Discusión. Cuando en una fermentación se producen varios productos finales la bacteria dispone de diferentes alternativas para reoxidar del NADH, no existe a priori una estequiometria definida. En cada caso concreto, según sea la bacteria y las condiciones de cultivo, puede cuantificarse tanto el consumo de glucosa (u otro sustrato) como la producción de productos finales I. Las levaduras como microorganismos quimioheterótrofos, necesitan compuestos orgánicos como fuentes de carbono y energía (FCE). Los glúcidos, principalmente las hexosas, son los compuestos más utilizados como FCE tanto para el metabolismo aeróbico como anaeróbico VIII. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismos muy utilizado en la microbiología industrial, en la producción de pan, grasas glicerina y la más importante la de bebidas fermentadas I. En las levaduras, bajo condiciones anaeróbicas el NAD+ se regenera por medio de la fermentación alcohólica: la conversión del piruvato en etanol y CO 2. Mediante dos reacciones consecutivas catalizada por dos enzimas III (ilustración 2). Por cada mol de glucosa que entra en la vía Embden Meyerhof Parnas se producirá 2 moles de piruvato, los cuales al incorporase al metabolismo fermentativo (fermentación alcohólica), se producirá 2 moles de dióxido de carbono y 2 moles de etanol. Esto es muy importante que sea tomado en cuanta en el momento de elaborar un balance de fermentación IX.
Ilustración 1. Reacciones llevadas a cabo en fermentación alcohólica.
Por lo anterior podemos decir que S. cereviciae, en condiciones de anaerobiosis, por cada mol de glucosa produce 1 mol de Dióxido de carbono y 1 mol de etanol, por esta razón nuestros cálculos dependen de muchos factores, tales como el método y los errores cometidos durante su ejecución. Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis (fermentación del pulque) y otras levaduras como Leuconostoc descomponen la glucosa para producir etanol, reoxidando NADH aunque cabe mencionar que la estequiometria varía dependiendo el microorganismo, pues teóricamente no tienen la misma relación de productos oxidados y reducidos y en la práctica estos pueden variar aún más. La fermentación alcohólica es un proceso muy complejo; el incremento de la concentración de etanol a medida que transcurre la fermentación supone un obstáculo para el correcto crecimiento y desarrollo de la levadura por los efectos negativos que esto conlleva. El etanol afecta la permeabilidad de la membrana celular disminuyendo su 1
selectividad, de forma que las levaduras en un medio con alta concentración alcohólica pierden propiedades funcionales y no pueden retener cofactores y coenzimas VIII. Una diferencia importante entre las levaduras silvestres y las levaduras de vino cultivadas es su tolerancia al etanol. La mayor parte de las levaduras silvestres pueden tolerar solamente alrededor de un 4 % v/v de etanol; cuando la concentración de alcohol llega a este punto, la fermentación se detiene.X Los balances de fermentación son esenciales para su aplicación en la industria, el principal objetivo del análisis de las fermentaciones es el de dirigir tanto carbono como sea posible desde un sustrato hacia un producto metabólico de importancia industrial, y obtener el máximo rendimiento posible. VIII Ahora bien en la práctica se realizo un microensayo de una fermentación alcohólica, una de las fermentaciones que solo tiene dos productos metabólicos: el etanol y el dióxido de carbono. Los cuales se les determinó su concentración por los métodos de Conway y gravimétrico, respectivamente, para conocer el % de carbono recuperado en el proceso fermentativo, así como también se determinó la concentración de glucosa fermentada. Estos métodos pueden presentar interferencias que afectan los balances de fermentación. El método de Conway, como ya hemos mencionado, se basa en la oxidación del alcohol por acción de una solución de dicromato de potasio en medio ácido por ácido sulfúrico. El alcohol es oxidado cuantitativamente a ácido acético y el dicromato es reducido a cromo trivalente, de acuerdo con la siguiente reacción. 2 K2Cr2O7 +8 H2SO4 + 3 CH3CH2OH 2 K2SO4 + 2 CH3CHOO + 2 Cr2(SO4)3 + 11 H2O En cuanto a la manera en que fue llevado a cabo el experimento, podemos decir que fue adecuada, ya que se estuvo al tanto de que no se mezclaran el contenido de la cámara central (K2Cr2O7), con el contenido de la cámara externa (H 2SO4 y K2CO3) y se procuró recuperar la mayor cantidad posible de K2Cr2O7. El rendimiento teórico estequiométrico para la transformación de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1g de glucosa XI. Nosotros obtuvimos una recuperación de ____ mmol de Etanol que correspondería a ____% del total, tomando como base 2 mmol de Etanol. Por lo que podemos decir que nuestro rendimiento fue bueno. Este método es apropiado para la determinación de glucosa en diversos jugos y néctares de fruta (naranja, durazno, tomate) y de verduras (zanahoria), como también en vinos y mieles. Dada la especificidad de la glucosadehidrogenasa frente a la glucosa, no reacciona con la fructosa, ni la sacarosa. Se eliminaría la incubación a ebullición ya que la incubación es a temperatura ambiente y el tiempo de incubación ya que son 5 mim además de poder trabajas con alícuotas pequeñas. VIII La ventaja del método de Conway, es que el material y el equipo que se utiliza para la determinación es más accesible, aunque también presenta una fuerte desventaja, ya que es relativamente inespecífico, ya que otros alcoholes, cetonas y aldehídos reducen el dicromato, así como también existe la posibilidad de la descomposición del dicromato por 2
exposición a la luz y considerando que es un método indirecto de oxido reducción colorimétrico y depende del complejo colorido que se forma por la reacción del dicromato con el etanol, éste no es muy estable, con lo que se pierde la intensidad del color y el complejo colorido no tiene la misma absorción por lo que produce una señal distinta a la inicial y existe pérdida. Otra situación a considerar por pérdida es que el etanol presenta una elevada presión de vapor, en donde es parcialmente miscible y la presión atmosférica es relativamente baja. Otras formas para determinar etanol son: Cromatografía de gases Micro difusión Determinación por picnómetro Determinación enzimática (Alcohol Deshidrogenasa) Titulación Si bien los métodos sugeridos requieren del tratamiento previo el que podría presentar mayores inconvenientes sería la determinación por medio de una titulación, ya que presenta “interferencias” en el método, al no ser específico para un sola especie química y en general para un cambio de vire solo depende el pH. Asimismo, la relación de productos oxidados entre productos reducidos es de 0.276 (donde el producto oxidado es CO2 y el reducido es el CH3CH2OH), lo que significa que existe mayor cantidad de productos reducidos que de oxidados y a sabiendas de que para determinar la cantidad de CO2 se realizó por un método gravimétrico, podemos pensar que de entrada, el CO2 no se capturó totalmente en el NaOH acuoso y por consiguiente en los lavados no se encontraría el CO 2 en su totalidad, también podemos considerar como una pérdida con sólo destapar el matraz microfermentador ya que el gas contenido en este es CO2. Sabiendo que se trata de un método gravimétrico, también se puede considerar que hay pérdidas al momento de realizar los lavados, ya que pudieran quedar trazas de BaCO3 en el matraz y obviamente estas no son cuantificadas. Viendo las anteriores situaciones podemos considerar que la relación entre la cantidad de productos oxidados y reducidos (O/R) no es cercana a uno debido a que durante las determinaciones para cada producto, pudieron haber tenido pérdidas de producto en la determinación de la relación, y podemos corroborarlo con nuestro por ciento de carbono recuperado. Notamos que la cantidad de carbono recuperado en función de la glucosa suministrada a Saccharomyces cerevisiae, existe un rendimiento del ___ %, cuando las pérdidas de CO 2 permitidas están en un intervalo del 87-95%. Por lo que en cuanto a recuperación de CO 2 podemos decir que fue deficiente. Tomando en cuenta, la citas bibliográficas y los antecedentes, podemos dar análisis de la pérdida de producto que existió o que delimitó la cuantificación total de los productos en 3
medida de la glucosa que se añadió para obtener etanol y dióxido de carbono y deducir que las variaciones presentadas por la relación de los productos oxidados y reducidos se debió meramente a errores aleatorios tanto del método como de los analistas, sabiendo que Saccharomyces cerevisiae se encontraba en las condiciones óptimas para llevar a cabo la fermentación.
Conclusiones. El índice O/R fue de un valor de ____ donde el producto oxidado es CO2 y el reducido es el CH3CH2OH por lo que no se llevó a cabo un flujo de carbonos correspondiente únicamente a la fermentación alcohólica. La recuperación de CO2 fue deficiente al tener un rendimiento de ____% con respecto a los intervalos establecidos de 87-95% Los errores en la fermentación representados en el balance de fermentación pudieron verse en su mayoría por errores de los analistas al formarse más producto reducido durante la fermentación. La fermentación por Saccharomyces cerevisiae debido al análisis de sus productos fue una fermentación alcohólica. Para un mejor balance de fermentación para la cepa utilizada S. cerevisiae es necesario utilizar equipos para evitar su pérdida de gas y un equipo que se encuentre estable para su óptimo manejo.
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