Manual Biología Celular y Molecular 2017 2

MANUAL DE PRÁCTICAS

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

Biología Celular y Molecular PRÁCTICAS DE LABORATORIO

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Derechos reservados REPROGEN S.A. CHICLAYO – PERÚ Quinta Edición, 2017 Impreso en Perú

Derechos reservados REPROGEN S.A.

ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

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DATOS DEL ESTUDIANTE

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APELLIDOS Y NOMBRES:

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CÓDIGO DE ESTUDIANTE:

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DIRECCIÓN:

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CORREO PERSONAL:

APODERADO:

Correo crece:

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FACULTAD:

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ESCUELA PROFESIONAL:

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SEMESTRE ACADÉMICO:

CICLO y SECCIÓN:

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TURNO DE PRÁCTICA:

No DE MESA:


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ÍNDICE Pag. ÍNDICE

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PRESENTACIÓN

5

NORMAS, RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA

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1. PRÁCTICA No 1: BIOSEGURIDAD: RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO

8

2. PRÁCTICA No 2: MICROSCOPÍA ÓPTICA: CONSTRUCCIÓN, MANEJO Y FORMACIÓN DE IMÁGENES

19 3. PRÁCTICA No 3: TECNICAS DE COLORACIÓN: OBSERVACIÓN DE CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

25

4. VALORACIÓN PRÁCTICA No PHMÉTRICA 4:

29

5. ACTIVIDAD PRÁCTICAENZIMÁTICA No 5:

34

6. PRÁCTICA No 6: IDENTIFICACIÓN CUALITATIVA DE BIOMOLÉCULAS: CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS Y PROTEÍNAS

40

7. PRÁCTICA No 7:TRANSPORTE A TRAVÉS DE MEMBRANA: FRAGILIDAD OSMÓTICA

52

8. PRÁCTICA No 8: REPRODUCCIÓN CELULAR: MITOSIS EN CÉLULAS VEGETALES

55

REPRODUCCIÓN CELULAR: MEIOSIS EN CÉLULAS ANIMALES 9. PRÁCTICA No 9:

60

10. PRÁCTICA No 10:OBTENCIÓN Y OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS POLITÉNICOS

64

11. PRÁCTICA No 11: OBTENCIÓN Y OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS DE VERTEBRADOS EN PREPARACIÓN DIRECTA

68

12. PRÁCTICA No 12:CONSTRUCCIÓN DE UN MODELO PLANO DEL CARIOTIPO HUMANO

74

13. PRACTICA 13: OBTENCIÓN DE CÉLULAS GAMÉTICAS DEL RATÓN 14. PRÁCTICA NoFECUNDACIÓN: 14: ANÁLISIS DE LÍQUIDO SEMINAL 15. PRÁCTICA No 15:EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDOS VEGETALES Y ANIMALES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


80 85 97 100

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PRESENTACIÓN La Biología constituye una de las disciplinas más importantes en la formación básica de los estudiantes universitarios orientados a las carreras pertenecientes a las Ciencias de la Salud. A pesar del espectacular desarrollo que en los últimos años vienen experimentando las ciencias aplicadas y sus diversas tecnologías, la vigencia y trascendencia de las ciencias básicas se mantiene debido al notable papel que tienen como generadora de conceptos, principios y teorías que configuran el soporte teórico de todo lo tecnológico. En ese sentido el curso deBiología celular y Molecular asume un importante papel en la formación académica de los estudiantes de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Señor de Sipán uniendo dos disciplinas de la Biología, la Biología Celular y La Biología Molecular lo que les permitirá comprender la ultra estructura y fisiología de los seres vivos, de las macromoléculas celulares como las proteínas y ácidosnucleicos en los procesos vitales así como la relación de estos con el entorno. La Biología Molecular representa una de las disciplinas que más se ha desarrollado en los últimos años por haber contribuido a establecer las bases para la comprensión de los tres fenómenos esenciales de los seres vivos: la replicación del ADN, la transcripción, y la traducción. El término biología molecular fue usado por primera vez en 1945 por W. Astbury para referirse al estudio de la estructura química y física de las macromoléculas biológicas. Desde ese año a la actualidad su desarrollo ha sido impresionante habiendo permitido a los investigadores aplicar las técnicas y los métodos lógicos de la genética molecular a temas como la función nerviosa, la estructura de la membrana, la diferenciación celular, la inmunología así como el desarrollo de la Ingeniería Genética. En el curso de Biología Celular y Molecular se produce una permanente interacción entre la teoría y la práctica, pues ésta permite consolidar la información conceptual recibida en el aula a través de la observación, ejecución de protocolos y análisis de experimentos; en ese sentido, el presente Manual de Prácticas de Biología Celular y Molecular pretende ser un instrumento que coadyuve a alcanzar las competencias curriculares en el estudiante a través del desarrollo de actividades, revisiones bibliográficas, revisiones en internet y de evaluaciones en cada sesión práctica. La presente edición del Manual lleva las correcciones y sugerencias observadas en ediciones anteriores, también se han incorporado nuevas prácticas que permitirán ampliar el área de conocimientos del estudiante en esta asignatura. Es nuestro deseo que el presente manual pueda ayudar al estudiante de Medicina Humana en la comprensión teórica y ejecución práctica de la asignatura y en la apertura de investigaciones básicas en el fecundo campo de las ciencias biológicas. Se espera que el esfuerzo desplegado, cumpla su cometido en bien de una óptima formación profesional y una mejor comprensión del papel importante que cumple el estudio de la Biología Celular y Molecular en el campo de las Ciencias de la Salud. Así mismo se esperan las valiosas sugerencias de colegas y estudiantes que permitan el perfeccionamiento de este manual en ediciones futuras. LOS AUTORES


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NORMAS, RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR El trabajo en el laboratorio, requiere la observación de una serie de normas de seguridad, a fin de evitar posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo a una posible negligencia. Quien trabaja en el laboratorio está expuesto a muchos riesgos, pues hay productos químicos que son tóxicos, inflamables, explosivos, corrosivos, carcinogénicos y, a veces, existe el peligro derivado del uso de altos voltajes, de luz ultravioleta y otras radiaciones. I. NORMAS PERSONALES 1. Seguir las instrucciones y recomendaciones dadas por el docente para cada sesión práctica. No manipule muestras, materiales, instrumentos o equipos por su cuenta. 2. Ingresar al laboratorio a la hora señalada, y dentro del tiempo de tolerancia, con el guardapolvo puesto y con el material de trabajo previamente solicitado. 3. Es conveniente la utilización de guardapolvo (mandil) ya que evita que posibles sustancias químicas lleguen a la piel; además, se evita posibles deterioros de las prendes de vestir. El guardapolvo es de uso exclusivo en el laboratorio, hay que sacárselo si se va abandonar el mismo. 4. Si se tiene el cabello largo, es conveniente llevarlo recogido. 5. Durante su permanencia en el laboratorio aproveche y use adecuadamente el tiempo, materiales de trabajo, agua, corriente eléctrica, gas, mobiliario y espacio. 6. No arroje desechos a los lavaderos ni al piso. Procure colocarlos en los tachos correspondientes para que sean descartados una vez finalizada la práctica. En el tacho con bolsa ROJA, se desechan los residuos de materiales biológico (restos vegetales y animales, material contaminado con sangre u otros); en el tacho con bolsa NEGRA se arrojan los desperdicios comunes no contaminados (papeles, plásticos, etc.). 7. Está estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio. 8. Sobre la mesa de trabajo del laboratorio debe de tener solamente el material solicitado y libreta de apuntes. Coloque las carteras, mochilas, libros y otros en los casilleros o en los lugares destinados para ellos. 9. Durante el desarrollo de la práctica observe y grafique con detalle los diversos experimentos, protocolos o vistas microscópicas; intercambie conceptos, ideas y puntos de vista con sus compañeros y profesor. 10. Al término de la práctica el estudiante debe limpiar su mesa de trabajo, lavar el material de vidrio utilizado, lavarse cuidadosamente las manos, despojarse del guardapolvo y retirarse ordenadamente. II. NORMAS DE UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS 1. Antes de utilizar un compuesto químico, asegurarse de que es el que se necesita. 2. No devolver a los frascos de srcen los sobrantes de los productos químicos o medios de cultivo. Si existiese sobrante, desecharlo.


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3. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos, utilizar peras de succión o propipetas. 4. Los ácidos requieren un cuidado especial, cuando haya que diluirlos, nunca echar agua sobre ellos; por el contrario, se debe agregar el ácido sobre agua. 5. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño maría, nunca directamente a la llama. 6. Si se vierte sobre la piel cualquier ácido o producto corrosivo, lavarse inmediatamente con abundante agua y avisar al encargado del laboratorio. 7. Si se preparan soluciones químicas, éstas deben colocarse en un frasco limpio y seco y rotulado convenientemente. III. NORMAS DE UTILIZACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO 1. Tener cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio. 2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frio. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo. 3. Las pipetas usadas deben colocarse en recipientes que contienen una solución desinfectante (mezcla sulfocrómica o bicloruro de mercurio). De la misma manera se procede para tubos de ensayo, láminas cubreobjetos y laminillas. 4. Si se tiene que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, debe considerarse lo siguiente: a) La boca del tubo de ensayo no debe apuntar a ningún compañero de trabajo ni a sí mismo. Puede hervir el líquido y salir disparado, ocasionando un accidente. b) El tubo de ensayo debe calentarse por la parte lateral, nunca por el fondo, agitando suavemente. Todos los que trabajan en el laboratorio, deben saber dónde está el botiquín, las botellas de irrigación de los ojos, y los extintores de incendio.


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PRÁCTICA No 1


BIOSEGURIDAD; RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO

COMPETENCIAS: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Comprende el concepto de Bioseguridad. Conoce los principios y niveles de Bioseguridad yreconoce pictogramas convencionales. Maneja los residuos según lasNormas de Bioseguridad Reconoce los diferentes equipos y materiales de uso común en el Laboratorio de Biología. Describe las características y forma de empleo de los materiales de Laboratorio. Reconoce los riesgos relacionados al uso de equipo y material de laboratorio

I.

INTRODUCCIÓN: En el campo de la salud existen diversos lugares donde el profesional se desempeña, comohospitales, clínicas, postas, centros asistenciales, etc. Sin embargo el laboratorio también constituye un lugar de trabajo, tanto en el campo clínico, educativo, de investigación e incluso de enseñanza, siendo por ello necesario que se conozcan las pautas mínimas necesarias para el normal desempeño dentro de él. Se define como bioseguridad al conjunto de combinaciones específicas (normas) de trabajo, equipo de seguridad y facilidades diseñadas para minimizar la exposición de los trabajadores y el ambiente a los agentes infecciosos; es así que las normas de bioseguridad están destinadas a reducir el riesgo de transmisión de microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas de infección en Servicios de Salud vinculadas a accidentes por exposición a sangre y fluidos corporales, así como también agentes físicos y químicos. Los objetivos de estas normas son: 1. Proteger la salud del personal que pueda estar expuesto a riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos, químicos y físicos. 2. Establecer la conducta a seguir frente a un accidente con exposición a dichos elementos. 3. Participar de las normas de Bioseguridad a todo el personal que directa o indirectamente toma contacto con el laboratorio. NIVELES DE BIOSEGURIDAD TIPOS DE ÁREAS DE TRABAJO: 1. Área contaminada.- Área donde se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: Laboratorios donde se manipulan virus, producción de antígenos etc. 2. Área de tránsito limitado.- Área donde el tránsito está permitido sólo a personas previamente autorizadas, debido a la presencia de agentes microbianos que tienen poca capcidad de causar


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enfermedad al ser humano (Grupo I y II). El acceso del personal administrativo está terminantemente prohibido. 3. Área de tránsito restringido.- Área en las que el tránsito está permitido sólo al personal adecuadamente protegido y autorizado, debido a la presencia de agentes del grupos III (Puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Implican patología grave, de difícil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y ocasionalmente producir la muerte). 4. Área limpia.- Área del laboratorio donde no se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: donde se mantienen los medios de cultivos celulares, se preparan los medios de cultivo y a la vez se realiza la formulación de la vacuna. 5. Área libre.- Área de tránsito libre para todo el personal. Ejemplo: pasadizos comunes, comedor y otras áreas de uso común. MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO Grupo de riesgo

Microorganismo infectante RIESGO 1

Agrupa microorganismos que tienen escaso o nulo riesgo de provocar enfermedades

-

Agrupa a microorganismos que pueden provocar enfermedades humanas de riesgo moderado. Si provoca una infección al personal de laboratorio, ésta tiene tratamiento y cura

-

Agrupa microorganismos que pueden provocar enfermedades humanas graves. Tienen tratamiento,

-

Acanthamoeba Plasmodium Protozoarios Helmintos intestinales

RIESGO 2 Acinetobacter Aeromonas Bordetella Bartonella bacilliformis Clostridium Corynebacterium Entamoeba hystolitica Escherichia coli entoropatógena Leishmania RIESGO 3 Brucella Histoplasma capsulatum Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis

-

-

Treponema pallidum Vibrio Neisseria Salmonella typhi Shigella Yersinia Pseudomonas Sataphylococcus Haemophylus Leptospira Paracoccidiodis brasilensis Taenia solium Trypanosoma cruzi Yersinia pestis

cura y se limita.

RIESGO 4 Agrupa microorganismos que provocan enfermedades graves en el ser humano. No hay tratamiento para su cura.


-

Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) Virus de fiebre hemorrágica Ebola.

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SEÑALES DE SEGURIDAD (PICTOGRAMAS) DE PROHIBICIÓN: Redondas, con pictograma de color negro sobre fondo blanco, con bordes y banda transversal de izquierda a derecha. Ejemplos:

DE ADVERTENCIA: Triangulares, con pictogramas de color negro y fondo amarillo o naranja.

DE SEGURIDAD: Rectangulares o cuadrangulares, con pictogramas de color blanco y fondo verde.

DE ONBLIGATORIEDAD: Circulares y con pictogramas de color blanco con fondo azul.


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GESTIÓN EN MANEJO DE RESIDUOS 1. Generalidades: La gestión de residuos debe ser considerada como una parte importante de la seguridad en los laboratorios. Los desechos que se generan pueden estar contaminados por microorganismos o contener sustancias químicas tóxicas y peligrosas. En menor medida, el personal del laboratorio puede estar expuesto a los efectos de las radiaciones ionizantes. Los casos de infecciones o intoxicaciones en el laboratorio son conocidos lo que obliga a la adopción de medidas de protección para el personal que trabaja en este ámbito. La visión que se pretende dar está sobre todo encaminada a la protección del personal de los laboratorios, no olvidar que las actividades que en ellos se realizan pueden afectar a la salud comunitaria. La mejor manera de racionalizar los residuos es mediante una gestión integrada cuyos pilares básicos son la minimización, segregación y eliminación. 2. Clasificación de los Residuos según su Peligrosidad: Clase A: Residuos Biocontaminados (Peligrosos) Tipo A 1: Atención al paciente. Instrumentos y materiales utilizados en la toma de muestra de sangre, tejidos y otros. Tipo A 2: Material biológico. Tipo A 3: Sangre humana y productos derivados. Tipo A 4: Quirúrgicos y anatomopatológicos. Tipo A 5: Animales contaminados. Clase B: Residuos Especiales Tipo B 1: Químicos peligrosos. Tipo B 2: Farmacéuticos. Tipo B 3: Radioactivos. Clase C: Residuos Comunes: Similares a los domésticos. Incluye a los generados en administración como: cartón, papel, material de oficina, basura orgánica, etc. 3. Manejo de Residuos Sólidos: Las bolsas de recolección de residuos sólidos se deben de diferenciar por colores: Residuos Biocontaminados: Color roja. Residuos Especiales: Color amarilla. Residuos comunes: Color negra. Si los residuos son punzantes o cortantes debe utilizarse recipientes rígidos resistentes a la perforación cuyo volumen no supere los 2 L y que contengan desinfectante (hipoclorito de sodio al 10%), el cual debe ocupar los 2/3 del volumen del recipiente.


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RECONOCIMIENTO DE MATERIALES, INSTRUMENTOS Y EQUIPOS DE LABORATORIO Es necesario que antes de comenzar cualquier trabajo experimental, el alumno conozca el material que se utilizará. Cada uno de los materiales tiene una función y su uso debe ser acorde con la tarea a realizar. La utilización inadecuada de este material da lugar a errores en las experiencias realizadas y aumenta el riesgo de accidentes en el laboratorio. Clasificación: Para clasificar la gran variedad de materiales, instrumentos y equipos, se eligen dos criterios generales para su mejor estudio, y son los siguientes. 1. Por la clase de material empleado en su fabricación. 2. Por su uso específico. I. POR LA CLASE DE MATERIAL EMPLEADO EN SU FABRICACIÓN: A. Material de Madera: Su empleo no muy variado, debido a su fácil destrucción cuando está en contacto con agentes químicos corrosivos. Ejemplo: gradilla para tubos, soportes para embudos, pinzas. B. Material de Vidrio: B.1. Los que pueden ser puestos en contacto directo con la fuente de calor. Ejemplo: matraces, vasos de precipitación, balones, tubos de ensayo, etc. B.2. Los que no pueden ser puestos en contacto directo con una fuente de calor. Ejemplo: buretas, probetas, fiolas, etc. El vidrio es el más importante en la fabricación de materiales de laboratorio, por su resistencia a los agentes químicos, como ácidos, álcalis, sales, etc.; además es empleado por su transparencia, lo que permite observar fácilmente todos los fenómenos que ocurren al realizar un ensayo. El vidrio es una mezcla de silicatos que se encuentran en la naturaleza como minerales de cuarzo, feldespato, arcillas, etc. El vidrio “PIREX” formado por SiO 2, NaO2, CaO, K2O, B2O3 y Al2O, es el de mayor utilidad. C. Material de Arcilla: Se emplea en la fabricación de materiales que sean resistentes a elevadas temperaturas. Ejemplo: crisoles, cápsulas, etc. D. Material de Acero: Es un material de alta resistencia física y viene a ser una mezcla de hierro, cromo, níquel, bronce, latón, carbón, etc. Ejemplo: soporte universal, gradillas, pinzas, bisturí, asa bacteriológica, tenazas, etc. E. Material de Plástico: Estos materiales de resina son muy usados por su bajo costo y fácil manipulación. La resina más empleada es el polipropileno que no es atacado por ácidos ni álcalis. Ejemplo: pisetas.


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II. POR SU USO ESPECÍFICO: 2.1. PARA MEDICIONES: Aquellos destinados para realizar medidas de las diferentes magnitudes, tales como: longitud, masa, volumen, presión, temperatura, tiempo, etc. 2.1.1. MATERIALES PARA MEDICIÓN: 1. PROBETAS GRADUADAS: Son recipientes cilíndricos graduados, de vidrio grueso, con pico y base para poderlos parar, algunos son de plástico o polietileno. Se emplean para medir volúmenes de líquidos cuando no se necesita mucha exactitud. 2. BURETAS: Son tubos largos, cilíndricos y graduados, cuyo extremo inferior termina en una llave de vidrio, o bien lleva un tubo corto de goma que termina con un pico de vidrio; éste último (tubo de goma) se cierra con una pinza. La llave sirve para controlar el flujo de líquido con que se les llena. Se emplea en operaciones en que se necesita medir volúmenes con gran exactitud. Los más comunes son de 10, 25, 50 y 100 mL. 3. PIPETAS: Son construidas de vidrio, destinados a medir líquidos, ya sea en operaciones rutinarias o en aquellos que requieren la mayor exactitud científica. 4. Pipeta volumétrica o aforada : Las que tienen una marca y emiten o transfieren un volumen de líquido definido y en ciertas condiciones específicas. Se construyen para 1, 2, 5, 10, 20, 25 y 50 mL. 5. Pipeta con émbolo o enrase: Están provistas con émbolos que sirven para realizar la succión, éstos se utilizan cuando se emiten volúmenes de ácidos, álcalis y/o soluciones concentradas, en general líquidos corrosivos y tóxicos. 6. Pipetas graduadas: son los que tienen el vástago graduado y se emplean para emitir a voluntad volúmenes diferentes y son útiles para medir volúmenes aproximados de líquidos, no se emplean para mediciones de precisión. 7. CUENTA GOTAS: Son tubos de vidrio cortos, delgados y sesgados donde en uno de los extremos se adapta una perilla o bombilla de goma y en el otro extremo se encuentra estrangulado. Se emplea para la adición de pequeños volúmenes (gotas) de reactivos o sustancias. 8. VASOS DE PRECIPITACIÓN: Son vasos de vidrio que poseen una escala graduada, que permite medir líquidos con aproximación. No es recomendable utilizarlos para este fin en algunos casos. 9. MATRACES DE ERLENMEYER: Son recipientes de vidrio de forma cónica, que disponen una escala graduada, y permiten aproximar volúmenes de líquidos. 10.PAPELES INDICADORES: Son papeles sensibles a determinados reactivos, indican el grado de acidez o alcalinidad de las distintas soluciones. Entre los más comunes disponemos del papel tornasol (azulo rojo), y los papeles indicadores “Universal” que permiten determinar el pH de una solución desde 0 hasta 14 unidades de pH. 2.1.2. INSTRUMENTOS PARA MEDICIÓN: 1. BALANZA: Son instrumentos diseñados para la determinación de masas de diversas sustancias. Entiéndase por masa como una medida de la cantidad de materia. Mientras


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que peso es la fuerza gravitacional de atracción que la tierra ejerce sobre los cuerpos. El tipo más empleado en el laboratorio es la balanza analítica que cuantifica la cantidad de masa de las sustancias con una sensibilidad de 0,1 mg; generalmente la carga máxima de este instrumento varía entre 100 y 200 g. 2. DENSÍMETROS: Llamados también aerómetros, son tubos de vidrio cerrados, de forma especial, con un lastre en su parte inferior para mantenerlos verticales y una escala impresa en papel pegado en su parte interior. Estas escalas están graduadas en diferentes unidades como gravedad o peso específico, grados A.P.I,oBe, hechos para líquidos más o menos pesados que el agua. El densímetro se hace flotar en los líquidos cuya densidad se desea medir y el enrase del menisco de la superficie libre sobre la escala graduada nos dará la densidad respectiva. 3. BARÓMETRO: Es un tubo de vidrio graduado en mm. o cm., que se emplea un líquido como el mercurio, para medir presiones, determina las presiones atmosféricas. 4. TERMÓMETROS: Son instrumentos destinados a medir temperaturas con escalas en grados centígrados o Fahrenheit (oC) o (oF). El tipo más usual en el laboratorio es aquel que tiene graduaciones desde -10 oC hasta 200 oC. 2.2. PARA SEPARACIONES: Aquellos destinados para la separación, purificación de los componentes de una sustancia o mezcla. 2.2.1. MATERIALES PARA SEPARACIÓN: 1. EMBUDOS: a. Simple: Denominados embudos de filtración, existen en distintos ángulos, diámetros y longitud de vástago, también se tienen embudos llanos y estriados. Los últimos para filtraciones rápidas. Con estos embudos se realiza la filtración por gravedad. b. De Buchner: Generalmente son de porcelana, de diferentes tamaños y con vástagos cortos. Poseen agujeros en la parte céntrica sobre los cuales se coloca un papel de filtro, para lograr filtraciones al vacío mediante una trompa de agua o una bomba de vacío. c. De separación: Llamado también “Peras de Bromo”, son de vidrio y tienen un vástago semejante a los embudos corrientes pero con llaves. Sirven esencialmente para agregar un solvente inmiscible y así lograr extracciones de algún compuesto, la separación se realiza abriendo la llave inferior. 2. MATRAZ DE FILTRACIÓN AL VACÍO: Llamado también Kitasato. Es un recipiente de vidrio semejante a los Erlenmeyer con la diferencia que en la parte del cuello posee un orificio lateral. Sobre este se para realizar las filtraciones al vacío conectando la bomba de usa vacíoelenembudo la salidaBuchner lateral del Kitasato. 3. PAPEL DE FILTRO: El papel filtro es un papel utilizado como tamiz que se usa principalmente en el laboratorio para filtrar. Es de forma redonda y este se introduce en un embudo, con la finalidad de filtrar impurezas insolubles y permitir el paso a la solución a través de sus poros. 2.2.2. EQUIPOS PARA SEPARACIONES:


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1. EQUIPO DE SECADO: Se puede utilizar las estufas eléctricas o muflas donde se puede regular la temperatura. 2. CENTRÍFUGAS: Trabajan a altas velocidades para separar un compuesto de menor densidad en una mezcla. 3. DECANTADORES: Entre ellos se encuentran las “peras” o pueden ser simples recipientes. 4. EXTRACTORES: El más conocido es el equipo de extracción SOKHLET que se utiliza para extraer los compuestos solubles a un solvente adecuado y así recuperar el compuesto útil. 5. EQUIPO DE DESTILACIÓN: El equipo consta de un balón, un tubo absorbente y un refrigerante o condensador. El condensador construido de vidrio condensa los vapores que se desprenden del balón por medio de una contracorriente de agua fría. 2.3. MATERIALES PARA MEZCLA, COMBINACIÓN Y REACCIÓN: 1. TUBOS DE PRUEBA: También conocidos como tubos de ensayo, generalmente de vidrio PYREX se emplean para pruebas con pequeñas cantidades de reactivo, siendo su mejor característica la resistencia a los cambios bruscos de temperatura. 2. VASOS DE PRECIPITACIÓN: Son de vidrio de forma cilíndrica con pico, lo cual facilita verter líquidos. Son resistentes al fuego pudiéndose efectuar calentamientos y evaporaciones a presión atmosférica. También se usan para reacciones donde se forman precipitados, pudiendo ser lavados sin complicaciones; para recibir el filtrado de soluciones, titulaciones, etc. Existen desde 50 mL hasta 1000 mL. 3. MATRAZ ERLENMEYER: Conocidos también como vasos o frascos cónicos, su uso más común son para las titulaciones, debido a la facilidad que ofrecen para agitar la solución sin peligro de derrame, también para filtraciones, evaporaciones y ocasionalmente para reacciones. Existen en varias capacidades. 4. BALONES: Son recipientes de cuerpo esférico y con cuello; en ellos se realizan las diferentes reacciones químicas. Los más comunes son los de fondo plano llamados también Matraces de Florencia, con fondo redondo, son de modelo clásico ideales para reacciones con calentamiento y finalmente los balones de destilación. 5. CRISOLES: Son recipientes de forma invertida, con tapa, y de diferentes materiales tales como porcelana, platino, níquel, hierro y material refractario. Se usan para calentamiento a elevadas temperaturas como en calcinación, fusión o disgregación. 6. CÁPSULAS: Son casquetes esféricos de diversos materiales. Pueden exponerse al fuego paraAFORADO concentrar:ySon evaporar. Se disponen conlargo pico yensinelpico. 7. directo FIOLA yOsirven MATRAZ recipientes de vidrioendecápsulas cuello muy cual tiene una marca que indica un volumen exacto a una determinada temperatura, generalmente a 20 oC. Su uso más común es en el análisis cuantitativo y en la preparación de soluciones. 8. LUNAS DE RELOJ: Son discos cóncavos de vidrio de diferentes diámetros. Se usan para tapar los vasos de precipitación y evitar salpicaduras, para evaporar ciertas cantidades de cierto líquido, pruebas de acides, etc.


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9. CRISTALIZADORES: Son recipientes de vidrio de poca altura y base ancha, algunos con tapa, se emplean para formar cristales por evaporación de soluciones saturadas. 2.4. MATERIALES PARA CALENTAMIENTO: Son los predispuestos para producir calor, siendo éste uno de los agentes importantes para la realización de los cambios y muchas reacciones químicas. 1. MECHERO: Aparatos destinados a quemar combustible y el más común es el mechero de BUNSEN, el cual consta de un tubo metálico que se hace girar sobre un anillo, con igual número de agujeros que éste, que sirve para controlar la entrada de aire necesario para la combustión del gas. La temperatura máxima se logra regulando la entrada de aire, de manera que sea algo mayor que la requerida para producir una llama no luminosa. La entrada de gas se regula mediante un tornillo colocado en la base del mechero. 2. HORNOS ELÉCTRICOS: Se utilizan para las operaciones a temperaturas de fundición, o de fusión, o realizar cocimiento de algún producto acabado o en el secado de cerámicos. 3. MUFLA ELÉCTRICA: Es una cámara cerrada hecha de material refractario, produce una temperatura máxima de hasta 1200 oC. Posee una termocupla o termómetro. 4. PLANCHAS ELÉCTRICAS: Se usan en calentamientos y evaporaciones de soluciones. 5. ESTUFAS ELÉCTRICAS: Se emplean para secar precipitados o sustancias sólidas a temperaturas bajas. Alcanzan temperaturas de hasta 300 oC. y cuentan con un termorregulador. 6. BAÑO MARÍA: Medio acuoso con temperaturas de 20 a 80oC. usado para incubar medios enzimáticos y sustancias líquidas. 2.5. MATERIALES PARA SOPORTE O SOSTEN: 1. SOPORTE UNIVERSAL: Consiste de una varilla metálica sujeta a una base de hierro o porcelana. En ella se instalan las nueces y pinzas para soportar buretas, balones, etc. 2. PINZAS: Existen para diferentes usos como: pinzas para crisol, para vasos de precipitación, tubos de ensayo, pesas, pinzas de Mohr, de Hoffman, y para buretas. 3. TRÍPODES: De naturaleza metálica, apoyadas en patas equidistantes soportando un anillo en donde se coloca la malla metálica o con asbesto en operaciones de calentamiento con un mechero de Bunsen. 4. GRADILLAS PARA TUBOS DE ENSAYO : De metal o madera para portar los tubos de ensayo durante el trabajo. 5. NUEZ: De material metálico, también denominado tenaza. Sirve para lograr diferentes instrumentos soportedeuniversal. Pueden ser fijasmayor o giratorias. 6. conexiones REJILLAS: de Mallas metálicasalhechas fierro estañado, los de uso son de 15 x 15 cm. 7. TRIÁNGULO DE PORCELANA: Llamado también triangulo de arcilla, está constituido de dos partes, una de metal y otra de porcelana, se usa para sostener a los crisoles puestos en el trípode en un proceso de calentamiento. 8. ANILLOS DE EXTENSIÓN: Llamados también soporte de anillo, es de estructura metálica, construido de un anillo soldado por una de sus partes a una varilla delgada del mismo material


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y algunos poseen una nuez. Sirve para sostener objetos con alguna parte esférica como: matraz redondo, embudos, etc. 2.6. MATERIALES PARA CONSERVACIÓN: Sirven para el mantenimiento de los reactivos químicos puros, soluciones, muestras, etc. y evitar que éstos sean afectados por agentes contaminantes. 1. FRASCOS: Recipientes de vidrio o plástico, algunos transparentes y otros oscuros acaramelados, que impiden el paso de las radiaciones. Todos los frascos poseen tapón y debe evitarse que éste se contamine. 2. PISETAS: Recipientes que generalmente son de plástico (polietileno), habiendo algunos de vidrio, contienen agua destilada y se emplea para el lavado de precipitados. 2.7. MATERIALES PARA REDUCCIÓN DE TAMAÑO, DISGREGACIÓN Y MOLIENDA: Son aquellos destinados a reducir el tamaño de los cuerpos a partículas y algunas veces ser pulverizados, de acuerdo a los trabajos experimentales que lo requieran. Estos materiales son de acero, porcelana, vidrio u otros. 1. MORTEROS: Son casquetes semiesféricos de base plana, construido de una material duro y resistente al desgaste, consta de dos partes: el mazo, que se llama mano o pilón y el mortero propiamente dicho que es la base donde se opera. 2.8. MATERIALES PARA USOS DIVERSOS: 1. VARILLA DE VIDRIO: Llamadas también agitadores o baguetas. Son varillas sólidas de vidrio de 3, 5, 7 mm. de ancho y de largo conveniente. El largo del agitar está determinado por el tamaño y la forma del recipiente en el que se emplea. Ambos extremos de la varilla deben redondearse en la llama del mechero de Bunsen o de soplete. Sirven para agitar o trasvasar líquidos. 2. ESPÁTULAS: Son instrumentos de forma plana, alargado, de metal y con bordes afilados, provisto de un mango largo de madera, sirven para coger y transportar muestras sólidas o reactivos durante la operación de pesada en la balanza.


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PRÁCTICA No 2


MICROSCOPÍA OPTICA: CONSTRUCCIÓN, MANEJO Y FORMACIÓN DE IMÁGENES

COMPETENCIAS: 1. Reconoce las partes y componentes del microscopio. 2. Identifica los elementos de la nomenclatura de los lentes del microscopio. 3. Explica el funcionamiento del microscopio y su utilidad. 4. auxiliar Valora el del microscopio en la formación académica, investigación, citología y como elemento en uso el diagnóstico. I. INTRODUCCIÓN: La palabra microscopio deriva de las voces griegas micros ( = pequeño y skopein = observar); es un instrumento que permite visualizar cerca y aumentado, cuerpos pequeños y sus detalles estructurales, cuyas dimensiones son inferiores al límite del poder de resolución del ojo humano calculado en 70 - 100 µm (0.1 mm). En el laboratorio es importante conocer la magnificación o el grado de aumento que ha sufrido la imagen del objeto que está siendo observado. Es importante también el poder de resolución del microscopio, es decir, elpoder separar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí. Por ejemplo: Si existen dos puntos separados por una distancia de 0.2 mma más, la vista los distingue por separado, pero si dos puntos presentan una separación de 0.1 mm a menos, la vista lo observará como un solo punto; en cambio el microscopio lo diferenciará por separado. El poder de resolución de un microscopio depende de su abertura numérica y de lalongitud de onda que usa. A menor longitud de onda, mayor poder de resolución. El microscopio compuesto usa dos lentes: lente objetivo con una pequeña distancia focal que le permite generar una imagen invertida y real y una lente ocular. Toda lente presenta dos propiedades ópticas que el estudiante de Biología Celular y Molecular debe diferenciar: apertura numérica, límite de resolución y poder de resolución. 1.1. APERTURA NUMÉRICA (N.A.): Es la capacidad de la lente en dar detalles finos. La apertura numérica (N.A)=n sen u; en donde “n” es el índice de refra cción del medio interpuesto entre el objeto y la lente, mide la cantidad de rayos luminosos que penetran en la lente; y “u” es la apertura angular

de la lente. A mayor apertura numérica de una lente mayor capacidad de la lente de aumentar la imagen. 1.2. RESOLUCIÓN (r): es la distancia entre dos puntos que puede discriminar una lente. (r)= 0,61 λ / NA, en donde “λ” es la longitud de onda de la luz usada (medida en micras o µm, preferentemente) y NA la apertura numérica. Observe que “r” es directamente proporcional a “λ” e inversamente proporcional

a NA. La distancia mínima en que la lente puede discriminar entre dos puntos se denomina límite de resolución. La capacidad de la lente de proporcionar dos imágenes individuales de dos puntos diferentes es el poder de resolución. 1.3. PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO: Se pueden agrupar en cuatro sistemas: El sistema de soporte, el sistema de aumento, el sistema de iluminación, y el sistema de ajuste.


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A. EL SISTEMA DE SOPORTE 1. EL PIE: Es la parte que sostiene al microscopio, asegurando perfecta estabilidad del aparato en posición vertical, inclinada uhorizontal. Presenta diferentes formas siendo lamás común la de herradura. 2. LA COLUMNA, BRAZO O BASTIDOR: Es la parte articulada al pie por medio de una bisagra, sostiene la platina, el tubo óptico, lleva los tornillos macrométrico y micrométrico. Generalmente tiene la forma de un arco, es por donde se toma para su traslado de un lugar a otro. 3. LA PLATINA: Es una plancha metálica colocada en posición horizontal, presenta un orificio en la parte central que permite el paso de luz proveniente del sistema de iluminación. En algunos modelos la platina lleva adherida un par de pinzas que sirven para sujetar la lámina porta-objeto o un carro móvil (charriot) para el desplazamiento del preparado hacia la derecha o izquierda durante la observación. 4. EL REVOLVER: Es un dispositivo metálico de forma circular, atornillado en la parte inferior del tubo óptico, gira sobre su eje central; presenta 3 o 4 orificios a los que van atornillados los objetivos. Este dispositivo sirve para cambiar la posición de los objetivos durante las observaciones. B. EL SISTEMA DE AUMENTO 1.

EL OCULAR. Denominado así porque va cerca al ojo del observador, dispuesto en un tubo cilíndrico de metal, con un diafragma intermedio, ambos lentes presentan las caras planas hacia el ojo del observador y las caras convexas hacia el objeto. La lente que va cerca al ojo del observador se denomina ocular propiamente dicho y la lente inferior como lente de campo; en la parte lateral y superior del tubo cilíndrico lleva una numeración que indica el número de aumento propio del ocular. El más común es el de 10X.

2.

OBJETIVOS. Llamado así porque va cerca del objeto a observar, constituye la parte más importante del microscopio de loscuales depende su alcance. Está constituido por un tubo metálico cilíndrico cónico, que lleva en su interior un sistema de lentes destinados a dar la imagen real e invertida del objeto. a. Objetivos Secos. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el preparado a observar, no existe sustancia alguna, excepto elaire. Se utiliza generalmente paraobservaciones de preparados en fresco. Los más comunes son de 4X, 10X y 40X. b. Objetivos de Inmersión. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el preparado a observar, se interpone una sustancia líquida, comúnmente el aceite de cedro, cuyo índice de refracción es de 1.5; se utilizan generalmente para observaciones de preparados en seco. El más común es el de 100X. De acuerdo a la procedencia lleva una franja o una raya negra o blanca para facilitar su identificación.


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C. SISTEMA DE ILUMINACION: Se encuentra ubicado en la parte inferior de la platina y comprende: 1. Fuente de Luz: Antiguamente estaba constituido por un espejo de forma circular, sujeto por medio de un eje giratorio. Se utilizaba para enviar los rayos luminosos hacia el preparado. Actualmente la mayoría de microscopios compuestos presentan una fuente de luz eléctrica incorporada, constituida por una lámpara de 15 vatios. 2. El diafragma: Es un dispositivo constituido por un sistema de laminillas metálicas dispuestas concéntricamente, de tal forma que permita cerrar y abrir, regulando de esta manera la entrada de luz emitida por el espejo. 3. El condensador: Es un dispositivo constituido, por un sistema de dos o más lentes montadas dentro de un cilindro cónico truncado de metal, está situado por debajo de la platina. Este sistema óptico sirve para concentrar o condensar los rayos luminosos emitidos por el espejo; funciona accionando un tornillo. 4. Porta filtro: Es un dispositivo que permite colocar filtros de diferentes colores, los cuales facilitan la observación. D. EL SISTEMA DE AJUSTE: El sistema comprende: 1.

TORNILLO MACROMETRICO. Se utiliza primero para lograr la aproximación del enfoque. Se encuentra situado en la parte superior o inferior de la columna, permite desplazamiento del tubo óptico y de la platina.

2.

TORNILLO MICROMETRICO. Hace que el objetivo se desplace más lentamente. Se encuentra situado por debajo del macrométrico. En los microscopios modernos, el micrométrico y el macrométrico se encuentran accionados por un solo tornillo.

3.

TORNILLO DE AJUSTE DEL CONDENSADOR. Se utiliza para elevar el condensador y aumentar la iluminación o descenderlo y reducir la iluminación.

4.

TORNILLOS PARA CENTRAR EL CONDENSADOR. Se usan para centrar el condensador exactamente en relación con el objetivo.

5.

ELEVADOR DEL DIAFRAGMA IRIS. Es un pequeño elevador fijado al condensador. Se mueve para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o aumentando así el ángulo y la intensidad de la luz.

6.

REGULADORES DE LA PLATINA METALICA. Se utilizan para desplazar el portaobjeto sobre

la platina (presente en los microscopios mejorados). 1.4. ILUMINACION Y ENFOQUE La iluminación y enfoque son dos condiciones principales para realizar una observación microscópica. La iluminación se consigue utilizando fuentes luminosas adecuadas, que pueden ser: natural o artificial. Los rayos de luz son reflejados por el espejo o por la lámpara de iluminación hacia el objeto o preparado. Cuando se examina con grandes aumentos, la luz debe ser intensa, en cambio cuando se hacen con menores aumentos, la luz debe ser menos intensa, lo que se consigue


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desplazando en forma vertical (arriba o abajo) al condensador, y graduando la abertura del diafragma. Obtenida la iluminación conveniente, se efectuará el enfoque del preparado, utilizando primero el macrométrico hasta encontrar la imagen (enfoque aproximado), y por último accionando el tornillo micrométrico que permite el enfoque perfecto (visualización de la imagen). 1.5. CONDICIONES NECESARIAS PARA LA ILUMINACIÓN Y ENFOQUE: Son las siguientes: 1. 2. 3. 4.

Objetivo a menor aumento (panorámico). Diafragma abierto. Lámpara encendida. Descienda el objetivo hasta que se encuentre inmediatamente por arriba de la preparación que se encuentra en el portaobjetos. 5. Utilizando el tornillo macrométrico eleve el objetivo hasta que observe una imagen clara a través del ocular. 1.6. AMPLIFICACION Cuando se trabaja en el laboratorio con el microscopio, es de gran importancia conocer los grados de aumento o de magnificación de los objetos observados. Así tenemos que, el grado de aumento es la amplificación que ha sufrido la imagen del objeto que está siendo observado. Para obtener la amplificación se multiplica el número de aumento del ocular por el número de aumento del objetivo.

Ejemplo: La lente ocular presenta el número 10X y el número de la lente del objetivo es 4X, el poder de amplificación del microscopio cuando se trabaja simultáneamente con estas dos lentes será de: Amplificación: 10X x 4X = 40 diámetros. 1.7. CUIDADO DEL MICROSCOPIO. El microscopio compuesto es un instrumento muy delicado y de costo muy alto, de allí que se deben seguirse los siguientes cuidados para su uso: 1. 2.

3. 4. 5. 6.

7.

Limpiar los lentes con papel especial, papel de silicona para no rayarlos. Al transportarlo de un sitio a otro se tomará con la mano derecha la columna del microscopio y con la mano izquierda el pie. El instrumento debe ir ligeramente inclinado hacia atrás para evitar la caída de los lentes o filtros. El microscopio se utiliza en posición vertical. Nunca arrastrar el microscopio para desplazar, levantarlo con las dos manos. Al realizar la observación de preparados en fresco, evite que el agua fluya sobre la platina. No colocar los dedos sobre los lentes o el espejo, pues la grasa ocasiona que estos elementos se empañen dificultando la buena visión. Por otro lado, la grasa facilita el desarrollo de microorganismos que deterioran el microscopio. Cuando se use el objetivo de inmersión, procure usar solo una gota de aceite de cedro. Luego de finalizar la observación, limpie el objetivo con xilol o metanol.


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8.


Cuando termine de utilizar los microscopios de luz incorporada, desconecte cuidadosamente los enchufes del tomacorriente. No tire del enchufe para evitar su maltrato.

II. MATERIALES Del alumno

De la Cátedra  Microscopio

compuestoLeica

 Algodón  Alcohol

 Recorte de periódico  Láminas Portaobjetos  Laminillas cubreobjetos.  Tijera  Papel absorbente  50 g. de Levadura de panificación

granulada

III. PROCEDIMIENTO 3.1. EXPERIENCIA 01: FORMACIÓN DE IMÁGENES EN EL MICROSCOPIO 1. Obtener un cuadrado de papel de 01 cm de lado. 2. Dibujar sobre él una flecha de 02 mm de longitud. 3. Colocarlo sobre una lámina portaobjetos; adicionar una gota de agua y cubrirlo con una laminilla. 4. Llevar la muestra al microscopio; observar a menor aumento, y realizar desplazamiento con los otros objetivos, a mediano y mayor aumento. 5. En cada una de las observaciones apreciar la orientación de la flecha de la muestra, respecto a la imagen observada en el ocular. 3.2. EXPERIENCIA 02: PODER DE RESOLUCIÓN DEL MICROSCOPIO 1. De una fotografía de periódico o revista obtener un cuadrado de 01 cm de lado (de preferencia de la parte más coloreada de la imagen). 2. Colocarlo sobre una lámina portaobjetos: adicionar una gota de agua y cubrirla con laminilla. 3. Llevarla al microscopio y observar a menor, mediano y mayor aumento; en cada caso contar el número de puntos que se observa en el campo microscópico. 3.3. EXPERIENCIA 03: PREPARADOS MICROSCÓPICOS EN FRESCO  Observación de Levaduras 1. Suspender la levadura granulada en un beacker con agua destilada. 2. Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar una gota de la mezcla sobre el portaobjeto. 3. Cubrir el preparado con un cubreobjeto. 4. Llevar al microscopio y observar a menor, mediano y mayor aumento con los objetivos en seco. NO USAR EL OBJETIVO DE INMERSIÓN. 5. Esquematizar lo observado tratando que exista proporción entre lo observado y lo esquematizado y que no haya variaciones de forma y color en ambos casos. 3.4. EXPERIENCIA 04: PREPARACIONES MICROSCÓPICAS EN SECO Observación de Levaduras coloreadas


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1. Del preparado realizado en la experiencia 3.3. Realizar una extensión o frotis sobre un portaobjeto. Esperar que esté completamente seco. 2. Agregar el colorante (azul de metileno o cristal violeta), en cantidad suficiente para cubrir el frotis. 3. Dejar en reposo durante 3 minutos y luego lavar con agua destilada. 4. Dejar secar al ambiente. Llevar al microscopio y observar con objetivo de inmersión NOTA: Limpiar y desengrasar bien las láminas antes de utilizar. Para evitar cámaras de aire en la preparación, debe colocar uno de los borde de la laminilla cubreobjetos a un costado de la gota de agua, en un ángulo de 45°, de tal manera que el fluido humedezca por completo el borde de la laminilla para luego dejarlo caer sobre la preparación. V. ACTIVIDADES: Actividad 1: En la siguiente figura del microscopio compuesto. Anote sus componentes indicados.


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TÉCNICAS DE COLORACIÓN: OBSERVACIÓN DE CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

PRÁCTICA No 3 COMPETENCIAS: 1. 2. 3. 4.

Comprende el concepto de colorante. Diferencia a los colorantes deacuerdo a su naturaleza química. Diferencia a los colorantes según lamuestra a colorear. Desarrolla una técnica para coloración de células eucariotas y otra para células

procariotas. 5. Comprende la importancia de la Coloración de Gram como medio de identificación

I.

INTRODUCCIÓN: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores de lo realmente son, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el Sudán III. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente


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habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas. Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente. Preparación de un frotis Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se flamea a la llama del mechero unas tres veces como máximo dejando enfriar dos minutos antes de cada pasada. II. MATERIALES:

Del alumno

De la Cátedra  Microscopio  Set Gram

compuestoLeica

 Láminas Portaobjetos  Laminillas cubreobjetos.

 Colorante Wright

 Lancetas

 Colorante Giemsa

 Rollo de Papel absorbente

para punción capilar

 Colorante Azul de Metileno

 Hisopos

 Colorante Nigrosina o Tinta china

 Mondadientes

 Solución de Sudan III

 50

estériles

g. de Levadura de panificación granulada

 Guantes descartables


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III. PROCEDIMIENTO: 1.1. EXPERIENCIA 01: Coloración simple de Levaduras. 1. Suspender una pequeña cantidad de levaduras granuladas en un beacker con agua destilada y agitar con una varilla de vidrio. 2. Del preparado, realizar una extensión o frotis sobre un portaobjeto. Esperar que esté completamente seco. 3. Agregar el colorante (azul de metileno o cristal violeta), en cantidad suficiente para cubrir el frotis. 4. Dejar en reposo durante 3 minutos y luego lavar con agua destilada, cuidando de no desprender la muestra. Para lo cual el chorro debe ser pequeño y dirigido al extremo de la lámina donde no hay muestra. (Lavado por reflujo). 5. Dejar secar al ambiente. Llevar al microscopio y observar con objetivo de inmersión 1.2. EXPERIENCIA 02: Coloración compuesta: Tinción Gram de sarro dentario. 1. Con ayuda de un mondadientes, extraer una pequeña muestra de sarro y realizar una extensión o frotis sobre un portaobjetos limpio y previamente desengrasado. 2. Fijar la extensión al calor del mechero (de 2 a 3 flameadas). Pasos de la Tinción Gram 3. Colocar la lámina sobre el soporte de coloración. Cubrir el frotis con el colorante cristal violeta y dejarlo en reposo de 1 a 2 minutos. 4. Transcurrido el tiempo, eliminar el exceso de colorante y lavar. La lámina debe estar inclinada, cuidando que el chorro de agua no caiga directamente sobre la muestra si no en un extremo de la lámina. 5. Agregar Lugol hasta cubrir la muestra y dejarlo en reposo de 1 a 2 minutos y luego lavar. 6. Decolorar con Alcohol–acetona, hasta dejar de observar desprendimiento de colorante. 7. Lavar la extensión con agua destilada o de caño. 8. Secar la lámina preferentemente al ambiente o al calor del mechero mediante flameado. 9. Llevar la lámina portaobjetos al microscopio, agregar una gota de aceite de cedro y observar con objetivo de inmersión. 1.3. EXPERIENCIA 03: Coloración Negativa de Levaduras. 1. En un portaobjeto limpio y desengrasado, colocar una gota del colorante Nigrosina o tinta china negra en el centro de la lámina. 2. Colocar asada de la suspensión de Levaduras preparada previamente, y homogenizar haciendouna un frotis. 3. Dejar en reposo hasta que esté completamente seco, si no hubiese tiempo, cubrir con una laminilla y observar al microscopio con objetivo de 40 X. 4. Si está completamente seco agregarle una gota de aceite de cedro y observar con objetivo de inmersión. 1.4. EXPERIENCIA 04: Coloración Neutra


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A. 1. 2. 3.

DE TEJIDO SANGUÍNEO Realizar una extensión o frotis de sangre. Esperar que esté completamente seco. Agregar el colorante Wright en cantidad suficiente para cubrir el frotis. Luego agregar aproximadamente el doble de cantidad de agua destilada o Buffer fosfato por cada gota de colorante. 4. Dejar en reposo durante 5 minutos y luego lavar con agua destilada. 5. Dejar secar al ambiente. Llevar al microscopio y observar con objetivo de inmersión

B. DE EPITELIO LABIAL 1. Con un mondadientes extraer una muestra de mucosa labial y realizar una extensión sobre una lámina portaobjetos. 2. Fijar la muestra al calor del mechero (flameado). 3. Colorear la muestra de 1 a 3 minutos con el coloranteGiemsa. 4. Secar la muestra al ambiente o con ayuda del mechero (flameado). 5. Llevar al microscopio y observar a menor, mediano y mayor aumento (objetivos 4 X, 10X y 40X). Identificar las características celulares. ESQUEMA DE UN FROTIS SANGUÍNEO

Limpiar y desengrasar el portaobjeto.

Dejar secar la extensión y rotular.

Depositar una gota de sangre.

Colocar la lámina extensora en forma perpendicular al portaobjeto.

Desplazar rápidamente y sin detenerse el porta extensor en el sentido de la flecha.

Ubicar el porta extensor sobre la gota de sangre hasta que ésta se distribuya sobre toda su base.

Frotis Sanguíneo listo para ser observado al microscopio con objetivo de inmersión.


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PRÁCTICA No 4


VALORACIÓN PH MÉTRICA

COMPETENCIAS: 1. Define el pH y explica la utilidad de éste en los sistemas biológicos. 2. Utiliza correctamente los diferentes métodos para la determinación de pH y diferencia su utilidad en situaciones prácticas. 3. Explica el funcionamiento de pH metros de sobremesa y de bolsillo. I. INTRODUCCIÓN: El control del pH es de vital importancia en todos los procesos metabólicos celulares puesto que las enzimas tienen una actividad máxima a un determinado valor de pH y declina bruscamente con una mínima variación del mismo. El pH sanguíneo de un individuo sano oscila entre 7.35 y 7.45. Estos límites tan estrechos son esenciales para las funciones metabólicas normales, incluyendo la actividad enzimática, la coagulación sanguínea y la actividad neuromuscular Por esta razón, los seres vivos deben mantener el pH de los fluidos intra y extracelulares a un valor constante, y lo consiguen gracias a sistemas de tamponamiento, por presencia de amortiguadores o buffers. A diario nos encontramos con sustancias (ácidas o básicas) que presentan propiedades muy diversas. Así, por ejemplo, el ácido clorhídrico es altamente corrosivo mientras que el vinagre (ácido acético) no lo es. El zumo de limón (ácido cítrico) presenta un sabor más ácido que una tableta de aspirina disuelta (ácido acetilsalicílico). Ciertas bases, o incluso sales, contrarrestan la acidez del estómago más efectivamente que otras. La mayoría de las disoluciones acuosas son ácidas o básicas. Es muy importante resaltar que la acidez y la basicidad son cualidades relativas, y si una sustancia se comporta como un ácido o una base depende del disolvente. El agua es un importante disolvente que se disocia, en una pequeña extensión en iones H+ y OH-, una propiedad que es importante en reacciones ácido-base. H2O + H2O

H3O+ + OH-

Un amortiguador es un compuesto que tiende a mantener una solución a un pH constante capturando o liberando H+ en respuesta a cambios pequeños en la concentración de H+. Si la concentración de H+ aumenta, los amortiguadores se combinan entre ellos; si la concentración de H+ baja, los amortiguadores liberan H+. El resultado es que la concentración de H+ vuelve a su nivel srcinal. Entre los amortiguadores que pueden hallarse en los organismos vivos están el bicarbonato HCO3- y el fosfato H2PO4- y HPO42-; ambos pueden aceptar o liberar H+ dependiendo de las circunstancias. Si la sangre se vuelve demasiado ácida, por ejemplo, el bicarbonato acepta H+ para formar ácido carbónico: HCO3- + H+ H2CO3 Bicarbonato ión hidrógeno Ácido carbónico


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Si la sangre se vuelve demasiado básica, el ácido carbónico libera iones hidrógeno, los cuales se combinan con iones hidróxido en exceso para formar agua: H2CO3Ácido carbónico

+

OHión hidróxido

HCO3Bicarbonato

+

H2O Agua

En ambos casos el resultado es que el pH de la sangre se mantiene cerca de su valor normal. El intervalo del pH para la sangre arterial se representa así

PH de la orina La orina normal tiene una reacción ligeramente ácida; su pH medio es de alrededor de 6, pero varía en límites amplios de 4.5 a 8.2, lo cual depende en gran parte de la alimentación. Si ésta es exclusivamente a base de carne, el pH disminuye y se elimina orina ácida; mientras que con una dieta a base de vegetales, se produce un aumento del pH y la eliminación de orina alcalina. La variación del equilibrio ácido base de la sangre se manifiesta por modificaciones del pH de la orina. II. MATERIALES: Del alumno

De la Cátedra  Cintas

indicadoras de pH

 Solución Indicadora Universal de  PH metro de Mesa o

de Bolsillo Calibración  3 Gradillas y 10 Tubos de ensayo por mesa  6 vasos de precipitados de 50 y 100 mL  3 pipetas de 10 mL, 3 pipeta graduada de 1 mL  Vasos descartables  Varillas de vidrio  Agua destilada  Solución buffer de pH 7  Cuentagotas de 0,05 M HCl  Cuentagotas de 0,05 M de NaOH  Cubetas de 250 y 60 mL  Lápiz de cera  Tampones de


Muestras de: orina (reciente y sedimentada).  Suero o plasma sanguíneo (obtenido al centrifugar la sangre durante 5 minutos a 2000 rpm).  Saliva (tomarlas en Laboratorio).  Leche materna.  Leche fresca de mamífero. 

PH



1 huevo. Material por mesa de práctica.

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III. PROCEDIMIENTO: Realizar la medición del pH con los métodos disponibles en mesa. 1.1. EXPERIENCIA 01. Determinación del pH en fluidos corporales El intervalo del pH en la sangre arterial compatible con la vida es relativamente estrecho: de aproximadamente 6,8 a 7,8. En el adulto sano, el pH está entre 7,35 y 7,45. El intervalo del pH para la sangre arterial se representa en la imagen anterior. Utilizando muestras de saliva, orina reciente, orina sedimentada (orina que se ha mantenido durante bastantes horas o toda la noche) y suero o plasma sanguíneo, determine el pH de cada solución utilizando los métodos indicados en clase. 1. Colocar cada una de las muestras en tres tubos de ensayo respectivamente (en cada uno de los tubos se aplicará un método de medición del pH). 2. Colocar 5 mL de la muestra de orina reciente y sedimentada en un dos tubos de ensayo respectivamente. Enseguida introducir una cinta de pH, una vez que entre en contacto con la muestra, retirar la cinta, secar la parte no útil de la cinta en un pedazo de papel secante, y proceder con la lectura en el empaque de las cintas de pH. Repetir el procedimiento con el PHMETRO y con la solución indicadora universal. 3. Realizar en mismo procedimiento con las demás muestras biológicas solicitadas. 4. Para la muestra del suero sanguíneo, obtener una muestra de sangre en un tubo de ensayo con o sin anticoagulante, una vez que ha coagulado la sangre, con una varilla de vidrio romper cuidadosamente el coágulo, centrifugar la muestra 5 minutos a 2000 rpm. Con una pipeta obtener el suero y colocar dos gotas sobre una cinta de pH, retirar el exceso en un papel secante y proceder con la lectura en el empaque de las cintas de pH. Registrar los resultados en la presente tabla. 1.2. ENo X P1 E2 R 3 I E4 N5 C6 I A7 8 09 2

MUESTRA

Solución Indicadora

PHmetro

Tira Reactiva

Conclusión

SALIVA ORINA RECIENTE ORINA SEDIMENTADA PLASMA SANGUÍNEO SUERO SANGUÍNEO LECHE MATERNA LECHE DE MAMÍFERO OVOALBÚMINA


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. Efecto de los amortiguadores en las soluciones ácidas y alcalinas. Un aspecto fundamental en la fisiología de todos los organismos es la homeostasis o capacidad para mantener una situación de equilibrio dinámico favorable. En este fenómeno tiene gran importancia los sistemas amortiguadores que equilibran la presencia de sustancias ácidas y básicas para mantener el pH dentro de los límites fisiológicos. Los objetivos de la presente práctica son el conocimiento de conceptos elementales (ácido, base, pH, pK, amortiguador, etc.) así como entender la base química del funcionamiento de los tampones fisiológicos. 1. Sumergir el electrodo en 100 ml de agua destilada y determina el pH. Añadir lentamente con el cuentagotas 0,05 M de HCl en el agua destilada, agitando suavemente el recipiente después de cada gota. 2. Apuntar el número de gotas de HCl añadido para cambiar el pH una unidad. Anotar en qué dirección cambió el pH. 3. Quitar el electrodo de la solución y enjuagarlo con agua destilada. 4. Sumergir el electrodo en la cubeta que contiene una solución de 100 ml de solución buffer de pH 7. Añadir 0,05 M de HCl en forma de gotas del amortiguador. Agitar suavemente después de cada gota. 5. Anotar el número de gotas de HCl añadidas para cambiar el pH del amortiguador una unidad 6. Quitar el electrodo de la solución y enjuagarlo con agua destilada. 7. Sumergir el electrodo en la segunda cubeta de agua destilada. Añadir 0,05 M de NaOH en forma de gotas al agua, agitar suavemente el recipiente después de cada gota. 8. Anotar el número de gotas de NaOH añadidas para cambiar el pH del amortiguador una unidad. qué dirección 9. Anotar Quitar elenelectrodo de la cambió soluciónely pH. enjuagarlo con agua destilada. 10. Sumergir el electrodo en la segunda cubeta de solución buffer de pH 7. Añadir 0,05 M de NaOH en forma de gotas en el amortiguador, agitando suavemente después de cada gota. 11. Anotar el número de gotas de NaOH añadidas para cambiar el pH del amortiguador una unidad. Registrar y discutir los resultados obtenidos.

ANEXO 1: PATRÓN DE LECTURA DE PH CON SOLUCIÓN INDICADORA UNIVERSAL


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MANUAL DE PRÁCTICAS 1.3.


CUESTIONARIO: Responda lo que se le solicita. a. ¿Por qué el Ph de las diferentes soluciones varía según el método utilizado? b. ¿Cuál crees Usted es el mejor método para calcular el pH de las soluciones? ¿Por qué? c. ¿Qué factores pueden afectar el valor de pH de la soluciones?

1.4.

CASO CLÍNICO: Mujer latinoamericana de 15 años de edad es llevada a la sala de urgencias en estado comatoso. Sus familiares comentan que durante todo el día viene sufriendo de náuseas y vómitos y que hace un rato ha perdido el estado de conciencia. También comentan que la paciente no había ingerido alcohol o cualquier otro tipo de drogas. Al efectuar el examen físico el médico de guardia aprecia que la paciente presenta:  Respiración profunda y rápida.  Aliento a frutas.  Piel y mucosas secas. Se solicita un análisis bioquímico y hematimetría. A la recepción de los análisis de laboratorio, el médico puede destacar los siguientes datos  Potasio 5,9 mmol/L (3,5-5,1 mmol/L)  Cloruro 80 mmol/L (98-106 mmol/L)  pH 7,10 (7,35-7,45)  PCO2 29 mm Hg

(34-35 mmHg)

 Glucemia 695 mg/dl (80-120 mg/dL)  Cetonemia 5+ (0)  Glucosuria 3+ (0)

Preguntas: 1. A partir de los datos del laboratorio y de una forma razonada indique: ¿Qué trastorno presenta la paciente? 2. ¿Por qué se produce una cetoacidosis? 3. ¿Cuáles son los tres cuerpos cetónicos formados? 4. ¿Por qué disminuyen el bicarbonato y la presión de CO2?


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PRÁCTICA No 5


ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

COMPETENCIAS: 1. 2. 3. 4.

I.

Explica el principio de la actividad enzimática Utiliza sustratos específicos para demostrar actividad de las enzimas. Reconoce la influencia de factores físicos que afectan la actividad enzimática. Determina gráficamente el efecto de la enzima catalasa.

INTRODUCCIÓN: Las enzimas son proteínas específicas, que actúan como catalizadores de las reacciones químicas en todos los seres vivos. La actividad enzimática puede comprobarse experimentalmente mediante la identificación y cuantificación de los productos formados en la reacción que ellas regulan. La acción de estos compuestos proteicos en una reacción, se ve afectada por la variación de factores físicos y químicos como la temperatura, concentración de la enzima y del sustrato, el pH, etc. La catalasa (peroxidasa o peróxido de hidrógeno oxidorreductasa) es una de las enzimas más abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente distribuida en los organismos eucariotas y algunos procariotas, aunque su actividad varía en dependencia del tejido en cual se encuentra; ésta resulta más elevada en el hígado y los riñones, más baja en el tejido conectivo y los epitelios, y prácticamente en el tejidodonde nervioso. A nivel celular se citosol. localiza en mitocondrias y losmetaloproteína peroxisomas, excepto en losnulaeritrocitos, se encuentra en el Estalasenzima es una tetramérica, cuyo peso molecular se encuentra en el rango de 210-280 kD. Consta de 4 subunidades idénticas que se mantienen unidas por interacciones no covalentes. Cada subunidad contiene un grupo prostético de protoporfirina IX, el contenido protohémico y el de hierro representan un 1,1 % y 0,09 % respectivamente del peso molecular total de la enzima. El peróxido es un producto de la actividad celular (radical libre srcinado en la respiración celular) y al acumularse en exceso intoxica la célula por lo cual debe ser degradado por la enzima específica. La reacción en la cual interviene la catalasa se presenta de la siguiente manera: 2H2O2

Catalasa

2H2O + O2

Esta reacción puede visualizarse por la formación de burbujas, las cuales se producen debido al desprendimiento de oxígeno. La cantidad de burbujas es una medida cualitativa proporcional a la intensidad de la reacción y puede utilizarse para evaluar la dinámica de la reacción. La amilasa salival, denominada también ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene un pH de 7. Cuando uno de estas glándulas se inflama aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre.


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El sustrato de la amilasa es el almidón, es el polisacárido de reserva más abundante en vegetales y constituye la principal fuente de nutrición glicídica para la humanidad. Los almidones estánconstituidos por una mezcla de dos componentes:  α-amilosa: cadena lineal de unas 200 unidades de D-glucosa unidas por enlaces α (1→4).  amilopectina: cadena lineal de D-glucosas unidas por enlaces tipo α (1→4) con numerosas ramificaciones α (1→6). El polímero contiene unas 1000 unidades de glucosa.

La proporción en que se mezclan la α-amilosa y la amilopectina para formar el almidón depende de la especie vegetal en que aparece el almidón. Una de los enzimas que hidrolizan el almidón es la amilasa, que se halla presente en el jugo pancreático y la saliva. Este enzima ataca al azar los enlaces α (1→4) del interior de la cadena. Así, rinde finalmente unidades de glucosa libre y maltosa. La amilasa no ataca los enlaces α (1→6), base de las ramificaciones de la amilopectina. Estos enlaces pueden ser hidrolizados por otro enzima desramificador. La ptialina o amilasa salival es una proteína enzimática presente en la saliva. Como todo enzima, la acción que ejerce sobre su sustrato (almidón) depende de una serie de parámetros: pH, temperatura, concentración de enzima. En esta práctica se intenta ver el efecto que sobre la actividad enzimática presentan esta serie de factores. II.

MATERIALES: De la Cátedra  Solución Indicadora Universal  20 Tubos de ensayo por mesa.  3 Gradillas  6 vasos de precipitados de 50 mL  3 pipetas de 10 mL  Pinzas de madera  Baño María  Varillas de vidrio  Embudos  Pisetas  Solución diluida de almidón.  Lugol.  Reactivo de Fehling.

III.

Del alumno  100 g de almidón.  6 vasos descartables.  Hielo (500 g por mesa). Llevar al laboratorio apenas se llega a la universidad para preservar en congelador.  1 caja de fósforos o 1 encendedor.  1 plumón marcador indeleble negro.  1 tallo de apio  1 rábano (pequeño)  1hígado de pollo  1 corazón de pollo ¡Todo el material es por mesa de práctica!

PROCEDIMIENTO: 3.1. EXPERIENCIA 01. Obtención de la enzima Amilasa Salival 1. Tras enjuagar la boca, se mastica un trozo de papel de filtro para estimular la salivación. Los líquidos segregados se van pasando a un embudo con un filtro humedecido colocado sobre un tubo de ensayo, hasta recoger la suficiente cantidad de saliva para realizar la práctica. 2. La saliva así obtenida se diluye 1:10 con agua destilada, obteniendo así la preparación de enzima base.


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3.2. EXPERIENCIA 02. Efecto del pH sobre la actividad de la Amilasa Salival 1. Tomar tres tubos de ensayo y añadir respectivamente: TUBO 1

TUBO 2

TUBO 3

HCl 0.1N

2 mL

NaOH 0,1N

2 mL

Agua Destilada

2 mL

Almidón 2%

2 mL

Almidón 2%

2 mL

Almidón 2%

2 mL

Saliva Diluida 1:10

2 mL

Saliva Diluida 1:10

2 mL

Saliva Diluida 1:10

2 mL

2. Agitar bien y medir rápidamente el pH de cada tubo. Para medir el pH, se toma una gota de la disolución con una varilla limpia y seca y se humedece con ella un trocito de papel indicador de pH, comparando el color obtenido con el de la escala. 3. Los tres tubos se colocan en un baño maría a 37ºC durante 15 minutos, dejando que la amilasa vaya hidrolizando al almidón. Una vez transcurridos los 15 minutos, se sacan los tubos y se efectúan las pruebas del Lugol y de Benedict. 4. Prueba del Lugol: permite identificar la presencia de almidón que con este reactivo da un color azul-violeta característico. Tomar 1 ml de muestra de cada uno de los tubos y añadirle unas gotas de la disolución de lugol. Si la actividad enzimática de la amilasa no se ve afectada, catalizará la hidrólisis del almidón y por tanto la prueba del lugol será negativa. 5. Prueba de Benedict: permite identificar a los azúcares reductores, obtenidos por hidrólisis del almidón, que con esta prueba dan una coloración rojiza (el almidón no tiene poder reductor). Tomar 1 ml de muestra de cada uno de los tubos y seguir el protocolo para la reacción de Benedict en la práctica de azúcares. 6. COMPARAR y DISCUTIR los resultados de la actividad de la amilasa a los diferentes pH. Deducir el pH en el cual la enzima es más activa. 3.3. EXPERIENCIA 03: Influencia de la Temperatura en la velocidad de reacción de la Amilasa Salival 1. Preparar 8 tubos: cuatro de ellos con 2ml de almidón 2% y los otros cuatro con 2 ml de saliva diluida 1:10. 2. Colocar dos tubos, uno conteniendo almidón y el otro saliva, a cada una de las cuatro temperaturas siguientes (marcar cada pareja de tubos según la temperatura a la que se ensaya):  En baño de hielo (O ºC, si se añade un poco de agua al hielo enfría más; cuidar que los tubos no vuelquen)  A temperatura ambiente ( 20 ºC)  En baño maría a 37 ºC.  A ebullición en baño maría (100ºC). 3. Mantener así los tubos durante 15 minutos para que alcancen la temperatura del experimento. 4. Añadir al tubo que contiene el almidón el contenido del tubo que tiene la saliva, agitar bien y dejar que siga a su temperatura correspondiente. Empezar a contabilizar el tiempo (los tubos deben mantenerse bien inmersos en los respectivos baños para que la acción de la amilasa tenga lugar


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a las temperaturas indicadas). Transcurridos 1, 2, 3, 4, 6 y 8 minutos coger una muestra de 0,5 ml de cada tubo y ponerla en la placa de pocillos ( si no hubiese utilizar una microplaca o tubos de ensayo de 13 x 75 mm) según el esquema adjunto: 5. Añadir a cada muestra unas gotas de reactivo de Lugol. Una vez realizada la prueba ANALICE los distintos cambios de color observados y la razón de estos. Cuando el almidón está hidrolizado no produce ningún cambio de color a la solución de lugol (punto acromático). El tiempo necesario para alcanzar tal punto da idea de la actividad de la enzima. La inversa de dicho tiempo equivale a la velocidad de la reacción enzimática. NOT A : Pr eparación de la A milas a salival (ptialina) Después de enjuagarse la boca, masticar un trozo de papel filtro para estimular la salivación. Los líquidos segregados se van pasando a un embudo que tenga un papel filtro, el filtrado se coloca en un tubo de ensayo hasta obtener 1 ml. La saliva así obtenida se diluye empleando 1mL de saliva y 10 mL de agua destilada, así se obtiene la preparación de la enzima base.

3.4. EXPERIENCIA 04. Medición de la acción enzimática de la catalasa 1. Coloque en cuatro tubos de ensayo 2 ml de agua oxigenada y 8 mL de agua destilada. Registre la temperatura en uno de ellos y anótela. 2. Monte un dispositivo como el de la Figura (Manómetro) 3. Al primer tubo agregar un trozo de tallo de apio de 1 g y realice las lecturas. Procure que el trozo sea compacto, no lo fragmente. Tapar el tubo y sellar con Parafilm cuidadosamente todas las uniones para evitar fugas y mida la producción de oxígeno por elevación de la solución coloreada en el brazo del manómetro que no está conectado a la manguera. Marque el punto inicial en el papel milimétrico inmediatamente después de tapar el tubo. Efectúe 10 mediciones a intervalos de 10 seg. 4. Seguir el mismo procedimiento descrito en el punto tres, colocando antes de hacer las lecturas en el segundo tubo un trozo de 1 g de rábano, y en el tercero y cuarto 1 g de, hígado y corazón respectivamente. Debido a que la velocidad de reacción en los tejidos animales es se sugiere hacer las mediciones con intervalos de 10 seg para los tejidos vegetales y de mayor, 5 seg para los tejidos animales. IV. RESULTADOS 1. Calcular el total de moles de oxígeno producidos para cada muestra con la siguiente fórmula: PV = nRT. Despejar para obtener número de moles: n = PV / RT; donde: V = Volumen V = πr2h, r = Radio (del tubo del manómetro), h = Altura máxima alcanzada por la

solución coloreada (ver última medición en la tabla del punto 2), P = Presión atmosférica P = 0.769


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atm., R = Constante universal de los gases R= 82 atm cm3 / mol °K, T = Temperatura absoluta (°K) T = °C + 273, n = Moles. 2.

Llenar la siguiente tabla con los datos obtenidos de las mediciones realizadas: x = Tiempo en segundos y = Altura en mm APIO X (seg)

RÁBANO Y

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

X (seg)

HÍGADO Y

X (seg)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

CORAZÓN Y

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

X (seg)

Y

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

3.

Graficar tiempo contra distancia (los datos de la tabla del punto 2) en un solo papel milimétrico (con un color diferente para cada muestra). 4. Al graficar los datos obtenidos de manera experimental observará que estos siguen una distribución semejante a una línea recta, sin embargo, dado que seguramente no se ajustan en su totalidad a ella, se utiliza el método de mínimos cuadrados, el que permite con los datos obtenidos calcular una ecuación con la que se calculan los valores teóricos, que se ajustarán en forma perfecta a una recta. Además, la ecuación permitirá calcular puntos intermedios (interpolación) o externos (extrapolación) a los medidos experimentalmente. Para aplicar el método de mínimos cuadrados es necesario que dé inicio llene la siguiente tabla con los datos obtenidos experimentalmente para cada muestra, y que calcule los valores que se le solicitan: x = Tiempo en segundos y = Altura en mm. APIO N 1 2 3

X 10 20 30

45 6 7 8 9 10 N=10

40 50 60 70 80 90 100 Ʃx = 550


Y

Ʃ

y

XY

X2

xy

Ʃ 2

Ʃ

x

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MANUAL DE PRÁCTICAS 5.


Utilizando los datos de la tabla anterior substituya en las siguientes ecuaciones los valores calculados:

El valor de la pendiente (m) es una estimación de la velocidad con la que ocurre cierto fenómeno, en esta práctica indicará la velocidad con la que se produce oxígeno al reaccionar la catalasa de los peroxisomas con el peróxido de hidrógeno. Finalmente para obtener la ecuación de la recta substituya los valores de m y b obtenidos en la siguiente ecuación: y = mx + b 6. Utilizando la ecuación de la recta obtenida en el punto anterior para cada una de las muestras, obtenga los valores teóricos de “y” substituyendo cada uno de los valores de “x” que utili zó durante el desarrollo de la práctica y grafique estos valores teóricos en el mismo papel con los valores experimentales (gráfica deldiferentes punto 3) muestras. para compararlos. Analice sus resultados comparando las pendientes obtenidas en las Con base en sus resultados y tomando como guía los siguientes enunciados, redacte la discusión de la práctica: 1. Explicar a qué se debe la diferencia en cuanto al desprendimiento de oxígeno en los tejidos estudiados: Para definir en qué muestras se desprendió mayor cantidad de oxígeno, utilice el número de moles producidos en cada una de ellas. 2. ¿Podría el valor de la pendiente indicar en qué muestras se desprende más oxígeno? 3. Explicar la utilidad del método de mínimos cuadrados en estudios biológicos. 4. En la gráfica, ¿Qué diferencias observó entre los valores teóricos y los experimentales? ¿A qué se deben estas diferencias?


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PRÁCTICA No 6


IDENTIFICACIÓN CUALITATIVA DE BIOMOLÉCULAS CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS y PROTEÍNAS

COMPETENCIAS: 1. Identifica la presencia de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos, mediante reacciones de coloración específicas. 2. Valora el rol que desempeñan las reacciones de coloración en la determinación práctica de carbohidratos. 3. Comprueba algunas propiedades de los lípidos, como solubilidad, emulsificación, saponificación y coloración. 4. Realiza experiencias para demostrar la coagulación de las proteínas. 5. Reconoce mediante reacciones de coloración la presencia de proteínas en muestras biológicas I.

INTRODUCCIÓN: La composición química de los seres vivos es muy diferente a la de la materia inanimada, y aunque presentan diferencias muy significativas entre las distintas especies, también muestra muchas semejanzas en todos los organismos. Los elementos químicos presentes en los seres vivos se denominan bioelementos, y se suelen clasificar en macroelementos (C, H, O y N), cada uno de los cuales aparece en una proporción superior al 5% del peso seco de la materia viva y en total constituyen aproximadamente el 90% la biomasa; (Ca, P, yK,oligoelementos S, Cl, Na y Mg), que varían el 0,3 el 5% seco de y suponen casimicroelementos el 10% de la biomasa; o trazas (B, F,entre Fe, Co, Cu,y Mn, Zn,del Mo,peso I, entre otros), que están presentes en cantidades muy pequeñas. Estos bioelementos suelen formar parte de moléculas, denominadasbiomoléculas, que pueden ser de naturaleza orgánica o inorgánica. Entre las inorgánicas están el agua, aniones (cloruros, fosfatos, carbonatos, etc.), cationes (sodio, potasio, calcio, amonio, etc.) y algunos gases como el O 2 y el CO2. Entre las biomoléculas orgánicas destacan los carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos, y sus correspondientes constituyentes básicos, y metabolitos como el piruvato, el 2oxoglutarato, el malato, etc. Para el reconocimiento de biomoléculas orgánicas, se utilizan diversas técnicas sencillas que pueden ser utilizadas para determinaciones cualitativas así como cuantitativas. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS Algunos tienen la propiedad en presencia de agentes oxidantes el ion 2+. Esta característica Fe3+ o Cuazúcares radicadeenoxidarse la presencia de un grupo carbonilo libre, elsuaves cual escomo oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo carbonilo libre son llamados azúcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se encuentra combinado en unión glicosídica se conocen como azúcares no reductores. Existen varias reacciones químicas que permiten determinar si se está en presencia de un azúcar reductor o no.


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La prueba de Benedict es una de ellas y se basa precisamente en la reacción o no de un azúcar con el ion Cu2+. El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato de sodio. El Na2CO3 confiere a la solución un pH alcalino necesario para que la reacción pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu2+ en solución ya que tiene la propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados con algunos de los metales pesados. Con el cobre produce un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo una solución de azúcar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullición, el azúcar en solución alcalina a elevadas temperaturas se convertirá en D-gluconato y enediol, rompiéndose luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos, reaccionarán con el Cu++. Se obtiene entonces un azúcar oxidado y dos iones Cu+. Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH- presentes en la solución para formar el hidróxido de cobre: Cu+ + OH - → Cu (OH) (precipitado amarillo) El hidróxido pierde agua 2Cu (OH) → Cu2O (precipitado rojo ladrillo) + H2O

La aparición de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azúcar reductor. Una secuencia que permite hacer el reconocimiento y diferenciación de carbohidratos. Ensayo de Benedict: El ensayo de Benedict: permite el reconocimiento de carbohidratos reductores, al igual que el reactivo de Fehling, el de Benedict contiene ion cúprico en medio alcalino que se reduce

hasta óxido cuproso en presencia de azúcares con el hidroxilo hemiacetálico libre.Ensayo con Lugol: El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer polisacáridos, particularmente el almidón por la formación de una coloración azul - violeta intensa y el glicógeno y las dextrinas por formación de coloración roja. Ensayo de Seliwanoff: Este ensayo es específico para cetosas y se basa en la conversión de la cetosa en 5-hidro-metil-furfural y su posterior condensación con resorcinol formando así complejos coloreados. II.

MATERIALES: De la Cátedra

Del alumno

 Soluciones

 Muestra

 Reactivo de Seliwanoff  Alcohol etílico

 50 mL. de jugo de

patrón de: Galactosa, Glucosa, Fructosa y Lactosa (al 1%).  Reactivo de Fehling y de Benedict

de orina de paciente diabético (por mesa de práctica).  Muestra de orina normal (por mesa de práctica).

uva, naranja, y piña.

 Ácido Nítrico

concentrado  Solución de hidróxido de sodio al 10%.  Solución de Lugol


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III.


PROCEDIMIENTO: Los azúcares constan de un esqueleto carbonado que porta un grupo carbonilo (Aldehído o cetona) y varios grupos hidroxilo. En esta práctica se entregan cuatro disoluciones problema de azúcares al 5%. Pueden ser cualquiera de los siguientes: glucosa, galactosa, sacarosa, lactosa o fructosa.La práctica consiste en identificar de qué azúcares se trata. Para ello se utilizan diversaspruebas que reconocen determinadas propiedades de los azúcares. El que una prueba sea positiva o negativa nos informará acerca de las propiedades del azúcar. A continuación se muestra un esquema de cómo pueden irse identificando losazúcares con las diferentes pruebas. En ciertos casos es bueno efectuar varias pruebas similares para asegurar aún más el resultado positivo a negativo de la prueba, que si nose realiza con precisión podría dar resultados erróneos. ESQUEMA DE IDENTIFICACIÓN DE AZÚZARES ( – ) No azúcar

Benedict

( – ) No Reductor: Sacarosa (hidrólisis y Seliwanoff). ( – ) Disacárido: Lactosa (Hidrólisis y Barfoed).

Ensayo de Molish

Barfoed ( + ) Azúcar

Braun ( + ) Monosacárido

Seliwanoff (–)

( + ) Reductor Fehling

( + ) Fructosa ( + ) Galactosa

Espejo de plata

Tollens ( – ) Glucosa

3.1. EXPERIENCIA 01. Determinación Cualitativa de la Glucosa (Poder reductor) A. METODO DE FEHLING 1. En un tubo de prueba colocar 2ml. de una disolución de glucosa al 5%, agregar 2ml. del reactivo de Fehling, calentar 2 minutos a ebullición (Control positivo) 2. En otro tubo de prueba colocar 2 ml. del reactivo de Fehling y 0,5 ml de orina de paciente diabético, calentar 2 minutos a ebullición. 3. Si el material contiene glucosa, se reduce la sal de cobre y se observa un precipitado de óxido cuproso de color rojo, anaranjado o amarillo Fundamento de la reacción: En medio alcalino, el cobre procedente del CuSO4 se encuentra en forma de hidróxido cúprico, y se forma la correspondiente sal Na 2SO4. Cuando el Cu (OH)2 (de color azul) se calienta en presencia de un compuesto reductor se forma óxido cuproso (de color rojo ladrillo). Si hay un compuesto reductor, el Cu cambia su estado de oxidación de (2+ a 1+), lo que se evidencia por el cambio de color.


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B. METODO DE BENEDICT 1. En un tubo de prueba colocar 2ml. de una disolución de glucosa al 5%, agregar 2ml. del reactivo de Benedict, calentar 2 minutos a ebullición (Control positivo). 2. En un tubo de prueba colocar 2 a 3 ml. del reactivo de Benedict y de 5 a 6 gotas de orina de paciente diabético. Calentar a ebullición durante 2 minutos y dejar enfriar. 3. Si el material contiene glucosa, observar un precipitado rojo ladrillo, amarillo o verdoso, de acuerdo con la proporción en que se halla presente. 3.2. EXPERIENCIA 02. Determinación Cualitativa de la Fructosa REACCION DE SELIWANOFF: La fructosa aparece juntamente con la glucosa y da las mismas reacciones; para diferenciarlas puede emplearse la reacción de Seliwanoff. Esta se basa en la formación de un precipitado de color rojo cuando la levulosa se calienta en una solución fuertemente ácida de resorcina, por la formación de OXIMETILFURFUROL. Soluciones patrón de carbohidratos: FRUCTOSA Y GLUCOSA. 1. En un tubo de prueba colocar 2ml. de una solución de fructosa al 5%, agregar 2ml. del reactivo de Seliwanoff, calentar 2 minutos a ebullición (Control positivo). 2. En un tubo de prueba colocar 0,5 ml de orina (u otro material) y 5 ml. de reactivo de Seliwanoff, calentar a ebullición durante 20 segundos, observar el color del líquido y si se forma o no un precipitado. 3. Si se forma un precipitado rojo, decantar el líquido sobrenadante y agregar 5 ml. de alcohol etílico (95°). Mezclar y observar la coloración del alcohol. 4. La reacción es positiva cuando aparece color rojo y se separa un precipitado rojo después de calentar a ebullición. El precipitado tiene que disolverse en el alcohol y dar éste un color rojo vivo. 3.3. EXPERIENCIA 03: Determinación Cualitativa del Almidón PRUEBA DEL LUGOL: En solución acuosa, la amilosa forma estructuras helicoidales lineales y la amilopectina ramificadas, gracias a la formación de puentes de H entre los grupos OH de la glucosa y las moléculas de H2O. Si a una disolución de almidón se le añade Yodo (I), esta toma un color azul violáceo Estalascaracterística es específica del almidón,dedebido a su estructura, debe adsorciónintenso. del I por cadenas helicoidales, especialmente la amilosa. Por tanto ynose es unaa la reacción química, sino una interacción física reversible por métodos físicos. Método: 1. Colocar en un tubo de ensayo 2 mL de la solución 1 y en otro 2 mL de la solución 2 (Una de ellas contiene almidón y la otra agua destilada).


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2. Añadir a cada uno de los tubos de ensayo 1 gota de Lugol (solución acuosa de iodo y ioduro potásico). Observar el resultado. 3. Comprobar que es una interacción física, calentando a la llama el tubo que contiene almidón (teñido de azul con I), hasta que desaparezca el color azul. Enfriar el tubo y observar la aparición de nuevo de color azul. 3.4. EXPERIENCIA 04: Hidrólisis ácida de un Disacárido En el caso de que la disolución problema de azúcar fuese sacarosa o lactosa se hace una comprobación. En primer lugar se hidroliza el disacárido en sus componentes (sus dos monosacáridos) mediante una hidrólisis ácida. Método: 1. En un tubo de ensayo limpio añadir:  Disolución problema 1 mL  HCl 0,1N 1 mL 2. Hervir durante 1 minuto. 3. Realizar las diferentes pruebas para determinar sus componentes. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LÍPIDOS Los lípidos son biomoléculas orgánicas formadas por C, H y Opudiendo contener además N, P yS. Son un grupo muy heterogéneo de moléculas aunque tienen en común las siguientes propiedades: Son insolubles en agua, pero solubles en disolventes orgánicos, es decir, no polares, como el éter, cloroformo, benceno, acetona y son poco densos. Son un grupo heterogéneo de compuestos, de naturaleza anfipática, es decir que contienen regiones hidrofóbicas y regiones hidrofílicas. La mayor parte de los lípidos abundan en la naturaleza bajo la forma de triacilgliceroles, están formados por ácidos grasos de cadenas hidrocarbonadas pares, saturados o insaturados. Los lípidos llevan a cabo múltiples funciones en el organismo, como: almacenamiento de energía, de transporte, hormonal, actúan como vitaminas, forman parte de las membranas celulares confiriéndoles la propiedad de permeabilidad selectiva. Algunas de las propiedades de los lípidos pueden ser usadas para su reconocimiento, ya que pueden reaccionar con una variedad de agentes srcinándose productos coloreados, desprendimiento de vapores, formación de jabones, entre otros. Una de las clasificaciones de los lípidos es la que se da en dos grandes grupos, atendiendo a que posean en su composición ácidos grasos (Lípidos saponificables) o no lo posean (Lípidos insaponificables). Ácidos grasos: Los ácidos grasos son moléculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada de tipo lineal, y con un número par de átomos de carbono. Tienen en un extremo de la cadena un grupo carboxilo (-COOH). Se conocen unos 70 ácidos grasos que se pueden clasificar en dos Grupos: 

Los ácidos grasos saturados sólo tienen enlaces simples entre los átomos de carbono. Son ejemplos de este tipo de ácidos el mirístico (14C); el palmítico (16C) y el esteárico (18C).


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MANUAL DE PRÁCTICAS 


Los ácidos grasos insaturados tienen uno o varios enlaces dobles en su cadena y sus moléculas presentan codos, con cambios de dirección en los lugares donde aparece un doble enlace. Son ejemplos el oleico (18C, un doble enlace) y el linóleo (18C y dos dobles enlaces).

Propiedades de los ácidos grasos Solubilidad. Los ácidos grasos poseen una zona hidrófila, el grupo carboxilo (-COOH) y una zona lipófila, la cadena hidrocarbonada que presenta grupos metileno (-CH2-) y grupos metilo (-CH3) terminales. Por eso las moléculas de los ácidos grasos son anfipática, pues por una parte, la cadena alifática es apolar y por tanto, soluble en disolventes orgánicos (lipófila), y por otra, el grupo carboxilo es polar y soluble en agua (hidrófilo). Desde el punto de vista químico, los ácidos grasos son capaces de formar enlaces éster con los grupos alcohol de otras moléculas. Cuando estos enlaces se hidrolizan con un álcali, se rompen y se obtienen las sales de los ácidos grasos correspondientes, denominados jabones, mediante un proceso denominado saponificación

Lípidos simples: Son lípidos saponificables en cuya composición química sólo intervienen carbono, hidrógeno y oxígeno. Acilglicéridos, son lípidos simples formados por la esterificación de una, dos o tres moléculas de ácidos grasos con una molécula de glicerina. También reciben el nombre de glicéridos o grasas simples. Según el número de ácidos grasos, se distinguen tres tipos de estos lípidos:   

Los monoglicéridos, que contienen una molécula de ácido graso Los diglicéridos, con dos moléculas de ácidos grasos Los triglicéridos, con tres moléculas de ácidos grasos.

Los Acilglicéridos frente a bases dan lugar a reacciones de saponificación en la que se producen moléculas de jabón. Las Ceras: Son ésteres de ácidos grasos de cadena larga, con alcoholes también de cadena larga. En general son sólidas y totalmente insolubles en agua. Todas las funciones que realizan están relacionadas con su impermeabilidad al agua y con su consistencia firme. Así las plumas, el pelo, la piel, las hojas, frutos, están cubiertas de una capa cérea protectora. Una de las ceras más conocidas es la que segregan las abejas para confeccionar su panal. Lípidos complejos: Son lípidos saponificables en cuya estructura molecular además de carbono, hidrógeno y oxígeno, hay también nitrógeno, fósforo, azufre o un glúcido. Son las principales moléculas constitutivas de la doble capa lipídica de la membrana, por lo que también se llaman lípidos de membrana. Son también moléculas anfipática. Fosfolípidos: Se caracterizan por presentar un ácido ortofosfórico en su zona polar. Son las moléculas más abundantes de la membrana citoplasmática. Glucolípidos: Son lípidos complejos que se caracterizan por poseer un glúcido. Se encuentran formando parte de las bicapas lipídicas de las membranas de todas las células, especialmente de las neuronas. Se sitúan en la cara externa de la membrana celular, en donde realizan una función de relación celular, siendo receptores de moléculas externas que darán lugar a respuestas celulares.


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Terpenos: Son moléculas lineales o cíclicas que cumplen funciones muy variadas, entre los que se pueden citar: Esencias vegetales como el mentol, el geraniol, limoneno, alcanfor, eucaliptol, vainillina, Vitaminas, como la vit.A, vit.E, vit.K, Pigmentos vegetales, como la carotina y la xantofila. Esteroides: Son lípidos que derivan del esterano. Comprenden dos grandes grupos de sustancias, los esteroles (como el colesterol y las vitaminas D) y las Prostaglandinas Funciones de los lípidos: Los lípidos desempeñan cuatro tipos de funciones: 1. Función de reserva. Son la principal reserva energética del organismo. Un gramo de grasa produce 9'4 kilocalorías en las reacciones metabólicas de oxidación, mientras que proteínas y glúcidos sólo producen 4'1 kilocaloría/gr. 2. Función estructural. Forman las bicapas lipídicas de las membranas. Recubren órganos y le dan consistencia, o protegen mecánicamente como el tejido adiposo de pies y manos. 3. Función biocatalizadora. En este papel los lípidos favorecen o facilitan las reacciones químicas que se producen en los seres vivos. Cumplen esta función las vitaminas lipídicas, las hormonas esteroideas y las prostaglandinas. 4. Función transportadora. El transporte de lípidos desde el intestino hasta su lugar de destino se realiza mediante su emulsión gracias a los ácidos biliares y a los proteolípidos. I.


Del alumno

 Reactivo de Hübl

 100 mL de aceite (de cualquier tipo).

 Cloroformo  NaOH al 20%.  Solución alcohólica de SUDAN III

 50 mL de aceite de oliva.  Un huevo para extraer yema.  Traer material que contenga algún

 Éter etílico.  Tubos de Ensayo  Beaker de diferentes volúmenes.  Pinzas de madera.  Mecheros Bunsen

II.

lípido de

interés (mantequilla)  Tinta china roja.  100 mL de bencina o éter.  Marcador indeleble.

PROCEDIMIENTO: 2.1. EXPERIENCIA 01. Prueba de Iodo a. En un tubo de ensayo colocar 1 ml (1 gr) de la sustancia problema. b. Agregar 1 ml. de Cloroformo c. Adicionar 1 gota de reactivo de Hübl d. Mezclar y observar. Reacción (+) desaparición del color del Yodo. Esperar 5’ para ver la reacción. La positividad de esta reacción indica la presencia de ácidos grasos de la serie etilénica. La reacción positiva se manifiesta por la desaparición del color del Yodo, debido a que se enlaza en el doble enlace presente en el lípido.


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REACTIVO DE HUBL: Disolver 26 gr de yodo en 500 ml de alcohol del 95%. Disolver 30 gr de cloruro de mercurio II (bicloruro de mercurio, cloruro mercúrico) en 500 ml de alcohol del 95%. Mezcle las dos soluciones y filtre si es necesario. Como se deduce el reactivo de Hübl está formado por yodo en alcohol (con bicloruro de mercurio como catalizador). El yodo se fija sobre la cadena carbonada de los ácidos grasos etilénicos a razón de dos átomos por cada doble ligadura, por lo tanto el reactivo se decolora al perder yodo (mientras el ácido graso lo gana). 2.2. EXPERIENCIA 02. Prueba de Saponificación a. Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%. b. Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María a 60 oC de 20 a 30 minutos. c. Pasado este tiempo, observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite inalterado. Fundamento: Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicas (lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina.

Es una prueba general para identificar ácidos grasos en los lípidos que los contienen. Los jabones se define químicamente como, las sales metálicas de los ácidos grasos superiores.


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2.3. EXPERIENCIA 03: Prueba de coloración de Lípidos a. Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite. b. Añadir a uno de los tubos de 4 – 5 gotas de solución alcohólica de Sudán III. c. Al otro tubo añadir 4– 5 gotas de tinta china roja. d. Agitar ambos tubos y dejar reposar. e. Observar los resultados: en el tubo con Sudán III todo el aceite tiene que aparecer teñido, mientras que en el tubo con tinta, ésta se irá al fondo y el aceite no estará teñido. Fundamento: Los lípidos se colorean selectivamente de rojo-anaranjado con el colorante Sudán III.

2.4. EXPERIENCIA 05: Prueba de Solubilidad a. Colocar 2ml de aceite en dos tubos de ensayo. b. Añadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de éter u otro disolvente orgánico, c. fuertemente ambosSe tubos d. Agitar Observar los resultados: veráy dejar cómoreposar. el aceite se ha disuelto en el éter y, en cambio no lo hace en el agua y el aceite subirá debido a su menor densidad. Fundamento: Los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que, por su menor densidad, se sitúa sobre el agua. Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgánicos, como el éter, cloroformo, acetona, benceno, etc. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE PROTEÍNAS Las proteínas son biomoléculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. Se consideran polímeros de aminoácidos y que constituyen, por tanto, su unidad monomérica. Los aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos. La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido; si el número de aminoácidos que forma la molécula no es mayor de 10, se denomina oligopéptido, si es superior a 10 se llama polipéptido y si el número es superior a 50 aminoácidos se habla de una proteína.


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Por tanto, las proteínas son cadenas de aminoácidos que se pliegan adquiriendo una estructura tridimensional que les permite llevar a cabo miles de funciones. Las proteínas están codificadas en el material genético de cada organismo, donde se especifica su secuencia de aminoácidos, y luego son sintetizadas por los ribosomas. En animales superiores, las proteínas son los compuestos orgánicos más abundantes, pues representan alrededor del 50% del peso seco de los tejidos. Desde el punto de vista funcional, su papel es fundamental pues no existe proceso biológico alguno que no dependa de la presencia y/o actividad de este tipo de sustancias; las proteínas cumplen diferentes funciones: enzimas, hormonas, trasportadores, anticuerpos, receptores de muchas células, etc. Si bien hay ligeras variaciones en diferentes proteínas, el contenido de nitrógeno representa, en término medio, el 16% de la masa total de la molécula, lo cual permite calcular la cantidad de proteína existente en una muestra, por medición del nitrógeno de la misma. Debido a su gran tamaño, cuando se dispersa a estas moléculas en un solvente adecuado, forman obligadamente soluciones coloidales. Por medio de la hidrólisis, las proteínas son escindidas en los aminoácidos y cientos o miles de aminoácidos pueden participar en la formación de una proteína. Los aminoácidos, como ya hemos comentado, son materia prima de proteínas y péptidos que cumplen diferentes funciones en nuestro organismo, no obstante, también pueden utilizarse como materia prima del metabolismo energético, de hecho, alrededor del 30% de los aminoácidos, pasan a una ruta metabólica que, después de eliminar el nitrógeno de la molécula, envía los productos desaminados al ciclo de Krebs. Todas las proteínas poseen una misma estructura química central, que consiste en una cadena lineal de aminoácidos. Lo que hace distinta a una proteína de otra es la secuencia de aminoácidos de que está hecha, a tal secuencia se conoce como estructura primaria de la proteína. La estructura primaria de una proteína es determinante en la función que cumplirá después, así las proteínas estructurales (como aquellas que forman los tendones y cartílagos) poseen mayor cantidad de aminoácidos rígidos y que establezcan enlaces químicos fuertes unos con otros para dar dureza a la estructura que forman. Sin embargo, la secuencia lineal de aminoácidos puede adoptar múltiples conformaciones en el espacio que se forma mediante el plegamiento del polímero lineal. Tal plegamiento se desarrolla en parte espontáneamente, por la repulsión de los aminoácidos hidrófobos por el agua, la atracción de aminoácidos cargados y la formación de puentes disulfuro y también en parte es ayudado por otras proteínas. Así, la estructura primaria viene determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados y la forma en que se pliega la cadena se analiza en términos de estructura secundaria. Además las proteínas adoptan distintas posiciones en el espacio, por lo que se describe una tercera estructura. La estructura terciaria, por tanto, es el modo en que la cadena polipeptídica se pliega en el espacio, es decir, cómo se enrolla una determinada proteína. Así mismo, las proteínas no se componen, en su mayoría, de una única cadena de aminoácidos, sino que se suelen agrupar varias cadenas polipeptídicas (o monómeros) para formar proteínas multiméricas mayores. A esto se llama estructura cuaternaria de las proteínas, a la agrupación de varias cadenas de aminoácidos (o polipéptidos) en complejos macromoleculares mayores. Los enlaces que determinan la estructura primaria son covalentes (enlace amida o enlace peptídico), mientras que la mayoría de los enlaces que determinan la


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conformación (estructuras secundaria y terciaria) y la asociación (estructura cuaternaria y quinaria) son de tipo no covalente. Las proteínas se pueden clasificar según el esquema a continuación. I.


Del alumno

 Material

 Material Biológico: clara de Huevo  Muestre de leche de vaca (en tarro

de vidrio: Tubos de ensayo, Gradilla, Varillas de vidrio, Mechero, Vasos de precipitados,Ácido Pipetas, etc.concentrado, Hidróxido nítrico de sodio a 40 %, Hidróxido de sodio al 20 %. Sulfato cúprico al 1 %, Acetato de plomo al 5 %, Reactivo de Biuret, alcohol.

 Reactivos:

II.

o fresca)

y leche materna. sanguíneo (se extraerá en el laboratorio).  Marcador indeleble.  Suero

PROCEDIMIENTO: 2.1. EXPERIENCIA 01. Coagulación de Proteínas 1. Colocar en un tubo de ensayo 3 ml. de clara de huevo diluida (también se puede utilizar suero sanguíneo), llevar a baño maría y observar. 2. En un segundo tubo colocar 3 ml de clara de huevo diluida y añadir 2 ml de alcohol etílico, observar los resultados. FUNDAMENTO Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones coloidales que pueden precipitar formándose coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a 70 °C o al ser tratadas con soluciones ácidas, salinas, alcohol, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados que al actuar sobre la proteína la desordenan por destrucción de sus estructuras secundaria y terciaria. 2.2. EXPERIENCIA 02. Reacción de Biuret. 1. Tomar un tubo de ensayo y colocar unos 3 mL de ovoalbúmina, realizar la prueba también con una muestra de leche. 2. Añadir 2 mL del Reactivo de Biuret. 3. Observar una coloración violeta-rosácea característica. FUNDAMENTO La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción de Biuret. El 4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o reactivo Biuret contiene CuSO KOH). Ladereacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H 2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.


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Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da una coloración violeta característica. 2.3. EXPERIENCIA 03. Reacción de los aminoácidos azufrados. 1. Colocar en el tubo de ensayo de 2 a 3 mL de ovoalbúmina y en otro de 2 a 3 mL de leche. 2. Añadir 2 mL de solución de hidróxido de sodio al 20%. 3. Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%. 4. Calentar el tubo hasta ebullición 5. Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos sirve para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre FUNDAMENTO Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo. III.

ACTIVIDADES: 1. Explique dos diferencias fundamentales entre hemoglobina adulta y hemoglobina fetal.

2. La hemoglobina es una proteína alostérica. Explique porqué.


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PRÁCTICA No 7


TRANSPORTE A TRAVÉS DE MEMBRANA: FRAGILIDAD OSMÓTICA


I.

Demuestra la fragilidad osmótica de los eritrocitos. Comprueba la resistencia globular máxima (RGM) yla resistencia globular mínima (RGm). Comprende las variaciones de la fragilidad eritrocitaria en estados patológicos. Demuestra experimentalmente y fundamenta los procesos físicos de la materia viva.

INTRODUCCIÓN: La ósmosis se refiere al movimiento de agua (solvente) a través de una membrana, de una solución de concentración menor a una de concentración mayor. Cuando se suspenden hematíes en una solución hipotónica de cloruro sódico estos absorben agua, se hinchan, adquieren una forma esférica y se hacen más frágiles produciendo una hemólisis. El aumento de la fragilidad que conduce a la lisis se determina por dos factores principales: es inversamente proporcional a la concentración de cloruro sódico y directamente proporcional al grosor de los hematíes. Una membrana eritrocitaria normal, tanto en estructura como en función es esencial para la vida de la célula. Compuesta de proteínas y lípidos, la membrana trilaminar tiene por función conservar la forma discoide normal de la célula, permitir su deformidad y de tener una permeabilidad selectiva, es decir permitir el paso de agua pero también restringir el de ciertos solutos iónicos como sodio, potasio, y cloro principalmente. Las anormalidades hereditarias en la malla proteica esquelética de la membrana eritrocitaria pueden reducir su estabilidad y flexibilidad, favorecer la perdida de fragmentos y desviar a la célula de su forma discoide natural. La prueba de fragilidad osmótica mide la resistencia de los eritrocitos a la hemólisis frente a condiciones de tensión osmótica que dependen del volumen de la célula, el área de superficie y la función membranal. La prueba de fragilidad osmótica mide la resistencia de los eritrocitos a la hemólisis frente a condiciones de tensión osmótica que dependen del volumen de la célula, el área de superficie y la función membranal. Cuando el eritrocito se incuba en un medio hipertónico, pierde agua y se deshidrata .Cuando se incuba en un medio hipotónico, se ve favorecida la entrada de agua y su hidratación. Los eritrocitos se incuban en soluciones hipotónicas de cloruro de sodio de varias concentraciones. Cuando la concentración de cloruro de sodio disminuye, los eritrocitos captan agua en un esfuerzo por lograr el equilibrio osmótico. La célula reduce se hincha hasta formar el esferocito. La captación adicional de agua crea una membrana porosa que deja escapar líquido y luego estalla, liberando la hemoglobina (hemólisis). Las células normales empiezan a hemolizarse a concentraciones de NaCl de 0.5%.La hemólisis es completa más o menos a 0.3 % de NaCl. Debido a la proporción superficie/volumen menor, los esferocitos no pueden expandirse tanto como el eritrocito discoide normal .Tienen mayor permeabilidad en su membrana, lo que contribuye con su fragilidad. Por lo tanto la lisis empieza con concentraciones más altas de NaCl y es completa a 0.5 – 0,4 % de NaCl .Se dice que las células tienen una fragilidad osmótica


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aumentada. Por lo contrario, una célula aplanada o delgada absorbe cantidades consideradas de agua y requiere concentraciones menores de cloruro de sodio para destruirse, por lo tanto tienen una fragilidad osmótica disminuida. La célula que más se aproxima a la forma esférica o redonda (el esferocito de la esferocitosis hereditaria) tiene un volumen muy pequeño para su contenido y su capacidad de expansión está limitada. Por consiguiente estalla al absorber pequeñas cantidades de agua a concentraciones relativamente altas de sal. Su fragilidad osmótica está aumentada. En cambio la célula delgada o aplanada de la anemia hipocrómica absorbe cantidades considerables de agua y requiere concentraciones menores de cloruro de sodio para destruirse. Su fragilidad osmótica está disminuida y su resistencia aumentada. La prueba de fragilidad osmótica es valiosa para el diagnóstico de diferentes tipos de anemias y trastornos en los que se alteran las propiedades físicas de la membrana eritrocitaria. Este procedimiento debe ser parte de un perfil hematológico para establecer un diagnóstico definitivo. Una fragilidad aumentada se encuentra en la esferocitosis hereditaria y en las anemias hemolíticas idiopáticas y sintomáticas adquiridas en las que exista una tendencia a la esferocitosis. Por el contrario, una fragilidad osmótica disminuida o una resistencia aumentada denota aplanamiento excesivo de los hematíes; esto se observa cuando existe ictericia en las anemias sideropénicas, talasemia, anemia de las células falciformes, policitemia vera, en las hepatopatías, después de una esplenectomía y en varias anemias en las que se encuentra hematíes en forma de diana. En la talasemia una parte de los hematíes queda a veces sin disolver en una solución salina al 0,3% e incluso en agua destilada. Dado a que los eritrocitos se destruyen continuamente en el cuerpo, correspondiendo a ciertos estados patológicos una destrucción muy acelerada y por lo tanto anemia; es de gran interés práctico averiguar si la hemólisis excesiva depende principalmente de una mayor fragilidad de los eritrocitos.

II.

MATERIALES: De la Cátedra  Centrífuga  Tubos de ensayo  Aguja hipodérmica.  Agua destilada  Ligadura, algodón  Heparina  Soluciones de Cloruro

Del alumno  Muestras de sangre.  1 ovillo de Hilo pabilo.  1 rollo de papel de aluminio.  1 ampolla de heparina sódica.

Sódico (0.10%, 0.20%, 0.30%, 0.35%, 0.40%, 0.45%, 0.50%, 0.55%, 0.60%, 0.65%, 0.70%, 0.75%, 0.80%, 0.85%).


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MANUAL DE PRÁCTICAS III.


PROCEDIMIENTO: 3.1. EXPERIENCIA 01: Fragilidad osmótica de los Eritrocitos. 1. Medir de 8 a 10 mL de cada una de las soluciones de cloruro de sodio en tubos de ensayo y rotularlos con las concentraciones que contienen. 2. Añadir a cada tubo 0,1 mL (8 gotas) de sangre heparinizada del paciente. 3. Mezclar bien el contenido de los tubos (por inversión cuatro veces). 4. Dejar en reposo los tubos durante 20 minutos, y volver a mezclar. 5. Inmediatamente después centrifugar todos los tubos a 2000 rpm. Durante 5 minutos. 6. Sacar los tubos, colocarlos en una gradilla y observar la hemólisis inicial y la hemólisis total. Fundamento de la prueba Si una membrana es permeable al soluto, provocará la lisis celular. La razón de ello es que el soluto penetra por difusión al interior de la célula, provocando la entrada de agua y ruptura final de la membrana. El tiempo que tarde en producirse la lisis será inversamente proporcional a la permeabilidad de la membrana para el soluto en cuestión. La resistencia globular se refiere a la resistencia de los eritrocitos de no hemolizarse cuando se les pone en medio hipotónico con respecto al plasma, cuya concentración decrece de 0,6 a 0.5% aproximadamente. La Resistencia globular máxima, es la que se registra en la solución más hipotónica (0,34 – 0, 26%), en la que la hemólisis es total. La resistencia globular mínima es la que se registra en la solución menos hipotónica, en la cual el tinte rojizo indica el comienzo de la hemólisis (0,48 – 0,42). IV. RESULTADOS: 3.2 EXPERIENCIA 01. Pinte los tubos según el resultado obtenido después de la centrifugación e indique a qué concentración de cloruro sódico correspondió cada tubo.


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PRÁCTICA No 8


REPRODUCCIÓN CELULAR: MITOSIS

COMPETENCIAS: 1. Reconoce y diferencia los estados fisiológicos por los que atraviesa la cromatina durante la división celular. 2. Diferencia las diferentes etapas por las que pasa la célula durante la mitosis. 3. Valora la importancia de la división celular mitótica.

I. INTRODUCCIÓN: La multiplicación celular por mitosis es un proceso propio de las células somáticas o células que forman SOMA o CUERPO de un organismo, que no han perdido su condición de EMBRIONARIAS o MERISTEMATICAS. Recurren a esta división los organismos en etapas de crecimiento, regeneración, reorganización de partes, cicatrización y a nivel de reproducción unicelular en etapas de expansión poblacional. La mayor parte de las células eucarióticas se reproducen a intervalos regulares para generar nuevas células hijas que contienen los materiales distribuidos de la célula srcinal. La distribución de los materiales nucleares, particularmente de los CROMOSOMAS, se denomina MITOSIS. Estos procesos forman parte de una larga secuencia de eventos conocida como CICLO CELULAR. CICLO CELULAR.- El ciclo celular puede ser considerado como una serie de fenómenos mediante los cuales el material hereditario se duplica y se distribuye en las células hijas. La división celular es sólo la fase final y microscópicamente visible de un cambio a nivel molecular. Antes de que la célula se divida por mitosis, sus principales componentes ya se han duplicado o sintetizado. En este aspecto, la división celular puede considerarse como la separación final de las unidades moleculares previamente CHICLAYOduplicadas. - PERÚ 2014 - II El ciclo celular comprende los siguientes acontecimientos: INTERFASE Y DIVISION CELULAR; la Interfase es el periodo que más dura durante la vida de la célula. Hay una intensa actividad biosintética, durante el cual se duplica el ADN (ácido desoxirribonucleico). La interfase se divide en tres períodos: G1, S y G2; siendo la fase S la de síntesis o replicación del material hereditario, y en la cual se forman ciertas proteínas asociadas a los cromosomas. ANALISIS DE LA MITOSIS .- En 1882 FLEMING describió con el nombre de MITOSIS los distintos cambios que experimenta el núcleo durante su división para transformarse en dos núcleos hijos. La división nuclear, también llamada CARIOCINESIS (Schleiger 1878) es seguida de la división del citoplasma o CITOCINESIS (Whitman 1887). Por el hecho de que las células que constituyen el cuerpo o soma se multiplican por Mitosis, se denomina división celular somática. En el proceso de división se hallan dos componentes fundamentales que constituyen la división mitótica: El aparato cromático, formado por los cromosomas, y el aparato acromático, constituido por los centros o Polos y el Huso.


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Las distintas fases o etapas de la mitosis son parte de un ciclo que se inicia con el final del periodo intermitótico o INTERFASE o INTERCINESIS y termina con el comienzo de la nueva interfase. Desde el punto de vista fisiológico cabe distinguir entre núcleo interfásico, que se encuentra entre dos ciclos mitóticos, y la interfase de las células que han perdido la condición de dividirse. La mitosis comprende una serie consecutiva de etapas conocidas como: PROFASE, METAFASE, ANAFASE Y TELOFASE. Es costumbre subdividir cada una de estas fases para identificar con más detalle los distintos momentos del proceso, designándolos por ejemplo, en fase inicial o temprana, media o final. PROFASE: En esta etapa la célula tiende a adoptar una forma esférica y su refringencia y viscosidad aumentan. Los cromosomas aparecen como delgados filamentos (CROMONEMAS) longitudinales u ovillados en la esfera nuclear. Cada cromosoma profásico se compone de dos filamentos en espiral denominados CROMÁTIDAS, que se hallan en íntima relación en toda su longitud y que son el resultado de la replicación que tuvo lugar en el periodo S. A medida que avanza la profase, las cromátidas se acortan y aumentan de espesor. Esta condensación ocurre al parecer mediante un proceso de espiralización y plegamiento. Con el aumento de espesor de los cromosomas, la región del centrómero, que luego será la constricción primaria, está más acentuada. A medida que trascurre la profase, los cromosomas que se hallan distribuidos al azar en el núcleo, tienden a acercarse al borde de la membrana nuclear, dejando un espacio libre en la cavidad central del núcleo. Este movimiento centrífugo de los cromosomas es indicio de que se acerca la desintegración de la membrana nuclear y con ella el fin de la profase. Mientras tienen lugar estos procesos en el núcleo, en el citoplasma se forma el Huso acromático. La aparición del mismo está relacionado con los dos pares de centriolos; cada par está rodeado por un ASTER compuesto de microtúbulos que irradian en todas direcciones el llamado: HUSO CENTRAL. Los centriolos se desplazan en sentido contrario junto con los ásteres siguiendo un trayecto semicircular hacia los polos hasta situarse en posiciones opuestas. También puede haber otra formación de Huso denominado HUSO METAFASICO, en que los centriolos se hallan polarizados antes de que comience la división. METAFASE: Alcanzada la máxima contracción ycondensación, durante las cuales la longitud delos cromosomas puede llegar a ser hasta 25 veces menor que la que tenían en la profase temprana, estos cromosomas se disponen radialmente en el plano ecuatorial de la célula, en la periferia del huso, como si se rechazaran entre sí. Cuando hay cromosomas pequeños en el complemento, estos se disponen generalmente en el centro y los grandes en la periferia del huso. Ordenados los cromosomas en el huso y vistos desde los polos forman la PLACA ECUATORIAL que es la etapa más favorable para determinar su número, morfología y dimensiones. Los centrómeros hijos y las cromátidas se separan y se inicia la migración polar anafásica. Las fibras del huso conectadas con los cromosomas toman nombre de fibras cromosómicas, y las que se extienden de polo a polo el de fibras continuas. ANAFASE: A partir de este estadio, las cromátides, ahora denominadas cromosomas hijos, se separan. Durante el anafase final ocurre un cambio en el aspecto del huso. En la zona situada entre los dos grupos anafásicos, las fibras se extienden y constituyen las FIBRAS INTERZONALES. Los


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crornosomas metafásicos asumen forma de y, los acrocéntricos y los telocéntricos tienen aspecto bastoniforme. Los microtúbulos de las fibras del huso se acortan de un tercio a un quinto de su longitud srcinal, al mismo tiempo que las fibras continuas aumentan su longitud. TELOFASE: Los cromosomas hijos anafásicos continúan su migración hacia los polos hasta confluir en sendos núcleos telofásicos. Se desespiralizan los cromosomas y luego sigue la reconstrucción nuclear en un proceso similar que en cierto sentido recapitula la profase en sentido inverso. Aparece el carioplasma entre los cromosomas y se reconstruye la membrana nuclear alrededor de los núcleos hijos. Reaparecen los NUCLEOLOS en las regiones del organizador nucleolar, observándose en ciertos casos un remanente del huso interpuesto entre los dos núcleos telofásicos. La alta viscosidad que caracteriza a la metafase y anafase disminuye. Cesa la actividad de los centriolos y los ásteres son menos visibles. CITOCINESIS (Clivaje Celular): La citocinesis consiste en la división del citoplasma, que comienza al final del anafase y termina con la telofase. Se realiza por estrangulamiento de la célula madre en la zona ecuatorial. En este proceso participa un mecanismo contráctil a nivel de la corteza celular (ANILLO CONTRACTIL). Esto se logra mediante un sistema de microfilamentos de naturaleza proteica de ACTINA Y MIOSINA. Al final de la telofase, la constricción se profundiza hasta llegar al cuerpo intermedio, el anillo contráctil desaparece dando como resultado la separación de las células hijas. Evidentemente todo el material cromosómico durante la mitosis sufre una división exacta de tal manera que las nuevas células así formadas contendrán la carga cromosómica total presente en la célula srcinal que las formó; es decir hay un reparto equitativo de cromosomas y de los constituyentes citoplasmáticos en las células hijas. Toda división mitótica conduce a la creación de estirpes celulares en las cuales todas las células tienen núcleos de idéntico genotipo, que contienen el mismo número de cromosomas. La meiosis es otro tipo de división celular mediante la cual el número de cromosomas es reducido a la mitad (reducción aparente), implicando una sola duplicación cromosómica y dos divisiones nucleares; tiene lugar en el transcurso de la gametogénesis, asegurándose de este modo la constancia del número de cromosomas, toda vez que el huevo o cigoto, resulta de la fecundación de los gametos masculino y femenino con un número de cromosomas representado por (n) cromosomas (haploide), cuya función srcina el cigoto con (2n) cromosomas (diploide). Los meristemos vegetales, particularmente los deAllium cepa “cebolla” (2n=16), representan un excelente material para el estudio de la división celular, dado que hay de un 10 al 15% de células en mitosis, y por mostrar un crecimiento constante. Por ejemplo a 15° C. en 24 horas. Crece el meristemo 1mm. Se puede obtener el porcentaje de células en mitosis o índice mitótico en una población de células meristemáticas; así como también los índices de fase para hacer evaluaciones de la división a través de tratamientos de diversa índole.


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II. MATERIALES:

III.

De la Cátedra

Del alumno

 Microscopio

Compuesto con sistema de videocámara.  Pinzas de punta fina.  Luna de Reloj.

 Bulbos

 Bisturí  Colorante Orceína acética al 2%  Mecheros de alcohol  Papel de filtro  Algodón  Láminas portaobjeto  Laminillas cubreobjeto  Ácido clorhídrico 1N.

 Papel secante.  Lápiz con borrador

de

Allium

cepa

“cebolla”

preparados con cinco días de anticipación en casa, con meristemos en crecimiento. en uno de sus

extremos.  Mondadientes.

PROCEDIMIENTO: 3.1. EXPERIENCIA 01. Mitosis en meristemos de Allium cepa “cebolla”. EN CASA: 1. Colocar un bulbo de cebolla y limpiar el extremo por donde se srcinan las raíces. Asegurarse de que no quede ninguna raíz senescente. 2. Con ayuda de tres mondadientes atravesar la cebolla por sus extremos para asegurar que flote en un vaso. 3. Agregar agua al vaso permitiendo que esta tenga contacto solo con el extremo por donde se srcinan las raíces. Preparar el sistema con un mínimo de cinco días de anticipación y cambiar el agua a diario. EN EL LABORATORIO: 4. Colectar las raicillas de los meristemos en crecimiento aproximadamente 1cm de ellas y colocarlos en una luna de reloj. 5. Adicionar una cantidad suficiente de Orceína acética clorhídrica, de tal manera que cubra el material biológico. 6. Calentar al mechero de alcohol hasta la emisión de vapores y dejar enfriar. Repetir la operación tres veces. 7. Separa 2 a 3 mm. de los extremos apicales de dos raicillas y añadirles una gota de colorante nuevo. 8. Realizar un squash golpeando suavemente con el extremo de un lápiz de grafito a fin de obtener una extensión adecuada del preparado 9. Eliminar con un trozo de papel de filtro el exceso de colorante y presionar con el pulgar en el cubreobjeto. 10. Realizar observación microscópica a menor y mayor aumento.


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IV. RESULTADOS: Esquematizar todos los estadios por los que atraviesan las células durante la mitosis en el material empleado, procurando caracterizar cada uno de ellos.

Mitosis en células vegetales: A. Interfase B. Profase C. Metafase D y E. Anafase F. Telofase. Coloración: Feulgen 4.1.

EXPERIENCIA 01. Observación de las fases de la mitosis en meristemos de Allium cepa “cebolla” al microscopio.

PROFASE, aumento:

METAFASE, aumento:

ANAFASE, aumento:

TELOFASE, aumento:


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REPRODUCCIÓN CELULAR: MEIOSIS EN CÉLULAS ANIMALES

PRÁCTICA No 9

COMPETENCIAS: 1. Reconoce y diferencia los estados fisiológicos por los que atraviesa la cromatina durante la división celular. 2. Reconoce las diferentes etapas por las que pasa lacélula animal durante la meiosis. 3. Interpreta los estadíos meióticos observados por microscopía óptica. 4. Comprende la importancia de la meiosis.

I.

INTRODUCCIÓN: La meiosis es otro tipo de división celular mediante la cual el número de cromosomas es reducido a la mitad (reducción aparente), implicando una sola duplicación cromosómica y dos divisiones nucleares; tiene lugar en el transcurso de la gametogénesis, asegurándose de este modo la constancia del número de cromosomas, toda vez que el huevo o cigoto, resulta de la fecundación de los gametos masculino y femenino con un número de cromosomas representado por (n) cromosomas (haploide), cuya función srcina el cigoto con (2n) cromosomas (diploide). Durante ambos procesos de división celular la duplicación de los cromosomas ocurre en fases interdivisionales, es decir en las interfases, considerada por muchos autores como fases de reposo a pesar que en este periodo la actividad cromosómica de transcripción, es mucho intensadey mitosis coincideo con el de estado fisiológico de descondensación de los cromosomas. A medida que losmás procesos meiosis se inician, los cromosomas comienzan a condensarse progresivamente hasta la etapa de metafase, paralelamente a la condensación, el nucléolo durante la profase va desapareciendo.

II.

MATERIAL Y MÉTODOS Un excelente material para la observación de los procesos de división celular lo constituyen, insectos de la especie Grillus asimilis “grillo” y Laplatacris sp. “Langosta”. En los individuos machos debe recuperarse el testículo después de la disección en el que se le estudiará simultáneamente la mitosis en células germinativas primordiales de la zona fúndica (espermatogonios) y la meiosis en células en maduración (espermatocitos) de la zona proximal al canal deferente. El material a usar en el presente ejercicio es el siguiente: 2.1.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Materiales: Grillos o saltamontes machos Microscopio compuesto Leica DM500 Estereomicroscopio ( o Lupas) Mechero de alcohol Éter etílico Orceína acética 2% Solución salina 0,7%


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MANUAL DE PRÁCTICAS 8. 9. 10. 11. 12. 2.2.


Placa de Petri Láminas portaobjeto y Laminillas cubreobjetos. Algodón Papel de filtro Estiletes de punta fina Procedimiento:

1. 2.

3. 4.

5. 6.

Anestesiar los insectos en una placa de Petri, colocando dentro, un pedazo de algodón embebido en éter. Disecar el animal con ayuda del Estereomicroscopio o con la ayuda de lupas, colocándolos en posición dorsal. Separar los testículos adicionándoles la solución salina procurando no exponerlos demasiado tiempo a esta solución. Seccionar los testículos en partes pequeñas de 2 a 3 mm. Colocar los fragmentos separados sobre una lámina limpia e inmediatamente colocarles una o dos gotas de Orceína acética. Esta solución además de fijar el material, lo coloreará. Con los estiletes separar los fragmentos en partes más pequeñas. Sobre el preparado, colocar una lámina cubreobjeto. Dejar colorear 5 minutos, controlando la intensidad de coloración al microscopio. Soluciones maduras de Orceína colorean más rápidamente. Cuando los cromosomas estén aptos para su visualización efectuar la técnica del squash, cuidando no dislocar el cubreobjeto sobre el material.

7. portaobjeto y cubreobjeto, Con la finalidad permitir evaporación de la solución entre la lámina sellar de los no bordes con laesmalte. 8. Observar al microscopio a mediano y mayor aumento. III. 1. 2.

RESULTADOS Esquematice los estadios reconocidos durante la práctica Reconocer los diferentes estadios por los que atraviesa la célula en meiosis


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Células del testículo del saltamontes Chorthippus jucundus teñidas con orceína lacto-propiónica. a.- núcleo de una espermatogonia en interfase. El cromosoma sexual ha sido señalado con una x. b.- metafase espermatogonial. c.núcleo prepaquiténico. Posiblemente corresponde a un núcleo en leptotene. d.- paquiteno medio y.- paquiteno tardío. f.- diploteno. Se ha señalado la posición de los quiasmas (cabezas de flecha) en un bivalente monoquiasmático (m7), en uno con dos quiasmas (m4) y en un tercero que presenta cuatro (l1).


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Células del radial testículo teñidasLas concromátidas orceína lacto-propiónica. A.- Metafase-II. SeC.-Anafaseobserva la disposición de de los Chorthippus cromosomas.jucundus B.- Anafase-II. están comenzando a separarse. II. D.- Telofase-II. E.- Espermátidas tempranas. La situada en la parte superior de la fotografía posee el cromosoma sexual (X), mientras que la de la parte inferior carece de él. F, G, H- Espermátidas en diferentes estados de maduración: redondeada, lanceolada, alargada. Espermatocitos de Chorthippus jucundus teñidos con orceína lacto-propiónica. A.- Diploteno tardío-diacinesis. B.- Metafase-I. C.- Anafase-I. El cromosoma sexual X migra completo al polo superior de esta célula. D.- Telofase-I. E.- Intercinesis/Profase-II. La célula de la parte superior de la fotografía posee el cromosoma X, mientras que la de la parte inferior carece de él.


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PRÁCTICA No 10


OBTENCIÓN Y OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS POLITÉNICOS

COMPETENCIAS: 1. Obtiene, fija, colorea yreconoce cromosomas politénicos deDrosophila melanogaster. 2. Reconoce la importancia de los cromosomas politénicos en estudios de morfología cromosómica. 3. Valora su importancia en estudios de mutagénesis.

I. INTRODUCCIÓN Los cromosomas politénicos (poli = muchos, taenia = filamento) fueron descubiertos por Balbiani en 1881 en glándulas salivales del género Chironomus, son cromosomas gigantes presentes también en otros tejidos como túbulos de Malpighi, epitelio intestinal, etc., y representan un tipo particular de estructuras propias de los insectos del orden Díptera. Se srcinan probablemente durante el desarrollo embriológico y resultan del apareamiento de cromosomas homólogos y la subsecuente replicación de sus cromómeros. Este proceso de politenia continúa se da cíclicamente durante casi todo el desarrollo larval del insecto. En la replicación los filamentos cromonémicos permanecen juntos (endorreduplicación), manteniéndose los dos homólogos sinapsados y comportándose como una unidad. No se da la división celular pero si el crecimiento celular. Como consecuencia del proceso de politenia, los cromómeros replicados se tocan, resultando bandas o fajas características, que expresan un patrón de bandas transversas, que consisten en áreas cromáticas y acromáticas (interbandas) alternas. Estas bandas se diferencian en anchura y otras características estructurales, de manera muy específica. La modificación comúnmente observada en los cromosomas politénicos, es la referente al incremento del diámetro en algunas regiones (desespiralización de una banda), constituyendo una estructura característica con importancia funcional bien definida llamada PUFF. Estas regiones que muestran un estado fisiológico de desarrollo, son zonas diferencialmente activas en ARN.


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Los cromosomas politénicos con un material excelente para ejercicios de estructura y acción génica del cromosoma. Realizando una simple técnica de aplastamiento “squash”, se puede demostrar los modelos de bandeo, las áreas que corresponden a los “pufs” y, las diferencias en el orden de las bandas entre los dos cromosomas, de una pareja que se reflejan en “asa” o en otras formaciones

topológicas anormales (inserciones, delecciones, duplicaciones) entre cromosomas.

Representación de bandas observadas en cromosomas politénicos deDrosophila melanogaster II. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Materiales 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Frascos con larvas de Drosophila en el último estadio en desarrollo (Tercer estadío). Microscopio Leica DM500 Estereomicroscopio Leica EZ4 Láminas portaobjeto y laminillas cubreobjeto Solución salina para insectos (Ringer) o SSF Orceína acética 2%


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7. Estiletes 8. Hojas de bisturí 9. Papel de filtro 10. Esmalte transparente para sellado de láminas 2.2. Procedimiento 1. Retirar de los frascos de cultivo de Drosophila larvas del tercer estadío. 2. Realizar la disección de la larva bajo el Estereomicroscopio, utilizando una lámina portaobjeto y una gota de solución salina. Al realizar la disección colocar un estilete en la parte céntrica de la larva y el otro en la parte más extrema de la cabeza; en esta última región, con un movimiento firme, romper la parte anterior del cuerpo y exponer las glándulas salivales. 3. Retirar los cuerpos grasos e intestinos de larvas. 4. Con la ayuda de un papel de filtro, retirar el exceso de solución salina fisiológica. 5. Colocar sobre la muestra una o dos gotas de Orceína acética y colorear de 8 a 15 minutos, tiempo que puede ser chequeado con microscopio a menor aumento 6. Colocar una laminilla sobre el preparado y realizar el procedimiento de aplastamiento o “squash”

7. Realizar observaciones microscópicas a menor y mayor aumento

Localización de órganos internos en la larva del tercer estadio de Drosophila melanogaster


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III. RESULTADO 1. Identificar y aislar las glándulas salivales como lo mostrado en la figura 2. Identificar en los preparados citológicos, las bandas, interbandas y “pufs” 3. Con ayuda de bibliografía explique la importancia de los estudios de estructura y acción génica en cromosomas politénicos

Glándulas salivales del Tercer estadio de Drosophila melanogaster

Cromosomas politénicos deDrosophila malanogaster


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PRÁCTICA No 11


OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS DE VERTEBRADOS EN PREPARACIÓN DIRECTA


Desarrolla una técnica para el estudio de cromosomas de vertebrados. Observa cromosomas y reconoce su morfología. Clasifica cromosomas según laposición del centrómero. Realiza recuentos cromosómicos a partir de preparados directos.

I. INTRODUCCIÓN Los avances logrados por la citogenética durante los últimos años ha permitido la determinación de los complementos cromosómicos, el estudio de los mecanismos de la herencia, la comprensión de los procesos de evolución, la identificación de especies, conseguidos a través del aislamiento y la observación directa de los cromosomas, han sido el resultado del desarrollo, mejoramiento y estandarización de técnicas citogenéticas a partir de 1956, cuando se determinó fehacientemente que el número de cromosomas en el hombre es de 46. En los años 70 ya se habían incorporado en los estudios citogenéticos una serie de técnicas como el uso de la Colchicina, el choque hipotónico, elair drying, en varios grupos de animales. En la mayoría de las especies los primeros métodos de análisis cromosómico recurrieron a la llamada “técnica directa” lo que implicaba en ocasiones a la infección del animal y su posterior sacrificio, debido a que los principales órganos utilizados eran branquias, bazo, riñón, hígado, testículos, medula ósea, intestinos, escamas entre otros. Como desventaja en la mayoría de las preparaciones se obtenían extendidos de mala calidad en cuanto a cromosomas superpuestos y bajos índices mitóticos además de la pérdida definitiva de los ejemplares analizados. En las técnicas directas los individuos se tratan in vivo con cantidades diluidas de colchicina o sulfato de vinblastina y luego se sacrifican, se extrae el tejido y se trata con solución hipotónica, finalmente se fija y tiñe, de manera que se obtienen metafases. Este método ha sido utilizado en mamíferos, con técnicas de squash, utilizando tejidos como médula ósea y bazo. Suzuki y Kurihara en 1990 obtuvieron cromosomas del ratón silvestreMus musculus a partir de médula ósea. En peces, Kligerman y Bloom en 1977 propusieron un método de preparación cromosómica directa de tejidos de branquias, escamas, riñones y tracto intestinal donde se obtuvo alta calidad de metafases. Forero y González en 1994 caracterizaron cromosómicamente especies ícticas de la sabana de Bogotá utilizando técnica directa (Air Drying) para los mismos tejidos. Peccinini en 1981 reportó estudios citogenéticos de reptiles donde utilizando métodos directos en los cuales los tejidos más eficaces fueron medula ósea, epitelio intestinal y bazo. Para serpientes ha sido utilizado médula ósea y bazo y en tortugas, bazo, riñón, córnea y tejido del músculo cardiaco. Dentro de la modalidad de métodos directos está el uso de la inyección y el de inmersión, dependiendo de la especie a tratar se puede utilizar una de las dos o su combinación, por ejemplo en mamíferos y reptiles se utiliza la inyección pero en animales como los peces y anfibios se pueden utilizar cualquiera


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de las dos o como se mencionó una combinación de inmersión e inyección. El método de inyección se refiere a la aplicación de la solución por punción directa intraperitonealmente aun cuando en ocasiones se aplica intramuscularmente en este caso tardará mucho más su acción, esta última punción es utilizada en ocasiones cuando el individuo a ser analizado es muy pequeño 1.5 – 2.0 cm. Por su parte los métodos indirectos son aquellos que permiten obtener un mayor número de células en división y lo más importante no recurren al sacrificio del animal pues se realizan cultivosin vitro de células sanguíneas (linfocitos) y/o fibroblastos, obteniendo como resultado gran cantidad y calidad de metafases asegurando de esta manera poder aplicar directamente la información en diagnósticos cromosómicos o posteriores mejoras genéticas. En las técnicas indirectas se toma la muestra de tejido, si se trata de sangre se aplica anticoagulante en el momento de la toma y posteriormente es llevada al laboratorio en donde es “sembrada” es decir se

coloca en las condiciones necesarias para la división celular; se aplican medios de cultivos específico que proveen a la célula de los nutrientes necesarios para el crecimiento, factores de crecimiento (Suero Bovino Fetal) que estimulan la multiplicación celulary un mitógeno (Fitohemaglutinina) que induce la proliferación celular. Es importante controlar temperatura y el pH de los cultivos, pero otros como CO 2, y ventilación no son tan críticos en el momento de mantener cultivos celulares viables, a no ser de que se trate de cultivos de fibroblastos. Los cultivos de células primarias son un excelente recurso de división celular, para tal fin se requiere estimular la división normal con medios de cultivos, y factores de crecimiento además los cultivos celulares ofrecen las mejores preparaciones para desarrollar técnicas de bandeamiento. El “cuy”, “cobayo”, “curi” o “conejillo de indias” es srcinario de la zona andina de los países de Bolivia,

Ecuador, Colombia y Perú. Según algunos análisis citogenéticos se demuestra que el Género Cavia se caracteriza por un número diploide de 64 cromosomas (2n=64) asociados en 4 grupos según su forma y tamaño. Esta especie representa un buen organismo a partir del cual se pueden ensayar las técnicas de la citogenética para el estudio de cromosomas de vertebrados. II. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. Material biológico:  Un

ejemplar juvenil deCavia porcellus “Cuy” (por turno de práctica).

2.2. Material de Laboratorio: 

–

ópticos Leica  Microscopios Colchicina 0.1% (100mL)

DM500  03 Jeringas descartables 2 ml.  Cloruro de potasio 0,075M (200ml)  09 Tubos de centrifuga cónicos con tapa descartables 15 ml.  Centrífuga  03 gradillas metálicas  Algodón (torundas para cada mesa)


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MANUAL DE PRÁCTICAS  09


Pipetas Pasteur

 09 Bulbos para pipetas pasteur  Pipeteador automático (Manual)  01

caja de Láminas portaobjeto Mecheros de alcohol  Solución de Colorante Giemsa 5%  Solución de Orceína 2%  03

2.3. Procedimiento: 1. Realizar una inyección intraperitoneal de 5 mL de Colchicina al 0,1% a un ejemplar de Cavia porcellus, tres horas antes de la práctica de cada grupo. INOCULACIÓN INTRAPERITONEAL Se realiza en la línea media de la pared abdominal, por debajo del ombligo o de la ingle izquierda. a) El ayudante sujetará firmemente al animal y lo mantendrá en posición ligeramente declive y con la cabeza hacia abajo para que bajen los intestinos. b) Introducir la aguja bajo la piel, luego levantando ligeramente la mano, forzar el paso de la aguja a través de la capa muscular y el peritoneo e inocular (volumen a inocular 5 mL). c) Cuando se atraviesa los músculos y el peritoneo, se siente la relajación de la pared abdominal. 2. Mantener el animal bajo los efectos de la droga por espacio de 2 a tres horas.


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3. Disecar el animal y obtener los huesos largos.

4. Obtener las diáfisis, y trozarlas en una solución hipotónica de KCl 0,075M.

Hipotonización del tejido de la médula ósea de Cavia porcellus


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5. Eliminar solamente huesos trozados y colocar la solución en tubos de centrífuga y mantener en la estufa 37°C por 15 minutos.

6. Realizar centrifugación a 1 000 rpm por 5’ y eliminar el sobrenadante.

7. Adicionar al tubo 7 ml. de fijador, homogenizar el medio, centrifugar como en el paso anterior para eliminar el sobrenadante. 8. hacer dos fijaciones nuevas como en 6 9. Adicionar por cada 0.5 de muestra, 1 ml de fijador, hacer una resuspensión


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10. Hacer goteos en láminas portaobjeto mantenidas en agua refrigerada 11. Secar al mechero de Alcohol 12. Colorear con Orceína o Giemsa y observar al microscopio.

Cariotipo de Cavia porcellus III. RESULTADOS:


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CONSTRUCCI N DE UN MODELO PLANO DEL CARIOTIPO HUMANO

PRÁCTICA No 12

COMPETENCIAS: 1. Reconoce pares de homólogos por su tamaño, posición del centrómero y apariencia de bandas. 2. Reconoce el complemento cromosómico humano normal: Grupos de autosomas y cromosomas sexuales. 3. Elabora un cariograma normal. 4. Señala la importancia del diagnóstico cromosómico.

I.

INTRODUCCIÓN:

El cariotipo es el arreglo sistemático y ordenado de los cromosomas del núcleo de una célula, y viene definido por el número y morfología de los cromosomas en una metafase mitótica. En la especie humana la dotación cromosómica es de 2n = 46 (22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales). Utilizando técnicas de tinción estándar los cromosomas aparecen uniformemente teñidos con GIEMSA o teñidos diferencialmente con WRIGTH y se clasifican en 7 grupos de la A a la G atendiendo a su longitud relativa y a la posición del centrómero que define su morfología. Los autosomas se numeran del 1 al 22 ordenados por tamaños decrecientes y por la posición del centrómero. Los cromosomas sexuales X e Y constituyen un par aparte, independientemente del resto (por su tamaño, el cromosoma X se incluiría en el grupo C, y el Y, en el grupo G). GRUPO

PARES CROMOSÓMICOS

CARACTERÍSTICAS

A

1, 2 y 3

Cromosomas muy grandes casi metacéntricos (1 y 3 metacéntricos, 2 submetacéntrico)

B

4y5

Cromosomas grandes y submetacéntricos, con dos brazos muy diferentes en tamaño

C

6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12

Cromosomas medianos submetacéntricos

D

13, 14 y 15

Cromosomas medianos acrocéntricos con satélites

E

16, 17 y 18

Cromosomas pequeños, metacéntrico el 16 y submetacéntricos 17, 18

F

19 y 20

Cromosomas pequeños y metacéntricos

G

21 y 22

Cromosomas pequeños y acrocéntricos, con satélites.

X, Y


El cromosoma X es parecido en tamaño a los del grupo C; el Y, al grupo G, pero sin satélites.

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CITOGENÉTICA CLÍNICA En 1956, Tijo y Levan determinaran el complemento cromosómico diploide del hombre (2n = 46). En 1959 Lejeune describió la primera cromosomopatía o enfermedad srcinada por una alteración cromosómica, el síndrome de Down producido por una trisomía del cromosoma 21. Desde entonces, la Citogenética Humana ha ido desarrollándose como una ciencia médica. Hay dos tipos fundamentales de cromosomopatías: Variaciones cromosómicas estructurales: afectan a la estructura del cromosoma en cuanto a la ordenación lineal de los genes. Aquí se incluyen deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones. Variaciones cromosómicas numéricas: afectan al número de cromosomas. Incluyen las poliploidías (triploidía: 3n; tetraploidía: 4n) y los diversos tipos de aneuploidía (trisomías: 2n +1; monosomías: 2n -1). Por otra parte, las anomalías cromosómicas pueden afectar a los autosomas o a los cromosomas sexuales. Las alteraciones cromosómicas más frecuentes en humanos son: A. Anomalías autosómicas: Síndrome de Down, por trisomía del cromosoma 21, translocación 21/21 o translocación 14/21.


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Síndrome de Patau, por trisomía del par 13. Síndrome de Edwards, por trisomía del par 18. Síndrome Cri du Chat , por deleción parcial del brazo corto del cromosoma 5 (5p). Síndrome de DiGeorge, por deleción parcial del brazo largo del cromosoma 22 (22q11). Cromosoma Filadelfia, formado por una translocación entre los cromosomas 9 y 22.

B. Anomalías de los cromosomas sexuales:  Síndrome de Klinefelter, por una constitución XXY, XXXY, XXXXY.  Síndrome XYY, cromosoma Y extra en varones.  Síndrome de Turner, constitución X0.  Síndrome XXX, cromosoma X extra en mujeres. Actualmente se ha llegado a profundizar bastante en el conocimiento del cariotipo humano y se sabe que es relativamente frecuente la aparición de anomalías cromosómicas. Por ejemplo, cerca de un 25% de los abortos ocurridos antes de la octava semana de gestación tienen cariotipos anormales y un 0,5% de los recién nacidos presentan aneuploidías. Estas alteraciones no sólo pueden producir anomalías en el propio individuo portador sino que, por tratarse de anomalías genéticas, pueden transmitirse a la descendencia en el caso de que afecten a las células germinales. La detección anticipada de anomalías cromosómicas permite dictaminar las posibilidades de que la descendencia de una pareja portadora de una de ellas pueda presentarla o no. Para ello es preciso conocer el cariotipo de cada progenitor, lo que permite emitir un diagnóstico de su posible descendencia, con lo que el individuo será consciente de sus posibilidades. El estudio del cariotipo tiene también su aplicación en el diagnóstico prenatal. Es posible determinar la constitución cromosómica del feto antes de su nacimiento pudiendo así observarse si presenta alguna anomalía cromosómica detectable. Hoy en día, el diagnóstico prenatal se practica a posteriori del inicio de la gestación y los resultados positivos suelen plantear conflictos éticos y emocionales. II.

MATERIALES De la Cátedra PC y Proyector Multimedia Extensión metafásica. Patrón de reconocimiento.

III.

Del alumno Goma. Tijeras.

PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3.

Contar los cromosomas en la extensión y anotar el número. Identificar los cromosomas y numerar. Recortar los cromosomas haciendo una elipse en torno a ellos (No cortar los) bordes

4. 5. 6. 7.

Ordenar en forma decreciente Aparearlos según su apariencia y bandas Formar los grupos ( de la A a la G) Identificar los cromosomas sexuales


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MANUAL DE PRÁCTICAS 8. 9.


Pegar las unidades apareadas sobre un patrón proporcionado por el laboratorio Anotar la fórmula cromosómica y hacer el diagnóstico FOTOGRAFÍA DE UNA EXTENSIÓN CROMOSÓMICA METAFÁSICA


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MANUAL DE PRÁCTICAS IV.


RESULTADOS: Presenta el cariotipo construido sobre la ficha a continuación. FECHA: Nombre del paciente: Laboratorio:

1

2

6

7

13

19

14

20

3

8

4

9

10

15

11

16

21

5

17

X

22

12

18

Y

MARCADORES ANALISTA


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MANUAL DE PRÁCTICAS V.


CUESTIONARIO: 1. ¿Qué características permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de otros?

2. ¿Qué células del organismo llevan el cariotipo diploide completo?

3. ¿Qué mecanismos cromosómicos producen anomalías del cariotipo humano?

4. ¿Se manifiestan siempre las alteraciones cromosómicas en el fenotipo del individuo que las transmite? Explique.

5. Mencione usted cromosómicas.

algunas

técnicas

útiles

en

el

diagnóstico

de

alteraciones

6. ¿Cuáles son las diferencias entre los cromosomas de células procariontes y eucariontes?

7. ¿A qué se llama sexo biológico de un individuo?

8. ¿Qué par de cromosomas está alterado en el síndrome de Langdon Down?


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PRÁCTICA No 13


OBTENCIÓN DE CÉLULAS GAMÉTICAS DE RATÓN

+ I. COMPETENCIAS: 1. Obtiene y prepara células gaméticas para su estudio. 2. Reconoce y representa cambiosmorfológicos en células sexuales 3. Destaca la importancia de la meiosis en la reproducción sexual como proceso básico en la gametogénesis

II. Introducción: Los roedores constituyen uno de los grupos de mamíferos más fecundos y numerosos de la Tierra, debido a la extraordinaria capacidad de crecer que tienen sus poblaciones. Los machos de la mayoría de las líneas de ratones de laboratorio son púberes (con actividad espermática establecida) entre 6 y 8 semanas y mantienen la fertilidad prácticamente toda la vida. Las células germinales masculinas se diferencian en los túbulos seminíferos a lo largo de toda la vida de un animal normal adulto. Esta diferenciación, que abarca desde las células primordiales (denominadas espermatogonias) hasta los espermatozoides, se denomina espermatogénesis; tardando alrededor de 13 semanas para que una espermatogonia produzca alrededor de 120 espermatozoides. Luego, los espermatozoides maduran pasando por el epidídimo y realizan la capacitación al entrar en contacto con el tracto reproductivo femenino (tras la monta).

Fig 1. Órganos internos de la rata. T omado de Starks D.M. y Ostrow, M.E. eds. Assistant Laboratory Technician. AALAS, 1991.


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Fig 2. Anatomía urogenital de rata macho de laboratorio. Tomado de Stark, D. M. y Ostrow, M. E. , eds. Assistant Laboratory Technician. AALAS, 1991) III. Materiales y Métodos: 1. Material biológico: Ratones machos en edad adulta. Material de laboratorio: 2 tubos cónicos de centrífuga de 15 mL o 2 tubos de 13x100 mm. 32 pipetas conde bulbo. pipetas Pasteur graduadas 5 mL. 1 caja de Petri. 2 hojas de bisturí o navajas de afeitar. 2 vasos de precipitados de 100 mL. Portaobjetos. Tabla de disección Algodón y gasa Alcohol Equipo de disección. 3. Reactivos: Solución hipotónica de citrato de sodio al 1% a 37°C (incubar). Fijador metanol absoluto-ácido acético glacial 3:1 Este reactivo deberá prepararse en el momento que se requiera. Colorante de Giemsa. Aceite de inmersión. Procedimiento: 1.Sacrificar al ratón por dislocación cervical: Tomar el ratón por la cola y ponerlo en una superficie firme y rugosa de forma que el animal pueda fijarse en ella por sus garras, con la otra mano fije el ratón de la nuca asegurándose de tomar la mayor cantidad de piel posible, fije la nuca y estire el animal de la cola, hasta sentir que la cabeza se separa de la columna vertebral. Puede optarse la administración de una sobre dosis


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de pentobarbital sódico (25 mg/kg de peso corporal) para causarle un paro respiratorio y con ello la muerte (Fig.1 ) Abrir la cavidad abdominal y extraer los testículos.

Fig 3. Disección de un ejemplar adulto

2. Sujetar las extremidades con alfileres de disección, sobre la tabla de disección con la parte ventral hacia arriba. Humedecer la piel de la región abdominal con alcohol de 96% para facilitar su corte. A continuación se pinza y se levanta la piel abdominal, para realizar una incisión en la línea medio-ventral desde los orificios genitales hasta la altura de la boca, y se retira hacia los lados sujetándola con alfileres (Fig.4 ).

Fig. 4. Exposición de estructuras internas del ratón tras la disección

3. Recibir los testículos en una caja de Petri con 5 mL de solución hipotónica de citrato de sodio al 1 % a 37°C


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4. Con la navaja, cortar el tejido en fragmentos tan pequeños como sea posible, eliminando antes pelo, grasa o cualquier otra adherencia. 5. Pasar a un tubo de centrífuga con ayuda de la pipeta Pasteur las células en suspensión. Incubar a 37oC. durante 30 minutos. 6. Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. 7. Resuspender el botón y añadir 5 mL de fijador gota a gota y agitando en el vortex, dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 min. 8. Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 5 min. y lavar por lo menos dos veces más con fijador. 9. Decantar y resuspender en un volumen pequeño (aproximadamente 0.5-1.0 mL). 10. Dejar caer 2-3 gotas de esta suspensión en un portaobjetos desengrasado. Dejar secar al aire. 11. Teñir con colorante de Giemsa durante 5 minutos. Lavar y observar al microscopio, primero con objetivo seco débil y posteriormente a inmersión. IV. Resultados: 1. 2. 3.

Reconocer la morfología del espermatozoide del ratón Reconocer las variaciones morfológicas de las células gaméticas Comparar la morfología de células gaméticas del ratón y del hombre

Fig. 5. Comparación estructural entre un espermatozoide de un ratón y el de un humano


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Fig. 6 Espermatozoides de ratón coloreados

Fig. 7 Células en l a estructura de un testículo de ratón


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Fig. 8 Morfología espermática en el ratón

V. Conclusiones VI. Referencias Bibliográficas


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PRÁCTICA No 14


ANÁLISIS DE LÍQUIDO SEMINAL

COMPETENCIAS: 1. Conoce y desarrolla lastécnicas propuestas por la OMS para la evaluación del eyaculado. 2. Conoce valores de referencia en los parámetros seminales y su interpretación clínica. 3. Desarrolla actitudes frente a los posibles riesgos biológicos yquímicos durante la evaluación del líquido seminal.

I. INTRODUCCIÓN El líquido seminal es una mezcla de espermatozoides suspendidos en las secreciones del testículo y del epidídimo, que, en el momento de la eyaculación, son combinados con las secreciones de la próstata, vesículas seminales, y glándulas bulbouretrales. La composición final es un líquido viscoso que comprende el eyaculado. El eyaculado en general es expulsado en cuatro fracciones diferentes: 1. La fracción preeyaculatoria, procedente de las glándulas de Cowper y Litré, es de consistencia mucosa y está exenta de espermatozoides. 2. Fracción previa, completamente fluida, proviene de la próstata, y tampoco presenta espermatozoides. Supone del 13 al 33% del total del eyaculado, posee un pH ácido y se caracteriza por su elevada concentración de fosfatasa ácida y ácido cítrico. 3. Fracción principal, que consta tanto de elementos líquidos como de elementos gelatinosos, es la más rica en espermatozoides y procede del epidídimo, deferente y ampolla deferencial. 4. Fracción terminal, gelatinosa, es la más abundante del eyaculado, 50-80%. Procede de las vesículas seminales, por lo que es rica en fructosa. Posee pH alcalino y espermatozoides, aunque la mayoría inmóviles. Las mediciones realizadas en el conjunto de la población de espermatozoides eyaculado no puede definir la capacidad de fertilización de los pocos que llegan al lugar de la fecundación. Sin embargo, el análisis seminal provee esencial información sobre el estado clínico del individuo. Evidentemente, la recopilación y el análisis de semen deben llevarse a cabo correctamente por procedimientos normalizados si los resultados son para proporcionar información válida. Recolección y envío de la muestra La muestra debe ser obtenida por masturbación y el eyaculado colocado en un frasco de vidrio o plástico de boca ancha que esté limpio; si se usa plástico, verificar la ausencia de efectos tóxicos sobre los espermatozoides. El recipiente debe estar tibio es decir mantenido entre 20 y 40°C, para evitar la reducción de la motilidad espermática. La muestra de semen debe recogerse tras un mínimo de 48 horas de abstinencia sexual, preferiblemente por masturbación, ya que el coito interrumpido puede contaminar la muestra con secreciones vaginales, verse afectada la movilidad por el pH ácido, así como perderse parte de la


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misma Igualmente, el uso de preservativos convencionales no está recomendado, ya que la mayoría contienen sustancias espermicidas que afectarían a la calidad espermática. Lo ideal es que la muestra deba recogerse en una sala privada próxima al laboratorio de lo contrario se la debe enviar al laboratorio antes de transcurrida 1 hora de la recolección. El personal de laboratorio debe ser conscientes de que las muestras de semen pueden contener agentes infecciosos (por ejemplo, los virus VIH, hepatitis y herpes simple) y por lo tanto, debe manejarse como sumo cuidado para evitar el riesgo biológico. La OMS, divide el examen del semen en: examen básico, opcional y avanzado. Examen básico 1. Examen macroscópico: licuefacción, aspecto, volumen, viscosidad, pH. 2. Examen microscópico: a. Concentración de espermatozoides y otras células. b. Motilidad c. Vitalidad d. Morfología espermática. e. Presencia de aglutinaciones. f. Detección de anticuerpos antiespermatozoides unidos a la superficie espermática. Examen Opcional 1. Índice de teratozoospermia. 2. Test hipoosmótico. 3. 4. 5. 6.

Cultivos seminales. Análisis bioquímico de Líquido Seminal. Análisis automático de la movilidad espermática. Test del Hámster.

Examen Avanzado 1. Test de función espermática: Especies reactivas de oxígeno, test de la zona pelúcida, evaluación de la reacción acrosómica. 2. Análisis automático de la morfología espermática. Examen Macroscópico LICUEFACCIÓN Una muestra de semen normal se licúa dentro de los 60 minutos a temperatura ambiente, aunque por lo generaldentro esto de ocurre de los 15 debe minutos. En algunos casos, la licuefacción completa no se produce los 60dentro minutos, y esto registrarse. ASPECTO La muestra de semen debe ser examinada inmediatamente después de la licuefacción o dentro de una hora de la eyaculación, primero por simple inspección a temperatura ambiente. Una muestra normal tiene una apariencia homogénea, gris opalescente.


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VOLUMEN El volumen de la eyaculación puede medirse utilizando un cilindro graduado con base cónica de base o por el registro del peso de los contenedores estándar con y sin esperma. VISCOSIDAD: La viscosidad puede ser estimada por aspiración suave con el agujero de una pipeta de 5 ml y luego permitir que el esperma caiga por gravedad observando la longitud del filamento. Una muestra normal permite a la pipeta dejar caer discretas gotas. La viscosidad puede evaluada también introduciendo una varilla de vidrio en la muestra y observando la longitud del filamento que se forma al retirar la varilla. Una vez más, el filamento no debe superar los 2 cm. PH El pH debe medirse a un tiempo uniforme dentro de la hora de la eyaculación. El pH tiene que estar entre 7,2 y 7,8. Si el pH es mayor de 7,8 sospéchese infección, si es menor a 7.0 en una muestra con azoospermia, puede haber disgenesia del conducto deferente, de las vesículas seminales o del epidídimo. Examen Microscópico RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES El recuento de espermatozoides se realiza mediante cámaras de recuento específicas como la de Makler, o Neubauer. El reporte se realiza por centímetro cúbico (mililitro) o el total de espermatozoides, que es el producto de multiplicar el volumen por el número de espermatozoides por centímetro cúbico. Cuando la cantidad de espermatozoides es inferior a 20 millones /cc o menor a 40 millones en recuento total se denomina oligozoospermia; cuando no hay ningún espermatozoide se denomina azoospermia. MOTILIDAD En la evaluación de la capacidad reproductiva o fértil del espermatozoide, la movilidad es un criterio determinante para su normalidad. La OMS clasifica la movilidad en cuatro categorías: Grado a: son móviles rápidos y con movilidad rectilínea. Grado b: son lentos y con desplazamientos no rectilíneos. Grado c: cuando no hay desplazamiento del espermatozoide pero sí hay movilidad flagelar, y grado d: cuando el Espermatozoide esta inmóvil. Una muestra tiene movilidad normal si tiene más de 50% de espermatozoide grado a + b, y si hay más de 25% grado a. Si no se cumplen estos criterios, la muestra seminal se califica con diagnóstico deastenozoospermia. MORFOLOGÍA Para realizar el reporte de la morfología se requiere hacer una tinción de los espermatozoides. La OMS clasificaActualmente las alteraciones según la región están localizadas: cabeza, flagelo combinadas. se acepta como normal donde una morfología con 30% OMS o 14 cuello, % Kruger. Dichoy en forma sencilla, el varón tiene el 70% o más de sus espermatozoides con alteraciones morfológicas, lo cual es una de las variables que explican el porcentaje alto de infertilidad que hoy existe; otras especies con mejor tasa de fertilidad como el conejo tienen el 90 % o más de formas normales. Cuando no se cumple con el porcentaje de formas normales se denominateratozoospermia.


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VITALIDAD Los espermatozoides inmóviles pueden estar vivos o muertos. Para determinar cuáles están vivos se realiza el test de eosina, el cual consiste en mezclar en un portaobjeto una gota de eosina y una de semen. Cuando las células mueren pierden su capacidad de permeabilidad de membrana y permiten el paso libre de los fluidos, por lo cual los espermatozoides muertos se observarán al microscopio como teñidos de rosado y los vivos estarán sin teñir. Este examen es de gran valor en los casos de astenozoospermia. OTRAS CÉLULAS El líquido seminal puede ser el vehículo de trasporte no sólo de los espermatozoides, sino de otras gonorrhoeae, células importantes como los linfocitos, virus (HIV, hepatitis B), bacteriasNeisseria ( Chlamydia, Treponema pallidum, E. coli, etc.) y hongos. Todas las células citadas están relacionadas con las infecciones de transmisión sexual y tienen al semen como la forma de transmitirla a la mujer o a otro hombre. Se conoce también que el líquido seminal tiene fructosa, manosa, aminoácidos, hormonas sexuales, y diversas proteínas, desechos metabólicos, entre otros. Es decir, el líquido seminal no solamente tiene como función transportar los espermatozoides sino que es una forma de excreción del cuerpo del hombre. II. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. Material biológico:  Una muestra de semen con un tiempo de extracción no menor a una hora. NOTA: Solicitar la obtención de una en recipientes ancha sexual estériles conservando las normas de asepsia. Es muestra recomendable un periododede boca abstinencia de y3 días. Colocar el recipiente con la muestra en una estufa a 37 °C. 2.2. Material de Laboratorio:  Microscopios ópticos – Leica DM500  Cámara de Neubauer.  Láminas portaobjetos.  Laminillas cubreobjetos.  Goteros 2.3. Procedimiento: 2.3.1. EXAMEN MACROSCÓPICO INICIAL: Hacer evaluaciones de licuefacción, apariencia, pH y volumen del semen entre los 30 y 60 minutos.

Licuefacción: Apariencia: Volumen: pH:


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2.3.2. INVESTIGACIÓN MICROSCÓPICA INICIAL: Durante el examen microscópico inicial de la muestra se realiza una estimación de la concentración y motilidad de los espermatozoides, de la presencia de aglutinación y de otras células. 2.3.2.1. AGREGACION DE ESPERMATOZOIDES: Colocar un pequeño volumen de semen (no mayor de 10 uL) y depositarlo en un portaobjeto, luego cubrirlo con un cubreobjeto de 22 x 22 mm. Observar si existe adherencia. La adherencia entre espermatozoides inmóviles o de espermatozoides móviles a hebras de moco, a células no espermáticas o cualquier otro elemento no celular, se considera como agregación no específica.

2.3.2.2. AGLUTINACIÓN DE ESPERMATOZOIDES: La aglutinación se refiere específicamente a espermatozoides móviles pegados entre sí, cabeza con cabeza, cola con cola o de forma mixta. La motilidad es a menudo vigorosa con un movimiento de agitación excitado, pero que a veces cuando los espermatozoides están aglutinados su movimiento es limitado. Debe ser registrado el tipo principal de aglutinación y el sitio de unión: Grado 1: Aislada (< a 10 espermatozoides por aglutinado, muchos espermatozoides libres). Grado 2: Moderada (Entre 10 y 50 espermatozoides por aglutinado, espermatozoides libres). Grado 3: Alta (aglutinados de > a 50 espermatozoides, algunos espermatozoides todavía libres). Grado 4: Muy alta (Todos los espermatozoides aglutinados y los aglutinados interconectados) 2.3.2.3. MOTILIDAD: La motilidad espermática debe ser evaluada tan rápido como sea posible después de la licuefacción de la muestra, preferentemente a los 30 minutos, pero en cualquier caso dentro de la hora después de la eyaculación, para limitar efectos de deletéreos de la deshidratación, o cambios en la motilidad por variaciones del pH o temperatura. Después de mezclar bien el semen en su contenedor srcinal, por aspiración con una pipeta (1,5 mm de diámetro), transferir 10 uL a una lámina portaobjeto y cubrir con un cubreobjeto (22mm x 22mm). Evaluar la motilidad a 200X o 400X, en por lo menos 200 espermatozoides. Repetir nuevas transferencias (4veces) y haga el registro en las categorías siguientes:

Motilidad Progresiva (PR): Espermatozoides con movimientos lineales o circulares, independiente de la velocidad. Motilidad No progresiva (NP): Todos los otros patrones de motilidad con ausencia de progresión.


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Inmóviles (IM): Sin movimiento Valores límites de referencia: Movilidad total (PR+NP) es de 40%, Movilidad progresiva (PR) es 32%. La motilidad se puede evaluar con un ocular reticulado, y contando a partir de los 5 mm del borde del cubreobjeto, como lo indica la figura abajo.

2.3.2.4. VITALIDAD: Llamada viabilidad espermática, ésta se refleja al señalar que los espermatozoides están "vivos" de acuerdo al criterio de exclusión de algún colorante vital o mediante la expresión de su capacidad osmorreguladora cuando se los expone a condiciones hipoosmóticas. Procedimiento:

Eosina sola Mezclar una gota (10 a 15 uL) de semen fresco con una gota de solución de eosina al 0,5% en un portaobjeto y cubrir con un cubreobjeto. Al cabo de uno o dos minutos observar el preparado a 400 x con luz intensa o contraste de fase. Contar los espermatozoides no teñidos (vivos) y teñidos (muertos). Nota: Eosina Y (Solución al 0,5% (p/v) en solución fisiológica). Eosina – Nigrosina Mezclar una gota de semen con dos gotas deeosina Y al 1 %. A los 30 segundos añadir tres gotas de Nigrosina al 10% (p/v) a la solución y mezclar. Poner una gota de la mezcla de semen, eosina y Nigrosina en un portaobjeto claro para microscopio y hacer un extendido, que después se seca al aire. (Los extendidos no deben ser demasiado gruesos.). NOTA: Eosina Y, 1 % en agua destilada; Nigrosina 10% en agua destilada. Valor de referencia límite: Espermatozoides con membranas intactas: 58%


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2.3.2.5. TEST HIPOSMÓTICO (HOS): Este test está basado en el principio de la semipermeabilidad de la membrana plasmática intacta. El influjo de agua que se produce al exponer los espermatozoides a un medio hipoosmótico produce la "hinchazón" de las células por expansión del volumen celular. El HOS no debe ser usado como un examen funcional sino como un análisis adicional de vitalidad. Método Entibiar 1 mL de la solución hipoosmótica en un tubo a 37°C por 5 minutos. Agregar 0,1 mL de semen licuado y mezclar con una pipeta. Incubar a 37°C por 30 a 120 minutos y examinar las células con un microscopio de contraste de fases. La "hinchazón" de los espermatozoides se identifica por cambios en la conformación de la cola, como se muestra en la figura abajo. Contar un mínimo de 100 espermatozoides y determinar el porcentaje de células hinchadas. El valor de referencia límite es el mismo para el test de la eosina


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Representación esquemática de los cambios morfológicos típicos que sufren los espermatozoides expuestos a un medio hipoosmótico. a) Sin cambios, en b-g) Varios tipos de cambios en la cola. La región de la cola que muestra hinchazón aparece sombreado

2.3.2.6. RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES: La concentración de espermatozoides puede determinarse con el método del Hemocitómetro. Representación del área inscrita en una cámara de Neubauer. 9 divisiones en la figura de la izquierda, el recuadro central (número 5) con 25 divisiones, y a la derecha la apariencia de la imagen en círculo, delimitado por triple línea, con 16 cuadrados.

Cada una de las dos subcámaras tiene 9 rejillas, cada una de las rejillas tiene 100 nL de volumen. Por tanto, el total de la cámara es de 900 nL. Cada rejilla está formada por cuadros que llamaremos grandes, agrupados en filas. A su vez, cada cuadro grande está dividido por una triple línea en cuadros que llamaremos pequeños. Centrándonos en la 5, ésta tiene 25 cuadros grandes y cada uno ellos está dividido en pequeños, Parade el cálculo del volumen total16decuadros una rejilla, tener en como cuenta:se muestra en la figura de la derecha. Base = Lado x Lado; Base = 1 mm x 1 mm = 1 mm2 Volumen = Base x Altura; Volumen = 1 mm2 x 0,1 mm = 0,1 mm3 = 100 Nl MÉTODO:


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1. Se prepara una dilución 1:20 con cada muestra homogénea mezclando bien 50 µL de semen licuado con 950 µL de diluyente. 2. Si el examen preliminar del semen indica que la concentración de espermatozoides es demasiado grande o demasiado baja, se debe ajustar el grado de dilución de la muestra como corresponda. Así, para las muestras que contiene 20 x 10 6 espermatozoides mL, puede emplear una dilución 1:10 mientras que para las que contienen más de 100 X 106 espermatozoides/mL corresponde una dilución 1:50. La muestra diluida se debe mezclar muy bien y luego se pasa una gota a un Hemocitómetro convencional y se cubre con el cubreobjeto. 3. Dejar el Hemocitómetro en reposo de uno a cinco minutos, con preferencia en una cámara húmeda para reducir a un mínimo el secado. En este tiempo las células sedimentan y luego se cuentan en el microscopio óptico o de contraste de fases con una magnificación de 100 X o 400 X. Sólo se cuentan los espermatozoides (células germinales morfológicamente maduras con colas). Los espermatozoides sin cabeza y las cabezas sin cola no se cuentan. 4. Se cuentan ambas cámaras del Hemocitómetro y se calcula un promedio de ambos recuentos, siempre que la diferencia entre ellos no exceda el 10%. En el caso de que los recuentos difieran en más de un 10%, ambos se descartan y se prepara una nueva dilución. 5. Para determinar la concentración de espermatozoides, en millones/mL del semen srcinal, se divide el promedio del recuento por el factor de conversión que aparece en el cuadro siguiente. Por ejemplo, si la muestra fue diluida 1+19 y se contaron 162 y 170 espermatozoides en 10 cuadrados grandes de cada cámara, la concentración de espermatozoides en la muestra srcinal es de 83 x 106/mL (166 dividido 2). Para otros Hemocitómetros hay diferentes factores de corrección que dependen del volumen de cada cuadrado en su retículo.

NOTA: Respecto a la triple línea que separa los cuadrados grandes, se ha de tener en cuenta lo siguiente: La línea media muestra el cuadrado relevante. Contar todos los espermatozoides que estén dentro del cuadro central. Contar cuando la cabeza cae dentro. Si la cabeza está justo en la línea central, se cuentan los de la línea vertical izquierda y horizontal inferior, y no se cuentan los de la vertical derecha y horizontal superior (estos se contarán en otro recuento). Ejemplo de recuento en cámara Neubauer improved. A) Se cuentan filas completas empezando por la rejilla 5 y siguiendo por la 4 y 6 si fuese necesario. B) Contaje de espermatozoides en uno de los cuadrados grandes: en círculo los que se cuentan en ese cuadro, y en rectángulo los que no son válidos o se cuentan en otro cuadro.


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El manual de la OMS establece el valor conocido como límite inferior de referencia para la concentración y para el contaje total de espermatozoides como sigue. Número total: 39 millones de espermatozoides / eyaculado. Concentración: 15 millones de espermatozoides / mL. 2.3.2.7. MORFOLOGIA: La clasificación de normalidad de la OMS se basa en considerar un espermatozoide normal al integrante de una subpoblación de espermatozoides potencialmente fertilizadores seleccionados naturalmente en el moco cervical. PROCEDIMIENTO: 1. Elegir dos portaobjetos y limpiarlos vigorosamente con papel por ambos lados para realizar una muestra por duplicado. 2. Hacer una extensión: con otro portaobjeto hacer un ángulo de unos 45º y tocando la gota arrastrar en el sentido que marcan las flechas de la imagen. Hacerlo a una velocidad tal que se tarde aproximadamente un segundo en hacer el arrastre de la gota sobre el porta. 3. Si la muestra es de baja concentración (<2 millones / mL), centrifugar a 600g durante 10 minutos. Posteriormente resuspender el pellet. 4. Depositar de 5-10 μL de muestra bien homogenizada en el extremo del portaobjetos. Se hace la extensión de igual manera que en la Ilustración A. Se debe hacer constar en el informe en caso de haber centrifugado la muestra, que esta manipulación puede afectar a los resultados de la morfología.

Técnica para realizar una extensión de semen. A) En muestras de viscosidad normal, se utiliza un porta a 45º para el arrastre de una gota en un segundo; B) En muestras viscosas, previamente tratadas, se emplea una pipeta pasteur

5. Secar al aire las extensiones. Se ha de ser consciente de los inconvenientes de este paso: Se produce una deshidratación menor que si la fijación hubiera sido en húmedo. Se produce la expansión de las cabezas de los espermatozoides inmaduros. Se produce la pérdida de la gota citoplasmática osmóticamente sensible. 6. Proceder a alguno de los siguientes métodos de tinción: Papanicolaou, Shorr, Giemsa (Opción 1: Extensión en alcohol metílico 3 minutos, Giemsa–diluido 1:92 en agua coloración 20 minutos, aclarar y dejar secar), Cristal Violeta (Opcióncoloración 2. Fijaciónen en alcohol éter 50:50 minutos, con cristal violeta minuto y medio). 7. Observar al microscopio a 1000 aumentos. 8. Se deben contar al menos 200 espermatozoides/portaobjeto. 9. Interpretación de la morfología. Un espermatozoide debe cumplir los siguientes criterios estrictos (Kruger) en cada una de sus partes para considerarse normal (Ver ilustración). Cabeza:


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MANUAL DE PRÁCTICAS a. b. c. d. e.


Forma oval. Longitud 3,7-4,7 micras. Anchura 2,5-3,2 micras. Relación longitud/anchura 1,3-1,8. Acrosómica 40-70% de la cabeza.

Pieza intermedia: a. Anchura <1 micra. b. Longitud 1 y ½ cabeza. c. Unión axial a la cabeza. d. Gotas de restos citoplasmáticos <1/3 de la cabeza. Flagelo: a. Recto o no presentar angulaciones bruscas que sugieran rotura. b. Longitud 45 micras. Restos citoplasmáticos: El área de los restos citoplasmáticos debe ser menor a 1/3 de la cabeza. El quinto manual de la OMS establece un valor para el límite inferior de referencia para la morfología espermática del 4%.

Clasificación de los defectos morfológicos de los espermatozoides.


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PRÁCTICA No 15


EXTRACCI N DE ADN DE TEJIDOS VEGETALES Y ANIMALES

COMPETENCIAS: 1. Comprende la importancia de la extracción y purificación del ADN. 2. Valora el papel de la extracción de ADN en protocolos de análisis. 3. Aplica procedimientos sencillos para la extracción de ADN en muestras vegetales y animales. 4. Se interesa por la comprensión de conceptos relacionados a la genética molecular y las aplicaciones de la genómica a la medicina.

I. INTRODUCCIÓN: El Ácido desoxirribonucleico o simplemente ADN, es el material genético de todos los organismos vivos y de casi todos los virus. Es el ADN quien lleva la información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la duplicación de la misma molécula. Esta biomolécula fue detectada en el núcleo celular por el investigador F. Miesher en 1869, y desde los años cuarenta, Avery y sus colaboradores descubrieron que el material genético está formado de ADN. La molécula de ADN (que es la que se va a extraer en ésta actividad práctica) está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Las dos cadenas de nucleótidos quelasconstituyen una molécula ADN,cadenas se mantienen unidas entre sí porque se forman enlaces entre bases nitrogenadas de de ambas que quedan apareadas. La unión de las bases se realiza mediante puentes de hidrógeno, y este apareamiento está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). La estructura de un determinado ADN está definida por la "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de nucleótidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la información genética del ADN. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es, por tanto, crítico para la célula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa genético de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje genético. La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado (A-T; G-C), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automáticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria. Partiendo del hecho de que para el estudio de las otras biomoléculas: lípidos, proteínas, enzimas, carbohidratos y vitaminas, no sólo existen diversos procedimientos prácticos para complementar la parte teórica, sino que además, son moléculas que por su importancia en la alimentación y en la salud humana, son más conocidas y reconocidas por los alumnos (y en general por todas las personas), no así, para el caso del ADN, pues éste ni forma parte directa de nuestra dieta, ni lo podemos consumir


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en su esencia como consumimos vitaminas a partir de frutas y vegetales, y aún más, su grado de abstracción nos resulta aún mayor. Además, por todas las implicaciones y aplicaciones que del estudio y manipulación de la molécula de ADN se derivan, se considera el descubrimiento de la misma como la segunda gran revolución científica (la primera fue para el campo de la física, con la bomba atómica). En los últimos años los constantes avances científicos y técnicos han tenido un profundo impacto en el ámbito de la prueba. La dactiloscopia, la balística, la documentoscopia, etc., son ejemplos de esta proyección de los conocimientos científicos en el campo policial y judicial. Los avances han sido particularmente espectaculares en el ámbito de la Biología Molecular. En concreto, lo que se denomina Genética Forense, consistente en el análisis genético de la diversidad humana, ha marcado un antes y un después en la resolución de ciertos problemas judiciales. Precisamente por ello, para reflexionar sobre los malentendidos y los problemas que plantea la prueba científica puede ser útil tomar como referencia una de las pruebas científicas que más fiabilidad y prestigio han alcanzado: LA PRUEBA DE POLIMORFISMOS ADN. Para estudiar el ADN es imprescindible aislarlo e identificarlo. Existen diferentes métodos de aislamiento, dependiendo del tipo de estudios o investigación que se quiera realizar. Sin embargo todos comparten el hecho de que, debido a que la molécula se encuentra al interior de estructuras membranosas y está asociada con proteínas, se requiere usar sustancias adecuadas para obtener al ADN de forma más purificada posible. La técnica utilizada en esta actividad experimental, se basa por un lado, en el principio de que el componente lasromper membranas los lípidos, cuallado, se utiliza un detergentefundamental (surfactante)depara estas plasmática estructuras yy nuclear, permitir lason salida del ADN.por Porlo otro el ADN de vegetales y animales se encuentra asociado a proteínas de tipo histona, por la tanto, al agregarle alcohol se precipitan las proteínas y de esta forma se obtiene el ADN como una estructura más pura. Finalmente, se conoce que el ADN es una molécula de carácter ácido, lo que permite ser identificada con colorantes específicos como el azul de metileno, naranja de acridina y otros.

Figura 1. Acción del detergente sobre las células


Figura 2. Filamentos de ADN en la interfase.

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II. MATERIALES: De la Cátedra

Del alumno

 Microscopio

Compuesto con sistema de videocámara.  Vasos de precipitación.  Baño maría 37 oC  Embudos de vidrio.

 Licuadora

 Varillas de agitación.  Gradillas.  Pipetas Pasteur de plástico.  Lámina portaobjeto y laminilla cubreobjeto.  Colorante azul de metileno.  Cloruro de sodio.  SDS  Agua destilada.  Alcohol refrigerado.

 Papel secante.  Detergente líquido

III.

o pibe (se requiere para licuar tanto el material vegetal como el animal)  Cuchillos de cocina.  Colador pequeño.  Gasa o ayudín líquido (solo 100 mL).  100 g de Hígado de pollo  Material vegetal: espinaca o cualquier otro vegetal (hojas).  Una piña (por grupo de práctica).

PROCEDIMIENTO: 3.1. EXPERIENCIA 01. Extracción de ADN de tejidos vegetales y animales. 1. Colocar el material vegetal en una placa de Petri y pesar 50 g. de ellos. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Agregarlos a un recipiente dede molienda o en su defecto al vaso cantidad del pibe odelicuadora. Agregar el doble de volumen agua destilada y una pequeña sal. Licuar (por 30 seg.) o moler según sea el caso. Colar el macerado obtenido con ayuda de un colador con gasa y el líquido obtenido depositarlo en un beacker refrigerado. Anadir al filtrado 20 mL de detergente líquido y agitar suavemente con una varilla hasta que el filtrado tome un aspecto mucoide. Agregar unos 5 mL de zumo de piña o de papaya y mezclar una sola vez. Dejar reposar de 2 a 4 minutos. Separar el filtrado en un volumen aproximado de 6 mL en tubos de ensayo grande o beacker pequeños. Inclinar levemente el tubo e incorporar LENTAMENTE el alcohol bien refrigerado por la paredes del tubo en cantidad equivalente al mismo volumen de macerado. Esperar aproximadamente dos minutos para observar unos filamentos blanquecinos en la interfase que es el “ADN” extraído por esta técnica.

12. Tomar una muestra de filamentos blanquecinos con un estilete o con una varilla de vidrio y colocarlos sobre un portaobjetos limpio. 13. Añadir una gota de azul de metileno y colocar el cubreobjetos. 14. Observar los filamentos de ADN al microscopio con objetivos de 10X y 40X. NOTA: Se realiza el mismo protocolo para la extracción de ADN a partir de células animales.


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Manual Biología Celular y Molecular 2017 2

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