CUESTIONARIO PRACTICA NO. 8 AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS. 1. ¿Que Que aplic licacion iones microorganismos?
prac ractica icas
tie tienen
los
méttodo mé odos
de
cuantif tifica icació ción
de
La medida cuantitativa del desarrollo de los microorganismos nos permite juzgar que un conjunto de condiciones han sido buenas porque las bacterias se desarrollan rápidamente, pero la cosecha final total puede no ser tan grande como las obtenidas con otro conjunto de condiciones en las que el desarrollo de las bacterias se inicia lentamente pero se continua aumentando durante un periodo mas largo. Es importante para interpretar las diferentes respuestas del desarrollo hipotético de la misma bacteria en medios de composición diferente. 2. ¿Que ¿Que técnicas técnicas se emplean emplean comúnmen comúnmente te para lograr lograr el aislamie aislamiento nto de bacteria bacteriass y obtener cultivos puros?
Podemos distinguir dos tipos, aquellos que se realizan en medios lquidos ! los que se realizan en medios sólidos. a" #edio lquido$ % técnica de dilución límite o diluciones en serie$ si el microorganismo que se busca en un cultivo mi&to se encuentra en ma!or cantidad que cualquiera de los otros microorganismos, es posible obtenerlo en cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo, del medio de cultivo apropiado. 'uando la muestra esté mu! diluida contendrá solamente la bacteria que buscamos. Es recomendable confirmar mediante el procedimiento de la siembra s iembra en placa la pureza del cultivo que se aisló de la manera descrita. des crita. b" #edio sólido$ % técnica de siembra por estrías en placa$ con un asa de platino se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar ! se siembra en el medio por estras. % técnica de siembra por difusión en placa (distribución del inoculo de manera homogénea por toda la placa p laca %al azar%"$ se usa una varilla de cristal estéril para esparcir la muestra. Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar queden las bacterias separadas unas de otras. % técnica de vertido en placa (también distribución de manera homogénea"$ el medio (agar" se mantiene en estado lquido para permitir que el inoculo se distribu!a adecuadamente en el medio. )na vez sembrado el medio se pone en cajas de Petri, se deja solidificar ! después se incuba. 'omo algunos microorganismos quedan atrapados entre el agar, se observarán colonias tanto en la superficie como entre el medio cuando éste solidifica.
Aislamiento die!to en medio sele!ti"o # di$een!ial %*écnica de enriquecimiento del cultivo"& el principio de esto es procurar un ambiente de cultivo dise+ado (medio de
composición conocida ! condiciones especficas de incubación" que puedan favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitemos pero que no sea adecuado para las demás.
T'!ni!a de aislamiento de (na sola !'l(la mediante (n mi!omani)(lado. e asla una sola célula utilizando este aparato 3. Mencione medios de cultivo selectivos !y"o diferenciales# as$ como las bacterias generalmente %%%%%%%%% en cada uno de ellos.
Medio de !(lti"o sele!ti"o #*o di$een!ial
+a!teias ,(e !e!en
&gar 'osina%a(ul de metileno 'M)
Enterobacteriaceae sp. Klebsiella, Eschericea coli. Serratia, Hafnia
&gar Mac*on+ey
-gar selectivo para el aislamiento de almonellas, highellas !, bacterias coliformes. Enterobacteriaceae sp. Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium Shigella flexneri roteus mirabilis Enterococcus faecalis
&gar ,oe-enstein%ensen
!ycobacterium sp. !ycobacterium tuberculosis !ycobacterium avium !ycobacterium gordonae !ycobacterium bovis
/. ¿Que venta0as y desventa0as encuentra entre los siguientes métodos de aislamiento
a" Por estra cruzada. entajas. e puede utilizar esta técnica en lugar de placas vertidas/ permite el desarrollo de las colonias puras por separado/ puede o no realizarse una dilución. 0esventajas. El estriado debe hacerse paciente ! cuidadosamente/ debe tenerse mucho cuidado de no contaminar la placa al abrir la caja petri/ se debe permitir que el agar este bien endurecido antes de la siembra ! al hacer las estras no debe romperse el medio b" Por diluciones seriadas. entajas. Permite aislar un tipo de microorganismo de un cultivo mi&to para obtener finalmente puro. 0esventajas. olamente es 1til cuando la bacteria que se intenta aislar esta presente en cantidades mucho ma!ores que las otras con las que se encuentra mezclada. . escriba el método de cuantificación de la gota o de Miles y Misra.
'onsiste en una sobre las placas de agar algunas gotas del material. 0espués de incubación, se cuenta las colonias en la superficie sembrada.
e preparan cuentagotas que den 23 gotas. on pipetas pasteur que se pasan a través del agujero no. 24 (3,42mm" de un calibrador de alambre tarratt ! que se corta e&actamente por encima del orificio. 'uando se prueben, deben dar gotas de 3,35ml, es decir, 23 gotas por ml. e permite una tolerancia de 6 5 gotas. La placa de un medio conveniente se seca mu! bien antes de su empleo. e dejan gotear al menos cinco gotas que cada dilución de la muestra sobre todo placa, desde una altura no ma!or de dos centmetros (para evitar salpicaduras". e vuelva colocar la tapa, pero no se invierten las placas hasta que las gotas estén secas. 0espués de incubarlas, se escogen las placas que tengan colonias aisladas en el área en la que echan unas gotas, de preferencia ! los que ha!an dado menos de 73 colonias por gotas (el ideal es de 83 a 53". e cuentan las colonias de cada gota utilizando una lupa. e divide el n1mero total de colonias contadas por el n1mero de gotas determinado, ! se multiplica por 23 (para convertir la cifra a colonias por ml" ! por la dilución emplear. Este método se apresta a una normalización arbitraria/ por ejemplo, haca en menos de 83 colonias en 2 gotas de la muestra, ésta cifra indica en que al menos de 833 colonias9ml en tal muestra. i son numerosas (más de 73 colonias", entonces el recuento de colonias por ml es ma!or de 5333. . escriba el fundamento b4sico de los siguientes instrumentos útiles para reali(ar una cuenta total de células en suspensión.
a" C-maa de !onteo. es una placa de 5%: mm de gruesa con un área en el centro, llamada la plataforma, que se ha!a rodeada por alg1n anillo e&cavado, la que es 3,35 mm más baja que el resto de la placa. La parte superior de la placa está esmerilada, de forma que cuando un cubreobjetos ópticamente plano se pone sobre el centro de la depresión, la profundidad es uniforme. obre la plataforma ah un área de 8 mm5 dividida en 733 peque+os cuadros, cada uno de los cuales tiene un área de 3,3352mm5. El volumen sobre cada cuadrado es de 3,35 & 3,3352mm:/ esto es 3, 33332 ml. a la suspensión iba a ser contada se le a+aden unas gotas de formalina. e coloca una asa de la suspensión sobre el área cuadrculas ! se pone en cubreobjetos. i el cubreobjetos se aplican correctamente, aparecerán entre las dos superficie óptica planas crculos concéntricos coloreados llamados anillos de ;e con respecto a una fuente luminosa. La densidad de partculas es entonces una función de la luz reflejada por las partculas a la fotocelda. 'uanta más luz se refleje en una determinada densidad de partculas depende de las propiedades de las partculas como su forma, color ! reflectividad. Estableciendo a una correlación de trabajo entre turbidez ! sólidos suspendidos (que más 1til, pero generalmente una más difcil de cuantificación de partculas" debe ser establecido independientemente para cada situación. La unidad de
turbidez para un nefelómetro calibrado se llama "nidad de #urbide$ %efelométrica, ;*) ó )*;. c" Contado Co(lte %Co(lte Co(nte/. El instrumento emplea un sistema de medición no óptico que provee un rango de medición que e&cede las ?333 células individuales por segundo con un intervalo de conteo de 82 segundos. )na suspensión de células sanguneas es pasada a través de un peque+o orificio simultáneamente con una corriente eléctrica. Las células sanguneas individuales pasando a través del orificio producen un cambio de resistencia en el orificio el cual está determinado por el tama+o de la célula. El sistema cuenta las células individuales ! provee distribución de tama+os. El n1mero de células contadas por muestra es apro&imadamente 833 veces ma!or que los recuentos microscópicos, reduciendo el error estadstico apro&imadamente 83 veces.
El n1mero de pulsos eléctricos indica la cantidad de partculas que pasan a través de la apertura ! el tama+o de los pulsos es proporcional al volumen de las partculas. Los contadores '@)L*EA realizan este recuento por triplicado para eritrocitos, leucocitos ! plaquetas 5. escriba el fundamento b4sico de las siguientes técnicas útiles para reali(ar la cuenta viable de células bacterianas en suspensión.
a" Tin!in "ital. on tinciones que se utilizan para preparados en fresco, es decir, sobre microorganismos que serán observados vivos. Los colorantes utilizados no matan al microorganismo !a que se concentra en el soma de los mismos sin afectar la viabilidad. los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. #uchos colorantes utilizados son moléculas cargadas positivamente (cationes" ! se combinan con intensidad con los constitu!entes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos ! los polisacáridos ácidos. Ej$ azul de metileno, cristal violeta ! safranina. @tros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones" ! se combinan con los constitu!entes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Ej$ la eosina, la fucsina ácida ! el rojo 'ongo. @tro grupo de colorantes son sustancias liposolubles/ los colorantes de este grupo se
combinan con los materiales lipdicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotculas o depósitos de grasa. Ej$ negro udán. b" Filta!in. Los lquidos que contienen las bacterias se hacen pasar a través de un filtro que retienen los gérmenes. e deja después que el filtro absorba un medio de cultivo ! se incuba, pudiendo contarse las colonias que se desarrollen. Lo aparatos portafiltros están hechos de metal o de vidrio ! se componen de un embudo inferior, que llevan una plataforma de cartón comprimido rodeado de un anillo de goma de silicona. Los filtros Brancisco derivados de ester de celulosa poroso, de unos 853Cm de grueso. Los poros de las caras superiores tienen un diámetro de 3,2%8,3Cm, agrandándose a :%2Cm en la cara inferior. 0e esta forma, las bacterias quedan detenidas en la parte superior, pero el medio de cultivo puede llegar fácilmente a ella por capilaridad. En la superficie de cada filtro ha! marcada una cuadrcula para facilitar el recuento. c" M'todo de dil(!iones seiadas. i el microorganismo que se busca en un cultivo mi&to se encuentra en ma!or cantidad que cualquiera de los otros microorganismos, es posible obtener lo en cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo, del medio de cultivo apropiado. 'uando la nuestra es que mu! diluida contendrá solamente la bacteria que se busca. Es recomendable confirmar mediante el procedimiento de la siembra en placa la pureza del cultivo que se aisló de la manera descrita. 6. 7ndi8ue como se prepara de manera general un tubo para traba0ar la escala de Mc9arland.
#étodo de preparación del 3,2 estándar de #cBarland &eactivos'
8D 'loruro de ario (a'l5" anhdrido 8D Fcido sulf1rico (G5@7" puro ! fro !étodo de reparación'
8. -+adir 3,2 mL de 8D a'l5 a 44,2 mL de 8D de G5@7. 5. Aevuelva para mantener en suspensión. :. #ezclar completamente ante de proceder al siguiente paso. 7. 0istribu!a 2 mL de la solución de #cBarland en tubos de diámetros similares. e sugiere usar los mismos tubos que se utilizan rutinariamente para ajustar la densidad de las suspensiones antes de la inoculación. 2. 'uando estos estándares están en suspensión completa, la turbidez equivale a un cultivo que contiene 8,2 & 83H células. ?. Los tubos que contienen la solución de 3.2 #cBarland se deben guardar en un lugar oscuro, a temperatura ambiente. :. ¿*omo se reali(a la cuantificación de ;ongos y bacterias filamentosas?
I e puede emplear el medio de cultivo desarrollado por chaufus para el recuento de hongos ! levaduras en productos azucarados ! otras muestras, por la técnica de filtración por membrana.
iembra % Biltrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable contaminación de la muestra. % Embeber la almohadilla con el caldo m%Aecuento de Gongos ! Levaduras hasta la saturación (la cantidad de medio de cultivo depende del grado de absorción de la misma". % -po!ar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de cultivo. % =ncubar las placas a :3 >' durante J5 horas. El recuento debe hacerse en aquellas placas que contengan entre 53 ! 533 )B'. )n conteo inferior escapa a los lmites de error del método. La concentración microbiana debe e&presarse como el n1mero de Gongos ! Levaduras presentes en 833 ml de la muestra. Aecuento de hongos ! levaduras K ;> de colonias 833 ml de muestra filtrada
