FUNDAMENTOS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
Franklin Muñoz Cárdenas 1
2011
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Historia 1850 Runge Anilinas (Colorantes) Cromatografia-Papel Fm: Solventes Fe: Papel
1955 Primer CG
1906 Mikhail Tswett Pigmentos vegetales Cromatografia-Colummna
1954 Ray 1 Publicación
1941 Martín y Singe Posibilidad teórica Fm: Gas
1952 Martín y James Realidad Experimental 1941
1955-1967
usos de otras Fases móviles JJ kirkalnd 1960 auge-comercialización
Chroma : Color Graphein: Escribir 1960 SFC 1987 se comercializa
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Método Separación física componentes Muestra distribuye 2 fases
Migración entre zonas Fase Estacionari a
Fase Móvil Líquida Sólida
Gas
Líquida Sólido
Líq/gas Gel
Modalidades de Cromatografia
Naturaleza Fase móvil
Gas : C. Gaseosa GC Líquido: C Líquida LC
Naturaleza Fase Estacionaria
Fenómeno en Columna
• ••L iq-Sol (LSC) Liq-Liq (LLC) •Gas-Liq (GLC) •Gas-Sol (GSC)
1. Afinidad • • •
•Capa Delgada TLC •Columna Abierta •HPLC *
Normal/Reversa Ligada Intercambio Iónico
2. Tamano molecular
Líquido/Gas :SFC
• •
Permeación por gel Filtración por gel
Cantidad Muestra Aplicada •Analítica: •Semipreparativa: •Preparativa:
Pg –Ug ug –gramos gramos-
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CG HPLC Separa: Sustancias Orgánicas Volátiles , NO Termolábiles, peso molecular promedio (no alto ) !
La fase el parámetro de separación
!
Separa: Orgánicos e inorgánicos Volátiles o no, Termolábiles o no,
!
20% pueden separarse sin previo tratamiento
!
Detectores; Diferencian fm del analito, la fm es inerte al detector
!
Destructivo no recupera muestra
!
!
!
!
La fm es el parámetro fundamental de la separación. Detectores; NO Diferencian fm del analíto, la fm no es inerte al detector. NO Destructivo recupera muestra
Inter. Iónico IEC LiqSol LSC
Formas CL
Excl. Tamaño SEC
LiqLiq LLC Fase ligada BPC
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Dónde está ?
Qué se usa?
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Solventes Es el verdadero motor y una gran diferencia con CG donde el gas es solo Carrier del analito.
Propiedades de los solventes en HPLC Alto poder solubilizante de las muestras Baja reactividad Compatibilidad con el detector utilizado Adecuado punto de ebullición y volatilidad Baja viscosidad Seguridad (salud) Alto grado de pureza
• • • • • • •
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Preparación fases móviles
Es necesario tener en cuenta; 1. Material volumétrico limpio 2. Fenómenos de contracción de volúmenes 3. Determinar uso del pH 4. Después de preparada se debe filtrar y desgasificar
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Se debe filtrar por: •
Partículas de la fase móvil taponan y desgastan los filtros tuberías sellos y rotor del inyector
•
Se efectúa con membranas de 0.45 o 0.22 um de poro que eliminan partículas y bacterias
•
Se recomienda descartar los primeros mililitros por arrastrar partículas de la membrana
•
Las muestras a inyectar también se deben filtrar. 20
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Se debe desgasificar por: •
Liberación de burbujas bomba y celda del detector
•
Eliminación de oxigeno
Métodos de desgasificación: Se pueden emplear métodos por Temperatura, Presión y Afinidad. •Temperatura favorece o no la disolución del gas en la
fase
N2 Disminuye en agua pero en Benceno aumenta.
•Presión:
Si Disminuye, se
disminuye la disolución
del gas • Afinidad
: Son más solubles en donde predomine fuerzas diferentes a las propias del gas.
Reflujo, Burbujeo gas inerte, Ultrasonido, Vacío 23
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Bomba •Función : Impulsar Fase móvil desde el Reservorio – Inyector y la columna
Características •Permitir caudal 0.1 a 10 mL/m •Generar presión hasta 6000 psi ( libras/pulgada ) •Exactitud de caudal alto •Ruido Bajo ( Generación de pulsos mínimos variación de caudal) •Deriva Baja ( Ruido que se genera por el uso en un largo tiempo) •Sistema Corte: Poder parar cuando aumente o disminuya presión del
sistema
Material
•Cuerpo en acero Inoxidable •Partes en contacto fase móvil : Zafiro, Rubí, teflón , Acero •Se usa TITANIO cuando el acero es incompatible con muestras
biológicas
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Clases Bombas
!
Pistón ( Reciprocantes )
• Mayoría equipos la poseen, las hay 1, 2, 3 pistones. Bomba •
Tanden.
Desplazamiento Continuo ( Jeringas ) 26
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Porqué usar gradientes ?
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Permite : Introducir la muestra en solución interrumpir el caudal .
Inyectores
Características • • • • • •
Fácil de operar Inerte Soportar altas presiones 7000 psi Preciso en la cantidad de muestra introducida Soportar altas temperaturas ( para mantener en solución polietilenos ) Biocompatible con la muestra TITANIO
Clases Inyectores Septum: Elastómero (Cromatografía de gases ) • • • • •
Desprenden material Perdida de presión Necesario vencer la presión para inyectar Necesita flujos altos Poca reproducibilidad en la inyección
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Clases Inyectores
Válvulas: Bucles de muestras •
Cuerpo fijo con un rotor y loop (intercambiable 5 a 2000 uL) 37
Válvula Válvulas posee dos posiciones: Posición de llenado o carga : Fm pasa directo a la columna Via Inyección a Presión atmosférica El loop se llena con 5 veces su capacidad RDS=0.05% Posición de Inyección : Fm arrastra muestra del loop y la lleva a la columna
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DUCTOS TUBERIA Para:uniones entre
la fase móvil
bomba
Inyector….
Características 1. 2.
Inerte Resistencia a la presión (Indeformable) Acero Inoxidable (316-314), Polímeros (Polipropileno-teflón)
Acero 316 Mayor Presión Bomba – Inyector Inyector – Columna Columna – Detector Entre detectores en serie.
Teflón Menor Presión Reservorio Solvente - Bomba Frasco desperdicios.
Su diámetro externo es estándar 1/16 de pulgada Su diámetro interior va desde 0.2 a 0.7 mm 42
UNIONES Permiten conectar las tuberías y los componentes cromatográficos
Características •Inertes a la fase Móvil •Cierre hermético •Evitar volúmenes muertos •Son dos piezas:
Macho Férula + Tornillo
Hembra Conector 43
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Columnas Función : contribuir a la separación de los analitos de una muestra. Características • Tubo de acero Inoxidable > 600 psi. • Tubo de vidrio < 600 psi • Diametro interno Uniforme
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Clases 1 Analíticas 10 a 30cm • •
Las hay Rectas y helicoidales (se pierde eficiencia) Diámetro interno 4 a 10 mm
• •
Tamaño a 10 umDint – Partícula 5um Más usadpartícula as 25cm -54,6mm 3-7cm – 1-4mm Dint – Partícula 3um
2 Precolumnas Aumento vida columna Elimina material suspensión, contaminantes fase móvil y sustancias que se unen irreversiblemente a la columna • Saturar fase móvil con fase estacionaria. • •
Rellenos Pelicular y Material poroso
Detectores Función : Ver y ubicar en el tiempo y espacio la posición de cada uno de los componentes a la salida de la columna.
Características 1. Sensible 2. Amplio rango dinámico de respuesta 3. No destruir la muestra 4. Estable a la temperatura 5. Respuesta lineal 6. Alta relación señal /ruido 7. No contribuir al ensanchamiento de la señal (Banda extracolumna) 8. Responder a todos los solutos 9. Constante de tiempo baja (Velocidad de respuesta rápida) 47
Clasificación Generales * Miden propiedad física de la fm Con y sin analíto Ej Índice de refracción Conductividad
Selectivos * Sensibles a propiedad del analíto Ej UV- visible
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Detector Índice de refracción Función : Medir la diferencia de Indice de refracción entre Solvente puro y solvente con analito
Características: • Detector Universal porque : • • • •
improbable Ir soluto = Ir solvente No destructivo Poco sensible Lo afecta la temperatura No se pueden emplear series eluotrópicas 49
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Función : Medir la cantidad de luz que absorbe el soluto o analito a una determinada longitud de onda
Características •Más empleado. Detector Ultravioleta •Buena sensibilidad •Buen rango lineal •No destructivo •Puede emplearse con gradientes eluotrópicos •Estable a cambios de caudal y temperatura •190-350 nm UV •Hasta 700nm Visible •Concentración analito cumple la ley de Beer
- Visible
A=a.b.c 52
Detector Ultravioleta – Visible
Onda fija
Longitud de trabajo prefijada •Generalmente se emplea 254nm - Lámpara de Hg •214nm Lámpara de Zn •229nm Lámpara de Cd
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Onda Variable ( Espectrofotométrico ) •Longitud de máxima absorción para el analito motivo
de estudio. •Lámpara de Deuterio o Xenón con filamento de Wolframio •Arreglo de diodos
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Detector Ultravioleta - Visible De luz dispersada tras evaporación • • • • •
Se evapora fase móvil Formación suspensión analíto en un gas ( N o Aire ) Haz de luz laser Medida dispersión del haz Mide un fotodiodo de Silicio
Electroquímico •
Compuestos redox
• •
1000 veces más sensible que UV. Necesita fases móviles conductivas ( Buffers dePO4 0.02M) Electrodos de Au, C, Pt, Hg
•
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Bases de la Separación Serie de Interacciones de la MUESTRA Fase móvil y Fase estacionaria •Hidrofóbica •Hidrofílica •Puentes de H2 •Momentos dipolares •Cargas electrostáticas
Todo ello define la afinidad por fm o fe " "
afinidad fm elución más rápida afinidad fe elución más lenta
Cada analito crea su propio equilibrio diferente al otro ello permite la separación. Si Un analito A necesita más volumen de elución por ende mayor tiempo
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Cromatograma • • • • • • • • • • • • •
Volumen de Elución, de retención total Volumen muerto Línea base Tiempo de retención Tiempo de retención neto o relativo Velocidad lineal ( u) Factor de capacidad ( K ), Cte , coeficiente, razón de distribución (IUPAC) Factor de separación, de selectividad, de resolución Ancho de pico Platos teóricos, Altura plato teórico Asimetría Resolución Eficiencia
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Procesos de ensanchamiento de banda El ensanchamiento demuestra la distribución de un analito desde el momento de la inyección.
Porque se sucede el ensanchamiento? Por las diluciones que sufre el analito a medida que atraviesa el sistema cromatográfico y por efectos extracolumnares. • Analitos menos retenidos producen picos más angostos • El ensanchamiento depende de la eficiencia (N) Platos teóricos y calidad de ellos
Ensanchamiento intramolecular Según Van Deemter las contribuciones son 4: •Proceso multipasos ( caminos múltiples) • Difusión Longitudinal • Resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil • Resistencia a la transferencia a la fase estacionaria 73
PROCESO MULTIPASO (
A)
Difusión de EDDY y contribuye al ensanchamiento basado en el
Diámetro de la Partícula y por una constante del proceso de relleno y calidad del empaquetamiento.
Este fenómeno es determinante cuando: • •
Tamaño de partícula irregular Columna mal empacada
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DIFUSION LONGITUDINAL (B/U) Difusión del analito en todas las direcciones de la fase móvil.
Este fenómeno es determinante cuando: • Viscosidad de la fase móvil baja • Flujo de la fase móvil lenta • Coeficiente de difusión del analito es alto
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RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MASA (C*U) •
En la fase móvil
• En la fase estacionaria
Este fenómeno es determinante cuando: Flujos rápidos Porque entre menor volumen de flujo se efectúa el equilibrio fm= fe en ese menor volumen y por tanto se generan picos más pequeños 76
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Ensanchamiento Extracolumnar En condiciones normales los ensanchamientos solo se producen por efectos columnares
Se sucede por: Desajustes en Inyección Tuberías, uniones y detector Como los analitos más retenidos generan picos más anchos que los menos retenidos este fenómeno afecta mas a los picos menos retenidos que son más agudos (Se nota mas) • • •
A medida que aumenta su longitud , diámetro Tuberias: Inyección: Demasiado volumen inyectado Detector : Volumen geometría y tubería de conexión asi como la
velocidad de respuesta si es lenta se pueden unir picos y ensancharse
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Material relleno columna Bases de la Separación 1. Morfología: Esférico o Irregular con tamaño de 2 a 60 um de diametro entre el volumen interno de los poros y el volumen de Relación la partícula 2. Porosidad: Poro: cavidades de mayor profundidad que diámetro, pueden ser abiertos o cerrados
Area Superficial:
Determina la capacidad de retención de la fase estacionaria
A menor diámetro del poro mayor área superficial y mayor retención
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Estructura Química
La columna se conforma por una estructura interna y una externa ( responsable de los procesos de retención ) La estructura EXTERNA se constituye por grupos activos Naturales Productos de modificación inducida Productos de modificación permanente
• • •
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Estructura Química La estructura INTERNA generalmente es SILICAGEL • • • • • •
• • •
Oxido de silicio hidratado Sólido amorfo y poroso de gran área superficial( 30 a 500 ) Alto volumen de poro ( 0.4 a 1.2 mL/g) con un diámetro de 60 y 300 A Es fuertemente higroscópico La humedad bloquea y hace perder actividad A 200C pierde agua y se condensan los grupos silinoles formando puentes siloxanos volviendo la silica inactiva Es insoluble en solventes apolares Soluble en agua 100ppm a pH Neutro y Temp ambiente La solubilidad aumenta con el pH (>7.5)
Preparación fase ligada Silicagel , alúmina, agarosa, copolímeros, divinilbenceno Compuesto con grupo funcional determinado. 1. 2. 3. 4.
Tipo ester Tipo Amino Tipo Carbono Tipo Siloxano
+
(Si-OR) (Si-NR2) (Si-CR3) (Si-O-SiR3)
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Cromatografía Fase Reversa Bases de la Separación Fase Estacionaria Fase móvil
APOLAR POLAR
VENTAJAS: •
• • • • • •
Compuestos ionicos , no ionicos e ionizables pueden separarse en la misma columna, con la misma fase móvil La fuerza de atracción superficial es débil La adsorción irreversible raramente ocurre La fase móvil predominante es agua El modificador orgánico es etanol o metanol El orden de elución es predecible en función hidrofobicidad Los equilibrios del sistema se alcanzan rápido. 92
Fase Móvil (Reversa) Es un solvente polar Mezcla de Agua y un modificador orgánico Se pueden agregar aditivos, sales, Boffers A mayor proporción de modificador orgánico menor retención (Menor K) A mayor cantidad de agua Mayor retención ( Mayor K) Los solventes de mayor uso son: Agua Metano Acetonitrilo Por Transparencia al UV y Viscocidad Tetrahidrofurano • •
• • • •
La selectividad es dada por los modificadores orgánicos 93
Fase Móvil(Reversa) AGUA METANOL • • •
Es el carrier. Modificador Orgánico más utilizado por
Alto poder de sales yy purificación rea ctivos de apareamiento ionico Poco tóxicodisolvente , fácil adquisición Bajo costo
DESVENTAJA Avido por el Oxigeno y genera mayor presión que los otros solventes ACETONITRILO • • •
Se almacena en el oscuro y bien cerrado por ser higroscópico Ideal para longitudes de onda cortas 190nm Solvente caro
TETRAHIDROFURANO •
•
Forma facilmente peroxidos y se comercializa c on antioxidantes que absorben al UV DIOXANO Muy viscoso se usa en pocas proporciones 94
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Mecanismo de Retención Fase Reversa
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Mecanismo de Retención Fase Reversa Puede ser de 3 tipos • • •
Partición entre fase móvil y estacionaria Adsorción sobre la fase estacionaria Proceso mixto Partición- adsorción
Teoría Solvofóbica : fuerzas más fuertes que las generadas con el soluto obligando al soluto a interactuar con laintrasolvente fase estacionaria ACCION DE LA CADENA CARBONADA ( FASE LIGADA ) • • • • •
•
La más empleada son cadenas alquilicas de 18 y 8 carbonos respectivamente A mayor longitud de la cadena más retención A mayor cobertura mayor retención A mayor hidrofobicidaad del soluto mayor retención. Ir de c1 a c22 la retención aumenta 10 veces. 10% de modificador orgánico reduce la retención en 2 a 3 veces por tanto la fase móvil sobre la selectividad afecta más que la fase estacionaria. Cadenas cortas producen picos más simétricos ( por menor tiempo de retención) Ensanchamientos intracolumnnares y porque los silinoles libres interaccionan con la fase móvil permitiendo equilibrios más rápidos
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Formas de cromatografía en fase reversa 1.
Regular o de partición Simple La fase móvil son mezclas de agua y un modificador orgánico ( hasta cuaternarias) La retención la gobierna la hidrofobicidad del soluto a Mayor polaridad menor retención ( Fase móvil Polar) A mayor proporción de agua mayor retención A mayor proporción de modificador menor retención Fuerza elutiva decrece asi THC> AcN> MeOH> AGUA 2 Control de ionización ( Supresión Iónica ) Los solutos ionizables dan picos con baja retención y baja simetría fenómeno que no se corrige con un modificador orgánico; 3. De apareamiento ionico 4. Complejación con iones metálicos Argentación de la silicagel ( Cu, Cd, Ni, Zn. Ag ) Excelente para resolución de isomeros geométricos ( cis- Trans) 5. En medio no acuoso ( para aceites, grasas, Hidrocarburos ) Con solventes de muy baja polaridad pero polares frente a la fase estacionaria 99
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Cromatografía Fase Normal Fase Estacionaria Fase móvil
POLAR APOLAR
VENTAJAS : •
Unico modo en HPLC que permite separar isómeros posicionales con sustituyenyes polares.
MATERIALES DE RELLENO •
• •
Silica Proceso de adsorción gobernado por los grupos silinol ( vecinal ,geminal y aislado ) formando ptes de hidrogeno. Alumina carácter básico Fase ligada 104
Fase Móvil ( Normal ) Es un solvente apolar •
Mezcla solventes Se pueden agregar aditivos que actuan sobre sitios de fuerte retenciónes causantes de irregularidades en la fase estacionaria (Agua o solvente altamente polar) •
•A mayor proporción de modificador menor retención
(Menor K) aumentar la fuerza eluotropica del solvente en 0.05 disminuye k en 3 a 4 unidades •A mayor cantidad de agua menor retención ( Menor K)
CUIDADO silica soluble en agua
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Mecanismo de Retención Fase Normal
Competencia fase móvil Competencia analito • • • •
Superficie adsorbente Superficie adsorbente
Interacciones dipolo- dipolo Puentes de hidrogeno Transferencias de carga Formación de complejos Pi 106
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Cromatografía Intercambio Iónico Fase Estacionaria Fase móvil
GRUPOS FUNCIONALES IONICOS SOLUCION ACUOSA DE pH
CLASES : • •
Aniónica Cationica
UTILIDAD Solutos ionicos, ionizables y neutros con capacidad de formar complejos ionicos. Generalmente Acidos, Bases y sus sales •
Esta cromatografia ha sido desplazada por cromatografia en fase reversa ( Apareamiento ionico, Supresión ionica) 108
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Mecanismo de Retención Intercambio Iónico •
•
• • •
Reacciones entrefase soluto y fase estacionaria Distribuciónirreversibles del soluto entre estacionaria y fase móvil Competencia analito- Superficie adsorbente. Ph = Pka forma ionica y no ionica coexistes 50% Ph+2UNIDADES por encima del Pka 99% ionizado Ph-2 UNIDADES por debajo del Pka 99% no ionizado por tanto se pueden emplear modificadores organicos en este caso
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Material relleno columna • •
Polímeros orgánicos Intercambiadores fase ligada
• •
Oxidos inorgánicospeliculares Intercambiadores
Fase Móvil Es un solución acuosa de pH y fuerza ionica controlada por un buffer. 111
Cromatografía Exclusión Fase Estacionaria GELES BLANDOS, RIGIDOS Fase móvil SOLVENTES Y AGUA
CLASES : • •
De filtración por gel (Hidrosolubles) De permeacion por gel ( Insolubles en agua )
UTILIDAD •
Solutos de peso mayor a 2000 que presentan problemas en otros metodos
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Características Generales
•
Picos angostos (por Volumen elución pequeño)
•
Tiempo de separación cortos
•
Orden elución predecible (por tamaño)
•
No hay perdida de muestra
•
La resolución no puede manipularse (Diferencia peso 10%)
Mecanismo de Retención Exclusión Tamaño efectivo en solución (Dimensión molecular)
• • •
Exclusión esterica Mayor peso mayor tiempo Menor tamaño mayor tiempo
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