INTRODUCCION A LA ESTIMACION DE INCERTIDUMBRE Y CURVAS DE CALIBRACIÓN EN LOS MÉTODOS ANALÍTICOS Prof. Marcial Pérez
PROCESO DE MEDIDA QUIMICO (PMQ) “Conjunto de etapas sistematizadas que van a permitir resolver un problema analítico” Muestreo, pesaje, digestión, etc.
X U Los métodos analíticos son establecidos por instituciones nacionales o internacionales que proporcionan procedimientos y características del método y que concluyen con indicadores indicadores de calidad (denominados características características del desempeño analítico) que suelen incluir: exactitud, precisión, especificidad, además de los parámetros que se determinan
PROCESO DE MEDIDA QUIMICO (PMQ) “Conjunto de etapas sistematizadas que van a permitir resolver un problema analítico” Muestreo, pesaje, digestión, etc.
X U Los métodos analíticos son establecidos por instituciones nacionales o internacionales que proporcionan procedimientos y características del método y que concluyen con indicadores indicadores de calidad (denominados características características del desempeño analítico) que suelen incluir: exactitud, precisión, especificidad, además de los parámetros que se determinan
Conocimientos previos Antes de empezar empezar el tema, es necesario necesario recordar a los alumnos que deben manejar los siguientes términos: Exactitud, precisión, error aleatorio, error sistemático, población, muestra, media de la población (m), desviación estándar de la población (s), varianza de la población (s2), media de la muestra ( x ), desviación estándar de la muestra (s), varianza de la muestra (s2), distribución normal de error y ANOVA. La información sobre estos términos puede p uede encontrarse encontrarse en: a) D.A. Sk Skoog, J.J. Leary Leary,, Análisis Análisis Instrumen Instrumental, tal, 4ta. 4ta. Edición, Edición, Apéndic Apéndicee 1. b) Paginas web: http://www.iupac.org/ http://www.iupac.org/;; http://www.cenam.mx/default.aspx
CONTROL DE CALIDAD EN MÉTODOS ANALÍTICOS 1. Trazabilidad metrológica
Propiedad de una medición, física o química, por de medio de la cual el resultado puede ser relacionado con una referencia establecida mediante una cadena ininterrumpida y documentada de comparaciones.
Una cadena de trazabilidad metrológica, se define como una sucesión de patrones y calibraciones que relacionan un resultado de medida con una referencia.
En métodos de análisis químicos, la trazabilidad se consigue trazando globalmente los resultados obtenidos en el procedimiento analítico a un valor de referencia y evaluar si los resultados obtenidos con dicho procedimiento son comparables a los de la referencia utilizada.
2. ¿Qué es la validación del método de ensayo? La Norma COVENIN-ISO 9000:2000 define a la validación como: “La confirmación por examen y el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos particulares para una utilización o aplicación específica prevista”.
La validación de un método de ensayo es un requisito primordial cuando deseamos obtener resultados técnicamente válidos, exactos y confiables. La validación del método es necesaria ya que permite conocer los parámetros de desempeño del método y proporcionar un alto grado de confianza y seguridad en el método y en los resultados que se obtienen al aplicarlo.
2. Incertidumbre de una medida
X ± U
Parámetro asociado con el resultado de una medición que caracteriza la dispersión de los resultados de los valores que pueden ser razonablemente atribuidos a una particular propiedad sujeta a medición denominada “mensurando”.
En la practica, la incertidumbre puede provenir de diversas fuentes incluyendo por ejemplo:
El muestreo, los efectos de la matriz e interferentes, las condiciones ambientales, la incertidumbre procedente de la balanzas y el material volumétrico, los patrones de referencia, el método o procedimiento utilizado, etc.
Las incertidumbres se pueden clasificar en:
a) Incertidumbre tipo A; son las que se pueden determinar exclusivamente a partir del análisis estadístico de un conjunto de observaciones individuales. Por ejemplo: Estudios de repetibilidad y/o reproducibilidad. Las incertidumbres de tipo A se determinan a partir de cualquier método matemático válido para analizar datos estadísticos. b) Incertidumbre tipo B; son aquellas en la que influyen factores diferentes a los puramente estadísticos y que usualmente no pueden ser modificadas por el operador, como por ejemplo:
Especificaciones del fabricante del instrumento o calibración previa. Incertidumbres de los patrones tomadas como referencia en los manuales o en los certificados del buró de estándares. Experiencias previas acerca del comportamiento de los instrumentos.
Incertidumbre estándar combinada:
Para estimar la incertidumbre total, es necesario considerar todas las fuentes de incertidumbre que pueden ser significativas y obtener la contribución individual de cada una de ellas (denominada incertidumbre del componente).
Las contribuciones deben ser expresadas como desviaciones estándar y combinadas de acuerdo a las reglas apropiadas para dar la incertidumbre estándar combinada.
Debido a que la incertidumbre de cada componente se expresa como una desviación estándar las mismas deben llamarse ´´Incertidumbre estándar del componente´´.
Uc
Diagrama de causa - efecto utilizado como ejemplo para determinar la incertidumbre estándar combinada total de un método analítico.
¿Y ahora como calculo la incertidumbre de una medición analítica?
Debido al elevado numero de fuentes de error presentes en un procedimiento analítico, no es fácil el cálculo de la incertidumbre; por esta razón se han propuesto diversas metodologías para determinar la misma.
I. Metodologías basadas en el cálculo de la incertidumbre de forma global. Es decir, agrupando términos de incertidumbres cuando esto sea posible. Este tipo de metodologías se conoce como aproximación top – down.
II. Metodologías basadas en la utilización de la información histórica de la que ya dispone el laboratorio, ya sea provenientes de la validación del método (estudios de precisión), de gráficos de control o de los resultados de la participación en pruebas interlaboratorios. Este tipo de metodologías se conoce como aproximación ISO o bottom – up.
Calculo de la Incertidumbre tipo A Repetibilidad: Es el resultado de mediciones del mismo mensurando realizadas en iguales condiciones de medida. Es sinónimo de precisión. Las condiciones de repetibilidad son:
El mismo procedimiento de medición. El mismo operador. El mismo instrumento, usado bajo las mismas condiciones. El mismo lugar de realización. Repeticiones realizadas en intervalos de tiempo cortos.
Reproducibilidad: Resultados de mediciones del mismo mensurando realizadas en diferentes condiciones de medida. Estas condiciones pueden incluir diferencias en:
Principios de medición Métodos de medición Analistas Instrumento de medida Estándar de referencia Lugar Condiciones de
La reproducibilidad y la repetibilidad son dos medidas de precisión.
PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO PARA ESTIMAR LA INCERTIDUMBRE
Calculo de la Incertidumbre total
Diagrama de flujo del procedimiento simplificado para estimar la incertidumbre.
PROCEDIMIENTO 1. Escribir la expresión matemática de la magnitud (y) que se mide
2. Considerar las causas de las incertidumbres
3. Identificar las diferentes fuentes de incertidumbre y analizar su influencia en el mensurando. Para efectuar esta identificación sirve de ayuda dibujar un diagrama causa efecto en el cual se deberán considerar las incertidumbres debidas a las magnitudes primitivas (incertidumbre tipo B) y la repetibilidad y/o reproducibilidad (incertidumbre tipo A). Este paso del procedimiento implica la búsqueda de información relevante como: manuales de los equipos (limites de exactitud, certificados de calibración, etc.), datos de fabricantes (tolerancias), datos existentes en el laboratorio (gráficos de control de calidad, validaciones, etc.).
Calibración
Pesaje de la muestra
Volumen
Dilución de las muestras
Diagrama de causa y efecto de las variables involucradas en la técnica de EAA.
4. Medir o estimar la incertidumbre individual del componente asociado a cada una de las potenciales fuentes de incertidumbre consideradas. Por ejemplo: En el caso de una simple pesada es necesario incluir cualquier incertidumbre proveniente de la linealidad de la balanza y de su reproducibilidad. Si el parámetro a considerar requiere dos mediciones (por ejemplo, para conocer la masa de un solido se necesita tarar y pesar) se deberá conocer la incertidumbre combinada del parámetro considerando la incertidumbre del instrumento o material. La formula para el cálculo de la incertidumbre combinada de la masa es:
5. Estimar la incertidumbre total evaluando el efecto combinado de todos los componentes, llamada “incertidumbre combinada estándar”.
Propagación del error en los cálculos aritméticos
NOTA: Cabe señalar que el curso de Laboratorio Instrumental se pretende únicamente introducir conceptos básicos y simplificados de como abordar el tema de cálculo de incertidumbre; un tratamiento mas formal requiere un curso completo que deberá ser tomado como materia optativa.
CURVAS DE CALIBRACIÓN Los resultados de un análisis químico, pueden verse afectados por la presencia de efectos de la matriz ó por errores inherentes al método. En estos casos, se requiere la utilización de métodos de calibración que permitan minimizar y/o eliminar estos inconvenientes.
La calibración se define como un procedimiento analítico muy utilizado en análisis cuantitativo y que implica la construcción de una “curva de calibración.
Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en función de la concentración de un estándar o patrón.
Patrón Primario
Secundarios
Los estándares químicos o patrones usados para la calibración de una metodología de un análisis químico son en general, sustancias puras, mezclas, disoluciones, gases, aleaciones, etc.
Cómo realizar una buena medida? •
Es reproducible?
Precisión
•
Cómo conseguir el valor aceptado como verdadero?
Exactitud
Cual es la cantidad más pequeña que puede ser medida?
Sensibilidad
•
En que rango de cantidad se puede medir?
Rango Dinámico o lineal
•
Existen interferencias?-
•
Selectividad
Independientemente de la técnica instrumental responsable de la señal analítica los parámetros que se determinan a partir de las curvas de calibración obtenidas con cualquiera de ellas son:
I. II. III. IV. V.
Linealidad Sensibilidad Límite de detección Límite de cuantificación Intervalo analítico
I. Linealidad
INTERVALO DE LINEALIDAD: Es el intervalo de concentraciones donde la relación señal-concentración es lineal.
Para demostrar la linealidad se requieren cumplir ciertos criterios de aceptación en la que estadísticamente se puede justificar esa linealidad; para ello es necesario calcular:
Como criterio de aceptación de la linealidad a partir de la curva de calibración (conjunto de concentraciones que describen el intervalo en el cual se deberá cuantificar el compuesto por analizar) se considera r2>0,98
Los estándares o disoluciones patrón para construir la recta de calibrado deben ser preparadas en forma independiente, a partir de una o varias soluciones madre; el número de puntos a escoger dependerá del uso que se dé a la recta de calibrado.
Si bien con dos puntos se puede construir una curva, estadísticamente se requieren por los menos tres para que la curva sea confiable; este número se suele aplicar a métodos de rutina perfectamente establecidos y validados (proceso por el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada).
Por el contrario, si el método está en una etapa de desarrollo, el número de puntos mínimo será de cinco o seis para que la variabilidad sea mínima y el intervalo lineal sea suficiente. Hay que considerar que un aumento en el número de puntos experimentales implicara mayor fiabilidad en la recta de calibrado.
Nota: La verificación del comportamiento de un analito mediante una curva de calibración requiere un mínimo de cinco puntos para un intervalo de confianza del 95 % y de ocho puntos para uno del 99 %.
Disolución
Aforo
Muestra
Medición
Obtención de la concentración de analito en
II. Sensibilidad Se define SENSIBILIDAD (s) como la razón del cambio en la señal de salida del instrumento, S, al cambio correspondiente en el estímulo, en este caso la concentración del analito, C. La sensibilidad mide la capacidad de método para discriminar entre pequeñas diferencias en la concentración del analito. Dos factores limitan la sensibilidad: la pendiente de la curva de calibración y la precisión del sistema de medida. Por otra parte, es importante mencionar que, al igual que la linealidad, también la pendiente de la curva puede ser distinta para matrices diferentes; esto significa que la pendiente de la curva depende de todas las condiciones de medida y que éstas deben ser iguales (o al menos similares) para los estándares y la muestra problema.
III. Limites de detección (LD) Se define como la mínima concentración del analito detectable por el método. Su determinación es importante, particularmente en análisis de trazas.
Matemáticamente, se define como el cociente de tres veces la desviación estándar de la medida del blanco (b) entre la pendiente (m) de la curva de calibración.
El blanco es la señal emitida por el instrumento con una disolución que contiene las mismas especies que la muestra problema (pero sin el analito). Para fines de validación se considera que deben hacerse 10 mediciones de blancos independientes El valor de 3 σ se refiere a tres veces la desviación estándar al realizar la medición de estos blancos; cabe mencionar que la elección de estos blancos no siempre es fácil.
IV. Limites de cuantificacion (LC) Se define como la concentración más pequeña del analito que puede ser determinada con un nivel de exactitud y precisión aceptables. Dependiendo del convenio utilizado se considera como la concentración de analito que corresponde al valor del promedio del blanco mas 5, 6 o 10 veces la desviación estándar del mismo (esta última es la más común). Matemáticamente, se define como el cociente de diez veces la desviación estándar de la medida del blanco (b) entre la pendiente (m) de la curva de calibración. Es importante hacer notar que ni LD ni el LC representan niveles a los cuales sea imposible la cuantificación del analito; el significado es que el LC representa la mínima concentración del analito que puede ser determinada con un aceptable nivel de incertidumbre
V. Intervalo analítico
Está definido como el intervalo de concentración en que el analito puede ser determinado mediante la utilización de la curva de calibración; se considera que es el comprendido entre el límite de cuantificación (LC o LOQ) hasta la concentración en la cual se pierde la linealidad de la curva (LOL).
Los métodos de calibración se pueden dividir en dos tipos
Los que utilizan estándares externos a la muestra.
Los que utilizan estándares añadidos a la muestra.
Los métodos de estándar externo los patrones se analizan separadamente de la muestra desconocida y contienen distintas concentraciones conocidas del analito, junto a la matriz la cual es similar ó idéntica a la de la muestra.
Los métodos que se basan en estándares añadidos, se requiere agregar una cantidad conocida del estándar a cada muestra que se analiza.
I. Calibración sencilla ó con estándares externos
Este método de análisis se aplica en la determinación de un analito, en el cual los componentes de la matriz de la muestra como también los reactivos usados en la preparación de la misma no interfieren en el análisis. Es decir, la matriz no tiene efecto sobre la señal medida.
También se puede emplear en condiciones tales que la contribución de los interferentes, sobre las medidas se mantiene constante, con lo cual se puede realizar la oportuna corrección del error determinado por el interferente. Los estándares de calibrado seleccionados deben aproximarse tanto en la concentración del analito como en su composición de los diferentes componentes químicos, presentes en la matriz de la muestra.
La calibración externa se denomina así porque las muestras y los patrones se determinan en forma separada.
Ejemplo 1: Se tienen tres muestras de agua potable A, B y C de 10 mL cada una, en la cual se debe cuantificar la cantidad de cobre presente por absorción atómica. Para ello, la muestra es filtrada, acidificada con ácido nítrico y se diluye a un volumen final de 25 mL. Posteriormente, se mide la respuesta instrumental de cada muestra de agua. Adicionalmente, se prepara una serie de patrones de Cu en agua destilada y deionizada que también se acidifica y se mide su respuesta instrumental junto con una solución blanco (solución que no contiene analito). Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 1.
Una vez que se calibra el instrumento, utilizando los estándares y aplicando el mismo procedimiento, se miden las muestras de agua y se registran los resultados que se presentan en la tabla 2.
SOLUCIÓN: PATRONES CAL IBRACION
Tanto los resultados obtenidos de las señales medidas correspondientes a las soluciones estándares como a las muestras, deben corregirse utilizando la medida del blanco. Luego se procede a realizar el análisis estadístico de la data experimental y la gráfica correspondiente.
x
y
(Conc.) Blanco P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
(Señal) 0,001 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,39 0,45 0,41
y (Señal corregida)
X^2
Y^2
XY
Resultados del análisis de las muestras de agua en concentración**.
**Valores obtenidos AL MULTIPLICAR POR el factor de dilución, al cual se sometió inicialmente las muestras de agua.
RECUERDEN SIEMPRE, TODA MEDICIÓN TIENE ASOCIADO UN VALOR DE INCERTIDUMBRE.
? ES CORRECTO REPORTAR UN VALOR DE ESTA FORMA?
X ± U
Estimación de la Incertidumbre en la determinación de la concentración de una disolución de concentración desconocida del analito en una muestra mediante el método de la curva de calibración
i. Cálculo de incertidumbre por el método de regresión por mínimos cuadrados El calculo de la pendiente y de la ordenada en el origen se simplifican cuando se definen tres cantidades, Sxx, Syy, y Sxy
( ∑ 2 S xx = ∑ xi − x = ∑ xi − N _
2
xi )
2
yi ) ( ∑ 2 S yy = ∑ yi − y = ∑ yi − N _
2
2
_ _ ∑ xi ∑ yi Sxy = ∑ xi − x yi − y = ∑ xi yi − N
Donde: N Números de pares o puntos de la curva. S xx , Syy , es la suma de los cuadrados de las desviaciones de la media para cada uno de los valores de x y y. sy , desviación estándar residual. s x , sm , sb desviación estándar de los resultado analíticos, pendiente y de la ordenada al origen. _
_
son los valores medios para x y y.
De las expresiones S xx , Syy, S xy se puede obtener las siguientes ecuaciones:
1. La pendiente m de la recta: m=
S xy S xx
2. La ordenada en el origen, b: _
_
b = y− m x 3. La desviación estándar de la regresión, Sy: s y =
S yy − m 2 S xx N − 2
4. La desviación estándar de la pendiente, S m: 2
sm =
s y
S xx
5. La desviación estándar de la ordenada en el origen, S b: sb = s y
∑ x
2
i
N
∑
xi2 − (
∑
xi )
2
1
= sy N −
(∑
xi )
2
∑ x
2
i
6. La desviación estándar de los resultados obtenidos a partir de la curva de calibración, Sx: s x =
s y
1
m
M
+
1
N
_ _ y c − y +
2
2
m S xx
_ yc
media de un conjunto de M análisis repetidos (replicas) cuando se usa una curva de calibración de N puntos.
Los resultados para una muestra incógnita se expresan como:
donde t depende del número de muestras realizadas en la calibración y del intervalo de confianza deseado.
Valores de t para varios niveles de confianza
Distribución Normal de Probabilidad.
ii. Cálculo de incertidumbre combinada extendida
Se calcula las desviaciones estándar para cada uno de los parámetros (y, b y m), los cuales se consideran como incertidumbre individuales.
Se calcula la incertidumbre estándar combinada de los dos términos del numerador:
Valido solo para una replica
Finalmente, se calcula la incertidumbre estándar combinada total:
En el caso de usar varias replicas, hay que introducir termino de la incertidumbre estándar asociada a la repetibilidad:
2
2
srep
2
U cn sm = x K + + _ y m n x
U ct
Nota: En las ecuaciones anteriores no se han considerado las incertidumbres asociadas al material volumétrico, la pesada de reactivos y muestras, entre otras.
II. Calibración con adición de estándar
Se utiliza cuando las muestras tienen matrices difíciles
El propósito de este método es generalmente corregir efectos de interferencias multiplicativas debidas a la matriz de la muestra.
Método muy largo, ya que hay que hacer una preparación por muestra
Algunos software permiten hacer el tratamiento de datos sin tener
Ejemplo : Para la determinación de aluminio en muestras de agua de río, se utilizó el método de adición de estándar. En todos los casos se empleo un volumen de muestra de 10 mL a las cuales se les adiciono una solución patrón (S) de aluminio 0,15 mM. Por último, todas las soluciones se diluyeron a un volumen final de 25 mL, y se obtuvieron los resultados presentados en la tabla
En este caso C M es 1,21E-5 M y aplicando el factor de dilución se obtiene que CM=3,03E-5 M.
Cálculo de la concentración de analito por extrapolación
Calibración por adición de estándar
Cálculo de incertidumbre en métodos de adición de estándar MÉTODO I
MÉTODO II
K=1
Nota: Si la determinación de la muestra hubiese sido realizada n veces, con el uso de material volumétrico y una balanza , habría que introducir estos datos en el cálculo de la incertidumbre final.
III. CALIBRACIÓN CON PATRÓN INTERNO Se utiliza sobre todo para corregir posibles derivas instrumentales
OBJETIVO
Medir la señal de un analito de concentración conocida a lo largo de un análisis
Elección del patrón interno: Comportamiento lo más parecido al analito problema: • Potencial de ionización • Masa atómica
METODOLOGÍA Añadir un volumen fijo del elemento elegido como patrón interno tanto a muestras como patrones
La calibración con estándar ó patrón interno se utiliza para compensar errores aleatorios y sistemáticos como interferencias no espectrales de componentes de la matriz, fluctuaciones debidas del método y errores instrumentales . Por ejemplo: variación de la velocidad de nebulización, del tamaño de gota, fluctuaciones de las presiones gaseosas, de la viscosidad y tensión superficial. Se aplica este método en técnicas instrumentales que permitan la determinación multielemental. La aplicación de este método consiste en realizar medidas simultáneas de la respuesta del instrumento al analito y al estándar interno. El estándar interno, se añade en una cantidad conocida y constante a la muestra, y a los estándares del analito. En la gráfica de calibrado se representa la relación Señal analito/Señal de estándar interno en función de la concentración del analito en los estándares. De esta manera la respuesta del instrumento o la señal analítica es independiente, de la fluctuación debida al método de análisis. Para la muestra la relación entre la señal (Señal M) y la concentración (C M) viene dada por:
Similarmente, para el estándar interno se tiene:
Dividiendo las ecuaciones anteriores se obtiene:
Donde, f corresponde al factor de respuesta f=kM/kEI este debe ser constante en un determinado intervalo de concentración. Además, f también viene dado por el producto de la pendiente de la curva de calibrado por la concentración del patrón interno, cuando se gráfica la relación de las señales versus la concentración del estándar. Mientras que si se gráfica la relación de las señales versus la relación de las concentraciones, la pendiente es directamente el factor de respuesta. Re-escribiendo la ecuación anterior en términos de los estándares del analito (C S, SeñalS), se tiene la expresión que describe la curva de calibrado, dada por:
Se determinan las respuestas del analito y del estándar interno, y se calcula el cociente de las dos respuestas. Si se varía algún parámetro que afecte a las respuestas medidas, dichas respuestas (del analito y estándar interno) se deben afectar por igual. Por tanto, el cociente de respuestas (del analito y del estándar interno) depende solamente de la concentración de analito.
Patrones internos más utilizados: 45Sc, 69Ga, 89Y, 115In, 103Rh, 159Tb, 165Ho, 175Lu, 187Re, 209Bi
Selectividad. La selectividad de un método analítico indica el grado de ausencia de interferencias, debidas a otras especies contenidas en la matriz de la muestra
Se cuantifica mediante la obtención de la sensibilidad del método frente al analito (mA) y al interferente (m B). La señal total (S) viene dada por la expresión:
Donde, CA y CB corresponde a la concentración del analito y del interferente, respectivamente y Sbl es la señal del blanco. De esta manera se define el coeficiente de selectividad de B con respecto a A como:
El coeficiente de selectividad es una medida de la respuesta relativa del método para la especie B cuando se compara con A. Los coeficientes de selectividad son parámetros de calidad
