el colorante con una corriente de agua amortiguada. No se escurra el colorante porque dejaría un depósito la extensión. G) Deposite agua limpia sobre el portaobjetos y déjela durante 2 - 3 minutos para que se afirmen las diferencias dentro de la extensión. H) Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte para portaobjetos deslizante hasta que se seque. Tinción rápida de extensiones con el método de Field El método de Field para teñir extensiones es diferente del que se usa para teñir gotas gruesas; el colorante B de Field se emplea antes del colorante A. Materiales — Colorantes A y B de Field (reactivo No. 25). — Frascos o vasos para análisis con agua limpia (no se necesita agua amortiguada). Los colorantes A y B de Field se pueden usar sin diluir mientras proporcionen resultados satisfactorios. Se deben filtrar cada 2 - 3 días. Método 1. Fije la extensión con metanol durante 2 - 3 minutos. 2. Sumerja el portaobjetos en el colorante B de Field y cuente hasta cinco (Fig. 9.72). Escurra la extensión y lávela en el primer recipiente con agua limpia (Fig. 9.73). 3. Escurra el portaobjetos y sumérjalo en el colorante
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A de Field y cuente hasta 10. Escúrralo de nuevo y lávelo bien en el segundo recipiente con agua. 4. Examine el color de la extensión. Deberá ser malva; ni demasiado azul ni demasiado rojizo. Si no es satisfactoria, sumérjala de nuevo durante algunos segundos en el colorante A o el colorante B de Field (cualquiera de los dos), según se necesite. Si esta vez la extensión es satisfactoria, coloque el portaobjetos en un soporte deslizante para portaobjetos y déjelo escurrir hasta que se seque. Resultados Similares a los que se obtienen con la tinción de Leishman (véase antes).
B
A
C
D
E A) Materiales de la tinción de Field. El método de Field para teñir extensiones es diferente del que se usa para teñir gotas gruesas; el colorante B de Field se emplea antes del colorante A. Los colorantes A y B de Field se pueden usar sin diluir mientras proporcionen resultados satisfactorios. B) Fijación. Fije la extensión de sangre con metanol durante 2 -3 minutos. Figura 9.72 Coloreando la extensión sanguínea con el tinte de Field. Figura 9.73 Enjuague el portaobjetos en agua. C) Sumerja el portaobjetos en el colorante B de Field y cuente hasta cinco. Escurra la extensión y lávela en el primer recipiente con agua limpia. D) Escurra el portaobjetos y sumérjalo en el colorante A de Field y cuente hasta 10. Escúrralo de nuevo y lávelo bien en el segundo recipiente con agua. E) Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte para portaobjetos deslizante hasta que se seque. Precauciones esenciales para obtener resultados provechosos Evite la formación de depósitos de colorante. En las extensiones tienen el aspecto de acumulaciones de manchas negras y pequeñas. Evite las tinciones defectuosas, que dan por resultado extensiones demasiado azules, demasiado rojizas o demasiado oscuras. 1. Utensilios de vidrio completamente limpios. Lávense todos los días. No utilice ácidos. Elimine los depósitos de colorantes con metanol. 2. Agua neutra (amortiguada, si es posible a excepción de la tinción de Field). La técnica de preparación se describe en la sección 2.4.4. El agua ácida hace que el frotis sea demasiado rojo; el
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agua alcalina hace que sea demasiado azul. El agua neutra que se use se deberá haber preparado recientemente, ya que se acidifica al exponerse al aire. 3. Mezcla de Giemsa. Prepárese con lentitud y cuidado. Los sacudimientos producen precipitaciones en los colorantes. Como remediar resultados insatisfactorios 1. Depósitos de colorantes Depósitos de la tinción de May-Grünwald o del agua neutra Son causados por la tinción de May-Grünwald o el agua neutra y se pueden observar a simple vista en el líquido que se encuentra sobre el portaobjetos. Escurra el colorante. Enjuague el portaobjetos dos veces con metanol. Déjese secar y tíñalo de nuevo con colorantes de May-Grünwald frescos o filtrados. 2. Depósitos de la tinción de Giemsa Se pueden observar a simple vista o con el microscopio. Enjuague el portaobjetos con metanol, como en el caso anterior, pero lave inmediatamente después con agua neutra. Déjelo secar y repita el procedimiento de tinción desde el principio. 3. Extensiones demasiado azules (tinción basofílica) Prepare una solución de ácido bórico al 1% en etanol al 95%. Enjuague el portaobjetos dos veces en esta preparación. Lávelo inmediatamente después con agua neutra. Déjese secar y examínelo con el microscopio sin otros tratamientos. Por lo general, la tinción basofílica se puede evitar empleando agua amortiguada con un pH más ácido y, si es necesario, alterando el tiempo para la diferenciación. 9.10.4 El examen microscópico Con el objetivo x 40, examine las extensiones. Las células deben aparecer tal como se describe en la Tabla 9.10. Eritrocitos En ciertas enfermedades, especialmente la anemia, los eritrocitos pueden tener una forma, tamaño o color anormales. Dónde se deben observar los eritrocitos: Para comprobar si hay eritrocitos anormales, los eritrocitos se deben observar poco antes del extremo donde termina la extensión de sangre; en esta porción se hallan diseminados y se tocan unos a otros sin sobreponerse (Fig. 9.74). No mirar el extremo grueso, donde las células están muy juntas, los eritrocitos se aglomeran (Fig. 9.75), o en el extremo delgado final, donde casi termina el extendido sanguíneo, donde no hay suficientes células, es decir, los eritrocitos son demasiado escasos (Fig. 9.76). A continuación se describen los distintos tipos de eritrocitos anormales.
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Figura 9.74 El examen de frotis de sangre de eritrocitos anormales: donde buscar. Los eritrocitos se deben observar poco antes del extremo donde termina la extensión de sangre; en esta porción se hallan diseminados y se tocan unos a otros sin sobreponerse. Figura 9.75 El examen de frotis de sangre de eritrocitos anormales: En esta porción la extensión es demasiado gruesa; los eritrocitos se aglomeran. Figura 9.76 El examen de frotis de sangre de eritrocitos anormales: no hay suficientes células. En esta porción los hematíes son demasiado escasos. Eritrocitos normales (Fig. 9.77) Tamaño: 7 - 8 µm Forma: redonda, discoidal, de vez en cuando un poco irregular. Tinción: La periferia se tiñe de color de rosa intenso; el centro lo hace de color rosa pálido, o bien es casi incoloro. Células diana (Fig. 9.78) Tamaño: 6-8 µm Forma: redonda o ligeramente irregular Tinción: el centro y la orilla se tiñen intensamente, pero entre ambos se observa un anillo incoloro. Este tipo de eritrocitos se suele encontrar en la talasemia, la deficiencia de vitamina B6, la anemia drepanocítica y otras anemias causadas por la existencia de hemoglobinas anómalas (hemoglobinopatías), enfermedades del hígado, así como en la anemia ferropénica. Eritrocitos falciformes (Fig. 9.79) Forma: alargada y estrecha, frecuentemente con uno o ambos extremos curvos y puntiagudos. Se suelen hallar en la anemia falciforme o drepanocítica y la talasemia falciforme junto con eritrocitos nucleados, eritrocitos normales y muchas veces también macrocitos. El examen de los eritrocitos falciformes en preparaciones húmedas se describe en la sección 9.11.4. Microcitos (Fig. 9.80) Tamaño: pequeño (alrededor de 5 µm). Visto a menudo en la anemia por deficiencia de hierro, anemia sideroblástica y talasemias. Deben distinguirse de los esferocitos (véase más adelante). Macrocitos (Fig. 9.81) Son eritrocitos grandes que miden 9-10 µm. Se observan en las anemias macrocíticas causadas por deficiencias de ácido fólico o vitamina B-12, anemia por deficiencia de hierro y en ciertos padecimientos hepáticos. Deben distinguirse de los reticulocitos (ver más abajo). Los eritrocitos voluminosos que se tiñen de color malva azulado (policromasia) se denominan reticulocitos. Esquistocitos (Fig. 9.82) Tamaño: normal o ligeramente más pequeño que los eritrocitos normales. Células fragmentadas. Visto en anemias hemolíticas, enfermedad de células falciformes y talasemias. Esferocitos (Fig. 9.83) Tamaño: pequeño (6 µm) Forma: completamente redonda Tinción: uniforme; todo el eritrocito se tiñe intensamente. Teñido más oscuro que los eritrocitos normales. Se suelen encontrar en las anemias hemolíticas y esferocitosis hereditaria. Eliptocitos (Fig. 9.84) Tamaño: normal (8 µm) Forma: oval Tinción: más oscura en la periferia (especialmente en los polos) Se observan muy raras veces. Se encuentran en la eliptocitosis hereditaria, anemia por deficiencia de hierro, anemia perniciosa, anemia de células falciformes, talasemias y mielofibrosis. Anisocitosis (Fig. 9.85) Este término se emplea para señalar una afección en que hay eritrocitos de tamaños diferentes en la misma sangre; por ejemplo, eritrocitos de 9 µm mezclados con pequeños glóbulos rojos de 6 µm. Se observan en anemias de numerosos tipos. Poiquilocitos (Fig. 9.86) Los poiquilocitos son eritrocitos de formas diferentes que se encuentran en la misma sangre; por ejemplo, puede haber una mezcla de células redondas, ovales, triangulares, piriformes y dentadas. Se encuentran en numerosos tipos de anemias severas y mielofibrosis. Eritrocitos que contienen cuerpos de Howell-Jolly (Fig. 9.87) En el interior de estos eritrocitos se observan uno o más gránulos voluminosos de color morado (restos del núcleo). No se deben confundir con las plaquetas que se suelen adherir a la superficie de los eritrocitos. Encontrados en anemias hemolíticas y anemia megaloblástica, y después de la esplenectomía. Eritrocitos que contienen cuerpos anulares Cabot (Fig. 9.88) Los eritrocitos contienen estructuras finas en forma de anillo o una figura en forma de ocho que se tiñen de rojo con la tinción de Wright. Estos cuerpos anulares también son llamados anillos de Cabot. Encontrados en anemias severas. No debe confundirse con parásitos de la malaria. Eritrocitos que contienen punteado basófilo (Fig. 9.89) En estos eritrocitos hay cierto número de gránulos pequeños (puntos) de color azul violáceo. Tales gránulos no se deben confundir con depósitos de los colorantes. Encontrados en deficiencias de vitaminas, talasemias y la intoxicación por plomo.
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Eritrocitos nucleados (Normoblastos) (Fig. 9.90) Tamaño: 8-10 µm Forma: redonda y, frecuentemente, irregular Núcleo: pequeño, redondo, de color morado oscuro, frecuentemente excéntrico y provisto de cromatina densa Citoplasma: de color rosa o azul grisáceo. Los normoblastos se observan en la eritropoyesis acelerada en anemias severas, como la anemia drepanocítica, en ciertas infecciones bacterianas graves y en las leucemias y cánceres. Reticulocitos (Fig. 9.91) Estos son precursores directos de los eritrocitos. Contienen gránulos (restos nucleares) que tiñen de azul oscuro con coloraciones vitales como el azul brillante de cresilo y el azul de Evan. Los reticulocitos normalmente desaparecen dentro de las 4 horas después de la liberación de los eritrocitos en la sangre. La cantidad de reticulocitos que se encuentre en la sangre indicará el grado de actividad de la médula ósea, y cuando ésta es muy activa (como ocurre en las anemias) su número aumenta. Su aparición y detección en un extendido de sangre periférica teñido convenientemente con algunas de las tinciones mencionadas antes (por Ej., la de May Grünwald – Giemsa) se denomina Policromatofilia o Policromasia.
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335
B A
C
D
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F E A) y B) Hematíes normales. C) y D) Células en diana (dianocitos) (véase flechas). E) y F) Células falciformes (hematíes) (observe dentro de los círculos).
H G J
I
L K G) Se observa un microcito y un esferocito. H) Microcitosis. I) Macrocitosis (macrocitos). J) Esquistocitos. K) Esferocitos (dentro de los círculos). L) Eliptocitos.
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M N
O
P
Q
R M) Anisocitosis. N) Poiquilocitosis (poiquilocitos). O) y P) Cuerpos de Howell – Jolly en los hematíes (véase dentro de los rectángulos). Q) Anillo de Cabot en un hematíe (flecha). R) Alteraciones en los hematíes (véase figura).
T
S
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V U S) Punteado basófilo en un eritrocito maduro. Al lado se observa un Eritroblasto policromático. T) Normoblasto (Eritroblasto ortocromático) (dentro del rectángulo). U) y V) Reticulocitos (ver dentro de los rectángulos). Fuentes: www.telmeds.org (Panamá). http://www.iqb.es/ (España) Leucocitos En contraste a los eritrocitos, los leucocitos contienen un núcleo que puede variar en tamaño y forma. Como ya se ha mencionado, hay cinco tipos principales de leucocitos: -neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos. La proporción de cada tipo de leucocitos, conocida como la fracción del número del tipo de leucocitos, es de importancia diagnóstica. Células polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) Las células polimorfonucleares tienen: -Un núcleo con varios lóbulos; -Gránulos en el citoplasma (de ahí su nombre común, granulocitos). Neutrófilos polimorfonucleares (Fig. 9.92) Tamaño: 12-15 µm Forma: redonda, bien definida Citoplasma: abundante, rosáceo Gránulos: de color malva, muy pequeños, numerosos pero separados. Los gránulos aparecen de un color marrón-violeta después de la tinción. Núcleo: varios lóbulos (2 - 5), unidos por bandas de cromatina. La cromatina tiene el aspecto de una masa uniforme de color morado oscuro. (A medida que el leucocito envejece aumenta el número de lóbulos del núcleo.) Eosinófilos polimorfonucleares (Fig. 9.93) Tamaño: 12- 15 µm Citoplasma: muy poco visible, que contiene numerosos gránulos de color rojo anaranjado. Gránulos: voluminosos, redondos, de color rojo anaranjado, abundantes y agrupados estrechamente Núcleo: generalmente consta de dos lóbulos. Algunas veces se observa que estos leucocitos se han dañado y los gránulos se encuentran diseminados en el exterior. Basófilos polimorfonucleares (Fig. 9.94) Este es el tipo más raro de los granulocitos. Tamaño: 11-13 µm. Forma: redonda. Gránulos: muy voluminosos, redondos, de color morado oscuro, abundantes pero menos estrechamente agrupados que los gránulos de los eosinófilos Núcleo: difícil de observar, pues se halla cubierto por los gránulos en el citoplasma Vacuolas: se encuentran escasas vacuolas incoloras y pequeñas. Citoplasma: muy poco visible, por la gran cantidad de gránulos. Linfocitos y monocitos Los linfocitos y monocitos tienen un núcleo compacto y pueden o no pueden tener gránulos en el citoplasma. Linfocitos pequeños (Fig. 9.95) Tamaño: 7 - 10 µm Forma: redonda Núcleo: voluminoso; ocupa la mayor parte de la célula; la cromatina es de color morado oscuro, y densa Citoplasma: la cantidad visible es reducida, de color azul y sin gránulos. Linfocitos grandes (Fig. 9.96) Tamaño: 10-15 µm Forma: redonda o irregular Núcleo: oval o redondo; puede ocupar un lado de la célula Citoplasma: abundante, de color azul pálido Gránulos: escasos, voluminosos y azurófilos (de color rojo oscuro). Monocitos (Fig. 9.97) Tamaño: 15 - 25 µm; son los leucocitos más voluminosos Forma: irregular Núcleo: variable, frecuentemente con forma de riñón; la cromatina se dispone en cordones irregulares de color malva pálido
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Gránulos: sumamente pequeños; semejan partículas de polvo; generalmente rojizos Vacuolas: casi siempre hay vacuolas en el citoplasma. En los pacientes que sufren de paludismo el citoplasma suele contener depósitos de color negro castaño, formados por el pigmento palúdico. Células raras o anormales Células plasmáticas (Fig. 9.98) Las células plasmáticas o plasmocitos producen anticuerpos. Se pueden observar en las extensiones sanguíneas de casos de sarampión, tuberculosis, otras virosis e infecciones bacterianas y mieloma múltiple. Tamaño: 12-15 µm Forma: redonda u oval Núcleo: redondo, excéntrico, con la cromatina aglutinada y frecuentemente dispuesta de tal manera que recuerda una rueda Citoplasma: de color azul oscuro, con un área que se tiñe débilmente alrededor del núcleo Vacuolas: numerosas y muy pequeñas; visibles con dificultad. Granulocitos inmaduros Durante algunas enfermedades (infecciones bacterianas graves) los granulocitos polimorfonucleares inmaduros emigran de la médula ósea al torrente sanguíneo. Se pueden distinguir por los caracteres siguientes: Tamaño: 12-18 µm Núcleo: un solo núcleo sin lóbulos, con cromatina de color que varía entre el rojo oscuro y el morado Citoplasma: de color azul pálido o rosáceo con gránulos Gránulos: abundantes, voluminosos, de color malva o rojo oscuro. A veces se puede observar una granulación tóxica con gránulos muy voluminosos que se tiñen de color oscuro. Si se ven polimorfonucleares neutrófilos inmaduros ("forma de banda" o "células en cayado") (Fig. 9.99), informar su fracción del número como para otros tipos de leucocitos. También es posible que se detecten leucocitos inmaduros de este tipo, sin gránulos, pero con nucléolos (Linfoblastos) (ver Fig. 9.102). Neutrófilos polimorfonucleares hipersegmentados (Fig. 9.100) Son neutrófilos polimorfonucleares "viejos", de aspecto normal, exceptuando que los núcleos poseen 5-10 lóbulos y con frecuencia son más voluminosos. Estos neutrófilos se suelen observar en pacientes que sufren de anemia macrocítica causada por deficiencias de ácido fólico o vitamina B-12. Linfocitos atípicos (Fig. 9.101) Los linfocitos atípicos se pueden encontrar en infecciones víricas, especialmente la mononucleosis infecciosa (fiebre glandular), la tos ferina y el sarampión. También se encuentran en la tuberculosis, en el paludismo grave y en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). También es posible que se detecten en casos de tuberculosis y paludismo grave. Tamaño: muy variable, de 12 – 18 µm Forma: generalmente irregular Núcleo: redondo o irregular; con frecuencia ocupa un lado de la célula, con nucléolos visibles Citoplasma: casi siempre es de color más oscuro que el de los linfocitos grandes; se oscurece a medida que se acerca a la pared de la célula. No contiene gránulos. Linfoblastos (Fig. 9.102) Constituye el tipo más joven (más inmaduro) de todos los leucocitos. Los linfoblastos se pueden ver en las extensiones de sangre de pacientes con leucemia. Tamaño: Grande, 15-25 µm. Núcleo: grande, redondo, malva pálido, conteniendo de 1 a 5 nucléolos. Citoplasma: azul oscuro, con un área clara que no se tiñe, situada alrededor del núcleo. No contiene gránulos. Megacariocitos (Fig. 9.103) Son los precursores de las plaquetas en la médula ósea (véase la sección 9.1.3). Tamaño: muy voluminosos, de 60 – 100 µm Núcleo: sumamente irregular, denso y con abundantes lóbulos Citoplasma: lleno de gránulos pequeños, principalmente azurófilos, y de plaquetas. La pared celular no está claramente definida. (Muy raras veces se encuentran en la sangre.)
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I
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A) PMN Neutrófilos segmentados. B) Collage que muestra varias células, entre ellas al PMN eosinófilo, al PMN basófilo, al linfocito pequeño. C) Linfocito grande. D) Monocito. E) Plasmocito. F) Neutrófilos en banda (cayado). G) PMN Neutrófilo hipersegmentado. H) Linfocitos atípicos. I) Linfoblastos. J) Megacariocito. PMN: Polimorfonuclear. Fuente: www.telmeds.org , www.anamerino.com 9.11 PRUEBA
DE LA ANEMIA DE CÉLULAS FALCIFORMES
Estudio de los eritrocitos falciformes La hemoglobina S es una hemoglobina anormal de tipo hereditario (una hemoglobina funcionalmente defectuosa). Si se hereda de ambos progenitores produce anemia falciforme (drepanocítica), una enfermedad grave. Cuando solo se hereda de un progenitor determina una propensión genética a la formación de células falciformes (rasgo de células falciformes: portador del rasgo de la célula falciforme), aunque generalmente no causa la enfermedad. En el frotis para la prueba de los eritrocitos falciformes no se distingue entre la anemia falciforme propiamente dicha y la propensión genética a ella (rasgo de células falciformes). La hemoglobina S se suele encontrar en las regiones tropicales de África, aunque también se observa en el Oriente Medio y entre los americanos de origen africano. 9.11.1 Principio En un portaobjetos se mezcla una gota de sangre con una gota de un reactivo elaborado a base de metabisulfito sódico. Si los eritrocitos contienen una hemoglobina anormal denominada hemoglobina S, adoptan formas de hoz o media luna (ver Fig. 9.79). El reactivo mencionado desplaza el oxígeno de los eritrocitos, con lo que sobreviene el cambio de forma de éstos.
9.11.2 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos ● Cubreobjetos ● Filtro de papel ● Pipeta Pasteur (o pipeta gotera) ● Dos palillos de madera pequeños ● Contenedores para prevenir el secado de la preparación, tales como placas de Petri ● Metabisulfito de Sodio fresco, solución al 2% (reactivo no. 55). 9.11.3 Método 1. En el centro del portaobjetos deposite una gota pequeña de sangre capilar (aproximadamente 0,02 ml, alrededor de 4 mm de diámetro) (véase la Fig. 9.65). 2. Añada una gota igual de la solución de metabisulfito sódico. 3. Con una esquina del cubreobjetos mezcle cuidadosamente ambas gotas (Fig. 9.104). Coloque el cubreobjetos sobre la mezcla, verifique que no se forman burbujas. 4, Coloque el portaobjetos sobre dos palillos, en una caja de Petri que tenga en el fondo un filtro de papel humedecido (Fig. 9.105).
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Nota: Cuando se usa un reactivo reductor como el metabisulfito sódico no se necesita cerrar herméticamente el recipiente en que se coloca la preparación. 5. Deje transcurrir 30 minutos.
A
B
A) Materiales y reactivos. Figura 9.65 En el centro del portaobjetos deposite una gota pequeña de sangre capilar. B) Añada una gota igual (del mismo tamaño) de la solución de metabisulfito sódico. Figura 9.104 Mezcla de la sangre y la solución de metabisulfito de sodio. Figura 9.105 Incubando el portaobjetos en una placa de Petri. 9.11.4 Examen microscópico Examine la preparación con el microscopio (usando el objetivo x 40). RESULTADOS Resultado negativo Los eritrocitos conservan su forma redonda. (Fig. 9.106). Si el resultado es negativo, examine de nuevo la preparación 30 minutos después, y dos veces más después de dos horas y 24 horas. Resultado positivo Los eritrocitos toman forma de: a) hoz o banana (Fig. 9.107 (a)), y b) frecuentemente tienen espolones (Fig. 9.107 (b)). Es importante que se examinen varias porciones de la preparación, ya que los cambios de forma pueden ocurrir más rápidamente en una parte que en otra. Es preciso tener cuidado de no confundir las células falciformes con los eritrocitos que se encuentran de canto ni los eritrocitos crenados.
Figura 9.106 Prueba para la anemia de células falciformes: Resultado negativo (hematíes intactos y redondos, bicóncavos). Figura 9.107 Prueba para la anemia de células falciformes: a) Resultado positivo: Eritrocitos falciformes; b: eritrocitos falciformes con espolones. No confundir con hematíes crenados. Nota: Los resultados falsos negativos pueden ocurrir si:
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- Se utilizan reactivos obsoletos; -Las concentraciones de hemoglobina S son bajas; - Los pacientes tienen anemia moderada o grave. Importante: Si el resultado del frotis es positivo se deberá examinar una extensión de sangre. En los pacientes que sufren de anemia falciforme se suelen encontrar al mismo tiempo células con forma irreversible de hoz, eritrocitos nucleados, células diana, abundantes poiquilocitos y, con frecuencia, también numerosos macrocitos. Por lo general, los pacientes que tienen el rasgo genético falciforme no son anémicos y la morfología de sus glóbulos rojos es normal. Siempre que sea posible se deberá efectuar un estudio de la hemoglobina por electroforesis para confirmar el diagnóstico de anemia falciforme. Tal estudio se hará en un laboratorio de referencia. Otros métodos 1. Esta misma prueba se puede realizar con sangre venosa, a condición que se haya obtenido muy recientemente (1-2 horas) en un recipiente que contenga un anticoagulante (sal bipotásica de EDTA, solución al 10% (reactivo no. 22)). 2. Método del tubo: La prueba también puede llevarse a cabo utilizando un tubo de ensayo en lugar de una placa de Petri. En el comercio existen los reactivos necesarios para poner en práctica este método. 9.12 DETERMINACIÓN DE
LA CONCENTRACIÓN
/ FRACCIÓN DEL
NÚMERO DE RETICULOCITOS
Los reticulocitos son glóbulos rojos inmaduros que emigran de la medula ósea al torrente sanguíneo. La cantidad de reticulocitos que se encuentre en la sangre indicará el grado de actividad de la médula ósea con respecto a la producción de eritrocitos, y cuando ésta es muy activa (como ocurre en las anemias) su número aumenta. Los reticulocitos contienen gránulos violetas oscuros y finos dispuestos en una red (retículo). No contienen núcleo. 9.12.1 Principio Los reticulocitos contienen gránulos pequeños que se pueden teñir con azul de cresil brillante. Este colorante se aplica a una extensión de sangre y a continuación se observa con el microscopio cierto número de eritrocitos. Con este examen se calculan: a) el número de reticulocitos por litro de sangre, o b) la proporción de glóbulos rojos que integran los reticulocitos. 9.12.2 Materiales y reactivos ● Microscopio ● Portaobjetos (sin grasa) ● Extensor de vidrio ● Tubos de ensayo ● Gradilla ● Embudo ● Filtro de papel ● Dos pipetas Pasteur con perillas de goma ● Contador manual (“cuenta ganado”), si está disponible ● Solución saturada de azul de cresilo brillante (no reactivo. 13). 9.12.3 Método 1. Filtre al interior de un tubo de ensayo una cantidad pequeña de la solución de azul de cresil. En el fondo de otro tubo deposite: — 2 gotas de la solución filtrada de azul de cresil (Fig. 9.108). 2. Con una pipeta de Pasteur aspire algunas gotas de sangre de un dedo (Fig. 9.109), o utilice sangre venosa que se haya recogido en un recipiente con sal bipotásica de EDTA, mezclándola completamente. 3. En el tubo que contiene las 2 gotas de la solución de azul de cresil deposite: — 2 gotas de sangre. 4. Haga la mezcla sacudiendo suavemente el tubo. Tape éste con algodón no absorbente. Déjelo reposar 15 minutos. 5. Tome el tubo y agítelo de nuevo con suavidad. Aspire una gota de la mezcla. Deposite esta gota en un portaobjetos, lista para hacer la extensión. 6. Haga una extensión sanguínea con el portaobjetos recortado (extensor) (ver sección 9.10.3). 7. Séquela al aire. 9.12.4 Examen microscópico Examine el frotis con el objetivo de inmersión en aceite (x 100) (Fig. 9.110). Observe la porción cercana al extremo donde termina la extensión, en que los eritrocitos suelen estar muy bien separados. Los eritrocitos se tiñen de color azul pálido. Los reticulocitos son glóbulos rojos en cuyo interior se observan pequeños gránulos que se tiñen de color violeta oscuro, y forman una red (retículo). Los retículos pueden contener: 1) gránulos, o 2) filamentos. Examine por lo menos 100 eritrocitos con el objetivo x 100 de inmersión en aceite. Cuente cuidadosamente: a) la cantidad total de hematíes examinados, y b) el número total de reticulocitos que halla entre ellos.
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(Estos recuentos se efectúan más fácilmente si se reduce el tamaño del campo microscópico. Tal cosa se logra colocando en el ocular una pieza de papel negro y rígido en la que se haya abierto un orificio de unos 5 mm de diámetro.) Algunos hematólogos prefieren que la cantidad de reticulocitos se comunique en términos de la concentración de número (número de reticulocitos por litro de sangre), en tanto que otros suelen solicitar que se les notifiquen en términos de la fracción de número (la proporción de reticulocitos que hay en el total de eritrocitos).
Figura 9.108 Preparación de la solución de azul de cresilo brillante. Figura 9.109 Toma de una muestra de sangre capilar.
Figura 9.110 Examinar el frotis al microscopio. a: reticulocitos típicos, contienen gránulos violáceos oscuros y finos; b: reticulocitos que contienen filamentos; c: reticulocitos maduros (que contienen sólo unos pocos gránulos)
Cálculo Según la costumbre adoptada en el laboratorio o la solicitud específica del médico haga los cálculos como se indica a continuación1: a) Concentración de número: para poder calcularla se necesita conocer primero la concentración del número total de eritrocitos. Si esta es C (omitiendo la multiplicación "x 1012/l" y n es el número total de reticulocitos que se ha encontrado al estudiar 500 eritrocitos, la concentración de número de reticulocitos será C x 2n x 109/l. Ejemplo: Concentración de número de eritrocitos = 4,5 x 1012/l Número de reticulocitos observados al contar 500 eritrocitos = 6 Concentración de número de reticulocitos = 4,5 x (2 x 6) x 109/l= 4,5 x 12 = 54 x 109/l (comunique este resultado). b) Fracción de número: para calcularla no es necesario conocer anticipadamente la concentración de número de eritrocitos. Si n es el número de reticulocitos observados al examinar 500 eritrocitos, la fracción de número de reticulocitos = (2 x n) x 10-3. Ejemplo: Número de reticulocitos visto en el conteo de 500 eritrocitos = 6 Fracción de cantidad de reticulocitos = (2 x 6) x 10-3 = 12 x 10-3 Nota: Si se examinan más de 500 eritrocitos en la extensión de sangre, el cálculo se deberá ajustar proporcionalmente. 1Tradicionalmente, los reticulocitos se han informado en forma de porcentajes (es decir, la proporción, expresada como un porcentaje, de los eritrocitos que son reticulocitos). Si se observan 500 eritrocitos en la extensión de sangre y n de ellos son los reticulocitos, el porcentaje de eritrocitos se calcula multiplicando n por 0,2. Ejemplo: De 500 eritrocitos examinados, 25 son reticulocitos. El porcentaje de reticulocitos es entonces 25 x0.2 = 5%. El rango normal para los recién nacidos es de 2,0 a 6,0%, y para los adultos y los niños es 0,2-2,0%. Rango de referencia La Tabla 9.11 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Tabla 9.11 Concentraciones del número de reticulocitos y fracciones del número de reticulocitos, por grupo de edad Grupo de edad Concentración del número de Fracción del número de
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reticulocitosa reticulocitos Bebés (recién nacido) 100-300 x 109/l 20-60 x 109/l Niños 8-110 x 109/l 2-20 x 109/l 9 Adultos 8-110 x 10 /l 2-20 x 109/l a Valores aproximados. La concentración depende de la concentración del número de eritrocitos (véase la Tabla 9.7). Otras estructuras que se observan en el frotis de sangre Es posible que también se observen las estructuras siguientes en la extensión de sangre teñida con azul de cresil brillante que se utiliza en la determinación de los reticulocitos: Cuerpos de hemoglobina H. Cuando los hay son pequeñas manchas de color azul pálido, de tamaño variable. A diferencia del retículo de los reticulocitos, se observan en la mayor parte de los glóbulos rojos de la extensión sanguínea. Se suelen encontrar en la talasemia y la hemoglobinopatía H. Cuerpos de Heinz. Si los hay en la extensión se distinguen como unos gránulos azules de tamaño variable que se agrupan en un lado de la célula, cerca de la membrana. Se suelen encontrar en la deficiencia de la glucosa-6-fosfato dehidrogenasa consecutiva al empleo de ciertos medicamentos.
1
2
4 3 1) y 2) Cuerpos de hemoglobina H. 3) y 4) Cuerpos de Heinz. 9.13 DETERMINACIÓN DE
LA FRACCIÓN NÚMERO DE TIPO DE LEUCOCITOS
No todos los leucocitos (glóbulos blancos) que circulan en la sangre son idénticos. Hay cinco tipos principales, que se diferencian por el tamaño, la forma del núcleo, el color de los gránulos del citoplasma y otros caracteres. La proporción de cada tipo de leucocitos es importante para el diagnóstico. Esta proporción se denomina fracción de número del tipo de leucocitos. 9.13.1 Principio Se cuentan 100 leucocitos y se anota el número que se ha encontrado de cada tipo de ellos. La proporción de cada tipo de leucocitos se expresa como una fracción decimal.* Ejemplo: Neutrófilos 0,56 Linfocitos 0,25 Eosinófilos 0,12 Monocitos 0,06 Basófilos 0,01 La suma de todas las fracciones deberá ser igual a 1. Si se conoce el número total de leucocitos, expresar el resultado en términos de la concentración del número (es decir, número de células por litro) en lugar de una fracción decimal. *En el sistema tradicional las fracciones de número de los tipos de leucocitos se denominan "recuento diferencial de leucocitos" y la proporción de cada tipo se notifica como un porcentaje; así, el ejemplo anterior se expresaría de la manera siguiente: neutrófilos, 56%; linfocitos, 25%; eosinófilos, 12%; monocitos, 6%; basófilos, 1%. 9.13.2 Materiales ● Un microscopio (con ocular x 10 y un objetivo x 100 de inmersión en aceite) ● Aceite de inmersión ● Extensiones finas de sangre, bien extendidas y teñidas con un Romanowsky (ver sección 9.10.3) ● Papel ● Lápiz ● Si es posible, un contador especial provisto de teclas. 9.13.3 Examen microscópico
348
Empleando el objetivo x 100, de inmersión en aceite, verifique que los glóbulos blancos se encuentran uniformemente distribuidos en la extensión. En un frotis defectuosamente extendido es posible que los neutrófilos se hallen agrupados en la última porción. Elaborar una tabla con: -cinco columnas verticales (N, E, B, L y M), y -10 Líneas horizontales (ver Fig. 9.111). Cuando 10 trazos se han hecho en la primera línea, vaya a la siguiente. Por lo tanto, cuando la línea 10 se ha completado, usted sabe que usted ha contado 100 leucocitos. Luego sume el total de cada columna vertical. Estos totales dan el porcentaje de cada tipo de leucocitos. Los totales se convierten en fracciones decimales mediante la colocación de un punto decimal de dos dígitos a la izquierda (en algunos casos esto puede requerir la inserción de un cero). Por lo tanto, 59 se convierte en 0.59, 8 se convierte en 0.08, 1 se convierte en 0,01, 28 se convierte en 0,28, etc., como en la última línea de la ilustración. Estos decimales son las fracciones del número de cada tipo de leucocitos, y son los resultados que se informan cuando se utilizan unidades SI.
A
B
C
349
Figura 9.111 Tabla para el registro de los diferentes tipos de leucocitos (se hace con lápiz y papel). N: neutrófilos, E: eosinófilos, B: basófilos, L: linfocitos, M: monocitos. A), B), C) Máquina especial para recuento, con teclado. Esta máquina contadora tiene un teclado, cada tecla corresponde a un tipo de leucocitos; la cantidad de cada tipo se registra automáticamente. Su costo es elevado. Rango de referencia La Tabla 9.12 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Tabla 9.12 Fracciones del número del tipo de leucocitos normales, por grupo de edad Tipo célulara Grupo de edad Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Linfocitos Monocitos recién nacidos 0.55-0.65 0.02-0.04 0.00-0.01 0.30-0.35 0.03-0.06 Bebés (hasta1 año, excluyendo a los 0,40 - 0,48 0,02-0,05 0,00 - 0,01 0,40-0,48 0,05-0,10 recién nacidos) 0.36-0.48 Niños (1-4 años) 0.02-0.05 0.00-0.01 0.44-0.54 0.03-0.06 Niños (10 años)
0,45 - 0,55
0,02 - 0,05
0,00-0,01
0,38 - 0,45
0,03-0,06
Adultos 0.55-0.65 0.02-0.04 0,00-0,01 0.25-0.35 0.03-0.06 obtener los valores en las unidades tradicionales (es decir, en porcentajes), se multiplica cada valor en 100. El recuento diferencial de leucocitos se calcula multiplicando el porcentaje de un tipo particular de leucocitos (por ejemplo, neutrófilos) por el recuento leucocitario total y dividiendo por 100. Ejemplo: Recuento total de leucocitos = 5000/mm3 Porcentaje de neutrófilos = 42 % "Absoluta" neutrófilos = (42 x 5.000)/100 = 2100/mm3 Hay dos patrones principales de distribución de diferentes tipos de leucocitos: ● Un patrón muestra una mayoría de los linfocitos (este tipo se observa en lactantes y menores de 10 años). ● El otro patrón muestra una mayoría de los neutrófilos (visto en el recién nacido, niños mayores de 10 años y adultos). Cada tipo de leucocitos se puede informar en términos de su concentración de número (es decir, número de células por litro) en lugar de como una fracción del número. El número de concentración se calcula multiplicando la fracción del número de un tipo particular de leucocitos por el número total de concentración de leucocitos. Ejemplo: Concentración del número de leucocitos = 5 x 109/l Fracción del número de neutrófilos = 0,42 Concentración del número de neutrófilos = 0.42 x 5 x 109 = 2,1 x 108/l. Resultados anormales (a) Neutrofilia: aumento de la proporción de neutrófilos (más de 0,65). Ocurre especialmente en las infecciones agudas. (b) Eosinofilia: aumento de la proporción de eosinófilos (arriba de 0,05). Casi siempre sugiere que existe en los tejidos una infestación por parásitos: esquistosomas, filarias, ancilostomas, áscaris, etc. También puede obedecer a una alergia. (c) Linfocitosis: aumento de la proporción de linfocitos (por encima de 0,35 en adultos y y por encima de 0,45 en los niños). Se suele observar en algunas infecciones víricas (sarampión, etc.), ciertas infecciones crónicas (paludismo, tuberculosis, etc.) y varios estados tóxicos. (d) Monocitosis: aumento de la proporción de monocitos (arriba de 0,06). Se observa en algunas infecciones bacterianas (por ej., fiebre tifoidea) y parasitarias como el paludismo y la leishmaniasis visceral. (e) Neutropenia: disminución del número de neutrófilos. Puede ocurrir en ciertas infecciones (por ej. sepsis) y algunas otras enfermedades. (f) Linfopenia: es una disminución del número de linfocitos y puede ocurrir en el SIDA. aPara
9.14 DETERMINACIÓN DE
LA CONCENTRACIÓN DEL NÚMERO DE TROMBOCITOS
9.14.1 Materiales ● Microscopio ● Aceite de inmersión ● Frotis de sangre bien extendido teñido con Romanowsky (ver sección 9.10.3). 9.14.2 Examen Microscópico Usando el objetivo de inmersión en aceite x 100, cuente el número de plaquetas en 20 campos y crear una estimación aproximada del número de eritrocitos por campo. Calcular la relación de plaquetas a los eritrocitos. Si se conoce la concentración del número de eritrocitos (ver sección 9.5), el recuento de trombocitos puede ser estimado. Si no, una estimación aproximada del número de trombocitos, puede ser "normal", "alto" o "bajo", y puede basarse en una proporción de aproximadamente un trombocito por cada 500-1000 eritrocitos y ser considerada normal. Rango de referencia La Tabla 9.13 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Tabla 9.13 recuento de trombocitos normales, por grupo de edad Grupo de edad Recuento de trombocitos (por mm3) Bebés (<1 año) 3.5 a 6.6 x 105 Niños (1-15 años) 2.5 a 5.1 x 105
Adultos
350
1,7-4,0 x 105
AGREGADO: Recuento en lámina (portaobjetos) Se cuentan 10 campos con objetivo de 100x y se multiplica por 1000 que es la fórmula convencional para recuento de plaquetas. Valores de referencia 150 000 - 450 000 plaquetas/mm3 RECUENTO DE PLAQUETAS Métodos cuantitativos manuales Hay varios métodos manuales para el contaje de plaquetas, se describirán 4: 1) RECUENTO DE PLAQUETAS (usando procaína) Principio El recuento de plaquetas se realiza directamente en un microscopio de contraste de fases, previa lisis de los hematíes, o también se puede observar en un microscopio convencional. Materiales ♦ Recuento en cámara ♦ Hemocitómetro o cámara de Neubauer. ♦ Solución de procaína (léase más adelante) ♦ Pipetas automáticas de 100 a 1000 µl y 0 a 100 µl. ♦ Cámara húmeda. ♦ Tubos de plástico de 12 x 75. ♦ Microscopio convencional. Método ♦ Mezclar bien la muestra de sangre obtenida con EDTA. ♦ Hacer una dilución de 20 µl de sangre total con 380 µl (0,38 ml) de solución de procaína en un tubo de plástico de 12 x 75 (dilución 1/20). ♦ Dejar en reposo por 15 minutos en una gradilla. ♦ De esta dilución, llenar en cámara de Neubauer. ♦ Dejar en reposo por 15 minutos en cámara húmeda. ♦ Enfocar con objetivo de 45x (o 40x) y contar las plaquetas en el retículo central de 1 mm2 cuadrado. ♦ Calcular el número total de plaquetas según la fórmula que se lee a continuación: Resultados Se aplica la siguiente fórmula:
Valores de referencia 150 000 - 450 000 plaquetas/mm3 SOLUCIÓN DE PROCAÍNA Reactivos Procaína (polvo) 3 g Cloruro de sodio 200 mg Agua destilada c.s.p. 1000 ml Procedimiento Mezclar los reactivos en agua destilada y completar hasta llegar a un litro. Guardar en refrigeración a 4ºC.
Fuente: Manual de Procedimientos de Laboratorio en Técnicas Básicas de Hematología, Ministerio de Salud,
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Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Salud Pública, República del Perú, Elaboración: T. M. María Muñoz Zambrano, Dra. Cecilia Morón Cortijo 2) RECUENTO DE PLAQUETAS (Método de Rees Ecker) COLORANTE PLAQUETAS REES ECKER COLORANTE PARA EL RECUENTO MANUAL DE PLAQUETAS PRINCIPIO El recuento de plaquetas es uno de los métodos de rutina. La condición previa de todos los métodos de recuento es la dilución programada y preparación de una muestra de sangre. La solución de reacción produce hemólisis de los hematíes la sangre. Se recuenta el tipo de célula deseado en un volumen definido y se calcula el número de células en un microlitro de sangre. CONTENIDOS COLORANTE PLAQUETAS –Listo para su uso Azul de Cresilo Brillante R.A. 1 g/l Sodio Citrato R.A 38g/l Formol neutro 22 ml Agua desmineralizada tipo II 978 ml CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD •Las soluciones deben almacenarse entre 15°C y 30°C y protegidos de la luz. Después de abierto el contenido almacenado entre 15°C y 30°C y protegidos de la luz es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. •Temperaturas inferiores a 15°C puede precipitar colorantes de las soluciones colorantes. •Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS •Observe la simbología en los rótulos de las soluciones. •Las soluciones usadas y las caducadas deben eliminarse como desechos especiales, debiendo cumplir las regulaciones locales para el desecho de compuestos peligrosos. MATERIALES ADICIONALES REQUERIDOS NO SUMINISTRADOS •Microscopio •Cámara de Neubauer •Pipeta glóbulos rojos •Cronometro y/o timer MUESTRAS Sangre venosa anticoagulada. Toda muestra biológica debe ser considerada como potencialmente infecciosa. PROCEDIMIENTO 1. Obtener sangre venosa o capilar hasta la marca 0,5 de pipeta de glóbulos rojos. 2. Llenar con el diluyente hasta la marca 101, haciendo una dilución a 1:200 de la sangre. 3. Mezclar la sangre diluida durante 5 minutos, preferiblemente en un agitador de pipetas. 4. Descartar varias gotas de la suspensión celular, llenando entonces ambas cámaras del contaje de la cámara de Neubauer y colocarlo en una placa de Petri cerrada conteniendo una pieza húmeda de algodón. Permitir reposar 15 minutos. 5. Utilizar un objetivo de 40 X del microscopio, contar las plaquetas contenidas en un mm2. (las plaquetas se observan color azul refringente), multiplicar el resultado por 2.000, obteniéndose así el numero de plaquetas por milímetro cúbico. VALORES DE REFERENCIA Varones, mujeres, niños: 150.000 – 300.000/mm3 NOTAS SOBRE EL EMPLEO •El microscopio usado debe cumplir los requisitos de un laboratorio de diagnóstico médico. •Utilizar pipeta para eritrocitos y cámara de recuento (Neubauer) estándar limpia. •Usar placas preferiblemente nuevas, sin ralladuras y libres de grasa. BIBLIOGRAFÍA 1. Brecher, G. Gronkite, E.P., 1950, Morphology and Enumeration of Human Blood Platelets, J. Appel Physiol 3.365. 2. Brecher, G. Scheneiderman, M. Cronkite, E.P. 1953. The Reproducibility and Consistency of the platelet count. Amer J. Clin Pathol 23.15.26. 3. Miale, J.B., 1962, Laboratory Medicine, Hematology 2nd ed. C.V. Mosby Co., St. Louis, p 806-808. Seiverd, C.E., 1958, Hematology-for Medical Techinologists. 2nd ed. Lea and Febiger, Philadelphia, p 145-150. 4. Tocantinss, L.M. Kazal, LA., 1964, Blood Coagulation-Hemorrhege and. Thrombosis. 2nd ed. Grune and Stratton, New York, p 44-45. 3) RECUENTO DE PLAQUETAS (usando oxalato de amonio al 1%) PROCEDIMIENTO El conteo de plaquetas se realiza en sangre anticuagulada con EDTA y diluida con oxalato de amonio al 1% mediante el uso de la pipeta para dilución de hematíes y el hemocitómetro. RECURSOS · Sangre anticoagulada con EDTA · Solución de oxalato de amonio al 1% y/ o Rees Ecker · Pipeta para dilución de hematíes · Cámara de de recuento de Neubauer · Laminilla de cuarzo · Placa de Petri con papel de filtro humedecido · Agitador de pipetas · Microscopio MÉTODO · Mezcle cuidadosamente, por inversión por lo menos 10 veces, la sangre anticoagulada con el fin de obtener una muestra homogénea · Llene la pipeta con la muestra de sangre hasta la marca 1.0 exactamente · Elimine el exceso de sangre de las paredes externas de la pipeta para no contaminar la solución diluente · Aspire el líquido diluente hasta la marca 101 exactamente · Sujeta la pipeta entre los dedos índice y pulgar, desprenda la boquilla y deje en reposo durante 3 minutos
352
· Agite durante 10 minutos · Descarte hasta la mitad del bulbo con el fin de eliminar el líquido del capilar e inmediatamente llene la cámara · Llene la cámara de Neubauer en ambos lados y coloque en ambiente húmedo por 10 minutos. El ambiente húmedo se logra cubriendo la cámara con una Caja de Petri que llevará adherido un disco de papel de filtro humedecido · Coloque la cámara en el microscopio. Enfoque con objetivo de 40X y observe el llenado de la cámara. No debe haber agregados plaquetarios. Cuidadosamente enfoque el cuadrado central · Disminuya la intensidad de la luz. Así le será más fácil distinguir y contar las plaquetas · Las plaquetas se reconocen como estructuras pequeñas, opacas, redondas o alargadas, medianamente refráctiles, y a veces con prolongaciones · El número está determinado por el conteo de los 25 cuadrados en que se subdivide el cuadrado central, descartando las plaquetas que tocan las líneas derecha e inferior. Cálculo El número de plaquetas por mm se calcula de acuerdo con: 1. Volumen del área contada: 0.1 mm (1x1x0.1) 2. Dilución utilizada: 1:100 3. Número de células contadas Plaquetas /mm Número de células contadas X 1 X dilución Volumen de área contada Plaquetas/mm = B X 10 X 100 Plaquetas /mm = B X 1000 Valores de Referencia El rango normal para el recuento de plaquetas es de 150.000 a 400.000xmm3 4) RECUENTO DE PLAQUETAS (usando Solución estéril de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo) Composición. Solución estéril de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo (85 milimolar) y cloruro de sodio (31 milimolar). Este líquido se provee listo para usar y su conservación es indefinida en refrigerador (2 - 10° C). El fundamento del método consiste en la producción de hemólisis por la utilización de un líquido hipotónico, y el mantenimiento de las plaquetas intactas y sin agrumar por la presencia de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo. Procedimiento para el recuento de Plaquetas. Antes de usar, llevar el Diluyente para recuento de Plaquetas Biopur a temperatura ambiente (15 - 32º C). Medir sangre del pulpejo del dedo (o extraída con Anticoagulante EDTA) hasta la marca 0,5 de una pipeta para recuento de leucocitos, y diluir hasta la marca 11 con Diluyente para recuento de Plaquetas. Mezclar y dejar en reposo 15 minutos. Volver a mezclar el contenido de la pipeta y cargar una cámara para recuento globular. Dejar en ambiente húmedo (cápsula de Petri con algodón humedecido) durante 15 minutos más. Contar las plaquetas de 25 cuadraditos mínimos, del retículo central que se emplea para recuento de glóbulos rojos. Las plaquetas aparecen redondeadas, refringentes y aumentadas de volumen por la hipotonía del Diluyente. Se favorece la observación imprimiendo un ligero movimiento al botón micrométrico del microscopio. Cálculos Multiplicar el número de plaquetas de los 25 cuadraditos por 3.200; el resultado es el número de plaquetas por milímetro cúbico. El factor 3.200 al que nos hemos referido, proviene de los siguientes cálculos: 10 X 16 X 20 = 3.200, donde: * factor 10 (altura de la cámara 0,1 mm) * factor 16 (400/25) Superficie contada, 1/16 del total del retículo. * factor 20 (dilución de la muestra en la pipeta) Valores normales: 150.000 a 450.000 plaquetas por milímetro cúbico. Importante Si se utiliza sangre recogida con anticoagulante debe vigilarse que el frasco de recolección esté perfectamente limpio, lo mismo que el tapón, pues de lo contrario puede observarse aglutinación parcial de las plaquetas. Si se utiliza sangre del pulpejo debe procurarse recoger la muestra dejando que la sangre fluya libremente, sin hacer excesiva presión sobre el dedo. La utilización de material siliconado (incluyendo pipetas) asegura excelentes resultados, especialmente en cuanto a reproducibilidad. Fuente: www.biopur.com.ar OBSERVACIONES Las plaquetas se cuentan más fácilmente utilizando microscopio de contraste de fase, pero si el microscopio de luz se adecúa correctamente y el conteo se hace con un estricto control de calidad el resultado será igualmente confiable. Especial atención debe tenerse con las soluciones diluentes. Estas no deben estar contaminadas, pues tanto las partículas como las bacterias pueden ser similares a las plaquetas. Los líquidos diluentes se deben mantener refrigerados y filtrar antes de su uso. La limpieza de la cámara de Neubauer y de las pipetas es importante en este procedimiento. Si se observan agregados en el recuento, el procedimiento debe repetirse. El uso de EDTA como anticoagulante ayuda a disminuir la agregación plaquetaria. El rango de error para el recuento de plaquetas en el microscopio de luz es de 16 – 25%. No se debe informar el recuento de plaquetas sin confrontarlo con el extendido de sangre periférica, coloreado con Wright. Existen dos métodos para el conteo de plaquetas: manual y electrónico. El electrónico (dado por los contadores hematológicos), es muy bueno y da otros parámetros. Su estudio aporta, además del valor numérico, otros parámetros de importancia diagnóstica, tales como promedio del volumen plaquetario e histograma plaquetario. A esta valoración la llamamos plaquetograma. Los contadores hematológicos son muy caros y es muy difícil disponer de uno en un laboratorio de un centro periférico. En todo caso, están disponibles en laboratorios de centros de mayor complejidad.
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BIBLIOGRAFÍA BERRIO Margarita, CORREA María Cecilia, JIMENEZ Marta Elena. El hemograma. Editorial Universidad de Antioquia. 2003.
Fotos que muestran contadores manuales. (Asimismo, en algunos países los denominan "cuenta ganado" o "cuenta personas")
HEMOGLOBIN
HEMOGLOBIN CAL
Hemoglobina Drabkin. Colorimétrico 2. 3.
Determinación cuantitativa de hemoglobina IVD Conservar a 2-8ºC
PRINCIPIO DEL METODO La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada1,2.
Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. Pipetear: Blanco 5,0 ---
RT (mL) HEMOGLOBIN CAL (µL) Muestra (µL) 4. 5.
Patrón 5,0 20 --
Muestra 5,0 -20
Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (15-25ºC). Leer la absorbancia (A) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo.
CALCULOS 2
SIGNIFICADO CLINICO La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias. Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud1,5,6. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio. REACTIVOS HEMOGLOBIN 50x HEMOGLOBIN CAL
Ferricianuro de potasio Cianuro de potasio Dihidrogeno fosfato de potasio
0,60 mmol/L 0,90 mmol/L 2 mmol/L
Patrón de Hemoglobina 15 g/dL Origen animal
PRECAUCIONES HEMOGLOBIN Ref: 1001230 Nocivo (Xn): R20/21/22: Nocivo por inhalación, ingestión y en contacto con la piel. S7: Mantener el recipiente bien cerrado. S/28.1: En contacto con la piel, lavar inmediatamente y abundantemente con agua. S45: En caso de accidente o malestar, acudir inmediatamente al medico. Cianuro (venenoso): La concentración de cianuro en el Reactivo concentrado (50x) es sensiblemente menor que la dosis mínima letal para el adulto. Su acidificación puede provocar liberación de ácido cianhídrico.
PREPARACION Reactivo de trabajo (RT): - Para 5 mL 4,9 mL agua destilada + 2 gotas de Reactivo - Para 250 mL 245 mL agua destilada + 1 frasco (5 mL) de Reactivo Mezclar bien. Estabilidad: 2 meses en nevera a 2-8ºC, protegido de la luz. CONSERVACION Y ESTABILIDAD Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos: - Presencia de partículas y turbidez. - Absorbancia (A) del Blanco a 540 nm ≥ 0,01. MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 540 nm. - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS 1 Sangre capilar o venosa . Usar anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato. Estabilidad de la muestra: 1 semana a 2-8ºC. PROCEDIMIENTO 1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . 15-25ºC
- Con factor : (A) Muestra x 36,77 = g/dL de hemoglobina en la muestra - Con Patrón: ( A ) Muestra x 15 (Conc. Patrón) = g/dL de hemoglobina en la muestra ( A ) Patrón CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio debe disponer su propio Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias. 1
VALORES DE REFERENCIA Hombres 14 - 18 g/dL ≅ 8,7 - 11,2 mmol/L Mujeres 12 - 16 g/dL ≅ 7,5 - 9,9 mmol/L Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CARACTERISTICAS DEL METODO Rango de medida: Desde el limite de detección de 0,1 g/dL hasta el limite de linealidad de 20 g/dL. Si la concentración de la muestra es superior al limite de linealidad, diluir 1/2 con ClNa 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2. Precisión:
Media (g/dL) SD CV (%)
Intraserie (n= 20) 8,00 15,2 0,29 0,33 3,59 2,19
Interserie (n= 20) 7,81 15,1 0,19 0,26 2,51 1,74
Sensibilidad analítica: 1 g/dL = 0,027 A. Exactitud: Los reactivos de SPINREACT no muestran diferencias sistemáticas significativas cuando se comparan con otros reactivos comerciales.
Las características del método pueden variar según el analizador utilizado. INTERFERENCIAS Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren en la 3,4 determinación de la hemoglobina . NOTAS SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de este reactivo en distintos analizadores. BIBLIOGRAFIA 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Franco R S. Hemoglobin. Kaplan A et al. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis. Toronto. Princeton 1984; 1294-1296 and 418. Van Kampen EJ et al. Standarization of hemoglobinometry Clin. Chim 1961;6: 438-544. Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed. AACC 2001. Burtis A. et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. AACC 1999. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. AACC 1995.
PRESENTACION
HEMOGLOBIN
Ref: 1001230
Cont.
4 x 5 mL
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10. QUÍMICA SANGUÍNEA 10.1 VALORACIÓN DE
LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE: MÉTODO DE LA O-TOLUIDINA 1
La determinación de la glucosa (azúcar) sanguínea es necesaria para establecer el diagnóstico de la diabetes mellitus y otras enfermedades en que existen alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos. En el curso de esta enfermedad se suele encontrar glucosa en la orina (véase la sección 7.2.4). 1Este método también es usado para medir la concentración de glucosa en LCR. La determinación de glucosa en el LCR es necesaria para diagnosticar casos de meningitis (véase la sección 8.3.4). 10.1.1 Principio Primeramente se provoca la precipitación de las proteínas de la sangre por medio de ácido tricloroacético. En el producto resultante, filtrado, la glucosa reacciona con la ortotoluidina y se forma un color verde, cuya intensidad se mide en un colorímetro fotoeléctrico (o un espectrofotómetro) a 630 nm. Teoría de la medición El grupo aldehído de las aldosas tales como la glucosa y la fructosa forma un producto de condensación colorido con aminas aromáticas en una reacción estequiométrica. El producto de reacción coloreado, soluble en agua tiene su máximo de absorción a 635 nm de longitud de onda y la absorbancia de la solución es proporcional a la concentración. En este método de determinación de glucosa, una amina aromática primaria, o-toluidina, reacciona en ácido acético glacial caliente con el grupo aldehído terminal de la glucosa para producir un color azul-verde. La absorbancia de este producto se mide fotométricamente y la glucosa se puede calcular. La absorbancia en la región de 600 a 700 nm es directamente proporcional a la concentración de glucosa. (Leer la bibliografía consultada.)
10.1.2 Materiales y reactivos ● Un fotocolorímetro o espectrofotómetro ● Tubos cónicos para centrifugación y tubos de ensayo de mayor tamaño (con capacidad para 20 ml) ● Gradilla ● Centrífuga ● Reloj o temporizador capaz de medir los tiempos indicados en la técnica ● Pipetas para sangre (Sahli) de 0,2 ml o micropipeta para 200 µl ● Pipetas graduadas de 0,5 ml, 1,0 ml, 5,0 ml ● Cubetas espectrofotométricas de caras paralelas ● Un baño maría en ebullición a 100 ºC ● Reactivos para glucosa (reactivo No. 30) (a) ácido tricloroacético en solución de 30 g/l (3%) (b) reactivo de ortotoluidina (c) ácido benzoico en concentración de 1 g/l (0,1%) (d) solución normal de referencia para glucosa (reserva) (100 mmol/l) (e) soluciones normales de trabajo de referencia para trabajar con glucosa (2.5, 5.0, 10, 20 y 25 mmol/l) ● Muestra: Sangre entera (capilar o venosa), plasma o suero obtenidos del paciente en ayunas2, LCR, orina ● Suero control Suero control: Se deberá usar un suero control con cada lote de muestras para ensayo. Si los resultados obtenidos con el suero control son correctos, se podrá suponer que también lo serán los que se obtengan con la sangre del paciente. 2Si se emplea sangre venosa es conveniente utilizar oxalato de flúor (reactivo No. 26) como anticoagulante. De este modo se evitará que la glucosa se descomponga en la sangre. El suero es el material de preferencia para trabajar con glucosa. El método también admite sangre total o plasma obtenido con oxalato de flúor. a) Recolección: - Suero o plasma: se debe obtener suero de la manera usual o plasma recolectado con anticoagulante oxalato de flúor. Si se usa suero, colocar la sangre recién extraída en un tubo cónico de centrífuga sin anticoagulante y centrifugar a 2500 rpm aproximadamente durante 10 minutos. Para obtener plasma, centrifugar de manera similar. - Orina: si se trata de una muestra aislada, utilizar preferentemente orina fresca. Puede realizarse el ensayo en orina de 24 horas. En este caso, recolectar la muestra en un recipiente oscuro. - LCR: en caso de utilizar LCR, el ensayo debe realizarse en forma inmediata a la obtención de la muestra.
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Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la destrucción enzimática de la glucosa sanguínea (glucólisis) por hematíes y leucocitos es proporcional a la temperatura a la que se conserva la sangre, siendo máxima a 37 oC. Este proceso no se inhibe aún en estado de congelación, por lo que la sangre debe centrifugarse dentro de las 2 horas de la extracción. El sobrenadante límpido se transfiere a otro tubo para su conservación. De esta forma la glucosa es estable 4 horas a temperatura ambiente o 24 horas refrigerada. En caso de no poder procesarse la muestra de la forma indicada, deberá adicionarse un conservador en el momento de la extracción. El LCR puede contaminarse con bacterias y otras células por lo que la determinación debe realizarse de inmediato. En caso de no poder procesarse de esta manera, centrifugar el LCR y conservarlo 3 días a 2-10 oC o 5 horas a 2025 oC. 10.1.3 Método Procedimiento previo antes de la medición En esta etapa se debe trabajar con los tubos cónicos de centrífuga. Aquí se procede a realizar la precipitación de las proteínas plasmáticas mediante el agregado de TCA. Prepare 3 tubos cónicos (o más, si se necesitan) y márquelos de la manera siguiente: — Tubo Blanco: B (etiquete con la letra B) — Tubo de referencia: R (etiquete con la letra R) — Tubo del paciente: P (etiquete con la letra P; P de “Paciente” o “Problema”) Aclaración: Si se lleva a cabo más de un ensayo, esto es, si hay más muestras correspondientes a varios pacientes, coloque en cada tubo cónico una etiqueta con el nombre y el número que correspondan a cada paciente. Por ej., si hay 4 pacientes a los cuales se les medirá la glucosa se etiquetarán cada uno de los siguientes tubos cónicos con las letras “P1, P2, P3, P4” o en su defecto el nombre de cada uno de los pacientes en su respectivo tubo cónico. Todos estos tubos cónicos se procesan junto con un tubo cónico blanco “B” y un tubo cónico de referencia “R”. Entonces, las operaciones previas exigen que se etiquete estos tubos cónicos. Tratamiento de la muestra 1. Por medio de una pipeta coloque en cada tubo cónico para centrifugación 1,8 ml de solución de ácido tricloroacético (TCA). Si se usan 3 tubos cónicos poner en los 3 la misma cantidad de TCA. Proceder de igual forma si hay más muestras problema (1,8 ml de TCA para cada uno). Nota: el ácido tricloroacético es corrosivo. Úsese con cuidado. 2. Con una pipeta para sangre de 0,2 ml (o con una micropipeta de 200 µl), deposite precisamente 0,2 ml de sangre total, suero o plasma1 (B en la Fig. 10.1) en el fondo del tubo cónico; es decir, debajo de la solución de ácido tricloroacético (A en la Fig. 10.1). La solución de ácido tricloroacético se enturbiará al ponerse en contacto con la sangre. 3. Suba la pipeta (o la punta de la micropipeta) dentro del tubo cónico y aspire la solución clara de ácido tricloroacético para enjuagar los residuos de sangre, plasma o suero (Fig. 10.2). 4. Sin sacar la pipeta del tubo expulse la solución de ácido tricloroacético que ha aspirado primero en el mismo tubo cónico de centrífuga (Fig. 10.3). 5. Mézclela bien (toda la solución se enturbiará) y déjela reposar 5 minutos. 1 Cuando esta prueba se lleva a cabo utilizando LCR, el volumen requerido en este paso es mayor (0,8 ml). Blanco y Referencia 6. Para preparar el blanco de reactivo y el estándar de trabajo de referencia de glucosa proceda exactamente de la misma forma que se explicó antes en los puntos anteriores para con la muestra. En estos casos, usando una pipeta para sangre limpia (o una micropipeta con puntas limpias), coloque 0,2 ml de agua destilada en el tubo cónico etiquetado con la letra B y 0,2 ml de solución de referencia de trabajo de glucosa en el tubo cónico etiquetado con la letra R. Estos tubos serán usados para preparar el blanco de reactivo y el estándar de trabajo de referencia de glucosa, respectivamente. En estos tubos (B y R) no se producirá turbidez. 7. Coloque todos los tubos cónicos marcados en la centrífuga y centrifúguelos a 3000 g durante 5 minutos. En el tubo que contiene la muestra de sangre (o suero) las proteínas precipitadas sedimentan y se obtiene un líquido sobrenadante claro. Luego de finalizada la centrifugación, saque los tubos cónicos de los portatubos de la centrífuga y colóquelos en una gradilla que esté ubicada sobra una plataforma horizontal firme y estable alejada de las vibraciones para poder trabajar. Recuerde que los tubos cónicos con muestra poseen un sedimento que no se debe resuspender. En esta técnica, se trabaja con el sobrenadante.
Figura 10.1 Colocando sangre debajo de una solución de ácido tricloroacético con una pipeta de sangre. A: solución de ácido tricloroacético; B: sangre. Figura 10.2 Enjuague la pipeta de la sangre con solución de ácido tricloroacético. Figura 10.3 Expulsando solución de ácido tricloroacético en un tubo de centrífuga.
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A B A) Mezcle el contenido de cada tubo. Mézclela bien (toda la solución se enturbiará) y déjela reposar 5 minutos. B) Centrifúguela a 3000 g durante 5 minutos a fin de que las proteínas precipitadas se sedimenten y se pueda obtener un líquido sobrenadante claro. Técnica de medición 8. Prepare 3 tubos de ensayo grandes (o más, si se necesitan) y márquelos de la manera siguiente (Fig. 10.4): — Tubo Blanco: B — Tubo de referencia: R — Tubo del paciente: P Nota: Si se lleva a cabo más de un ensayo coloque en cada tubo P una etiqueta con el nombre y el número que correspondan a cada paciente. 9. Con las pipetas graduadas correspondientes deposite en cada tubo lo siguiente: — En el tubo marcado blanco: — 0,5 ml de agua destilada y — 3,5 ml del reactivo de ortotoluidina — En el tubo de referencia: — 0,5 ml de solución de referencia para trabajar con glucosa y — 3,5 ml del reactivo de ortotoluidina — En el tubo del paciente: — 0,5 ml del líquido sobrenadante y — 3,5 ml del reactivo de ortotoluidina Nota: el reactivo de ortotoluidina es corrosivo; si es posible, utilice una propipeta para aspirar el líquido al interior de la pipeta. 10. Mezclar el contenido de cada tubo. Coloque todos los tubos en el baño maría de agua a 100 °C (en ebullición) durante exactamente 12 minutos, a fin de que se forme el color verde (Fig. 10.5). 11. Saque los tubos del baño maría y déjelos enfriar durante 5 minutos en un vaso para análisis lleno de agua fría. 12. Mida la intensidad del color que se ha formado por medio de un fotocolorímetro o en un espectrofotómetro con longitud de onda de 630 nm: A. Coloque el filtro de color rojo anaranjado en el fotocolorímetro (rango que cubre 630 nm) o seleccione en el espectrofotómetro (EF) la longitud de onda de 630 nm. B. Llene el tubo de fotocolorímetro o cubeta espectrofotométrica de caras paralelas con la solución contenida en el tubo marcado B (en blanco) y colóquelo en el fotocolorímetro. C. Ajuste la lectura del fotocolorímetro o del EF a cero con la cubeta que contiene la solución B conservando esta cubeta en su sitio. D. Deseche la solución B de la cubeta; enjuague ésta con una pequeña cantidad de la solución R (referencia); deseche esta pequeña cantidad de la solución y llene la cubeta de nuevo con solución R; coloque otra vez la cubeta en el colorímetro y vea en el tablero o pantalla el grado de absorbancia, AR E. Deseche la solución R de la cubeta; lávela con una cantidad reducida de la solución P (paciente); deseche también ésta y a continuación llene la cubeta con solución P; coloque la cubeta en el fotocolorímetro (o EF) y observe el grado de absorbancia, AP. Calibración del fotocolorímetro Antes de tomar las mediciones, preparar una curva de calibración empleando las diferentes concentraciones de la solución de referencia de trabajo de glucosa tratada como se describe en los pasos 6-9. El gráfico debe ser lineal hasta la concentración más alta y debe pasar por el origen. Prepare un nuevo gráfico cada vez que se renueva el reactivo o-toluidina, para confirmar la linealidad.
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A
Figura 10.4 Etiquetar los tubos de ensayo para la prueba. B: Tubo blanco; R: Tubo de referencia; P: Tubo del paciente. A) Mezcle el contenido de cada tubo.
Figura 10.5 El calentamiento de los tubos de ensayo en un baño maría de agua a 100 ºC para que se forme el color verde.
10.1.4 Resultados Cálculo Calcular la concentración de glucosa en la muestra de sangre usando la siguiente fórmula1: Concentración de glucosa en sangre (mmol/l) = (AP/AR) x C Donde: AP = Lectura de la absorbancia de la muestra del paciente AR = Lectura de la absorbancia de la solución de referencia de trabajo de glucosa C = Concentración de la solución de referencia de trabajo de glucosa. Nota: Si se ha incluido un suero de control, hacer el cálculo para que el suero coincida exactamente de la misma manera, sustituyendo Ac (Absorbancia de la solución de control) por AP en la fórmula. 1 El cálculo dado es para unidades SI. La fórmula para el cálculo de las concentraciones de glucosa en la sangre en las unidades tradicionales es el siguiente: Concentración de glucosa en (mg/100 ml) = Concentración de glucosa (mmol/l) x 1/0,0555 Rango de referencia Los rangos de referencia de las concentraciones de glucosa en la sangre de los pacientes en ayunas se muestran en la Tabla 10.1. Tabla 10.1 Concentraciones de glucosa en sangre en pacientes en ayunas Concentración de glucosa Líquido Unidades SI (mmol/l) Unidades tradicionales (mg/100 ml) Sangre venosa 3.3 a 5.5 60-100 Sangre capilar 3.9 a 5.5 70-100 Suero 3.9 a 6.4 70-115 Plasma 3.9 a 6.4 70-115 Valores altos y bajos Si se observan valores inusualmente altos o bajos, la prueba debe repetirse con el fin de confirmar los resultados, tal como se describe a continuación. Concentraciones superiores a 16,5 mmol/l: Diluya las soluciones T (testigo) y P (paciente) con cantidades iguales de ácido acético glacial. Coloque la solución B diluida en la cubeta del fotocolorímetro y ajuste el aparato en 0. Después vea en el tablero el grado de absorbencia AP con la solución P diluida en la cubeta. Calcule otra vez la concentración de glucosa utilizando la nueva cifra de AP y el valor de AR obtenido anteriormente. Multiplique el resultado por 2 (puesto que la solución P se ha diluido 1/2) para conocer la concentración verdadera de la glucosa. Concentraciones inferiores a 2,3 mmol/l: Si se obtienen cifras tan reducidas como éstas, repita todo el ensayo.
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En el paso 1 utilice 1,6 ml de solución de ácido tricloroacético (en vez de 1,8 ml) y en el paso 2 utilice 0,4 ml de sangre, suero o plasma (en vez de 0,1 ml). El ensayo y el cálculo del resultado se harán exactamente con el mismo procedimiento usado anteriormente. Divida el resultado en 4 para conocer la concentración verdadera de la glucosa. Método enzimático de la glucosa oxidasa Este método se viene usando desde hace mucho tiempo, y en la actualidad, su acceso es más fácil que en décadas anteriores. Este método ya ha reemplazado al de la ortotoluidina en muchas partes del planeta y en especial en los países subdesarrollados en donde llegó a varios lugares distantes hasta en los centros periféricos de salud más alejados. Léase el manual de instrucciones adjunto de un laboratorio comercial sobre la técnica enzimática para glucosa. Fuente: www.wiener–lab.com.ar Bibliografía consultada 1. Frings, C. S., Ratliff, C. R., and Dunn, R. T., Automated determination of glucose by a direct o-toluidine procedure. CLIN. CHEM. 16, 282 (1970). 2. Frings, C. S., Effect of dextrans on o-toluidine methods for glucose. CLIN. CHEM. 16, 618 (1970). (Letter to Ed.) 3. American Monitor Procedure Insert for “Trucose,” Literature No. 1051-P, Sept. 24, 1971, American Monitor Corp. 4. De Haan, J. B., and Roth, N., A new medium for the aldohexose-o-toluidine reaction: Direct microdeteriulnation of blood glucose. Z. Kim. Chem. Kim. Biochem. 7, 624 (1969). 5. Feteris, W. A., A serum glucose method without protein precipitation. Amer. J. Med. Technol. 31, 17 (1965). 6. Cooper, G. R., and McDaniel, V., Workshop Manual of Methods for the Determination of Glucose, American Society of Clinical Pathologists, Chicago, Ill. 1966, pp 70-75. 7. Fletcher, M. J., A colorimetric method for estimating serum triglycerides. Clin. Chim. Acta 22, 393 (1968). 8. Hugh Y. Yee, Edward S. Jenest, and Fred R. Bowles Modified Manual or Automated o-Toluidine System for Determining Glucose in Serum, with an Improved Aqueous Reagent Clinical Chemistry, Vol. 17, No. 2, 1971 103 - 107
10.2 ESTIMACIÓN
DE LA CONCENTRACIÓN DE UREA EN LA SANGRE: MÉTODO DE LA DIACETIL
MONOXIMA /TIOSEMICARBACIDA
La urea es un producto de desecho, que se forma en el hígado por la degradación de las proteínas. Pasa a la sangre, se filtra en los riñones y se excreta en la orina. Si los riñones no eliminan la urea, aumenta su concentración en !a sangre. Esto puede ocurrir cuando se lesionan los túbulos renales o disminuye la irrigación sanguínea de los riñones. 10.2.1 Principio Primeramente se precipitan las proteínas de la sangre por medio de ácido tricloroacético. La urea que se encuentra en el producto filtrado reacciona con la diacetilmonoxima en presencia del ácido, del reactivo oxidante y de la tiosemicarbacida, formándose un color rojo en la solución. La intensidad del color se mide en un colorímetro fotoeléctrico o en un EF a 520 nm. 10.2.2 Materiales y reactivos ● Fotocolorímetro o un espectrofotómetro (EF) ● Tubos cónicos y tubos de ensayo (para contener 20 ml) ● Centrífuga ● Reloj o temporizador capaces de cronometrar los tiempos indicados ● Pipetas, 50 µl, 0,1 ml, 0,5 ml, 5 ml (una micropipeta ajustable de 1 – 100 µl o dos micropipetas de volumen fijo para medir 50 µl y 100 µl respectivamente) ● Probetas, 50 ml ● Baño maría con agua a 100 °C ● Reactivos para Urea (reactivo n º 62): Ácido tricloroacético, solución al 5% - Solución madre de Diacetilmonoxima (Diacetilmonoxima estandarizada) - Reactivo de color - Solución de referencia madre o de reserva de Urea (Solución de referencia estandarizada para urea) (125 mmol/l) - Solución de referencia de trabajo de Urea (10 mmol/l) ● Reactivo ácido (reactivo no. 6) ● Blanco de reactivo (reactivo no. 11) ● sangre del paciente (tratada con sal dipotásica de EDTA, solución al 10% (reactivo Nº 22)), suero o plasma ● Suero control. Un suero de control (de concentración conocida) se debe utilizar con cada lote de pruebas. Si el resultado de la prueba con el suero de control es correcto, se puede suponer que los resultados del paciente también serán correctos. 10.2.3 Método 1. Preparar el reactivo de color inmediatamente antes de su uso, usando una mezcla 1:1 de la solución madre de diacetil monoxima y reactivo ácido. Preparar al menos 15 ml de reactivo de color para cada prueba. . Mezcle el reactivo en un tubo de ensayo grande o en un matraz pequeño. 2. Pipetear en un tubo cónico de centrífuga 50 µl de sangre completa (tratada con una solución de sal de EDTA dipotásico), suero o plasma. 3. Añadir 1 ml de solución de ácido tricloroacético y mezclar. La mezcla se enturbiará. Centrifugar a alta velocidad (3000 g) durante 5 minutos para sedimentar las proteínas precipitadas y obtener un líquido sobrenadante claro. 4. Tome tres (o más si es necesario) tubos de ensayo grandes y etiquételos como se muestra en la Fig. 10.4:
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- Tubo Blanco (B) - Tubo de Referencia (R) - Tubo del Paciente (P). Nota: Si se realiza más de una estimación, coloque etiquetas en cada uno de los tubos P con el nombre o número del paciente. 5. Pipetear en cada tubo de la siguiente manera: ● Blanco: -0,1 ml de blanco de reactivo -3,0 ml de reactivo de color recién preparado. ● Referencia: -0,1 ml de la solución de referencia de trabajo -3,0 ml de reactivo de color recién preparado. ● Paciente: -0,1 ml de líquido sobrenadante -3,0 ml de reactivo de color recién preparado. 6. Mezclar el contenido de cada tubo. Luego coloque todos los tubos en el baño de agua a 100 °C durante 15 minutos (ver Fig. 10.5) para permitir que el color rojo se desarrolle. 7. Retire los tubos y colocarlos en un recipiente con agua fría hasta que se enfríen a temperatura ambiente. 8. Mida el color producido en un colorímetro a una longitud de onda de 520 nm. (A) Coloque el filtro verde en el fotocolorímetro, o en un EF seleccione la longitud de onda de 520 nm. (B) Llenar el tubo o cubeta del fotocolorímetro con la solución contenida en el tubo marcado B (blanco) y colóquelo en el fotocolorímetro o EF en la respectiva cámara para cubetas. (C) Ajuste la lectura del fotocolorímetro a cero con la cubeta que contiene la solución B en la cámara para cubetas. (D) Vaciar la solución B de la cubeta, luego enjuague la cubeta con una pequeña cantidad de solución de trabajo de referencia R (referencia), desechar esto, y luego llenar la misma cubeta con solución de R, poner la cubeta con la Sol. R en la cámara de la cubeta del fotocolorímetro y leer la absorbancia, AR. (E) Vaciar la solución R de la cubeta, luego enjuague la cubeta con una pequeña cantidad de solución de P (paciente), deseche esto, y luego llenar la misma cubeta con solución de P, poner la cubeta con la Sol. P en la cámara de la cubeta del fotocolorímetro y leer la absorbancia, AP.
A
Figura 10.4 Etiquetar los tubos de ensayo para la prueba. B: Tubo blanco; R: Tubo de referencia; P: Tubo del paciente. A) Mezcle el contenido de cada tubo.
Figura 10.5 El calentamiento de los tubos de ensayo en un baño maría de agua a 100 ºC para que se forme el color rojo.
10.2.4 Resultados Cálculo Calcular la concentración de urea en la sangre de la siguiente manera1:
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Concentración de urea (mmol/l) = (AP/AR) x C Donde: AP = Lectura de la absorbancia de la muestra del paciente AR = Lectura de la absorbancia de la urea de trabajo estándar de referencia C = concentración de estándar de referencia de trabajo (10 mmol/l). 1El cálculo dado es para unidades SI. La fórmula para el cálculo de las concentraciones de urea en sangre en unidades tradicionales es el siguiente: Concentración de urea (mg/ 100ml) = concentración de urea en (mmol/l) x 1/0,167 Rango de referencia El rango de referencia de las concentraciones de urea en la sangre es de aproximadamente 3-7 mmol / l (18-42 mg/100 ml). Valores altos Si se obtiene un valor mayor que 25 mmol/l (150 mg/100 ml), repetir toda la prueba, usando 0,1 ml de sangre completa (tratada con una solución de sal de EDTA dipotásico), suero o plasma como en el paso 2. Realice la prueba y calcular los resultados exactamente como antes, pero el resultado se divide por dos para obtener la concentración de urea verdadera. Método enzimático para la medición de urea Este método se viene usando desde hace mucho tiempo, y en la actualidad, su acceso es más fácil que en décadas anteriores. En muchas partes del planeta y en especial en los países subdesarrollados en donde llegó a varios lugares distantes hasta en los centros periféricos de salud más alejados. Léase los manuales de instrucciones adjuntos de un laboratorio comercial sobre las técnicas enzimáticas para urea. Fuente: www.wiener–lab.com.ar
Uremia Para la determinación de urea en suero, plasma y orina
SIGNIFICACION CLINICA La urea constituye la fracción de nitrógeno no proteico más importante en la mayoría de los líquidos biológicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico. Se produce en el hígado y es excretada por la orina a través de los riñones. Una elevación de la concentración sérica de urea, se interpreta generalmente como una posible disfunción renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores séricos de urea se encuentran íntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier alteración en estas variables se traducirá en un cambio de la concentración de urea en suero. FUNDAMENTOS DEL METODO La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoníaco; éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: reactivo desecado conteniendo fenol y nitroferricianuro de sodio. B. Reactivo B: reactivo concentrado de hipoclorito de sodio e hidróxido de sodio. S. Standard: solución de urea 0,60 g/l. Concentraciones finales fenol ................................................................... 532 mmol/l nitroferricianuro de sodio ................................. 0,85 mmol/l hipoclorito de sodio .......................................... 36,6 mmol/l hidróxido de sodio ............................................. 0,625 mol/l REACTIVOS NO PROVISTOS - Agua destilada. - Ureasa de Wiener lab.: solución estabilizada y tamponada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A; preparación: - 100 determinaciones: disolver con 95 ml de agua destilada. Mezclar por inversión hasta disolución completa. Fechar. - 500 determinaciones: disolver con 475 ml de agua destilada. Mezclar por inversión hasta disolución completa. Fechar. Reactivo B; preparación: - 100 determinaciones: disolver con 80 ml de agua destilada. Mezclar por inversión hasta disolución completa. Fechar.
- 500 determinaciones: disolver con 400 ml de agua destilada. Mezclar por inversión hasta disolución completa. Fechar. Standard: listo para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Reactivo A: nocivo. R20/22: nocivo por inhalación y por ingestión. S24/25: evítese el contacto con los ojos y la piel. S26/ 28: en caso de contacto con la piel y los ojos, lávese inmediatamente con abundante agua y acúdase a un médico. Reactivo B: irritante. R36/38: irrita los ojos y la piel. S26/28: en caso de contacto con ojos y piel, lávense inmediatamente y abundantemente con agua y acúdase a un médico. S37/39: usar guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Reactivos A y B: una vez reconstituidos son estables 1 año en refrigerador (2-10oC) y al abrigo de la luz, a partir de la fecha de su preparación. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Las contaminaciones con vapores amoniacales producen deterioro de los reactivos. Lecturas del Blanco > 0.150 D.O. indican contaminación con amoníaco, en tal caso desechar. Deben emplearse distintas pipetas para los Reactivos A y B y no deben intercambiarse las tapas de los frascos, ya que la contaminación de un reactivo con el otro produce su deterioro definitivo. MUESTRA Suero, plasma u orina a) Recolección: obtener de la manera usual. b) Aditivos: en caso de que la muestra a usar sea plasma se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Sustancias interferentes conocidas: - Los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la acción de la ureasa.
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- La hemólisis intensa puede producir resultados falsamente elevados que no sobrepasan el 5%. Esta interferencia puede corregirse con un Blanco de suero. - No se observan interferencias por hemólisis ligeras o moderadas y bilirrubina hasta 400 mg/l. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la urea en suero o plasma es estable varios días en refrigerador o 6 meses en congelador, sin agregado de conservantes. En orinas de pH < 4 es estable 4-5 días en refrigerador (2-10oC). MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotómetro - Micropipetas y pipetas - Baño de agua a 37oC - Reloj o timer
Densidad hasta 1,015 ................................ diluir 1/10 Densidad de 1,016 a 1,025 ........................ diluir 1/20 Densidad mayor de 1,025 .......................... diluir 1/40 Como la orina contiene cantidades variables de amoníaco debe efectuarse un Blanco de orina (BD). Este Blanco se ejecuta igual que el Blanco de Reactivo (B), con la diferencia que, luego de agregar el Reactivo A y antes del B, se agregan 20 ul de la dilución de orina. Llevar el aparato a cero con el Blanco de Reactivos (B) y leer el Standard (S), el Blanco de orina (BD) y el Desconocido (D). ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reacción final es estable 12 horas, por lo que la absorbancia debe ser leída en ese lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS Suero o plasma
CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 540 nm - Temperatura de reacción: 37oC - Tiempo de reacción: 20 minutos - Volumen de reacción: 12 ml - Volumen de muestra: 20 ul
Urea (g/l) = D x factor
factor =
BUN (g/l) = D x factor
factor =
PROCEDIMIENTO
Orina
I- TECNICA EN SUERO O PLASMA En tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido) colocar 1 ó 2 gotas de agua y agregar:
Urea (g/l) =
Standard Suero o plasma Ureasa
B
S
D
-
20 ul
-
-
-
20 ul
1 gota
1 gota
1 gota
Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37oC. Luego agregar: Reactivo A
1 ml
1 ml
1 ml
Reactivo B
1 ml
1 ml
1 ml
Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37oC. Luego agregar: Agua destilada 10 ml
10 ml
10 ml
Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 10 minutos leer en fotocolorímetro con filtro verde (510550 nm) o en espectrofotómetro a 540 nm, llevando a cero con el Blanco. II- TECNICA EN ORINA Se sigue la misma técnica que para sangre utilizando orina diluida con agua o solución fisiológica. Como el contenido de urea está relacionado con la densidad, es conveniente diluir según el siguiente esquema:
(D-BD) x 0,60
0,60 g/l S 0,28 g/l S
x dilución
S METODO DE CONTROL DE CALIDAD Si la muestra a ensayar es suero, procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con concentraciones conocidas de urea, con cada determinación. En el caso de muestras de orina, utilizar un control con base de orina. CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI Urea (g/l) x 16,67 = Urea (mmol/l) BUN (mg/dl) x 0,357 = Urea (mmol/l) VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma Sobre un total de 1700 individuos de ambos sexos, con edades comprendidas entre los 20 y 45 años, concurrentes al consultorio externo de un servicio hospitalario en la zona de Rosario (Argentina) sin patología renal manifiesta (con control de diuresis y densidad urinaria), el 95% de los valores de uremia en suero estuvo comprendido entre 0,20 g/l y 0,45 g/l. Orina Normalmente, la eliminación de urea está sujeta a grandes variaciones dependientes de la dieta. Por término medio, y con una dieta mixta corriente, se excretan unos 30 g en 24 horas, con oscilaciones comprendidas entre 20 g y 40 g.
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Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
SIMBOLOS Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Evitar contaminaciones con amoníaco provenientes del ambiente (humo de cigarrillo, vapores amoniacales).
C
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra, se obtuvo:
V
Uso diagnóstico "in vitro"
X
Contenido suficiente para ensayos
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
G
No congelar
F
Riesgo biológico
Nivel 0,36 g/l 1,02 g/l
D.S. ± 0,016 g/l ± 0,035 g/l
C.V. 4,4 % 3,4 %
b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de urea a distintos sueros, se obtuvo una recuperación entre 94,7% y 101,3%. c) Rango dinámico: cuando el resultado obtenido sobrepasa los 1,5 g/l de urea, debe diluirse la solución final 1/3 empleando como diluyente Blanco de Reactivos y efectuando la lectura luego de 10 minutos de efectuada la dilución. El resultado obtenido debe multiplicarse por la dilución efectuada. d) Sensibilidad analítica: depende del fotómetro empleado y de la longitud de onda. En espectrofotómetros con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor, para un ΔA de 0,001 el mínimo cambio de concentración detectable será de 0,003 g/l. PRESENTACION - 100 determinaciones (Cód. 1810057) - 500 determinaciones (Cód. 1810058)
P Representante autorizado en la Comunidad Europea
Volumen después de la reconstitución Cont.
Contenido
g
Número de lote
M
Elaborado por:
Xn
Nocivo Corrosivo / Caústico
Xi
Wiener lab. provee separadamente: - Ureasa x 100 determinaciones (Cód. 1810054) - Ureasa x 500 determinaciones (Cód. 1810055) - Ureasa x 3000 determinaciones (Cód. 1810061)
i Calibr.
BIBLIOGRAFIA - Stegemann, H.; et al. - Z. Physiol. Chem. 329:241 (1962). - Fawcett, J. K.; Scott, J. E. - Brit. J. Clin. Path. 13:156 (1960). - Searcy, R. L. et al. - Am. J. Med. Techn. 27:255 (1961). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.
b b c h
Irritante Consultar instrucciones de uso Calibrador Control Control Positivo Control Negativo Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Disp. Nº: 252/75-145/99
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Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina UR120327
Urea color
C
Para la determinación de urea en líquidos biológicos
SIGNIFICACION CLINICA La urea constituye la fracción de nitrógeno no proteico más importante en la mayoría de los líquidos biológicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico. Se produce en el hígado y es excretada por la orina a través de los riñones. Una elevación de la concentración sérica de urea, se interpreta generalmente como una posible disfunción renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores séricos de urea se encuentran íntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier alteración en estas variables se traducirá en un cambio de la concentración de urea en suero.
Reactivo B: irritante. R36/38: Irrita los ojos y la piel. S26: En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. S37/39: Úsense guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.
FUNDAMENTOS DEL METODO La ureasa descompone específicamente la urea produciendo dióxido de carbono y amoníaco. Este reacciona en medio alcalino con salicilato e hipoclorito para dar indofenol color verde.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Valores de Blanco superiores a 0,150 D.O. son indicio de deterioro de los reactivos. En tal caso desechar.
REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: solución concentrada conteniendo buffer fosfatos 200 mmol/l, ácido salicílico 750 mmol/l, nitroprusiato de sodio 20 mmol/l y EDTA 10 mmol/l. B. Reactivo B: solución concentrada de hipoclorito de sodio 10 mmol/l en hidróxido de sodio 0,1 mol/l. C. Reactivo C: ureasa ≥ 75 U/ml en solución glicerinada. S. Standard: solución de urea 0,60 g/l (28,04 mg/dl de BUN). REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A; preparación: diluir 1 parte del Reactivo A concentrado + 4 partes de agua destilada. Reactivo B; preparción: diluir 1 parte del Reactivo B concentrado + 4 partes de agua destilada. Reactivo A+C: se prepara agregando 4 ml de Reactivo C cada 100 ml de Reactivo A. Pueden prepararse otras cantidades mientras se respete la proporción indicada. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Reactivos A y B: estables durante 1 año a partir del momento de su preparación conservados en refrigerador (2-10oC). La mezcla de Reactivo A+C es estable durante 20 días en refrigerador (2-10oC) a partir del momento de su preparación.
MUESTRA Suero, plasma u orina a) Recolección: obtener de la manera usual. b) Aditivos: en caso de que la muestra a usar sea plasma se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Sustancias interferentes conocidas: - Los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la acción de la ureasa. - No se observan interferencias por hemólisis ligeras o moderadas y bilirrubina hasta 400 mg/l. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la urea en suero es estable varios días en refrigerador (2-10oC) o 6 meses en congelador, sin agregado de conservadores. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotómetro o fotocolorímetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. - Baño de agua a 37oC (opcional). - Reloj o timer. CONDICIONES DE REACCION - Temperatura de reacción: 37oC o temperatura ambiente. - Tiempo de reacción: 10 minutos a 37oC o 20 minutos a temperatura ambiente. - Volumen de reacción: 2 ml - Volumen de muestra: 10 ul
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PROCEDIMIENTO I) TECNICA PARA SUERO O PLASMA En tres tubos marcados B (Blanco), D (Desconocido) y S (Standard) colocar: B
S
Standard
-
10 ul
-
Suero o plasma
-
-
10 ul
1 ml
1 ml
1 ml
Reactivo A+C
D
Mezclar. Incubar 5 minutos a 37oC o 10 minutos a temperatura ambiente. Luego agregar: Reactivo B
1 ml
1 ml
1 ml
o
Mezclar. Incubar 5 minutos a 37 C o 10 minutos a temperatura ambiente. Leer en espectrofotómetro a 570 nm o en fotocolorímetro con filtro naranja (560-580 nm). II) TECNICA PARA ORINA Se sigue la misma técnica que para suero o plasma utilizando orina diluida con agua o solución fisiológica. Como el contenido de urea está generalmente relacionado con la densidad, es conveniente diluir según el siguiente esquema: Densidad hasta 1,015 .................................... diluir 1/10 Densidad de 1,016 a 1,025 ........................... diluir 1/20 Densidad mayor de 1,025 .............................. diluir 1/40 Como la orina contiene cantidades variables de amoníaco debe efectuarse un Blanco de orina (BD). Dicho Blanco se ejecuta igual que el Blanco de reactivos (B), con la diferencia que, después de agregado el Reactivo B, se agregan 10 ul de la dilución de orina. Llevar el aparato a cero con el Blanco de Reactivos (B) y leer el Standard (S), el Blanco de orina (BD) y desconocido (D).
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reacción es estable durante 2 horas por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS Suero o plasma: factor = S Orina: (D - BD) x 0,60 g/l Urea g/l =
VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma: 0,10 - 0,50 g/l Este rango se obtuvo de 120 muestras de individuos en ayunas, pertenecientes a ambos sexos, con edades comprendidas entre 20 y 45 años, provenientes de la ciudad de Rosario (Argentina), sin síntomas de disfunción renal u otra enfermedad aparente. Orina: normalmente, la eliminación de urea está sujeta a grandes variaciones dependientes de la dieta. Por término medio, y con una dieta mixta corriente, se excreta unos 30 g en 24 horas, con oscilaciones comprendidas entre 20 g y 40 g. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra en un mismo día se obtienen los siguientes resultados: Nivel 0,60 g/l 2,28 g/l
D.S. ± 0,008 g/l ± 0,045 g/l
C.V. 1,32 % 1,97 %
b) Linealidad: la reacción es lineal hasta 2,50 g/l. Si las lecturas resultan muy altas para el aparato empleado pueden utilizarse 1,5 ml de cada Reactivo y 10 ul de muestra para obtener la linealidad mencionada. Cuando la concentración de urea supera los 2,50 g/l o está por encima de la linealidad del aparato, puede diluirse la reacción final con el blanco. En estas condiciones es lineal hasta 5 g/l. c) Recuperación: agregando cantidades conocidas de urea a diferentes alícuotas de la misma muestra se obtuvo una recuperación entre 94,2 y 100,6%. d) Sensibilidad analítica: depende del fotómetro empleado y de la longitud de onda. En espectrofotómetros con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor, para un ∆A de 0,001 el mínimo cambio de concentración detectable será de 0,0125 g/l. PRESENTACION Equipo para 500 determinaciones (Cód. 1810050).
0,60 g/l Urea g/l = D x factor
CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI Urea (g/l) x 16,67 = Urea (mmol/l) BUN (mg/dl) x 0,357 = Urea (mmol/l)
x dilución
S METODO DE CONTROL DE CALIDAD Si la muestra a ensayar es suero, procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con concentraciones conocidas de urea, con cada determinación. En el caso de muestras de orina, utilizar un control con base de orina.
BIBLIOGRAFIA - Kim, H.S.; et al. - J. Korean Agr. Chem. Soc. 2:23 (1961). - Stergermann, H. et al. - Z. Physiol. Chem. 329:241 (1962). - Fawcett, J.K. et al. - Brit. J. Clin. Path. 13:156 (1960). - Searcy, R.L. et al. - Am. J. Med. Techn. 27:255 (1961). - Patton, C.J. et al. - Analytical Chem. 49/3:464 (1977). - Lorenzo, L.; Setta, F.; Demaría, I. - “Evaluación de un método de Berthelot modificado para dosar urea” - Revista ABA 55/2:76 (1991). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.
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Símbolos Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C P V X
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
M
Elaborado por:
Xn
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Nocivo
Uso diagnóstico "in vitro" Corrosivo / Caústico
Contenido suficiente para ensayos Xi
Irritante
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
!
No congelar
F
Riesgo biológico
Volumen después de la reconstitución
Cont.
g
Contenido
Número de lote
i
Consultar instrucciones de uso
Calibr.
Calibrador
b b c h
Control
Control Positivo
Control Negativo
Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Disp. Nº: 184/90-5266/98
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Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina UR120607
368
11. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS Y SEROLÓGICAS Muchas de las técnicas de diagnóstico utilizadas en inmunología se basan en el hecho que los antígenos y anticuerpos interactúan, esto es, la interacción entre el antígeno y el anticuerpo. La mayoría de las enfermedades infecciosas se diagnostican mediante aislamiento e identificación del microorganismo infeccioso en una muestra del paciente. En algunos casos, los microorganismos son difíciles de cultivar y aislar o pueden requerir técnicas especiales y, a menudo caras que no están disponibles para el diagnóstico rutinario. En otros trastornos inmunológicos no hay microorganismo per se para identificar o aislar. También hay algunas enfermedades inmunes "naturales" que se producen, a menudo clasificadas como enfermedades autoinmunes, que no son causadas por un microorganismo, pero pueden ser detectadas por algunas de las técnicas de diagnóstico empleadas en inmunología. Varias de estas técnicas detectan productos metabólicos específicos o anticuerpos y antígenos específicos. En aquellos estados patológicos en los que haya un microorganismo, estas pruebas inmunológicas no detectan el microorganismo directamente, pero proporcionan una evidencia de su presencia. Se describen una serie de técnicas de diagnóstico basadas en reacciones biológicas utilizando interacciones antígeno-anticuerpo. Está más allá del alcance de este manual entrar en detalles sobre el sistema inmunológico. El objetivo es introducir algunos conceptos y terminología en general del sistema inmunológico, lo que ayudará en la comprensión de algunas de las técnicas inmunológicas descritas. Tenga en cuenta que las diversas metodologías están disponibles para diferentes propósitos de diagnóstico, la elección debe basarse en la pregunta y de la disponibilidad de las instalaciones. Las técnicas de diagnóstico que se describen aquí son los que se utilizan con más frecuencia como una ayuda en el diagnóstico de ciertas enfermedades que causan una reacción inmunológica. 11.1 INTRODUCCIÓN A LA INMUNOLOGÍA El papel del sistema inmune es la defensa. El sistema inmune tiene ambos mecanismos no específicos y específicos para reconocer y responder en consecuencia a microorganismos extraños y potencialmente patógenos. Las defensas no específicas son barreras físicas o mecánicas, por ejemplo, la piel y las membranas mucosas. Estas barreras están ahí para evitar la entrada de agentes patógenos en el cuerpo. Estas barreras suelen funcionar muy bien, pero algunos patógenos logran entrar en el cuerpo donde son destruidos inmediatamente por los fagocitos como los macrófagos. Cuando los microorganismos patógenos entran en el cuerpo se activan los mecanismos de defensa específicos. Los mecanismos específicos se dividen en el humoral (mediado por anticuerpos) y los sistemas mediados por células o celular. El sistema humoral se asocia con las células conocidas como linfocitos B, que son los precursores de las células plasmáticas. Las células plasmáticas producen y secretan sustancias proteicas conocidas como anticuerpos o inmunoglobulinas. El sistema mediado por células está asociado con linfocitos T que pueden procesar y destruir cuerpos extraños. 11.1.1 Anticuerpos Los anticuerpos se encuentran en el suero, leche, saliva, lágrimas, orina y otros fluidos corporales. En los recién nacidos, la producción de anticuerpos está virtualmente ausente y la protección es proporcionada por los anticuerpos maternos principalmente a través de la leche materna y los que cruzan la placenta. Un niño en crecimiento está constantemente expuesto a varios antígenos ambientales los que promueven la producción de anticuerpos. En los seres humanos hay cinco clases principales de anticuerpos o inmunoglobulinas: Ig G, Ig M, Ig A, Ig E e Ig D. Estas proteínas difieren en su movilidad electroforética, la masa molecular relativa, estructura antigénica, coeficiente de sedimentación, la forma y otras propiedades. Todas las inmunoglobulinas tienen una estructura compuesta de cuatro cadenas polipeptídicas con dos cadenas largas o pesadas (H) y dos cadenas cortas o livianas (L) (Fig. 11.1). Dentro de estas cadenas H y L hay regiones conocidas como regiones constantes, en donde las secuencias de aminoácidos son regiones muy similares, y regiones variables (por lo general en los extremos de las cadenas), en donde las secuencias de aminoácidos son altamente variables. Las regiones variables dan a los diferentes anticuerpos su especificidad.
369
11.1.2 Antígenos Los antígenos son moléculas (usualmente proteínas) que pueden provocar una respuesta inmune. Los antígenos tienen sitios en su estructura conocidos como determinantes antigénicos que pueden ser reconocidos por los anticuerpos. Los antígenos pueden tener varios determinantes antigénicos de diferente configuración o varios de la misma configuración tal que los anticuerpos de la misma clase o de diferentes tipos pueden unirse a estos sitios. Varias propiedades pueden influir en la inmunogenicidad de un antígeno, los cuales se describen brevemente a continuación. Reconocimiento del antígeno como una sustancia extraña La propiedad más importante de un antígeno es la que permite que el cuerpo reconozca la sustancia como extraña. El sistema inmune de un individuo es normalmente capaz de distinguir las sustancias que pertenecen al cuerpo de las que no lo hacen (discierne lo propio de lo que no es propio o extraño). Ciertas condiciones incapacitan el mecanismo de auto-tolerancia y el sistema comienza a reaccionar en contra de sí mismo. Masa molecular relativa La masa molecular relativa o el tamaño de un antígeno también afecta su inmunogenicidad. Como regla general, las moléculas grandes son buenos antígenos (es decir, que son eficaces en la generación de una respuesta inmune), siempre que sean extrañas al organismo. Las moléculas pequeñas normalmente son antígenos pobres (poca o nula inducción de anticuerpos o capacidad inmunogénica). Complejidad Cuanto más compleja sea la molécula, mejor será la respuesta inmune al antígeno. Las proteínas complejas hacen "mejores" antígenos que los polímeros repetitivos de hidratos de carbono, lípidos y ácidos nucleicos. Estabilidad Es esencial para el antígeno ser estable para que pueda ser reconocido por el sistema inmune. Degradabilidad La sustancia debe ser degradable. Con el fin de iniciar una respuesta inmune, el sistema inmune debe ser capaz de procesar la sustancia. La vía de administración y la dosis de antígeno Los antígenos deben ser administrados correctamente. Algunas sustancias provocan una respuesta inmune si se administran por vía subcutánea, pero no si se administran por vía intravenosa. La dosis correcta es también importante, ya que demasiado antígeno o muy poco antígeno puede no provocar la respuesta inmune deseada. 11.1.3 Interacciones antígeno-anticuerpo La unión entre un antígeno y un anticuerpo puede ser comparado con el ajuste exclusivo que existe entre una cerradura y su llave. El determinante antigénico (la "cerradura") tiene una conformación predeterminada y sólo un anticuerpo específico (la "llave") con las regiones variables adecuadas (ranuras y contornos) dará un ajuste perfecto. Sin embargo, la situación no siempre es tan clara. A veces, un antígeno se combina (mal o deficientemente) con un anticuerpo que se ha producido contra un antígeno diferente, causando la reactividad cruzada. Para evitar estas interacciones no deseadas, es importante conocer y definir la sensibilidad y especificidad analítica de los ensayos inmunológicos basados en reacciones anticuerpo-antígeno. La sensibilidad analítica de un ensayo inmunológico se refiere a su capacidad para detectar pequeñas cantidades de antígeno o anticuerpo. Se utiliza como sinónimo para el límite de detección. La especificidad analítica de un ensayo inmunológico es su capacidad para medir sólo la sustancia que pretende medir.1 Estas consideraciones son importantes, sobre todo cuando se elige una nueva prueba. Otras consideraciones incluyen: Aplicabilidad en un entorno de laboratorio determinado, el costo y disponibilidad, nivel de experiencia requerido, velocidad y simplicidad. 1La sensibilidad y especificidad analítica de un ensayo inmunológico no deben confundirse con la sensibilidad y especificidad diagnóstica tal como se define para discriminar entre las poblaciones de enfermos y no enfermos. 11.2 PRINCIPIO
DE LAS TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS
370
Las reacciones antígeno-anticuerpo se pueden clasificar en tres grupos: Las reacciones de unión primaria, secundaria y terciaria. Sólo se describen aquí las reacciones de unión primaria y secundaria. Las reacciones terciarias siguen reacciones secundarias y por lo general se presentan In vivo. 11.2.1 Ensayos de unión primaria Este grupo de pruebas proporciona una medida directa de la reacción de unión inicial entre un antígeno y un anticuerpo. Este es un método muy sensible para el cual se necesita una marca para detectar la reacción de unión. Tales ensayos incluyen radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos y ensayos de inmunofluorescencia. Radioinmunoensayo En un radioinmunoensayo, ya sea un antígeno o un anticuerpo se conjuga con una substancia de marcado radiactivo y se mide la radiactividad con un contador de centelleo (Fig. 11.2). Este tipo de ensayo es cada vez menos común, en parte debido a la necesidad de sustancias radiactivas y también debido a que el equipo de medición requerido es difícil de usar. Aparte de ser muy caro.
Inmunoensayo enzimático En un inmunoensayo enzimático, un antígeno o un anticuerpo se conjugan con una enzima marcada y un cambio de color se produce por la reacción de la enzima con su sustrato. Este cambio se puede detectar visualmente o con un espectrofotómetro. El tipo de unión puede ser ya sea competitivo o no competitivo. La unión competitiva depende de la competencia entre un antígeno marcado (de cantidad conocida) y un antígeno no marcado (de cantidad desconocida) para el mismo anticuerpo (al medir el antígeno) o entre un anticuerpo marcado (de cantidad conocida) y un anticuerpo no marcado (de cantidad desconocida) para el mismo antígeno (cuando se mide el anticuerpo) (Fig. 11.3). La cantidad de unión del antígeno marcado (o anticuerpo) se relaciona con la cantidad de antígeno no marcado (o anticuerpo) presente. En la unión no competitiva (técnica de sándwich), el antígeno o anticuerpo es adsorbido (o inmovilizado) a una fase sólida, que puede ser una partícula insoluble (perla) o los lados de un tubo de ensayo o la parte inferior de una placa de microtitulación. A continuación, se añade la muestra de ensayo que contiene el anticuerpo o antígeno correspondiente. Un anticuerpo o antígeno marcado (conjugado) se añade al último para formar la capa superior del sándwich (Fig. 11.4). Cuando se prueba para un anticuerpo, el conjugado contendría anti-inmunoglobulina y cuando se prueba para un antígeno, el conjugado contendría un anticuerpo específico para ese antígeno. La cantidad de unión del conjugado está directamente relacionada con la cantidad de antígeno o anticuerpo en la muestra de ensayo y sólo la porción ligada o unida se mide en este ensayo. Un ejemplo de esta técnica es el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Las enzimas utilizadas en el ELISA incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, lisozima y galactosidasa. Los inmunoensayos enzimáticos están reemplazando a muchos radioinmunoensayos debido a sus ventajas con respecto a este último, que incluyen tiempo de conservación del reactivo más largo, equipo más barato y más simple, no hay normas restrictivas para la eliminación de reactivos (no hay reactivos radiactivos), y los reactivos son más seguros. - ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay
371
Inmunofluorescencia Los colorantes fluorescentes tales como el isotiocianato de fluoresceína y el isotiocianato de tetrametilrodamina se pueden acoplar a los anticuerpos sin destruir su especificidad. La fluorescencia se produce cuando las moléculas que han sido excitadas a un estado energético superior retornan a su estado normal de energía. El exceso de energía se libera en forma de luz. Un microscopio de fluorescencia, que es un microscopio óptico modificado, se utiliza para visualizar la luz emitida. Se pueden utilizar dos tipos de técnica de inmunofluorescencia. Inmunofluorescencia directa La inmunofluorescencia directa se utiliza cuando se ensaya un antígeno. En esta técnica un colorante fluorescente está unido a la porción aislada de un antisuero que contiene anticuerpos dirigidos contra un componente específico de células o de un tejido. El antisuero se aplica directamente a la muestra de tejido. El antígeno y el anticuerpo reaccionan, a continuación, la muestra de tejido se lava. La muestra de tejido se examina bajo el microscopio de fluorescencia y se ve en donde el anticuerpo se une al antígeno (Fig. 11.5).
Inmunofluorescencia indirecta La inmunofluorescencia indirecta se utiliza para determinar si los anticuerpos están presentes en el suero de un paciente. El suero se aplica directamente a una muestra de tejido apropiado que contiene un antígeno dirigido contra el anticuerpo específico bajo investigación. El antígeno y el anticuerpo reaccionan, a continuación, la muestra de tejido se lava. Se añade una antiinmunoglobulina con una marca fluorescente y posteriormente la muestra de tejido se incuba, antes de ser lavadas de nuevo. La anti-inmunoglobulina marcada se unirá a cualquier anticuerpo ya unido al antígeno en la muestra de tejido y se observa bajo el microscopio como áreas de fluorescencia (Fig. 11.6). El método indirecto es más sensible que el método directo, ya que se amplifica, en el sentido que cada anticuerpo no marcado puede ser ligado por dos anticuerpos marcados.
372
11.2.2 Ensayos de unión secundaria Los ensayos de unión secundarias permiten manifestaciones visibles después de la reacción primaria que se observa. En estas pruebas uno puede ver los efectos de la unión sin la ayuda de una marca adicional. Estas pruebas incluyen la aglutinación, la precipitación, las reacciones dependientes del complemento y los métodos de neutralización. Los métodos de aglutinación y precipitación se emplean de forma rutinaria para fines de diagnóstico. Estos métodos se describen brevementeacontinuación. Aglutinación La aglutinación implica la reacción de un anticuerpo con un antígeno particulado (insoluble) que conduce a la formación de grumos visibles de estas partículas (Fig. 11.7). La interacción de los antígenos de superficie y anticuerpos dirigidos contra ellos conduce a la reticulación de las partículas adyacentes, por ejemplo, bacterias, para formar un entramado o retículo de las células aglutinadas.
Aglutinación activa (directo) Aglutinación activa implica determinantes antigénicos que son un componente intrínseco de la partícula, por ejemplo, reacciones de hemaglutinación utilizadas para la determinación del grupo sanguíneo. Los anticuerpos específicos reaccionan con antígenos de la superficie del hematíe dando una aglutinación visible macroscópicamente sin necesidad del agregado de partículas extra para observar la aglutinación. Aglutinación pasiva (indirecta) Aglutinación pasiva implica determinantes antigénicos que no son un constituyente intrínseco de la partícula. Un antígeno soluble se combina con partículas insolubles, tales como los eritrocitos. Los eritrocitos normalmente se tratan con ácido tánico, que altera sus propiedades superficiales de modo que el antígeno pueda unirse firmemente a la superficie del eritrocito. Otras partículas insolubles incluyen bacterias, carbón, bentonita (arcilla) y látex de polivinilo donde el antígeno es simplemente adsorbido. Las titulaciones semicuantitativas pueden llevarse a cabo para determinar la cantidad de anticuerpo presente en una muestra. Un volumen constante de partículas en suspensión (antígeno) se añade a un volumen constante de antisuero diluido en serie. La presencia de anticuerpos en el suero causa aglutinación de las partículas (Fig. 11.8) y la reacción por lo general se califica en una escala de 0 a 4 +. El contenido de anticuerpos se expresa como un título: La inversa de la dilución final de antisuero capaz de producir una aglutinación visible.
373
Inhibición de la aglutinación La inhibición de la aglutinación se utiliza para determinar la presencia de antígeno. Este ensayo se basa en la competencia entre partículas y antígeno soluble por los sitios de unión del anticuerpos. El anticuerpo y la muestra de ensayo se dejan reaccionar juntos. Si el antígeno soluble está presente en la muestra, el anticuerpo reacciona con él y no está libre para reaccionar con otro aún más después de la adición posterior de partículas de indicador o células. Por lo tanto, la ausencia de aglutinación con una muestra bajo investigación indica un resultado positivo de la prueba. Un ejemplo de este tipo de ensayo es la detección de gonadotrofina coriónica humana (hCG) utilizado en el ensayo para la confirmación del embarazo y también en ciertas condiciones patológicas en las que los niveles de hCG son importantes (Fig. 11.9).
Precipitación A diferencia de las reacciones de aglutinación en las que el antígeno está particulado (insoluble), en las reacciones de precipitación es la interacción entre un anticuerpo soluble y un antígeno soluble. Si un anticuerpo soluble se incuba con un antígeno soluble, los complejos de anticuerpo y antígeno se entrecruzan y forman un precipitado. Los métodos de precipitación puede ser cuantitativos o cualitativos y las interacciones son dependientes de la fuerza iónica, pH y concentración. Una curva cuantitativa de precipitina se puede preparar en la que la proporción de antígeno y anticuerpo determina la extensión de la reticulación o entrecruzamiento y la precipitación. La curva muestra las siguientes características (Fig. 11.10): ● La zona de equivalencia en la que las proporciones de antígeno y anticuerpo son equivalentes. ● La zona de exceso de anticuerpos en la que todos los determinantes antigénicos disponibles están limitados por las moléculas de anticuerpos individuales, dejando un poco de moléculas de anticuerpo no unido. ● La zona de exceso de antígeno en la que todos los sitios de unión al antígeno de un anticuerpo están unidos con moléculas de antígenos individuales, dejando algunas moléculas de antígeno sin unir.
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Varias otras técnicas inmunológicas emplean la reacción de precipitación en una forma u otra. Estas incluyen a la nefelometría, la turbidimetría, la inmunodifusión radial (técnica de Mancini), la doble difusión (Ouchterlony) y algunas técnicas de inmunoelectroforesis.
Nefelometría y turbidimetría La nefelometría y turbidimetría implican la medición de la dispersión de la luz y las propiedades de absorción de la luz, respectivamente, de los complejos antígeno-anticuerpo. Estas técnicas se utilizan para medir las concentraciones de proteínas y fármacos en el suero o el líquido cefalorraquídeo. Los ensayos son rápidos y sensibles. Una cantidad excesiva y constante de anticuerpo se incuba con un antígeno en una cubeta. En la nefelometría la luz pasa a través de la cubeta y se mide la dispersión producida por los complejos antígeno-anticuerpo que se han formado. La concentración de antígeno se determina a partir de una curva estándar realizada por la medición de la dispersión de la luz producida por una serie de soluciones de concentraciones conocidas de antígeno. En algunos ensayos, se añaden polímeros para acelerar la formación de complejos antígeno-anticuerpo. En la turbidimetría la luz pasa a través de la cubeta y se mide la absorción producida por los complejos antígeno-anticuerpo que se han formado. Un fotómetro convencional se puede utilizar para este propósito. Inmunodifusión radial (Técnica de Mancini) La inmunodifusión radial se basa en el principio de que existe una relación cuantitativa entre la cantidad de antígeno colocado en un pocillo cortado en un gel de agarosa que contiene anticuerpo y el diámetro del anillo resultante de precipitado. La concentración de antígeno es proporcional al cuadrado del diámetro del anillo de precipitado. La concentración de muestras desconocidas se calcula con la ayuda de una curva estándar que se prepara mediante el trazado del (diámetro)2 (diámetro elevado al cuadrado) del anillo de precipitado resultante producido por una serie de soluciones de antígeno de concentración conocida (Fig. 11.11). Esta técnica se puede utilizar para la medición cuantitativa de los factores del complemento e inmunoglobulinas.
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11.3 DETERMINACIÓN
DE LOS FACTORES REUMATOIDES MEDIANTE LA TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN DE
LÁTEX
11.3.1 Materiales y reactivos ● Placas de ensayo (preferiblemente con un fondo oscuro) ● varillas de agitación, palillos de madera de color naranja o un rotador ● Tubos de ensayo, 5 ml ● Gradilla ● Micropipetas ● Reactivo de factor reumatoide en látex (FR) (suspensión acuosa de partículas de látex recubiertas con Ig G humana) ● Sueros de control Negativo y positivo ● Cloruro de Sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53). Los materiales y reactivos mencionados anteriormente se suministran por lo general como parte de un kit de ensayo comercial. # Kit: Sinónimo de equipo 11.3.2 Método 1. Coloque la muestra, los sueros de control para FR y el reactivo de látex a temperatura ambiente. 2. Diluir la muestra y el control de los sueros 1:5 con solución de cloruro de sodio. 3. Aplicar una gota de cada dilución a las placas de ensayo. 4. Agitar el vial del reactivo FR látex y añadir una gota de cada una de las muestras sobre las placas de ensayo. 5. Mezclar bien con las varillas de agitación o los palillos naranjas (una para cada muestra) y girar las placas suavemente (unas 10 veces), o coloque las placas en un rotador. 6. Después de 2 minutos, examine las placas y comparar las reacciones de los sueros de ensayo con los de los sueros de control (Fig. 11.12). 7. Si algunos sueros son positivos, repita los pasos 3-6, utilizando una dilución 1:2. La dilución más alta de suero que produzca la aglutinación es el título
11.4 PRUEBAS
PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI -ESTREPTOLISINA
11.4. 1 Prueba para la Anti-estreptolisina O (ASO, AELO)
O
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La estreptolisina O es una toxina producida por los estreptococos hemolíticos. La prueba antiestreptolisina O (AELO o ASO) es la prueba de laboratorio más comúnmente utilizada para el seguimiento de una infección estreptocócica y sus secuelas (fiebre reumática y glomerulonefritis post estreptocócica aguda). Ahora están disponibles otras metodologías, pero la prueba para AELO "estándar" se basa en el hecho que la estreptolisina O destruye a los eritrocitos humanos o a los de oveja a menos que sea neutralizada por los anticuerpos anti-estreptolisina O presentes en el suero del paciente. Una unidad de estreptolisina O es la cantidad mínima de estreptolisina O que lisan 0,5 ml de una suspensión de eritrocitos de oveja recién preparada al 5% cuando se incuba durante 1 hora a 37 °C. Una unidad Todd se define como la cantidad de anticuerpo anti-estreptolisina O que va a neutralizar 0,5 unidades de estreptolisina O. Principio La prueba se lleva a cabo mediante la incubación de una cantidad constante y estandarizada de estreptolisina O con diluciones en serie de suero (que contiene anticuerpos antiestreptolisina O) a 37 °C del paciente, inactivados con calor durante 15 minutos. Una suspensión recién preparada al 5% de eritrocitos de oveja se añade a todos los tubos y la incubación se continúa durante otros 45 minutos. Después de la centrifugación a 500 g, la dilución más alta de suero del paciente que todavía tiene un sobrenadante claro (sin hemólisis) es el punto final y se notifica su valor en unidades Todd (inversa de la dilución). Esta técnica es más bien lenta, pero ahora están disponibles métodos de aglutinación con látex más simples y más rápidos (véase la sección 11.4.2). Materiales y reactivos ● Matraz aforado, 1000 ml ● Tubos de ensayo de 75 mm x 12 mm ● Gradillas ● Pipetas serológicas ● Baño maría ● Centrífuga ● Agua tamponada con búfer de fosfato, pH 6,8 (reactivo no. 43) ● Cloruro de Sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53) ● Suspensión de eritrocitos de oveja al 5% lavados con solución al 0.85% de cloruro de sodio, (reactivo. N º 53) ● Estreptolisina O reducida (las instrucciones para la preparación de la estreptolisina O (SLO) reducida de la forma no reducida son provistos normalmente por el fabricante). Método 1. Hacer tres diluciones de suero del paciente (inactivado por calentamiento a 56 °C por 30 minutos) de la siguiente manera: 0,5 ml de suero + 4,5 ml de tampón fosfato = 1:10 0,5 ml de suero 1: 10 + 4,5 ml de tampón fosfato = 1: 100 1 ml de suero 1: 100 + 4 ml de tampón fosfato = 1: 500 2. A partir de estas diluciones maestras, hacer una amplia serie de diluciones como se muestra en la Tabla 11.1. Para propósitos de detección, utilizar sólo los primeros siete tubos y los tubos de control (13 y 14). 3. Añadir 0,5 ml (equivalente a 1 unidad internacional (UI)) de estreptolisina O reducida a todos los tubos excepto al tubo 13. Mezclar e incubar en un baño maría a 37 °C durante 15 minutos. 4. Añadir 0,5 ml de la suspensión al 5% de eritrocitos de oveja a cada tubo. Mezclar e incubar en un baño maría a 37 °C durante 45 minutos, mezclando de nuevo después de los primeros 15 minutos de incubación. 5. Centrifugar los tubos suavemente a 500 g por 3 minutos y observar la hemólisis. El punto final es el último tubo (es decir, la dilución más alta) que no muestra la hemólisis. El tubo de control 13 no debe mostrar hemólisis. Si hay hemólisis en este tubo debe repetirse la prueba. El tubo de control 14 debe mostrar hemólisis completa. Tabla 11.1 Preparación de series de dilución para la prueba de antiestreptolisina O (AELO) Volumen Volumen del Volumen del de la Volumen del suero del Dilución búfer para Tubo búfer para suspensión paciente (inactivado) (ml), del suero estreptolisina número estreptolisina al 5% de diluido: resultante O reducida O (ml) eritrocitos (ml) de oveja 1:10 1:100 1:500 1 0.8 ----0.2 1:12.5 0.5 0.5 2 0.2 ----0.8 1:50 0.5 0.5 3 --1.0 --0.0 1:100 0.5 0.5 4 --0.8 --0.2 1:125 0.5 0.5 5 --0.6 --0.4 1:167 0.5 0.5 6 --0.4 --0.6 1:250 0.5 0.5 7 --0.3 --0.7 1:333 0.5 0.5 8 --1.0 0.0 1:500 0.5 0.5 9 --0.8 0.2 1:625 0.5 0.5 10 --0.6 0.4 1:833 0.5 0.5 11 --0.4 0.6 1:1250 0.5 0.5 12 --0.2 0.8 1:2500 0.5 0.5 13 ----1.5 Control 0.0 0.5
377
14
---
---
1.0
Control
0.5
0.5
11.4.2 Aglutinación en látex Materiales y reactivos ● Placas de ensayo ● Varillas de agitación, palillos de madera o un rotador ● Tubos de ensayo, 5 ml ● Gradilla ● Micropipetas, 50 µl ● Reactivo de látex para anti-estreptolisina O: Suspensión de partículas de látex recubiertas con estreptolisina O ● Suero de control negativo ● Sueros control positivo (uno fuertemente positivo y otro débilmente positivo) ● Cloruro de Sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53). ● Lámpara de iluminación Método 1. Llevar los reactivos, los sueros de control y los sueros de ensayo a temperatura ambiente. 2. Aplicar una gota de cada uno de los sueros de prueba (o ensayo) y de control en las placas de ensayo. 3. Agitar el reactivo de látex para anti-estreptolisina O para mezclarlo, añadir una gota a cada uno de los sueros de prueba y de control. 4. Mezclar bien con las varillas de agitación o palillos de madera (una por muestra) y rotar manualmente las placas suavemente unas 10 veces, o en su lugar colocarlo en un rotador. (Generalmente durante 2 minutos.) 5. Después de 2 minutos, examinar las placas y comparar las reacciones de los sueros de prueba con las de los controles. Una reacción positiva se detecta por la presencia de aglutinación. Una reacción negativa se detecta por la ausencia de aglutinación. 6. Si algunos sueros son positivos, repita los pasos 2-5, utilizando una dilución 1/2. La dilución más alta que produzca la aglutinación es el título. La mayoría de reactivos antiestreptolisina O tienen un límite de detección (por ejemplo, 200 UI/ml) que por lo general se multiplica por el factor de dilución para obtener la concentración de suero de anti-estreptolisina O en UI/ml. 11.5 DETERMINACIÓN
DE
-GONADOTROFINA
CORIÓNICA HUMANA
( -hCG)
EN LA ORINA CON LA
TÉCNICA DE INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN
11.5.1 Materiales y reactivos ● Placas de ensayo ● Varillas de agitación, palillos de madera o un rotador ● Tubos de ensayo de 75 mm x 12 mm ● Gradilla ● Anticuerpos anti--gonadotrofina coriónica humana (anti--hCG) ● Reactivo látex hCG (suspensión de partículas de látex recubiertas con hCG) ● Control negativo ● Controles positivos (uno fuertemente positivo y otro débilmente positivo). Los reactivos anteriormente mencionados se suministran habitualmente como parte de un kit de ensayo comercial. 11.5.2 Método 1. Lleve las muestras de orina y los reactivos a temperatura ambiente. 2. Añadir una gota de cada una de las muestras de orina y cada uno de los controles a las placas de ensayo. 3. Añadir una gota de anticuerpo anti- -hCG para cada una de las muestras y cada uno de los controles. Mezclar con cuidado. 4. Mezclar bien la suspensión reactivo látex hCG, aplicar una gota a las muestras de ensayo y rotar las placas o mezclar con varillas de agitación o palillos de madera (una por muestra). 5. Después de 3 minutos examinar las placas y comparar las reacciones de las muestras de ensayo con las de los controles. Una reacción positiva (embarazada o -hCG presente) se detecta mediante la ausencia de aglutinación. Una reacción negativa (no embarazada o -hCG ausente) se indica por la presencia de aglutinación. Análisis semicuantitativo El análisis semicuantitativo puede ser conveniente en algunos casos en los que la producción de hCG pueda tener una causa patológica. Esto puede ocurrir tanto en pacientes embarazadas y no embarazadas. Hacer una dilución 1/2 de las muestras de orina positivas y examinar como se describe en los pasos 2-5 anteriores. La dilución más alta que no causa la aglutinación es el título. Los resultados de este análisis semicuantitativo se informan en UI/ml, que se puede obtener multiplicando el factor de dilución de la dilución más alta que no causa la aglutinación por la sensibilidad o límite de detección del método, según lo indicado por el fabricante. 11.6 DETERMINACIÓN
CUANTITATIVA DE ANTICUERPOS
IGA, IGG
E
IGM
POR INMUNODIFUSIÓN
RADIAL
11.6.1 Materiales y reactivos ● Placas de vidrio siliconadas de 8 cm x 12 cm, o placas de Petri (de vidrio o plástico)
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● Cajas con tapas que cierren herméticamente ● Perforador con diámetro interior de 2 mm ● Pipetas de 5 µl (o micropipetas de 5 µl) ● Baño maría ● Termómetro ● Tubos de ensayo ● Gradillas ● Agar, solución al 3% en agua destilada ● Cloruro de Sodio, 0,15 mol/l con 0,1% de azida sódica ● Agarosa o agar ● Antisuero anti IgA humana ● Antisuero anti IgG humana ● Antisuero anti IgM humana ● suero estándar humano que contiene: -IgA 2,0 mg/ml (123 UI/ml) -IgG de 9,5 mg/ml (110 UI/ml) -IgM 0,96 mg/ml (111 UI/ml). Los reactivos anteriormente mencionados se suministran habitualmente como parte de un kit de ensayo comercial. 11.6.2 Método 1. Recubrir tantas placas de vidrio (o placas de Petri) como sea necesario (permitiendo una por paciente) con solución al 3% de agar. 2. Calcular el volumen exacto de gel de agarosa al 1% que tiene que estar preparado para cubrir todas las placas con gel de un espesor de 1,5 mm. La fórmula para el cálculo de esto la siguiente:
Donde d es el diámetro de la placa (en cm). 3. Preparar 40 ml de 1% de agarosa en 0,15 mol/l de cloruro de sodio con 0,1% de azida de sodio. Disuelva la agarosa mediante la colocación en el baño maría a 100 °C. Cuando la suspensión es clara, deje que se enfríe a 56 °C. 4. Caliente el antisuero a 56 °C en el baño maría. 5. Añadir 0,1 ml de antisuero anti IgA humana por cada 10 ml de la solución de agarosa. Mezclar bien. 6. Verter en cada placa de vidrio (o placa de Petri) el volumen exacto de la mezcla de agarosaantisuero necesario para hacer un gel con un espesor de 1,5 mm, y permitir que solidifique a temperatura ambiente. 7. Preparar otros dos geles de agarosa más de la misma manera: la primera con 0,2 ml de antisuero anti IgG humana por 10 ml de solución de agarosa y el segundo con 0,13 ml de antisuero anti IgM humana por 10 ml de solución de agarosa. 8. Haga agujeros de 2 mm de diámetro en los geles (con el perforador). 9. Preparar diluciones 1:2 del suero estándar en 0,15 mol/l de cloruro de sodio, de la siguiente manera, para la determinación de: ● IgA: 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 y 1:128. ● IgG: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320. ● IgM: sin diluir, 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. 10. Preparar diluciones 1:2, 1:16 y 1:40 de los sueros de los pacientes en 0,15 mol/l de cloruro de sodio para la determinación de IgM, IgA e IgG, respectivamente. 11. Pipetear 5 µl de cada una de las diluciones del suero estándar y de los sueros de los pacientes en diferentes agujeros de los geles de agarosa correspondientes (ver pasos 6 y 7). 12. Coloque las placas en cajas bien cerradas, en un ambiente húmedo e incubarlas durante 3 días a temperatura ambiente. 13. Medir el diámetro de los anillos de precipitado (en milímetros) usando una regla. 14. Haga un gráfico de las titulaciones del suero estándar. En el eje y grafique el diámetro al cuadrado de los anillos de precipitado, y en el eje x grafique las concentraciones del suero estándar (ver Fig. 11.11). 15. Usar estas curvas para leer la concentración de IgA, IgG e IgM en los sueros de los pacientes. 11.7 PRUEBAS
PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA EL
VIH
11.7.1 ELISA Materiales y reactivos ● Micropipetas ● Incubadora o baño maría a 37 °C ● Lavador o una bomba de vacío ● Espectrofotómetro (lector) ● Agua destilada o desionizada ● Equipo de ELISA (disponible en el comercio) ● Sistema de soporte en fase sólida, reactivos y controles. Método Cada kit viene con sus propias instrucciones que se deben seguir cuidadosamente. Sin embargo, los pasos generales son como se describen a continuación.
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1. Añadir la muestra de prueba (suero) y los controles al sistema de soporte de fase sólida recubierta con antígeno e incubar a la temperatura especificada durante el tiempo correspondiente. 2. Con cuidado aspirar la muestra del sistema en fase sólida y lavar para eliminar el exceso de la muestra y otras proteínas. El lavado no debe eliminar los anticuerpos contra el VIH que se han adherido a la fase sólida durante la incubación. 3. Añadir la cantidad indicada de conjugado (IgG anti-humana (por lo general de cabra) ligada a enzima) y se incuba siguiendo las instrucciones del fabricante. 4. Con cuidado aspirar el líquido de nuevo para eliminar cualquier conjugado no unido y lavar el sistema de fase sólida. 5. Añadir la cantidad apropiada de sustrato e incubar siguiendo las instrucciones del fabricante. Esta es la etapa de desarrollo de color y debe protegerse de la luz. 6. Al final del periodo de incubación, añadir la solución de detención (agregar el “stopper”). La solución de detención inhibe cualquier reacción adicional entre la enzima y el sustrato. 7. Leer los resultados en un espectrofotómetro a la longitud de onda recomendada. 8. Calcular los valores de corte (“cut-off”) para cada prueba de corrida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 9. Si se obtienen resultados dudosos, repita la prueba en caso que se hayan producido errores técnicos. Si todavía se obtienen resultados dudosos, examinar la muestra usando un western blot. Alternativamente, repita la prueba usando un ELISA diferente y/o un sistema de prueba rápida (véase la sección 11.7.2). Una corrida de la prueba no es válida si los valores de los controles positivos son menores que los valores de corte calculados. En tales casos, la ejecución de la prueba debe repetirse. Nota: Los criterios para las muestras de prueba usando un western blot varían de un laboratorio a otro. Algunos laboratorios ensayan todas las muestras que dan una reacción positiva en el ELISA. En algunos casos, se puede hacer una solicitud específica para realizar un Western blot, incluso si el ELISA fue no reactivo. 11.7.2 Tira reactiva Principio Las tiras reactivas se han desarrollado para la detección rápida de antígenos y anticuerpos en suero humano. Estas pruebas se emplean generalmente en situaciones en las que se puede necesitar tomar decisiones rápidas y en las que a menudo no requieren ningún otro equipo aparte del proporcionado en los kits de decisiones rápidas. En la prueba con tira reactiva para anticuerpos contra el VIH, que está disponible comercialmente, una tira de poliestireno está recubierta con el antígeno del VIH que se hace reaccionar con el suero. Entonces, los anticuerpos contra VIH presentes se unen al antígeno del VIH. Después de la incubación posterior con una solución de sustrato, se desarrolla una mancha de color en el punto donde está el antígeno que indica la presencia de anticuerpos contra el VIH (Fig. 11.13). Materiales y reactivos ● Temporizador ● Toallas absorbentes o de papel de filtro ● Kit de prueba comercialmente disponible que contiene tiras reactivas, reactivos y controles positivos y negativos ● Suero de control casero débil-positivo. Método Siga las instrucciones proporcionadas en el kit. Un resultado positivo se indica mediante cualquier desarrollo de color en el punto recubierto de antígeno; esto indica que los anticuerpos se unieron al antígeno. Un punto debe ser visible en el control positivo y una ausencia de color debe ser vista en el control negativo. Los controles internos débilmente positivos deben ser incluidos para ayudar en los resultados de la lectura. La realización de la prueba no es válida si los resultados obtenidos con los controles no son como se ha descrito anteriormente.
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11.8 PRUEBAS
PARA LA INFECCIÓN POR VIRUS DE LA HEPATITIS
Las pruebas de rutina para la hepatitis incluyen el uso de marcadores para los virus de la hepatitis A, B y C. La hepatitis A es más común en niños, especialmente en las guarderías infantiles, sin embargo, no se prueba rutinariamente, excepto en casos de epidemias. Los virus de las hepatitis B y C se transmiten a través de productos de sangre, fluidos corporales, agujas contaminadas y otros materiales contaminados. El virus de la hepatitis B tiene varios marcadores los cuales incluyen: -Antígeno de superficie (HBsAg) -Anticuerpo contra el antígeno de superficie (anti-HBs) -Antígeno de la envoltura o cubierta (HBeAg) -Anticuerpo contra el antígeno de la cubierta (anti-HBe) -anticuerpos contra el antígeno core (anti-HBc). (Core: Núcleo, centro o corazón viral) Las concentraciones de estos marcadores pueden variar durante el curso de una infección. Los marcadores antígenos aparecen primero o al principio después de la exposición al virus. La seroconversión (producción de anticuerpos) a menudo ocurre varias semanas o meses después de la exposición. La prueba de hepatitis se realiza rutinariamente con ELISA en fase sólida y métodos de radioinmunoanálisis. Están disponibles los kits comerciales para la detección de marcadores de hepatitis y los criterios e instrucciones específicas se proporcionan en cada kit. Los principios generales de la técnica de ELISA para uno de los marcadores del virus de la hepatitis B se describen a continuación. 11.8.1 ELISA para el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) Materiales y reactivos ● Micropipetas ● Incubadora o baño maría ● Lavador o bomba de vacío ● Espectrofotómetro (lector) ● Kit de ensayo comercialmente disponible que contiene sistema de soporte de fase sólida, reactivos y controles ● Agua destilada o desionizada. Método 1. Añadir la muestra de prueba (suero) y los controles al sistema de soporte de fase sólida recubierta con una capa preliminar de anti-HBs (anti-HBsAg)* e incubar siguiendo las instrucciones del fabricante. *Generalmente, suele ser anticuerpo de cobayo anti-HBs que actúa como anticuerpo de captura. 2. Usando una bomba de vacío o un lavador automático, aspirar cuidadosamente el líquido de la fase sólida (la fase sólida suele estar en pocillos de una policubeta) y lavar el sistema. 3. Añadir la cantidad especificada de conjugado (anticuerpo anti-HBs ligado a una enzima) y se incuba siguiendo las instrucciones del fabricante. 4. Aspirar el líquido del pocillo y lavar para eliminar el conjugado no unido. 5. Añadir la cantidad especificada de sustrato (generalmente o-fenilendiamina) y se incuba en la oscuridad. (Esta es la etapa de desarrollo de color y debe protegerse de la luz.) 6. Añadir la solución de detención como se especifica. La solución de parada o detención (por lo general un ácido) inhibe cualquier reacción adicional entre la enzima y el sustrato. 7. Leer los resultados en un espectrofotómetro a la longitud de onda especificada. 8. Calcular el valor de corte (“cut off”) para la realización de la prueba según las instrucciones del fabricante. La realización de la prueba no es válida si los valores de los controles positivos son menores que el valor de corte. En tales casos, se debe repetir el ensayo. Precauciones El método ELISA es bastante fácil de realizar, pero preste atención a lo siguiente: ● Asegúrese que los reactivos y las muestras se llevaron a temperatura ambiente. ● Hacer diluciones apropiadas de reactivos o muestras si es necesario. ● Asegúrese que el antígeno o anticuerpo pre-revestido (fase sólida) no se altere durante la adición de la muestra o de los reactivos, y también tener precaución durante los lavados. ● Preparar una única solución de cromógeno suficiente como para una sola prueba. Guardar la solución en un recipiente cerrado, en la oscuridad. Si el color se desarrolla antes del empleo de la técnica, debe preparase una nueva solución. ● Evite la contaminación cruzada de las muestras. ● Siga estrictamente los tiempos de incubación, las temperaturas y otras condiciones que se especifican en las instrucciones del fabricante. ● Además de los controles en el kit, por lo general se recomienda incluir un control interno de densidad óptica conocida para los propósitos de control de calidad. Nota: Si no se dispone de un espectrofotómetro (“lector de ELISA”), se puede hacer la lectura visual de los colores formados siempre comparando con un control positivo y otro negativo. 11.8.2 Tira reactiva para el antígeno de superficie de la hepatitis B Principio La tira reactiva para la detección de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) se aprovecha de la formación de un punto visible dado por la precipitación de inmunocomplejos.
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Los conjugados de anticuerpos monoclonales contra HBsAg acoplado a partículas de oro coloidales se adsorben a un área de una tira de nitrocelulosa (la zona A en la Fig. 11.14.). Los anticuerpos policlonales contra HBsAg se fijan químicamente a otra zona de la tira (zona B en la Fig. 11.14.). Una gota de suero humano se aplica a la zona A (Fig. 11.15). El antígeno HBsAg en el suero se une al anticuerpo conjugado y el inmunocomplejo oro-HBsAg migra a lo largo de la tira hasta que llega a los anticuerpos policlonales fijos en la zona B. Los anticuerpos policlonales precipitan el inmunocomplejo oro-HBsAg, y forman una banda roja visible en la zona B (Fig. 11.16). No se forma la banda roja si el suero no contiene HBsAg. Materiales y reactivos ● Kit de prueba comercialmente disponible que contiene tiras reactivas, reactivos y controles. Método 1. Etiquetar la tira de prueba con el nombre y / o número del paciente. 2. Añadir una gota de suero a la zona A según lo recomendado por el fabricante. 3. Permitir que el suero migre a la zona B en la tira de prueba. 4. Inspeccionar la zona B después de 10-20 minutos para observar la aparición de un punto coloreado visible que indica una reacción positiva.
11.9 Tira reactiva para P. falciparum También se encuentran disponibles tiras reactivas de análisis para la detección del parásito del paludismo Plasmodium falciparum. El ensayo descrito aquí se basa en la detección con anticuerpos monoclonales de la proteína específica de especie, la proteína rica en histidina II (HRP-II), que se expresa en las etapas asexuales sanguíneas y posiblemente en las etapas tempranas de los gametocitos del parásito. 11.9.1 Materiales y reactivos ● Tubos capilares y perillas de goma
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● Tubos de ensayo ● Gradilla ● Soporte para la reacción ● Kit de prueba comercialmente disponible que contiene tiras reactivas, placas de prueba, reactivos y controles. La tira reactiva se trata previamente con un anticuerpo monoclonal de ratón contra la HRP-II, que se aplica en una línea a través de la tira de aproximadamente 1 cm desde su base. Una segunda línea de puntos de antígeno HRP-II se incorpora en la tira reactiva aproximadamente 2-3 mm por encima de la línea del anticuerpo monoclonal como un reactivo de control positivo. 11.9.2 Método 1. Recoger una muestra de sangre de punción en el dedo del paciente. 2. Coloque una gota de sangre en un tubo de ensayo que contiene tres gotas de reactivo de lisis (o reactivo lisante) (Fig. 11.17). 3. Coloque una gota de la muestra de sangre lisada en uno de los pocillos de la placa de prueba en el soporte de reacción (Fig. 11.18). 4. Coloque la tira reactiva en la sangre lisada hasta que toda la sangre ha sido absorbida (Fig. 11.19). 5. Aplicar una gota de reactivo de detección en la base de la tira reactiva (Fig. 11.20). Este reactivo consta de una suspensión de micelas (vesículas de fosfolípidos) que contiene sulforodamina B como un marcador acoplado al anticuerpo de conejo producido contra HRP-II. 6. Cuando el reactivo ha sido absorbido, aplicar dos gotas de reactivo de lavado para limpiar la sangre lisada (Fig. 11.21). Si el resultado es positivo, una delgada línea roja se quedará en la tira reactiva con una línea discontinua (el reactivo control) por encima de ella. Si el resultado es negativo, sólo se ve la línea de puntos (el reactivo control). Toda la prueba se realiza en menos de 10 minutos. Los estudios actuales indican que la prueba tiene una sensibilidad y una especificidad del 86-95% cuando se compara con la microscopia de luz estándar realizada por técnicos experimentados. Una prueba similar para P. vivax está en fase de desarrollo.
Figura 11.17 Adición de una muestra de sangre al reactivo lisante. Figura 11.18 Poniendo la muestra de sangre lisada a la placa de prueba.
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Figura 11.19 Poniendo la tira reactiva en la sangre lisada. Figura 11.20 Agregando el reactivo de detección a la tira reactiva.
Figura 11.21 Eliminación de la sangre lisada con el reactivo de lavado. 11.10 PRUEBAS PARA LA INFECCIÓN POR
SÍFILIS
La sífilis es causada por el Treponema pallidum. Hay cuatro etapas de la infección por sífilis: primaria, secundaria, latente y terciaria, y una condición especial de la transmisión materno-fetal denomina sífilis congénita. Las respuestas inmunes a la sífilis se pueden agrupar en dos categorías: no específica (o reagínica) y específica. La reagina no específica es de la clase IgM y reacciona con un extracto alcohólico de corazón de bovinos conocido como cardiolipina (un fosfolípido). Dado que el anticuerpo reagínico carece de especificidad, este aparece en muchas otras enfermedades y estados patológicos no relacionados con la infección treponémica. En estos casos pueden ocurrir reacciones falsas positivas. Se pueden desarrollar anticuerpos específicos para treponemas no patógenos habitantes de la flora bacteriana normal del tracto genital u oral. También se pueden desarrollar anticuerpos específicos para T. pallidum. En ambos casos, estos anticuerpos son de la clase IgG y permanecen detectables durante toda la vida del paciente a pesar del tratamiento. Las pruebas de rutina para sífilis incluyen la prueba rápida para reaginas plasmáticas (RPR), la prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-Abs) y la prueba de hemaglutinación para T. pallidum (TPHA). FTA-Abs: fluorescent treponemal antibody-absorbed; TPHA: T. pallidum haemagglutination test; RPR: rapid plasma regain. Principio Prueba de RPR La prueba RPR ha sustituido a la prueba VDRL, como prueba de detección rápida por las siguientes razones: ● No hay necesidad de una preparación diaria de los reactivos. ● No se requiere microscopio. ● No se requiere La inactivación del suero con calor (no es necesario inactivar la muestra)
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VDRL significa Venereal Disease Research Laboratory, donde se elaboró originalmente este ensayo. La prueba RPR utiliza el antígeno VDRL modificado con cloruro de colina para inactivar el complemento, y partículas de carbón para permitir que los resultados de la reacción puedan ser observados sin un microscopio (la reacción produce una floculación visible macroscópicamente, favorecida por las partículas de carbón). La prueba RPR también se puede aplicar como una prueba semicuantitativa. Prueba de FTA-Abs La prueba de FTA-ABS se utiliza en la confirmación de la sífilis. En el primer paso de la prueba, el suero se diluye en un cultivo concentrado y filtrado de treponemas Reiter para absorber anticuerpos contra los treponemas no patógenos. El suero se coloca entonces sobre una placa de vidrio en la que se han fijado los microorganismos de T. pallidum muertos (cepa Nichols). La placa de vidrio se incuba, se lava y se recubre con un anticuerpo anti inmunoglobulina humana marcado con un compuesto fluorescente. Si el resultado es positivo los treponemas emiten fluorescencia. Esta técnica de inmunofluorescencia indirecta es altamente sensible en todas las etapas de la sífilis, especialmente en las etapas muy tempranas y muy tardías. Una vez que esta prueba es positiva sigue siendo positiva por el resto de la vida del paciente. No se utiliza como una prueba de tamiz para la sífilis, ya que no detecta la reinfección y además consume tiempo y es costosa (se requiere un microscopio de fluorescencia con un condensador de campo oscuro). Los resultados de una prueba para la sífilis deben ser interpretados de acuerdo con el tipo (o tipos) de prueba empleada y de la etapa de la enfermedad que el paciente ha alcanzado. Recuerde que un resultado positivo de una prueba tamiz o screening para sífilis puede deberse a la presencia de otros anticuerpos heterófilos, a una técnica defectuosa o a la presencia de otros anticuerpos treponémicos (no sifilíticos). Un resultado negativo puede significar uno de los siguientes: ● La infección es demasiado reciente como para haber producido niveles detectables de anticuerpos. ● La prueba está temporalmente no reactiva debido al tratamiento que el paciente está recibiendo. ● La prueba se ha convertido temporalmente en no reactiva debido a que el paciente ha consumido alcohol antes de la prueba. ● La enfermedad está latente o inactiva. ● El paciente no ha producido anticuerpos protectores, debido a la tolerancia inmunológica. ● La técnica es defectuosa. Los resultados débilmente positivos pueden deberse a: - infección muy temprana; -disminución de la actividad de la enfermedad después del tratamiento; -reacciones inmunológicas no específicas; - técnica incorrecta. El mayor valor de las pruebas no treponémicas es en el seguimiento después de la terapia y en la detección de la reinfección. Prueba TPHA La prueba TPHA también se utiliza en la confirmación de la sífilis. En el primer paso de la prueba, el suero diluido se mezcla con diluyentes que contienen treponemas Reiter no patógenos absorbentes. El suero se transfiere a continuación a una placa de microtitulación y se añaden eritrocitos sensibilizados con microorganismos de T. pallidum muertos (cepa Nichols). Si el resultado es positivo los eritrocitos forman una capa fina o “manto fino” de células aglutinadas (hemoaglutinación). 11.10.1 Prueba RPR Materiales y reactivos1 ● Placas de ensayo ● Pipetas Pasteur desechables ● Pipeta serológica ● Tubos de ensayo de 75 mm x 12 mm ● Gradilla ● Rotador ● Antígeno RPR ● Controles negativos, débilmente positivos y muy positivos ● Cloruro de Sodio, solución al 0,85% (reactivo no. 53). Los reactivos anteriores se suministran normalmente como parte de un kit de prueba. 1 Nota: Los reactivos para la prueba RPR deben ser almacenados a 2-6 °C en el frigorífico. Método 1. Llevar la prueba y los sueros de control y el antígeno de RPR a temperatura ambiente. 2. Dispense una gota de cada uno de los sueros de prueba y de control a las placas de ensayo y extiéndalos cuidadosamente en los pocillos individuales. 3. Añadir una gota de antígeno RPR a cada pocillo de las placas de prueba. 4. Colocar las placas de ensayo en el rotador y rotar durante 8 minutos a 100 rpm. (La velocidad recomendada es de entre 95 y 105 rpm, lo que debería ser revisado diariamente como parte del control de calidad.) Si un rotador mecánico no está disponible, hacer rotar horizontalmente la placa de reacción en forma manual, inclinando las placas de ida y vuelta y rotando las placas cuidadosamente durante 8 minutos a 80-85 rpm. 5. Examine las placas de ensayo para ver la floculación (Fig. 11.22) y comparar las reacciones de los sueros de prueba con los de los controles.
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6. Preparar una dilución 1:2 de cualquiera de los sueros positivos y examinar las diluciones tal como se describe en los pasos 2-5. La dilución más alta de suero en el que se observa floculación es el título.
11.10.2 Prueba TPHA Materiales y reactivos ● Tubos de ensayo ● Gradilla ● Kit de la prueba TPHA comercialmente disponible que contenga placas de microtitulación, micropipetas (con puntas desechables), diluyente de absorción, eritrocitos sensibilizados con T. pallidum, eritrocitos no sensibilizados, controles de suero positivo y negativo ● Agua destilada. Los reactivos y controles deben ser reconstituidos antes de su uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Método 1. Diluir la prueba y el control de sueros 1:20 con diluyente de absorción. 2. Usando una micropipeta, dispensar 25 µl del suero control negativo en los pocillos 1 y 2 de la primera fila horizontal de la placa de microtitulación (A en la Fig. 11.23). 3. Dispensar 25 µl del suero control positivo en los pocillos 1 y 2 de la segunda fila horizontal de la placa de microtitulación (B en la Fig. 11.23). 4. Dispensar 25 µl del primer suero de ensayo en los pocillos 1 y 2 de la tercera fila horizontal de la placa de microtitulación (C en la Fig. 11.23). Repita el procedimiento con los sueros de prueba restantes. Si es necesario, utilice los pocillos adyacentes (por ejemplo, 3 y 4 en la Fig. 11.23). 5. Añadir 75 µl del control de eritrocitos a los pocillos en la primera fila vertical (1) y en todas las demás filas (3, 5, 7, 9 y 11), según corresponda. 6. Añadir 75 µl de los eritrocitos sensibilizados a los pocillos en la segunda fila vertical (2) y en todas las demás filas (4, 6, 8, 10 y 12), según corresponda. 7. Rotar las placas con cuidado, cubrir y dejar reposar a temperatura ambiente durante el tiempo recomendado por el fabricante. Las placas deben ser protegidas de las vibraciones, el calor radiante y la luz solar directa. 8. Colocar las placas con cuidado sobre un fondo blanco o una placa de vidrio sinterizado iluminada desde abajo, o usar un dispositivo de visualización que permita que el patrón de sedimentación pueda ser visto desde abajo a través de un espejo. Si el resultado es positivo se verá una capa fina (manto fino) de células aglutinadas (hemoaglutinación). Las células pueden estar rodeadas por un círculo o anillo rojo, o incluso pueden cubrir toda la base del pocillo. Si el resultado es negativo se puede ver un botón compacto rojo de las células no aglutinadas, con o sin un agujero muy pequeño en su centro. Si el resultado es dudoso (borderline o limítrofe) se verá un botón de células no aglutinadas con un pequeño agujero en su centro. Nota: Los resultados deben interpretarse de acuerdo con los criterios establecidos por el fabricante.
Figura 11.23 Placa para la prueba de TPHA Nota: Se agregan manuales de instrucciones de equipos comerciales correspondientes a varias de estas técnicas. Fuente: www.wiener-lab.com.ar La técnica de VDRL se agrega como información
O-Estreptolisina liofilizada Método hemolítico para la determinación del título de antiestreptolisina O
SIGNIFICACION CLINICA El anticuerpo antiestreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas en títulos bajos, debido a que las infecciones estreptocócicas son comunes. Sin embargo un título alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una infección reciente producida por estreptococo β-hemolítico grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela. Tiene además especial interés en los procesos que aparecen como segunda enfermedad: fiebre reumática y glomerulonefritis aguda. Por lo tanto, a pesar de no ser una prueba específica para fiebre reumática, apoya su diagnóstico cuando lo sugieren la historia y los signos clínicos. FUNDAMENTOS DEL METODO La estreptolisina O, producida por el estreptococo β-hemolítico de grupo A, tiene la propiedad de producir hemólisis cuando se pone en contacto con glóbulos rojos. Al colocar distintas diluciones de un suero que contenga antiestreptolisina O en presencia de dosis constantes de estreptolisina O, se produce una reacción antígeno-anticuerpo que neutraliza la capacidad hemolítica de la misma. Este fenómeno se evidencia por una inhibición de la hemólisis al agregar suspensión de glóbulos rojos del 3 al 5%. El título de antiestreptolisina será la recíproca de la máxima dilución del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente la estreptolisina. REACTIVOS PROVISTOS Estreptolisina-O: estreptolisina liofilizada titulada. Buffer concentrado: solución de buffer fosfatos conteniendo fosfatos 0,36 mol/l y cloruro de sodio 1,2 mol/l, para pH final 6,5. REACTIVOS NO PROVISTOS - Agua destilada. - Eritrocitos frescos humanos de grupo O, del mismo paciente o de conejo. - Solución fisiológica. INSTRUCCIONES PARA SU USO A baja temperatura el Buffer concentrado puede cristalizar. En tal caso, colocar en baño de agua a 37oC unos minutos mezclando por inversión hasta disolución completa. Buffer; preparación: - 6 x 3 ml: diluir el contenido con 150 ml de agua destilada. - 6 x 10 ml: diluir el contenido con 600 ml de agua destilada. Estreptolisina-O: disolver el vial con el volumen de Buffer indicado en el rótulo, mezclando por inversión hasta disolución completa. Suspensión de eritrocitos: lavar los mismos 3 veces con solución fisiológica. Luego del último lavado centrifugar a 2.000 r.p.m. durante 15 minutos. En el sobrenadante no debe aparecer
hemólisis; caso contrario desechar. Con los eritrocitos lavados, una vez descartado el sobrenadante, preparar una suspensión del 3 al 5% con Buffer pH 6,5. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química clínica. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Estreptolisina-O: una vez preparada es estable 2 horas a temperatura ambiente, 5 días en refrigerador (2-10oC) o 2 meses congelada (-20oC) y fraccionada. Ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO. Buffer: estable 1 año en refrigerador (2-10oC). Suspensión de eritrocitos: los eritrocitos pueden usarse hasta 48 horas después de preparada la suspensión, si previamente se lavan una vez con Buffer y no se observa hemólisis. MUESTRA Suero a) Recolección: debe obtenerse suero libre de hemólisis. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: muestras con hemólisis visible pueden conducir a una interpretación errónea de los resultados, por lo que deben descartarse. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la antiestreptolisina en suero es estable congelada por lo que puede mantenerse en estas condiciones hasta efectuar el ensayo. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Tubos de hemólisis. - Material volumétrico apropiado. - Centrífuga. - Baño de agua a 37oC. CONDICIONES DE REACCION - Temperatura de reacción: 37oC - Tiempo de incubación: 60 minutos - Volumen final de reacción: 2 ml Si se emplea la presentación 6 x 3 ml los volúmenes de muestra y reactivo deben reducirse a la mitad. Si se desea realizar microtécnica en policubetas, solicitar las instrucciones al Servicio Bibliográfico de Wiener lab. 870780000 / 00
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PROCEDIMIENTO Preparar diluciones de la siguiente forma: 1:10 (0,2 ml de suero + 1,8 ml de Buffer), 1:100 (0,5 ml de dilución 1:10 + 4,5 ml de Buffer), 1:500 (1 ml de dilución 1:100 + 4 ml Buffer). Luego proceder de la siguiente forma: Dilución del suero Tubo Nº
1:10
1:100
1:500
CONTROLES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Suero diluido (ml)
0,2
1
0,8
0,6
0,4
0,3
1
0,8
0,6
0,4
0,2
-
-
Buffer (ml)
0,8
-
0,2
0,4
0,6
0,7
-
0,2
0,4
0,6
0,8
1,5
1
Estreptolisina-O (ml)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Mezclar y mantener a baño María a 37°C 15 minutos. Eritrocitos 3-5% (ml)
0,5
0,5
0,5
0,5
Mezclar agitando ligeramente y mantener en baño María a 37oC durante 15 minutos, agitar nuevamente y continuar en baño María durante 30 minutos más. Centrifugar 3 minutos a 1.500 r.p.m. y leer. Unidades Todd/ml
50
100
125
166
250
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS El título de la muestra se expresa mediante la inversa de la mayor dilución en la cual se observa ausencia total de hemólisis. El tubo 12 (control eritrocitario) no deberá presentar hemólisis mientras que el tubo 13 (control Estreptolisina-O) deberá mostrar hemólisis completa. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Para controlar el procedimiento y los reactivos es conveniente procesar simultáneamente un suero con cantidad conocida de antiestreptolisina O. VALORES DE REFERENCIA Normalmente pueden existir en suero hasta 200 unidades de antiestreptolisina O. Títulos superiores son indicativos de un proceso infeccioso por estreptococo β-hemolítico de grupo A.
333
500
625
833
1250
2500
(-)
(+)
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO En caso de conservar la Estreptolisina-O reconstituida congelada, se recomienda fraccionarla de modo de evitar los congelamientos y descongelamientos sucesivos que ocasionan su deterioro. PRESENTACION - 6 x 3 ml (Cód. 1073202). - 6 x 10 ml (Cód. 1073204). BIBLIOGRAFIA - Bennett, C.V. - "Clinical Serology" - Charles Thomas Pub., USA (1964). - Sonnenwirth, A.C.; Jarret, L. - Gradwohl Métodos y Diagnósticos del Laboratorio Clínico - Edit. Panamericana - 8ª Ed. (1983). - Rantz, L.A. y Randall, M.F. - Proc. Soc. Exp. Bio. 59:22 (1945).
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EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS Estreptolisina O Estreptolisina O
Buffer
conc
Buffer concentrado
Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
P Representante autorizado en la Comunidad Europea V
Uso diagnóstico "in vitro"
X
Contenido suficiente para ensayos
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
?
No congelar
F
Riesgo biológico Volumen después de la reconstitución
Cont.
Contenido
g
Número de lote
M
Elaborado por:
Xn
Nocivo Corrosivo / Caústico
Xi
i Calibr.
b b c h
Irritante Consultar instrucciones de uso Calibrador Control Control Positivo Control Negativo Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº: 30/92
Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina 870780000 / 00
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ASO
C
látex
Prueba de látex para la determinación de antiestreptolisina O en suero
SIGNIFICACION CLINICA El anticuerpo antiestreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas en títulos bajos, debido a que las infecciones estreptocócicas son comunes. Sin embargo un título alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una infección reciente producida por un estreptococo beta hemolítico de grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela. FUNDAMENTOS DEL METODO Los anticuerpos antiestreptolisina O se detectan en suero por su reacción con la estreptolisina O adsorbida sobre soporte inerte de látex. Los anticuerpos antiestreptolisina reaccionan con la estreptolisina produciendo una aglutinación visible macroscópicamente. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: suspensión de partículas de látex poliestireno recubiertas con estreptolisina O. Control Positivo: suero humano conteniendo antiestreptolisina O en concentración superior a 250 UI/ml. Control Negativo: suero humano no reactivo con el Reactivo A. REACTIVOS NO PROVISTOS Solución fisiológica (para la técnica semicuantitativa). INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A: homogeneizar por agitación intensa y luego cambiar la tapa ciega por la tapa gotero suministrada adicionalmente. Controles (Positivo y Negativo): listos para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Los Controles Positivo y Negativo han sido examinados para antígeno de superficie del virus de hepatitis B, virus de la hepatitis C y anticuerpos contra HIV 1/2, encontrándose no reactivos. No obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La autoaglutinación del Reactivo A es indicio de deterioro del mismo. En tal caso desechar. MUESTRA Suero a) Recolección: obtener suero de la manera usual. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: los sueros marcadamente lipémicos o contaminados pueden dar resultados falsamente positivos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la antiestreptolisina en suero es estable 24 horas refrigerada (210oC) o congelada por períodos prolongados. MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - 1 placa de vidrio - 1 tapa gotero 2- No provisto - goteros o pipetas para dispensar los volúmenes indicados. - palillos mezcladores descartables - cronómetro - lámpara o fuente de luz - tubos de Kahn PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. Agitar el Reactivo A antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero. I- TECNICA CUALITATIVA En uno de los sectores delimitados de la placa de vidrio adjunta al equipo colocar: Reactivo A
1 gota (50 ul)
Muestra
1 gota (50 ul)
Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una suspensión uniforme en la superficie delimitada de la placa. Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos. II- TECNICA SEMICUANTITATIVA Los sueros positivos pueden titularse efectuando di-
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luciones seriadas en tubos de Kahn. a) Colocar 0,5 ml de solución fisiológica en cada uno de los tubos. b) Agregar 0,5 ml de suero al tubo No 1 y mezclar. Transferir 0,5 ml de esta dilución al tubo No 2 y mezclar, continuando así las diluciones hasta el último tubo. Las diluciones así obtenidas equivalen a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, etc. c) Ensayar cada dilución según técnica I.
en el 95% de los casos. En una población infantil ( mayores de 2 años) se pueden tener títulos de hasta 300 UI/ml. PRESENTACION Equipo para 50 determinaciones (Cód. 1073151). BIBLIOGRAFIA - Sonnenwirth A.C.; Jarret L. - Gradwohl Métodos y Diagnósticos del Laboratorio Clínico - Editorial Panamericana - 8o Ed (1983).
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Técnica cualitativa Negativo: suspensión homogénea. Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. Se califica de 1 a 4 +, siendo: 4+: aglutinación franca 3+: moderada aglutinación 2+: ligera aglutinación 1+: aglutinación débil Técnica semicuantitativa Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible macroscópicamente. El nivel aproximado de antiestreptolisina O en la muestra, puede ser calculada por la fórmula siguiente: ASO (UI/ml) = Título x Sensibilidad de la reacción (200 UI/ml) Ejemplo: la muestra presenta un título de 1:2. El nivel de ASO es de 2 x 200 = 400 UI/ml METODO DE CONTROL DE CALIDAD Es conveniente procesar simultáneamente el Control Positivo y el Control Negativo provistos, empleando una gota del Control correspondiente en lugar de la muestra y una gota del Reactivo A según la técnica cualitativa. VALORES DE REFERENCIA Hasta 200 UI/ml. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - Tiempos de reacción mayores de 2 minutos pueden producir reacciones falsamente positivas por efecto del secado de los reactivos. - Se pueden producir falsos negativos en niños mayores de 6 meses y menores de 6 años o en infección reciente. - Debe tenerse en cuenta que en este tipo de infecciones, un resultado aislado sólo constituye un dato auxiliar, por lo que se recomienda efectuar determinaciones seriadas cada 15-20 días durante 4 ó 6 semanas. PERFORMANCE a) Sensibilidad: 200 UI/ml. b) Especificidad: en una población adulta sana se obtienen títulos de antiestreptolisina O menores o iguales a 200 Ul/ml 870150000 / 00
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Símbolos Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
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Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
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Elaborado por:
Xn
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Nocivo
Uso diagnóstico "in vitro" Corrosivo / Caústico
Contenido suficiente para ensayos Xi
Irritante
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Fecha de caducidad
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Límite de temperatura (conservar a)
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No congelar
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Riesgo biológico
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Consultar instrucciones de uso
Calibr.
Calibrador
b Volumen después de la reconstitución
Cont.
i
Contenido
Número de lote
b c h
Control
Control Positivo
Control Negativo
Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº: 993/95
Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina 870150000 / 00
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C
Fecuntest directo
Prueba de aglutinación directa en placa para diagnóstico de embarazo
SIGNIFICACION CLINICA La Gonadotrofina Coriónica Humana (hCG) es una glucoproteína producida por las células trofoblásticas de la placenta. Comienza a secretarse en la fase más temprana de la etapa gestacional y aumenta constantemente hasta alcanzar un pico, alrededor de 9 semanas después del comienzo del último período menstrual normal, cuyos niveles son muy variables de una mujer a otra. Su producción es índice de crecimiento placentario, hecho que permite establecer una relación directa entre la aparición de hCG y el diagnóstico de embarazo. FUNDAMENTOS DEL METODO La muestra se pone en contacto con un reactivo de látex sensibilizado con anticuerpos monoclonales anti-hCG. Si la muestra contiene hCG, ésta se unirá en forma sensible y específica produciéndose una aglutinación visible macroscópicamente. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: suspensión de partículas de látex-poliestireno que tienen adsorbidas moléculas de anti-hCG. Control Positivo: solución buffer conteniendo hCG y conservantes. Control Negativo: solución buffer libre de hCG conteniendo conservantes. REACTIVOS NO PROVISTOS Solución fisiológica.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La turbidez y/o cambio de coloración de los reactivos pueden ser indicio de contaminación de los mismos. MUESTRA Orina a) Recolección: recolectar orina en un recipiente perfectamente limpio y libre de restos de detergente. Para la Técnica Cualitativa emplear orina sin diluir, recolectada en cualquier hora del día. No obstante, si se emplea la primera orina de la mañana, puede lograrse mayor sensibilidad diagnóstica. Para la titulación emplear orina de 24 horas. La misma debe ser mantenida en refrigerador (2-10oC) durante su recolección. b) Aditivos: no se requieren. No usar conservantes. c) Sustancias interferentes conocidas: hematuria, proteinuria y/o contaminaciones bacterianas son causa de resultados erróneos. Las orinas no límpidas deben filtrarse o centrifugarse antes de ser ensayadas. Referirse a las bibliografías de Young para los efectos de las drogas y las enfermedades en el presente método. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: emplear orina fresca. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento de la recepción de la muestra, la misma debe ser mantenida en el refrigerador (2-10oC). Preferentemente, la orina debe procesarse lo antes posible dentro de las doce horas contadas desde el momento de su obtención.
INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A: homogeneizar por agitación antes de usar. Controles Positivo y Negativo: listos para usar.
MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - 1 placa de vidrio. - espátulas-gotero plásticas descartables
PRECAUCIONES Los Reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Los Controles Positivo y Negativo han sido examinados para antígeno de superficie del virus de hepatitis B (HBsAg), virus de la hepatitis C (HCV) y anticuerpos contra HIV 1/2, encontrándose no reactivos. No obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.
2- No provisto - 1 cronómetro. - material volumétrico adecuado. - fuente luminosa.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.
PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente antes de usar. Utilizar una espátula-gotero plástica provista, en posición vertical, para colocar cada muestra o control. I) TECNICA CUALITATIVA En cada uno de los sectores delimitados de la placa provista, colocar:
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Muestra o Controles
1 gota
Reactivo A
1 gota
Con el extremo cerrado de la espátula-gotero descartable utilizada para dispensar la muestra o control, mezclar durante 4-5 segundos hasta obtener una suspensión uniforme en toda la superficie del sector. Inmediatamente, disparar el cronómetro, balancear suavemente la placa y observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos, utilizando una fuente de luz ubicada directamente por encima de la placa. II) TITULACION Mezclar la orina recolectada durante 24 horas de la forma antes indicada (Ver MUESTRA) y medir su volumen. Tomar una alícuota y procesar como sigue: a) Preparar diluciones sucesivas (1/2, 1/4, 1/8, etc.) con solución fisiológica. b) Ensayar cada dilución según la TECNICA CUALITATIVA. INTERPRETACION Y CALCULO DE LOS RESULTADOS Positivo: aglutinación que aparece dentro de los dos minutos. Negativo: suspensión homogénea. Pasados los dos minutos, pueden aparecer aglutinaciones inespecíficas. Título: inversa de la máxima dilución a la cual se produce la aglutinación. Cálculos: 1- Ul de hCG/ml = S x T donde: S= sensibilidad de la reacción= 0,2 UI/ml de hCG T= título 2- Ul de hCG/24 horas = S x T x V donde: V= volumen total (en ml) de orina excretada durante las 24 hs METODO DE CONTROL DE CALIDAD Control Positivo: las reacciones positivas de Fecuntest directo presentan un aspecto grumoso que puede ser corroborado procesando una gota de orina que contenga una cantidad de hCG igual o mayor a la sensibilidad del equipo o una gota de Control Positivo en lugar de la Muestra, siguiendo la técnica descripta (ver PROCEDIMIENTO). Orinas francamente positivas pueden conservarse en alícuotas a -20oC durante no más de 60 días debiendo ser descartadas después de su uso, puesto que su integridad no se mantiene al congelarlas y descongelarlas más de una vez. Control Negativo: las reacciones negativas de Fecuntest directo presentan un aspecto homogéneo que puede ser corroborado procesando una gota de solución fisiológica o una gota de Control Negativo en lugar de la muestra siguiendo la técnica descripta (Ver PROCEDIMIENTO). VALORES DE REFERENCIA Durante el primer trimestre del embarazo se observan valores de hCG entre 25-50 Ul/ml, pudiendo llegar a un máximo de 250 Ul/ml en condiciones normales.
Un número de condiciones, además del embarazo, incluyendo enfermedad trofoblástica y ciertos neoplasmas no trofoblásticos provocan niveles elevados de hCG. Estos diagnósticos deberán considerarse si la evidencia clínica es apropiada. Un diagnóstico clínico definitivo no deberá estar basado en el resultado de una sola prueba, sino que deberá hacerlo un médico después que todos los exámenes clínicos y de laboratorio han sido evaluados. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Si la muestra de orina está demasiado diluida puede no contener niveles representativos de hCG. Repetir con la primera orina de la mañana. Muestras con concentraciones de hCG menores a la sensibilidad del método darán resultados negativos. Otras causas de resultados erróneos son: - Intercambiar las tapas de los reactivos. - No respetar los tiempos de mezclado indicados en el PROCEDIMIENTO. - No emplear los goteros en posición vertical. - Usar una placa de vidrio que no esté perfectamente limpia. - No llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente antes de comenzar a trabajar. PERFORMANCE Sensibilidad: Fecuntest directo detecta hCG en orina a partir de 0,2 Ul/ml. Dicha sensibilidad fue verificada frente al 3rd International Standard de hCG (W.H.O.). PRESENTACION Equipo para 50 determinaciones (Cód. 1323152). BIBLIOGRAFIA - Derman, R. et al - "Current Status of Immunologic Pregnancy Test" - Int. Gynaecol. Obstet. 17/90 (1979). - Reiss, A.M. - "Immunologic Cross-Reaction between Luteinizing Hormone and Antisera to Human Chorionic Gonadotropin" - Int. Arch. Allergy 30:561 (1966). - Wide, L. - "An Immunological Method for the Assay of Human Chorionic Gonadotropin" - Acta Endocrinol. 41:49. Suppl. 70 (1962). - Batzer, F. - Fertil. Steril. 34:1 (1980). - Catt, K.; Dufan, M.; Vaitukaitis, J. - J. Clin. Endocrinol. Metab. 40:537 (1975). - Braunstein, G.; Rasor, J.; Adler, D.; Danzer, H.; Wade, M. Am. J. Obstet. Gynecol. 126:678 (1976). - Lenton, E.; Neal, M.; Sulaiman, R. - Fertil. Steril. 37:773 (1982). - Dawood, M.; Saxeba, B.; Landesman, R. - Ob. Gyn. 126:678 (1976). - Braunstein, G. et al. - Ann. Inter. Med. 78:39 (1973). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001. - Young, D.S. - "Effects of Deseases on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.
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Símbolos Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C P V X
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
M
Elaborado por:
Xn
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Nocivo
Uso diagnóstico "in vitro" Corrosivo / Caústico
Contenido suficiente para ensayos Xi
Irritante
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
?
No congelar
F
Riesgo biológico
g
Consultar instrucciones de uso
Calibr.
Calibrador
b Volumen después de la reconstitución
Cont.
i
Contenido
Número de lote
b c h
Control
Control Positivo
Control Negativo
Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº: 1127/95
Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina 870430000 / 00
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C
Fecuntest strips
Prueba inmunocromatográfica para la detección de embarazo en suero, plasma u orina
SIGNIFICACION CLINICA La gonadotrofina coriónica humana (hCG) es una glicoproteína producida por las células trofoblásticas de la placenta. Comienza a secretarse en la fase más temprana de la etapa gestacional y aumenta constantemente hasta alcanzar un pico, alrededor de 9 semanas después del comienzo del último período menstrual normal. Su producción es índice de crecimiento placentario, hecho que permite establecer una relación directa entre la aparición de hCG y el diagnóstico de embarazo. FUNDAMENTOS DEL METODO La prueba Fecuntest strips es un inmunoensayo cromatográfico rápido para la detección de hCG en orina o suero. La membrana se encuentra recubierta con anticuerpos de captura anti-hCG en la zona de prueba (T) y de cabra antiratón en la zona de control (C). Durante la prueba, la muestra reacciona con las partículas de oro coloidal cubiertas con anticuerpos monoclonales de ratón anti-hCG. La mezcla migra por la membrana por capilaridad. Si el resultado es positivo, se formará una banda coloreada con la partícula compleja en la zona de prueba. La ausencia de una banda coloreada en la zona de prueba indica un resultado negativo. Como un control de procedimiento, siempre aparecerá una banda de color en la zona de control independientemente de la presencia de hCG en la muestra. REACTIVOS PROVISTOS Tiras de reacción: tiras de nitrocelulosa recubierta con anticuerpos de captura anti-hCG y partículas de oro coloidal recubiertas con anticuerpo monoclonal de ratón anti-hCG. PRECAUCIONES - Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". No usar luego de la fecha de vencimiento. - Las tiras deben permanecer en su envase hasta el momento de usar. - Una vez utilizada, la tira debe descartarse en recipientes destinados a desechos biológicos. - Todas las muestras deben manipularse como si fueran potencialmente infectivas. - Los resultados obtenidos por este ensayo son estrictamente cualitativos y no arrojan ninguna correlación con el grado de aumento o disminución de la concentración de hCG. - Los resultados del test deben usarse en conjunto con información disponible de la evaluación clínica del paciente y otros procedimientos diagnósticos.
- Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química clínica. - Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los reactivos provistos son estables a temperatura ambiente (2-30oC) hasta la fecha de vencimiento indicada, mientras sean conservadas en su envase cerrado. Una vez abierto el envase retirar las tiras de reacción necesarias y volver a cerrar inmediatamente el envase para evitar que las tiras restantes se humedezcan. MUESTRA Suero, plasma heparinizado u orina a) Recolección: obtener la muestra de la manera usual. La orina puede ser cualquiera del día sin embargo se recomienda la primera de la mañana ya que contiene, en general, la mayor concentración de la hormona. b) Aditivos: no se requieren. En caso de utilizar plasma, recolectar con heparina. c) Sustancias interferentes conocidas: la hemólisis intensa puede ser causa de resultados erróneos. Las muestras de orina que presentaran sedimento o turbiedad deben ser filtradas o centrifugadas previamente al ensayo. No producen interferencias tanto en orina como en suero y plasma: acetaminofeno (20 mg/dl), ácido acetilsalicílico (20 mg/dl), ácido ascórbico (20 mg/dl), etinil estradiol (1400 mg/dl), progesterona (1500 mg/dl), cafeína (20 mg/dl), bilirrubina (20 mg/dl), glucosa (2 mg/dl) y triglicéridos (1200 mg/dl). Referirse a las bibliografías de Young para los efectos de las drogas y las enfermedades en el presente método. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras pueden conservarse durante 48 horas a 2-10oC. Si deben conservarse por períodos más prolongados, deben ser congeladas a -20oC o menos. Deben evitarse ciclos de congelamiento y descongelamiento reiterados. Llevar la muestra a temperatura ambiente antes de realizar la prueba. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Recipiente para recolección de muestras. - Cronómetro. CONDICIONES DE REACCION - Tiempo de reacción: 3 minutos en caso de orina y 5 minutos 861238200 / 00
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en caso de suero o plasma. - Temperatura de reacción: temperatura ambiente (< 30oC). PROCEDIMIENTO 1- Tanto la tira de reacción como la muestra deben mantenerse a temperatura ambiente (< 30oC) antes de la prueba. 2- Retirar la tira de reacción de su envase y rotular con la identificación correspondiente al paciente. 3- Sumergir la tira de reacción en la muestra a ensayar, manteniéndola en posición vertical por lo menos 15 segundos cuidando de no sobrepasar la línea máxima permitida (MAX) especificada. 4- Colocar la tira de reacción sobre una superficie limpia, plana y seca, activar el cronómetro y esperar hasta la aparición de la/s líneas coloreadas. Para cada muestra, utilizar una tira de reacción nueva. 5- Observar la aparición de bandas coloreadas. Leer el resultado a los 3 minutos cuando se ensaya orina o a los 5 minutos si se ensaya suero. No interpretar los resultados pasados los 10 minutos ni antes del tiempo recomendado para cada tipo de muestra.
hCG
hCG
hCG
hCG
hCG
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
C
C
T
T
T
T
T
positivo
negativo
{
C
{
C
{
C
inválido
Positivo: se observan dos líneas rojas en la tira, una debida al control y otra debida a la presencia de hCG. Negativo: se observa sólo una línea roja en la región de control (C). Inválido: falla en la aparición de la línea roja en la zona de control (C), que puede deberse a: · insuficiente volumen de muestra; · procedimiento técnico incorrecto; · deterioro de los reactivos. Si el resultado es inválido se debe repetir la determinación con otra tira. Si el resultado es dudoso deberá probarse nuevamente con una muestra obtenida 48 a 72 horas más tarde. Las muestras dudosas con un resultado posterior negativo
pueden atribuirse a la disminución de los niveles de hCG posteriores a abortos espontáneos o inducidos. La intensidad del color en la zona de la banda de prueba (T) variará de acuerdo a la concentración de hCG presente en la muestra. METODO DE CONTROL DE CALIDAD La prueba incluye un control de procedimiento. Pueden procesarse adicionalmente controles comerciales. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Se observan resultados falsos positivos en ciertas patologías como enfermedad trofoblástica y neoplasmas no trofoblásticos (tumores testiculares), cáncer de próstata, mama y pulmón que cursan con niveles aumentados de hCG. Se observan resultados falsos negativos en caso de embarazo muy reciente, donde la concentración de hCG se encuentra por debajo del valor de discriminación y también en orinas muy diluidas, por lo que en estos casos se recomienda repetir el examen luego de 48-72 horas. Como cualquier ensayo que utiliza anticuerpos murinos, existe la posibilidad de interferencia positiva o negativa debido a la presencia de anticuerpos humanos anti-murinos (HAMA) presentes en la muestra del paciente (veterinarios, individuos tratados con terapias de anticuerpos, etc.). Esta prueba se utiliza para obtener un resultado cualitativo y visual. VALORES ESPERADOS Las mujeres sanas no gestantes y los varones sanos presentan valores de hCG no detectables para la prueba de hCG Fecuntest strips. Habitualmente en las mujeres gestantes sanas la concentración de hCG se duplica cada 2 días durante los primeros días del embarazo alcanzando a los 10 días valores entre 10-30 mUI/ml; al mes, valores cercanos a 100 mUI/ml y al final del primer trimestre, un pico de actividad con valores entre 100.000-200.000 mUI/ml. Luego, la concentración de hCG disminuye paulatinamente hasta alcanzar un valor normal luego del parto. Por lo tanto Fecuntest strips tiene la sensibilidad necesaria (25 mUI/ml), para detectar la hormona gonadotrofina coriónica (hCG) en el suero, plasma u orina de mujeres gestantes sanas. PERFORMANCE a) Sensibilidad: Fecuntest strips detecta concentraciones urinarias de hCG iguales o superiores a 25 mUI/ml (calibradas de acuerdo al WHO Fourth International Standard NIBSC Code: 75/589). b) Especificidad: efectuando estudios de reacción cruzada con 300 mUI/ml de LH, 1000 mUI/ml de FSH y 1000 uUI/ml de TSH se obtuvieron resultados negativos. c) Efecto prozona: no se observa efecto prozona hasta una concentración de 625.000 mUI/ml. d) Estudio poblacional: se realizó el ensayo de correlación del producto a evaluar (Fecuntest strips) con un kit co861238200 / 00
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mercialmente disponible (Fecuntest un paso v.2 de Wiener lab.). Los resultados fueron obtenidos siguiendo el protocolo EP12-A del NCCLS. Se procesaron 100 muestras de orina, 102 muestras de suero y 87 muestras de plasma heparinizado. Los resultados muestran una sensibilidad y una especificidad del 100% cuando se los compara con otro test inmunocromatográfico para hCG de características similares. PRESENTACION Kit para 25 determinaciones (Cód. 1999705). BIBLIOGRAFIA - User Protocol for Evaluation of Quantitative Test Performance. Approved guideline. NCCLS 2006. - Bristow A, et al. "Establishment, value assignment, and characterization of new WHO Reference Reagents for six molecular forms of human chorionic gonadotropin" Clin. Chem. 51/1:177, 2005. - Cole LA et al. "Selecting human chorionic gonadotropin immunoassays: Consideration of cross-reacting molecules in first-trimester pregnancy serum and urine" Am. J. Obstet. Gynecol. 168/5:1580, 1993. - Fenili CA, et al. "Evaluación de seis inmunoensayos (IES) utilizados para la medición de hCG humana en primer trimestre de embarazo" Rev. Soc. Argent. Endocrinol. Ginecol. Reprod. 6:34, 2000. - Saavedra MS, et al. "Formas moleculares de Gonadotrofina Coriónica Humana (hCG). Impacto en su medición" Rev. Argent. Endocrinol. Metab. 41/1:27,2004. - Stenman UH. "Immunoassay standardization: is it possible, Who is responsible; who is capable?" Clin. Chem. 47:815, 2001.
SIMBOLOS Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
autorizado en la Comunidad EuroP Representante pea
V
Uso diagnóstico "in vitro"
X
Contenido suficiente para ensayos
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
?
No congelar
F
Riesgo biológico Volumen después de la reconstitución
Cont.
Contenido
g
Número de lote
M
Elaborado por:
Xn
Nocivo Corrosivo / Caústico
Xi
i Calibr.
b b c h
Irritante Consultar instrucciones de uso Calibrador Control Control Positivo Control Negativo Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. PM-1102-40
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DIA (Dot Immuno Assay)* HIV 1+2 Inmunoensayo sobre soporte sólido para la detección de anticuerpos contra los virus de inmunodeficiencia humana HIV-1, HIV-1 grupo O y HIV-2 SIGNIFICACION CLINICA Los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) causantes del SIDA, son transmitidos principalmente por contacto sexual o a través de sangre o productos contaminados derivados de la sangre. En individuos infectados con estos virus aparecen anticuerpos, como respuesta del sistema inmunitario a la invasión viral. Estos anticuerpos no son protectores y no confieren inmunidad, pero por ser marcadores tempranos de la infección, su detección constituye la base del estudio de la patología. El presente equipo ha sido desarrollado para detectar conjuntamente la presencia de los anticuerpos anti-HIV-1, antiHIV-1 grupo O y anti-HIV-2. FUNDAMENTOS DEL METODO La muestra diluida se pone en contacto con el soporte sólido en forma de peine en el cual se encuentran inmovilizados péptidos sintéticos de transmembrana de HIV-1 y HIV-2. Si la muestra contiene anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O o anti-HIV-2 se formará un inmunocomplejo que quedará unido al soporte. Luego de un lavado, se incuba el soporte con un conjugado de proteína A-oro coloidal (Revelador). La proteína A se une al fragmento Fc de los anticuerpos. La aparición de una mancha rojiza en el lugar donde se encuentran depositados los péptidos sintéticos es indicativo de que se formó el inmunocomplejo y por lo tanto de la presencia en la muestra de anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O o antiHIV-2. REACTIVOS PROVISTOS Antígeno: soporte sólido en forma de peine, conteniendo inmovilizados en cada “diente” péptidos sintéticos de antígenos de transmembrana de HIV-1 y HIV-2 (parte opaca del peine). Diluyente de Muestras: solución fisiológica con tensioactivo no iónico, pH 7,3. Buffer de Lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/l en buffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no iónico 0,1 g/l. Revelador: proteína A de Staphylococcus aureus conjugada con oro coloidal. Control Positivo: dilución de suero inactivado, reactivo para anticuerpos anti-HIV. Control Negativo: dilución de suero inactivado, no reactivo. INSTRUCCIONES PARA SU USO Antígeno: listo para usar. Al cortar el sobre, tener la precaución de no cortar con la tijera los peines o el sobre con desecante. * Elaborado bajo licencia de Concept Foundation
Diluyente de Muestras: listo para usar. Buffer de Lavado: a baja temperatura los componentes del reactivo pueden precipitar. En tal caso, colocar en baño de agua a 37oC unos minutos, mezclando luego por inversión. Diluir 1+7 con agua destilada (1 parte Buffer de Lavado concentrado + 7 partes de agua destilada). Tener en cuenta que al realizar la técnica el Buffer de Lavado se prepara una sola vez y se utiliza en los dos lavados. Luego, debe descartarse la solución agregándole previamente 5 ml de hipoclorito de sodio al 5%. Revelador: listo para usar. Control Positivo: listo para usar. Control Negativo: listo para usar. PRECAUCIONES - Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infección. Los controles se encuentran inactivados. Sin embargo, deben emplearse como si se tratara de material infectivo. - Los sueros controles han sido examinados para HBsAg, encontrándose negativos. - Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruidos a fin de asegurar la inactivación de agentes patógenos. El método recomendado para este procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los líquidos de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concentración final 5%) durante por lo menos 60 minutos. - Si los pocillos de la policubeta no se utilizan en su totalidad, descartar el líquido de los pocillos utilizados en un recipiente para desechos biológicos que contenga 5% de hipoclorito sódico. Luego golpear la policubeta varias veces sobre papel absorbente que se descartará como residuo biológico y lavarla con una solución alcohólica al 50%. Secarla y cubrir los pocillos empleados en el ensayo con cinta autoadhesiva para evitar su reutilización. - No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes. - No emplear reactivos de otro origen. - Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". - El Buffer de Lavado contiene azida sódica. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Buffer de Lavado: preparar en el momento de usar. Antígeno: los peines con antígeno inmovilizado se proveen cerrados y con desecante. No abrir el envoltorio hasta el momento de usar ni antes que hayan tomado temperatura am870420000 / 00
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biente, para evitar la humectación del contenido. Los peines no utilizados deben conservarse dentro del sobre con el desecante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-10oC. Los peines conservados en estas condiciones pueden ser utilizados dentro de los 2 meses posteriores mientras no se supere la fecha de vencimiento del equipo. MUESTRA Suero o plasma a) Recolección: obtener la muestra de la manera usual. b) Aditivos: si se emplea plasma puede utilizarse cualquier anticoagulante de uso corriente en la práctica transfusional. c) Sustancias interferentes conocidas: la hemólisis puede ser causa de resultados erróneos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras no diluidas pueden conservarse durante no más de 4 horas a temperatura ambiente y hasta 7 días refrigeradas (2-10oC). Para conservación por períodos más prolongados deben ser congeladas a -20oC o menos. Los congelamientos y descongelamientos reiterados pueden producir falsos positivos y falsos negativos. Si las muestras deben ser transportadas, embalar de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envío de materiales infecciosos. MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - policubetas - recipiente para lavado 2- No provisto - micropipeta de 100 ul - reloj alarma o cronómetro - material volumétrico adecuado CONDICIONES DE REACCION - Tiempo total de reacción: 20 minutos - Temperatura de reacción: temperatura ambiente (> 22oC). Si la temperatura ambiente es menor a 22oC, realizar la reacción en estufa a 37oC. - Volumen de muestra: 100 ul PROCEDIMIENTO Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el análisis completarlo sin interrupción. Procesar simultáneamente 1 Control Positivo (en el “diente” del extremo derecho del peine) y 1 Control Negativo (en el “diente” del extremo izquierdo del peine). Luego proceder de la siguiente forma: Preparación del material: Colocar 2 gotas de Diluyente de Muestras en cada pocillo a utilizar de la policubeta. En cada uno de estos pocillos colocar 100 ul de Muestra o Controles. Tener la precaución de colocar los mismos en el fondo de los pocillos para asegurarse de no producir salpicaduras que puedan contaminar pocillos vecinos. Mezclar aspirando con la
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micropipeta varias veces el contenido de cada pocillo a fin de asegurar una correcta homogeneización. En la hilera de pocillos contigua a la utilizada para las muestras colocar 3 gotas de Revelador por pocillo a utilizar. Preparar el Buffer de Lavado como se explicó en INSTRUCCIONES PARA SU USO. Colocar el Buffer de Lavado en el recipiente destinado a tal fin, teniendo la precaución de no formar espuma. Este recipiente debe permitir que los dientes del peine queden completamente sumergidos. Realización de la prueba: Abrir cuidadosamente el envoltorio y extraer el número de peines necesarios para el ensayo. Conservar los restantes como se indicó en ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO. Colocar la identificación de cada muestra directamente en la parte superior del diente correspondiente. Importante: no tocar en ningún momento las zonas reactivas del peine ya que esto puede ocasionar resultados erróneos. Colocar el peine en los pocillos de la policubeta que contienen las diluciones de muestras y controles e incubar durante exactamente 10 minutos a temperatura ambiente. Extraer el peine de los pocillos y escurrir las puntas de los dientes tocando sobre papel absorbente. No tocar el papel con la zona reactiva de los dientes. Manteniendo el peine en posición vertical con los dientes hacia abajo y la zona reactiva de frente al operador sumergir el peine en el Buffer de Lavado. El lavado debe realizarse repitiendo 10 veces un movimiento del peine constante, lento y suave de adelante hacia atrás, sin tocar con el mismo las paredes del recipiente. Escurrir nuevamente las puntas de los dientes como se explicó anteriormente. Insertar el peine en los pocillos que contengan el Revelador e incubar a temperatura ambiente durante exactamente 10 minutos. Tener en cuenta que la reacción positiva se intensifica si se agita durante el revelado, por ejemplo en un agitador de Kline. Al finalizar la incubación repetir el lavado como se indicó más arriba, empleando el mismo Buffer de Lavado que se usara anteriormente. Colocar el peine sobre una superficie limpia con la zona reactiva hacia arriba y dejar secar completamente antes de observar los resultados. El color del “dot” se intensifica al secarse. Efectuar la lectura de los resultados bajo luz natural o fluorescente. No emplear lámpara incandescente.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reacción es estable indefinidamente por lo que el soporte puede conservarse para referencias futuras de los resultados. CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDA La corrida se considera válida si se cumplen simultáneamente las siguientes condiciones:
a) No debe aparecer color detectable en el diente correspondiente al Control Negativo. b) El Control Positivo debe ser nítidamente detectable. Si alguna de estas condiciones no se cumple, repetir la corrida, empleando un nuevo equipo de reactivos. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - El kit está diseñado para usar con muestras puras. No utilizar muestras diluidas debido a que las mismas pueden ocasionar resultados falsos negativos. - Debe recordarse que la presencia de anticuerpos anti-HIV en el suero NO es diagnóstico de SIDA. Los resultados repetidamente reactivos deben corroborarse por métodos de referencia como Western blot. - Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposición o infección por HIV. - Pueden obtenerse resultados falsos positivos en las siguientes situaciones: enfermedades autoinmunes, tuberculosis, lupus eritematoso sistémico, embarazo, vacunación contra hepatitis B y otras inmunizaciones, hemodiálisis, enfermedad hepática y otras enfermedades. PERFORMANCE - En un estudio conducido por el Global Program on AIDS (GPA) perteneciente a la World Health Organization (WHO) se evaluó un panel de 600 sueros humanos y 8 paneles de seroconversión. Los datos obtenidos se compararon con Western blot como método de referencia, encontrándose una sensibilidad del 100%, una especificidad del 99,7% y una reproducibilidad del 99,4%. - En un estudio realizado sobre 425 muestras provenientes de pacientes del Instituto de Infectología Emílio Ribas de San Pablo, se obtuvo una sensibilidad del 99,5%, una especificidad del 96,4% y una eficiencia del 97,8%. - En un estudio realizado sobre dos muestras de HIV-1 grupo O, B7-2705-0001 y JP8-2707-0001, de Boston Biomedica Inc., fueron detectadas las 2 muestras. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Una vez finalizada la prueba y cuando el peine se haya secado completamente, observar los resultados sobre una superficie blanca, a ojo descubierto y con buena iluminación. Muestra Reactiva: aparición de una mancha coloreada (rosa tenue a rojo) en la zona reactiva del peine. Siempre que este círculo esté presente, aún cuando el color sea de menor intensidad que el Control Positivo, indica muestra reactiva. Muestra No Reactiva: no se observa coloración en la zona reactiva del peine. Toda prueba inicialmente reactiva debe ser ensayada nuevamente por duplicado. Si uno o ambos de los duplicados son Reactivos, se presume que la muestra contiene anticuerpos anti-HIV-1 o anti-HIV-2. Si ambos duplicados resultan No Reactivos se considera el primer resultado como falsamente positivo, presumiéndose que la muestra no contiene anti-HIV-1 ni anti-HIV-2. Toda muestra Reactiva debe ensayarse nuevamente empleando un método de referencia y realizar la discriminación para HIV-1/HIV-2.
Esquema de interpretación Muestra inicial
zona reactiva incolora Muestra No Reactiva
zona reactiva coloreada Muestra Reactiva
Repetir por duplicado
Ambos duplicados No Reactivos
Muestra No Reactiva
Uno o ambos duplicados Reactivos
Confirmar por Western blot y discriminar HIV-1/HIV-2
PRESENTACION Equipo para 48 determinaciones (Cód. 1723201). BIBLIOGRAFIA - Gallo, R.C. y cols. Science 224:500 (1984). - Montagnier, L. - Ann. Inst. Pasteur/Virol., 138, 3-11 (1987). - Centers for Disease Control - Morbidity and Mortality Weekly Report 36/31 (1987). - Lossa, G.R. - Acta Bioq. Clín. Latinoam. XXI/1:47-65 (1987). - NotiWiener Nº76, pág. 1, abril 1990. - Bansal, J.; Constantine, N.; Zhang, X.; Kataaha, P. - VIIth International Conference on AIDS in Africa, 1992. - Sato, N.; Rojkín, F.; Lorenzo, L.; Piovesana, M.; Beristain, C.; Takeda, A. - XXVII Congreso Brasileiro de Patología Clínica San Pablo, Brasil - Setiembre 1993. - Lorenzo, L.E. ; Rojkín, L.F. ; Beristain, C.N. - 46th National Meeting, AACC, 17-21 julio, 1994, New Orleans, LA, USA Clin. Chem. 40/60:1036 Abs., 254, 1994. - Rojkín, L.F.; Lorenzo, L.E.; Beristain, C.N.- Resúmenes 1° Congreso Argentino de Biotecnología, II° Feria Congreso Latinoamericano de Biotecnología, 6-8 junio, 1994, Buenos Aires, Argentina, pag. 70. - Report of the WHO evaluation of the DIA (Dot Immuno Assay) HIV 1+ 2 (Wiener lab. - Argentina). Institute of Tropical Medicine, Department Infection and Immunity, WHO Collaborating Centre on AIDS, Division of Microbiology Antwerpen, 24 February, 1995. - Celum C., Coombs R., Jones M. et al. - Arch. Intern. Med. 154:1129 (1994). - Barthel H., Wallance D. - Semin. Arthritis Rheum. 23:1 (1993). - Doran T. and Parra E. - Arch. Fam. Med. 9/9:924 (2000). - Centers for Disease Control - MMWR 50/RR19:59 (2001).
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EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS Antígeno
Diluyente
Antígeno Revelador
Buf. Lavado
Revelador Control
Muestra
Diluyente de Muestras Conc.
Buffer de Lavado concentrado +
Control
Control Positivo
-
Control Negativo
Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
P Representante autorizado en la Comunidad Europea V
Uso diagnóstico "in vitro"
X
Contenido suficiente para ensayos
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
?
No congelar
F
Riesgo biológico Volumen después de la reconstitución
Cont.
Contenido
g
Número de lote
M
Elaborado por:
Xn
Nocivo Corrosivo / Caústico
Xi
i Calibr.
b b c h
Irritante Consultar instrucciones de uso Calibrador Control Control Positivo Control Negativo Número de catálogo
M
Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº: 5181/04
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Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina
WL Check HIV 1+2 Para la detección de anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O y anti-HIV-2 en suero, plasma y sangre entera
SIGNIFICACION CLINICA Los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) son los agentes causales del Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Estos retrovirus son transmitidos por la exposición a ciertos fluidos corporales infectados, principalmente secreciones genitales y sangre o productos contaminados derivados de la sangre y por pasaje a través de la placenta. En individuos infectados con estos virus aparecen anticuerpos como respuesta del sistema inmunitario a la invasión viral. La detección de dichos anticuerpos es utilizada como herramienta de diagnóstico. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE.UU. (CDC), en su iniciativa "Advancing HIV Prevention" (AHP) destacan la importancia de la utilización de pruebas rápidas de detección del HIV para facilitar el acceso al diagnóstico precoz en zonas de alta prevalencia, en individuos de alto riesgo o en zonas donde otros métodos de diagnóstico como ELISA, Western Blot o amplificación de ácidos nucleicos no estén disponibles. También son de gran utilidad en el momento del parto, especialmente para el diagnóstico de mujeres que no hayan sido controladas durante el embarazo. Por otra parte, estas pruebas rápidas constituyen una herramienta diagnóstica que puede desempeñar un papel importante en campañas de prevención y diagnóstico en entornos clínicos y no clínicos, facilitando de esta manera, la detección precoz de la infección. FIN Y USO WL Check HIV 1+2 es una prueba rápida que detecta conjuntamente la presencia de anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV1 grupo O y anti-HIV-2, destinada a diagnóstico clínico o estudios de campo. No está destinada como prueba de tamizaje de anticuerpos anti-HIV 1 y 2 para donantes de sangre y derivados. FUNDAMENTOS DEL METODO WL Check HIV 1+2 es un ensayo inmunocromatográfico "in vitro", de lectura visual, para la detección cualitativa de anticuerpos contra los virus HIV-1 y HIV-2 en suero, plasma y sangre entera. La prueba consta de un cassette plástico que contiene: - una membrana de nitrocelulosa sensibilizada con antígenos recombinantes para HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36) en la zona de prueba "T". - un parche impregnado con antígenos recombinantes específicos para HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36) conjugados a oro coloidal. La muestra y el buffer se agregan en el pocillo de muestra "S"
solubilizando y mezclándose con el conjugado de antígenos recombinantes. Seguidamente, esta mezcla migra por capilaridad a través de la membrana de nitrocelulosa. Si la muestra es reactiva, los anticuerpos anti HIV-1 y HIV-2 presentes, formarán un complejo con los antígenos conjugados a oro coloidal. Este complejo se unirá posteriormente a los antígenos inmovilizados en la zona de prueba "T" de la membrana de nitrocelulosa, formando así una línea de color rosa-rojo púrpura. La ausencia de dicha línea indica un resultado negativo. Como control de procedimiento, la prueba incluye una zona de control "C" de color celeste que cambia a color rosa-rojo púrpura tras el paso de la muestra. La ausencia de esta línea invalida los resultados. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: cassette plástico compuesto por una membrana de nitrocelulosa sensibilizada con antígenos recombinantes específicos para HIV-1 y HIV-2 y conjugado de antígenos recombinantes. Listo para usar. B. Reactivo B: buffer borato de sodio 15 mM, azida 0,95 g/L, agente tensioactivo, pH = 9,1. Listo para usar. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Micropipeta automática para medir los volúmenes indicados. - Dispositivo de 20 uL descartable para toma de sangre entera capilar (sólo provisto en algunas presentaciones) - Tips descartables. - Reloj alarma o cronómetro. - Material para extracción de muestra. - Guantes descartables, guardapolvo, protección ocular. - Contenedor para el descarte de residuos biológicos. - Hipoclorito de sodio. PRECAUCIONES - Leer el manual de instrucciones de manera completa antes de realizar el ensayo y seguir las instrucciones cuidadosamente. - No realizar la prueba si el envase está dañado. - No utilizar los reactivos después de la fecha de vencimiento indicada en el envase. - Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". - Esta prueba proporciona un resultado cualitativo y visual. Es necesaria una buena fuente de luz para la lectura de los resultados. - No mezclar reactivos de diferentes lotes. - No utilizar reactivos de otro origen. - No tocar la membrana de nitrocelulosa con los dedos. - Seguir las prácticas de seguridad biológica al utilizar muestras y reactivos:
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. Manipular todas las muestras de pacientes como potencialmente infecciosas. . Utilizar guantes, guardapolvo y protección ocular. . No pipetear con la boca. . No comer, beber, fumar, utilizar maquillaje ni manejar lentes de contacto en los lugares donde se trabaje con estos materiales. . Limpiar y desinfectar las salpicaduras de muestra o reactivos usando hipoclorito sódico (concentración final 5%) u otro desinfectante adecuado. Para inactivar el material empleado autoclavar durante 1 hora a 121oC. - Evitar la formación de burbujas en el pocillo de muestra "S" tanto al colocar la muestra como el Reactivo B. Al dispensar el Reactivo B descartar cualquier gota con burbuja. - Durante la realización de la prueba, colocar el cassette sobre una superficie limpia, plana y sin vibraciones. - No agitar el cassette durante la realización del ensayo. - El cassette y el dispositivo para toma de sangre entera capilar, son descartables. No reutilizar. Desechar en recipientes destinados a residuos con riesgo biológico. - El Reactivo B posee azida sódica en bajas concentraciones como conservante. - Los reactivos y las muestras deben ser descartados de acuerdo a la normativa vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El kit es estable a 2-30oC hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. En caso de almacenar refrigerado, asegurarse que el sobre alcance temperatura ambiente antes de ser utilizado, de lo contrario se favorecerá la humectación del contenido. El cassette debe permanecer en su sobre original sellado. No abrir el envoltorio hasta el momento de usar. MUESTRA Suero, plasma y sangre entera obtenida por punción venosa o punción capilar a) Recolección: recoger las muestras asépticamente y de manera tal de evitar hemólisis. - Suero: obtenido de sangre entera sin anticoagulantes. Separar el suero del coágulo inmediatamente para evitar hemólisis. Puede utilizarse suero obtenido en tubos con acelerador y gel separador. - Plasma: utilizar plasma recogido con EDTA, citrato o heparina. - Sangre entera (punción venosa): utilizar sangre recogida con EDTA, citrato o heparina. - Sangre entera (punción capilar): utilizar sangre recogida con el dispositivo descartable (sólo provisto en algunas presentaciones). Realizar la prueba inmediatamente. En caso de utilizar otro dispositivo, es responsabilidad del usuario validar el dispositivo de toma de sangre entera capilar. b) Estabilidad y almacenamiento: - Suero y plasma: conservar a 2-10oC. En caso de no realizar la prueba dentro de los 5 días conservar la muestra a -20oC. No es recomendable realizar múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento. Esto puede generar
resultados erróneos. En caso de usar muestras congeladas, éstas deben ser homogeneizadas y centrifugadas antes de usar. - Sangre (punción venosa): puede almacenarse hasta 3 días entre 2-10ºC. No congelar. - Sangre (punción capilar): utilizar inmediatamente. No congelar. c) Sustancias Interferentes: en sueros y plasmas enriquecidos, no se ha observado interferencia por: - Hemólisis: hasta 1,1 g/dL de hemoglobina. - Lipemia: hasta un equivalente de triglicéridos de 1500 mg/dL, tras enriquecer con Intralipid®. - Bilirrubina: hasta 30 mg/dL. - Acido ascórbico: hasta 50 mg/dL. d) Transporte: si las muestras deben ser transportadas, embalar de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envío de material infeccioso.
PROCEDIMIENTO 1- Los reactivos y las muestras deben estar a temperatura ambiente (18-30oC) antes de utilizar. 2- Extraer el cassette de su sobre sellado inmediatamente antes de utilizar. 3- Colocar el cassette sobre una superficie limpia, plana y sin vibraciones. 4- Agregar la muestra sobre la superficie absorbente del pocillo de muestra "S". PARA SUERO O PLASMA - Colocar 10 uL con micropipeta automática. - Esperar 10-15 seg. hasta que se absorba la muestra. - Agregar 3 gotas (100 uL) de Reactivo B en el pocillo de muestra "S". - Iniciar el cronómetro. PARA SANGRE ENTERA - Colocar 20 uL con micropipeta automática.* - Esperar 10-15 seg. hasta que se absorba la muestra. - Agregar 3 gotas (100 uL) de Reactivo B en el pocillo de muestra "S". - Iniciar el cronómetro. Nota: *en caso de utilizar sangre entera capilar, usar el dispositivo de 20 uL descartable (sólo provisto en algunas presentaciones) 5- En cualquiera de los casos, leer los resultados entre los 20 y 30 minutos. No leer pasado los 30 minutos ya que pueden obtenerse resultados erróneos. Algunas muestras positivas reaccionan inmediatamente mientras que otras lo hacen más lentamente dentro del tiempo de lectura indicado. Debido a características particulares de algunas muestras, el color de fondo de la membrana puede quedar ligeramente rosado sin afectar la interpretación de los resultados.
CRITERIOS DE VALIDACION DE LA PRUEBA - El cassette cuenta con una línea de color celeste en la zona de control "C" que permite identificar la determinación WL Check HIV 1+2 e indica que los componentes de la prueba están presentes y activos.
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- Al realizar el ensayo la línea de color celeste debe cambiar a color rosa-rojo púrpura. Este cambio de color confirma que se ha agregado el volumen adecuado de muestra, que su migración fue apropiada y que la realización del procedimiento fue correcta. - Es responsabilidad del usuario efectuar el Control de Calidad del equipo de acuerdo a las normas locales vigentes. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS POSITIVO
C T
S
NEGATIVO
C T
C T
S
S
INVALIDO
C T
C T
S
S
Resultado Positivo (2 líneas): se observan 2 líneas de color rosa-rojo púrpura, una en la zona de prueba "T" y otra en la zona de control "C". La intensidad de color de la línea "T" dependerá de la muestra en estudio. Cualquier color rosado visible, aunque sea muy tenue debe ser interpretado como positivo. El resultado es positivo aunque las intensidades del color de las líneas "T" y "C" sean diferentes. Resultado Negativo (1 línea): se observa solamente una línea de color rojo-rosa púrpura en la zona de control "C". No aparece línea de color en la zona de prueba "T". Resultado Inválido: la ausencia de la línea de color rosarojo púrpura en la zona de control "C" invalida el resultado, aunque esté o no presente la línea de color rosa-rojo púrpura en la zona de prueba "T". Un resultado inválido generalmente indica un error en la realización del procedimiento o un problema con la muestra. Con determinadas muestras pueden aparecer dificultades como migración incompleta, muestra muy viscosa o presencia de fibrina. En cualquier caso, revisar el procedimiento, centrifugar nuevamente la muestra y repetir el ensayo utilizando un nuevo cassette.
Algoritmo de interpretación Muestra original Resultado Positivo por WL Check HIV 1+2
Resultado Negativo por WL Check HIV 1+2
Repetir por duplicado Uno o ambos duplicados Positivos por WL Check HIV 1+2
Ambos duplicados Negativos por WL Check HIV 1+2 NEGATIVO
POSITIVO Realizar otra prueba (ej.: ELISA) y confirmar por Western Blot
NEGATIVO
Nota: tener en cuenta las normativas específicas de cada país para el diagnóstico de infección por HIV LIMITACIONES DEL METODO - WL Check HIV 1+2 es una prueba complementaria en el diagnóstico del HIV. Cualquier resultado obtenido con esta prueba debe ser cotejado con los datos clínicos del paciente antes de realizar el diagnóstico definitivo. - Un resultado negativo no excluye la posibilidad de infección por HIV. Se puede obtener un resultado falso negativo en las siguientes circunstancias: . Niveles bajos de anticuerpos anti-HIV en estadios tempranos de la infección. . Infección con una variante del virus que no se detecta con esta prueba. Por estas razones se debe tener cuidado al interpretar un resultado negativo, especialmente en pacientes con presencia de síntomas clínicos y factores de riesgo. En este caso se recomienda analizar una nueva muestra obtenida con posterioridad. - Muestras positivas por WL Check HIV 1+2 indican la presencia de anticuerpos anti-HIV-1 y anti-HIV-2. Estas mues-
tras deben ser repetidas utilizando otro método (como ELISA) y confirmadas por Western Blot. El diagnóstico puede ser establecido solamente luego de interpretar los resultados junto con los datos clínicos del paciente. - Para un resultado positivo, la intensidad de color de la línea "T" no necesariamente se correlaciona con la concentración de anticuerpos anti-HIV específicos en la muestra. - Pueden obtenerse resultados falsos positivos en las siguientes situaciones: enfermedades autoinmunes, tuberculosis, lupus eritematoso sistémico, embarazo, vacunación contra hepatitis B y otras inmunizaciones, hemodiálisis, enfermedad hepática y otras enfermedades. - WL Check HIV 1+2 ha sido diseñado para la detección de anticuerpos contra HIV-1 y HIV-2 en suero, plasma y sangre entera humana. No utilizar otros fluidos biológicos como saliva, líquido cefalorraquídeo u orina. - Pueden obtenerse resultados erróneos con muestras de suero o plasma con aspecto turbio debido a contaminación bacteriana o por haber sido sometidas a varios ci-
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clos de congelación y descongelación. - La utilización de muestras inactivadas por calor puede proporcionar resultados incorrectos. - No utilizar pooles de muestras o muestras diluidas. - Ver sustancias interferentes en MUESTRA. PERFORMANCE a) Sensibilidad Sensibilidad Clínica en Paneles de Performance En un estudio realizado sobre diferentes paneles comerciales internacionales, se obtuvieron los siguientes resultados: - PRB 108 (Anti-HIV 1 Low Titer Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 13 de las 14 muestras reactivas. - PRB 109 (Anti-HIV 1 Low Titer Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 15 de las 19 muestras reactivas. - PRB 204 (Anti-HIV 1 Mixed Titer Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 23 de las 23 muestras reactivas. - WWRB303 (Worldwide HIV Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 13 de las 14 muestras reactivas para HIV-1 grupo M (subtipos A, B, C, D, F y G), HIV-1 grupo O y HIV-2. - WWRB350 (Worldwide HIV Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 18 de las 18 muestras reactivas para HIV-1 grupo M (subtipos A, CRF02_AG, B, C, D, CRF01_AE, F, G y H). - PRB 601 (HIV-1 Incidence/Prevalence Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 15 de las 15 muestras reactivas para HIV-1 correspondientes a infecciones recientes y de larga duración. - PRZ 204 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 14 de las 14 muestras reactivas para HIV-1 y HIV-2. - PRZ 205 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 14 de las 14 muestras reactivas para HIV-1 y HIV-2. - PRZ 207 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 14 de las 14 muestras reactivas para HIV-1 y HIV-2. - PP 0508 (Panel de Performance para HIV, Q Panel, Brasil): se detectaron 16 de las 16 muestras reactivas. - PP 0409 (Panel de Performance para HIV, Q Panel, Brasil): se detectaron 16 de las 16 muestras reactivas. Sensibilidad Clínica en Paneles de Seroconversión En un estudio realizado sobre diferentes paneles comerciales internacionales de seroconversión (Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics), se obtuvieron los siguientes resultados: Nombre del panel
Tiempo (días) en el cual la muestra es reactiva Dias desde el primer sangrado WL Check Western Blot HIV 1+2 (datos Sera Care)
PRB 904-D
0, 21, 49, 92, 99
92
92
PRB 912-L
0, 9, 14, 16, 28, 30
0
9
PRB 916-P
0, 4, 9, 15, 30, 35
30
30
PRB 919-S
0, 9, 11
9
9
PRB 924-X
0, 2, 8, 10, 26, 33, 35, 40
33
35 (Indet)
PRB 925-Y
0, 10, 18, 22, 44, 49
44
44 (Indet)
PRB 929-AD
0, 4, 14, 18, 21, 25, 28
25
25 (Indet)
PRB 930-AE
0, 3, 7, 10
7
10 (Indet)
PRB 944-AT
0, 2, 7, 9, 14, 16
14
14 (Indet)
PRB 947-AW
0, 9, 11, 20
9
9 (Indet)
PRB 949-AY
0, 6, 9, 18, 20
20
20 (Indet)
PRB 951-BA
0, 2, 8, 11, 15, 19
19
Negativo hasta 19 días
PRB 952-BB
0, 7, 10, 14, 17, 21
17
14 (Indet)
0, 3, 7, 10
10
Negativo hasta 10 días
0, 2, 20, 22, 30, 35, 37, 44, 48, 51
48
Negativo hasta 51 días
PRB 953-BC PRB 966
Indet: indeterminadas
Sensibilidad Clínica en Paneles de muestras reactivas En un estudio de 68 muestras reactivas, incluidas 4 muestras HIV-1 grupo O, provenientes de una institución hospitalaria, se detectaron las 68 muestras. En otro estudio se suplementaron 30 sangres enteras con 30 sueros positivos para HIV y se evaluaron en paralelo las sangres enteras suplementadas y los respectivos sueros. Se detectaron la totalidad de las muestras (sangres enteras y sueros). En otro estudio se evaluaron, en paralelo, 15 muestras reactivas de suero y plasma obtenidas del mismo paciente y para 10 de estas muestras también se evaluó sangre entera obtenida por punción capilar. Con todos los tipos de muestras se tuvieron resultados positivos. b) Especificidad En un estudio realizado sobre 1122 muestras de sueros, plasmas y sangres enteras provenientes de tres centros de salud diferentes, se encontró una especificidad de 99,91% con un IC95% = 99,49% - 99,98%. En otro estudio realizado sobre 417 muestras de banco de sangre, la especificidad obtenida fue de 99,76% con un IC95% = 98,65% - 99,96%. Para 100 muestras de las 417 se evaluaron, en forma paralela, muestras de suero y plasma del mismo paciente y para 40 de estas 100 muestras también se evaluó sangre entera obtenida por punción capilar. Con todos los tipos de muestras se tuvieron resultados negativos. En otro estudio de 393 muestras de sueros y plasmas de tres centros de salud diferentes, se encontró una especificidad de 99,24% con un IC95% = 97,78% - 99,74%. También se estudió la posible aparición de reactividades cruzadas ensayando muestras provenientes de 440 individuos con diferentes condiciones clínicas que pueden ser causantes de reacciones inespecíficas para el ensayo WL Check HIV 1+2. Estas condiciones incluyen mujeres em-
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comendado por el CLSI (ex NCCLS). Los ensayos fueron realizados con 4 muestras positivas con diferentes niveles de reactividad y con 1 muestra negativa. Se realizaron 2 ensayos diarios evaluando cada muestra por duplicado por el transcurso de 20 días. Los resultados fueron leídos a los 20 minutos en un lector inmunocromatográfico y en forma visual. Las muestras positivas siempre dieron un resultado reactivo y la muestra negativa siempre dio un resultado no reactivo.
barazadas, pacientes hemodializados, pacientes con enfermedades autoinmunes o enfermedades infecciosas diferentes a HIV (Chagas, HTLV, Hepatitis C, Hepatitis B, Sífilis, otras). Para esta población la especificidad fue de 98,18% con un IC95% = 96,45% - 99,08%. c) Precisión Se evaluó la precisión del test siguiendo el protocolo EP5-A reLínea T Media
Línea C
Intraensayo
Total
Media
Intraensayo
(DO)
S
CV
S
CV
(DO)
S
Muestra positiva 1
0,221
0,027
12,36%
0,032
14,36%
0,676
Muestra positiva 2
0,085
0,018
20,88%
0,021
24,23%
0,686
Muestra positiva 3
0,271
0,044
16,40%
0,049
18,02%
Muestra positiva 4 (en dilución)
0,049
0,017
35,79%
0,017
Muestra negativa
(-)
NC
NC
NC
Total
CV
S
CV
0,066
9,69%
0,078
11,61%
0,077
11,22%
0,087
12,61%
0,702
0,070
9,94%
0,076
10,80%
35,36%
0,679
0,075
11,11%
0,085
12,59%
NC
0,591
0,073
12,34%
0,104
17,61%
N = 80; (-) = no reactivo por lectura visual; NC = no corresponde PRESENTACION 25 determinaciones (Cód. 1690319) BIBLIOGRAFIA - Centro Nacional de referencia para el SIDA (http:// www.cnrsida.org.ar) - Centers for Disease Control and Prevention: Rapid HIV Testing (http://www.cdc.gov/hiv/topics/testing/rapid/ index.htm) - Greenwald JL, Burstein GR, Pincus J, Branson B. - A rapid review of rapid HIV antibody tests. - Curr. Infect. Dis. Rep. 8/2:125 (2006). - Centers for Disease Control and Prevention: Advancing HIV Prevention: New Strategies for a Changing Epidemic, United States, 2003. MMWR 2003, 52:329–332. (http://
www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5215a1.htm) - Centers for Disease Control and Prevention: Notice to Readers: Protocols for Confirmation of Reactive Rapid HIV Tests. MMWR 2004, 53:221-222 (http://www.cdc.gov/mmwr/ preview/mmwrhtml/mm5310a7.htm) - Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. EP5-A, Vol. 19, Nº 2, NCCLS. - User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline. EP12-A, Vol. 22, Nº 14, NCCLS. - Procedures and Devices for the Collection of Diagnostic Capillary Blood Specimens; Approved Standard, 5ª Edición. H4-A5, Vol. 24, Nº 21, CLSI (ex NCCLS). - Evaluation of Stability of In Vitro Diagnostic Reagents. Approved Guideline. EP-25A, Vol. 29, Nº 20, CLSI (ex NCCLS).
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SIMBOLOS Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
V
Uso diagnóstico "in vitro"
X
Contenido suficiente para ensayos
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
G
No congelar
F
Riesgo biológico
P Representante autorizado en la Comunidad Europea
Volumen después de la reconstitución Cont.
Contenido
g
Número de lote
M
Elaborado por:
Xn
Nocivo Corrosivo / Caústico
Xi
i Calibr.
b b c h
Irritante Consultar instrucciones de uso Calibrador Control Control Positivo Control Negativo Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº 6661/11
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Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina UR120705
HIV 1+2 ELISA 3ª Generación Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección de anticuerpos anti- HIV-1 y anti HIV-2 en suero o plasma
SIGNIFICACION CLINICA Los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) son los agentes causales del Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Estos retrovirus son transmitidos por la exposición a ciertos fluidos corporales infectados, principalmente secreciones genitales y sangre o productos contaminados derivados de la sangre y por pasaje a través de la placenta. La evidencia serológica de la infección por HIV-1 y HIV-2 puede ser obtenida determinando la presencia de antígenos y anticuerpos en el suero de individuos en los que se sospecha la infección. Los antígenos pueden generalmente ser detectados en la fase aguda y durante la fase sintomática de la enfermedad. Los anticuerpos pueden ser detectados a lo largo de toda la infección, comenzando en la fase aguda o inmediatamente después de ella. El ensayo HIV 1+2 ELISA 3ª Generación está diseñado para detectar anticuerpos contra HIV-1, HIV-1 grupo O y HIV-2. FUNDAMENTOS DEL METODO Los pocillos de la policubeta están recubiertos con antígenos recombinantes de los virus HIV-1 y HIV-2. La muestra se incuba en los pocillos. Si la muestra contiene anticuerpos contra HIV-1 o HIV-2, los mismos se unirán a los antígenos sensibilizados en la placa. El material no unido es removido por lavado. En el paso siguiente se agrega el conjugado que contiene los mismos antígenos de la placa conjugados a peroxidasa. Estos se unirán a los anticuerpos si estaban presentes en la muestra. El conjugado no unido se remueve por lavado. A continuación se agrega una solución conteniendo tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno. Las muestras reactivas desarrollan color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con ácido sulfúrico. REACTIVOS PROVISTOS Policubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles con 96 pocillos recubiertos con antígenos recombinantes de HIV-1 y HIV-2. Conjugado: antígenos recombinantes unidos a peroxidasa. Color rojo. Revelador: solución de tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. Stopper: ácido sulfúrico 2 N. Buffer de Lavado Concentrado: buffer salino con tensioactivo (25x). Color verde. Control Positivo: suero humano inactivado conteniendo anticuerpos anti-HIV-1 y HIV-2. Color naranja. Control Negativo: suero humano no reactivo inactivado. Color amarillo.
REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada o desionizada. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Micropipetas para medir los volúmenes indicados - Tips descartables - Material volumétrico para preparar las diluciones indicadas - Estufa a 37oC - Papel absorbente - Guantes descartables - Reloj alarma o cronómetro - Hipoclorito de sodio - Sistema de lavado de policubetas (manual o automático) - Espectrofotómetro para lectura de policubetas PRECAUCIONES - Los reactivos son para uso diagnóstico “in vitro”. -Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infección. - Los sueros controles han sido examinados para antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) y anticuerpos contra el virus de hepatitis C (HCV), encontrándose no reactivos. Sin embargo, se recomienda manipularlos con las precauciones requeridas para muestras potencialmente infecciosas. - Al descartar los materiales empleados en el ensayo se deben tratar a fin de asegurar la inactivación de agentes patógenos. El método recomendado para este procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los líquidos de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concentración final 5%) durante por lo menos 60 minutos. - No intercambiar reactivos de distintos lotes. - No emplear reactivos de otro origen. - Evitar tocar las paredes de los pocillos con los tips. - No utilizar elementos metálicos que puedan entrar en contacto con los reactivos. - Las policubetas deben incubarse en estufa. Debe evitarse abrir la estufa durante este proceso. No usar baño de agua. - Evitar que los vapores de hipoclorito provenientes de los recipientes para desechos biológicos u otras fuentes entren en contacto con los reactivos, ya que el hipoclorito afecta la reacción. - Evitar contacto del ácido sulfúrico (Stopper) con piel y mucosas. R36/38: irrita los ojos y la piel. R34: provoca quemaduras. S24/25: evítese el contacto con los ojos y la piel. S26: en caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. S28: en caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua. S37/39: usar guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.
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- Evitar el derrame de líquidos y formación de aerosoles. - No pipetear con la boca. Usar guantes descartables y protección en los ojos durante la manipulación de las muestras y reactivos del ensayo. - Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa vigente.
La inactivación por calor puede afectar el resultado. No utilizar muestras con contaminación microbiana. Si las muestras deben ser transportadas, embalarlas de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envío de material infeccioso.
PREPARACION DE LOS REACTIVOS Es importante que todo el material utilizado para la preparación de los reactivos esté limpio y libre de detergente e hipoclorito. Buffer de Lavado: a baja temperatura los componentes del reactivo concentrado pueden precipitar. En tal caso, llevar la solución a 37oC hasta disolución completa. Para la obtención del buffer de lavado listo para usar, diluir una parte de Buffer de Lavado Concentrado (25x) con 24 partes de agua destilada o desionizada. Ej.: 20 ml con 480 ml para una policubeta. Policubeta sensibilizada, Conjugado, Revelador, Stopper, Control Positivo y Control Negativo: listos para usar.
PROCEDIMIENTO 1- Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. 2- Preparar el volumen necesario de buffer de lavado diluido. 3- Colocar en el soporte de tiras, el número de pocillos requeridos para la cantidad de determinaciones a realizar, incluyendo 2 pocillos para el Control Positivo (CP) y 3 para el Control Negativo (CN). 4- Dispensar la Muestra (M) y los controles según el siguiente esquema:
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. Buffer de Lavado Concentrado y Stopper: se pueden conservar a una temperatura entre 2 y 25oC. Buffer de lavado (1x): una vez diluido es estable 3 meses a temperatura entre 2 y 25oC. Policubeta sensibilizada: no abrir el sobre hasta el momento de usar, ni antes que haya tomado temperatura ambiente, de lo contrario se favorecerá la condensación de humedad sobre la superficie de los pocillos. Las tiras no utilizadas deben conservarse entre 2-10oC dentro del sobre con desecante bien cerrado. Las tiras conservadas en estas condiciones pueden ser utilizadas dentro de los 4 meses posteriores mientras no supere la fecha de vencimiento indicada en la caja. MUESTRA Suero o plasma a) Recolección: obtener la muestra de la manera habitual. b) Aditivos: no se requieren para suero. Para las muestras de plasma se puede emplear heparina, citrato o EDTA como anticoagulante. c) Sustancias Interferentes conocidas: no se observan interferencias por bilirrubina hasta 30 mg/dl, ácido ascórbico hasta 50 mg/dl, triglicéridos hasta 1500 mg/dl o hemoglobina hasta 270 mg/dl. Muestras conteniendo partículas deberán clarificarse mediante centrifugación. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra se debe conservar refrigerada (2-10oC). En caso de no realizar el análisis dentro de las 72 horas se debe congelar a -20oC. No se recomienda realizar múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento. Esto puede generar resultados erróneos. En caso de utilizar muestras congeladas, éstas deben ser homogeneizadas y centrifugadas antes de su uso.
M
CP
CN
Control Positivo
-
50 ul
-
Control Negativo
-
-
50 ul
50 ul
-
-
Muestra
5- Para evitar la evaporación, cubrir la placa con la cinta autoadhesiva provista, e incubar 30 ± 2 minutos a 37oC ± 1oC. 6- Después de la incubación eliminar el líquido de cada pocillo por completo. Lavar 5 veces según instrucción de lavado (ver Procedimiento de Lavado). 7- Agregar el Conjugado: Conjugado
100 ul
100 ul
100 ul
8- Para evitar la evaporación cubrir la policubeta con cinta autoadhesiva. Incubar 30 ± 2 minutos a 37oC ± 1oC. 9- Lavar 5 veces según instrucción de lavado. 10- Dispensar el Revelador trasvasando a un recipiente limpio solamente el volumen necesario. No devolver el Revelador restante al frasco original. Evitar el contacto del reactivo con agentes oxidantes. Revelador
100 ul
100 ul
100 ul
11- Incubar 30 ± 2 minutos a temperatura ambiente (1825oC), protegido de la luz. 12- Agregar el Stopper: Stopper
100 ul
100 ul
100 ul
13- Leer absorbancia en espectrofotómetro en forma bicromática a 450/620-650 nm o a 450 nm. Nota: se recomienda realizar siempre la lectura en forma bicromática. En caso de que la lectura sea monocromática, realizar un blanco de reactivos que luego deberá ser restado de todos los valores de las muestras.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reacción es estable durante 10 minutos, por lo que los resultados deben leerse dentro de ese lapso.
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PROCEDIMIENTO DE LAVADO Eliminar el líquido de los pocillos por aspirado o volcado. Los pocillos se lavan con 350 ul de buffer de lavado diluido. Asegurar que la altura alcanzada al llenar los pocillos no cause desbordes. La solución de lavado debe estar en contacto con los pocillos entre 30 y 60 segundos. Garantizar que luego del último lavado no quede líquido residual. Realice un doble aspirado para eliminar el excedente de buffer. Si persiste luego de este procedimiento, invertir la placa sobre papel absorbente y golpearla varias
veces, de lo contrario podrán obtenerse resultados erróneos. Nota: el procedimiento de lavado es crítico para el resultado del ensayo. Si queda buffer de lavado en el pocillo o si los pocillos no están completamente llenos se obtendrán resultados erróneos. No dejar que los pocillos se sequen durante el procedimiento. Los lavadores automáticos deben ser enjuagados con agua destilada o desionizada al final del día para evitar obstrucciones debido a las sales presentes en el buffer de lavado.
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO ETAPA
PROCEDIMIENTO
PRECAUCIONES/OBSERVACIONES
Dilución
Preparación de la solución de lavado (1x)
Disolución de los cristales de sales
Muestras
Agregar 50 ul de M, CP e CN
Incubación
Cubrir los pocillos e incubar durante 30 ± 2 mi- En estufa nutos a 37 ± 1oC
Lavado
Lavar cada pocillo con 350 ul de buffer de lavado (5 veces)
Conjugado
Agregar 100 ul de Conjugado
Incubación
Cubrir los pocillos e incubar durante 30 ± 2 mi- En estufa nutos a 37 ± 1oC
Tiempo de contacto de la solución de lavado de 30 e 60 segundos. Eliminar completamente el líquido residual de los pocillos
Lavado
Idem al lavado anterior
Revelado
Agregar 100 ul de Revelador
Trasvasar el volumen necesario de Revelador a usar. No pipetear del frasco original. Descartar el reactivo remanente. Evitar el contacto com agentes oxidantes.
Incubación
Durante 30 ± 2 minutos entre 18-25oC
Mantener la policubeta protegida de la luz
Detención
Agregar 100 ul de Stopper
Lectura
Leer en espectrofotómetro
Leer dentro de los 10 minutos
CRITERIOS DE VALIDACION DEL ENSAYO El ensayo se considera válido si se cumplen simultáneamente las siguientes condiciones: 1. El promedio de las densidades ópticas (D.O.) de los Controles Negativos deben ser ≤ 0,050. Ejemplo: Lectura 1 = 0,015, Lectura 2 = 0,018, Lectura 3 = 0,021 Promedio = (0,015+0,018+0,021) / 3= 0,018 2. Eliminar cualquier Control Negativo con D.O. > 0,050. 3. Si se ha eliminado algún Control Negativo, volver a calcular el promedio de los Controles Negativos. Un ensayo es válido si se aceptan al menos dos de los Controles Negativos. 4. El promedio de las D.O. de los Controles Positivos debe ser ≥ 1,200. Ejemplo: Lectura 1 = 1,658, Lectura 2 = 1,721 Promedio = (1,658+1,721) / 2 = 1,689
5. La diferencia entre el promedio de las D.O. de los Controles Positivos y Controles Negativos debe ser ≥ 1,100. Si una de estas condiciones no se cumple, repetir el ensayo. Recordar que las lecturas obtenidas dependerán de la sensibilidad del aparato empleado. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS a) Con instrumental óptico: La presencia o ausencia de anticuerpos anti-HIV-1 o HIV-2 se determina relacionando la absorbancia de la muestra respecto al valor del Cut-off. Cut-off = CN + 0,250 CN: promedio de las D.O. del Control Negativo Ejemplo: 0,018 + 0,250 = 0,268 Muestras No Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias menores al Cut-off Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias mayores o iguales al Cut-off.
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b) Interpretación visual: Si se opta por este tipo de interpretación, debe considerarse No Reactiva toda muestra que no presente una coloración mayor que la de los Controles Negativos. Por el contrario, una muestra netamente amarilla se considera Reactiva. Toda muestra inicialmente reactiva debe ser repetida por duplicado. Si una o ambas repeticiones dan positivas, la misma debe considerarse reactiva. Una muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva en las dos repeticiones. Esto puede deberse a: - Contaminación cruzada de un pocillo no reactivo por una muestra reactiva. - Contaminación de la muestra durante la dispensación, imprecisión en el dispensado de muestra, conjugado y/o Revelador en el pocillo - Reutilización de tips. - Contaminación del pocillo con hipoclorito u otros agentes oxidantes. En ciertos casos una muestra no reactiva puede presentar una reacción falsamente reactiva, tanto en el análisis inicial como en sus repeticiones. Algunas causas de este fenómeno pueden ser: - Contaminación de la muestra durante la extracción, procesamiento o conservación. - Presencia de sustancias interferentes, tales como autoanticuerpos, fármacos, etc. - Dispensación y/o aspirado ineficiente de la solución de lavado (sistema obstruido). LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Ver Sustancias Interferentes conocidas en Muestra. - No se debe utilizar pool de muestras. - No se deben utilizar otros fluidos corporales como la saliva, líquido cefalorraquídeo u orina. - Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposición o infección por HIV-1 o HIV-2. Los resultados repetidamente reactivos deben corroborarse por un método confirmatorio, de acuerdo a la normativa legal vigente. - No utilizar muestras inactivadas por calor ya que pueden ocasionar resultados falsos positivos. CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE PERFORMANCE Sensibilidad clínica a) Sensibilidad clínica con paneles de seroconversión (BBI, Boston Biomedica Inc)
Nombre del panel
Días desde la recolección de la muestra
Tiempo (días) en que la muestra se torna reactiva HIV 1+2 ELISAHIV ELISA 3ª 3ª Gen. Gen. (BBI)
W. Blot (BBI)
PRB 904-D
0, 21, 49, 92, 99
92
92
PRB 912-L
0, 9, 14, 16, 28, 30
0
0
92 9
PRB 916-P
0, 4, 9, 18, 30, 35
30
30
30
PRB 919-S
0, 9, 11
9
9
9
PRB 924-X
0, 2, 8, 10, 26, 33, 35, 40
33
33
35 (Indet)
PRB 925-Y
0, 10, 18, 22, 44, 49
44
44
44 (Indet)
PRB 930-AE
0, 3, 7, 10
7
7
10 (Indet)
PRB 934 AI
0, 7, 11
7
7
ND
PRB 944-AT
0, 2, 7, 9, 14, 16
14
14
14 (Indet)
PRB 945 AU
0, 3, 13, 15, 20
15
13
20
PRB 947-AW
0, 9, 11, 20
9
9
20
PRB 949-AY
0, 6, 9, 18, 20
20
20
20 (Indet)
PRB 951-BE
0, 2, 8, 11, 15, 19
19
19
No reactivo
PRB 952-BB
0, 7, 10, 14, 17, 21
17
14
17
PRB 953-BC PRB 966
0, 3, 7, 10
10
7
No reactivo
0, 2, 20, 22, 30, 35, 37, 44, 48, 51
48
48
No reactivo
Indet: indeterminadas
b) Sensibilidad clínica en Paneles de Performance En un estudio realizado sobre diferentes paneles comerciales internacionales, se obtuvieron los siguientes resultados: -PRZ 207 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel): se detectaron 14 de las 14 muestras reactivas. -PRZ 206 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel) se detectan 11 de las 12 muestras reactivas. c) Sensibilidad en paneles de muestras reactivas anti-HIV En un estudio realizado sobre 123 muestras de pacientes con infección por HIV-1 confirmados por diferentes métodos, se encontraron reactivas la totalidad de las muestras con el kit HIV 1+2 ELISA 3ª Generación. b) Especificidad En un estudio realizado sobre 3004 muestras de sueros y plasmas de cinco centros de salud diferentes, se encontraron 33 muestras reactivas de las cuales 28 fueron confirmadas por otros métodos, obteniéndose una especificidad del 99,83% Se estudio la posible aparición de reactividad cruzada en 272 muestras provenientes de individuos con diferentes condiciones clínicas que podrían ser causantes de reacciones inespecíficas en el ensayo HIV 1+2 ELISA 3ª Generación. Este grupo incluye muestras: - con anticuerpos contra HAV, HBV, EBV, CMV, HSV, VZV, HCV, HTLV y otros virus - con anticuerpos contra Treponema pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Toxoplasma gondii, Toxocara canis, Trypanosoma cruzi y otros microorganismos. - con diferentes autoanticuerpos (AGA, AMA, ATA, FAN, factor reumatoideo y otros) La especificidad en esta población fue de 97,42%. En otro estudio sobre 91 plasmas de mujeres embarazadas se observó una especificidad del 98,9%. c) Precisión Se evaluó la precisión del test siguiendo el protocolo EP5A recomendado por la NCCLS. Los ensayos fueron realizados con muestras de diferentes niveles de reactividad y con
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los controles. Se realizaron 2 ensayos diarios evaluando cada muestra por duplicado por el transcurso de 20 días. Muestra M1 M2 C (+) C (-)
Media (D.O.) 0,354 0,790 1,273 0,014
Intra-ensayo D.S. 0,026 0,073 0,056 0,002
C.V. 7,34% 9,24% 4,40% 15,22%
Inter-ensayo D.S. 0,037 0,107 0,096 0,003
C.V. 10,45% 13,54% 7,54% 23,19%
EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS Policubeta
Sensib.
Policubeta sensibilizada
Buf. Lavado
Conjugado Conjugado
Conc.
Buffer de Lavado Concentrado Control
+
Control Positivo
Revelador Revelador
Control
-
Control Negativo
Stopper
n= 80
Stopper
PRESENTACION - 96 determinaciones (Cód. 1723096) - 192 determinaciones (Cód. 1723192)
Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
BIBLIOGRAFIA - Gallo, RC - Retrovirology 3:72, 2006. - Fauci, AS - Nature Medicine 9/7:839-843, 2003. - Fiebig, EW et al. - AIDS 17 /13:1871-1879, 2003. - WHO - HIV Testing, Treatment and Prevention. Generic tools for operational research, 2009. - WHO - AIDS Epidemic update, 2009. - Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A 19/2 (1999) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Specifications for Immunological Testing for Infectious Diseases. Approved Guideline I/LA18-A2 (1994) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Clinical Evaluation of Immunoassays. Approved Guideline I/LA21-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Interference testing in Clinical Chemistry. Approved Guideline EP7-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory Standards.
C
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
V
Uso diagnóstico "in vitro"
X
Contenido suficiente para ensayos
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
G
No congelar
F
Riesgo biológico
P Representante autorizado en la Comunidad Europea
Volumen después de la reconstitución Cont.
Contenido
g
Número de lote
M
Elaborado por:
Xn
Nocivo Corrosivo / Caústico
Xi
i Calibr.
b b c h
Irritante Consultar instrucciones de uso Calibrador Control Control Positivo Control Negativo Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº 6696/11
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HBsAg ELISA Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg)
SIGNIFICACION CLINICA La hepatitis B es una enfermedad viral del hígado causada por el virus de la hepatitis B (HBV). Puede cursar en forma asintomática, o como un proceso agudo o crónico. En los casos más graves puede derivar en cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular primario. Se transmite principalmente por contacto parenteral, percutáneo, o sexual. También se ha observado transmisión perinatal y horizontal. El HBV está constituido por una nucleocápside que contiene el ADN asociado a proteínas core y una envoltura cuyo principal componente es una proteína conocida como antígeno de superficie (HBsAg). El HBsAg generalmente aparece 6 semanas después de la exposición al HBV y persiste durante 4-14 semanas. Está presente durante el periodo de incubación, antes de la aparición de la enfermedad clínica y puede ser detectado en sangre 2 a 8 semanas antes de la aparición de ictericia o de evidencias bioquímicas de disfunción hepática. Así, el HBsAg es un primer indicador de infección por el HBV. La hepatitis B crónica se define como la presencia del HBsAg en sangre durante más de 6 meses. La detección del HBsAg es importante para el diagnóstico de las hepatitis agudas y crónicas, el control de portadores en bancos de sangre y unidades de diálisis, de transplantados y gestantes y para el control de preparados de sangre y derivados destinados a transfusiones. FUNDAMENTOS DEL METODO HBsAg ELISA es un método inmunoenzimático directo tipo sandwich. Los pocillos de la policubeta están recubiertos con anticuerpo de cobayo anti-HBs (anti-HBsAg) que actúa como anticuerpo de captura. La muestra se incuba en uno de los pocillos. Si la misma contiene HBsAg, éste formará un complejo con el anticuerpo unido a la placa. El material no unido se elimina por lavado. En el siguiente paso se agrega el anticuerpo de cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa, que se unirá con los complejos anticuerpo-antígeno formados previamente. El conjugado no unido se remueve por lavado. Posteriormente se agrega una solución conteniendo tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno. En los casos en que el HBsAg esté presente en la muestra, se desarrolla color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con ácido sulfúrico. REACTIVOS PROVISTOS Policubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles con 96 pocillos recubiertos con anticuerpo de cobayo anti-HBs. Conjugado Concentrado: anticuerpo de cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa (51x). Color rojo.
Diluyente de Conjugado: buffer tris conteniendo proteínas y conservantes. TMB: solución de tetrametilbencidina (TMB) 36 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) (100x). Diluyente de TMB: buffer citrato 40 mM y peróxido de hidrógeno 1,27 mM, pH 4,3. Stopper: ácido sulfúrico 2 N. Buffer de Lavado Concentrado: buffer salino con tensioactivo (25x). Color verde. Control Positivo: suero que contiene HBsAg inactivado y conservantes. Color naranja. Control Negativo: suero con conservantes. Color amarillo. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada o desionizada MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Micropipetas para medir los volúmenes indicados - Tips descartables - Material volumétrico para preparar las diluciones indicadas - Estufa a 37oC - Papel absorbente - Guantes descartables - Reloj alarma o cronómetro - Hipoclorito de sodio - Sistema de lavado de policubetas (manual o automático) - Espectrofotómetro para lectura de policubetas PRECAUCIONES - Los reactivos son para uso diagnóstico “in vitro”. - Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infección. - Los sueros controles han sido examinados para anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) y hepatitis C (HCV), encontrándose no reactivos. Sin embargo, se recomienda manipularlos con las precauciones requeridas para muestras potencialmente infecciosas. - A fin de asegurar la inactivación de agentes patógenos, los materiales que han sido empleados en el ensayo deben descontaminarse antes de ser descartados. El método recomendado para este procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los líquidos de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concentración final 5%) durante un mínimo de 60 minutos. - Evitar que los vapores de hipoclorito provenientes de los recipientes para desechos biológicos u otras fuentes entren en contacto con los reactivos, ya que el hipoclorito afecta la reacción. - Evitar el derrame de líquidos y formación de aerosoles.
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- No usar los reactivos luego de la fecha de vencimiento. - No intercambiar reactivos de distintos lotes, o modificar los procedimientos del ensayo. - No emplear reactivos de otro origen. - Evitar tocar las paredes de los pocillos con los tips. - No utilizar elementos metálicos que puedan entrar en contacto con los reactivos. - Las policubetas deben incubarse en estufa. Debe evitarse abrir la estufa durante este proceso. No usar baño de agua. - Evitar el contacto del ácido sulfúrico (Stopper) y DMSO (TMB) con piel, mucosas y ojos. Si esto ocurre, enjuagar con abundante agua. R36/38: irrita los ojos y la piel. R34: provoca quemaduras. S24/25: evítese el contacto con los ojos y la piel. S26: en caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. S28: en caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua. S37/39: usar guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. - No pipetear con la boca. Usar guantes descartables y protección en los ojos durante la manipulación de las muestras y reactivos del ensayo. - La TMB es sensible a la luz. Mantenga el frasco cerrado cuando no se utiliza. - Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa vigente. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Buffer de Lavado: a baja temperatura los componentes del reactivo concentrado pueden precipitar. En tal caso, llevar la solución a 37ºC hasta disolución completa. Para la obtención del buffer de lavado listo para usar (1x), diluir una parte de Buffer de Lavado Concentrado (25x) con 24 partes de agua destilada o desionizada. Ej.: 20 ml con 480 ml para una policubeta. Conjugado: para la obtención del conjugado listo para usar (1x), diluir 1 parte de Conjugado Concentrado + 50 partes de Diluyente de Conjugado según tabla siguiente: Nº de pocillos
Conjugado Concentrado
Diluyente de Conjugado
8 16 24 32 96
20 ul 40 ul 60 ul 80 ul 240 ul
1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 12 ml
Revelador: para la obtención del revelador listo para usar (1x), diluir 1 parte de TMB (100x) + 100 partes de Diluyente de TMB (ver tabla siguiente). La TMB concentrada está disuelta en DMSO. Dado que la temperatura de fusión del DMSO es 18oC, la TMB debe alcanzar temperatura ambiente (2025oC) y homogeneizarse bien antes de usar. Nº de pocillos
TMB
Diluyente de TMB
8 16 24 32 96
10 ul 20 ul 30 ul 40 ul 120 ul
1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 12 ml
Stopper, Control Positivo y Control Negativo: listos para usar. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. Buffer de Lavado Concentrado y Stopper: conservar a temperatura entre 2 y 25oC. Buffer de lavado (1x): conservar en recipiente cerrado. Es estable 3 meses a temperatura entre 2 y 25oC. Conjugado (1x): es estable 7 días a 2-10oC, y 6 horas a temperatura 20-25oC. Policubeta sensibilizada: abrir el envoltorio cuando haya tomado temperatura ambiente y no antes del momento de usar, de lo contrario se favorecerá la condensación de humedad sobre la superficie de los pocillos. Las tiras no utilizadas se deben conservar a 2-10oC dentro del sobre con desecante y cerrado. Las tiras conservadas en estas condiciones pueden ser utilizadas dentro de los 4 meses posteriores, mientras no se supere la fecha de vencimiento indicada en la caja. MUESTRA Suero o plasma a) Recolección de muestra: obtener de la manera habitual. b) Aditivos: no se requieren para suero. Puede usarse el suero obtenido en tubos con acelerador de la coagulación y gel separador. Para las muestras de plasma se puede emplear heparina, citrato o EDTA como anticoagulantes. c) Sustancias Interferentes conocidas: no se ha observado interferencia con muestras que contienen hasta 25 mg/dl de bilirrubina, 50 mg/dl de ácido ascórbico, 1200 mg/dl de triglicéridos o 300 mg/dl de hemoglobina. Muestras conteniendo partículas deberán clarificarse mediante centrifugación. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra puede conservarse refrigerada (2-10oC) hasta 3 días. Si se necesita conservarla por más tiempo, se debe congelar a -20oC (o inferior). No es recomendable realizar múltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento, ya que puede generar resultados erróneos. En caso de utilizar muestras congeladas, éstas deben ser homogeneizadas y centrifugadas antes de su uso. La inactivación por calor puede afectar el resultado. No utilizar muestras con contaminación microbiana. Si las muestras deben ser transportadas, deben embalarse de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envío de material infeccioso.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO 1- Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. 2- Preparar el volumen necesario de Buffer de Lavado (1x). 3- Colocar en el soporte de tiras, el número de pocillos requeridos para la cantidad de determinaciones a realizar, incluyendo 2 pocillos para el Control Positivo (CP) y 3 para el Control Negativo (CN).
861104205 / 01 p. 2/12
4- Dispensar la muestra (M) y los controles según el siguiente esquema: M
CP
Control Positivo
-
100 ul
-
Control Negativo
-
-
100 ul
100 ul
-
-
Muestra
CN
Se puede verificar la dispensación de controles o muestras a los pocillos visualmente, o mediante lectura espectrofotométrica (a 410/450 nm). 5- Para evitar la evaporación, cubrir la placa con las láminas adhesivas provistas, e incubar 60 ± 2 minutos a 37 ± 1oC. En forma paralela, preparar el Conjugado (ver Tabla en PREPARACION DE LOS REACTIVOS). 6- Después de la incubación eliminar por completo el líquido de cada pocillo. Lavar 5 veces según instrucción de lavado (ver Procedimiento de Lavado). 7- Agregar el Conjugado: Conjugado
100 ul
100 ul
100 ul
Para evitar la evaporación cubrir la policubeta con láminas adhesivas. 8- Incubar 30 ± 1 minutos a 37 ± 1oC. En forma paralela, preparar el Revelador (ver Tabla en PREPARACION DE LOS REACTIVOS). 9- Lavar 5 veces según instrucción de lavado. 10- Dispensar el Revelador. Revelador
100 ul
100 ul
100 ul
11- Incubar 30 ± 2 minutos a temperatura ambiente (1825oC), protegido de la luz. 12- Agregar el Stopper:
Stopper
100 ul
100 ul
100 ul
13- A los 5 minutos leer absorbancia en espectrofotómetro en forma bicromática a 450/620-650 nm, o monocromática a 450 nm. Nota: se recomienda realizar siempre la lectura en forma bicromática. En caso de que la lectura sea monocromática, realizar un blanco de reactivos que luego deberá ser restado de todos los valores de las muestras.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reacción es estable entre 5 y 30 minutos, por lo que los resultados deben leerse dentro de ese lapso. PROCEDIMIENTO DE LAVADO Eliminar el líquido de los pocillos por aspirado o volcado. Los pocillos se lavan con 350 ul de Buffer de Lavado. Asegurar que la altura alcanzada al llenar los pocillos no cause desbordes. La solución de lavado debe estar en contacto con los pocillos entre 30 y 60 segundos. En caso de hacer el lavado en forma automática, se aconseja realizar un doble aspirado al final de cada lavado. Garantizar que luego del último lavado no quede líquido residual. Para ello, realice un doble aspirado para eliminar el excedente de buffer. Si persiste luego de este procedimiento, invertir la placa sobre papel absorbente y golpearla varias veces, de lo contrario podrán obtenerse resultados erróneos. Nota: el procedimiento de lavado es muy crítico para el resultado del ensayo. Si queda buffer de lavado en el pocillo o los pocillos no están completamente llenos, se obtendrán resultados erróneos. No dejar que los pocillos se sequen durante el procedimiento. Los lavadores automáticos deben ser enjuagados con agua destilada o desionizada al final del día, para evitar obstrucciones o corrosiones debido a las sales presentes en el buffer de lavado.
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO ETAPA Dilución
PROCEDIMIENTO Preparación de la solución de lavado (1x)
PRECAUCIONES/OBSERVACIONES Disolución de los cristales de sales
Muestras
Agregar 100 ul de M, CP y CN
Incubación
Cubrir los pocillos e incubar durante 60 ± 2 minutos a 37 ± 1oC
En estufa
Lavado
Lavar cada pocillo con 350 ul de buffer de lavado (5 veces)
Tiempo de contacto de la solución de lavado entre 30 y 60 segundos. Eliminar completamente el líquido residual de los pocillos
Dilución
Preparación del Conjugado (1x)
Durante la incubación con la muestra, diluir el Conjugado Concentrado (51x)
Conjugado
Agregar 100 ul de Conjugado (1x)
Incubación
Cubrir los pocillos e incubar durante 30 ± 1 minuto a 37 ± 1oC
Lavado
Idem al lavado anterior
861104205 / 01 p. 3/12
En estufa
Dilución
Preparación del Revelador (1x)
Durante la incubación con el Conjugado, diluir la TMB (100x)
Revelado
Agregar 100 ul de Revelador
Evitar el contacto con agentes oxidantes. No exponer a la luz.
Incubación
Durante 30 ± 2 minutos entre 18-25oC
Mantener los pocillos protegidos de la luz
Detención
Agregar 100 ul de Stopper
Lectura
Leer en espectrofotómetro
Leer dentro de los 5 y 30 minutos
CRITERIOS DE VALIDACION DEL ENSAYO El ensayo se considera válido si se cumplen simultáneamente las siguientes condiciones: 1- El promedio de las absorbancias de los Controles Negativos debe ser menor o igual a 0,050. Ejemplo: Lectura 1 = 0,025, Lectura 2 = 0,028, Lectura 3 = 0,022 Promedio = (0,025 + 0,028 + 0,022) / 3= 0,025 2- Para el cálculo eliminar cualquier Control Negativo con absorbancia mayor a 0,050. 3- Si se ha eliminado algún Control Negativo, calcular nuevamente el promedio de los Controles Negativos. Un ensayo es válido si se aceptan al menos dos de los Controles Negativos. 4- El promedio de las absorbancias de los Controles Positivos debe ser mayor a 1,000. Ejemplo: Lectura 1 = 1,504, Lectura 2 = 1,496 Promedio = (1,504 + 1,496) / 2= 1,500 5- La diferencia entre el promedio de las absorbancias de los Controles Positivos y Controles Negativos debe ser mayor o igual a 0,950. Si una de estas condiciones no se cumple, repetir el ensayo. Recordar que las lecturas obtenidas dependerán de la sensibilidad del aparato empleado. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La presencia o ausencia de antígeno HBsAg se determina relacionando la absorbancia de la muestra respecto al valor del Cut-off. Cut-off = CN + 0,060 CN: promedio de las absorbancias del Control Negativo Ejemplo: 0,025 + 0,060 = 0,085 Muestras No Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias menores al Cut-off. Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias mayores o iguales al Cut-off. Toda muestra inicialmente reactiva debe ser repetida por duplicado. Si una o ambas repeticiones dan reactivas, la misma debe considerarse reactiva. Una muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva en las dos repeticiones. Esto puede deberse a: - Contaminación cruzada de un pocillo no reactivo por una muestra reactiva.
- Contaminación de la muestra durante la dispensación, imprecisión en el dispensado de muestra, conjugado y/o revelador en el pocillo. - Reutilización de tips. - Contaminación del pocillo con hipoclorito u otros agentes oxidantes. En ciertos casos una muestra no reactiva puede presentar una reacción falsamente reactiva, tanto en el análisis inicial como en sus repeticiones. Algunas causas de este fenómeno pueden ser: - Contaminación de la muestra durante la extracción, procesamiento o conservación. - Presencia de sustancias interferentes, tales como autoanticuerpos, fármacos, etc. - Dispensación y/o aspirado ineficiente de la solución de lavado (sistema obstruido). LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias Interferentes conocidas en Muestra. No se debe utilizar pool de sueros o plasmas. No se deben emplear otros fluidos corporales como la saliva, líquido cefalorraquídeo u orina. Un resultado no reactivo no excluye la posibilidad de infección por HBV ya que el antígeno puede encontrarse a una concentración inferior a los límites de detección. Si una muestra es repetidamente reactiva deberán realizarse pruebas de confirmación, y otros marcadores serológicos de la hepatitis B, para confirmar la infección por el HBV. CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE PERFORMANCE Sensibilidad clínica En un estudio realizado con 122 muestras con infección por HBsAg, confirmada por diferentes métodos, se encontraron repetidamente reactivas con el kit HBsAg ELISA la totalidad de las muestras. Sensibilidad en Paneles de Performance Se evaluaron diferentes paneles comerciales internacionales obteniéndose los siguientes resultados: Panel PHA105 PHA106M PHA204 PHA205 PHA206
861104205 / 01 p. 4/12
Muestras reactivas
Muestras detectadas
14 12 23 23 23
13 11 22 23 20
PHA105, y PHA106M (HBsAg Low Titer Performance Panels, BBI, USA). PHA204, PHA205, y PHA206 (HBsAg Mixed Titer Performance Panels, BBI, USA). Sensibilidad en Paneles de Seroconversión Se evaluaron los siguientes paneles comerciales internacionales de seroconversión de BBI (USA): Panel PHM917 PHM920 PHM927 PHM928 PHM930 PHM933M PHM934
Nº de muestras
HBsAg ELISA*
Subtipo
3 6 6 7 5 5 6
1 (43) 4 (26) 4 (7) 3 (14) 4 (3) 4 (7) 5 (3)
indet. ad indet. ad ad ad ad
*Se indica el número de muestras reactivas con el ELISA. El número entre paréntesis indica el número de días entre el sangrado inicial y la primera muestra reactiva. Sensibilidad analítica (Límite de detección inferior) Ha sido calculada con las siguientes preparaciones internacionales: - Second International Standard for HBsAg, subtype adw2, genotype A. NIBSC código 00/588: Diluido en suero humano negativo para HBsAg y anti-HBs, se detectó hasta 0,10 UI/ml. - Estándares para HBsAg subtipos ad y ay provistos por el Paul Erlich Institute (a partir de preparaciones de 100 U/ml y 50000 U/ml, respectivamente): Diluidos en suero bovino se detectó hasta la dilución 0,063 U/ml del subtipo ad y hasta la dilución 0,12 U/ml del subtipo ay. - Hepatitis B Surface Antigen Sensitivity Panel PHA808, BBI, USA: Se detectaron las muestras 1-8 (hasta 0,06 UI/ml del subtipo ad), y 11-17 (hasta 0,09 UI/ml del subtipo ay). Especificidad En un estudio realizado sobre 685 muestras de sueros y plasmas de pacientes de consultorios externos, la especificidad obtenida fue de 100 % (IC95%: 99,93-100). En un estudio realizado sobre 1134 muestras de sueros de banco de sangre, la especificidad obtenida fue de 99,82 % (IC95%: 99,54-100). En otro estudio de 1256 muestras de plasmas de dos centros de salud, se encontró una especificidad de 99,68 % (IC95%: 99,33-100). Se estudió la posible aparición de reactividad cruzada ensayando 364 muestras provenientes de individuos con diferentes condiciones clínicas que podrían ser causantes de reacciones inespecíficas para el ensayo HBsAg ELISA. Este grupo incluía muestras: - con anticuerpos contra HCV, EBV, CMV, HIV, HTLV y otros virus. - con diferentes autoanticuerpos (AGA, AMA, ATA, ACA, TPO, y otros).
- con anticuerpos contra Treponema pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Trypanosoma cruzi, y otros microorganismos. - de pacientes hemodializados y mujeres embarazadas. La especificidad obtenida para esta población fue de 99,73 % (IC95%: 99,05-100). Precisión Se evaluó la precisión de la prueba siguiendo el protocolo EP5-A recomendado por la NCCLS. Los ensayos fueron realizados con muestras de diferentes niveles de reactividad en el HBsAg ELISA y con los controles. Se realizaron 2 ensayos diarios evaluando cada muestra por duplicado y por el transcurso de 20 días.
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Control (+) Control (-)
Intra-ensayo
Total
Media de abs.
D.S.
C.V.
D.S.
C.V.
0,277 0,930 1,171 1,880 0,026
0,012 0,031 0,050 0,068 0,002
4,44% 3,32% 4,30% 3,62% 8,53%
0,032 0,113 0,117 0,146 0,004
11,44% 12,11% 10,02% 7,79% 16,83%
DS: desviación estándar, CV: coeficiente de variación n= 80 PRESENTACION Equipo para 96 determinaciones (Cód. 1483254). Equipo para 192 determinaciones (Cód. 1483260). BIBLIOGRAFIA - Barbara J. (1993) Vox sanguinis 65, 249-250. - Comanor L. (2006) Vox sanguinis 91, 1-12. - Engvall E. (1980) Methods in Enzymology 70, 419-439. - Gerlich WH (2007) Journal of Viral Hepatitis 14(I), 16-21. - Previsani N, Lavanchy D y Zuckerman A. Hepatitis B (2004) Viral. Hepatitis. In: Mushawar IK, editors. Perspectives in Medical. Virology, vol. 10. - Diagnostic problems caused by HBsAg mutants- A consensus report of an expert meeting (2004) Intervirology 47, 310-313. - WHO Working Group on International Reference Preparations for Testing Diagnostic Kits used in the Detection of HBsAg and anti-HCV Antibodies. Switzerland 2003. - Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A 19/2 (1999) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Specifications for Immunological Testing for Infectious Diseases. Approved Guideline I/LA18-A2 (1994) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Clinical Evaluation of Immunoassays. Approved Guideline I/ LA21-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Interference testing in Clinical Chemistry. Approved Guideline EP7-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory Standards.
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EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS Policubeta
Sensib.
Policubeta sensibilizada Conjugado
Conc.
Conjugado Concentrado TMB
Diluy.
Conjugado
Diluy.
Diluyente de Conjugado Buf. Lavado
TMB Control
TMB
Diluyente de TMB
Conc.
Buffer de Lavado Concentrado +
Control Positivo
Control
-
Control Negativo
Stopper Stopper
Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
V
Uso diagnóstico "in vitro"
X
Contenido suficiente para ensayos
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
G
No congelar
F
Riesgo biológico
P Representante autorizado en la Comunidad Europea
Volumen después de la reconstitución Cont.
Contenido
g
Número de lote
M
Elaborado por:
Xn
Nocivo Corrosivo / Caústico
Xi
i Calibr.
b b c h
Irritante Consultar instrucciones de uso Calibrador Control Control Positivo Control Negativo Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº 7791/11
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Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina UR130321
RPR slide test
C
Prueba no-treponémica para la detección serológica de sífilis
SIGNIFICACION CLINICA La sífilis es una enfermedad venérea causada por el Treponema pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel en áreas de abrasiones. El contacto sexual es la forma más común de transmisión. La detección y tratamiento de la enfermedad en sus estadios tempranos es fundamental a fin de evitar complicaciones graves como sífilis cardiovascular, neurosífilis y sífilis congénita. El diagnóstico de esta enfermedad sufre la carencia de un método para cultivar el microorganismo en medios de laboratorio y la dificultad para detectarlo en estadios de la enfermedad en los que no se observan lesiones epidérmicas. Sin embargo, desde el comienzo de la infección aparecen en el suero del individuo infectado ciertas sustancias denominadas "reaginas", que reaccionan con antígenos de cardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a los signos clínicos son por lo tanto los procedimientos más rápidos y útiles disponibles para diagnóstico de sífilis. FUNDAMENTOS DEL METODO En la prueba rápida para reaginas plasmáticas (RPR), las "reaginas" presentes en el suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan por acción de las mismas con antígeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre partículas de carbón. La reacción produce una aglutinación visible macroscópicamente, favorecida por las partículas de carbón. Las reacciones inespecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina, por lo que no es necesario inactivar la muestra. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: suspensión de antígeno de cardiolipina 0,003%, lecitina 0,02% y colesterol 0,09%, adsorbido sobre partículas de carbón 0,02% especialmente tratado en buffer fosfatos 0,01 mol/l con cloruro de colina 0,72 mol/l, EDTA 12,5 mmol/l y conservantes apropiados. Control Positivo: dilución de suero reactivo. Control Negativo: dilución de suero no reactivo. REACTIVOS NO PROVISTOS Si se desea realizar la técnica semicuantitativa se requiere adicionalmente solución fisiológica (ClNa 9 g/l). ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.
INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A: listo para usar. Agitar antes de usar. Para dispensar este reactivo utilizar el gotero metálico provisto o bien colocar 17 ul medidos con micropipeta. Controles Positivo y Negativo: listos para usar. PRECAUCIONES Los Reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Los Controles Positivo y Negativo han sido examinados para antígeno de superficie del virus de hepatitis B y anticuerpos contra HCV y HIV 1/2, encontrándose no reactivos. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química clínica. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - Tarjetas de reacción - Gotero metálico para dispensar el Reactivo - Goteros plásticos descartables para dispensar y distribuir las muestras 2- No Provisto - Agitador rotativo de 100 rpm MUESTRA Suero o plasma a) Recolección: obtener la muestra de la manera usual. No es necesario inactivar. b) Aditivos: en caso de obtener plasma, utilizar heparina, EDTA, fluoruro u oxalato de sodio como anticoagulantes. c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis o hiperlipemia pueden provocar resultados erróneos, así como el exceso de anticoagulante empleado en la obtención de plasma. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: si no se procesa en el momento, el suero puede conservarse hasta 7 días en refrigerador (2-10oC). El plasma debe emplearse antes de las 24 horas de efectuada la extracción.
PROCEDIMIENTO I- PRUEBA CUALITATIVA Llevar a temperatura ambiente los reactivos y la muestra antes de realizar el ensayo. En cada uno de los círculos de la tarjeta de reacción colocar con un gotero plástico provisto:
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Muestra o Controles
1 gota (50 ul)
Con el extremo cerrado del gotero distribuir la muestra uniformemente en todo el círculo. Con el gotero metálico provisto, en posición vertical, agregar en el centro del círculo: Reactivo A
1 gota (17 ul)
SIN MEZCLAR, hacer rotar horizontalmente la tarjeta de reacción en forma manual o con agitador rotativo a 100 rpm durante 8 minutos. Observar la presencia o ausencia de aglutinación al cabo de este tiempo. Tiempos de lectura mayores pueden dar lugar a falsos resultados. II- PRUEBA SEMICUANTITATIVA Efectuar diluciones seriadas 1:2, 1:4, 1:8, hasta 1:64 empleando solución fisiológica y proceder de la misma manera que en la técnica cualitativa. El título estará dado por la inversa de la última dilución que se observe reactiva.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Reactivo: presencia de aglutinación visible en forma de grumos negros sobre el fondo claro que indica presencia de "reaginas" en la muestra. No reactivo: aspecto gris homogéneo que indica ausencia de "reaginas" en la muestra.
do se presenta el fenómeno de prozona. Por este motivo se recomienda repetir la prueba con muestra diluida al 1:5 con solución fisiológica para verificar el resultado. Si en estas condiciones se observa aglutinación, la muestra es reactiva. - No obstante las ventajas del método, sus resultados, al igual que los de cualquier método serológico, sólo constituyen un dato auxiliar para el diagnóstico que debe corroborarse con la historia clínica del paciente. PERFORMANCE Los estudios estadísticos realizados indican que la sensibilidad y especificidad del método son similares a los correspondientes a la prueba USR (Unheated Serum Reagin). PRESENTACION Equipo para 250 determinaciones (Cód. 1853154). BIBLIOGRAFIA - Zinsser Microbiología, Joklik W., Willett H. y Amos D., 17o edición Editorial Médica Panamericana, 1983. - Manual of Tests for Syphilis, cap. 8 - American Public Health Association, Washington, D.C 20005, 1990. - McGrew, B.E. et al. - Am. J. Clin. Path. 50:52, 1968. - Stevens, R.W. and Stroebel, E. - Am. J. Clin. Path. 53:32, 1970.
METODO DE CONTROL DE CALIDAD Para controlar la calidad del sistema procesar un Control Positivo y un Control Negativo utilizándolos de la misma forma que la muestra. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - Evitar el contacto de los dedos con los círculos de la tarjeta de reacción, dado que el depósito de grasa en los mismos puede ocasionar una mala distribución de la muestra, produciendo resultados erróneos. Si la muestra no puede ser distribuida uniformemente en toda la superficie de prueba, se recomienda utilizar otro círculo de la tarjeta. - Una vez utilizado el gotero metálico para dispensar el Reactivo A, descartar el remanente y enjuagarlo con agua destilada. - El Reactivo A debe dispensarse manteniendo el gotero en posición vertical respecto de la tarjeta de reacción a fin de asegurar que el volumen de la gota sea el correcto. - A temperaturas elevadas o humedad ambiente baja se recomienda el uso de una cámara húmeda durante la rotación, para evitar que las muestras se sequen. - En individuos con cuadros patológicos diversos como hepatitis, influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma, tuberculosis, cáncer, diabetes y enfermedades autoinmunes, pueden obtenerse resultados falsos positivos. Estos casos se presentan con títulos bajos y una historia clínica que no coincide con las características de sífilis. - Pueden observarse resultados falsamente negativos cuan870860022 / 00 p. 2/9
Símbolos Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C P V X
Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
M
Elaborado por:
Xn
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Nocivo
Uso diagnóstico "in vitro" Corrosivo / Caústico
Contenido suficiente para ensayos Xi
Irritante
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)
G
No congelar
F
Calibr.
Riesgo biológico
Volumen después de la reconstitución
Cont.
g
i
Contenido
Número de lote
b b c h
Consultar instrucciones de uso
Calibrador
Control
Control Positivo
Control Negativo
Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. Nº: 41/92
870860022 / 00 p. 3/9
Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina UR120606
V.D.R.L. test Suspensión antigénica estabilizada para realizar la prueba VDRL modificada (USR) de detección de sífilis
SIGNIFICACION CLINICA La sífilis es una enfermedad venérea causada por el Treponema pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel en áreas de abrasiones. El contacto sexual es la forma más común de transmisión. La detección y tratamiento de la enfermedad en sus estadios tempranos es fundamental a fin de evitar complicaciones graves como sífilis cardiovascular, neurosífilis y sífilis congénita. El diagnóstico de esta enfermedad sufre la carencia de un método para cultivar el microorganismo en medios de laboratorio y la dificultad para detectarlo en estadios de la enfermedad en los que no se observan lesiones epidérmicas. Sin embargo, desde el comienzo de la infección aparecen en el suero del individuo infectado ciertas sustancias denominadas "reaginas", que reaccionan con antígenos de cardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a los signos clínicos son por lo tanto los procedimientos más rápidos y útiles disponibles para diagnóstico de sífilis. FUNDAMENTOS DEL METODO Las "reaginas", presentes en individuos infectados por T. pallidum se detectan en suero por la reacción con un antígeno cardiolipínico purificado y estabilizado. Si la muestra contiene reagina, ésta se unirá al antígeno produciendo una floculación visible en microscopio. Las reacciones inespecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina característica de la técnica USR (Unheated Serum Reagin) en la que no es necesario inactivar la muestra. REACTIVOS PROVISTOS Antígeno: suspensión acuosa de antígeno de cardiolipina y lecitina purificados, en buffer fosfatos con cloruro de colina y EDTA de acuerdo a las indicaciones de la O.M.S. REACTIVOS NO PROVISTOS - Solución fisiológica (para la prueba semicuantitativa). - Solución de cloruro de sodio 10 g/dl (para la técnica en líquido cefalorraquídeo). ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Antígeno: estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. INSTRUCCIONES PARA SU USO Antígeno: listo para usar. Agitar previo a la ejecución de la prueba.
PRECAUCIONES El Reactivo es para uso diagnóstico "in vitro". MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - 1 gotero 2- No Provisto - Agitador rotativo ajustable a 180 rpm. - Placa de vidrio transparente con sectores de 14 mm de diámetro cada uno. - Micropipetas para medir los volúmenes indicados. - Microscopio MUESTRA Suero, plasma o líquido cefalorraquídeo (LCR) a) Recolección: obtener de la manera usual. No inactivar. b) Aditivos: no se requieren para suero o LCR. Si la prueba se realiza con plasma, éste puede obtenerse empleando heparina, EDTA u oxalato de sodio como anticoagulantes. c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis o hiperlipemia pueden ocasionar resultados erróneos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: en caso de no procesarse de inmediato los sueros pueden conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). El plasma puede emplearse hasta 24 horas luego de la extracción.
PROCEDIMIENTO Tanto los reactivos como la muestra deben estar a temperatura ambiente antes de realizar la prueba. I- PRUEBA CUALITATIVA EN SUERO O PLASMA En cada uno de los sectores delimitados de la placa colocar: Muestra
50 ul
Con gotero provisto colocar: Antígeno
1 gota
Agitar horizontalmente la placa a 180 rpm durante 4 minutos. Observar inmediatamente en microscopio con poco aumento (60 a 100 X). II- PRUEBA SEMICUANTITATIVA EN SUERO O PLASMA Preparar diluciones de la muestra 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32 con solución fisiológica y realizar para cada dilución la prueba como se describe en I. 861237504 / 00 Pág. 1 de 4
III- PRUEBA CUALITATIVA PARA LCR Diluir el Antígeno 1:2 con solución de cloruro de sodio 10 g/dl. Emplear dentro de las 2 horas de preparación. En cada sector delimitado de la placa colocar: Muestra
50 ul
Con aguja calibre 6 agregar: Antígeno diluido
1 gota (10 ul)
BIBLIOGRAFIA - Zinsser Microbiología, Joklik W., Willett H. y Amos D., 17o edición Editorial Médica Panamericana, 1983. - Manual of Tests for Syphilis, cap. 8 - American Public Health Association, Washington, D.C 20005, 1990. - Podestá, D.; Svetaz. M.J.; Ricomi, R.; Capriotti, G.; Rojkín, L.; Lorenzo, L.; "Evaluación de tres reactivos para detección de sífilis" - VIII Congreso Argentino de Bioquímica, 54º Triduo Bioquímico Científico Anual 1990 - Revista A.B.A. 54/3, 1990.
Mezclar bien y agitar horizontalmente la placa durante 8 minutos a 180 rpm. Leer los resultados en microscopio con poco aumento (60 a 100 X).
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Reactivo: presencia de floculación. No reactivo: ausencia completa de floculación. Prueba semicuantitativa: el título estará dado por la inversa de la última dilución que se observe reactiva. Leer atentamente las LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Para controlar la calidad del sistema procesar un Control Positivo (suero seguramente reactivo) y un Control Negativo (suero seguramente no reactivo) utilizándolos de la misma forma que las muestras. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Resultados falsamente positivos pueden ser observados en individuos con cuadros patológicos diversos como hepatitis, influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma, tuberculosis, cáncer, diabetes y enfermedades autoinmunes. Estos casos no son muy comunes y generalmente presentan reacciones con títulos bajos y una historia clínica que no coincide con las características de sífilis. Es imprescindible por estos motivos ante toda prueba cualitativa reactiva realizar la prueba semicuantitativa. Resultados falsamente negativos pueden observarse cuando se presenta el fenómeno de prozona. Por este motivo se recomienda repetir la prueba en suero diluido 1:5 con solución fisiológica para verificar el resultado. Si en estas condiciones se observa floculación la muestra es reactiva. A pesar de las ventajas de este método, sus resultados al igual que los de cualquier prueba serológica, sólo constituyen un dato auxiliar de diagnóstico que debe corroborarse con la historia clínica del paciente. PERFORMANCE Sobre 2140 muestras de un servicio hospitalario, ensayadas usando V.D.R.L. test e inmunofluorescencia como método de referencia, se observó una concordancia superior al 96%. PRESENTACION Equipo para 250 determinaciones (Cód 1853151).
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Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud
OMS Anexo: Reactivos y su preparación
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Orden La relación de reactivos se ha dispuesto en orden alfabético. Por ejemplo: acético, ácido ......................................................... se encuentra en ................ …..A brillante, azul de cresilo.............................................. .... se encuentra en ..............B carbolfucsina.............................................. .... se encuentra en ..............................C bovina, albúmina .............................................. .... se encuentra en .................... .B fenicada, fucsina ................................................ .... se encuentra en ......................F potásico, hidróxido .............................................. se encuentra en ................……....P sódico, carbonato .............................................. .... se encuentra en ..................... S A cada reactivo se ha dado un número, que figura inmediatamente después del nombre (estos números también se encuentran junto a las descripciones de las técnicas). q.s.= cantidad necesaria para preparar un volumen dado Por ejemplo: cloruro sódico ................................. 8,5 g agua destilada ...................... q.s. 1 000 ml # q.s. en castellano sería “c.s.”, es similar a c.s.p. (cantidad suficiente para), Significado: Coloque 8,5 g de cloruro sódico en un matraz volumétrico o en una probeta. Agregue agua destilada suficiente (q.s.) para lograr un volumen total de 1 000 ml.
Fórmulas químicas Las fórmulas químicas de los compuestos empleados se indican, por lo general, inmediatamente después de los nombres: — sódico, cloruro (NaCl) — potásico, hidróxido (KOH) — sulfúrico, ácido (H2S04) etc. Esto puede ser útil para comparar la etiqueta del frasco correspondiente. Una solución acuosa es la que se prepara con un compuesto disuelto en agua. Nota: A modo de orientación se agrega el nombre tradicional y habitual en castellano, es decir, el mismo nombre del reactivo preparado pero sin el orden indicado antes. Esto es solamente para facilitar la lectura de corrido y la comprensión directa que realiza el lector, de esta manera, la persona entiende rápidamente el nombre del reactivo. Lo expuesto no debe contradecir el orden ya explicado, el cual debe seguirse. Lo explicado es a manera de ayuda. Por tanto, NO debe ser considerado para la etiquetación de los frascos. Por ej.: Acético, Ácido, 50 g/l (5%) solución de (Nº 1), en el orden establecido; usualmente sería “Solución de Ácido Acético al 5% (50 g/l)” Además, en la traducción del inglés al castellano, siguiendo el orden alfabético del inglés no sale tan fiel el orden alfabético en el castellano (A Z), por lo que debe seguirse el orden numérico dado a cada reactivo ya que este permanece inalterado. 1. Acético, Ácido, 50 g/l (5%) solución de (Nº 1) Ácido acético glacial (CH3COOH) 20 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Etiquetar el frasco con "ACÉTICO, ÁCIDO 5% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: El ácido acético glacial es altamente corrosivo. “Solución de Ácido Acético al 5% (50 g/l) (Nº 1)” 2. Acético, Ácido, 100 g/l (10%) solución de (Nº 2) Ácido acético glacial (CH3COOH) 20 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Etiquetar el frasco con "ACÉTICO, ÁCIDO 10% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: El ácido acético glacial es altamente corrosivo. “Solución de Ácido Acético al 10% (100 g/l) (Nº 2)” 3. Acético, Ácido, 500 g/l (50%) solución de (Nº 3) Ácido acético glacial (CH3COOH) 100 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Etiquetar el frasco con "ACÉTICO, ÁCIDO 50% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: El ácido acético glacial es altamente corrosivo. “Solución de Ácido Acético al 50% (500 g/l) (Nº 3)” 4. Acetona-etanol decolorante para la tinción de Gram (No. 4) Acetona 200 ml Etanol absoluto 475 ml Agua destilada 25 ml Mezclar la acetona, el etanol y el agua destilada y transferir a un frasco de vidrio limpio con tapón. Etiquetar el frasco con "ACETONA-ETANOL DECOLORANTE" y escriba la fecha.
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“Decolorante acetona-etanol para la tinción de Gram (Nº 4)” Nótese que aquí no va “q.s (c.s.p.)” porque la cantidad de agua destilada para agregar aquí (25 ml) es la requerida y se debe medir con pipeta graduada. 5. Ácido-etanol para Ziehl-Neelsen (Nº 5) Ácido clorhídrico (HCl), concentrado 3 ml Etanol (CH3CH2OH) , 95% 97 ml Etiquetar el frasco con "ACIDO-ETANOL PARA ZIEHL-NEELSEN" y escriba la fecha. Advertencia: El ácido clorhídrico es altamente corrosivo. 6. Ácido, reactivo (Nº 6) Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) 44ml Ácido ortofosfórico (H3PO4), 85% 66 ml Sulfato de Cadmio 1,6 g Tiosemicarbazida 50 mg Agua destilada q.s. (c.s.p.) 500 ml Llene la mitad de un frasco de 500 ml con agua destilada, añadir el ácido sulfúrico muy lentamente, revolviendo constantemente, y seguir con el ácido ortofosfórico (mezclando). Continuar mezclando la solución y añadir la tiosemicarbazida y luego el sulfato de cadmio. Completar el volumen a 500 ml con agua destilada. Transferir el reactivo a un frasco marrón oscuro. Consérvese en un frasco de vidrio oscuro. Etiquetar el frasco con "ÁCIDO, REACTIVO" y escriba la fecha. Almacenar a 2-8 ° C. El reactivo se mantendrá durante al menos 6 meses a 2-8 ° C. Advertencia: El ácido sulfúrico es sumamente corrosivo. “Reactivo Ácido (Nº 6)” 7. Albert, tinción (No. 7) Azul de toluidina 0,15 g Verde de malaquita 0,20 g Ácido acético glacial (CH3COOH) 1 ml Etanol (CH3CH2OH), 96% 2 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Disolver el ácido acético glacial en 30 ml de agua destilada en un frasco limpio de 100 ml. Agregue el azul de toluidina y el verde de malaquita y mezclar bien. Añadir el etanol y completar el volumen a 100 ml con agua destilada. Mezclar bien. Etiquetar el frasco con "ALBERT, TINCIÓN" y escriba la fecha. Guarde a temperatura ambiente. Advertencia: El ácido acético glacial es altamente corrosivo. “Tinción de Albert (Nº 7)” 8. Alcalina, Hematina D reactivo (Nº 8) Hidróxido de sodio (NaOH) 4g Triton X-100 (o equivalente) 25 g Agua destilada 1000 ml Se disuelve el hidróxido de sodio en el agua destilada en un matraz cónico limpio. Agitar con una varilla de vidrio hasta que los cristales se disuelvan completamente. Añadir el Triton X-100 (o equivalente) y mezclar bien. Filtrar la solución en un frasco de reactivo de vidrio limpio con tapón de vidrio, usando papel de filtro Whatman Nº 1 (o equivalente). Etiquetar el frasco con "ALCALINA, HEMATINA D REACTIVO" y escriba la fecha. Conservar a temperatura ambiente (20-25 ºC). Compruebe la calidad de la solución (ver abajo). El reactivo Hematina Alcalina D (HAD) se mantendrá durante varios meses a 20-25 °C. Si se forma un precipitado durante el almacenamiento, el reactivo debe ser filtrado antes de su uso. Nota: Si el agua destilada no está disponible, use agua de lluvia filtrada. “Reactivo Hematina Alcalina D (Nº 8)” Control de calidad del reactivo Hematina Alcalina D Una solución estándar de hematina alcalina D (estándar HAD) suministrado por el laboratorio central se utiliza para probar la calidad de los nuevos lotes de reactivos de HAD en laboratorios de nivel periférico. 1. Llenar una cubeta limpia con agua destilada. Colocar la cubeta en la cámara de cubetas y ajustar el hemoglobinómetro o el espectrofotómetro para leer el cero a 540 nm de longitud de onda. 2. Cambie el agua destilada con el reactivo de HAD. El hemoglobinómetro o colorímetro deberán marcar cero. 3. Pipetear 20 µl del estándar HAD en un tubo de ensayo que contiene 3 ml del reactivo de HAD recién preparado (dilución 1:150). 4. Medir la concentración de hemoglobina del estándar HAD (ver sección 9.3.2). 5. Repita el procedimiento con el lote anterior de reactivo de HAD. Compare los resultados. 6. Si los valores de hemoglobina difieren en más de 5 g/l, deseche el reactivo HAD recién preparado y preparar un nuevo lote, prestando atención a la medida exacta de los constituyentes y la limpieza del material de vidrio. La solución madre estándar de HAD se mantendrá durante 8 meses a 4-8 °C. 9. Amies, medio de transporte (No. 9) Carbón de calidad farmacéutica Cloruro de sodio (NaCl) Hidrofosfato disódico dihidratado (Na2HPO4 • 2H2O) Fosfato de potasio y dihigrógeno (KH2P04) anhidro Tioglicolato de sodio
10,0 g 3,0 g 1,15 g 0,20 g 0,10 g
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Cloruro de calcio (CaCl2), anhidro 0,10 g Cloruro de magnesio (MgCl2) 0,10 g Agar 4,00 g Agua destilada 1000 ml Suspender la mezcla de sales en el agua destilada. Añadir el agar y calentar hasta que el agar esté completamente disuelto. Añadir el carbón. Distribuir en pequeños tubos o frascos y agitarlos para mantener el carbón suspendido uniformemente. Esterilizar en autoclave a 120 °C durante 15 min. Enfriar inmediatamente en agua fría para mantener el carbón suspendido uniformemente. Etiquetar los tubos o frascos "AMIES, MEDIO de TRANSPORTE " y escriba la fecha. El medio de transporte Amies también está disponible comercialmente. “Medio de transporte Amies (No. 9)” 10. Benedict, solución de (Nº 10) Sulfato de cobre (CuSO4 • 5H2O) 17,3 g Citrato trisódico (Na3C6H5O7 • 2H2O) 173 g Carbonato de sodio (Na2CO3) anhidro 100 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disolver los cristales de sulfato de cobre por calentamiento en 100 ml de agua destilada. Se disuelve el citrato trisódico y el carbonato de sodio en aproximadamente 800 ml de agua destilada. Añadir la solución de sulfato de cobre lentamente al carbonato de sodio/solución de citrato trisódico, revolviendo constantemente. Completar el volumen a 1000 ml con agua destilada. Transferir la solución a un frasco de vidrio con tapón. Etiquetar el frasco "BENEDICT, SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución de Benedict (Nº 10)” 11. Blanco, reactivo (No. 11) Ácido tricloroacético (CCl3COOH), solución 50 g/l (5%) 50 ml (5 g en 100 ml de agua destilada; véase el Nº 62) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Mezclar. Transferir la solución a un frasco de vidrio con tapón de vidrio. Etiquetar el frasco con "BLANCO, REACTIVO" y escriba la fecha. Conservar a temperatura ambiente (20-25 º C). El reactivo se conserva durante varios meses a 20-25 °C. Advertencia: El ácido tricloroacético es altamente corrosivo. “Reactivo Blanco (Nº 11)” 12. Bórico, ácido, solución saturada (Nº 12) Ácido bórico 4,8 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Guarde en un frasco de vidrio con tapón de vidrio. Etiquetar el frasco con "BÓRICO, ÁCIDO SOLUCIÓN SATURADA" y escriba la fecha. “Solución saturada de Ácido Bórico (Nº 12)” 13. Cresilo brillante, Azul de (No. 13) Azul brillante de cresilo 1,0 g Citrato trisódico (Na3C6H5O7 • 2H2O) 0,4 g Solución de Cloruro de sodio (NaCl), 8,5 g/l (0,85%) (Nº 53) 100 ml Se disuelve el colorante y el citrato trisódico juntos en la solución de cloruro de sodio. Se filtra la solución obtenida en un frasco de tinción. Etiquetar el frasco con "CRESILO BRILLANTE, AZUL DE" y escriba la fecha. “Azul brillante de cresilo (No. 13)” 14. Amortiguado, Glicerol salino (Nº 14) Cloruro de sodio (NaCl) 4,2 g Fosfato dipotásico de hidrógeno (K2HPO4), anhidro 3,1 g Fosfato de potasio y dihigrógeno (KH2P04) anhidro 1,0 g Rojo de fenol 0,003 g Agua destilada 700 ml Glicerol (C3H8O3) 300 ml PH final = 7,2 Dispensar la solución en pequeñas botellas de vidrio cilíndrico con un tapón de rosca (botellas de bijou) por lo que sólo hay una brecha de 2 cm entre la parte superior del medio y la parte superior de las botellas. Etiquetar las botellas "AMORTIGUADO, GLICEROL SALINO" y escriba la fecha. “Glicerol salino tamponado o amortiguado (Nº 14)” 15. Agua amortiguada, pH 7,2 (Nº 15) Solución tampón de las tinciones de May-Grünwald, Giemsa y Leishman. Hidrofosfato disódico (Na2HPO4 • 2H2O) 3,8 g Fosfato de potasio y dihigrógeno (KH2P04) anhidro 2,1 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disolver las sales en el agua destilada, agitar bien. Compruebe el pH utilizando papeles de pH de intervalo estrecho, este debería estar entre 7,0-7,2. Transferir la solución a un frasco con tapón de vidrio. Etiquetar el frasco con "AGUA TAMPONADA" o “AGUA AMORTIGUADA” y escriba la fecha. 16. Carbolfucsina, Solución de, para la tinción de Ziehl-Neelsen (Nº 16) Solución A (solución saturada de fucsina básica):
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Fucsina básica 3g Etanol (CH3CH2OH), 95% 100 ml Solución B (solución acuosa de fenol, 50 g/l (5%)): Fenol (C6H5OH) 10 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Mezclar 10 ml de la solución A con 90 ml de la solución B. Transferir la mezcla resultante a un frasco con tapón de vidrio. Etiquetar el frasco con "CARBOLFUCSINA, SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: El fenol es altamente corrosivo y venenoso. “Solución de Carbolfucsina para la tinción de Ziehl-Neelsen (Nº 16)” 17. Cary-Blair, medio de transporte (No. 17) Tioglicolato de sodio 1,5 g Hidrofosfato disódico (Na2HP04) anhidro 1,1 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g Agar 5,0 g Agua destilada 991,0 ml Añadir las sales, el agar y el agua destilada a un vaso de precipitados de 1000 ml limpio y mezclar. Calentar mientras se mezcla hasta que la solución se aclare. Enfriar a 50 °C, añadir 9 ml de cloruro de calcio acuoso recién preparado (CaCl2), solución de 10g/l (1%), y ajustar el pH aproximadamente a 8,4. Vierta la solución en volúmenes de 7 ml en viales con tapón de rosca de 9 ml previamente lavados y esterilizados. Autoclave los viales que contienen el medio durante 15 minutos, enfriar y apriete las tapas. Etiquetar los viales con "CARY BLAIR, MEDIO DE TRANSPORTE" y escriba la fecha. “Medio de transporte Cary-Blair (Nº 17)” 18. Cristal violeta, Hucker modificado (No. 18) Solución A Cristal violeta 2,0 g Etanol (CH3CH2OH), 95% 20 ml Solución B Oxalato de amonio ((NH4) 2CO4 • H2O) 0,8 g Agua destilada 80 ml Mezcle las soluciones A y B. almacenar durante 24 horas antes de su uso. Filtrar en un frasco de tinción. Se filtra la solución de tinción en un frasco de tinción. Etiquetar el frasco con "CRISTAL VIOLETA, MODIFICADO HUCKER" y escriba la fecha. “Cristal violeta modificado por Hucker (No. 18)” 19. Delafield, Hematoxilina tinción de (Nº 19) Hematoxilina 4,0 g Alumbre de amonio 8,0 g Permanganato de potasio 0,2 g Etanol absoluto 125 ml Agua destilada 410 ml Caliente el etanol, colocando el vaso de precipitados en un recipiente con agua caliente. Agregue la hematoxilina y remover hasta que se disuelva. Deje que la solución se enfríe, y luego filtrar. Añadir el alumbre de amonio a 400 ml de agua destilada (calentada a 40 °C) y agitar hasta que se disuelva. Añadir la solución a la solución de hematoxilina filtrada y mezclar bien. Disolver el permanganato de potasio en 10 ml de agua destilada y añadir esta solución a la solución de tinción. Mezclar bien. Transferir la solución de tinción a un frasco de tinción. Etiquetar el frasco "DELAFIELD, TINCIÓN HEMATOXILINA" y escriba la fecha. Conservar a temperatura ambiente (20-25 ºC). La tinción se mantendrá durante varios meses a 20-25 °C. “Tinción de hematoxilina de Delafield (Nº 19)” 20. Dicromato, solución de limpieza (No. 20) Para la limpieza del material de vidrio. Dicromato de potasio (K2Cr2O7) 100g Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) 100 ml Agua destilada 1000 ml Disolver el dicromato en el agua destilada. Añadir el ácido gradualmente, revolviendo constantemente. El ácido siempre debe ser añadido al agua, no el agua al ácido. Transferir la solución a un frasco de vidrio con tapón de vidrio. Etiquetar el frasco con "DICROMATO SOLUCIÓN DE LIMPIEZA" y escriba la fecha. Advertencia: Debido a que el dicromato de potasio y el ácido sulfúrico son ambos corrosivos y la mezcla aún más, utilice la solución lo menos posible. “Solución de limpieza de dicromato (No. 20)” 21. Drabkin, líquido de, para dilución (Nº 21) El líquido de Drabkin para dilución se puede preparar con tabletas reactivas que se adquieren directamente del fabricante. Estas tabletas se acompañan de las instrucciones pertinentes. En los laboratorios que cuentan con una balanza de precisión el líquido de Drabkin se puede elaborar de la manera siguiente: Ferricianuro de potasio (K3Fe (CN)6) 0,40 g Cianuro de potasio (KCN) 0,10 g Fosfato de potasio y dihigrógeno (KH2PO4) 0,28 g Sterox SE (o equivalente) 1 ml
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Agua destilada q.s. (c.s.p.) 2000 ml Disuelva los tres primeros agentes químicos en el agua y mézclelos. Agregue el detergente (Storex) y mézclelos con suavidad. El reactivo resultante deberá ser claro y de color amarillo pálido. Cuando se mide contra el agua como blanco en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm, la absorbancia debe ser cero. Consérvese en un frasco de vidrio oscuro. Se debe desechar si se enturbia. Advertencia: el cianuro potásico es una sustancia química extraordinariamente tóxica que solo debe ser manejada por químicos capacitados. Mientras no se emplee se deberá guardar en una alacena con cerrojo. Después de utilizarla las manos se lavarán escrupulosamente. En su defecto, usar guantes desechables de látex. Etiquetar el frasco con "DRABKIN LÍQUIDO DILUYENTE" y escriba la fecha. “Líquido de Drabkin para dilución (Nº 21)” 22. EDTA, solución salina bipotásica de, 100 g/l (10%) (Nº 22) Etilendiaminotetraacetato bipotásico 20 g (Edetato potásico) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Para el uso, pipetear 0,04 ml de esta solución en pequeños contenedores con capacidad para contener 2,5 ml de sangre. Déjese secar este anticoagulante haciendo que los recipientes permanezcan toda la noche sobre una mesa de trabajo tibia o en una incubadora a 37°C. Etiquetar el frasco con “EDTA, SOLUCIÓN SALINA BIPOTÁSICA” y escriba la fecha. “Solución salina bipotásica de EDTA 100 g/l (10%) (Nº 22)” 23. Eosina, 10 g/l (1%), solución acuosa de (Nº 23) Eosina Agua destilada Etiquetar el frasco con "EOSINA 1% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución acuosa de Eosina al 1% (Nº 23)”
1g q.s. (c.s.p.) 100 ml
24. Eosina, 20 g/l (2%) solución salina de (N º 24) Eosina 2g Cloruro de sodio (NaCl), 8,5 g/l (0,85%) en solución acuosa (Nº 53) q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el frasco con "EOSINA SOLUCIÓN AL 2% EN SOLUCIÓN SALINA" y escriba la fecha. “Solución salina de Eosina al 2% (Nº 24)” 25. Field, tinción de (Nº 25) Colorante A de Field: Elaboración a partir de polvos preparados: Polvos para colorante A de Field 5,0 g Agua destilada caliente (calentada a 80 °C) q.s. (c.s.p.) 600 ml Mezcle hasta que los polvos se disuelvan. Filtre cuando se haya enfriado en un frasco de 1000 ml. Etiquetar el frasco con "FIELD, COLORANTE A" y escriba la fecha. Elaboración a partir de colorantes y agentes químicos originales: Azul de metileno (medicinal) 1,6 g Azur 1 1,0 g Hidrofosfato disódico (Na2HP04) anhidro 10,0 g Fosfato de potasio y dihidrógeno (KH2P04) anhidro 12,5 g agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disuelva ambos fosfatos en el agua. Vierta aproximadamente la mitad de esta solución en un frasco con capacidad para un litro, en que se hayan colocado algunas cuentecillas de vidrio. Añada los polvos colorantes y mezcle minuciosamente todo el contenido del frasco. Agregue el resto de la solución de fosfatos. Mezcle bien y filtre en un frasco de 1000 ml limpio. Etiquetar el frasco con "FIELD, COLORANTE A" y escriba la fecha. Colorante B de Field: Elaboración a partir de polvos preparados: Polvos para colorante B de Field 4,8 g Agua destilada caliente (calentada a 80 °C) q.s. (c.s.p.) 600 ml Mezcle bien hasta que se disuelva. Filtre la mezcla cuando se haya enfriado en un frasco de 1000 ml limpio. Etiquetar el frasco con "FIELD, COLORANTE B" y escriba la fecha. Elaboración a partir de colorantes y agentes químicos originales: Eosina (hidrosoluble, amarilla) 2,0 g Hidrofosfato disódico (Na2HP04) anhidro 10,0 g Fosfato de potasio y dihidrógeno (KH2P04) anhidro 12,5 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disuelva ambos fosfatos en el agua. Vacíe la mezcla en un frasco con capacidad para 1 litro. Añada la eosina. Mezcle hasta que se disuelva. Filtre en un frasco de 1000 ml limpio. Etiquetar el frasco con "FIELD, COLORANTE B" y escriba la fecha. Sin diluir, los colorantes de Field pueden ser usados por un tiempo, ya que dan buenos resultados. Después de la dilución, deben ser filtrados cada 2-3 días. 26. Flúor, oxalato de (Nº 26), Anticoagulante Fluoruro sódico (NaF) Oxalato potásico (KCOOH)
1,2 g 6,0 g
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Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Para usar este anticoagulante, trasládelo con una pipeta de 0,1 ml a recipientes pequeños con capacidad para 2 ml de sangre (o LCR). Advertencia: el fluoruro sódico y el oxalato potásico son sustancias tóxicas. “Anticoagulante Oxalato de Flúor (Nº 26)” 27. Formaldehido, solución salina de (Nº 27) Solución neutra de formaldehido (CH2O), por lo menos al 37% 10 ml ("formalina") Solución de cloruro sódico, 8,5 g/l (0,85%) (No. 53) 90 ml La solución comercial de formaldehido se neutraliza añadiendo unas gotas de solución de carbonato sódico en concentración de 50 g/l (5%) (Reactivo Nº 52). Mida el pH con una cinta de papel indicador. Etiquetar el frasco con " Formaldehido solución Salina" y escriba la fecha. Advertencia: el formaldehido es corrosivo y tóxico. “Solución salina de Formaldehido (Nº 27)” 28. Formaldehido, solución al 10% de (Nº 28) Solución comercial de formaldehido (CH2O), por lo menos al 37% ("formalina") 100 ml Agua destilada 300 ml Transferir la solución a un frasco con tapón de vidrio. Etiquetar el frasco con "FORMALDEHIDO AL 10% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: El formaldehido es corrosivo y tóxico. “Solución al 10% de Formaldehido (Nº 28)” 29. Giemsa, tinción de (Nº 29) Colorante de Giemsa en polvo 0,75 g Metanol (CH3OH) 65 ml Glicerol (C3H8O3) 35 ml Coloque los ingredientes en un frasco que contenga cuentecillas de vidrio y sacúdalo. Después sacuda el frasco 3 veces al día durante 4 días consecutivos. Por último, fíltrese en un frasco para tinción. Etiquetar el frasco con “GIEMSA, TINCIÓN” y escriba la fecha. (Véanse las instrucciones del fabricante; puede ocurrir que las cantidades indicadas por éste sean diferentes). “Tinción de Giemsa (Nº 29)” 30. Glucosa, reactivos para (No. 30) Ácido tricloroacético, 30 g/l (3%) Acido tricloroacético (CCl3COOH) 15 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 500 ml Pese el ácido con rapidez, ya que es sumamente delicuescente. Trasládelo a un vaso para análisis y agregue agua para disolverlo. Vacíe la solución en un matraz con capacidad para 500 ml y llene hasta esta marca con agua. Esta solución se puede conservar en el frigorífico por tiempo indefinido. Etiquetar el frasco con "ÁCIDO TRICLOROACÉTICO AL 3% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: el ácido tricloroacético es sumamente corrosivo. Reactivo de ortotoluidina Tiourea 0,75 g Acido acético glacial (CH3COOH) 470 ml Ortotoluidina 30 ml Disuelva la tiourea en el ácido acético glacial. (Si esto resulta difícil, coloque el matraz en un recipiente con agua caliente). Añada la ortotoluidina y mezcle bien. Vacíe en un frasco oscuro y consérvese a la temperatura ambiente. Etiquetar el frasco con "O-TOLUIDINA REACTIVO" y escriba la fecha. Dejar reposar durante al menos 24 horas antes de su uso. Advertencia: evite tocar estos agentes químicos; el ácido acético glacial es sumamente corrosivo. Ácido benzoico, 1 g/l (0,1%) Ácido benzoico 1g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1 000 ml Mida 1000 ml de agua destilada y caliéntela casi hasta el punto de ebullición. Agregue el ácido benzoico y mezclar bien hasta que se disuelva. Deje que se enfríe. Transferir la solución a un frasco con tapón de vidrio de 1000 ml. Etiquetar el frasco con "ÁCIDO BENZOICO 0,1% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Solución estandarizada de referencia para glucosa (100 mmol/l) Glucosa pura, anhidra 9g Solución de ácido benzoico, 1 g/l (0,1%) q.s. (c.s.p.) 500 ml Pese la glucosa con precisión extrema. Trasládela a un matraz volumétrico de 500 ml y llene el matraz hasta ese nivel con la solución de ácido benzoico. Mezcle bien. Congele fracciones separadas, aproximadamente de 100 ml. Utilice un nuevo frasco de solución de referencia congelada cada vez que se prepare la solución de referencia para trabajar con glucosa. Etiquetar el frasco con "GLUCOSA, SOLUCIÓN REFERENCIA ESTANDARIZADA 100 mmol/l" y escriba la fecha.
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Solución de referencia para trabajar con glucosa (2,5, 5, 10, 20 y 25 mmol/l) Deje que la solución estandarizada de referencia para glucosa alcance la temperatura ambiente. Cuidadosamente pipetear 2,5, 5, 10, 20 y 25 ml de la solución estandarizada de referencia para glucosa en cada uno de cinco matraces volumétricos de 100 ml. Completar hasta la marca con la solución de ácido benzoico y mezclar bien. Etiquetar los frascos como se describió antes y escribir la fecha. Guárdese en el frigorífico. Se debe renovar cada mes. 31. Glicerol-verde malaquita Solución de (No. 31) 1. Preparar una solución madre de verde malaquita, solución al 1%: Verde de malaquita 1g Agua destilada 100 ml Usando una mano de mortero y un mortero, moler los cristales de verde malaquita hasta obtener un polvo. Disolver 1 g del polvo recién preparado en 100 ml de agua destilada y verter la solución en un frasco oscuro. Etiquetar el frasco con "VERDE MALAQUITA 1% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Cierre bien el frasco y guárdelo en la oscuridad. 2. Prepare una solución de trabajo de glicerol-verde malaquita: Glicerol 100 ml Verde malaquita, solución al 1% 1 ml Agua destilada 100 ml Añadir el glicerol, la solución de verde malaquita de stock (madre) y agua destilada a un frasco con tapón de vidrio de 250 ml. Etiquetar el frasco con "GLICEROL - VERDE MALAQUITA SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Mezclar bien antes de usar. “Solución de glicerol – verde de malaquita (Nº 31)” 32. Clorhídrico, Ácido, 0,01 mol/l solución de (Nº 32) Ácido clorhídrico (HCl), concentrado 8,6 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Medir 500 ml de agua destilada en un frasco con tapón de vidrio de 1 000 ml. Añadir el ácido, gota a gota. Completar hasta 1 000 ml con el resto del agua destilada. Etiquetar el frasco con "ÁCIDO CLORHÍDRICO 0,01 mol/l" y escriba la fecha. Renovar mensualmente. Advertencia: El ácido clorhídrico es altamente corrosivo. “Solución de Ácido Clorhídrico 0,01 mol/l (Nº 32)” Isotónica, solución salina Ver cloruro de sodio. 33. Lactofenol, solución de montaje de azul algodón de (No. 33) Azul algodón (azul de anilina) 50 mg Cristales de fenol (C6H5OH) 20 mg Ácido láctico (CH3CH(OH)COOH) 20 ml Glicerol (C3H8O3) 40ml Agua destilada 20 ml Añadir el fenol, el ácido láctico y el glicerol al agua destilada, mezclar todo y disolver por calentamiento suavemente. Agregue el azul algodón y mezclar. Transferir la solución a un frasco con tapón. Etiquetar el frasco con "LACTOFENOL AZUL ALGODÓN, SOLUCIÓN DE MONTAJE" y escriba la fecha. Advertencia: El fenol es altamente corrosivo y venenoso. “Solución de montaje de azul algodón de lactofenol (No. 33)” 34. Leishman, tinción de (Nº 34) Polvos de Leishman 1,5 g Metanol (CH3OH) q.s. (c.s.p.) 1000 ml Enjuague con metanol un frasco limpio. Coloque en su interior algunas cuentecillas de vidrio limpias y secas. Añada los polvos colorantes y el metanol. Mezcle bien para disolver los polvos colorantes. El material de tinción estará así listo para usarlo al día siguiente. Etiquetar el frasco con "LEISHMAN, TINCIÓN" y escriba la fecha. Al preparar una tinción empleando metanol, es importante que se impida la entrada a la humedad durante la elaboración y posteriormente, durante su conservación. “Tinción de Leishman (Nº 34)” 35. Loeffler azul de metileno (Nº 35) Azul de metileno 0,5 g Etanol absoluto (CH3CH2OH) 30 ml Hidróxido de potasio (KOH), 200 g/l (20%) solución (Nº 45) 0,1 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Disolver el azul de metileno en 30 ml de agua destilada y transferir la solución a un frasco marrón (color caramelo) limpio. Añadir el hidróxido de potasio, el etanol y el resto del agua destilada y mezclar bien. Etiquetar el frasco con "LOEFFLER AZUL DE METILENO" y escriba la fecha. Conservar en un lugar oscuro a temperatura ambiente (20-25 ºC). “Azul de metileno de Loeffler (Nº 35)” 36. Lugol, solución yodurada 1 g/l (0,1%) de (Nº 36) Yodo Yoduro potásico (KI) Agua destilada
1g 2g 300 ml
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Pese el yodo en un plato de porcelana o un vidrio de reloj. Pulverícelo junto con el yoduro potásico, ambos secos, en un mortero. Añada algunos mililitros de agua a intervalos y muela minuciosamente hasta que el yodo y el yoduro se disuelvan. Deposite esta solución en un frasco de vidrio de color ámbar con el resto del agua destilada. De otro modo: Coloque 300 ml de agua destilada en una probeta. Disuelva primero el yoduro potásico en unos 30 ml de esta agua. Agregue el yodo y mezcle hasta disolverlo. Añada el resto del agua destilada y mezcle bien. Consérvese en un frasco oscuro color caramelo. Etiquetar el frasco con "LUGOL YODO 0,1% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución yodurada 1 g/l (0,1%) de Lugol (Nº 36)” 37. Lugol, solución yodurada 5 g/l (0,5 %) de (Nº 37) Yodo 5g Yoduro potásico (KI) 10 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 300 ml Pese el yodo en un plato de porcelana o un vidrio de reloj. Pulverícelo junto con el yoduro potásico, ambos secos, en un mortero. Añada algunos mililitros de agua a intervalos y muela minuciosamente hasta que el yodo y el yoduro se disuelvan. Deposite esta solución en un frasco de vidrio de color ámbar con el resto del agua destilada. Alternativamente, coloque 300 ml de agua destilada en una probeta. Disuelva primero el yoduro potásico en unos 30 ml de esta agua. Agregue el yodo y mezcle hasta disolverlo. Añada el resto del agua destilada y mezcle bien. Consérvese en un frasco oscuro color caramelo. Etiquetar el frasco con "LUGOL YODO 0,5% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución yodurada 5 g/l (0,5%) de Lugol (Nº 36)” 38. May - Grünwald, tinción de (Nº 38) Polvos de May-Grünwald 5g Metanol q.s. (c.s.p.) 1000 ml Enjuague con metanol un frasco limpio. Deposite en su interior algunas cuentecillas de vidrio limpias y secas. Agregue los polvos colorantes y el metanol. Mezcle bien para disolver completamente los polvos colorantes. Esta tinción mejora después de conservarla durante 1 - 2 semanas, mezclándola con suavidad a intervalos. Al preparar una tinción empleando metanol, es importante que se impida la entrada a la humedad durante la elaboración y posteriormente, durante su conservación. Etiquetar el frasco con "MAY-GRÜNWALD, TINCIÓN" y escriba la fecha. “Tinción de May – Grünwald (Nº 38)” 39. Metileno, azul de, solución acuosa (Nº 39) Azul de metileno 0,3 g Agua destilada 100 ml Disolver el azul de metileno en el agua destilada. Filtrar la solución en un frasco color caramelo limpio. Etiquetar el frasco con "METILENO, AZUL DE, SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución acuosa de azul de metileno (Nº 39)” 40. Rojo neutro, 1 g/l (0,1%) solución (Nº 40) Rojo neutro 1g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disolver el rojo neutro en aproximadamente 300 ml de agua destilada en un frasco de 1000 ml limpio. Completar el volumen a 1000 ml con agua destilada y mezclar bien. Etiquetar el frasco con "ROJO NEUTRO 0,1 % SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Guarde a temperatura ambiente. “Solución de Rojo neutro 0,1% (Nº 40)” 41. Pandy, reactivo de (Nº 41) Fenol (C6H5OH) 30 g Agua destilada 500 ml Coloque el fenol en un frasco de 1000 ml. Agregue el agua destilada. Agite vigorosamente. Etiquetar el frasco con "PANDY REACTIVO" y escriba la fecha. Deje en reposo durante un día. Observe si hay alguna parte de fenol que no se haya disuelto. Si es así, fíltrelo. (Si todo el fenol se ha disuelto, añada otros 10 g y espere durante un día más antes de filtrar). El reactivo de Pandy es una solución saturada de fenol. Advertencia: el fenol es sumamente corrosivo y tóxico. “Reactivo de Pandy (Nº 41)” 42. Rojo fenol, 10 g/l (1%) solución de (Nº 42) Cristales de rojo fenol 0,1 g Agua destilada 10 ml Pesar los cristales de rojo fenol en un vaso de precipitados de 20 ml. Agregue el agua destilada y agitar hasta que los cristales se hayan disuelto. Transferir la solución a un frasco cuentagotas de plástico. Etiquetar el frasco con "ROJO FENOL 1% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Conservar a temperatura ambiente (20-25 ºC). “Solución de rojo fenol 10 g/l (1%) (Nº 42)” 43. Tamponada, agua con Fosfato 0,01 mol/l, pH 6,8 (Nº 43) 1. Preparar una solución madre de hidrofosfato disódico anhidro en un matraz aforado de 1000 ml: Hidrofosfato disódico (Na2HP04) anhidro 13,6 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml
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Esterilizar la solución madre filtrándola a través de un filtro con tamaño de poro de 0,2 µm. Si no está disponible el hidrofosfato disódico anhidro, la solución se puede preparar mediante la disolución de 17,2 g de hidrofosfato disódico dihidratado (NaH2PO4 • 2H2O) en 1000 ml de agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "ANHIDRO DISÓDICO HIDROFOSFATO" y escriba la fecha. Mantenga la solución madre en un refrigerador. 2. Preparar una solución madre de fosfato de hidrógeno disódico en un matraz aforado de 1000 ml: Hidrofosfato disódico dihidratado (Na2HPO4 • 2H2O) 17,8 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Esterilizar la solución madre filtrándola a través de un filtro con tamaño de poro de 0,2 µm. Si no está disponible el hidrofosfato disódico dihidratado, la solución se puede preparar mediante la disolución de 26,8 g de hidrofosfato disódico heptahidratado (Na2HPO4 • 7H2O) o 35,8 g de hidrofosfato disódico dodecahidratado (Na2HPO4 • 12H2O). Etiquetar el matraz aforado con "DISÓDICO HIDROFOSFATO, SOLUCIÓN MADRE" y escriba la fecha. Mantenga la solución madre en un refrigerador. 3. Mezclar las dos soluciones madre en las cantidades que se muestran en la siguiente tabla para obtener 100 ml de agua tamponada. El pH debe ser como se indica en la tabla. Si el pH es demasiado bajo, ajuste con hidróxido de sodio (NaOH), solución 0,01 mol/l (Nº 54), y si es demasiado alto, ajustarlo con ácido clorhídrico (HCl), solución 0,01 mol/l (Nº 32). “Agua tamponada con Fosfato 0,01 mol/l, pH 6,8 (Nº 43)” “Agua tamponada con Fosfato 0,01 mol/l, pH 6,8 (Nº 43)” pH de la solución de trabajo Volumen de la solución madre (ml) NaH2PO4 Na2HPO4·2H2O 83.2 16.8 6.4 6.5 75.0 25.0 6.8 50.8 49.2 6.9 43.9 56.1 7.0 39.0 61.0 7.2 28.0 72.0 7.4 19.9 81.0 7.6 13.0 87.0 7.8 8.5 91.5 8.0 5.3 94.7 44. Alcohol de polivinilo (PVA) fijador (Nº 44) Nota: Esto se debe preparar en un laboratorio de nivel intermedio, debido a los reactivos peligrosos involucrados. “Fijador de Alcohol de polivinilo (PVA) (Nº 44)” Schaudinn, fijador modificado Cristales de cloruro de mercurio (HgCl2) 1,5 g Etanol, 95% 31,0 ml Ácido acético glacial 5,0 ml Se disuelve el cloruro de mercurio en el etanol en un matraz tapado (50 o 125 ml) por agitación a intervalos. Añadir el ácido acético, obturar con el tapón y mezclar por agitación. Etiquetar el frasco con "SCHAUDINN FIJADOR MODIFICADO" y escriba la fecha. Advertencia: El ácido de mercurio es altamente tóxico. El ácido acético glacial es altamente corrosivo. “Fijador modificado de Schaudinn” Mezcla de PVA Glicerol 1,5 ml PVA en polvo (de baja viscosidad) 5,0 g Agua destilada 52,5 ml En un pequeño vaso de precipitados, añadir el glicerol al PVA en polvo y mezclar bien con una varilla de vidrio hasta que todas las partículas aparezcan recubiertas con el glicerol. Remover la mezcla raspándola en un matraz de 125 ml. Agregue el agua destilada, tapar y dejar a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 3 horas o toda la noche. Etiquetar el frasco con "MEZCLA PVA" y escriba la fecha. Agitar la mezcla de vez en cuando para mezclar. El PVA en polvo y las soluciones fijadoras de PVA están disponibles de varias fuentes comerciales. Hay muchos grados de PVA en polvo en el mercado, pero los grados con alta hidrólisis y baja o media viscosidad son más satisfactorios para la preparación del fijador PVA. PVA fijador, solución de trabajo de 1. Calentar en baño maría (o en un vaso grande de agua) a 70-75 ºC. Ajuste el calor para mantener este rango de temperatura. 2. Colocar el matraz que contiene la mezcla de PVA, sin apretar el tapón, en el baño maría durante unos 10 minutos, agitando con frecuencia. 3. Cuando el polvo de PVA parece estar disuelto en su mayor parte, se vierte en la solución fijadora modificada de Schaudinn, volver a tapar y agitar para mezclar. 4. Continuar girando la mezcla en el baño maría durante 2-3 minutos para disolver el resto del PVA, para permitir que se escapen las burbujas, y para aclarar la solución. 5. Retirar el matraz del baño maría y dejar que se enfríe. Guarde el fijador de PVA en un frasco con tapa a rosca o tapón de vidrio. Etiquetar el frasco con "PVA FIJADOR" y escriba la fecha. El fijador se mantendrá durante 6 a 12 meses.
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“Solución de trabajo de Fijador de PVA” 45. Potasio, Hidróxido, solución de 200 g/l (20%) (Nº 45) Hidróxido de potasio (KOH) a granel 20 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado "POTASIO HIDROXIDO 20% solución" y escriba la fecha. Advertencia: El hidróxido de potasio es corrosivo. “Solución de Hidróxido de Potasio 200 g/l (20%) (Nº 45)” 46. Permanganato de potasio, solución de 40 g/l (4%) (Nº 46) Permanganato de potasio (KMnO4) 40g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disolver el permanganato de potasio en 300 ml de agua destilada en un matraz aforado de 1000 ml. Completar el volumen a 1000 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "PERMANGANATO DE POTASIO 4% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución de Permanganato de Potasio (40 g/l) (4%) (Nº 46)” 47. Safranina, solución de (Nº 47) 1. Preparar una solución madre: Safranina O 2,5 g Etanol (CH3CH2OH), 95% q.s. (c.s.p.) 100 ml Mezclar hasta que toda la safranina se haya disuelto. Transferir la solución a un frasco con tapón de vidrio. Etiquetar el frasco con "SAFRANINA, SOLUCIÓN MADRE" y escriba la fecha. 2. Prepare una solución de trabajo en un frasco con tapón de vidrio: Solución madre 10 ml Agua destilada 90 ml Etiquetar el frasco con "SAFRANINA, SOLUCIÓN DE TRABAJO" y escriba la fecha. Almacenar en la oscuridad. “Solución de safranina (Nº 47)” 48. Saponina, solución salina de 10 g/l (1%) (Nº 48) Saponina 1g Cloruro de sodio (NaCl), solución de 8,5 g/l (8,5%) (Nº 53) 100 ml Añadir la solución de cloruro de sodio a una botella de vidrio. Añadir la saponina, mezclar y calentar hasta que se haya disuelto completamente. Etiquetar el frasco con "1% SAPONINA EN SOLUCIÓN SALINA" y escriba la fecha. “Solución salina de saponina 10 g/l (1%) (Nº 48)” 49. Nitrato de plata, solución 17 g/l (1,7%) (Nº 49) Nitrato de plata (AgNO3) 5,1 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 300 ml Mezclar hasta que todo el nitrato de plata se ha disuelto. Etiquetar el frasco con "NITRATO DE PLATA 1,7% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: El nitrato de plata es cáustico. “Solución de Nitrato de Plata 17 g/l (1,7%) (Nº 49)” 50. Sodio bicarbonato, solución de 20 g/l (2%) (Nº 50) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 2g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "SODIO BICARBONATO 2% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución de bicarbonato de sodio 20 g/l (2%) (Nº 50)” 51. Sodio carbonato, solución de 2 g/l (0,2%) (Nº 51) Carbonato de sodio (Na2CO3), anhidro 2g (o una cantidad equivalente de uno de los hidratos) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "CARBONATO DE SODIO 0.2% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución de carbonato de sodio 2 g/l (0,2%) (Nº 51)” 52. Sodio carbonato, solución de 50 g/l (5%) (Nº 52) Carbonato de sodio (Na2CO3), anhidro 5g (o una cantidad equivalente de uno de los hidratos) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "CARBONATO DE SODIO 5% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución de carbonato de sodio 50 g/l (5%) (Nº 52)” 53. Sodio, Cloruro, solución de 8,5 g/l (0,85%) (solución salina isotónica) (Nº 53) Cloruro de sodio (NaCl) 8,5 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Etiquetar el matraz aforado con "CLORURO DE SODIO 0,85% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución de Cloruro de Sodio 8,5 g/l (0,85 %) (Nº 53)” Sodio, Citrato de Ver Citrato trisódico. Sodio, Carbonato ácido de Ver bicarbonato de sodio.
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54. Sódico, solución acuosa de hidróxido, 0,01 mol/l (Nº 54) Hidróxido de sodio (NaOH) a granel 3g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "SÓDICO, HIDRÓXIDO 0,01 mol/l" y escriba la fecha. Advertencia: El hidróxido de sodio es corrosivo. “Solución acuosa de hidróxido de sodio 0,01 mol/l (Nº 54)” 55. Sódico, solución acuosa de metabisulfito, 20 g/l (2%) solución (Nº 55) Metabisulfito de sodio (Na2S2O5) 0,5 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 25 ml Prepárese para usarse inmediatamente. Etiquetar el matraz aforado con "SODIO METABISULFITO 2% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución acuosa de metabisulfito de sodio 20 g/l (2%) (Nº 55)” 56. Stuart, medio de transporte modificado de (Nº 56) Agar 4,00 g Agua destilada 1000 ml Caliéntese hasta que se disuelva y, mientras se encuentra caliente: Cloruro sódico (NaCl) 3,00 g Cloruro potásico (KCl) 0,20 g Hidrofosfato disódico (Na2HP04) anhidro 1,15 g Fosfato sódico y de hidrógeno (NaH2P04) anhidro 0,20 g Tioglicolato sódico 1,00 g Cloruro cálcico (CaCl2), 10 g/l (1%), solución acuosa recién 10,00 ml preparada Cloruro magnésico (MgCl2), 10 g/l (1%), solución acuosa 10,00 ml pH final: 7,3 1. Agite hasta que se disuelva. Agregue 10 g de polvos de carbón neutro. 2. Coloque 5 - 6 ml en tubos de 13 x 10 mm con tapa de rosca (evitar el aplastamiento). 3. Esterilice los tubos en el autoclave a 121°C durante 20 minutos. Invierta los tubos antes de que el medio se solidifique, a fin de que el carbón neutro se distribuya uniformemente. Etiquete los tubos con "STUART TRANSPORTE MEDIO, MODIFICADO" y escriba la fecha. A continuación guarde en el frigorífico. “Medio de transporte modificado de Stuart (Nº 56)” 57. Sulfosalicílico, solución acuosa de ácido, 30 g/l (30%) (Nº 57) Ácido sulfosalicílico 3g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "SULFOSALICÍLICO ÁCIDO 3% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución acuosa de Ácido Sulfosalicílico 30 g/l (30%) (No. 57)” 58. TIF (tiomersal yodo-formaldehido) fijador (Nº 58) 1. Preparar una solución madre: Tintura de tiomersal, 1: 1000 200 ml Formaldehido, solución al 10% (Nº 28) 25 ml Glicerol 5 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 250 ml Transferir la solución madre a un frasco color caramelo. Etiquetar el frasco con "TIOMERSALFORMALDEHIDO SOLUCIÓN MADRE" y escriba la fecha. Consérvese en un frasco oscuro color caramelo hasta 3 meses. 2. Elaboración de solución yodurada de Lugol, 50 g/l (5%): Yodo 5g Yoduro potásico (KI) 10 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Prepárela de la misma manera que la solución yodurada de Lugol (No. 37). Se debe guardar durante un mes solamente en un frasco oscuro. 3. El día en que se vaya a usar, mezcle: Solución madre de tiomersal 9,4 ml Solución yodurada de Lugol; 50 g/l (5 %) (Nº 37) 0,6 ml Advertencia: el formaldehido es corrosivo y tóxico. “Fijador TIF (tiomersal yodo-formaldehido) (Nº 58)” 59. Trisódico, solución salina de citrato, 20 g/l (2%) (Nº 59) Citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7 • 2H2O) 2g Cloruro de sodio, 8,5 g/l (0,85%) solución (Nº 53) q.s. (c.s.p.) 100 ml Consérvese en el frigorífico. Etiquetar el matraz aforado con "CITRATO TRISÓDICO 2% SOLUCIÓN SALINA" y escriba la fecha. “Solución salina de citrato trisódico 20 g/l (2%) (Nº 59)” 60. Trisódico, solución acuosa de citrato, 32 g/l (3,2%) (Nº 60) Esto se utiliza como un anticoagulante. Citrato trisódico anhidro (Na3C6H5O7) (o una cantidad equivalente de 3,2 g dihidrato o pentahidrato) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml
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Consérvese en el frigorífico. Úsese 1 ml de la solución por 4 ml de sangre. Etiquetar el matraz aforado con "CITRATO TRISÓDICO 3,2% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución acuosa de citrato trisódico 32 g/l (3,2%) (Nº 60)” Trisódico, solución acuosa de citrato, 38 g/l (3,8%) (Nº 60) Esto se utiliza como un anticoagulante. Citrato trisódico anhidro (Na3C6H5O7) (o una cantidad equivalente de dihidrato o pentahidrato) 3,8 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Consérvese en el frigorífico. Úsese 1 ml de la solución por 4 ml de sangre. Etiquetar el matraz aforado con "CITRATO TRISÓDICO 3,8% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución acuosa de citrato trisódico 38 g/l (3,8%) (Nº 60)” *La solución de citrato trisódico al 3,8 % aún se usa bastante en Latinoamérica. 61. Türk, Solución de (Nº 61) Ácido acético glacial (CH3COOH) 4 ml Solución acuosa de azul de metileno (Nº 39) 10 gotas Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml La solución de azul de metileno (Nº 39) se prepara disolviendo 0,3 g de azul de metileno en 100 ml de agua destilada. Fíltrese antes de añadirla a la solución ácida. Disolver el ácido acético glacial en 100 ml de agua destilada. Añadir la solución de azul de metileno y mezclar. Transfiera la mezcla a un matraz aforado de 200 ml y completar el volumen a 200 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "TÜRK SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: el ácido acético glacial es altamente corrosivo. “Solución de Türk (Nº 61)” 62. Urea, reactivos para (Nº 62) Ácido tricloroacético, 50 g/l (5%) solución Ácido tricloroacético (CCl3COOH) 10 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Pese el ácido con rapidez, ya que es sumamente delicuescente. Trasládelo a un vaso de precipitados. Agregue 100 ml de agua destilada y mezclar para disolverlo. Trasládelo a una probeta o a un matraz aforado con tapón y complete los 200 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "ÁCIDO TRICLOROACÉTICO 5% SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: el ácido tricloroacético es sumamente corrosivo. “Solución de ácido tricloroacético 50 g/l (5%)” Diacetil monoxima solución madre Diacetil monoxima (también llamado monoxima 2,32g butanodiona) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 500 ml Disuelva la diacetil monoxima en agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "DIACETIL MONOXIMA, SOLUCIÓN MADRE" y escriba la fecha. La solución se mantendrá durante al menos 6 meses a 2-8 °C. “Solución madre de diacetil monoxima” Reactivo de color Reactivo ácido (Nº 6) 50 ml Reactivo de diacetil monoxima 50 ml Mezclar el reactivo de ácido y la solución madre en un matraz de 100 ml tapado. Etiquetar el frasco con "COLOR, REACTIVO". Las cantidades que se muestran arriba son suficientes para 33 mediciones. El reactivo debe prepararse diariamente. Solución de referencia de reserva de urea, 125 mmol/l Urea 750 mg Solución de ácido benzoico (C7H6O2), 1 g/l (0,1%) (véase Nº 30) q.s. (c.s.p.) 100 ml Pese la urea con precisión extrema. Disolver la urea en aproximadamente 20 ml de la solución de ácido benzoico en un matraz aforado de 100 ml. Completar el volumen a 100 ml con solución de ácido benzoico. Mezcle minuciosamente la solución de ambos compuestos. Etiquetar el frasco "UREA RESERVA REFERENCIA SOLUCIÓN 125 mmol/l" y escriba la fecha. Guarde en el frigorífico. La solución se conserva durante varios meses a 2-8 °C. Solución de referencia de trabajo de urea, 10 mmoles/l Solución de referencia de reserva de urea 8 ml Solución de ácido benzoico (C7H6O2), 1 g/l (0,1%) (véase Nº 30) q.s. (c.s.p.) 100 ml Mezclar bien las soluciones en un matraz aforado de 100 ml. Etiquetar el matraz aforado "UREA SOLUCIÓN DE TRABAJO DE REFERENCIA 10 mmol/l" y escriba la fecha. 63. Wayson, tinción de (Nº 63) Solución A1: Fucsina básica Metanol absoluto anhidro (CH3OH) Solución A2: Azul de metileno Metanol absoluto anhidro (CH3OH) Combinar las dos soluciones para dar la solución “A”. (A1 + A2 = A) Solución B: solución acuosa de fenol, (50 g/l) (5%):
2g 100 ml 7g 100 ml
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Fenol (C6H5OH) 100 g Agua destilada 2000 ml Agregue la solución “A” a la solución B. Las propiedades de la tinción de Wayson mejoran con el tiempo. Prepare en grandes volúmenes y distribúyase en cantidades pequeñas, en frascos de vidrio oscuro, para usarla posteriormente. Etiquetar los frascos con "WAYSON, TINCIÓN" y escriba la fecha. Advertencia: el fenol es corrosivo. “Tinción de Wayson (Nº 63)” 64. Willis, Solución de (Nº 64) Esta es una solución saturada de cloruro de sodio. Cloruro de sodio (NaCl) 125 g Agua destilada 500 ml Disuelva el cloruro sódico calentando la mezcla hasta el punto de ebullición. Déjese enfriar y reposar. Observe si cierta proporción de sal queda sin disolver. Si toda la sal se ha disuelto agregue otros 50 g. Fíltrela y consérvela en un frasco con tapón de corcho. Etiquetar el frasco con "WILLIS, SOLUCIÓN" y escriba la fecha. “Solución de Willis (Nº 64)” 65. Wintrobe, solución de (Nº 65) Solución anticoagulante. Oxalato de amonio (NH4) 2C2O4 • H2O) 1,2 g Oxalato de potasio (K2C2O4 • H2O) 0,8 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Disolver las dos sales en 50 ml de agua destilada en un matraz aforado de 100 ml. Completar el volumen a 100 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "WINTROBE, SOLUCIÓN" y escriba la fecha. Deposite 0,5 ml de esta mezcla en cada frasco o tubo de 5 ml que se use para recolectar sangre. Deje los frascos abiertos a fin de que se sequen a la temperatura ambiente o, de preferencia, colóquelos en una incubadora a 37° C. “Solución de Wintrobe o Mezcla de Wintrobe (Nº 65)” 66. Zenker, fijador de (Nº 66) Dicromato de potasio (K2Cr2O7) 2,5 g Cloruro mercúrico (HgCl2) 5,0 g Sulfato de sodio (Na2SO4) 1,0 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Poco antes de usarla, agregue a los 100 ml de la solución: Acido acético glacial 5 ml Disolver las tres sales en 50 ml de agua destilada en un matraz aforado de 100 ml. Completar el volumen a 100 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "ZENKER FIJADOR" y escriba la fecha. Advertencia: el ácido acético glacial es sumamente corrosivo y el cloruro mercúrico es extremadamente tóxico. Este fijador solo debe ser preparado por técnicos totalmente capacitados, que posean suficiente experiencia. “Fijador de Zenker (Nº 66)”
# Esta traducción realizada del inglés al castellano del Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud, OMS, 2ª Edición, 2003, no trae índice analítico.
Selección de publicaciones de la OMS sobre temas afines Métodos básicos de laboratorio en parasitología médica 1991 (122 páginas) Métodos básicos de laboratorio en bacteriología clínica 1991 (128 páginas) Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual (ITS) Van Dyck E, Meheus AZ, Piot P. 1999 (146 páginas) Mantenimiento y reparación del laboratorio, diagnóstico por imagen, y equipos hospitalarios. 1994 (164 páginas) Manejo seguro de los residuos procedentes de las actividades de atención de la salud Prüss A, Giroult E, Rushbrook P, eds. 1999 (244 páginas) Seguridad en los laboratorios de salud (documento OMS/LAB/97.1) 1997 (157 páginas) The World Health Organization was established in 1948 as a specialized agency of the United Nations serving as the directing and coordinating authority for international health matters and public health. One of WHO’s constitutional functions is to provide objective and reliable information and advice in the field of human health, a responsibility that it fulfils in part through its extensive programme of publications. The Organization seeks through its publications to support national health strategies and address the most pressing public health concerns of populations around the world. To respond to the needs of Member States at all levels of development, WHO publishes practical manuals, handbooks and training material for specific categories of health workers; internationally applicable guidelines and standards; reviews and analyses of health policies, programmes and research; and state-of-the-art consensus reports that offer technical advice and recommendations for decision-makers. These books are closely tied to the Organization’s priority activities, encompassing disease prevention and control, the development of equitable health systems based on primary health care, and health promotion for individuals and communities. Progress towards better health for all also demands the global dissemination and exchange of information that draws on the knowledge and experience of all WHO’s Member countries and the collaboration of world leaders in public health and the biomedical sciences. To ensure the widest possible availability of authoritative information and guidance on health matters, WHO secures the broad international distribution of its publications and encourages their translation and adaptation. By helping to promote and protect health and prevent and control disease throughout the world, WHO’s books contribute to achieving the Organization’s principal objective – the attainment by all people of the highest possible level of health.
Manual de laboratorio de bioseguridad, 2 ª ed. 1993 (133 páginas) Conceptos básicos de garantía de calidad para los laboratorios intermedios y periféricos, 2 ª ed. El-Nageh MM et al. OMS Publicaciones Regionales, Eastern Mediterranean Series, No. 2 2002 (256 páginas)
Más información sobre estas u otras publicaciones de la OMS pueden solicitarse a Comercialización y Difusión, Organización Mundial de la Salud, 1211 Ginebra 27, Suiza.
MANUAL OF BASIC TECHNIQUES FOR A HEALTH LABORATORY – 2nd edition
Este manual ofrece una guía práctica para el desempeño seguro y preciso de las técnicas básicas de laboratorio. Diseñado para ser utilizado por técnicos de laboratorio que trabajan en laboratorios de nivel periférico en los países en desarrollo, el libro hace hincapié en procedimientos sencillos y económicos que pueden producir resultados precisos en lugares donde los recursos, incluidos los equipos, son escasos y el clima es cálido y húmedo. El libro está dividido en tres partes. La primera describe la puesta en marcha de un laboratorio de salud periférico y procedimientos generales de laboratorio, incluyendo el uso de un microscopio y balanzas de laboratorio, centrifugación, medición y dispensación de líquidos, y la limpieza, desinfección y esterilización de material de laboratorio. También son tratados los métodos de eliminación de residuos de laboratorio, el envío de muestras a los laboratorios de referencia y seguridad del laboratorio. En la segunda parte se describen las técnicas para el estudio de diferentes muestras para los helmintos, protozoos, bacterias y hongos. Las técnicas para la preparación, la fijación y tinción de frotis también se discuten. En la tercera y última parte se describe el examen de la orina, líquido cefalorraquídeo y sangre, incluyendo las técnicas basadas en principios inmunológicos y serológicos. Se da para cada técnica, una lista de materiales y reactivos, seguida por una descripción detallada del método y los resultados del examen microscópico. Numerosas ilustraciones se utilizan en todo el libro para aclarar los diferentes pasos. Un resumen de los reactivos necesarios para las diversas técnicas y su preparación se proporciona en el anexo.
M A N U A L O F B A S I C TECHNIQUES
FOR A HEALTH L A B O R AT O R Y 2nd edition
ISBN 92-4-154530-5
9 789241 545303
WHO
World Health Organization Geneva
