DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC IN SIFILIS Specii din Genul Treponema, de interes medical: 1. Treponeme patogene pentru om: care produc boli endemice, cu transmitere sexuala: - Treponema pallidum: agentul etiologic al sifilisului venerian, 2. Treponeme saprofite: Tr. genitalis, Tr. microdentium, Tr. mucosum etc. Treponema pallidum este un parazit exclusiv al omului, care nu se intalneste in mediul exterior, avand o rezistenta extrem de redusa.Transmiterea veneriana reprezinta calea aproape exclusiva de contagiune interumana pentru sifilis. Structura antigenica: 1. „haptena Wassermann”: apartine unor fractiuni lipoidice (antigen lipoidic ubiquitar), identificate in tesuturi umane sau animale (miocard, SNC), dar exista si lipoizi specifici treponemici, - lipoidul ubiquitar este extras si din cord bovin (cardiolipina), utilizat ca antigen netreponemic, in diagnosticul serologic de rutina al sifilisului, 2. antigen proteic „de grup”, comun genului Treponema (se extrage din Treponema Reiter, tulpina obtinuta in laborator, in conditii de anaerobioza, utilizata pentru extragerea componentelor antigenice utile in diagnosticul serologic al sifilisului/ RFC), 3. antigen poliozidic de grup (specific Treponemei pallidum, util in testul de imunofluorescenta (IF), 4. antigen somatic treponemic (util in testul Nelson de imobilizare a treponemelor/ TIT). Detectarea si identificarea treponemelor patogene 1. Sifilis primar: examen bacteriologic direct din serozitatea sancrului dur, aspirat ganglionar, biopsie leziune primara, 2. Sifilis secundar: exudat din leziuni specifice (placi mucoase), biopsii, 3. Sifilis tertiar: LCR (neurosifilis), piese bioptice sau necroptice, 4. Sifilis congenital: prelevate din cordon ombilical, placenta, secretii nazale, leziuni cutanate. Diagnosticul bacteriologic direct: 1. Microscopia directa: - metoda ce permite un diagnostic rapid, necostisitor, in forme precoce de boala, - treponemele patogene pot fi vizualizate numai la microscopul cu fond intunecat sau prin coloratie imunofluorescenta, • Microscopia in camp intunecat: - probele trebuie examinate in maxim 20 min, pentru a pastra viabilitatea treponemelor, - se evita antrenarea hematiilor, resturilor celulare, microorganismelor contaminante, - serozitatea exprimata la suprafata leziunii se recolteaza prin amprentare pe lama de sticla sau prin capilaritate (prin aspirare cu o pipeta Pasteur), - prelevatul este aplicat pe lama si acoperit cu lamela, apoi examinat la microscop cu camp intunecat, cu obiectiv de 40X, - Treponema pallidum: apare sub forma de spirochete fine, caracterizate prin miscari de insurubare sau flexie rigida si brusca,
1
-
demonstrarea prezentei treponemelor cu morfologie si miscari caracteristice, constituie un diagnostic pozitiv pentru leziunile sifilitice precoce, pacientii cu leziuni primare, in fazele incipiente, au teste serologice negative, iar aceasta metoda permite aplicarea precoce a tratamentului antibiotic, un rezultat microscopic negativ nu exclude infectia treponemica: numar insuficient de microorganisme, tratament intercurent cu antibiotice, leziuni pe cale de vindecare, tehnica microscopica defectuoasa.
Fig. 1: Treponema pallidum, microscopie in camp intunecat
• -
Microscopia fluorescenta (DFA-TP: Direct Fluorescent Antibody test pentru Treponema pallidum): test microscopic standard pentru sifilis, alternativa practica la microscopia cu camp intunecat, tehnica utilizeaza anticorpi monoclonali cuplati cu substanta fluorescenta, strict specifici pentru Treponema pallidum, DFA- TP este cea mai specifica tehnica pentru evidentierea T. pallidum in exudate sifilitice, LCR, piese bioptice (piele, ganglioni, cordon ombilical, placenta etc) sau necroptice (creier), Evidentierea T. pallidum in tesuturi reprezinta un diagnostic definitiv in sifilis,
Fig. 2: Treponema pallidum- imunofluorescenta (conjugate monoclonale fluorescente):
2
2. Metode de biologie moleculara: reactia de amplificare genica, PCR: - testele nu sunt inca standardizate, - amplificarea genei care codifica antigenul de suprafata imunodominant (47 kDa), pentru diagnosticul sifilisului neonatal (lichid amniotic, LCR, ser), - amplificarea genei care codifica proteina membranara de 39 kDa, utilizata pentru diagnosticul neurosifilisului (testul detecteaza ADN din treponeme viabile in LCR sau ADN rezidual, rezultat din microorganismele moarte in urma aplicarii tratamentului), - tehnica de tip Multiplex- PCR 9amplificare simultana a doua sau mai multe fragmente ADN), - PCR va deveni unul din testele de electie pentru diagnosticul sifilisului congenital, neurosifilisului, sau sifilisului primar, precoce. Fig 3: RT- PCR in diagnosticul molecular al sifilisului:
3. Testul de infectivitate pe iepure (RIT/ Rabit Infectivity Testing): - inocularea prelevatului patologic se face intradermic sau intratesticular la iepure, - acest test este inalt specific (identifica T. pallidum) si cel mai sensibil pentru diagnosticul sifilisului (poate detecta doar cateva treponeme vii), - testul este dificil tehnic, foarte costisitor, necesita pana la 3 luni pentru obtinerea rezultatului, - este utilizat numai pentru cercetare si ca test de referinta in evaluarea altor teste de diagnostic. Diagnostic bacteriologic indirect Diagnostic serologic: 1. Teste cu antigene netreponemice, cardiolipinice: - utilizeaza ca antigen extracte lipoidice nespecifice, extract alcoolic purificat din muschi de cord bovin, numit cardiolipina; evidentiaza anticorpii antilipoidici, a) Reactia de floculare VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), • Principiu: VDRL foloseste un antigen care contine cardiolipin¸ lecitina si colesterol, pentru a pune in evidenta, prin aparitia unor grunji de dimensiuni microscopice, anticorpii antilipoidici, - testul poate fi calitativ sau cantitativ, • Indicatii: - test de screening in diagnosticul sifilisului,
3
•
in monitorizarea terapiei antibiotice, evidentierea anticorpilor antilipoidici in LCR (sensibilitate redusa)< Proba: ser sanguin sau LCR,
a.1. Test VDRL calitativ pentru ser: - Necesar: placi din material plastic cu godeuri (tip OMS recomandate pentru RFC), - Cardiolipina tip VDRL, ser de bolnav, - Seruri martor, • Citire si interpretare: - serurile negative sunt considerate ca atare, mai ales in lipsa contextului clinicoepidemiologic sugestiv pentru sifilis, - exista rare seruri fals negative datorita fenomenului de pre- sau postzona, - serurile pozitive se retesteaza prin reactia VDRL cantitativa, a.2. Test VDRL cantitativ pentru ser in godeuri: - se lucreaza cu acelasi antigen, dar cu seruri de bolnav in dilutii binare succesive: 1/ 2, ...1/128, • Citire, interpretare: - se noteaza intensitatae reactiei pentru fiecare godeu, - titrul anticorpilor este indicat prin inversul celei mai mari dilutii de ser la care se obtine o intensitate a reactiei de floculare de 2+, • Martori pentru controlul de calitate al reactiei: - martor antigen (Ag), martor ser non-reacticv (negativ), slab reactiv, reactiv, - Rezultate fals (+): tratament cu heparina, sulfamide, - Reactii fals (-): tratament cu vitamina B1, tiroxina, lecitina, - Prelevarea probelor de sange trebuie temporizata dupa consumul de alcool, sau stari febrile.
b) RPR (Rapid Plasma Reagin) este un test de floculare, cu antigene netreponemice, utilizat pentru determinarea calitativa si semicantitativa a anticorpilor in serul sau plasma bolnavilor de sifilis. - Principiul testului: Treponema pallidum produce cel putin doua tipuri de anticorpi, in organismul infectat: AC anti-treponemici ce pot fi detectati prin testul Fluorescent Treponemal Antibody – Absorbtion (FTA-ABS) si Ac non- antitreponemici (reagine), ce pot fi detectati prin RPR. - Antigenul utilizat in reactia RPR este un Ag VDRL modificat, care contine in plus, particule de carbune, ce permit o mai buna vizualizare a reactiei si o buna diferentiere intre reactiile negative de cele pozitive.
4
-
Reactia pozitiva (prezenta anticorpilor non-treponemici in ser de bolnav): reactia de floculare se exprima prin prezenta unor coaglutinate negre (antigenele sunt cuplate cu particule de carbune si cu reagine/ Ac), suspensionate intr-un lichid clar, Reactia negativa (lipsa Ac, reaginelor) se manifesta prin prezenta unei suspensii omogene, gri. Pentru reactia semicantitativa, se lucreaza cu dilutii binare, succesive, de ser. Interpretarea reactiei: ultima dilutie de ser care contine agregate vizibile, indica titrul probei de ser. Reactii fals pozitive se intalnesc in urmatoarele situatii: lupus eritematos, mononucleoza infectioasa, pneumonie virala, etc. Toate reactiile pozitive in tehnica RPR, se confirma obligatoriu cu o alta tehnica, bazata pe antigene treponemice. In diagnosticul de sifilis este obligatoriu a se asocia cel putin doua tehnici: una de screening/ VDRL sau RPR (antigene netreponemice, cardiolipina) si una de confirmare/ TPHA (antigene treponemice).
c) Reactia de Fixare a Complementului (RFC): - Utilizeaza antigen cardiolipinic (haptena lipidica Wassermann) si antigen treponemic purificat (antigen proteic din tulpina Reiter). - Principiu: RFC asociaza doua complexe antigen/Ag- anticorp/ Ac care isi disputa complementul/C`: primul complex Ag/Ac contine Ag cunoscut, Ac poate fi prezent sau nu; al doilea complex contine hematii de berbec si anticorpi anti hematii (cuplul hemolitic), - Daca primul complex se formeaza (Ag si Ac complementari prezenti in ser), activeaza si fixeaza Complementul. Rar aceasta reactie este vizibila cu ochiul liber, motiv pentru care este nevoie de un sistem indicator (sistemul hemolitic). - Daca in sistemul de reactie exista Complement, inseamna ca: in primul sistem nu exista Ac (rezultat negativ pentru diagnosticul de sifilis), C` ramane disponibil pentru al doilea sistem imun, sistemul hemolitic. Rezulta hemoliza (lichid omogen rosu). - Daca in sistemul de reactie nu avem C`, inseamna ca avem reactie pozitiva pentru diagnosticul de sifilis (Ac prezenti, complex imun Ag/Ac care activeaza si fixeaza C`). In absenta C`, fixat de primul complex imun Ag/Ac, hematiile din al doilea sistem imun, indicator, vor ramane nelizate, care cad „in buton”. 2. Diagnostic serologic cu teste treponemice: TPHA (Treponema pallidum HaemAgglutination test ): test de confirmare a diagnosticului serologic de sifilis: - Ac specifici, produsi fata de antigene treponemice, persista timp indelungat dupa ce infectia cu Treponema pallidum a fost corect tratata, - Tehnica se bazeaza pe o reactie de hemaglutinare pasiva, pentru evidentierea anticorpilor specifici anti-treponemici, - Principiu: hematii de cocos acoperite (sensibilizate) cu antigene treponemice se pun in contact cu seruri de bolnavi; daca serul contine anticorpi specifici, acestia determina aglutinarea hematiilor (continut omogen rozat al lichidului din godeuri), daca reactia este negativa (absenta anticorpilor) hematiile „cad in buton”compact, rosu intens.
5
TPHA: Reactia de confirmare serologica a sifilisului, cu antigene treponemice
6
- Tehnica TPHA cantitativa este utilizata ca test de confirmare a reactiilor pozitive din testele de screening, cu antigene netreponemice, - se recomanda retestarea prin metoda TPHA, a reactiilor fals pozitive din alte afectiuni decat sifilisul, - testarea altor prelevate decat LCR sau ser nu este recomandata prin acest test; altfel spus, diagnosticul de neurosifilis se pune cu tehnici treponemice, - prin aceasta tehnica se pun in evidenta Ac si dupa un tratament corect administrat; un rezultat pozitiv indica o infectie acuta sau una in antecedente (in trecut), - o infectie recenta se diferentiaza de una trecuta, prin tehnica TPHA cantitativa: un titru crescut semnifica o infectie acuta. - TPHA poate avea rezultat negativ in formele precoce de boala, cand sunt utile alte metode de diagnostic (microscopie in camp intunecat, imunofluorescenta/ FTA-ABS, PCR), - FTA- ABS poate diferentia intre IgM (faza acuta) si IgG (faza cronica), - VDRL, RPR- Carbon: tehnici utilizate pentru monitorizarea tratamentului, evaluarea evolutiei clinice, imunologice.
7
