"Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento de la Educación"
"Universidad nacional de Piura"
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL E INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
ALUMNOS: cobeñas Rojas Alexander
Rodriguez Villacres Juan D.
DOCENTE:
Mcrblg. Cesar Torres
CURSO:
Biotecnología
TEA:
Cultivo in vitro de Papa
GRUPO: 7
INTRODUCCION
La papa (Solanum tuberosum L.) es un cultivo alimenticio de mucha importancia mundial. En la producción mundial de alimentos, la papa (315 millones de t) es solo superada por el maíz (872.39 millones de t), arroz (680 millones de t) y trigo (663 millones de t). Las papas son consumidas por más de mil millones de personas en todo el mundo. Los modos de propagación varían en función de los intereses de los productores, siendo la micro propagación una de las técnicas más empleadas con estos fines.
PRODUCCIÓN DE PLANTAS DE PAPA LIBRES DE VIRUS USANDO CULTIVO DE MERISTEMO
La disponibilidad de material inicial libre de patógenos es un pre-requisito para cualquier programa de micro propagación. Las plantas producidas por medio de cultivo de meristemos, libres de patógenos, pueden mantenerse indefinidamente por cultivo de tejidos, las cuales garantizan un constante flujo de plantas libres de enfermedades. Sin embargo, para la confirmación y mantenimiento de la identidad, tal stock in vitro necesita, regularmente, estar sujeto a pruebas, por lo menos una vez por un año.
La micro propagación es un método de cultivo de tejidos (in vitro) usado para una rápida multiplicación de plantas en medios nutritivos artificiales bajo ambiente controlado. El ambiente controlado y aséptico del laboratorio de cultivo de tejidos proporciona las condiciones óptimas para la multiplicación de plantas.
Posteriormente, el medio de cultivo, la luz y la temperatura deben ajustarse para reunir los requisitos específicos para el desarrollo de vitro plantas. La micro propagación es el área explotada más comercialmente del cultivo de tejidos vegetales, habiendo sido ampliamente usada para la producción de material vegetal de calidad en especies propagadas vegetativamente. Las ventajas más sobresalientes ofrecidas por la micro propagación son: a.) un gran números de plantas libres de patógenos causantes de enfermedades pueden ser obtenidas de una sola planta en un período corto, b.) la propagación puede llevarse a cabo en todo el año, c.) y el material de propagación puede ser acomodado en un espacio pequeño.
El cultivo de meristemos es un procedimiento en el cual las puntas de crecimiento axilar o apical (0.1-0.3 mm) se disectan y se desarrollan en plántulas en medios nutritivos artificiales bajo condiciones controladas. El cultivo de meristemos para la eliminación del virus se basa:
Esencialmente en el principio de que muchos virus son incapaces de infectar el meristemo apical/axilar de una planta en desarrollo y de que una planta libre de virus puede producirse si un pequeño pedazo de tejido meristemático (0.1- 0.3 mm) es propagado (Morel y Martin 1952). Sin embargo, a pesar del éxito del cultivo de meristemos en la eliminación de virus de plantas, todavía no está claro el por qué los meristemos apicales/axilares contienen poco o ningún virus. Algunas de las explicaciones son:
Las partículas virales se diseminan a través del sistema vascular, las cuales no se desarrollan en la región meristemática. La replicación de cromosomas durante la mitosis y el alto contenido de auxinas en el meristemo puede inhibir la multiplicación del virus vía interferencia con el metabolismo del ácido nucleico viral. y la existencia de un sistema de inactivación de virus con actividad mayor en la región apical que en otra parte.
En general, a medida que es más grande el tamaño de meristemo, mejor es su supervivencia in vitro, mientras que, a medida que es más pequeño el tamaño del meristemo, mejor la oportunidad de estar libre de virus (Wang y Hu 1980).
La presencia de primordio foliar también parece determinar la habilidad de un meristemo para desarrollarse en una plántula. Por ello, se ha sugerido que los meristemos cortados deban incluir uno o dos primordios foliares.
Por consiguiente, se prefieren a menudo los meristemos axilares sobre los meristemos apicales para propósitos de eliminación de virus. La excisión de meristemos muy pequeño requiere un alto grado de especialización y el desarrollo de plantas de estos meristemos pequeños toma tanto tiempo como cuatro a ocho meses. Es más, el porcentaje de virus liberados en mericlones regenerados es muy bajo. Como resultado, el cultivo de meristemos es principalmente combinado con termoterapia (tratamiento de temperatura alto) o quimioterapia (tratamiento con compuestos antivirales) para incrementar la probabilidad de obtener plantas libres de virus.
La replicación de muchos virus de plantas se reduce significativamente cuando la planta hospedante se desarrolla en temperaturas elevadas (Spiegel et al. 1993). También se ha sugerido que la disrupción en la producción o actividad del movimiento de la proteína viral, las cuales están involucradas en el movimiento de célula a célula del virus a través de plasmodesmos puede también jugar un papel en la efectividad de la termoterapia para la eliminación de virus (Martin y Cartero 1999).
Los mayores problemas del cultivo de meristemos son la dificultad para la disección de meristemos pequeños, baja supervivencia y tiempo largo para que se desarrollen. Para salvar estos problemas, la termoterapia de las plantas madre (stock) seguido de cortes nodales (0.1 a 0.5 mm) en medio nutritivo que contenga ribavirina se ha usado para obtener plantas libres de virus. evaluaron cortes nodales y meristemos después de combinar la termoterapia con terapia de ribavirina en 34 genotipos de papa infectados con PVS, PVX, PVY y PLRV. Ellos observaron que la terapia combinada generó como dos veces más plantas libres de virus comparado con la termoterapia. En general, el medio semisólido (0.8% agar) se usa para la propagación inicial.
El agar es el agente gelificante más frecuentemente usado para cultivos semisólidos; sin embargo, algunos laboratorios usan 0.24% de Gelrita, un polisacárido sintético, como un sustituto del agar. Las temperaturas en el rango de 22-25 °C y la intensidad luminosa relativamente alta (50-60 E/m2/s= 3000 luxes) en fotoperiodos de 16 horas son benéficos para el desarrollo de retoños axilares en la papa (Wang y Hu 1982). Las micro plantas anteriores se usan para la producción de semilla de papa por medios diversos.
El procedimiento más simple es aclimatarlas y trasplantarlas en casa sombras (casa de malla) con malla a prueba de áfidos en camas de vivero Las plantas in vitro pueden también usarse para la producción de micro tubérculos en laboratorio (Wang y Hu 1982). Para lograr la producción a escala comercial, los mini tubérculos se producen y son plantas micro propagadas libres de enfermedades bajo casas de malla especiales.
Multiplicación de mericlones en hidroponia Producción de Mini tubérculos El mini tubérculo es una fase intermedio de producción de semilla de papa entre la micropropagation de laboratorio y la multiplicación de campo. La producción convencional de mini tubérculos es en sustrato esterilizado en invernadero, pero recientemente, se han desarrollado sistemas hidropónicos y aerológicos para la producción de mini tubérculos a partir de plantas in vitro.
Además de reducir el costo de producción, estos sistemas permiten la producción durante todo el año y la adopción de normas fitosanitarias. La técnica de aeroponia es una herramienta ideal para obtener semilla pre-básica de papa. Las semillas de papa obtenidas son de excelente calidad, tamaño y peso apropiados para la siembra, además de producir tubérculos libres de virus, hongos, bacterias y nematodos. Esta técnica se inicia con vitroplantas.
Los micro tubérculos cosechados son lavados, tratados con fungicida, secados bajo oscuridad, empacados en bolsas de polietileno perforado y almacenados bajo oscuridad a 5-6 °C hasta la liberación de la dormancia.
CULTIVO DE MERISTEMOS
Técnica de cultivo que consiste en aislar asépticamente la región meristemática con 1-3 de los primordios foliares más jóvenes e implantarla en un medio de cultivo estéril, con el propósito de inducir la diferenciación de células y tejidos en plantas completas, mediante la utilización de medios de cultivos adecuados.
En multitud de especies cuyo método de propagación habitual es de tipo vegetativo e incluso en algunas cuya propagación es por semilla, se encuentran problemas de contaminación por diversos microorganismos, que los métodos tradicionales de desinfección utilizados por los propagadores y viveristas no consiguen erradicar, ni siquiera mediante tratamientos químicos agresivos, esto conlleva una serie de pérdidas económicas por pérdidas de producción, de calidad de fruto y hasta de cosechas completas. Incluso utilizando técnicas de cultivo in vitro es a veces imposible eliminar a determinados organismos patógenos, como virus, micoplasmas, bacterias y hongos endógenos, algunos de los cuales se transmiten incluso vía semillas, y ante los cuales muchas veces son ineficaces los antibióticos, bactericidas y antivíricos añadidos a los medios de cultivo.
MÉTODO DE SANEAMIENTO
La técnica de cultivo in vitro de meristemos, como método de saneamiento, se fundamenta en la distribución no uniforme de los microorganismos (virus, bacterias, micoplasmas) en los tejidos de las plantas infectadas, y su disminución progresiva hacia el ápice del tallo. Por tanto, son mayores las posibilidades que las células del meristemoapical se encuentren libres de microorganismos, a diferencia de los tejidos más organizados de las plantas.
Desde que Morel y Martin (1955) mostraron la posibilidad de regenerar clones de papa (Solanum tuberosum L), libres de virus, mediante el cultivo in vitrode meristemos, varios trabajos han confirmado la existencia de esta técnica de saneamiento, para el saneamiento de numerosas especies portadoras de enfermedades. Algunos estudios han demostrado la presencia de partículas virales en las células del meristemo ápical; sin embargo plantas obtenidas a partir del cultivo de meristemos resultaron libres de virus.
La obtención de plantas libres de patógenos, por medio del cultivo de meristemos, hace suponer que las zonas meristemáticas tienen propiedades o características especiales, en relación con el resto de los tejidos, para mantenerse libre de virus. Este hecho supone la existencia de otros factores, los cuales probablemente operan en el momento del cultivo in vitro y son responsables de la inactivación del virus en las nuevas plantas. Una interrupción temporal de la organización normal del tejido meristemático ocasiona la inhibición de la multiplicación de los virus, debido a la no-disponibilidad de enzimas claves.
Para explicar la sanidad o limpieza del meristemo se han formulado varias hipótesis, una de ellas plantea, que debido a la ausencia de tejido vascular en la proximidad del meristemo apical y que las conexiones plasmodermáticas en las células de este tejido son muy pequeñas, por tanto los microorganismos se desplazan muy lentamente hacia esta zona. Esta característica morfológica, unida a la activa multiplicación celular que allí ocurre, puede explicar la baja concentración o la ausencia de patógenos en este tejido.
Existe la hipótesis sobre la producción en las células meristemática, de sustancias inhibitorias de los microorganismos y que el efecto de las hormonas en el medio de cultivo, influyen en la inhibición de los virus mediante el cultivo de meristemos. Otra de las hipótesis se basa en la activa multiplicación celular en que se encuentra la zona meristemática, invirtiendo la totalidad de la maquinaria bioquímica celular para la formación de macromoléculas, membranas y otras estructuras de las células nuevas, dejando por tanto a los virus, parásitos obligados, en condiciones desventajosas para su propia multiplicación.
TAMAÑO DE LOS MERISTEMOS
El tamaño óptimo del meristemo es entre 0.2-1mm, pero realmente el utilizado está en dependencia de los objetivos que se persigan con propagación comercial. Si el objetivo es la obtención de plantas libres de enfermedades sistémicas es necesario, la utilización de meristemos, pero si por el contrario solamente se requiere de la multiplicación y no hay peligro de diseminación de enfermedades o se parte de plantas sanas, se pueden utilizar ápices de mayor tamaño con un mayor porcentaje de regeneración.
AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE LOS MERISTEMOS
El reconocimiento de la zona meristemática varía entre especies, por tanto, se requiere de estudios preliminares que revelen su ubicación y manipulación adecuada, con el objetivo de facilitar su extracción. Existen meristemos muy fáciles de localizar, como son los expuestos, tal es el caso de la papa; en otros cultivos pueden estar más internamente protegidos y se necesita separar mayor cantidad de pequeñas hojas, para encontrar la zona meristemática. Este es el caso de bulbos, ya sean de ajo (Allium sativum L.), cebolla (Allium cepa L.) o en el caso de tubérculos o cormelos de (Xanthosoma sp.).
La disección aséptica del meristemo es un proceso delicado y requiere de muchas horas de práctica; se realiza con el apoyo de un microscopio esterioscópico, desprendiendo los foliolos que rodean el punto de crecimiento, hasta que solo queda el ápice con algunos primordios foliares, para su posterior transferencia a medios de cultivo de establecimiento.
La eficiencia del cultivo de meristemos, como método de saneamiento a patógenos, esta determinada por los siguientes factores:
Origen y edad del explante inicial
La selección de un adecuado explante inicial determina mejores resultados en la regeneración o formación de plantas in vitro. La sección de tejido utilizada varía en dependencia de las características morfológicas de las diferentes especies, como regla general, se toman las yemas del tallo principal y de los brotes axilares de las plantas.
Las principales causas de pérdidas están dadas por la muerte de los meristemos, ocasionada por daños en el momento de la extracción, y por la formación de plantas no definidas con crecimiento en rosetas.
Tamaño del explante inicial
El tamaño de los meristemos es directamente proporcional a su regeneración y crecimiento posterior in vitro. En caña de azúcar, plátanos y bananos, a pesar de emplearse ápices meristemáticos, de mayor tamaño, la principal causa de bajos índices de establecimiento está dada por la necrosis de los tejidos, producto de la oxidación fenólica.
De forma general el riesgo de aparición de patógenos en los tejidos vegetales aumenta con el incremento del tamaño de los explantes iniciales. La ubicación de los patógenos en los tejidos es determinante en la elección del tamaño a utilizar, por ejemplo el (PLRV) es un virus confinado al floema y puede ser eliminado cuando se extraen meristemos de mayor tamaño.
CARACTERÍSTICAS GENOTÍPICAS
Existe una marcada influencia del genotipo en el éxito del cultivo de meristemos donde los porcentajes de establecimiento varían entre especies, variedades y clones. Independientemente de la influencia del origen del explante, del tamaño de los meristemos y del genotipo, la eficiencia del cultivo de meristemos como método de saneamiento, depende de las condiciones de crecimiento según los requerimientos de las diferentes especies, la habilidad del operador para efectuar dicha escisión y la utilización de medios de cultivo con adecuado balance hormonal que favorezca la regeneración de los ápices meristemáticos.
INFLUENCIA DEL MEDIO DE CULTIVO
Es importante señalar que aunque el balance hormonal utilizado está en dependencia del genotipo que se trabaje, para el éxito del empleo del cultivo de meristemos como método de saneamiento este factor debe tenerse muy en cuenta.
En el cultivo de meristemos no existe ningún medio de cultivo universal, sin embargo, los medios basales propuestos por Murashige & Skoog (1962), con algunas modificaciones en sus componentes, han sido los que con más frecuencia se han utilizado. Un balance adecuado entre auxina y citoquinina en el medio de cultivo es necesario para la formación de plantas a partir de meristemos.
Ventajas
Los meristemos son genéticamente estables y resultan el tejido idóneo para la iniciación de programas de propagación in vitro.
El cultivo de meristemos permite eliminar la contaminación de algunos virus por escape, puesto que los tejidos meristemáticos se mantienen sanos aun cuando el resto de las células están infestadas.
Este método resulta efectivo para el control de bacterias y hongos contaminantes y patógenos.
Los progresos alcanzados en su aplicación han hecho posible propagar gran número de especies de importancia económica, los resultados han sido particularmente atractivos porque se pueden obtener clones limpios de patógenos a partir de plantas sistémicamente infectadas.
LIMITACIONES
El éxito en el cultivo de meristemo es juzgado por el porcentaje de regeneración, tamaños pequeños (0.1-0.2mm) crecen lentamente disminuyendo la eficiencia del método.
La resistencia de algunos genotipos al cultivo in vitro limita su extensión a diferentes variedades y especies.
En la actualidad el cultivo de meristemos apicales constituye una alternativa en la erradicación de patógenos, aunque no siempre se logran los niveles de efectividad deseados; por esta razón es frecuentemente combinado con otros métodos de saneamiento que aumenten su eficiencia y generalización. En el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT), es frecuentemente utilizado con éxito en la multiplicación in vitro de yuca, boniato y malanga, con el objetivo de obtener explantes libres de patógenos.
Materiales Necesarios Para El Cultivo In Vitro
Medio de cultivo Murashige y Skoog (MS), agua y nutrientes macronutrientes y micronutrientes en medio minimo, hormonas de crecimiento
Tubos de ensayo.
Vasos precipitados
Cloro
Cocina eléctrica
Componentes del macronutrientes y micronutrientes
STOCk A
Pesar
KNO3
Nitrato de potasio
19 g/L
CaCl 2 2H2O
Cloruro de potasio de hidratado
1.7 g/L
KH2PO4
Fosfato de potasio monobásico
1.7g/L
NH4 NO3
Nitrato de amonio
16.5 g/L
Stock A2
10 ml
Stock A3
0.2ml
Completar a 100 ml
Stock B
Pesar
Mg O4 7H2O
Sulfato de magnesio heptahidratado
3.7gr
Completar a 100 ml con agua destilada
Stock C
Fe SO4 7H2O
Sulfato de hierro heptahidratado
0.55g
Disolver separado en 20 ml
Na2 EDTA 2 H2O
Sodium edta deshidratado
0.75g
Disolver separado en caliente 20 ml
Llevar a 100ml
Stock A2
Pesar
K I
Cloruro de potasio
0.083g
H3 BO3
Acido borico
0.62g
Mn SO4 4H2O
Sulfato de magnesio 4 H2O
1.68g
Zn So4 7 H2O
Sulfato de zinc heptahidratado
0.86g
Na MO O4 2H2O
Molibdato de sodio 2 H2O
0.025
Completar a 100 ml con H2O
Pesar y usar Stocks
CaSo4 H2O
Sulfato de cobre 5 aguas
1.5g
CaCl2 6H2O
Cloruro de cobalto hexahidratado
1.5g
Completar aa 1000ml con H2O destilada
Metodología
Fases de Cultivo
Desinfección: Preparar soluciones de cloro respectivamente de 10 ml de agua en vasos precipitados durante 1 minuto cada frasco seguidamente. Desinfectar los tubérculos (papas). Introduciendo al vaso precipitado.
Preparación del cultivo: Prepara el agar en estado líquido y agregar los macro nutrientes y micronutrientes y las hormonas de crecimiento.
Agitar y Homogenizar: Depositar el medio de cultivo en los tubos de ensayo respetivamente y esperar a que se solidifique.
Después de que se haya solidificado se toma un brote del tubérculo y con la ayuda de una pinza se coloca el brote en el tubo de ensayo a la mitad del medio de cultivo. Se hace lo mismo en los demás tubos de ensayos.
Se lleva a la luz solar.
Después de una semana se verán los resultados
Resultados de formación de órganos/ plántula completas
Elección de Planta: Desinfección de vegetal (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial para inducir el brote, se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos.
Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas.
El Raizamiento: Es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir a los brotes o embriones somáticos en plántulas completas. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contengan auxinas.
Rusticación o climatización: Es el paso de a climatización de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.
CONCLUSIONES
Para realizar un buen cultivo in vitro se debe tener en cuenta las siguientes consideraciones, la especie a propagar, el problema a eliminar y el tipo método a realizar.
El explante del meristemo más adecuado, que permitió el normal y rápido desarrollo fue la parte axilar por estar en un gran porcentaje libre de virus.
El cultivo de meristemos es el más comercial gracias a ello se obtienen micro plantas y micro tubérculos que están garantizadas ya que están libres de patógenos.
Resultados:
Los resultados que se obtuvieron fueron negativos, pues no hubo crecimi8ento del cultivo.
Discusión
Las plantas producidas por medio de cultivo de meristemos, libre de patógenos, pueden mantenerse indefinidamente por cultivo de tejidos, las cuales garantizan un constante flujo de plantas libres de enfermedades. Sin embargo, para la confirmación y mantenimiento de la identidad, tal srock in vitro necesita, regularmente, estar sujeto a pruebas, por lo menos una vez por un año.
Los mayores problemas del cultivo de meristemos son la dificultad para la diseccion de meristemos pequeños, baja supervivencia y tiempo largo para que se desarrollen. Para salvar estos problemas, la termoterapia de las plantas madre (stock) seguido de cortes nodales (0.1 a 0.5 mm) en medio nutritivo que contenga ribavirina se ha usado para obtener plantas libres de virus.
Anexos:
