ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA
Fagocitosis In Vivo Vivo ASIGNATURA
: Inmunología
DOCENTE
: Blgo. Carlos Espinoza Valera
ALUMNO
: Rómulo Aycachi Aycachi Inga
CICLO
: 2007 - I
Lambayeque, Marzo de 2007.
FAGOCITOSIS IN VIVO I.
Introducción:
En 1984 el El biólogo biólogo ruso Iliá Mechniko Mechnikovv desarrolló desarrolló la teoría de la fagocitosis. Mechnikov describió como ciertas células blancas de la sangr sangre e o leucoc leucocito itos, s, a las que llamab llamaba a fagoc fagocito itos, s, eran eran capace capacess de destruir bacterias y otros elementos extraños al organismo. Denominamos fagocitosis a la unión de un microorganismo (o, en gene genera ral,l, un agen agente te parti particu cula lado do,, inso insolu lubl ble) e) inva invaso sorr o extra extraño ño,, a la superficie de una célula fagocítica especializada (PMN o macrófago), por algún mecanismo inespecífico, de tipo “primitivo” (ameboide), esto es la emisión de pseudópodos y englobamiento, para crear un fagosoma al que luego se unen los lisosomas y así poder destruir o inactivar a la célula o partícula invasora. La destrucción del agente invasor se propicia en pocos minutos. Se sabe que para que para que se lleve a cabo la fagoci fagocitos tosis is el fagoci fagocito to debe debe ser capaz capaz de unirse unirse al microo microorga rganis nismo mo (rodearlo y englobarlo con su membrana); para ello utiliza la activación del complemento por la vía alternativa. La activación de la vía del complemento por la ruta alternativa es característica de la inmunidad innata o natural. El complemento es un conjunto de 20 proteínas del plasma, que interactúan entre sí y con otros elementos de los sistemas inmunitarios innato y adquirido, para mediar en una una seri serie e de impo import rtan ante tess resp respue uest stas as inmu inmuno noló lógi gica cas. s. La ruta ruta alte altern rnat ativ iva a del del comp comple leme ment nto o se basa basa en un sist sistem ema a de acti activa vaci ción ón enzimática en cascada, en el que el producto de una reacción es a su vez una enzima para la sgte. reacción, produciéndose una respuesta amplia y rápida del estímulo inicial.
Macrófagos engullendo bacterias Un macrófago, en amarillo, engulle y digiere una bacteria. Los macrófagos son grandes fagocitos, fagocitos, células que recorren el cuerpo y consumen partículas extrañas como polvo, amianto y bacterias. Ayudan Ayudan a proteger el organismo contra las infecciones.
2
II. -
III. -
Objetivos: Probar el poder bactericida del suero de un animal de experimen experimentació tación n (cobayo) (cobayo) inoculado inoculado con una cepa bacteriana bacteriana ( E. ). coli ). Materiales: Biológico: o o
-
De laboratorio: o o o o o o o o o o o
IV. -
Cobayo macho de edad adulta Cepa bacteriana ( E. coli )
Láminas portaobjetos Tabla de disección Estuche de disección Pabilo Jeringas de 5 ml Agujas Nº 21 Colorante de Wright o Giemsa Microscópio Solución salina fisiológica estéril Baño María Mechero Bunsen
Procedimiento: Primer Primero o prepar preparamo amoss nuest nuestra ra cepa cepa bact bacteri eriana ana a inocul inocular ar.. Prep Prepar aram amos os una suspe suspens nsió ión n bact bacter eria iana na usand usando o SSFE SSFE,, igua iguall a tubo tubo Nº 3 del nefelómetro de Mc Farlan (en este caso se uso como cepa ). E. coli ). Luego Luego inactiv inactivam amos os las las cepa: cepa: ponemo ponemoss la suspen suspensió sión n recien recientem tement ente e preparada en baño María a 70 ºC por 60 min. Luego uego dejam ejamos os enfri nfria ar. Pasado el tiempo, inoculamos vía peritoneal al cobayo ayo de experimentación. En este caso nuestra primera inoculación fue de 1 ml. Luego Luego damos damos al cobayo cobayo un descan descanso so de de 4 días. días. Pas Pasado ado el tiemp tiempo o volv volve emos mos a ino inocula cularr vía peri perito ton neal eal 1 ml de la suspensión preparada y dejamos de nuevo 4 días de descanso al cobayo. Lueg Luego o real realiz izam amos os la terce tercera ra inoc inocul ulac ació ión, n, esta esta vez vez de 2 ml de la suspensión preparada y dejamos descansar al cobayo por 8 días. Pasa Pasado do el tiem tiempo po,, volve volvemo moss a prepar prepara a una una susp suspen ensi sión ón bacte bacteri rian ana a igual al tubo número 3 del nefelómetro de Mc Farlan, pero esta vez no inactivamos la cepa.
3
-
Luego Luego inocu inoculam lamos os 1 ml de esta esta susp suspens ensión ión prep prepara arada da vía peri periton toneal eal y dejamos descansar al cobayo por aprox. 2 horas. Pasa Pasado do el tiem tiempo po,, se disec disecci cion ona a al anima animall para para extr extrae aerr el líqui líquido do peritoneal. Del Del líqu líquid ido o peri perito tone neal al obte obteni nido do se real realiz izan an frot frotis is en las las lámi lámina nass portaobjetos. Se realiza realiza la tinción tinción de Wrigth Wrigth o Giemsa Giemsa y luego luego se pasa pasa a observar observar.. Busca Buscamos mos célu células las que que hayan hayan desarr desarroll ollado ado la fagoc fagocito itosis sis..
4
V. -
Resultados: El desa desarr rrol ollo lo de esta esta práct práctic ica a fue fue con con la inte intenc nció ión n de obse observ rvar ar el desarrollo de la fagocitosis “in vivo”, además de la estimulación de una respue respuesta sta inmun inmunita itaria ria espec específi ífica ca por por parte parte del del cobayo cobayo a las inoculaciones repetidas con cepas inactivas de E. coli .
5
-
-
-
-
Como Como ya se dijo, dijo, las las inocul inoculaci acione oness repeti repetidas das de de cepas cepas inact inactiva ivadas das de de E. coli tuvieron la finalidad de estimular en el cobayo su sistema inmunológico especializado (un afecto parecido al de las vacunas), o sea, que además de la respuesta inmunológica natural (mediada tanto por macrófagos y PMN), con las inoculaciones repetitivas se trató trató de acti activa varr la resp respue uest sta a inmu inmuni nita taria ria espe especí cífifica ca,, esto esto es, es, la mediada tanto por LTCD4 activados (LT de memoria y LT efectores), no así los LTCD8, que en este caso no serán “ac “activa ivados” necesariamente; también la respuesta inmune específica que aquí veremos estará mediada por LB (que se dividirán sobre todo en LB de memoria y LB efectoras o células plasmáticas), para la secreción en este caso de inmunoglobulinas (tipo G o tipo M), características de la infección activa. En un cobayo ayo normal, la piel es su primera línea de defen fensa, nosotros al inocular directamente en la cavidad peritoneal estamos salvando esa barrera natural. La cavi cavida dad d peri perito tone neal al es el espa espaci cio o virt virtua uall comp compre rend ndid ido o entr entre e el peritoneo y las vísceras del animal, aunque los intestinos, que forman parte de este conjunto, tienen una elevada y diversa flora microbiana, no así la cavidad peritoneal, que por lo demás es estéril (libre de micr microo oorg rgan anis ismo mos) s),, aunq aunque ue sí es cust custod odia iado do por por uno uno que que otro otro macrófago errante. Cuando los E. coli ingresan en esta cavidad, son reconocidos como “extraños” por los macrófagos errantes y empieza el proceso de fagoci fagocitos tosis. is. Aquí Aquí se inicia inicia el proceso proceso de inflam inflamaci ación, ón, típico típico de la inmunidad innata. El daño del tejido (hecho por la aguja al inocular) propicia la liberación de factores vasoactivos y quimiotácticos que tien tienen en por por resu resulta ltado do un incr increm emen ento to loca locall del del fluj flujo o sang sanguí uíne neo o y permeabilidad capilar. Estos capilares permeables permiten la salida de líquido y células, en este caso más macrófagos. Los macrófagos presentes de manera temprana también empiezan a emitir sustancias quimiotáct quimiotácticas, icas, llamadas llamadas quimiocinas, que cumplen la funcion de atraer más macrófagos al sitio de infección. Los macrófagos que circ circul ulan an por por los los vaso vasoss sang sanguí uíne neos os adya adyace cent ntes es,, al reci recibi birr esta estass señales químicas, empiezan a emigrar al sitio de infección (salen del vaso vaso sangu nguíneo íneo por diap iapéde édesis sis) y van van ayud ayudar ar a los los demás emás macrófagos presentes, ahí además liberación de TNF que ayudará al proceso infeccioso por su acción pirógena. Aunque Aunque todos todos esto estoss proces procesos os deber deberian ian contr controla olarr la “invasi “invasión” ón” de las las cepas inactivadas de E. coli , pueden ocurrir otros acontecimientos. Tanto en la primera y más aun en la segunda inoculación, tanto los macr macróf ófag agos os como como los los linf linfoc ocititos os B (LB) (LB) fago fagoci cita tan n a la bact bacter eria ia “extraña” y cumplen con el procesamiento de la misma, como ambas son presentadoras de antígeno, procesan el péptido en su interior y lo presentan al LTCD4 a través del MHC – II. Éste, al ser activado, se diferencia en su mayoría en LTH1, el cual cumplirá tres funciones importantes: o
El LTH1 LTH1 va a ayudar a yudar a la acción fagocítica de los macrófagos a través de la secreción de INF-γ que mediará la activación de
6
o
o
-
-
-
los los macr macróf ófag agos os,, o sea, sea, esto esto aume aument nta a la fago fagoci cito tosi siss y la destrucción de las bacterias en el fagolisosoma (enzimas más potentes. El INF-γ también actúa sobre el LB estimulando la síntesis de anticuerpos (IgG) que mediarán en la opsonización de estas bacterias para su mejor fagocitosis (potencia la fagocitosis). La LTH1 también libera linfotoxinas y TNF que van a actuar sobre los neutrófilos, activándolos (aumentando la destrucción microbiana) y estimulando estimulando la inflamación.
La LTH1 libera además además una una interl interleucin eucina a autocr autocrina, ina, la la IL-2, IL-2, que que ayuda ayuda a la proliferación de los mismos (factor de crecimiento “autocrino”). Todos odos estos estos aconte acontecim cimien ientos tos,, antes antes mencion mencionado ados, s, son part parte e ya de la resp respue uest sta a inmu inmuni nita tari ria a y las inoculaciones adaptativa, intra intrape peri rito tone neal ales es repe repetitida das, s, son son real realiz izad adas as para para refo reforz rzar ar esto estoss eventos (para mejorar la respuesta inmune). Entonces, en la cuarta inoculación, en la cual se inocula la suspensión microbiana con células vivas (bacterias activas), si todo ha salido bien en el desarrollo de la práctica, la respuesta del cobayo será será ráp rápida ida y efec efecti tivva, ya que éste ste posee osee en su org organis anismo mo macrófagos activados e inmunoglobulinas tipo G, características de la inmu inmuni nida dad d espe especí cífifica ca y que que neut neutra raliliza zará rán n rápi rápida dame ment nte e a la bacteria. En las las lámina láminass del froti frotiss de líqui líquido do perito peritonea neall se obser observar varán án de de forma forma clara la fagocitosis y destrucción de las bacterias inoculadas.
7
VI. -
Conclusiones: Se logr logró ó concl concluir uir con éxito éxito el el desar desarrol rollo lo de de la prácti práctica. ca. Se logró logró induc inducir ir en el cobay cobayo o la respue respuesta sta inmun inmunoló ológic gica a especí específic fica, a, cara caract cter eriz iza ada por la prese resenc ncia ia de macr macróf ófag ago os activ ctiva ados e inmunoglobulinas opsonizantes. Se logró logró obse observa rvarr la fagoci fagocitos tosis is desarr desarroll ollada ada por por las célu células las inmun inmunes es del cobayo (macrófagos, linfocitos B, PMN) en respuesta a la cuarta inoculación de una suspensión de bacterias vivas (1 ml) en la cavidad intraperitoneal.
VII. -
Referencias:
ABBA ABBAS S A. K. y cols cols.. (200 (2002) 2) Inm Inmun unol olog ogía ía Celular y Molecular. 3º Edic. Mc Graw Hill. Madrid. GOLD GO LDS SBY y colb colbs. s. (200 (2005) 5).. Inmu Inmuno nolo log gía. ía. Edit. it. Pre Prentic ntice e Hall – Interamericana. Madrid. IÁÑE IÁÑEZ Z PAREJ AREJA, A, Enri Enriqu que e (200 (2003) 3) Curs Curso o de Inmu Inmuno nolo logí gía a Gene Genera ral:l: Introducción al sistema inmunitario. Departamento de Microbiología. Universidad de Granada. España. Micr Micros osof oftt ® Enca Encart rta a ® 2007 2007.. © 1993 1993--2 --200 006 6 Micr Micros osof oftt Corp Corpor orat atio ion. n. Reservados todos los derechos. ROJAS ESPINOSA, Oscar y Patricia, Arce paredes (2003) Fagoci Fagocitos tosis: is: Mecani Mecanismo smoss y consec consecuen uencia cias. s. Asoc. Asoc. Mexica Mexicana na de Bioquímica Clínica. Mexico D.F.
8
