UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA BIOQUÍMICA BIOQUÍMIC A EXPERIMENTAL EXPERIMENTAL SEMESTRE 2014-2 07/MARZO/2014
FOSFATASA ALCALINA 1
Equipo 04: Mariana Cobos García, Andrés González Méndez, Christian Rodolfo Rengel García y Cristian Rodríguez Mateos.
CINÉTICA
Los experimentos de cinética examinan la relación que existe entre la cantidad de producto (P) Formado en la unidad de tiempo, Δ[P]/Δt (donde Δ es el símbolo
universal de cambio), de acuerdo a las condiciones experimentales bajo las cuales se realiza la reacción. La base de la mayoría de las determinaciones cinéticas es la observación de como la velocidad (v), de una reacción varía directamente con la concentración de cada una de las sustancias que actúan como reactivos para producir el producto. Por ejemplo, la ecuación de velocidad para la conversión, no enzimática, de un sustrato (S) a un producto por una reacción de isomerización sería:
2
CINÉTICA
Los experimentos de cinética examinan la relación que existe entre la cantidad de producto (P) Formado en la unidad de tiempo, Δ[P]/Δt (donde Δ es el símbolo
universal de cambio), de acuerdo a las condiciones experimentales bajo las cuales se realiza la reacción. La base de la mayoría de las determinaciones cinéticas es la observación de como la velocidad (v), de una reacción varía directamente con la concentración de cada una de las sustancias que actúan como reactivos para producir el producto. Por ejemplo, la ecuación de velocidad para la conversión, no enzimática, de un sustrato (S) a un producto por una reacción de isomerización sería:
2
CONSTANTE DE VELOCIDAD El símbolo k es llamada constante de velocidad e indica la relación proporcional entre [S] y la cantidad de producto producido por unidad de tiempo, es decir indica la relación que existe entre la [S] y la velocidad de la reacción. Cada reacción, bajo determinadas condiciones, presenta una constante de velocidad característica. Las unidades en que se expresa la constante de velocidad (k) serán s-1
3
ENERGÍA LIBRE DE ACTIVACIÓN
El punto máximo en esta figura expresa el valor de la Energía Libre de Activación, es decir, decir, la diferencia en energía libre entre el(los) reactivo(s) y el estado de transición en donde se ha formado el intermediario de alta energía necesario durante la conversión de reactivos a productos. El alto valor de esta energía libre de transición, para la formación de este estado de alta energía, es lo que propicia que las reacciones químicas no catalizadas sean frecuentemente demasiado lentas.
4
VELOCIDAD DE LA REACCIÓN Para que puedan reaccionar, las moléculas deben contener suficiente energía para sobrepasar la barrera que impone el alcanzar el estado de transición. En ausencia de un catalizador, en nuestro caso en ausencia de una enzima, la cantidad de moléculas en una población de reactivos que pueden poseer esta energía es muy pequeña y la capacidad de formar producto es igualmente demasiado pequeña. Por lo tanto la velocidad de la reacción esta determinada por el número de moléculas con energía suficiente para alcanzar el estado de transición.
5
6
7
8
9
10
11
INHIBIDORES ENZIMÁTICOS
Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. La unión de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y obstaculizar que la enzima catalice su reacción correspondiente. La unión del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y modifican su estructura química a nivel de residuos esenciales de los aminoácidos necesarios para la actividad enzimática. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de la manera como el inhibidor se une a la enzima o al complejo enzima-sustrato.
12
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
Competitiva El Inhibidor se fija en el sitio activo de la enzima. La inhibición es reversible puesto que altas concentraciones de sustrato compiten con el inhibidor. Depende de las afinidades relativas de la enzima por su sustrato y por el inhibidor. La Km aumenta, la Vm ax permanece sin cambios
No-competitiva El Inhibidor se fija en un sitio diferente al sitio activo de la enzima. El complejo ESI (Enzima-SustratoInhibidor) no puede formar productos. Concentraciones altas de sustrato no son competidoras. La Km no s e mod ifica, la Vmax disminuye
Un-competitiva o Anti-competitiva El inhibidor es capaz de fijarse únicamente una vez que el complejo ES está ya formado y el cambio en la conformación de la enzima le proporciona un sitio para su fijación. Tanto la Km com o la Vmax disminuyen
13
INHIBICIÓN COMPETITIVA
14
INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
15
INHIBICIÓN ANTI-COMPETITIVA
16
INHIBICIÓN POR SUSTRATO
La inhibición por sustrato y por producto es donde el sustrato o el producto de una reacción enzimática inhiben la actividad enzimática. Este tipo de inhibición puede seguir cualquier tipo de patrón de inhibición y es frecuentemente de gran importancia en la regulación del metabolismo celular. En la inhibición por sustrato hay una disminución progresiva de la actividad a altas concentraciones de sustrato. Esto puede indicar la existencia de dos sitios de unión entre sustrato y enzima. Cuando hay poco sustrato, se ocupa el sitio de alta afinidad y sigue la cinética normal. Sin embargo, a altas concentraciones, el segundo sitio de inhibición se ocupa, inhibiendo a la enzima.
17
C ARACTERÍSTICAS GENERALES
Es una glicoproteína que se encarga de retirar grupos fosfato de diversas moléculas (desfosforilación), su estructura depende del sitio donde se origina. En general es un dímero con subunidades casi idénticas teniendo cada una 2 moléculas de Zinc; una de ellas proporciona estabilidad a la enzima, la otra le brinda propiedades catalíticas y cuatro puentes disulfuro. Orto-fosfórico-monoéster hidrolasa
18
Se encuentran situadas en la membrana celular y entre sus principales funciones se pueden mencionar:
Precipitación del fosfato cálcico en huesos. Absorción de fosfatos por el intestino. Hidrólisis de esteres fosfáticos del riñón e hígado.
19
Peso molecular: 140 -160 KDa Punto isoeléctrico: La fosfatasa alcalina puede existir como isoenzimas con un rango de pH 4.4 - 5.8 El pH óptimo: La enzima es más estable en el rango de pH 7.5-9.5 El pH óptimo para la actividad enzimática es de pH 8-10. El pH óptimo cambiará dependiendo de sustrato, la concentración de sustrato, y la concentración iónica. 20
La enzima es una glicoproteína que contiene aproximadamente 12% de carbohidratos (6% hexosas y 6% de otros azúcares neutras). La actividad máxima con fosfatasa alcalina se logra en la presencia de magnesio. Inhibidores fuertes de la fosfatasa alcalina incluyen arseniato, cisteína, yodo, fosfato inorgánico, pirofosfato, fosfato de diisopropilo, fosfato de trifenilo, y fluorofosfato de diisopropilo, y L-fenilalanina.
21
REACCIÓN QUE CATALIZA
La determinación de Fosfatasa Alcalina se lleva a cabo mediante el método del p-nitrofenil-fosfato: la fosfatasa alcalina cataliza la hidrólisis del enlace éster fosfórico entre un grupo orgánico y un grupo fosforilo a pH alcalino (NaOH), liberando fosfato inorgánico y pnitrofenol.
22
El p-nitrofenol es un compuesto que presenta absorbancia a λ = 405 nm (color amarillo), por lo que
el aumento de la absorbancia del p-nitrofenol en función del tiempo es un indicador de la actividad enzimática.
23
24
La ALP es una hidrolasa responsable de la eliminación de grupos fosfato en las posiciones 5 y 3 - de muchas moléculas, como los nucleótidos, proteínas y alcaloides.
F ACTORES QUE MODIFICAN SU ACTIVIDAD
pH
Temperatura
Concentración del sustrato
Presencia de un inhibidor
25
FOSFATASA ALCALINA B ACTERIANA
26
PRESENCIA DE LA FOSFATASA ALCALINA EN B ACTERIAS G(-)
27
FOSFATASA ALCALINA EN HUMANOS
28
PRESENCIA DE LA FOSFATASA ALCALINA EN HUMANOS Epitelio Intestinal
Osteoblastos de Huesos Membranas de los sinusoides y canalículos del Hígado
29
Presente en la totalidad de tejidos corporales: Epitelio intestinal (transporte de lípidos) Osteoblastos (procesos de remodelación ósea) Placenta (durante el primer trimestre de embarazo) Hígado (membrana sinusoide y canalículos)
30
ISOENZIMAS
ALP
-1: se sintetiza en células epiteliales del canalículo
biliar. (10% act. Total ALP) ALP -2 ter m o láb il: estable a 56°C, pierde actividad a 65°C/30 min; se produce en células hepáticas (25% act. total) A LP -2 termo estable: no se degrada a 65°C pero se inhibe con fenilalanina, de origen placentario y en sangre durante embarazo (1% act. total) β: origen en hueso, termolábil (se destruye a ALP pre- 56°C/10 min) y constituye el 50% act. Total A L P g a m m a: se inhibe con fenilalanina y se origina en células intestinales Fosfatasa alcalina de leucocitos (LAP): disminuye en leucemia y aumenta en linfoma
31
ENSAYO DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
32
33
3.
Efecto del pH
34
35
36
APLICACIONES: La prueba de la fosfatasa alcalina (ALP o FA) se realiza para: Comprobar si hay enfermedad hepática o daños en el hígado. Los síntomas de la enfermedad del hígado pueden incluir ictericia, dolor abdominal, náuseas y vómitos. También se puede realizar una prueba de FA para comprobar el hígado cuando se toman medicamentos que pueden dañarlo.
Controlar los problemas óseos tales como raquitismo, osteomalacia, tumores óseos, enfermedad de Paget o demasiada cantidad de la hormona que controla el crecimiento del hueso (hormona paratiroidea). El nivel de FA se puede utilizar para comprobar la eficacia del tratamiento para la enfermedad de Paget o si se está produciendo una deficiencia de vitamina D.
37
Edad. En mayores de 60 años se pueden obtener elevaciones de la
Embarazo . Principalmente durante el tercer trimestre, la placenta
Hiperfosfatasemia benigna familiar . Se produce cuando hay un
fosfatasa alcalina debido al proceso de involución ósea. En los niños y adolescentes con crecimiento óseo esta enzima está normalmente elevada ya que una de las mayores fuentes de fosfatasa alcalina es el hueso. produce fosfatasa alcalina, que está por encima del nivel normal, alrededor de 125 a 250 UI/L. Esta elevación no es un motivo de preocupación, ya que esta enzima es necesaria para la síntesis de proteínas en las células y tiene una parte vital en la calcificación de los huesos y cartílagos. aumento persistente de la fosfatasa alcalina en miembros de una misma familia en ausencia de enfermedad o causa clara de hiperfosfatasemia. Es poco frecuente y de naturaleza hereditaria.
38
Valor de referencia:
IFCC, en UI/l a 30°C Adultos hombres < 60 años 30-90 U/L Adultos mujeres < 60 años 30-80 U/L Ambos > 60 años 30-90 U/L Niños (IFCC, en UI/L a 37°C) 1-30 días H: 75-316 M: 48-406 1 Mes-1 año H: 82-383 M: 124-341 1-3 años H: 104-345 M: 108-317 4-6 años H: 93-309 M: 96-297 7-9 años H: 86-315 M: 69-325 10-12 años H: 42-362 M: 51-332 13-15 años H: 75-390 M: 50-162 16-18 años H: 52-171 M: 47-119 39
CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA….
Los niveles son significativamente más altos en las mujeres embarazadas y niños.
ALP elevada indica que podría haber formación activa de hueso, ya que ALP es un subproducto de la actividad osteoblástica (como el caso de la enfermedad de Paget del hueso).
Los niveles también son elevados en personas con enfermedad celiaca sin tratar.
Niveles bajos de FA son menos comunes que los niveles elevados.
Las comidas grasas, diabetes, úlceras, etc.; elevan la concentración plasmática de FA hepática. 40
Altos niveles de la fosfatasa pueden mostrar que los conductos biliares están obstruidos.
La concentración de FA en plasma es la magnitud bioquímica con mayor sensibilidad para diagnosticar las colestasis (es la detención del flujo de bilis hacia el duodeno). Fármacos que aumentan los niveles de FA hepática: verapamilo, carbamazepina, fenitoína, eritromicina, purinol, ranitidina.
alo
41
REDUCCIÓN DE NIVELES DE FOSFATASA ALCALINA Hipofosfatasia Postmenopausia las mujeres que reciben terapia con estrógenos debido a osteoporosis. Hombres con cirugía reciente de corazón, malnutrición, deficiencia de magnesio, hipotiroidismo o anemia severa. Niños con acondroplasia y cretinismo. Niños después de un episodio severo de la enteritis. Anemia perniciosa y aplásica. Leucemia mielógena crónica Enfermedad de Wilson Anticonceptivos orales
42
