CONTROLE IMUNOHEMATOLÓGICO DAS TRANSFUSÕES SANGUÍNEAS
2009
•
Transfusões sanguíneas ABO / Rh(D) compatíveis > ± 98% de sucesso (elevação da concentração de Hb).
•
Anticorpos clinicamente importantes diferentes de anti-A, -B, -AB e -D presentes em ± 2% dos pacientes > destruição prematura dos glóbulos transfundidos ou causando DHRN.
•
Os anticorpos anti- eritrocitários (IgG e IgM) não produzem diretamente danos às hemácias.
•
A importância clínica dos anticorpos depende de fatores que determinam o grau, o local e o mecanismo da hemólise imune.
FATORES DETERMINANTES DA HEMÓLISE IMUNE
1- Em relação ao anticorpo: • • • • • •
Range térmico Especificidade Concentração plasmática Avidez Classe e subclasse Capacidade de fixar complemento
2- Em relação ao antígeno: • •
Natureza e densidade na membrana eritrocitária Presença no plasma (solúvel)
3- Atividade de Macrófagos / Monócitos / Linfócitos 4- Quantidade de glóbulos transfundidos
MECANISMOS DE HEMÓLISE IMUNE
1- INTRAVASCULAR: Exs de Acs: Anti- A, -B, -AB, -PP1Pk • • •
Ativação do complemento (C1 – C9) Liberação de anafilotoxinas (C3a – C5a) Hemoglobinemia / Hemoglobinúria
2- EXTRAVASCULAR: Exs de Acs: Anti-Rh, -K, -Fya, -Fyb, -Jka, -Jkb, -S, -s, etc. • •
Fagocitose por macrófagos com receptores de Fc e C3b Citotoxidade induzida por hemácias altamente opsonizadas (IgG1 e 3)
ANTICORPOS CLINICAMENTE IMPORTANTES
ANTICORPOS BENÍGNOS
ANTICORPOS POSSIVELMENTE IMPORTANTES (SE REATIVOS A 37 0C)
ANTICORPOS RARAMENTE IMPORTANTES
ABO
Chido / Rodgers
Lewis
Yt (Yta)
Rh
Xg (Xga)
MNS (M, N)
Vel
Kell
Bg
P (P1)
Ge
Duffy
Knops
Lutheran
Do (Gya, Hy)
Kidd
Csa
A1
Sda
Diego
JMH
MNS (S, s)
Características Sorológicas dos Fenótipos A
Características Sorológicas dos Fenótipos B
Discrepâncias nas Classificações ABO 4 Grupos Básicos:
1. Anticorpos ABO fracos ou ausentes 2. Anticorpos Irregulares 3. Antígenos Extras 4. Antígenos ABO fracos ou ausentes
Anticorpos ABO fracos ou ausentes Exemplos
Anti-A
Anti-B
AC
1
4+
0
0
0
0
A
2
0
4+
0
0
0
B (ou AB *)
3
0
0
0
0
0
O
Hemácias Hemácias A1 B
Causas mais prováveis para as discrepâncias: 1- Recém-nascidos 2- Idosos 3- Hipo ou Agamaglobulinemia
* Antígeno A fraco não detectado
Fenótipos Prováveis
Anticorpos Irregulares Exemplos
Anti-A
Anti-B
AC
1
4+
0
0/+
1+
4+
A
2
4+
4+
0
2+
0
AB
3
0
4+
0/+
4+
1+
B
Hemácias Hemácias A1 B
Fenótipos Prováveis
Causas mais prováveis para as discrepâncias: 1- Anti-A1 em indivíduos A2 e A2B (exs: 1 e 2 com AC negativos)
2- Alo-anticorpos IgM : anti-M, -N, -Lea, -Leb, -P1 (exs: 1, 2 e 3 com AC negativos) 3- Rouleaux ou Auto anti-I (exs: 1 e 3 com AC positivos)
Antígenos Extras Exemplos
Anti-A
Anti-B
AC
1
4+
1+
0/+
0
4+
A
2
2+
4+
+
4+
0
B
3
2+
2+
+
4+
4+
O
4
2+
2+
+
2+
2+
O
Hemácias Hemácias A1 B
Fenótipos Prováveis
Causas mais prováveis para as discrepâncias: 1- Fenômeno B adquirido (ex: 1 com AC negativo) 2- Poliaglutinação por exposição do antígeno T (exs: 1, 2 e 3 com AC positivos) 3- Geléia de Wharton (ex: 4 com AC positivo)
Antígenos ABO fracos ou ausentes Exemplos
Anti-A
Anti-B
AC
1
0
0
0
0
4+
A
2
0
4+
0
0
0
AB (ou B *)
3
1+
0
0
0
4+
A
Hemácias Hemácias A1 B
Fenótipos Prováveis
Causas mais prováveis para as discrepâncias: 1- Enfraquecimento ou ausência de A em pacientes com Leucemia (exs: 1, 2 e 3)
2- Antígenos A fracos como: Am, Ay (exs: 1 e 2) e Ax (ex: 3)
* Anticorpo Anti-A não detectado
PESQUISA E IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES Ausência de anticorpos irregulares
Negativa
PROVA CRUZADA / PAI
ESPECIFICIDADE (S) DETERMINADA (S)
Validar a identificação, pesquisando os antígenos correspondentes aos anticorpos identificados
-
- Mistura de anticorpos - Anticorpos anti-público
Positiva
IDENTIFICAÇÃO
AUTOCONTROLE
TODAS AS REAÇÕES POSITIVAS
+
- Auto-anticorpos - Erro técnico
Presença de Anti-D somente identificado com a técnica enzimática (Papaína).
Presença de Anti-Fya, identificado pela técnica de Coombs. A técnica enzimática apresenta reações negativas com todas as hemácias-teste, já que os antígenos Fy são destruidos por enzimas proteolíticas.
Paciente A
Presença de auto-anticorpos que podem estar produzindo uma anemia hemolítica auto-imune (AHAI). Em caso de necessidade de transfusão sanguínea, pesquisar a possibilidade de alo-anticorpos mascarados pelos auto-anticorpos.
Paciente A
Presença de auto-anticorpos que podem estar produzindo uma anemia hemolítica auto-imune (AHAI).
Em caso de necessidade de transfusão sanguínea, pesquisar a possibilidade de alo-anticorpos mascarados pelos auto-anticorpos.
Mecanismos de Auto-Tolerância Imune
Linfócitos Auto-Reativos: -
Genes produtores das imunoglobulinas de superfície dos linfócitos B (Ig) e dos receptores dos linfócitos T (TCR) são codificados em segmentos que se rearranjam no DNA de precursores dos linfócitos para formar um gene completo. Este processo possibilita milhares de combinações dos segmentos, criando uma grande diversidade de genes e uma variedade de linfócitos específicos.
-
Impossível prevenir a construção de receptores (Ig, TCR) auto-reativos, mas existem mecanismos de eliminação ou inativação de linfócitos auto-reativos que chamamos “tolerância central”.
-
A tolerância central não é completa. Alguns clones auto-reativos permanecem em órgãos linfoides periféricos e, possivelmente nunca serão estimulados por auto-antígenos. Além do estímulo de reconhecimento do auto-antígeno, a resposta imune requer, ainda, uma segunda série de sinais transmitidos através de pares de moléculas (Ligante Receptor) conhecidas como co-estimuladoras. Exs: B7.1 e B7.2 (Linf. B, Macrófagos, Células Dendríticas) CD28 (Células T). CD40 (Linf. B) CD40L (ligante) (Células T).
-
Inflamações de qualquer natureza, infecções ou traumas, no entanto, podem produzir respostas autoimunes, porque moléculas co-estimuladoras são induzidas não-específicamente. Ex: Respostas auto-imunes após Glomerulonefrite Estreptocócica ou após Micoplasma podem produzir anemias hemolíticas auto-imunes.
< 2+ = Fraco positivo > 2+ = Coombs Monoespecíficos
< 2+ (IgG) = Fraco positivo Não titular > 2+ (IgG) = Titulação com ID-cartão IgG - Dilution
< 1:30 = Fraco positivo (IgG) Baixo risco de hemólise > 1:30 = Forte positivo (IgG) Alto risco de hemólise
Positivo 1:1 = Moderado risco de hemólise (IgG1) Alto risco de hemólise (IgG3) Positivo 1:100 = Alto risco de hemólise (IgG1 e/ou IgG3)
Coombs Monoespecíficos
Dissociação de Anticorpos IgG pela Cloroquina Princípio: Difosfato de Cloroquina dissocia anticorpos de classe IgG fixados na membrana eritrocitária, sem danos à sua integridade.
Reagente: Difosfato de Cloroquina a 20% em ID-Diluente 2. Estocar entre 2 - 6 oC.
Método de Uso: Incubar 1 volume de concentrado de hemácias lavadas com 4 volumes de Difosfato de Cloroquina de 22 - 25ºC por no mínimo 30 minutos e no máximo 2 horas. Lavar uma pequena alíquota e fazer teste de Coombs direto a cada 30 minutos de incubação. Lavar as hemácias 3 vezes em salina e 1 vez em ID-Diluente 2 e usá-las para fenotipagem e auto-absorções de anticorpos.
Notas: Componentes do Complemento não são dissociados pela cloroquina. Tempos de incubações superiores a 2 horas provocam hemólise e perda de atividade de antígenos Rh. Os antígenos Bg são removidos pela cloroquina.
Tratamento das Hemácias com DTT Princípio: DTT é um agente redutor das pontes de dissulfeto da estrutura terciária das proteinas. DTT 0.2M, desnatura os antígenos dos sistemas Kell, Cartwright, LW e Dombrock e a maioria dos antígenos HTLA. Baixas concentrações de DTT (0.002M) desnaturam somente os antígenos Jsa e Jsb.
Reagentes: DTT 0.2M em PBS: 1,0g de DTT (Dithiothreitol) em 32 ml de ID-Diluente 2. Estocar em inferiores.
alíquotas
em
temperaturas
de
–20ºC
ou
Método de Uso: Incubar 1 volume de concentrado de hemácias lavadas com 4 volumes de DTT 0,2M a 37ºC por 30 minutos. Lavar as hemácias 3 vezes em salina e 1 vez em ID-Diluent 2 e usá-las para detecção e identificação de anticorpos e autoabsorções.
Notas: Usar uma amostra K+ como controle.
Tratamento das Hemácias com ZZAP Princípio: reagente ZZAP é uma mistura de DTT e uma enzima proteolítica (Papaina). ZZAP remove imunoglobulinas e componentes complemento da membrana eritrocitária.
do
Reagentes: Preparar diáriamente o ZZAP: 2,5 ml de DTT 0.2M + 0,5 ml de ID-Papaina + 2,0 ml de ID-Diluent 2.
Método de Uso: Incubar 1 volume de concentrado de hemácias lavadas com 2 volumes de ZZAP a 37ºC por 30 minutos. Lavar as hemácias 3 vezes em salina e 1 vez em ID-Diluent 2 e usá-las para detecção e identificação de anticorpos e autoabsorções.
Notas: Duas absorções são, normalmente, remoção dos auto-anticorpos.
suficientes
para
tratamento com ZZAP destroi os antígenos dos sistemas Kell, Cartwright, LW e Dombrock e a maioria dos antígenos HTLA, além dos antígenos sensíveis ao tratamento por enzimas proteolíticas ( M, N, S, s, Fya, Fyb e Xga).
Paciente A
OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.
Paciente A
OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.
Paciente A
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP
Presença de Anti-E mascarado pelo auto-anticorpo
Paciente A Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP
Presença de Anti-E mascarado pelo auto-anticorpo
Paciente B
OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.
Paciente B
OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.
Paciente B
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP
Presença de Anti-C mascarado pelo auto-anticorpo
Paciente B
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP
Presença de Anti-C mascarado pelo auto-anticorpo
Paciente C
OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.
Paciente C
OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.
Paciente C
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP
Presença de Anti-c mascarado pelo auto-anticorpo
Paciente C
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP
Presença de Anti-c mascarado pelo auto-anticorpo
Paciente D
OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.
Paciente D
OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.
Paciente D
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP
Presença de Anti-Jka mascarado pelo auto-anticorpo
Paciente E
OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.
Paciente E
OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.
Paciente E
Presença de auto-anticorpos das classes IgG e IgM, além da fração C3d do Complemento, opsonizando as hemácias do paciente.
Paciente E
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP
Ausência de alo-anticorpos no soro auto-absorvido
Paciente E Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP
Ausência de alo-anticorpos no soro auto-absorvido
Paciente F Obs: - A reação muito forte com anti-Rh(D).
- Coombs direto negativo.
Obs: - Prova reversa discrepante.
- PAI positiva. - Presença de anticorpo(s) irregular(es) reagindo em meio salino e em Coombs.
Paciente F
OBS: Todas as reações são fortemente positivas em Coombs e o autocontrole negativo, sugerindo multiplos alo-anticorpos ou alo-anticorpo contra antígeno de alta freqüência.
Paciente F
OBS: Todas as reações fortemente exacerbadas em Papaína e o autocontrole negativo, sugerindo multiplos alo-anticorpos ou alo-anticorpo contra antígeno de alta freqüência.
Paciente F
- Embora a paciente seja Rh(D) positiva (reação forte com o anti-D), os antígenos Rh localizados na proteína RHCE ( C, Cw, c, E, e) estão todos ausentes.
- Os resultados indicam um fenótipo RhCE nul ( possível “D - -” pela alta reatividade com o anti-D) e o anticorpo presente é um anti-Rh17, que só não reagirá contra os fenótipos Rh nul e RhCE nul.
Paciente G
OBS: Todas as reações são positivas em Coombs e o autocontrole negativo, sugerindo múltiplos alo-anticorpos ou alo-anticorpo contra antígeno de alta freqüência.
Paciente G
OBS: Todas as reações são positivas em Papaína e o autocontrole negativo, sugerindo múltiplos alo-anticorpos ou alo-anticorpo contra antígeno de alta freqüência.
Paciente G
- Os antígenos de alta freqüência ( k, Kpb e Jsb ) localizados na proteína Kell estão todos ausentes. - Os resultados indicam um fenótipo KEL nul ( K 0 ) e o anticorpo presente é um anti-Ku, que só não reagirá contra hemácias do mesmo fenótipo K0.
Paciente G
Contra-prova: As 11 hemácias-teste do painel de identificação foram tratadas por ZZAP, que é capaz de desnaturar a proteína Kell, pela quebra das pontes de bissulfeto nos resíduos de cisteína ao longo da cadeia peptídica. O anticorpo anti-Ku foi confirmado pela ausência de reações contra as hemácias-teste tratadas por ZZAP (painel acima).
Doador A
Obs: -Doador Grupo O, Rh(D) positivo, Coombs direto negativo. - PAI positiva contra todas hemácias-teste.
Doador A
OBS: Todas as reações são positivas em Coombs e o autocontrole negativo. Por se tratar de um doador de sangue, não pensamos em múltiplos anticorpos mas em alo-anticorpo natural contra antígeno de alta freqüência ausente no doador.
Doador A
OBS: Todas as reações são positivas em Papaína e o autocontrole negativo. Por se tratar de um doador de sangue, não pensamos em múltiplos anticorpos mas em alo-anticorpo natural contra antígeno de alta freqüência ausente no doador.
Doador A
OBS: Todas as reações são positivas em meio salino e o autocontrole negativo.
Por se tratar de um doador de sangue, não pensamos em múltiplos anticorpos mas em alo-anticorpo natural contra um antígeno de alta freqüência ausente no doador. O painel salino com todas as hemácias-teste fortemente positivas, reforça a possibilidade de um anticorpo natural.
Doador A
- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador.
- Como o doador é Rh(D) positivo e apresenta alguns antígenos relacionados com a proteína RHCE, descartamos a possibilidade de um fenótipo “nul” no sistema Rh.
Doador A
- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador.
- Como o doador produz os antígenos de alta freqüência k (Cellano) e Kp b, descartamos a possibilidade de um fenótipo “nul” no sistema Kell.
Doador A
- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador.
- Como o doador produz o antígeno de alta freqüência Lub, descartamos a possibilidade de um fenótipo “nul” no sistema Lutheran. - Observem que o antígeno P1 está ausente.
Doador A
- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador. - Como o doador produz os antígenos M e N relacionados à GPA e s relacionado à GPB, descartamos a
possibilidade de um fenótipo “nul” no sistema MNS.
Doador A
- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador. - O doador produz o antígeno de alta freqüência Vel da coleção 212, descartando a possibilidade de um anti-Vel.
Doador A
- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador. - O doador não produz o antígeno P1, como vimos em fenotipagem anterior e apresenta reação negativa contra o anti-Tja. Como o anti-Tja é um anti- P1-P-Pk, isto significa que o doador pertence a um fenótipo raro que não produz os antígenos do sistema P-relacionados ( ISBT: 003 - P / 028 - GLOB / 209 - GLOB ). - O anticorpo presente no doador é um anti-Tja (P1-P-Pk) natural e muito hemolítico.
