ISOLASI DAN PEMURNIAN MIKROBIA
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI OLEH :
NAMA
: EKI SOPHYA NOORHAYATI
NIM
: H1E107005
KELOMPOK
:5
ASSI ASSIST STEN EN
: M. BASU BASUKI KI YUS’ YUS’A A
PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT BANJARBARU
OKTOBER, 2009
BAB I PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat sangat besar besar dan komple komplek. k. Beratu Beratus-ra s-ratus tus spesie spesiess berbag berbagai ai mikrob mikrobaa biasan biasanya ya meng menghu huni ni berm bermac acam am-m -maca acam m bagi bagian an tubu tubuh h kita, kita, terma termasu suk k mulu mulut, t, salu saluran ran pencernaan, dan kulit. Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beriburibu mikroorganisme. Satu tinja dapat mengandung jutaan bakteri (Pelczar, 1986). Bakt Bakteri eri ters terseb ebar ar sang sangat at luas luas baik baik dita ditana nah, h, air air dan dan udara udara,, bila bila hend hendak ak mengisolasi bakteri dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut, atau atau zat cair lain, lain, maka maka dilaku dilakukan kan serang serangkai kaian an pengen pengencer ceran an (dilut (dilution ion series series)) terhad terhadap ap zat terseb tersebut. ut. Sumber Sumber isolat isolat dari dari bakter bakterii benda benda yang yang liat atau atau padat, padat, misatnya misatnya daging daging maka zat tersebut tersebut dihancurkan dihancurkan terlebih dahulu. Tehadap bakteri yang yang hanya hanya terdapa terdapatt diperm dipermuka ukaan an maka maka pengen pengencer ceran an dilaku dilakukan kan terhad terhadap ap air tempat zat tersebut dicelupkan/ direndam. Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara, cukup dengan membuka cawan petri yang berisi media agar steril beberapa saat. Di dalam laboratorium laboratorium mikrobiolog mikrobiologi, i, populasi populasi bakteri ini dapat diisolasi diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
1.2
Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mempelajari teknik-teknik isolasi dan pemurniannya.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Isolasi Isolasi merupakan merupakan cara untuk memisahkan memisahkan atau memindahka memindahkan n mikroba mikroba tertentu tertentu dari lingkungannya lingkungannya,, sehingga sehingga diperoleh diperoleh kultur kultur murni atau biakan biakan murni. murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986). Kultur Kultur murni murni atau biakan murni sangat berguna didalam didalam mikrobiolo mikrobiologi, gi, yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri ciri-ciri cultural, cultural, morfologis morfologis,, fisiologis fisiologis,, maupun maupun serologis serologis,, memerlukan memerlukan suatu popolasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Untu Untuk k bebe bebera rapa pa bakt bakter erii yang yang yang yang ada ada dan dan ters terseb ebar ar dima dimana na sang sangat at memban membantu tu dalam dalam hal biokim biokimia ia dan biofis biofisika ika lingku lingkunga ngan. n. Biokim Biokimia ia (masal (masalah ah nutrient) lingkungan ada karena berkat adanya kultur medium, dan semua itu tergantung dari bakteri particular itu (sebagaimana sebagai particular investigator) bermacam bermacam sumber dan jenis dari kultur kultur media akan berkembang berkembang dengan dengan adanya perbedaan maksud dan. kultur media sebagai tempat untuk teknik isolasi dan pemeliharaan kultur murni dari bakteri dan juga digunakan untuk mengidentifikasi bakteri menurut biokimia dan biofisika yang ada (Todar, (Todar, 2000) Sel– Sel–se sell
bakte akteri ri mem mempuny punyai ai muata uatan n
yang ang
agak agak nega negati tiff
bila ila
pH
lingkungan lingkungannya nya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Frobisher et all, 1974)
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi bakteri, fungi, dan khamir dengan menggunakan metode gores, metode tuang, metode sebar, metode pengenceran serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering diguna dig unakan kan ada adalah lah tek tekhni hnik k caw cawan an tua tuang ng dan cawan gor gores. es. Ked Kedua ua met metode ode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies individu spesies dapat dipis dipisahkan ahkan dari lainn lainnya ya (Hadioetomo, 1993).
Isolasi dan Pemurnian Bakteri
Di alam alam ters terseb ebar ar sang sangat at luas luas baik baik tana tanah, h, air, air, udar udara. a. Bila Bila hend hendak ak mengisolasi bakteri dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut atau atau zat cair lain, lain, maka maka dilaku dilakukan kan serang serangkai kaian an pengen pengencer ceran an (dilut (dilution ion series series)) terhadap zat tersebut. Sumber isolat bakteri benda yang liat atau keras, misalnya daging daging maka zat tersebut tersebut dihancurka dihancurkan n terlebih terlebih dahulu. dahulu. Terhadap bakteri yang hanya terdapat di permukaan maka pengenceran dilakukan terhadapa air tempat zat tersebut dicelupkan/direndam. Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara cukup dengan membuka cawan petri yang berisi media agar steril beberapa saat.
Faktor Lingkungan Yang Berpengaruh Terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme •
Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme
Berdasarkan Berdasarkan suhu optimum optimum untuk untuk pertumbuh pertumbuhan an maka dapat dikelompo dikelompokan kan menjadi 3 yaitu : 1. psikrofilik (0-20 0C), 2. mesofilik Mesofilik (20-30 0C), 3. termof termofilik ilik (50-10 (50-100 00C). C).
Suhu Suhu meru merupa paka kan n
fakt faktor or ling lingku kung ngan an yang yang sang sangat at
menentukan menentukan kehidupan kehidupan mikroorgan mikroorganisme, isme, pengaruh pengaruh suhu suhu berhubung berhubungan an dengan dengan
aktivitas enzim. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim. Cara Kerja : 1. 8x2 tab tabung ung yan yang beri berisi si Nutrient Broth untuk suhu inkubasi 5 0C, 250C, 370C, dan 500C dan mikroorganisma yang berbeda berbeda (E.coli dan Bacillus sp.) diberi label . Setelah diinokulasi diinokulasi dengan bekteri yang yang berb berbed eda, a, diin diinku kuba basi si sesu sesuai ai suhu suhu yang tertera; 2. Sete Setela lah h ditum itumbu buhk hkan an sela selama ma 48 jam, jam, bandingkan derajat kekeruhannya.
•
Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme
Keberad Keberadaan aan mikroo mikroorga rganis nisma ma diling dilingkun kungan gan dapat dapat dipeng dipengaru aruhi hi kepeka kepekatan tan suspensi/cairan di lingkungan. Bila kepekatan suspensi di lingkungan tinggi maka isi sel akan ke luar. Sebaliknya kepekatan suspensi di lingkungan rendah maka akan terjadi pergerakan massa cair ke dalam sel. Cara Kerja: 1. buat 4 bua buah caw cawan Nutrient Agar Nutrient Agar yang mengan mengandun dung g NaCl NaCl 0,5%, 0,5%, 3%, 5% dan 15%; 2. Setiap Setiap kons konsent entras rasi, i, cawan cawan dibag dibagii menjadi menjadi 2 dengan dengan spidol spidol kemudian kemudian labeli dengan dengan bakteri E.coli dan Bacillus sp. 3. Ino Inokula kulasi sik kan E .coli dan Bacillus sp. dengan streak kontinyu;
4. Gunaka Gunakan n kontrol kontrol untuk untuk masing masing-mas -masing ing biakan biakan dengan dengan media media yang tidak ditambahi NaCl; 5. Inkuba Inkubasi si selama selama 48 jam dan amati amati pertum pertumbuh buhann annya. ya.
•
Pengaruh sinar ultraviolet terhadap pertumbuhan mikroorganisme
Sinar UV panjang gelombang 210-300 nm dapat membunuh mikroorganisme jika di paparkan. paparkan. Komponen Komponen seluler seluler yang dapat menyerap sinar UV adalah asam nukleat sehingga dapat rusak dan menyebabkan kematian. Cara Kerja: 1. Ino Inokula kulasi sik kan Aspergillus sp., E.coli dan pada 3 cawan NA.· Dedahkan Bacillus sp. pada keti ketiga ga cawa cawan n ters terseb ebut ut pada pada sina sinarr UV dengan panjang 254 nm selama 1 menit, 5 menit, menit, dan 15 menit menit (ingat (ingat tutup tutup cawan cawan dibuka dan diusahakan lingkungan sekitar steril). Jarak antar UV dan cawan sekitar 12 inchi; 2. Gunaka Gunakan n kontro kontroll untuk untuk masing-m masing-masi asing ng biakan biakan dengan dengan tidak tidak memapa memaparka rkan n pada sinar UV; 3. Inkubasi Inkubasi selama selama 48 48 jam dan amati amati pertumb pertumbuhan uhan koloninya. koloninya. •
Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime
pH berpen berpengar garuh uh terhad terhadap ap sel dengan dengan mempen mempengar garuhi uhi metabo metabolism lisme, e, pada pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada pH netral (7,0). Berdasarkan nilai pH yang dibutuhkan untuk kehidupannya dikenal 3 kelompok mikroorganisme yaitu : Acidofilik, Mesofilik/Neutrofilik dan Basofilik.
Cara Kerja : 1. Buat Buatla lah h tabung tabung reaks reaksii berisi berisi NB dan atur atur pH-nya (pH 3, 7 dan 9) masing-masing 2 tabung untuk tiap nilai pH 2. Labe Labeli li deng dengan an nama nama bakt bakter erii yang yang akan akan diinokulasikan 3. Inok Inokul ulas asii tiap tiap tabun tabung g denga dengan n Bacillus sp dan E. coli lalu diinkubasi diinkubasi pada suhu 37 0C selama 48 jam 4. Amati Amati perbed perbedaan aan keker kekeruha uhan n pada pada tiap nila nilaii pH (Pradhika, 2008) Teknik Pengambilan Sampel
Sebelu Sebelum m melaku melakukan kan isolas isolasii terlebi terlebih h dahulu dahulu dilaku dilakukan kan pengam pengambil bilan an sampel sampel.. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel. 1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambila pengambilannya nnya disesuaikan disesuaikan dengan dengan tujuan tujuan dan kebutuhan. kebutuhan. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran.
2. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika berasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air (1). Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali (2), jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat (3) dan mulut kran dibakar (4)
(1)
(2)
(3)
(4)
Isolasi Dengan Cara Pengenceran ( Dilution) Dilution) 1. Teknik Teknik Prepa Prepara rasi si Su Suspe spensi nsi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel : a. Swab (ulas), (ulas), dilakukan dilakukan menggunak menggunakan an cotton steril pada pada sampel sampel yang yang cotton bud steril memi memili liki ki perm permuk ukaa aan n luas luas dan dan pada pada umum umumny nyaa suli sulitt dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adal adalah ah meja meja,, batu batu,, bata batang ng kayu kayu dll. dll. Cara Carany nyaa deng dengan an mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton
bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water . b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun daun bung bungaa dll. dll. Rins inse
meru erupaka pakan n pro prosed sedur kerj kerjaa
deng engan
mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9
(w/v). (w/v). Contoh Contohnya nya sampel sampel daun daun diambi diambill dan ditimb ditimbang ang 5 g kemudi kemudian an dibila dibilass dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass glass . c. Maseration (penga (pengancu ncuran ran), ), sampel sampel yang yang berben berbentuk tuk padat padat dapat dapat ditumb ditumbuk uk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbanding Perbandingan an antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi
2. Teknik Teknik Penge Pengence nceran ran Ber Bertin tingka gkatt
3. Te Tekn knik ik Pena Penana nama man n
Tujuan Tujuan dari dari pengen pengencera ceran n bertin bertingka gkatt yaitu yaitu memper memperkec kecil il atau mengur mengurang angii jumla jumlah h mikrob mikrobaa yang yang tersusp tersuspens ensii dalam dalam cairan. cairan. Penent Penentuan uan besarn besarnya ya atau atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan Digunakan perbandingan perbandingan 1 : 9 untuk sampel sampel dan pengenceran pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Cara Kerja :
a.
Samp ampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung
pen penge genc ncera eran n pert pertam amaa (1/1 (1/10 0 atau atau 10-1) seca secara ra asep asepti tiss (dar (darii prep prepara arasi si suspen suspensi) si).. Perban Perbandin dingan gan berat berat sampel sampel dengan dengan volume volume tabung tabung pertam pertamaa adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab swab sudah sudah termas termasuk uk pengen pengencer cer 10-1. Setelah Setelah sampel sampel masuk masuk lalu lalu dilarutkan dilarutkan dengan dengan mengocokny mengocoknyaa (pengocoka (pengocokan n yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) b.
Diambil 1 ml m l dari tabung 10 1 0-1 dengan dengan pipet pipet ukur ukur kemudi kemudian an
dipind dipindahk ahkan an ke tabung tabung 10-2 secara secara asepti aseptiss kemudi kemudian an dikoco dikocok k dengan dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang yang perlu perlu diinga diingatt bahwa bahwa pipet pipet ukur ukur yang yang diguna digunakan kan harus harus selalu selalu digant diganti, i, artiny artinyaa setiap setiap tingka tingkatt pengen pengencera ceran n diguna digunakan kan pipet pipet ukur ukur steril steril yang yang berb berbed eda/ a/ba baru ru.. Prin Prinsi sipn pnya ya bahw bahwaa pipe pipett tida tidak k perlu perlu diga digant ntii jika jika memindahkan cairan dari sumber yang sama. a. Teknik penanaman dari suspense • Spread Plate (agar tabur ulas) adalah teknik teknik menana menanam m dengan dengan menyeb menyebark arkan an suspen suspensi si Spread Spread plate plate adalah bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut : 1.
Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur
kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. 2.
Bata Batang ng L atau atau bat batan ang g drug drugal al dia diamb mbil il kem kemud udia ian n dise disemp mpro rott alko alkoho holl
dan dibaka dibakarr diatas diatas bunsen bunsen beberap beberapaa saat, saat, kemudi kemudian an diding didingink inkan an dan ditunggu beberapa detik.
3.
Kem Kemudia udian n diseb isebar arka kan n denga engan n meng mengg goso osokan kannya nya pad pada perm permu ukaan kaan
agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. 4.
Hal Hal yang yang per perlu lu dii diin ngat gat bahw bahwaa bata batan ng L yan yang terl terlal alu u pana panass dapa dapatt
menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
•
Pour Plate (agar tuang)
Teknik Teknik ini memerlu memerlukan kan agar agar yang yang belum belum padat padat (>45 (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada pada permuk permukaan aan agar agar saja saja melain melainkan kan sel terenda terendam m agar agar (di dalam dalam agar) agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O 2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : 1. Siap Siapka kan n cawa cawan n ster steril il,, tabu tabung ng peng pengen ence ceran ran yang akan dita ditana nam m dan dan media padat yang masih cair (>45 oC) 2. Teteskan Teteskan 1 ml secara aseptis aseptis.sus .suspensi pensi sel kedalam kedalam cawan cawan kosong kosong 3. Tuan Tuangk gkan an media media yang yang masih masih cair ke cawan cawan kemudi kemudian an putar putar cawan cawan untu untuk k meng mengho homo moge genk nkan an susp suspen ensi si bakt bakteri eri dan dan medi media, a, kemu kemudi dian an diinkubasi.
Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untu untuk k pour pour plat platee kare karena na spre spread ad plate plate ditu dituju juka kan n untu untuk k menu menumb mbuh uhka kan n dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebaran penyebarannya nya sehingga sehingga diberikan diberikan lebih banyak banyak dari pada spread
plate .
b. Teknik Penanaman dengan Goresan ( Streak ) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. •
Goresan Sinambung
Cara kerja :
1. Sentuh Sentuhkan kan inokul inokulum um loop pada pada koloni koloni dan gores gores secara secara kontin kontinyu yu sampai sampai setengah permukaan agar. 2. Jang Jangan an pijar pijarka kan n loop, loop, lalu putar putar cawa cawan n 180oC lanjutkan goresan sampai habis. 3. Gores Goresan an sina sinamb mbun ung g umum umumny nyaa digu diguna naka kan n buka bukan n untu untuk k mend mendap apat atka kan n koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
•
Goresan T
Cara kerja :
1.
Bagi Bagi cawa cawan n menj menjad adii 3 bagi bagian an meng menggu guna naka kan n spi spido doll mar marke ker r
2.
Inokulasi da daerah 1 den deng gan streak zi zig-zag
3.
Pana Panask skan an jar jarum um ino inoku kula lan n dan dan tung tunggu gu ding dingin in,, kemu kemudi dian an lan lanju jutk tkan an
streak zig-zag pada daerah 2 ( streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna. 4.
•
Lakukan hal yang ang sama pada daerah rah 3.
Goresan Kuadran ( Streak quadrant Streak quadrant )
Cara kerja :
Hampir Hampir sama dengan goresan T, namun berpola berpola goresan goresan yang berbeda yait yaitu u diba dibagi gi empa empat. t. Daera Daerah h 1 meru merupa paka kan n gore goresa san n awal awal sehi sehing ngga ga masi masih h mengandun mengandung g banyak banyak sel mikroorgan mikroorganisma. isma.Goresa Goresan n selanjutny selanjutnyaa dipotongk dipotongkan an atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.
(Pradhika, 2008) Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu: 1) Isolasi pada agar cawan
Prin Prinsi sip p pada pada meto metode de isol isolas asii pada pada agar agar cawa cawan n adal adalah ah meng mengen ence cerk rkan an mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setela setelah h inkuba inkubasi si berasa berasall dari dari satu satu sel tungga tunggal. l. Terdap Terdapat at beberap beberapaa cara cara dalam dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawan tuang.Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilk menghasilkan an terisolasin terisolasinya ya mikroorgan mikroorganisme, isme, dimana dimana setiap koloni berasal berasal dari satu sel. Metode agar tuang berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang meng menggu guna naka kan n medi medium um agar agar yang yang dica dicair irka kan n dan dan didi diding ngin inka kan n (50 (50 0C), C), yang yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang yang terakh terakhir ir mengan mengandu dung ng koloni koloni-ko -kolon lonii yang yang terpisa terpisah h di atas atas permuk permukaan aan/di /di dalamcawan. 2) Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan dilakukan pengenceran pengenceran dengan beberapa serial
pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar. 3) Isolasi sel tunggal
Metode
isolasi
sel
tunggal
dilaku akukan
untuk
mengisolasi
sel
mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapile kapilerr yang yang sangat sangat halus halus ataupun ataupun microm micromani anipul pulato ator, r, yang yang dilaku dilakukan kan secara secara aseptis (Admin, 2008)
BAB III METODE PRAKTIKUM
3.1
Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari rabu tanggal 5 Oktober 2009 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas MIPA Unlam Banjarbaru.
3.2
Alat dan Bahan
Alat Alat yang yang digu diguna naka kan n dala dalam m prak prakti tiku kum m ini ini adal adalah ah tabu tabung ng reak reaksi si steril,vortex mixer, cawan petri steril, lampu spritus, kertas label,alkohol 70%, pipet ependorp, pipet volumetric, jarum ose, kapas. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah medium NA (Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), aquadest, sampel sumber bakteri (air sumur, air kemasan, air ledeng, tanah kebun, tanah dekat sampah)
3.3
Prosedur Kerja Isolasi dan Pemurnian Bakteri
1. Disiapkan Disiapkan medium medium nutrien nutrientt agar yang yang sudah sudah dalam dalam keadaan keadaan steril. steril. 2. Dila Dilaku kuka kan n peng pengen ence cera ran n terh terhad adap ap samp sampel el air, air, untu untuk k air air kema kemasa san n sebanyak 10-1 - 10-3 dan untuk sampel air sumur dan ledeng sebanyak 10-1 - 10-6 3. Dituangkan 1 ml sampel air ke dalam cawan petri pada pengenceran 10-2 - 10-3 untuk air kemasan, 10 -4 - 10-6 untuk air sumur
dan ledeng, masing-masing dilakukan sebanyak dua kali. Kemudian dihomogenkan dengan vortex mixer. 4. Dituangkan Dituangkan larutan larutan medium medium NA kedalam kedalam cawan petri sebany sebanyak ak 101015 ml; 5. Cawan Cawan petri petri digoya digoyang ng memben membentuk tuk angka angka delapa delapan; n; 6. Diinku Diinkubas basii dalam kead keadaan aan terbal terbalik ik pada pada suhu suhu 300 selama 24 jam. 7. Dari Dari koloni koloni yang terpisa terpisah h dimurn dimurnika ikan n secara secara goresan. goresan. Selanju Selanjutny tnyaa dipindahkan ke media agar miring.
Isolasi dan Pemurnian Fungi
1. Disiapkan Disiapkan PDA (Potato (Potato Dextros Dextrosee Agar) Agar) yang sudah dalam keadaan keadaan steril. 2. Dila Dilaru rutk tkan an samp sampel el tanah tanah kebu kebun n dan dan tanah tanah deka dekatt samp sampah ah deng dengan an aquadest; 3. Dila Dilaku kuka kan n peng pengen ence ceran ran terha terhada dap p samp sampel el air tana tanah, h, untu untuk k tana tanah h kebun dan tanah dekat sampah sampah sebanyak 10-1 - 10-6 8. Dituan Dituangka gkan n 1 ml sampel sampel air tanah tanah tersebu tersebutt ke dalam cawan cawan petri petri pada pengenceran pengenceran 10-4 - 10-6, masing-masing dilakukan sebanyak dua kali. Kemudian dihomogenkan dengan vortex mixer. 4. Dituan Dituangka gkan n larutan larutan medium medium PDA kedala kedalam m cawan petri petri sebanyak sebanyak 10-15 ml; 5. Cawan Cawan petri petri digoya digoyang ng memben membentuk tuk angka angka delapa delapan; n; 6. Diin Diinku kuba basi si dalam dalam kead keadaa aan n terba terbalik lik pada pada suhu suhu 30 0 selama 2 x 24 jam.
7. Dari Dari koloni koloni yang terpisa terpisah h dimurn dimurnika ikan n secara secara goresan. goresan. Selanju Selanjutny tnyaa dipindahkan ke media agar miring.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil
Tabel 1. Sampel Air Kemasan (1x24 jam) No.
Gambar
Konsentrasi
Jumlah Koloni
1.
10-2(1)
1
2.
10-2(2)
8
3.
10-3(1)
3
4.
10-3(2)
2
Tabel 2. Sampel Air Sumur (1x24 jam) No. 1.
Gambar -
Konsentrasi 10-4(1)
Jumlah Koloni -
10-4(2) 10-5(1)
-
4.
10-5(2)
1
5.
10-6(1)
2
10-6(2)
-
Konsentrasi
Jumlah Koloni
10-4(1)
1
10-4(2)
-
10-5(1)
16
10-5(2) 10-6(1) 10-6(2)
29 12 9
2. 3.
-
6.
Rusak
Tabel 3. Sampel Air Ledeng (1x24 jam) No.
Gambar
1.
2.
-
3.
4. 5. 6.
-
Tabel 4. Sampel Tanah Kebun (2x24 jam) No.
Gambar
Konsen
Jumlah
trasi
Koloni
Bentuk
Tepian
Warna
Elevasi
1.
10-4(1)
-
-
-
-
-
2. Serat 10-4(2)
2
benang -
-
Putih susu
-
benang 3.
10-5(1)
-
-
-
-
-
10-5(2)
-
-
-
-
-
10-6(1)
-
-
-
-
-
4.
5.
6.
10-6(2)
-
-
-
-
-
Tepian
Warna
Elevasi
Tabel 5. Sampel Tanah Dekat Sampah (2x24 jam) No.
Gambar
Konsen
Jumlah
trasi
Koloni
Bentuk
1. Serat -4 (1)
10
3
benang -
-
Putih susu
-
benang 2.
Serat -4 (2)
10
2
benang -
-
Putih susu
-
benang 3. Serat 10-5(1)
2
benang -
-
Putih susu
-
benang 4.
10-5(2)
-
-
-
-
-
5.
10-6(1)
-
-
-
-
-
10-6(2)
rusak
-
-
-
-
6.
4.2
Pembahasan
Pada praktikum yang telah dilakukan, teknik isolasi dan pemurnian mikroba dengan dengan Medium Medium NA (Nutri (Nutrient ent Agar) Agar) diguna digunakan kan untuk untuk menumb menumbuhk uhkan an bakter bakteri, i, sedangkan PDA (Potato Dextrose Agar) digunakan untuk menumbuhkan fungi dapat dilakukan beberapa cara antara lain dapat dilakukan dengan cara goresan (streak plate), cara taburan/ tuang (pour plate), cara sebar (spread plate), cara pengencera pengenceran n (dilution (dilution method), method), serta micromanipu micromanipulator lator (teh micromanip micromanipulator ulator method method). ). Dari Dari ke-5 cara teknik teknik isolas isolasi, i, pada pada prakti praktikum kum yang yang telah telah dilaku dilakukan kan menggunakan cara pengenceran pengenceran bertingkat, teknik tuang dan juga teknik goresan (isolasi dari kultur campuran). Isolasi yang digunakan yaitu metode pengenceran bertingkat. Dilakukannya pengenceran bertingkat ini dengan maksud memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba mikroba yang tersuspensi tersuspensi dalam cairan. Semakin Semakin tinggi tinggi pengenceran pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat tingkat pengenceran pengenceran tergantung tergantung kepada kepada perkiraan perkiraan jumlah jumlah mikroba mikroba dalam sampel.
Dalam Dalam hal ini dilaku dilakukan kan pengen pengencera ceran n dari dari dari dari 10-1 – 10-6, pada pada samp sampel el air air kemasan pengenceran dilakukan dari 10 -1 - 10-3 berbeda dari yang lain karena di sini air kemasan merupakan air yang sudah mengalami proses sterilisasi air dan juga pasti jumlah koloni yang berada seharusnya tidak ada, karena air kemasan merupakan air yang siap minum dalam hal ini pada adalah pembuktian terhadap sampel air kemasan. Setelah itu, dituangkan 1 ml sampel air ke dalam cawan petri pada pengenceran pengenceran 10-2 - 10-3 untuk air kemasan, 10 -4 - 10-6 untuk air sumur dan ledeng, masing-masing dilakukan sebanyak dua kali. Dituangkan larutan medium NA kedalam cawan petri sebanyak 10-15 ml (merata pada permukaan cawan petri). Digoyang membentuk angka delapan dengan maksud supaya merata dan dibiarkan hingga memadat. Hasil setelah diinkubasi selama 1 x 24 jam, terdapat koloni di setiap cawan petri. Isolasi lain yaitu menggunakan metode tuang, lebih cocok digunakan untuk mikrobia yang bersifat anaerob, teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untu untuk k ditu dituan ang g bers bersam amaa susp suspen ensi si bakt bakteri eri ke dala dalam m cawa cawan n petri petri lalu lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan selsel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O 2 dan ada yang yang tumbuh tumbuh di dalam dalam agar agar yang yang tidak tidak begitu begitu banyak banyak mengandu mengandung ng oksigen. Kekurangan pada teknik tuang ini membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya. Metode Metode ketiga ketiga yaitu yaitu isolas isolasii bakter bakterii dari dari kultur kultur campur campuran. an. Metode Metode ini memakai medium agar miring dalam tabung reaksi, caranya dengan menggunakan ose lurus sudah steril dengan dibakar di api bunsen, mengambil biakan bakteri lalu
menusu menusukka kkan n ke dalam dalam medium medium lalu lalu di tutup. tutup. Dengan Dengan mengun mengunaka akan n ose bulat, bulat, mengambil biakan bakteri dan menggoreskannya secara zig- zag pada medium agar miring lalu di tutup. Menginkubasinya selama 24- 72 jam, baru dapat diamati hasilnya. hasilnya. Untuk hasil, hasil, kami tidak sempat sempat melihat melihat hasil dari pengisolas pengisolasian ian bakteri tersebut tersebut berhubung berhubung dengan keterbatasan keterbatasan waktu praktikum. praktikum. Namun setidaknya setidaknya disini disini telah dilakukan praktiknya praktiknya secara langsung oleh para praktikan bagaimana cara mengisolasi bakteri yang baik dan benar. Dari Dari hasil hasil percob percobaan aan,, diketa diketahui hui jumlah jumlah koloni koloni terban terbanyak yak terliha terlihatt pada pada sampel air ledeng sebanyak 29 koloni pada pengenceran 10 -5 pada pengambilan kedua. kedua. Air ledeng ledeng ditemu ditemukan kan mengan mengandun dung g banyak banyak koloni koloni,, walaupu walaupun n telah telah di tangani melalui IPAM dan telah dinyatakan hilang (pemberian chlor membunuh mikroba) dan menjadi air layak pakai, namun ternyata dalam pendistribusian air ledeng sendiri yang sampai ke konsumen, melewati pipa yang dimungkinkah telah terkon terkontam tamina inasi si suatu suatu koloni koloni (pipa (pipa tersebu tersebutt menjad menjadii tempat tempat berkem berkemban bang g biak biak koloni baru) sehingga terdapatlah mikroba yang cukup banyak. Jumlah koloni teren terenda dah h terd terdap apat at pada pada air air sumu sumurr yait yaitu u tida tidak k dite ditemu muka kan n kolo koloni ni satu satupu pun. n. kemung kemungkin kinan an ini terjadi terjadi karena karena letak letak sumur sumur yang yang jauh jauh dari dari kontam kontamina inan. n. Atau Atau terd terdap apat at kand kandun unga gan n sesu sesuat atu u dida didala lam m air air sumu sumurr (ent (entah ah itu itu peng pengar aruh uh suhu suhu,, kedalaman, maupun yang lain) yang membuat kontaminan tidak tercemar. Selain itu juga karena air sumur sendiri, air yang masuk kedalam tanah dan menjadi air sumur melalui penyaringan dari lapisan tanah berpori. Untuk Untuk medium medium PDA sendir sendirii yang yang menggu menggunak nakan an sampel sampel tanah. tanah. Fungi Fungi terbanyak berada pada sampel tanah dekat sampah pada pengenceran 10 -4 pada pengambilan pertama. Setelah pengamatan 2 x 24 jam, jumlah yang ditemukan 3
koloni, dengan bentuk serat benang-benang dan berwarna putih susu. Ditemukan mikroba dikarenakan sampel yang diambil lokasinya dekat dengan tempat sampah seda sedang ngka kan n kita kita tahu tahu bahw bahwaa temp tempat at samp sampah ah meru merupa paka kan n tempa tempatt terur terurai ainy nya/ a/ terdekomposisinya mikroba sehingga wajar apabila sampel ditempat ini memiliki jumlah mikroba lebih banyak dibanding tanah yang lain. Sebenarnya tanah kebun kurang lebih juga memiliki jumlah koloni yang sama dengan tanah dekat sampah, jumla jumlah h yang yang ditemu ditemukan kan adalah adalah 2 koloni koloni pada pada pengen pengencera ceran n 10-4 pengambilan kedua. kedua. Tanah Tanah kebun kebun biasan biasanya ya adalah adalah tanah tanah subur subur dan gembur gembur,, mikrob mikrobaa juga juga mudah berkembang di tanah kebun ini karena biasanya tanah kebun kandungan hara pada tanahnya tanahnya tinggi. tinggi. Menunjukk Menunjukkan an mikroba mikroba didalam didalam tanah berkembang berkembang biak. Dilakukan isolasi dan pemurnian mikroba untuk mengetahui sampel yang kita uji mengandung mikroba atau tidak. Isolasi itu sendiri yaitu dengan cara memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni sendiri yaitu kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari satu sel tunggal, biakan murni diperlukan untuk menelaah dan mengidentifikasi termasuk penelaahan cirri-ciri kultur, morfologis, fisiologis fisiologis maupun maupun serologis. serologis. Sangat penting penting dilakukann dilakukannya ya sterilisasi sterilisasi sebelum sebelum mela melaku kuka kan n isol isolas asii memu memung ngki kink nkan an agar agar tida tidak k ada ada mikr mikrob obaa lain lain yang yang tida tidak k diinginkan diinginkan tumbuh tumbuh pada isolat isolat
dan dapat diperoleh diperoleh hasil hasil biakan yang yang murni.
Manfaat dari isolasi dan pemurnian mikroba yaitu didapat kultur murni yang selsel mikrobanya berasal dari pembelahan sel tunggal sehingga dapat diketahui satu sampel jenis mikroba yang ingin diketahui.
BAB V PENUTUP
5.1
Kesimpulan
Berd Berdas asar arka kan n hasi hasill prak prakti tiku kum m yang yang tela telah h dila dilaku kuka kan n dapa dapatt diam diambi bill kesimpulan sebagai berikut: 1. Isol Isolas asii mikr mikrob obaa sang sangat at meme memerlu rlukan kan kead keadaan aan ster steril il baik baik alat alat maup maupun un lingku lingkunga ngan n di sekita sekitarr proses proses pengis pengisola olasia sian n untuk untuk mendap mendapatk atkan an kultur kultur murni. 2. Metode Metode isolas isolasii yang digunak digunakan an ada 3 macam macam yaitu dengan dengan pengen pengencer ceran an bertingkat, metode tuang dan isolasi bakteri kultur campuran. 3. Natrium Natrium agar merupaka merupakan n media tumbu tumbuh h untuk untuk bakteri. bakteri. PDA media tumbuh tumbuh fungi (berbentuk serat benang-benang) 4. Diketah Diketahui ui sampel sampel air ledeng ledeng lebih lebih banyak banyak mengandu mengandung ng bakteri bakteri dibandin dibanding g air sumur dan air kemasan. Sedangkan tanah dekat sampah lebih banyak mengandung fungi dibanding tanah kebun. 5.2
Saran
Dalam melakukan isolasi faktor penting yang perlu dilakukan yaitu selalu dala dalam m mela melaku kuka kan n peng pengis isol olas asia ian n jang jangan an samp sampai ai mela melaku kuka kan n kesa kesala laha han n atau atau melupakan tahapan yang seharusnya karena dapat mempengaruhi hasil akhir yang didapat.
DAFTAR PUSTAKA
Frobisher, Hinsdill,etc. 1974. Fundamentals Fundamentals of Microbiology. Microbiology. Saunders Company. USA. Hadiet Hadietomo omo,, R. S. 1993. 1993. Mikrobio Gramedi dia, a, Mikrobiologi logi Dasar Dasar Dalam Dalam Praktek Praktek . PT Grame Jakarta. Pelczar, Jr et al. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi Mikrobiologi . Penerbit Universitas Indonesia (U I Press), Jakarta. Pradhika, E.I. 2008. MIKRO-BA NGET: Bab 4. Isolasi Mikroorganisme. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-4-isolasimikroorganisme.html? showComment=1250835814547#c348 showComment=12508 35814547#c348216433596296 216433596296173 173 Diakses tanggal 6 Oktober 2009 Pradhika, E.I. 2008. MIKRO-BA NGET: Bab 7. Faktor Lingkungan Yang Berpengaruh Terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme.
http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-7-faktor-lingkunganyang.html Diakses tanggal 6 Oktober 2009 Todar, Kenneth.2000. Culture Media for The Growth of Bacteria . http://lecturer.ukdw.ac.id/dhira/NutritionGrowth/culturemedia.html Di akses tanggal 6 Oktober 2009
