FAGOCITOSIS IN VIVO, INOCULACIÓN EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN (PRUEBA OPSONOCITOFÁGICA EN EL CUY)
I.- INTRODUCCION:
La fagocitosis es una "herramienta" de suma importancia en la respuesta inmune, ya que a través de este mecanismo se eliminan principalmente las bacterias patógenas que logran ingresar al organismo, así también se eliminan los complejos antígeno-anticuerpo formados y las células que han cumplido su ciclo vital, por citar algunos casos.
Este mecanismo es realizado por células conocidas como "fagocitos", dentro de esta denominación se encuentran las células mononucleadas como los macrófagos o también los polimorfonucleares como los neutrófilos, principalmente; ambos tipos de células realizan una fagocitosis como respuesta a reconocimiento de patrones moleculares que les permiten diferenciar entre sustancias y/o estructuras propias del organismos y las que no lo son, en este caso la fagocitosis realizada no es muy eficaz (desde el punto de vista de la eliminación total del "cuerpo extraño") pero permite el procesamiento del antígeno de manera que se pueda generar una respuesta inmune específica, que en algunos casos termine induciendo una "fagocitosis mejorada", la cual sea mucho más eficiente que el primer proceso fagocítico.
MACRÓFAGOS
Los macrófagos juegan un papel importante en una amplia variedad de funciones, incluyendo la fagocitosis de material extraño, destrucción de células bacterianas y tumorales y la secreción de prostaglandinas y citocinas que regulan la actividad de linfocitos y otros macrófagos.
Una de las principales actividades de los macrófagos es su participación en la respuesta inmune adquirida, ya que procesan los antígenos y los presentan a las células T. Igualmente, los macrófagos desempeñan una importante función en la respuesta inflamatoria, principalmente, mediante la secreción de citocinas. Aparte de su actividad en la defensa inespecífica, también tienen un papel importante en la regulación de la respuesta inmune específica. Por último debe mencionarse que los centros germinales y los folículos de linfocitos B contienen una población típica de macrófagos, que eliminan a las células en proceso de autodestrucción (apoptosis).
Al cabo de unas 8 horas de su salida de la médula, los monocitos migran a tejidos y se diferencian a macrófagos. Los macrófagos son células de vida más larga (meses e incluso años). Poseen un núcleo en herradura, en su citoplasma se ve un abundante retículo endoplásmico rugoso y gran número de mitocondrias. Están especialmente adaptados a luchar contra virus, bacterias y protozoos intracelulares, pueden ser residentes (fijos en tejidos) o libres:
Residentes: cumplen misiones concretas en cada uno de los tejidos, pudiendo recibir, en su caso, denominaciones peculiares. Por ejemplo:
Células de Kupffer, en las paredes vasculares de las sinusoides hepáticas.
Células mesangiales de los glomérulos renales macrófagos alveolares de los pulmones.
Macrófagos de las serosas (p. ej., de la cavidad peritoneal)
Células de la microglía del cerebro.
Osteoclastos de los huesos.
Histiocitos del tejido conjuntivo.
Libres: están estratégicamente situados para atrapar material extraño en órganos linfoides secundarios:
Macrófagos de los sinusoides esplénicos (en el bazo)
Macrófagos de los senos medulares (en los ganglios linfáticos)
NEUTRÓFILOS
Son los más abundantes, su producción y diferenciación en la médula ósea es entre 6- 10 días.
Una vez liberados permanecen en circulación por 6-12 horas antes de migrar a tejidos donde desarrollan su actividad fagocítica. Esto explica la necesidad de una producción tan alta.
La mayoría de los neutrófilos circulantes entran en los tejidos filtrándose a través de las paredes capilares por diapédesis pero también muchos abandonan el organismo vía sistema digestivo.
Cuando migran a los tejidos permanecen 2-4 días antes de su destrucción, debido a la muerte en acción (por su acción fagocítica) o al proceso fisiológico de envejecimiento.
2.-OBJETIVOS:
Determinar la respuesta del sistema inmune del organismo del animal inoculado frente a la cepa bacteriana empleada.
Realizar la prueba opsonocitofágica.
Diferenciar la eficiencia de una fagocitosis inicial y una opsonización.
3.-MATERIALES:
De laboratorio:
Tubos de ensayo.
Mechero y ansa bacteriológica, en anillo.
Centrífuga
Solución salina fisiológica estéril.
Tubo Nº 3 de Mc. Farland.
Estufa y Baño María.
Agujas hipodérmicas.
Citrato de Sodio. 2%
Tabla de disección.
Láminas porta-objetos.
Soporte de coloración.
Colorante de Wright.
Agua destilada.
Microscopio.
Aceite de cedro.
Biológico:
Cepa de E. coli.
Cobayo, para la obtención de sangre.
4.- PROCEDIMIENTO:
Obtención de la cepa bacteriana: Sembrar la cepa de E. coli en caldo nutritivo e incubar a 37 ºC.
Lavado e inactivación de la cepa bacteriana: Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 15 minutos, eliminar el sobrenadante y agregar solución salina fisiológica (repetir esta acción tres veces). Comparar la turbidez del tubo lavado con la del tubo Nº 03 del Nefelómetro de McFarland. Llevar el tubo obtenido a baño maría a 85 ºC durante 60 min.
Se centrifuga el inoculo bacteriano a 1500 r.p.m. por 20 minSe centrifuga el inoculo bacteriano a 1500 r.p.m. por 20 min
Se centrifuga el inoculo bacteriano a 1500 r.p.m. por 20 min
Se centrifuga el inoculo bacteriano a 1500 r.p.m. por 20 min
Se compara con el tubo número 3 del nefelómetro de MacfarlánSe compara con el tubo número 3 del nefelómetro de Macfarlán
Se compara con el tubo número 3 del nefelómetro de Macfarlán
Se compara con el tubo número 3 del nefelómetro de Macfarlán
Comparado el tubo inactivamos la bacteriana en baño maríaComparado el tubo inactivamos la bacteriana en baño maría
Comparado el tubo inactivamos la bacteriana en baño maría
Comparado el tubo inactivamos la bacteriana en baño maría
Unas ves pasadas el tiempo para la inactivación sembramos la bacteria inactiva en una placa con Agar Nutritivo para asegurarnos que ha sido eficaz la inactivaciónUnas ves pasadas el tiempo para la inactivación sembramos la bacteria inactiva en una placa con Agar Nutritivo para asegurarnos que ha sido eficaz la inactivación
Unas ves pasadas el tiempo para la inactivación sembramos la bacteria inactiva en una placa con Agar Nutritivo para asegurarnos que ha sido eficaz la inactivación
Unas ves pasadas el tiempo para la inactivación sembramos la bacteria inactiva en una placa con Agar Nutritivo para asegurarnos que ha sido eficaz la inactivación
Inoculación: Inoculamos al cobayo vía peritoneal. En este caso nuestra primera inoculación fue de 0.5 ml. Luego damos al cobayo un descanso de 4 días. Pasado el tiempo volvemos a inocular vía peritoneal 1 ml de la suspensión preparada y dejamos de nuevo 4 días de descanso al cobayo. Luego realizamos la tercera inoculación, esta vez de 2 ml de la suspensión preparada y dejamos descansar al cobayo por 4 días. Pasado el tiempo, volvemos a inocular, esta vez de 4 ml de la suspensión preparada y dejamos descansar al cobayo por 4 días. Una vez pasado ese tiempo inoculamos 1ml de la bacteria viva.
Obtención de la bacteria viva
Sembramos la bacteria (E. coli) en caldo nutritivo a 37°C por 8 horas.
Transcurrido el tiempo centrifugamos la bacteria 1500 r.p.m. por 10 min
Luego de centrifugar comparamos con el tubo número 3 del Nefelómetro de Mc Farland.
Quinta inoculación de 1 ml de la bacteria viva después de 4 días de la cuarta inoculación.
Obtención del líquido intraperitoneal: Primero sacrificamos al animal de experimentación. Haciendo uso del Kit de disección realizamos un corte longitudinal, y abrimos la región abdominal del animal, luego mediante el uso de una jeringa realizamos la extracción del líquido peritoneal
Una vez que se ha sacrificado al animal realizamos un corte longitudinal en la región abdominal
Una vez realizado el corte pasamos a la extracción del líquido intraperitoneal
Coloración de Wright: Tomar una gota de la mezcla y realizar un frotis, tiñéndola con colorante Wright previamente filtrado y dejar secar.
Una vez extraído el líquido intraperitoneal, agregamos una gota a cada lámina, extendemos y dejamos secar.
Una vez seca las lamina agregamos el reactivo de Wright, y lo dejamos por dos 2 minutos
Una vez transcurrido el tiempo le agregamos solución salina fisiologica, hasta q se forme el espejo de agua, luego de eso lavamos y dejamos secar
Observación Microscópica: Observar con objetivo de inmersión las láminas teñidas y realizar el recuento de 100 células polimorfonucleares (PMNs) y 100 macrófagos. Luego sacar el promedio correspondiente y comparar con los valores de referencia.
5.- RESULTADOS:
Cepa utilizada: E.coli.
Datos obtenidos:
Número de
célula
Macrófago
(bacterias fagocitadas)
PMN
(bacterias fagocitadas)
Número de célula
Macrófago
(bacterias fagocitadas)
PMN
(bacterias fagocitadas)
Número de célula
Macrófago
(bacterias fagocitadas)
PMN
(bacterias fagocitadas)
1
2
10
35
2
13
68
18
23
2
8
20
36
3
8
69
17
11
3
10
8
37
7
17
70
10
0
4
6
9
38
24
11
71
4
13
5
7
4
39
23
3
72
5
4
6
1
4
40
9
8
73
17
13
7
12
2
41
12
23
74
21
15
8
3
1
42
17
11
75
18
12
9
7
23
43
21
4
76
20
17
10
13
11
44
17
22
77
15
8
11
4
0
45
3
15
78
12
11
12
4
2
46
7
19
79
13
7
13
8
7
47
6
13
80
19
4
14
9
13
48
8
7
81
13
2
15
8
15
49
11
11
82
15
11
16
6
11
50
4
5
83
18
9
17
5
16
51
17
12
84
21
10
18
16
3
52
11
13
85
15
0
19
3
15
53
7
8
86
22
4
20
11
20
54
17
21
87
2
9
21
12
11
55
17
15
88
11
6
22
4
2
56
8
16
89
14
10
23
2
15
57
19
0
90
32
8
24
4
16
58
10
15
91
19
17
25
7
2
59
8
12
92
15
10
26
17
5
60
9
2
93
23
12
27
4
6
61
7
7
94
36
10
28
7
3
62
21
23
95
20
11
29
12
15
63
10
9
96
15
19
30
3
12
64
21
17
97
21
17
31
17
13
65
8
21
98
30
13
32
21
2
66
11
13
99
17
9
33
7
7
67
15
8
100
18
17
34
1
12
Total de bacterias fagocitadas por macrófagos: 1217
Total de bacterias fagocitadas por PMN: 1088
Promedio obtenido por macrófago: 12.17 bacterias por macrófago.
Promedio obtenido por PMN: 10.88 bacterias por macrófago.
Promedio total: 11.53 bacterias por fagocito.
Tabla de resultados:
0 a1 bacterias por fagocitos
Fagocitosis nula
2 a 20 bacterias por fagocito
Fagocitosis insipiente
21 a 40 bacterias por fagocito
Fagocitosis franca (normal)
41 a + bacterias por fagocito
Fagocitosis excelente
Comparando los resultados obtenidos con la tabla se concluye que en el animal sensibilizado se ha dado una "fagocitosis insipiente".
CONCLUSIONES:
SE concluye con éxito la práctica de Fagocitosis in vivo, observando una fagocitosis insipiente, tras una exposición temporal a un agente extraño.
Se logró inducir en el cobayo la respuesta inmunológica innata caracterizada por la presencia de macrófagos activados.
Se logró observar la fagocitosis desarrollada por las células fagocíticas tras la exposición de los microorganismos.
BIBLIOGRAFIA:
ABBAS A. K. y cols. (2002) Inmunología Celular y Molecular. 3º Edic. Mc Graw Hill. Madrid.
GOLDSBY y colbs. (2005). Inmunología. Edit. Prentice Hall – Interamericana. Madrid.
IÁÑEZ PAREJA, Enrique (2003) Curso de Inmunología General: Introducción al sistema inmunitario. Departamento de Microbiología. Universidad de Granada. España.
Microsoft ® Encarta ® 2007. © 1993--2006 Microsoft Corporation. Reservados todos los derechos.
ROJAS ESPINOSA, Oscar y Patricia, Arce paredes (2003) Fagocitosis: Mecanismos y consecuencias. Asoc. Mexicana de Bioquímica Clínica. Mexico D.F.
http://es.scribd.com/doc/6435883/Fagocitosis-In-Vivo
http://es.scribd.com/doc/32543544/pract-3-inmuno-fagocitosis
http://www.puc.cl/sw_educ/eprueba.opsonocitofagica./viaparenteral/html/contenidos/msubcutanea.html
