Prof. Luis Mario Madrid Jiménez
OMIIS Gpo. BK02Q
Deducción de la Ecuación de Michaelis – Menten Menten El propósito de esta deducción es desarrollar una expresión matemática útil para describir Vo, que es la Velocidad inicial (velocidad instantánea) de una enzima, que define el tiempo en que la enzima modifica a su sustrato único. Toda la deducción parte de la expresión de la reacción enzimática:
K +1
E+S
K +2
ES K -1
E+P K -2
en donde E es la concentración molar de la enzima, que para propósitos del formulismo de Michaelis – Michaelis – Menten se mantiene constante. S es la concentración molar del sustrato, que puede variar con el tiempo, y P es la concentración del producto, que también varía con el tiempo. La reacción ocurre en dos etapas: Durante la primera la enzima E se une al sustrato S para +1 -1 formar el complejo ES y está definida por la suma algebraica de las constantes K y K . Durante la segunda etapa el complejo ES se desintegra después de alcanzar el estado reactivo de la enzima, para dar paso a la aparición del producto P, y está definida por la +2 -2 -2 suma algebraica de las constantes K y K . Sin embargo como K está muy poco favorecida se puede eliminar del cálculo. El tiempo que la enzima tarda en alcanzar su estado excitado para modificar al sustrato corresponde a la velocidad inicial (instantánea) de la enzima y se denota por Vo. Dado que la enzima debe emplear un cierto tiempo para excitarse, este punto de la reacción constituye el Paso limitante de la velocidad de reacción. En este punto de la reacción la velocidad depende exclusivamente de la concentración del complejo Enzima – Enzima – Sustrato Sustrato [ES], por lo que se presenta una cinética de primer orden, en la que la velocidad depende de la concentración de uno de los reactantes. Por lo tanto Vo podría determinarse a partir de la expresión de la ecuación de velocidad de primer orden, que para esta reacción corresponde a la forma:
-d [ES] dt
=
-d [ES]
K+2 [ES] en la que
dt
es la desaparición de [ES] en función del tiempo, es decir la velocidad, o sea Vo.
Por lo tanto:
Vo = K+2 [ES]
1/9
Prof. Luis Mario Madrid Jiménez
OMIIS Gpo. BK02Q
Pero ni K+2 ni [ES] pueden determinarse directamente, debido a que no es posible medir la fracción de la “población” molecular de la enzima que está efectivamente acomplejada con +2 el sustrato en un momento dado y consecuente K no se puede calcular a partir de la expresión de la reacción en equilibrio. Así que se debe encontrar otra expresión para Vo a partir de otras variables que si se puedan medir. Para desarrollar esa otra expresión escribiremos primero la ecuación para la reacción directa o “de ida” de la primera etapa de la reacción enzimática, cuya velocidad depende de las concentraciones de la enzima E y del sustrato S, por lo tanto será una ecuación de segundo orden que rinde la formación del complejo Enzima – Sustrato [ES]
K +1
K +2
E+S
ES K -1
E+P K -2
Esta ecuación de segundo orden que describe la parte sombreada de la reacción tiene la forma:
-d [ES] dt
=
K+1 ([ET]-[ES]) [S]
En esta expresión ([ET] – [ES]) corresponde a la enzima libre en el sistema, es decir la E que está del lado izquierdo del área sombreada que representa la concentración de la enzima que aún no se acompleja con el sustrato. Después escribiremos la ecuación para la desintegración del complejo Enzima – Sustrato [ES] resultado de la suma de dos reacciones, a saber: La reacción directa o “de ida” de la segunda etapa que rinde el producto P y que es descrita por K+2 y la reacción inversa o “de vuelta” de la primera etapa, descrita por K-1. La reacción de formación del complejo ES a -2 partir de la Enzima y el Producto descrita por K se puede eliminar del cálculo debido a que está muy poco favorecida bajo las condiciones de reacción actuales.
K +1
K +2
E+S
ES K -1
E+P K -2
Esta ecuación que describe la parte sombreada de la reacción tiene la forma:
-d [ES] dt
=
K-1[ES] + K+2 [ES]
2/9
Prof. Luis Mario Madrid Jiménez
OMIIS Gpo. BK02Q +1
+2
-1
Al considerar estas dos ecuaciones estamos incluyendo en el cálculo a K , K y K que dan cuenta de las reacciones termodinámicamente favorecidas del proceso completo de la reacción enzimática. Dado que ambas ecuaciones comparten un término, como se demuestra en la siguiente comparación.
-d [ES] dt
=
-d [ES]
K+1 ([ET]-[ES]) [S]
dt
=
K-1[ES] + K+2 [ES]
Es posible igualarlas de la siguiente manera:
K+1 ([ET]-[ES]) [S]
=
K-1[ES] + K+2 [ES]
Y a partir de esta ecuación igualada se reordena de la siguiente manera: +1
A) Se despeja K que está multiplicando y pasa dividiendo del otro lado de la ecuación.
K+1 ([ET]-[ES]) [S]
([ET]-[ES]) [S]
=
=
K-1[ES] + K+2 [ES] K-1[ES] + K+2 [ES] K+1
B) Se factoriza el segundo término de la ecuación.
([ET]-[ES]) [S]
=
K-1 + K+2 K+1
.
[ES] 1
desde esta expresión la suma algebraica de las constantes se renombra como Km
K-1 + K+2 K+1
=
Km
por lo que la ecuación se transforma en:
([ET]-[ES]) [S]
= Km
.
[ES] 1
que equivale a
Km [ES]
=
([ET]-[ES]) [S]
3/9
Prof. Luis Mario Madrid Jiménez
OMIIS Gpo. BK02Q
C) Se descompone el segundo término de la ecuación para obtener la forma factorizada
Km [ES] Km [ES]
=
=
([ET]-[ES]) [S]
[ET] [S] - [ES] [S]
D) Se despeja el componente [ES][S] que está restando y pasa sumando del otro lado de la ecuación,
Km [ES]
=
[ET] [S] - [ES] [S]
Km [ES] + [ES] [S]
=
[ET] [S]
E) Se realiza la suma algebraica del primer término de la ecuación.
Km [ES] + [ES] [S] [ES] (Km + [S])
=
=
[ET] [S]
[ET] [S]
F) Se despeja (Km + [S]) desde el primer término, en donde está multiplicando y pasa dividiendo al otro lado de la ecuación.
[ES] (Km + [S])
[ES]
=
=
[ET] [S]
[ET] [S] (Km + [S])
G) Se sustituye el valor de [ES] en la ecuación
[ES]
=
[ET] [S] (Km + [S])
Vo
=
K+2 [ES]
Vo
+2 = K
[ET] [S] (Km + [S])
4/9
Prof. Luis Mario Madrid Jiménez
OMIIS Gpo. BK02Q
Cuando el sistema alcanza la saturación, es decir cuando toda la enzima se halla acomplejada con el sustrato, se alcanza la velocidad máxima del sistema o Vmax este estado corresponde a la reacción directa o “de ida” de la segunda etapa de la +2 reacción, descrita por K , y es cuando se está produciendo producto P a la mayor tasa. La velocidad en este punto depende solo de la concentración del complejo Enzima - Sustrato [ES] implicando que es una reacción de primer orden, y dado que el sistema está saturado, [ES] equivale a la concentración de la enzima total o [ET] por tanto en este punto la ecuación de primer orden:
Vo = K+2 [ES] se puede escribir como sigue
Vmax
=
K+2 [ET]
H) Podemos entonces sustituir la ecuación abajo
Vmax
=
K+2 [ET]
en la ecuación
Vo = K+2
como se demuestra
[ET] [S] (Km + [S])
con esta sustitución final obtenemos la Ecuación de Michaelis – Menten.
Vo
Vmax [S] =
(Km + [S])
5/9
Prof. Luis Mario Madrid Jiménez
OMIIS Gpo. BK02Q
Aplicación de la Ecuación de Michaelis – Menten La ecuación de Michaelis – Menten en realidad describe la velocidad inicial Vo del sistema enzimático relacionando la velocidad del sistema en el estado de saturación Vmax con la concentración del sustrato [S] y la Km. Sin embargo en cierto estado del sistema es posible calcular el valor de Km. Ese estado del sistema referido antes es el que corresponde a la mitad exacta de la velocidad máxima es decir:
Vo Vmax
Vo = ½ Vmax
[S] en este estado se cumple la siguiente expresión matemática a partir de la ecuación de Michaelis – Menten: Ecuación original:
Vo
=
Vmax [S] (Km + [S])
cuando Vo = ½ Vmax entonces se expresa como:
Vmax [S]
Vmax =
2
(Km + [S])
que al ser divida por Vmax se transforma en:
[S]
1 2
=
(Km + [S])
6/9
Prof. Luis Mario Madrid Jiménez
OMIIS Gpo. BK02Q
y despejando (Km + [S]) que está dividiendo en el segundo término de la ecuación pasa multiplicando al otro lado de la ecuación:
[S]
1 2
=
(Km + [S])
(1) (Km + [S]) =
2
[S]
continuando con el despeje el 2 del término de la izquierda que está dividiendo, pasa multiplicando del otro lado de la ecuación:
(1) (Km + [S]) =
2 (1) (Km + [S])
=
[S]
2 [S]
que equivale numéricamente a:
Km + [S]
=
2 [S]
Ahora se despeja [S] del término izquierdo, que está sumando y pasa restando del otro lado de la ecuación:
Km + [S] Km
=
=
2 [S]
2 [S] – [S]
Finalmente se realiza la resta algebraica indicada en la ecuación.
Km
=
Km
2 [S] – [S] =
[S]
7/9
Prof. Luis Mario Madrid Jiménez
OMIIS Gpo. BK02Q
de donde se deduce que cuando que cuando Vo = ½ Vmax la Km tiene el mismo valor numérico que la concentración del sustrato [S] en ese punto preciso, como se demuestra en la siguiente gráfica.
Vo Vmax
Vo = ½ Vmax
Km
[S]
Esta estrategia de cálculo de Km tiene la desventaja de estar basada en una curva hiperbólica con aproximación asintótica a Vmax, lo que significa que nunca se llega a determinar el valor de Vmax con precisión, por lo que el cálculo de Km resulta mas preciso cuando se realiza a partir de la linearización de la ecuación de Michaelis – Menten que se consigue gracias a la:
Transformación de Lineweaver – Burk Esta consiste en la obtención de los dobles recíprocos o “inversos” de los dos términos de la ecuación de Michaelis – Menten como se muestra a continuación: Ecuación de Michaelis – Menten original:
Vo
Vmax [S] =
(Km + [S])
Obtención de los dobles recíprocos:
1 Vo
(Km + [S]) =
Vmax [S]
Descomponiendo esta ecuación de acuerdo a la suma algebraica indicada se obtiene:
1 Vo
Km =
Vmax [S]
+
[S] Vmax [S]
8/9
Prof. Luis Mario Madrid Jiménez
OMIIS Gpo. BK02Q Km Vmax [S]
A continuación se factoriza el componente
y se realiza la división
[S] Vmax [S]
algebraica indicada en el componente
1
Km
Vo
=
lo que transforma la ecuación
1
.
Vmax
[S]
+
en:
1 Vmax
que corresponde, término a término con la ecuación de la recta, como se demuestra abajo:
1 Vo y
Km =
.
Vmax
=
m
1 [S]
.
x
+
+
1 Vmax b
en donde m es la pendiente de la curva, b es el intercepto al origen y variables independiente y dependiente respectivamente.
x e y son las
A partir de la ecuación se puede graficar la curva de cinética enzimática linearizada como se demuestra abajo.
1 Vo
Pendiente =
-1 Km
Km Vmax
1 Vmax
1 [S] que resulta mas precisa para el cálculo.
9/9
