Acadêmicos: Bruna Farias, Lucas Geraldini Coelho, Maria Gabriela Alves, Phellipe Rodero Bataglini e Thaynny Oliveira DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR (A) 1. INTRODUÇÃO A amilase, também chamada de diástase, é uma enzima que catalisa a liberação das ligações glicosídicas 1-4 do amido e glicogênio. Existem dois tipos de amilase: as α-amilases e as β-amilases. As α-amilases são
encontradas nas bactérias, nos tecidos e nos fluídos animais, incluindo o sangue, a urina e a saliva. As β -amilases são encontradas em plantas de
organizações mais complexa. As α-amilases agem sobre o amido, produzindo uma ruptura progressiva das moléculas. Desta forma, o amido se desdobra, inicialmente, em dextrinas redutoras, que são logo hidrolisadas, transformando-se em unidades menores. O amido é hidrolisado pela α-amilase até maltose.
Em um meio contendo iodo e amido ocorre à formação de um complexo coloidal azul. Este complexo ficará comprometido (perda da cor) quando a este meio for adicionado certa quantidade de amilase. Uma vez que, esta enzima é capaz de hidrolisar o amido, fazendo com que ocorra uma diminuição da intensidade da cor azul. Quanto maior a atividade enzimática da amilase menor a intensidade de cor. A α-amilase tem temperatura e pH ótima de 37°C e 7,0-7,2, respectivamente.
A atividade da amilase salivar (A) mede o tempo mínimo que a amilase leva para digerir totalmente o amido em condições ótimas de temperatura, pH e concentração de cloretos. Quando o amido estiver totalmente digerido, isto é, transformado em maltose, teremos reação negativa com o iodo e consequentemente a solução ficará com a cor castanha do iodo. Dizemos, então, que foi atingido o ponto acromático. Na prática, incuba-se a saliva com o amido em condições ótimas de temperatura (37ºC), pH e concentração de cloretos e, de minuto a minuto, faz-se a leitura da digestão do amido pela reação com o iodo, até ser atingido ponto acromático. O resultado é expresso em unidades amilásicas (ua). Uma unidade amilásica é a atividade da amilase
para digerir totalmente 50mg de amido (5ml de solução de amido a 1g%), em 10 minutos, em condições ótimas de temperatura, pH e cloreto. Normalmente, A varia entre 100 a 150 ua/ml de saliva. Em pacientes muito susceptíveis à cárie dental, os valores de A são muito elevados em relação aos pacientes resistentes à cárie dental, onde os valores de A são bem menores. O Lugol ou solução de Lugol é uma solução de Iodo (1%) em equilíbrio com KI (2%) em água destilada. Este produto se emprega frequentemente como desinfetante e antisséptico. O soluto de Lugol é um indicador para testar a presença de amido, tendo em vista suas propriedades. O corante irá colorir o amido à medida que interage com a estrutura enrolada do polissacarídeo, produzindo cor azul escura (ENGELBRECHT, Fred e WENDT, Thomas).
2. OBJETIVOS Determinar a atividade da amilase salivar. Analisar o efeito do tempo de incubação sobre a atividade enzimática.
3. MATERIAIS E MÉTODOS Materiais:
Béquer de 10mL
Pipeta de 2 e 5mL
Tubos de ensaio
Estantes para tubos
Garra de madeira
Tubos de hemólise (11)
Erlenmeyer Conta-gotas Cronômetro
Saliva diluída
Solução de amido 1%
Solução de iodo
Solução salina
Método:
Colocou-se 1 mL de amido a 1% (50mg de amido + 5 ml de água), num tubo de hemólise.
Adicionou-se 2 gotas de solução salina: saliva colhida de um componente do grupo pelo seguinte procedimento: lavou-se bem a boca com água, colocou-se um chumaço de algodão sob a língua o qual foi removido após estar embebido em saliva, o material foi espremido para coletar cerca de 2 mL de saliva livre de espuma. Pipetou-se 1 mL de saliva e misturou-se com 9 mL de água destilada. Deste recipiente, pipetou-se 1 mL da saliva diluída e adicionou-se 9 mL de água.
Adicionou-se 1 mL de saliva diluída (1:100) – Diluição Seriada.
A Solução foi levada para banho-maria a 37ºC.
Aguardou-se o tempo conforme a tabela 1 e adicionou-se 2 gotas de
Iodo em cada um dos tubos de hemólise. Observou-se os resultado e estes foram anotados na Tabela 1, além de utilizados para os cálculos do tempo de viragem da reação. Tabela 1: Tempo de duração de reação e coloração obtida.
TUBO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Azul Castanho
Calculou-se o tempo o tempo mínimo da amilase para digerir o amido, ou seja, até a coloração do substrato ser modificada. E, então respondeu-se qual o valor obtido da atividade da amilase salivar, à partir da seguinte fórmula:
A = 10D/T ua/ml de saliva
A = Atividade da amilase salivar mínima para digestão completa do amido em condições ideais D = Diluição utilizada T = Tempo de viragem
4. RESULTADO E DISCUSSÃO O tempo mínimo encontrado para que a amilase degradasse completamente o amido foi 5 minutos. Nos tubos 1, 2 e 3 após a adição de iodo observou-se uma coloração azul-escuro (coloração também encontrada nos tubos 8 e 10 por motivos abordados adiante). O amido quando tratado com Lugol modifica sua coloração formando um complexo de cor azul-intensa. Já no tubo 4 foi encontrado uma coloração levemente mais clara, observando a degradação parcial do amido. Isso ocorre porque esta substância forma um complexo de adsorção (complexos de transferência de carga) com o iodo. O amido é composto basicamente de amilose e amilopectina. A amilose possui conformação helicoidal, acredita-se que a cor azul intensa seja resultante da adsorção do iodo nessas cadeias. (UFPA, 2001). Portanto, em até 4 minutos a amilase não degradou completamente o substrato. Nos tubos 5, 6, 7 e 9 após a adição de Iodo observou-se uma coloração castanho clara, isso ocorre quando o amido estiver totalmente digerido, isto é, transformado em maltose. O Lugol é um reagente de polissacarídeos. Não reage com monossacarídeos ou dissacarídeos. Pelo fato de frutose e glicose serem monossacarídeos, não há esse tipo de ligação, e, portanto, a cor castanha do Iodo permanece. (NUNES, Sandra). Portanto, encontrou-se o “T” – tempo mínimo para a amilase digerir completamente o amido em condições ótimas. A coloração azul nos tubos 8 e 10 se deve ao fato da errônea diluição e pipetagem, pois, ao pipetar a solução diluída ocorreu uma concentração de amilase maior do que a esperada, provavelmente ocorrida por serem os primeiros tubos de ensaio que foram montados, o que indica uma que a mistura
da diluição não havia ainda sido feita, culminando em uma reação amido-iodo que resultou na coloração azul-escuro. A partir dos valores obtidos e utilizados na fórmula, o valor de A foi de 200 ua/ml de saliva. Baseado em MORIEL, Patricia et. al. o valor está dentro da normalidade para o período pós-prandial. Como o doador da saliva havia terminado sua refeição havia poucos minutos, ainda persistia a alta atividade dessa enzima. O valor médio encontrado para indivíduos saudáveis e em jejum nessa pesquisa foi de 150 ua/ml de saliva. A amilase salivar é uma importante enzima presente na cavidade oral. A sua principal função é promover a hidrólise do amido transformando-o em maltose, o qual pode servir como substrato para as bactérias orais executarem as suas funções como: a produção de ácidos de fermentação, que podem promover a desmineralização do esmalte, facilitando a formação da cárie. (Apud STEINBERG & ZIMMERMAN, 1978). Logo, pode-se inferir que quanto maior a atividade dessa enzima no indivíduo, maior será a degradação dos grandes carboidratos, como amido, em pequenos (ex: maltose), logo, esse estará mais propício a adquirir cáries. Por outro lado, indivíduos com menor atividade enzimática da amilase, são menos susceptíveis à cárie dentária.
5. CONCLUSÃO No experimento realizado, utilizou-se a mesma temperatura, pH e mesmo volume e concentração de reagentes e produtos, tendo como única variável o tempo. E, com tal trabalho demonstrou-se que este é um fator determinante e importante no resultado final de uma reação, visto que os tubos iniciais expressavam uma reação ainda não estabelecida, enquanto que os últimos tubos expuseram o produto completamente formado. Portanto, para que possa ser produzir determinado produto utilizando-se da ação enzimática no processo, deve-se contabilizar o tempo como um dos fatores de grande importância.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ENGELBRECHT, Fred; WENDT,Thomas. Detecção de açúcar: um problema diário quando se enfrenta a diabetes. Revista Science in School. Disponível em:
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http://www.scienceinschool.org/2008/issue9/diabetes/portuguese>
Acessado em 10 de março de 2014. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ. Iodometria: detecção do ponto final. Disponível em:< http://www.ufpa.br/quimicanalitica/detectapfinaliodo.htm >. Acessado em: 10 de março de 2014. MORIEL, Patricia et al. Influência do fumo na atividade da amilase salivar e na curva glicêmica. Rev. Nutr. [online]. 2010, vol.23, n.4 [cited 2014-07-11], pp. 565-572
.
Disponível
em:
. Acessado em 11 de junho de 2014. NUNES, Sandra. et al. Bioquímica prática: protocolo para análise de biomoléculas
e
exercícios
complementares.
Disponível
em:
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http://www.repositorio.ufma.br:8080/jspui/bitstream/1/445/1/Livro%20de%20Bio quimica%20Pratica.pdf >. Acessado em 8 de março de 2014. Steinberg AD, Zimmerman S. The Lincoln dental caries study: a three year evaluation of dental caries in persons with various mental disorders. J AmDent Assoc. 1978; 97(6): 981-4.
