Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología Biotecnología Departamento de Bioprocesos Academia de Biotecnología Biotecnología Practica 1: Uso de la micro pipeta
Profesores:
Moreno Zavala Fabiola Perez Solis Erick Emmanuel
Equipo: 1 Integrantes del equipo:
Cruz Camargo César Alonso Freitez Diez Adriana Sánchez Cid Mariana Sinisterra Sierra María Camila
México, CDMX a 21 de Agosto de 2017
INTRODUCCIÓN En biología molecular, la habilidad para medir de manera exacta, reproducible y transferir volúmenes pequeños de líquidos son críticos para obtener resultados útiles. Para los volúmenes menores de 1mL, el método más común para medir líquidos requiere el uso de un dispositivo conocido como micro pipeta. Se presenta un dibujo de dos m icro pipetas. La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas. Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente.
Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plástico, que habitualmente son estériles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las amarillas para pipetear volúmenes pequeños (por ejemplo, 10 μl), y las azules para pipetear volúmenes grandes (por ejemplo, 800 μl).
Tipos de micro pipetas Existen diversos tipos de micro pipetas, entre las que se encuentran: Micro pipetas manuales El volumen a aspirar se fija girando un botón en su parte superior que está conectado a un sistema analógico de confirmación de volumen, y automáticas, en las cuales dicho sistema es digital. Micro pipetas simples México, CDMX a 21 de Agosto de 2017
Sólo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar múltiples puntas (por ejemplo, ocho), absorbiendo el mismo volumen en todas ellas. Debemos asegurarnos que estamos usando la micro pipeta correcta para el volumen que necesita. También que la micro pipeta está realmente lista para el volumen que necesita revisando la “ventana de volumen”, y, si es necesario, cambiando el volumen mediante el “dispositivo” del
control o mando del volumen hasta que la micro pipeta corrija el volumen No se debe tratar de colocar la micro pipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micro pipeta. Toda micro pipeta utiliza puntas desechables (no se debe utilizar la pipeta sin usar la punta apropiada, hacer esto contaminará la micro pipeta y la puede dañar). No utilizar la micro pipeta con líquidos que atacan el polipropileno. No utilizar líquidos que estén emitiendo vapores. La temperatura de los líquidos debe estar entre 15 y 40 º C. Al poner la punta, asegúrese que la punta sea del tipo correcto y que esta correctamente ajustada. Generalmente para P1000 las puntas son azules, para P200 son amarillas y para P20 pueden ser amarillas o blancas.
Manejo de la micro pipeta Llenado de la pipeta Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado. Oprimir el émbolo. Cuando el émbolo se presiona sentirá un punto de resistencia. Éste es el primer “alto” o "tope". Si continúa presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia abajo, este corresponde al segundo “alto” o "tope".
Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta una profundidad de 2 a 3 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presión del émbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo abruptamente, al permitirlo causará que el líquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo volúmenes inexactos y generando contaminación de la pipeta. Una vez el émbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la micro pipeta en el líquido durante un segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final. Expulsión de la muestra Llevar la micro pipeta al envase en el cuál quiere añadir el líquido. Se apoya la punta en la pared del recipiente sin evitar la salida de la muestra. Oprima el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden gotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notará que al oprimir hasta el segundo alto se expele todo el líquido de la punta.
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Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las soluciones de alta viscosidad. Para solventes orgánicos o para soluciones conteniendo grandes cantidades de proteína (plasma y suero), es difícil sacar todo el líquido de la punta. En estos casos, es mejor pipetear una vez la solución expeliéndola y luego llevando hacia arriba el líquido a medir en un segundo tiempo. Para soluciones de alta viscosidad el llenado y la expulsión deben ser m ás lentas. Si es usada inadecuadamente, la micro pipeta transferirá volúmenes inexactos. La micro pipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos.
OBJETIVOS
Conocer las partes y el funcionamiento de las micro pipetas Adquirir destreza en la utilización de pipetas para la medición de volúmenes entre 1 y 1000 µl. Aprender a usar la micro pipeta de tamaños diversos medir su exactitud, precisión y calibración.
MATERIALES
Juego de micro pipetas Agua Glicerina o glicerol Etanol Balanza Analítica Puntas para las micro pipetas (amarillas y azules)
PROCEDIMIENTO Para cada micro pipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y la desviación estándar, para la micro pipeta de (20-200) y (50-200) se medirá 65 micro litros y 700 micro litros para la pipeta de (100-1000) , además se hará una medición de 325 micro litros con una pipeta de cualquier volumen y se repetirá, para el etanol y el glicerol se tomara el volumen de 50 y 250 micro litros para cada una y se medirá la masa con la fórmula de densidad 1. Seleccionar la micro pipeta y las puntas adecuadas. 2. Colocar el vaso de precipitados en la balanza y tarar a cero. 3. Tome el volumen de agua destilada con la micro pipeta y dispénselo en el vaso de precipitados. Registre el peso del agua añadido. 4. Repita el procedimiento tres veces para cada volumen.
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5. Repetir todo el procedimiento para glicerol y para el etanol. Calcular la masa esperada para cada volumen. Calculo de la exactitud (E%) y de la desviación estándar (S) Cálculo del volumen medio Los valores de las pesadas del control gravimétrico son sólo la masa del volumen dosificado. Para obtener el volumen real se debe efectuar un cálculo corrector. El cálculo corrector se realiza por multiplicación del valor medio de los valores de las pesadas (x) con el factor Z (mL/g que es lo mismo que µl/mg), que toma en consideración la densidad del agua, la temperatura de control y la presión atmosférica. Z es igual a 1,0032 µl/mg, referido a 21,5 ° C, 1013 mbar (hPa) y a la utilización de agua destilada o z es igual a 1,0029 µl/mg, referido a 20 5 ° C y 1013 mbar (hPa). El factor Z es igual a 1/densidad. Valores del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032)
Valor medio
Desviación Estándar
Volumen Medio
Exactitud
RESULTADOS Utilizando las pipetas proporcionadas se obtuvieron los siguientes resultados: Tabla 1 " Mediciones con agua" Equipo 1
Volumen medido (L)
Micropipeta utilizada (L)
Peso volumen medido (promedio)
Volumen obtenido (Promedio)
Desviación estándar
Error porcentual
México, CDMX a 21 de Agosto de 2017
700 65 65 32
100 – 1000 20 -200 10 – 100 100 - 1000
0.6895 g 0.0495 g 0.0463 g 0.3002 g
1.22 x 10-3 1.34 x 10-3 2.2 x 10-3 0.0106
689.5 L 49.5 L 46.3 L 300.2 L
1.5 % 23.85 % 28.77 % 7.63 %
Tabla 2 "Mediciones con glicerina y etanol" Equipo 1
Sustancia
Volumen medido (L)
Glicerina
50 250 50 250
Etanol
Peso volumen medido (promedio) 0.1899 g 0.3704 g 0.0400 g 0.0100 g
Densidad calculada
Densidad reportada
Error
3.798 g/mL 1.5 g/mL 0.8 g/mL 0.8 g/mL
1.26 g/Ml
201.42 % 19.04 % 1.39 % 1.39 %
0.789 g/Ml
Tabla 3 "Mediciones de agua, glicerol y etanol" Resultados grupales
Equipo 1 2 3 4 5 6 7
65 L s % Error 2.25 x 28.77 -3 10 0.0147 4.2563
100 L s % Error 1.22 x 1.5 -3 10 0.02145 6.75
0.0136 0.3323 1.1112 2.72 x 10-3 2.25 x 10-3
13.97 7.64 9.0909 7.69
0.02886 0.5404 0.634 0.0218
3.205 8.63 0.6864 3.11
1.38
1.0184 x 10-4
12.18
325 L s % Error 0.0106 7.63
Densidades (g/mL) Etanol Glicerina 0.8 1.5
2.76 x 10-3 0.02513 0.0014 1.2317 2.82 x 10-3 1.4225 x 10-3
1.69
0.7421
1.167
6.73 0.56 0.7545 1.33
0.724 0.7148 0.642 0.64
0.787 1.068 0.974 0.68
0.97
0.73
0.96
CONCLUSIONES Las micropipetas son instrumentos de medición de volúmenes que son muy útiles para la biotecnología molecular pero es necesario conocer su correcto uso y los cuidados necesarios para que tengan una vida útil larga, nos puedan aportar resultados confiables y minimizar los errores en el experimento debido al factor humano, el que puede producir el pipetear volúmenes pequeños y de cualquier otro instrumento que podamos estar utilizando. También es importante conocer cómo se utilizan con sustancias de distintas características como las de alta viscosidad que requieren de un mayor tiempo de espera al ser pipeteadas o los líquidos volátiles para los cuales es necesario saturar la cámara de la micropipeta antes de tomar el volumen del líquido.
México, CDMX a 21 de Agosto de 2017
