Laporan Biokimia Protein 1.
Tujuan
a. Kognnitif b. Afektif Afektif
: Praktikan dapat memahami protein ditinjau dari segi kimia :Dihadapkan :Dihadapkan pada gejala-gejal gejala-gejalaa percobaan percobaan protein, protein, praktikan praktikan menjadi menjadi gizi minded
c. Psikomotor : Praktikan terampil melakukan percobaan-percobaan protein 2.
Dasar Teori
Protein adalah sumber-sumber asam amino yang mengandung unsur C, H, O dan N yang yang tida tidak k dimi dimili liki ki oleh oleh lema lemak k atau atau karb karboh ohid idra rat. t. Prot Protei ein n adal adalah ah makr makrom omol olek ekul ul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptid peptida, a, berbobo berbobott moleku molekull tinggi tinggi dari dari 5000 sampai sampai berjut berjuta-j a-juta uta.. Protei Protein n terdir terdirii dari dari bermac bermacam-m am-maca acam m golonga golongan, n, makro makro molekul molekul yang yang hetero heterogen, gen, walaup walaupun un demiki demikian an semuanya merupakan turunan dari polipeptida dengan BM yang tinggi. Unsur yang ada dalam hampir semua protein adalah hidrogen, oksigen, nitrogen, dan belera belerang. ng. Beberap Beberapaa protei protein n berisi berisi unsur unsur lain lain sepert sepertii besi besi yang yang terdapa terdapatt dalam dalam hemogl hemoglobi obin, n, iodium iodium terdap terdapat at dalam dalam thirog thiroglob lobin in dan fosfor fosfor terdapa terdapatt dalam dalam kasein kasein.. Molek Molekul ul prot protei ein n sang sangat at besa besar, r, masa masa mole moleku kuln lnya ya berk berkis isar ar anta antara ra 10.00 10.0000-25. 25.00 000. 0. oksihem oksihemogl oglobi obin n dengan dengan rumus rumus moleku molekull (C783H
O208 N N203S2Fe(4 mempunyai mempunyai massa
1166
molekul kurang lebih 65.000. Asam amino Penyusun protein adalah asam amino, yaitu asam organik yang mengandung gugus amimo (-NH2) disamping gugus karboksilat (-COOH). Asam amino yang terdapat di alam selalu berupa asam amino alpa , artinya gugus - NH2 selalu terikat pada atom Calpa, yaitu atom C di dekat gugus –COOH. Asam amino yang dikenal banyak sekali tetapi hanya 20 jenis yang termasuk penyusun protein alami.
Gugus R disebut gugus samping, gugus inilah yang membedakan sifat-sifat antara satu adam amino dengan asam amino lainnya, sedangkan gugus lainnya sama untuk semua asam amino. Protein secara kimia dapat dibedakan : 1. 2.
Protein sedehana : terdiri dari polipeptida Prot Protei ein n komple kompleks ks : yang meng mengan andun dung g zat-za zat-zatt tamba tambahan han seper seperti ti hem, hem, karbohidrat, lipid atau asam nukleat.
Struktur Protein Protein terbagi atas 4 struktru dasar yaitu 1.
Struktur Primer / Struktur Utama
2.
Struktur Sekunder
3.
Struktur Tersier
4.
Struktur Kwartener
Berdasarkan fungsinya protein dapat dikelompokkan menjadi : Protein
transport (hemoglobin, albumin serum)
Protein
enzim (tripsin, pepsin)
Protein
struktural (keratin, kolagen)
Protein
pertahanan (antibodi, trombin)
Protein
nutrien (kasein, ovalbumin)
Protein
pengatur (insulin, hormon pertumbuhan)
Menurut daya larut protein dapat dibedakan :
1.
Albumin. Albumin larut dalam air dan mengendap dalam garam berkonsentrasi tinggi melalui proses yang disebut penggaraman atau salting aut. Contohnya : albumin telur dan albumin serum.
2. Globulin Globulin tidak larut dalam air, tidak larut dalam garam encer, juga tidak larut dalam garam pekat dengan kejenuhan 30-50 %. Pada temperatur rendah, pengendapan globulin dan albumin dapat dilakukan dengan hati-hati ( mengaduk sesedikit mungkin) memakai metode salting out. Dengan cara ini protein murni bahkan dapat dikristalkan. Contoh : globulin serum dan globulin telur. 3. Glutelin Protein tidak larut dalam larutan netral,tetapi larut dalam asam dan basa encer. Contoh : protein gandum ( glutenin) dan protein padi ( orizenin). 4. Gliadin ( prolamin) Gliadin larut dalam 70 – 80 % etanol,tak larut dalam air dan etanol 100%. Contoh : protein gandum (gliadin) dan protein jagung (zein). 5.
Histon Sangat basa dibandingkan dengan protein lain dan cenderung berikatan dengan nukleat di dalam sel. Contoh: Histon timus, disebut juga nukleohiston sebab bergandengan dengan histon. Protein globin bersenyawa dengan heme ( senyawa asam) membentuk hemoglobin.
6.
Protamin Dibanding dengan protein lain, protamin relatif mempunyai bobot molekul rendah. Protamin larut dalam air dan bersifat basa. Biasanya didapatkan
bergandengan
dengan
asam
nukleat.
Di
dalam
sperma
ikan,
disebut
nukleoprotamin contoh: salmin. Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh, karena zat ini disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh, juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Sebagai zat pembangun, protein merupakan bahan pembentuk jaringan-jaringan baru yang selalu terjadi dalam tubuh. Pada masa pertumbuhan proses pembentukan jaringan terjadi secara besar-besaran. Pada masa kehamilan proteinlah yang membentuk jaringan janin dan pertumbuhan emrio. Protein terbentuk dari unsur-unsur organik yang relatif sama dengan karbohidrat dan lemak, yaitu sama-sama terjadi dari unsur-unsur karbon, hidrogen dan oksigen, tetapi bagi protein unsur-unsur ini ditambah lagi dengan unsur nitrogen dan ditemukan pula unsur mineral (fosfor, belerang, besi). Molekul protein tersusun dari asam amino, 12 sampai 18 macam asam amino yang saling berhubungan dalam suatu ikatan peptida.
6.
Pembahasan
Sumber protein dapat diperoleh dari bahan hewani maupun nabati. Salah satu sumber protein dari bahan makanan adalah telur. Telur mengandung protein, lemak, vitamin dan beberapa mineral. Kandungan penyusun protein dapat dibagi kedalam protein putih telur dan protein kuning telur. Salah satu sumber protein dalam bahan makanan adalah telur. Telur merupakan sumber makanan yang banyak dimanfaatkan manusia. Bahan makanan ini mengandung protein, lemak, vitamin dan beberapa mineral. Kandungan penyusun protein telu dapat dibagi kedalam protein putih telur dan protein kuning telur. Disamping itu, susu juga merupakan salah satu bahan makanan
atau larutan yang mengandung protein.
Sehingganya dalam percobaan ini, sampel yang digunakan adalah protein dari susu berupa kasein dan dari putih telur yaitu albumin. Untuk mendapatkan larutan protein, maka putih telur diencerkan dengan aquadest ( H2O ) dengan perbandingan (1:10).
Setelah itu larutan protein ini siap diuji. Dalam penentuan uji protei diklasifikasikan menjadi 2 kategori, yaitu analisis kualitatif dan kuantitatif. A. ANALISIS KUALITATIF ASAM AMINO
Dalam pengujian pembuktian protein pada sampel yang digunakan ada beberapa cara atau tes yang dilakukan, diantaranya
a.
Tes Ninhydrin
Reaksi warna protein dengan ninhydrin menunjukkan positif bila memberikan warna biru atau ungu. Reaksi ini terjadi pada gugus amino bebas dari asam amino dengan ninhydrin yang dituliskan di bawah ini : R
O
O
O + R C O H
I
OH
H – C – NH2 + 2 I CO2H
-N=C OH
II
O
O
O Dalam percobaan ini menambahkan 0,5 ml larutan Ninhydrin 0,1 % dalam 3 ml larutan protein, kemudian memanaskan hingga mendidih, dan ternyata hasilnya positif
mengandung protein, karena dalam larutan menghasilkan larutan berwarna biru setelah dipanaskan beberapa menit, yang sebelumnya berwarna bening.
Gugus ninhidrin : Jawaban pertanyaan : 1.
Warna yang terbentuk sebelum dipanaskan adalah bening tapi setelah dipanaskan berubah menjadi biru.
2.
Gugus protein yang memberikan tes positif terhadap tes ini adalah gugus amino b.
Tes Biuret
Reaksi biuret merupakan reaksi warna yang umum untuk gugus peptida (-CO NH-N) dan protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptida. Senyawa dengan dipeptida memberikan warna biru, tripeptida ungu dan tetrapeptida warna merah. Dalam percobaanh ini, dimana 3 ml larutan protein ditambahkan 1 ml NaOH pekat, dalam penambahan ini warna larutan menjadi bening, hal ini dikarenakan NaOH bersifat basa, sehingga dapat bereaksi dengan larutan protein. Namun setelah ada penambahan tembaga sulfat 0,01 M, maka larutan akan menjadi berwarna ungu. Sehingga dapat disimpulkan bahwa larutan protein tersebut mengandung protein. Seperti yang dijelaskan diatas, dimana reaksi biuret merupakan reaksi warna yang umum untuk gugus peptida (-CO-NH-N) dan protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan
peptida. Secara umum warna positif dari reaksi biuret ini membentuk senyawa kompleks yang digambarkan dibawah ini : I
I
O=C
C=O
I
I
NH
NH
I
I
HCR
RCH
I
I Cu2+
C=O I
I
NH
NH
I
I
HCR
RCH
C=O
Jawaban pertanyaan : 1.
Karena jika kelebihan tembaga sulfat, maka pada saat penambahan amonia, warna tidak akan berubah.
2.
Karena garam ini dapat merubah sifat kelarutan protein dalam air c.
Pengendapan Dengan logam
Dasar reaksi pengendapan oleh logam berat adalah penetralan muatan. Pengendapan dapat terjadi apabila protein berada dalam bentuk isoelektrik yag bermuatan negatif. Dengan adanya muatan positif dari logam berat akan terjadi reaksi netralisasi dari
protein dan dihasilkan garam netral proteinat yang mengendap. Endapan protein ini akan larut kembali pada penambahan alkali (NH3, NaOH,). Untuk pengendapan dengan logam, salah satu logam berat yang digunakan adalah HgCl2. Jika protein ditambahkan HgCl2 akan terbentuk endapan putih. Ketika larutan protein ditambahkan Pb –asetat terdapat endapan putih tapi hanya sedikit dan terdapat ruang-ruang larutan berwarna bening. Ada beberapa ion yang dapat mengendapkan protein yaitu Ag+, Ca+, Zn+, Hg+, Cu+ dan Pb+,. Jadi peranan HgCl2 adalah untuk menggendapkan protein yang terkandung dalam larutan sampel, sehingga menghasilkan larutan yang positif. B. ANALISIS PROTEIN SECARA KUANTITATIF a.
Penentuan Kadar Protein Secara Biuret
Penentuan protein secara biuret didasarkan atas pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang berwarna ungu. Hal ini terjadi apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam lingkungan alkali. Adanya penambahan alkali pada protein dapat menyababkan terjadinya hidrolisis ikatan peptida dari polimer protein. Hidrolisis ini menghasilkan monomer-monomer asam amino dan ada sebagian gugus asam amino yang berubah menjadi amonia. Akibat hidrolisis itu jumlah gugus asam amino berkurang. Sebelum melakukan percobaan ini, awalnya yang dilakukan adalah pembuatan reagen dan larutan standar yang akan digunakan. Reagen yang akan digunakan adalah reagen biuret dan larutan satandar protein. -
Reagen biuret dibuat dengan cara : melarutkan 1,5 gram CuSO4. 5H2O dan 6,0 gram NaKC4O6.4H2O kedalam kira-kira 500 ml aquadest dalam labu takar ukuran 1 liter. Kemudian ditambahkan 300 ml NaOH 100 % sambil dikocok. Akhirnya tambahkan air sampai batas garis.
-
Larutan standar protein dibuat dengan cara : melarutkan serum albumin murni atau kasein dalam air dengan kadar 10 mg per ml. Untuk mudahnya ditambahkan beberapa tetes NaOH 3 %
-
Larutan blanko : campuran 1 ml aquadest dan 4 ml reagen biuret kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar.. Pada percobaan ini yang akan dilakukan adalah menentukan kadar protein dengan
menggunakan spektrometer 20. Percobaan dilakukan dengan mencampurkan 1 ml protein + 4 ml reagen biuret kenudian dikocok dan diamkan selama 30 menit. Sebelum mengukur dan menggunakan alat, terlebih dahulu alat ini sudah harus di hidupkan / dipanaskan selama kurang lebih 15 menit. Setelah itu alat dikalibrasi dengan menggunakan blanko atau aquadest. Setelah itu masukkan dalam kuvet dan baca serapannya pada 450 nm. Mengulangi cara yang sama pada l yang bervariasi yang dimulai dari l 400 nm, 450 nm, 500 nm dan 550 nm. Diperoleh data serapan kadar protein dengan beberapa variasi l sebagai berikut :
b.
l
T
400
98 T
450
97,2 T
500
92 T
550
89 T
Pembuatan Kasein
Susu merupakan larutan yang berisi protein, laktosa mineral dan vitamintertentu yang mengemulsi lemak dari kasein. Jika lemak dihilangkan dari susu tersebut diperoleh susu skim sedangkan apabila kaseinnya diendapkan residu yang diperoleh disebut serum. Kasein dapat diendapkan dengan cara mengasamkan susu sampai pH 4,7. Larutan dibuat dengan cara mencampurkan 100 ml susu dalam air panas dipanaskan sampai 40o C + 1 ml as asetat glacial tetes demi tetes sambil diaduk. Setelah diaduk kasein mengendap. Selanjutnya menyaring endapan dengan menggunakan corong buchner dengan pompa vakum, terbentuk endapan dan filtrat. Suspensikan endapan dengan 50 ml etanol 95 %,
kemudian dekantasi, ulangi dengan menggunakan 50 ml campuran etanol eter, diperoleh endapan yang berbentuk tepung. Cuci endapan dengan 50 ml eter. Hisap endapan kemudian keringkan dan pindahkan pada kaca arloji. Terbentuk kasein dalam bentuk tepung kering. KESIMPULAN
Dari data yang diperoleh dan pembahasan diatas dapat disimpulkan : 1.
Ternyata untuk Tes Biuret, Tes Ninhydrin dan penegndapan logam
memberikan hasil positif terhadap protein pada telur yaitu pada putih telur (albumin) dengan adanya warna yang ditampilkan pada setiap perlakuan. 2.
Pada penentuan kadar protein secara kuantitatif secara biuret, diperoleh data
sebagai berikut l
T
400
98 T
450
97,2 T
500
92 T
550
89 T
Dari data diatas dapat dilihat pada panjang gelombang 400 nm, memiliki kadar sebesar 98 T. KEMUNGKINAN KESALAHAN Kemungkinan
Kesalahan
kesalahan pada mereaksikan larutan
pada saat pemanasan larutan
Kesalahan
pada saat pengukuran larutan
Kesalahan
pada saat pengamatan warna Daftar Pustaka
Team
Teaching. 2006. Penuntun Praktikum Biokimia. Jurusan Pendidikan Kimia
FMIPA UNG : Gorontalo Chairil
Anwar. 1994. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Depdikbud Dirjen
Pendidikan Tinggi : Yogyakarta. Martoharsono,
Soeharsono. 1975. Biokimia. Gadjah Mada University Press. :
Yogyakarta Poedjiadi,
Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI-Pres : Jakarta
Diposkan oleh Musrin Salila,S.Pd. M.Si di 09.20 0 komentar: Poskan Komentar
PROTEIN Gugus R disebut gugus samping, gugus inilah yang membedakan sifat-sifat antara satu adam amino dengan asam amino lainnya, sedangkan gugus lainnya sama untuk semua asam amino. Protein secara kimia dapat dibedakan : Protein sedehana : terdiri dari polipeptida Protein kompleks : yang mengandung zat-zat tambahan seperti hem, karbohidrat, lipid atau asam nukleat. Struktur Protein terbagi atas 4 struktru dasar yaitu Struktur Primer / Struktur Utama Struktur Sekunder
Struktur Tersier Struktur Kwartener Berdasarkan fungsinya protein dapat dikelompokkan menjadi : Protein transport (hemoglobin, albumin serum) Protein enzim (tripsin, pepsin) Protein struktural (keratin, kolagen) Protein pertahanan (antibodi, trombin) Protein nutrien (kasein, ovalbumin) Protein pengatur (insulin, hormon pertumbuhan) Menurut daya larut protein dapat dibedakan : Albumin. Albumin larut dalam air dan mengendap dalam garam berkonsentrasi tinggi melalui proses yang disebut penggaraman atau salting aut. Contohnya : albumin telur dan albumin serum. 2. Globulin Globulin tidak larut dalam air, tidak larut dalam garam encer, juga tidak larut dalam garam pekat dengan kejenuhan 30-50 %. Pada temperatur rendah, pengendapan globulin dan albumin dapat dilakukan dengan hati-hati ( mengaduk sesedikit mungkin) memakai metode salting out. Dengan cara ini protein murni bahkan dapat dikristalkan. Contoh : globulin serum dan globulin telur. 3. Glutelin Protein tidak larut dalam larutan netral,tetapi larut dalam asam dan basa encer. Contoh : protein gandum ( glutenin) dan protein padi ( orizenin). 4. Gliadin ( prolamin)
Gliadin larut dalam 70 – 80 % etanol,tak larut dalam air dan etanol 100%. Contoh : protein gandum (gliadin) dan protein jagung (zein). Histon Sangat basa dibandingkan dengan protein lain dan cenderung berikatan dengan nukleat di dalam sel. Contoh: Histon timus, disebut juga nukleohiston sebab bergandengan dengan histon. Protein globin bersenyawa dengan heme ( senyawa asam) membentuk hemoglobin. Protamin Dibanding dengan protein lain, protamin relatif mempunyai bobot molekul rendah. Protamin larut dalam air dan bersifat basa. Biasanya didapatkan bergandengan
dengan
asam
nukleat.
Di
dalam
sperma
ikan,
disebut
nukleoprotamin contoh: salmin. Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh, karena zat ini disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh, juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Sebagai zat pembangun, protein merupakan bahan pembentuk jaringan-jaringan baru yang selalu terjadi dalam tubuh. Pada masa pertumbuhan proses pembentukan jaringan terjadi secara besar-besaran. Pada masa kehamilan proteinlah yang membentuk jaringan janin dan pertumbuhan emrio. Protein terbentuk dari unsur-unsur organik yang relatif sama dengan karbohidrat dan lemak, yaitu sama-sama terjadi dari unsur-unsur karbon, hidrogen dan oksigen, tetapi bagi protein unsur-unsur ini ditambah lagi dengan unsur nitrogen dan ditemukan pula unsur mineral (fosfor, belerang, besi). Molekul protein tersusun dari asam amino, 12 sampai 18 macam asam amino yang saling berhubungan dalam suatu ikatan peptida. 3. Alat Dan Bahan
Bahan :
Alat
Tabung reaksi
Pereaksi biuret
Rak tabung reaksi
Pereaksi ninhidrin
Pipet tetes
Susu
Batang pengaduk
Etanol 95%
Gelas kimia
Campuran : eter 1:1
Spektrofotometer UV-VIS
Larutan HCl 0,1 M
Gelas ukur
Larutan protein Larutan HgCl2 Larutan (NH4)2 SO4 jenuh Larutan NaOH
4. Prosedur Kerja
Uji Biuret Larutan protein 3 ml
Menambahkan 1 ml larutan NaOH 2,5 N Menambahkan 1 tetes larutan CuSO4 0,01 M Mengamati Perubahan warna Uji Ninhidrin Larutan protein 3 ml
Menambahkan 0,5 ml larutan Ninhydrin 0,1%
Memanaskan hingga mendidih Mengamati Perubahan warna Pengendapan dengan logam Larutan protein 3 ml
Menambahkan 5 tetes HgCl2 0,2 M mengulangi dengan menggunakan Pb- asetat mengamati Perubahan warna d. Penentuan kadar protein secara biuret Larutan protein 1 ml
menambahkan 4 ml reagen biuret mengocok dan diamkan selama 30 menit membaca serapannya pada 450 nm membuat variasi panjang gelombang Hasil pengamatan Membuat kurva baku Dan tetapkan kadar protein
catatan : untuk blanko dipakai campuram 1 ml aquadest dan 4 ml reagen biuret e. Pembuatan kasein 100 ml susu dalam air panas
menambahkan tetes demi tetes asam asetat glasial sebanyak 1 ml sambil diaduk Kasein mengendap
menyaring menggunakan corong buchner dengan pompa vakum endapan filtrat
disuspensi dengan 50 ml etanol 95 % dekantase ulangi dengan menggunakan 50 ml campuran etanol eter kasein Hasil Pengamatan UJI / TES Biuret
Ninhydrin
PROSEDUR PENGAMATAN 1 ml larutan NaOH + 3 ml Protein berubah warna larutan protein menjadi bening. Setelah ditambahkan dengan Terjadi perubahan warna CuSO4 0,01 M menjadi warna ungu. 0,5 ml larutan ninhydrin 0,1 % Terbentuk 2 lapisan : Lapisan + larutan protein 3 ml atas ( Berwarna bening ); Dipanaskan hingga mendidih dan lapisan bawah juga berwarna bening Terjadi perubahan warna awalnya berwarna merah jambu setelah didiamkan beberapa menit larutan
Pengendapan dengan 3 ml larutan protein + 5 tetes larutan HgCl2 0,2 M logam 3 ml larutan protein + 5 tetes larutan PbCOOH 0,2 M
Penentuan Kadar 1 ml protein + 4 ml reagen Protein Secara Biuret biuret, dikocok, dan diamkan selama 30 menit. Masukkan dalam kuvet dan baca serapannya pada 450 nm. Mengulangi cara yang sama pada λ yang bervariasi yang dimulai dari λ 400 nm, 450 nm, 500 nm dan 550 nm. 100 ml susu dalam air panas Pembuatan Kasein dipanaskan sampai 40o C + 1 ml as asetat glacial tetes demi tetes sambil diaduk Menyaring endapan dengan menggunakan corong buchner dengan pompa vakum Suspensikan endapan dengan 50 ml etanol 95 %, kemudian dekantasi, ulangi dengan menggunakan 50 ml campuran etanol eter Cuci endapan dengan 50 ml eter Hisap endapan kemudian keringkan dan pindahkan pada kaca arloji Pembahasan
berubah menjadi biru muda. Terbentuk endapan putih pada seluruh larutan Terdapat endapan putih tapi dalam jumlah sedikit dan terdapat ruang-ruang yang berwarna bening pada tabung. Larutan berwarna biru muda dan setelah diukur pada spektrometer 20 pada λ 450 nm diperoleh serapan kadar protein sebesar 97,2 T Diperoleh nilai serapannya berturut-turut : 98 T, 97,2 T, 92 T dan 89 T. Kaein mengendap Terbentuk endapan dan filtrat Diperoleh endapan yang berbentuk tepung Terbentuk kasein dalam bentuk tepung kering.
Sumber protein dapat diperoleh dari bahan hewani maupun nabati. Salah satu sumber protein dari bahan makanan adalah telur. Telur mengandung protein, lemak, vitamin dan beberapa mineral. Kandungan penyusun protein dapat dibagi kedalam protein putih telur dan protein kuning telur. Salah satu sumber protein dalam bahan makanan adalah telur. Telur merupakan sumber makanan yang banyak dimanfaatkan manusia. Bahan makanan ini mengandung
protein, lemak, vitamin dan beberapa mineral. Kandungan penyusun protein telu dapat dibagi kedalam protein putih telur dan protein kuning telur. Disamping itu, susu juga merupakan salah satu bahan makanan atau larutan yang mengandung protein. Sehingganya dalam percobaan ini, sampel yang digunakan adalah protein dari susu berupa kasein dan dari putih telur yaitu albumin. Untuk mendapatkan larutan protein, maka putih telur diencerkan dengan aquadest ( H2O ) dengan perbandingan (1:10). Setelah itu larutan protein ini siap diuji. Dalam penentuan uji protei diklasifikasikan menjadi 2 kategori, yaitu analisis kualitatif dan kuantitatif. A. ANALISIS KUALITATIF ASAM AMINO
Dalam pengujian pembuktian protein pada sampel yang digunakan ada beberapa cara atau tes yang dilakukan, diantaranya Tes Ninhydrin
Reaksi warna protein dengan ninhydrin menunjukkan positif bila memberikan warna biru atau ungu. Reaksi ini terjadi pada gugus amino bebas dari asam amino dengan ninhydrin yang dituliskan di bawah ini : ROOO + RC OH
I OH H – C – NH2 + 2 - N = C I OH CO2H II O O O Dalam percobaan ini menambahkan 0,5 ml larutan Ninhydrin 0,1 % dalam 3 ml larutan protein, kemudian memanaskan hingga mendidih, dan ternyata hasilnya positif mengandung protein, karena dalam larutan menghasilkan larutan berwarna biru setelah dipanaskan beberapa menit, yang sebelumnya berwarna bening. O II OH OH II O
O
Gugus ninhidrin : Jawaban pertanyaan : Warna yang terbentuk sebelum dipanaskan adalah bening tapi setelah dipanaskan berubah menjadi biru. Gugus protein yang memberikan tes positif terhadap tes ini adalah gugus amino Tes Biuret
Reaksi biuret merupakan reaksi warna yang umum untuk gugus peptida (-CO NH-N) dan protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptida. Senyawa dengan dipeptida memberikan warna biru, tripeptida ungu dan tetrapeptida warna merah. Dalam percobaanh ini, dimana 3 ml larutan protein ditambahkan 1 ml NaOH pekat, dalam penambahan ini warna larutan menjadi bening, hal ini dikarenakan NaOH bersifat basa, sehingga dapat bereaksi dengan larutan protein. Namun setelah ada penambahan tembaga sulfat 0,01 M, maka larutan akan menjadi berwarna ungu. Sehingga dapat disimpulkan bahwa larutan protein tersebut mengandung protein. Seperti yang dijelaskan diatas, dimana reaksi biuret merupakan reaksi warna yang umum untuk gugus peptida (-CO-NH-N) dan protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptida. Secara umum warna positif dari reaksi biuret ini membentuk senyawa kompleks yang digambarkan dibawah ini : II O=C C=O II
NH NH II HCR RCH
II C=O Cu2+ C=O II NH NH II HCR RCH Jawaban pertanyaan : Karena jika kelebihan tembaga sulfat, maka pada saat penambahan amonia, warna tidak akan berubah. Karena garam ini dapat merubah sifat kelarutan protein dalam air . Pengendapan Dengan logam
Dasar reaksi pengendapan oleh logam berat adalah penetralan muatan. Pengendapan dapat terjadi apabila protein berada dalam bentuk isoelektrik yag bermuatan negatif. Dengan adanya muatan positif dari logam berat akan terjadi reaksi netralisasi dari protein dan dihasilkan garam netral proteinat yang mengendap. Endapan protein ini akan larut kembali pada penambahan alkali (NH3, NaOH,). Untuk pengendapan dengan logam, salah satu logam berat yang digunakan adalah HgCl2. Jika protein ditambahkan HgCl2 akan terbentuk endapan putih. Ketika larutan protein ditambahkan Pb –asetat terdapat endapan putih tapi hanya sedikit dan terdapat ruang-ruang larutan berwarna bening. Ada beberapa ion yang dapat mengendapkan protein yaitu Ag+, Ca+, Zn+, Hg+, Cu+ dan Pb+,. Jadi peranan HgCl2 adalah untuk menggendapkan protein yang terkandung dalam larutan sampel, sehingga menghasilkan larutan yang positif. B. ANALISIS PROTEIN SECARA KUANTITATIF Penentuan Kadar Protein Secara Biuret
Penentuan protein secara biuret didasarkan atas pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang berwarna ungu. Hal ini terjadi apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam lingkungan alkali. Adanya penambahan alkali pada protein dapat menyababkan terjadinya hidrolisis ikatan peptida dari polimer protein. Hidrolisis ini menghasilkan monomer-monomer asam amino dan ada sebagian gugus asam amino yang berubah menjadi amonia. Akibat hidrolisis itu jumlah gugus asam amino berkurang.
Sebelum melakukan percobaan ini, awalnya yang dilakukan adalah pembuatan reagen dan larutan standar yang akan digunakan. Reagen yang akan digunakan adalah reagen biuret dan larutan satandar protein. Reagen biuret dibuat dengan cara : melarutkan 1,5 gram CuSO4. 5H2O dan 6,0 gram NaKC4O6.4H2O kedalam kira-kira 500 ml aquadest dalam labu takar ukuran 1 liter. Kemudian ditambahkan 300 ml NaOH 100 % sambil dikocok. Akhirnya tambahkan air sampai batas garis. Larutan standar protein dibuat dengan cara : melarutkan serum albumin murni atau kasein dalam air dengan kadar 10 mg per ml. Untuk mudahnya ditambahkan beberapa tetes NaOH 3 % Larutan blanko : campuran 1 ml aquadest dan 4 ml reagen biuret kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar.. Pada percobaan ini yang akan dilakukan adalah menentukan kadar protein dengan menggunakan spektrometer 20. Percobaan dilakukan dengan mencampurkan 1 ml protein + 4 ml reagen biuret kenudian dikocok dan diamkan selama 30 menit. Sebelum mengukur dan menggunakan alat, terlebih dahulu alat ini sudah harus di hidupkan / dipanaskan selama kurang lebih 15 menit. Setelah itu alat dikalibrasi dengan menggunakan blanko atau aquadest. Setiap masukkan dalam kuvet dan baca serapannya pada 450 nm. Mengulangi cara yang sama pada λ yang bervariasi yang dimulai dari λ 400 nm, 450 nm, 500 nm dan 550 nm Dari pembahasan diatas dapat disimpulkan : Ternyata untuk Tes Biuret, Tes Ninhydrin, Tes Xanthoprotein, Tes Milon, Tes Hopkins Cole, dan Tes Pb-asetat memberiukan hasil positif terhadap protein pada telur yaitu pada putih telur (albumin). Selain itu pada tes sifat-sifat protein, yaitu tes pengendapan dengan logam-logam, Tes Helier dan Tes Koagulasi juga memberikan hasil positif terhadap protein pada putih telur (albumin). Kemungkinan Kesalahan
Kemungkinan kesalahan pada mereaksikan larutan Kemungkinan kesalahan pada saat pemanasan larutan
Kemungkinan kesalahan pada saat pengukuran larutan Kemungkinan kesalahan pada saat pengamatan warna
Daftar Pustaka Team Teaching. 2006. Penuntun Praktikum Biokimia. Jurusan Pendidikan Kimia FMIPA UNG : Gorontalo Chairil Anwar. 1994. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Depdikbud Dirjen Pendidikan Tinggi : Yogyakarta. Martoharsono, Soeharsono. 1975. Biokimia. Gadjah Mada University Press. : Yogyakarta Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI-Pres : Jakarta
