đồ án nghiên cứu sắc tố chlorophyll.docx

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chất lƣợng của các sản phẩm thực phẩm không chỉ bao gồm giá trị về mặt dinh dƣỡng mà còn cả giá trị về mặt cảm quan cũng nhƣ vệ sinh an toàn thực phẩm. Trong đó, màu sắc là chỉ tiêu bắt buộc và rất quan trọng khi đánh giá chất lƣợng của bất kỳ một sản phẩm thực phẩm nào. Một sản phẩm có màu sắc đẹp sẽ góp phần lôi kéo sự chú ý của khách hàng. Hơn nữa, màu sắc của các sản phẩm thực phẩm còn có tác dụng sinh lý rất rõ rệt. Màu sắc thích hợp sẽ góp phần giúp cơ thể đồng hóa thực phẩm đó dễ dàng hơn 5. Do đó, trong kỹ thuật sản xuất thực phẩm ngƣời ta không chỉ quan tâm đến việc bảo vệ màu sắc tự nhiên mà còn tạo ra và bổ sung vào thực phẩm những chất màu mới thích hợp với tính chất và trạng thái sử dụng của chúng. Tuy nhiên, vấn đề sử dụng chất màu thực phẩm hiện nay đang tồn tại rất nhiều bất cập. Việc vô ý hay cố ý bổ sung vào thực phẩm những chất màu không đƣợc phép hoặc sử dụng vƣợt quá liều lƣợng quy định đã và đang gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, làm ảnh hƣởng đến sức khoẻ và gây hoang mang tâm lý ngƣời tiêu dùng. Chính vì điều đó mà hiện nay trên thế giới, ngƣời ta đang tập trung nhiều nghiên cứu để tìm cách hạn chế tối đa những tổn thất của sắc tố trong quá trình bảo quản, chế biến đồng thời tách chiết các nhóm sắc tố từ những loại nguyên liệu tự nhiên rẻ tiền hay tận dụng các phế phụ phẩm để thu nhận các nhóm sắc tố làm chất màu tổng hợp và ứng dụng vào ngành công nghệ thực phẩm. Đó là do sắc tố tự nhiên có ƣu điểm vƣợt trội hơn, chúng không gây độc tính cho con ngƣời, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm hơn so với các sắc tố tổng hợp nhân tạo (phẩm màu), mặc dù các nhóm sắc tố tự nhiên lại có nhƣợc điểm là rất dễ bị biến đổi và tổn thất trong các điều kiện môi trƣờng…

Trong đồ án này, tôi có nhiệm vụ “Nghiên cứu về sắc tố Chlorophyll trong rau quả và những biến đổi của nó trong quá trình bảo quản và chế biến” nhằm tìm hiểu một cách sâu sắc và toàn diện về bản chất và tác dụng của Chlorophyll, hàm lƣợng, tính chất của nó và những biến đổi của chúng trong các sản phẩm rau quả. Từ đó rút ra đƣợc các biện pháp để phát huy tối đa giá trị của nhóm sắc tố này trong công nghệ thực phẩm.

PHẦN 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1. Tổng quan về sắc tố trong rau quả Sắc tố là những hợp chất hóa học quy định màu sắc của nguyên liệu hoặc sản phẩm. Mỗi loại nguyên liệu rau quả thì có một màu sắc đặc trƣng khác nhau, đó là do thành phần và tỷ lệ hàm lƣợng cũng nhƣ cƣờng độ màu của các loại sắc tố có trong nguyên liệu đó. Khi ăn uống, màu sắc của sản phẩm sẽ gây ấn tƣợng tốt, tạo cho con ngƣời cảm giác hấp dẫn, dễ chịu, ăn uống thấy ngon hơn, thích thú hơn nhờ đó tăng đƣơc mức độ tiêu hóa và làm tăng giá trị dinh dƣỡng của thực phẩm. Chính vì vậy, sắc tố đƣợc xem nhƣ một chỉ tiêu để đánh giá chất lƣợng cảm quan về màu sắc của các sản phẩm thực phẩm đặc biệt là trong các sản phẩm rau quả. Màu sắc của thực phẩm trƣớc hết dùng để đánh giá nguồn gốc của nguyên liệu. Mỗi loại nguyên liệu thƣờng có màu sắc đặc trƣng để nhận biết, ví dụ nhƣ cà chua có màu đỏ, rau có màu xanh, bắp cải có màu trắng hoặc tím… Nhƣ vậy màu sắc là chỉ tiêu cảm quan để xem xét chất lƣợng của sản phẩm. Mặt khác, màu của sản phẩm cũng đƣợc hình thành trong quá trình chế biến hoặc phối trộn nhiều nguyên liệu với nhau tạo thành dƣới tác động của các yếu tố kĩ thuật nhƣ nhiệt độ, pH …Ví dụ bánh mì luôn có màu vàng nâu do phản ứng caramen, xôi gấc luôn có màu đỏ của gấc… Khi chế biến đúng kĩ thuật, màu sắc của sản phẩm thƣờng rất đặc trƣng, thƣờng những màu sắc nổi bật sẽ thu hút đƣợc ngƣời tiêu dùng. Ngoài tác dụng tạo màu sắc thì các sắc tố còn có nhiều tác dụng sinh lý đáng quý khác nhƣ khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa ung thƣ, chữa bệnh tim mạch, cải thiện chức năng mắt và rất nhiều các bệnh khác, tùy theo từng nhóm sắc tố mà có chức năng riêng.

2.1.1. Nhóm sắc tố tự nhiên

Có nhiều quan niệm khác nhau về việc phân loại chất màu thực phẩm. Do đó, việc phân loại chất màu thực phẩm không mang tính tuyệt đối [8]. Dựa theo nguồn gốc xuất hiện, chất màu thực phẩm đƣợc phân thành: chất màu có sẵn trong nguyên liệu, chất màu hình thành trong quá trình chế biến và chất màu đƣợc thêm vào với tƣ cách là phẩm màu phụ gia 5. Các sắc tố tự nhiên là những sắc tố có sẵn trong thực vật hoặc động vật đƣợc tạo nên trong quá trình sống thích ứng với từng loại. Sắc tố tự nhiên gồm có một số nhóm chính: 2.1.1.1. Carotenoid Nhóm sắc tố màu vàng, da cam và màu đỏ. Carotenoid đƣợc tìm thấy không chỉ ở thực vật (cà rốt, cà chua, ớt đỏ, cam…) mà còn ở vi khuẩn, nấm, tảo và động vật. Cho đến nay, đã có hơn 600 carotenoid đƣợc phân lập và xác định. Một số sắc tố tiêu biểu của nhóm chất màu này là: caroten (C40H56), xanthophyl (C40HnOm), capxanthin, licopen… Carotenoid bền dƣới tác dụng của pH môi trƣờng và chất khử, nhƣng không bền dƣới tác dụng của nhiệt độ và ánh sáng. Carotenoid tan trong chất béo và các dung môi hữu cơ, không tan trong nƣớc. Carotenoid cũng có khả năng huỳnh quang nhờ đó mà năng lƣợng ánh sáng do nhóm này hấp thụ có thể truyền sang cho chlorophyll để chuyển đến 2 tâm quang hợp. Chức năng chính của nhóm sắc tố này là hấp thụ năng lƣợng ánh sáng rồi truyền sang cho chlorophyll. Một chức năng rất quan trọng khác của carotenoid là bảo vệ chlorophyll. Có thể xem carotenoid là cái lọc ánh sáng thu bớt năng lƣợng của các tia bức xạ có năng lƣợng lớn, nhờ đó bảo vệ cho chlorophyll tránh bị phân huỷ khi chịu tác động của các tia bức xạ có năng lƣợng lớn. Xanthophyll tham gia vào các phản ứng phân li nƣớc.

2.1.1.2. Flavonoid Gồm có anthocyan và flavon, trong đó anthocyan là những sắc tố có màu từ đỏ tím tía đến xanh, có nhiều trong nho, cherry, bắp cải tím… Sắc tố tự nhiên thì có nhiều ƣu điểm nổi trội hơn và đặc biệt là hầu nhƣ không có tính độc hại. Nhƣng nó lại có nhƣợc điểm lớn là rất dễ bị biến đổi dƣới tác dụng của nhiệt độ, oxy, ánh sáng, pH…và những gì thuộc về thiên nhiên thì cũng thƣờng có tính hữu hạn không đáp ứng hết nhu cầu của con ngƣời. Phần lớn các flavonoid có màu vàng. Ngoài ra, còn có những chất màu xanh, tím, đỏ, hoặc không màu. Flavonoid có mặt trong tất cả các bộ phận của các loài thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa, tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ để quyến rũ các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây. Trong cây, flavonoid giữ vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản một số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng,…), một số còn có tác dụng điều hoà sự sinh trƣởng của cây cối. Là nhóm sắc tố làm cho rau quả có nhiều màu khác nhau, từ đỏ đến tím (nho, cà tím, bắp cải..). Màu chỉ tồn tại ở lớp vỏ ngoài ở một số loại rau quả nhƣ cherries, táo và mận.

Hình 2.1. Cấu tạo của anthocyanin

Về bản chất hóa học, anthocyanin là glucoside khi bị thủy phân cho đƣờng và anthocianidin. Anthocyanin hòa tan trong nƣớc dễ dàng và có tính sát trùng. Có thể bị phá huỷ bởi nhiệt, pH, enzym và sự hiện diện của kim loại. Màu tím hoặc xanh anthocyanin trong môi trƣờng kiềm chuyển thành đỏ khi bổ sung acid. Anthocyanin chuyển sang tím và xanh khi phản ứng với kim loại. 2.1.1.4. Chlorophyll Chlorophyll là sắc tố màu xanh lá cây đƣợc tìm thấy trong tất cả các cây xanh cũng nhƣ các loại tảo xanh 5. Đây là sắc tố chịu trách nhiệm cho quá trình quang hợp ở thực vật. Nó có màu từ xanh oliu đến xanh lục thẫm tùy thuộc vào lƣợng magie kết hợp. Gồm có clorofil a, b, c, d nhƣng chiếm chủ yếu là clorofil a, b. Clorofil có màu xanh lá (màu lục), còn gọi là diệp lục tố. Clorofil a có màu xanh lam, Clorofil b có màu xanh vàng. Tỷ lệ của hai loại là 3/1. Hàm lƣợng chất diệp lục càng cao thì màu xanh càng đậm . Clorofil đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp, là nguồn chủ yếu tạo ra hợp chất hữu cơ và là nguồn duy nhất sinh ra oxy tự do. 

Khi đun nóng trong môi trƣờng acid

bị thay thế bởi

tạo thành pheophytin có màu vàng úa, đôi khi có màu đen sẫm 

Dƣới tác dụng của Fe, Sn, Al, Cu thì Mg trong clorofil sẽ thay

thế và sẽ cho màu sắc khác nhau: + Fe cho màu nâu + Sn và Al cho màu xám + Cu cho màu xanh sáng

2.1.2. Nhóm sắc tố tổng hợp nhân tạo Sắc tố tổng hợp nhân tạo là các sắc tố đƣợc tổng hợp hữu cơ từ các nguyên liệu tự nhiên. Các sắc tố này thì rất ổn định dƣới các điều kiện môi trƣờng, đa dạng về màu sắc, dễ sử dụng, bảo quản và số lƣợng lớn đáp ứng đƣợc nhu cầu của con ngƣời, nhƣng nó lại có nhƣợc điểm là tồn dƣ trong thực phẩm thì gây ra những độc hại cho ngƣời tiêu dùng. Trong thực phẩm thì sắc tố tổng hợp nhân tạo chủ yếu đƣợc sử dụng trong sản xuất bánh kẹo, sản xuất các loại nƣớc uống giải khát, sản xuất đồ hộp, đồ hộp rau quả… Khi sử dụng phải tuân theo quy định và có giới hạn liều lƣợng cho phép. Trong quá trình chế biến và bảo quản các sản phẩm thì màu sắc thƣờng kém đi, bị biến đổi màu hoặc bị mất màu. Để giữ màu sắc cho thực phẩm thì có 4 biện pháp nhƣ sau [1]. - Xây dựng quy trình công nghệ bảo toàn tối đa màu sắc của tự nhiên có sẵn trong nguyên liệu thực phẩm. Ví dụ chần rau nhanh qua nƣớc sôi để giữ màu xanh cho rau… - Tách, cô đặc, bảo quản các chất màu tách ra từ nguyên liệu, sau đó dùng nó để nhuộm màu cho các sản phẩm khác. Ví dụ tách màu đỏ của gấc để nhuộm xôi… - Tổng hợp nhân tạo các chất màu giống nhƣ màu của sản phẩm thực phẩm. - Dùng các biện pháp kỹ thuật để điều chỉnh các phản ứng theo chiều tạo ra chất màu mới từ những hợp phần có trong nguyên liệu. Ví dụ tạo màu nâu đen bằng phản ứng oxy hóa polyphenol trong công nghệ sản xuất chè đen… 2.2. Sắc tố Chlorophyll 2.2.1. Giới thiệu chung Chlorophyll đƣợc phân lập lần đầu bởi Joseph Bienaimé Caventou and Pierre Joseph Pelletiervào năm 1817 [9]. Năm 1913, Richard Willstatter là một nhà hóa học ngƣời Đức đã chỉ ra tất cả các năng lƣợng sống đều nhờ mặt trời. Cây xanh có một cách nào đó để giữ

năng lƣợng mặt trời. Năm 1919, ông đã giải thích đƣợc chức năng của chất giữ năng lƣợng mặt trời chính là Chlorophyll. Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ đƣợc năng lƣợng bức xạ và chuyển hóa thành năng lƣợng dự trữ trong cơ thể hay đó gọi là quá trình quang hợp. Quá trình quang hợp sử dụng năng lƣợng của ánh sáng mặt trời đƣợc hấp thụ bởi chất diệp lục (chlorophyll), phân tách nƣớc thành hydro và oxy sau đó tổng hợp thành các chất hữu cơ - chất dinh dƣỡng phục vụ cho bản thân chúng và hầu hết các sinh vật trên trái đất, đồng thời tạo ra oxy và thiết lập sự cân bằng Oxy-Nitơ-Cacbonic cho bầu khí quyển. Cấu trúc tổng quát của chlorophyll đƣợc Hans Fischer tìm ra vào năm 1940 và đến năm 1960 cấu trúc lập thể của chlorophyll a đã đƣợc làm sáng tỏ hoàn toàn và hầu hết các lập thể của chlorophyll đã đƣợc biết đến. Năm 1967, việc giải thích lập thể còn lại cuối cùng đã đƣợc hoàn thành bởi Ian Fleming [10], [17]. Chlorophyll d (hay f ) đƣợc công bố năm 2010 tồn tại ở vi khuẩn lam và các vi sinh vật hiếu khí khác có khả

năng hình

thành

stromatolites [17]. Chlorophyll có công thức phân tử là C55H70O6N4Mg và cấu trúc

2-formyl. Tuy nhiên màu sắc của thực vật, ngoài chất diệp lục (chlorophyll) cho màu

xanh thì ở thực vật còn có diệp hoàng tố (carotenoid) gồm: caroten cho màu vàng cam, xantophyll cho màu đỏ, và flavonoid có màu hỗn hợp vàng, xanh, tía, đỏ, trong đó có anthocyanins cho màu đỏ đặc trƣng. 2.2.2. Cấu trúc của Chlorophyll Cấu trúc hoá học của chlorophyll là gần giống hemoglobin ở máu ngƣời, cũng gồm 4 nhóm heme gắn với một nguyên tố kim loại, ở ngƣời là nguyên tố sắt, còn ở thực vật và tảo, nguyên tố magiê (Mg) thay thế cho nguyên tố sắt. Ngƣời ta còn gọi chất diệp lục (chlorophyll) là máu của thực vật.

Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của chlorophyll Cấu trúc cơ bản của chlorophyll là nhân porphyrin. Nhân porphyrin do 4 vòng pyrol nối với nhau bằng các cầu metyl tạo thành vòng khép kín (các cầu =CH- chƣa no nối 4 vòng pyrol lại với nhau), trên toàn bộ vòng porphyrin có 8 nguyên tử C, ở đó có các nhóm thay thế có thể chuyển hóa lẫn nhau. Vòng pyrol thứ IV ở trạng thái khử (giữa C7 và C8 không có nối đôi) và có một gốc acid. Cầu γ C nối vòng pyrol III và pyrol IV tạo nên một vòng khử V, vòng này không chứa N và qua đó là một gốc acid gắn vào và gốc này có thể bị ester hóa bằng rƣợu metylic, tạo thành gốc COOCH3. Giữa nhân có nguyên tử Mg tạo nên cấu trúc dạng hem, là phần quan trọng nhất vì nó quyết định màu xanh lục của diệp lục. Bên cạnh các vòng pyrol còn có vòng phụ thứ 5. Điều đặc biệt quan trọng là trên nhân porphyrin hình thành 10 nối đôi cách là cơ sở của hoạt tính quang hoá của chlorophyll. Từ nhân porphyrin có hai gốc rƣợu là metol (CH3OH) và fytol (C20H39OH) nối vào tại C10 và C7. Có nhiều loại phân tử chloropyll. Các loại chlorophyll đều có phần cấu trúc giống nhau, đó là nhân porphyrin và 2 gốc rƣợu. Mỗi loại chloropyll đƣợc đặc

trƣng riêng bởi các nhóm bên khác nhau tạo nên một số tính chất khác nhau. Chlorophyll là chất có hoạt tính hoá học cao, vừa có tính acid, vừa có tính kiềm. Đặc biệt chloropyll có những tính chất lý học quan trọng giúp cho chúng thực hiện chức năng trong quang hợp. Tính chất lý học quan trọng nhất là chlorophyll có khả năng hấp thụ năng lƣợng áng sáng chọn lọc. Quang phổ hấp thụ cực đại của chlorophyll vùng tia xanh (λ: 430-460 nm) và vùng ánh sáng đỏ (λ: 620-700 nm). Nhờ khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nên chloropyll có hoạt tính quang hoá. Khi hấp thụ năng lƣợng từ các lƣợng tử ánh sáng, năng lƣợng của các lƣợng tử đã làm biến đổi cấu trúc của chlorophyll làm cho phân tử chlorophyll trở thành trạng thái giàu năng lƣợng – trạng thái kích động điện tử. Ở trạng thái đó phân tử chlorophyll thực hiện các phản ứng quang hoá tiếp theo. Một tính chất quan trọng khác của chlorophyll là có khả năng huỳnh quang. Nhờ khả năng huỳnh quang mà năng lƣợng đƣợc truyền qua các hệ sắc tố để tập trung vào hai tâm quang hợp. Nhờ những tính chất trên nên chlorophyll là sắc tố có vai trò quan trọng trong quang hợp. Chlorophyll tiếp nhận năng lƣợng ánh sáng truyền năng lƣợng ánh sáng thành năng lƣợng điện tử của chlorophyll để rồi biến đổi năng lƣợng điện tử thành năng lƣợng hoá học tích trữ trong ATP cung cấp cho quá trình tổng hợp chất hữu cơ. 2.2.3. Phân loại 2.2.3.1.Chlorophyll a (C55H72O5N4Mg) Chlorophyll a đƣợc tìm thấy trong tất cả các sinh vật nhân chuẩn đƣợc biết đến quang hợp. Trong số các sinh vật nhân sơ, nó đƣợc tìm thấy với số lƣợng lớn chỉ có ở vi khuẩn lam, mặc dù dấu vết biến thể nhỏ của chlorophyll a đƣợc tìm thấy trong một số vi khuẩn anoxygenic, vi khuẩn lƣu huỳnh màu xanh lá cây và heliobacteria, nơi mà nó có một chức năng quan trọng nhƣ là một trung gian trong

chuỗi vận chuyển điện tử . Một số prochlorophytes chứa divinyl chlorophyll a, trong đó các nhóm thế tại vị trí C-8 trên vòng B là vinyl thay vì ethyl. Một biến thể quan trọng của chlorophyll a là chlorophyll a'. Sắc tố này khác với chlorophyll a chỉ trong hóa học lập thể tại vị trí C-132. Sự giảm oxy hóa quang phổ và đặc tính của chlorophyll a’ tƣơng tự nhƣ chlorophyll a. Hiện nay nhiều bằng chứng cho thấy rằng chlorophyll a’ đƣợc tạo thành từ chlorophyll a, mặc dù các giả định C-132 chất enzyme tồn tại trong một số cây và động vật chƣa đƣợc xác định. Ở Chlorophyll a ta thấy các tia xanh và đỏ đƣợc hấp thụ còn tia lục không đƣợc hấp thụ. Tia lục không đƣợc các sắc tố hấp thụ và phản chiếu vào mắt ta do đó ta thấy lá có màu lục. 2.2.3.2. Chlorophyll b (C55H70O6N4Mg) Chlorophyll b giống hệt chlorophyll a ngoại trừ tại một vị trí là C-7, nơi một nhóm formyl (-CHO) thay thế nhóm methyl (-CH3). Sự thay đổi này thay đổi sự hấp thu tối đa các bƣớc sóng ngắn hơn. Chlorophyll b phần lớn có trong các sinh vật nhân chuẩn quang hợp, ngoại trừ các tảo đỏ và tảo nâu. Trong sinh vật nhân sơ quang hợp nó chỉ đƣợc tìm thấy trong prochlorophytes. 2.2.3.3. Chlorophyll c Chất diệp lục c phần lớn hiếm thấy, trong đó nó không có đuôi isoprenoid và cũng không có vòng D giảm ( thiếu gốc phytol tail_ C20H39OH ). Vì vậy bằng phƣơng pháp hóa học phân loại nhƣ porphyrin, và không phải là một chlorin. Chlorophyll c đƣợc tìm thấy riêng biệt trong các nhóm khác nhau của tảo biển nhƣ tảo cát. Nó hoạt động nhƣ là một phụ kiện thu ánh sáng, trong sắc tố phức hợp protein tƣơng tự chlorophyll b ở thực vật và tảo xanh. Có một vài biến thể cấu trúc của chlorophyll c, trong đó khác nhau trong một số nhóm thế vòng ngoại vi.

2.2.3.4.Chlorophyll d Chlorophyll d khác chlorophyll a chỉ một vài điểm: các nhóm thế ở vị trí C-3 là một nhóm formyl trong chlorophyll d, thay vì nhóm vinyl tại chlorophyll a, chlorophyll d đƣợc biết đến nhƣ là một dấu vết thành phần của tảo nhất định và đƣợc cho rằng là không có thật. Tuy nhiên, vào năm 1996 một loài vi khuẩn Cyanobacteria acaryochloris ( nhân giả ), đƣợc phát hiện nhƣ là một sự cộng sinh trong một số động vật không xƣơng sống ở biển. Sinh vật này có chứa chlorophyll d nhƣ là các sắc tố chính, và nó cũng chứa chlorophyll a và sắc tố bilin. Chlorophyll d là động lực và cấu trúc trung gian giữa chlorophyll a và bacteriochlorophyll a, mà đã đƣợc gợi ý rằng nó, hoặc một sắc tố có liên quan, có thể có đƣợc chuyển đổi trung gian trong quá trình quang hợp anoxygenic.

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của chlorophyll a, b, d 2.3 Hàm lượng và thành phần chlorophyll trong rau quả [14], [17]. Trong các phần xanh của cây, chlorophyll có trong tổ chức đặc biệt, phân tán trong nguyên sinh chất gọi là lục lạp ( Chloroplast ) hay hạt diệp lục. Hàm lƣợng của chlorophyll trong cây xanh chiếm khoảng 1 chất khô. Trong đa số thực vật bậc cao thì tỷ lệ giữa chlorophyll a và chlorophyll b là: 3/1, tỷ lệ này có thể thay đổi dựa vào nhiều yếu tố nhƣ loài, trạng thái và môi trƣờng ( độ ẩm, độ sáng,chất khoáng,… ). VD: Thực vật thƣờng sống ở nơi có ánh sáng nhiều thì thƣờng có tỷ lệ chlorophyll a cao hơn so với thực vật sống ở nơi tối, mát. Đối với trái cây khi chín, tỷ lệ (3/1) này có khuynh hƣớng giảm xuống nhƣng trong vài trƣờng hợp đặc biệt thì tỷ lệ này lại tăng lên, do chlorophyll b bị phân hủy nhanh hơn chlorophyll a.

Hình 2.3. Hạt diệp lục (chloroplast) Bảng 2.3. Sự phân bố của Chlorophyll và thành phần cấu trúc của chúng Chlorophyll a

CTPT Nhóm

Chlorophyll b

C55H72O5N4Mg C55H70O6N4Mg CH =

CH =

Chlorophyll

C35H30O5N4Mg CH =

Chlorophyll

C35H28O5N4Mg CH =

Chlorophyll d

C54H70O6N4Mg CHO

C3 Nhóm

CHO

C7 Nhóm C8

CH =

Nhóm C17 Liên kết C17-C18

Đơn

Đơn

Kép

Đơn

Kép

Tần suất

Phổ biến

Đa số ở thực vật

Các loại Tảo

Các loại Tảo

Vi khuẩn Lam

khác nhau

khác nhau

(cyanobacteria)

2.4. Tính chất và các yếu tố ảnh hưởng đến sự ổn định của chlorophyll Sự có mặt của sắc tố chlorophyll trong các nguyên liệu thực vật đã làm cho chúng có màu xanh lục đặc trƣng. Màu xanh tự nhiên đặc trƣng này thƣờng bị biến đổi trong quá trình chế biến nhiệt. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do khi tế bào còn sống, chlorophyll tồn tại dƣới dạng liên kết với protein có trong tế bào, dƣới tác động của nhiệt độ cao, protein sẽ bị biến tính và giải phóng chlorophyll khi đƣợc giải phóng thƣờng không bền vững sẽ chuyển thành hợp chất pheophytin có màu xanh olive hoặc nâu. Ví dụ: rau quả xanh đóng hộp, Cu tạo thành chất dẫn xuất với chlorophyll cho màu xanh sáng Enzyme chlorophylase trong rau quả có khả năng chuyển pheophytin thành pheophorbid có màu xanh olive hoặc nâu. (1) Dƣới tác dụng của nhiệt độ và acid chứa trong dịch bào của rau quả hoặc acid có trong dung dịch. Các acid chiếm lấy ion Mg2+ trong phân tử chlorophyll và thay thế bằng 2 ion H+ làm cho chúng chuyển hóa thành pheophytin có màu xanh oliu sẫm. Thời gian đun nóng càng lâu thì sự sẫm màu xảy ra càng mạnh. Và sự sẫm màu này xảy ra mạnh hơn nữa đối với các loại rau quả có hàm lƣợng acid cao [1]. Vì vậy, những sản phẩm thực phẩm chua nhƣ lá me, khế, xoài bị mất màu xanh và có màu oliu ngay trong quá trình chần. Điều này có thể đƣợc giải thích là do:một mặt protein bị đông tụ làm vỏ tế bào bị phá hủy, mặt khác là do liên kết giữa chlorophyll và protein bị đứt làm chlorophyll dễ dàng tham gia phản ứng.

Hình 2.4. Sơ đồ chuyển hoá của chlorophyll

Chlorophyl + 2HX  Pheophytin (màu sẫm oliu) + MgX2 COOCH3 C32H30ON4Mg

COOCH3 + 2HCl

C32H30ON4H2

COOC20H39 Chlorophyll a

+ MgCl2 COOC20H39

Pheophytin

(2) Khi chlorophyll tác dụng với kiềm nhẹ (carbonat kềm và kiềm thổ) thì

acid và muối acid của dịch bào sẽ bị trung hoà, tạo thành các muối phức tạp có chứa Mg gọi là chlorophylinic acid. Vì kiềm có tác dụng làm mất nhóm phytin do quá trình xà phòng hoá tạo thành chlorophyllinic acid, metanol, rƣợu phytol. Acid chlorophylic hay muối của nó làm cho sản phẩm có màu xanh đậm. C55H72O5N4Mg + NaOH

C32H30ON4Mg(COONa)2 + CH3OH + C20H39OH

Chlorophyll a

Chlorophilinic acid

C55H70O6N4Mg + NaOH

C32H28O2N4Mg(COONa)2 + CH3OH + C20H39OH

Chlorophyll b

Metanol Rượu phitol

(3) Dƣới tác dụng của Fe, Sn, Al, Cu, thì Mg2+ trong chlorophyll sẽ bị thay thế và cho ra các màu khác: - Với Fe cho màu nâu. - Với Sn, Al cho màu xám. - Với Cu cho màu xanh sáng bền Bởi vậy, trong sản xuất thực phẩm, đặc biệt khi chế các loại rau xanh, ngƣời ta rất chú trọng tới việc bảo tồn lƣợng chlorophyll có sẵn trong nguyên liệu nhằm giữ màu xanh tự nhiên cho sản phẩm, bằng cách: + Gia nhiệt nhanh trong một lƣợng nƣớc lớn (3-4 lít/kg) để giảm hàm lƣợng acid. Acid lúc này sẽ bị bay đi cùng với hơi nƣớc. + Gia nhiệt rau xanh trong nƣớc cứng, carbonat kiềm thổ sẽ trung hòa một phần acid của dịch. Do đó, trong sản xuất cần chú ý đến thành phần của nƣớc luộc rau. + Bổ sung muối Bicacbonat Natri (NaHCO3) vào nƣớc luộc rau xanh (rau cải, rau muống…). + Trong sản xuất chè xanh, ngƣời ta bổ sung vào khối chè khi diệt men một lƣợng Cacbonat amon (NH4)2CO3. Nhờ đó là chè giữ đƣợc màu xanh rất đẹp. 2.5. Vai trò của chlorophyll - Trong quá trình quang hợp 14: Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang hợp, là chất đầu tiên nhận năng lƣợng ánh sáng cho hệ quang hợp để tổng hợp các chất hữu cơ từ chất vô cơ nuôi sống mọi sinh vật trên trái đất. Chlorophyll hấp thụ ánh sáng chuyển về dạng năng lƣợng ATP (hóa năng), trong quá trình này xảy ra các phản ứng chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử) tạo thành các sản phẩm oxy hóa và khử. Hay nói cách khác là giúp cây sử dụng ánh sáng mặt trời trong quá trình quang hợp (tạo ra các hợp chất hữu cơ và nguồn oxy duy nhất cho trái đất), cho phép lá cây tạo tinh bột từ dioxyt cacbon và nƣớc.

Ánh sáng 6CO2 + 6H2O

C6H12O6 + 6O2 Chlorophyll

Ở thực vật, chlorophyll thƣờng có khả năng che khuất những màu khác khiến cho lá cây có màu xanh đặc trƣng. Nhƣng trong quá trình trái cây chín hoặc là lá già thì màu sắc này bị thay đổi là do chlorophyll bị mất đi, thay thế bằng sự tổng hợp những sắc tố khác. Trong quá trình chế biến thực phẩm, dƣới tác động của các yếu tố của môi trƣờng nhƣ: độ pH, nhiệt độ, nƣớc, ion kim loại, enzyme…sẽ xảy ra các quá trình biến đổi màu. Các biến đổi này có thể là quá trình mất màu của các chất màu có bản chất tự nhiên hoặc là các phản ứng tạo màu. Và sự biến đổi này phụ thuộc rất lớn vào bản chất của chất màu và các thông số kỹ thuật của quy trình chế biến [2]. Chính vì vậy trong thực phẩm nói chung cũng nhƣ trong ngành rau quả nói riêng Chlorophyll đƣợc sử dụng nhƣ một phẩm màu phụ gia thực phẩm (tự nhiên hay nhân tạo). Một số nguyên liệu thực vật phổ biến đƣợc sử dụng để tách chiết chlorophyll là: cỏ linh lăng, cây tầm ma, rong biển... Nó thƣờng đƣợc chiết xuất từ nguyên liệu thực vật khô bằng cách sử dụng các loại dung môi nhƣ: các hydrocacbon clo, acetone, ethanol,... 7, 8. Ngoài ra, sản phẩm thƣơng mại có thể là Chlorophyll phức đồng. Sản phẩm này thu đƣợc khi thêm muối đồng hữu cơ vào sản phẩm chiết từ cỏ linh lăng, tầm ma và các nguyên liệu thực vật khác với dung môi (aceton, dicloromethan, methanol, ethanol, propan-2-ol và hexan). Chlorophyll phức đồng bền màu hơn so với chlorophyll 6.

Hình 2.5. Cấu tạo của Chlorophyll phức đồng Chlorophylphức đồng chlorophyll phức đồng Muối natri/kali của chlorophyll phức đồng. Sản phẩm thu đƣợc khi cho đồng vào dịch chiết chlorophyll đã bị xà phòng hóa. Sau khi thêm đồng vào chlorophylin đã tinh chế, nhóm acid bị trung tính hóa tạo thành dạng muối của kali và/hoặc natrihexan. Sản phẩm thƣơng mại có thể ở dạng dung dịch nƣớc hoặc bột khô 6.

Hình 2.6. Công thức cấu tạo của muối kiềm của chlorophyll phức đồng Sự hình thành phức chất kim loại màu xanh lục khi làm mát màu chlorophyll trong quá trình xử lí nhiệt là phƣơng pháp hữu hiệu để giữ cho màu sắc cho rau quả đóng hộp. Kẽm và đồng sẽ thay thế cho Mg trong vòng porphyrin những liên kết này có phức chất khá chắc chắn, bền với nhiệt và acid so với phức của Mg.

Tóm lại, một sản phẩm có màu sắc hấp dẫn sẽ góp phần làm tăng khả năng lựa chọn của khách hàng. Từ đó, giúp cho lƣợng sản phẩm tiêu thụ tăng nhanh, góp phần thúc đẩy quá trình sản xuất. Vì vậy, chất màu thực phẩm có một vai trò hết sức quan trọng trong ngành công nghệ thực phẩm. Mặc dù nó không có ý nghĩa nhiều về mặt giá trị dinh dƣỡng nhƣng có ý nghĩa rất lớn ở các mặt sau: - Gia tăng màu sắc đặc hiệu của thực phẩm có cƣờng độ màu kém. - Làm đồng nhất màu sắc của thực phẩm (với các nguyên liệu khác nhau màu sắc sản phẩm sau khi chế biến có thể khác nhau). - Khôi phục sự mất và biến màu của các sản phẩm do tác động của các quá trình chế biến. - Tạo thực phẩm có màu sắc hấp dẫn hơn.

2.6. Những biến đổi của chlorophyll trong chế biến và bảo quản 8, 14.

Hình 2.7. Cơ chế phản ứng cho sự suy giảm của chlorophyll trong rau quả chế biến và lưu trữ. a = gây ra bởi nhiệt.

Trong quá trình chế biến và bảo quản rau quả chlorophyll thƣờng bị mất đi. Chlorophyll dễ bị chuyển hóa hoặc thoái biến cả ở trong và ngoài tế bào thành một loạt dẫn xuất nâu và xanh ôliu hoặc thành các phần tử không màu (có hoặc không có khả năng phát huỳnh quang), do quá trình làm mất màu chlorophyll bằng hóa chất hay ánh sáng. Các sản phẩm có màu nâu ôliu: pheophytin, pheophorbide, pyropheophytin và pyropheophorbide. Các sản phẩm có màu xanh ôliu: chlorophyllide, pyrochlorophyll và đồng phân của chlorophyll là hydroxychlorophyll. 2.6.1. i n ổi sau hi thu hoạch Mất màu xanh là dấu hiệu lão hóa sau khi thu hoạch. những lá già, màu có thể chuyển từ xanh sang vàng, đỏ, nâu tùy thuộc vào sự biến đổi của chlorophyll thành những sản phẩm không màu hoặc bị tẩy màu. Sự lão hóa đƣa tới những biến đổi xấu, dẫn đến việc làm chết các tế bào, các mô,… Sự mất màu ở diệp lục có thể so sánh với sự oxi hóa lipid. Thực vật có cơ chế bảo vệ chống oxy hóa cao giữ diệp lục tốt hơn thực vật có cơ chế bảo vệ chống oxy hóa diệp lục thấp. Ở một vài thực phẩm và ở những điều kiện cất trữ nhất định, các mô có khả năng tổng hợp diệp lục sau khi thu hoạch, sau đó mới bị mất. Ethylen (

) thúc đẩy nhanh tốc độ mất màu chlorophyll ở rau quả trong

khi nhiệt và nén áp suất ( Controlled Atmosphere_ CA ) cản trở quá trình này. Lers et al (1998) chứng minh đƣợc ethylen đẩy nhanh sự mất màu chlorophyll ở rau cần giữ sau 8 ngày trong tối ở nhiệt độ 25C.Ngƣợc lại, nồng độ sẽ làm chậm các quá trình lão hóa và vô hiệu hóa sự lão hóa do ethylen thúc đẩy. Paradis (1996) đã chứng tỏ lƣợng chlorophyll trong cải bông đƣợc giữ lại sau 6 tuần bảo quản ở 2

+ 6

ở 4C. Ngƣợc lại, 60 chlorophyll bị mất

sau 4 tuần bảo quản ngoài trời. Tuy nhiên, khi hoa đƣợc chuyển ra ngoài trời sau khi đƣợc bảo quản trong điều kiện CA thì lƣợng chlorophyll giảm, búp hoa vàng đi và nở rất nhanh. 2.6.2. i n ổi trong qu tr nh ch

i n

Để rau quả giữ đƣợc lâu và vô hiệu hóa enzym, ngƣời ta thƣờng xử lí nhiệt. Ở nhiệt độ trên 60C, tế bào sẽ chết, phân tử pectin bị bẽ gãy, cấu trúc tế bào không thể phục hồi lại. Trong quá trình lên men sự phát triển của vi khuẩn sẽ phá vỡ cấu trúc tế bào. Chlorophyll định vị trong các grana của lục lạp trong tế bào chƣa bị phá hủy. Khi tế bào bị chết trong quá trình xử lí nhiệt, lục lạp sẽ mất, các grana bị phân tán và các giọt mỡ đƣợc bao trong một lớp màng. Khi tế bào chất bị vỡ, tính thẩm thấu của màng tăng lên, acid của dịch bào đƣợc giải phóng, dẫn tới quá trình mất màu chlorophyll. Sự chuyển hóa chlorophyll thành pheophytin trong xử lí nhiệt phụ thuộc nhiệt độ, thời gian xử lí và pH. Từ 60C trở lên, quá trình chuyển thành pheophytin tăng nhanh khi nhiệt độ tăng. Chlorophyll a nhạy với nhiệt hơn chlorophyll b. Ơ broccoli juice, chlorophyll a mất màu nhanh hơn chlorophyll b gấp 2 lần. Quá trình làm mất màu chlorophyll xảy ra theo 2 giai đoạn và sự thay đổi về màu sắc đƣợc nhận thấy khi gia nhiệt broccoli juice, đặc biệt ở 90 và 100C. Giai đoạn đầu là pheophytin hóa và giai đoạn sau là phân hủy pheophytin thành pyropheophytin. Haisman và Clark (1975), đƣa ra kết luận: 55 chlorophyll bị chuyển thành pheophytin trong 20 phút trong diều kiện xử lí nhiệt brussels sprout ở 80C. Trái lại, chỉ có 39 bị chuyển hóa ở lá cây thuốc lá (hình 2.8). pH của brussels sprout và lá cây thuốc lá sau khi xử lí nhiệt là 6.2 và 6.0. Haisman và Clark cũng kiểm tra

tỷ lệ pheophytin hình thành ở nhiệt độ 60C ở 25 mô cây với pH tăng dần từ 4.1 đến 7.2. Họ quan sát sự tăng pheophytin khi pH giảm. Tuy nhiên, nhìn chung không có mối liên hệ chung giữa pheophytin và pH thấp. Haisman và Clark cũng có kết luận rằng sự ổn định chlorophyll trong những tế bào bị phá hủy sự tập trung và dạng tự nhiên của acid dịch bào và sự liên kết giữa chlorophyll và lipoprotein trong lục lạp.

Hình 2.8: Sự chuyển hóa thành pheophytin ở Brussels Sprouts và lá cây thuốc lá sau 20 phút xử lí nhiệt tại 60, 70, 80 và 90 º C 2.6.3 Tẩy trắng ( blanching) Nếu tẩy không đủ thì màu sắc của sản phẩm sẽ thay đổi trong quá trình bảo quản đông lạnh do hoạt động của enzym chlorophyllase và peroxidase. Ngoài ra dƣới tác dụng của enzym lipoxygenase sẽ hình thành lipid hydroperoxide và gốc hydroperoxy tự do có thể làm mất màu chlorophyll. Nếu tẩy quá mức sẽ tạo ra những màu không mong muốn, vì khi đó nó bị pheophytin hóa hoàn toàn, hình thành pyropheophytin và phá hủy luôn lục lạp.

Sử dụng phƣơng pháp tẩy trắng bằng nƣớc, nƣớc sẽ vào trong tế bào và những khoảng trống trong nội bào, lục lạp sẽ phồng lên và chất diệp lục sẽ khuếch tán qua tế bào vào đĩa tẩy. Việc tẩy bằng nƣớc nóng, hơi nƣớc và microwave_steam không làm cho sản phẩm có sự khác biệt về màu sắc 2.6.4 Nấu Nấu đậu 3 phút trong nƣớc, ta thấy không có ảnh hƣởng lớn đến tổng lƣợng chlorophyll, tuy nhiên chlorophyll a va b thì tăng trong khi đó chlorophyll a' và b' lại giảm. Chen (1993) đã ghi nhận sự thay đổi của các thành phần có liên quan tới chlorophyll trong khi xử lí nhiệt bằng sóng viba ở lá khoai tây (bảng 2.4). Trong 8 phút nấu tổng lƣợng chlorophyll giảm đúng 7 lần. Chlorophyll a biến đổi thành chlorophyll a', một đồng phân của chlorophyll a và pheophytin a một cách đều đặn. Trong khi đó chlorophyll b chuyển thành chlorophyll b' trong 2 phút đầu, pheophytin b và pyropheophytin a sau 8 phút nấu mới xuất hiện.

ảng 2.4: Sự thay đổi của các thành ph n liên quan t i chlorophyll khi xử l nhiệt

b ng sóng viba ở lá khoai tây

2.6.5. Đóng hộp và diệt huẩn Trong quá trình đóng hộp và tiệt trùng, màu của rau quả sẽ chuyển từ xanh lục chlorophyll sang màu sang màu xanh oliu của pheophytin do yêu cầu xử lí nhiệt trong thời gian dài để đạt yêu cầu vô trùng trong công nghiệp. VD: 100 chlorophyll ở rau bina biến thành pheophytin trong 30 phút ở 121C. Trong khi đó chỉ có 16 bị mất trong đông lạnh. Rau quả đóng hộp có màu nâu oliu của pheophytin a và b cùng với pyropheophytin a và b. 2.6.6. Dehydrat ho sấy Thời gian sấy ở nhiệt độ cao dẫn tới những sản phẩm kém chất lƣợng do quá trình caramen hóa, phản ứng Maillard, phản ứng enzym và làm mất màu của các chất màu thực phẩm nhƣ sự pheophytin hóa. Sự pheophytin hóa xảy ra ở các thực phẩm có hàm lƣợng nƣớc thấp trong khi bảo quản. Sấy lá cây rau cần ở 80 và 900C, 3-7% chlorophyll chuyển thành pheophytin; còn sấy ở 100 và 1400C thì có 12-15% chuyển thành pheophytin. Những mẫu sấy đƣợc giữ trong 2 năm ở nhiệt độ thấp chứa lƣợng pheophytin cao hơn những mẫu sấy ở nhiệt độ cao. Bảo quản lâu chlorophyll b bền hơn chlorophyll a. Điều này ảnh hƣởng đến màu của sản phẩm vì chlorophyll a có màu xanh lục còn chlorophyll b màu vàng xanh. Chloropyll bị mất ít nhất khi sấy trong tủ sấy ở 300C. Phƣơng pháp sử dụng hơi nƣớc làm tăng tính thẩm thấu của màng tế bào, có lợi cho sự dịch chuyển của nƣớc và giảm thời gian sấy. 2.6. . Ngâm n ớc muối và qu tr nh lên men Dùng giấm hay axit trong muối dƣa sẽ ảnh hƣởng tới việc duy trì màu xanh của rau. Khi muối dƣa, bắp cải đƣợc xắt thành những miếng nhỏ và đƣợc để trong

thùng kín với áp suất thấp, cho thêm acid trƣớc khi loại không khí để giảm mạnh pH của sản phẩm. Trong quá trình lên men, ta phải tạo những điều kiện thích hợp cho sự lên men nhƣng điều này cũng gây mất màu diệp lục. Ở quá trình chế biến dầu oliu, pH thay đổi khá chậm, nguyên nhân chính làm mất màu chlorophyll là sự biến đổi thành chlorophyllide và sau đó là pheophorbide. Sự chuyển hóa chlorophyll thành pheophorbide là do tác dụng của pH chua, tức môi trƣờng acid. Sự biến đổi chlorophyllide và chlorophyll là do hoạt động của chlorophyllase. Nếu trong hỗn hợp trộn có chứa các axit ƣa nƣớc nhƣ acid citric, malic, acid acetic,… sẽ giữ màu xanh của rau tốt hơn những hỗn hợp chứa axit kò nƣớc nhƣ acid benzoic vì acid kị nƣớc có thể khuếch tán qua màng lipid của lục lạp và phân ly H+ trong tế bào. 2.6.8. ự

ng lạnh

Đông lạnh là một trong những phƣơng pháp quan trọng để giữ chất lƣợng rau quả trong thời gian bảo quản dài. Hầu hết rau quả đƣợc tẩy trƣớc khi đông lạnh đê ngăn chặn sự mất màu do enzym và sự phát triển của khí thối. Tuy nhiên một số loại nhƣ cà rốt thì không. Những yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng đông lạnh là: nhiệt độ, thời gian bảo quản và sự thay đổi nhiệt độ trong kho thời gian bảo qủan tăng khi nhiệt độ đông lạnh tối thiểu là -25 đến -400C . Sự mất màu của các chất màu thực phẩm liên quan đến nhiệt độ bảo quản, loại rau quá đƣợc xử lý, những bƣớc chuẩn bị cần thiết của ngũ cốc, ƣu tiên cho tẩy và đông lạnh. Buckle và Edwards (1970), theo dõi quá trình mất màu của chlorophyll của đậu đƣợc tẩy và bảo quản ở -90C trong N2 suốt 20 tháng. (Hình 2.9).

Lƣợng chlorophyll giảm; chlorophyllide, pheophytin, pheophorbide tăng. Tuy nhiên sự tăng này không giải thích đƣợc lƣợng bị mất đi. Nguyên nhân là do hoạt động của các enzym chlorophilase, oeroxidase, lipoxygenase.

Hình 2.9: uá trình mất màu của Chlorophyll của đ u được t y và bảo quản ở -90C trong N2 suốt 20 tháng 2.7. Các phương pháp xác định chlorophyll từ rau quả 17. Có 4 phƣơng pháp chủ yếu để xác định hàm lƣợng chlorophyll. + Phƣơng pháp trắc quang. + Phƣơng pháp huỳnh quang. + Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng ( HPLC). + Phƣơng pháp điện hóa. Phƣơng pháp huỳnh quang có độ nhạy cao hơn phƣơng pháp trắc quang, do đó đối với các mẫu có hàm lƣợng chlorophyll nhỏ, phƣơng pháp huỳnh quang sẽ ƣu tiên đƣợc sử dụng. Phƣơng pháp HPLC với thiết bị phức tạp hơn nhƣng vẫn dựa trên nguyên tắc của phƣơng pháp huỳnh quang và trắc quang.

Phƣơng pháp điện hóa xác định chlorophyll bằng cực phổ tuần hoàn trực tiếp thông qua điện cực màng carbon thu đƣợc mũi đơn thuận nghịch oxy hóa tại cực dƣơng ở EV = +400 mV, điện cực so sánh là Ag/AgCl. Trong quá trình nghiên cứu, thƣờng sử sụng phƣơng pháp huỳnh quang và trắc quang để xác định lƣợng chlorophyll. 2.7.1 Ph ơng ph p huỳnh quang 2.7.1.1. Phương pháp đo trực tiếp Phƣơng pháp này cho phép xác định chlorophyll trong phiêu sinh vật mà không cần chiết hay xử lí hóa học. Phƣơng pháp đo huỳnh quang trực tiếp này có thể thực hiện theo 2 cách: - Đo trên dòng chảy liên tục áp dụng cho giám sát môi trƣờng. - Đo trên mẫu nƣớc riêng lẻ tại hiện trƣờng hoặc phòng thí nghiệm. Thiết bị cho phƣơng pháp đo trực tiếp này là máy đo huỳnh quang hiện trƣờng 10-AU hay máy huỳnh quang cho phòng thí nghiệm DT-700. 2.7.1.2. Phương pháp ngâm chiết (gián tiếp) Các phép đo huỳnh quang trong dung môi ngâm chiết từ các tế bào bị phá vỡ thƣờng đƣợc dùng để xác định lƣợng tuyệt đối của chlorophyll hiện diện và lƣợng sản phẩm chlorophyll bị phân hủy pheophytin. Trong quá trình chiết tách để xác định chlorophyll bằng phƣơng pháp ngâm chiết thƣờng dùng các loại dung môi sau: acetone, ethanol, methanol và DMSO (Dimethyl sulfoxide). Cho dù dùng bất kì dung môi nào thì chlorophyll đều không

ổn định khi có mặt acid và ánh sáng. Lƣợng vết acid sẽ làm

cho

chlorophyll chuyển thành pheophitin tƣơng ứng. Vì vậy, dụng cụ phải đƣợc trung hòa đảm bảo không có acid. Ánh sáng mặt trời hay ánh sáng huỳnh quang sẽ làm chlorophyll phân hủy rất nhanh. Do đó cần tiến hành thí nghiệm ở ánh sáng dịu và dụng cụ chứa cản sáng. Nên nghiền mẫu trƣớc khi chiết bởi vì đã có nghiên cứu cho thấy rằng nghiền mẫu trƣớc khi chiết sẽ làm tăng lƣợng chlorophyll tách

đƣợc từ 5 – 60%. Một số thử nghiệm sử dụng dung môi DMSO thì không cần nghiền. 2.7.2. Ph ơng ph p trắc quang Nguyên tắc: các dạng chlorophyll a, b, c, d có thể ngâm chiết bằng các dung môi acetone, ethanol, methanol và DMSO. Mỗi loại chlorophyll có một phổ hấp thu ánh sáng đặc trƣng với peak hấp thu riêng. Phần ngâm chiết trong các dung môi đƣợc phân tích trên máy so màu tƣơng ứng với các peak đó. Phép xác định chlorophyll bằng phƣơng pháp trắc quang bao gồm các quá trình: phá vỡ tế bào và ngâm chiết chlorophyll, sau đó đo độ hấp thụ ở các bƣớc sóng.  Ƣu nhƣợc điểm trong việc xác định chlorophyll a bằng phƣơng pháp trắc quang và huỳnh quang: - Độ nhạy: phƣơng pháp huỳnh quang có độ nhạy lớn hơn 1000 lần. Xử lí mẫu cho phƣơng pháp huỳnh quang dùng kĩ thuật ngâm chiết tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp trắc quang nhƣng có độ nhạy cao hơn và lƣợng mẫu sử dụng ít hơn. - Tốc độ: phƣơng pháp trắc quang phải đo mẫu ở một vài bƣớc sóng, trong khi phƣơng pháp huỳnh quang chỉ cần đo ở một bƣớc sóng. - Chọn bƣớc sóng đo: với máy huỳnh quang kết quả đo không phụ thuộc vào việc chọn bƣớc sóng. - Cuvet: phƣơng pháp huỳnh quang không phụ thuộc quá nhiều vào vị trí cũng nhƣ sự tƣơng thích của cuvet. 2.7.3. Một số loại dung m i chi t chlorophyll  Acetone Dung môi acetone đƣợc sử dụng rộng rãi trong cả hai phƣơng pháp trắc quang và huỳnh quang. Đối với phƣơng pháp trắc quang cần ly tâm để loại bỏ ảnh hƣởng của độ đục của dung dịch, nhƣng với phƣơng pháp huỳnh quang thì có thể bỏ qua vì kĩ thuật này không nhạy với độ đục ở mức độ bình thƣờng. Nếu mẫu

trắng (blank) có giá trị đo huỳnh quang cao hoặc không thể xét giá trị bằng 0 cho máy huỳnh quang bằng một dung môi acetone trắng, thì có nghĩa là acetone đã bị nhiễm bẩn. Sự nhiễm bẩn thông thƣờng là do sự sánh dầu từ quá trình chế tạo các bình chứa kim loại.  Methanol Methanol có hiệu quả hơn acetone trong một vài trƣờng hợp. Phƣơng pháp này có thể đo huỳnh quang trực tiếp khi không cần độ chính xác cao và hàm lƣợng pheophytin thấp. Khi cần độ chính xác cao hơn và pheophytin có mặt với lƣợng đáng kể, dịch chiết methanol đƣợc làm khô và chuyển sang acetone 90%. Phổ pheophitin a và b khá nhạy với pH của môi trƣờng trong dung môi methanol nhƣng không nhạy trong dung môi acetone 90% nên xác định đƣợc lƣợng chlorophyll chuẩn xác hơn trong phƣơng pháp trắc quang cũng nhƣ phƣơng pháp đo huỳnh quang.  DMSO (dimethyl sunfoxide) Dung môi này có hiệu quả khi ngâm chiết các loại tảo nâu, một loại tảo khó có thể tách chiết chlorophyll bởi các dung môi khác. Dung môi này cho phép ngâm chiết hầu nhƣ hoàn toàn các loại tảo, chúng không để lại một chút sắc tố nào trong bã thải. DMSO có khả năng phá vỡ các thể hạt bên trong và cấu trúc màng của tảo nâu và tảo lam.  Ethanol Ethanol đƣợc xem là một trong những dung môi chiết tách tốt, sử dụng để đánh giá chlorophyll trong sinh khối vi tảo. Ngoài ra ethanol còn có hiệu quả trong quá trình chiết tách và định lƣợng các sắc tố từ các tế bào tự dƣỡng hơn so với acetone. 2.8. Các phương pháp tách chiết chlorophyll 2.8.1. Cơ sở lý thuy t của ph ơng ph p t ch chi t chlorophyll 13, 17.

Do nhân Mg trong vòng pyron mang tính tan trong nƣớc và kết hợp với protein màng, trong khi đó đuôi dài cacbon của gốc rƣợu phytol lại mang tính kị nƣớc và hƣớng tới cấu trúc lipid của màng tilacoit, nên phân tử chlorophyll chủ yếu hòa tan trong các dung môi hữu cơ. Tuy nhiên để tách tốt chlorophyll ra khỏi lá, ngƣời ta không dùng ether petrol hay benzen mà dùng cồn hoặc acetone pha với một ít nƣớc để tách đƣợc hết phân tử chlorophyll từ lá. Các sắc tố thuộc nhóm carotenoit cũng đƣợc chiết tách theo phƣơng pháp này. Chlorophyll tách rời khỏi phức hệ sắc tố vẫn có khả năng hoạt động quang hóa, tức là vẫn có khả năng bị kích thích bởi ánh sáng và khi đó có thể làm đƣợc vai trò chuyển H+ và e trung gian. Hiện tƣợng này gọi là tính chất cảm quang của chlorophyll. 2.8.2. Quy tr nh t ch chi t Chlorophyll [10] Chlorophyll dùng làm phẩm màu phụ gia thực phẩm thƣờng ở dạng: Magiê chlorophyll hoặc Magiê phaeophytin. Thu đƣợc bằng cách chiết cỏ, cỏ linh lăng, tầm ma và các nguyên liệu thực vật khác với dung môi phù hợp nhƣ: aceton, dicloromethan, methanol, ethanol, propan-2-ol và hexan... Sau đó loại dung môi thu đƣợc sản phẩm gồm thành phần màu chính là các phaeophytin và magiê chlorophyll. Sản phẩm sau khi chiết và loại dung môi chứa các chất màu khác nhƣ carotenoid, sáp và chất béo có nguồn gốc từ nguyên liệu. Để thu đƣợc chất màu tinh khiết hơn ngƣời ta có thể sử dụng phƣơng pháp kết tinh lại [11].

Hình 2.10. Rong mứt

Quá trình tách chiết chlorophyll từ Rong Mứt (Porphyra.sp) với hệ dung môi (ethanol, methanol, aceton) đƣợc tiến hành nhƣ sau: Rong khô

Ngâm lần 1

Ngâm lần 2

Ngâm lần 3

Làm ráo nƣớc CaCO3 (250-750 mg) Xay (5 phút) Acetone, methanol,

Hòa trộn

ethanol Ủ (40C/ 16-24h)

Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút

Cô đặc

Dịch chlorophyll

Hình 2.11. Sơ đồ tách chiết chlorophyll từ rong mứt

- Cho 3g rong khô đƣợc ngâm với 1000 ml nƣớc cất (D.W) để loại bỏ sắc tố phycoerythrin và các tạp chất tan trong nƣớc khác. Sau mỗi 1 giờ, rong đƣợc vớt ra và cho vào 1000 ml D.W mới. Công đoạn này đƣợc tiến hành 3 lần liên tiếp nhau. - Sau đó, rong đƣợc vớt ra và để ráo nƣớc hoàn toàn. - Tiếp theo, rong đƣợc cho vào máy xay cùng với một lƣợng D.W xác định (nhiệt độ 4 – 100C) và đƣợc xay trong 5 phút. CaCO3 đƣợc bổ sung trƣớc khi xay với lƣợng xác định (250 – 750 mg). - Sau đó, dịch xay đƣợc đổ ra 1 cốc thủy tinh và đƣợc bổ sung dung môi (acetone, methanol, ethanol) sao cho nồng độ dung môi sau cùng đạt tỉ lệ phần trăm xác định (70 – 90%) và thể tích cuối cùng đạt 100 ml. Cốc thủy tinh đƣợc bọc kín và đƣợc giữ trong điều kiện tối ở nhiệt độ 40C và thời gian thích hợp (16 – 24 giờ). - Dịch thu đƣợc sau khi chiết đƣợc đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch trong đƣợc thu hồi để cô đặc để tạo thành chlorophyll dạng cao. Nếu sản phẩm yêu cầu độ tinh khiết cao hơn cóa thể dùng phƣơng pháp sắc ký cột hoặc kết tinh. 2.9. Một số ứng dụng của chlorophyll vào trong thực phẩm 2.9.1 Trong c ng nghiệp thực phẩm[11] Trong thực phẩm Chlorophyll cũng là một chất màu thực phẩm (E140), đƣợc sử dụng để bổ sung trong một số sản phẩm bánh kẹo, súp, sốt, các sản phẩm trái cây, nƣớc chấm, mứt, nƣớc giải khát hoặc dầu thực vật để tăng giá trị cảm quan. Chlorophyll và các dẫn xuất của nó đƣợc biết đến là các chất có hoạt động chống oxy hóa. Viêc tiêu thụ các loại rau lá, giàu chlorophyll và các dẫn xuất của nó nhƣ chlorophyllin, có liên quan đến việc giảm một số loại bệnh ung thƣ. Vì vậy việc áp dụng một chế độ giàu chlorophyll có thể giúp trì hoãn hoặc ngăn ngừa sự khởi đầu của một số bệnh nhƣ ung thƣ, đó là các biểu hiện lão hóa đƣợc gây ra bởi

các gốc tự do.Các ngiên cứu đã chỉ ra rằng các dẫn xuất của chlorophyll có hoạt tính chống oxy hóa ít nhất là nhƣ vitamin C. Chúng ức chế quá trình hydroperoxide từ sự oxy hóa acid linoleic và bảo vệ ty thể khỏi sự tấn công của các gốc tự do và các loại phản ứng oxy hóa khác.Theo đó, các dẫn xuất của chlorophyll a đã cho thấy là có khả năng bắt gốc tự do hiệu quả hơn các dẫn xuất từ chlorophyll b. Hơn nữa, các dẫn xuất

kim loại tự do của chlorophyll nhƣ chlorin, pheophytin,

pyropheophytin cho thấy có khả năng chống oxy hóa thấp hơn các dẫn xuất kim loại

nhƣ

Mg-chlorophyll,

Zn-pheophytins,

Zn-pyropheophytins

và

Cu-

chlorophyllins. 2.9.2. Một số ứng dụng h c 2.9.2.1. Trong Y học [12] Trong y học, chlorophyll đƣợc xem nhƣ một thành phần cơ bản cho khẩu phần ăn kiêng để chữa bệnh. Chlorophyllin dẫn xuất kim loại của chlorophyll, có tiềm năng phòng chống các chất gây ung thƣ từ thức ăn bị thiu mốc nhƣ hydrocarbon mạch vòng, aflatoxin. Chlorophyll và các dẫn xuất còn đƣợc sử dụng nhƣ là chất cảm thụ ánh sáng để diệt các tế bào ung thƣ và chống virus, chất kháng bổ thể, chất chữa vết thƣơng và khử mùi hôi. Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã bị hƣ hại và bảo vệ con ngƣời khỏi các chất gây ung thƣ. Chlorophyll còn giúp cho tiêu hóa tốt và làm cho da thêm đẹp. Chlorophyll còn làm tăng chức năng của tim, hệ huyết quản, phổi và các chức năng của phụ nữ. Chlorophyll đƣợc dùng tốt trong các trƣờng hợp thiếu máu, huyết áp không bình thƣờng có nguy cơ dẫn đến xơ vữa động mạch. Nó kích thích các trạng thái nhu động: hoàn thiện hệ thống ruột non, giảm hàm lƣợng ure – nhƣ là một thuốc lợi tiểu.

2.9.2.2. Trong công nghiệp tiêu dùng [15] Chlorophyll đƣợc bổ sung trong kem đánh răng (chống hôi miệng, chống sâu răng), xà phòng (kháng nấm, kháng khuẩn), nhuộm màu nƣớc hoa, mỹ phẩm...

PHẦN 3 KẾT LUẬN Màu sắc là chỉ tiêu bắt buộc và rất quan trọng khi đánh giá chất lƣợng của bất kỳ một sản phẩm thực phẩm nào. Một sản phẩm có màu sắc đẹp sẽ góp phần lôi kéo sự chú ý của khách hàng. Màu sắc của sản phẩm trƣớc hết phản ánh nguồn gốc của nguyên liệu hay nói cách khác nó có sẵn trong bản thân của nguyên liệu thực vật, động vật. Khi đánh giá chất lƣợng của các loại thực phẩm này ngƣời ta căn cứ vào màu sắc tự nhiên của nguyên liệu để xem xét chất lƣợng của sản phẩm. Tuy nhiên, nhóm chất màu này rất không bền, dễ bị biến đổi dƣới tác động của các điều kiện khác nhau nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, pH, oxy không khí... Vì vậy, trong quá trình sản xuất và bảo quản thực phẩm, ngƣời ta luôn tìm mọi cách để bảo tồn lƣợng chất màu tự nhiên vốn có của nguyên liệu. Qua quá trình nghiên cứu đã giúp em hiểu rõ hơn về chất màu chlorophyll, về tính chất, đặc điểm, ứng dụng và những biến đổi của nó trong các sản phẩm thực phẩm. Từ đó rút ra đƣợc các biện pháp làm giảm sự biến đổi của nó chế biến đúng kỹ thuật và phù hợp để giữ màu sắc đặc trƣng của sản phẩm. Cũng nhờ quá trình tìm hiểu mà em đã có thêm nhiều kinh nghiệm về viết bài và dịch thuật hơn, kỹ năng tìm, đọc, và chắt lọc tài liệu. Qua đây cho em đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô đã giúp đỡ hƣớng dẫn cho em, đặc biệt cho em gửi lời cảm ơn cô Nguyễn Thị Diễm Hƣơng, là giáo viên hƣớng dẫn đã nhiệt tình hƣớng dẫn em để hoàn thành tốt đồ án này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt [1] Đỗ Thị Bích Thủy, Bài giảng hóa sinh thực phẩm1, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Huế, 2011. [2]. Nguyễn Duy Thịnh, Bài giảng phụ gia thực ph m, Đại học Bách khoa Hà Nội, 2009. [3]. Nguyễn Chí Linh, Bài giảng phụ gia trong sản xuất thực ph m, Trƣờng Cao đẳng cộng đồng Kiên Giang, 2007. [4]. Nguyễn Thùy Linh và Lê Phạm Công Hoang, Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tách chiết chlorophyll từ rong mứt (Porphyra sp.), Khoa Thủy sản, trƣờng Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. [5]. Trƣơng Thị Mỹ Linh, Phụ gia trong chế biến thực ph m, Đại học Công nghệ Sài Gòn, 2010. [6]. uy chu n kỹ thu t quốc gia về phụ gia thực ph m – ph m màu, QCVN 410:2010/BYT.

Tiếng Anh [7]. Yuan-Kun Lee, Hee-Peng KHNG, Natural color additives, Nation University of Singapore [8]. Douglas B. MacDougall, Colour in food, woodhead publishing limited, Cambridge England. [9]. Delépine, Marcel, (September 1951), Joseph Pelletier and Joseph Caventou, Journal of Chemical Education, 28 (9), 454. [10]. Fleming Ian, (14 October 1967), Absolute Configuration and the Structure of Chlorophyll, nature 216 (5111), 151–152.

Trang Web [11].http://fof.hcmuaf.edu.vn/data/file/58_%20NT%20Linh-DHNLzTach%20chiet%20chlorophyll.pdf]. [12]. http://www.lifecare.com.vn/news.aspx?tab0=3&tab1=4&id=15 [13].http://doan.edu.vn/do-an/luan-van-nghien-cuu-xac-dinh-chlorophyll-a-bang phuong-phap-huynh-quang-ung-dung-cho-phan-tich-mau-nuoc-mat-va-so-sanh5624. [14].http://tai-lieu.com/tai-lieu/de-tai-chlorophyll-va-nhung-bien-doi-trong-chebien-va-bao-quan-thuc-pham-7554/ [15].http://www.docs.vn/vi/sinh-hoc-38/27404-san-xuat-chat-mau-tu-phelieu.html) [16].http://123doc.vn/document/41518-nhung-sac-to-quang-hop-cau-truc-vaquang-pho-hoc.htm [17].

http://www.kilobooks.com/showthread.php?t=319480-Nghiên-cứu-chiết-

xuất-dịch-chlorophyll-chống-oxy-hóa-từ-lbắp?referrerid=388746