INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS B IOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACIÓN DEPARTAMENTO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN EN ALIMENTOS
CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS PRESENTES EN LA SEMILLA Y ACEITE DE CHÍA ( Salvia hispanica L.), MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR.
T
E
S
I
S
PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS EN ALIMENTOS PRESENTA: FRANCISCO ERIK GONZÁLEZ JIMÉNEZ
DIRECTORES DE TESIS: M. EN C. MARÍA DEL CARMEN BELTRÁN OROZCO DRA. MARÍA GABRIELA VARGAS MARTÍNEZ
MÉXICO, D. F. DICIEMBRE 2010.
RESUMEN Actualmente el estudio de alimentos con propiedades antioxidantes ha aumentado considerablemente debido al interés que se tiene sobre los efectos benéficos a la salud que previenen dichos compuestos, tales como la prevención de cáncer, enfermedades cardiovasculares y otras patologías de carácter inflamatorio. Además de que el consumo frecuente de antioxidantes se relaciona con la disminución de otras enfermedades como diabetes y enfermedades coronarias. En esta investigación se estudiaron 4 tipos de semilla de chía de los estados de Puebla y Colima y el aceite extraído de la misma, determinando la capacidad antioxidante de cada muestra por el método del ABTS y la cantidad de fenoles totales con el reactivo de Folin-Ciocalteu e identificación de los compuestos fenólicos mediante la técnica de electroforesis capilar la cual es una herramienta muy útil en el análisis de alimentos ya que disminuye la generación de contaminantes, el tiempo de análisis y costo de los mismos. Los resultados obtenidos mostraron que la fracción desengrasada de la semilla de chía contiene una elevada capacidad antioxidante (98.73 µmol Trolox/g muestra) comparada con frutos como la frambuesa (84 µmol Trolox/g muestra) y la manzana roja (40 µmol Trolox/g muestra) que se distinguen por su alto contenido de antioxidantes. Mientras que el aceite de chía muestra valores de fenoles totales comparables (12 mg acido gálico/100 g muestra) en relación al aceite de olivo (13.36 mg acido gálico/100 g muestra), en lo que respecta al análisis mediante electroforesis capilar se lograron identificar hasta 9 compuestos fenólicos en el caso de la semilla desgrasada; ácido ferúlico, ácido vainillinico, ácido trans-cinámico, ácido gálico, ácido cafeico, ácido clorogénico, miricetina, quercetina, kaempferol. En el caso del aceite se logró identificar hasta 4 compuestos fenólicos (dependiendo del tipo de aceite); ácido trans-cinámico, ácido clorogénico, ácido pcumárico y Quercetina. En general se puede puede considerar la semilla semilla de chía como como un alimento con potente capacidad antioxidante que incluyéndola en la dieta diaria ayudaría a satisfacer los requerimientos diarios de antioxidantes y prevenir ciertas enfermedades de patología inflamatoria, además de los beneficios que se obtendrían por los demás nutrientes que contiene como es el caso de la proteína, fibra, y ácidos grasos omega 3 y 6.
ABSTRACT Currently the study of food with antioxidants has increased considerably due to the interest that has beneficial efects on health from such compounds, such as cancer prevention, cardiovascular and other inflammatory cancer diseases. In addition to the frequent consumption of antioxidants is related to the reduction of other diseases such as diabetes and heart disease. In this work we have studied 4 types of chia seeds from the states of Puebla and Colima and the oil extracted from it, determining the antioxidant capacity of each sample by the ABTS method and the amount of total phenolics with the Folin Folin – Ciocalteu reagent, and identification of –Ciocalteu phenolic compounds by capillary electrophoresis which is a very useful tool in food analysis because it reduces the generation of pollutants, the analysis time and cost of them. The results showed that the fraction defatted chia seeds contains a high antioxidant capacity (98.73 mmol Trolox / g sample) compared with fruits such as raspberries (84 mmol Trolox / g sample) and red apple (40 mmol Trolox / g shown) that are distinguished by their high antioxidant content. While chia oil shows comparable values of total phenols (12 mg acid gallic/100 g sample) compared to olive oil (13.36 mg acid gallic/100 g sample), with respect to analysis by capillary electrophoresis was achieved identify up to 9 phenolic compounds in the case of seed defatted; ferulic acid, vanillin, trans-cinnamic acid, gallic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, myricetin, quercetin and kaempferol. In the case of oils were identified up to 4 phenolic compounds (depending on the type of oil), trans-cinnamic acid, chlorogenic acid, pcoumaric acid and quercetin. In general we can consider chia seed as a food with powerful antioxidant that including it in the daily diet would help meet the daily requirement of antioxidants and prevent certain inflammatory disease pathology, in addition to the benefits to be gained by the other nutrients it contains such as protein, fiber, omega 3 and 6.
INDICE GENERAL Página ÍNDICE GENERAL
i
ÍNDICE DE CUADROS
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
v
1.
1
INTRODUCCIÓN
1.1 Características de la semilla de chía.
1
1.1.2 Cultivo.
2
1.1.3 Usos y aplicaciones.
3
1.1.4 Composición de las semillas de chía.
5 7
1.2
1.1.5 La chía como fuente de ácidos grasos indispensables en la nutrición humana. Antioxidantes.
1.3
Compuestos polifenólicos.
10
1.3.1 Biosíntesis de compuestos fenólicos.
11
1.3.2 Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos.
14
1.3.3 Análisis de compuestos fenólicos.
15
Electroforesis capilar.
16
1.4.1 Tipos de electroforesis.
17
1.4.2 Flujo electroosmótico.
19
1.4.3 Inyección de la muestra.
23
Aplicaciones de la electroforesis capilar al análisis de alimentos. Análisis de compuestos fenólicos en alimentos mediante E.C.
25
JUSTIFICACIÓN.
30
OBJETIVOS.
31
Objetivo general.
31
Objetivos específicos.
31
2.
MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1
Materia prima.
32 32
2.2
Reactivos y materiales.
32
1.4
1.5 1.6
8
25
IIi
2.3
Desarrollo experimental.
33
2.4
Equipo.
34
3.
MÉTODOS.
34
3.1
Determinación de proteínas.
34
3.2
Determinación de humedad.
35
3.3
Determinación de fibra.
3.4
Determinación de cenizas.
35
3.5
Determinación de lípidos.
35
3.6
Determinación de carbohidratos
36
3.7
Extracción del aceite de chía.
36
3.8
Extracción de compuestos fenólicos de la semilla semilla de chía
36
3.9
Extracción de compuestos fenólicos presentes en el aceite de chía.
36
.
35
3.10 Determinación de fenoles totales.
37
3.11 Capacidad antioxidante antioxidante de los extractos extractos de semilla y aceite de chía por el método del radical ABTS.
38
3.12 Análisis de compuestos polifenólicos mediante electroforesis capilar
38
4.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
40
4.1
Análisis proximal
40
4.2
Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chía.
41
4.3
Determinación de la capacidad antioxidante por el método del ABTS.
45
4.4
Identificación de compuestos fenólicos mediante electroforesis capilar.
47
4.4.1 Elección de las condiciones óptimas de análisis
47
4.4.2 análisis de los extractos de aceite de chía
65
5.
CONCLUSIONES
92
6.
BIBLIOGRAFÍA
94
ii
ÍNDICE DE CUADROS Cuadro No.
Página
1.
Concentración de antioxidantes en extractos de semilla de chía.
6
2.
Concentración relativa de compuestos fenólicos en tejidos vegetales
10
3.
Las principales clases de compuestos fenólicos en
11
frutos. 4.
Métodos para el análisis de compuestos fenólicos mediante E.C.
27
5.
Análisis proximal de la semilla de chía
40
6.
Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chía.
42
7.
Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chía y aceite
45
8
Condiciones de análisis en electroforesis capilar.
48
9
Condiciones utilizadas en el análisis electroforético.
50
10
Condiciones utilizadas en el análisis electroforético.
51
11
Condiciones utilizadas en el análisis electroforético.
51
12
Condiciones utilizadas en el análisis electroforético.
52
13
Condiciones utilizadas en el análisis electroforético.
56
14
Condiciones óptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar.
57
15.
Tiempos de migración de cada estándar.
58
iii
16
Condiciones óptimas experimentalmente.
de
análisis
halladas
62
17
Tiempos de migración de cada estándar.
64
18
Contenido de fenoles totales, capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar.
78
19
Condiciones utilizadas en el análisis de extractos frescos de semilla y aceite de chía.
79
20
Comparación de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 días
88
20
Contenido de compuestos fenólicos en extractos frescos.
89
iv
ÍNDICE DE FIGURAS Figura No.
Página
1.
Cultivo de chía y clasificación botanica
1
2.
Biosíntesis de los compuestos fenólicos a partir de la vía del shikimato y fenilalanina
12
3.
Formación de fenilpropanoides, estilbenos, lignanos, ligninas, suberinas, cutinas, flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina. FAL: Fenilalanina amonio liasa.
13
4.
Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles
14
5.
Electroferograma.
18
6.
Distribución de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmótico resultante.
19
7.
Formación de la doble capa eléctrica.
20
8.
Perfiles de flujo para líquidos: (a) por presión electroosmótica EC, y (b) por presión hidrodinámica HPLC.
21
9.
Detección de moléculas con distinta carga.
22
10.
Inyección electrocinética.
24
11.
Inyección por vacío.
24
12.
Semilla 094
32
13.
Semilla 125
32
14.
Semilla 287
32
15.
Semilla 301
32
16
Desarrollo experimental
33
17.
Curva tipo de ácido gálico
41
18.
Fenoles totales en el aceite de chía y aceite de olivo.
43
v
19.
Contenido de fenoles totales de la semilla de chía desgrasada con otros frutos.
44
20.
Curva tipo Trolox expresada como µM Trolox
45
21.
Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chía.
47
22.
Electroferograma de la mezcla de 8 estándares.
49
23.
Electroferograma de la mezcla de 8 estandares .
53
24.
Electroferogramas de cada par de estandares.
54
25.
Electroferograma de comparación de 8 estándares.
54
26.
Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial.
55
27.
Espectros de absorción de cada estándar.
60
28.
Electroferograma de 11 concentraciones de buffer.
distintas
61
29.
Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo tiempo de migración de los 11 estándares.
63
30.
Espectros de absorción obtenidos mediante detector de arreglo de diodos.
64
31.
Electroferograma del aceite comercial de chía.
65
32.
Electroferograma del aceite 094.
66
33.
Electroferograma del aceite 094 añadiendo estándares.
66
34.
Electroferograma del aceite 125.
67
35.
Electroferograma añadidos.
36.
Electroferograma del aceite 287
37.
Electroferograma añadidos.
del
del
estándares
aceite
aceite
125
más
a
estándares
67
68 287
más
estándares
68
vi
38.
Electroferograma del aceite 301.
69
39.
Electroferograma de la semilla 094
70
40.
Electroferograma de la semilla 125
70
41.
Electroferograma de la semilla 287.
71
42.
Electroferograma de la semilla 301.
73
43.
Electroferograma añadidos.
de
semilla
094
con
estándares
73
44.
Electroferograma añadidos.
de
semilla
125
con
estándares
74
45.
Electroferograma añadidos.
de
semilla
287
con
estándares
75
46.
Electroferograma añadidos.
de
semilla
301
con
estándares
76
47.
Electroferograma del aceite fresco 094.
79
48.
Electroferograma del aceite fresco 125.
80
49.
Electroferograma del aceite fresco 287.
81
50.
Electroferograma del aceite fresco 301.
82
51.
Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chía.
83
52.
Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco.
84
53.
Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco.
85
54.
Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco.
86
55.
Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco.
87
vii
1 INTRODUCCIÓN La chía (Salvia hispánica L.) es una planta herbácea de la familia de las Lamiáceas; junto con el lino (Linum usitatissimum ), es una de las especies vegetales con la mayor concentración de ácido graso alfa-linolénico omega 3 conocidas hasta 2006. Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas, que se utilizan molidas como ingrediente alimenticio (Cahill, 2003).
1.1 CARACTERÍSTICAS DE LA SEMILLA DE CHÍA Es una hierba anual, de hasta 1 m de altura; presenta hojas opuestas, de 4 a 8 cm de largo y 3 a 5 cm de ancho. Las flores son hermafroditas, púrpuras a blancas, y aparecen en ramilletes terminales; florece entre julio y agosto en el hemisferio norte. Al cabo ca bo del verano, las flores dan lugar a un u n fruto en forma de aquenio indehiscente indehiscen te (Figura 1). La semilla es rica en mucílago, fécula y aceite; tiene unos 2 mm de largo por 1,5 mm de ancho, y es ovalada, lustrosa, y de color pardo grisáceo a rojizo (Cahill, 2003).
Reino:
Plantae
Subreino:
Tracheobionta
División:
Magnoliophyta
Clase:
Magnoliopsida
Subclase:
Asteridae
Orden:
Lámiales
Familia:
Lamiáceas
Subfamilia:
Nepetoideae
Tribu:
Mentheae
Género:
Salvia
Especie:
S. hispanica L.
Nombre binomial
S. hispanica L.
Figura 1. Cultivo de chía y clasificación botánica
1
1.1.2 CULTIVO La chía prefiere suelos ligeros a medios, bien drenados, no demasiado húmedos; como la mayoría de las salvias, es tolerante respecto a la acidez y a la sequía, pero no soporta las heladas. Requiere abundante sol, y no fructifica en la sombra. Antes de la conquista de América, la chía era un alimentos básico para las civilizaciones de América Central y México; su cultivo era probablemente el tercero en importancia económica, superado sólo por el maíz ( Zea mays) y el frijol ( Phaseolus vulgaris). Los aztecas imponían a sus pueblos tributarios una contribución de hasta 15,000 toneladas anuales (Cahill, 2003). Desplazada por los cereales aportados por los españoles, el cultivo de chía desapareció durante la colonia; sobrevivió sólo en áreas montañosas aisladas de México (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y Guatemala. El mayor centro productor de México está en Acatic, Jalisco, de donde se exportan cantidades crecientes a Japón, Estados Unidos y Europa. Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios países de América Latina comenzó en la década de 1990 a replantar experimentalmente la chía en el norte de Argentina, para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos, con resultados excelentes (Ayerza, 1996). Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 1.6 t/ha, con contenidos de aceite de hasta el 38,6%. Se han suscrito contratos para la producción comercial de chía en las provincias de Catamarca, Salta y Tucumán (Argentina), exportando el producto sobre todo a los Estados Unidos. La viabilidad en los estudios piloto se estimaba entre el 78% y el 87% (Coates, 1996).
2
1.1.3 USOS Y APLICACIONES Hay evidencia científica que muestra que la semilla de chía comenzó a usarse en la alimentación humana hace 3,500 años A.C. y se convirtió en uno de los cultivos básicos en el centro de México entre 1,500 y 900 A.C junto con el amaranto, fríjol y maíz. Por siglos, la semilla de chía fue utilizada como alimento por los indígenas del oeste y del sur de México. Los aztecas, entre otros usos, ofrecían la chía a los dioses como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas. Conocida como el alimento de caminatas, su uso como un alimento de resistencia y alta energía ha sido registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas, cuyos guerreros subsistían con la semilla durante sus conquistas. Los indígenas del suroeste ingerían muy poco, no más de una cucharada llena cuando salían de marchas forzadas durante 24 horas (Ayerza, 1996). Hacia el año 1600 D.C. se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41% correspondían a los medicinales y el resto eran culinarios, artísticos y religiosos, entre otros. Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la formulación de medicamentos eran en su mayoría las semillas y en menor medida los tallos, hojas y raíces, las cuales se utilizaban principalmente para combatir las infecciones respiratorias. Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el tratamiento contra fiebres, diarreas, estreñimiento, regulación de la secreción biliar, infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias, también servía como estimulante y para proteger la piel. Como alimento, las semillas de chía se tostaban y molían hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli. La harina se incorporaba en las tortillas, tamales y en varias bebidas de los aztecas llamadas Chianatoles. Los usos artísticos se restringieron al aceite de la semilla para pinturas, barnices, cosméticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las vasijas y platos. Adicionalmente, el aceite sirvió como componente básico en la pintura para el cuerpo y rostro (Cahill, 2003).
3
En rituales religiosos, las semillas le servían a los aztecas como ofrenda al dios Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill, 2003). Si se mezcla una cuchara llena de chía dentro de un vaso de agua y se deja durante aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi sólida. La reacción que genera el gel se debe a la fibra soluble presente. El gel que se forma en el estómago crea una barrera física entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los disuelven, de manera tal que disminuye la conversión de carbohidratos en azúcar (Ayerza, 2002). En adición a los obvios beneficios para los diabéticos, esta demora en la conversión de los carbohidratos en azúcar genera la habilidad de crear resistencias. Los carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos. La prolongación de su conversión a azúcar estabiliza los cambios metabólicos, creando así una mayor duración en sus efectos de generación de energía. Además, una de las cualidades excepcionales de estas semillas son sus propiedades hidrofílicas, teniendo la habilidad de absorber más de 12 veces su peso en agua, dicha habilidad de mantener el agua ofrece la posibilidad de prolongar la hidratación los fluidos y electrolitos que proveen el entorno que da vida a las células del cuerpo humano. Con semillas de chía, se puede retener la humedad, humedad, regulando la absorción corporal de nutrientes y fluidos corporales. Debido a que hay una gran eficiencia en la utilización de los fluidos corporales, el balance electrolítico se mantiene (Ayerza, 2002). En la actualidad, mucha gente utiliza las semillas de chía en la preparación de una bebida refrescante y popular llamada llamad a “chía fresca”, también se puede preparar un mucílago dejando reposar la semilla en agua, para utilizarla como fibra dietética o para añadirla y dar espesor a mermeladas, jaleas, yogures, mostazas, salsa tártara; igualmente es útil en la industria cosmetológica y otras aplicaciones. En el pan se puede utilizar el gel como un imitador de grasa, así como para resaltar su sabor, asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible aumentar su vida de anaquel (Beltrán y Romero, 2003).
4
La chía es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el país, que los hay y son muchos. Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como fórmulas para bebés, alimento para animales, barras nutritivas, entre otros. (Beltrán y Romero, 2003). Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos con ω-3 ω-3 como huevos, pollos, carne vacuna, jamón, leche, quesos, etc. Utilizada como una fuente de ácidos grasos ω-3, ω-3, no requiere el uso de antioxidantes artificiales como las vitaminas sintéticas. El aceite esencial encontrado en las hojas tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de algunos insectos a la planta (Craig, 1997).
1.1.4 COMPOSICIÓN DE LAS SEMILLAS DE CHÍA La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chía contiene un 32% de aceite y éste ofrece el contenido natural conocido más elevado de ácido α-linolénico α-linolénico que es aproximadamente de 58.7%, la siguen el cártamo y el girasol. Asimismo, entre sus componentes principales se encuentra también el ácido linoléico que varía de 17 a 26%. El ácido graso αα -linolénico es un ácido graso insaturado ω-3, ω-3, es muy importante para la nutrición humana, se denomina indispensable ya que debe de suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo. Se ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de ácidos grasos ω -3, reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado con la reducción de casos de arteriopatía coronaria. Otras de sus funciones son que ayudan al mantenimiento de la piel, del pelo y del sistema reproductivo, mejoran el desempeño mental y visual, así como el de la regulación del metabolismo del colesterol. Consumiendo 25 g de semilla de chía, se alcanza la cantidad diaria de ácido graso ω-3 ω-3 recomendada por las organizaciones de nutrición (Tosco, 2004).
5
Una vez que el aceite se ha extraído de la semilla de chía, el material remanente contiene un 40% de fibra, de la cual un 5% es fibra soluble o dietética. Los extractos de agua y metanol de la semilla de chía una vez que se ha prensado y extraído el aceite, han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltrán y Romero, 2003). La semilla de chía contiene una cantidad de compuestos con potente actividad antioxidante, entre los más impor tantes tantes se encuentran el δ y γγ - tocoferol y antioxidantes fenólicos tales como ácidos clorogénico y cafeico y flavonoles (miricetina, quecetina y kaempferol). La importancia de los mismos radica en su protección frente a la oxidación lipídica que afecta tanto la calidad de los alimentos como la salud de los consumidores, con el posible deterioro de las características organolépticas, funcionales y nutricionales (Taga et al. 1984). En el Cuadro 1 se muestra la concentración de compuestos antioxidantes presentes en la semilla de chía de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por Taga et al en 1984.
Cuadro 1. Concentración de antioxidantes en extractos de semilla de chía.
Compuesto
Concentración (mol/kg de semilla de chía)
Ácido cafeico
6.6 x 10-3
Ácido clorogénico Miricetina
7.1 x 10-3 3.1 x 10-3
Quercetina
0.2 x 10-3
Kaempferol
1.1 x 10-3
Ácido cafeico Fuente: Taga et al . 1984.
13.5 x 10 -3
La oxidación de los alimentos constituye un grave problema, tanto para los consumidores como para los fabricantes de alimentos. Si no se controla, la oxidación puede producir no sólo sabores extraños, sino también promover el envejecimiento y las enfermedades degenerativas de la edad como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, cataratas, declinación del sistema inmunológico y disfunción cerebral, de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir ácidos grasos ω-3 ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al . 1997).
6
1.1.5 LA CHÍA COMO FUENTE DE ÁCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIÓN HUMANA. Existe un grupo de ácidos grasos poli-insaturados que se denominan ácidos grasos indispensables (AGE), los cuales son muy importantes para la nutrición humana pero no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de la dieta. Los AGE para el hombre son: los ácidos grasos Omega-3 (ácido a-linolénico y sus derivados de cadena larga) y los ácidos grasos Omega-6, cuyo precursor es el ácido linoléico. La evidencia sugiere que los ácidos grasos Omega-3 juegan un papel importante en la membrana celular. La función de éstos ácidos grasos, es aportar mayor flexibilidad a las membranas celulares, permitiendo el movimiento de proteínas en su superficie y dentro de la bicapa lipídica (Lauritzen et al . 2001). Las cantidades necesarias de ácidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de vida de cada persona y de su estado fisiológico o patológico que pueden llevar a un aumento en las necesidades de ácidos grasos. Se estima en promedio que es necesaria una ingesta del 1 % de la energía total de ácidos grasos Omega-3 y un 4% de la energía total para los Omega-6. El problema radica en que el contenido de ácidos grasos Omega-3 en nuestra alimentación es muy bajo, por lo que el consumo diario no alcanza a superar el 0,5 % de la energía total (Harper et al . 2006). De todas las fuentes de ácido grasos Omega-3, sólo el lino ( Linum usitatissimum L.) y la chía tienen su origen en cultivos agrícolas. Ambas son especies vegetales con la mayor concentración de ácido graso a-linolénico conocida hasta la fecha. Estas semillas, fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente alimenticio, o en forma natural como suplemento dietético. Las otras dos fuentes disponibles son de origen marino: las algas y el aceite de pescado (Ayerza, 1995). La oxidación de los alimentos constituye un grave problema, tanto para los consumidores como para los fabricantes de alimentos. Si no se controla, la oxidación puede producir no sólo sabores extraños, sino también promover el envejecimiento y las enfermedades degenerativas de la edad como el cáncer, las enfermedades
7
cardiovasculares, cataratas, declinación del sistema inmunológico y disfunción cerebral, de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir ácidos grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al . 1997).
1.2 ANTIOXIDANTES Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo enzimático y nutrientes esenciales (como vitaminas, pigmentos)
cuya función
principal es prevenir la formación de radicales libres e interceptar los que ya se han generado (Shi, 2001). Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales: avena, soya, té, granos de café, especias, arroz, aceites vegetales, papas, frutas, productos microbianos. Los antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevención de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo. Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y también sintéticos, elaborados por la industria y adicionados a los alimentos. En particular, los antioxidantes naturales
que pueden ser hidrosolubles y liposolubles, pueden
funcionar como compuestos reductores, interrumpen la cadena de formación de radicales libres, inhiben o impiden la formación de oxígenos libres e inactivan los metales pro-oxidativos. Los radicales libres se forman en el organismo mediante la respiración aeróbica y existen en diferentes formas como: anión superóxido, hidroxilos, peróxidos, y alcóxilos. Son dañinos ya que pueden reaccionar con componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi, 2001). El daño oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades crónicas, como la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), enfermedades cardiovasculares, daño oxidativo al ADN, cáncer y alteración de la visión (Serrano et al. 2007).
8
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son: carotenoides, fosfolípidos, tocoferoles (vitamina E), vitamina C, compuestos fenólicos, pigmentos, y sistemas enzimáticos como la superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa. Las vitaminas E, C, carotenos y los cofactores (Cu, Zn, Mn, Fe y Se) son importantes antioxidantes que funcionan de manera sinérgica inhibiendo la formación de radicales libres. Los compuestos fenólicos interfieren con el proceso de oxidación al reaccionar con radicales libres, quelan metales catalíticos y capturan el oxígeno. Estos compuestos se dividen en dos grupos: flavonoides y no flavonoides (Cedillo, 2006). Los polifenoles o compuestos fenólicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades crónicas como cáncer, degeneración neuronal relacionada con la edad y enfermedades cardiovasculares. Las plantas contienen una gran variedad de compuestos fenólicos como fenilpropanoides, derivados del ácido benzoico, taninos y ligninas (Macheix et al. 1990). Los flavonoides que incluyen flavonas, flavonoles y taninos condensados, funcionan como quelantes de metales, atrapan radicales libres, inhiben la xantina-oxidasa asociada a la formación de especies reactivas del oxígeno y la proliferación de células cancerígenas en pulmones, estómago y colon, además, previenen enfermedades coronarias. En general, la actividad antioxidante aumenta cuando existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidrógeno en la estructura molecular del compuesto (Wang et al . 1996).
9
1.3 COMPUESTOS POLIFENÓLICOS Los compuestos fenólicos o polifenoles, son las sustancias que poseen un anillo aromático, unidos a uno o más más grupos hidroxilo, incluyendo derivados funcionales (esteres, glucósidos, etc.) (Macheix et al . 1990) En el Cuadro 2, se muestra la concentración relativa en tejidos vegetales de estos compuestos fenólicos presentes en la naturaleza, se conocen aproximadamente 4000, siendo los flavonoides el grupo más más importante. Un número considerable de fenoles monocíclicos simples, quinonas fenólicas, lignanos, xantonas se incluyen en esta clasificación, al igual que materiales poliméricos tales tales como ligninas, lignanos, melaninas y taninos (Lee, 1992).
Cuadro 2. Concentración relativa de compuestos fenólicos en tejidos vegetales. Tejido Concentraciones relativas Fruto
ácidos cinámicos > catequinas leucoantocianinas leucoantocianinas (flavan-3,4-dioles) (flav an-3,4-dioles) > flavonoles
Hojas Tronco
flavonoles
ácidos cinámicos >
catequinas
leucoantocianinas
catequinas
leucoantocianinas leucoantocianinas > flavanoles >
ácidos cinámicos Corteza
Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente: Robards et al . 1999.
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3, la mayoría de los cuales se pueden encontrar en las frutas, siendo estos una excelente fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al . 1990), siendo la mejor fuente algunas bebidas como el vino tinto, café y té (Scalbert y Williamson, 2000).
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Cuadro 3. Las principales clases de compuestos fenólicos en frutos.
Átomos de carbono
Estructura Básica
Clase
Ejemplo
Fruto (Ejemplo)
7
C6 – C1
Ácido hidroxibenzoico
p – hidroxibenzóico
Fresa
9
C6 – C3
Ácido hidroxicinámico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Cítricos
10 13 14 15
C6 – C4 C6 – C1 – C6 C6 – C2 – C6 C6 – C3 – C6
Juglona Mangiferina Resveratrol quercetina, cianidina daidzeína
Nuez Mango Uva Cereza Frijol de soya Frutos con hueso.
Naftoquinonas Naftoquinonas Xantonas Estilbenos Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos Fuente: Macheix et al . 1990.
Sólo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma alimentación, estos compuestos son el ácido gálico, sináptico, ferúlico, cafeico, p – p – cumárico, y sus derivados así como los flavonoides y sus glucósidos. Las antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas y verduras. Mientras que la mayoría de los polifenoles no son pigmentos, son de igual importantes pues son responsables de la pérdida de color, principalmente el oscurecimiento, que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de frutas y verduras, formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimático y no enzimático (Lee, 1992).
1.3.1 BIOSÍNTESIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS. Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metabólicas: la ruta del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los ácidos hidroxicinámicos (Figura 2 y Figura 3); y la ruta del acetato, la cual produce fenoles simples y algunas quinonas (Decker, 1997).
11
Figura 2. Biosíntesis de los compuestos fenólicos a partir de la vía del shikimato y fenilalanina Fuente; Harborne, 1989. El grupo más importante de los compuestos fenólicos son los flavonoides, incluyendo flavonas, isoflavonas y antocianidinas, las que se forman vía condensación del fenilpropano (C6 – (C6 – C3), con la participación de 3 moléculas de malonil coenzima coenzima A, la cual permite la formación de chalconas, que posteriormente se ciclan en condiciones ácidas. Por lo que los flavonoides tienen la estructura básica de los difenilpropanoides (C6 – (C6 – C3 – C3 – C6) que consiste en dos anillos aromáticos unidos a 3 carbonos que forman un anillo heterocíclico oxigenado. El estado oxidativo de esta cadena de 3 carbonos, determinan las diferentes clases de flavonoides. Los flavonoides incluyen antocianinas (glucósidos ó acilglucósidos de las antocianidinas),
flavanoles
(catequinas),
flavonoles,
flavonas,
isoflavonas,
flavononoles y sus derivados.
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Figura 3. Formación de fenilpropanoides, estilbenos, lignanos, ligninas, suberinas, cutinas, flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina. FAL: Fenilalanina amonio liasa. Fuente; Shahidi y Naczk 2004.
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1.3.2 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS A lo largo de los años, algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos fenólicos, y un gran número de estudios han sugerido que el consumo de frutas y verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de cáncer, potencialmente a través de la actividad biológica de los compuestos fenólicos fenólicos así como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al. 2003). Por lo que los polifenoles pueden prevenir a la oxidación lipídica, la mutación del DNA y el daño del tejido (Figura 4).
Figura 4. Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente; Shahidi y Naczk, 2004.
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El comportamiento antioxidante de los compuestos fenólicos parece estar relacionado con su capacidad para quelar metales, inhibir la lipoxigenasa y captar radicales libres, aunque en ocasiones también pueden promover reacciones de oxidación in vitro. (Decker, 1997). Para que un compuesto fenólico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos condiciones básicas: 1) Cuando se encuentre en una concentración baja con relación al sustrato que va a ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidación o la oxidación mediada por un radical libre. 2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones posteriores.
1.3.3 ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS. Actualmente el, interés en los compuestos antioxidantes (fenólicos) ha aumentado debido a la
evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos compuestos
antioxidantes en la salud humana. Específicamente se han encontrado varios efectos preventivos en diferentes enfermedades como la prevención de cáncer, las enfermedades coronarias del corazón, los desórdenes inflamatorios, la degeneración neurológica, envejecimiento, etc (Madhavi et al. 1996). Este interés ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analíticos analíticos capaz de manejar matrices más complejos en que estos compuestos se descubren. En este contexto, las técnicas de electroforesis capilar
han surgido como como las
herramientas poderosas, permitiendo la separación e identificación identificación de compuestos que no pueden separarse fácilmente por los métodos de HPLC tradicionales, además de proporcionar información complementaria, y permitiendo el análisis simultáneo de diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al. 2002). Además, los métodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos de análisis más cortos y eficacias superiores comparadas con otras técnicas, requiriendo volúmenes de muestra y reactivos mínimos (Herrero et al. 2005).
15
1.4 ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis es un método de separación que se basa en las diferencias de movilidades de los analitos generadas cuando estos están bajo la influencia de un campo eléctrico. Los analitos, se encuentran en un medio conductor (electrolito soporte o buffer) y el campo eléctrico es generado en el medio conductor al aplicar una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del tubo capilar. El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a migrar hacia uno u otro de los electrodos: las moléculas con una carga neta negativa se desplazarán hacia el ánodo (electrodo positivo) y las moléculas con una carga neta positiva migrarán hacia el cátodo (electrodo negativo). La velocidad de migración de un ión, v, en el seno de un campo eléctrico, medida en cm s -1, es (Curtis et al . 1994). v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforética del ión, medida en cm 2V-1s-1, y E la intensidad del campo eléctrico medida en Vcm-1. La movilidad electroforética de un ión es directamente proporcional a la fuerza eléctrica del ión “F e” e inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento “Ff ”. ”. La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ión a partir de su tamaño o radio del ión solvatado “r i” y de la viscosidad del medio en el que migra “ ”, siendo siendo Q la carga carga iónica de la sustanc sustancia. ia. Fe= -Ff
Si Fe = EQ y F f = 6 Por lo tanto:
vi
Q 6
r i
E
r ivi
Q e
6
r i
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Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relación carga-tamaño entre los diferentes analitos presentes en la muestra; cuanto mayor sea esta relación más rápido migrará el ión en el seno del campo eléctrico. Para iones del mismo tamaño, el de mayor carga eléctrica migrará más rápidamente. Para iones con la misma carga migrará más aquel de menor tamaño, ya que tendrá una fuerza de retardo por rozamiento de menor valor. La resistencia del medio al paso del ión también influirá en su movilidad electroforética, siendo ésta mayor cuanto mayor sea la viscosidad del medio. Para hacer una separación efectiva es necesario mantener constantes las cargas de cada especie de iones, de manera que la relación cargatamaño (y por tanto la velocidad de migración) permanezcan en el intervalo más estrecho posible. Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier ácido o base quiere decir que las separaciones electroforéticas requieren disoluciones tampón (Castanon, 2006).
1.4.1 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos métodos electroforéticos ampliamente utilizados: la electroforesis convencional y la electroforesis capilar. La primera se lleva a cabo sobre papel o sobre un gel, en los que se aplica la muestra directamente. La disolución tampón, que será el medio conductivo, cubre la placa de papel o de gel. Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a través de la placa. Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso de la corriente y, si es necesario, las muestras se tiñen para visualizarlas. En la segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos capilares de diámetros diámetros internos menores a 100 100 µm, donde se disipa mejor mejor el calor y no es necesario el uso de geles (aunque es posible). Esto permite la aplicación de voltajes de hasta 30 mil volts, acelerando la separación.
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Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas pueden detectarse directamente al aplicar el método, es decir la técnica se puede automatizar. Se obtiene una gráfica de la respuesta en función del tiempo, llamada electroferograma (Figura 5), en la que cada pico representa una especie química separada (Albarrán, 2000).
Figura 5. Electroferograma. Por resolución se puede entender la capacidad de una técnica o método para separar dos componentes en una mezcla. En la electroforesis capilar se define de forma análoga a la cromatografía: Resolución = Separación del pico / Anchura media del pico La separación entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades electroforéticas de las especies, y por tanto será la anchura de la banda la que determine la mayor o menor resolución del método. El flujo electroosmótico, es el responsable de la disminución de anchura de las bandas. Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los cromatogramas, por ello, la nomenclatura utilizada para describir la separación de los picos o bandas en cromatografía se usa también para la electroforesis capilar. Sin embargo, la mayor diferencia es que la posición de los picos se determina por las movilidades electroforéticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
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con la fase estacionaria. De manera que la eficacia (o número de platos N ) en electroforesis capilar vendría dada por: N = μ eV / 2D
Dónde: D es el coeficiente de difusión del soluto. Por tanto, para aumentar la eficacia N , y por tanto la resolución, es necesario aumentar lo máximo posible el potencial
eléctrico V (Curtis et al . 1994).
1.4.2 FLUJO ELECTROOSMÓTICO (FE) Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene con tiene un líquido (electrolito), el líquido se mueve, este movimiento se denomina flujo electroosmótico (Figura 6).
Figura 6. Distribución de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmótico resultante. La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del regulador y depende de la carga en la superficie del capilar. La causa de la aparición del flujo electroosmótico es la formación de la doble capa eléctrica (Figura 7).
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Figura 7. Formación de la doble capa eléctrica.
Básicamente es una separación de la carga iónica, una segregación de capas de iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la disolución. Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de sílice fundida. A pH por encima de 3, la l a pared pa red interna del capilar de sílice s ílice presenta pre senta carga car ga negativa debido a la desprotonación de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie. Los cationes de la disolución formarán cerca de la superficie del capilar una primera capa interna, fija, en la que los cationes, inmóviles, están unidos fuertemente a la superficie del capilar. Una segunda capa, denominada capa móvil o difusa, formada también por cationes aunque unidos de manera más débil a la superficie del capilar, migrará hacia el cátodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eléctrico. El resto de la disolución, mediante capilaridad, migrará a la misma velocidad y en la misma dirección, lo que producirá un perfil de flujo plano, a diferencia de la cromatografía, que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006).
20
(a)
(b)
Figura 8. Perfiles de flujo flujo para líquidos: (a) por presión presión electroosmótica EC, y (b) por presión hidrodinámica HPLC. La segregación de las capas de iones produce un potencial en la superficie que disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie. Este potencial ψ es grande en la capa fija, y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa difusa. El punto clave es que donde termina la capa fija aún existe un cierto potencial, llamado potencial zeta , que permitirá el movimiento del fluido. La velocidad del flujo electroosmótico es proporcional a la diferencia de potencial e inversamente proporcional a la viscosidad del regulador “ ”. La velocidad del FE y por consiguiente la movilidad de FE “µ FE” va a variar en función de los cambios que se produzcan en el regulador; por ejemplo, una variación del pH del tampón origina un cambio en la ionización del capilar y un aumento de la concentración del regulador da lugar a una disminución del flujo flujo electroosmótico, así como cambios cambios en la constante constante dieléctr dieléctrica ica del del disolvente disolvente “ ” (Castanon, 2006).
FE
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En general, cualquier alteración en la disolución que modifique la carga en la superficie del capilar, modifique la viscosidad del tampón o requiera un cambio en el potencial, altera la velocidad del FE. Como se ha comentado, el flujo electroosmótico da lugar a un perfil de flujo plano, lo que reduce significativamente el ensanchamiento de banda y por tanto, mejora la resolución. Además, la gran ventaja que presenta el FE es que la separación electroforética y la detección pueden realizarse a la vez para cationes y aniones. Sin el FE, o sólo aniones, o sólo cationes migrarían hacia el detector. El ión de carga opuesta migraría retrocediendo al final de la inyección, y los compuestos neutros se quedarían al final y se dispersarían por difusión. Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro, 2006).
Figura 9. Detección de moléculas moléc ulas con distinta carga.
Finalmente, la velocidad de un ión en la electroforesis capilar vendrá determinada por su velocidad electroforética y por su velocidad de flujo electroosmótico: Dónde: V= Velocidad del ión μe = Velocidad electroforética μfeo= Velocidad del flujo electroosmótico E= Campo eléctrico
v = (μ e + μ feo feo ) E
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En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el cátodo, los iones negativos tendrán una movilidad electroforética μ e negativa, y por tanto estos iones migrarán más lentamente que los positivos. El resultado final en el electroferograma será una serie de picos que indican el siguiente orden de elución: primero los cationes más rápidos, seguidos sucesivamente de los cationes más lentos, todas las especies neutras en una única zona, y finalmente los aniones más lentos seguidos de los aniones más rápidos (Pais y Knize, 2000).
1.4.3 INYECCIÓN DE LA MUESTRA Debido a que el volumen de líquido que cabe en el capilar es de 4-5 4- 5 μL, el volumen de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros: esto implica una serie de dificultades al inyectar las muestras en el capilar. Existen varios métodos: Iny ecc ión elect ro ci né tic a : se retira del depósito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo, y se colocan en un pequeño recipiente que contiene la muestra. Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo, por lo que la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmótico y a la migración iónica. Después el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el recipiente con la disolución regulador (Figura 10). Inconvenientes: la muestra no es del todo representativa, ya que se introduce en el capilar más cantidad de los iones más móviles respecto a los más lentos (Castañeda et al . 2005).
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Figura 10. Inyección electrocinética.
Inyección p or presión presión : el extremo del capilar se coloca momentáneamente en un
pequeño recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una diferencia de presión para conducir la muestra al interior del capilar. Esta diferencia de presión proviene de aplicar vacío en el extremo del detector o de la aplicación de presión en el recipiente que contiene la muestra, o bien se consigue por elevación del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura 11). La inyección por presión no diferencia los iones según su movilidad, por lo que no es discriminativa (Castañeda et al . 2005).
Figura 11. Inyección por vacío.
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1.5 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANÁLISIS DE ALIMENTOS. La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el análisis de alimentos es bien reconocido y establecido actualmente. Esto se confirma con las aplicaciones en el estudio de sustancias de interés de alimentos, que van desde compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que afectan a dichos alimentos. Este hecho es corroborado por los más de 650 trabajos publicados en los últimos 10 años (Castañeda et al. 2005) y manuales para el desarrollo de métodos de análisis de alimentos (Frazier et al. 2000). El alcance de las aplicaciones es muy amplia en términos de tamaño molecular de los componentes de los alimentos, ya que pueden analizarse desde pequeñas moléculas como ácidos orgánicos o aminoácidos hasta el análisis de biomoléculas de gran tamaño, como proteínas, hidratos de carbono o ADN (Castañeda et al . 2005).
1.6 ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS FENÓL ICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE E.C. Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas, los cuales poseen una característica común de las estructuras; una fracción de fenol, y se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo. Los compuestos fenólicos son de interés debido a su posible contribución al al gusto (astringencia, la amargura, y acidez) y la formación de los sabores desagradables en los alimentos, incluidos el té, café y jugos de diferentes frutas, durante el almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007). Algunas aplicaciones recientes de la EC al análisis de d e compuestos fenólicos en tés, vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4. Cabe señalar que no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenólicos debido a que son aromáticas y, por tanto, presentan la absorción intensa en la región UV.
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Varios análisis han sido publicados, que puede ser utilizado como una guía para el análisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al. 2000) (Herrero et al. 2005).
En una revisión reciente, se discutieron las estrategias que se han utilizado durante la optimización de los métodos de E.C. para el análisis fitoquímico de los compuestos bioactivos, y se propuso el uso de múltiples variables diseños experimentales para simplificar esta tarea (Li et al. 2006). Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la detección rápida y simultánea de importantes antioxidantes naturales, incluidos los fenoles y antioxidantes no fenólicos, utilizando EC con un microchip con detección electroquímica a través de un electrodo de carbón vítreo (Blasco et al. 2005).
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Cuadro 4. Métodos para el análisis de compuestos fenólicos mediante E.C. APLICACIÓN
METODO DE MODO DETECCIÓN E.C.
BUFFER
REFERENCIA
UTILIZADO
UV
CZE
Polifenoles en aceite de olivo
UV
CZE
Polifenoles en queso (Bromus inermis L.)
UV
CZE
ELECTROQUÍMICA
MECK
Quercetina, rutina, kaempferol, catequina, en plantas
UV
CZE
Procianidinas después tiólisis
UV
MECK
50 mM fosfatos pH 7
Suntornsuk et al .2003. .2003. Herrero et al . 2005
Catequinas in té verde
UV
MECK
20 mM fosfatos pH 7
Bonoli et al . 2003
ELECTROQUÍMICA
CZE
DAD
MEKC
VISIBLE
CZE
Ácidos fenólicos (derivados de ácido benzoico y cinámico)
CONDUCTIMETRIA
CZE
150 mM 2-amino-2metilpropanol
Flavonoides y compuestos fenólicos (ácido ferúlico, apigenina, luteolina,ácido rosmarinico y ácido cafeico) en Perilla frutescens L.
ELECTROQUÍMICA
CZE
100 mM boratos pH 8.7
UV
MECK
Rutina y quercetina in plantas
Resveratrol en vinos, hierbas, y en alimentos saludables Resveratrol y piceid en vino tinto Antocianinas en vino tinto
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza
45 mM tetraborato de sodio pH 9.3 60 mM acetato de amonio pH 9.5 20 mM tetraborato de sodio pH 9.2 20 mM boratos pH 8.8
Blasco et al . 2005.
Fracción polifenólico de aceite de olivo extra virgen
100 mM boratos pH 10
100 mM borato pH 9.24
Carrasco et al 2006 Strerbova et al 2006 Li et al . 2002
Gao et al. 2002.
20 mM tetraborato de Brandolini et al 2002. sodio Saenz et al . 2003. 50 mM boratos pH 8.4 Kuban et al . 2006.
Peng et al 2005.
25 mM tetraborato de Cortacero et al . 2005. sodio pH10.5
DAD; detector de arreglo de diodos, CZE: electroforesis capilar de zona, MECK; Electroforesis micelar electrocinética.
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Otras aplicaciones de la EC en el análisis de alimentos son mencionados por Vallejo y Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran ; Determinación de proteínas de la leche (caseínas, αα-lactoalbúminas, ββlactoglobulinas). Análisis de proteínas del trigo. Determinación de carbohidratos por CZE con detección amperométrica mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola). Determinación de oligosacáridos mediante CZE (rafinosa, estaquiosa y verbascosa de semillas de leguminosas).
Otras aplicaciones de la EC en el análisis de alimentos son mencionados por Vallejo y Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran ; Determinación de proteínas de la leche (caseínas, αα-lactoalbúminas, ββlactoglobulinas). Análisis de proteínas del trigo. Determinación de carbohidratos por CZE con detección amperométrica mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola). Determinación de oligosacáridos mediante CZE (rafinosa, estaquiosa y verbascosa de semillas de leguminosas). Análisis del color/sabor de los alimentos. Análisis de los flavonoides de la caña de azúcar mediante CZE. Separación de los ácidos del lúpulo que dan amargor mediante CZE y MEKC (ácidos α y β de de extracto de lúpulo comercial).
Análisis de compuestos orgánicos en alimentos: Determinación del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de zumo de naranja). Comparación cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinación de aditivos en alimentos (cafeína, aspartamo y ácido benzoico en refrescos). Determinación cuantitativa de propionato en pan mediante CZE. Análisis de iones inorgánicos. Análisis cualitativo de aniones presentes en cerveza, salsa de soja, té y café. Determinación semicuantitativa de calcio, sodio, cloruros, fosfatos y citratos en muestras de leche.
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La versatilidad de la electroforesis capilar en el análisis de alimentos se demuestra claramente por los numerosos y amplios métodos presentados anteriormente. anteriormente. Por otra parte, la eficiencia y la rapidez de la E.C. en las separaciones fueron las principales ventajas que hacen de esta técnica una alternativa atractiva en los laboratorios de análisis de alimentos. alimentos. La E.C aún está lejos de ser tan bien establecida como las técnicas cromatográficas, aunque ciertamente ha ganado popularidad como una alternativa a la electroforesis convencional en gel para el análisis de proteínas de los alimentos, muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE, gran poder de resolución y velocidad de análisis. Tal vez el mayor potencial de la EC fue encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los alimentos (Vallejo et al. 2007).
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JUSTIFICACIÓN
Actualmente existe un interés por el estudio de alimentos con un alto contenido en antioxidantes naturales, como son los compuestos fenólicos los cuales están ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una disminución en la aparición de enfermedades cardiovasculares así como el cáncer y otras enfermedades crónico-degenerativas que actualmente están en crecimiento.
El interés que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos, por lo cual hace que la semilla de chía sea un alimento idóneo para este estudio.
Esta investigación tiene por objetivo caracterizar la semilla de chía cultivada en los estados de Puebla y Colima, con relación a los compuestos polifenólicos presentes en la misma y en el aceite extraído de dicha semilla, mediante la técnica de electroforesis capilar debido a que es una técnica actual y muy eficiente en cuanto al análisis químico se refiere, las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad mínima comparándolas con otras técnicas que son costosas, tardadas y con menor eficiencia.
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OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Identificar los compuestos fenólicos presentes en la semilla de chía y en el aceite extraído de la misma, procedente de los estados de Colima y de Puebla, utilizando la técnica de electroforesis capilar, así como la medición de la capacidad antioxidante de los mismos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Cuantificación del contenido de fenoles totales, en semilla y aceite de chía.
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chía y del aceite de chía mediante el método ABTS.
Establecer una metodología para la identificación y cuantificación de compuestos fenólicos mediante electroforesis capilar.
Identificar mediante el método de electroforesis capilar los compuestos fenólicos presentes en la semilla y el aceite de chía.
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2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Materia Prima.
Semilla de chía ( Salvia hispánica L.) asignándoles la numeración de tres dígitos simplemente para evitar evitar confusiones (094, 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla, cultivadas en la misma temporada del año y en el mismo suelo.
Figura 12. Semilla 094 Aumento 10x
Figura 13. Semilla 125 Aumento 10x
Figura 14. Semilla 287 Aumento 10x
Semilla 301 de chía ( Salvia hispánica L.) proveniente del Estado de Colima
Figura 15. Semilla 301. Aumento 10x
2.2 Reactivos y materiales.
Estándares de polifenoles grado HPLC: Ácido ferúlico, Ácido vainillinico, Ácido Ácido trans-cinámico, Ácido p-cumárico, Ácido gálico, Ácido cafeico, Ácido clorogénico, Miricetina, Quercetina, Kaempferol (Sigma-aldrich). Solución reguladora Na 2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS) (Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Ácido 6-hidroxi-2, 3, 7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (TROLOX) (Sigmaaldrich).
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2.3 DESARROLLO EXPERIMENTAL. En la Figura 16, se muestra el diseño experimental que se seguirá para el desarrollo de esta investigación.
´ ´
´ ´
´
´
´
´
II).- ELECTROFORESIS CAPILAR.
Figura 16. Desarrollo experimental.
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2.4 Equipo
Balanza analítica, marca Sartorius, modelo H110.
Balanza analítica, marca Mettler-Toledo, modelo PB5001.
Bomba de vacío, marca Welch, Welch , Modelo GEM 1.0,
Cartuchos Diol SEP-PACK, marca Waters.
Espectrofotómetro con longitud de onda visible, marca Perkin Elmer.
Evaporador rotatorio, marca Yamato modelo BM100.
Sonicador, marca Sonic modelo 200.
Sistema de electroforesis capilar P/ACE™ capilar P/ACE™ marca MDQ Beckman-Coulter.
3. MÉTODOS 3.1 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: Se determina por el método Kjeldahl, la muestra se digirió en ácido sulfúrico concentrado con un catalizador, el nitrógeno se convierte en sulfato de amonio. Se agrega hidróxido de sodio concentrado para liberar amoníaco, que se destila en ácido estandarizado para su cuantificación por titulación. (AOAC 2.057, 1990). El contenido de proteína se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación:
protei na % proteina
(V )( N )(0.014 014 )( f ) ( w)
(100 100 )
Dónde: V = Volumen gastado de HCl en la titulación. N = Normalidad del HCl. 14 = Equivalente-gramo del nitrógeno. w = Peso de muestra en gramos. g ramos. f = Factor proteico (6.25). El contenido de proteína puede representarse en gramos por 100g de muestra, g/100g.
34
3.2 DETERMINACIÓN DE HUMEDAD: (A.O.A.C. 14.003, 1990). El contenido de humedad, se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final, de una muestra representativa sometida a una temperatura de 130º C.
3.3 DETERMINACIÓN DE FIBRA: se determinó el contenido de fibra cruda de acuerdo al método oficial de la l a A.O.A.C 962.09 el cual se basa en la pérdida de masa que corresponde a la incineración del residuo orgánico que queda después de la digestión con soluciones de ácido sulfúrico e hidróxido de sodio en condiciones específicas.
3.4 DETERMINACIÓN DE CENIZAS: Se utilizó el método de calcinación en mufla a 500º C (A.O.A.C. 14.006, 1990). 1990). El contenido de cenizas cenizas se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación:
%cenizas
CC C w
(100)
Dónde; CC = peso inicial de la muestra. C = peso final de la muestra. muestra. w = peso de la muestra.
3.5 DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS: Se emplea el método de Soxhlet (A.O.A.C. 7.062), utilizando éter de petróleo anhidro como disolvente. Se emplea la siguiente ecuación para el cálculo de grasa:
% lípidosB.S. = ( a – b) X 100 m Dónde: a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada envuelta en papel filtro. b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante. m = peso de la muestra seca en gramos.
35
3.6 DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS: Los carbohidratos totales se calculan por diferencia de porcentaje de humedad, proteína, lípidos, cenizas y fibra (BlancoMetzler et al . 2009). El contenido de carbohidratos totales se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación: %carbohidratos totales = 100- (% humedad + % proteína + % grasa + % cenizas + % fibra)
3.7 EXTRACCIÓN DEL ACEITE DE CHÍA (García et al. 2003). Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chía mediante equipo Soxhlet, empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas. Los parámetros de extracción fueron: temperatura 45 ± 2ºC y flujo de disolvente de 30 gotas por minuto. La mezcla hexano-aceite se destiló a presión reducida en un evaporador rotatorio a 45 ºC, para obtener el aceite crudo, el cual se envasó en frascos de vidrio ámbar con rosca y se almacenó a 0º C bajo atmósfera de nitrógeno hasta su posterior evaluación.
3.8 EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS DE LA SEMILLA DE CHÍA (Reyes et al . 2007). Una masa de 10 g de harina de chía desengrasada se mezcló con 100 mL de etanol a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitación mecánica. La mezcla fue centrifugada a 2500 g durante 15 min. El sobrenadante se evaporó a 40 ° C en un evaporador rotatorio de vacío. El residuo seco se redisolvió con 15 mL de etanol.
3.9 EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHÍA. (Carrasco-Pancorbo et al. 2006). Cada muestra de aceite (10 g) se disolvió en 10 mL de hexano y se hicieron pasar sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de 1mL/min, posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
36
para eluir la fracción no polar del aceite, finalmente se eluyó la fracción polar (polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de metanol y posteriormente se llevó a sequedad en evaporador rotatorio al vacío a 45ºC y el residuo seco se redisolvió en 2 mL de metanol.
3.10 DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi, 1965). El método original de Folin – Folin – Ciocalteau se desarrolló en 1927, en la cual la oxidación de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reacción coloreada a λmáx a 745 – 745 – 750 nm: Na2WO4 NaMoO Mo VI amarillo
fenol
e
Mo V
MoW 11O40
4
azul
Este método es simple, sensible y preciso. Sin embargo, la reacción es lenta a un pH ácido, por lo que pierde especificidad. Singleton y Rossi (1965) mejoraron el método con un reactivo heteropolianiónico molibdotungstofosfórico que reduce los fenoles de forma más específica; específica; la λ máx para el producto es 765 nm: 3H 2O
P 2O5
13WO3
5MoO3
10H 2O
3H 2O
P 2O5
14WO3
4MoO3
10H 2O
Obtención de la curva tipo. Se prepararon soluciones de 100, 200, 300, 400 y 500 mg/L de ácido gálico o tánico. En los tubos de ensaye se adicionaron 100
L de cada una de las soluciones
anteriores, 100μL de agua desionizada, 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 0.8 mL de una de solución de carbonato de sodio al 7.5 %. Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes de tomar la lectura en el espectrofotómetro a 760 nm.
37
Tratamiento de la muestra. En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada, 100 μL μL de muestra, 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 0.8 mL de una solución de carbonato de sodio al 7.5%. Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotómetro, se interpoló en la curva tipo y se expresó el contenido de fenoles totales totales como como equivalente de ácido gálico (GAE) en mg por g de muestra.
3.11 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHÍA: MÉTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al . 2003). La actividad antioxidante se determinó usando el radical ABTS la generación del ABTS°+, se llevó a cabo con la producción del cromóforo azul/verde ABTS °+, a través de la reacción entre el ABTS y persulfato de amonio. El ABTS se disolvió en agua desionizada a una concentración 7 mM. El catión del radical ABTS (ABTS °+) se produjo haciendo reaccionar la solución stock de ABTS con persulfato de amonio 2.45 mM en una relación 1:1 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a temperatura ambiente (20°C) 16 horas antes de su uso. Posteriormente se realizó una dilución del ABTS •+ con etanol, para obtener una absorbancia de 0.700 ± 0.020 a 734 nm, la cual fue de 1:60. Para la reacción con las soluciones estándar Trolox ® y los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 µL de muestra con 1980 µL de ABTS•+ y se tomó la absorbancia después de 6 minutos.
3.12 ANÁLISIS DE COMPUESTOS ELECTROFORESIS CAPILAR.
POLIFENÓLICOS
MEDIANTE
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar equipado con un detector UV-Vis. El software 32 Karat se utilizó para el control instrumental y análisis de datos. Las separaciones se realizaron con un capilar de sílice fundida con una longitud total de 51.9 cm (41.7 cm al detector) de 50 µm de diámetro interno.
38
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separación lavándolos con hidróxido de sodio 0.1 M durante 2 min, agua desionizada durante 2 min, y luego con el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar. Después del último análisis de cada día, los capilares se lavaron con hidróxido de sodio 0.1 M durante 2 min, min, y finalmente con agua desionizada (10 min). Los estándares se disolvieron en etanol al 80 % a excepción de la miricetina, quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 % en etanol. Todos los estándares fueron preparados a una concentración de 1000 ppm.
Los extractos de las muestras de aceite de chía y fracción desgrasada de semilla de chía fueron analizadas bajo las siguientes condiciones óptimas de análisis encontradas experimentalmente. Concentración de regulador de pH: 50mM de Na 2B4O7.10H2O pH: 9.4 (ajustado con NaOH 0.1N) Voltaje: 28 kV. Inyección de muestra: 0.5 psi durante 5 s. Temperatura de análisis: 22ºC. Longitud total de capilar: 51.9 cm. Longitud efectiva: 41.7 cm Diámetro interno: 50 µm. Longitud de onda: 200 nm.
39
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 4.1 ANÁLISIS PROXIMAL El análisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chía se presentan en el Cuadro 5, se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el tipo de semilla, sin embargo, en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra, siendo 20.71 % el valor más bajo lo cual la convierte en un alimento con alto contenido de fibra.
Cuadro 5. Análisis proximal de la semilla de chía. MUESTRA
a
SEMILLA SEMILL A 094
HUMEDAD % 5.84±0.1
LÍPIDOS a % 30.36±1.6
PROTEÍNA a % 21.98±1.91
CARBOHIDRATOS a % 16.40±0.5
FIBRA a % 20.71±0.4
CENIZA a % 4.09±0.1
SEMILLA SEMILL A 125
5.56±0.1
30.20±1.4
19.84±2.13
15.00±0.9
24.55±0.8
4.45±0.1
SEMILLA SEMILL A 287*
5.68±0.1
30.51±1.0
22.96±2.01
12.00±0.6
24.45±0.3
4.20±0.1
SEMILLA SEMILL A 301
6.56±0.1
32.41±0.7
20.83±0.98
10.50±1.6
25.51±0.7
3.92±0.1
Valores expresados en base húmeda por triplicado con desviación estándar.
De igual manera, el elevado contenido de lípidos 30-32 % la convierte en una de las semillas con más contenido de lípidos y según estudios realizados por Ayerza, la semilla de chía es la fuente natural más rica en ácidos grasos omega-3 comparada con el aceite de menhaden (especie de róbalo) y de algas; al mismo tiempo el aceite obtenido de la semilla de chía no tiene ni produce olor a pescado por lo que el consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chía no necesitan un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de sabor como sucede en los productos ricos en omega 3, provenientes de pescado, para prevenir incluso, los menores cambios ocasionados por el medio ambiente. Su contenido elevado de proteínas 19-23 % la convierten en una opción viable para satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteína en comparación con productos cárnicos como la carne de res la cual a pesar de tener aproximadamente el mismo contenido proteínico que la chía, es de mayor valor económico.
40
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha determinado que la mayoría de estos forman mucílagos, los cuales se sugiere que pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estómago se forma un gel el cual disminuye la conversión de azúcares y esto produce una sensación de saciedad durante más tiempo.
4.2 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES T OTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHÍA. En la Figura 17, se presenta la curva tipo que se utilizó para la cuantificación de compuestos fenólicos totales, o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4 muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chía, tomando como referencia ácido gálico. 2
y = 0.0033x + 0.1116 R² = 0.9966
1.8 1.6 1.4 1.2
m n 5 1 6 7 A0.8
0.6 0.4 0.2 0 0
100
200
300 Ácido gálico mg/L.
400
500
600
Figura 17. Curva tipo de ácido gálico. Los resultados de la cuantificación de compuestos fenólicos de los extractos de semilla y aceite de chía estudiadas estudiadas se muestran muestran en el Cuadro 6 expresados como mg equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100 gramos de muestra.
41
Cuadro 6. Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chía. Fracción de semilla mg desengrasada gálico/100 muestraa
a
ácido g
Semilla 094*
1104.71±6.05
Aceite de chía mg ácido extraído de la semilla gálico/100 g a muestra 5.92±0.42 Aceite de chía prensado en frío Aceite 094* 11.49±0.53
Semilla125*
854.29±5.82
Aceite 125*
2.47±0.13
Semilla287*
1052.61±3.36
Aceite 287*
3.80±0.23
Semilla301*
1091.34±13.33
Aceite 301*
5.21±0.23
Valores expresados en base húmeda. * Análisis realizado por triplicado.
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenólicos que contiene el aceite extraído de la semilla de chía y la fracción desengrasada de la misma semilla, esto se pensó en un principio que era posiblemente causado por el método de extracción del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenólicos no son solubles en disolventes no-polares se consideró que la cantidad que pudiera existir de polifenoles en la semilla se quedarían en la fracción desengrasada y no en el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras. Sin embargo, para descartar o comprobar lo anterior, se adquirió aceite comercial de chía el cual se obtiene por “prensado en frío” de acuerdo a especificaciones del fabricante, y los resultados obtenidos mostraron que el método de extracción del aceite no influye en esta determinación de fenoles totales y que todas las muestras de aceite de chía obtenido por extracción con disolvente están en el mismo orden de contenido de fenoles totales en comparación con el aceite de chía obtenido por prensado en frio. Independientemente de qué cantidad de compuestos fenólicos existen en el aceite y la semilla de chía desengrasada, sí se puede observar que existen valores desde 854.29 GAE hasta los 1104.71 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chía lo cual indica que posiblemente y de ser necesario se podría distinguir una variedad de otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales.
42
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et al en 2009 y su comparación con las diferentes muestras de aceite de chía, es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chía (Figura 18), a excepción de una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo, esta diferencia es probablemente debido al tipo tipo de la semilla y no por el método método de obtención del aceite.
20 a r t s e u m g 0 0 1 / o c i l á g o d i c á g m
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
Figura 18. Fenoles totales en el aceite de chía y aceite de olivo.
Respecto a la cantidad de compuestos fenólicos presentes en la semilla de chía desengrasada puede observarse que, al ser comparados estos resultados con diferentes muestras de cereales (quinua, kañiwa) y amaranto se pone en evidencia la cantidad de polifenoles que contiene la chía, que va desde los 904.01 hasta 1172.72 GAE/100 g, mientras que los cereales de origen andino sólo llegan a alcanzar los 159.02 mg GAE/100 g en el caso de la quinua (Figura 19).
43
Al ser comparada la semilla de chía con frutos que se sabe que tienen un alto contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por García Alonso (2003), se observa que de igual forma que con los cereales, la s emilla de chía tiene una cantidad superior de compuestos fenólicos, a excepción de la muestra 125 que se encuentra en el mismo orden (900 mg ácido gálico/100 g muestra).
1400
a d e m u h a r t s e u m g 0 0 1 / o c i l á g o d i c á g m
1172.72
1200
1116.23
1167.2
985.33
1000
910
904.01
800 600 400 200
159.02
97.39 34.55
0
Figura 19. Contenido de fenoles totales de la semilla de chía desgrasada con otros frutos. Fuente: García-Alonso et al . 2003.
44
4.3 DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MÉTODO DEL ABTS. Previamente se realizó una curva tipo de Trolox como compuesto estándar, debido a su analogía con la vitamina E, las unidades en las que se realizó la curva tipo fueron: Absorbancia vs µM Trolox (Figura 20).
y = -0.0292x + 0.6899 R² = 0.9904
0.8 0.7 0.6 m0.5 n 4 3 7 0.4 A I C N0.3 A B R0.2 O S B A0.1
0 0
2
4
6
8
μM TROLOX
10
12
14
16
Figura 19. Curva tipo Trolox expresada como µM Trolox Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7.
Cuadro 7. Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chía y aceite. Semilla desengrasada
(µM Trolox/g (µmol Trolox/g a a muestra) muestra)
Aceite extraído de la semilla
(µM Trolox/g a muestra)
Semilla094 Semill a094
283.28±35.31
56.65±7.06
Aceite 094
9.67±0.79
(µmol Trolox/g a muestra) 1.93±0.16
Semilla125 Semill a125
493.67±51.12
98.73±10.22
Aceite 125
7.39±0.39
1.48±0.08
Semilla287 Semill a287
227.81±20.37
45.56±4.07
Aceite 287
6.59±0.20
1.32±0.04
Semilla301 Semill a301
361.54±19.57
72.30±3.92
Aceite 301
22.91±0.91
4.58±0.18
Aceite comercial de chía prensado
10.70±0.52
2.14±.10
a
Valores expresados en base húmeda, por triplicado.
45
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chía del presente estudio y la fracción desengrasada de la misma semilla, muestran una relación directa con el contenido total de fenoles, es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de chía muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la fracción desengrasada, estos resultados corroboran que en el aceite de chía la cantidad de compuestos fenólicos es mínima en relación con la fracción desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante, sin embargo, al igual que en la determinación de fenoles totales existen diferencias importantes de actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chía, lo cual es de interés debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos fenólicos que actúan como antioxidantes. En el Figura 21 se hace la comparación de la actividad antioxidante de las semillas de chía estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos en un estudio realizado por García-Alonso et al (2003) bajo el mismo método (ABTS). Puede observarse que la muestra de chía 125 presenta una mayor capacidad antioxidante que el resto de las muestras de chía e incluso de frutos que comúnmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza, frambuesa, manzana, granada y kiwi. Esto nos indica que al igual que en el aceite de chía, la muestra 125 proveniente del estado de Puebla, contiene un mayor poder antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo, lo cual indica que efectivamente cada muestra de semilla de chía contiene un perfil polifenólicos diferente al resto. Independientemente del distinto perfil de compuestos fenólicos que contiene cada tipo de semilla de chía analizada en el presente estudio, se puede observar que todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en antioxidantes como la frambuesa, cereza, manzana roja, granada y kiwi (Figura 21) lo cual convierte a la semilla de chía en un alimento viable para complementar la dieta diaria en antioxidantes.
46
120
98.73 100
84 a r t s e u m g / x o l o r T l o m µ
82
80
72.3
69 56.65
60
40 40
45.56 38
20 0
Figura 21. Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chía. Fuente: García-Alonso et al. 2003. 4.4 IDENTIFICACIÓN DE ELECTROFORESIS CAPILAR.
COMPUESTOS
FENÓLICOS
MEDIANTE
4.4.1 ELECCIÓN DE LAS CONDICIONES ÓPTIMAS DE ANÁLISIS. Con el objetivo de identificar los compuestos fenólicos presentes en las muestras de semilla y aceite de chía se realizó una base de datos en el equipo de electroforesis capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estándares incluyendo vainillina como estándar interno:
Vainillina
Ácido p-cumárico
Ácido tánico
Ácido vainillinico
Ácido clorogénico
Ácido cafeico
Ácido ferúlico
Ácido gálico
47
Todos los estándares utilizados fueron grado HPLC, para garantizar su pureza. El primer procedimiento fue obtener las condiciones óptimas para que el método fuera reproducible y confiable para el posterior análisis de los extractos de las muestras de aceite y de semilla de chía desgrasada. Se procedió a hacer una mezcla de todos los estándares mencionados anteriormente para lo cual se tomó 0.5 mL de una solución de 1000 mg/L de cada estándar disuelto en etanol al 80 % y se mezcló en un baño sonicador con el objetivo de mejorar la disolución de la mezcla. Las condiciones utilizadas para este análisis se muestran en el Cuadro 8.
Cuadro 8. Condiciones de análisis en electroforesis capilar. Tiempo de inyección 8 segundos Temperatura
25ºC
Presión de inyección
0.5 psi
Diámetro del capilar
75 µm
Voltaje
24 kV
Longitud del capilar
50 cm
Tiempo de análisis
30 min.
Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomó un vial y se le colocó una alícuota de la mezcla de los estándares mencionados anteriormente, sin embargo, en 3 ocasiones la corriente dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logró finalizar el análisis bajo esas condiciones, esta caída de corriente pudo ser provocada debido a la concentración de metanol que contenía la mezcla proveniente de la disolución de los estándares en dicho disolvente, por lo anterior se procedió a diluir la mezcla mezcla de estándares antes de colocarla en el vial, esta dilución se realizó con agua desionizada así como todas las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar, la dilución de la mezcla es en relación 1:1, para que de esta forma el metanol se redujera un 25% y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22).
48
También se disminuyó el tiempo de inyección de la muestra a 5 segundos en lugar de 8 segundos que tenía anteriormente, de este modo se redujo el volumen de muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar. Bajo estas condiciones se logró obtener el electroferograma de los estándares que se muestran en la Figura 22. 2
0.0775
0.0750
0.0725
0.0700
0.0675
0.0650
1.-Vainillina 2.-Ácido tánico 3.-Ácido clorogénico 4.-Ácido ferúlico 5.-Ácido p-cumárico 6.-Ácido vainillinico 7.-Ácido cafeico 8.-Ácido gálico
0.0775
0.0750
0.0725
2
0.0700
7
4
8
0.0675
0.0650
5
0.0625
0.0625
0.0600
U A
0.0600
1 3
0.0575
6
0.0575
0.0550
0.0550
0.0525
0.0525
0.0500
0.0500
0.0475
0.0475
2. 0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5. 0
5.5
6.0
1
6.5
7.0
7.5
8. 0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11. 0
Minutes
Figura 22. Electroferograma de la mezcla de 8 estándares.
Se observó que a pesar de que sólo se inyectaba una mezcla de 8 estándares, en el electroferograma se detectaban nueve señales (picos), lo cual hacía dudar de la pureza de algún estándar y por consiguiente la posibilidad de tener señales ocasionadas por dichas impurezas, para corroborar dicha hipótesis se realizó el análisis de cada estándar por separado, y efectivamente se observó que el ácido tánico era el compuesto del cual se obtenía más de una señal y en muchas ocasiones no era reproducible ninguna de esas señales. Se realizó una búsqueda bibliográfica de este compuesto en artículos que hablaban del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que este compuesto fuera utilizado como estándar, esto es probablemente por la estructura química del ácido tánico, la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos unidos a anillos aromáticos (polifenólicos) estos grupos se encuentran condensados
49
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un polímero lo cual no lo hace apto para utilizarlo como estándar en el presente trabajo. Por la razón antes mencionada se decide excluir de la lista de estándares el ácido tánico ya que no es considerado estrictamente un polifenol. Una vez determinados los estándares que se podían utilizar se procedió a realizar diferentes análisis para verificar la reproducibilidad del método. Se cambió el capilar y se procedió a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado de métodos. Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedió a realizar el ensayo de los estándares bajo diferentes condiciones. Las primeras condiciones de análisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9.
Cuadro 9. Condiciones utilizadas en el análisis electroforético. Presión de inyección
0.5 psi.
Tiempo de inyección
5 segundos
Voltaje de análisis
20 kV
Temperatura de análisis
25ºC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el comportamiento de las señales, bajo las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo problemas entre los cuales destacaron: La caída de corriente, traslape de señales,
baja
reproducibilidad,
grandes
tiempos
de
análisis
(30
min
aproximadamente). Por lo cual se consideró volver a modificar las condiciones de análisis. Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10.
50
Cuadro 10. Condiciones utilizadas en el análisis electroforético. Presión de inyección
1 psi.
Tiempo de inyección
8 segundos
Voltaje de análisis
24 kV
Temperatura de análisis
25ºC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la mayoría de los análisis la corriente se caía, esto era probablemente ocasionado por que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la corriente estable y constante. Sin embargo, con estas condiciones de análisis se logró una mejoría en el tiempo de análisis reduciéndolo de 30 min a 20 min. Esto fue provocado por el aumento de voltaje, no obstante estas condiciones no eran las óptimas para realizar análisis reproducibles. Las siguientes condiciones que se utilizaron se muestran en el Cuadro 11.
Cuadro 11. Condiciones utilizadas en el análisis electroforético. Presión de inyección
0.7 psi.
Tiempo de inyección
5 segundos
Voltaje de análisis
24 kV
Temperatura de análisis
25ºC
Las condiciones resultaron no ser las óptimas para trabajar ocasionando que la corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse, por tal motivo se decidió cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na 2B4O7.10H2O de concentración 50 mM al 7.5 % de metanol y ajustando el pH a 9.4. Al cambiar el amortiguador, las condiciones de análisis también debieron cambiar a las que se muestran en el Cuadro 12.
51
Cuadro 12. Condiciones utilizadas en el análisis electroforético. Presión de inyección
0.5 psi.
Tiempo de inyección
5 segundos
Voltaje de análisis
28.8 kV
Temperatura de análisis
25ºC
Con estas condiciones se realizó el análisis de 7 estándares, pero solo se observaron 5 señales de polifenoles, por lo cual se decidió disminuir el voltaje a 24 kV para verificar si era debido a un traslape de señales que no aparecían todas, sin embargo, tampoco se observó diferencia en el electroferograma. Para verificar si los estándares no se habían degradado se analizaron por pares para verificar que todos dieran señal. Se observó poca resolución en los análisis lo cual indicó que el problema no eran los estándares sino la concentración del regulador de pH, y se optó por disminuir la concentración del regulador a 30 mM con pH 9.4 y 7.5% de metanol. Posteriormente se procedió a realizar una mezcla de los 8 estándares siguientes:
ácido benzoico
ácido cinámico
ácido cafeico
ácido clorogénico
ácido gálico
ácido vainillinico
ácido cumárico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 28.8 kV con inyección de 0.5 psi por 5 segundos (Figura 23), observándose una buena reproducibilidad del método.
52
0.20
0.20
UV - 200nm MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PM.dat
UV - 200nm mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pm.dat
1.-Vainillina 2.-Ácido clorogénico 3.-Ácido ferúlico 4.-Ácido p-cumárico 5.-Ácido vainillinico 6.-Ácido benzoico 7.-Ácido cafeico 8.-Ácido gálico
1
0.18
0.16
0.14
5
0.12
6
0.18
0.16
0.14
0.12
1
0.10
U A
0.10
0.08
0.08
0.06
2 0.04
7
3
0.06
8
4
0.04
0.02
0.02
0.00
0.00
5. 0
5. 5
6. 0
6. 5
7. 0
7. 5
8. 0
8. 5
9. 0
9. 5
10. 0
Minutes
Figura 23. Electroferograma de la mezcla de 8 estandares. estandares. Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron análisis de pares de estos, obteniendose obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura 24). UV -200nm CAF-GAL30mM3-31-20094-13-21 PM.dat
UV -200nm cin-clor30mm3-31-20093-51-06pm.dat
UV-200nm CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21PM.d at
ácido cinámico-ácido clorogénico .
0.275
ácido caféico-ácido gálico.
0.275
0.275
0.250
0.250
0.250
0.250
0.225
0.225
0.225
0.225
0.200
0.200
0.200
0.200
0.175
0.175
0.175
0.175
0.150
0.150 A
0.150
U 0.150 A
0.125
0.125
0.125
0.125
0.100
0.100
0.100
0.100
0.075
0.075
0.075
0.075
0.050
0.050
0.050
0.050
0.025
0.025
0.025
0.025
0.000
0.000
U
0.000 1
2
3
4
5
6 Minutes
7
8
9
10
11
0.275
0.000 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Minutes
53
0.50
0.50
UV- 200nm CUM-BENZ30mM3-31-20094-29-15PM.dat
UV- 200nm cum-benz30mm3-31-20094-29-15 pm.dat
UV - 200nm CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PM.dat
ácido cumárico-ácido cumárico-á cido benzoico.
0.45
0.40
0.35
0.35
0.30
0.30
0.25
0.25
0.20
0.20
0.15
0.15
0.10
0.10
0.05
0.05
0.00
0.00 1
2
3
4
5
6
7
8
9
mezcla de seis estándares.
0.275 0.45
0.40
10
11
U A
UV - 200nm 6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pm.dat 0.275
0.250
0.250
0.225
0.225
0.200
0.200
0.175
0.175
0.150
0.150 A
0.125
0.125
0.100
0.100
0.075
0.075
0.050
0.050
0.025
0.025
U
0.000
0.000 1
2
3
4
5
6
Minutes
7
8
9
10
11
Minutes
Figura 24.-Electroferogramas de cada par de estandares. Al final se comparararon todas las señales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25).
0.250
UV - 200nm 8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PM.dat
UV - 200nm 6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pm. dat
0.225
0.200
6
0.175
0.150
0.125
0.250
1.-Vainillina 2.-Ácido clorogénico 3.-Ácido ferúlico 4.-Ácido p-cumárico 5.-Ácido vainillinico 6.-Ácido benzoico 7.-Ácido cafeico 8.-Ácido gálico
0.225
0.200
0.175
0.150
0.125
5
0.100
0.100
0.075
0.050
U A
0.075
1 2
3
7
4
8
0.050
0.025
0.025
0.000
0.000 5.5
6. 0
6.5
7.0
7. 5
8.0
8. 5
9. 0
9. 5
1 0. 0
1 0. 5
Minutes
Figura 25. Electroferograma de comparación de 8 estándares. e stándares. Posteriormente una vez que ya se había obtenido el método adecuado para hacer el análisis de fenoles mediante electroforesis capilar, se procedió a analizar una muestra comercial de aceite de chía para observar el perfil polifenólico que este mostraba (Figura 26).
54
. a í h c e d l a i c r e m o c e d e t i e c a e d o t c a r t x e e d a m a r g o r e f o r t c e l E . 6 2 a r u g i F
55
Las condiciones utilizadas para este análisis se muestran en el Cuadro 13.
Cuadro 13. Condiciones utilizadas en el análisis electroforético. Presión de inyección 0.5 psi. Tiempo de inyección
5 segundos
Voltaje de análisis Temperatura análisis Amortiguador
24 kV
de
25ºC 30 mM de Na 2B4O7.10H2O con 7.5% de metanol ajustado a pH 9.4
Se puede observar que en cada análisis que se le realizó al extracto, los resultados no fueron reproducibles, en el primer análisis se observa un par de sañales a los 4 min aproximadamente y una señal más alrededor de los 18 min, pero en el segundo análisis la señal de los 18 min se recorrió hasta los 27 min aproximadamente. Posteriormente en el tercer y cuarto análisis ya no aparece esa señal, al comparar los 4 análisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos. Analizando los resultados obtenidos se observó que bajo las condiciones antes mencionadas no era reproducible el método por lo cual no se lograba identificar los compuestos, no obstante se observan señales de compuestos fenólicos lo cual indica que el aceite de chía sí contenía compuestos fenólicos, sin embargo, se necesitaba establecer las condiciones para que el método fuera reproducible y pudieran obtenerse conclusiones, por lo cual se volvió a trabajar con los estándares bajo ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el método. En esta ocasión se modificó el diámetro interno del capilar de 75 a 50 µm y la concentración del regulador a 45 mM a pH 9.3 sin metanol, otro factor que se tomó en cuenta fue la temperatura de análisis la cual siempre había sido a 25ºC y en esta ocasión se redujo a 22ºC, el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyección de muestra fue de 0.5 psi durante 8 segundos, la longitud efectiva del capilar fue de 45 cm, mientras que la longitud total fue de 55.3 cm.
56
Se realizaron ensayos por pares de estándares para observar si no existía un traslape entre alguno de ellos, la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el momento, aunque sí existía un traslape de dos señales. Se determinó que el estándar que se traslapaba era el ácido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla ya que inicialmente inicialmente se decidió incluirlo en la muestra como estándar interno pero este se remplazó por vainillina, por tal razón se decidió quitarlo de la mezcla para evitar que las señales se traslaparan. Al final se analizaron an alizaron los 8 estándares solubles en agua; ácido cinámico, ciná mico, ácido transcinámico, ácido cafeico, ácido gálico, ácido vainillinico, ácido clorogénico, ácido cumárico y vainillina como estándar interno. Las condiciones óptimas que se encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro 14.
Cuadro 14. Condiciones óptimas encontradas electroforesis capilar. Tiempo de inyección 5 seg Temperatura
experimentalmente
Presión de inyección
0.5 psi Longitud efectiva del capilar
Voltaje
30 kV
Tiempo de análisis
Longitud total del capilar
30 min. Regulador de Na2B4O7
en
22ºC 40 cm 50 cm 45 mM pH 8.8
Una vez establecidas las condiciones se procedió a realizar el ensayo de la mezcla de los 8 estándares para obtener sus tiempos de migración y evaluar la repetibilidad del método para lo cual se calculó el coeficiente de variación (C.V) según la siguiente fórmula:
C. V=
X 100
57
En el Cuadro 15, se observan los tiempos de migración que se obtuvieron de cada uno de los 8 estándares (picos) y su desviación estándar durante los cuatro ensayos que se realizaron. El coeficiente de variación no debía ser mayor al 3% que es lo deseable en cualquier método analítico.
Cuadro 15. Tiempos de migración de cada estándar.
corrida 1 corrida 2 corrida 3 corrida 4 MEDIA STD C.V (%)
Tiempos de migración (min) tµ3 tµ4 tµ5
tµ1
tµ2
tµ6
tµ7
tµ8
5.34
5.53
5.74
5.84
6.38
6.63
9.92
10.83
5.41
5.6
5.82
5.94
6.51
6.77
9.99
11.03
5.43
5.63
5.85
5.96
6.53
6.8
10.23
11.18
5.58 5.44 0.0875 1.61
5.79 5.64 0.0952 1.69
6.01 5.86 0.0981 1.68
6.11 5.96 0.0965 1.62
6.7 6.53 0.1138 1.74
6.98 6.80 0.1246 1.83
10.67 10.20 0.2934 0.2934 2.88
11.69 11.18 0.3182 2.85
C.V: coeficiente de variación, tµ: tiempo de migración, STD: desviación estándar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron útiles en la separación de los 8 estándares de polifenoles mencionados anteriormente, sin embargo se lograron adquirir 3 estándares nuevos de polifenoles los cuales fueron: miricetina, quercetina y kaempferol. Debido a este cambio, fue necesario hacer un análisis de cada uno de los 11 estándares. Cada uno de los 11 estándares fue analizado individualmente y se hizo un barrido de cada estándar con un detector de arreglo de diodos (DAD), para obtener su espectro de absorción (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificación de los compuestos fenólicos.
58
40
40
5.66 Min 10STDnuevos
40
40
5.87 Min 10STDnuevos
35
35
35
35
30
30
30
30
25
25
25
25
20
20
20
20
15
U A m
U A m
15
15
15
10
10
10
5
0
VAINILLINA
-5
5
5
5
0
0
0
-5
-5
200
2 20
240
26 0
280
300
32 0
340
360
380
400
42 0
10
AC TRANS-CINÁMICO
440
-5
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
nm
nm
180
6.60Min AC CLOROGENICO500ppm
80
80
70
70
180
8.83Min AC p-CUMARICO500ppm
160
160
AC P-CUM P-CUM RICO RICO
140 60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
AC CLOROGÉNICO
0
140
120
120
100
100
U A m
U A m
0
80
80
60
60
40
40
20
20
0 2 00
22 0
2 40
2 60
2 80
3 00
3 20
3 40
3 60
3 80
4 00
4 20
44 0
0
200
220
240
260
280
300
nm
320
340
3 60
380
400
420
440
nm
40
180
40
6.84Min 10STDnuevos
180
7.62Min AC FERULICO500ppm
35
35
160
160
30
30
140
140
25
25
120
120
20
20
100
100
U A m
U A m
15
15
80
80
10
10
60
60
5
40
40
0
20
5
0
AC VAINILLÍNICO
-5
-5
2 00
220
2 40
2 60
2 80
3 00
3 20 nm
34 0
36 0
380
40 0
4 20
44 0
AC FERÚLICO
20
0
0
200
220
2 40
260
280
300
320
340
360
380
40 0
420
440
nm
59
100
100
11.25Min ACC AFEICO500ppm
90
90
80
80
70
70
45
40
40
35
35
30
30
25
25
20
60
50
U 50 A m
40
40
20
30
30
15
20
20
10
10
5
0
0
AC CAFÉICO
10
0 220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
50
45
60
200
13.36Min AC GALICO500ppm
50
AC GÁLICO
U A m
15
10
5
0
440
200
220
240
260
280
300
320
nm
340
360
380
400
420
440
nm
9.11Min QUERCETINA500ppm
7.88Min KAEMPFEROL500ppm
130
50
130
50
45
45
40
40
35
35
120
120
110
110
100
100
90 U A m
30
90
80
80
KAEMPFEROL
30
25
25
20
20
QUERCETINA
15
70
70
60
60
50
50
40
40
15
30 200
220
240
260
U A m
280
300
320
340
360
380
4 00
4 20
44 0
30
200
220
2 40
260
280
300
320
nm
3 40
360
380
400
4 20
440
nm
8.68 Min MIRICETINA500ppm
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
MIRICETINA
0
200
2 20
240
260
280
300
3 20
3 40
U A m
0
360
380
400
420
440
nm
Figura 27.-Espectros de absorción de cada estándar estudiado.
60
Las condiciones óptimas de separación de los estándares fueron determinadas después de hacer distintas pruebas en la concentración del regulador a 50, 52.5, 55, 60 y 70 mM de Na 2B4O7.10H2O, con pH fijo de 9.4, e inyección de 0.5 psi durante 5 segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ºC los electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28. 0.12
PDA - 200nm 10STD50mM
PDA - 200nm 10std52.5mm
PDA - 200nm 10std55mm
PDA - 200nm 10std60mm
PDA - 200nm 10std70mm
0.12
70 mM
0.10
0.08
0.10
0.08
60 mM
0.06
0.06
55 mM 0.04
0.04
52.5 mM
0.02
0.02
50 mM
0.00
0.00
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Minutes
Figura 28. Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador. Como se puede observar en la Figura 28 sólo los electroferogramas con concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las señales de los 11 componentes de la mezcla, mientras que a más altas concentraciones del regulador solo pueden verse 10 señales, lo que indica que dos señales de los estándares se encuentran traslapadas.
61
U A
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y Perlin, 1963), por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentración de los boratos Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos, especialmente a los que se encuentran entre los 9 y 10 min. La concentración adecuada del regulador resultó ser 50 mM debido a que se obtuvo una buena separación de los 11 estándares, y mostró una buena reproducibilidad a diferencia de las demás concentraciones en las que existían señales que se traslapaban, lo cual era indeseable. Las condiciones óptimas de análisis se muestran en el Cuadro 16.
Cuadro 16. Condiciones óptimas de análisis halladas experimentalmente. Tiempo de inyección
5 seg
Temperatura
Presión de inyección
0.5 psi
Longitud efectiva del capilar
41.7 cm
Voltaje
28 kV
Longitud total del capilar
51.9 cm
Tiempo de análisis
30 min. Regulador de Na2B4O7
22ºC
50 mM pH 9.4
Una vez establecidas las condiciones óptimas de análisis se procedió a realizar una mezcla de todos los estándares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron 0.5 mL de cada estándar y se mezcló en un sonicador para mejorar la disolución de la mezcla. La mezcla se realizó con soluciones de 1000 mg/L de cada estándar disuelto en etanol al 80%, a excepción de miricetina, quercetina y kaempferol los cuales se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% en etanol. Los análisis fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16.
62
El electroferograma de la mezcla de los 11 estándares se muestra en la Figura 29.
0.055
0.055
1.-Vainillina 2.-Ácido trans-ciná tr ans-cinámico mico 3.-Ácido clorogénico 4.-Ácido ferúlico 5.-Kaempferol 6.-Miricetina 7.-Ácido p-cumárico 8.-Ácido vainillinico 9.-Quercetina 10.-Ácido cafeico 11.-Ácido gálico
0.050
5 0.045
2 0.040
6
0.035
0.050
0.045
0.040
0.035
U A
4
1
0.025
9
8
0.030
11
10
7
0.030
0.025
3
0.020
0.020
0.015
0.015
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 29. Electroferograma Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migración de los 11 estándares. Cada uno de los 11 estándares fue identificado mediante su espectro de absorción (previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo diodos) y comparándolos en la mezcla analizada gracias a una función con la que cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la señal (pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo, nos muestra el espectro de absorción (Figura 30), de esa especie que previamente se analizó individualmente y de esta forma se identifica el compuesto además junto con la información del tiempo de migración de cada uno de los estándares que se muestran en el Cuadro 17.
63
Figura 30. Espectros de absorción obtenidos mediante detector de arreglo de diodos.
Cuadro 17. Tiempos de migración de cada ca da estándar.
Estándar
Tiempo de migración
Estándar
Tiempo de migración
Vainillina
5.99 min
Ac p-cumárico
8.83 min
Ac trans-cinámico
6.32 min
Ac vainillinico
9.03 min
Ácido clorogénico
6.60 min
Quercetina
9.11 min
Ácido ferúlico
7.57 min
Ácido cafeico
11.30 min
Kaempferol
7.87 min
Ácido gálico
13.37 min
Miricetina
8.68 min
64
4.4.2 ANÁLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHÍA Una vez establecida la base de datos de polifenoles, y las condiciones óptimas se procedió a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla de chía para identificar los posibles compuestos fenólicos. En primer lugar se analizó el aceite comercial de chía, el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por prensado en frío, el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31. Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuación fueron obtenidos bajo las condiciones óptimas mencionadas en el cuadro 16.
0.056
0.056
0.054
0.054
0.052
0.052
0.050
0.050
0.048
0.048
0.046
0.046
0.044
0.044
0.042
0.042
0.040
0.040
0.038
0.038
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 12
13 13
14 14
15 15
16 16
17
U A
18 18
Minutes
Figura 31. Electroferograma del aceite comercial de chía. Las señales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ningún tiempo de migración de alguno de los 11 estándares utilizados. La muestra de aceite 094 mostró señales de posibles compuestos fenólicos (Figura 32) debido a su tiempo parecido de migración, en específico ácido clorogénico y ácido gálico, por lo cual se decidió añadir una alícuota de 5 µL de solución de cada estándar de 1000 ppm, para poder confirmar o descartar la presencia de estos
65
compuestos fenólicos (un aumento de la intensidad de esa señal indicaría la presencia de dicho compuesto) (Figura 33). 0.06
0.06
0.05
0.05
0.04
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00
U A
0.00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 11
12
13 13
14
15 15
16
17 17
18
Minutes
Figura 32. Electroferograma del aceite 094.
PDA- 200nm
0.055
0.055
0.050
0.050
0.045
0.045
Ácido clorogénico
0.040
Ácido gálico
0.040
0.035
0.035
Compuesto no identificado
0.030
0.030
0.025
0.025
0.020
0.020
0.015
0.015
0.010
0.010
0.005
0.005
0.000
U A
0.000
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Minutes
Figura 33. Electroferograma del aceite 094 añadiendo estándares. Sin embargo, como puede observarse, los estándares añadidos no corresponden con el tiempo de migración de la señales de la muestra de aceite, lo cual indica que dicha muestra de aceite no contiene ningún compuesto fenólico de los utilizados en este trabajo.
66
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechó que podía contener kaempferol debido a la señal que se obtuvo alrededor de los 9 min, por lo cual se añadió una alícuota de la solución de estándar de kaempferol para confirmar o descartar su presencia (Figura 35). 0.06
0.06
0.05
0.05
0.04
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00
U A
0.00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 11
12
13 13
14
15 15
16
17 17
18
Minutes
Figura 34. Electroferograma del aceite 125.
PDA- 200nm
0.11
0.11
Kaempferol
0.10
0.10
0.09
0.09
0.08
0.08
0.07
0.07
0.06
0.06
0.05
0.05
Compuesto no identificado
0.04
U A
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00
0.00
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Minutes
Figura 35. Electroferograma del aceite 125 más estándares añadidos. Al añadirle la alícuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho compuesto en la muestra debido a que no coincidió con el tiempo de migración de la muestra.
67
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125, mostraron una señal alrededor de los 9 min, indicando posiblemente la presencia de kaempferol, por lo cual se procedió de igual forma a añadir una alícuota de dicho compuesto (Figura 37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad. 0.055
0.055
0.050
0.050
0.045
0.045
0.040
0.040
0.035
0.035
0.030
0.030
0.025
0.025
0.020
0.020
0.015
0.015
0.010
0.010
0.005
0.005
0.000
U A
0.000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 11
12
13 13
14
15 15
16
17 17
18
Minutes
Figura 36. Electroferograma del aceite 287
PDA- 200nm
0.11
0.11
0.10
0.10
Kaem Kaem fero feroll
0.09
0.09
0.08
0.08
0.07
0.07
0.06
0.06
Compuesto no identificado
0.05
U A
0.05
0.04
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00
0.00
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Minutes
Figura 37. Electroferograma del aceite 287 más estándares añadidos. Al igual que la muestra 125 de aceite, se descartó la presencia de kaempferol en esta muestra debido a que no coincidió el tiempo de migración con el de la muestra de aceite.
68
De igual forma se analizó la muestra de aceite 301, (Figura 38) sin embargo a pesar de que efectivamente se observaron señales, todas estas no coincidieron con ningún tiempo de migración de alguno de los 11 estándares utilizados en el presente trabajo. 0.055
0.055
0.050
0.050
0.045
0.045
0.040
0.040
0.035
0.035
0.030
0.030
0.025
0.025
0.020
0.020
0.015
0.015
0.010
0.010
0.005
0.005
0.000
U A
0.000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 11
12 12
13 13
14
15 15
16 16
17 17
18
Minutes
Figura 38. Electroferograma del aceite 301. 5.4.3 ANÁLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHÍA De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chía desengrasada en el equipo de electroforesis capilar, en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron detectados probablemente 6 compuestos fenólicos, los cuales podían ser; ácido trans-cinámico, ácido clorogénico, ácido ferúlico, kaempferol, ácido gálico y ácido cafeico. El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostró señales de posibles compuestos fenólicos que debido a su tiempo de migración podían ser; ácido trans-cinámico, ácido clorogénico, kaempferol, ácido cafeico y ácido gálico. En el extracto de la semilla 287 (Figura 41), se detectaron compuestos que posiblemente podían ser; ácido trans-cinámico y ácido clorogénico.
69
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las señales de posibles compuestos fenólicos como el ácido trans-cinámico, ácido clorogénico, ácido ferúlico, kaempferol, ácido cafeico y ácido gálico. 0.12
0.12
0.10
0.10
0.08
0.08
0.06
0.06
0.04
0.04
0.02
0.02
0.00
U A
0.00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 11 1
12
1 13 3
14
1 15 5
16
1 17 7
18
Minutes
Figura 39. Electroferograma de la semilla 094
0.20
0.20
0.18
0.18
0.16
0.16
0.14
0.14
0.12
0.12
0.10
0.10
0.08
0.08
0.06
0.06
0.04
0.04
0.02
0.02
0.00
U A
0.00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 11
12
13 13
14
15 15
16
17 17
18
Minutes
Figura 40. Electroferograma de la semilla 125
70
0.10
0.10
0.09
0.09
0.08
0.08
0.07
0.07
0.06
0.06
0.05
0.05
0.04
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00
0.00
-0.01
U A
-0.01
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 11
12
13 13
14
15 15
16
17 17
18
Minutes
Figura 41. Electroferograma de la semilla 287.
0.11
0.11
0.10
0.10
0.09
0.09
0.08
0.08
0.07
0.07
0.06
0.06 U A
0.05
0.05
0.04
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00
0.00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 11 1
12
1 13 3
14
1 15 5
16
1 17 7
18
Minutes
Figura 42. Electroferograma de la semilla 301.
71
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenólicos en los extractos de semilla, se decidió añadir una alícuota de 5 µL de cada estándar del cual se sospechaba su presencia en la muestra, esto se decidió realizar debido a que los tiempos de migración de las muestras sufrieron un corrimiento en comparación con la mezcla de estándares, esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser inyectada en el equipo de electroforesis capilar. Debido a este fenómeno las señales sufrieron un desplazamiento del orden de segundos, por lo cual fue necesario poder confirmar con la adición del estándar del cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la señal se confirmaba de ese modo la presencia de dicho compuesto. Al extracto de la semilla 094 se le añadió ácido ácido trans-cinámico y ácido cafeico. ca feico. Al extracto de la semilla 125 se le añadió ácido ácido gálico y ácido clorogénico. Al extracto de la semilla 287 se le añadió kaempferol kaempferol.. Al extracto de la semilla 301 se le añadió ácido ácido ferúlico. Así de esta forma se logró confirmar o descartar los compuestos fenólicos que se sospechaba su presencia en cada tipo de semilla, debido a que los estándares al estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma. En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar ácido trans-cinámico, ácido clorogénico y ácido cafeico. Estos compuestos lograron identificarse mediante la superposición de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chía que previamente se le añadieron estándares.
72
0.20
0.20
PD A - 200n m
P D A - 200 n m
Ácido clorogénico
Ácido cafeico
0.18
0.18
Ac trans-cinámi t rans-cinámico co 0.16
0.16
0.14
0.14
0.12
0.12
0.10
0.10
2
0.08
U A
0.08
0.06
0.06
3
0.04
0.04
0.02
0.02
0.00
0.00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 11
12
13 13
14
15 15
16
17 17
18
Minutes
1.-extracto sin estándares añadidos. 2.-extracto con ácido cafeico y ácido transcinámico añadidos. 3.-extracto con ácido clorogénico añadido. Figura 43. Electroferograma de semilla 094 con estándares añadidos.
73
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar ácido trans-cinámico y ácido clorogénico de la misma forma anteriormente mencionada. PD A - 200nm
PD A - 200n m
0.18
0.16
0.18
Ac trans-cinámico co 0.16
Ácido clorogénico 0.14
0.14
0.12
0.12
0.10
0.10
U A
2
0.08
0.08
3
0.06
0.06
0.04
0.04
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Minutes
1.-extracto sin estándares añadidos. 2.-extracto con ácido clorogénico añadido. 3.extracto con ácido trans-cinámico añadido. Figura 44. Electroferograma de semilla 125 con estándares añadidos.
74
En la semilla 287 (Figura 45) se detectó ácido trans-cinámico y ácido clorogénico. PD A - 2 00 n m
PD A - 2 00 n m
0.10
0.10
0.09
0.09
Ácido clorogénico
0.08
0.08
Ac trans-cinámi t rans-cinámico co
0.07
0.07
0.06
0.06
0.05
0.05
0.04
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00
0.00
U A
-0.01
-0.01
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Minutes
1.-extracto sin estándares añadidos. 2.-extracto con ácido trans-cinámico añadido. 3.-extracto con ácido clorogénico añadido. Figura 45. Electroferograma de semilla 287 con estándares añadidos.
75
En la semilla de chía 301 se identificó ácido trans-cinámico y ácido gálico (Figura 46). PDA - 200n m
PDA - 200n m
Acido gálico
0.14
0.14
Ac trans-cinámi t rans-cinámico co 0.12
0.12
0.10
0.10
0.08
0.08
U A
2
0.06
0.06
0.04
0.04
0.02
0.02
3
0.00
0.00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 11
12
13 13
14
15 15
16
17 17
18
Minutes
1.-extracto sin estándares añadidos. 2.-extracto con ácido gálico añadido. 3.-extracto con ácido trans-cinámico añadido. Figura 46. Electroferograma de semilla 301 con estándares añadidos.
76
El único compuesto fenólico que fue identificado en común en las 4 muestras de semilla de chía fue el ácido trans-cinámico, y cada tipo de semilla contiene distintos compuestos fenólicos, lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el contenido de compuestos fenólicos, mostrando así que cada variedad de semilla tiene un perfil diferente de compuestos fenólicos. Al realizar r ealizar la comparación con los resultados r esultados obtenidos por Taga T aga et al en 1984, sólo se encuentra coincidencia en la presencia de ácido clorogénico compuesto que está presente en las muestras 094, 125 y 287 provenientes del estado de Puebla, y ácido cafeico que está presente en una sola muestra (094), sin embargo, es de llamar la atención que los flavonoles miricetina, quercetina y kaempferol, no fueron detectados en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio anteriormente mencionado sí se reporta la presencia de dichos polifenoles. Sin embargo, es destacable que en el estudio de comparación no indican la procedencia o variedad de semilla de chía que se estudió, lo cual es muy común en trabajos que se realizan con materiales vegetales, en los cuales no se especifica el tipo o procedencia de dicha muestra, lo cual complica una caracterización de acuerdo al tipo o variedad de semilla. En el presente trabajo se estudiaron 3 variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmó que cada variedad de semilla de chía contiene distintos compuestos fenólicos. Independientemente de los compuestos fenólicos que se identificaron en los distintos extractos, sí existen distintas señales con diferentes tiempos de migración que no coinciden con alguno de los 11 estándares utilizados en este trabajo, sin embargo es evidente que estas señales son de compuestos fenólicos de diferente naturaleza a los que se adquirieron en esta investigación. En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales, la capacidad antioxidante y los compuestos fenólicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chía.
77
Cuadro 18. Contenido de fenoles totales, capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar. MUESTRA FENOLES CAPACIDAD COMPUESTO TOTALES (mg ac ANTIOXIDANTE IDENTIFICADO gálico/100g (µM Trolox/g muestra) muestra) Semilla 1.-ácido clorogénico. 094 1104.71±6.05 283.28±35.31 2.-ácido trans-cinámico. 3.-ácido cafeico. Semilla 1.-ácido clorogénico. 125 854.29±5.82 493.67±51.12 2.-ácido gálico. 3.-ácido trans-cinámico. Semilla 1.-ácido trans-cinámico. 287 1052.61±3.36 227.81±20.37 2.-ácido clorogénico. Semilla 301
1091.34±13.33
361.54±19.57
1.-ácido gálico. 2.-ácido trans-cinámico.
Aceite comercial de chía Aceite 094
5.92±0.42
10.70±0.52
N.D.
11.49±0.53
9.67±0.79
N.D.
Aceite 125
2.47±0.13
7.39±0.39
N.D.
Aceite 287
3.80±0.23
6.59±0.20
N.D.
Aceite 301
5.21±0.23
22.91±0.91
N.D.
N.D.= No detectado. Como puede observarse en el Cuadro 6, son interesantes los valores que se presentan en los extractos de aceite de chía, debido a que al analizar los extractos, estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante, no obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron compuestos fenólicos.
78
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habían degradado al momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese momento, dichos extractos tenían 120 días de almacenamiento bajo atmósfera de nitrógeno y en frascos ámbar a 0ºC, por lo cual se decidió realizar pruebas con extractos de aceite fresco (1 día de almacenamiento) y comparar los electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 días. Los electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19.
Cuadro 19. Condiciones utilizadas en el análisis de extractos frescos de semilla y aceite de chía. Tiempo de inyección 5 seg Temperatura 22ºC Presión de inyección
0.5 psi
Longitud efectiva del capilar
41.7 cm
Voltaje
28 kV
Longitud total del capilar
51.9 cm
Tiempo de análisis
30 min. Regulador de Na2B4O7
50 mM pH 9.4
En la Figura 47 se muestran las señales del aceite 094 fresco, en el cual se observan distintas señales, y se sobrepuso la mezcla de los 11 estándares de polifenoles y logrando identificar el ácido trans-cinámico. PDA - 200nm ACEITE0941
PDA - 200nm 10std50mm
0.05
0.05
Ac trans-cinámico co 0.04
0.04
U A
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 47. Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094.
79
En la Figura 48 se muestran las señales del aceite 125 fresco, en el cual se observan distintas señales, y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estándares de polifenoles, logrando identificar el ácido trans-cinámico y el ácido cafeico, y también una señal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los estándares.
0.06
0.06
PDA- 200nm
0.05
0.05
Ac trans-cinámico trans-cinámico
Ácido cafeico
0.04
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00
0.00
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 48. Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125. En la Figura 49, se muestran las señales del aceite 287 fresco, en el cual se observan distintas señales, y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estándares de polifenoles, logrando identificar el ácido trans-cinámico, ácido clorogénico y ácido gálico, sin embargo, esta muestra de aceite contuvo más señales en comparación con las otras dos muestras de aceite previamente analizados.
80
U A
PDA- 200nm
0.055
0.055
0.050
0.050
Ac trans-cinámi t rans-cinámico co
0.045
0.045
Ac clorogénico Acido gálico
0.040
0.040
0.035
0.035
U A
0.030
0.030
0.025
0.025
0.020
0.020
0.015
0.015
0.010
0.010
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 49. Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287.
La última muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logró identificar ácido trans-cinámico, ácido clorogénico, ácido p-cumárico y quercetina, y de igual forma se obtienen señales de diferentes compuestos que no coinciden con el tiempo de migración de los 11 estándares utilizados en este trabajo. Esta muestra de aceite es la que contiene mayor número de compuestos fenólicos y con mayor concentración
81
PDA- 200nm
0.055
0.055
Ac transcinámico
0.050
0.050
AAc clorogé cl orogénico nico
0.045
0.045
Ac p-cumárico
0.040
0.040
0.035
0.035
U A
Quercetina 0.030
0.030
0.025
0.025
0.020
0.020
0.015
0.015
0.010
0.010
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 50. Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301.
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones, se observó que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenólicos (Figura 51) y también varían en la concentración de dichos compuestos, siendo el aceite 301 el que más compuestos fenólicos contuvo.
82
0.06 PDA - 200nm ACEITE0941
PDA - 200nm aceite125 3 seg1
PDA - 200nm aceite287 3 seg1
PDA - 200nm aceite fresco espectros
0.05
0.04
Aceite 301 0.03
Aceite 287 0.02
Aceite 125 0.01
Aceite 094 0.00 5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
Minutes
Figura 51. Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chía.
A pesar de que q ue en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos fenólicos, dichos extractos tenían 120 días de almacenamiento, por lo cual se decidió volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fracción desengrasada pero frescos ( de 1 día de almacenamiento), para poder comparar los resultados obtenidos con los extractos que tenían 120 días de almacenamiento y al mismo tiempo tener un estudio completo, tanto del aceite como de la fracción desengrasada de la semilla de chía.
83
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es determinante en el contenido de compuestos fenólicos, al analizar el extracto fresco de la semilla 094 se logró identificar; ácido clorogénico, ácido trans-cinámico, ácido cafeico (Figura 52). 0.06
0.06
1. Ácido cido clor clorogé ogéni nicco 2. Ácido cido trans trans-c -cin inám ámic ico o 3. Ácido cido cafe cafeic ico o 0.05
0.05
0.04
0.04
3
0.03
0.02
0.03
U A
0.02
1 0.01
2
0.01
0.00
0.00
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 52. Electroferograma Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco. fresco. En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos fenólicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada, aunque la identificación en este caso fue más sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 días, debido a que las señales se encontraron mejor definidas y esto facilitó la comparación con la base de datos de polifenoles.
84
En la semilla 125 se logró identificar; ácido trans-cinámico, ácido clorogénico, ácido ferúlico, kaempferol, miricetina, quercetina, y ácido gálico (Figura 53). 0.06
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
0.05
cido transns-cinám námico Ácido cido cl clorog orogéénic nico Ácido cido ferú ferúllico ico Kaempfe pferol Miricetina Quer uercetina Ácido gál gálico
0.06
0.05
0.04
0.04
1 0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
6
3
2
U A
7
5
0.01
4
0.00
0.00
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 53. Electroferograma Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco. fresco. En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con extractos frescos y almacenados 120 días, esta misma muestra cuando se analizó con 120 días de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (ácido trans-cinámico, ácido clorogénico y ácido gálico), mientras que en el extracto fresco se identificaron 7 compuestos fenólicos de la base de datos que tenemos de comparación.
85
En el extracto de la semilla 287 se identificaron; ácido trans-cinámico, ácido clorogénico, ácido ferúlico, kaempferol, kaempferol, miricetina, quercetina, ácido gálico (Figura (Figura 54). 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
0.06
1 0.05
Ácido cido trans trans-c -cin inám ámic ico o Ácido cido cl clorog orogéénic nico Ácido cido fer ferúlic úlico o Kaempfe pferol Miricetina Quer uercetina Ácido gál gálico
0.06
0.05
0.04
0.04
U A
0.03
0.03
7
0.02
0.01
5
3
2
0.02
6
4
0.01
0.00
0.00
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 54. Electroferograma Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco. fresco. Al igual que en la muestra 125, en la muestra 287 se detectaron los mismos compuestos fenólicos, lo cual es contrastante al compararse con el análisis del extracto con 120 días de almacenamiento, en el cual solo se logró identificar 2 compuestos fenólicos (ácido trans-cinámico y ácido clorogénico).
86
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron; ácido trans-cinámico, ácido clorogénico, ácido ferúlico, kaempferol, miricetina, miricetina, ácido ácido vainillinico,
quercetina,
ácido gálico y ácido cafeico (Figura 55). 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
0.06
0.05
0.04
Ácido tran Ácido transs-ci cinám námic ico o Ácido cido clo cloro rogé géni nicco Ácido ido fer ferúl úlic ico o Kaempfe pferol Miricetina Ácido cido vain vainil illi lini nico co Que Quercetina Ácido gál gálico ico Ácido ido cafe cafeic ico o
0.06
0.05
0.04
U A
0.03
2
0.03
8 0.02
7 3
9
5
1 4
0.01
0.02
0.01
6
0.00
0.00
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 55. Electroferograma Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco. fresco. En esta muestra fue donde se identificaron mayor número de compuestos fenólicos (9), además de ser la que mostró mayor número de señales y de mayor absorbancia, lo cual nos indica que están presentes en mayor cantidad. En el Cuadro 20 se hace la comparación de los compuestos fenólicos detectados en los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 días después de almacenados los extractos, como puede observarse, la diferencia es relevante entre el tiempo tiempo de un análisis y otro por lo cual es recomendabl recomendable e que para cualquier análisis de compuestos compuestos fenólicos se realice lo más pronto posible una vez que se hayan extraído los compuestos fenólicos de la matriz del alimento o muestra,
87
esto es debido a que dichos compuestos fenólicos al actuar como antioxidantes se oxidan después de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz, calor, y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidación.
Cuadro 20. Comparación de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 días.
M u e s t r a
) I . E ( a n i l l i n i a v
o c i a n i c s n a r t . c c á A
o c i n é g o r o l c . c c a A
o c i l ú r e f . c c a A
l o r e f p
a n i t e c i r i
e a K
o c i r á u c p . c c
A
o c i n i l l i n i a v . c c
a n i t e c r e u
A
o c í e f a c . c c a A
o c i l á g . c c a A
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco
X
aceite 125 a lmacenado
aceite 125 fresco
X
X
aceite 287 almacenado
X
X
aceite 301 fresco
X
X
semilla 094 almacenada
X
X
X
semilla 094 fresca
X
X
X
semilla 125 al macenada macenada
X
X
semilla 125 fresca
X
X
semilla 287 almacenada
X
X
semilla 287 fresca
X
X
semilla 301 al macenada macenada
X
semilla 301 fresca
X
aceite 287 fresco
X
aceite 301 a lmacenado
X
X
X X
X
X
X
X
X
X
X
X
X X
X
X
X
X
X
X
X
X
88
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales, actividad antioxidante y los compuestos fenólicos identificados mediante electroforesis capilar, podrá notarse que la fracción desgrasada de semilla de chía muestra valores muy superiores de capacidad antioxidante y fenoles totales totales al del aceite extraído de la misma, esto se relaciona con la cantidad de compuestos fenólicos identificados en la fracción desgrasada, en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos, mientras que en la fracción desgrasada se logró identificar hasta 9 compuestos fenólicos en el caso de la semilla 301.
Cuadro 21. Contenido de compuestos fenólicos en extractos de aceite y semilla frescos. o c i m á n i c s n a r t c Á
Aceite 094 fresco Aceite 125 fresco Aceite 287 fresco Aceite 301 fresco Semilla 094 fresca Semilla 125 fresco Semilla 287 fresca Semilla 301 fresca
o c i n é g o r o l c c Á
l o o r c i e l f ú p r e m f e c a Á k
a n i t e c i r i M
o c i r á m u c p c Á
Fenoles totales o c i n a o i n c l i l i i t e n e f i a c a r v e c u c c Á Q Á
o c i l á g c Á
X X
X X
(mg ac gálico/100g muestra)
Capacidad antioxidante
(µM Trolox/g muestra)
11.49±0.53
9.67±0.79
2.47±0.13
7.39±0.39
3.80±0.23
6.59±0.20
5.21±0.23
22.91±0.91
1104.71±6.0
283.28±35.31
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
854.29±5.82
493.67±51.12
X
X
X
X
X
X
X
1052.61±3.3
227.81±20.37
X
X
X
X
X
X
1091.34±13.3
361.54±19.57
X
X X
X
X
X
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla de chía existieron señales en la región de los compuestos fenólicos que debido a la falta de estándares no pudieron ser identificados
89
Sin embargo, debe tomarse en cuenta que dichas señales nos indican la presencia de distintos compuestos fenólicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales. Puede observarse que el aceite 301, es el que contiene una mayor capacidad antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenólicos identificados con 4 compuestos, curiosamente no resultó ser el de mayor valor de fenoles totales, en lo que respecta a la semilla de chía sucedió algo similar; la semilla que contiene una mayor capacidad antioxidante fue la 125, sin embargo, el contenido de fenoles totales resultó ser el menor, un comportamiento similar al que se presentó en los extractos de aceite. La semilla con mayor contenido de compuestos fenólicos identificados mediante E.C fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se mencionó anteriormente existieron compuestos fenólicos que no se identificaron por falta de estándares de polifenoles. En el aceite 301 fue en el que se logró identificar el mayor número de compuestos fenólicos con 4 siendo este aceite el que mostró la mejor capacidad antioxidante aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales, esto es ocasionado posiblemente por el efecto sinérgico que existe entre los compuestos fenólicos. Por el comportamiento anteriormente descrito sería interesante determinar la capacidad antioxidante de cada uno de los estándares a utilizar en futuros trabajos y en mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos fenólicos juega un papel fundamental en la determinación de la capacidad antioxidante. Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chía chía separados e identificados identificados mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por taga et al en 1984, en el cual reporta; ácido cafeico, ácido clorogénico, miricetina, quecetina y kaempferol, no obstante, no puede ser del todo comparable ya que en dicho trabajo no se menciona de que región de México provino dicha semilla, además de que el método de identificación no es comparable al utilizado en el presente trabajo.
90
Es importante mencionar que tratándose de semillas la composición química de sus metabolitos está determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos casos también por el genotipo de la misma, es por ello la importancia de saber de dónde proviene dicho alimento, de lo contrario resulta complicado la comparación de resultados de diferentes trabajos, aunado a esto en lo que respecta a la identificación de compuestos fenólicos presentes en la semilla de chía no existen artículos con los cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo, cabe mencionar que esta situación fue una de las razones por las cuales se planteó esta investigación, además de que en diferentes estudios realizados se han reportado las excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra, proteínas, ácidos grasos Ω 3 y 6, y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar puede ser considerado el alimento funcional por excelencia.
91
5. CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultó ser una técnica eficiente, rápida y económica de análisis, y aplicable a cualquier tipo de muestra y en específico a alimentos.
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chía es determinante para un resultado confiable, ya que en el presente trabajo se observó que después de 120 días de almacenamiento la totalidad de compuestos fenólicos se degradan, esto es posiblemente ocasionado por el alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados que contiene la chía y los cuales aceleran ac eleran la oxidación del misma.
El estudio del contenido de fenoles totales, en la semilla de chía desgrasada y en aceite extraído con hexano mostró que: la mayor cantidad de compuestos fenólicos se mantuvieron en la fracción desengrasada y no en el aceite.
El contenido de fenoles totales de la semilla de chía desengrasada, mostró valores por encima de algunos frutos que se consideran súperfrutos como la uva roja y fresa.
El contenido de fenoles totales del aceite de chía en promedio (5.8 mg ácido gálico/100 g de muestra) resultó ligeramente inferior al del aceite de olivo (15.5 mg ácido gálico/100 g de muestra).
Con relación a la capacidad antioxidante total medida por el método del ABTS,
la
fracción
desengrasada
de
la
semilla
de
chía
independientemente del tipo de semilla, mostró una potente capacidad antioxidante, mientras que los extractos de aceite mostraron una capacidad antioxidante menor
92
El aceite que mostró mejor contenido de antioxidantes fue el 301, proveniente de la semilla del estado de Puebla, a pesar de no ser el que contiene mayor contenido de fenoles totales, fue el que mostró una mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de compuestos fenólicos al analizarse mediante electroforesis capilar.
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla, fue la semilla que se considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de compuestos fenólicos detectados mediante electroforesis capilar.
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de compuestos fenólicos está determinado por el suelo donde se cultiva la semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la composición química del alimento.
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla de chía desengrasada, mostraron valores por arriba de algunos frutos como: granada y del kiwi, valores muy cercanos a la frambuesa, cereza y manzana roja.
Lo anterior convierte a la semilla de chía en un excelente complemento en la dieta diaria d iaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes.
93
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