Tecnológico de Monterrey Campus Guadalajara
Diagnóstico Molecular para la detección de anemia falciforme
Claudia Del Toro Runzer A01222071 Sebastián Patiño Valenzuela A01222331 Francisco Andrés Robles Escoto A01133410 Ricardo Hernández Medina A01226072 Vicente Paúl Armenta Pérez A01112119 Ingeniería Genética Grupo 1 Dra. Clara Patricia Ríos Ibarra
Diagnóstico Molecular para la detección de anemia falciforme
Introducción La anemia falciforme es una enfermedad en la que su cuerpo produce glóbulos rojos con un contorno anormal. Las células tienen forma semilunar o de una hoz. Estas células son más rígidas y menos flexibles, por lo que se atascan en los vasos sanguíneos y bloquean el flujo, esto provoca dolor y puede lesionar los órganos e incluso pueden causar infartos. Debido también a sus extremos puntiagudos, pueden llegar a desgarrar las paredes de los vasos. A diferencia de los hematíes normales, que duran unos 120 días en la corriente sanguínea, los falciformes son eliminados después de sólo unos 10 o 20 días y, como no pueden reponerse con suficiente rapidez, la sangre tiene insuficiencia permanente de glóbulos rojos (eritrocitopenia), causando la enfermedad conocida como anemia (NIH, 2014). Las personas con la enfermedad nacen con dos genes de células falciformes, uno de cada padre por lo que son homocigotos. Si hereda el cambio del gen de uno solo de sus padres, será portador y tendrá el gen de células falciformes y otro normal, por lo que serán heterocigotos, a este rasgo se le denomina drepanocítico. Aproximadamente 1 de cada 12 personas de raza negra es portadora del rasgo drepanocítico, y la enfermedad como tal, afecta al 8% de la población afroamericana (ONSALUS, 2013). Existen varias alternativas para hacer un diagnóstico de esta enfermedad por ejemplo se puede hacer un recuento de reticulocitos, es decir, de la cantidad de glóbulos rojos inmaduros de la sangre, a su vez se puede hacer pruebas para determinar las concentraciones de hierro en la sangre y en el cuerpo. No obstante una alternativa más precisa es el diagnóstico molecular, que a su vez es una opción sencilla y rápida. El diagnóstico molecular se define como el conjunto de técnicas que emplean la biología molecular para identificar anomalías o defectos moleculares subyacentes a una enfermedad de carácter hereditaria o infecciosa. El empleo de estas técnicas ofrece una evaluación más específica, sensible y rápida, además se requiere cantidades mínimas de muestra en comparación con las pruebas convencionales.
Para planear una estrategia
de diagnóstico es necesario plantearse una serie de preguntas secuenciales para enfocarse en el problema en cuestión, dichas preguntas se pueden observar en la Tabla1.
1 ¿Está asociada a una alteración cromosómica? NO SI 2
¿Presenta herencia mendeliana?
3
¿Locus localizado?
4
5
¿Gen identificado?
ir a 2 Diagnóstico citogenético
NO Estudios de asociación y factores de riesgo SI
ir a 3
NO
Diagnóstico por patrón de segregación
SI
ir a 4
NO
Diagnóstico Indirecto con marcadores
SI
ir a 5
¿Muchos alelos mutados?
Diagnóstico Indirecto con marcadores
¿Un alelo prevalente?
Diagnóstico Directo
Tabla 1. Cuadro dicotómico para la elección de la estrategia diagnóstica (Fibla, 2006).
Muchas patologías genéticas están asociadas a alteraciones en el complemento cromosómico, sobre todo aquellas que se manifiestan de forma sindrómica. Por lo que se debe de averiguar si la patología pertenece a este grupo, de ser así, se efectúa un diagnóstico citogenético, con el cual se realizará una caracterización cromosómica del propositus y de su familia, esto se obtiene con la elaboración de un cariotipo para el estudio de posibles alteraciones estructurales cromosómicas (Echegaray, Rosetti & Vildoza, 2014). Si la enfermedad no pertenece a este grupo, se debe plantear si la patología presenta o no un herencia mendeliana. De tratarse de una patología con herencia multifactorial, como es el caso de la hipertensión, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares etc., las únicas aproximaciones diagnósticas son los estudios de asociación y la determinación de factores de riesgo. Si la patología estudiada presenta una herencia mendeliana definida, deberemos preguntarnos si se ha localizado o no al locus implicado. De no ser así, solo podremos ofrecer un diagnóstico basado en el patrón de segregación. Se trata en este caso de un diagnóstico eminentemente probabilístico y de una baja calidad informativa principalmente empleado para enfermedades no caracterizadas que se basa en un análisis del patrón hereditario (Vizmanos, 2014). Si el gen ha sido caracterizado y se conoce la mutación o mutaciones responsables de la patología, podemos encontrarnos con dos situaciones: existe una única mutación que causa la enfermedad o su número es muy limitado siendo una de ellas muy prevalente, o bien, existe un gran número de mutaciones distintas que causan la enfermedad y su frecuencia es equitativa. En el primer caso, es posible abordar una estrategia de diagnóstico directo mediante la detección de la mutación única o la más
prevalente, es decir, mediante la detección del cambio producido a nivel del ADN. En el segundo supuesto, es más apropiado un diagnóstico indirecto mediante el estudio de la segregación del carácter estudiado con marcadores polimórficos íntimamente ligados a éste (Fibla, 2006). Dado que la anemia falciforme es causada por una sola mutación, la estrategia que se describe a continuación es para un diagnóstico directo. Los temas de ingeniería genética asociados a este caso son: extracción de DNA, diseño de oligonucleótidos, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), enzimas de restricción y el uso de vectores de clonación como marcadores de peso molecular.
Glosario
Ac. glutámico, valina, alanina, fenilalanina y leucina
Amino ácidos implicados en la formación de los glóbulos rojos (ODNA, 2011).
Anemia falciforme
Enfermedad de carácter hereditario que consta en la deformación del contorno de los glóbulos rojos en forma de hoz y produce desgaste de órganos, obstrucción del flujo sanguíneo y anemia (NIH, 2014).
Cebador o primer
Secuencia de oligonucleótidos complementaria a la secuencia que se va a amplificar (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).
Diagnóstico citogenético
Estudio de la estructura, función y comportamiento de los cromosomas (Echegaray, Rosetti & Vildoza, 2014).
Diagnóstico directo
Estudio mediante la detección de la mutación única o la más prevalente (Fibla, 2006).
Dianóstico indirecto
Estudio de la segregación del carácter estudiado con marcadores polimórficos íntimamente ligados a éste (Fibla, 2006).
Drepanocítico
Rasgo adquirido cuando se hereda el cambio del gen de uno solo de sus padres por lo que será portador y tendrá el gen de células falciformes y otro normal (ONSALUS, 2013).
Enfermedad autosómica Rasgo, trastorno o enfermedad se puede transmitir de padres recesiva a hijos, deben estar presentes dos copias de un gen anormal para que se desarrolle la enfermedad o el rasgo (NIH, 2014). Enzimas MstII y Bsu36I
Isoesquizómeros que cortan en la diana donde se encuentra la sustitución de adenina por timina en el gen de la globina beta (CMM, 2014).
Globina beta
Proteína que forma parte de la hemoglobina (heteroproteína) y se única en el cromosoma 11 (Khalsa, 2008).
Hematíes
Cada uno de los glóbulos rojos de la sangre, discoides, bicóncavos, de seis a nueve micras de diámetro que contienen la hemoglobina (Farlex, 2007).
Herencia mendeliana
Se refiere a la transmisión de un único gen mediante un patrón dominante, recesivo o ligado al cromosoma X (Vizmanos, 2014).
Heterocigoto
Individuo que ha heredado un gen para un rasgo de un progenitor y un gen alternativo distinto del otro progenitor. Es decir, posee dos alelos diferentes para un mismo rasgo (Enciclopedia Salud, 2013).
Homocigoto
Individuo que ha heredado un gen para un rasgo de un progenitor y un gen idéntico del otro progenitor. Es decir, posee dos alelos iguales para un mismo rasgo (Enciclopedia Salud, 2013).
Isoesquizómero
Dos enzimas con la misma secuencia de reconocimiento, aunque pueden que no corten en la misma posición (CMM, 2014).
Locus
Localización específica de un Gen o una secuencia de ADN en un cromosoma (Karp, 2009).
Marcador pUC18/SFC1
Vector plasmídico que al cortarse con la enzima de restricción SFC1 funcionó como marcador para la electroforesis de las muestras de DNA.
PCR
Reacción en cadena en la que se aprovecha una polimerasa de DNA para amplificar durante varios ciclos una secuencia específica de DNA (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013)
Reticulocitos
Glóbulos rojos inmaduros de la sangre (NIH, 2014).
Diagrama
Diagrama 1. Esquema del diagnóstico molecular para la detección de anemia falciforme
Discusión La anemia falciforme es una enfermedad genética autosómica recesiva resultado de la sustitución de adenina por timina en el gen de la globina beta, lo que conduce a una mutación de ácido glutámico por valina en la posición 6 de la cadena polipeptídica de globina beta, esto ocasiona la producción de una hemoglobina defectuosa llamada hemoglobina S. Paralelamente se altera la diana de restricción para el enzima MstII, o bien para la enzima Bsu36I, que es un isoesquizómero de MstII, es decir, cortan para el mismo sitio de restricción. El ácido glutámico tiene carga negativa y la valina es hidrófoba, entonces se forman contactos con alanina, fenilalanina y leucina, lo que promueve polímeros cruzados que deforman el glóbulo rojo (Fibla, 2006). Como se trata de una sola mutación en un gen conocido se siguió una estrategia de diagnóstico directo; en primer lugar se extrae el DNA de la sangre, posteriormente sigue el diseño de primers que flanqueen la diana donde ocurre la mutación, ya sea con la herramienta que ofrece Blast o bien “manualmente”; en este caso se usó la herramienta Blast; después se procede con la amplificación y en seguida se emplean enzimas de restricción que corten justo en donde ocurre la mutación; finalmente, un gel de electroforesis permitirá hacer una evaluación del diagnóstico molecular. Estos pasos se observan en el Diagrama 2 y a continuación se explican a detalle. Extracción de DNA
Diseño de primers
Amplificación
Corte con enzimas de restricción
Electroforesis
Diagnóstico Diagrama 2. Resumen de los pasos para el diagnóstico molecular directo.
Extracción de DNA La extracción de DNA a través de sangre periférica consta de dos etapas, la primera es la extracción de sangre; en donde, se hace uso de herramientas para una extracción correcta de sangre teniendo los cuidados necesarios para evitar cualquier tipo de contagio o de infección ya que con el material que se trabaja es biológico. para la extracción de sangre periférica se necesita de: ligar el brazo de la persona 10 cm arriba del codo y realizar la búsqueda de la mejor vena por medio de palpaciones, seguido de esto, con ayuda de torundas empapadas en alcohol se procede a desinfectar el área de punción; una vez que la vena se encuentra sujetada se introduce la jeringa, manteniendo la jeringa lo más cerca posible de la piel del antebrazo para no lastimar a la persona. se extraen 3 mL de sangre y una vez dentro de la jeringa se coloca alcohol con ayuda de una torunda sobre la zona de extracción y se procede a desligar y retirar la aguja; la sangre es colocada en un tubo el cual es previamente rotulado. (Roque, 2012). La segunda etapa es para la extracción de DNA a través de la muestra de sangre obtenida. La extracción consta de una lisis celular con ayuda de un tensoactivo como Tris o tritón, los cuales, se encargan de romper las estructuras que confinan el citoplasma y así liberar su contenido. Una vez lisada la célula se procede a la remoción protéica contaminante con ayuda de Fenol así como la remoción de la carga lipídica con ayuda de cloroformo para terminar de limpiar la muestra. Para la purificación del DNA, se precipita el DNA en alcohol ya que es insoluble en este; se puede usar etanol al 100% frío (4°C) o tambien isopropanol al 100% a temperatura ambiente. el uso de etanol hace que tarde más tiempo en precipitar el DNA, el isopropanol lo precipita inmediatamente aunque sea un poco más costoso. Por último, se remueven las sales utilizando etanol al 70% y el DNA es recuperado en agua mili Q. (Microbial, 2009; Falcón, 2004).
Diseño de primers Para el diseño de primers, se decidió utilizar la herramienta PRIMER BLAST del NCBI. Pero antes, fue necesario localizar la secuencia donde ocurre la mutación puntual. Esta mutación ocurre específicamente en la cadena β de la he moglobina, ya que la mutación Glu6Val provoca que el gen HBB codifique una cadena β defectuosa que al unirse en el heterotetrámero (2 cadenas α y 2 cadenas β) forma la hemoglobina S (Hb S), causante de las células con anemia falciforme (Bender y Douthitt, 2014) . Por lo tanto, nuestro interés fue encontrar el gen HBB, el cual se encuentra en el cromosoma 11 en Homo
sapiens (GeneBank U01317.1). Cabe mencionar que los genes codificantes de las cadenas α se encuentran en el cromosoma 16. Una vez localizada la secuencia de la mutación, se procedió a elegir una secuencia específica de alrededor de 310 nt, ya que nuestro producto de digestión debían ser 2 fragmentos de ≈200 nt y ≈100 nt a partir del corte de restricción en el sitio de la mutación. Para esto, ele gimos ≈155 nt río arriba y ≈155 nt río abajo a partir de la mutación, y tras copiar el formato FASTA, accedimos a la herramienta PRIMER BLAST. Especificamos que el producto de la PCR debía medir entre 290 y 310 pb y la herramienta nos arrojó 9 primers. De los cuales elegimos el siguiente debido a su % de G y C, y la poca diferencia en la temperatura de alineamiento:
Figura 1. Primer elegido, propuesto por PRIMER BLAST
Además, como se observa en la Figura 1, se le podían realizar pequeñas modificaciones como eliminar la timina al final del primero para facilitar el anclaje. Esto con la finalidad de optimizar la PCR.
Amplificación Posteriormente se lleva a cabo una reacción de la polimerasa en cadena (PCR) para amplificar el segmento de DNA donde se encuentra la mutación y que está flanqueado por los primers diseñados en el paso anterior. La PCR es un método de diagnóstico molecular que permite obtener enzimáticamente grandes cantidades de un fragmento específico de DNA a partir de un molde de DNA complejo (Arnheim y Erlich, 1992), para este caso el DNA extraído de la sangre. En esta reacción, se utiliza una mezcla que contiene el juego de primers, la muestra de DNA, desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sales, amortiguadores y una
DNA polimerasa, típicamente proveniente de Thermus aquaticus. En el primer paso, la doble hebra de DNA muestra se desnaturaliza por calor a 92-96 °C. Una vez separada en dos cadenas molde, la temperatura se baja a 55-60 °C para permitir la hibridación de los primers en su secuencia complementaria. Este rango de temperatura da buenos resultados para primers con un contenido GC de 50 %; en otro caso habría que ajustarlo para evitar amplificar inespecificidades. En el siguiente paso, se eleva la temperatura para permitir que la DNA polimerasa elongue la secuencia de interés. Típicamente se utiliza una DNA polimerasa proveniente del microorganismo Thermus aquaticus, esta enzima permite que la elongación ocurra a una temperatura elevada (72 °C), lo que nos evita la hibridación de secuencias inespecíficas. Los tres pasos recién mencionados conforman un ciclo de PCR y se repiten hasta 50 veces para generar millones de copias del producto de interés, denominado amplicón. (Arnheim y Erlich, 1992). Enzimas de restricción Los amplicones serán procesados por una enzima de restricción. Las enzimas de restricción son endonucleasas que identifican una secuencia específica, llamada sitio diana, en una doble hebra de DNA y escinden el DNA en ese punto. (Pingoud, Alves y Geiger, 1993). En procariontes se ha detectado este sistema como un mecanismo de defensa contra DNA exógeno; sin embargo, para el diagnóstico molecular presente, se aprovechan estas proteínas para detectar la mutación puntual que provoca la anemia falciforme. La mutación se localiza en el sexto codón de la globina (GAG), por lo que se prosigue a buscar una enzima que realice el corte en ese punto. Para esta tarea se utilizó NEB Cutter ®. Al introducir la secuencia amplificada en esta herramienta, obtenemos como resultado una lista de enzimas de restricción, sus sitios de corte y los amortiguadores a los que la actividad de la enzima es óptima. Como se muestra en la Figura 2, la enzima más conveniente es Bsu36I, ya que solo realizaría el corte en las secuencias de los pacientes normales (CCT GAG G). Al haber un timina en vez de adenina en la secuencia mutante (CCT GTG G), Bsu36I no reconocería el sitio diana en uno de los alelos de los portadores y ambos alelos de los afectados; el amplicón permanecería en tal caso intacto. Estos resultados pueden visualizarse en un patrón electroforético. Para detectar esta enfermedad se suele utilizar MstII. Aunque NEB Cutter ® no sugirió en sus resultados esta enzima, Bsu36I se considera un isoesquizómero de MstII.
Los isoesquizómeros son enzimas de restricción que comparten el mismo sitio diana (Pingoud, Alves y Geiger, 1993).
Figura 2. Enzimas de restricción sugeridas por NEB Cutter ®
Electroforesis del producto de la PCR después del corte con enzimas de restricción Se realizó una electroforesis en gel (ver Figura 3) para separar las moléculas de DNA obtenidas posterior a la amplificación de los fragmentos de interés generados por una PCR convencional y a partir de los cortes producidos por acción endonucleasa (enzima de restricción). La electroforesis es una técnica que permite la separación, identificación, y purificación de macromoléculas en función a su tamaño, propiedades eléctricas y otras propiedades físicas. (Somma, M. s.f.).
El patrón de bandeo se lleva a cabo en un gel polimérico, se decidió trabajar con agarosa porque el producto a separar eran ácidos nucléicos y el tamaño de los poros en agarosa es mayor en comparación con poliacrilamida, lo cual permite una migración más rápida de la macromolécula. (Somma, M. s.f.). La concentración utilizada de agarosa fue de 1.4 X lo cual incrementa la resolución de las bandas debido a que los productos amplificados eran cercanos en número de pares de bases. Se utilizó un control negativo, cuyo patrón de bandas correspondía a un individuo sano, se esperaba observar dos bandas debido al corte generado por MstII uno de 100 pb y otro de 191 pb, la cual es altamente específica por lo que sólo reconocerá la secuencia correspondiente al alelo sano. Asimismo se realizó el patrón de bandeo de un individuo heterocigoto para la enfermedad. En este caso el patrón de bandas observado corresponderá a tres fragmentos con una resolución de bandas menor al control negativo, una de las bandas corresponde al alelo que no fue cortado por MstII (291 pb) debido a la presencia de la mutación, y las otras dos bandas (100 pb y 191 pb) corresponden al corte generado por MstII en el alelo sano. El siguiente patrón de bandas corresponde a un individuo homocigoto para la enfermedad, en cuyo caso MstII no reconoce la secuencia de interés, de tal manera que sólo se observará una banda de 291 pb.
Figura 3. Resultado del gel de electroforesis.
Para validar el patrón de bandeo se utilizó un marcador de peso molecular. Como alternativa se decidió utilizar pUC18 debido a que es un plásmido barato en términos
económicos, posee numerosos sitios de restricción y el tamaño de su genoma es de 2686 pb. (Yanisch-Perron, C.,1985). La enzima utilizada para cortar el plásmido fue SFC1, ya que genera cinco bandas cuyos tamaños se aproximan a los generados por MstII. La metodología electroforética se llevó a cabo in silico utilizando la herramienta de NEBcutter ® para simular la electroforesis en gel de agarosa con una concentración de 1.4 X.
Diagnóstico Molecular La utilización de un método de corte por enzimas de restricción permite un diagnóstico efectivo y temprano para enfermedades con etiología genética. Para el caso particular de anemia falciforme el diagnóstico molecular supone una alternativa de tratamiento efectiva, sensible y temprana. El hecho de que sea una enfermedad de carácter mendeliano permite conocer si la descendencia puede tener predisposición, o no, a padecer la enfermedad. Para conocer las posibles recombinaciones de la anemia falciforme, se simuló un cruzamiento genético entre dos padres heterocigotos para la enfermedad. Las posibles opciones de manifestación del padecimiento genético son 50% de probabilidad de que el individuo sea heterocigoto para la enfermedad. Para este caso el individuo es sano, sin embargo una centésima parte de sus eritrocitos son falciformes, por lo cual deberá llevar a cabo medidas preventivas para no agravar los posibles síntomas. Se tiene un 25% de probabilidad de que el individuo sea homocigoto silvestre y no presente la enfermedad o ninguno de sus síntomas, y el otro 25% de probabilidad corresponde a un individuo homocigoto mutante, de forma que ambos alelos tendrán la mutación y por lo tanto la enfermedad se manifestará. A pesar de la eficacia de un diagnóstico molecular, no se puede afirmar con completa seguridad que la anemia falciforme se presentará en todos los casos en los cuales se tenga el alelo mutante para la enfermedad, ya que representa un padecimiento multifactorial que se puede aliviar o agravar dependiendo del contexto de desarrollo y los hábitos de salud del paciente afectado.
Enfoque con Southern Blot (SB) Otra forma de realizar el diagnóstico de la anemia falciforme es el uso de enzimas de restricción y el SB. Para lograrlo, se usan primero enzimas de restricción cuyo sitio diana es el sitio de mutación (por ejemplo, MstII). A los costados de dicho sitio de corte, se
encuentra uno río arriba a 1.2 kb y otro río abajo a 2 kb, por lo que el corte del fragmento total (1.4 kb), producirá 2 fragmentos de 1.2 kb y 2 kb. No obstante, una vez que se realiza la digestión, existirán miles de fragmentos producto de la digestión con MstII, por lo que es necesario identificar aquellos de nuestro interés. Para esto, todos los fragmentos digeridos son separados por tamaño en un gel de agarosa tras realizar una electroforesis. Posteriormente se transfiere el resultado a un filtro de nitrocelulosa. Finalmente, mediante el uso de una sonda complementaria al fragmento de 1.2 kb, podemos detectar el fragmento al que pertenece la sonda tras visualizarlo en rayos X (Fibla, 2006). Obteniendo los siguientes resultados:
Figura 4.Posibles resultados del diagnóstico de anemia falciforme mediante Southern Blot (Fibla, 2006).
Como se observa, en la Figura 4, hay 3 posibles resultados, los cuales son descritos a continuación: 1. Normal: La primera columna corresponde a un paciente sin mutación en sus 2 alelos, por lo que la sonda se unió al fragmento de 1.2 kb, ya que sí se realizó el corte de restricción por MstII. 2.
Portador: La segunda columna corresponde a un paciente portador, es decir, que la mutación sólo ocurre en uno de sus alelos por lo que observamos que la sonda se unió a ambos fragmentos (1.2 y 1.4 kb) ya que la enzima de restricción sólo cortó en el alelo salvaje.
3.
Afectado: La tercera columna corresponde a un paciente afectado, ya que la sonda se unió sólo al fragmento de 1.4 kb por lo que no se presentó corte con enzima de restricción ya que ésta no reconoció el sito, debido a que hay una mutación.
PCR en tiempo real con taqman
Una tercera alternativa para detectar esta mutación es usando PCR en tiempo real con sondas taqman, como se observa en la Figura 5. El polimorfismo en un solo nucleótido se detecta con dos sondas específicas. A bajas temperaturas, se hibrida la mutación y a veces se
puede
generar
un
mismatch
(A).
Al
incrementar la temperatura sólo las sondas que son totalmente complementarias se hibridan en sus sitios respectivos (B). En la elongación, las sondas se degradan por la polimerasa con lo que se libera el reportero y el quencher. La otra sonda permanece intacta, por lo que el reportero y el quencher se
Figura 5. Detección de mutaciones con sonda taqman.
encuentran cercanos (C). Al excitar al reportero con una luz a su respectiva longitud de onda, se puede medir la emisión del reportero libre. Por otro lado, la emisión del reportero que no se ha liberado se trasmite vía FRET al quencher adyacente y no se detectará la señal. Esta detección se repite después de cada ciclo y como resultado la intensidad del reportero libre muestra un crecimiento exponencial por unidad de tiempo (D).
Conclusión En breve, el diagnóstico molecular es una herramienta de gran utilidad para el tratamiento de enfermedades genéticas, tal es el caso de la anemia falciforme. Existen múltiples formas de abordar el problema, como el uso de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, el cual se describió en este trabajo. No obstante, las posibilidades dentro de este campo son tantas y van desde las más simples hasta las más complejas, (como el uso de sondas Taqman ®). Todo depende del enfoque que se le quiera dar al problema y los recursos disponibles.
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