PEMANFAATAN KROMATOGRAFI KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS TIP IS DALAM IDENTIFIKASI PEMALSUAN JAMU DAN ANALISIS SIDIK RAGAM EKSTRAK A. Tujuan 1. Menentukan adanya bahan kimia obat yang ditambahkan pada sampel jamu yang diuji pada percobaan. 2. Menentukan perbedaan sidik ragam antara Rhei radix dan Aloe Aloe yang terhidrolisis dengan yang tidak terhidrolisis melalui kromatografi lapis tipis sirkular dan satu arah . arah .
B. Prinsip Percobaan Dalam
upaya
meningkatkan
kemanjuran
produk
jamu,
tidak
jarang
produsen
menambahkan bahan sintetis. Bahan sintetis yang ditambahkan disesuaikan dengan khasiat yang diindikasikan dari produk jamu. Obat-obat yang sering ditambahkan seperti analgesik, antipiretik, vitamin B kompleks dan kortikosteroid sering ditambahkan pada jamu pegal linu, obat kuat atau penambah nafsu makan. Penambahan bahan sintetik kedalam sediaan jamu termasuk salah satu bentuk pemalsuan. Salah satu metode untuk mendeteksi adanya bahan kimia obat dalam produk jamu adalah dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT).
C. Metodologi 1. Identifikasi Pemalsuan Jamu Terdapat dua jenis jamu yang masing-masing diambil sebagai sampel 1 dan sampel 2. Tiap sampel jamu diambil 500 mg dan dilarutkan dalam 5 mL etanol. Dikocok dan dibiarkan mengendap, kemudian disaring. Obat pembanding disiapkan dengan konsentrasi 25 mg dalam 5 mL metanol, karena pembanding sudah merupakan senyawa murni jadi tidak perlu disaring. Pembanding yang digunakan adalah asetosal, antalgin dan deksametason. Kemudian dipersiapkan fase gerak berupa campuran kloroform dan metanol dengan perbandingan (7:3). Dua buah sampel dan tiga pembanding ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada fase diam silika gel GF254. Penotolan harus berada dalam satu garis lurus agar jarak migrasi tiap sampel dan pembanding bisa teramati dengan baik. Setelah selesai ditotolkan, plat KLT dimiringkan dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan eluen. Posisi plat adalah bagian yang ditotolkan berada dipaling bawah namun tidak sampai terendam oleh eluen. Ditunggu beberapa saat hingga sampel dan pembanding terelusi dengan baik. Kemudian noda
yang terbentuk diamati dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 atau 366. Nilai Rf bisa ditentukan.
2. Penentuan Sidik Ragam dengan KLT satu arah dan KLT sirkular Serbuk Rhei radix dan Aloe masing – masing diekstraksi masing – masing dalam metanol dengan pemanasan lalu disaring. Filtrat digunakan untuk KLT. Serbuk Rhei radix dan Aloe lainnya dipanaskan dalam HCl 7.5% kemudian diekstraksi dengan etilasetat. Fraksi etilasetat diuapkan dan dilarutkan dalam metanol. Cuplikan Rhei radix dan Aloe yang dihidrolisis maupun tidak dihidrolisis pada plat KLT satu arah dan KLT sirkular. Dielusikan menggunakan etilasetat-metanol-air (100:17:13). Kromatogram diamati dibawah UV 254nm dan UV 365 nm. Nilai Rf bisa ditentukan
D. Alat dan Bahan Alat
Bahan
Mikroskop
Jamu tradisional
Bejana KLT
Metanol
Lampu UV 254 dan
Senyawa pembanding (asetosal, antalgin, deksametason)
366
Plat KLT
Penampak bercak
Pereaksi penampak bercak
Kapiler
Rhei radix
Kertas saring
Gelas kimia
Etil asetat
Gelas ukur
Air
Kloroform
E. Data dan Pengolahan Data 1. Identifikasi Pemalsuan Jamu
5,65 cm
Aloe
Keterangan: Antalgin Asetosal Sampel 1 Deksametason Sampel 2 Nilai Rf masing-masing senyawa:
Berdasarkan hasil perhitungan Rf terdapat bahan kimia obat pada produk jamu tradisional yaitu pada sampel 1 terdapat deksametason dan sampel 2 terdapat asetosal. 2. Penentuan Sidik Ragam dengan KLT satu arah dan KLT sirkular
KLT SatuArah (Penentuan Sidik Ragam)
Pengembang: Etilasetat : methanol : air (100:17:13)
Jarak Tempuh Noda Rhei radix
Jarak Tempuh Eluen Aloe
KLT Sirkular (Penentuan Sidik Ragam)
Pengembang : Etilasetat : methanol : air (100:17:13) Jarak Tempuh Noda
Jarak Tempuh Eluen Aloe
Rhei radix
F. Pembahasan
Jamu adalah sebutan untuk obat tradisional dari Indonesia. Jamu dibuat dari bahanbahan alami, berupa bagian dari tumbuhan seperti rimpang, daun, kulit batang dan buah. Persyaratan suatu bahan bisa dikategorikan sebagai jamu adalah apabila manfaatnya telah dirasakan oleh 3 generasi. Bahan-bahan yang biasanya digunakan dalam produk jamu bukanlah bahan yang terstandar. Selain itu untuk pengujian khasiatnya tidak dilakukan uji klinis maupun praklinis. Dewasa ini sering kita jumpai di pasaran jamu
tradisional yang dipalsukan.
Pemalsuan yang dilakukan oleh produsen berupan penambahan bahan kimia obat yang memiliki indikasi sama dengan produk jamu, misalnya jamu untuk pegal linu ditambahkan analgesik. Bahan-bahan kimia lain yang biasa ditambahkan seperti antipireutik, vitamin B kompleks dan kortikosteroid. Penambahan bahan kimia obat ini menyalahi peraturan yang telah ditetapkan oleh BPOM karena bisa membahayakan konsumen. Seperti yang sama-sama kita ketahui, paradigma yang berkembang di tengah masyarakat awam adalah bahwa jamu dan obat-obat tradisional lebih aman dibandingkan dengan obat-obat sintesis. Sehingga kecenderungan untuk mengkonsumsi produk jamu lebih tinggi. Produsen yang tidak bertanggung jawab memanfaatkan kesempatan ini untuk menurunkan biaya produksi dengan khasiat produk yang sama melalui penambahan bahan kimia obat secara ilegal. Pastinya bahan kimia obat yang ditambahkan pada jamu tidak mencantumkan keterangan dosis pada kemasan. Jika masyarakat tidak mengetahui pasti komposisi jamu, penggunaan secara berlebihan bisa saja menimbulkan overdosis. Oleh karena itu diperlukan suatu metode untuk menganalisis keaslian suatu produk jamu. Cara
termudah
untuk
kromatografi lapis tipis.
melakukan
analisis
adalah
dengan
menggunakan
Kromatografi adalah proses pemisahan dua atau lebih senyawa berdasarkan distribusi pada dua fasa yaitu fasa gerak dan fasa stasioner. Kromatografi lapis tipis adalah kromatografi padat-cair dimana fasa diam normalnya adalah absorben polar dan fasa geraknya adalah pelarut tunggal atau campuran pelarut. Kromatografi dapat digunakan untuk:
Menentukan jumlah komponen pada campuran
Mengetahui identitas senyawa
Menentukan kondisi yang tepat untuk kormatografi kolom
Menganalisis fraksi dari kromatografi kolom Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan komponen menggunakan fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben inert. KLT merupakan
salah
satu
jenis
kromatografi
analitik.
Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan adsorben seperti silika gel, aluminiumoksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai fasa diam. Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan pengembang. Pemilihan pengembang didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu.Pengembang KLT dipilih dengan cara trial and error . Kepolaran pengembang sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh. Pada kromatografi sirkuler, fase gerak dialirkan dengan sebuah sumbu atau pompa melalui pipa kapiler di tengah lapisan fase diam. Senyawa terlarut bergerak cepat dari tengah penotolan menghasilkan lingkaran-lingkaran sempit. Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pengembang. Rumus faktor retensi adalah:
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel.Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar.
Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasadiam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisarantara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya. Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan s uatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjad ijelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV dibawah sinar UV 254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366 nm akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254 nm atau 366 nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat bercahaya. Metode deteksi lain adalah dengan menggunakan peraksi semprot. Pereaksi semprot yang umum digunakan : Pereaksi Semprot Vanilin Asam Sulfat
Komposisi 1 gram vanilin dalam asam sulfat pekat
Asam fosfomolibdat
Asam fosfomolibdat 5% b/v dalam etanol
Reagen Dragendorff
10 mL larutan KI 40% ditambahkan dengan 10 mL larutan 0,85 gram bismuth subnitrat dalam 10 mL asam asetat dan 50 mL air. Larutan tersebut diencerkan dalam 10 mL asam asetat dan 50 mL air
Perlakuan Disemprot dan dipanaskan hingga muncul warna Disemprot dan dipanaskan hingga muncul warna
Keterangan Pereaksi umum yang digunakan. Terpen akan menghasilkan warna merah atau biru Untuk mendeteksi terpen dengan bercak biru berlatar kuning
Disemprot dan dipanaskan hingga muncul warna
Deteksi alkaloid menghasilkan warna oranye pekat hingga merah
Mekanisme pemisahan dengan kromatografi lapis tipis berdasarkan prinsip adsorbsi dan desorbsi. Adsorbsi adalah keadaan senyawa tertahan pada permukaan
fasa stasioner dalam hal ini adalah silica gel . Ada beberapa faktor yang mempengaruhi kemampuan adsorpsi suatu adsorben diantaranya adalah 1. Luas permukaan adsorben Semakin luas permukaan adsorben maka semakin banyak adsorbat yang diserap sehingga proses adsorpsi semakin efektif 2. Ukuran partikel Semakin kecil ukuran partikel maka semakin besar kecepatan adsorpsinya 3. Waktu kontak Semakin lama waktu kontak dapat memungkinkan proses difusi dan penempelan molekul adsorbat berlangsung lebih baik 4. Distribusi ukuran pori Distribusi pori akan mempengaruhi distribusi ukuran molekul adsorbat yang masuk dalam partikel adsorben. Kebanyakan adsorben merupakan bahan yang sangat berpori dan adsorpsi berlangsung terutama pada dinding pori (Kiranoudis et al. 1992) Pada kromatografi lapis tipis, fasa stasioner yang digunakan biasanya adalah adsorben dengan tingkat kepolaran yang sangat tinggi, contohnya alumina (Al 2O3) atau silica gel (SiO2). Pada saat pemisahan, solute akan teradsorpsi pada fasa stasioner karena memiliki sifat kepolaran yang sama dengan fasa stasionernya. Pengembang yang memiliki kepolaran lebih tinggi dari solute akan mendesak solute sehingga solute terlepas dari fasa stasionernya. Setelah itu, solute akan terdesorpsi dan terbawa oleh fasa geraknya. Desorpsi adalah proses pelepasan kembali molekul atau senyawa yang telah berikatan dengan gugus aktif pada adsorben . Semakin dekat kepolaran atara sampel dengan fasa gerak maka sampel akan semakin terbawa oleh fasa gerak tersebut. (Park et al. 2002) Proses pemisahan dua senyawa menggunakan kromatografi lapis tipis adalah
Pada percobaan dilakukan identifikasi pemalsuan jamu menggunakan kromatografi lapis tipis. Sampel jamu yang akan diidentifikasi dilarutkan terlebih dahulu dalam metanol. Obat pembanding yang merupakan bahan kimia yang sering ditambahkan dalam jamu dilarutkan pula dalam metanol.Obat pembanding yang digunakan adalah asetosal, antalgin dan deksametason. Selanjutnya dipilih pengembang yang sesuai yaitu kloroform : metanol dengan perbandingan 7 : 3. Menurut literatur, campuran pengembang yang biasa digunakan untuk kromatografi lapis tipis dengan pelat silica gel adalah
kloroform
metanol
(7:3)
dan
kloroform-etanol-air-HCl
(100:90:5:3.5).
Sedangkan untuk pelat selulosa biasa digunakan pengembang kloroform-metanol-air (100:90:14). Digunakan pengembang campuran kloroform-metanol (7:3) agar diperoleh kepolaran yang diinginkan. Jika hanya digunakan kloroform yang bersifat non polar, maka senyawa akan teradsorpsi dalam waktu yang sebentar kemudian terlarut dalam fasa gerak dengan cepat sehingga sulit untuk dideteksi. Oleh sebab itu, ditambahkan metanol untuk menambah sifat kepolaran. Chamber/bejana yang digunakan pada KLT harus dijenuhkan terlebih dahulu menggunakan kertas saring. Cara menjenughkan bejana ini adalah dengan melapisi dinding bejana dengan kertas aring lalu diteteskan masing – masing pelarut dan biarkan pelarut terserap sempurna oleh kertas siring. Tujuan dilakukan penjenuhan adalah untuk menyamakan tekanan uap pelarut sehingga saat proses pemisahan, pelarut akan naik dalam waktu yang bersamaan sehingga hasil yang didapatkan lebih akurat. Sampel jamu dan obat pembanding yaitu asetosal, antalgin dan deksametason ditotolkan pada plat KLT. Selanjutnya plat dielusikan hingga kurang lebih 1 cm dibawah ujung plat agar dapat dihitung distribusinya. Setelah itu, dilakukan visualisasi pada UV 254 nm dan UV 365 nm. Digunakan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm karena pada panjang gelombang tersebut akan menghasilkan nilai absorbsi maksimum pada banyak senyawa. Selain itu, panjang gelombang 254 nm digunakan untuk analisis gugus cincin benzena karena akan tampak bright line pada panjang gelombang tersebut. Setelah itu, dibandingkan Rf antara sampel jamu dan obat pembanding. Pada percobaan penentuan sidik ragam dengan KLT satu arah dan sirkuler digunakan sampel Rhei radix dan Aloe vera. Sampel Rhei radix dan Aloe vera yang digunakan dibandingkan dalam keadan normalnya dan keadaan terhidrolisis. Namun, pada saat percobaan penentuan sidik ragam keadaan terhidrolisis tidak dilakukan.
Untuk penyiapan sampel Rhei radix dan Aloe vera keadaan normal, masing – masing sampel dilarutkan dan dipanaskan kemudian disaring. Proses ini dilakukan untuk mengekstraksi masing – masing simplisia. Untuk penyiapan sampel Rhei radix dan Aloe vera keadaan terhidrolisis, masing –masing simplisia dihidrolisis terlebih dahulu dengan HCl 7.5 % barulah diekstraksi dengan etilasetat. Setelah itu, fraksi etilasetat diuapkan dan dilarutkan dalam metanol. Sampel Rhei radix dan Aloe vera yang telah disiapkan, ditotolkan pada KLT satu arah dan KLT sirkular dengan menggunakan pengembang etilasetat-metanol-air (100:17:13). Penggunaan campuran pengembang tersebut untuk mendapatkan kepolaran yang sesuai. Kemudian diamati dibawah UV-254nm dan UV-365nm. Untuk deteksi dibawah UV 365nm, ditambahkan KOH dalam etanol untuk memperkuat intensitas fluorosens. Dari hasil percobaan, digunakan dua sampel jamu tradisional. Setelah diuji menggunakan KLT, didapati bahwa kedua produk jamu ini mengandung tambahan bahan kimia obat. Sampel 1 mengandung deksametason dan sampel 2 mengandung asetosal berdasarkan nilai Rf masing-masing sampel yang dibandingkan dengan standar. 1. Penentuan Sidik Ragam dengan KLT satu arah dan KLT sirkular (NISA tolong ditambahin ya) G. Kesimpulan Sampel 1 mengandung deksametason. Sampel 2 mengandung asetosal. H. Daftar Pustaka http://ulpk.pom.go.id/ulpk/index.php?task=view&id=41&option=com_easyfaq&Itemid=26 &lang=in (Diakses pada tanggal 15 Maret 2014 pukul 12.00) http://courses.chem.psu.edu/chem36/Experiments/PDF%27s_for_techniques/TLC.pdf (diakses tanggal 15 Maret 2014, 11:10) J.Flieger. 2000. Thin Layer Chromatography . Academic Press : Poland (hal 1956-1971) Yinon, Yehuda. 2000. Modern Methods and Applications in Analysis of Explosives. John Wiley (hal 32-36)
