Determinación de a movilidad bacteriana.
Introducción.
La determinación de la movilidad bacteriana es uno de los parámetros que se utilizan en la identificación de las bacterias. Esta capacidad usualmente se debe a la presencia de flagelos; sin embargo, algunas bacterias no flageladas son capaces de moverse a lo largo de las superficies solidas por deslizamiento asociado a fibras polares muy largas, también, algunas bacterias acuáticas (las cianobacterias) pueden regular su posición y moverse mediante vesículas de gas. En cualquier caso, la movilidad capacita a la célula bacteriana para alcanzar diferentes regiones en su microambiente, lo que representa una ventaja, pero ese desplazamiento tiene un costo energético. Para evaluar la movilidad bacteriana en el laboratorio es necesario proveer condiciones que favorezcan; los medios más adecuados son líquidos o semisólidos, con suficiente fuente de energía. El movimiento usual debido a la presencia de flagelos, se puede determinar con el movimiento browniano, que es un movimiento vibratorio, originado por choques de moléculas del líquido contra las bacterias, que provoca vibraciones sin desplazamiento. (Evel Rodriguez, 2005)
Marco Teórico. Movilidad en cultivo
La determinación de la movilidad en medios semisólidos es utilizada cuando no se dispone del cultivo joven en medio liquido o cuando se sospecha que la bacteria a examinar es patógena, debido a que el riesgo para el operador cuando se inocula la bacteria es un medio semisólido, además es un método seguro para determinar movilidad, pues permite a las bacterias de cultivo viejos que pudieran haber perdido sus flagelos, se renueven y los manifiesten durante su crecimiento, presenta una desventaja, es necesario esperar el periodo de incubación para obtener resultados La inoculación se hace con la aguja bacteriológica, al introducirla y sacarla en línea recta en 2 tercios del medio, de manera que el fondo de tubo quede inocular y sirva como control de turbiedad. Esto se conoce como “inoculación por picadura”. Si las bacterias no son móviles lograran desplazarse a partir de esta
línea, enturbiando el medio de cultivo, sin que sea muy aparente la línea de inoculación. Si las bacterias son móviles y no son fermentadoras, el crecimiento se concentrara en la superficie del medio. (Evel Rodriguez, 2005) S taphylococ cus aureus .
es un microorganismo que se encuentra ampliamente diseminado en el ambiente ya que posee características particulares de virulencia y resistencia contra antibióticos, lo cual representa un grave problema de salud, esto es, gracias a que su distribución se extiende a nivel mundial y el impacto en la morbimortalidad es considerable a nivel comunitario e intrahospitalario. En los humanos, causa una amplia variedad de enfermedades infecciosas y su principal impacto es ocasionado por las cepas de S. aureus, que son sumamente resistentes a la meticilina (MRSA) y otros antibióticos que antes eran eficaces contra el tratamiento de las infecciones. Desde el punto de vista genómico, la resistencia se produce por selección natural a través de mutaciones producidas al azar; sin embargo, también se pueden inducir artificialmente mediante la aplicación de una presión selectiva a una población, como sería el abuso o la utilización de antibióticos; asimismo, S. aureus tiene características genéticas que le han permitido convertirse en una de las bacterias más importantes en la clínica y en las enfermedades transmitidas por alimentos. Se mencionan también algunas características principales para el aislamiento y el estudio del patógeno, utilizando procedimientos microbiológicos (Harris LG y col., 2002). Staphylococcus aureus es importante no solo porque ocasiona infecciones en
diversas partes del organismo humano, sino porque es una de las principales bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Tales enfermedades son causadas por diversas acciones, incluyendo la capacidad del patógeno de producir toxinas, siendo esto relativamente común en determinados sectores de la población y en algunas regiones geográficas desfavorecidas por la falta de sistemas de salud y de control de infecciones adecuados. (Tibavizco D y col., 2007) Análisis microbiológico Para la identificación de S. aureus es necesario utilizar algunas pruebas bioquímicas y medios de cultivo especiales que permitan su fácil determinación. Esta identificación se basa en las enzimas y las toxinas que produce el microorganismo. Aprovechando estas características se han diseñado medios para aislar esta bacteria, que son Baird-Parker, agar salado manitol, agar estafilococos N° 110, agar DNAsa.
Agar Baird-Parker Es un medio excelente para el recuento de Staphylococcus aureus, incluso, aunque se trate de células que sufrieron un daño subletal. Además, es el medio moderadamente selectivo más corrientemente usado. Su composición consta de piruvato sódico el cual ayuda a recuperar las bacterias lesionadas; su poder selectivo se debe a la presencia de telurito, cloruro de litio y glicina. En el medio, Vol. 25, No. 3, septiembre-diciembre de 2014 la característica positiva de la presencia de Staphylococcus aureus es la presencia de un aspecto negro, debido a la reducción del telurito, con un halo transparente que revela la actividad lipolítica sobre la yema de huevo; sin embargo, las colonias deben confirmarse mediante un examen de frotis teñido con coloración de Gram (Fernández-Escartín E., 2000). Agar Salado Manitol Se emplea para el aislamiento selectivo de Staphylococcus aureus. El agar sal manitol contiene una concentración de cloruro sódico de 7.5%, el cual es el agente activo del medio e inhibe parcial o completamente a los organismos bacterianos diferentes de los estafilococos. Los estafilococos coagulasa (+) ( Staphylococcus aureus) producen colonias de color amarillo y un medio circundante de color amarillo, mientras que los estafilococos negativos a la coagulasa producen colonias de color rojo y no provocan cambios en el color del indicador rojo fenol (Chapman GH., 2000). Agar estafilococos N° 110 Es un medio selectivo para aislar estafilococos patógenos a partir de muestras clínicas y no clínicas, basado en la fermentación de manitol, la formación de pigmento y la actividad gelatinasa. Este medio también se utiliza para el aislamiento de estafilococos que contaminan una amplia variedad de alimentos y producen una intoxicación alimentaria. Los estafilococos coagulasa (+) patógenos crecen en altas concentraciones de NaCl y forman colonias amarillas y doradas. Por otra parte, la fermentación de manitol se detecta por medio de la adición de unas gotas de azul de bromotimol a la placa, buscando las colonias con un halo amarillento alrededor. Los estafilococos licúan la gelatina produciendo zonas claras alrededor de las colonias. Para esta prueba, se le agrega a la caja Petri 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio o adicionando una gota de ácido sulfosalicílico al 20% e incubando 12 minutos para observar la hidrólisis de la gelatina. Una zona clara-transparente alrededor de la colonia constituye una hidrólisis (+) (Stone’s reaction) (Chapman GH., 2000).
Agar DNAsa Es utilizado para identificar estafilococos potencialmente patógenos; manifiesta la actividad de la desoxirribonucleasa, la cual es indicadora de su patogenicidad. Asimismo, se investiga la capacidad del microorganismo de producir enzimas que hidrolicen el ADN. La aparición de halos transparentes alrededor del área de crecimiento se considera resultado positivo, ya que estas corresponden a zonas de hidrólisis del ADN. La prueba es considerada negativa en caso de que los halos característicos no estén presentes (Silva-García MC y col., 2006). Catalasa Se utiliza para probar la capacidad del microorganismo para producir la enzima catalasa, la cual facilita la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, siendo de utilidad para evitar la formación de radicales tóxicos por el sistema de la mieloperoxidasa en las células fagocíticas. La prueba es positiva cuando la bacteria reacciona produciendo la liberación de burbujas, que es la característica dada por la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno (Núñez-Martínez JP, 2007). Coagulasa Esta prueba se emplea para determinar y diferenciar especies dentro del género Staphylococcus, así como para probar la existencia de Staphylococcus aureus. Dicho microorganismo tiene la capacidad de coagular dicha enzima. La coagulasa es un factor de agregación y constituye una prueba muy sensible y específica para esta bacteria. Esta proteínarepresenta un importante factor de virulencia. La coagulasa puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual tiende a formar depósitos donde los estafilococos pueden agregarse. La prueba puede hacerse de dos maneras: en portaobjeto, en la cual la solución se ha tratado previamente con ácido etilendinitrilo tetraacético (EDTA) y plasma de conejo. Por otra parte, la prueba se puede realizar en tubo, para lo cual se inoculan 0.5 ml de una dilución de plasma de conejo con la colonia sospechosa (Núñez-Martínez JP, 2007). Perfil bioquímico para el aislamiento y la caracterización de Staphylococcus aureus.
Para el estudio del patógeno es necesario hacer una serie de comparaciones que permitan identificar concretamente la presencia de la bacteria en la muestra que se analiza, ya sea de procedencia clínica o de alimentos.
S almonella typhi
El estudio de los mecanismos por los cuales una bacteria como Salmonella typhi puede causar la fiebre tifoidea en el humano, implica comprender cómo este patógeno invade las células, se multiplica y evade la respuesta inmune en el hospedante y, a su vez, cómo el humano responde a esta infección.. Todo ello, no sólo provee información básica sobre procesos biológicos fundamentales a nivel molecular y celular, sino que puede aportar herramientas para el diseño de mejores métodos de diagnóstico y prevención de esta y otras enfermedades de origen bacteriano (Romero C, Raúl, 2007). S almonella y su taxonomía
Las salmonellas son bacterias gram-negativas, lo cual significa que no se tiñen de azul con el colorante aplicado en la prueba diseñada por Gram. Esto se debe a que dicho colorante tiñe la pared celular, que en estos casos está cubierta por una membrana externa. Es así que estas bacterias están envueltas por varias capas: la membrana externa, la pared celular (que es diez veces más delgada que en las bacterias gram-positivas), y la membrana interna. La membrana externa e interna delimitan al periplasma. La apariencia de las bacterias en el microscopio es de bacilos, o cilindros con puntas redondeadas. El género Salmonella fue descrito a principios del siglo XX por el bacteriólogo estadounidense Theobald Smith, recibiendo el nombre por su jefe David Salmon. Las salmonellas son bacterias entéricas, o sea que se alojan en el intestino, y su taxonomía es compleja. Actualmente, el género Salmonella consiste de una sola especie, que ha sido denominada Salmonella enterica . Ésta, a su vez, está formada por siete subespecies, dependiendo de su capacidad para realizar diferentes reacciones bioquímicas. Esta subdivisión ha sido apoyada por varios método de hibridación ADN/ADN y métodos serológicos. Cada subespecie, a su vez, está subdividida en serotipos o serovares, de acuerdo al tipo de antígeno H u O. El antígeno H está conformado por la proteína más abundante del flagelo, que es la estructura que permite el movimiento. El antígeno O está conformado por una cadena repetida de polisacáridos, que forma parte del lipopolisacárido (LPS), que se genera y sobresale de la membrana externa y que actúa como una barrera de protección a agentes externos. Es así que se han descrito más de 2,375 serovares de Salmonella, que finalmente pertenecen al mismo género en base a su gran identidad en el genoma, de 90% o más (Romero C, Raúl, 2007).
Salmonellosis
El género Salmonella es el agente causal de diferentes infecciones intestinales, conocidas como salmonellosis. La salmonellosis humana puede dividirse en dos síndromes. 1) La fiebre entérica, que incluye la fiebre tifoidea causada por S. typhi , y la fiebre paratifoidea que es patológica y clínicamente similar a la tifoidea pero con síntomas menos fuertes, causada por S. paratyphi A, B, o C. La fiebre entérica implica una infección sistémica, debido a la invasividad de la bacteria. 2) La gastroenteritis o envenenamiento por alimentos, la cual es la más común de las infecciones, causada por muchos serotipos. Este tipo de infecciones no es acompañada de una infección sistémica. Los serotipos más comunes en la salmonellosis no-tifoidéica son S. typhimurium y S. enteritidis . Puede también ocurrir una invasión sistémica sin gastroenteritis, sobre todo en individuos inmunocomprometidos, como en el caso de las infecciones intrahospitalarias. Asimismo, sobre todo para la fiebre tifoidea, puede establecerse la condición de portador asintomático (Dr. Venzmer, 1967). Salmonella typhi
La S. typhi es una bacteria anaeróbica facultativa, que puede en ocasiones sobrevivir en bajas condiciones de oxígeno. Pertenece al serotipo 9,12, en base a los epítopes de la tivelosa, el azúcar repetida en su antígeno O. El antígeno flagelar "d" es el más preponderante, aunque algunas cepas de Indonesia poseen otro antígeno denominado "z"; lo que significa que expresan un flagelo muy diferente en secuencia de aminoácidos al encontrado en las cepas de otras regiones del mundo. Además de los antígenos O y H, tiene en su exterior una cápsula de polisacáridos denominada Vi (por antígeno de "virulencia"). Estos bacilos no producen esporas. La mayoría de las cepas son móviles debido a que poseen flagelos peritricos, que rodean a la célula. Interesantemente, existen cepas no móviles en Indonesia, en donde la incidencia de la fiebre tifoidea es más alta. La S. typhi produce ácido a partir de glucosa, maltosa y sorbitol, sin la producción de gas; pero no fermenta la lactosa, sacarosa, la ramnosa y otros azúcares. Produce nitrito a partir de nitrato y también produce ácido sulfhídrico. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37oC.(Romero C, Raúl, 2007).
Epidemiología S. typhi causa la fiebre tifoidea en humanos, quienes son sus únicos hospedantes.
Esto abre importantes preguntas sobre qué genes determinan dicha especificidad, las cuales se podrán abordar en vista de los recientes proyectos de secuenciación del genoma de diferentes serotipos, incluyendo la S. typhi CT18 (con resistencia múltiple a antibióticos proveniente de Vietnam); la S. typhimurium, que se postula reproduce el mecanismo de la infección humana en el ratón; o la S. gallinarum que produce una fiebre enterica en las gallinas. La fiebre tifoidea prevalece principalmente en países en vías de desarrollo, donde normalmente significa un reto a las autoridades en salud pública. Hay aproximadamente 17 millones de casos anuales con casi 600,000 muertes, principalmente en Asia y África. Las más altas incidencias se encuentran en Indonesia y en algunos puntos del sureste asiático, como Papua Nueva Guinea, en donde puede alcanzar niveles de 103 por cada 100,000 habitantes. En otros lugares en Asia la incidencia es menor. Interesantemente, la mayoría de los casos en las regiones de mayor incidencia, se encuentran en niños en edad escolar de 13 a 19 años de edad. En México, la incidencia es cien veces menor a la de Indonesia, o sea de 10 por cada 100,000 habitantes. De hecho, de 1989 a 1993, la incidencia disminuyó a la mitad, coincidiendo con las campañas del sector salud para la prevención del cólera. El grupo etario más afectado es el de adultos jóvenes, de 19 a 44 años de edad. Ciertamente, las diferencias en incidencia y en grupos de edad afectados son problemas de interés para la epidemiología, cuya resolución involucra la mejor comprensión de los modos de transmisión y sobrevivencia de la bacteria en el ambiente, el conocimiento más profundo de la respuesta inmunológica del hospedante y de las posibles variaciones genéticas entre los aislados clínicos de S. typhi (Dr. Venzmer, 1967). Manifestaciones clínicas
El período de incubación para S. typhi abarca de una semana a un mes, siendo principalmente de dos semanas, a partir de la ingesta de la bacteria proveniente de alimentos o agua contaminada. Se presume que S. typhi invade a través de las células M del intestino, las cuales forman parte del tejido linfoide o inmunológico. Sin embargo, debido a que no se han podido cultivar las células M en el laboratorio, los experimentos de invasividad de Salmonella se han realizado con células epiteliales y macrófagos, los cuales, además, constituyen otros eslabones en el proceso de invasión.No siempre ocurre la diarrea, pero generalmente hay ulceración. S. typhi se multiplica en el epitelio de la submucosa, después de lo cual entra el torrente circulatorio y se disemina por el cuerpo. La multiplicación ocurre otra vez en el bazo y en el hígado, para que después la bacteria sea liberada en grandes cantidades al torrente sanguíneo. Esta septicemia o invasión
generalizada puede confirmarse por el cultivo de la bacteria de la sangre, lo cual refleja una bacteremia. Este estadio de la infección, que puede durar 2 a 3 semanas, se caracteriza por una tos seca, fiebre alta, e intenso dolor de cabeza. La fiebre puede ser cíclica, es decir, la temperatura puede incrementarse por las tardes, acompañada de escalofríos, convulsiones y delirio. De hecho, el nombre de la enfermedad proviene del griego typhus, o "neblina o humo", que probablemente se usó para describir enfermedades febriles que causan alteraciones mentales.Desenlaces fatales por tifoidea ocurren primordialmente por la ruptura de bazo, ocurriendo un choque séptico ocasionado por el LPS, que estimula la liberación de agentes mediadores de la respuesta inmune como las citocinas. Alternativamente, el 10% de los individuos afectados pueden desarrollar el síndrome de portador sano, excretando continuamente las bacterias del bazo. La hepatitis por S. typhi ha sido documentada. Sin embargo, no se cuenta con información suficiente para describir en detalle los nichos de sobrevivencia y multiplicación de la bacteria en el humano, excepto que se considera que invade células epiteliales del intestino y, además, se han aislado macrófagos hospedantes de la bacteria. Por otro lado, estudios de la patogénesis (o de los mecanismos para generar enfermedad) de S. typhimurium en ratones, ha conducido a la postulación de la sobrevivencia y multiplicación en ambientes extracelulares. Preguntas fascinantes en este sentido y otras relacionadas a qué factores del hospedante o de la bacteria determinan el cuadro clínico, esperan una respuesta(Dr. Venzmer, 1967). Diagnóstico, tratamiento y prevención
El diagnóstico de una infección por S. typhi se realiza a través del aislamiento de la bacteria de sangre, heces, orina, aspirado de médula ósea y bilis. Estas pruebas tardan dos a tres días en aportar los resultados, pues la muestra se diluye en un medio de cultivo y, dado que se estima que un paciente con fiebre tifoidea presenta, por ejemplo, 20 bacterias o menos por ml de sangre, se requiere esperar a que se multiplique lo suficiente para ser observada por turbidez del medio. El cultivo de la sangre es el método más frecuentemente usado para un diagnóstico preciso, aunque su sensibilidad no es más del 90%, incluso cuando se toman tres muestras consecutivas. El cultivo de aspirado de médula ósea es más sensible, pero el procedimiento de extracción del aspirado es delicado y doloroso. Pruebas bioquímicas y serológicas se realizan para confirmar el diagnóstico. El serodiagnóstico de la infección por S. typhi , usando el ensayo de aglutinación de Widal (reacciones febriles), se basa en la detección de anticuerpos en el suero de los pacientes a los antígenos O (LPS), H (flagelar) y el Vi (antígeno capsular). La limitante de este método es que pobladores sanos de áreas endémicas (en donde la enfermedad es prevalente), presentan títulos (concentraciones) altos de
anticuerpos, dificultándose en ocasiones la distinción entre individuos afectados y sanos. Varios otros inmunoensayos en el formato de ELISA, también se han utilizado para la detección de antígenos o anticuerpos específicos en suero. Asimismo, métodos moleculares como la hibridación con ARN ribosomal, con el gen del antígeno Vi, o con la secuencia de inserción IS200, han sido usados. La limitante principal con estos métodos es que requieren de una infraestructura sofisticada de laboratorio y personal altamente especializado, además de que pueden tomar de varias horas a varios días. Es así que métodos de detección más rápidos, precisos y sencillos, son en extremo necesarios para ésta y otras bacteremias. Ciertamente, la mejor caracterización de antígenos para pruebas inmunológicas, o de genes de virulencia (que determinan la severidad y las características de la enfermedad) para pruebas por amplificación específica de material genético, como la reacción en cadena de la polimerasa o PCR por las siglas en inglés, serán claves para avanzar en este rubro de impacto en salud pública. La fiebre tifoidea se trata con antibióticos. Los regímenes típicos incluyen amoxicilina, cotrimoxazol y cloranfenicol. Sin embargo, desafortunadamente, la emergencia de cepas con resistencia múltiple a antibióticos se está convirtiendo en un problema global serio. Algunas de las regiones donde estas cepas resistentes se han multiplicado incluyen el subcontinente Indio, Vietnam, Latinoamérica, y Egipto. A pesar de estas cepas resistentes, el cloranfenicol sigue siendo el antibiótico de elección, por su capacidad de infiltración en los tejidos. Las cefalosporinas y quinolonas de tercera generación, constituyen alternativas interesantes. Las vacunas principales contra la fiebre tifoidea son la oral Ty21a y la parenteral del polisacárido Vi. Ambas proveen una protección hasta del 65-70%, con una inmunidad de 3 a 7 años. Es interesante que la Ty21a es una cepa atenuada por mutagénesis química, por lo que tiene múltiples mutaciones, de las cuales se desconoce las que determinan la atenuación. Ciertamente, una mejor comprensión de los mecanismos básicos, a nivel molecular y celular, de la interacción bacteria-hospedante, permitirá la generación de cepas atenuadas en los genes clave, para obtener el balance apropiado entre la capacidad de generar una respuesta inmune y la atenuación que evite una infección virulenta. De la misma manera, la mejor caracterización de antígenos relevantes durante la fiebre tifoidea, deberá permitir el diseño de mejores vacunas parenterales (Romero C, Raúl, 2007). Taxonomía molecular
Se ha utilizado la electroforesis multilocus de enzimas para caracterizar diferentes cepas bacterianas, incluyendo las de S. typhi . En este método se separan por electroforesis los componentes de un extracto celular, bajo condiciones que permiten el ensayo de la actividad de una batería de enzimas. Así, la actividad de
veinte o más enzimas se asocia a la banda de la proteína respectiva, que migra en el gel de acuerdo a su carga y tamaño. Las variaciones en el genoma de la bacteria pueden reflejarse en alteraciones en la migración de alguna o más enzimas (que representan varios loci o genes), por lo que pueden obtenerse electroferotipos, o patrones de migración específicos que permiten distinguir una cepa de otra. De esta manera, se ha concluido que S. typhi es de naturaleza clonal, es decir que ha variado poco en la evolución, al menos con respecto a una serie de enzimas básicas de su metabolismo. Otras bacterias muestran más variación, incluyendo otros serotipos de Salmonella. Otra manera de clasificar a las bacterias es por electroforesis en geles pulsados. En este método, se digiere el genoma de la bacteria con una enzima de restricción que corta poco frecuente, es decir, que produce fragmentos grandes de ADN (mayores a 20 kb o 20,000 pares de bases). Estos fragmentos se separan por electroforesis en gel bajo un campo eléctrico pulsado, lo que hace que el ADN tome diferentes orientaciones alternas durante la migración. Interesantemente, esta metodología mostró que el cromosoma de S. typhi es mucho más variable de lo que se pensaba bajo el concepto de cepas clonales, habiéndose identificado patrones de migración electroforética comunes para cepas correlacionadas geográficamente. También se observó que el cromosoma fluctúa en tamaño entre 3.96 y 4.92 Mb, o millones de pares de bases, es decir, alrededor del 20% . Sin embargo, hasta la fecha, no se ha podido correlacionar estos tamaños con un fenotipo en particular: dicho de otra forma, la S. typhi se comporta de manera clonal en cuanto a su especificidad de hospedante y virulencia. Sin embargo, recientemente, se han descrito casos severos de tifoidea en Papua Nueva Guinea, pero no se ha determinado todavía si la bacteria posee características particulares. De nueva cuenta, hay preguntas interesantes por resolver en cuanto a la relación entre el tamaño y la plasticidad del genoma y la habilidad de la bacteria para sobrevivir en diferentes ambientes y causar enfermedad. El análisis de plásmidos o moléculas circulares de ADN con replicación autónoma al cromosoma, que se transfieren de manera horizontal entre bacterias, y que codifican para resistencia a antibióticos o factores de virulencia, ha revelado que la gran mayoría de las cepas de S. typhi carecen de ellos. Solamente las cepas con resistencia múltiple a antibióticos las poseen, y éstas han aparecido esporádicamente aunque su presencia se ha incrementado en los últimos años. Otros serotipos de Salmonella poseen plásmidos con frecuencia variable, aunque también hay plásmidos que son específicos de cada serovar. De esta manera, no hay un método general de tipificación de Salmonella por perfil de plásmidos. Las huellas genéticas de las bacterias, y de las salmonellas en particular, se han generado por la hibridación de fragmentos de ADN con sondas de regiones o genes repetidos en el genoma, marcadas radioactivamente. Los fragmentos de ADN se obtienen por el corte con enzimas de restricción, se separan por electroforesis a través de un gel y se transfieren a
un papel filtro. De esta manera, se producen columnas con bandas de diferentes tamaños (o posición en la columna) que distinguen a una cepa en particular; en un formato similar a una barra de identificación en los productos del supermercado. Para este propósito se han utilizado genes ribosomales, de los cuales hay siete copias, o de la secuencia de inserción IS 200 , de la cual hay convenientemente más de quince copias en el genoma de S. typhi , aunque otros serotipos tienen un número menor de copias. De manera similar, se han utilizado genes no repetidos para tipificar cepas de Salmonella sp. y S. typhi , los cuales han incluido genes del flagelo (fli ), de invasividad (inv ), del antígeno capsular ( via), del LPS ( rfb), de antígenos de superficie ( omp), de proteínas de estrés ( groEL), o de islas de patogenicidad (SPI-1 y SPI-2). De hecho, estos estudios y la caracterización de la secuencia nucleotídica de éstos y otros genes, ha permitido determinar que las salmonellas pertenecen a un solo género, S. enterica, por su alto grado de conservación genética (Bravo Perez y col., 2007). Organización del genomas
El genoma de S. typhi CT18 está constituido por un cromosoma circular de 4,809,036 pb, con un contenido de G+C de 52.09 %, más dos plásmidos: el pHCM1 de 218,160 pb, que codifica para resistencia múltiple a antibióticos, y pHCM2 de 106,516 pb, que es críptico o de función desconocida. Al igual que E. coli , contiene más de cuatro mil genes. S. typhi constituye una excepción a la conservación del orden cromosómico, porque presenta rearreglos mayores observados entre diferentes aislados clínicos. Existen inversiones y transposiciones de grandes segmentos, posiblemente promovidos por recombinación homóloga entre genes ribosomales ( rrn), y no se observan pérdidas, inserciones, o duplicaciones de regiones cromosómicas. El significado biológico de estas particularidades en el genoma de S. typhi permanece un misterio y, ciertamente, será el tema de futuras investigaciones. En general, parece haber menor conservación del orden cromosómico en cepas de Salmonella que infectan hospedantes específicos. Por ejemplo, el orden de los fragmentos grandes obtenidos con la enzima I- CeuI, y analizados por electroforesis de campos pulsados, es de ABCDEFG en S. typhimurium LT2, E. coli K-12, y en especies de Salmonella que crecen en diferentes hospedantes. Sin embargo, en S. typhi, S. paratyphi C, S. gallinarum , y S. pullorum, las cuales son hospedanteespecíficas (la última también para aves), estos fragmentos están rearreglados. Otras variantes entre los genomas de las salmonellas incluyen la presencia o ausencia de diferentes islas de patogenicidad y de operones para fimbrias (descritos en las siguientes secciones). Asimismo, recientemente, se ha reforzado el concepto de la transferencia horizontal de genes de patogenia a través de fagos temperados, o virus bacterianos que pueden alojarse en el cromosoma de la
bacteria, acarreando genes pasajeros de diferentes partes del genoma de otra bacteria (Bravo Perez y col., 2007). Pseudomonas
Son bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos. La mayoría son móviles por un flagelo polar o por un mechón formado por dos o tres flagelos. Casi todas las especies poseen fimbrias y pilis. Algunas especies forman una delgada microcápsula compuesta por los azúcares. Su metabolismo es oxidativo de tipo respiratorio, y son aerobios estrictos. Algunas cepas producen pigmentos. Casi todas crecen en agar MacConkey con colonias lactosa negativa y algunas especies pueden desarrollarse a 4°C, pero la mayoría son mesofilícas. Puede instalarse en cualquier órgano o tejido, invadir el oído externo y colonizar las vías urinarias, los pulmones, el endocardio, la córnea y los huesos. De una infección localizada en alguno de esos tejidos, puede diseminarse por el torrente circulatorio, producir septicemias de alta gravedad e instalarse en otros tejidos. (Romero, 1999) E s cherichia coli
La bacteria Escherichia coli fue inicialmente aislada y descrita por el pediatra alemán Escherich en 1885, quien demostró su existencia como huésped habitual del intestino. La denominó Bacterium coli commune , que puede traducirse como “bacteria común del colon”. Escherichia coli se caracteriza por poseer bacilos Gram negativos, no esporulante, producción de indol a partir de triptófano, no utilización de citrato como fuente de carbono y no producción de acetoína. Además, fermenta la glucosa y la lactosa con producción de gas. Como todas las bacteria Gram (-), la cubierta de Escherichia coli consta de tres elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio periplásmico constituido por péptidoglucano. Esta última estructura confiere a la bacteria su forma y rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas ambientales relativamente elevadas. Escherichia coli es una bacteria mesófila, su óptimo de desarrollo se encuentra en
el entorno de la temperatura corporal de los animales de sangre caliente (35-43 ºC). La temperatura límite de crecimiento se sitúa alrededor de 7 ºC, lo que indica que un control eficaz de la cadena de frío en las industrias alimentarias es esencial para evitar el crecimiento de Escherichia coli en los alimentos. La congelación tiene pocos efectos sobre la población de Escherichia coli en el alimento, y no garantiza la destrucción de un número suficiente de bacterias viables para asegurar su inocuidad. Sin embargo, Escherichia coli es sensible a temperaturas superiores a 70 ºC, a partir de la cual son fácilmente eliminadas; por ello, es muy
importante la pasteurización de alimentos como la leche, zumos, etc., para garantizar su eliminación. (Rodríguez et. al. 2009)
Objetivos Objetivo general El alumno observará algunas reacciones bioquímicas relacionadas con la fisiología bacteriana, a la vez aprenderá su utilización para la identificación de enterobacteria, para saber si es móvil e inmóvil
Metodología
Material. Cultivo de 18 a 24 hrs para Staphylococcus aerus en caldo Cultivo de 18 a 24 hrs E. coli Cultivo de 18 a 24 hrs Pseudomonas Cultivo de 18 a 24 hrs Salmonella Tubos de ensaye con rosca Gradilla Jeringas de 3 ml (aguja bacteriológica)
1. Con la aguja bacteriológica, inocular por picadura como se indicó antes, cada cepa en un tubo de agar movilidad. Incubar los tubos a 37°C por 24 horas.
Figura.1 tubo con aguja bactereologica. 2. Transcurrido el tiempo de incubación, observar los tubos inoculados y compararlos. Si la prueba de movilidad es positiva se observara migración de las bacterias a partir de la línea del inoculo, lo que se manifiesta como turbiedad en el medio o concentración del crecimiento en la superficie. Si la movilidad es negativa las bacterias crecerán a lo largo de la línea de inoculación y el resto del tubo permanecerá sin turbiedad. Resultados esperados.
Resultados obtenidos Bacteria
Produccion H2S
de Movilidad
Nombre del alumno quien
Pseudomona aeruginosa
negativo
movil
Sadra M.Gonzalez
Salmonella typhy
Positive
movil
E.coli
negativo positivo
movil inmovil
Sofia Fiscal, Laura Fiscal, Diana Gutierrez Edith Santos ----------
Stafilococus
aureus
Fig.2 Salmonella typhy S.F.F
Fig.3. Salmonella typhy D.G.S
Fig.3 Salmonella typhy L.F.F
Fig.5 E.coli E.S.A
Fig. 6 Pseudomona aeruginosa S.G.S
Referencias
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