LABORATORIO: LABORATORIO: RECUENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO I.
POR EL METODO DE PLAT LATOS DE DILUCIÓN
1. OBJETIVO: •
Deter termin minar
e
ident entific ificar ar
el
tipo ipo
y
número ero
de
micr micro oorgan ganism ismos,
espe especi cial alme ment nte e hong hongos os,, pres presen ente tes s en mues muestr tras as de suel suelo, o, medi median ante te diluciones diluciones seriadas, con el fin de obtener obtener un número adecuado de colonias en el medio de cultivo específico.
2. INTRODUCCIÓN: El manto de minerales y de materia orgánica, que cubre la mayor parte de la superficie terrestre y que propicia el crecimiento de las plantas se denomina SUE!. os suelos con más del "#$ %en peso& de materia s'lida consistente en partículas partículas minerales y que contienen por lo tanto un (#$ de material orgánico se cono conoce ce como como suel suelos os mine minera rale les s y son son más más comu comune nes s que que los los suel suelos os orgá orgáni nico cos s que que tien tienen en más más del del (#$ (#$ de mate materi ria a orgá orgáni nica ca.. Un prom promed edio io apro)imado de materia orgánica en un suelo mineral bueno es de * a +$. El suelo es para las plantas terrestres, la fuente primaria de agua y es además un e)celente fiador de nitr'geno. El tamatama-o o de las las partí partícul culas as del del suelo, suelo, codif codific ica a las carac caracter terís ístic ticas, as, como como te)tura, consistencia, en fin definen diversos tipos de suelos. as partículas coloi coloidal dales es en parti particu cula larr aque aquella llas s de #.## #.## mm de groso grosor, r, tienen tienen fuert fuerte e influencia en la te)tura, en la capacidad de retenci'n del agua y en la actividad química del suelo. /actores tales como fertilidad, acide0, humedad, etc., determinan el tipo y la cantidad de microorganismos presentes en el suelo. 1o se ha podido estimar con e)actitud el número de microorganismos presentes en un gramo de tierra2 las cuentas microbianas disminuyen notablemente en las profundidades. os recuentos de bacterias y de mohos terrestres hechos en placa son mucho menores menores que los recuent recuentos os microsc' microsc'pico picos. s. as dos principa principales les causas causas de
dicha divergencia radica en el hecho de que los medios de cultivo en placa, permiten el crecimiento de un segmento muy peque-o de flora mi)ta y que muchos microorganismos muertos pueden apreciarse en el microscopio.
MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL SUELO: 3 BACTERIAS4 Son las más abundantes de la tierra. as bacterias terrestres son de varios tipos y presentan diferente comportamiento fisiol'gico. 5ueden ser ser aero aerobi bias as,,
anae anaero robi bias as y
facu facult ltat ativ ivas as22
auto autotr tr'f 'fic icas as o
hete hetero rotr tr'f 'fic icas as22
descomponen carbohidratos y 6 o proteínas. a may mayor part parte e de las las bacte acteri rias as del del suel suelo o pert perten enec ecen en a los los grup grupos os Pseudomonadales , el g7nero más representativo es Pseudomonas sp., bacilo
8ram 8ram nega negati tivo vo,, cort corto, o, no espo espor' r'ge geno no,, capa capa0 0 de prod produc ucir ir pigm pigmen ento tos s hidrosolubles verdes o a0ules fluorescentes, producen en0imas pectinolíticas que que degra degrada dan n el gel de pectat pectato. o. as Eubacteriales incluyen bacilos 8ram negat negativ ivos os corto cortos, s, no espor espor'g 'geno enos s perte pertene necie cient ntes es al g7ner g7nero o
Rhizobium,
y las formas pigmentadas Chromobacterium y Agrobacterium, Achromobacter y %violet eta a y amar amarill illo o respec respectiv tivame amente nte&2 &2 cocos cocos del del g7ner g7nero o Flavobacterium %viol Sarcina2 bacilos bacilos 8ram negativos negativos del g7nero g7nero Corynebacterium Micrococcus y Sarcina2 %no %no espor esporula ulado do&& y los espor esporula ulados dos 8ram 8ram posit positivo ivos s Bacill Bacillus us y Clostr Clostridi idium um. Dentro del grupo de los Actinomycetales están los miembros pertenecientes pertenecientes a producen n colonia colonias s filament filamentosa osas s con frecuencia frecuencia duras duras y Streptomyces que produce terrosas y suelen e)peler olores similares a hoas en descomposici'n. Estos microorg microorganis anismos mos abundan abundan en suelos suelos de bosques bosques que conteng contengan an grandes grandes can cantid tidades
de
mat materia
orgá rgánica ica
y
partici ticip pan
activ tivamen mente
en
su
descomposici'n. (3 HONGOS Y MOHOS4 os mohos descomponen activamente la celulosa, las proteínas vegetales y animales y otras sustancias orgánicas del suelo.
El recuento por el m7todo de platos de diluci'n es la t7cnica más frecuente utili0ada para determinar el número de c7lulas viables de microorganismos del
suelo. 9dicionalmente, este m7todo suele utili0arse para el aislamiento de microorganismos del suelo. a t7cnica se basa en que un peso conocido de suelo se agita en un líquido apropiado, los microorganismos se desprenden del suelo y cada una de las c7lulas da origen a una colonia discreta sobre un medio de cultivo. El número de c7lulas en el suelo original %muestra& se estiman con base en las colonias que se cuentan. Debido a que el número de c7lulas es alto, aún en una muestra de suelo peque-o, la suspensi'n del suelo debe diluirse de tal forma que en los platos de petri se desarrollen solamente unas pocas colonias bien separadas. Debe tenerse en cuenta que e)isten varias fuentes de error y que por lo tanto los resultados obtenidos deben considerarse considerarse como estimativos estimativos del número de microorganismos y no como un recuento e)acto de los mismos.
3. MATERIALES: :uestra de suelo 9gua destilada destilada est7ril est7ril ;aas de petri con medio de cultivo 5D9 Encubadora a ((<; 8radillas =ubos de ensayo 5ipetas est7riles de # ml y ml
4. PROCEDIMIENTO: °
5repare una soluci'n patr'n de suelo diluido en agua destilada est7ril4 # gr de suelo se disuelven bao condiciones de asepsia en ## ml de agua destilada est7ril.
°
9 partir de la soluci'n anterior prepare soluciones soluciones más diluidas de concentraciones # 3(, #3>, #3*, #3+, #3?, #3@.
°
Siembre en cada caa de 5etri que contiene 5D9, ml de la soluci'n de conce concentr ntraci aci'n 'n conoc conocida ida y para para logr lograr ar una una dispe dispersi rsi'n 'n unifo uniforme rme agite agite circularmente, de tal forma que la suspensi'n microbial aislada del suelo se espar0a en toda la superficie del medio. Efectúelo con * repeticiones.
°
Espere a que el volumen que sirvi' en la caa, se absorba en la superficie superficie del del medio medio y luego luego proce proceda da a volte voltear ar la caa, caa, coloc colocán ándol dola a en posic posici'n i'n adecuada para someterla a incubaci'n.
°
Ancube a ((<; durante (* horas
°
5ara conteo de los hongos use las diluciones # 3>, #3*, #3+ y #3?. el tiempo de incubaci'n será de > o * días y deben evaluarse los platos que presenten un número de microorganismos representativos.
°
5ara el conteo de Actinomycetes, use las diluciones # 3* hasta # 3@ y utilice los platos que contengan de (+ a ># colonias.
°
Utili0ar Utili0ar el medio medio de cultivo cultivo apropiad apropiado o para para cada microorgan microorganismo ismo.. %ver ane)o&
°
Efectúe el cálculo teniendo en cuenta el volumen de diluci'n, para así obtener un porcentae significativo del número de microorganismo en la muestra.
II.
TECNICAS CAS DE GRANI RANIT TOS DE TIERRA Se basa en el principio de que los granos de suelo la microflora total. Se agregan agregan sobre sobre los medios medios s'lidos s'lidos específ específicos icos para el microorg microorganis anismo mo deseado, las colonias de ese microorganismo se desarrollan alrededor del gran grano. o. a abun abunda danc ncia ia del del crec crecim imie ient nto o del del grup grupo o dado dado da una una idea idea apro)imada de la rique0a del suelo en ese grupo fisiol'gico. Se utili0a una porci'n peque-a de tierra tami0ada en una malla de ( mm la cual se coloca en una caa petri. Se necesita tambi7n otra caa de petri con un poco de agua destilada est7ril y una pipeta 5asteur cerrada %tapada&. Se sumerge el e)tremo cerrado de la pipeta en el agua y despu7s se coloca encima de una partícula de suelo4 un BgranoC. Este se adhiere a la pipeta y
es tran transf sfer erid ido o de esta esta mane manera ra a la caa caa petr petri, i, que que cont contie iene ne el medi medio o nutr nutrit itiv ivo. o. Se tran transf sfie iere re así así vario arios s gran granos os alin lineado eados s más más o men menos regularmente en la caa. Es meor colocar siempre el mismo número de granos para efectos comparativos %# o (#&. Este m7todo da buena orientaci'n cualitativa de la muestra que se está estudiando. 1o es el más aconseable para estudios cuantitativos.
ANEXO: PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO MEDIO PARA ACTINOMICETOS 8licerol
"g
9sparginato 9sparginato
#." g
/osfato ácido de 5otasio
#." g
8elosa Soluci'n de inogradsy 9gua destilada destilada
( g #." g "## ml
SOLUCION DE WINOGRADSKY /osfato acido de potasio
#.(+ g
Sulfato de magnesio
#.(+ g
;loruro de sodio
#.(+ g
;loruro f7rrico o sulfato f7rrico
#.##(+ g
Sulfato de manganeso
#.##(+ g
9gua destilada destilada 5F4
+# ml @.(
AGAR PAPA DEXTROSA PDA! 5apa
>(+ g
De)trosa
(.? g
9gar39gar 9gar39gar
G.+ g
9gua destilada destilada
>## ml
AGAR TIERRA Es la preparaci'n del e)tracto de tierra con gel %9gar& para obtenci'n de medios s'lidos y semis'lidos. 5ara medio s'lido se prepara el medio utili0ando la concentraci'n usual para el gel específico %generalmente +$& y se reduce la concentraci'n para medio semis'lido. a esterili0aci'n se hace por los m7todos corrientes.
EXTRACTOS DE SUELO Se escoge un suelo rico %tierra de ardín& de pF neutro o cercano a la neutralidad %nunca se debe utili0ar suelo acido&. ;olocar la tierra en un recipiente con agua en partes iguales. Dear a temperatura ambien ambiente te por por unas unas (* hora horas s agita agitand ndo o ocas ocasion ionalm almen ente. te. ueg uego o se lleva lleva a la autoclave durante hora a >#<;. Dear decantar y filtrar hasta obtener una soluci'n clara %límpida color ámbar& se controla el pF que debe estar cercano a la neutralidad. Esterili0ar nuevamente por (# minutos.
". RESULTADOS: :UES=H94
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
!;9AD9D4 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII HE;UE1=! DE :A;H!!H891AS:!S4 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
