Abstracto
La separación de fases es un método simple, eficiente y barato para purificar y concentrar las proteínas de membrana solubilizada con detergente. A pesar de esto, esto, la sepa separac ració ión n de fases fases no se usa usa mucho mucho o inclus incluso o conoc conocido ido entre entre los cientí científic ficos os de prote proteín ínas as de membra membrana na,, y protoc protocolo olos s listo listos s para para su uso uso están están disp dispon onib ible les s por por sólo sólo rela relati tiva vame ment nte e poca pocas s comb combin inac acio ione nes s de prot proteí eína nas s de detergente / membrana. Auí, resumimos los parámetros físicos y uímicos ue influyen en el comportamiento de separación de fases de los detergentes de uso com!n para los estudios de proteínas de membrana. "e proporcionan e#emplos para la purificación con é$ito de las proteínas de membrana utilizando este método con diferentes clases de detergentes. %omo la elección del detergente es crítico en muchas aplicaciones posteriores &por e#emplo, la cristalización cristalización de proteínas proteínas de membrana o ensayos funcionales', se discute cómo los nuevos protocolos de separación de fases se pueden desarrollar para un sistema tampón detergente dado.
Introducción
Los Los deter deterge gente ntes s se utiliz utilizan an para para e$trae e$traerr proteí proteína nas s de la membra membrana na de las membranas biológicas y para mediar su solubilidad en soluciones acuosas, lo cual es un reuisito reuisito previo para una mayor purificación de proteínas &('.)urificación &('.)urificación de proteínas de la membrana es generalmente tedioso &*', &*', ya ya ue se eliminan de su entorno nativo de membrana en un tampón detergente ue pueden mimetizar sólo parcialmente las propiedades físicas y uímicas de una membrana lipídica. )or lo tanto, muchas proteínas de la membrana no conservan su actividad biológica después de la e$tracción, o lo hacen sólo parcialmente o sólo ba#o condiciones de tampón muy especiales. +esp +espué ués s de la e$tra e$tracci cción ón,, purif purifica icació ción n de proteí proteínas nas de membr membrana ana se logra logra gener generalm alment ente e por por los mismos mismos métod métodos os utiliz utilizad ados os para para la cromat cromatogr ografí afía a de proteínas solubles, siendo la diferencia ue los detergentes deben estar presentes en las memorias intermedias en todo momento. +etergentes no interfieran con intercambio iónico o cromatografía de uelatos metálicos, y sólo a veces con otros métodos métodos de cromato cromatograf grafía ía de afinidad afinidad.. n la cromatog cromatograf rafía ía de e$clusi e$clusión ón por tama-o, el peso molecular aparente de proteínas de la membrana se incrementa por el detergente unido. La separación de fases es una poderosa alternativa o adición a los protocolos de purificación basado en la cromatografía. )uede ser utilizado directamente en las membranas solubilizadas, separando las proteínas de membrana de las proteínas solubles y otras impurezas hidrófilas. ales protocolos de purificación brutos se utilizan en la proteómica membrana o como una primera etapa de purificación, seguido por cromatografía &, 0'.Alternativamente, la separación de fases puede
ser e$plotado como una concentración simultánea y etapa de pulido en una etapa posterior de purificación &1'. l uso de etapas de separación de fase en la purificación de proteínas de la membrana tiene una serie de beneficios.Los protocolos son simples de usar, no reuieren euipos de laboratorio comple#os, son fácilmente ampliarse a grandes vol!menes, y son compatibles con la mayoría de los métodos cromatográficos. specialmente, la eliminación de compuestos hidrófilos es muy eficiente. )or otra parte, las proteínas de membrana pueden purificarse y se concentraron al mismo tiempo, comparable en eficacia con protocolos de precipitación de las proteínas solubles ue emplean &23 0' * "4 0 u otras sales. 5na posible desventa#a del método son las altas concentraciones de detergentes implicados, ue pueden ser desfavorable para la estabilidad de la proteína y puede interferir con los ensayos biouímicos y procesos de unión. La diálisis u otros métodos como la absorción de detergente o de filtración en gel pueden ser necesarias para eliminar el e$ceso de detergente de la solución. A continuación, describimos los parámetros físicos y uímicos ue influyen en la separación de fases de las diferentes clases de detergentes de uso com!n en la purificación de proteínas de membrana. "e discuten los protocolos de separación de fases e$itosas y dar pautas sobre cómo estos protocolos se pueden adaptar a los nuevos sistemas tampón detergente. Propiedades General de Detergentes
Los detergentes son moléculas anfipáticas por lo general consisten en un grupo de cabeza polar o cargado y una cadena hidrocarbonada hidrófoba e$tendida. A concentraciones muy ba#as, estas moléculas son solubles en agua como monómeros. Al aumentar la concentración de detergente por encima de la denominada concentración micelar crítica &%6%', las moléculas de detergente forman agregados con una distribución de tama-o muy estrecha, llamada micelas. l tama-o de las micelas es dependiente del tipo de detergente7 para detergentes usados típicamente en la biouímica de la membrana, el n!mero de agregación &es decir, el n!mero de moléculas de detergente por micela' puede variar de * a para colato de sodio a apro$imadamente (08 para riton9 :; (88 &<'. )or otra parte, el tama-o de la micela y %6% dependen de la fuerza iónica y la temperatura de la solución de detergente. 6ientras ue la %6% de detergentes iónicos disminuye con el aumento de las concentraciones de sal, pero apenas se ve afectado por la temperatura, la %6% de los detergentes no iónicos es de sólo poco afectada por la presencia de sales, pero aumenta al aumentar la temperatura &='. 4tros factores ue influyen en el tama-o de la micela y la %6% son la presión, el p3 y la presencia de impurezas &<'. Point Cloud y separación de fases
l punto de enturbiamiento llamada puede ser alcanzado mediante el aumento de la concentración de detergente o cambiando la temperatura o la concentración de
sal de una solución micelar acuosa de detergente. La solución micelar entonces se convierte en turbia7 las micelas se convierten en inmiscible con agua y forman grandes agregados ue se separará de la fase de agua. La mayoría, pero no todas las particiones de detergente en la fase rica en detergente, ue a su vez contiene todavía una cantidad sustancial de agua. +ependiendo del detergente y las condiciones de tampón, la fase rica en detergente puede ser completamente transparente o turbia y se puede encontrar en la parte superior o por deba#o de la fase de detergente pobres. ste proceso se llama separación de fases o, a veces, la e$tracción de nubes de puntos. La separación de fases se produce debido a una diferencia de temperatura dependiente de la entropía entre el sistema de una sola fase y de dos fases. l efecto es similar a la precipitación de proteínas utilizando polietilenglicol &)>' o &23 0' * "4 0, donde no hay suficiente agua libre está disponible para mantener la proteína totalmente hidratado y, por tanto, soluble. +el mismo modo, las micelas de detergente agregarse y formar una fase separada en la ue menos agua cubre su superficie, y este comportamiento de agregación es influenciada por la temperatura, sales, y polímeros. Diagramas de fase
La ?igura ( muestra dos e#emplos simplificados de diagramas de fase de detergente en solución acuosa, ue muestra el comportamiento de fase de dos detergentes diferentes al aumento de la temperatura y / o concentración de detergente. odos los detergentes son monomérica en solución a ba#as concentraciones. La línea ue separa la solución de detergente monomérica de la solución de micelas representa la %6% ue por sí mismo es dependiente de la temperatura. )or encima de esta concentración, el detergente forma micelas de un tama-o definido. La frontera entre la solución micelar y la separación de fases en el diagrama de fase se llama ya sea límite superior o inferior consolución. n la ?igura (A, del punto de enturbiamiento del detergente se alcanza mediante el aumento de la temperatura de una solución de micela de concentración intermedia de cruzar el límite inferior consolución, mientras ue el punto de enturbiamiento del detergente en la ?igura (@ se alcanza por la disminución de la temperatura de una solución de micela del compuesto intermedio concentración de detergente para cruzar la frontera consolución superior.%omportamiento de fase como en la ?igura (A es típico de detergentes a base de )>, mientras ue un límite superior consolución como en la ?igura (@ se observa para muchos detergentes de ion híbrido y glicosídicos. %uando se alcanza el punto de enturbiamiento, el detergente se formará una fase separada, y la fase acuosa se agota de detergente. A muy alta concentración de detergente y ba#a temperatura &por lo general en concentraciones ue no son pertinentes a efectos biouímicos', una fase cristalina líuida formará ue contiene moléculas de detergente bien ordenadas. ?ases cristalinas líuidas se pueden clasificar en fases c!bicas, he$agonales, o laminares &'dependiendo de muchos factores ue no se discuten auí. s importante tener en cuenta ue la temperatura en función diagramas de fase de concentración puede cambiar drásticamente cuando se varía la fuerza iónica de la solución. )or lo tanto, el punto de enturbiamiento de una solución de micela se puede alcanzar mediante la adición de sal en lugar de cambiar la
temperatura. sto ha sido estudiado e$tensivamente para detergentes de la familia de riton&B'. 4tros aditivos como glicerol o urea afectan en gran medida el comportamiento de fase de un detergente, al igual ue la presencia de lípidos en micelas mi$tas &(8' y la adición de polímeros &véase la sección siguiente'.
Figura 1. (A) n diagrama de fase simplificada de un detergente con un l!mite inferior consolución. (Clic" para ampliar)
#l uso de separación de fases para purificar prote!nas de membrana
La separación de fases a base de detergente se desarrolló a partir de la separación de fases a base de polímero.%uando dos polímeros solubles en agua suficientemente diferentes &por e#emplo, de$trano y )>' se mezclan en solución a concentraciones elevadas, se forman dos fases acuosas inmiscibles. +iferentes proteínas se repartirá en las dos fases en función de sus propiedades físicas y las propiedades de los polímeros &(('. %uando se utilizan polímeros de diferentes cargas &por e#emplo, catiónico o derivados de )> aniónicos', una proteína puede ser desplazado de una fase a la otra simplemente cambiando el p3 desde arriba por deba#o de su punto isoeléctrico a ba#a fuerza iónica del sistema de tampón &(*' . Las variaciones de este método son sistemas de dos fases ue comprenden )> y sal &('. Los sistemas acuosos de dos fases se han adaptado a los procesos a escala industrial &(0', pero sólo se utiliza con poca frecuencia en aplicaciones de laboratorio. "istemas de dos fases acuosas a base de polímero se puede utilizar para proteínas de membrana solubilizada con detergente, donde las propiedades del detergente unido influirá en la partición de la proteína de membrana en cuestión. %omo esto implica dos polímeros, además de la proteína y el detergente, tales sistemas son difíciles de mane#ar, y la eliminación de polímeros para aplicaciones de aguas aba#o es un desafío adicional. )ero el sistema )>; de$trano en combinación con el detergente riton :;(88 ha sido utilizado con é$ito
para purificar Escherichia coli fosfolipasa membrana e$terna &(1' y Micrococcus lysodeikticus @11< citocromo &(<'. Los detergentes pueden eliminar gradualmente separada en la presencia de un solo polímero, reduciendo la comple#idad del sistema. n este caso, las propias micelas de detergente toman el papel del segundo polímero. sto funciona para muchos detergentes no iónicos en combinación con )> o de$trano y se ha utilizado en la purificación de proteína de membrana &(='. %uando se a-ade una etiueta hidrófobo para proteínas solubles de otro modo, pueden repartirse en la fase rica en detergente en tales sistemas &('. La separación de fases se puede realizar también en sistemas sin otros polímeros, a condición de ue el punto de enturbiamiento del detergente en cuestión está a una temperatura no es per#udicial para la estructura y función de las proteínas. "i este no es el caso, el punto de enturbiamiento puede ser modificado por la adición de sales o un cambio de p3, como se e$plica en las siguientes secciones para las diferentes clases de detergentes y ue se muestra en la ?igura *. La separación de fases de los detergentes es fácilmente ampliado y se aplica a procesos industriales &(B, *8, *('. $a familia de %ritón
)rotocolos más indicadas para la separación de fases se basan en detergentes de la familia. riton terc poli octilfenol ðyleneglycolether' n está disponible comercialmente ba#o diferentes marcas comerciales. Las ligeras diferencias entre los productos están en el tama-o medio de n y la distribución del tama-o del grupo de cabeza a base de )>.n riton :;(88, 2onidet9 );08 &2);08', y Cgepal9 %A; <8, n es B,<, B,8, y B,1, respectivamente &**'. La separación de fases clásico utilizado para proteínas de membrana se basa en el detergente riton :;((0 (n D =;' y fue desarrollado por @ordier en (B( &*'. ste detergente tiene un punto de enturbiamiento en alrededor de ** E % a concentraciones relevantes para el traba#o de proteína de la membrana, lo ue permite una fácil separación a temperatura ambiente, mientras ue sólo una fase está presente cuando las muestras se mantuvieron en hielo.6uchas proteínas de membrana diferentes se han e$traído y purificado usando el sistema de riton :; ((0 a partir de te#idos animales y vegetales, así como a partir de microorganismos &**'. )ara una me#or separación de las dos fases, un colchón de sacarosa
fases con proteínas de membrana. AdiciónG BF de &23 0' * "4 0 oG (
Ieen9 detergentes son ésteres de sorbitán de polio$ietileno de ácidos grasos ue se utilizan para la solubilización de proteínas de membrana porue son relativamente suaves detergentes ue rara vez interfieren con ensayos enzimáticos &<'. n cuanto a riton y otros detergentes no iónicos, los efectos de la sal sobre el n!mero de los detergentes Ieen %6% y la agregación son ba#os &*='. La separación de fases de una solución de *F de Ieen *8 o Ieen 8 puede ser iniciada mediante la adición de ( o de$trano &(='. Ieen 8 en combinación con dos polímeros comple#os se ha utilizado para purificar apolipoproteína A( humana y recombinante &*'. %on frecuencia, los detergentes Ieen sólo se utilizan para solubilizar proteínas ue son a continuación, utilizando el método de riton :;((0 descrito bien debido a sus propiedades muy similares de fases separadas. Ieen *8 y Ieen 8 pueden reemplazar riton :;(88 en los protocolos de separación de fases usando polímeros &*B'. Polio'ietilenglicol monoter Detergentes
6onoéteres de glicol de polio$ietileno están disponibles comercialmente en muchos diferentes longitudes de cadena, ya sea como sustancias puras o mezclas de una distribución de tama-o determinado. 5na lista de los detergentes disponibles )>;monoéter y sus puntos de enturbiamiento, %6%, y los n!meros de agregación se puede encontrar en varias revisiones de uímica físicos &8, ('. "e nombran % $ y de acuerdo a su longitud de cadena aluílica (x) y el número de unidades de glicol de polioxietileno en el grupo de cabeza &J'. %on frecuencia, estos detergentes son más conocidos por sus nombres comerciales &por e#emplo, @ri#9 1 para % (* * o mulgen (0= para
% (* *1'. l punto de turbidez de estos detergentes depende de la longitud de la cadena aluilo, así como del grupo de cabeza7 en longitud de cadena aluílica constante, el punto de la nube aumenta con el tama-o del grupo de cabeza &por e#emplo, de 1 E ; E % para % tres a B< E % para % '. Al mismo tiempo, el punto de turbidez disminuye con el aumento de tama-o de la cadena aluilo &por e#emplo, desde 0 E % para % 0 a 0 E % para % (* 0' &('. A pesar de esta amplia variabilidad de puntos de enturbiamiento ue debe permitir la separación de fases ba#o casi cualuier condición de tampón a temperatura ambiente, e$isten pocos protocolos para la purificación de proteínas de membrana utilizando )> separación de fases monoéter. Kecientemente, % )4, un % $ mezcla con x D *;B se ha utilizado en la purificación de una proteína de la membrana e$terna bacteriana. l componente principal de % )4 es % 0, cuya nube de puntos es 0 E %, pero la nube de puntos se modificó a la temperatura ambiente con la ayuda de *8F &23 0' * "4 0 &1'. 5na venta#a importante de % )4 sobre ritón :;((0 es su alta %6%, lo ue permite una fácil e$tracción de e$ceso de detergente por diálisis. % (8 0 muestra las mismas propiedades, favorables con la venta#a a-adida de ue la separación de fases se produce a temperatura ambiente ya en tampones con poca sal &*'. Al igual ue con los detergentes de la serie riton y Ieen, monoéteres de glicol de polio$ietileno se pueden utilizar en la separación de fases a base de polímero con de$trano o )>. 5n estudio detallado con la proteínas de la membrana bacteriorodopsina y colesterol o$idasa se hizo para los detergentes % (* 1, % (* y % (* * &es decir, @ri# 1' en combinación con 188 de$trano o )> 08888. Ambos polímeros cambió el puntos de enturbiamiento de los detergentes de tal manera ue la separación de fases se produ#o a temperatura ambiente, mientras ue sólo e$istía una fase a 0 E % &(='. +el mismo modo, polivinilpirrolidona se puede utilizar para inducir la separación de fases de detergentes a base de )> &'. Detergentes glicos!dicos
Los detergentes con grupos de cabeza glicosídicos se utilizan frecuentemente en la cristalografía de proteínas de membrana. Los detergentes más comunes de esta clase son aluilo beta;glucósidos y aluil ;maltosides, con longitudes de cadena de aluilo típicamente van desde a (0. )arece ue los detergentes glicosídicos tienen propiedades !nicas en comparación con detergentes ue tienen otros grupos de cabeza, ue los hace especialmente adecuados para la solubilización y estabilización de proteínas de la membrana7 la región de interfaz de micelas M;dodecilmaltósido &M;+6' proporciona un microambiente acuosa;liNe, ue no es el caso para otros detergentes &no;glicosídicos' &0'. n los sistemas de tampón ue contienen )>, los diagramas de fase de detergentes glicosídicos muestran un límite consolución superior y por lo tanto se someten a separación de fases a ba#a temperatura &1'&?igura (@'. sto puede ser e$plotado para la purificación de proteínas de membrana, utilizando )> &o de$trano' con M;
octilglucósido &M;4>', M;dodecil;maltósido &(=, <', o M;octylthioglu;coside &M; 4>' & =, '. +ependiendo de la relación de detergente y de lípidos, la separación de fases de M;4> puede ocurrir durante la solubilización de la membrana sin la adición de polímeros y se ha utilizado para purificar receptor nicotínico de acetilcolina &(8'. tros detergentes no iónicos
2, 2;dimetildodecilamina;2;ó$ido &++A47 también llamado 2, 2; laurildimetilamina;2;ó$ido o L+A4' ha sido utilizado con é$ito para purificar centros de reacción bacterianas a través de la separación de fases. n esta aplicación especial, se utilizó un cambio de p3 ,8 a un p3 O=,8 para iniciar la separación de fases. La fase rica en detergente tiene una densidad muy similar a la fase de agua en este sistema, lo ue resulta en una emulsión ue no se separa fácilmente tras la centrifugación &B'. La separación de fases es promovida por un aumento de la temperatura, pero es inhibida por adición de sal &08'. +igitonina, un detergente suave utilizado principalmente para la solubilización selectiva de proteínas de la membrana plasmática eucariotas &0(', se puede utilizar en los procedimientos de separación de fases. La separación de fases se lleva a cabo después de la adición de (F de )> <888 a 8 E % a digitonina solubilizadas en membranas &por e#emplo, de staphy;lococci' &0*'. 6uchas otras clases de detergentes no iónicos se utilizan en la biouímica de proteínas de membrana y cristalografía para los ue no e$iste información detallada sobre los diagramas de fase y los puntos de la nube. #emplos de tales detergentes son aluil;2;metilglucamidas &6>A; a 6>A;(8' &0' y <;4; &2; heptylcarbamoyl' ;methylglucosid &3%A6>', todos los cuales son fácilmente dializable y no desnaturalice las proteínas de membrana incluso a altas concentraciones. *&itteriónica Detergentes
6uchos diagramas de fase de detergentes zIitteriónicos muestran un límite superior consolución &00', similar a la de los detergentes glicosídicos &?igura (@'. "u punto de turbidez aumenta al aumentar el tama-o de la cadena de aluilo.+esafortunadamente, e$isten estudios físico;uímicas detalladas sólo en dimethylammonioethylsulfates de aluilo y aluil;sulfatos dimethylammoniopropyl ue se utilizan para la e$tracción de peue-os compuestos orgánicos hidrofóbicos y no para la proteína biouímica de la membrana &00, 01'. +imethylammoniopropylsulfonates aluilo &longitudes de cadena aluílica de entre (8 y (<, más conocido como detergentes sulfobetaína o PIittergents9' son detergentes suaves utilizados para la solubilización de proteínas de membrana &0<'. "us puntos de enturbiamiento se encuentran por
deba#o de 8 E %7 por lo tanto, su límite consolución superior no se puede cruzar para inducir la separación de fases por disminución de la temperatura a menos aditivos tampón traer la nube de puntos a la temperatura ambiente &00'. l detergente bipolar basado en colato ; Q&;colamidopropil' ;dimethylammnioR sulfonato l;propano &%3A)"' &0=' se utiliza con frecuencia para solubilizar proteínas de membrana7 "in embargo, no e$iste información sobre los diagramas de fase o puntos en la nube, mientras ue % ;lecithin está bien estudiado por su comportamiento de separación de fases, pero no se ha utilizado en la e$tracción de proteínas de la membrana &0'. Detergentes aniónicos
+odecil sulfato de sodio &"+"' se utiliza con frecuencia en aplicaciones de proteínas, pero por lo general desnaturaliza las proteínas. n cuanto a otros detergentes aniónicos, el comportamiento de la solución de "+" es fuertemente dependiente de la fuerza iónica del sistema tampón. l n!mero de agregación de "+" a más del doble de <* a (*, mientras ue su %6% se reduce (< veces a partir de ,( a 8,1 mm cuando la concentración de 2a%l se incrementa desde 8 hasta 188 m6 a partir de *1 E % &0B'. )ara inducir la separación de fases "+", 2a%l 8,0;8,1 6 se a-ade a la mezcla de proteínas "+" &18, 1('. 4bviamente, la mayoría de las proteínas se desnaturalizan cuando se e$pone a altas concentraciones de "+", pero es concebible ue las proteínas de membrana e$tremadamente estables &por e#emplo, algunas proteínas de membrana e$terna bacterianas' pueden purificarse usando "+". l detergentes colato y deso$icolato aniónico parecen estabilizar proteínas de membrana muy bien, pero se precipitan después de la adición de sales y por tanto no puede ser utilizado para la separación de fases &B'. Catiónico Detergentes
Los detergentes catiónicos desnaturalizan mayoría de las proteínas, al igual ue lo hace "+" &1*'. "in embargo, bromuro de dodeciltrimetilamonio &+A@ o % (* A@' ha sido utilizado con é$ito para aislar la rodopsina intacto de retina bovina &1'. )or lo tanto, también detergentes catiónicos podrían utilizarse en los procedimientos de separación de fases para el aislamiento de proteínas de membrana. %loruro de tricaprililmetilamonio &Aliuat9;<' en combinación con 2a * "4 0 permite concentrar las to$inas peptídicas de muestras de agua a través de la separación de fases &10'. Harios protocolos de separación de fases utilizan mezclas de catiónico con detergentes no iónicos. La adición de peue-as cantidades de +A@ induce la separación de fases de L+A4 en la purificación de centros de reacción bacterianas &B'. Las mezclas de % (8 0 con % (8 A@ me#orar la purificación basada en la separación de fase de glucosa deshidrogenasa;<;fosfato &11'.
$as me+clas de detergentes
n algunos casos, puede ser favorable para mezclar diferentes detergentes para modificar las propiedades de separación de fases de un tampón detergente. Las mezclas de no iónicos con detergentes catiónicos se han utilizado con é$ito para purificar proteínas de la membrana &véase la sección titulada catiónico +etergentes', y mezclas de % (8 0 y plomo 4> a propiedades me#oradas de separación de fases en la purificación de centros de reacción bacterianas en comparación con los detergentes individuales & 1<'. 5na mezcla de riton :;((0 y el detergente zIitteriónico "@;(8 asegura la solubilización completa y el enriuecimiento de las proteínas de membrana a través de la separación de fases para los estudios de proteómica, mientras ue cada !nico detergente no &'. 6uchos detergentes están disponibles comercialmente como mezclas de diferentes longitudes de cadena aluilo o grupo de cabeza, lo ue los hace barato y por lo tanto aplicable a los procesos a gran escala Qpor e#emplo, riton &1=', Angrimul9 &1', o Lorol9 &*('R. "i el uso de una mezcla de detergentes es aceptable para la purificación de una proteína de membrana dependerá principalmente de las aplicaciones posteriores7 en la cristalografía de proteínas de membrana, donde la pureza del detergente influye en la calidad del cristal, este será sin duda un problema. $a eliminación del detergente
Las proteínas de membrana partición en la fase detergente ricos durante la separación de fases. Las altas concentraciones de detergente en esta fase pueden ser per#udiciales para la proteína, y la viscosidad de la fase plantea problemas técnicos para la manipulación de líuidos &por e#emplo, por pipeteado de vol!menes precisos'. l cobro de la fase rica en detergente y diluyéndolo es la forma más simple de volver a establecer una solución micelar de una fase. La diálisis contra un tampón con una concentración de detergente definido sólo funcionará para detergentes con un alto %6%, pero tiene la venta#a de conservar la alta concentración de proteínas de la fase rica en detergente. La filtración en gel se puede utilizar para el intercambio de tampón &1B', como puede otros métodos de cromatografía tales como intercambio iónico o cromatografía de afinidad. Alternativamente, los detergentes se pueden unir específicamente y eliminan, ya sea utilizando resinas de poliestireno hidrófobas &@io;@eads9, %albiosorb S, o Amberlite :A+*, entre otros' &<8' o ciclode$trinas. Las ciclode$trinas se unen a monómeros detergentes. "e pueden a-adir a la solución y se eliminan por diálisis #unto con detergente límite, ya ue son más peue-as ue las micelas de detergentes no dializable &<('. Las ciclode$trinas también pueden ser acoplados a resinas de cromatografía para la eliminación del detergente &<*'. %are tiene ue ser tomado debido a ue las proteínas de la membrana precipitarán si la concentración de detergente se reduce a por deba#o de la %6%.
Cómo adaptar el protocolo a sus necesidades
l punto de partida para el desarrollo de un procedimiento de separación de fases es un tampón detergente cuyos componentes están determinadas por la proteína de la membrana a purificar, como la mayoría de las proteínas de membrana solubilizadas son estables sólo en ciertos detergentes &<, <0'. ste tampón se ensayó entonces por sus propiedades de separación de fases. n los casos más simples, la separación de fases se produce tras un aumento o disminución de la temperatura &véase la abla ( y la ?igura ('. %on frecuencia, la separación de fases puede ser iniciada mediante la adición de altas concentraciones de &23 0' * "4 0 u otras sales. +el mismo modo, la mayoría de los detergentes serán sometidos a la separación de fases tras la adición de )>, de$tranos, u otros polímeros de alto peso molecular. La estabilidad de la proteína de membrana en presencia de altas concentraciones de sal o de polímero tiene ue ser probado. )or otra parte, la atención tiene ue ser tomado ue la proteína no se desnaturaliza cuando se e$ponen a las altas concentraciones de detergente ue se producen durante la separación de fases. )ero si se cumplen estas condiciones, las condiciones de separación de fases se pueden encontrar para la mayoría de los casos, a pesar de diagramas de fases no están disponibles para muchos detergentes especiales. Cnformación sobre las condiciones de separación de fases también se puede obtener a partir de ensayos de cristalización de proteínas de membrana, ya ue muchas proteínas de membrana se cristalizan a partir de soluciones de detergente en condiciones cercanas a la del punto de enturbiamiento del detergente &<1, <<, <='. 5n simple titulación de la memoria intermedia de detergente de elección con sales o polímeros suele ser suficiente para establecer un protocolo !til. La separación de fases se puede observar a simple vista, por mediciones de turbidez en un espectrofotómetro, o por dispersión de luz estática &<'. 5n análisis más detallado de las propiedades y la cinética de separación de fases se puede obtener utilizando la transmisión combinada y las mediciones de dispersión de luz estática &
es el uso de polímeros ue contienen grupos uelantes de metales capaces de unirse etiuetas de polihistidina. 6arcada con 3is proteínas de membrana pueden entonces repartirse en la fase de polímero &en lugar de la fase rica en detergente', lo ue permite una separación de etiuetado de proteínas de la membrana sin etiuetar y la protección de la proteína etiuetada por el contacto con concentraciones de detergente e$tremas &=('. ste método también puede utilizarse para purificar las vesículas de membrana ue contienen proteína 3istagged &=*'.
