DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA GLICOSILADA 1. FUNDA FUNDAMEN MENTO TO DE LA PRUEBA PRUEBA La Hemoglobina Glicosilada es conocida también como Hemoglobina A1c, HbA1c, Glicohemoglobina o Hemoglobina glicada. En el labo labora rato tori rio o de anál anális isis is clín clínic icos os se real realiz iza a la dete determ rmin inac ació ión n de hemoglobina glicosilada para el seguimiento de los pacientes afectados de diabetes y como ayuda en la toma de decisiones durante el tratamiento. La hemoglobina es una proteína que se encuentra en los glóbulos rojos de la sangre (hematíes) y sirve para aprovisionar de oxígeno al resto de nuestras células y tejidos. Existen varios tipos de hemoglobina en adultos, la Hb A, que constituye el 97% del total, la Hb A 2, ( un 2,5%) y la hemoglobina fetal, la Hb F, que constituye el 0,5% del total. Una parte parte de la Hemoglob Hemoglobina ina A se une a la glucosa glucosa que que circula circula por el torrente sanguíneo. El porcentaje de esta hemoglobina A unida a glucosa es lo que se denomina hemoglobina glicosilada. Esto sucede también en las personas sin diabetes. Glucosa en sangre + Proteínas (hemoglobina) Proteínas glicadas (hemoglobina glicada o glicosilada) La hemoglobina glicosilada tiene varias fracciones (Hb A1a, Hb A1b y Hb A1c) y, de ellas, la más estable, la que tiene una unión con la glucosa más específica, es la fracción HbA1C. Los valores normales de hemoglobina glicosilada en un adulto sano oscilan entre 3 y 6%. Cuanto mayor es la cantidad de glucosa en sangre más se une a las proteínas y su porcentaje de unión indica cual ha sido la cantidad media de glucosa circulante durante el tiempo de vida de la proteína en cuestión. La HbA1c no se ve alterada por cambios agudos o recientes de las glucemias y depende de la concentración de glucosa del entorno y de la vida media de los glóbulos rojos en el organismo. Como la vida media de estos hema hematí tíes es es apro aproxi xim madam adamen ente te de 90-1 90-120 20 días días,, cono conoce cerr como como está están n “marcados” por la glucosa que circula junto con ellos nos indica como ha sido el control metabólico durante ese periodo de tiempo. 1
En conclusión, la prueba determina el promedio de glucosa en sangre de los últimos 2-3 meses.
2. OBJETIVO El objetivo de esta determinación es conseguir que, en estos pacientes diabéticos, las concentraciones de glucosa se mantengan dentro de los límites de referencia, siempre que sea posible. De esta forma se consigue minimizar las complicaciones causadas por las concentraciones de glucosa elevadas como, por ejemplo la lesión progresiva en distintos órganos como los riñones, los ojos, el sistema cardiovascular y el sistema nervioso. La determinación de hemoglobina glicosilada es una forma de representar las concentraciones de glucosa en los últimos meses. Se permite así al paciente y a su médico conocer si el control de la diabetes es satisfactorio. Esta prueba es frecuentemente solicitada en el momento del diagnóstico de la diabetes, para conocer el desajuste de las concentraciones de glucosa. Además, debe practicarse de forma regular para así conocer si las concentraciones de glucosa se encuentran bajo control. Suele ser solicitada entre 2 y 4 veces al año.
3. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE HbA1c Existen diversos métodos para determinar las hemoglobinas glicosiladas: -
Electroforesis, Cromatografia de intercambio iónico, Inmunoensayo, Cromatografia de afinidad.
El método de referencia propuesto en EEUU por el Programa Nacional para la Estandarización de la Hemoglobina Glicosilada (NGSP) es el de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), basada en una cromatografía de intercambio catiónico. Este método permite la separación y determinación del porcentaje relativo de hemoglobinas normales y anormales.
4. DETERMINACIÓN DE HbA1c MEDIANTE HPLC Entendemos por cromatografía aquellas "técnicas de separación de solutos disueltos en disolventes basadas en las diferentes afinidades que muestran dichas sustancias por dos fases distintas denominadas móvil y estacionaria". Dicho de otra forma, la cromatografía es una técnica de separación que se 2
fundamenta en la distinta distribución de las sustancias estudiadas en dos fases, una móvil y otra estacionaria. Al aplicar una técnica cromatográfica sobre una mezcla de sustancias cualquiera, la fase móvil "empuja" dicha mezcla a través de la fase estacionaria de tal forma que aquellos componentes que tengan más afinidad por la fase estacionaria, se "retrasarán" en su avance a través de esta, mientras que los componentes con poca afinidad por la fase estacionaria la atravesarán rápidamente. De esta manera, cada uno de los componentes progresa a lo largo de la fase estacionaria con una velocidad distinta. Como consecuencia, una vez que la fase móvil ha atravesado a la fase estacionaria, los componentes de la muestra han quedado separados unos de otros en una serie de bandas.) Según el mecanismo físico que lleva a cabo la separación de los solutos entre las dos fases (móvil y estacionaria), existen diversas clases de cromatografía, una de ellas es la cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico se realiza en columnas dentro de las cuales va empaquetada la fase estacionaria (resinas de intercambio iónico). El fundamento de la separación de solutos es de tipo electrostático (interacciones electrostáticas que se producen entre los grupos ionizados de las sustancias a separar y los grupos ionizados unidos a la resina de intercambio iónico; dichas interacciones permiten la sustitución de unos por otros). Efectivamente, cuando se produce el paso de la fase móvil (arrastrando la muestra a separar) a través de la fase estacionaria, los iones de la muestra compiten con los de la fase estacionaria por ciertos lugares de fijación, de manera que acaban desplazándolos; aquellos que tienen mayor fuerza de unión son más retenidos y tardarán más tiempo en atravesar la columna. Las resinas de intercambio iónico pueden ser
catiónicas (que
intercambian iones de la muestra con carga positiva → cationes) y aniónicas (que intercambian iones de la muestra con carga negativa → aniones). La cromatografía líquida de alta resolución usada para determinar HbA1c es en definitiva una cromatografía de intercambio catiónico en columna a la cual se aplica una sobrepresión que permite acelerar el proceso de separación. Su gran ventaja es la disminución del tiempo de análisis. El método de intercambio iónico en microcolumnas separa las variantes de hemoglobina por la carga eléctrica. La resina de intercambio catiónico (cargada negativamente) atrae a la hemoglobina cargada positivamente. El tampón utilizado para eluír tiene un pH y fuerza iónica seleccionado de forma que las hemoglobinas glicadas se cargan menos positivamente que la HbA y 3
por lo tanto al no unirse fuertemente a la resina, eluye primero. En esencia, la fase móvil líquida (constituida por un disolvente adecuado que vehicula a la muestra) se bombea a través de un sistema de separación compuesto por un prefiltro y una columna, esta última conteniendo la fase estacionaria, a una elevada presión. Por su distinta interacción entre las dos fases, la muestra es retenida con variable intensidad, eluyendo separada de la columna. Caber reseñar que para el análisis de hemoglobinas, la muestra (sangre total-EDTA) deber ser hemolizada previamente. Además, el empleo de varios eluyentes permite la separación de las distintas fracciones de hemoglobina. Los distintos tipos de hemoglobina que se pueden separar son: -
Hemoglobina glicosilada (HbA1c)
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Hemoglobina fetal (HbF)
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Hemoglobina A2 (HbA2)
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Hemoglobinas anormales S y C (HbS y HbC)
5. BIO RAD D-10 El equipo de HPLC utilizado en este laboratorio se denomina BIO RAD D-10 (DUAL PROGRAM). El Bio-Rad D-10 Dual Program ha sido diseñado para uso exclusivamente profesional. Para uso en diagnóstico in vitro. Consta de dos programas: -
Programa corto: El Bio-Rad D-10 Dual Program ha sido diseñado para la determinación porcentual de los niveles de hemoglobina A1c en sangre humana utilizando la cromatografía líquida de alta resolución por intercambio iónico (HPLC). Programa ampliado: El Bio-Rad D-10 Dual Program ha sido diseñado para la determinación porcentual de los niveles de hemoglobina A2, F y A1c, así como para la detección de variantes anormales de hemoglobinas en sangre humana utilizando la cromatografía líquida de alta resolución por intercambio iónico (HPLC). -
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6. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS La hemoglobina glicosilada refleja la concentración de glucosa en los últimos 120 días (tiempo de vida de los glóbulos rojos). El porcentaje de HbA1c se aumenta en proporción a las cifras de glucemia que han precedido en las últimas 6-8 semanas. En general, por cada 1% de aumento en la HbA1c evidencia un incremento en los promedios de glucemia de aproximadamente 30 mg/dl. Una HbA1c de 6% refleja un promedio de glucemia de 120 mg/dl.
Es deseable que las personas con diabetes mantengan un promedio de HbA1c inferior a 7%. ------------------------------------------------------------------------------Trabajo realizado por: -
Luis Medina Quesada
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Inmaculada Rodríguez Rueda
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