HONGOS Y LEVADURAS.
El moho y las levaduras son hongos, y algunas especies se producen en alimentos, aunque estos hongos se producen en alimentos generalmente benéficos, algunos son microorganismos dañinos. El moho y la levadura normalmente no causan enfermedades alimenticias, pero si pueden provocar la descomposición de los alimentos. La mayoría de las levaduras y mohos son mesofilos aeróbicos (tejidos que cresen con oxigeno a temperaturas templadas). Algunos mohos producen producen sustancias sustancias venenosa venenosas s denominadas micotoxinas. micotoxinas. Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos.
El término moho Se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificación y clasificación de los mohos se basa en observaciones macroscópicas y microscópicas.
Hifas y micelio. El talo de los mohos está formado por una masa de filamentos ramificados, llamados hifas, llamándose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas pueden ser sumergidas o aéreas. También se pueden clasificar en hifas vegetativas o en crecimiento, las cuales se encargan de la nutrición del moho, y en hifas fértiles o hifas que producen los órganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos: septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no septados cenocíticos, cuyas hifas están formadas por cilindros sin tabiques transversales. Este tipo de hifas posee núcleos diseminados a lo largo del cilindro y se les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados órganos ayudan a identificar a los mohos. Por ejemplo los rizoides o “anclajes” de los géneros Rhizopus o Absidia , la célula basal del género Aspergillus y la ramificación dicotómica, o en forma de Y, del género Geotrichum .
Órganos o estructuras reproductoras. Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas asexuales. Algunos mohos también producen esporas sexuales. A tales hongos se les denomina “perfectos”, los cuales se dividen en Oomycetes y Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son septados, en contraposición a los mohos “imperfectos”, Fungi Imperfecti , los cuales sólo poseen esporas asexuales.
Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son pequeñas, ligeras y resistentes a la desecación. Se diseminan fácilmente por la atmósfera para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos principales de esporas asexuales son: (1) conidios, (2) artrosporas u oidios y (3) esporangiosporas. Los conidios se separan, o crecen, en determinadas hifas fértiles denominadas conidióforos y generalmente son libres, es decir, no se encuentran dentro de ningún receptáculo, en contraposición a las esporangiosporas, las cuales se encuentran dentro de un esporangio o receptáculo, situado en el extremo de una hifa fértil, el esporangióforo. Las artrosporas se forman por fragmentación de una hifa. El extremo engrosado del esporangióforo se denomina columnela y adopta formas típicas en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos mohos poseen conidios comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen de una célula especializada, el esterigma o fiálide situada en el extremo del conidióforo.
PROPIEDADES FISIOLÓGICAS. En comparación con la mayoría de las levaduras y de las bacterias, la mayoría de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedirá o retardará mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podrían considerarse mesófilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura óptima de la mayoría se encuentra alrededor de los 25 a 30°C, aunque algunos son psicrótrofos y algunos son termófilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido. Son capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos. Poseen enzimas hidrolíticas, y de aquí que algunos se utilicen para la producción industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas.
Algunos géneros de mohos importantes en alimentos.
Mucor. Intervienen en la alteración de algunos alimentos y se utilizan en la fabricación de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificación del almidón, para la maduración de quesos y para la fabricación de algunos alimentos orientales. Rhizopus. La especie R. stolonifer , o moho del pan, es muy común e interviene en la alteración de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc. Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la producción industrial de ácido cítrico y glucónico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricación de ciertos alimentos orientales y en la obtención de enzimas.
Se han reportado casi 50 especies de Aspergillus como productores de metabolitos tóxicos denominados en general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las denominadas aflatoxinas (producidas por A. flavus , A. parasiticus y A. nomius ); la ocratoxina A producida por A. ochraceus , A. carbonarius y A. niger ; sterigmatocistina producida principalmente por A. versicolor ; el ácido ciclopiazónico producidas por A. flavus y A. tamarii . La citrinina, patulina y ácido penicílico también son producidas por especies de Aspergillus , las
tóxinas tremorgénicas son producidas por A. terreus (territremas), A. fumigatus (fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina). Las aflatoxinas son derivados de la difurancumarina. Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se producen en la naturaleza por los mohos ya mencionados. Las letras B y G se refieren a los colores de flurescencia por sus nombres en inglés ( azul y verde, respectivamente) observados bajo longitudes de onda en la región UV, y los subíndices 1 y 2 se refieren a sus patrones de separación cromatográficos. Las aflatoxinas M1 y M2 se producen por la hidroxilación de las respectivas aflatoxinas B. La aflatoxina B1 tal vez sea el carcinógeno de hígado más potente para animales incluyendo al humano. La ocratoxina A y la citrinina afectan la función renal. Las toxinas tremorgénicas afectan el sistema nervioso central.
Penicillium. Es otro género de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P italicum producen la podredumbre de frutas cítricas. Las especies P. camemberti , P. roqueforti se utilizan en la maduración de quesos.
Se han reportado más de 80 especies de Penicillium como productores de micotoxinas. Estas micotoxinas pueden dividirse en dos grupos: las que afectan la función del hepática o renal, y las neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por Penicillium son, ocratoxina A, citrinina, patulina, ácido ciclopiazónico, citreoviridina, penitremo A, toxina PR y roquefortina y el ácido secalónico. De éstas la ocratoxina A es sin duda la más importante, es un carcinógeno renal y es producida por P. citrinum , P. viridicatum , P. verrucosum . La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o trigo, o a través de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es posteriormente consumida por humanos.
Levaduras y hongos levaduriformes. El término levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemación o por fisión. Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benéficas o perjudiciales. Las levaduras se utilizan en la elaboración de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, también se utilizan en la obtención de enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteración del sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos.
Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación microscópica. Su forma puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, piriforme, cilíndrica, triangular e incluso alargada. La mayoría se reproducen asexualmente por gemación multicelular o por gemación polar. Unas pocas especies se reproducen por fisión. En los cultivos en placas de agar es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la observación microscópica de los microorganismos es la única forma segura de diferenciarlas. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas; la mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. La mayoría de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen mejor que la mayoría de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo la mayoría de las levaduras necesitan mayor humedad que los mohos. Para la mayoría de las levaduras la Aw mínima de crecimiento oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a 30°C y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47°C. Crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden oxidar los ácidos orgánicos y el alcohol.
ALGUNOS GÉNEROS DE IMPORTANCIA EN ALIMENTOS SON:
Schizosaccharomyces. Levaduras de este género se han encontrado en frutas tropicales, en la melaza y en la miel. Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias alimentarias, como en la fermentación del pan, fermentación de la cerveza, fermentación de los vinos, en la producción de alcohol, glicerol e invertasa. Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis ) se utiliza en la obtención de productos lácteos por su capacidad de fermentar la lactosa. Zygosaccharomyces. Las levaduras de este género son importantes por su capacidad para crecer en medios con elevadas concentraciones de azúcar (osmófilas), intervienen en la alteración de la miel, jarabes y melazas, y también en la fermentación de la salsa de soya y de algunos vinos. Pichia. Crecen en la superficie de los líquidos formando una película. P. membranafaciens produce una película en la superficie de las cervezas y vinos. Debaromyces. Forman película en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en la superficie de los quesos y de los embutidos. Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limón y crecen en los zumos de frutas. Torulopsis. Originan problemas en las fábricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la lactosa, alterando productos lácteos. Otras especies alteran la leche condensada azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos ácidos. Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtención de proteína unicelular para incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lácteos. C. lipolytica produce alteración de la mantequilla y margarina. Brettanomyces. Producen grandes cantidades de ácido e intervienen en la fermentación de la cerveza belga de tipo “lambic”, de las cervezas inglesas y de los vinos franceses. Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrándose en las fábricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada. Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color rosado en el sauerkraut.
EL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN
Lavar el material a ser utilizado así como desinfectar la mesa de trabajo hasta dejarlos perfectamente limpios. Envolver el material a utilizar con papel destraza. Preparar el agar papa dextrosa como lo indica el fabricante, preparar el agua peptonada a utilizar y el acido tartárico solamente la cantidad necesaria para el agar. Colocar los medios de cultivo ya preparados (de acuerdo a las diluciones a elaborar) en los tubos de ensaye antes de su esterilización.
Agar papa dextrosa 39 g
1000 ml
X
180ml
= 7.02 g
Agua peptonada 15g
1000 ml
X
117 ml
= 1.75
Acido tartárico 100 ml de agar 180 ml de agar
0.4 ml ac. Tartárico x
= 0.252 ac. Tartárico / 2.25 ml de agua
Depositar el material ya envuelto con papel destraza en la canastilla de la autoclave. Depositar el material en la canastilla de la autoclave, cuidando de colocar los materiales cerca del cuello de la autoclave. Vaciar agua dentro de la autoclave hasta donde se marca el nivel. Cerrar la tapa cuidando de apretar, la tapadera encima de las pipetas. Encender y girar el botón en la posición máximo. Cuando el agua contenida dentro de la autoclave hierve, el vapor elimina el aire de la autoclave, el vapor saldrá por la válvula. Cuando se ha obtenido la temperatura deseada de 120°C que corresponde a 1 Kg. de presión, se pone el botón en la posición de “medio” lo cual nos permite conservar la temperatura y la presión deseada por un tiempo determinado de 120°C por 15 minutos a 1 Kg. de presión.
Trascurridos los 15 minutos se coloca el botón en la posición apagado. Se abre la válvula para disminuir rápidamente la presión, cuando la presión baje por completo solamente entonces así puede abrirse la tapadera y retirar lo objetos.
Todo el material que tenga contacto con las muestras o los microorganismos debe estar estéril. La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM110-SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su análisis Microbiológico.
SIEMBRA
Primeramente se empieza conectando él equipo de calentamiento la cual proporcionara una campana ya que este proporciona una zona de esterilidad de aproximadamente 20 cm. de radio. Se comienza con la preparación de la dilución primaria. Pesar 10 gr. de muestra y adicionarlo al frasco de dilución que contiene 117 ml de agua peptonada y agitar por menos 2.5 min para homogenizar la muestra. Transferir 1 ml de la dilución primaria a un tubo de ensaye que contiene 9 ml de agua peptonada con una pipeta estéril de 1 ml este seria la dilución 10 -2. Transferir 1 ml de la dilución 10 -2 a un tubo de ensaye que contiene 9 ml de agua peptonada con una pipeta estéril de 1 ml este seria la dilución 10 3. Transferir 1 ml de la dilución 10 -3 a un tubo de ensaye que contiene 9 ml de agua peptonada con una pipeta estéril de 1 ml este seria la dilución 10 4.
Nota.- siempre evitar el contacto entre la pipeta y el agua peptonada.
Dejar dos cajas petri como testigos. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo, y quitar el papel destraza cuidando que no salga de la campana. Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado. Agregar 20 ml de agar acidificada con el acido tartárico aproximadamente.
Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis
de atrás para delante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia arriba) por un tiempo de 3, 4,5 días a una temperatura de 25 ± 1°C. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis.
RESULTADOS. testigo Hongos levaduras
2 Dilución 304 -4 180
284 244
Hongos 304 + 284 / 2= 294 * 10,000 = 2, 940,000 Levaduras 180 + 244 / 2= 212 * 10,000 = 2, 120,000 “Valor estimado” De Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (2940000 UFC/g o ml) de hongos en agar papa - dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 4 días. “Valor estimado” De Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (2120000 UFC/g o ml) de levaduras en agar papa dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 4 días.
CONCLUSIÓN Las malas condiciones de conservación, especial mente de los productos con baja actividad de agua como cereales, puede causar la proliferación de mohos en alimentos y la reproducción de micotoxinas, las cuales tienen grados de intoxicación y pueden dañar al consumo humano. El grano de maíz utilizado dio como resultado dos tipos de hongos el Aspergillus y Fusarium ya que estos hongos se encuentran en abundancia así como levaduras en las cajas petri, la muestra testigo también salió contaminada una causa de este pudo ser el mal manejo de los materiales durante la inoculación, otra pudo ser el refrigerador donde se mantuvo las diluciones ya que este es un medio donde se puede ver muchas esporas por la cantidad de materias que se le almacena.
APRECIACIONES Por la cantidad de hongos y levaduras dentro de las cajas petri no se pudo contar las demás muestras por lo que se escogió la muestra con menos cantidad la 10-4 y se le dio un valor aproximado tanto de hongos y levaduras.
