Deteksi Mutasi Gen EGFR Menggunakan PNA-LNA PCR Clamp Pada

DETEKSI MUTASI GEN EPIDERMAL GROWTH GROWTH FACTOR RECEPTO RECEPTOR R (EGFR) MENGGUNAKAN METODE PNA-LNA PCR CLAM P PADA CELL CELL LI NE PC9 PC9 , PC3, H1975 DAN H 1299 1299 1 2 3 Ferry Dwi Kurniawan , Toshihiro Nukiwa , Koichi Hagiwara 1 Department of Pulmonology Pulmonolog y and Respiratory Medicine, Faculty of Medicine, Medicin e, University of Indonesia, Persahabatan Hospital, Jakarta, Indonesia 2 Department of Respiratory Oncology and Molecular Medicine, Tohoku University, Sendai, Japan 3 Department of Respiratory Medicine, Saitama Medical School, Saitama, Japan

Growth Factor Receptor (EGFR) signaling pathway play a role in regulation of cell Background: Epidermal Growth proliferation, survival, differentiation and tumor progression. Tyrosin kinase domain within exon 18 -21 of EGFR gene mutation had significantly significantly correlated co rrelated with clinical response to Tyrosine Kinase Inhibitor (TKI). Thus, EGFR gene mutation become a biomarker predictor to Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) treatment. However, the gold standar in detecting EGFR gene mutation is direct sequencing method which which requires req uires mostly cancer cells, low sensitivity and non uniform unifo rm technical handling. This research aim is to observe PNA-LNA PCR Clamp method as an alternative method to detect EGFR gene mutation on PC9, PC3, H1975, and H1299 cell lines. This research design is an experimental study using four cell lines which are PC9 (lung adenocarsinoma), This M ethod: PC3 (prostate adenocarsinoma), H1975 (NSCLC), (NSCLC), and H1299 (NSCLC). The samples are isolated to extract DNA then the consentration adjusted to 25 ng thus the final consentration is 1 ng/µl. The The PCR PCR primer within exon 18 to 21 along with Peptide Nucleic Acid (PNA) which designed to attach to wild type alleles and Locked Nucleic Acid (LNA) designed to attach with mutant alleles and also exTaq enzyme are added to the samples. Then the samples are running on SmartCycler real time PCR. The method could detect EGFR gene mutations which are G719S and G719C in exon 18, seven types of exon 19 deletion, T790M in exon 20, also L858R and L861Q in exon 21. This method reveals the mutations which are E746-A750del-1p (type 1) in PC9, exon 19 deletion in PC3, This Result: T790M and L858R in H1975 while no mutation in H1299. Conclusion: The PNA-LNA PCR Clamp could detect EGFR gene mutation on PC9, PC3, H1975 and H1299 cell lines. epidermal growth factor receptor mutation; epidermal mutation; peptide nucleic acid; locked nucleic acid; polymerase chain Key word: reaction

sebelumnya, KPKBSK dianggap satu entitas penyakit

PENDAHULUAN

saja karena klasifikasi histologi sub tipe seperti Walau

telah

banyak

perkembangan

bermakna dalam terapi sistemik, sistemik, radiasi onkologi serta teknik

pembedahan

namun

pasien kanker

masih belum sepenuhnya dapat diobati.1 Berdasarkan laporan Direktorat Jenderal Pelayanan Medik tahun 2004, kanker paru menempati peringkat keenam diantara sepuluh penyakit neoplasma ganas terbanyak pasien rawat inap di rumah sakit di Indonesia dengan jumlah penderita 2.757 orang atau dengan proporsi 3,2%. Angka ini meningkat menjadi 5,8% pada tahun 2005.2

adenokarsinoma, skuamosa dan sel besar terlihat mempunyai faktor etiologi yang sama, karakteristik klinis yang sama serta hasil terapi yang juga sama. Sehingga penatalaksanaan untuk pasien KPKBSK juga sama. Namun ternyata KPKBSK KPKBSK merupakan suatu entitas penyakit yang kompleks. Hal ini dapat dilihat dari profil genetik yang ditemukan pada KPKBSK.

Salah

satu

yang

berperan

dalam

patogenesis ini adalah mutasi gen Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). 4

Gen EGFR berperan dalam patogenesis Secara umum kanker paru terdiri dari

Kanker Paru Karsinoma Sel Kecil (KPKSK) sebanyak 10% dan Kanker Paru Karsinoma Bukan Sel Kecil (KPKBSK)

sebanyak seban yak 90%.3 Jauh

adenokarsinoma paru yang berawal dari lesi pre neoplastik

yang

disebut

sebagai

hiperplasia

adenomatosa atipikal yang kemudian berkembang

__________________________________________ _________________________ __________________________________ _______________________________________ ______________________________ ________ 1 Departemen Pulmonologi & Ilmu Kedokteran Respirasi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia

RS Persahabatan Persahab atan - Jakarta, 2012

menjadi

bronchioloalveolar

carcinoma (BAC).

biopsi bronkus ataupun

sediaan sitologi berupa

Fokus invasi berkembang dari pusat fibrotik BAC

sikatan bronkus, bilasan bronkus, ataupun efusi

yang kemudian berubah menjadi adenokarsinoma

pleura sangatlah sedikit. Terlebih lagi sediaan berupa

invasif walaupun elemen non invasif masih berada di

biopsi bronkus jugalah tidak mudah didapat namun

perbatasan

sediaan sitologi lebih sering didapatkan.

tumor.

Pada

beberapa

penelitian

Sebagai

ditemukan mutasi gen EGFR sudah terjadi pada awal

dasar diagnosis, sediaan baik histopatologi ataupun

patogenesis dengan ditemukan mutasi ini pada epitel

sitologi akan disimpan sebagai arsip sehingga sampel

saluran napas normal yang berdekatan dengan tumor.

yang tersisa untuk pemeriksaan mutasi gen pun

Walaupun demikian, mutasi gen EGFR tetap lebih

semakin sedikit.9

banyak ditemukan di lesi pre neoplastik dan lesi pre invasif

dibandingkan

dengan

epitel

normal.

Standar baku emas pemeriksaan mutasi gen EGFR

adalah

menggunakan

metode

direct

Heterogenitas mutasi pada tumor sangat kecil sehigga

sequencing . Metode ini telah lama digunakan secara

mutasi

dalam

luas serta mempunyai spesifisitas hingga 100%

patogenesis tumor. Sementara itu amplifikasi gen

namun sensitifitas metode ini hanya 30 -50%. Metode

EGFR ternyata terjadi pada fase akhir karsinogenesis

ini membutuhkan sampel dengan kandungan sel

dan lebih sering ditemukan pada saat metastasis yang

kanker yang banyak dengan pengerjaan sekitar 3-5

mencerminkan amplifikasi gen EGFR lebih berperan

hari dengan teknik bervariasi dan biaya yang

pada fenotip metastasis. Sementara itu epiregulin

mahal.9,10

gen

EGFR

berkontribusi

besar

loop terjadi pada fase tumor invasif namun lebih

Salah satu metode alternatif pemeriksaan

sering juga ditemukan pada saat metastasis. Sehingga

mutasi gen EGFR adalah metode PNA-LNA PCR

dapat disimpulkan mutasi gen EGFR telah berperan

Clamp yang menggunakan Peptide Nucleic Acid

sejak awal karsinogenesis.5

(PNA) sebagai klem primer yang menghambat

Dengan ditemukannya agen terapi target

amplifikasi alel wild type dan Locked Nucleic Acid

yang bekerja menghambat jalur sinyal EGFR yaitu

(LNA) sebagai probe deteksi alel mutan yang akan

Tyrosin Kinase Inhibitor (TKI) maka telah terjadi

diamplifikasi

pergeseran

terapi

Polymerase Chain Reaction (real time PCR). Klem

konvensional tidak hanya sel kanker tetapi juga sel

primer dan probe mutan terletak pada urutan basa

normal sehingga dengan pemberian terapi target

yang mengalami mutasi poin yang dilambangkan

maka hanya sel kanker saja yang akan menjadi

dengan huruf (X). Probe total mendeteksi fragmen

sasaran.6 Mutasi gen EGFR dengan domain tirosin

alel mutan dan alel wild type yang terletak

kinase pada ekson 18-21 berkorelasi secara bermakna

bersebelahan. Sedangkan pada delesi, hanya sebagian

paradigma

terapi.

7,8

terhadap pemberian TKI.

Sasaran

Sehingga mutasi gen

menggunakan

mesin

r eal

time

klem primer yang menutupi delesi. Urutan pada

EGFR berperan sebagai faktor prediktif pemberian

kedua

ujung

delesi

dihubungkan

sehingga

TKI.9

membentuk urutan probe mutan. Posisi primer dan Kendala dalam praktek sehari-hari adalah

posisi probe dalam sistem PNA-LNA PCR Clamp

sampel yang didapat untuk menegakkan diagnosis

ditampilkan dalam gambar 1 (a). Selanjutnya proses

kanker paru baik itu sediaan histopatologi berupa

amplifikasi menggunakan sistem nested PCR yang

_________________________________________________________________________________________ 2 Departemen Pulmonologi & Ilmu Kedokteran Respirasi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia

RS Persahabatan - Jakarta, 2012

membutuhkan primer luar dan primer dalam. Ketika terjadi

proses

amplifikasi,

klem

primer

akan

berikatan dengan alel wild type sehingga tidak terjadi amplifikasi alel wild type. Ketika proses deteksi terjadi, probe mutan berikatan dengan alel mutan dan terjadi proses amplifikasi kemudian sinyal yang dipancarkan dari probe akan ditangkap oleh mesin real time PCR. Mekanisme kerja sistem PNA-LNA PCR Clamp ditampilkan dalam gambar 1 (b).11

Rumusan masalah :

Apakah metode PNA-LNA PCR Clamp dapat mendeteksi mutasi gen EGFR pada cell line PC9, PC3, H1975, dan H1299?

Hipotesis Penelitian :

Metode PNA-LNA

PCR

Clamp

dapat

mendeteksi mutasi gen EGFR pada cell line PC9, PC3, H1975, dan H1299.

Tujuan Penelitian : Tujuan Umum :

Melihat metode PNA-LNA PCR Clamp sebagai

Gambar 1. Posisi primer dan probe (a) dan mekanisme kerja (b) dalam metode PNA-LNA PCR Clamp. Dikutip dari (11)

metode alternatif pemeriksaan mutasi gen EGFR pada cell line PC9 , PC3, H1975, dan H1299.

METODOLOGI PENELITIAN

Desain penelitian yang digunakan adalah Tujuan Khusus :

studi

eksperimental.

Penelitian

dilakukan

di

Mempelajari cara kerja metode PNA-LNA

Respiratory Medicine Department, Saitama Medical

PCR Clamp.

School pada bulan Februari 2010. Populasi target

Mengetahui keunggulan dan kekurangan

penelitian adalah cell line tumor. Populasi terjangkau

metode PNA-LNA PCR Clamp.

penelitian ini adalah cell line tumor paru dengan jenis adenokarsinoma atau Kanker Paru Karsinoma Bukan Sel Kecil (KPKBSK) dan tumor selain tumor paru dengan jenis adenokarsinoma. Sampel penelitian adalah cell line PC9 (adenokarcinoma), PC3 (kanker

prostat

jenis

adenokarsinoma), H1975 (KPKBSK), dan H1299 _________________________________________________________________________________________ 3 Departemen Pulmonologi & Ilmu Kedokteran Respirasi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia


(KPKBSK). Cell line PC9 diperoleh dari IBL

detik lalu sebanyak 45 siklus dengan suhu 950C

(Takasaki, Japan), PC3 diperoleh dari Japanese

selama 3 detik lalu 620C (ekson 18; R1), 560C (ekson

Collection of Research Bioresources (Tokyo, Japan),

19 & 21; R2, R4, R5, PCR Check) , 580C (ekson 20;

H1975 diperoleh dari the American Type Culture

R6) selama 30 detik.

Collection (Rockville, MD, USA), dan H1299

Analisis hasil

diperoleh dari Japanese Collection of Research

Analisis hasil menggunakan piranti lunak

Bioresources (Tokyo, Japan). Cell line dibiakkan

SmartCycler II . Sebelum menentukan hasil, perlu

dalam media RPMI-1640 yang mengandung 10%

dilakukan dahulu kontrol kualitas yang menggunakan

fetal calf serum di dalam inkubator dengan suhu 370C

Probe total untuk ekson 21 pada reaksi PCR Check .

dengan kandungan CO2 sebesar 5% di atmosfer.

Apabila Probe total berpendar maka hal ini

Cara Kerja

menandakan bahwa sampel yang diperiksa adekuat

Sampel cell line dikumpulkan lalu dilakukan

dan layak untuk dianalisis lebih lanjut. Selanjutnya

isolasi DNA. Setelah itu dilakukan pemeriksaan

dilihat bila Probe total masing-masing ekson

kadar DNA dengan spektrofotometer dan konsentrasi

berpendar maka h al ini menandakan terdapat mutasi

yang dibutuhkan adalah 25 ng sehingga konsentrasi

atau delesi pada ekson tersebut. Kemudian untuk

akhir adalah 1 ng/µl.

mengetahui jenis mutasi yang terjadi di ekson

Reagen dan Premix

tersebut dilihat probe florogenik apa yang berpendar.

Reaksi ini membutuhkan dua campuran yaitu Premix A dan Premix B . Premix A merupakan

Gambar 2 menampilkan alur metode PNA-LNA PCR Clamp.

campuran isolat DNA dan enzim ExTaq, Takara. Sedangkan Premix B merupakan campuran primer luar dan dalam, Nihon Gene Research Lab (masingmasing 200nM), LNA sebagai probe florogenik, IDT Lab (masing-masing 100nM), dan PNA sebagai klem

primer, Panagene (masing-masing 5mM). Kemudian Premix A dibagi ke dalam 6 tabung reaksi dan

selanjutnya Premix B ditambahkan sesuai dengan jenis reaksi. Reaksi PCR yang dijalankan terdiri dari

Gambar 2. Alur penelitian deteksi mutasi gen EGFR menggunakan PNA-LNA PCR Clamp .

6 jenis reaksi yaitu R1 (ekson 18: G719C; G719S ), R2 (ekson 19: E746-A750del tipe 1; E746-A750del tipe 2; L747-A750del T751S ), R4 (ekson 21: L858R), R5 (ekson 21: L861Q), R6 (ekson 20: T790M ) dan PCR Check sebagai kontrol kualitas sampel. Reaksi PCR

Reaksi PCR dijalankan secara real time menggunakan mesin SmartCycler II, Cepheid . Siklus

HASIL PENELITIAN

Dengan metode ini dideteksi mutasi gen EGFR yaitu delesi ekson 19 E746-A750del tipe 1 pada PC9, delesi ekson 19 pada PC3, mutasi T790M dan L858R pada H1975 dan tidak ditemukan mutasi pada H1299. Tabel 1 menampilkan ringkasan pendaran probe total dan probe mutan semua sampel.

PCR yaitu dipertahankan pada suhu 950C selama 30 _________________________________________________________________________________________ 4 Departemen Pulmonologi & Ilmu Kedokteran Respirasi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia


juga akan lebih sering ditemukan pada cell line. Di Tabel 1. Ringkasan hasil pemeriksaan. Sampel

PC9

PC3

H1975

H1299

PCR Check (siklus) Cy5

25,7

27

Probe total (siklus); Reaksi Cy5

Probe mutan (siklus); Reaksi; Pewarna

24,3; Reaksi 2

25,12; Reaksi 2; FAM

29; Reaksi 2

-

28,7; Reaksi 6 29; Reaksi 4

29,3; Reaksi 6; FAM 28,5; Reaksi 4; FAM -

28,6

23,9

-

sisi lain, proses kultur sel yang berulang-ulang kali Kesimpulan

menggambarkan kanker stadium lanjut. Salah satu alasan mengapa cell line ynng dipilih karena isolat

delesi ekson 19 tipe 1 (E746 A750del) delesi ekson 19 jenis pasti belum diketahui ekson 20 T790M dan ekson 21 L858R

DNA yang didapat berupa isolat dari sitologi yang

tidak ada mutasi ekson 18, 19, 20 & 21

diupayakan sebesar 25 ng/μl sehingga konsentrasi

mencerminkan hasil pemeriksaan yang bisa didapat dalam praktek sehari-hari yaitu bilasan bronkus, sikatan bronkus, sputum ataupun cairan pleura.11,12 Konsentrasi sampel

Konsentrasi DNA masing-masing sampel

akhir sebesar 1 ng/μl untuk masing-masing hasil. Konsentrasi sebesar 1 ng/μl setara dengan 8000 genom haploid sehingga jumlah sel yang dibutuhkan

PEMBAHASAN

sebanyak 8000 sel. Karena sistem ini mampu

Penelitian ini merupakan penelitian dengan

mendeteksi alel mutan di antara alel wild type hingga

desain eksperimental. Pengerjaan sampel dilakukan

perbandingan 1:1000 maka alel mutan yang dapat

berulang-ulang kali sehingga didapatkan hasil yang

diperiksa sekurangnya 8 alel mutan. Jumlah ini cukup

memuaskan. Di awal proses pengerjaan, hasil yang

sedikit mengingat sampel yang didapat dalam praktek

didapat sangat tidak memuaskan. Hal tersebut

sehari-hari baik itu berupa jaringan dari biopsi

disebabkan karena proses isolasi DNA yang tidak

bronkus ataupun sitologi dari dari sikatan brokus,

baik, ataupun pencampuran reagen yang tidak hati-

bilasan bronkus ataupun efusi pleura juga tidak

hati hingga terjadi kontaminasi reagen.

banyak.11,12

pengerjaan

ini

pun

berkali-kali

Proses

menggunakan

berbagai konsentrasi sehingga didapatkan konsentrasi yang optimal agar didapatkan hasil yang memuaskan.

Siklus PCR

Pengukuran konsentrasi isolat DNA dengan spektrofotometer

Sampel

perlu

dilakukan

sebelum

menjalankan metode PNA-LNA PCR Clamp . Hal ini Sampel yang digunakan yaitu cell line PC9 ,

diperlukan sebagai standarisasi dalam menganalisis

PC3, H1975 dan H1299 yang dibiakkan berulang

hasil. Sistem ini memerlukan konsentrasi DNA

kali. Sebagai aplikasi metode ini secara klinik maka

sekurangnya 1 ng/μl

sampel cell line yang dipilih adalah jenis KPKBSK

Sehingga

yang

Jepang.

mengandung 8000 salinan DNA. Jumlah salinan

Rasionalisasi pemilihan ini adalah karena tingkat

DNA sebanyak ini akan terlihat di monitor berupa

mutasi gen EGFR lebih sering ditemukan pada orang

grafik yang meningkat seiring dengan fungsi log pada

Jepang sehingga kami mempertimbangkan mutasi

siklus ke 27. Grafik yang meningkat sebelum siklus

diperoleh

dari

donor

orang

dalam

sebagai konsentrasi akhir.

sampel

yang

akan

diperiksa



ini menandakan sampel yang diperiksa mengandung

sequencing pada produk PCR yang didapat untuk

konsentrasi lebih dari 1 ng/μl. Sedangkan apabila

mengetahui jenis mutasi pasti pada sampel PC3.

siklus meningkat lebih dari 27 maka konsentrasi sampel kurang dari 1 ng/μl. Rentang konsentrasi yang

H1975

optimal akan terlihat peningkatan siklus berkisar 20

Pada cell line ini DNA yang didapat cukup

hingga 33 bila menggunakan mesin SmartCycler real

adekuat yang dibuktikan dengan peningkatan siklus

time PCR. Pada keempat sampel didapatkan rentang

ke-28,6 pada PCR Check . Pada probe total terdapat

siklus antara 23,9 hingga 29,3. Rentang siklus

peningkatan pada siklus 28,7 di Reaksi 6 dan siklus

keempat sampel ini masih dalam batas konsentrasi

29 di Reaksi 4 sehingga dapat disimpulkan terdapat

yang optimal sehingga dapat disimpulkan semua

mutasi pada ekson 20 dan ekson 21. Hasil temuan ini

hasil peningkatan siklus baik dan adekuat.13

dikuatkan oleh probe mutan yang menunjukkan peningkatan siklus ke-29,3 di Reaksi 6 pada pewarna FAM sehingga dapat disimpulkan terdapat mutasi

PC9

Pada cell line ini DNA yang didapat cukup

ekson 20 T790M dan terdapat peningkatan siklus ke-

adekuat yang dibuktikan dengan peningkatan siklus

28,5 di Reaksi 4 pada pewarna FAM sehingga dapat

ke-25,7 pada PCR Check . Pada probe total terdapat

disimpulkan terdapat mutasi ekson 21 L858R.

peningkatan pada siklus 24,3 di Reaksi 2 sehingga dapat disimpulkan terdapat mutasi delesi ekson 19.

H1299

Hasil temuan ini dikuatkan oleh probe mutan yang

Hasil temuan pada PCR Check peningkatan

pada

siklus

yang

menunjukkan peningkatan siklus ke-25,12 Reaksi 2

menunjukkan

23,9

pada pewarna FAM sehingga dapat disimpulkan

menunjukkan bahwa DNA yang didapat sangat

terdapat mutasi delesi ekson 19 tipe 1 (E746-

adekuat. Namun pada probe total tidak terdapat

A750del).

peningkatan siklus. Hasil temuan ini juga dikuatkan dengan tidak ditemukannya peningkatan siklus pada probe mutan. Jadi pada sampel H1299 tidak

PC3

Hasil temuan pada PCR Check menunjukkan

peningkatan

pada

siklus

yang

ditemukan ada mutasi gen EGFR pada ekson 18, 19,

27

20 atau 21 dengan kata lain sampel H1299

menunjukkan bahwa DNA yang didapat cukup

mempunyai genotip wild type.

adekuat dan tepat 1 ng/µl. Pada probe total terdapat peningkatan pada siklus 29 di Reaksi 2 sehingga

PNA sebagai PCR Clamp

dapat disimpulkan terdapat mutasi delesi ekson 19.

Salah satu komponen terpenting sistem ini

Namun tidak ditemukan peningkatan siklus pada

adalah penggunaan klem primer . Penggunaan klem

probe mutan. Jenis pasti mutasi yang ada pada

prime bertujuan untuk menghambat amplifikasi alel

sampel PC3 belum diketahui hanya in formasi delesi

wild

ekson 19 saja yang dapat diketahui pasti. Perlu

amplifikasi inilah yang menyebabkan alel mutan saja

dilakukan

yang akan teramplifikasi sehingga dapat dideteksi.

pemeriksaan

lanjutan

seperti

direct

type.

Tentunya

dengan

penghambatan

Pemilihan Peptide Nucleic Acid (PNA) sebagai klem _________________________________________________________________________________________ 6 Departemen Pulmonologi & Ilmu Kedokteran Respirasi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia


primer berdasarkan atas sifat PNA yang resisten terhadap aktifitas 5` nuklease dalam hal ini DNA

Kelebihan dan kekurangan metode PNA-LNA PCR Clamp

polimerase. Di sisi lain, ikatan heterodupleks antara

Metode PNA-LNA PCR Clamp ini mampu

PNA-DNA ternyata lebih stabil dan mempunyai T

mendeteksi mutasi gen EGFR dengan perbandingan

melting yang lebih tinggi dari ikatan DNA-DNA.14

1:1000 terhadap sel dengan genotip wild type.11 Dalam suatu uji klinik lanjutan tingkat sensitifitas

LNA sebagai probe fluorogenik

Komponen

lain

yang

dan spesifitas metode ini sebesar 97% dan 100%.12 penting

adalah

penggunaan probe fluorogenik untuk mendeteksi alel mutan. Salah satu bahan yang handal untuk digunakan adalah Locked Nucleic Acid (LNA). Struktur molekul yang unik pada jembatan metilen membuat

konformasi

struktur

terkunci

yang

Lama pengerjaan isolasi DNA dari sampel sekitar 2 jam sedangkan untuk hasil yang optimal sekitar 1 malam (10 jam) termasuk proses pencampuran dan pengukuran konsentrasi. Sedangkan lama pengerjaan menjalankan mesin SmartCycler real time PCR hanya sekitar 40 menit per sampel.13

mengakibatkan ikatan heterodupleks LNA-DNA juga cukup stabil dan mempunyai T melting yang lebih tinggi. Salah satu keunggulan lain adalah penggunaan fluorogenik sebagai reporter dan quencher yang dapat dilekatkan pada ujung LNA. Jadi penggunaan

Metode PNA-LNA PCR Clamp ini mampu mendeteksi mutasi gen EGFR seperti terlihat dalam reaksi yang ditampilkan pada gambar 2 atau dengan kata lain sistem ini tidak dapat mendeteksi jenis mutasi di luar itu. Namun sistem ini mampu

15,16

LNA sangatlah tepat dalam sistem ini.

mendeteksi sebagian besar jenis mutasi gen EGFR karena 95% mutasi gen EGFR terjadi pada mutasi

Mesin Smart Cycler r eal ti me PCR

Mesin

yang

digunakan

adalah

mesin

SmartCycler real time PCR. Mesin ini digunakan

karena mempunyai beberapa keunggulan yaitu dapat menjalankan sampel secara simultan dengan protokol yang berbeda-beda serta dengan waktu yang cepat sekitar 30-40 menit. Mesin PCR yang digunakan adalah jenis real time dengan berbagai optik karena jenis mutasi yang dirancang mencapai 12 jenis mutasi yang dapat dijalankan sekaligus. Piranti lunak yang disediakan

dapat

membantu

mengidentifikasi

peningkatan siklus bahkan dapat dilakukan analisis 2nd derivative graphic.

alasan

mengapa

Hal inilah yang menjadi

mesin

SmartCycler real time PCR.

yang

dipakai

13

adalah

delesi ekson 19 dan mutasi ekson 21.17 Reagen PNA dan LNA sangat rapuh, sangat sensitif terhadap cahaya dan suhu sehingga dalam proses pengenceran PNA dan LNA diperlukan kehati-hatian yang tinggi agar

reagen

mengencerkan

tidak reagen

rusak.14-16 dalam

Setiap jumlah

kali

banyak

diperlukan kontrol positif dan kontrol negatif sebagai jaminan mutu kualitas. Kontrol positif dan negatif membutuhkan

kultur

sel

dan

plasmid

yang

membutuhkan infrastruktur untuk melakukan kultur sel dan plasmid. Biaya produksi untuk mendeteksi apakah ada mutasi gen EGFR pada setiap sampel klinik menggunakan metode PNA-LNA PCR Clamp adalah

sekitar

$20

pada

tahun

2010.12 Bila

dibandingkan dengan pengerjaan mennggunakan direct sequencing , tentu metode ini menawarkan

biaya produksi yang jauh lebih hemat. Kelebihan dan _________________________________________________________________________________________ 7 Departemen Pulmonologi & Ilmu Kedokteran Respirasi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia


kekurangan metode PNA-LNA PCR Clamp dalam

mendeteksi mutasi gen EGFR pada sampel klinis

mendeteksi mutasi gen EGFR ditampilkan dalam

baik itu histopatologi ataupun sitologi.

tabel 2.10 Tabel 2. Kelebihan dan kekurangan metode PNA- L NA PCR Clamp . Kelebihan Proses pengerjaan cepat sekurangnya 2 jam 40 menit (2 jam isolasi DNA, 40 menit PCR)

Sampel klinik yang dibutuhkan tidak banyak; jumlah DNA @ r eaksi 25 ng = 8.000 genom haploid Sensitifitas 97% dan spesifitas 100%

Kekurangan Infrastruktur laboratorium yang mendukung kultur sel dan plasmid sebagai kontrol kualitas metode Butuh kehati-hatian dan ketrampilan dalam mengerjakan metode ini Jenis mutasi gen EGFR hanya yang tertera dalam sistem ini

Biaya produksi dibandingkan menggunakan metode standar baku emas lebih hemat

KESIMPULAN

Metode PNA-LNA

PCR

Clamp

dapat

mendeteksi mutasi gen EGFR pada cell line PC9, PC3, H1975, dan H1299. Cell line PC9 mengandung mutasi delesi

ekson 19 tipe 1 (E746-A750del), PC3 mengandung mutasi delesi ekson 19, H1975 mengandung mutasi ekson 20 T790M dan ekson 21 L858R sedangkan H1299 tidak mengandung jenis mutasi. Metode PNA-LNA

PCR

Clamp

dapat

digunakan sebagai metode alternatif dalam mendeteksi mutasi gen EGFR pada cell line.

SARAN

Karena penelitian ini belum menggunakan sampel klinis maka perlu penelitian lanjutan untuk melihat metode PNA-LNA PCR

Clamp

apakah

dapat

DAFTAR PUSTAKA

1.

Dutta PR, Maity A. Cellular responses to EGFR inhibitors and their relevance to cancer therapy. Cancer Lett. 2007;254:165 – 77. 2. Departemen Kesehatan RI. Profil kesehatan Indonesia 2004. Jakarta: Depkes RI; 2005.p.1322. 3. Alberg AJ, Ford JG, Samet JM. Epidemiology of lung cancer. Chest. 2007;132(:29S-55S. 4. Mok TSK. Personalized medicine in lung cancer: what we need to know. Nat Rev Clin Oncol. 2011;8:661 – 8. 5. Gazdar AF, Minna JD. Deregulated EGFR signaling during lung cancer progression: mutations, amplicosns, and autocrine loops. Cancer Prev Res. 2008;1:156-60. 6. Gazdar AF. Personalized medicine and inhibition of EGFR signaling in lung cancer. N Engl J Med. 2009;361(10):1018-20. 7. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, Gurubhagavatula S, Okimoto RA, Brannigan BW, et al. Activating mutations in the EGFR underlying responsiveness of NSCLC to geﬁtinib. N Engl J Med. 2004;350(21):2129-39. 8. Paez JG, Janne PA, Lee JC, Tracy S, Greulich H, Gabriel S, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to geﬁtinib therapy. Science. 2004;304(1497):1497 – 500. 9. Eberhard DA, Giaccone G, Johnson BE. Biomarkers of response to EGFR inhibitors in NSCLC working group: standardization for use in the clinical trial setting. J Clin Oncol. 2008;26(6):983-94. 10. Angulo B, Conde E, Suárez-Gauthier A, Plaza C, Martínez R, et al. A Comparison of EGFR mutation testing methods in lung carcinoma: direct sequencing,rReal-time PCR and immunohistochemistry. PLoS ONE. 2012;7(8): e43842. 11. Nagai Y, Miyazawa H, Huqun, Tanaka T, Udagawa K, Kato M, et al. Genetic heterogeneity of the EGFR in NSCLC cell lines revealed by a rapid sensitive detection system, the PNA-LNA PCR Clamp. Cancer Res. 2005; 65: 7276-82. 12. Tanaka T, Nagai Y, Miyazawa H, Koyama N, Matsuoka S, Sutani A, et al. Reliability of the PNA-LNA PCR Clamp test for EGFR mutations integrated into the clinical practice for NSCLC. Cancer Sci. 2007;98(2):246-52.



13. Cepheid Technical Support. Optimizing and analyzing real-rime assays on the SmartCycler® II System. Cepheid. 2005.p.1-6. 14. Nielsen PE, Egholm M. An introduction to Peptide Nucleic Acid. Current Issues Molec Biol. 1999;1(2):89-104. 15. Braasch DA, Corey DR. Locked nucleic acid (LNA) : fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 2001;8(1):1-7. 16. Petersen M, Wengel J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends Biotechnol. 2003;21(2):74-81. 17. Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer. 2007; 7: 169 – 81.



Deteksi Mutasi Gen EGFR Menggunakan PNA-LNA PCR Clamp Pada

Recommend Documents