La fagocitosis por neutrófilos
abstracto La fagocitosis es central para la función microbicida de los neutrófilos. Los agentes patógenos son inicialmente envuelta en una m embrana plasmática derivado vacuola, el fagosoma, que procede a adquirir propiedades de degradación de un complejo proceso denominado maduración. En este capítulo, se discute el conocimiento actual de los mecanismos moleculares implicados en la formación y maduración del fagosoma de los neutrófilos.
1. introducción Los neutrófilos, que junto con los macrófagos constituyen la fagocitos profesionales, están dotados de una capacidad única para engullir (Fig. 1) y con ello eliminar los age ntes patógenos y células escombros. Los fagocitos están equipados con receptores especializados a reconocer sus objetivos, lo que m edia la compleja maquinaria internalización e inicia un surtido de degradativa mecanismos que culminan en la matanza y eliminación de la partículas envolvió. La mayor parte de nuestro conocimiento de los mecanismos mo leculares mecanismos de fagocitosis se ha derivado de los estudios de la fagocitosis en macrófagos, y mucho menos se sabe sobre neutrófilos, debido al hecho de que son refrac tarios a manipulación genética por cualquiera de transfección o microinyección. Por esta razón, la frecuente referencia se hará a fagocitosis en macrófagos, neutrófilos, aunque permanecen el objetivo principal de esta revisión. Al igual que los macrófagos, los neutrófilos pueden internalizar tanto opsonizado
(Fig. 1) y las partículas no opsonizadas. El director de la opsonina receptores de neutrófilos, los receptores Fc y un subgrupo de las integrinas b2, se unen a la inmunoglobulina o recubiertos por complemento partículas, respectivamente. Los principales receptores Fc de los neutrófilos humanos en reposo son FccRIIA (CD32) y FccRIIIb (CD16), mientras que la alta afinidad FccRI (CD64) funciones predominantemente neutrófilos después de haber sido cebados con interferón [1]. Complemento fragmento C3bi se reconoce por la integrina activada b2 MAC1 (CD11b/CD18). Los estudios en los macrófagos sugieren que mientras que la inmersión de partícula en una vacuola de membrana derivada es el re sultado final en ambos casos, los procesos que subyacen internalización no están idéntica en IgG o mediada por e l complemento eventos. mientras que opsonizadas complemento partículas son internalizados por suavemente "Hundimiento" en la célula, la ligadura Fcc receptor inicia la extensión vigorosa de seudópodos que rodean y en última instancia, atrapar las partículas [2]. Una vez formada, la vacuola se somete a una serie rápida de sucesos de remodelación que alterar su composición, que confiere sobre ella la capacidad para matar los patógenos y disponer de los desechos. Estos eventos de re modelación son colectivamente denomina maduración. Este capítulo presenta una visión general del conocimiento actual de los procesos moleculares que mediar en la formación y maduración del fagosoma de los neutrófilos 2. Los primeros eventos de señalización en la fagocitosis Como se discutió anteriormente, los múltiples tipos de receptores pueden iniciar fagocitosis y, si bien son superficialmente similares,
los acontecimientos moleculares que subyacen a la internalización de las partículas son más probable que difieran en cada caso individual. Por simplicidad, sólo las señales producidas por los receptores de la F CC, que han sido estudiado más ampliamente, se revisarán brevemente aquí. activación de la transmembrana Fcc receptores requiere la fosforilación de los residuos de tirosina en tándem dentro del contexto de un motivo inmunoreceptor activación de tirosina o ITAM. Fosforilación se produce por el reclutamiento de activado Quinasas de la familia Src en la proximidad inmediata de los re ceptores, como resultado de los conglomerados receptor por ligandos multivalentes. La fosforilación de los motivos ITAM en vez sirve para generar sitios de atraque para las proteínas que llevan dominios SH2, en particular la tirosina quinasa Syk. Localizada actividad Syk ha sido demostrado que es esencial para la fagocitosis mediada por F c, como los neutrófilos de Syk-ratones deficientes son incapaces de ingerir I gGopsonized partículas [3]. La participación de Syk se acompaña por la estimulación de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), que es en gran parte responsable de la conversión de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PI4, 5P2) para fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PI3, 4,5 P3). Syk r atones deficientes muestran una reducción Fosforilación de PI3K, lo que implica que la activación de la tirosina quinasa es un evento temprano que contribuye indirectamente a phosphoinositide metabolismo. metabolismo. PI4, 5P2 no sólo se convierte a PI3, 4,5 P3, pero también actúa como un sustrato para la fosfolipasa C (PLC) para generar localmente diacilglicerol (DAG) [4]. La Este último produce activación de coordinación de las isoformas clásicas y nuevas
de la proteína quinasa C (PKC) y domaincontaining C1 otro enzimas en la proximidad inmediata del fagosoma [5]. A pesar de conversión intensiva a PI3, 4,5 y P3 DAG, el nivel de PI4, 5P2 se mantiene e incluso aumentado en las primeras etapas de la fagocitosis por e stimulación localizada de fosfatidilinositol 4-fosfato 5-quinasa [4]. Act ivación normal de las quinasas phosphoinositide [2] y del PLC [4] requerido para la fagocitosis, mientras que el requisito para e l individuo Isoformas de PKC es todavía objeto de debate. Los efectores de las quinasas de proteínas y lípidos inducir la polimerización de la actina y la membrana localizada remodelación que son esenciales para la ingestión de partículas. Rac1 y Cdc42 se cree que se requiere para la actina conjunto después de la estimulación del receptor de FCC, mientras que juega un Rho papel equivalente en células activadas del complemento [2]. Otro pequeña GTPasa, Arf6, parece jugar un doble papel en phosphoinositide síntesis y en la regulación de la entreg a de endomembranas a los sitios de la fagocitosis [6]. La g uanina preciso factores de intercambio de nucleótidos (FMAM) que participan en cada instancia no han sido completamente identificados, se cree que butVav contribuir a la activación de Rho-GTPasas de la familia [7], como lo contiene una homología pleckstrin (PH) de dominio que tiene un alto afinidad por PI3, P3 4,5. Más abajo, el complejo Arp2 / 3 Se considera que desempeñan un papel central en el conjunto de actina [8]. Arp2 / 3 es estimulada por Cdc42 a través de WASP y por Rac1 a través de SCAR / WAVE. La polimerización de actina, junto con la
activación de la PI3, 4,5 P3 -sensible miosina X [9] y el la administración localizada de endomembranas, impulsa la formación de la copa phagosomal y su sellado. 3. Maduración del fagosoma Incluso después de un fagosoma se forma alrededor de una partícula, su composición inicial no es antimicrobiana: el término "fagosoma maduración "por lo tanto, se refiere al proceso por el cual el fagosoma naciente adquiere la maquinaria celular necesaria para la matanza y eliminación de los microorganismos internalizados. Este desarrollo es un proceso dinámico, que se cree implicar múltiples eventos de fusión con los componentes de la endocítica vía, así como la eliminación de componentes por vesicular fisión. Estas interacciones secuenciales (apodado el "Kiss and run" hipótesis) provocar gr andes cambios a los contenidos phagosomal y de la membrana, incluyendo el adquisición de enzimas microbicidas, vacuolar (V) ATPasas y el complejo NADPH oxidasa. Aunque mucho se ha aprendido acerca de los determinantes moleculares de esta maduración proceso en los últimos años, la mayoría de los estudios han sido llevó a cabo en los macrófagos o e n células no fagocíticas (por ejemplo, fibroblastos) transfectadas con receptores fagocíticas (los llamados diseñados fagocitos). Algo menos se conoce sobre fagosoma maduración de los neutrófilos, en gran parte debido a que son como no susceptibles de manipulación molecular. 3,1. Endocitosis y fagocitosis Poco después del sellado, la vacuola phagosomal inicia la
proceso de maduración. Debido a las similitudes obvias con endocitosis, una revisión de la maduración del fagosoma no puede ser a cabo sin una cierta comprensión de la endocítica vía [10]. Después de la internalización de un complejo rece ptor-ligando por endocitosis, el contenido de una vesícula endocítica son dirigida a un endosoma temprano. En esta etapa, e l ligando y su receptor a menudo se disocian, con el receptor se recicla a la superficie de la célula y el ligando continua a lo largo de la degradación brazo de la endocítica endosoma temprano pathway.An puede ser identificado por su lumen moderadamente ácido (pH 6,5 a 6,0) y por sus moléculas característicos asociados, incluyendo principios de los años endosomal antígeno 1 (EEA1), receptores de transferrina, y el pequeña GTPasa Rab5. Aquellos componentes de la endosoma temprano que no se recicla a la superficie celular se entregan a endosomas tardíos, donde la degradación puede comenzar. Late endosomes son más ácidas (pH 5,5 a 6,0), y porque contienen vesículas intraluminales, se denominan a menudo m ultivesicular cuerpos. Endosomas tardíos se pueden identificar por su asociación con las GTPasas Rab7 y Rab9, y con lysosomalassociated proteínas de membrana (lámparas). Posteriormente, endocítica carga se suministra a los lisosomas, que se car acterizan por su extrema acidez (pH ≤ 5,0) y elevación de Las concentraciones de proteasas. Los lisosomas son el destino final endocítica de la carga que se destina para la degradación. Debido a que los lisosomas compartir muchos marcadores con endosomas tardíos (Lámparas, por ejemplo), pueden ser mejor identificado en "pulso-caza"
etiquetado experimentos, utilizando protocolos que garanticen la entrega de sondas internalizados a un compartimiento tarde, terminal, es decir, el lisosoma. En muchos sentidos, la maduración de los macrófagos phagosomal parece ser una recapitulación de la se cuencia endocítica [11]. Tras el cierre de la copa phagosomal, el recién formado fagosoma se somete a eventos secuenciales de fusión con principios, entonces endosomas tardíos, hasta que finalmente la fusión con los lisosomas para producir un fagolisosoma. El fagolisosoma es un ácido compartimento rico en hidrolasas, donde la mayor parte de la degradación del contenido luminal se cree que ocurre. A diferencia de los macrófagos, los cuales se comprometen endocitosis activa, neutrófilos maduros son notablemente pasiva. Convencional principios y finales de los endosomas, lisosomas y no son fácilmente encontrado en estas células. En cambio, contienen una variedad de e specializada vesículas y gránulos que no son ni sujetos a tráfico entre sí, ni son accesibles desde el medio externo. Estos se describen en más detalle a continuación. 3,2. Vesículas secretoras y gránulos El fagosoma de los neutrófilos adquiere su antimicrobiano efectos a través de la fusión con las vesículas secretoras y gránulos. Estos orgánulos endomembrane se cree que se forman a partir de vesículas que brotan de la red trans-Golgi durante neutrófilos desarrollo, y contienen un heterogéneo notablemente y poderoso arsenal de péptidos microbicidas y proteolíticas enzimas, así como en numerosos unidas a la membrana
proteínas que contribuyen a la eliminación de patógenos. Cuatro categorías de gránulos han sido identificados: primaria (o azurófilos) gránulos caracterizados por la presencia de la mieloperoxidasa y unido a la membrana CD63, gránulos secundarios (También conocido como gránulos específicos) cuyo contenido incluye lactoferrina y unido a la membrana CD66b, gránulos terciarios, que falta CD66b pero contienen gelatinasa, y secretora vesículas, que contienen fosfatasa alcalina albúmina y expresa y CD35 en sus membranas. Los mecanismos de la desgranulación de los neutrófilos son el tema de otra artículo de este número [12], e n esta sección, vamos a limitar nuestra discusión gránulos de neutrófilos, ya que se refieren específicamente a la fagocitosis. Aunque se ha aprendido mucho acerca de los mecanismos que subyacen fusión gránulo, los lectores deben comprender que muchos de estos estudios utilizaron mediadores solubles para estimular gránulo exocitosis en el plasmalema (secreción generalizado), mientras que un número menor analizaron gránulo localizada coalescencia con la membrana phagosomal, utilizando partículas estímulos. Si los resultados de estos estudios son directamente comparable no está claro, pero es seguro suponer que las dos fenómenos están relacionados. En efecto, el uso de la se creción generalizada como un modelo para la fusión localizada puede ser una aproximación razonable, dado que la fusión de los gránulos con los no sellados membrana plasmática se ha demostrado que se producen ce rca formando phagosomes [13].
3,3. Las señales para la secreción La naturaleza abrupta de la fagocitosis después de la fusión implica la generación de señales efectivas aguda. Como en otro sistemas, el calcio puede provocar la fusión de los g ránulos de los neutrófilos. Además, elevado calcio libre citosólico se sabe que acompañar la ingestión de partículas durante la fagocitosis. Múltiple fuentes contribuyen a aumentar el calcio citosólico: la catión es liberado del retículo endoplasmático [14], que a su vez activa la entrada e ntrada de calcio extracelular. En Además, es concebible que el calcio también puede ser liberado localmente por el compartimento de destino, es decir, el fagosoma en sí [15]. Cambios en el nivel de calcio libre citosólico se requieren para la secreción de gránulos [16] y, más importante, para granular fusión con fagosomas en los neutrófilos [17]. El individuo compartimentos secretores tienen diferentes umbrales de calcio para la secreción, con vesículas secretoras que tienen el más bajo y gránulos azurófilos del umbral más alto [18]. El mecanismo responsable de esta sensibilidad diferencial de calcio es desconocido. Una familia de proteínas sensibles a calcio, las sinaptotagminas, Se ha postulado para mediar la sensibilidad al calcio en otras células. Una isoforma, la sinaptotagmina II, fue encontrado para ser asociado con gránulos específicos y t ranslocado para el fagosoma en una manera dependiente de calcio [19]. Los autores de este estudio especularon espec ularon que la sinaptotagmina II sirve como el sensor de calcio de estos gránulos. Será de
interés para definir si las isoformas de sinaptotagmina diferentes existen en los compartimentos individuales secretoras de neutrófilos y para validar su participación en la fusión. Otros sitios de acción podrían contribuir al efecto de calcio en maduración del fagosoma. La capa de actina que las líneas la copa phagosomal se desmonta rápidamente después del sellado, y este paso se piensa que es permisiva para el acoplamiento y la la fusión de vesículas y gránulos con la membrana phagosomal. Es de destacar que la despolimerización de la actina periphagosomal requiere cambios en el calcio intracelular [20]. El catión por lo tanto, podría promover la secreción de las vesículas mediante la concesión de acceder a su objetivo, la membrana mem brana phagosomal. La calmodulina es otra posible efector de calcio durante el fagosoma maduración. Estudios en levaduras sugirieron que la calmodulina mayo serán contratados de forma dependiente de c alcio a las vacuolas, en los que puede catalizar la co alescencia de membrana apposed bicapas [21]. Los efectores de la c almodulina en este proceso probablemente incluirá calmodulina dependiente de la proteína quinasa II [22]. Por último, las proteínas de unión a calcio-I y anexina anexina III son conocidos para asociar con e l fagosoma en neutrófilos, y puede contribuir a su maduración, aunque su función sigue siendo poco clara [23]. Mientras que el requisito de calcio en la secreción de gránulos está bien establecido, el papel de las isoformas de PKC en este proceso no está tan bien definida. Aunque por lo menos cuatro isoformas de PKC translocación a la membrana plasmática sobre la fagocitosis,
parece que mientras que la PKC es esencial para la superóxido generación, la quinasa no es estrictamente necesar io para la degranulación [24]. Por otra parte, la familia Src de tirosina de proteínas quinasas ha sido implicado en la maduración del fagosoma en los neutrófilos. Como se dijo anteriormente, la familia Src quinasas juegan un papel decisivo en la secuencia de activación temprana, provocada por receptor clustering. Además, sin embargo, Hck se ha localizado a gránulos azurófilos y en la fagocitosis de los zimosan opsonizado, se activa y se transloca hacia el fagosoma [25]. Curiosamente, se ha demostrado que cuando neutrófilos internalizar micobacterias, Hck no se activará y no se translocan al fagosoma. Más importante aún, bajo estas condiciones, la fusión de los gránulos azurófilos con el fagosoma se realiza la ablación, mientras que la fusión con gránulos específicos no se ve afectada [26]. Estas observaciones sugerentes implicar Hck en fusión de gránulos azurófilos, pero la modo de acción de la quinasa queda por definir. En resumen, comparativamente poco se sabe acerca de la eventos que desencadenan la fusión de membrana durante la maduración de phagosomes en los neutrófilos. Calcio y proteínas quinasas sin duda juegan un papel clave, pero sus objet ivos y los posible existencia de señales adicionales debe ser el centro de trabajo futuro. 3,4. Especificidad de la secreción Mientras que las vesículas secretoras y gránulos son claramente capaces de fusión a través de la membrana plasmática cuando las células están
activado por los agonistas solubles, durante la inmersión de las partículas, fusión se limita a la membrana de la naciente y formado fagosoma. Claramente, algún mecanismo (s) debe existir para garantizar el carácter vectorial ve ctorial y especificidad de estos fusión eventos. Los candidatos obvios para esta tarea son la SNARE familia de proteínas. Se cree que un SNARE (soluble N-etilmaleimida sensible-fusión-proteína de unión a proteínas receptor) en una membrana de donante interact úa con un cognado SNARE en una membrana diana para formar un complejo estable que consta de cuatro hélices, pre sentadas por el SNARE dos proteínas. Este complejo tetrahelical sirve para llevar los dos membranas juntos y promueve su fusión. Hasta la fecha, se conoce relativamente poco sobre el papel de SNAREs definidos en la maduración del fagosoma. Sin embargo, la exocitosis de los gránulos de los neutrófilos activados por soluble estimulantes se ha estudiado. En los neutrófilos activados con forbol-12-miristato-13-acetato, la proteína SNARE SNAP-23 translocado a partir de gránulos específicos y te rciaria a la superficie de la célula [27], en el que se encontró a interactuar con syntaxin 6, otro SNARE. Los anticuerpos del SNAP-23 impidió exocitosis de los gránulos azurófilos no específicos pero gránulos; en contraste, los anticuerpos para syntaxin 6 impedido exocitosis de gránulos específicos y ambos azurófilos. La autores de este informe se proponía que syntaxin 6 en el neutrófilo membrana plasmática actúa como un objetivo para la secre ción de gránulos específicos y azurófilos, mientras SNAP-23 es
sólo participan en la secreción de gr ánulos específicos. Un similar estudio realizado por los mismos investigadores sugirieron que syntaxin 4 en la membrana de plasma interactúa con VAMP-2 en la superficie de gránulos específicos y terciarias, con miras a su exocitosis [28]. Es evidente que aún queda mucho por aprender sobre el papel de la Trampas de neutrófilos fisiología. Aunque trampas son mediadores importantes de la membrana los eventos de fusión, el grado de e specificidad de sus interacciones sigue siendo controvertido. Otros determinantes de la especificidad y direccionalidad sería necesario en el caso de que SNAREs hacer no dictar todo el proceso. La familia de GTPasas Rab es probabilidades de cumplir esta función. Al trabajar en concierto con Trampas, las proteínas Rab conferir una capa adicional de especificidad para el acoplamiento de los donantes a las membranas dianas. De la familia Rab de GTPasas, Rab5 es de lejos el mejor estudiado. Al igual que otros miembros de la familia, Rab5 es una GTPasa monomérica, c uya capacidad para desplazarse entre GTP y GDP unido estados permite que funcione como un interruptor molecular [29]. En los macrófagos, Rab5 se ha detectado a residir r esidir transitoriamente en fagosomas tempranos, cada vez más evidente poco después de la escisión de la superficie de la membrana. Más importante aún, fue recientemente Rab5 demostrado que regulan la maduración del fagosoma de los neutrófilos: inhibición de Rab5a (uno de tres isoformas de Rab5) utilizando oligonucleótidos antisentido alterada LAMP-1 y lactoferrina adquisición por el fagosoma maduración [30]. La precisa
modo de acción de Rab5 es totalmente comprendida. La GTPasa se cree que interactúan con un gran número de proteínas, denomina Rab5 efectores, que incluyen Rabaptin-5, -5 Rabenosyn, EEA1, y la clase III PI3K, el mamífero homólogo de la levadura Vps34, que genera fo sfatidilinositol sfatidilinositol 3-fosfato (PI3P). ¿Cómo estos y posiblemente otros Rab5 efectores funcionar conjuntamente para facilitar el acoplamiento de la me mbrana es no se sabe con certeza. El reclutamiento de Vps34 se consideró una etapa temprana, lo que conduce a la formación rápida de PI3P. La generación de la fosfoinositida por el complejo Rab5 efector podría servir para reclutar otras proteínas. De hecho, algunos Rab5 efectores, como EEA1 Rabenosyn y 5, tienen FYVE llamada dominios ricos en cisteína secuencias que se unen e specíficamente a PI3P. Además, PI3P es también un ligando para ciertas proteínas teniendo phox homología (PX) dominios. Curiosamente, EEA1 contiene dos espacialmente distintos Rab5 sitios de unión, y puede por lo tanto sirven para atar dos membranas que contienen Rab5. Además de traer compartimentos membranosos juntos, Proteínas Rab también pueden regular la dirección de la procesos de fusión. Fagosomas son conocidos para mover bidireccionalmente a lo largo de los microtúbulos y los inhibidores de microtúbulos evitar fagosomas adquieran los marcadores de la tarde endocítica vía [31]. Rab5 se ha demostrado que interactúan con dineína, un menos-end dirigidas microtúbulos basada en proteína motora [32]. De manera similar, Rab7, que se encuentra en endosomas tardíos y los lisosomas, se ha demostrado que interactúan con una prote ína
llamado RILP (Rab7 interacción proteína lisosomal). RILP reclutas el complejo dineína dynactin, que media centrípeta movimiento de orgánulos a lo largo de microtúbulos [33]. A qué punto estas proteínas motoras están implicados en la maduración de fagosomas en los neutrófilos no se conoce todavía. Finalmente, aunque la secreción de gránulos de los neutrófilos requiere calcio, es interesante señalar se ñalar que el centro de coordinación, naturaleza polarizada de fusión gránulo en los sitios de fagosoma es no dictada por el calcio. Esta administración localizada puede ser interrumpido por la colchicina, pero no citocalasina, lo que sugiere un papel por los microtúbulos en la entrega prefere ncial de gránulos a el fagosoma [13]. 4. La NADPH oxidasa de neutrófilos Tras la activación, los neutrófilos son altamente eficaz en la ge neración especies reactivas de oxígeno (ROS) por un proceso conocido como la explosión respiratoria. En los neutrófilos estimulados, ROS son generado casi exclusivamente por una NADPH oxidasa que pertenece a la familia de proteínas de NOX. El leucocitos NADPH oxidasa específico es una entidad con multisubunit componentes unidos a la membrana y soluble que se ensamblan en un complejo heterómero cuando las células son estimuladas. Mientras que un fracción de los componentes intrínsecos de la oxidasa están presentes en la membrana plasmática en el momento de la fagocitosis, más se entregan a través de la fusión con el almacenamiento intracelular sitios. Gránulos secundarios se piensa que son la principal fuente de la NADPH oxidasa phagosomal [34].
Asamblea puede ocurrir en el plasmalema, cuando soluble agonistas se utilizan, o en la membrana durante phagosomal ingestión de partículas. La oxidasa de ensamblado facilita la la transferencia de un electrón del NADPH citosólico a molecular oxígeno capturado a partir del medio. El producto de est a reacción, el anión superóxido, entonces se puede convertir en otro metabolitos de oxígeno reactivo, incluyendo el peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso. En conjunto, estos ROS servir como altamente agentes antimicrobianos eficaces. La importancia clínica de la NADPH oxidasa y sus productos se ejemplifica mejor en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (CGD). Estos pacientes, que tienen la función defectuosa oxidasa, son susceptibles a infecciones recurrentes bacterianas y fúngicas. 5. Papel de pH en maduración del fagosoma: macrófagos vs neutrófilos En los macrófagos, uno de los rasgos clave de la maduración fagosoma es su acidez aumenta constantemente. Fagosomas tardíos (Fagolisosomas) puede alcanzar un pH luminal ≤ 5,0. Esta
acidificación es la clave para la actividad óptima de las prot easas y otras hidrolasas lisosomales implicados en el asesinato de patógenos. Sin embargo, además de su efecto inhibidor directo sobre la crecimiento y la viabilidad de los microbios, el pH ácido phagosomal Es probable también importante para la maduración del fagosoma. Por lo tanto, tratamiento de los macrófagos con bases débiles likeNH4Cl inhibe fagosoma-lisosoma fusión. El mecanismo de esta inhibición no se conoce, pero el hallazgo sugiere que, en lugar
de ser simplemente una consecuencia de la m aduración, acidificación en sí puede ser necesario para el fagosoma para desarrollarse completamente. Esta noción es consistente con las observaciones hechas en e l endocítica vía, donde la inhibición de la vacuolar (V) ATPasa disminuyó la tasa de entrega de la c arga de multivesicular endosomas a lisosomas [35]. Como en los endosomas, la acidificación de los fagosomas en los macrófagos se establece principalmente por la acción de la V-ATPasa, una proteína transmembrana de multisubunidades que las bombas protones en el lumen del fagosoma. V-ATPasas son apenas detectable en la membrana plasmática de las cé lulas quiescentes y por tanto no se presente inicialmente en el fagosoma naciente. Sin embargo, son rápidamente insertada por los eventos de fusión con orgánulos endomembranas. En los neutrófilos, secretora vesículas, gránulos primarios y terciarios, secundarios, pero no gránulos fueron encontrados para contener V-ATPasas [36]. Sorprendentemente, a pesar del hec ho de que los gránulos se fusionan con ácidos los fagosomas de los neutrófilos, lo que insertingV-ATPasas, el lumen de los fagosomas en estas cé lulas no es muy ácida. En hecho, una alcalinización transitorio inicial se ha descrito, que desaparece después de un período de minutos. No e stá claro si el pH se mantiene cerca de la neutralidad a continuación, o se convierte ligeramente ácida (para revisión ver [37]). Este comportamiento inesperado se ha atribuido principalmente al reclutamiento y activación de la NADPH oxidasa, que es mucho más pronunciada en los neutrófilos que en los macrófagos. La oxidasa
altera phagosomal pH por varios var ios mecanismos independientes. En primer lugar está el consumo co nsumo neto de H + luminal durante la dismutación del superóxido en peróxido de hidrógeno (Fig. 2I). En segundo lugar, ROS generado por la oxidasa disminuir la eficacia de la fusión con el gr ánulo phagosomal membrana, resultando en una reducción de la inserción de V-ATPasas y tasas consiguiente inferiores de H + bombeo [38]. Debido a que el pH misma juega un papel en el proceso de maduración, la incapacidad de fagosomas para desarrollar una acidificación temprano tendrá un impacto en su posterior fusión con gránulos de cojinete adicional V-ATPasas, lo que agrava el efecto sobre el pH. Por último, el oxidativo efecto de las ROS también aumenta la "fuga" de pasivo o permeabilidad al H + (equivalentes), evitando su acumulación en el lumen [38]. 6. Electrofisiología de maduración del fagosoma La activación de la NADPH oxidasa es una elec trogénico evento. Durante el estallido respiratorio, la oxidasa media la translocación vectorial de electrones a través de la bicapa, a catalizar la reducción de oxígeno extracelular o luminal. Al mismo tiempo, los protones se liberan en el citoplasma durante la oxidación de NADPH a NADP +. El combinado efectos de esta separación de la carga positiva representar el citosol con respecto a la parte extracelular o luminal de la membrana. La magnitud de esta despolarización se ha estimado exceda de 100 mV [39]. Un reciente análisis detallado de la relación corriente -voltaje
de la oxidasa demostró que, como se había previsto, la actividad de la enzima disminuye a medida que lucha contra una creciente gradiente electroquímico [39]. De ello se deduce que la continuación, robusta actividad de la oxidasa, que es esencial para su acción microbicida, sólo puede sostenerse si una disipación de carga vía desarrolla en paralelo. El más importante colaborador de esta vía parece ser un único, altamente selectivo H + (equivalente) canal (ver [40] para una revisión). Tres características de este canal c anal que sea idealmente apropiado para su función disipativa en los fagocitos: en primer lugar, es marcadamente voltaje sensible, siendo activada como la célula se despolariza. La relación corriente-voltaje muestra una profunda hacia afuera rectificación, asegurando que el H + (equivalentes) se irá, y no de entrar en el c itosol, el alivio de la acidificación en desarrollo. En segundo lugar, el canal se activa por acidificación citosólica, favoreciendo la exportación de H + citosólico durante la respiración reventar. Finalmente, la activación del canal parece ser estrechamente ligada a la estimulación de la oxidasa, asegurando acoplamiento de sus funciones [40]. De hecho, se ha argumentado que la actividad conductiva es inherente a la t ransmembrana subunidades de la oxidasa (Fig. 2II), es decir, que la oxidasa es también el canal [41]. La evidencia tanto a favor como en contra de esta hipótesis se ha informado y se resume y se debatieron en un artículo reciente [42]. 6,1. La oxidasa y la desgranulación Como se discutió anteriormente, la NADPH oxidasa se ha marcado
efectos sobre el desarrollo de la acidificación luminal que está cree que, a su ve z, necesaria para la maduración óptima de la fagosoma. En consecuencia, los pacientes con exposición anormal CGD la desgranulación de neutrófilos, y la inhibición de la oxidasa en Las células normales ha marcado efectos sobre la m aduración phagosomal [43]. Aunque estos efectos pueden ser más fácilmente explicada por la bien establecidos alteraciones en el pH inducidos por phagosomal la oxidasa, una explicación alternativa fue presentado recientemente. Basado en las mediciones de los flujos de c ationes alcalinos y contenido, Reeves et al. [44] propone que K +, en lugar de H +, puede ser el contraión primaria que neutraliza la e lectrogénico desplazamiento de los electrones por la oxidasa. Según estos autores, la acumulación de accionamiento eléctrico de K + en el lumen del fagosoma genera un medio hipertónico de alta fuerza iónica. Esta solución única es entonces previstas para facilitar la disolución de la matriz que contiene los contenidos de gránulos secretores juntos. Si no se activan la oxidasa, por ejemplo en individuos con CGD, privaría al fagosoma de la capacidad de dispersar los contenidos granulares, haciendo que el observado deficiencia de secreción. Aunque atractivo, este modelo requiere confirmación independiente, ya que no está claro cómo un solución hipertónica puede ser generada en el agua y permeable y la membrana phagosomal distensible. Por otra parte, la supuesta alta concentración de K + generada en el phagosomal lumen por la oxidasa no se ha demostrado directamente. Por último, la valinomicina ionóforo conductor tenía efectos paradójicos
en el informe de Reeves et al. [44], que no son fácilmente compatible con su hipótesis. Es evidente que una más directa la cuantificación de la contribución relativa de H + y K + a la corriente eléctrica y para los eventos asociados con la secreción maduración se requiere. 7. Observaciones finales Cada vez es más evidente que la formación de fagosoma y la maduración no son idénticos en todos los casos. Obvio Se indican las diferencias entre los neutrófilos y los macrófagos, que necesariamente impacto en la capacidad de los fagosomas a eliminar los agentes patógenos o cuerpos apoptóticos. Además, no todos pares de ligando y receptor dese ncadenar modos comparables de fagosoma formación, y la velocidad y grado de maduración también parece diferir entre ellos. Como resultado, el modo de entrada de patógenos es más probable para influir en su destino, que puede además, resultan ser muy diferentes de los ne utrófilos y macrófagos. Esta toma de conciencia hace que sea imperativo definir los distintos eventos moleculares que subyacen a la fagocitosis mediada por los receptores individuales y la contribución diferencial de la NADPH en tipos celulares específicos. Además, otro desafío será explicar las similitudes y las diferencias entre el "clásico" de la maduración de fagosomas en los macrófagos, que es paralela a la secuencia endocítica, y que en neutrófilos, en la que el secretora único y muy especializado orgánulos no son componentes activos de la endocítica maquinaria. Es evidente que aún queda mucho por aprender.
