HEMOGLOBINA

Tarhon Elena Seria IV, grupa 29

1

HEMOGLOBINA Hemoglobina este o hemoproteina, cu masa moleculara de 64500 D, la l imita superioara a capacitatii de filtrare a membrane glomerulare renale (ceea ce inseamna ca h emoglobin libera in plasma se filtreaza la nivelul nefronilor si trece in urina) Este o proteina tetramerica, alcatuita din:  globina:este formata din 4 lanturi de aminoacizi aranjati intr-o structura aproape sferica, aceasta reprezentand 90% din hemoglobina 2+  hem (feroprotoporfirina): alcatuit din fier bivalent Fe si un inel tetrapirolic, protoporfirina IX

Lanturile de aminoacizi sunt de mai multe tipuri:α,β,γ,λ,ε,δ.Sinteza lor se realizeaza sub controlul genelor specifice din AND-ul aflat aflat in nucleul celulelor care sintetizeaza hemoglobina. Genele care asigura sinteza lanturilor α sunt situate pe cromozomul 16, iar cele care controleaza sinteza lanturilor β sunt situate pe cromozomul 11 si sunt active toata viata. Genele care codifica informatia necesara sintezei celorlalte tipuri de lanturi de globina sunt situate tot pe cromozomul 11, dar sunt active doar in scurte perioade ale dezvoltarii embrio-fetale. In functie de lanturile continute, hemoglobina poate fi:  Hb Gower I=4ε; este prezenta in primele 25-30 de zile ale vietii embrionare;  Hb Gower II=2α,2ε; este prezenta in primele 3 luni ale vietii embrionare;  Hb Portland I=4λ; se gaseste in cantitati foarte mici la embrioni;  Hb F (fetala)=2α,2γ; apare in primele luni de viata intrauterine, coexistand cu Hb Gower II, iar in lunile 3-6 este forma majoritara de Hb. Dupa nastere scade rapid si la varsta de un an nu reprezinta decat 0.5-1% din Hb totala. La adult raman urme de Hb fetala.  Hb A=2α,2β; incepe sa se sintetizeze din saptamana a 7a-a9a a vietii embrionare si inlocuieste rapid Hb F dupa nastere. 2

Se intalnesc mai multe tipuri de Hb A:  Hb A1: se deosebeste prin prezenta unui rest glucidic legat de lantul β;  Hb A2: contine 2 lanturi α si 2 lanturi δ (lanturile δ difera de cele β prin secventa inversata a 10 aminoacizi). Sinteza ei incepe in viata fetala si este permanenta, la circa 2.5% din adultii normali, gasindu-se in procente mici.  Hb A3: este o forma imbatranita de HbA, cu o molecula de glutation in plus la lantul β;  Hb A4: s-a izolat din hematiile conservate;  Hb Koelliker este o Hb initial normala si modificata dupa hemoliza. La nastere sunt prezente: HbA: 15-40% HbA2: 0.1% HbF: restul Structura HbA: La adult, Hb A contine 2 lanturi α cu 14 1 aminoacizi si 2 lanturi β cu 146 aminoacizi, legate prin legaturi labile, punti de H sau legaturi Van der Waals. Cele 4 lanturi realizeaza o structura globulara compacta, ce are in vecinatatea suprafetei externe 4 cavitati, pungile hemului. Exista zone de contact intre lanturile subunitatilor vecine, α1-β2 si α2-β1. In axul moleculei exista o cavitate central cu 2 mici fosete, ce separa lanturile α si β, fosete in care se fixeaza 2,3 bisfosfoglicerat (2,3 DPG). Hemul este gruparea prostetica a o serie de pigmenti respiratori: Hb, mioglobina, citocromi si a unor enzime oxido-reductoare: catalaze, peroxidaze. El este o feroprotoporfirina alcatuita din Fe++ si un heterociclu tetrapirolic,protoporfirina IX.Biosinteza hemului se desfasoara in precursorii eritrocitari. Fe este inserat in centrul inelului porfirinei sub actiunea enzimei ferochelataza.   

La trecerea prin capilarele pulmonare, Hb incarcata cu CO2 , numita carbhemoglobina sau carbamin-hemoglobina, elibereaza CO2 si fixeaza O2 , devenind oxihemoglobina. Schimburile de gaze se realizeaza prin membrane alveolo-capilara si este conditionat de diferentele de presiune

3

partial a celor doua gaze de-o parte si de alta a memranei. Procesul se numeste hematoza pulmonara. Astfel, sangele arterial, care pleaca de la plamani este bogat in oxi-Hb.

La nivelul capilarelor tisulare, procesul este invers, Hb eliberand O2 si fixand CO2 . Sangele venos contine mai multa carb-Hb decat sangele arterial.

Fiecare atom de Fe2+ leaga covalent o molecula de oxigen, iar fiecare molecula de Hb leaga 4 O2 . Un gram de Hb fixeaza 1, 34 ml O2. In medie, concentratia sanguina a Hb este de 15g%, ceea ce inseamna ca in cei 56 litri de sange ai adultului sunt 750-900 g Hb .

In sangele arterial: -presiunea partiala a O2=95 mmHg -saturatia Hb cu O2 =97%; -cele 15 g% Hb fixeaza 15x1,34=19,5 ml O2/100 ml sange - O2 dizolvat fizic=0,3 ml/100 ml plasma In sangele venos: -presiunea partial a O2=40 mmHg - saturatia Hb cu O 2 =75%; - cele 15 g% Hb fixeaza 15 ml O2/100 ml sange Diferenta dintre volumul de oxigen fixat de Hb in sangele arterial si venos, de 4,5 ml O2/100 ml sange, se numeste diferenta arterio-venoasa si reprezinta cantitatea de O2 cedata la tesuturi. Deci, in repaus, debitul cardiac de 4.5-6 l/min furnizeaza tesuturilor circa 250 ml O2/min. In timpul fixarii si eliberarii O2 de pe Hb, se4 produc o serie de modificari conformationale ale structurii Hb, cu micsorarea si marirea cavitatii interne a molecule, motiv pt care Hb este denumita “plaman molecular”, iar fenomenul- “respiratie moleculara”.

4

METODE DE EXPLORARE A HEMOGLOBINEI I.DOZAREA HEMOGLOBINEI Hb este greu de obtinut in stare pura si nu se poate doza ca atare.De aceea, se folosesc diverse metode indirecte:    

Gazometrice (dozarea O2 si a CO2) Chimice (dozarea Fe), Spectrofotometrice, Colorimetrice (obtinerea unor derivati colorati ai Hb).

Metodele colorimetrice: Sunt simple, rapide si toate se bazeaza pe acelasi principiu: densitatea optica in lumina monocromatica a unei solutii colorate este proportionala cu concentratia substantei. Derivatii Hb utilizati trebuie sa se obtina usor si rapid, sa fie stabili sis a formeze solutii clare optic. Concentratia substantei in functie de culoare se stabileste cu ajutorul unor aparate numite spectrofotometre sau fotometre. Fotometrele au filtre (in loc de prisma sau retea), prin care lumina trece lasand sa treaca undele cu o anumita lungime de unda, cea care este cel mai bineabsorbita de solutia colorata. Citirea se face visual (fotometrul Pulfrich) sau automat (fotometre cu celula fotoelectrica). Unele colorimetre vizuale sunt mai simple, diferenta de intensitate a culorii fiind comparata cu un standard (hemometrul Sahli). Metoda colorimetrica Sahli: Aparatul folosit este hemometrul Sahli, format dintr-un support cu 3 eprubete: doua laterale care contin standardul (solutie de clorhemina) si una centrala, gradate in unitati Sahli (US), de la 10 la 140 US si uneori si in g rame Hb/100 ml sange. In spatele eprubetelor se afla un geam mat care usureaza compararea nuantelor solutiilor de clorhemina. Aparatul are anexata o pipeta capilara pentru recoltarea sangelui, asemanatoare cu pipeta Potain, dar care nu prezinta portiunea dilatata si are doar un reper la diviziunea 20 μl (0,02 ml). Principiu: Se compara Solutia de clorhemina (hematina) obtinuta din sangele din care se face dozarea (Hb+HCl) cu clorhemina standard a aparatului. Metoda este subiectiva, depinde mult de sensibilitatea vizuala a persoanei care lucreaza. Tehnica: 1. In eprubeta centrala se pune HCl N/10 pana la diviziunea 10 US.

5

2. Se recolteaza sange capilar din pulpa degetului sau din calcai (la nou-nascut) direct cu pipeta capilara, aspirandu-se pana la reperul 20 μl. Se poate folosi si sange venos. 3. Se sterge varful pipetei de eventualele urme de sange. 4. Se introduce varful pipetei pana la fundul eprubetei si se sulfa cu grija sangele in HCl, fara a se forma bule; se clateste de 2-3 ori pipeta cu Solutia din eprubeta, apoi se agita usor pentru omogenizare. 5. Se asteapta 10 minute formarea clorheminei de culoare maron-brun. 6. Cu o pipeta Pasteur se adauga putin cate putin apa distilata si se omogenizeaza cu o bagheta subtire de sticla, pana cand culoarea solutiei de clorhemina din eprubeta central devine identica cu cea a clorheminei standard a aparatului. Citirea si transformarea US in Grame%: 1. Citirea se face la nivelul inferior al meniscului solutiei de clorhemina, direct in unitati sahli (US). 2. Aparatul este astfel realizat incat la 100 US corespund 16 g HB/100 ml sange. De exemplu, se citesc 80 US => 100 US…………….16 g% 80 US……………..x%=>x=(80x16)/100=12,8%Hb Valori normale: -nou-nascut: 110-135 US sau 17-20 g% -barbati: 90-110 US sau 15-17g% -femei: 80-100 US sau 13,5-15,5 g% Variatii: sunt identice cu ale numarului de eritrocite:concentratia Hb sanguine creste atunci cand numarul de hematii sis cade cand scade numarul de hematii. Dozarea Hb este un test uzual, util in diagnosticarea policitemiilor si anemiilor.

EVIDENTIEREA SPCTROSCOPICA A DERIVATILOR DE HB Normal, hematiile contin oxi-Hb, carb-Hb si eventual mici cantitati de met-Hb si carboxi-Hb. Este importanta cunoasterea spectrelor de absorbtie caracteristice fiecaruia din acesti compusi deoarece pe baza lor se identifica prezenta acestora in sange. Principiul spectroscopiei: Razele de lumina care trec prin lentilele spectroscopului sunt descompuse in cele 7 culori care compun lumina alba:rosu, orange, galben, verde, albastru,indigo, violet. Hb si derivatii ei au spectre de absorbtie diferite, adica absorb razele luminoase cu o anumita lungime de unda (λ). Astfel, una sau mai multe culori vor fi acoperite de benzi intunecate, negre, care corespund lungimii de unda in care acea substanta absoarbe razele luminoase Tehnica: se prepara solutii cu derivati de Hb, se pun in eprubete si eprubetele se analizeaza la spectroscop.

6

1.

Oxi-hemoglobina Solutia de oxi-Hb (HbO2) se obtine din 20 ml apa si 3 picaturi de sange. La contactul cu aerul solutia capata o culoare rosu-deschis, pentru ca Hb se satureaza cu O 2 . Spectroscopic, se observa 2 benzi de absorbtie:una mai lata care acopera partial culoarea galbena si una mai ingusta peste culoarea verde. 2. Hemoglobina redusa Pentru prepararea solutiei de Hb redusa (HbH+) se folosesc 10 ml din Solutia de oxi-Hb la care se adauga cateva cristale de hidrosulfit de sodium.Culoarea solutiei este rosu-violaceu. Analiza spectroscopica arata o singura banda de absorbtie care acopera culorile galben si verde, numita banda Stokes. Scaderea oxi-Hb si cresterea proportiei de HbH+ peste 1/3 din Hb totala, adica peste 5g%, duce la coloratia albastruie a tegumentelor si mucoaselor, numita cianoza. Concentratiile normale ale Hb reduse sunt: 0,75g% in sangele arterial  2,4g% in sangele capilar  4,5g% in sangele venos De exemplu, in insuficienta cardiaca (slabirea fortei de contractie a miocardului ventricular) circulatia sistemica este incetinita, desaturarea Hb de oxigen creste la nivel tisular, creste concentratie Hb reduse si apare cianoza. 3. Carboxi-hemoglobina Obtinerea solutiei de carboxi-Hb (HbCO) se realizeaza prin barbotarea timp de o ora in Solutia de oxi-Hb, a CO provenit din arderea incompleta a carbunilor. Solutia are culoare visinie si se gaseste gata-preparata in laborator. La spectroscop, se observa 2 benzi de absorbtie asemanatoare cu ale oxi-Hb: in galben si verde, deplasate putin spre violet. Pentru a deosebi oxi-Hb de carboxi-Hb, se adauga solutiei cateva cristale de hidrosulfit de sodium si se analizeaza din nou spectroscopic: - Daca este oxi-Hb, se reduce si apare banda Stokes; - Daca este carboxi-Hb, nu se reduce si spectrul nu se modifica. HbCO este un compus patologia al Hb, format rapid la expunerea sangelui la monoxide de carbon, afinitatea Hb pentru CO fiind de 200 ori mai mare decat penntru oxigen. O concentratie a CO in aerul atmosferic de numai 0.1% este suficienta pentru ca 50% din Hb sa se combine cu CO. Intoxicatia este letala atunci cand 70% din Hb totala este sub forma de HbCO. CO este un gaz incolor, inodor, obtinut prin arderea incomplete a carbonului din diferite substante organice. Intoxicatia cu CO este accidental in incendii, accidente de munca din mine, sau intentionata-in scop de suicid –cu gaze de esapament. Inhalarea gazului “de oras” nu produce intoxicatie. HbCO transforma culoarea sangelui in rosu visiniu. Legarea rapida a CO (aflat in aerul alveolar chiar in cantitati mici) de Hb, in timpul procesului de hematoza pulmonara (schimbul de gaze intre sangele capilar si aerul alveolar), blocheaza locusurile pe care in conditii normale se fixeaza O2. Sangele arterial pleaca de la plaman cu putin O2=>hipoxemie. In plus, CO deviaza la stanga curba de disociere a oxi-Hb, adica Hb cedeaza mai greu oxigenul. Efectul asupra tesuturilor este hipoxia tisulara. 

7

Daca intoxicatia este acuta, clinic se manifesta prin:cefalee, greata, varsaturi, astenie, stare pseudo-ebrioasa, pierderea starii de constienta, coma. In intoxicatiile cornice apar leziuni cerebrale, care pot determina boli psihice sau parkinsonism. Pentru ca legatura Hb-Co este reversibila, in tratamentul intoxicatiilor cu CO, cand procentul de HbCO depaseste 20% din Hb totala sau exista urme de tulburare a constientei sau de hipoxie miocardica-ischemie, infarct-, se administreaza O2 pe masca la presiune ridicata (oxigenoterapie hiperbara). Concentratie normala a HbCO in sange este de 0-1% din Hb totala. La fumatori, poate ajunge la 710%. Cresterea concentratiei de HbCO in sange este factor de risc pentru infarctul miocardic si pentru nasterea premature. Diagnosticul intoxicatiei cu CO se pune spectroscopic. 4. Met-hemoglobina Se adauga 5 picaturi de fericianura de potasiu K3[Fe(CN)6] la 10 ml de solutie oxi-Hb si se obtine Solutia de met-Hb, de culoare maron. Analizata spectroscopic, met-Hb are 4 spectre de absorbtie: in rosu, galben, verde si albastru. 3+ Met-Hb este Hb ce contine Fe , care nu fixeaza O2, ci radicalii –OH. Astfel, Hb transporta numai 3+ 3+ jumatate din cantitatea de oxigen (hipoxemie). Legatura Fe –OH este mai stabila ca legatura Fe – O2. Ca si HbCO, met-Hb deviaza la stanga curba de disociere a oxi-Hb, cedarea O2 la tesuturi facandu-se mai greu. Ca urmare, apare hypoxemia si hypoxia tisulara, semnele clinice aparand la concentratii de peste 50% ale met-Hb din Hb totala. La concentratii peste 60% se instaleaza coma. Sangele in car peste 15% din Hb totala este met- Hb (2g%) are culoare bruna si apare cianoza albastra-cenusie a mucoaselor si tegumentelor. 3+ 2+ Mici cantitati de met-Hb se formeaza tot timpul, dar Fe este transformat in Fe de o enzima sintetizata in ficat: methemoglobin-reductaza, precum sip e cale neenzimatica, de glutationul redus si acidul ascorbic (vitamina C). Concentratia sanguine normal maxima a met-Hb este 1% la adulti si 1.5% la copii, care au mecanismele de reducere sufficient dezvoltate. Cauzele cresterii methemoglobinemiei peste valorile normale sunt: 2+ 1. Ereditare: incapacitate de reducere a met-Hb sau transformarea ireversibila a Fe in 3+ Fe –(lipsa congenitala a methemoglobin-reductazei) 2. Dobandite:administrarea de substante oxidante :nitriti, nitrati (din ingrasamintele chimice), aniline (crete colorate cu derivati anilinicei), derivati benzinici, fenacetina, sulfamide. Diagnosticul de met-hemoglobinemie se pune spectroscopic. OBSERVAREA CRISTALELOR TEICHMAN Sunt cristale de hematina (clorhemina), obtinute prin tratarea Hb cu HCl in stare nascanda (rezultate din reactia NaCl + acid acetic glacial) Tehnica: 1. Se face un frotiu, prin punerea unei picaturi de sange pe lama si intinderea ei in strat subtire cu ajutorul unei lame inclinate la 45˚. 2. Se usuca frotiul la temperature camerei sau la flacara, dar nu la o temperature mai mare de 40-45˚C, pentru a nu precipita proteinele. 3. Se adauga pe frotiu o picatura de ameste acid acetic glacial si NaCl 1% si se acopera cu o lamella.

8

4. Se incalzeste la flacara pana la fierbere-pana apar bule. Culoarea preparatului devine maron pentru ca s-a format clorhemina: hematiile lizeaza, eliberand Hb, iar HCl in stare nascanda descompune Hb in hem+globina si apoi HCl+hem=>clorhemina. 5. Se raceste lent, la temperature camerei si se observa la MO (obiectivul 10x sau 40x) prezenta unor cristale rombice, brune, umite cristale teichman 6. Interpretare: Prezenta cristalelor Teichman arata ca in reactive s-a folosit sange. Este o metoda de identificare a petelor de sange, folosita in medicina legala. Nu permite insa precizarea specie de la care provine sangele, pentru ca hemul este acelasi la toate vertebratele, numai globina difera.

HEMOLIZA.REZISTENTA GLOBULARA

Hemoliza=procesul prin care Hb iese din eritrocite in mediul din jur si isi pierde functia respiratorie.(“hemoliza”=”eritroliza”) Rezistenta globulara (eritrocitara) este rezistenta pe care o opun eritrocitele la actiunea agentilor hemolizanti. Eritrocitele tinere sunt mai rezistente, cele batrane au o rezistenta slaba. Daca Hb ar circula libera prin plasma, fara a fi inchisa in hematii, ar aparea o serie de dezavantaje: - Functia respiratorie ar fi blocata - Ar creste vascozitatea sangelui - S-ar modifica presiunea osmotica - Hb libera s-ar elimina prin rinichi, producand hemoglobinurie si ar precipita in tubii nefronilor determinand blocarea functiei renale - Prin metabolizarea hepatica, Hb s-ar transforma in bilirubina, eliminata in intestine prin bila. Boala hemolitica este o stare patologica cu multiple cause, in care durata de viata a hematiilor este redusa (in conditii normale, durata de viata a hematiilor este de 120 zile). Scurtarea duratei de viata a hematiilor prin liza se demonstreaza prin marcarea hematiilor 51 de la bolnav cu Cr si injectarea lor la un alt pacient, urmarindu-se apoi radioactivitatea unor probe de sange recoltat la diferite intervale de timp. Pana la un anumit grad, pierderea hematiilor prin liza poate fi compensate prin stimularea maduvei hematogene (hemoliza compensata). Hemoliza este decompensate cand capacitatea eritropietica a maduvei este depasita si nu poate echilibra pierderile de hematii. 9

Activarea eritropoiezei este prezenta in hemoliza si poate fi evi dentiata prin:reticulocitozi si eritroblastoza sanguine, hiperplazia seriei eritrocitare la nivelul maduvei osoase, cresterea turnover-ului fierului plasmatic si eritrocitar. Cauzele hemolizei: I.Cauze eritrocitare: a)Defecte ale membranei: Membrana eritrocitului este formata din 2 straturi si este prinsa de citoscheletul cellular format din 4 proteine:spectrina, proteina 4.1., actina si ankirina. Sinteza acestor protein poate fi deficitara datorita unor defecte genetice care produc boli congenitale, ereditare: - Reducerea continutului in spectrina=>hematii rigide, sferocitoza in boala denumita sferocitoza ereditara. Anemia hemolitica poate fi asimptomatica sau severa. - Deficitul de sinteza a proteinei 4.1. se transmite autosomal dominant si determina formarea de hematii ovale, in forma de elipsa (25-90% din totalul hematiilor circulante), iar boala se numeste eliptocitoza.Heterozigotii nu au anemie, dar la homozigoti anemia este severa. b)Defecte ale Hb=hemoglobinopatii  Defecte calitative , sturucturale, in care un aminoazid dintr-o anumita pozitie a lantului de globină este înlocuit cu altul. Sunt datorate unor mutații genetice punctiforme. Hemoglobinele patologice S, C, E .. etc care se sintetizează sunt identificate prin electroforeză, pentru că au altă greutate moleculară și altă mobilitate în câmpul electroforetic. Hemoglobina S, în care acidul glutamic din poziția 6 a lanțului β este înlocuit de valină, în condiții de hipoxie (și chiar la PCO2 din sângele venos) se deoxigeneaza, polimerizeaza si formeaza fibere rigide care dau hematiilor forma de secera. Boala se numeste siclemie si este severa la homozigoti, care prezinta semnele clinice de anemie, infarcte pulmonare, osoase, splenice, ulcere de gamba. – 



Hemoglobinopatiile cantitative se datoreaza unor defecte ale genelor implicate in sinteza lanturilor globinei α si β. Bolile se numesc alfa si beta talasemii. - α-talasemia apare ca urmare a deletiei 1,2,3 sau tuturor celor 4 gene care codifica sinteza lantului α al globinei, gene situate pe cromozomul 16. Deletia a 1,2 gene nu duce la manifestari clinice. Deletia a 3 gene duce la formarea HbH (4 lanturi beta) care precipita intracelular si formeaza corpii Heinz, hematiile fiind rapid lezate. Deletia celor 4 gene va bloca sinteza lanturilor alfa dar va permite o sinteza masinva de lanturi gama, formandu-se Hb Bart (4 lanturi γ) care nu permite supravietuirea . β-talasemia are trei forme: 1. Heterozigota –asimptomatica, cu hematii mici, hipocrome, “in tinta”; 2. Homozigota-severa, lanturile α precipitand in eritroblasti ce vor fi di strusi in maduva, iar hematiile circulante imperfect sunt recunoscute ca atare si au viata scurta; 3. Majora (anemia Cooley)-forma cea mai grava, se manifesta in primele luni de viata (cand HbF trebuie inlocuita cu HbA) prin anemie si icter. Daca nu se fac transfuzii apar tulburari de crestere, hepatomegalie cu marirea abdomenului, deformari osoase prin expansiunea tesutului eritropoietic: boselarea oaselor frontale si parietale, cresterea maxilarului cu 10

anomalii mari de implantare ale dintilor si malocluzie. Pacientii fac frecvente fracture osoase, au hipersplenism, sideremia este mare, iar hemoliza si transfuziile repetate determina aparitia hemosiderozei, cu afectare endocrina, cardiaca, hepatica,evolutia fiind letala. c) Defecte enzimatice Hematiile contin glutation redus care impiedica oxidarea gruparilor sulfhidrice ale hemoglobinei sub actiunea unor toxine (toxine ale agentilor infectiosi, ingestia boabelor sau inhalarea polenului unei specii de fasole) sau medicamente (fenacetina, dozele mari de aspirina, antimalaricele ... etc). Cand hematiile sunt expuse la astfel de agenti, concentratia normala a glutationului redus este mentinuta prin metabolizarea unei cantitati mari de glucoza pe calea suntului pentozo-monofosfatilor. Defectele congenitale care determina deficinete in sinteza enzimelor implicate in suntul pentozo-monofosfatilor au ca urmare ozidarea gruparilor sulfhidrice ale Hb si precipitarea Hb in hematii, formand corpii Heinz.  Deficitul de piruvat-kinază  Cea mai des intalnita este deficienta de G-6-PD (glucozo-6-fosfat-dehidrogenaza) transmisa ereditar, gena implicata fiind situata pe cromozomul X. Manifestarile clinice ale anemiei hemolitice apar la barbati si la femelile homozigote. 2.

CAUZE EXTRAERITROCITARE

a) Factori fizici: ** actioneaza asupra sangelui recoltat:  agitarea tuburilor cu sange  contactul prelungit al sangelui cu sticla.  Iradierea cu raze X sau UV.  Congelarea/decongelarea repetata.  Modificarea osmolaritatii sangelui sau mediului in care sunt hematiile. ** care actioneaza intravascular:  iradierea cu raze X sau UV  modificari ale peretilor vaselor mici, cu ingustari ale lumenului si blozaje ale circulatiei, care favorizeaza fragmentarea hematiilor si fomarea de schizocite (exemplu: hemoliza microangiopatica din coagularea intravasculara diseminata acuta).  Trecerea sangelui prin aparatul de dializa la pacienti cu afectare renala severa, care necesita rinichi artificial.  Protezarea valvulara aortica, boala valvulara aortica (apar schizocite=fragmente eritrocitare)  hipersplenism (hiperreactivitatea macrofagelor splenice cu citopenie sanguina si splenomegalie)  modificarea osmolaritatii samgelui. b) Factori chimici  solventi ai lipidelor: alcool, benzen, cloroform, eter ...etc.  Substante care precipita proteinele: acizi, baze, saruri biliare.  Substante medicamentoase in doze mari: penicilinele, aspirina, fenacetina, primaquina, analogii vitanimei K, metil-dopa ... etc.  Metale: plumb, arsenic. 11

c)Factori biologici veninurile unor specii de albina, sarpe, paianjen, scorpion toxinele microbiene – determina hemoliza si anemie in boli infectioase (exemplu: infectia cu streptococ beta-hemolitic) infectia cu Plasmodiom (agentul malariei) prezenta anticorpilor (IgG) si/sau complementului (fractiunea C3) pe suprafata hematiilor produce anemii homolitice prin mecanism imun: hemoliza serologica, post-transfuzionala, in cadrul incompatibilitatii de grup sanguin. Anemia hemolitica autoimuna, idiopatica (din lupusul eritematos diseminat, limfoame ... etc) hipersplenismul. •

•

•

•

◦

◦

•

CLASIFICAREA HEMOLIZEI In functie de conditiile in care are loc este: fiziologica – se desfasoara in organele sistemului reticulo-endotelial, in special in splina, sub 1. actiunea macrofagelor locale, care fagociteaza zilnic circa 1,5 miliarde hematii imbatranite. 2. Patologica – este datorata actiunii agentilor hemolizanti, lizeaza si hematiile tinere si se desfasoara si intravascular. 3. Experimentala , de laborator, realizata de cele mai multe ori prin agitare mecanica sau introducerea hemtiilor in mediu hipoton.

Dupa mecanismele prin care se produce hemoliza: hemoliza coloid -osmotica : hemoglobina paraseste hematiile datorita cresterii permeabilitatii membranei eritrocitare, fara ruperea ei (exemple: hemoliza in mediu hipoton, prin congelare, prin iradiere UV). 2. Stromatoliza : membrana si stoma sunt rupte (hemoliza data de agentii chimici si biologici). 1.

Dupa locul unde se produce: Extravasculara : celulele sistemului monocit-macrofag din splina, ficat, maduva osoasa (sistemul reticulo-histiocitar) fagociteaza hematiile imbratanite, lezate sau anormale. 2. Intravasculara : este patologica, hemoglobina este eliberata in sange, unde circula legata de o proteina specifica (haptoglobina). Hemoglobina este captata si distrusa de catre macrofage. La concentratii ale hemoglobinei libere peste 100 mg / 100ml de sange, acesta traverseaza membrana fitranta glomerulara si o parte se elimina prin urina. Deci spre deosebire de hemoliza extravasculara, in cazul hemolizei extravasculare exista hemoglobinemie si hemonoglobinurie. Din distrugerea hemoglobinei rezulta hem (fier si protoporfirina IX) si globina. Fierul va fi reutilizat, ca si aminoacizii globinei iar protoporfirina IX va fi metabolizata la bilirubina. Bilirubina va fi conjugata in ficat si eliminata prin bila in intestin unde este convertita in uro-,mezo-,stercobilinogen. Depasirea capacitatii hepatice de conjugare duce la cresterea bilirubinemiei, pana la aparitia icterului (daca se hemolizeaza peste 300-500ml sange / zi). Hemoliza patologica este: 1. ereditara (afectarea congenitala a structurii eritrocitelor) 1.

12

2.

dobandita (imuna sau non-imuna). Testul de fragilitate osmotica. (Determinarea rezistentei globulare in mediul hipoton prin metoda Mosso -Hamburger)

Solutia care are o presiune osmotica egala cu a plasmei (300mOsm/l) se numeste izoton. Hematiile pot fi pastrate intr-un mediu izoton mai multe ore, fara a se modifica. Mediul izoton folosit este serul fiziologic, o solutie de NaCl de concentratie 0.9g%. Solutia care are o presiune osmotica mai mare decat a plasmei se numeste mediu hiperton. Eritrocitele puse in mediu hiperton pierd apa, pentru ca apa trece prin membrana eritorcitara din mediul cu presiune osmotica mai mica (interiorul hematiei), in mediul extern hiperton. Hematiile se ratatineaza (se zbarcesc). Solutia care are o presiune osmotica mai mica decat a plasemi se numestemediu hipoton. In mediu hipoton apa intra in hematie, volumul erit rocitar creste si cand atinge dimensiunea critica de 3 135 μ hemoglobina incepe sa iasa din hematii. A detemina rezistena globulara inseamna a afla care este concentratia solutiei hipotone de NaCl la care hemoglobina incepe sa paraseasca hematiile-rezistenta globulara minima, respectiv concentratia la care hemoliza este completa – rezistenta maxima. Materiale necesare: 18 eprubete de hemoliza, numerotate, asezate stativ. Ser fiziologic (solutie NaCl 0.9%) apa distilata sange proaspat recoltat pe anticoagulant. Doua pipete de 2ml gradate pipeta Pasteur

– 

– 

– 

– 

– 

– 

Tehnica 

In eprubetele de hemoliza se pipeteaza ser fiziologic: 1.8ml in prima, 1.7ml in a doua, 1.6ml in a treia s.a.m.d. Pana la ultima in care se pun 0.1ml.  Se completeaza cu apa distilata pana la un volum total de 1.8ml: in prima eprubeta nu se adauga apa, in a doua se pun 0.1ml, in a trei 0.2ml .. etc. Concentratiile solutiilor de NaCl scad de la 0.9 g% in prima eprubeta la 0.85g% in a doua, 0.8g% in a trei s.a.m.d cu cate 0.05g% in fiecare eprubeta.  Cu pipeta Pasteur se lasa cate o picatura de sange sa cada in solutia din fiecare eprubeta. Nu se agita. Se lasa in repaus timp de o ora. Eprubeta

1

2

3

4

5

6

7

8

Solutie NaCl 0.9g% (ml)

1.8

1.7

1.6

1.5

1.4

1.3

1.2

1.1

Apa distilata (ml)

-

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Concentratie (%)

0.9

0.85

0.8

0.75

0.7

0.65

0.6

0.55

13

Eprubeta

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Solutie NaCl 0.9g% (ml)

1

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

Apa distilata (ml)

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

Concentratie (%)

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3

0.25

0.2

0.15

0.1 0.01

Rezultat. Interpretare: In mod normal, daca hematiile nu prezinta modificari patologice, se observa In primele 9 eprubete hematiile se depun la fund fromand un sediment rosu opac iar supernatantul este incolor. Aici nu exista hemoliza, hematiile rezista la conditiile de mediu. Eprubetele 10,11,12,13 contin un sediment redus si supernatant colorat roz ceea ce indica prezenta hemolizei partiale. Concentratia solutiei de NaCl de 0.45g% din a 10 eprubeta (prima eprubeta la care apare hemoliza partiala) corespunde resistentei globulare minime. Incepand cu a 14-a eprubeta pana la ultima, nu mai exista separare sediment/supernatant, solutia care culoare rosie, hemoliza este totala. Concentratia solutiei de NaCl de 0.3g% din a 13 -a eprubeta (ultima eprubeta la care hemoliza este partiala) corespunde rezistentei globulare maxime. – 

– 

– 

Valori normale:

rezistenta globulara = 0.45% - concentratia de NaCl a primei eprubete in care se constata hemoliza. Resistenta globulara maxima = 0.3% - concentratia de NaCl a ultimei eprubete in care se mai observa hematii nehemolizate. Intre 0.45% si 0.3% este intinderea sau scara rezistentei globulare. – 

– 

– 

Variatii:

Deplasarea la stanga a scarii de rezistenta (exemplu: 0.50% - 0.75%) arata ca hematiile au o rezistenta scazuta. Se intalneste in hemolize intense si este insotita de anemie si icter hemolitic. Cauza poate fi eritrocitara sau extraeritrocitara. Apare si dupa splenectomie indicand o populatie eritrocitara imbratranita. 2. Deplasarea la dreapta a scarii de rezistenta (exemplu: 0.1% - 0.3%) indica prezenta unor hematii rezistente. Apare in hipersplenism, dar si dupa hemoragii importante odata cu refacerea volumului globular prin stimulare medulara si eliberarea unor hematii tinere in circulatie. 3. Apropierea celor doua valori ale rezistentei globulare (maxima si minima) indica o popiulatie eritrocitara omogena. 4. Diferenta mare intre cele doua valori ale rezistentei globulare (maxima si minima) indica o populatie eritrocitara heterogena. 1.

14