Kloning DNA.pptx

Cloning Steps

Choosing Vector and Host

Cloning: What and Why

Copying gen of interest

Inserting and Ligation

Transforming

Purification and Sequencing

Transformasi

Buatan

Kimiawi

Fisika

Alami

Elektroporasi

TRANSFORMASI

Proses memasukkan DNA luar (exogeneus) ke dalam sel

Enzim T4 Ligase

DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofage T4

Enzim deoksinukleotidil transferase

Untuk menyintesis utas tunggal homopolimerik 3'.

Enzim DNA Ligase dari bakteri

Blunt ended DNA + linker (T4 ligase)

Digest with appropriate R.E.

Ligate

KEUNGGULAN

Jumlah salinan tinggi

Mudah uji seleksi
Memiliki antibiotik Ampicilin

Memiliki MCS

Penyalinan dipengaruhi oleh gen lacZ (galaktosidase) yang akan dikenali β lacZ pada E.Coli

Mudah uji Screening
Keberadaan lacZ dapat diuji dengan medium yg mengandung X-gal

Pemilihan vektor & host

Memotong Gen of interest dengan RE, lalu proses PCR

Memotong plasmid dengan RE yang sama

Memasukkan goi ke dalam plasmid (Ligasi)

Memasukkan plasmid rekombinan ke dalam host (Transformasi)

Proses Seleksi

Sequencing

Modifikasi gen of interest (endo-1,4-beta-d-glucanase)
(Restriksi dengan Enzim BamHI dan HindIII)
Kloning = proses memperbanyak organisme yang identik
Kloning dalam bioteknologi merujuk pada penggandaan fragmen DNA, sel, ataupun organ MH.
Tahap paling penting dalam riset bioteknologi
Cloning: What and Why?
PCR
Polymerase Chain Reaction
Clone DNA in Cell
Memperbanyak fragmen DNA
Kebutuhan riset
Memperoleh fragmen DNA tertentu
Memperbanyak fragmen DNA seiring dengan perbanyakan host
Kebutuhan produksi & riset
Memperoleh hasil ekspresi DNA (protein, metabolit, karakteristik bakteri, dll)

Hasil sangat identik
Proses cepat (tanpa reproduksi)
Therapeutic Cloning
Reproductive Cloning

Mengandung informasi genetik
Mudah dan cepat dibiakkan
Tidak butuh area yang besar
Relatif mudah direkayasa
Ekspresi cepat terlihat

Cloning DNA in Bacteria

Tahapan Teknologi DNA Kloning

Plasmid
(vektor)

+
DNA yang akan di'klon
(gene of interest)'

DNA
rekombinan

Sel Inang (host)

Penumbuhan
Sel inang
Membawa klon dan perbanyakan
Diagram Proses Kloning DNA
Outline
Dna cloning
KELOMPOK 2
Famila Anindia Putri
Faustina P.M
Giovanni Anggasta
Nadia Tuada
M. A. H. Vinci Kurnia
Sonia Limoes

Membentuk R.E site pada gen of interest
Ada 2 cara:
1. Menggunakan linkers untuk membentuk RE site baru (membentuk sticky end pada molekul blunt end)

Ligasi DNA rekombinan
DNA ligation: pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 3' hidroksil dari satu nukleotida dengan ujung 5 pospad dari nuklotida lain.

Terdapat 3 cara ligase in vitro:
Ligasi merupakan proses peyisipan atau penggabungan fragmen DNA dengan plasmid.
LIGASI gen of interest ke dalam plasmid

Pengujian dengan gel elektroforesis

Ternyata, proses modifikasi gene of interest berhasil.
MW: 50 bp DNA Ladder

1: endo1,4-beta-D-glucanase cloned
BamHI + HindIII
1. 2656 bp
2. 930 bp

Pemotongan dengan BamHI dan HindIII membagi plasmid menjadi dua bagian
Hasil amplifikasi PCR
Setelah amplifikasi PCR selesai, terbentuk daerah recognition site BamHI dan HindIII pada gene of interest

Desain primer
Forward primer
5' GCA TGA GGA TCC ATG ACATTTCTTCACTTCCACAC 3'

Basa
tambahan
BamHI site
Start codon

Gen of interest
Reverse primer
20 annealed bp
Tm = 53oC
GC content 46%

5' GCG CGC CAA GCT TTA AAGTAGACTACAGTTGTTATT 3'
20 annealed bp
Tm = 48oC
GC content 42%

HindIII site

Stop codon
2. Membentuk R.E site dengan PCR
Kode basa RE site ditambahkan pada ujung 5' PCR primer
PCR fragmen kemudian dikontakkan dengan R.E. sesuai

Umumnya, enzim bekerja dengan lebih baik jika dia punya beberapa basa tambahan pada ujng. Enzim tidak bekerja dengan baik jika posisinya berada pada paling ujung molekul

Membentuk R.E site pada gen of interest
Isolasi Gen of interest

Gen of Interest (Cellulose)

Teknik Kloning yang dipilih: Directional Cloning
Jenis kloning untuk memasukkan DNA insert dengan posisi/arah yang sesuai (tidak terbalik)
Bisa dilakukan dengan memotong vektor di dua bagian, dengan dua enzim restriksi yang berbeda
DNA insert juga dikontruksi ulang dengan dua enzim restriksi yang sama
Menghindari terjadinya self-ligation jika menggunakan hanya 1 enzim restriksi

Enzim Restriksi (RE)
Enzim restriksi memotong DNA pada daerah pengenalan (recognition sites) dan membentuk ujung tertentu
STICKY ENDS: 5' dan 3' OVERHANGS
5' overhangs: Enzim memotong secara asimetris pada recognition sites sehingga terjadi penjuluran untai pendek di ujung 5'. Contoh: Bam HI
3' overhangs: Sama seperti 5' overhangs, namun terbentuk pada ujung 3'. Contoh: HindIII, KpnI
BLUNT ENDS
Blunts: Enzim memotong tepat di tengah bagian dan membagi DNA menjadi dua, tanpa overhangs.
Contoh: SmaI
Enzim Restriksi yang dipilih:
BamHI

HindIII

Kenapa memilih BamHI dan HindIII?
Recognition site enzim ini ada pada pUC19 dan enzim ini memotong plasmid hanya pada MCS (tidak di bagian lain)
Enzim ini tidak memiliki recognition site pada gen of interest, sehingga tidak akan memotong-motong gen of interest
R.E. Characteristic
Memotong pada site yang tidak dimiliki gen of interest
Baik memotong pada suhu 370C dan sticky end
Dapat terinaktifasi karena suhu
Bekerja pada larutan buffer NEB 3.1
Memotong pada site yang tidak dimiliki gen of interest
Baik memotong pada suhu 370C dan sticky end
Menyebabkan star activity jika terdapat Mn2+
Bekerja pada larutan buffer NEB 3.1

HindIII
BamHI

Hasil Restriksi pada Plasmid pUC19

Menentukan daerah penyisipan pada vektor

E.Coli Host
Advantages
Mudah digunakan
Biaya pembiakan murah
Pertumbuhan sangat cepat (rapid)
Pengekspresian gen mudah dikontrol
Banyak pilihan vektor dan metode fusi
Produksi sangat tinggi umumnya 5-20% dari total protein sel
Disadvantages
Endotoxin
Jarang terjadi modifikasi post-translasi
Banyak produk samping (metabolit)

Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi plasmid ke E.Coli
DNA sequence terlibat dalam transkripsi
DNA sequence terlibat dalam translasi
Kekuatan Promotor
Kestabilan vektor dalam host
Kecenderungan penggunaan kodon
Cloning Site

E.Coli Host
Cloning Parts
PEMILIHAN VEKTOR & HOST
LANGKAH 1
PLASMID VEKTOR
adalah kromosom DNA ekstra (berbentuk DNA sirkular kecil) yang terdapat pada sel bakteria.
Vektor plasmid 1.2–3kb dan memiliki:
Replication Origin (ORI)
Segmen DNA yang dikenali oleh enzim replikasi DNA, untuk dimulainya proses replikasi
Gen Seleksi (Selective marker)
Contoh: Pada gambar di samping, gen seleksi ampr; yang membuat plasmid resistan terhadap antibiotik ampicillin
3. Daerah penyisipan DNA luar (exogenous DNA)
MULTIPLE CLONING SITE
Banyak vektor kloning memiliki multiple cloning site atau polylinker: segmen DNA dengan beberapa situs restriksi enzim yang saling berdekatan
Memotong plasmid dengan RE pada daerah polylinker tidak akan mengganggu/mengubah sifat utama vektor
Gene yang ingin dikloning dapat disisipkan di salah satu daerah RE site dalam polylinker

Panjang DNA 2686 bp (pasang basa) dengan untai ganda
Memiliki 54 pasang basa MCS polylinker dengan 13 diantaranya merupakan enzim endonuklease restriksi-hexanucleotide yang unik/khas

Diisolasi dari E.Coli ER2272
pUC19 vector

Ligasi DNA rekombinan (2)
Ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4OC - 15OC dengan waktu inkubasi satu malam (overnight)

Suhu lebih besar dari ini akan menyebabkan ikatan hidrogen yang terbentuk secara alami di antara sticky ends menjadi tidak stabil dan rusak akibat panas
Gen target biasanya ditambahkan lebih banyak dibandingkan dengan vektor (1:3), tujuannya: untuk memperbesar peluang gen target berikatan dengan vektor (Anam 2010).
Fig. 8.5

*Dipotong dengan enzim RE yang sama
*DNA ligase

Hasil Ligasi endo-1,4-β-D-glucanase ke dalam pUC19
Metode Sanger
Dikembangkan oleh Frederick Sanger tahun 1975
Lebih populer daripada metode Maxam-Gilbert
Mengalami banyak perkembangan dari tiap – tiap percobaannya hingga akhirnya ditemukan automated sequencing
Metode Maxam - Gilbert
Kurang populer dibanding Sanger karena rumit
DNA yang akan diurutkan dilabel dengan enzim kinase dengan 32P ATP di ujung 5'
Diberi piperidin panas (CH2)5NH agar DNA pecah
Fragmen dimasukkan ke dalam masing – masing empat tabung reaksi berisi A, T, G dan C
Dilakukan elektroforesis untuk melihat urutannya
Definisi
Merupakan cara untuk mengetahui urutan basa dalam suatu fragmen DNA
Mirip dengan PCR, namun PCR menggunakan deoxy-Nucleotyde Triphospate (dNTP), sedangakn sequencing menggunakan dideoxy-Nucleotyde Triphospate (ddNTP)

Komponen DNA Sequencing
Metode Sanger
Primer (oligonukleotida)
Polimerase
dNTP (dATP, DGTP, dCTP, dTTP)
Dideoksinucleotyde triphosphate (ddNTP)
Metode Maxam - Gilbert
Primer (oligonukleotida)
enzim kinase dengan 32P ATP di ujung 5'
Piperidin

DNA SEQUENCING

Lisis dinding
Ekstraksi DNA
Pemurnian DNA dengan Etanol
Endo-1,4-beta-D-glucanase tidak memiliki bentuk yang sesuai dengan sticky end vector
Endo-1,4-beta-D-glucanase tidak memiliki RE site untuk BamHI dan HindIII
Modifikasi primer sebelum melakukan PCR:
Penambahan RE site (BamHI dan HindIII site)
Penambahan start/stop kodon
Penambahan basa tambahan
Lalu bagaimana?

!
Prinsip Dasar
Double strand DNA dipisahkan dengan pemanasan single strand DNA
dNTPs dan enzim polimerase disiapkan
Primer menempel dan membentuk rantai nukleotida dengan bantuan enzim polimerase

Pembentukan rantai nukleotida terhenti ketika ddNTP menempel
Terbentuk fragmen – fragmen DNA
Fragmen – fragmen tersebut dielektroforesis untuk mengetahui urutan basanya
Metode Sanger : Labelled primer
Generasi 1
Dilakukan dalam empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan.
ddNTP yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung.
Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
Dilakukan elektroforesis, primer dilabeli dengan radioaktif sehingga berpendar ketika terkena UV

TERIMA KASIH

Daftar Pustaka
University of Waikato. 2007. http://biotechlearn.org.nz/themes/dna_lab/dna_cloning diakses pada 4 November 2015
Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985). Gene. 33, 103-119
M. Devasahayam, "Factors affecting the expression of recombinant glycoproteins," Indian Journal of Medical Research, vol. 126, no. 1, pp. 22–27, 2007
https://www.addgene.org/plasmid-protocols/subcloning/

Automated DNA Sequencing
tiap ddNTPs dilabel dengan pewarna flourescent yang berbeda.
warna yang ada pada tiap fragmen yang disintesa berhubungan dengan warna yang berikatan pada dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk menghentikan sintesis fragmen.
Metode Sanger : Dye Terminator Sequencing
ddNTP langsung dilabel dengan 4 warna berbeda
Pertumbuhan rantai dibatasi sekaligusdan ditandai dengan dye yang terhubung dengan basa.
Metode Sanger : Dye Primer dengan Label Berbeda
Pada saat denaturasi, dilabeli dengan 4 warna berbeda
Terjadi pembentukan rantai DNA, berhenti ketika berikatan dengan ddNTP
Menghasilkan produk yang telah terlabeli sesuai warna pada gambar
PEMURNIAN PLASMID REKOMBINAN

Tahapan
1.Kultivasi sel dalam media yang sesuai
2. Pemecahan dinding sel (fisik dan kimia)
3. Ekstraksi DNA genom
4. Purifikasi DNA

Umumnya pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol atau campuran fenol dan kloroform, untuk mengendapkan protein dengan cara di sentrifugasikan dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase.

DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara "presipitasi etanol".

Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+), pada suhu -20oC etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi. (Radji, M., 2011; Thermo Scientific, 2009)
Mengapa berubah warna?
Gen endo-1,4-beta-D-glucanase disisipkan di pertengahan gen lacZ yang merupakan penyandi lacZ-á subunit dari enzim -galaktosidase. Enzim ini dapat memecah substrat seperti X-gal (suatu galaktosa yang dimodifikasi) menjadi galaktosa dan pre-chromophore 5-bromo-4-kloro-3-hidroksindole, yang selanjutnya dioksidasi menjadi 5,5'-dibromo-4,4'-dikloro-indigo yang berwarna biru.
Jika gen lacZ masih utuh (tidak ada penambahan plasmid rekombinan), maka koloni bakteri E.coli BL21akan berwarna biru akibat pengaruh zat warna indigo yang dihasilkan. Tetapi jika endo-1,4-beta-D-glucanase berhasil disisipkan (diligasikan) dengan vektor, otomatis gen lacZ-nya akan terdisrupsi (rusak) dan ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan indigo yang berwarna biru, sehingga koloni akan berwarna putih. Jadi hanya koloni putih yang tumbuh pada media yang mengandung antibiotik dan X-Gal saja yang kemungkinan mengandung gen endo-1,4-beta-D-glucanase yang ditransformasikan
Teknik Elektroporasi
Salah satu teknik transformasi DNA yaitu menggunakan aliran listrik (elektroporasi) untuk merusak membran sel sementara (protoplas sementara) dan membentuk pori-pori pada membran sel.

Mekanisme degradasi X-gal oleh -galaktosidase
Transformasi Alami
Meskipun banyak spesies tidak dapat mengambil molekul DNA secara alami, namun mereka mungkin dapat memperoleh DNA dari sel-sel lain melalui transduksi dan konjugasi

Transformasi Alami
Lebih dari 1% spesies bakteri mampu melakukan transformasi secara alami, dimana mereka memproduksi protein-protein tertentu yang dapat membawa DNA menyeberangi dinding sel
Transformasi alami biasanya melibatkan DNA rantai lurus (linear)
Kemampuan alami untuk mengambil molekul DNA eksogen sering disebut kompetensi

Jenis Teknik Transformasi
Transformasi Plasmid ke E coli

Teknik Elektroporasi
DNA plasmid yang sudah di elektroporasi kemudian ditambahkan LB cair untuk pemulihan sel dan diinkubasi selama 3 jam pada incubator shaker. Hasil inkubasi kemudian diratakan pada permukaan medium LB padat dengan penambahan antibiotin untuk seleksi. Medium tersebut kemudian diinkubasi dengan suhu 30˚C selama 48 jam.

Teknik Kimiawi
Bakteri didinginkan pada larutan yang mengandung kation divalen seperti Ca2+ untuk membuat dinding sel menjadi permeable dengan cara menganggu keseimbangan kalsium dalam membran. Dengan melakukan teknik 'heat-shock', maka DNA dapat masuk ke dalam sel.

Perlakuan dengan campuran bahan kimia yang lebih kompleks dapat membawa efisiensi yang lebih tinggi dalam penyerapan DNA
Seleksi

Tahapan Seleksi Plasmid pUC19
Mengkultur bakteri pada LB-plate yang mengandung 100 μg/ml of ampicillin, 80 μg/ml X-gal segar, dan 20 mM IPTG. Penambahan Amphicilin berguna untuk mencegah pertumbuhan E. Coli yang tidak mengandung plasmid Puc19.
Koloni yang mengandung plasmid tanpa insert akan berwarna biru setelah diinkubasi selama 12-18 jam pada suhu 37°C. Koloni dengan plasmid yang mengandung insert akan tetap berwarna putih. Warna biru yang lebih jelas akan didapatkan dengan menempatkan plate pada suhu 4°C selama 2 jam, diikuti dengan pengondisian pada suhu 37°C selama semalam.
2
1
Teknik Fisika
Salah satu metode fisika adalah dengan menggunakan particle gun yang dapat membakar DNA didalam sel penerima karena adanya tekanan yang tinggi. DNA teradsorbsi ke dalam microprojectile yang biasanya terbuat dari emas atau tembaga.
DNA yang sudah terlapisi emas kemudian masuk ke dalam jaringan tumbuhan dan melakukan integrasi ke dalam DNA kromoson secara acak.

Cara lain:
Memvortex sel menggunakan silicon carbide whiskers / glass beads dan DNA target.
Mikroinjeksi DNA melalui jarum suntik kecil (femtosyringe) dengan diameter 0,1 mm.

Metode Blue-White Screening
Seleksi berdasarkan warna
Menggunakan enzim -galaktosidase yang merupakan enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen LacZ. Gen ini diatur ekspresinya oleh operon Lac. Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen LacZ.

Skema Blue-White Screening
Apa itu enzim -galaktosidase?
Enzim yang terdiri dari 2 subunit yakni peptida dan peptida . Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional, enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal. Gen penyandi peptida biasanya terdapat pada kromosom, sedangkan gen penyandi peptida terdapat pada plasmid. Apabila hanya ada peptida yang diekspresikan oleh gen pada kromosom, maka tidak akan adapemecahan laktosa atau X-gal. Namun, apabila terjadi komplementasi oleh peptida , maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim -galaktosidase yang terbentuk sempurna. Oleh karena itu, komplementasi dapat membantu untuk proses seleksi biru putih sebagai indicator keberhasilan cloning atau transformasi.

1. Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS (sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single strain). Terjadinya proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil supernatannya berupa lautan suspensi.

2. Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi, terdapat senyawa DNA plasmid, RNA, Protein, Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Ekstraksi dilakukan dengan adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA plasmid berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar.

3. Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabila dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral lagi. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE ataupun dH2O.
59
Click to edit Master title style
Click to edit Master text styles
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#

Pemecahan dinding sel bakteri dilakukan secara fisik (misal: sonikasi), secara kimia (enzim lisozim, etilen diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya).

58
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
05/10/2015

#

Second level
Third level
Fourth level
Fifth level

10/5/2015

#

Second level
Third level
Fourth level
Fifth level

10/5/2015

#
39

Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
Click to edit Master subtitle style
10/5/2015

#
Plasmid vectors are used to clone DNA ranging in size from several base pairs to several thousands of base pairs (100bp -10kb).
15
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
05/10/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
05/10/2015

#

05/10/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
10/5/2015

#
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
Click icon to add picture
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
05/10/2015

#
05/10/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#

35
10/5/2015

#
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
10/5/2015

#
Click icon to add picture
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
10/5/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
05/10/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
05/10/2015

#
05/10/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
05/10/2015

#
05/10/2015

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level

#
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level
Second level
Third level
Fourth level
Fifth level

#
05/10/2015

#
Pemilihan vektor & host

Memotong Gen of interest dengan RE, lalu proses PCR

Memotong plasmid dengan RE yang sama

Memasukkan goi ke dalam plasmid (Ligasi)

Memasukkan plasmid rekombinan ke dalam host (Transformasi)

Proses Seleksi

Sequencing
Cloning: What and Why
Cloning Steps
Choosing Vector and Host
Copying gen of interest
Inserting and Ligation
Transforming
Purification and Sequencing
KEUNGGULAN
Jumlah salinan tinggi
Mudah uji seleksi
Memiliki antibiotik Ampicilin
Memiliki MCS
Penyalinan dipengaruhi oleh gen lacZ (galaktosidase) yang akan dikenali β lacZ pada E.Coli
Mudah uji Screening
Keberadaan lacZ dapat diuji dengan medium yg mengandung X-gal

Transformasi
Alami
Buatan
Kimiawi
Elektroporasi
Fisika
TRANSFORMASI
Proses memasukkan DNA luar (exogeneus) ke dalam sel

5/10/2015

Second level
Third level
Fourth level
Fifth level

#
Enzim DNA Ligase dari bakteri
Enzim T4 Ligase
DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofage T4
Enzim deoksinukleotidil transferase
Untuk menyintesis utas tunggal homopolimerik 3'.
Blunt ended DNA + linker (T4 ligase)

Digest with appropriate R.E.

Ligate

Kloning DNA.pptx

Recommend Documents