laporan praktikum biologi sel molekuler

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

Oleh KURNIAWAN NIM. P2BA09003

PROGRAM STUDI MAGISTER BIOLOGI PROGRAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO 2010

2010

Laporan Praktikum Biologi Sel Molekuler S2 Biologi UNSOED KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan laporan praktikum biologi molekuler program studi S 2 Biologi Universitas Jenderal Soedirman ini yang telah tertunda sekian lama. Pada kesempatan kali ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dosen Pengampu Mata Kuliah Biologi Sel Molekuler yang terdiri atas Dr. Hendro Pramono, MS dan Ibu Alice Yuniati, Ph.D. Tidak lupa pula ucapan terima kasih penulis tujukan kepada dua Asisten Praktikum Biologi Sel Molekuler yaitu Mas Farid Fatkhomi dan Arief Mulyanto yang telah dengan penuh dedikasi mengarahkan kami dalam pelaksanaan praktikum ini. Penyusunan laporan praktikum ini telah diusahakan sesuai dengan aturan penulisan laporan yang telah ditetapkan baik tentang sistematika maupun isi laporan. Mengenai isi laporan telah diupayakan sesuai dengan tujuan acara praktikum dengan didasarkan pada berbagai sumber referensi yang relevan. Akhirnya penulis berharap semoga laporan ini bisa memberikan sedikit manfaat bagi studi biologi sel molekuler. Amin.

Purwokerto, Maret 2010 ttd Penulis

2

Laporan Praktikum Biologi Sel Molekuler S2 Biologi UNSOED

2010

LEMBAR PENGESAHAN

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER PROGRAM STUDI S 2 BIOLOGI PROGRAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

Oleh KURNIAWAN P2BA09003

Diajukan sebagai salah satu kelengkapan penilaian mata kuliah biologi sel molekuler

Disetujui dan disahkan Pada tanggal ................................. .................................

Asisten Praktikum

................................

3


2010

DAFTAR ISI

Kata Pengantar ............................................... ...................................................................... .............................................. ................................. ..........

2

Lembar Pengesahan .............................................. ..................................................................... .............................................. .......................... ...

3

Daftar Isi ............................................ ................................................................... .............................................. ............................................. ......................

4

I.

Isolasi DNA plasmid ............................................... ...................................................................... ..................................... ..............

5

II.

Pemotongan DNA plasmid ............................................. .................................................................... .............................. .......

11

III.

Elektroforesis gel agarosa ............................................ ................................................................... ................................. ..........

18

IV.

Transformasi ............................................ ................................................................... .............................................. .............................. .......

26

Lampiran ............................................ ................................................................... .............................................. ............................................. ......................

33

4


2010

I. ISOLASI DNA PLASMID

1.

Landasan Teori

Semua organisme tersusun atas sel – sel, yang merupakan struktur fungsional terkecil dari suatu organisme. Berdasarkan jumlah sel penyusunnya, organism dapat dibedakan atas organisme yang hanya terdiri atas satu sel (uniseluler) dan organisme yang terdiri atas banyak sel (multiseluler) (Raven and Johnson, 1989). Berdasarkan klasifikasi yang disampaikan oleh Carl Woese, organisme yang ada di dunia ini dapat dikelompokkan atas tiga domain yaitu prokariotik, eukariotik, dan archaea. Masing – masing domain ini memiliki ciri dan karakteristik yang spesifik yang menjadi pembeda antara domain satu dengan yang lainnya. Setiap sel baik itu prokariotik, eukariotik, maupun archaea mempunyai informasi hereditas yang dikode oleh DNA. Eukariotik memiliki DNA berbentuk linier yang terdiri atas segmen – segmen dan terikat dengan protein untuk membentuk kromosom yang tersimpan di dalam nukleus. Berbeda dengan bentuk DNA eukariotik, DNA prokariotik berbentuk sirkular untai untai ganda yang terletak di dalam sitoplasma (Raven and Johnson, Johnson, 1989). Bakteri merupakan salah satu organisme yang termasuk dalam kelompok organism prokariotik sehingga memiliki DNA kromosom yang berbetuk sirkuler dan terletak di sitoplasma. Selain memiliki DNA kromosom, bakteri ternyata juga memiliki DNA sirkuler lain yang kemudian dikenal dengan sebutan plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA untai ganda berbentuk sirkuler yang terpisah dari DNA kromosom dengan ukuran mulai dari beberapa ribu pasang basa sampai dengan 100 kilobasa (Lodish et all , 1995). Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup bakteri (Raven and Johnson, 1989). Tetapi gen – gen tersebut berperan dalam menyandi sintesis protein yang memiliki memiliki resistensi terhadap antibiotik. Nilai lebih lain yang dimiliki oleh plasmid adalah kemampuannya untuk dapat ditransfer ke sel lain dan kemampuan untuk dapat memperbanyak diri sendiri (www.en.wikipedia.org/wiki/Plasmid www.en.wikipedia.org/wiki/Plasmid). ). Melihat adanya kemampuan tersebut, maka para ahli sekarang telah menjadikan plasmid sebagai salah satu vektor yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan. Dalam teknologi ini, plasmid akan diberi perlakuan tertentu sehingga dapat membawa gen – gen yang menyandi senyawa, produk, atau sifat tertentu untuk kemudian ditransfer dari organisme satu ke organisme lainnya (Retnoningrum, 2010)

5


2010

Lodish et al (1995) menyatakan bahwa plasmid merupakan salah satu materi yang sangat diperlukan dalam teknologi DNA rekombinan. Oleh karena itu, pada praktikum biologi sel molekuler ini sangat tepat dilakukan acara praktikum isolasi DNA plasmid.

2.

Tujuan

Tujuan dari acara praktikum kali ini adalah untuk melihat cara kerja isolasi DNA plasmid pUC 19

3.

Alat dan Bahan 3.1. Alat

1.

Bunsen burner

2.

Cawan petri

3. Freezer 4.

Glove

5.

Jarum ose

6.

Erlenmeyer 100 ml

7.

Microcentrifuges 5415D (Eppendorf)

8.

Micropipette segala ukuran

9. Refrigerator 10. Shaker incubator 11. Spidol marker 12. Tip micropipette segala ukuran (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 13. Tube microsentrifuge 3.2. Bahan

1. Ampisilin 2. E. coli JM109 yang mengandung plasmid pUC19 3. Es batu 4. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair 5. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

4.

Cara Kerja

1. Koloni tunggal bakteri E. coli JM 109 yang mengandung plasmid pUC19 dinokulasikan ke medium LB cair 25 ml kemudian diinkubasi semalam (16 jam) pada suhu 37 oC di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm;

6


2010

2. Kultur hasil inkubasi dimasukkan ke dalam beberapa tube microsentrifuge masing – masing sebanyak 3 ml ml dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g (5000 rpm) selama 5 menit sampai terbentuk pelet sel; 3. Pelet sel yang diperoleh diresuspensi dengan menambahkan 1 ml larutan STE ke dalam tube microsentrifuge kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g (5000 rpm) selama 5 menit; 4. Pelet sel diresuspensi kembali (vorteks dan bolak – balik 4 – 6 kali) dengan menambahkan 250 l Buffer P1 dingin sampai homogen; 5. Suspensi ditambah dengan 250 l Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4 – 6 kali sampai warnanya berubah menjadi biru; 6. Suspensi selanjutnya ditambah dengan 350 l N3 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak – balik sebanyak 4 – 6 kali sampai berwarna putih; 7. Tube microsentrifuge disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm (17,900 x g) selama 10 menit; 8. Supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13.000 rpm (17,900 x g) selama satu menit; 9. QIAprep spin column diangkat dan cairan yang tertampung di dalam collection tube dibuang kemudian QIAprep spin column dipasang kembali ke dalam collection tube ; 10. QIAprep spin column dicuci dengan 500 µl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. 11. Cairan yang tertampung di dalam collection tube dibuang kemudian ke dalam

QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 µl buffer PE dingin dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama satu menit. 12. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci. 13. QIAprep spin column dipindahkan ke tube microsentrifuge 1,5 ml baru dan ditambah dengan 50 µl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama satu menit (elusi pertama). 14. QIAprep spin column dipindahkan ke tube microsentrifuge 1,5 ml yang lain dan ditambah dengan 25 µl buffer EB. Tube microsentrifuge beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama satu menit (elusi kedua). 15. Diperoleh DNA plasmid sebanyak 50 µl (elusi pertama) dan 25 µl (elusi kedua) yang kemudian dicek dengan cara dielektroforesis dalam gel agarosa

7

2010

Laporan Praktikum Biologi Sel Molekuler S2 Biologi UNSOED 5.

Hasil dan Pembahasan

Teknologi DNA rekombinan pada dasarnya adalah pembentukan kombinasi materi genetik baru melalui penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami duplikasi di dalam suatu sel organisme lain yang bertindak sebagai sel inang (Susanto, 2008). Jadi, teknologi ini merupakan upaya mengubah susunan gen dari suatu organisme dengan maksud untuk mendapatkan organism yang memiliki keunggulan dan kelebihan dalam sifat – sifat tertentu. Dari pengertian di atas, kita dapat menemukan satu istilah penting yaitu vektor. Istilah ini merujuk pada molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi dari fragmen DNA asing tersebut (Susanto, 2008) Telah disampaikan di atas, bahwa plasmid memiliki peran yang penting dalam teknologi DNA rekombinan. Oleh karena itu, sangat perlu bagi kita untuk dapat mengisolasi DNA plasmid dari suatu bakteri. Terdapat beberapa macam metode isolasi DNA plasmid sampai saat ini, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,

alkaline lysis, dan enzymatic digestion (Devi dan Victor, 2009). Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan isolasi DNA plasmid dengan metode

mini preparation dalam kondisi basa ( alkaline lysis ). Proses isolasi ini dilakukan dengan menggunakan miniprep kit yang diproduksi oleh Qiagen (Anonim, 2006). Hasil isolasi DNA plasmid yang diperoleh kelompok kami menunjukkan kualitas yang kurang bagus, hal ini ditunjukkan dengan kondisi pita yang tipis dan terfragmentasi (lihat gambar 5.1; 10). Ternyata hal ini tidak terjadi dengan DNA plasmid yang diperoleh kelompok lain (lihat gambar 5.1; 11), dimana pita DNA plasmid yang diperoleh menunjukkan dua pita yang tajam dan utuh. 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 Keterangan : HindIII 1. DNA λ/ HindIII 2. K 1 (pUC 19/ HindIII) HindIII) 3. K 2 (pUC 19/ EcoRI) EcoRI) 4. K 3 (pUC 19/ PS PS tI) tI) HindIII) 5. K 4 (pUC 19/ HindIII) 6. A1 (pUC 19/ EcoRI) EcoRI) PS tI) 7. A2 (pUC 19/ PS tI) 8. A3 (pUC 19/ HindIII) HindIII) 9. A4 (pUC 19 uncut) 10. K 1 (pUC 19 hasil isolasi) 11. K 2 (pUC 19 hasil isolasi)

Gambar I.5.1. Elektroforegram Elektroforegram Isolasi DNA plasmid pUC 19

8


2010

Dari gambar I.5.1. di atas memang terlihat bahwa DNA plasmid yang kita peroleh sangat tipis dan mengalami fragmentasi. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh adanya kesalahan prosedur dalam penambahan jenis solution. Ketika praktikum berlangsung, terjadi kekeliruan penambahan jumlah bufer P2 dari yang seharusnya hanya sebanyak 250 µl, tetapi dalam prakteknya kemarin kita menambahkan sebanyak 350 µl. Akibatnya, penambahan solution selanjutnya (bufer N3) menjadi berkurang yaitu dari yang seharusnya 350 350 µl menjadi 250 µl. Di dalam protokol yang dikeluarkan oleh qiagen (Anonim, 2006) disebutkan bahwa penambahan bufer P2 adalah sebanyak 250 µl, sedangkan untuk bufer N3 sebanyak 350 µl. Bufer P2 merupakan bufer yang berperan dalam proses pelisisan sel, dimana kandungan bufer ini berupa sodium hidroksida (NaOH) dan sodium dedocyl sulphate (SDS). Sodium hidroksida berfungsi untuk mendenaturasi DNA kromosom dan DNA plasmid untai ganda menjadi untai tunggal, sedangkan SDS merupakan suatu detergen yang akan membantu proses pelisisan sel dengan cara melarutkan fosfolipid dan komponen protein sehingga membran sel akan mengalami kerusakan (Brown (1991); http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Extraction.html)) http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Extraction.html Bufer N3 dari miniprep kit ini merupakan larutan netralisasi yang mengandung guanidine hydrochloride dan asam asetat. Potasium asetat akan membentuk endapan yang tidak larut dalam kompleks SDS/lipid/protein dan mampu menetralisasi sodium hidroksida yang ada pada tahap sebelumnya untuk menciptakan kondisi pH yang netral. Pada kondisi netral ini, DNA mengalami renature , dimana DNA kromosom akan terikat dengan endapan kompleks SDS/lipid/protein, sedangkan DNA plasmid akan membentuk untai ganda kembali dalam supernatan dan terhindar dari perangkap endapan SDS/lipid/protein (Anonim, 2006). Selain itu, bufer N3 juga mengandung garam berkonsentrasi tinggi yang berperan dalam denaturasi protein, DNA kromosom, dan sisa – sisa sel sehingga akan menghasilkan larutan DNA plasmid murni dan berkonsentrasi tinggi.

6.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum dan pembahasan di atas, maka dapat diambil kesimpulan bahwa DNA plasmid berhasil diisolasi tetapi kualitasnya rendah (tipis dan terfragmentasi) sebagai akibat dari kesalahan prosedur.

9


2010

DAFTAR REFERENSI

Anonim. 2006. Qiaprep Miniprep Handbook second edition. www.qiagen.com www.qiagen.com.. Diakses 20 Februari 2010 Brown, T.A. 1991. Pengantar cloning Gena. Yayasan Essentia Medica. Yogyakarta. Devi dan Victor. 2009. Laporan Praktikum Teknik Analisa DNA: Isolasi DNA Plasmid. Fakultas Teknobiologi. Universitas Surabaya. http://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid. http://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid. Diakses 30 januari 2010 http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Extraction.html. Diakses 30 januari 2010 Lodish, H., D. Baltimore, A. Berk, S.L. Zipursky, P. Matsudaira, and J. Darnell. 1995. Molecular Cell Biology. Scientific American Books. New York. Raven, P.H. and Johnson, G.B. 1989. Biology second edition. Times Mirror/Mosby College Publishing. Missouri. Retnoningrum, D.S. 2010. Prinsip Teknologi DNA Rekombinan. Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung. www.download.fa.itb.ac.id www.download.fa.itb.ac.id.. Diakses 30 Januari 2010 Susanto, A.H. 2008. Bab VIII. Dasar – Dasar Teknologi DNA Rekombinan. http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/dasar-tek-dna-rek/.. Diakses 30 Januari 2010 http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/dasar-tek-dna-rek/ .

10


2010

II. PEMOTONGAN DNA PLASMID

1.

Landasan Teori

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi. Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan Pst I dapat memotong masing-masing strand DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi.

2.

Tujuan

Tujuan dari acara praktikum kali ini adalah untuk melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid

3.


1. Freezer 2.

Glove

3.


4.

Microsentrifuge 5415D ( Eppendorf )

5.

Spidol marker

6.

Tip micropipette segala ukuran ( Bio-Rad Bio-Rad dan Axygen Scientific)

7.

Tube microsentrifuge

8.

Water bath tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

3.2. Bahan

1.

BSA

2.

Buffer E

3.

Buffer H

4.

ddH2O

11

2010

Laporan Praktikum Biologi Sel Molekuler S2 Biologi UNSOED 5.

DNA plasmid pUC 19

6.

Es batu

7. Restriction enzyme of Hin d III , , EcoR I , , Pst I

4.

Cara Kerja

1.

Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam beberapa tube microsentrifuge berukuran 1 ml, dengan komposisi sebagai berikut No

2.

ddH2O Buffer H Buffer E BSA DNA pUC 19 Enzim Hind III Enzim EcoR I Enzim Pst I

1 (µl) 10,5 2,5 0,5 10 1,5 -

2 (µl) 10,5 2,5 0,5 10 1,5 -

Tube (µl) 3 (µl) 10,5 2,5 0,5 10 1,5

Volume reaksi

25

25

25

Komponen

4 (µl) 10,5 2,5 0,5 10 1,5 -

5 (µl)

6 4 -

25

10

Campuran reaksi dihomogenkan sebentar dengan cara di spin menggunakan microsentrifuge selama 1 – 2 detik dan setelah itu tube microsentrifuge diketuk – ketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah t ersuspensi;

3.

Tube microsentrifuge diinkubasi selama 4 jam di dalam water bath bersuhu 37 oC;

4.

Tube microsentrifuge dipindahkan ke dalam water bath bersuhu 70 0C selama 10 menit untuk inaktifasi enzim restriksi;

5.

5.

DNA pUC 19 hasil pemotongan dicek menggunakan elektroforesis gel agarosa;


Pada acara praktikum kali ini dilakukan pemotongan DNA plasmid pUC19 dengan beberapa macam enzim restriksi yaitu enzim Hind III, EcoR I, dan Pst I sesuai dengan reaksi restriksi di atas. Hasil pemotongan DNA plasmid kemudian dianalisis dengan cara elektroforesis pada gel agarosa (gambar II.5.1.)

12

2010


1

2

3

Keterangan : 1. DNA λ/ HindIII HindIII 2. K 1 (pUC 19/ Hind Hind III) 3. K 2 (pUC 19/ EcoR EcoR I) Pst I) 4. K 3 (pUC 19/ Pst I)

4

23130 b 9416 pb 6557 b 4361 b

5543

4897 pb

5210 pb

b

Gambar II.5.1. Elektroforegram Pemotongan Pemotongan DNA plasmid pUC 19

Dari gambar di atas, dapat dilihat bahwa DNA plasmid yang dipotong menggunakan enzim restriksi Pst I diperoleh satu fragmen yang cukup baik, meskipun tidak terlalu tajam (lajur 4). Hasil yang lebih baik diperoleh untuk DNA plasmid yang dipotong dengan enzim restriksi Hind III (lajur 2) dan EcoR I (lajur 3), dimana pita DNA terlihat sangat tajam.

Pst I merupakan salah satu enzim restriksi endonuklease yang diperoleh dari Providencia stuartii yang dapat memotong urutan basa DNA untai ganda dengan sisi

pengenalan

▼

CTGCA G/GACGT▲C

(www.roche-applied-science.com www.roche-applied-science.com;;

www.promega.com;; www.en.wikipedia.org/wiki/PstI www.promega.com www.en.wikipedia.org/wiki/PstI). ). Enzim ini dapat digunakan untuk memotong DNA bakteriofage lambda, DNA kromosom dan DNA plasmid bakteri (www.promega.com www.promega.com). ). Plasmid pUC 19 merupakan salah satu vektor kloning yang biasa digunakan dalam penelitian – penelitian biologi molekuler molekuler (Puspitasari, 2008). Plasmid ini berukuran 2686 2686 pasang basa dan memiliki tiga bagian utama yaitu gen resisten ampisilin, gen lac-Z yang mengandung Multiple Cloning Site

(MCS), dan Origin of Replication

(ORI)

(www.en.wikipedia.org/wiki/pUC19 www.en.wikipedia.org/wiki/pUC19))

13


2010

Telah disebutkan di atas, bahwa plasmid pUC 19 memiliki gen lacZ yang mengandung Multiple Cloning Site (MCS) yang berisi sisi pengenalan dari beberapa macam enzim restriksi. Salah satu jenis enzim restriksi yang dikenali oleh plasmid ini adalah enzim Pst I yang memiliki sisi pengenalan restriksi pada urutan basa nomor 435.

Gambar II.5.2. Struktur Plasmid pUC 19 maps / pUC19 _ map map.pdf) (dikutip dari www.neb.com/nebecomm/tech.../ restriction.../ maps

Gambar II.5.3. Grafik Estimasi Ukuran Fragmen DNA Plasmid Hasil Restriksi

14

2010


Hasil Perhitungan dengan menggunakan software microsoft office excel 2003 menunjukkan bahwa ukuran fragmen DNA plasmid yang telah dipotong menggunakan enzim Hind III, EcoR I, dan Pst I berturut – turut adalah 4897 pb, 5210 pb, dan 5543 pb (lihat gambar II.5.1). Penentuan ukuran fragmen DNA plasmid hasil restriksi ini di dasarkan pada perbandingan jarak migrasi yang ditempuh oleh fragmen DNA plasmid dengan fragmen DNA marka yang telah diketahui pada suatu gel agarosa hasil elektroforesis.

Menurut

Brown,

(1991)

dinyatakan

bahwa

elektroforesis

akan

memisahkan molekul DNA sesuai dengan ukurannya. Semakin kecil ukuran DNA, maka semakin cepat migrasinya. Dari hasil perhitungan ini terlihat bahwa ukuran fragmen DNA hasil restriksi ternyata lebih besar dari ukuran DNA plasmid pUC 19. Adalah sesuatu yang tidak masuk akal, bahwa ketika suatu untai DNA dipotong dengan enzim restriksi tertentu ternyata hasil potongannya memiliki ukuran yang lebih besar dari ukuran DNA asal. Terdapat beberapa uraian yang bisa digunakan untuk menjawab fenomena tersebut. Hal ini didasarkan pada hasil studi, bahwa setiap enzim restriksi memiliki permintaan yang spesifik agar proses restriksi dapat berlangsung optimal. Kondisi penyimpanan dan pengujian ideal sangat diperlukan untuk mendukung aktivitas dan keakuratan fungsi suatu enzim tertentu (www.promega.com www.promega.com). ). Seperti halnya dengan sifat enzim pada umumnya, aktivitas dan stabilitas enzim restriksi juga dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti suhu, pH, kofaktor, komposisi garam, dan kekuatan ionik. Selain itu, jenis buffer, adanya kontaminan (DNA tipe lain, nuclease, dan inhibitor), pelarut organic, detergen, dan chelating agent juga ikut mempengaruhi aktivitas dan stabilitas enzim restriksi (www.promega.com ( www.promega.com). ).

Pst I merupakan salah satu enzim restriksi yang dalam penggunaannya perlu ditambahkan buffer solution H agar dapat mencapai aktivitas optimal 100 %. Reaksi restriksi DNA dengan Pst I biasanya menggunakan buffer H 10X sebanyak 2 – 2,5 ul untuk volume total 25 ul. ( www.promega.com www.promega.com;; www.roche-applied-science.com www.roche-applied-science.com). ). Pada praktikum kemarin, untuk pada reaksi restriksi dengan Pst I, digunakan buffer solution E. Penambahan buffer solution E pada reaksi restriksi dengan Pst I hanya mampu memberikan persentase aktivitas sebesar 25 – 50 % saja (www.promega.de ( www.promega.de). ). Kemungkinan lain yang bisa digunakan untuk menjelaskan fenomena ini adalah, adanya perbedaan bentuk konformasi antara DNA plasmid hasil restriksi dengan DNA plasmid asal. Brown (1991) menyatakan bahwa bentuk konformasi DNA plasmid dapat mempengaruhi kecepatan migrasi molekul DNA pada gel agarosa. Secara umum, bentuk konformasi DNA plasmid ada lima macam. Berikut adalah kelima bentuk konformasi

15


2010

DNA plasmid yang diurutkan berdasarkan kecepatannya dalam bermigrasi pada gel agarosa yaitu dari yang terlamban sampai yang tercepat. a. Nicked open circular, merupakan DNA yang memiliki satu untai yang terpotong; b. Relaxed circular, merupakan DNA yang kedua untainya sepenuhnya tidak terpotong tetapi telah memiliki kemampuan untuk berelaksasi secara enzimatik; c. Linear, merupakan DNA dengan ujung bebas dengan kedua untai yang telah terpotong; d. Supercoiled (covalently closed circular), merupakan DNA yang yang kedua untainya sepenuhnya tidak terpotong dan dengan suatu bengkokan, maka akan menghasilkan bentuk yang padat; e. Supercoiled denatured, merupakan DNA yang mirip dengan supercoiled, tetapi memiliki daerah yang tidak berpasangan yang membuatnya menjadi sedikit kurang padat (www.en.wikipedia.org/wiki/plasmid (www.en.wikipedia.org/wiki/plasmid). ). Jadi, berdasarkan pengelompokan plasmid ini, dapat diperkirakan bahwa fragmen DNA hasil restriksi kemungkinan hanya terpotong satu untai saja sehingga membentuk konformasi nicked open sirkuler yang lambat dalam bermigrasi pada gel agarosa. Plasmid dengan konformasi CCC (covalenly closed circular) memiliki kecepatan migrasi yang lebih tinggi daripada plasmid dengan konformasi OC (nicked open circular) (Brown, 1991). Pengukuran konsentrasi fragmen DNA plasmid pUC 19 yang dipotong dengan Pst I dilakukan melalui perbandingan tingkat perpendaran dari pita DNA marka dengan pita DNA plasmid. Menurut Nicholl (2008) dalam Fathkomi (2009), disebutkan bahwa estimasi konsentrasi DNA dapat ditentukan melalui perbandingan tingkat perpendaran DNA sampel dengan tingkat perpendaran DNA marka. Hasil analisis menunjukkan bahwa fragmen DNA hasil restriksi dengan enzim Pst I (lajur 4) memiliki tingkat perpendaran yang mirip dengan tingkat perpendaran dari pita kedua DNA marka (lajur 1). Dari perhitungan secara matematis, diperoleh data bahwa konsentrasi DNA plasmid hasil restriksi dengan Pst I adalah 5,714 ng/ul (lihat lampiran 1).

6.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, dapat diambil kesimpulan bahwa pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi Pst I tidak berhasil dilakukan.

16


2010

DAFTAR REFERENSI

Brown, T.A. 1991. Pengantar cloning Gena. Yayasan Essentia Medica. Yogyakarta. Nicholl (2008) dalam Fathkomi. 2009. Konstruksi Perpustakaan Genom Dari Isolat Bakteri TS 36 Menggunakan Vektor pUC 19. Skripsi. Fakultas Biologi Universitas Muhammadiyah Purwokerto. Purwokerto. Puspitasari, A. 2008. Fraksinasi Protein Bungan Kucing – Kucingan (Acalipha indica L) dan Uji Aktivitas Terhadap pemotongan DNA pUC 19. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta. 2008 www.roche-applied-science.com.. Diakses 23 Februari 2010 www.roche-applied-science.com www.promega.com.. Diakses 23 Februari 2010 www.promega.com www.en.wikipedia.org/wiki/PstI.. Diakses 23 Februari 2010 www.en.wikipedia.org/wiki/PstI www.en.wikipedia.org/wiki/pUC19.. Diakses 23 Februari 2010 www.en.wikipedia.org/wiki/pUC19 www.neb.com/nebecomm/tech.../restriction.../maps/pUC19 _ map map.pdf . Diakses 23 Februari 2010 www.promega.de.. Diakses 23 Februari 2010 www.promega.de www.en.wikipedia.org/wiki/plasmid.. Diakses 23 Februari 2010 www.en.wikipedia.org/wiki/plasmid

17

2010


III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

1.

Landasan Teori

Elektroforesis merupakan suatu teknik yang digunakan di dalam laboratorium untuk memisahkan suatu molekul tertentu (DNA) berdasarkan muatan dari molekul tersebut (www.life.illinois.edu/molbio/geldigest/electro.html#run (www.life.illinois.edu/molbio/geldigest/electro.html#run). ). Elektroforesis gel agarosa merupakan suatu metode yang digunakan dalam bidang biokimia dan biologi molekuler

untuk

memisahkan

molekul

DNA

atau

RNA

berdasarkan

ukuran

(http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis)) Teknik ini merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan mudah untuk dilakukan jika dibandingkan dengan teknik – teknik lain yang serupa. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA (Fatchiyah, 2006), estimasi ukuran molekul DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi, analisis produk PCR, dan memisahkan DNA atau RNA genom hasil pemotongan sebelum digunakan untuk Southern transfer atau Northern transfer. Sampai saat ini telah dikenal dua macam elektroforesis yaitu elektroforesis gel agarosa dan elektroforesis gel poliakrilamide. Elektroforesis gel agarosa memiliki sifat sebagai berikut tenaga yang dibutuhkan relatif rendah, mempunyai laju pemisahan lebih cepat, dapat memisahkan fragmen DNA antara 100 pb sampai 50 kb tergantung dari konsentrasi gel agarosa yang digunakan, dan medan gerak biasanya horizontal. Berbeda dengan elektroforesis gel agarosa, elektroforesis gel poliakrilamide memiliki sifat lebih efektif untuk pemisahan fragmen DNA antara 5 pb sampai 500 pb, membutuhkan tenaga yang relatif tinggi, ukuran perbedaan DNA yang terpisah mencapai 1 pb, pembuatannya relatif lebih sulit karena biasanya digunakan poliakrilamide dengan resolusi yang relatif tinggi, medan gerak secara vertikal dan listriknya konstan. Pada kesempatan kali ini, yang akan dipraktikumkan hanya sebatas pada elektroforesis gel agarosa. Hasil yang dirunning hanya berupa hasil restriksi DNA plasmid dengan beberapa macam enzim restriksi. Elektroforesis

DNA

merupakan

teknik

untuk

memisahkan

sampel

DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).

18


2010

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen – fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet terhadap gel agarosa yang dalam pembuatannya telah ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah dengan cara gel direndam di dalam larutan etidium bromid baru kemudian dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

2.

Tujuan

Tujuan dari acara praktikum elektroforesis gel agarosa ini adalah untuk melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa

3.


1. Digital camera 2.

Erlenmeyer 50 ml

3.

Gelas Ukur 25 ml

4.

Glove

5.

Isolasi kertas

6.

Kertas parafilm

7.

Kompor gas

8.

Lempeng asbes

9.


10. Seperangkat alat elektroforesis 11. Tip micropipette segala ukuran ( Bio-Rad Bio-Rad dan Axygen Scientific) 12. Tube microsentrifuge 13. UV transiluminator 3.2. Bahan

1.

Akuades

2.

Bubuk agarosa

3.

DNA marker ( λ/HindIII )

4.

DNA plasmid pUC 19 hasil isolasi ( uncut )

5.

DNA plasmid pUC 19 hasil restriksi ( cut )

19

2010

Laporan Praktikum Biologi Sel Molekuler S2 Biologi UNSOED 6. Etidium Bromid e (EtBr) 7.

Larutan buffer TAE 50X

8. Loading dye 6x

4.

Cara Kerja

1.

Membuat 250 ml larutan buffer TAE 1X dengan cara mencampurkan 5 ml TAE 50X ke dalam 245 ml akuades;

2.

Membuat gel agarosa 1 % dengan cara mencampurkan 0,2 g bubuk agarosa ke dalam buffer TAE 1X hingga volume 20 ml yang kemudian dipanaskan di atas api sampai homogen;

3.

Angkat gel agarosa cair dan biarkan suhunya turun sampai ± 45 oC

4.

Menyiapkan cetakan gel agarosa dengan cara menutup kedua ujung cetakan dengan isolasi kertas dan pastikan isolasi melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing – masing ujung cetakan;

5.

Memasang sisir pencetak sumuran di dekat salah satu ujung cetakan;

6.

Setelah suhu gel agarosa cair turun sampai ± 45 oC, tambahkan 1 l etidium bromide lalu kocok – kocok sampai homogen ( PERHATIAN PERHATIAN,, selalu gunakan sarung tangan karena ethidium bromide bersifat karsinogenik);

7.

Gel agarosa cair dituang ke dalam cetakan yang telah disiapkan dan biarkan sampai memadat;

8.

Sisir pencetak sumuran diangkat dan isolasi yang menutupi kedua ujung cetakan dilepas secara hati – hati;

9.

Gel agarosa padat dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis sehingga terendam dalam larutan TAE 1X;

10. Disiapkan beberapa loading dye 6X masing – masing sebanyak 1 µl disepanjang kertas parafilm berukuran ± 5 cm; 11. Masing – masing loading dye 6X dicampur dengan masing – masing 5 µl DNA marker, DNA plasmid hasil isolasi ( uncut ), ), DNA plasmid hasil pemotongan (cut) sampai homogen yang kemudian dimasukkan ke dalam sumuran – sumuran gel agarosa secara urut sesuai dengan penomoran berikut :

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Keterangan :

20


2010

1. DNA λ/ Hin HindIII 2. K 1 (pUC 19/ Hin HindIII) 3. K 2 (pUC 19/ Eco EcoRI) 4. K 3 (pUC 19/ PS tI) PS tI) 5. K 4 (pUC 19/ Hin HindIII) 6. A1 (pUC 19/ Eco EcoRI) 7. A2 (pUC 19/ PS tI) PS tI) 8. A3 (pUC 19/ Hin HindIII) 9. A4 (pUC 19 uncut) 10. K 1 (pUC 19 hasil isolasi) 11. K 2 (pUC 19 hasil isolasi) 12. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis; (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran, jika tidak maka posisi baki / gel harus dibalik); 13. Tekan tombol power pada posisi angka 1, atur besarnya voltase dan setting waktu running sesuai keinginan; 14. Tekan tombol run untuk menjalankan elektroforesis dan tunggu sampai terdengar bunyi alarm yang menandakan eletroforesis telah selesai; 15. Tekan tombol power pada posisi angka 0 dan kemudian angkat gel agarosa dari tangki elektroforesis; 16. Gel agarosa diletakkan di atas UV transluminator ; 17. Tekan tombol power pada posisi angka 1 dan amati pita – pita DNA yang terdapat pada gel agarosa; 18. Hasil visualisasi pita – pita DNA yang terlihat diambil gambarnya dengan menggunakan digital camera

5.


Elektroforesis gel agarosa merupakan suatu metode yang digunakan dalam bidang biokimia atau biologi molekuler untuk memisahkan molekul DNA atau RNA berdasarkan ukuran. Pada praktikum kali ini, kita mencoba untuk melakukan elektroforesis terhadap DNA plasmid pUC 19 hasil isolasi dari E. coli JM109, plasmid normal ( uncut ), ), dan plasmid yang telah diberi perlakuan berupa pemotongan dengan beberapa macam enzim restriksi seperti Hind III, III, EcoRI, dan PS tI tI (cut ). ). Sebagai pembanding, maka kita juga menyertakan DNA marka yaitu DNA λ/ Hind III untuk memudahkan kita nantinya dalam Hind III

21

2010


menentukan ukuran – ukuran fragmen dari plasmid yang kita peroleh. Berikut adalah gambaran secara jelas tentang hasil elektroforesis yang kita peroleh dalam praktikum.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 Keterangan : 1. DNA λ/ HindIII HindIII 2. K 1 (pUC 19/ HindIII) HindIII) 3. K 2 (pUC 19/ EcoRI) EcoRI) 4. K 3 (pUC 19/ PS PS tI) tI) HindIII) 5. K 4 (pUC 19/ HindIII) EcoRI) 6. A1 (pUC 19/ EcoRI) 7. A2 (pUC 19/ PS PS tI) tI) 8. A3 (pUC 19/ HindIII) HindIII) 9. A4 (pUC 19 uncut) 10. K 1 (pUC 19 hasil isolasi) 11. K 2 (pUC 19 hasil isolasi)

Gambar III.5.1. Elektroforegram Elektroforegram pUC 19 hasil isolasi dan hasil restriksi

Berdasarkan gambar hasil elektroforesis di atas, dapat kita ketahui bahwa hasil elektroforesis tidak terlalu bagus. Hal ini tercermin dari adanya beberapa sumuran yang pita DNAnya masih smear, tidak utuh, dan tidak terpisah secara jelas. Dari beberapa referensi yang kita dapat, diketahui bahwa baik buruknya hasil elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu : 1.

Ukuran DNA Semakin besar ukuran DNA, maka laju migrasi pada gel agarosa akan semakin lambat. Hal ini terkait dengan adanya kesulitan bagi molekul – molekul DNA yang berukuran besar untuk menembus pori – pori gel agarosa. Hal ini terjadi sebaliknya pada molekul – molekul yang berukuran lebih kecil, dimana molekul ini akan bergerak lebih cepat dalam menembus pori – pori gel agarosa. Sebagai akibatnya, maka molekul – molekul DNA akan terpisah berdasarkan ukurannya, dan penentuan ukuran DNA dapat dilakukan dengan membandingkan dengan DNA marka yang dirun secara bersama – sama dalam satu gel. Menurut Fatchiyah, (2006), jarak migasi molekul DNA pada gel merupakan laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.

2.

Konsentrasi Gel Agarosa

22


2010

Penggunaan gel agarosa dengan konsentrasi yang berbeda akan menghasilkan laju migrasi molekul – molekul DNA yang berbeda juga. Penentuan konsentrasi gel agarosa yang akan digunakan harus memperhatikan ukuran molekul – molekul DNA yang akan diruning. diruning. Umumnya, konsentrasi yang tinggi dari gel agarosa agarosa biasanya digunakan untuk memfasilitasi pemisahan molekul – molekul DNA yang berukuran kecil, sedangkan konsentrasi gel agarosa yang lebih rendah, umumnya digunakan untuk memisahkan molekul – molekul DNA dengan ukuran yang l ebih besar. 3.

Bentuk Konformasi DNA Laju migasi ternyata juga dipengaruhi oleh bentuk konformasi dari molekul DNA. Sampai saat ini dikenal tiga macam bentuk atau konformasi molekul DNA yaitu Super Helix Circular, Circular Opened, dan Linier . Meskipun ketiga bentuk atau konformasi molekul DNA tersebut memiliki berat yang sama, tetapi laju migrasi pada gel agarosa akan berbeda.

4.

Kekuatan Tegangan Hasil elektroforesis juga dipengaruhi oleh besar kecilnya sumber tegangan listrik yang digunakan. Apabila tegangan yang digunakan dinaikkan, maka laju migrasi dari fragmen – fragmen DNA yang berukuran yang lebih besar akan secara proporsional bermigrasi lebih cepat daripada fragmen – fragmen DNA

yang

berukuran yang kecil. Oleh karena itu, maka resolusi terbaik untuk fragmen – fragmen DNA yang berukuran lebih dari 2 kb dapat dicapai dengan menggunakan tegangan yang tidak lebih dari 5 volt per cm ke dalam gel. Yang dimaksud dengan nilai cm ini merupakan jarak antara dua elektroda, dan bukan panjang gel. 5.

Komposisi Buffer Ada beberapa buffer berbeda yang telah direkomendasikan untuk elektroforesis DNA, dan kebanyakan yang biasa digunakan adalah TAE (tris-acetate-EDTA) dan TBE (Tris-borate-EDTA). Penggunaan buffer yang berbeda akan menyebabkan laju migrasi yang berbeda pula. Hal ini disebabkan oleh adanya kekuatan ionic yang berbeda dari kedua buffer tersebut. Buffer yang digunakan dalam elektroforesis tidak hanya digunakan untuk menentukan nilai pH saja, tetapi juga berperan dalam menyediakan ion – ion yang diperlukan untuk mendukung konduktivitas.

6.

Komposisi Basa DNA dan Suhu Komposisi basa – basa DNA dan suhu secara umum tidak terlalu berpengaruh terhadap mobilitas dari molekul – molekul DNA. Umumnya elektroforesis dilakukan pada suhu kamar dan akan stabil pada kisaran suhu 4 – 30 oC. Namun demikian, perlu diperhatikan bahwa proses elektroforesis biasanya akan menghasilkan panas

23

2010


sehingga suhunya di dalam chamber akan naik. Apabila kenaikan suhu ini terlalu tinggi, maka ada kemungkinan molekul – molekul DNA yang sedang diruning akan mengalami kerusakan. Selain itu gel agarosa juga dapat mengalami pelelehan pada suhu di atas 90 oC. 7.

Keberadaan Pewarna

Intercalating

agent

Ethidium

bromide (EtBr)

merupakan

pewarna

berfluorescent yang biasa digunakan untuk mendeteksi asam nukleat. Sesaat setelah EtBr ini ditambahkan ke dalam gel agarosa, maka akan terjadi pengikatan molekul ini diantara sela – sela pasangan basa DNA. Penambahan EtBr ke dalam gel agarosa dimaksudkan untuk memudahkan kita dalam mengamati hasil elektroforesis karena hanya sedikit saja yaitu sekitar 1 ng molekul DNA yang dapat dideteksi tanpa menggunakan EtBr. EtBr akan menghasilkan perpendaran ketika dipaparkan di atas sinar UV. Namun demikian, perlu diperhatikan bahwa EtBr dapat mengurangi mobilitas linier dari molekul – molekul DNA sampai 15 % dan juga sifatnya yang karsinogenik atau zat mutagen kuat.

6.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa elektroforesis gel agarosa merupakan suatu teknik laboratorium yang digunakan untuk memisahkan molekul – molekul DNA atau RNA berdasarkan ukurannya. Teknik ini dalam penerapannya dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu ukuran DNA, konsentrasi gel agarosa, bentuk konformasi DNA, kekuatan tegangan, komposisi buffer, komposisi basa DNA dan suhu, serta keberadaan pewarna.

24


2010

DAFTAR REFERENSI

Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler dan Seluler Departemen Biologi Universitas Brawijaya. Malang http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis. Diakses 23 Januari 2010 http://www.life.illinois.edu/molbio/geldigest/electro.html#run.. Diakses 23 Januari 2010 http://www.life.illinois.edu/molbio/geldigest/electro.html#run

25

2010


IV. TRANSFORMASI

1.

Landasan Teori

Istilah transformasi pertama kali diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1928 yang pada saat itu sedang berusaha menemukan vaksin untuk melawan penyakit pneumonia yang disebabkan oleh bakteri. Ketika itu beliau menemukan bahwa suatu strain bakteri S. pneumoniae nonvirulen berubah menjadi virulen ketika terpapar dengan

S. pneumoniae yang virulen. Transformasi merupakan salah satu jalan bagi bakteri untuk memperoleh DNA asing selain konjugasi dan transduksi. Dalam bidang biologi molekuler, transformasi sering didefinisikan sebagai perubahan genetik di dalam suatu sel yang dihasilkan dari proses pemasukan, penggabungan genomik, dan ekspresi dari material genetik (DNA) asing (wikipedia.en.org) Dalam perkembangannya, istilah transformasi telah didefinisikan secara lebih luas lagi yaitu pengambilan molekul DNA oleh setiap jenis sel tanpa memandang apakah pengambilan molekul DNA tersebut menyebabkan adanya perubahan dalam sel yang dapat dideteksi atau tidak dan objek dari transformasi ini tidak terbatas pada bakteri saja, tetapi termasuk juga fungi, hewan, dan tumbuhan (Brown, 1991). Transformasi memiliki arti penting dan sangat berguna dalam penelitian – penelitian genetik bakteri di laboratorium terutama bagi pemetaan kromosom bakteri. Hal ini terjadi karena frekuensi terjadinya transformasi antara dua gen pada waktu yang sama merupakan petunjuk jarak antara gen – gen ini pada kromosom (Pelczar dan Chan, 1986).

2.

Tujuan

Setelah

mengikuti

pemahaman

acara

praktikum

ini,

mahasiswa

diharapkan

memiliki

yang benar mengenai transformasi dalam pembelajaran biologi sel

molekuler

3.


1.

Cawan Petri

26


2010

2. Digital camera 3. Drugalsky 4.

Erlenmeyer

5.

Jarum ose

6.


7.

Microsentrifuge 5415D ( Eppendorf )

8.

Shaker incubator

9.

Thermometer

10. Tip micropipette segala ukuran ( Bio-Rad dan Axygen Scientific) 11. Tube microsentrifuge 12. Water bath tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea) 3.2. Bahan

4.

1.

Es batu

2.

Media LB agar + ampisilin

3.

Media LB agar tanpa ampisilin

4.

Media LB cair

5.

Strain E. coli JM 109

Cara Kerja

1.

Satu koloni kultur semalam strain E. coli JM 109 diinokulasikan ke media LB cair 25 ml dan selanjutnya diinkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37 oC selama 16 jam (semalam);

2.

Kultur strain E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam diinokulasikan ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 µl kultur strain E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml (perbandingan volume media dan volume kultur 10:1) dan kemudian diinkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37 oC;

3.

Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tube

microsentrifuge dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g (5000 rpm) selama 5 menit; 4.

Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tube ditambahkan 500 µl CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g (5000 rpm) selama 5 menit;

5.

Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tube ditambahkan 200 µl CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tube

27

2010


microsentrifuge , dua tube (nomor 1 dan 2) diinkubasi selama 2 jam dan 3 tube lainnya (nomor 3, 4, dan 5) diinkubasi selama 16 jam; 6.

Tube microsentrifuge hasil inkubasi 2 jam ( tube nomor 1 dan 2), salah satunya ( tube nomor 1) ditambah dengan 10 µl plasmid pUC19 sirkuler, sedangkan tube lainnya (tube nomor 2) tidak ditambah dengan plasmid;

7.

Kedua tube tersebut selanjutnya diinkubasi di dalam es selama 20 menit dan kemudian diberi kejut panas ( heat-shock ) dalam water bath bersuhu 42 oC selama 90 detik dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit;

8.

Tube microsentrifuge ditambah dengan media LB cair dingin hingga volume 1 ml (± 800 l) dan selanjutnya diinkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37 oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam;

9.

Diambil masing – masing 100 µl kultur dari tube nomor 1 dan 2 untuk ditumbuhkan ke dalam media agar cawan LB amphisilin dan masing – masing 50 µl dari tube nomor 1 dan 2 untuk ditumbuhkan ke dalam media agar cawan LB tanpa amphisilin dan hasil plating kemudian diinkubasi dalam inkubator bersuhu 37 oC selama 16 jam;

10. Amati apa ada pertumbuhan koloni bakteri pada media LB amphisilin dan media LB tanpa amphisilin, dan jika ada maka hitung jumlah koloninya

5.


A

B

C

D

28


2010

Gambar IV.5.1. Seleksi hasil transformasi pada dua medium LB berbeda Keterangan : A. B. C. D.

Koloni bakteri E. bakteri E. coli JM 109 + pUC 19 pada medium agar cawan LB beramphisilin Koloni bakteri E. bakteri E. coli JM 109 + pUC 19 pada medium agar cawan LB tanpa amphisilin Koloni bakteri E. bakteri E. coli JM 109 pada medium agar cawan LB beramphisilin Koloni bakteri E. bakteri E. coli JM 109 pada medium agar cawan LB tanpa amphisilin

Transformasi merupakan suatu proses pemindahan DNA bebas sel yang mengandung sejumlah informasi DNA yang terbatas dari satu sel ke sel lainnya (Pelczar dan Chan, 1986). Transformasi ini terjadi ketika suatu sel yang disebut dengan sel donor mengalami lisis sel baik secara alamiah ataupun kimiawi dimana kandungan DNA yang dimilikinya akan keluar sel dan akhirnya dapat diambil oleh sel lain yang disebut dengan sel resipien sehingga terjadilah proses rekombinasi DNA. Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan transformasi terhadap strain bakteri E.

coli JM 109 dengan memasukkan plasmid pUC 19. Strai n bakteri tersebut dimasukkan ke dalam dua buah tube yang berbeda yaitu tube nomor satu yang ditambah dengan plasmid pUC 19 dan tube nomor dua yang tidak ditambah apapun. Dari kedua tube tersebut diambil masing – masing 100 µl untuk ditumbuhkan pada media agar cawan Luria Bertani (LB) yang mengandung antibiotik amphisilin dan masing – masing 50 µl untuk ditumbuhkan pada media agar cawan Luria Bertani tanpa antibiotik amphisilin. Hasil praktikum menunjukkan bahwa strain yang berasal dari tube nomor satu mampu tumbuh pada kedua media agar cawan LB baik yang mengandung antibiotik amphisilin maupun tidak. Setelah di hitung jumlah koloni bakterinya, maka diketahui bahwa pada media agar cawan LB yang mengandung antibiotik amphisilin terdapat 156 koloni bakteri sedangkan pada media agar cawan LB tanpa antibiotik amphisilin jumlah koloni bakterinya tidak dapat dihitung (TBUD). Hasil yang sama juga ditunjukkan untuk strain yang diambil dari tube nomor dua, dimana strain ini mampu tumbuh pada kedua media agar cawan LB baik yang mengandung antibiotik amphisilin maupun yang tanpa antibiotik amphisilin. Namun demikian, jumlah koloni yang tumbuh pada media agar cawan LB yang mengandung antibiotik amphisilin jumlahnya relatif lebih sedikit jika dibandingkan dengan strain dari

tube pertama yaitu hanya sekitar 11 koloni. Untuk media agar cawan LB yang tanpa antibiotik amphisilin berhasil ditumbuhi oleh strain secara spreader sehingga tidak dapat dihitung jumlah koloninya (TBUD). Dari hasil praktikum ini, maka dapat diketahui bahwa proses transformasi yang telah dilakukan mengalami kegagalan. Seharusnya pertumbuhan koloni bakteri pada

29


2010

media agar cawan LB yang mengandung antibiotik amphisilin hanya terjadi pada strain yang berasal dari tube pertama karena strain ini telah disisipi dengan plasmid pUC 19 yang memiliki kemampuan untuk tumbuh pada media yang mengandung amphisilin, sedangkan strain dari tube kedua seharusnya tidak mampu tumbuh pada media yang sama karena strain ini tidak disisipi dengan plasmid pUC 19. Plasmid pUC 19 memiliki gen penanda (marka) yaitu gen penyandi resistensi terhadap antibiotik ampisilin. Gen penyandi ini akan mengeksploitasi enzim β-lactamase ke dalam plasma sel bakteri inang, dimana enzim ini akan mengkatalisis proses hidrolisis cincin β lactam sehingga jika proses transformasi berhasil, maka sel bakteri inang akan memiliki kemampuan untuk hidup dan tumbuh pada medium yang mengandung antibiotik amphisilin (Sambrook et

al , 1989 dalam Puspitasari, 2008). Plasmid pUC 19 merupakan salah satu plasmid yang sering digunakan sebagai vector cloning dalam sel inang E. coli. Molekul ini merupakan DNA untai ganda, berbentuk sirkuler, berukuran kecil sekitar 2686 bp, dan memiliki jumlah salinan yang tinggi. Plasmid ini juga membawa 54 bp multiple cloning site (MCS) polylinker yang mengandung situs pengenal khusus untuk 13 jenis hexanucleotide-specific restriction

endonucleases yang berbeda. Secara umum, plasmid pUC 19 memiliki tiga bagian fungsional yaitu the origin of

replication , gen resisten amphisilin,dan gen lac-Z. Dari ketiga bagian ini, gen lac-Z inilah yang dapat digunakan dalam seleksi DNA insert dalam pembuatan DNA rekombinan. Gen lac-Z merupakan gen yang menyandi pembentukan enzim β-galactosidase, yaitu suatu enzim yang dapat memecah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Selain itu, gen lac-Z juga memiliki polylinker cloning site yang terdiri dari sisi pengenalan terhadap beberapa enzim restriksi. Adanya kemampuan E. coli JM109 dari tube kedua yang mampu tumbuh pada medium LB yang mengandung ampisilin kemungkinan disebabkan oleh adanya plasmid pUC 19 yang masuk menyisip ke dalam sel inang. Menurut Mangunwardoyo, (2002), disebutkan bahwa proses transformasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu suhu, jumlah/ukuran DNA, lama perlakuan kejutan panas, cara pemberian kejutan panas, adanya enzim eksonuklease, spesifikasi inang, kekuatan ion, konformasi dan konsentrasi DNA. pUC 19 termasuk ke dalam kategori plasmid yang berukuran kecil yaitu hanya sekitar 2,6 kb. Namun demikian, plasmid ini memiliki kemampuan untuk melakukan replikasi yang tinggi ( high copy number ) yaitu berkisar 500 – 7000. Adanya sifat seperti ini telah memberikan keuntungan tersendiri dimana proses transformasi akan berjalan

30


2010

lebih mudah karena umumnya akan lebih mudah dalam penanganan, lebih efektif untuk kloning DNA, dan memiliki sisi penyisipan yang spesifik (Muladno, 2002 dalam Puspitasari, 2008). Itulah mengapa plasmid pUC 19 dapat masuk menyisip ke dalam sel inang E. coli JM109 pada tube kedua.

6.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, maka dapat diambil kesimpulan bahwa proses transformasi pUC 19 ke dalam sel inang E. coli JM109 tidak berhasil dilakukan.

31


2010

DAFTAR REFERENSI

Brown, T.A. 1991. Pengantar cloning Gena. Yayasan Essentia Medica. Yogyakarta. http://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial Transformation . Diakses 23 Januari 2010 Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan, 1986. Dasar _ Dasar Mikrobiologi Jilid I. Universitas Indonesia. Jakarta. Muladno, (2002) dalam Puspitasari. 2008. Fraksinasi Protein Bungan Kucing – Kucingan ( Acalipha indica L) dan Uji Aktivitas Terhadap pemotongan DNA pUC 19. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta. 2008 Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) dalam Puspitasari, A. 2008. Fraksinasi Protein Bungan Kucing – Kucingan ( Acalipha indica L) dan Uji Aktivitas Terhadap pemotongan DNA pUC 19. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta. 2008 Mangunwardoyo, W. 2002. Transformasi Fragmen DNA Kromosom Xanthomonas campestris ke dalam Escherichia coli. Makara Sains. Volume 6 No 1.

32


2010

Lampiran 1. Estimasi Konsentrasi DNA plasmid pUC19

1

2

3

4 Keterangan : HindIII 1. DNA λ/ HindIII 2. K 1 (pUC 19/ Hind Hind III) 3. K 2 (pUC 19/ EcoR EcoR I) 4. K 3 (pUC 19/ Pst I) Pst I)

9416 pb Perpendaran sama

Penghitungan konsentrasi pUC19 linier

1.

Penghitungan berat total DNA marka (λ/ Hin HindIII) Berat total = volume X konsentrasi DNA marka = 5 ul X 50 ng/ul = 250 ng

2.

Penghitungan berat pita X pada DNA marka (λ/ Hin HindIII)

Berat pita X =

Panjang pita X

X berat total

Panjang total Berat pita ke-2 =

5543 pb

X 250 ng

48502 pb Berat pita ke-2 = 28,57 ng 3.

Penghitungan konsentrasi pita pUC 19 Berat pita ke-2 ≈ berat pita pUC 19

33

2010

Laporan Praktikum Biologi Sel Molekuler S2 Biologi UNSOED Konsentrasi pUC 19 = 28,57 ng/5 ul = 5,714 ng/ul Lampiran 2. Estimasi Ukuran Fragmen DNA Plasmid Hasil Restriksi

Base Pairs Distance Distance(bp) (mm) Log10 bp Unknown m*Distance 23130 15 4.3641756 38 -1.0222 9146 26 3.9612312 37 -0.9953 6557 31 3.8167052 36 -0.9684 4361 42 3.6395861 37 -0.9953 35 -0.9415 35 -0.9415 38 -1.0222 46 -1.2374 47 -1.2643 48 -1.2912

y Value 3.69 3.7169 3.7438 3.7169 3.7707 3.7707 3.69 3.4748 3.4479 3.421

Unknown bp Value 4897.78819 5210.74715 5543.70357 5210.74715 5897.93524 5897.93524 4897.78819 2984.00812 2804.78774 2636.33139

34

laporan praktikum biologi sel molekuler

Recommend Documents