CONTROLE GENÉT NÉTII CO D E D OEN OEN ÇAS D E PLANTAS
CONTROLE GENÉTICO L.E.A. Camargo e A. Bergamin Filho
37.1 INTRODUÇÃO O emprego de resistência genética no controle de doenças vegetais representa um dos mais significativos avanços tecnológicos da agricultura. O uso de cultivares resistentes é o método de controle preferido simplesmente por ser o mais barato e de mais fácil utiliza;ção. Na verdade, existem culturas onde o controle das doenças mais importantes dá-se, quase que exclusivamente, por meio da resistência, tais como as ferrugens e carvões dos cereais e da cana-de-açúcar, as murchas vasculares em hortaliças e as viroses na maioria das culturas. Três etapas devem ser consideradas em qualquer programa de obtenção de cultivares resistentes: 1.O fitopatologista deve primeiro identificar fontes de resistência ,ou seja, identificar germoplasma que possui genes de resistência procurados; 2.o segundo passo é a incorporação desses genes em cultivares comerciais por meio de métodos de melhoramento. 3.Finalmente, após a obtenção de uma cultivar resistente, o fitopatologista deve traçar melhor estratégia para que a resistência seja durável face à natureza dinâmica das populações patogênicas.
37.2 FONTES DE RESISTÊNCIA O primeiro passo na elaboração de um programa de melhoramento é a identificação de material vegetal que fornecerá os genes de resistência. O melhorista geralmente recorrem aos genes existêntes em linhagens ou cultivares comerciais, pois essas são as fontes de mais fácil acesso. Elas apresentam indiscutível vantagens de serem
melhoradas, isto é, a freqüência de alelos que controla características agronômicas indesejáveis é muito baixa. O trabalho de: Krupinski & Sharp (1979), que será discutido no ítem 37.4.2 é um típico exemplo da reutilização de genes de resistência a ferrugem amarelo presentes em cultivares comerciais de trigo. Em alguns casos, no entanto, os genes inexistem , ou, se presentes nos cultivares comerciais, não conferem o nível satisfatório de resistência. Neste caso, o melhorista deve recorrer ao germoplasma selvagem, isto é, não-cultivado. Em uma primeira instância, o melhorista pode procurar tais genes em populações selvagens ou não melhoradas que sejam da mesma espécie do cultivar a ser melhorado. Em uma segunda instância, o melhorista pode recorrer a espécies deferentes, mas geneticamente afins, pertencentes ao mesmo gênero. A transferência intraespecífica de genes é facilmente obtida por meio de cruzamentos, ao passo que transferências interespecíficas geralmente requerem auxílio de técnicas especiais para garantir a sobrevivência do híbrido. Estas técnicas, que foram discutidas no capítulo 25, incluem fusão de protoplastos, cultura de anteras, resgate de embrião, etc. Tabela 37.4- Ausência de interação diferencial. Presença de cultivares com diferentes níveis de resistência horizontal. Isolados
Cultivares G
H
I
7
4
3
2
8
4
3
2
9
4
3
2
TABELA 37.5- Ausência de interação diferencial. Presença de isolados com diferentes níveis de agressividade
Isolados
Cultivares
J
K
L
10
4
4
4
11
3
3
3
12
2
2
2
TABELA 37.6- Presença de interação diferencial. Os cultivares apresentam resistência vertical e horizontal,e os isolados (raças) também apresentam agrecividade e virulência. Isolados
Cultivares M
N
O
13
5
3
3
14
2
5
2
15
1
1
5
resistência horizontal e agressividade. Na tabela 37.4, tem-se apenas resistência horizontal, não havendo virulência nem variação de agressividade no patógeno. Na Tabela 37.5 tem-se variação de agressividade de ausência tanto de variação em níveis de resistência horizontal como de resistência vertical e virulência. Finalmente, na Tabela 37.6, tem-se variação tanto em resistência vertical e horizontal no hospedeiro como variação em agressividade e virulência no patógeno. 37.3.2 Características genéticas e agronômicas das resistências vertical e horizontal
37.3.2.1 Controle genético É comum encontrar na literatura a noção de que a resistência vertical é do tipo monogênica enquanto que a resistência horizontal é do tipo oligo/poligênica. Embora exista inúmeros exemplos onde esta correlação é verdadeira, deve-se tomar muito cuidado com esta generalização, pois existem contra-exemplos de todos os tipos. A resistência em sorgo a Periconia circinata, a Puccinia hordei, medida pelo tempo que leva entre inoculação e o aparecimento de sintomas (período latente), é poligênica, mas apresentam interações diferenciais com raças do patógeno (Parlevliet, 1977).
37.3.2.2 Durabilidade Resistência vertical monogênica é passível de ser vencida dentro da capacidade microevolutiva do patógeno. Isto significa, em outras palavras, que este tipo de resistência tende a ser efêmera. Este é um fato para o qual não faltam exemplos na literatura, dentre os quais a transitoriedade da eficiência dos genes Dm de alfaçe contra Bremia lactucae (Crute,
1992), do genes R de resistência a Phytophthora em batata (
Vanderplank, 1968), dos monogenes de resistência a Pyricularia oryzae em arroz (Kiyosawa, 1989) e dos monogenes de resistência a ferrugem e antracnose (gene ARE) em feijoeiro( Beebe & Corrales, 1991) são alguns dos mais conhecidos. Também é geralmente aceita a idéia de que a resistência horizontal oligo-poligênica está além da capacidade microevolutiva do patógeno em ser vencida. É o caso do cultivar Proctor de cevada, resistente ao fungo Ustilago nuda. O fungo penetra o embrião da planta, infectando os pistilos jovens da flor somente na época da polinização. No cultivar Procton, ao contrário dos cultivares susceptíveis a polinização ocorre enquanto a inflorescência está envolta pela bainha (cleistogamia), impossibilitando a infecção. Esta resistência tipicamente horizontal, impresumivelmente além da capacidade de mudança do patógeno é oligogênica, sendo governada por três genes. A concepção da durabilidade da resistência vertical e horizontal não se originou baseada apenas em dados de campo. Existem considerações teóricas que levem ao aceite de que sistemas poligênicos de resistência possuem maior “capacidade tampão” de resistir a mudanças genéticas no patógeno do que sistemas monogênicos. Estas argumentações assumem que tanto sistemas poligênicos como monogênicos seguem a hipótese gene-a-gene, discutida no capítulo 24. Assim sendo, uma resistência poligênica será muito mais estável do que uma monogênica pois, para que surjam formas variantes do patógeno, no primeiro caso (assumindo as mesmas condições ambientais e genéticas, tais como pressão de seleção e taxa de mutação, respectivamente) são requeridas mudanças genéticas em vários loci de patogenicidade, ao contrário do sistama monogênico, onde a mudança deve ocorrer em apenas um locus.
37.3.2.3 Efeitos na epidemia A resistência vertical, pode ser efetiva apenas contra algumas raças do patógeno, age no sentido de reduzir a quantidade efetiva de inóculo inicial, fazendo com que o início da epidemia seja atrasado. Imagine-se, como exemplo, dois campos de batata lado a lado. Num deles cresce um cultivar sem nenhum gene R de resistência vertical e no outro um cultivar com o gene R1, que confere resistência a determinadas raças de Phythophthora infestans. Geralmente, no início do ciclo da cultura, o numero de esporos do patógeno é bastante pequeno, de tal forma que ambos os campos, independentemente do genótipo dos cultivares neles plantados, permanecem insentos de doença. No entanto, mais tarde, ambos são atingidos por uma leve chuvas de esporos originária, por exemplo, de campos vizinhos que foram infectados mais cedo. Dos esporos que chegam até os dois campos em discussão, 1.0 0.8 SUSCETÍVEL
0.6 0.4 0.2
RESISTENTE 0.0 10
20
30
40
50
Suponha que 99% pertença a raças que não podem infectar a variedade com gene R1, tais como as raças (0), (2), (3), k(4), (2,3), ketc. O restante 1% de esporos pertence às raças (1), (1,2), (1,3), (1,4), (1,2,3), etc., que podem infectar ambos os campos.
Para este grupo de raças, o campo com o gene R1 é tão suscetível quanto o campo sem genes R. O resultado da chuva de esporos é que o campo sem o gene R1 iniciou seu ciclo com um inóculo efetivo 100 vezes maior do que o campo com o gene R1. O Número inicial de lesões (por planta, por M2 , por há, enfim, qualquer unidade que se escolha) é 100 vezes maior no campo sem gene R1 do que no campo com ele. Dessas lesões iniciais o fungo começa a se disseminar: a epidemia tem início. Daqui para a frente, a epidemia prosseguirá com a mesma rapidez tanto num campo como no outro, mas a quantidade de inóculo no campo com R1 é somente 1/l00 daquela existente no outro campo. Por causa dessa menor quantidade de inóculo inicial, a epidemia em R1 é retardada pelo período de tempo necessár9io para o inóculo aumentar 100 vezes. Isso se traduz em um atraso no início da epidemia. A Figura 37.1 ilustra os fatos descritos acima. Além dos dias de atraso no início da epidemia, pode-se também notar que a taxa de aumento da doença, neste caso, não é reduzida pela presença do gene R1, mostrando-se tão rápida no cultivar resistente quanto no suscetível. Isto significa que a raça (1), por exemplo. Pode atacar uma variedade R0: os esporos germinam e penetram do mesmo modo, o micélio coloniza o tecido hospedeiro com a mesma eficiência, os esporos são produzidos no mesmo modo e nos mesmos números, etc. Um observador experimentando, mesmo fazendo inspeções periódicas nos dois campos em discussão, não poderá decidir qual deles tem o cultivar com gene R1, a não ser baseado no atraso inicial da epidemia. Com a resistência horizontal a situação é diferente. Ao contrário da rsistência vertical, que geralmente manifesta-se conferindo ao cultivar que posui a imunidade ou hipersensibilidade contra determinadas raças do patógeno (efeito
1.0 0.8
A
0.6
B
C
0.4 0.2 0.0 10
20
30
40
50
60
TEMPO(DIAS qualitativo), a resistência horizontal, apesar de efetiva contra todas as raças, apenas diminui o tamanho das lesões produzidas pelo patógeno, aumenta seu período latente, diminui o número de esporos produzidas pelo patógeno, aumenta seu período latente, diminui o número de esporos produzidos por lesão, e assim por diante. Todos os seus efeitos são parciais e quantitativos: em cultivares com resistência horizontal, a eficiência de infestação é menor do que um cultivar suscetível, as lesões crescem mais lentamente, os esporos são produzidos mais tardiamente e em menor quantidade, etc. Todos estes efeitos somados produzem uma redução na taxa de desenvolvimento da doença (o valor de r na equação 30.14 do capítulo 30, por exemplo), sem afetar significativamente o inóculo inicial, como ilustrado na Figura 37.2. pode-se então, de maneira geral, resumir os efeitos dos dois tipos de resistência no curso de uma epidemia dizendo que a resistência vertical afeta, principalmente, o inóculo inicial (xo da equação 30.11 para doenças de juros compostos e Q da equação 30.13 para doenças de juros simples, conforme visto no capítulo 30), enquanto que a resistência horizontal afeta, principalmente, a taxa de desenvolvimento da doença (r da equação 30.11 para doenças de juros compostos e R da equação 30.13 para doenças de juros simples). Até aqui se discutiu o efeito isolado na epidemia das resistências vertical e horizontal. Para avaliar o comportamento da epidemia na presença de ambas, considere-se os quatro cultivares hopotéticos representados na Figura 37.3. O cultivar A tem pouca resistência horizontal e nenhuma vertical. O cultivar B tem a mesma quantidade de resistência horizontal que A além de resistência vertical. O cultivar C assemelha_se ao
70
cultivar A por não ter resistência vertical, mas possui uma maior quantidade de resistência horizontal. Essa resistência horizontal é suficiente para dobrar o tempo gasto pelo patógeno para causar o dobro de doença, qualquer que seja ele, em relação ao cultivar A. O cultivar D tem a mesma resistência vertical de B e a mesma resistência horizontal de C. A curva D tem, portanto, a mesma inclinação da curva C. Entretanto, enquanto a curva B está somente 10 dias atrás da curva A, a curva D está 20 dias atrás da curva C porque a resistência horizontal reduziu pela metade a taxa de infecção e duplicou o tempo necessário para a doença recuperar a perda de inóculo inicial causada pela resistência
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 10
20
30
40
50
60
TEMPO(DIAS) vertical. A resistência horizontal do cultivar D reforça grandemente a resistência vertical que ele possui, Mesmo considerando que os níveis da resistência vertical e da horizontal sejam pequenos, como mostrado pelas curvas B e C, o efeito combinado delas no cultivar D é muito satisfatório. Os bons resultados obtidos com a combinação de resistência horizontal e vertical, como enfatiza Vanderplank (1968), são importantes de se conhecer. A leteratura de resistência a doenças discute com freqüência o uso alternativo das resistências horizontal e vertical. Raramente reconhece, no entanto, que os dois tipos apresentam resultados sensivelmente melhores quando usados em combinação.
37.4MÉTODOS CONVENCIONAIS DE MELHORAMENTO O método usado em programas de melhoramento para resistência a doenças não diferem dos métodos usados para outras características agronômicas. A escolha do melhor método de seleção leva em consideração, principalmente, o tipo de reprodução do hospedeiro (autógama ou alógama) e a natureza genética da resistência (monogênica ou poligênica). Neste capítulo, não se pretende uma discussão aprofundada sobre os métodos convencionais de melhoramento, uma vez que estes podem ser encontrados em textos clássicos de excelente qualidade (item 37.8). O que se pretende aqui é discutir certas peculiaridades intrínsecas que devem ser levadas em consideração durante o processo de seleção de genótipos resistentes a doenças.
37.4.1 Seleção de resistência monogênica
Como discutido no capítulo 24, a resistência monogênica caracteriza-se por uma distribuição descontínua do fenótipo, de tal modo que indivíduos resistentes podem ser facilmente distinguidos dos susceptíveis. Viu-se, também, que esta resistência é a preferida dos melhoristas, pois é muito mais fácil de ser manipulada em programas de melhoramento. Em se tratando de resistência monogênica, o melhorista, normalmente, depara-se com a seguinte situação: um gene de resistência é identificado em uma fonte de resistência, que pode ser uma linhagem ou um germoplasma selvagem, por exemplo. O objetivo é transferir o gene para um cultivar suscetível, mas que possua um ótimo mercado para outras características agronômicas. A preocupação deve ser a de adotar um método de seleção que preserve ao máximo as características agronômicas. A preocupação deve ser a de adotar um método de seleção que preserve ao máximo as características agronômicas deste cultivar, ao mesmo tempo em que possibilite a introdução do gene de resistência. Neste caso, o método do retrocruzamento
é o preferido. O termo retrocurzamento refere-se ao
cruzamento repetido de uma progênie híbrida com um dos genótipos parentais, que é
chamado de parental recorrente (no caso, o cultivar ao qual se quer incorporar o gene de resistência). O genótipo parental dque fornece o gene de resistência é o doador. Na Figura 37.4 é apresentada uma representação esquemática da transferência de um gene de resistência à raça 1 de Phytophthora megasperma f. sp. Sojae por meio do retrocruzamento. Os cultivares Mukden e Hark são, respectivamente, os parentais doador e recorrente. Neste caso, a resistência é controlada pelo gene dominante Rps. A cada ciclo, a proporção do genoma do parental doador na progênie vai diminuindo, até que, após vários ciclos, o genoma do parente recorrente é restaurado, exceto que, agora, ele contém o gene de resistência. Note que, no caso da transferência de um gene dominante, o retrocruzamento é extremamente simples, uma vez que existem duas classes fenotípicas: a resistente e a suscetível. Assim, testes de progênie são necessários para saber quais plantas retrocruzadas ao parental recorrente). O método do retrocruzamento também pode ser utilizado para transferência de mais de um gene simultaneamente, desde que o efeito fenotípico destes possa ser facilmente identificado. Um exemplo é obtenção de um cultivar que possui vários monogenes de resistência vertical, uma prática chamada de piramidamento de genes , como será visto adiante. Cada gene é facilmente identificado por inoculações com as correspondentes raças do patógeno. Segundo Fehr (1987), existem duas estratégias que podem ser utilizadas quando da transferência de múltiplas características monogênicas: a) a transferência simultânea dos genes durantes um único programa de retrocruzamento ou b) a transferência dos genes em programas independentes e posterior combinação destes em um único indivíduo ao final do programa. O problema da primeira
Parente doador Resistente Mukden Rps1 Rps1
50% Mukden 50% Hark
X
F1 Rps1 rps1
Parente recorrente Suscetível Hark rps1 rps1
Hark
M
25% Mukden 75% Hark
X
BC1F1 Suscetível rps1rps1 e resistente Rps1
12.5% Mukden 87,5% Hark Suscetível rps1 rps1 e resistente Rps1 rps1
descartar X
Hark
BC2F1 Descartar X
Hark
Repetir por várias gerações Figura 37.4- Esquema de retrocruzamento para incorporação do gene Rps da resistência a Phytophthora
megasperma
f.sp. sojae usando os cultivares Mukden e Hark,
respectivamente, como parental doador e recorrente ( Fehr, 1987).
estratégia é que um número elevado de plantas deve ser obtido a cada geração para que seja possível obter, entre estes, um indivíduo que contenha todos os alelos desejáveis. A título de exemplo, suponha que o objetivo seja transferir simultaneamente quatro genes de resistência, ABCD. A frequência de indivíduos heterozigotos para cada locus (Aa Bb Cc Dd) na geração BC1F1 é de 1/16. Em contraste, se os quatro genes fossem transferidos em programas independentes, a freqüência de heterozigotos em cada programa aumentaria para ½. Um outro problema associado com a primeira estratégia é a necessidade de inculação simultânea com diversas raças, o que pode não ser viável na prática.
Quando os genes são transferidos independentemente para um mesmo cultivar recorrente, obtém-se linhagens quase-isogênicas (praticamente idênticas), cada uma contendo um gene diferente de resistência. Como visto, estes genes podem ser combinados em um único cultivar (piramidamento), mas também podem ser mantidos em linhagens separadas, que serão plantadas em misturas, dando origem às multilinhas( ver item 37.5.4). Autógamas Amandoim Ervilha Feijão Soja Sevada Trigo Aveia Arroz Sorgo Tomate Tabaco Citros alfaçe linho
Alógamas Milho Centeio Alfafa Repolho Brócolis Couve-flor Melancia Cebola Pepino Abacate Banana Uva Mamão Manga
37.4.2 Seleção de resistência oligo/poligênica Os métodos de melhoramento de resistência oligo/poligênica não diferem dos demais utilizados para outras características agronômicas quantitativas. O melhoramento dá-se pelo acúmulo gradual de alelos favoráveis e pode ser acompanhado por meio de médias e variâncias. A principal consideração, como foi dito, é quanto ao tipo de reprodução da cultura, se alógama ou autógama (Tabela 37.7).
37.4.2.1 Seleção em plantas alógamas Em alógamas, os métodos de seleção massal e de famílias são muito utilizados para acumular genes de resistência. A seleção massal é a estratégia de seleção mais simples, onde os indivíduos mais resistentes são selecionados e suas sementes são colhidas e misturadas, originando uma nova população. O processo é repetido, até que se
obtenha o nível de resistência desejado. A obtenção de cultivares resistentes ao vírus do encrespamento da berterraba deu-se, no início do século, por meio de seleção massal. A doença ameaçava dizimar os plantios desta cultura. Indivíduos resistentes foram continuamente selecionados, por mais de 27 anos,em plantios comerciais onde a doença mostrava-se severa, resultando em uma população altamente resistente, a US1. Desta população originou-se a maioria dos cultivares resistentes atualmente em uso nos EUA. Na seleção massal, plantas são selecionadas baseadas em suas reações individuais à doença. Na seleção de famílias (progênies). Ao contrário, as plantas são selecionadas baseadas nas reações de suas progênies. As sementes de plantas cujas progênies mostraram-se mais resistentes são usadas no próximo ciclo de seleção. As progênies podem ser obtidas de diversas maneiras: pela autopolinização de uma planta, pelo cruzamento controlado entre duas plantas (progênie de irmãos germanos) ou, ainda, pelo cruzamento entre uma planta mãe com várias outras plantas ao acaso (progênie de meio-irmãos). Não será discutido aqui o mérito de cada um destes métodos, uma ves que o tema já foi exaustivamente tratado por Hallauer & Miranda (1988). Bleicher et al. (1993) estudaram a eficiência da seleção massal em acumular genes de resistência a Exserohilum turcicum, agente causal da queima das folhas dom milho, no cultivar pirapoca de milho-pipoca. Os autores compararam três de conídios, capturados, à taxa aparente de infecção e ao inóculo inicial. Na Figura 37.5 pode-se ver o progresso obtido com a seleção nestes diversos parâmetros. Nota-se, já no primeiro ciclo de seleção, uma diminuição estatisticamente sigfnificativa da ordem de 20% na porcentagem de área folia infectada. Houve também uma diferença significativa para este parâmetro entre o primeiro e terceiro ciclos. A diferença no número médio de conídios capturados foi significativa somente no promeiro ciclo, ao passo que uma diminuição significativa na taxa aparente de infecção foi verificada após o seguundo ciclo de seleção. Os autores concluíram que a seleção massal simples foi eficiente em aumentar os níveis de resistência ao patógeno em apenas três ciclos de seleção. Na cultura do milho, que faz uso intensivo de cultivares híbridos, depois que genes de resistência são acumulados em uma população, como exemplo discutido acima, os melhores indivíduos são selecionados e auto-polinizados se, assim, linhagens homozigotas ou puras que poderão ser, posteriormente, cruzadas entre si, gerando híbridos simples. Um
híbrido simples, por sua vez, ou com outro híbrido simples, gerando um híbrido duplo. A produção de piramidamento (ver item 37,5,2), onde os genes de resistência de cada linhagem pura são combinados em híbridos.
47.4.2.2 Sele.cão em plantas autógamas Os métodos de seleção em culturas autógamas devem se adequar ao sistema reprodutivo da planta. Nestas culturas, geralmente, a polinização cruzada é difícil de ser obtida na prática, o que eleva os custos do processo. Desta forma, a regra é reduzir os cruzamentos manuais ao mínimo indispensável. Os métodos mais utilizados em programas de melhoramento para resistência são “pedigree”e “bulk”. No primeiro caso (Figura 37.6), uma população F2 é estabelecida e os melhores indivíduos desta geração são selecionados. Estas plantas são auto-polinizadas naturalmente, gerando famílias F3, que serão avaliadas no campo. A seleção, a partir desta geração, é feita tanto dentro de famílias como entre famílias, isto é, os melhores indivíduos das melhores famílias são selecionados. As sementes oriundas do auto-cruzamento destes indivíduos selecionados irão compor a geração F4. A seleção inter-e intrafamilial é repetida
60 50 I F A %
40 30 20 10 0
o ã c e f n i e d e t n e r
0.07
0,065 0,06 0,055 0,05
2500,05 s 2000.05 o r o s e 1500.05 e d o r e m 1000,05 ú N
500.05 0,05 0
1
2
3
Ciclo de seleção Figura 37.5- Progresso na seleção massal para resistência a E. turcicum no cultivar de milho Pirapoca medido através da porcentagem da área foliar atacada (A), taxa aparente de infecção (B) e produção de esporos (c). Dados adaptados de Bleicher et al.(1993).
até, aproximadamente, a geração F6-F8. Quando estas gerações avançadas são atingidas, existe um alto grau de homozigotos dentro de famílias devido aos sucessivos ciclos de autocruzamento. Entre famílias, porém, existe interfalilial, com a seleção de todos os indivíduos das melhores famílias. O método do “bulk”difere do pedigree, pois a semente dos indivíduos selecionados em cada geração são misturadas antes do início do ciclo seguinte.
A seleção é baseada na performace individual de cada planta e não na performace de sua progênie. Este processo avança até a geração F6-F8 começando, a partir deste método é que permite a manipulação de um maior número de plantas até o início da seleção interfamilial. Parlevliet & Kuiper (1985) demostraram que o método do pedigree pode ser usado para selecionar genes de resistência poligênica a Puccinia hordei em cevada que prolongam o período latente da doença. Mais importante foi a demonstração de que a seleção de plantas sub condições artificiais de inoculação em casa-de-vegetação é eficiente Pedigree
F2
F3
F4
F5
Progênie a Planta b
Progênie
17-5-9-13 275
230
265
260
308
278
300
329
17-16-7
230
265
260
325
287
313
347
275
Planta
Progênie
F6 Planta
Progênie
A= IPL médio da progênie. B=IPL da planta selecionada para selecionar genótipos que, mais tarde, demonstraram elevado grau de resistência em condições de campo. Os autores estabeleceram um índice de período latente (IPL), relativo ao período latente do cultivar suscetível L94, que foi fixado em 100 unidades. O cultivar Cebada Capa, que além de possuir resistência poligênica para longo IPL, também possui o gene vertical Pa7, foi cruzado com o cultivar Vada, que apresenta somente baixos níveis de resistência poligênica (IPL= 185), gerando uma população F2. As plantas F2 foram inoculadas no estágio de “seedling” com a raça 1-2-1 do patógeno, que é avirulenta ao gene Pa7. As plantas que se mostraram resistentes foram descartadas, para que a seleção continuasse na ausência do gene vertical (ver item 37.4.3). O restante das plantas foi inoculado e avaliado no estágio do início da formação de suas estruturas florais, sob condições de casa-de-vegetação. Nesta geração foram selecionadas plantas F2 que apresentaram extremos de resistência, medido através do período latente. As sementes resultantes do auto-cruzamento de cada planta F2 originou famílias F3, que também foram avaliadas para período latante. Os melhores indivíduos das melhores famílias foram
selecionados e suas sementes foram utilizadas para o ciclo seguinte. O processo repetiu-se até a geração F5. A Tabela 37.8 ilustra os progressos obtidos na seleção para longos períodos latentes em dois pedigrees resultantes do cruzamento entre Cebada Capa e Vada. O pedigree 17-5-9-13. Por exemplo, originou-se de uma planta F2 que apresentou um IPL=275. O IPL médio da progênie resultante do auto-cruzamento desta planta foi de 230. Nesta família, um indivíduo que apresentou IPL=265 foi selecionado e originou uma família cujo IPL médio foi de 260. O IPL médio da progênie F6 deste pedigree foi de 329, bem superior, portanto, ao IPL do cultivar parental suscetível Vada. Como a seleção deu-se unicamente baseada em ensaios de casa-de-vegetação, o material selecionado da geração F5 foi posteriormente testadosob condições de campo (Parlvliet et al., 1985). O IPL médio destas variou entre 280 e 291, indicando uma boa correspondência entre resultados de casade-vegetação e campo. Segundo os autores, o aumento obtido no período latente através da seleção reduziu em aproximadamente 100% a severidade da doença seis semanas após o plantio, comparada à severidada verificada no cultivar parental Vada. Krupinsky & Sharp (1979) realizaram um programa de melhoramento visando a resistência poligênica à ferrugem amarela do trigo usando cultivares comerciais que apresentam níveis baixos e intermediários de resistência. O método de seleção empregado foi o do “pedigree”. Os autores hibridizaram mais de 20 cultivares de trigo e selecionaram, em cada cruzamento, os melhores indivíduos F2. As progênies destes indivíduos foram avaliadas e os melhores indivíduos selecionados. O progresso repetiu-se até a geração F6. A Figura 37,7 entre os cultivares Manitou e centana. A freqûencia de indivíduos resistentes (lesões do tipo 00,0-, 0 e 1-) aumentou de zero, na geração F2, para mais de 90%, na geração F6. O fato mais interessante é que houve segregação
transgressiva para resistência, isto é, foram obtidos indivíduos mais resistentes intermediários de resistência, (lesões do tipo 2 e 3 , respectivamente). A segregação transgressiva deu-se, neste caso, possivelmente pela combinação de genes de resistência dos dois cultivares, ilustrando a possibilidade de utilizar cultivares com níveis intermediários de resistência em programas de melhoramento.
37.4.3 Seleção de resistência oligo/poligênica na presença de resistência vertical monogênica
Resistências vertical monogênica e horizontal poligênica podem ocorrer em um mesmo genótipo. Neste Caso, de acordo com Parlevliet (1989), a seleção da resistência horizontal na presença de resistência vertical monogênica pode produzir efeito contrário ao desejado, resultando em frequências elevadas de genes de resistência vertical. Isto porque o efeito principal dos genes de resistência vertical pode fazer com que o efeito secudário dos poligenes não seja detectado sob determinadas condições experimentais (ver discussão no item 24.2.1). na tentativa de solucionar este problema, é comum a noção de que o uso de misturas de raças como inóculo reduz a variação devida à resistência horizontal. Segundo Parlevliet (1983), este procedimento é incorreto pois, quando cultivares contendo diferentes genes verticais são inoculados com uma mistura de raças, estas podem diferir quanto ao número de raças na mistura a que são resistentes. Esta diferença, por sua vez, pode acarretar uma variação fenotípica quantitativa entre cultivares que, finalmente, pode ser interpretada, erroneamente, como resultante da presença de resistência horizontal poligênica. O cultivar que apresentar uma combinção de genes que seja efetiva contra o maior número de raças na mistura apresentará, também, os menores níveis de severidade. O autor sugere que, nestes casos, uma raça com o espectro de virullência o mais amplo possível seja utilizada.
37.4.4 O efeito da Vertifolia O efeito vertifolia refere-se à erosão (perda) da resistência horizontal poligênica no processo de seleção para resistência vertical, devido a um estreitamento da base genética do material vegetal durante o melhoramento. O termo foi cunhado por Vanderplank (1963), referindo-se à erosão da resistência horizontal verificado no cultivar Vertifolia de batata, que contém os genes R3 e R4 de resistência a Phytophthora infestans. O autor conclui que quando a resistência vertical de Vertifolia é quebrada com isolados capazes de vencer os genes R3 e R4, a doença desenvolve-se mais rapidamente do que em cultivares devido ao efeito dos genes de resistência vertical. Uma vez que se inicia, pporém o progresso é mais rápido. Nos cultivares sem genes verticais, por outro lado, a epidemia
tem início precocemtente, mas sua taxa de progresso é reduzida. Vanderplank acredita que, durante o melhoramento de Vertifolia, os genes de resistência horizontal foram descartados, ao passo que nos cultivares sem genes de resistência horizontal foram descartados, ao passo que nos cultivares sem genes verticais ainda há um nível de resistência horizontal suficiente para reduzir a taxa de progresso da epidemia. A erosão da resistência pode ocorrer mesmo em casos onde a seleção não é intencionalmente voltada para a resistência vertical. Davis et al. (1990) relataram a erosão de resistência a Puccinia sorghi em uma população de milho doce submetida a 10 ciclos de seleção massal para várias características agronômicas, exceto para resistência a P. Sorghi. Foi verificado um significativo aumento da suscetibilidade média da população melhorada em relação a população original, evidenciando a perda de genes de resistência durante a seleção. A erosão, segundo os autores, pode ser devida à associação da resistência com características agronômicas indesejáveis, que foram eliminadas durante a seleção. Um outro mecanismo de erosão genética é a deriva genética , muito freqüente em populações pequenas. Segundo Falconer (1989), em populações pequenas a frequência de genes que não estão sob pressão seletiva tende a variar de geração em geração de maneira aleatória devido, principalmente, a efeitos de amostragem. A deriva tem um efeito cumulativo em populações sob seleção, porque a freqüência de um certo gene em uma dada geração é que as freqüências irão se alterar cada vez mais até atingir um de dois extremos: a fixação (quando a freqüência do gene for igual a 1,0) ou a extinção (quando a freqüência do gene for igual a 0,0). No caso do cultivar Vertifolia, é possível para os genes R3 e R4. O melhorista pouco pode fazer para evitar a deriva. Ela pode ser atenuada, no entanto, se o tamanho da população for aumentando ou, ainda, selecionandose, ao mesmo tempo , para resistência vertical e horizontal.
37.5
ESTRATÉGIAS DE USO DA RESISTÊNCIA VERTICAL MONOGÊNICA
Cultivares que possuem resistência vertical geralmente mantêm-se resistentes apenas por um período de tempo devido ao aparecimento (por mutação) e/ou à seleção de genes correspondentes de virulência de genes de virulência é extremamente rápida e pode ser detectada de um ano para outro. Existem algumas estratégias de utilização de genes de resistência vertical que podem, no entanto, prolongar sua vida útil. Para entender os mecanismos de atuação de tais estratégias na população patogênica faz-se entender os mecanismos de atuação de tais estratégias na população patogênica faz-se necessário introduzir os conceitos de seleção estabilizadora e direcional.
37.51 Seleção estabilizadora e direcional as estratégias que serão discutidas a seguir baseiam-se no princípio proposto por Vanderplank (1963) de que “raças com genes desnecessários de virulência são menos áptas em sobreviver”.
O experimento de Watson & Singh (1952) ilustra este. Nesse
experimento, foram inoculadas, ao mesmo tempo, num cultivar de trigo com o gene R1 de resistência vertical, duas ou três raças de Puccinia graminis f.sp. tritici que diferiam entre si no número de genes de virulência. Através de isolamentos e inoculaçòes sucessivas, foi possível demostrar, claramente, que raças com genes desnecessários de virulência tem menor capacidade adaptativa quando comparadas com raças sem genes desnecessários ou com um menor número deles. Os resultados estão sumarizados na Tabela 37.9.
Tabela 37.9- Efeito da passagem através do cultivar Federation sobre a porcentagem de várias raças de Puccinia graminis f.sp. tritici (estraído e modificado de Vanderplank, 1963. Dados originais de Watson & Singh, 1952). Mistura
Raças*
Mistura
Raças
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Número de passagens em Federation (R1)
1
3
4
5
(1)
69.0
85.5
86.4
88.8
(1,2)
31.0
14.5
13.6
11.2
(1,2)
71.3
90.4
90.8
86.5
(1.2.3)
28.7
9.6
9.2
13.5
(1,2)
61.1
58.6
56.6
47.7
(1.3)
38.9
41.4
43.4
52.3
(1)
84.9
96.6
97.8
95.2
(1,2,3)
15.1
3.4
2.2
4.8
(1)
65.7
82.1
77.0
72.6
(1,3)
34.3
17.9
23.0
27.4
(1,2,3)
65.6
4.7
8.3
5.2
(1.3)
34.4
95.3
91.7
94.8
(1)
57.9
68.5
63.8
74.2
(1,2)
33.2
30.4
35.4
25.4
(1,2,3)
8.9
1.1
0.8
1.4
(1)
52.9
68.1
378.1
71.5
(1,2)
9.4
4.0
3.2
3.7
(1,3)
37.7
27.9
18.7
24.8
(1)
66.2
92.1
089.7
87.2
(1,2,3)
19.9
1.1
0.8
0.5
(1.3)
13.9
6.0
9.5
12.3
*A nomeclatura das raças de Puccinia graminis f.sp. tritici foi alterada visando maior clareza. Na realidade, a raça (1) corresponde à raça 126-6; a raça (1,2) à 126-6; a raça (1,3) à 222-2,6 e a raça (1,2,3) corresponde à raça 222-1,23.
O postulado de Vanderplank implica na presença de um mecanismo de
homeostase genética , onde a freqüência de genes de virulência em determinada população do patógeno, após ser perturbada por algum evento(como a introdução de um cultivar resistente), tende a reverter o seu estado original quando da remoção do evento perturbador. Este mecanismo foi demostrado por Vanderplank de seleção estabilizadora , em contraste com a seleção direcional , onde ocorre a seleção em direção à virulência. Imagine-se, como exemplo, que um cultivar R1 de um hospedeiro qualquer esteja sendo cultivado numa grande extenção de terra. No início, ocorre seleção direcional favorecendo a raça que tem o genótipo suficiente para quebrar a resistência conferida por R1; a raça que contém o gene 1 de virulência. Se o cultivar for substituído por um outro contendo os genes R1 e R2, a população do patógeno, também por seleção direcional, passará a se constituir, em sua maioria, de indivíduos da raça contendo os genes 1 e 2 de virulência. Se, após algum tempo o cultivar R1R2 for substituído por R1, a raça (1,2) do patógeno, embora virulenta em R1, estaria menos apta a se adaptar às novas condições do que a raça (1), pois carrega um gene desnecessário de virulência (o gene 2). Desta forma, ocorreria seleção estabilizadora favorecendo a raça (1), que voltaria a prevalecer no campo. Um exemplo concreto da ocorrência da seleção direcional e estabilizadora foi relatado por Watson & Luig (1963). Esses autores acompanharam o comportamento do patógeno, Puccinia graminis f.sp. tritici, quando o cultivar de trigo Eureka foi introduzido na Austrália, em 1939. Os dados obtidos pelos autores estão presentes na Figura 37.8. Na figura,
vê-se claramente que em 1939, quando Eureka foi introduzida, não existia,
praticamente, a raça de ferrugem capaz de atacá-la. Logo em seguida, porém, essa raça começou a aumentar, até causar uma severa epidemia, por volta de 1945, quando Eureka foi abandonada pelos agricultores. A partir daí, a raça que possuía o gene de virulência capaz de vencer a resistência de Eureka começou, cada vez mais, a tornar-se menos prevalecente, até desaparecer quase que completamente por volta de 1960. Desse ano em
diante, no entanto, o cultivar Eureka voltou a ser cultivado em larga escala, fato que foi acompanhado, novamente, por um aumento significativo da população da raça em questão. Neste exemplo real, a pressão seletiva que obrigou a população do patógeno a mudar foi o cultivar Eureka, ficando bem evidenciada a ação da seleção estabilizadora quando a pressão seletiva deixou de existir.
37.5.2 Piramidamento de genes O piramidamento de genes é uma estratégia de usode genes de resistência vertical cujo objetivo é o de previnir o aparecimento de novas raças do patógeno. Segundo esta estratégia, vários genes de resistência vertical são incorporados em um único cultivar. O sucesso do piramidamento depende da premissa de que a probabilidade de aparecimento de uma “super-raça”, contendo todos os genes de virulência necessários para atacar esta combinação de genes de resistência, é muito baixa. Assim, quanto maior o número de genes incorporados, mais longeva será a resistência do cultivar. No entanto, os crítocos do piramidamento acreditam que o aparecimento de “super-raças” não é um evento tão raro, ainda mais sob a prática do piramidamento, uma vez que esta acaba impondo uma pressão direcional tremenda em favor das “super-raças”. Aparecendo numa “super-raça”, argumentam os críticos, os genes de resistência serão utilizados de uma só vez, ko que seria uma catástrofe. Como discutido anteriormente, o piramidamento pode ser obtido por meio de retrocruzamento,. Este foi o método utilizado por Flor & Comstock (1971), por exemplo, para desenvolver um cultivar de linho contendo vários genes de resistência a Melampsora lini.
O processo de obtenção de pirâmide de genes é muito lento e culstos, o que representa
uma séria limitação da estratégia (Fehr, 1987). O uso do piramidamento tem sido preconizado no controle da ferrugem do feijoeiro (Beebe & Corrales, 1991) e utilizado em vários patossidtemas (Pedersen & Leath, 1988), mas a eficiência de tal estratégia em prolongar a longevidade de genes de resistência ainda está por ser demonstrada.
37.5.3 Rotação de genes O princípio da rotação de genes é o mesmo da rotação de culturas usado no controle de certas doenças (ver capítulo 35). O objetivo é o de reduzir a pressão da seleção direcional, reduzindo a pressão para o aparecimento de novas raças. Um certo cultivar contendo um gene de resistência vertical R1 é usado até que surja uma raça (1) capaz de quebrar sua resistência. Esete cultivar é então sustituído por um outro contendo um gene diferente de resistência (2). Após alguns anos, retorna-se ao cultivar R1, fechando o ciclo de rotação. A rotação de genes foi utilizada na Austrália entre 1938 e1950 no controle da ferrugem do colmo em trigo. Também foi recomendada como medida de controle de doenças do arroz pelo Instituto Internacional de Pesquisas do Arroz (IRRI), em 1980 (Singh, 1986). A estratégia requer um alto grau de cooperação por parte dos agricultores, o que pode representar um sério fator limitante uma vez que o agricultor, geralmente, não é muito afeto a trocar, anualmente, de cultivar.
37.5.4 Multilinhas As multilinhas são uma mistura de linhagens agronomicamente semelhantes (ou quase idênticas), mas que diferem entre si por possuírem, cada qual, um diferente gene de resistência vertical. As multilinhas são o oposto da pirâmide de genes pois, na pirâmide, os genes são concentrados em um único indivíduo. Ao passo que nas multilinhas, os genes estão distribuídos em indivíduos de linhagens diferentes. O objetivo desta estratégia é o de estabilizar a estrutura racial da população patogênica, minimizando as possibilidades de aparecimento de novas raças. Existem dois conceitos de multilinha (marshall & Pryor, 1978): a multilinha
suja (“dirty crop”) e a limpa (“clean crop”). Na multilinha suja, nenhuma das linhagens usadas na mistura é resistente a todas as raças do patógeno. A denominação “suja” vem do fato de que a doença sempre estará presente no campo, embora em níveis reduzidos. Na multilinha limpa, ao contrário, são usadas linhagens que possuem genes diferentes que
conferem resistência à maioria das raças do patógeno prevalecentes no local, com o intuito de obter um campo limpo, livre de doença. O uso de multilinhas sujas tem duas conseqüências importantes para o controle de doenças: reduz o inóculo inicial e a taxa progresso da doença e estabiliza a composição racial da população patogênica (Marshall,1989). As conseqüências epidemiológicas das multilinhas sujaspodem ser ilustradas com o seguinte exemplo. Considere uma multilinha composta por quatro linhagens, cada qual contendo um gene de resistência: R1, R2, R3 e R4. Assim, a raça do patógeno(1) pode atacar a linhagem R1, a raça (2), a linhagem R2, a raça (1,2), as linhagens R1 e R2, e assim por diante. A multilinha, do ponto de vista epidemiológico, apresenta as vantagens das resistências vertical e horizontal somadas, já que tanto o inóculo inicial como a taxa de desenvolvimento da doença são diminuídos (ver item 37.3.2). Supondo que as raças (1), (2), (3) e (4) ocorram na mesma proporção, o inóculo inicial será reduzido a 25%. A texa de progresso da doença também será grandemente afetada, já que os esporos provenientes de uma planta doente terão 75% de probabilidade de caírem em alarmantes dentro da plantação é bem pequena. É digno de nota que a multilinha apresenta as vantagens da resistência horixontal mesmo que suas linhagens não apresentam elevados níveis desta. Se, porém, as linhagens forem reforçadas com algum nível de resistência horizontal em edição aos genes de resistência vertical, o resultado será, sem dúvida, uma variedade D da figura 3. O sucesso da multilinha suja depende, a exemplo do piramidamento, do não aparecimento de uma “super-raça”contendo todos os genes de virulência necessários para atacar as multilinhas da mistura. Uma raça do tipo (1,2.3.4) seria capaz de atacar todas as multilinhas do exemplo discutido acima de uma só vez. Então, qual a diferença entre o piramidamento e a multilinha no que diz respeito ao aparecimento de novas raças? A diferença, clamam os defensores das multilinhas, está na intensidade da seleção direcional. Num campo com genes piramidados, existe uma enorme pressão para a seleção de uma “super-raça”, pois o patógeno não tem altlelrnativa: ele só sobreviverá se possuir todos os genes necessários para atacar o cultivar. Na multilinha, ao contrário, a pressão de seleção direcional é relaxada, uma vez que sempre existirá uma linhagem suscetível. Com o
relaxamento da seleção direcional, aumenta a seleção estabilizadora contra genes desnecessários de virulência, o que, por sua vez, garante a não seleção de “super-raças”. Multilinhas têm sido empregadas no controle de doenças de culturas autógamas, tais como trigo e aveia. A Fundação Rockfeller, por exemplo, lançou um programa de desenvolvimento de multilinhas de trigo para o controle da ferrugem do colmo. A primeira multilinha, denominada de Miramar 63, foi lançada na Colômbia, no início da década de 60 (Singh, 1986). A multilinha era composta pelas dez linhagens mais resistentes selecionadas entre 1200 resultantes de 600 cruzamentos envolvendo o cultivar brasileiro Frocor. Dois anos após o início da utilização de Miramar 63, duas linhagens tiveram que ser substituídas, pois apresentavam níveis elevados da doença. Apesar disso, as perdas econômicas sempre se mantiveram abaixo de 20%.o programa de melhoramento de trigo do Centro Internacional de Melhoramento do Milho e Trigo (CIMMYT), no México, também desenvolve multilinhas resistentes à ferrugem do colmo, ferrugem da folha e septorioses. Um exemplo é a multilinha obtida através do cruzamento do cultivar “Siete Cerros”com mais de 500 cultivares ou linhagens provenientes de várias partes do mundo (Fehr, 1987). Um outro exemplo do uso de multilinhas é o programa de melhoramento de aveia para rresistência a Puccinia graminis f. sp. Avenae e Puccinia coronata, desenvolvido pela Universidade de Iowa (Browning & Frey, 1969), no qual mais de 25 genes de resistência foram incorporados, via retrocruzamento, a linhagens isogênicas, resultando em seis diferentes multilinhas. O programa de melhoramento do Instituto de Melhoramento Vegetal de Cambridge, desenvolvido por M.S. Wolfe e colaboradores, também faz uso de uma mistura, não de linhagens, mas de cultivares comerciais, numa estratégia bem semelhante ao das multilinhas. A diferença, neste caso, é que a mistura envolve um número reduzido de cultivares comerciais, cada um apresentando um certo nível de resistência ao espectro de raças presentes na área.embora os efeitos epidemiológicos das misturas de cultivares sejam essencialmente os mesmos das multilinhas, os genes de resistência utilizados não seriam “fortes” o suficiente para garantir o aparecimento de “super-raças”. Segundo Wolfe e seus colegas, a composição da mistura deve ser alterada antes que a freqüência da “super-
raça”atinja níveis epidêmicos, de modo a causar um contínuo desequilíbrio nas forças seletivas que agem na composição racial da população patogênica.
37.5.5 Distribuiçã geográfica de genes de resistência A estratégia de distribuição geográfica de genes de resistência equivale, na prática, a um sistema multilinhas em escala maior. Segundo esta estratégia, o plantio de cultivares contendo genes de resistência segue um padrão planejado de distribuição geográfica. No caso das ferrugens dos cereais no hemisfério norte, por exemplo, o padrão de distribuição dos genes de resistência seguiria o caminha anualmente trilhado pelo patógeno, a chamada “trilha da Puccinia”. Para entender melhor o exemplo, deve-se considerar que a erradicação do hospedeiro alternativo da Puccinia graminis f. sp. Tritici, o Beriberis vulgaris ,
criou uma situação na qual o patógeno não pode mais sobreviver no
campo na fase de écio durante o inverno. Seu ciclo de vida foi reduzido à fase uredinial, que ocorre no trigo (ver capítulo 4). Dessa forma, o patógeno tem que forçosamente, acompanhar os plantios de seu hospedeiro. A “trilha de Puccinia”ocorre no hemisfério norte porque os plantios, durante o inverno, são feitos no sul e, gradativamente, acompanhando as mudanças de estação, atravessam o continente, estendendo-se até o Canadá, lá chegando durante o verão. Assim sendo, as epidemias que ocorrem no norte são dependentes de inóculo produzido no sul. Esta interdependência, na opinião de Browning Frey (1969), pode ser explorada com genes de resistência vertical, de modo a reduzir o inóculo inicial. Segundo os autores, se diferentes genes de resistência forem usados em plantios do sul e do norte, o inóculo produzido em uma área seria avirulento em outra quebrando, desta maneira, a “trilha da Puccinia”. A estratégia é extremamente elegante e engenhosa e foi sugerida, também, para o controle da ferrugem de aveia e da podridão de Phytpphthora em soja no norte dos EUA, assim como para o controle da ferrugem da folha do trigo na Índia. A estratégia requer a existência de um certo número de genes de eficiência similar no controle das raças prevalecentes na área, assim como uma intensa cooperação entre melhoristas, fitopatologistas e agricultores. Segundo Fehr (1987), exemplos de uso da estratégia em grande escala nos EUA são raros, primariamente devido à dificuldade de encontrar genes
de eficiência similar. Segundo o autor, caso um gene mostre-se superior aos outros, ele será o preferido entre os melhoristas, que acabam relegando os demais a um segundo plano.
37.6 SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES: UMA NOVA PERSPECTIVA NO CONTROLE GENÉTCO Um dos maiores problemas associados ao melhoramento de resistência poligênica reside na difícil identificação de todos os genes responsáveis por esta característica. No caso de resistência monogênica, o problema não é tão grave assim, uma vez que, como foi visto, estes genes exercem uma grande influência sobre o fenótipo. No caso de poligenes, ao contrário, a contribuição fenotípica individual de cada gene não é tão evidente. A solução ideal seria “marcar” cada um dos poligenes, de modo que a seleção destes pudesse ser monitorada durante o programa de melhoramento. A idéia de usar marcadores em programas de melhoramento não é nova. Thoaday (1691)foi quem primeiro reconheceu a possiblidade do uso de características fenotípicas controladas por monogenes como marcadores para a seleção indireta de poligenes. A idéia é muito simples: se um poligene estiver em ligação (“linkage”) com um monogene que causa um efeito facilmente detectável no fenótipo, então pode-se selecionar indiretamente o poligene baseado no efeito fenotípico do gene vizinho. É claro qua a eficiência desta seleção vai depender muito de quão próximo do cromossomo estão os dois genes. Quanto mais próximos, menor a probabilidade de que os genes sejam separados por permuta. Para ilustrar esta idéia, tome-se o exemplo da resistência de repolho a Xanthomonas campestris pv. campestris
(Camargo, 1994). A resistência da linhagem
Badger Inbred-16 é oligogênica, envolvendo pelo menos quatro genes. Uma planta desta linhagem foi cruzada com uma planta da linhagem de brócolis Cr-7, suscetível ao patógeno. A análise genética da segregação da resistência revelou que dois dos oligoligenes estão em ligção com dois genes que controlam o comprimento do pecíola da folha, de modo que plantas resistentes apresentam pecíolos curtos em plantas suscetíveis apresentam, pecíolos longos (lembre que a folha de repolho é séssil, enquanto que a folha de brócolis possui um longo pecíolo. Desta fpr, a transferência dos dois genes de resistência da linhagem Badger Inbred-16 para linhagem Cr-7 poderia ser feita indiretamente, \selecionando-se as plantas
com menor pecíolo. Neste caso, o comprimento do pecíol,o estaria sendo usado como um marcador fenotípico. O exemplo usado acima apresenta algumas limitações práticas. A primeira diz respeito ao nível de polimorfismo do marcador. O comprimento do pecíolosó pode ser usado em cruzamentos repolho versus brócolis, e não em cruzamentos existe pouca ou nenhuma variação para comprimento de pecíolo (diz-se que o marcador não é polimorfo nestes casos). A segunda limitação deve-se às características agronomicamente indesejáveis que podem ser conferidas pelo gene marcador. Usando-se o comprimento de pecíolo para a seleção de genes de resistência no cruzamento brócolis versus repolho, resultariam linhagens resistentes de brócolis com folhas sésseis ou de pecíolo curto, que fogem do padrão estético tradicional do brócolis (folhas largas e de longo pecíolo); neste caso, poderia haver uma rejeição de mercado aos novos cultivares de brócolis. A terceira e mais importante limitação diz respeito à quantidade de genes marcadores: apenas dois dos quatro genes de resistência seriam selecionados, uma vez que os outros dois não estão ligados a outros genes que controlam o comprimento do pecíolo. As limitações impostas pelo uso de marcadores fenotípicos foram, em grande parte, suprimidas com o advento dos chamados marcadores moleculares, tais como os fragmentos de restrição de comprimento polimórfico, ou simplesmente RFLPs (ver item 26.7.1). Estes marcadores são fragmentos cromossômicos
pequenos, gerados após a
digestão do ácido nucléico com enzimas de restrição. O tamanho de fragmentos homólogos entre indivíduos distintos de uma mesma espécie pode ser altamente variável, o que pode ser visualizado sob certas condições géis de eletroforese ou membranas de nutrocelulose. Isto faz com que seja possível definir, por exemplo, de qual linhagem parental um indivíduo F2 recebeu um certo fragmento. Considere-se o cruzamento entre um indivíduo resistente e um suscetível que mostram polimorfismo para um determinado fragmento cromossômico (RFLP) e indivíduos F2 obtidos deste cruzamento, conforme ilustra a Figura 37.9. Se este fragmento vier de uma região cromossômica que esteja muito próxima a um gene de resistência, então ele deve co-segregar com o gene de resistência, isto é, a grande maioria das plantas F2 que apresentarem o fragmento da planta parental resistente deverão também ser resistentes, e a grande maioria das plantas suscetíveis deverão apresentar o
RFLP da planta parental suscetível. Se, por outro lado, o RFLP vier de uma região distante do gene de resistência, não haverá co-segregação. No exemplo da Figura 37.9, está muito claro que há co-segregação. Na prática, no entanto, devido à natureza poligênica da resistência, as diferenças não são tão óbvias, uma vez que outros genes envolvidos na resistência também estão presentes. Neste caso, recorre-se a funções estatísticas para determinar se há cosegeegação ou não (ver item 37.8 para referências sobre o assunto). Os RFLPs são superiores como marcadores, pois um número virtualmente ilimitado deles pode ser obtido, possibilitando o mapeamento de todas as regiões cromossômicas e dos genes presentes nestas. Assim um RFLP pode ser identificado ligado a cada poligene de resistência. Outra vantagem é que são fenotipicamente neutros, isto é, não apresentam a desvantagem de estar associados com características agronomicamente indesejáveis. Finalmente, o nível de polimorfismo é bem superior aos marcadores fenotípicos . A identificação de genes responsáveis por características quantitativas por meio de marcadores
moleculares permite a manipulação individual de cada um,
essencialmente como se fosse genes mendelianos, seguindo a idéia de H. Nilsson-Ehle, discutida no início do capítulo 24, de características quantitativa podem ser vistas como fruto da presença de vários genes mendelianos, cada qual contribuindo para uma pequena parcela de variação fenotípica. A possibilidade de marcar cada poligene de resistência abre novas perspectivas no controle de diversas condições ambientais e genéticas. Por meio de cruzamentos genéticos, pode-se construir linhagens quase-isogênicas para cada poligene e estudar os efeitos de cada um, separadamente e em diversas combinações, no desenvolvimento da doença. A combinação de genes verticais e genes horizontais poligênicos pode ser obtida com relativa facilidade, possibilitando explorar as vantagens da combinação destes tipos de resistência. A transferência de genes recessivos de resistência durante o retrocruzamento também pode ser grandemente facilitada pela eliminação da necessidade de testar plligênies. Finalmente, o mais interessante é a possibilidade de piramidar vários poligênies de resistência, talvez realizando o sonho comum de
fitopatologistas e melhoristas, ou seja, a obtenção de cultivares que sejam resistentes para sempre.
37.7 BIBLIOGAFIA CITADA
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Australian Inst. Agr. Sci. 18 : 190-197, 1952. 37.8 BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA Os esforços concentrados, principalmente por parte de países desenvolvidos como os EUA, de instalar, a nível global , uma política de patenteamento de genes que porventura forem descobertos em germoplasma selvagem, tanto animal como vegetal, têm suscitado grande polêmica acerca do controle do material depositado em bancos de genes. Os intrigantes livros de Mooney (1986) e Juma (1989) trazem uma discussão profunda sobre este problema e são de leitura obrigatória para melhoristas e fitopatologistas interessados em aspectos históricos, sociais, econômicos e éticos da utilização conservação do germoplasma selvagem. O artigo de Goodman (1990) aborda os custos relativos e benefícios para a agricultura da manutenção dos bancos de germoplasma. O autor apresenta uma perspectiva histórica sobre a utilização de germoplasma selvagem em programas de melhoramento das grandes culturas, especialmente milho.
Goodman , M.M. Genetic and germ plasm stocks worth conserving. Journal of
Heredity 81: 11-16, 1990.
Juma, C. The gene Hunters: Biotechnology and the Scramble for Seeds. New
Jersey, Princeton University Press, 1989. 288 p.
Mooney, P.R. O Escândalo das Sementes . São Paulo, Livraria Nobel, 1986. 146p. Existem livros clássicos que abordam com detalhes os métodos convencionais de
melhoramento. Dentre eles, recomenda-se os livros de Allard (1960) e Fehr (1987), já citados, que são utilizados como livros de texto em disciplinas sobre métodos de melhoramento. Recomenda-se também, o livro de Hallauer & Miranda Filho (1988) para
uma discussão avançada sobre os diversos métodos de seleção massal e de progênies em espécies alógamas. Finalmente, o excelente livro de Vencovsky & Barriga (1992) trta de aspectos biométricos da seleção de caracteres quantitativos.
Hallauer, A. R. & Miranda Filho, J.B. Quantitative Genetics in Maize Breeding. Ames, Iowa State University Press, 1988, 468p.
Vencovsky, R. & Barriga, P. Genética Biométrica no Fitomelhoramento. Sociedade Brasileira de Genética, 1992, 486p. A idéia de que raças patogênicas contendo genes desnecessários de virulência são
menos aptas em sobreviver é, na verdade, um axioma proposto por Vanderplank. Existe considerável controvérsia acerca da validade deste axioma. Primeiro, porque este não foi extensivamente validado na prática. Segundo, porque não está claro se a menor aptidão de sobrevivência destas raças está ligada aos genes de virulência Per se. Recomenda-se o capítulo de Marshall sobre a validade do axioma de Vanderplank e possíveis repercussões nas estratégias de emprego de genes de resistência vertical. Os métodos de mapeamento de genes de resistência usado RFLPs como marcadores genéticos esttão descritos nos trabalhos de Edwards et al. (1987), Lander & Botstein (1989) e Tanksley é bem concisa e explanatória e apresenta as várias aplicações na agricultura do mapeamento de genes via RFLPs. Como exemplos onde a técnica foi utilizada para mapear genes de resistência oligo/poligênica, consulte Heun (1992), Nodari et al. (1993) e Young bet al. (1993), além de Camargo (1994), já citado. A revisão de Melchinger (1993) e Young et al. (1993), além de Camargo (1994), já citado. A revisão de Melchinger (1990) aborda aspectos teóricos e práticos do uso de marcadores moleculares no melhoramento visando a resistência oligogênica.
Edwards, M.D..; Stuber, C.W.; Wendel, J. E. Molecular-marker-facilitated investigations of quantitative-trait loci in maize. I. Numbers, genomic distributions and types of gene action. Genetics 116 : 113-125, 1987.
Heun, M. Mapping quantitative powdery mildew resistance of barley using a restriction fragment length polymorphism map. Genome 35: 1019-1025, 1992.
