BAB III METODE PENELITIAN
3.1
Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah maserator, rotary evaporator (Buchi Rotavapor R-300), otoklaf (Hirayama), inkubator (Sakura IF-
4), cawan petri (Pyrex), tabung reaksi (Pyrex), jangka sorong (Aigo), mikropipet volume 20-1.000 µL (Eppendorf), perforator berdiameter 9 mm, oven (Memmert), penangas air (Toyomi), timbangan digital (Mettler Toledo), tip mikropipet, dan alat-alat gelas yang umum digunakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Fitokimia.
3.2
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari bahan tanaman, bahan kimia, bakteri dan jamur uji, dan medium pertumbuhan bakteri dan jamur.
3.2.1
Bahan Tanaman
Bahan tanaman yang digunakan berupa simplisia daun sirih merah spesies Piper crocatum Ruiz & Pav yang berasal dari daerah Bogor, Jawa Barat,
Indonesia.
22
23
3.2.2
Bahan Kimia
Bahan kimia yang digunakan terdiri dari pelarut, pereaksi, dan pensuspensi. Pelarut yang digunakan saat ekstraksi adalah etanol 70% (Merck). Pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak adalah Dimetil Sulfoksida 99% (Merck). Pelarut dan pereaksi yang digunakan untuk penapisan fitokimia adalah amonia 10% (Merck), kloroform, asam klorida 2 N (Merck), pereaksi Mayer (larutan kalium merkuri iodida), pereaksi Dragendorff (larutan kalium bismuth iodida), serbuk magnesium, amil alkohol (Merck), pereaksi besi (III) klorida, larutan gelatin 1%, eter (Merck), pereaksi vanilin-sulfat (larutan vanilin 10% dalam H2SO4 pekat), pereaksi Liebermann-Burchard (larutan asam asetat anhidrat dalam H2SO4 pekat), natrium hidroksida 1 N, dan air suling. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan medium pertumbuhan bakteri dan jamur uji adalah air suling steril. Pensuspensi yang digunakan untuk mensuspensikan jamur uji adalah NaCl fisiologis steril.
3.2.3
Bakteri dan Jamur Uji
Bakteri uji yang digunakan pada penelitian ini adalah Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan Escherichia coli, sedangkan jamur uji yang
digunakan pada penelitian ini adalah Candida albicans. Bakteri dan jamur uji diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran.
24
3.2.4
Medium Pertumbuhan Bakteri dan Jamur
Medium pertumbuhan bakteri yang digunakan adalah Mueller-Hinton Agar (Merck), Mueller-Hinton Broth (Oxoid), Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid),
dan Sabouraud Dextrose Broth (Conda).
3.3
Metode Penelitian
Metode
penelitian
yang
dilakukan
meliputi
pengumpulan
bahan,
pembuatan simplisia dan determinasi tanaman, ekstraksi simplisia, penapisan fitokimia ekstrak, pengujian aktivitas antibakteri dan antijamur, penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM), penentuan waktu kontak.
3.3.1
Pengumpulan
Bahan,
Pembuatan
Simplisia
dan
Determinasi
Tanaman Sirih Merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav)
Bahan tanaman yang digunakan adalah daun sirih merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav) yang berasal dari Bogor, Jawa Barat. Bahan berupa daun sirih merah segar yang didiamkan terlebih dahulu hingga daun menjadi layu kemudian disortir, dirajang dan dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung selama beberapa hari hingga diperoleh simplisia kering yang siap digunakan untuk tahapan selanjutnya. Bahan tumbuhan tersebut dideterminasi di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran.
25
3.3.2
Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
Ekstraksi simplisia daun sirih merah dilakukan menggunakan metode maserasi atau perendaman. Metode ini dipilih untuk mencegah kerusakan senyawa-senyawa komponen oleh suhu tinggi. Pelarut yang digunakan adalah etanol 70% karena etanol merupakan pelarut yang umum digunakan untuk mencari senyawa polar dan non polar. Proses ini dilakukan dengan perendaman serbuk simplisia sirih merah sebanyak 300 gram selama 3x24 jam dalam maserator dengan penggantian pelarut setiap 24 jam. Ekstrak ditampung dalam labu Erlenmeyer, kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu < 40˚C. Rendemen ekstrak dihitung dengan menggunakan rumus : Rendemen = Berat ekstrak kental x 100% Berat simplisia
3.3.3
Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia dilakukan dengan metode Phytochemical Screening of Plants (Farnsworth, 1966) untuk mengetahui golongan metabolit sekunder yang
terdapat pada ekstrak. 1.
Golongan Senyawa Alkaloid Sampel dibasakan dengan larutan amonia 10% di dalam mortir lalu
ditambahkan kloroform sambil digerus. Lapisan kloroform yang terbentuk lalu dipipet dan disaring. Setelah disaring, filtrat ditambahkan larutan asam klorida 2 N lalu dikocok kuat hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan atas dipisahkan kemudian dibagi menjadi tiga bagian dan diperlakukan sebagai berikut : a. Bagian pertama digunakan sebagai blanko.
26
b. Bagian kedua ditetesi dengan pereaksi Mayer kemudian diamati. Terjadinya kekeruhan atau endapan putih menunjukkan adanya alkaloid. c. Bagian ketiga ditetesi dengan pereaksi Dragendorff lalu diamati. Terbentuknya endapan jingga coklat menunjukkan adanya alkaloid. 2.
Golongan Senyawa Flavonoid Sampel dalam tabung reaksi dicampur dengan serbuk magnesium dan
ditetesi asam klorida 2 N. Campuran tersebut dipanaskan di atas penangas air selama 30 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan amil alkohol lalu dikocok kuatkuat. Terbentuknya warna kuning hingga merah yang dapat ditarik dengan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. 3.
Golongan Senyawa Polifenol Sampel dalam tabung reaksi dipanaskan di atas penangas air kemudian
disaring panas-panas. Setelah dingin, filtrat ditetesi pereaksi besi (III) klorida. Adanya polifenol dalam sampel ditandai dengan munculnya warna biru-hitam. 4.
Golongan Senyawa Tanin Sampel dalam tabung reaksi dipanaskan di atas penangas air kemudian
disaring panas-panas. Setelah dingin, filtrat ditetesi larutan gelatin 1%. Bila ada endapan putih, berarti terdapat tanin dalam sampel. 5.
Golongan Senyawa Monoterpenoid dan Seskuiterpenoid Sampel digerus dengan eter kemudian dipipet sambil disaring. Filtrat eter
ditempatkan dalam cawan penguap lalu dibiarkan menguap hingga kering. Pada residu diteteskan pereaksi vanilin-sulfat melalui pinggir cawan penguap.
27
Terbentuknya warna-warna menunjukkan adanya senyawa monoterpenoid dan seskuiterpenoid. 6.
Golongan Senyawa Steroid dan Triterpenoid Sampel digerus dengan eter lalu dipipet sambil disaring. Filtrat eter
ditempatkan dalam cawan penguap kemudian dibiarkan menguap hingga kering. Pada residu diteteskan pereaksi Liebermann-Burchad. Terjadinya warna ungu menunjukkan adanya senyawa golongan triterpenoid, sedangkan terbentuknya warna biru-hijau menunjukkan adanya senyawa golongan steroid. 7.
Golongan Senyawa Kuinon Sampel dalam tabung reaksi dipanaskan di atas penangas air kemudian
disaring. Filtrat ditetesi dengan larutan natrium hidroksida 1 N. Terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan adanya kuinon. 8.
Golongan Senyawa Saponin Sampel dalam tabung reaksi dicampur dengan air dan dipanaskan beberapa
saat di atas penangas air kemudian disaring. Setelah dingin, filtrat dikocok kuatkuat secara vertikal selama lebih kurang 30 detik. Bila muncul busa setinggi lebih kurang 1 cm yang persisten selama beberapa menit dan tidak hilang setelah penambahan 1 tetes asam klorida encer atau pada pendiaman selama lebih kurang 20 menit, maka menunjukkan adanya senyawa saponin.
3.3.4
Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak dimaksudkan untuk mengetahui kemampuan ekstrak etanol daun sirih merah dalam menghambat pertumbuhan
28
atau membunuh bakteri uji. Pengujian ini dilakukan dengan metode difusi agar dan teknik perforasi dengan kekeruhan bakteri uji yang setara dengan 0,5 Mc Farland dalam medium Mueller-Hinton Broth (MHB). Inokulasi bakteri uji menggunakan metode pulas pada medium padat Mueller-Hinton Agar (MHA). Konsentrasi ekstrak yang digunakan dalam pengujian adalah 20, 40, 60, dan 80% b/v menggunakan pelarut Dimetil Sulfoksida (DMSO). Pengamatan ada tidaknya aktivitas antibakteri dapat dilihat setelah diinkubasikan sesuai dengan suhu dan waktu optimum pertumbuhan masing – masing masing bakteri dari diameter zona hambat yang terbentuk disekeliling lubang perforasi yang berisi ekstrak.
3.3.5
Uji Aktivitas Antijamur Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
Pengujian aktivitas antijamur ekstrak dimaksudkan untuk mengetahui kemampuan ekstrak etanol daun sirih merah dalam menghambat pertumbuhan atau membunuh jamur uji. Pengujian ini dilakukan dengan metode difusi agar dan teknik perforasi dengan kekeruhan jamur uji uji yang setara dengan 0,3 Mc Farland dalam NaCl fisiologis. Inokulasi jamur uji menggunakan metode pulas pada medium padat Sabouraud Dextrose Agar (SDA). Konsentrasi ekstrak yang digunakan dalam pengujian adalah 10, 20, 40, dan 60% b/v menggunakan pelarut Dimetil Sulfoksida (DMSO). Pengamatan ada tidaknya aktivitas antijamur dapat dilihat setelah diinkubasikan sesuai dengan suhu dan waktu optimum pertumbuhan jamur dari diameter zona hambat yang terbentuk disekeliling lu bang perforasi yang berisi ekstrak.
29
3.3.6
Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM)
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dari ekstrak etanol daun sirih merah yang masih memiliki aktivitas antibakteri dan antijamur terhadap bakteri dan jamur uji. Metode yang dilakukan adalah metode makrodilusi cair dengan melakukan pengenceran bertingkat konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah dengan variasi konsentrasi 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 dan 0, 15625% b/v menggunakan media cair MHB untuk pertumbuhan bakteri uji dan media SDB untuk pertumbuhan jamur uji. Kemudian ditambahkan suspensi bakteri atau jamur uji dan diinkubasikan sesuai sesuai dengan suhu dan waktu waktu optimum pertumbuhan masing – masing masing mikroba. Penentuan letak KHTM dilakukan dengan pengamatan kekeruhan media uji dengan pembanding kontrol positif dan negatif yang digunakan. Nilai KHTM terletak pada konsentrasi uji terkecil dimana terdapat penurunan jumlah koloni mikroba yang tinggi pada media padat. Setelah itu, dilakukan teknik dropping untuk melihat pertumbuhan koloni mikroba kedalam media padat MHA untuk bakteri uji dan media SDA untuk jamur uji. Nilai KBM berada pada konsentrasi uji terkecil dimana tidak terdapat pertumbuhan koloni mikroba.
3.3.7
Penentuan Waktu Kontak
Tahapan ini bertujuan untuk mengetahui waktu tercepat yang dibutuhkan oleh ekstrak etanol daun sirih merah sebagai kandidat antiseptik untuk dapat
30
membunuh bakteri dan jamur uji. Hal ini berhubungan dengan penggunaannya sebagai antiseptik yang diharapkan dapat membunuh mikroba dalam waktu yang relatif singkat. Penentuan waktu kontak ini dilakukan dengan merancang serangkaian serangkaian konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah dan interval waktu kontak yang dibutuhkan. Suspensi mikroba uji diinokulasikan kedalam variasi konsentrasi ekstrak dan setiap interval waktu kontak, diinokulasikan kembali pada media MHB untuk bakteri uji dan media SDB untuk jamur uji, kemudian masingmasing mikroba uji diinkubasikan pada suhu dan waktu optimal pertumbuhan jamur dan bakteri uji. Hasil inkubasi digores pada media padat menggunakan ose dan diinkubasi pada suhu dan waktu optimal pertumbuhan jamur dan bakteri uji.
