PRÁCTICA N° 1
EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL ADN INTRODUCCIÓN Los ácidos ácidos nucleicos nucleicos son macromolécu macromoléculas las de carácter carácter polinucle polinucleotídic otídico, o, encontrados en los seres vivos y que cumplen funciones muy. Importantes de almacenamiento de la información genética, participan también en la expresión de dicha información. En la naturaleza existen dos tipos de ácidos nucleicos, el acido desoxirribonucleico (DNA) y el ácido ribonucleico (RNA).
El DNA es el responsable de la transmisión de los caracteres hereditarios. El DNA esta formado por dos cadenas polinucleotidicas, enrrolladas en espiral a lo largo de un eje común. Las dos cadenas de la doble hélice corren en direcciones opuestas. El esqueleto azúcar fosfato de cada una de las cadenas se encuentra hacia el exterior de la doble hélice y las bases nitrogenadas están en el interior. Las dos cadenas están unidas por puentes de hidrógeno establecidos entre las bases, se constituyen dos puentes de hidrógeno entre los pares A-T y tres puentes de hidrógeno entre los pares G-C.
La adenina siempre se unirá a la timina y la guanina siempre se unirá con la citosina. Los puentes de hidrógeno pueden romperse por el calor y por agentes químicos, obteniéndose un DNA desnaturalizado. El aislamiento y purificación del DNA se puede realizar realizar aprovechando la longitud longitud de onda de 260 nm ya ya que las bases nitrogenadas absorben luz a esta longitud de onda.
En la siguiente figura se muestra la estructura del ADN propuesto según el modelo de Watson y Crick en 1953
1
H
OH
P O
SURCO MAYOR
A
T H
O
A
T G
G
3.4 nm
C T
P
H
P
SURCO MENOR
O
C O P
H
A H
P
O
C
G O P
H P
O
H
T
A O P
OH
H
2.0 nm FIGURA.- Modelo de la estructura del DNA según Watson y Crick
Dentro Dentro de las propiedad propiedades es fisicoquímic fisicoquímicas as de los ácidos ácidos nucleicos, nucleicos, que permiten su identificación, destacan:
• La Absor presencia cia de Bases Bases Nitroge Nitrogenad nadas as permite permiten n una Absorció ción n de luz : La presen absorción en el espectro UV con un pico máximo a 260 nm de longitud de onda.
• Propiedades Acido-básicas: En solución acuosa los grupos fosfato liberaran H+, lo cual determina un pH acido del medio y una carga negativa de los radicales fosf fosfat ato, o, los los cual cuales es dent dentro ro de la célu célula la conf confor orma man n comp comple lejo joss con con ione ioness Mg, Mg, histonas, poliaminas, etc. Las bases Nitrogenadas tienen grupos ionizables y en el caso del DNA en la doble hélice algunos de los grupos ionizable participan en la conformación de enlaces de hidrogeno entre las bases. El DNA es estable gracias a estos enlaces entre los pH 4 a 11.
• Propiedades de solubilidad: Tanto el DNA como el RNA son solubles en 2
H
OH
P O
SURCO MAYOR
A
T H
O
A
T G
G
3.4 nm
C T
P
H
P
SURCO MENOR
O
C O P
H
A H
P
O
C
G O P
H P
O
H
T
A O P
OH
H
2.0 nm FIGURA.- Modelo de la estructura del DNA según Watson y Crick
Dentro Dentro de las propiedad propiedades es fisicoquímic fisicoquímicas as de los ácidos ácidos nucleicos, nucleicos, que permiten su identificación, destacan:
• La Absor presencia cia de Bases Bases Nitroge Nitrogenad nadas as permite permiten n una Absorció ción n de luz : La presen absorción en el espectro UV con un pico máximo a 260 nm de longitud de onda.
• Propiedades Acido-básicas: En solución acuosa los grupos fosfato liberaran H+, lo cual determina un pH acido del medio y una carga negativa de los radicales fosf fosfat ato, o, los los cual cuales es dent dentro ro de la célu célula la conf confor orma man n comp comple lejo joss con con ione ioness Mg, Mg, histonas, poliaminas, etc. Las bases Nitrogenadas tienen grupos ionizables y en el caso del DNA en la doble hélice algunos de los grupos ionizable participan en la conformación de enlaces de hidrogeno entre las bases. El DNA es estable gracias a estos enlaces entre los pH 4 a 11.
• Propiedades de solubilidad: Tanto el DNA como el RNA son solubles en 2
soluciones salinas diluidas, por ejemplo cloruro de sodio 0,015M. El DNA cuando se encuentra en forma de complejos unidos a nucleoproteínas también es soluble en rangos de NaCI 1 a 2M, mientras que las proteínas se desnaturalizan a concentraciones altas de sal, lo cual permitirá la separación en el proceso de extracción de los ácidos nucleicos. Las nucleoproteínas son insolubles a 0,14M de concentración de NaCI.
El alcohol etílico precipita tanto el DNA como el RNA, en tanto que el isopropanol precipita selectivamente al DNA.
DNA tien tiene e estr estruc uctu tura ra fibr fibrila ilar, r, la dobl doble e hélic hélice e es rígi rígida da o • Viscosidad: El DNA inmensamente larga en relación a su diámetro, debido a ello las soluciones del DNA son altamente viscosas. El proceso de desnaturalización se suele observar por la perdida de viscosidad. • Desnaturalización del DNA: El proceso de desnaturalización consiste en la separación de las dos cadenas por rompimiento principalmente de los enlaces hidrogeno que unen las bases complementarias y los otros tipos de uniones que mantienen unidas a los pares de bases, dicha separación puede ser completa o parcial. Dentro de los agentes que son desnaturalizantes están pH muy acido o muy alcalino, calor, detergentes, soluciones de baja fuerza iónica, tratamiento del DNA con urea y diversas amidas, etc.
Extracción de ácidos nucleicos Dentro de los agentes extractores de las nucleoproteínas se incluyen: el agua, alcoholes diluidos, soluciones de NaCI y buffers de rango de 4 a 11 de pH. En cada caso, la extracción es seguida de precipitación por sulfato de amonio saturado, cloruro de calcio diluido, los ácidos nucleicos pueden ser obtenidos por dige digest stió ión n de las las prot proteí eína nass con con anim animas as prot proteo eolílític ticos os o por por remo remoci ción ón de las las
3
proteínas por desnaturalización. Sin embargo esta última puede alterar los ácidos nucleicos. Los iones divalentes como el Mg ++, activan a la DNasa, por tal motivo se emplea el citrato para evitar la hidrólisis enzimático y pH 8 el cual es incompatible con su actividad biológica
El SDS actúa sobre las proteínas por tanto desnaturaliza a la DNasa, actúa también sobre los lípidos disminuyendo su tensión superficial y permitiendo su solubilización.
Objetivos
1.
Obtención del DNA usando como fuente, timo de ternera
2.
Identificación del componente desoxirribosa del DNA: Reacción de Dische
3.
Desnaturalización del DNA: Observación del efecto hipercrómico
Procedimiento 1.- Aislamiento del DNA 1.1.- Los tejidos machacados, son primero lavados con NaCI 0.15M, para remover sustancias citoplasmáticas. 1.2.- Luego homogenizar 2 g aprox. de timo de ternera con 25 mi de solución salina 0.15M mas EDTA 0.1M. pH 8.0, empleando un mortero, licuadora o mixer. 1.3.- Transferir el contenido anterior a una probeta de 100 ml con tapa esmerilada y agregar 2 ml de SDS al 25%, mezclar. 1.4.- Colocar en baño María a 60 °C durante 10 minutos. 1.5.- Añadir 6,3 ml de una solución de NaCI 5M para obtener una concentración final de 1M. 1.6.- Añadir una mixtura de cloroformo-alcohol isoamilico (24:1) v/v en un volumen 4
igual al obtenido hasta la etapa anterior. 1.7.- Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos, de preferencia en una centrifuga refrigerada. 1.8.- Separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar desnaturalizar los ácidos nucleicos. 1.9.- Precipitar el DNA del sobrenadante con dos volúmenes de alcohol etílico al 95%, mezclar con varilla de vidrio, tratando de enrollar el DNA. 1.10.- Colocar la varilla de vidrio con el DNA enrollado y disolver en 10 ml de solución salina de NaCI 0,015M - citrato 0,0015M.
2.
Identificación de Desoxirribosa : Reacción de Dische
2.1.
Tomar 2 tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera :
X (Solución de DNA obtenido en la práctica) y C (Control) 2.2.
En cada tubo medir lo siguiente :
C Solución de DNA obtenido en la práctica Agua destilada Reactivo difenilamina en solución
2,0 ml 4,0 ml
X 2,0 ml
4,0 ml
ácida 2.3.
Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 10
min. 2.4.
Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de
desoxirribosa se revela por la aparición de un color azul
3.
Desnaturalización del DNA Diversos agentes externos, como el calentamiento, la disminución de la 5
constante dieléctrica del medio, pHs extremos menores de 4 y superiores de 11, reactivos como la urea y la formamida pueden debilitar dichas fuerzas y rompen los puentes de hidrógeno lo que origina que las dos cadenas se desenrollen y se separen proceso conocido como desnaturalización del DNA
FIGURA.-
Esquema para explicar el proceso de desnaturalización del DNA
CALOR
DNA NATIVO
DESNATURALIZACIÓN PARCIAL
DESNATURALIZACIÓN TOTAL
Procedimiento
Medir en un tubo 5 ml de la solución del DNA obtenida en la práctica. Colocar el tubo en baño hirviente durante 15 min., enfriar. Medir la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 260 nm.
Si la solución del DNA desnaturalizada es muy concentrada, diluirla con solución salina citrato y determinar nuevamente la absorbancia. Comparar la absorbancia obtenida, con la absorbancia de la solución del DNA (nativo) obtenida en la práctica. Realizando los pasos señalados anteriormente, en una práctica similar a la presente, se obtuvieron los siguientes resultados:
6
Longitud de onda en Absorbancia del DNA nm 320 310 300 290 280 270 260 250 240 230
Absorbancia del
nativo
DNA
0,005 0,019 0,025 0,062 0,135 0,205 0,283 0,235 0,175 0,140
desnaturalizado 0,020 0,026 0,038 0,125 0,335 0,520 0,650 0,600 0,420 0,350
En el siguiente espacio coloque el gráfico obtenido con los resultados anteriores, colocando en el eje de las ordenadas las ABSORBANCIAS y en el de
abscisas las LONGITUDES DE ONDA tanto para el DNA nativo como para el desnaturalizado en el mismo gráfico.
7
Interrogantes 1.- Exponer los aspectos fundamentales de la estructura del DNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2.- Que otros tejidos podrían ser utilizados para aislar DNA en la presente práctica. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 3.- A que se denomina efecto Hipercrómico del DNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 4.- Qué relación tiene el Tm con la estructura del DNA _______________________________________________________________ 8
_______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 5.- Qué importancia tiene el estudio espectrofotométrico en el proceso de extracción del DNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 6.- Cómo podemos aseguramos que tenemos un DNA puro, exento de proteína y de RNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 7.- Se puede identificar grupos fosfato en los ácidos nucleicos, cómo procederíamos _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 8.- Qué características del alcohol etílico y el alcohol isopropílico, permiten la precipitación selectiva de DNA y de RNA. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 9
9.- Qué propiedades fisicoquímicas se tomaron en cuenta para el aislamiento de DNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 10.- Qué ventajas tiene el emplear células de timo para aislar y estudiar el DNA. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 11.- Qué variaciones realizaría si tiene que extraer DNA de: mitocondria, de plantas, de levaduras _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 12.- Qué importancia cree Ud. que tiene el hecho de que en el DNA las bases queden en el interior de la doble hélice? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 13.- Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de la DNAasa II _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________
10
Terminología: DNA: Ácido desoxirribonucleico RNA: Ácido ribonucleico EDTA: Etilen diamino tetra-acético, quelante de iones divalentes. SDS: Dodecíl sulfato de sodio (Lauril sulfato de sodio), detergente aniónico. DNasa: Nucleasa especifica en la hidrólisis de DNA
PRACTICA N° 2
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA INTRODUCCIÓN A mediados de la década de los 80', investigadores de la Corporación Cetus de California, EEUU, idearon un nuevo procedimiento de amplificación 11
génica que tenía ventaja sobre la tecnología del DNA recombinante. Para este procedimiento se acuño la denominación de Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction) o simplemente PCR,
en ingles, en
vista que consiste en (1) la separación de las 2 cadenas de DNA, (2) el flaquear con "primers" adecuados el gen que se quiere amplificar y (3) permitir que la DNA polimerasa haga la copia de ambas cadenas. La repetición sucesiva de estas etapas posibilita que en corto tiempo (pocas horas), se puedan obtener importantes amplificaciones del gen (varios millones). Una de las principales dificultades que tuvo este método cuando fue inicialmente introducido resulto ser el tener que añadir la enzima polimerizante en cada ciclo, ya que al aumentar la temperatura de la preparación para obtener la separación de las dos cadenas de DNA inactivaba la enzima. Este inconveniente fue superado con el uso de la DNA polimerasa de un organismo que normalmente vive a temperaturas elevadas (Thermus aquaticus) y por lo tanto no es inactivado a la temperatura usada para separar ambas cadenas de DNA. Junto a introducción de esta enzima termoestable, denominada Taq-polimerasa y que determine que la enzima solo se añada una vez, se han diseñado aparatos (denominados termocicladores) que han automatizado los cambios de temperatura y los tiempos de incubación requeridos para este procedimiento Las ventajas más importantes que la PCR tiene sobre la tecnología del DNA recombinante, son: a.- En menos tiempo se consiguen mayores amplificaciones. En solo 4 horas se pueden obtener aproximadamente un millón de copias, en tanto que con la tecnología del DNA recombinante se requieren varios días. b. Dispensa la necesidad de usar plásmidos, bacterias, isótopos radioactivos, etc. c. No se requiere que el DNA a amplificar se encuentre extensamente purificado y de otro lado se puede partir de mínimas cantidades de DNA, teóricamente hasta de una molécula d. Se puede usar muestras de DNA que han estado expuestas por mucho tiempo (siglos medio ambiente, incluso fragmentadas.
12
Cuarto ciclo Tercer ciclo Sgundo ciclo AMPLIFICACIÓN EXPONENCIAL Primer ciclo
35 ciclos
235 copias = 34000 millones copias 21 copias 22 copias 23 copias
24 copias
PARTE EXPERIMENTAL AMPLIFICACIÓN IN VITRO DEL DNA MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA USANDO TAQ-POLIMERASA Y DNA POLIMERASA I (fragmento Klenow). Procedimiento: 1. Se ha aislado el DNA de blástula de erizo de mar usando el protocolo descrito en la práctica respectiva. En un tubo de minifuga (Ependorf) se midió lo siguiente: - Agua destilada
30 ul
- Buffer de amplificación 10X
10 ul (*)
- Mixtura de los 4 dNTPs a la concentración de 200 uM
16ul
- Primer 1 (en 5 ul de H2O)
100 pmoles
- Primer 2 (en 5 ul de H2O)
100 pmoles
- DNA de blástula ( 2ug) - Agua destilada hasta completar un volumen fina! de 100ul 13
(*) El buffer de amplificación contiene KCl 500 mM, Tris-HCl pH 8.3 100 mM,MgCl2 15mM 2. Calentar la preparación por 5 minutos a 94°C por 5 minutos 3. Estando la mixtura a 94°C se añade 0.5 ul de Taq polimerasa (5 unidades/ml) Medir encima de la mixtura de reacción 100 ul de aceite mineral. 4. Programar las variaciones de temperatura de la siguiente manera: a) Primer ciclo:
5 minutos a 94°C, luego 2 minutos a 50°C y
posteriormente 3 minutos a 72°C. b) Siguientes ciclos: 1 minuto a 94°C, luego 2 minutos a 50°C y posteriormente 3 minutos a 72 C. c) Último ciclo:
1 minuto a 94°C, luego 2 minutos a 50° C y
posteriormente 10 minutos a 72 °C 5. Para la amplificación usando el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I, se procedió de una manera similar, con las siguientes modificaciones. El pH del tampón de amplificación es de 7.6, la concentración de los dNTP es de 125 mM. Para la amplificación se programaron las siguientes variaciones de temperatura: 5 minutos a 94° luego 2 minutos a 37°C, posteriormente se agrega el fragmento Klenow (1 unidad por cada ciclo) y luego se incuba por otros 2 minutos a 37 °C., siendo necesario e! añadido de la polimerasa en cada ciclo. 6. Luego de completados los ciclos de amplificación, se precipita el DNA con el añadido de dos volúmenes de etanol frío, se centrifuga y se descarta el sobrenadante. El precipitado se suspende en 100 ul de buffer Tris-EDTA pH 8 7. Usando 5ul de cada muestra se practicó la electroforesis en geles de agarosa al 1%. Concluido el tiempo de corrida se tiñe el gel con bromuro de etidio y se tomó la fotografía del mismo, bajo luz ultravioleta, obteniéndose los resudados que se muestran en la figura siguiente :
14
C4 C3 C2 C1 1.35
0.603
0.194
0.118
Origen
En la canaleta 1 del gel se puso un marcador de pesos moleculares consistente en el ADN del fago φX174 cortado con Hae III. En la canaleta 2 se puso luego de 35 ciclos de amplificación usando el fragmento Klenow. En la canaleta 3 se puso el DNA amplificado por la Taq-Polimerasa luego de 25 ciclos. En la canaleta 4 se puso el DNA amplificado por la Taq-Polimerasa luego de 35 ciclos.
CUESTIONARIO 1. ¿Qué significa un buffer de amplificación 10X? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 2. ¿Qué objeto tiene el añadir aceite mineral al tubo de minifuga en donde se hace la de amplificación en la PCR? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 3. Justifique las diferencias que en cuanto a las variaciones de temperatura se hacen se usa taq-polimerasa y cuando se usa el fragmento de Klenow? _________________________________________________________________ 15
_________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 4. ¿Qué es el fragmento de Klenow? ¿Qué actividades enzimáticas tiene? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 5. Justifique las diferencias que en cuanto al pH del tampón y a la concentración de nucleótidos que se hace cuando se utiliza en la amplificación con la Taqpolimerasa y el fragmento Klenow. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 6. ¿En cuanto a la fidelidad de la copia, qué diferencia existe entre la Taqpolimerasa y la polimerasa de Konberg? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 7. ¿Qué fuentes de Taq-Polimerasa conoce? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 8. ¿Por qué se tiene que añadir el fragmento Klenow en cada ciclo de amplificación? _________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 16
9. En la electroforesis del DNA amplificada usando fragmento Klenow se observan varias bandas, a diferencia del DNA amplificado con la Taq-polimerasa en donde sólo se observan una banda. ¿Qué explicación tiene esto? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 10. Estime el porcentaje de fragmentos amplificadas por PCR que tienen un tamaño delimitado por los primeros 3 ciclos de amplificación. Justifique su respuesta hacer esquema correspondiente a los 3 ciclos de amplificación.
BIBLIOGRAFÍA 1. AQUINO, J y ZEGARRA, F. Fundamentos de Biología Molecular. 2010 2. EHRLICH H. PCR Technology. Oxford University Press 1992. 3. SAMBROOK J. FRITSCH E.F. and MANIATIS T. Molecular Cloning. A Lobaratory Manual CSH. II Ed. 1989
PRACTICA – SEMINARIO N° 3
MANEJO DE PLÁSMIDOS INTRODUCCIÓN Uno de los vectores más comúnmente usados para la amplificación de fragmentos de DNA, en el curso de la manipulación genética, son los plásmidos. 17
Estos vehículos de clonaje son moléculas circulares de DNA de doble hebra, que se encuentran en una variedad de especies bacterianas y que se replican independientemente del DNA genómico. Los plásmidos usados corrientemente en ingeniería genética tienen algunas características que se aprovechan ventajosamente como un origen de replicación, capacidad de mantenerse en un alto número de copias por célula bacteriana, contener un gran número de sitios (palíndromos) para ser cortados por diferentes enzimas de restricción y contener genes que confieren fenotipos que hacen posible la selección de las bacterias que han incorporado el plásmido. En el laboratorio, los plásmidos pueden ser introducidos a las bacterias utilizando procedimientos que hacen temporalmente permeables a las bacterias a estos círculos de DNA. En la mayoría de casos la replicación del DNA plasmídico es realizada por el mismo grupo de enzimas encargadas de la replicación del DNA cromosómico. Con frecuencia se encuentra un número de copias del plásmido que oscila entre 10 a 200; pero puede ser incrementado a varios miles si la síntesis de proteínas en el hospedero es detenida. Uno de los plásmidos vectores de mayor empleo es el pBR322, que contiene un gen que confiere resistencia a la ampicilina y otro a la tetraciclina y un número importante de sitios únicos para diversas enzimas de restricción, como Eco R1 Ava I, Pst I, Bam H1, Pvu II, Cla I, Sal I, Eco R1 y HindHind III (Figura III 1). El tamaño de este plásmido es de 4.3 kb y desde 1979 se conoce completamente su secuencia nucleotídica.Hind II
Bam H1 Gen de resistencia a tetraciclina
Gen de resistencia a ampicilina
Hind II Pst I
Sal I ORI 18
Pvu II
Figura 1.- Mapa de restricción del plásmido pBR322
OBJETIVO (PROBLEMA) El problema del presente seminario es clonar los genes de actina de erizo de mar (Strogilocentrotus purpuratus ).
METODOLOGÍA 1. Purificación del DNA Se utilizaron embriones (estadio de blástula) de S. Purpuratus y se procedió al aislamiento del DNA en la forma indicada en el Protocolo de la Práctica Seminario Caracterización de Fragmentos de DNA- El DNA obtenido fue suspendido en 2 ml de una solución de Tris-HCI 10mM pH 7.4 y EDTA 0.1 mM. Para verificar la pureza del DNA obtenido, se midió la absorbancia a 260 nm. y 280nm en una dilución de esta solución, obteniéndose las siguientes lecturas, 0.420 y 0.315, respectivamente. Podemos decir que este DNA está suficientemente purificado?. Justifique su respuesta. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Recuerde que es necesaria una buena purificación del DNA para que las enzimas de restricción puedan cortar. ¿Qué se puede hacer ahora para superar este problema? 19
_________________________________________________________________ _________________________________________________________________
2. Estimativa de la cantidad de DNA obtenida Habiendo verificado que ahora nuestra muestra de DNA está suficientemente purificada, debemos estimar cuanto DNA se obtuvo. Para esto, tengamos en cuenta que una solución de DNA de doble hebra, que está a una concentración de 50 ug/ml, tiene una absorbancia de 1. Con ese fin, a 10 ul de la solución señalada de DNA se añadió 990 ul de agua destilada y al medir su absorbancia a 260 nm dio una lectura de 0.760. ¿Cuál es la cantidad total de DNA purificado? (Cálculos)
Respuesta____________
3. Tratamiento del DNA con la enzima de restricción Para la construcción de la biblioteca genómica debemos cortar el DNA con la enzima de restricción, para después construir las moléculas de DNA recombinante utilizando el plásmido pBR322.
¿Qué enzima elegimos? Junto al nombre de cada enzima de restricción de la siguiente lista, indique si la usaría o no, justificando en cada caso su respuesta. EcoR1 _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 20
Hind II _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ PvulI _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Pst I _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Bgl II _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Hind III _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Hae I _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Bam H1 _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Sal I _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ La enzima de elección es ______________________________________ ¿Qué enzima elegiría para cortar el plásmido? Justifique su respuesta. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________
4. Eliminación de los fragmentos pequeños (menores a 2.8 kb., por ejemplo) 21
Se hizo mediante la centrifugación en gradiente neutra de sacarosa (16-43%) ¿Qué sentido tiene esta etapa? ________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________
5. Unión de los fragmentos de DNA al plásmido La enzima utilizada para este proceso, es ________________________________
6. Ingreso de las moléculas de DNA recombinante a la bacteria y la transformación de esta. Mandel e Higa en 1970 demostraron que la captación del bacteriófago lambda aumentaba considerablemente si las bacterias se trataban con cloruro de calcio Cohén y col. pudieron demostrar más tarde que este procedimiento también funcionaba con los plásmidos. Con todo, debemos tener en cuenta que sólo una proporción muy pequeña de bacterias, son competentes para incorporar el plásmido (aproximadamente una por cada 10000). Una vez que el plásmido ingresó a la bacteria, se replica y expresa los marcadores de la resistencia a los antibióticos y es lo que permite a la célula transformada sobrevivir en presencia del antibiótico. ¿Cómo reconocemos a las bacterias que no recibieron el plásmido? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ ¿Cómo reconocemos a las bacterias que recibieron el plásmido, pero sin el inserto? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 22
¿Cómo reconocemos a las bacterias que recibieron el plásmido conteniendo inserto? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Haga las gráficas de las placas de cultivo correspondientes:
7. Hibridación "in situ" de las colonias bacterianas Una vez que se han seleccionado las colonias de bacterias que contienen el plásmido con el inserto, se debe hacer la identificación de aquellas que contienen el inserto que nos interesa, en este caso los genes de actina. El procedimiento general que se sigue para conseguir este objetivo, consiste básicamente en la transferencia de las bacterias de la placa de cultivo a un filtro de nitrocelulosa (Millipore HAWP). Las colonias presentes en el papel 23
filtro son lisadas y el DNA liberado es fijado al papel filtro mediante calor. Después se hace la hibridización a una prueba (sonda) marcada con P-32. La detección de las colonias que hibridizaron se hizo mediante autorradiografía del filtro de nitrocelulosa expuesto a la prueba radioactiva y la comparación de la posición de las manchas con la correspondiente a las colonias de la placa madre. De las aproximadamente 8000 colonias estudiadas, seis dieron una significativa reacción con la prueba que se utilizó. La prueba correspondió a un fragmento de DNA de Drosophila melanogaster de 1.8 kb, conteniendo una secuencia de 1.1 kb que codificaba para actina y otra de 0.7 kb que no codificaba para actina. Este fragmento estaba insertado en un vector, resultando el plásmido quimérico pDmA2. Las colonias seleccionadas de este modo fueron cultivadas para posteriormente pasar al aislamiento del DNA plasmídico. Si se revisan los protocolos comúnmente usados para la hibridización, constataremos que se hace a temperatura elevada (68° C por ejemplo) y la prueba es previamente calentada a 100°C por 5 minutos. ¿Cuál es la razón?__________________________________________________ _________________________________________________________________
8. Aislamiento del DNA plasmídico Se hace utilizando varios procedimientos, que en general incluyen 3 etapas básicas: - Detención de la proliferación. - Lisis de las bacterias hospederas. - Purificación del DNA plasmídico. Estos procedimientos aprovechan de alguna manera las dos diferencias más importantes que existen entre el DNA de la bacteria (E. coli) y el DNA plasmídico, es decir, que el DNA de la bacteria es mucho más grande que el DNA del plásmido comúnmente usado como vector y que el DNA que se retira de E. 24
coli corresponde a moléculas lineales fraccionadas; en cambio el DNA plasmídico
es retirado generalmente bajo la forma de un círculo cerrado covalentemente. El procedimiento utilizado consistió básicamente en lo siguiente: - Las bacterias contenidas en 500 ml de medio de cultivo, fueron colectadas por centrifugación a 4000 g. por 10 min. a 4° C. El precipitado fue suspendido en 100 ml de tampón Tris-HCI 10 mM pH 8.0, conteniendo NaCl 0.1M y EDTA 1 mM y colectadas nuevamente por centrifugación, como se señaló antes. - El precipitado bacteriano obtenido fue resuspendido en 10 ml. de tampón STET (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, NaCl 0.1M, EDTA 1mM y tritón X-100 al 5%) y transferida esta solución a un Erlenmeyer de 50 ml. - A esta solución se añadió 1 ml. de solución de lisozima (10 mg/ml). Se llevó la preparación al fuego de un mechero Bunsen, agitando constantemente hasta que comenzó a hervir. Luego se pasó inmediatamente el Erlenmeyer a un baño maría hirviente y se le dejó allí por 40 seg. - Enseguida se enfrió el frasco en baño de hielo, durante 5 min. El contenido viscoso del frasco fue transferido a un tubo de ultracentrífuga y se centrifugó por 30 minutos a 30000 rpm y se colectó el sobrenadante. Justificar el rol del tritón x-100, de la lisozima y del tratamiento por ebullición de la preparación. a) Del tritón x-100___________________________________________________ _________________________________________________________________ b) De la lisozima ____________________________________________________ _________________________________________________________________ c) De la ebullición ___________________________________________________ _________________________________________________________________
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La purificación del DNA plasmídico se realizó mediante el método de centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio. Con este fin se añadió a la solución anterior 1g de CsCl hasta lograr su disolución. Se añadió luego 0.8 ml de una solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) por cada 10 ml de solución y se mezcló. La densidad final de la solución resultó de 1.556 g/ml. ¿En cuanto a la preparación de esta gradiente, qué diferencia importante encuentra con respecto a la gradiente de sacarosa vista anteriormente? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ ¿Por qué se utilizó bromuro de etidio? ¿Qué precauciones debe tenerse en cuanto a su uso? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Se centrifugó la solución por 5 minutos a 8000 rpm a temperatura ambiente. Al detener la centrífuga se constató en la parte superior la presencia de una capa rosada. Con una pipeta Pasteur de punta fina se retiró el líquido que se encontraba debajo de esta capa, se le pasó a otro tubo de ultracentrífuga y se le centrifugo a 45000 rpm por 16 horas. Al detener la ultracentrífuga se observó en el tubo tres capas de color rosado y precipitado del mismo color (Ver esquema). A qué corresponde cada capa?
a b
a) ______________________________ b) ______________________________
c d
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c) ______________________________ d) ______________________________
La colección se hizo siguiendo el esquema mostrado en la figura siguiente:
9. Análisis de los fragmentos de DNA conteniendo secuencias de genes de actina. Se aisló el DNA plasmídico según el procedimiento descrito, utilizando dos de las seis colonias que se habían cultivado y que dieron positividad con la prueba. Ambos DNA fueron cortados con Hind III y los fragmentos resultantes analizados mediante electroforesis en agarosa al 1%. Paralelamente se corrió en el mismo gel el DNA del fago lambda digerido con Hind III. Cumplido el tiempo de la corrida se tiño el gel con bromuro de etidio y se tomó la fotografía del mismo bajo luz ultravioleta. El diagrama que se muestra a continuación es una 27
reproducción a escala de dicha fotografía.
C2
C1
23
9.5
6.4
4.2
2.2 1.8
Origen
INTERROGANTES ¿Cómo se explica que en ambas canaletas se detecte un fragmento del mismo tamaño? ¿A qué correspondería? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ ¿Cuál es el tamaño de los fragmentos presentes en el gel? _________________________________________________________________ ¿Se podría decir que corresponden a genes de actina? ¿Por qué? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ ¿Podrían corresponder ambos fragmentos al mismo gen? Fundamente su respuesta _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 28
¿Cómo se puede afirmar o descartar experimentalmente que correspondan al mismo gen?________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ ¿Qué significado tiene el que al cortar ambos fragmentos con seis enzimas diferentes de restricción, se haya encontrado hasta un 50% de sitios comunes de corte? ________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________
PRACTICA N° 4
INMUNOBLOTING IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ESPECÍFICAS POR WESTERN BLOT
INTRODUCCIÓN La presente practica esta diseñada en base a un estudio que se realizo en nuestro medio y que tenia como uno de los objetivos, demostrar que Uncaria 29
tomentosa "uña de gato" induce apoptosis a través de la degradación de la
proteína PARP (Poly ADP-ribosa Polimerasa). Cabe señalar por lo tanto, que en este caso no es la intención estudiar la apoptosis inducida por "uña de gato", sino que estamos tomando como modelo este estudio, a fin de mostrar la aplicación de la técnica de "Inmunoblotting" y por lo tanto, para una buena comprensión e interpretación de los resultados que se obtuvieron, mencionaremos algunos detalles a) respecto.
Uncaria tomentosa, comúnmente conocida como "uña de gato" es una
liana perteneciente al genero Uncaria, familia de las rubiaseas, que desde hace muchos años en el Perú se le emplea en la medicina popular en el tratamiento de un amplio rango de enfermedades particularmente digestivas e inflamatorias; sin embargo, muchas de sus bondades no están aun del todo comprendidas.
Los modernos métodos de la biología molecular, que cada vez son más versátiles, ya que además de tener un alto grado de confiabilidad y especificidad pueden muy bien aplicarse a nuestra realidad, contribuyendo al conocimiento de muchos aspectos del quehacer científico. Por otro lado, la evaluación de las acciones farmacológicas y moleculares de muchos productos naturales son posibles de ser abordados usando el sistema de macrófagos de rata que se ha convertido en una valiosa herramienta en este tipo de estudios.
La PARP (poli ADP-ribosa polimerasa), es una proteína de 116 kd que esta involucrada en la reparación del ADN, esta proteína se ha convertido en un indicador de apoptosis, puesto que es degradada por la caspasa-3, la cual lo convierte en dos fragmentos: uno de 85 kd y otra de 31 kd.
OBJETIVOS.
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1. Conocer el fundamento y los principios en que se basa la metodología del Western blot. 2. Conocer la utilidad de esta técnica en el campo de la investigación.
1.- Tratamiento de macrófagos con Uncaria tomentosa Aproximadamente 2 x 10 6 macrófagos aislados fueron cultivados en placas Petri, conteniendo 10 ml de medio de cultivo (Buffer fosfato pH 7.2 suplementado con 10% de suero de bovino, penicilina 100 Ul/ml y estreptomicina 100 ug/ml) e incubados a 37°C en presencia y ausencia de U. tomentosa al 20 % durante 0, 6,12 y 24 horas.
2.- Lisis de macrófagos para el análisis de PARP. a) Reactivos: - Tampón de lisis: Tris-HCI
20mM
CINa
137mM
Cl2Mg
5 mM
Glicerol
10%
NP-40
1%
- Mezcla de inhibidores de proteasas para 1 ml Pefabloc
100mg
- Tampon de carga "laemmli": Tris-HCI
125mM
SDS
2%
Glicerol
5% 31
Azul de bromefenol 0.003 % 2-Mercaptoetanol 1%
a) Procedimiento: Transcurridos los tiempos de incubación, se concentran las células de la placa por centrifugación a 3000 rpm durante 3 minutos. A continuación, el precipitado celular se resuspende y se lava 2 veces con PBS (Buffer fosfato pH 7.4) frió.
El precipitado celular se lisa con 100 ul de tampón de lisis y 5pl de la mezcla de inhibidores de proteasas en un baño de hielo. El homogenizado celular se centrifuga a 13000 rpm durante 20 minutos: Se determina luego la cantidad de proteínas totales en el sobrenadante por el método de Bradford. Alícuotas de sobrenadante conteniendo 10 ug de proteínas totales se diluyen en tampón de carga 2X y se incuban en baño hirviente durante 7 minutos. Luego se procede a la electroforesis de proteínas.
3.- Electroforesis de proteínas en gel de Poiíacrilamina. a) Reactivos: • Acrilamida.bis acrilamida 30 % • Tris-HCI 1.5 M pH 8.8 • Persulfato de amonio 10 % • Temed • Tris-HCI 0.5 MpH 6.8 • Tampón de corrida pH 8.3 Tris-HC1
25 mM
SDS
0.1 %
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Glicina
250 mM
b) Procedimiento: La electroforesis se realiza utilizando un gel de apilamiento de 4 % de poliacrilamida y un gel de separación al 12.5 %. Ambos geles se dejan polimerizar durante 45 minutos a emperatura ambiente. El sistema de geles se prepara utilizando el sistema mini-ROTEAN II; para ello, primero se prepara la solución separadora, dejándola polimerizar en el sistema. Para evitar el efecto inhibitorio del oxigeno atmosférico sobre la polimerización, se añaden con cuidado 500 ul de agua desionizada sobre la solución una vez polimerizado, se elimina el agua y se añade la polución de apilamiento en la cual se construyen los “pocillos” para las muestras.
Una vez cargados los pocillos con las muestras conteniendo 10 ug de proteínas totales (Método de Bradford) y con el estándar de pesos moleculares, se introduce el sistema en el tanque de electroforesis, el cual se rellena con tampón de corrida. Por último, el sistema se conecta a una fuente de alimentación manteniéndose a 150 Voltios durante 1 hora.
4.- Transferencia de las proteínas a membranas de Polyvinylidene difluoride (PVDF). a) Reactivos: -Tampón de transferencia: Tris HCl Glicina SDS Metano! pH
48 mM 39 mM 0.0375 % 20% 9.2
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b) Procedimiento: La transferencia se efectúa utilizando el sistema húmedo de Bio-Rad y membrana de PVDF, siguiendo el protocolo recomendado por esta casa comercial.
Una vez terminada la electroforesis, el gel se introduce en tampón de transferencia para un enjuague y a continuación se le coloca en forma de emparedado (soporte-esponja-papel filtro-membrana PVDF-gel-papel filtroesponja-soporte) en el equipo de transferencia, en baño de hielo. Se conecta luego el sistema a una fuente de alimentación, efectuándose la transferencia y manteniéndose la intensidad de la corriente eléctrica a 350 mA durante 3 horas.
5.- Incubación con el anticuerpo (PARP): "Inmunoblotting”: a) Reactivos: • Tampón de lavado (TBS) Tris-HCI CINa
20 mM 137 mM pH 7.6
• Tampón de saturación de membrana: Leche en polvo 5% en TBST (TBS y Tween 20 al 0.5 %) • Anti-PARP (dilución 1:2000). Las diluciones se hacen en TBST.
b) Procedimiento: En primer lugar la membrana de PVDF con las proteínas transferidas, se incuba toda la noche en tampón de saturación, para bloquear los espacios libres con caseína de la leche (también se puede usar albúmina). Luego se hacen tres lavados con TBS; a continuación se incuba la membrana durante 12 horas con el primer anticuerpo (en el presente caso con Anti- PARP). Luego se lava la membrana 3 veces con TBS y a continuación se incuba con un segundo 34
anticuerpo Antj-lgG (de conejo) marcado o conjugado con peroxidasa y diluido.1:5000 en TEST. Finalmente se lava la membrana tres veces con TBS.
6.- Revelado o identificación de la proteína a estudiar.
a) Reactivos: • Tampón ECL Tris-HC1 10mM, pH: 8.5 • Luminol 4 mg de Luminol disueltos en 25 ul de NaOH IN y completados hasta 5 ml con tampón ECL. • -Yodofenol 1 mg de 4-yodofenol disueltos en 5 ml de tampón ECL.
c) Procedimiento: Tras la mezcla de los reactivos Luminol y yodofenol en volúmenes iguales, se añade 5ul de H 2O2 concentrado y se incuba la membrana durante 1 minuto. A continuación, en cuarto oscuro, la membrana se coloca en un casete, en contacto con una película radiográfica (Hyperfilm MP de Amersham) durante 2 ó 3 minutos. Por último, la película se revela de una forma manual, modificando los tiempos de exposición según las circunstancias.
RESULTADOS:
++++ 0
6
U. tormentosa
12
24
PM
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Figura N° 1.- Degradación de la PARP en macrófagos de rata tratados con Uncaria tomentosa.
Las células fueron incubadas con "uña de gato" al 20 % durante los tiempos indicados. Los "western blot" fueron realizados como se indica en la sección de Métodos. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
INTERROGANTES: 1.- ¿Qué función cumple el SDS? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________
2.- ¿Qué ocurre, si a la membrana de PVDF no se la trata con leche en polvo (caseína)? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 36
______________________________________________________________
3.- ¿Interprete los resultados mostrados en la figura ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________
4.- ¿Por qué aparecen otras bandas en el revelado de inmunoblotting? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________
5.- ¿Qué significa la banda de 85 Kd? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________
6.- ¿Por qué no aparece la banda de 31 Kd? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________
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