Cultivos Celulares
Linfocitos humanos Chamba Alexis, Hurtado Ma. Gabriela, Ramos Diana, Sauca William. ****Profesiona Profesionales les en ormaci!n ormaci!n,, Ciencias Ciencias de la Salud, Salud, "itulaci "itulaci!n !n de #io$u%mi #io$u%mica ca & armacia, armacia, 'ni(ersi 'ni(ersidad dad
")cnica Particular de o+a, San Ca&etano Alto sn C.P. -- - /01 o+a, 2cuador.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Introducción.
La mayoría de las células in vivo se encuentran interaccionando con células vecina vecinas, s, una Membra Membrana na basal basal o una una matriz matriz extra extracel celula ularr. Estas Estas célula célulass se denominan dependientes de de Anclaje y se cultivan aderidas aderidas a una super!cie "cultivo en mono capa#. $in embar%o las células ematopoyéticas y al%unos tipo tiposs de célu célula lass tumo tumora rale less se encu encuen entr tran an en micr micro o %rav %raved edad ad en los los or%anismos vivos. vivos. Estas células se denominan denominan independientes independientes de anclaje y se pueden cultivar en suspensi&n en un lí'uido nutritivo. "(ro), (, *il-Loyza%a. ++# Estos tipos de cultivos no necesitan dis%re%aci&n enzimtica, pero para poder obtener poblaciones omo%éneas omo%éneas de células se tiene 'ue recurrir a métodos de separaci&n o puri!caci&n celular. Estos métodos se pueden emplear antes, durante o después del cultivo. Al%unos de ellos son métodos )ísicos o 'uímicos y otros se denominan métodos de muerte celular selectiva por'ue seleccionan las condiciones de cultivo para la supervivencia selectiva de un tipo celular. "(ro), (, *il-Loyza%a. ++# OBJETIVO • •
Extracci&n de los lin)ocitos de la san%re. /ijar las células con metanol Comp Compar arar ar la prol proli) i)era eraci ci&n &n celu celula larr medi median ante te el cicl ciclo o celu celula larr de los los lin)ocitos por citometría de 0ujo.
•
Materiales y métodos.
1el medio ya preparado se tempero a 2+3C el medio ya suplementado, se lo coloc& coloc& cerca cerca del mecer mecero o para para evitar evitar posible posible contami contaminac naci&n i&n,, se limpi limpi& & el medi medio o y el rea rea de trab trabaj ajo o con con alco alcoo oll al 45, 45, dond donde e se ubic ubicar aron on los los materiales necesarios para trabajar, los di)erentes medios de desecos para corto punzantes, derecos biol&%icos etc. Obtención de linfocitos de la sangre
$e obtuvo 2 a 6mL san%re venosa eparinizada, posteriormente se dej& caer con suavidad la cantidad de san%re extraída sobre los 6mL de la super!cie del Tutora: Mgs. Ma. Isabel Ramírez
Cultivos Celulares percoll "medio 'ue nos permiti& separar los lin)ocitos#.$e centri)u%& a 2.6 r.p.m. durante 76minutos a una temperatura de 73C. 1espués de los 76 minutos de centri)u%aci&n se obtuvo las si%uientes )ases $uero8 color ocre suave 9anda de %l&bulos blancos8 aspecto blanco y lecoso 9anda (ercoll8 transparente 9anda de %l&bulos rojos8 sedimentados
$e reco%i& con una micropipeta la banda de %l&bulos blancos. $e re suspendi& el anillo blanco y lecoso "a'uel donde se encontraban los lin)ocitos# en 6mL de (9$ y se centri)u%o a .: r.p.m. durante minutos a una temperatura de 7;C. $e paso el pellet celular tanto de lin)ocitos en los micro tubos respectivamente. Fijación !infocitos
$e coloc& mL de la mezcla de metanol<(9$ 8 en cada microtubo 'ue contenía pellet lin)ocitario, donde se omo%enizo en el v&rtex y se centri)u%o a .: r.p.m. durante minutos a una temperatura de 7;C y se elimino el sobrenadante. =e suspendimos el pellet con mL de metanol al 45 )río en el v&rtex para disolver todos los %rumos y lo %uardamos en la re)ri%eradora por lo menos + oras antes de su lectura. TE"#E"$ %$"TE %re&aración de los linfocitos &ara su lectura en el citómetro. %arte 'O estéril #uarto d(a
Analizamos el ciclo celular Coseca8 todo en )río =etiramos de la re)ri%eradora y centri)u%amos las células suspendidas en metanol al 45 a .: rpm durante minutos a una temperatura de 7;C, posteriormente desecamos el metanol. Tutora: Mgs. Ma. Isabel Ramírez
Cultivos Celulares =esuspendimos el pellet en mL de (9$, donde esperamos 2 se%undos y centri)u%amos durante 6 minutos.=esuspendimos el pellet celular en +>L de soluci&n de tinci&n ?( ".5 "v
En el conteo inicial para constatar si ubo proli)eraci&n de lin)ocitos, antes de la lectura en citometria de 0ujo contamos en la cmara de neubauer8
En el primer cuadrante obtuvimos células, en el se%undo , en el tercero 4 y en el cuarto :. (ara calcular el nFmero de células aplicamos la si%uientes )ormulas.
Fd+ ,*ul de a-ul de tri&an,*ul de células + /**ul0,* alicuota de células Fd +1
+
N °
cel ml
32 =
4
∗2∗10000
+2*****cel0ml
El cultivo nos dio un total de D celulas antes de leer en citometria de 0ujo con un tiempo de incubaci&n menor de +7 oras a una temperatura de 243C y CG+ al 65. En el conteo por citometro de 0ujo nos dio bajo crecimiento de lin)ocitos.
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$e evidencio 'ue ubo poco crecimiento. 3iscusión
Lue%o de aber se%uido cuidadosamente los pasos para la extracci&n de lin)ocitos, tuvimos un resultado poco )avorable en la lectura del clit&metro de 0ujo en la cuanti!caci&n de los lin)ocitos, aun abiendo tenido un pellet de consideraci&n y un crecimiento inicial de células de suspensi&n de Dcel
oras.
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1e las tres %ra!cas observadas, "el control sin proli)eraci&n, la %r!ca con proli)eraci&n y la %r!ca sin proli)eraci&n# podemos discutir lo si%uiente8 en los isto%ramas del control sin proli)erar se puede observar un scatterplot ne%ro, lo 'ue representa nuestra poblaci&n de células existente, se puede observar 'ue se encuentra disminuida, es decir 'ue la poblaci&n de células es escasa, el scatterplot azul representa cual'uier otro tipo de impurezas, ya sean restos celulares, células daJados 'ue an cambiado su tamaJo y
Cultivos Celulares proli)eraci&n celular. Esto se podría con!rmar realizando un conteo manual de células en meta)ase usando un microscopio &ptico. La tercera %ra!ca correspondiente a una no proli)eraci&n, observamos en los isto%ramas 'ue el scatterplot ne%ro correspondiente a nuestras células a analizar se encuentra normal, lo 'ue nos indica 'ue si existen células en )ase *, pero también se observa una %ran cantidad de ruido, inclusive se puede interpretar 'ue existe una contaminaci&n de la muestra ya 'ue el scatterplot azul es demasiado %rande para ser solo restos celulares y células daJadas. En la curva de crecimiento celular, observamos 'ue la curva de crecimiento en )ase * se encuentra ses%ada a la iz'uierda, saliendo de los parmetros normales, inclusive el descenso celular empieza en esta misma )ase, i%ualmente se encuentra muy dentada, también se observ& 'ue casi no existen células dentro de las dems )ases, $ y *+. Al observar estos resultados determinamos 'ue las células no )ueron estimuladas para entrar en divisi&n por lo 'ue solo 'uedaron en )ase *, no se observ& la protuberancia clsica 'ue se da en la )ase *+ cuando existe un crecimiento. $#TIVI3$3E4 $nticoagulante utili-ado Función de la 6to7ematoglutinina Medio utili-ado Fluorocromo utili-ado
5e&arina $yuda a la diferenciación células bl8sticas Medio "%MI 9oduro de &ro&idio
de
/. 3ibuje y e:&li;ue cu8les son las &artes del citómetro de
Consta de cuatro componentes8 sistema de 0uidos, sistemas &ptico, electr&nico e in)ormtico.
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a# El sistema de 0uidos Constituido por el lí'uido 'ue contiene la suspensi&n celular y un 0uido m&vil 'ue rodea al lí'uido 'ue contiene la muestra. Las células son inyectadas a presi&n variable en el 0uido m&vil o lí'uido envolvente. El lí'uido envolvente es impulsado continuamente a salir por un ori!cio estreco y se mantiene a presi&n constante. 1urante el trayecto, se consi%ue 'ue las células permanezcan en el centro del caudal del lí'uido envolvente alineadas y de una en una "en)o'ue idrodinmico#.La presi&n con la 'ue se introduce la muestra en el 0uido in0uye sobre la resoluci&n de la ad'uisici&n de la muestra. b# $istema &ptico La luz, al incidir sobre las células se dispersa en dos direcciones8 orizontal y verticalmente. Esta dispersi&n proporciona in)ormaci&n relativa sobre el tamaJo de las células y la %ranulosidad. La luz incidente puede, adems, excitar una serie de 0uorocromos presentes en las células. La presencia de 0uorocromos proporciona in)ormaci&n adicional sobre las células. En principio, el cit&metro puede detectar cual'uier propiedad celular o bio'uímica 'ue se acople a un 0uorocromo. c# Emisi&n de luz "/luorescencia# Los 0uorocromos son sustancias 'ue absorben ener%ía luminosa de una determinada lon%itud de onda. Esta absorci&n de luz provoca el ascenso de electrones a niveles ener%éticos superiores. Los electrones excitados re%resan rpidamente a su estado normal emitiendo un )ot&n y desprendiendo ener%ía radiante. La ener%ía consumida en la absorci&n de luz es mayor 'ue la liberada y, por
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Cultivos Celulares lo tanto, la lon%itud de onda 'ue se desprende es mayor 'ue la 'ue se absorbe "salto de $toKes#. Ec< d# El sistema in)ormtico almacena la in)ormaci&n y permite el anlisis de los datos de manera interactiva con el operador. 1. =#u8les son las a&licaciones de la citometr(a de
?nmuno)enotipo Anlisis del ciclo celular *enes reporteros Medida de la proli)eraci&n celular Apoptosis /lujo de calcio $eJalizaci&n intracelular8 detecci&n de )os)oproteínas a nivel unicelular Ensayos Multiplexado de moléculas en disoluci&n. Gtras aplicaciones8 Nematolo%ía8 tipi!caci&n y conteo de células, reticulocitos y anlisis de medula &sea. /armacolo%ía 8estudios de cinética celular ?nmunolo%ía 8subpoblaciones de lin)ocitos ,tipaje tisular Gncolo%ía8 1ia%nostico y pronostico ,monitores de tratamientos Microbiolo%ía 8dia%nostico bacteriano y vírico ,estudios de sensibilidad a los antibi&ticos
). 3ibuje el 7istograma de sus muestras y analice su ciclo celular.
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Cultivos Celulares $e puede evidenciar en nuestro resultado 'ue no ubo replicaci&n celular, debido a 'ue no ay un pico en la zona de replicaci&n del A1B"$#, y por ende no va a ver mitosis ni divisi&n celular. En el isto%rama no se puede observar la curva del ciclo celular por'ue el nFmero de células )ue insu!ciente para poder determinar las distintas )ases del ciclo en la curva.
?. Es &osible obser@ar el crecimiento celular en el microsco&io in@ertidoA 4i0'OA ra-one su res&uesta.
El microscopio invertido es &ptimo para los cultivos o muestras se pueden colocar en di)erentes recipientes con espesores y características &pticas variables, se utilizan entonces, placas de @erasaKi, )rascos Cornin%, )rascos =oux, cajas de (etri plsticas y de vidrio, lo cual permite observar or%anismos o tejidos en cultivo sin una preparaci&n previa, se pueden adems observar %randes cultivos o muestras bajo estados muy naturales, lo cual permite disminuir las condiciones de estrés.
,. 3e acuerdo las gr86cas obser@adas en el citómetroA simule como se @er(an en el citómetro de
en *<* c. Lin)ocitos estimulados con un compuesto 'ue detienen el ciclo celular en *+
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