Tugas Makalah
Bioteknologi Molekuler
ANALISIS DNA DAN RNA DENGAN MENGGUNAKAN
TEKNIK ELEKTROFERESIS GEL
DISUSUN OLEH
KELOMPOK I:
M. ILHAM (H311 14 001)
ELVA SIHAYA (H311 14 002)
SRI RAMDANI (H311 14 006)
RISMA ACHMAD (H311 14 007)
FENTI SAMPE SIALLA' (H311 14 012)
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2017
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT, yang atas rahmat-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan penyusunan makalah yang berjudul "Analisis DNA Dan RNA Dengan Menggunakan Teknik Elektroferesis Gel". penyusunan makalah ini merupakan salah satu tugas yang diberikan dalam mata kuliah Bioteknologi Molekuler di Departemen Kimia Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas hasanuddin.
Dalam penyusunan makalah ini kami merasa masih banyak kekurangan baik pada teknis penulisan maupun materi, mengingat akan kemampuan dimiliki. Untuk itu, kritik dan saran dari semua pihak sangat kami harapkan demi penyempurnaan pembuatan makalah ini.
Dalam penyusunn makalah ini kami menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada pihak-pihak yang membantu menyelesaikan makalah ini.
Makassar, 17 Oktober 2017
Penyusun
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR................................................................................
i
DAFTAR ISI ………………………………………………………….....
ii
BAB I. PENDAHULUAN …………………………………..................
1.1 Latar Belakang …………………………………….............
1.2 Rumusan Masalah ……...…………………………….........
1.3 Tujuan ………………………………………….................
1
BAB II. PEMBAHASAN………. …………............................................
2.1 Pengertian DNA dan RNA………………………..............
2.2 Perbedaan DNA dan RNA..................................................
2.3 Pengertian Elektroforesis.....................................................
2.3.1 Bagian-bagian dari Elektroforesis ..............................
2.3.2 Fungsi Elektroforesis…………………………………
2.3.3Analisis DNA dan RNA dengan Teknik Elektroforesis Gel…………………………………..
2.3.4 Teknik Elektroforesis Analisis DNA, RNA maupun Protein……………………………………………...
2.3.5Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pemisahan Komponen Pada Elektroforesis DNA…………….
3
3
8
BAB III. PENUTUP………….......………….........................................
3.1 Kesimpulan…………………………………………………
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………..........
2
BAB 1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik).
Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga DNA, RNA dan protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel partikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan. Elektroforesis dapat dibagi menjadi tiga yaitu elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan elektroforesis kapiler. Dalam makalah ini dibahas elektroforesis gel.
Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah makalah ini yaitu :
Apakah yang dimaksud dengan DNA dan RNA ?
Apa perbedaan DNA dan RNA
Bagaimanakah teknik analisis DNA, RNA menggunkan metode elektroferesis gel ?
Tujuan
Adapun tujuan makalah ini yaitu :
Mengetahui pengertian DNA dan RNA ?
Mengetahui perbedaan DNA dan RNA
Mengetahui teknik analisis DNA, RNA menggunkan metode elektroferesis gel ?
BAB II
PEMBAHASAN
2. 1 Pengertian DNA dan RNA
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA).
DNA, Deoxyribose Nucleic Acid adalah asam nukleotida, biasanya dalam bentuk heliks ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan perkembangan biologis dari seluruh bentuk kehidupan sel. DNA seringkali dirujuk sebagai molekul hereditas karena ia bertanggung jawab untuk penurunan sifat genetika dari kebanyakan ciri yang diwariskan. Pada manusia, ciri-ciri ini misalnya dari warna rambut hingga kerentanan terhadap penyakit. Selama pembelahan sel, DNA direplikasi dan dapat diteruskan ke keturunan selama reproduksi (Campbell,2000).
DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3 suatu mononukleotida dan posisi 5 pada mononukleotida lainnya.Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel.
Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya.
2.2 Perbedaan DNA dan RNA
Meskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki perbedaan dengan DNA, antara lain yaitu:
a). Bentuk serta Ukuran DNA dan RNA
Pada umumnya molekul RNA lebih pendek dari molekul DNA. DNA berbentuk double helix, sedangkan RNA berbentuk pita tunggal. Meskipun demikian pada beberapa virus tanaman, RNA merupakan pita double namun tidak terpilin sebagai spiral. Rantai DNA memiliki lebar 22-24 Å, sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 Å[2]. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai. Misalnya, kromosom terbesar pada manusia terdiri atas 220 juta nukleotida.
b) Fungsi DNA dan RNA
DNA berfungsi memberikan informasi atau keterangan genetik, sedangkan fungsi RNA tergantung dari macamnya, yaitu:
RNA d, menerima informasi genetik dari DNA, prosesnya dinamakan transkripsi, berlangsung didalam inti sel.
RNA t, mengikat asam amino yang ada di sitoplasma.
RNA r, mensintesa protein dengan menggunakan bahan asam amino, proses ini berlangsung di ribosom dan hasil akhir berupa polipeptida.
Namun demikian, peran penting RNA terletak pada fungsinya sebagai perantar antara DNA dan protein dalam proses ekspresi genetik karena ini berlaku untuk semua organisme hidup. Dalam peran ini, RNA diproduksi sebagai salinan kode urutan basa nitrogen DNA dalam proses transkripsi. Kode urutan basa ini tersusun dalam bentuk 'triplet', tiga urutan basa N, yang dikenal dengan nama kodon. Setiap kodon berelasi dengan satu asam amino (atau kode untuk berhenti), monomer yang menyusun protein. Lihat ekspresi genetik untuk keterangan lebih lanjut.
c) Komponen DNA dan RNA
Gambar 2.1 Komponen DNA dan RNA
Komponen :
Gula pada DNA deoksiribosa , sedangkan RNA adalah ribosa
Struktur dasar RNA mirip dengan DNA. RNA merupakan polimer yang tersusun dari sejumlah nukleotida. Setiap nukleotida memiliki satu gugus fosfat, satu gugus gula ribosa, dan satu gugus basa nitrogen (basa N). Polimer tersusun dari ikatan berselang-seling antara gugus fosfat dari satu nukleotida dengan gugus gula ribosa dari nukleotida yang lain.
Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya; gula RNA adalah ribosa.
d) Lokasi DNA dan RNA
DNA pada umumnya terdapat di kromosom, sedangkan RNA tergantung dari macamnya, yaitu:
RNA d(RNA duta), terdapat dalam nukleus, RNA d dicetak oleh salah satu pita DNA yang berlangsung didalam nukleus.
RNA p(RNA pemindah) atau RNA t(RNA transfer), terdapat di sitoplasma.
RNA r(RNA ribosom), terdapat didalam ribosom.
e) Struktur DNA dan RNA
Gambar 2.2 Struktur DNA dan RNA
Basa nitrogen :
Purin — DNA adalah Adenin dan Guanin, pada RNA adalah Adenin dan Guanin
Pirimidin — DNA adalah Timin dan sitosin, pada RNA adalah Urasil dan sitosin
Kadar: pada DNA: tetap (tidak dipengaruhi oleh kecepatan sintesis protein), RNA:berubah-ubah, tergantung aktivitas sintesis protein.
Perbedaan RNA dengan DNA terletak pada satu gugus hidroksil tambahan pada cincin gula ribosa (sehingga dinamakan ribosa). Basa nitrogen pada RNA sama dengan DNA, kecuali basa timin pada DNA diganti dengan urasil pada RNA. Jadi tetap ada empat pilihan: adenin, guanin, sitosin, atau urasil untuk suatu nukleotida.Selain itu, bentuk konformasi RNA tidak berupa pilin ganda sebagaimana DNA, tetapi bervariasi sesuai dengan tipe dan fungsinya.
DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalah adenin (dilambangkan A), sitosin (C, dari cytosine), guanin (G), dan timin (T). Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan sitosin (Fessenden dan Joan, 1986) .
2.3 Pengertian Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel atau spesiesatau ion atau partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik. Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current).Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik. Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik.
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pada bentuk molekulnya.
Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik.Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
2.3.1 Bagian-bagian dari Elektroforesis
Gambar 2.3 Elektroforesis Gel Agarosa
Gambar 2.4 Elektroforesis Gel Akrilamida
Gel
Salah satu komponen dari elektroforesis adalah gel. Gel merupakan media yang berfungsi sebagai matriks Penyaring molekul. Pemilihan gel bergantung pada ukuran molekul yang akan di elektroforesis.
Ada dua jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
Gel agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 50 bp)dan digunakan secara horizontal. Gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 50 bp) dan digunakan secara vertikal. Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarosa.Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif.
Gel agarosa dimurnikan dari polisakarida alga Rhodophyla. Gelidian dan Glaucaria adalah komponen yang dimodifikasi residu galaktosanya. Didalam hubungan dengan polisakarida, agropefin dibentuk agar. Agarose larut pada buffer (TAE) yang mendidih dan ditunggu untuk dingin, Hasil ini dicetak pada cetakan gel yang ditempatkan pada suhu ruang.
Gambar 2.5 Agarosa
Poliakrilamida dibentuk dari akrilamida dan N,N'-methyle-bis-akrilamida yang dihubungkan dengan reaksi polimerisasi dengan penambahan ammonium perisulphate dan N,N,N,N'-tetramethylethylenediamin (TEMED). TEMED adalah katalis yang dibentuk dari radikal bebas ionperisulfate dan diinisiasi polymerization dari akrilamida. Poliakrilamida dapat dikondisikan sebagai polimer yang netral, kationik, anionik, atau amfoter dengan sifat fisika dan kimia, panjang dan berat molekul yang bervariasi.
Gambar 2.6 Polimerisasi akrilamida
Perbedaan penggunaan pada gel agarosa dengan gel akrilamida adalah :
Gel Poliakrilamid
Lebihefektifuntukpemisahanfragmen DNA antara 5-50bp
Power: ekstrimtinggi.
Ukuranperbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp.
Pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarosa, karena biasanya digunakan poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi.
Medan gerak secara vertical dan listriknya konstan.
Gel Agarosa
Power lebih rendah.
Mempunyailajupemisahanlebihcepat.
Dapat memisahkan fragmen DNA antara 50 bp – 50kb tergantung dari konsentrasi gel agarosa yang digunakan.
Medan gerak biasanya horizontal.
Buffer
Buffer atau larutan penyangga yang digunakan pada proses elektroforesis berfungsi untuk menjaga kesetimbangan pH dan memberikan ion untuk konduktivitas saat proses elektroforesis.
Jenis-jenis buffer yang digunakan pada proses elektroforesis, yaitu :
Elektroforesis DNA :
Buffer TAE (Tris-acetate-EDTA), atau
TBE (Tris-borate-EDTA )
Loading buffer
Elektroforesis Protein yaitu Buffer Tris
Proses Elektroforesis
Elektroforesis gel agarosa memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.
Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.
Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa.
Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.
Proses elektrolisis terbagi menjadi tiga tahap yaitu, tahap pembuatan matriks gel, eletroforesis, visualisasi atau stainning.
Pembuatan matriks gel
Untuk mempersiapkan gel, agarosa bubuk dicampur dengan buffer elektroforesis dengan konsentrasi yang diinginkan, dan dipanaskan dalam oven microwave untuk mencairkannya. Etidium bromida ditambahkan ke gel (konsentrasi akhir 0,5 ug / ml) untuk memfasilitasi visualisasi DNA setelah elektroforesis. Setelah pendinginan larutan menjadi sekitar 60oC, larutan dituangkan ke nampan pengecoran berisi sisir sampel dan pemadatan akan terjadi pada suhu kamar. Setelah gel telah dipadatkan, sisir diambil dengan hati-hati agar jangan sampai merobek bagian bawah sumur.
Gambar 2. 7 Pembuatan Matriks Gel Agarosa
Elektroforesis
Gel yang berada dalam nampan plastik, dimasukkan ke ruang horizontal elektroforesis dan ditutupi dengan buffer. Campuran sampel yang mengandung DNA dicampur loading buffer kemudian dipipet ke dalam sumur sampel, tutup dan kekuasaan lead ditempatkan pada aparatus dan dialirkan arus. Aliran arus dapat dipastikan dengan mengamati gelembung dari elektroda. DNA akan bermigrasi ke arah elektroda positif, yang biasanya berwarna merah, yang menunjukkan kandungan muatan negatif.
katodaanodaGel agarosabuffer
katoda
anoda
Gel agarosa
buffer
Gambar 2.8 Proses Elektroforesis
Visualisasi atau stainning
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan seperti Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel. Jarak perpindahan DNA dalam gel dapat diperkirakan melalui pemantauan visual dengan menggunakan pewarna pelacak seperti pewarna bromofenol biru dan xilena cyanol.
Gambar 2.9 Visualisasi (stainning)
Fungsi Elektroforesis
Berikut ini adalah beberapa fungsi dari elektroforesis, yaitu:
menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat
sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu
Pada bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.
Dalam biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
2.3.3 Analisis DNA dan RNA dengan Teknik Elektroforesis Gel
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler protein (Jean and Francois G., 2010)
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urine, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Lee & Bahaman, 2010).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999).
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu (Lee & Bahaman, 2010):
Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).
Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).
Gambar 2.10 Rangkaian Alat Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari
Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).
2.3.4 Teknik Elektroforesis Analisis DNA, RNA maupun Protein
Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis fargmen-fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA yang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel agarosa yaitu suatu bahan semi-padat ditentukan ukurannya dengan cara membuat dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer. Agar dapat larut dengan baik, pelarutannya dibantu dengan pemanasan, misalnya menggunakan oven gelombang mikri (microwave oven). Dalam keadaan panas, gel akan berupa cairan sehingga mudah dituang ke atas suatu lempeng (plate) yang biasanya terbuat dari Perspex. Sebelum mendingin dan memadat, pada ujung gel tersebut dibuat lubang-lubang dengan menggunakan lembaran Perspex tipis yang dibentuk menyerupai sisir. Sisir tersebut di tancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Dengan demikian, pada waktu gel memadat dan sisirnya diambil terbentuklah lubang-lubang kecil. Kedalam lubang-lubang kecil itulah sampel molekul DNA dimasukkan. Gel agarosa yang sudah terbentuk kemudian dimasukkan ke dalam suatu tanki yang berisi buufer yang sama dengan yang digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat dibuat misalnya dengan tris-asetat EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE) (Yuwono, 2007).
Setelah DNA dimasukkan kedalam lubang sampel, arus listrik dialirkan kutub yang sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negative, sedangkan kutub lainnya posistif. Oleh karena DNA bermuatan negative maka molekul-molekul DNA akan bergerak ke arah kutub positif. Setelah beberapa waktu gel kemudian direndam dalam larutan yang mengandung etidium bromida. Etidium bromida akan menginteraksi (menyisip ke dalam) DNA, penggunaan etidium bromida dimasukkan untuk membantu visualisasi karena etidium bromida akan memendarkan sinar ultraviolet. Jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah maka akan tampak citra berupa pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis. Molekul RNA dapat dianalisis dengan prinsip yang sama, yaitu menggunakan gel agarosa, namun dengan menggunakan buffer yang berbeda yaitu yang mengandung formaldehid (Yuwono, 2007).
Gambar 2.11 Perangkat Elektroforesis SDS-PAGE
Elektroforesis protein pada dasarnya dilakukan dengan prinsip serupa seperti yang digunakan dalam elektroforesis DNA, namun gel yang digunakan adalah gel poliakrilamid. Seringkali dalam pembuatan gel akrilamid ditambahkan sodium dodecyl sulphate (SDS) yang merupakan senyawa untuk mendisosiasikan protein menjadi subunitnya. Metode elektroforesis yang demikian disebut SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate polyacrylamid gel electrophoresis). Berbeda halnya dengan DNA, protein yang dielektroforesis dapat dianalisis dengan pengecatan menggunakan Coomassie Blue. Senyawa ini biasanya ditambahkan bersama-sama dengan sampel. Pengecatan protein dapat juga dilakukan dengan larutan perak nitrat yang lebih sensitive disbanding dengan Coomassie blue (Yuwono, 2007).
2.3.5 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pemisahan Komponen Pada Elektroforesis DNA
Berikut ini merupakan faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan komponen pada elektroforesis DNA, adalah :
Ukuran molekul DNA
Molekul yang lebihbesarakanbergeraklebihlambat, misalnya DNA linier lebihcepatdibanding DNA sirkuler. Jarakmigrasimolekul DNA pada gel adalahlajuterbalikproporsional log-10 darijumlahpasangan basa.
Gambar 2.12 Migrasi DNA Berdasarkan Molekul DNA
Gambar di atas menunjukkan hasil khas elektroforesis DNA dalam kaitannya dengan ukuran fragmen DNA dan jarak yang dimigrasikan melalui gel agarose. Di sebelah kiri, ada sampel penanda yang bisa dijadikan kontrol dan sebagai referensi untuk panjang DNA (pada pasangan basa). Di sebelah kanan penanda, ada tiga contoh sampel DNA yang berbeda: Contoh A, Contoh B dan Contoh C. Gambar menunjukkan betapa kecil fragmen DNA bergerak lebih jauh di seluruh gel agarose daripada fragmen DNA yang lebih besar. Jarak ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi atau mencocokkan sekuens DNA tertentu. Grafik di sebelah kanan gambar menunjukkan hubungan nonlinier, hubungan antara ukuran fragmen DNA dan jarak yang dimigrasikan. Ini adalah kurva negatif karena fragmen DNA semakin besar, mereka bermigrasi lebih sedikit jaraknya melalui gel.
Konsentrasi gel agarose
Fragmen DNA yangbervariasiukuranmolekulnyaakanberberaksesuaidengankonsentrasidari gel agarosa yang digunakan.
Gambar 2.13 Migrasi DNA Berdasarkan Konsentrasi Gel Agarosa
Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III).Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasip ada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:
Terutama konsentrasi gel agarose
Kekuatan aruslistrik dan ionik buffer yang digunakan
Densitas kembaran super heliks pada bentuk I
Padabeberapakondisibentuk I lebihcepatdisbandingbentuk III
Tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasiEtBr meningkat, pengikatan DNA meningkat pula sehinggamobilitasmeningkattajam, contoh untuk bentuk I
Konsentrasi EtBr kritis antara 0.1mg/ml-0.5ml/mg
Penggunaan Voltage danarahdaribidangelektris
Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarose bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodic sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.
Komposisibasa DNA atau temperatur
Baikkomposisibasamaupun temperatur tidakbegituberpengaruh, mobilitas DNA stabilpada temp. 4-30°C. Dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada suhu kamar
Keberadaan pewarna DNA
Iintercalating agentethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%.Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengancara gel diletakkan pada media UV-transil luminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dariEtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relatif rendah dan pendaran fluorensen minimum.
Komposisi buffer elektroforesis
Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarose. Misal:
Tris-asetat; umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa baik elektro elusi maupun gel ekstraksi.
Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarosa kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarosa.
BAB III
PENUTUP
Kesimpulan
Adapun kesimpulan dari makalah ini yaitu
unit-unit pembangun dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA).
Perbedaan DNA dan RNA dapat lihat berdasarkan bentuk serta ukuran , fungsi, komponen, lokasi DNA dan RNA
Pemisahan DNA ataupun RNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA dan RNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik. DNA dan RNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif, hanya saja Buffer yang digunakan dielektoforesis gel berbeda untuk DNA biasanya menggunakan buffer tris-asetat EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE), sedangkan RNA buffer yang mengandung formaldehid.
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N.A, J.B. Reece, and L.G. Mitchell, 2000. Biology. 6th ed. Jakarta : Erlangga.
Fessenden, RJ dan Joan F. 1986. Kimia Organik. Jakarta: Erlangga.
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA, 21(1), 1-8.
Yuwono, T., 2007. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.
Sumber lain :
http://diazonium.wordpress.com/2012/05/18/tabel-perbedaan-dna-rna/diakses tanggal 9 Oktober 2017.
http://hidayatulfaizah.wordpress.com/2011/03/03/perbedaan-dna-dan-rna/ diakses tanggal 9 Oktober 2017.
