Cuantificación y Pureza del ADN por Espectrofotometría

Cuantificación y estimación de la pureza del ADN extraído mediante Cuantificación Espectrofotometría. Antes de realizar la PCR debemos comprobar que el ADN extraído está suficientemente puro y tiene pocas proteínas contaminantes. Esto se determina mediante espectrofotometría.

El ADN presenta un máximo de absorbancia a 260 nm (50 Qg/mL tienen una OD a 260=1), mientras que las proteínas lo tienen a 280 nm, aunque a 260 n m también presentan absorbancia. Si calculamos la relación A260/A280 podemos determinar si el ADN es más o menos puro: A260/A280

= 1,9-1,7  ADN puro (si tiene un valor más bajo sería necesario purificarlo y eliminar las impurezas). Procedimiento

1) Etiquetar un tubo eppendorf de 1,5 mL como Blanco y pipetear en él 50 QL de agua destilada 2)

Marcar

otro tubo como ADN 1/5 y pipetear en él 10 QL de la

disolución de ADN y 40 QL de agua desionizada. 3) Poner el espectrofotómetro en modo absorbancia a 260 nm 4) Cargar el Blanco en una cubeta y pulsar el botón de blanco 5) Retirar el blanco de la cubeta y car gar el contenido del tubo ADN 1/5 y hacer la medida de absorbancia (el valor ideal estaría entre 0,100 y 1,000) 6) Cambiar la absorbancia a 280 nm y medir de nuevo 7) Calcular la cantidad de ADN y su pureza: Concentración, Pureza

cc = A260 *50*1/5 (Qg/mL)  Cantidad ADN = cc *50 QL (ng)

(A260 /A280) debe ser (1,7-1,9 )

Si obtenemos un valor muy pequeño de A260 podemos hacer una nueva medida con 50 QL de la disolución de ADN sin disolver, que después recuperaríamos en un nuevo tubo de 1,5 mL.