Analisis Protein Protein Jupiter Eresta Jaya/Teknik Kimia/1206230183
Abstrak Dalam menganalisis protein, ada berbagai macam cara yang dapat dilakukan tergantung dari jenis analisis yang dilakukan dan tujuan dari analisis tersebut. Secara umum terdapat dua macam analisis untuk mendeteksi protein yaitu analisis secara kualitatif dan analisis secara kuantitatif. Serta analisis yang dapat juga dibagi berdasarkan fungsi dari analisis tersebut seperti analisis struktur dan jenis protein. Pada lembar tugas mandiri ini akan dibahasasberbagai macam jenis cara untuk mendeteksi kandungan protein dalam suatu sampel beserta prinsip kerja dari metode tersebut. Kata Kunci: kristalogafi sinar-x, spektroskopi nmr, septroskopi cd, elektroforesis, tes xantorprotein, tes Hopkins-cole, tes millon, tes biuret, tes nitroprusid, tes sakaguchi, pereaksi ninhidrin, metode Sullivan, metode kjehdahl, metode biuret.sequencing protein, metode lowrly, titrasi formol.
A. Metode Kuantitatif
1. Analisis Struktur Protein 1.1. Metode Kristalografi Kristalograf i Sinar-X Struktur protein tiga dimensi penting untuk diketahui sebab dapat merepresentasikan aktivitas, fungsi, stabilitas, maupun paramater fisika-kimia lainnya. Metode penentuan struktur tiga dimensi protein yang luas digunakan saat ini adalah kristalografi sinar-X ( X-ray ( X-ray crystallography ). ). Kristalografi sinar-X menggunakan pancaran sinar-X yang ditembakkan mengenai suatu protein yang telah dimurnikan atau memiliki kemurnian tinggi sehingga berbentuk kristal. Pancaran gelombang sinar-X yang mengenai struktur kristal protein kemudian akan terhambur. Hamburan sinar-X yang muncul kemudian dibaca dan struktur kristal protein dapat diketahui. 1.2. Metode Spektroskopi NMR Pada Protein, tidak semua protein dapat dikristalisasi. Sebaga contoh, membrane protein yang memiliki banyak asam amino hidrofobik akan sulit untuk mengkristalisasi. Teknik lain untuk melakukan analisis protein dalam larutan tanpa kristalisasi adalah nuclear magnetic resonance (NMR). NMR bekerja berdasarkan prinsip jika nuclei dari beberapa elemen atom. Seperti hydrogen, akan beresonansi saat sebuah molekul, seperti protein, ditempatkan pada medan magnet kuat. NMR mengukur perubahan kimia pada nuclei atom pada protein, yang tbergantung pada atom di sekitarnya dan jarak dengan atom di sekitarnya . NMR akan mnghasilkan data berupa kemungkinan struktur yang terjadi, bukan sebuah struktur. Untuk protein kecil, NMR dapat secara akurat memprediksi strukturnya secara tiga dimensi. 1.3. Metode Spektroskopi CD Spektroskopi Circular Dichroism (CD) mengukur perbedaan antara penyerapan cahaya yang terpolarisasi tangan kiri versus cahaya terpolarisasi takan kanan yang muncul akibat struktur yang asimentri. Tidak adanya struktur regular akan menunjukan intensitas CD yang bernilai no, sementari struktur yang berurutan dalam spectrum dapat menunjukan nilai intensitas CD yang berupa positif atau negative. Spektrum CD dari protein pada daerah spektrum “near -UV” (250-350 nm) akan sensitive pada beberapa aspek struktur tersier. Pada panjang gelombang sebesar ini, chromophores-nya chromophores -nya adalah asam amino aromatic dan ikatan disulfide, dan sinyal CD yang dihasilkan akan sensitive pada struktur tersier protein secara keseluruhan. SInyal
pada daerha spectrum dari 250-270 nm akan cocok dengan residu phnylalanine, sinyal pada daerah 270-290 nm akan menunjukan tirosin, 280-300 akan cocok dengan atribut tryptophan.\ 2. Pewarnaan 2.1.
Metode Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet. 2.2. Metode Lowry Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropoly molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Berawal dari pemanfaatan alat spektrofotometer yaitu untuk mengukur jumlah penyerapan zat suatu senyawa. Penyerapan cahaya pada senyawa larutan tersebut, dalam spektrofotometri dapat digunakan sebagai dasar atau pedoman dalam penentuan konsentrasi larutan atau senyawa secara kuantitatif. Dalam pratikum ini penggunaan KMnO 4 bertujuan untuk memudahkan dalam pengenalan dan latihan awal spektrofotometri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret (Sudarmaji, 1996).
3. Analisis Berat Molekul Protein 3.1. Metode Elektroforesis Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Westermeier, 2004). Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Seperti halnya dengan elektroforesis DNA, elektroforesis protein memungkinkan kita untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dan memperlihatkan hasilnya. Akan tetapi protein jauh lebih beragam dalam ukuran dan strukturnya, karena itu tekniknya jauh lebih rumit Beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan komponen pada elektroforesis protein Densitas muatan molekul – berbeda diantara pH media dan pl molekul. Pengaruh buffer pH – akan mempengaruhi densitas muatan protein dan akibatnya mempengaruhi tingkat dan arah pergerakannya Kekuatan ionik – mempengaruhi tingkat pemisahan Komposisi – bisa berinteraksi dengan protein menyebabkan perubahan dalam densitas muatan sebagai contoh ion borak dan glikoprotein
Bentuk dan ukuran molekul Media pendukung Restriksi pada mobilitas Pengaruh difusi Elektroendosmosis Mikro-heterogenitas molekuler spesies
4. Titrasi Asam Amino 4.1. Metode Kjehdahl Analisis protein dalam bahan pangan dapat dilakukan dengan dua metode yaitu metode kuantitatif dan kualitatif. Kadar protein yang ditentukan berdasarkan cara Kjeldahl disebut sebagai kadar protein kasar (crude protein) karena terikut senyawaan N bukan protein. Prinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan komponen organic dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. Hasil destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali dan melalui destilasi. Destilat ditampung dalam larutan asam borat. Selanjutnya ion- ion borat yang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl. Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah banyak mengalami modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek. Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25, diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95, 5,71, dan 5,83. Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen.
4.2.
Metode Titrasi Formol
Pada metode ini, larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik
B. Metode Kualitatif
5. Analisis Asam Amino (pembentukan warna protein) 5.1. Tes Xantoprotein Pereaksi xantoprotein adalah larutan asam nitrat pekat. Jika larutan HNO 3 pekat dimasukkan ke dalam larutan protein secara hati-hati, akan terbentuk endapan putih, dan berubah menjadi kuning jika dipanaskan. Gejala ini akibat nitrasi pada inti benzena yang terdapat dalam protein.
Gambar 4.1. Fenilalanin Pereaksi xantoprotein positif terhadap protein yang mengandung asam amino dengan gugus samping fenil, seperti asam amino tirosin, fenilalanin, dan triptofan. 5.2.
Tes Hopkins-Cole
Pereaksi Hopkins-cole dibuat dari asam oksalat dan serbuk magnesium dalam air. Pereaksi ini positif terhadap protein yang mengandung asam amino dengan gugus samping indol, seperti pada asam amino triptofan.
Gambar 4.2. Triptofan
Triptofan memberikan hasil yang positif dengan tes Hopkins-cole karena mengandung gugus indol. Dalam pereaksi ini, asam oksalat direduksi menjadi asam glioksilat dengan bantuan katalis serbuk magnesium Asam glioksilat yang terbentuk mengkondensasi asam amino triftofan membentuk senyawa berwarna. Setelah H2SO4 pekat dituangkan, akan terbentuk dua lapisan dan beberapa saat kemudian terbentuk cincin ungu di antara batas kedua lapisan itu. 5.3.
Tes Millon
Pereaksi Millon adalah campuran larutan raksa (I) nitrat dan raksa (II) nitrat dalam asam nitrat. Jika pereaksi Millon ditambahkan ke dalam larutan protein, akan dihasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah akibat pemanasan.
Gambar 4.3. Tirosin Tirosin memberikan hasil yang positif dengan tes Millon karena mengandung gugus fenol. Pereaksi ini positif untuk protein yang mengandung asam amino dengan gugus samping senyawa fenol sebab terjadi reaksi antara senyawa raksa (II) dengan gugus hidroksifenil membentuk senyawa berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan hasil positif. 5.4.
Tes Biuret
Larutan protein memberikan hasil yang positif terhadap pereaksi biuret. Tes Biuret dilakukan dengan cara menuangkan larutan natrium hidroksida pekat ke dalam larutan protein. Kemudian, larutan CuSO4 ditambahkan setetes demi setetes yang akan terbentuk warna ungu.
Gambar 4.4. Larutan protein memberikan hasil yang positif terhadap pereaksi biuret dengan terbentuknya warna ungu. 5.5.
Tes Nitroprusida
Natrium nitroprusida dalam larutan amonia akan menghasilkan warna merah dengan protein yang mempunyai gugus –SH bebas (merkapto). Jadi, protein yang mengandung sistein akan memberikan hasil positif. Gugus –S –S – pada sistein apabila direduksi terlebih dahulu dapat juga memberikan hasil positif.
Gambar 4.5. Nitroprusida 5.6.
Tes Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan adalah naftol dan natrium hipobromit. Pada dasarnya reaksi ini akan memberikan hasil positif jika terdapat gugus guanidin seperti arginin memberikan warna merah.
5.7.
Pereaksi Ninhidrin
Pereaksi ninhidrin merupakan oksidator lemah, asam amino dapat bereaksi dengan ninhidrin sebagai berikut.
Gambar 4.6. reaksi tes ninhidrin 5.8.
Reaksi Sullivan
Dalam larutan basa, larutan protein yang struktur kimianya memliki residu sistein dengan preaksi Sullivan (natrium 1,2-naftokuinon-4sulfonat dan natrium hidrosulfit) dapat menbentuk larutan berwarna merah. Intensitas warna yang terbentuk bergantung pada jumlah resude sistein yang terdapat pada protein tersebut. Selain dengan pereaksi Sullivan, warna merah protein ini juga dapat terjadi jika protein tersebut ditambahkan dengan larutan natrium nitroprusid dalam amonica encer. 6. Pengurutan Asam Amino 6.1.
Sequencing Protein
Terdapat dua cara langsung dalam melakukan sequencing protein yaitu spektroskopi massa dan reaksi degradasi edman. Namun, banyak juga cara lain yang dapat dilakukan untuk mendapat informasi terbatas mengenai urutan protein dan dapat digunakan sebagai pendahuluan untuk metode di atas untuk menaklukan kekurangan metode di atas. Dalam melakukan sequencing, biasannya dilakukan pencarian mengenai urutan asam amino sebagai komposisi protein terlebih dahulu. Metode umum yang biasa digunakan untuk mengetahui frekuensi asam amino adalah sebagai berikut: I.
II.
III.
Menghidrolisi protein menjadi asam amino konstituen Hidrolisis dilakukan dengan memanaskan sampel protein pada asam hidroklori sampai suhu 100 –110°C selama 24 jam atau lebih Pemisahan asam amino The amino acids can be separated by ion-exchange chromatography or hydrophobic interaction chromatography. Asam amino dapat dipisahkan dengan ion-exchange chromatography atau hydrophobic interaction chromatography . Analisis secara kuantitatif Setelah asam amino dipisahkan, kuantitasnya dapat ditentukan dengan menambahkan reagen yang akan membentuk warna jika ditambahkan. Jika jumlah dari asam amino lebih besar dari 10nmol, ninhydrin dapat digunakan; ini akan menghasilkan warna kuning saat bereaksi dengan proline, dan ungu jika bereaksi dengan asam amino asam lainnya. Konsentrasi asam amino adalah proporsional dengan absorbansi hasil reaksi pewarnaan.
7. Reaksi Pengendapan untuk Protein
Denaturasi dengan panas dan pH ekstrim Pembentukan endapan dengan logam berat (antara lain: HgCl 2, AgNO3)
O H R C
C O
O _
+ AgNO3
NH3+ protein
H R C
C O Ag + HNO 3
NH2 perak proteinat
Pembentukan endapan dengan reagen bersifat asam (antara lain: asam fosfotungstat, asam pikrat)
O R
H C
C O
O _
+
+ H - pikrat
NH 3+
R +
C OH + H+
NH 2
pikrat
protein pikrat
protein
H C
Endapan dengan ferrosianida Endapan dengan alkohol
Kesimpulan Terdapat berbagai macam metode untuk mendeteksi protein. Dalam penelitian, metode yang digunakan bergantung dari tujuan dari pendeteksian tersebut. Pendeteksian dapat bertujuan untuk mengetahui kadar, menentukan jenis protein, dan juga pengurutan protein
Daftar Pustaka
http://www.learner.org/courses/biology/textbook/proteo/proteo_3.html (diakses 18 maret 2014) http://skp.unair.ac.id/repository/Guru 18 maret 2014)
(Indonesia/ReaksiAnalisaProte_NurdinAchmad_57.pdf (diakses
Sumardjo, Damin. 2006. Pengantar Kimia Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran. Pengantar Kimia Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran. Jakarta: Penerbit Buku Kedokter EGC
