ARTICULO ORIGINAL
Comparación de las técnicas de Willis y de Sheather para el diagnóstico coproparasitoscópico 1
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César A. Jara , Carlos A. Minchón-Medina y César Zárate3 Asmat 1
Departamento Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Perú 2 Departamento de Estadística. Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas. Universidad Nacional de Trujillo 3 Egresado de la Escuela Académico-Profesional Académico-Profesional de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo
RESUMEN Se desarrolló un estudio comparativo para evaluar evaluar la concordancia de la técnica de Willis Willis respecto de la de Sheather en la detección de protozoarios y helmintos intestinales en 98 muestras fecales correspondientes a igual número de niños aguarunas de la zona de Mesones Muro (Bagua, Amazonas, Perú). Se detectaron cinco especies de protozoarios intestinales y cinco de helmintos, de las cuales Blastocystis hominis (91.8%) fue la más frecuentemente hallada entre las primeras y A. lumbricoides (71.4%) entre las segundas, por ambas técnicas. Se encontró una elevada sensibilidad de la técnica de Willis respecto de la de Sheather para la investigación de quistes de B. hominis (97.8%) y de huevos de A. lumbricoides (91.4%) , , así como un elevado valor predictivo positivo para estos organismos y para quistes de Giardia lamblia (93.8, 88.9 y 100.0) y un elevado índice de concordancia para Entamoeba coli (kappa= 0.63) y para A. lumbricoides (kappa= 0.64). En conclusión: es posible la utilización de la técnica de Willis para la detección de quistes de B. hominis y de E. coli, así como de huevos de A. lumbricoides con la misma eficacia que la técnica de Sheather.
Palabras clave: Técnica coproparasitoscopica de Willis, de Sheather, índice de concordancia, aguarunas, Bagua-Amazonas-Perú
ABSTRACT A comparative study was developed to evaluate the concordance between the Willis (satured saline-flotation) and Sheather (sugar-flotation) techniques in the detection of intestinal protozoan and helminthes in ninety-eight native aguarunas from Mesones Muro Village (Bagua, Amazonas, Peru). It was detected five species of protozoan parasites and five species of intestinal helminthes. Of them, Blastocystis hominis (91.8%) was found with the highest frequency among the protozoan and Ascaris lumbricoides (71.4%) among the helminth parasites, by both of coprological techniques used. It was found too high sensitivity of Willis technique related to Sheather technique to investigation of B. hominis cists (97.8%) and A. lumbricoides ova (91.4%), as well as, high positive predictive value for these organisms and for Giardia lamblia cists (93.8, 88.9 y 100.0) and high concordance index for Entamoeba coli cists (kappa= 0.63) and for A. lumbricoides ova (kappa= 0.64). It was concluded that it’s possible the using of Willis technique with the same efficiency of Sheather technique for the detection of cists of B. hominis and E. coli, as well as, for A. lumbricoides ova
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Key words: Willis technique, Shather technique, concordance index, aguarunas, BaguaAmazonas-Peru
INTRODUCCIÓN Las infecciones por protozoarios y helmintos intestinales constituyen las dolencias crónicas más frecuentes en muchos países del mundo, en especial en zonas rurales donde causan disminución de la capacidad productiva de individuos adultos parasitados y la falta de crecimiento, aprehensión y desarrollo cognoscitivo en niños y adolescentes 1,2, 3, 4. Siendo tan frecuentes, el diagnóstico de rutina de tales infecciones intestinales se ejecuta mayormente por la técnica denominada en fresco, que por su simpleza y bajo costo se ha convertido en una técnica universal; sin embargo, es poco sensible 5,6 lo que ha conducido ha tener en cuenta la importancia de someter una muestra fecal adicionalmente a una o más técnicas de concentración para aumentar la sensibilidad y confiabilidad en el hallazgo de las formas parasitarias, sobre todo cuando la carga parasitaria es baja 7. Tales técnicas de concentración, que permiten el análisis de mayor cantidad de muestra en comparación a la técnica en fresco, se dividen en dos grupos: las de flotación, que emplean soluciones densas de modo que las formas parasitarias floten en el depósito de análisis, y las de sedimentación, que por el contrario utilizan soluciones menos densas y las formas parasitarias deberán buscarse en sedimento luego de ejecutada la técnica 5,6. Las técnicas de concentración, por usar equipos y reactivos diferentes, poseen distinto grado de sensibilidad y de uso existiendo preferencias por parte del laboratorista por el uso de unas u otras. Siendo así, ha resultado importante someterlas a evaluaciones que, en definitiva, es parte del proceso de validación que conduce a acreditar el uso de ell as 8.,9,10,11 o realizar comparaciones bajo ciertos parámetros a fin de determinar las bondades de cada una y posterior uso 12,13,14,15,16. Por la sencillez de su ejecución y por utilizar reactivos de uso común, dos son las técnicas de flotación más frecuentemente usadas: la de Willis, que utiliza solución saturada de NaCl 22 y la de Sheather 1, que usa solución saturada de azúcar y centrifugación; sin embargo, resulta necesario determinar si la primera, que es más ventajosa por prescindir del uso de equipos distintos al microscopio compuesto, tiene la misma eficacia en la detección de protozoarios y helmintos intestinales del hombre que la segunda que ha demostrado alta eficacia 1,2. Teniendo en cuenta que el diagnóstico coproparasitoscópico debe ser realizado de manera apropiada, con mayor sensibilidad y especificidad para la detección de protozoarios y helmintos intestinales en lo posible con técnicas sencillas en su procedimiento y baratas de aplicación masiva, toda vez que d ellos dependerá el tratamiento específico, es que se propuso una investigación que estuvo dirigida a determinar si la técnica de Willis cuando se usa para la detección de protozoarios y helmintos intestinales del hombre resulta tan eficaz como la técnica de Sheather para tales fines.
MATERIAL Y MÉTODOS Muestras fecales Se utilizaron 98 muestras fecales positivas a una o mas especies de protozoarios y helmintos intestinales de un total de 212 muestras obtenidas de igual número de niños de comunidades Aguarunas de la zona de Mesones Muro, provincia de Bagua, Departamento de Amazonas, en el Alto Marañón (Perú), cuyos resultados fueron publicados en un trabajo previo 17. Los niños participantes en dicho estudio tenían entre seis y 11 años de edad, estaban aparentemente sanos, concurrían con normalidad al colegio y vivían en comunidades cuyas habitaciones estaban construidas de madera con techo de palma y carecían de luz, agua potable y de Infra-estructura básico sanitaria. En dicho estudio, asimismo, se cumplieron con dar charlas de prevención y de cumplir con los requisitos éticos. Para la detección de protozoarios y helmintos intestinales se utilizaron, en dicha ocasión, las técnicas en fresco (con solución salina fisiológica y lugol), de Teleman y de Kynioun 17
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Técnicas coproparasitoscópicas. Se compararon las técnicas de Willis, tal como se halla descrita en el Manual de Métodos básicos de laboratorio en Parasitología proporcionada por la Organización Mundial de la Salud 5 mientras que la técnica de Sheather usada es la descrita en el Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre propuesto por el Instituto Nacional de Saluid 4. Por sus antecedentes de mayor sensibilidad 1, la técnica de Shether fue tomada como la “gold estándar”
Tratamiento estadístico Los datos obtenidos fueron analizados utilizando el programa computarizado EPIDAT, versión 3.1, a fin de determinar la sensibilidad, especificidad, índice de predictibilidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, el índice de concordancia y probabilidad, con un nivel de confianza del 95%.
RESULTADOS En las 98 muestras fecales investigadas se detectaron cinco especies de protozoarios intestinales y cinco de helmintos. Blastocystis hominis fue el protozoario detectado con mayor frecuencia tanto por la técnica de Willis como la de Sheather y Giardia lamblia el detectado con menor frecuencia, también por ambas técnicas (Tabla 1). Respecto de los helmintos, Ascaris lumbricoides fue el más frecuentemente detectado por ambas técnicas, en tanto que las demás especies sólo fueron detectadas por la técnica de Sheather (Tabla 1). Se encontró elevada especificidad de la técnica de Willi s respecto de la de Sheather cuando se trata de detectar quistes de B. hominis (97.8%) y huevos de A.lumbricoides (91.4%), por el contrario, se encontró baja especificidad para estos parásitos pero alta, del 100%, para el cas o de G. lamblia y F. hepatica (Tabla 2). Se encontró, asimismo, como se muestra en la misma Tabla 2, que el índice de validez fue mayor para el caso de los helmintos que para los protozoarios intestinales y que el valor predictivo positivo fue elevado cuando se pretende encontrar quistes de B. hominis (93.8%) y de G. lamblia (100.0%) y, por el contrario, el valor predicitivo negativo fue alto para la detección de parásitos distintos a estos últimos. El índice de concordancia (valor kappa) fue relativamente alto sólo para el caso de cuando se quiere detectar la presencia de qustes de E. coli y de huevos de A.lumbricoides, asimismo, se encontró una diferencia significativa (p<0,05) cuando se trata de utilizar las técnicas en el hallazgo de los protozoarios, a excepción de B. hominis (Tabla 2)
Tabla 1. Frecuencia de infección por protozoarios y helmintos intestinales en 98 muestras fecales positivas a dichos organismos pertenecientes a niños aguarunas de Wawico, Bagua, Amazonas-Perú* detectadas por las técnicas de Sheather y de Willis
Técnica Protozoario o helminto
Sheather Willis N°(%) N°(%)
Blastocystis hominis Entamoeba coli Iodamoeba butchslii Endolimax nana Giardia lamblia
92(93.9) 50(51.0) 46(46.9) 12(12.2) 10(10.2)
90(91.8) 40(40.8) 20(20.4) 04(04.1) 02(02.0)
Ascaris lumbricoides Trichocephalus trichiura Necator/Ancylostoma Fasciola hepatica Enterobius vermicularis
70(71.4) 06(06.1) 04(04.1) 04(04.1) 02(02.0)
64(65.3) 00(00.0) 00(00.0) 00(00.0) 00(00.0)
*Los datos completos de la investigación respecto de la prevalencia han sido publicados previamente
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Tabla 2. Comparación de la técnica de Willis en relación a la técnica de Sheather en la detección de protozoarios y helmintos intestinales en 98 muestras fecales ,positivas a dichos organismos, pertenecientes a niños aguarunas de Wawico, Bagua, Amazonas-Perú*
Protozoo o helminto
Willis/
Sheather
S%
E%
Índice de validez
VP+
VP-
Kappa
p
Positivo
Negativo
Blastocystis hominis Entamoeba coli Iodamoeba butchslii Endolimax nana Giardia lamblia
90/92 40/50 20/46 4/12 2/10
0/6 40/48 44/52 84/86 88/88
97.8 80.0 43.5 33.3 20.0
00.0 83.3 84.6 97.7 100.0
91.8 81.6 65.3 89.8 91.8
93.8 83.3 71.4 66.7 100.0
00.0 80.0 62.9 91.3 91.7
-0.03 0.63 0.29 0.39 0.31
0.715 0.000 0.002 0.000 0.000
Ascaris lumbricoides Trichuris trichiura Necator/Ancylostoma Fasciola hepatica Enterobius vermicularis
64/70 0/6 0/4 0/4 0/2
20/28 92/92 92/94 94/94 92/96
91.4 0.0 0.0 0.0 0.0
71.4 100.0 97.9 100.0 95.8
85.7 93.9 93.9 95.9 93.9
88.9 * 0.0 * 0.0
76.9 93.9 95.8 95.9 97.9
0.64 0.00 -0.03 0.00 -0.03
0.000 1.000 0.768 1.000 0.768
*Los datos completos de la investigación respecto de la prevalencia han sido publicados previamente 17 S= sensibilidad, E= especificidad, VP+= valor predictivo positivo, VP-= valor predictivo negativo, p= probabilidad
DISCUSIÓN La aplicación de diferentes métodos de examen de heces se torna necesaria teniendo en cuenta la gran variabilidad morfológica y biológica que presentan los protozoarios y helmintos intestinales. Los dos métodos elegidos para efectuar la presente investigación son de fácil proceso, fácil obtención de materiales y reactivos y de relativa eficacia. De ambos, la técnica de Sheather ha sido usada como patrón, toda vez que utiliza en su procedimiento la centrífuga lo que asegura que los detrituts presentes en la muestra fecal serán separados con mayor eficacia de las formas parasitarias que cuando se usa la técnica de Willis en la cual no se usa tal equipo y la separación se hace manualmente, con el uso de una bagueta de vidrio o material parecido. Al mismo tiempo, la solución saturada de azúcar utilizada en la técnica de Shetaher presenta un mayor peso específico que la solución saturada de sal utilizada en la técnica de Willis dándole una mayor eficacia en el diagnóstico. Sin embargo, como se ha mencionado, la última de las técnicas nombradas no utiliza equipos diferentes al microscopio compuesto, el ClNa 2 usado es mucho más disponible que el azúcar, las medidas recomendadas (28g para 100mL) para la preparación de la solución saturada usada en el procedimiento son más precisas que las medidas de azúcar, respectivamente, de la cual no se tiene una medida exacta 5,6. El presupuesto de que la técnica de Sheather es más eficiente que la de Willis para el diagnóstico de coproparásitos establecido en trabajos previos, ha sido corroborado luego de efectuados los análisis coproparasitoscópicos porque, como se puede apreciar en la Tabla 1, mediante la técnica de Sheather se ha detectado mayor número de especies de parásitos intestinales y en mayor frecuencia, a excepción de cuando fue utilizada para la investigación de quistes de Blastocystis hominis y de Entamoeba coli, así como huevos de Ascaris lumbricoides . Esto estaría indicando que para estos casos específicos puede usarse una u otra técnica, siendo preferible el uso de la técnica de Willis por ser, como se ha manifestado, más sencilla y barata; sin embargo, para lograr este cometido debe recomendarse que la lectura se haga antes de los 15 minutos a fin de evitar que la solución saturada de sal se des-sature. De otro modo se arribará a resultados equivocados, sobre todo para el caso de A. lumbricoides, porque se trata de un helminto cuyos huevos son más pesados que los quistes de los referidos protozoarios y, pasados entre 15 y 30 minutos, tienden a sedimentar en el depósito 5,6,7. Concordante con lo señalado en el párrafo anterior, luego de efectuar las comparaciones se encontró elevada sensibilidad solamente cuando se trata de detectar a los quistes de B. hominis y
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a los huevos de A. lumbricoides y mediana sensibilidad cuando se trata de encontrar quistes de E. coli y muy baja sensibilidad para el resto de protozoarios y helmintos buscados. Ello podría interpretarse como que la técnica de Willis tiene una eficacia en alto porcentaje para la detección de B .hominis y de A. lumbricoides que la técnica de Shather y menores porcentajes para los demás simbiontes. Anteriormente, Santos-Araujo et al7 y Rodrígues-Alarcón 11 encontraron resultados parecidos utilizando también técnicas de flotación. Si se tiene en cuenta que las técnicas usadas para la búsqueda de protozoarios y helmintos intestinales en esta investigación son cualitativas, de flotación y, por lo tanto, con los mismos principios básicos, se entenderá que en general se espera que deban tener baja especificidad, entendida ésta como la capacidad para detectar una determinada especie entre otras. Se espera, asimismo, que cuando la sensibilidad es alta, la especificidad debe ser baja y eso es los que se ha verificado. En efecto, para los casos de B. hominis y A. lumbricoides en los cuales se halló elevado porcentaje de sensibilidad es alta, el porcentaje de especificidad, por el contrario, es bajo y una de las tareas de diversos grupos científicos es encontrar técnicas de diagnóstico con elevados porcentajes (idealmente 100%) para ambos parámetros para recomendar el uso de tal o cual técnica. En el mismo sentido, se ha observado alta especificidad para el caso de helmintos intestinales y para el hallazgo de quistes de G. lamblia, hecho que nuevamente indica que para el caso de helmintos puede usarse la técnica de Willis con la misma expectativa que la otra técnica investigada y de hecho los manuales prácticos consultados: el del Instituto Nacional de Salud del Perú5 y el de la Organización Mundial de la Salud 6 recomiendan el uso de estas técnicas para la investigación de helmintos intestinales. El hecho de que el índice de validez sea mayor para el caso de la detección de la presencia de helmintos intestinales en muestras fecales que para los protozoarios estaría indicando lo que se ha señalado previamente: las técnicas de Willis comparada con la de Sheather debe preferentemente utilizarse para la búsqueda de huevos de helmintos, porque las soluciones que utiliza en el proceso son de textura gruesa comparadas con otras soluciones saturadas, como la de sulfato de Zinc que utiliza la técnica de Faust, y que detecta con mayor prestancia a protozoarios7,8 En el mismo sentido, cuando se analizan los resultados hallados respecto del valor predictivo positivo se observa que se han detectado valores altos cuando se trata de quistes de B. hominis y de G. lamblia. Esto significa que ambas técnicas son de elevada predisponibilidad para el hallazgo de dichos organismos y que puede, por lo tanto, usarse la una o la otra para tales fines con, básicamente, las mismas posibilidades de detección o de diagnóstico positivo. Igualmente sucede para el caso de A. lumbricoides , siendo el único dentro de este grupo de parásitos, pues para las demás especies los valores hallados son bajos. Probablemente esté influyendo las bajas frecuencias halladas para las especies de helmintos distintas a las de A. lumbricoides7,11,13,14. Como sucede con el caso de la sensibilidad y especificidad, cuando el valor predictivo positivo es alto, el valor predictivo negativo es bajo (Tabla 2) El índice kappa es uno de los medidores más útiles cuando se comparan la eficiencia de dos medidores utilizados, porque permite medir la concordancia o discrepancia de técnicas de coprodiagnóstico en este caso. Siendo así, en la mayoría de casos analizados el índice determinado es bajo, incluso, como cuando se trata de quistes de B. hominis y de huevos de Necator/Ancylostoma y de E. vermicularis, con valor negativo, entendiéndose que la técnica de Sheather es más eficiente que la de Willis cuando se trata de detectar a las formas señaladas; sin embargo, para el caso de quistes de E. coli y de huevos de A. lumbricoides se detectó valores por encima del 0.6, lo que significa que podría emplearse cualquiera de las dos técnicas de diagnóstico coprológico de estas últimas especies con un porcentaje esperado mayor al 50%7,8,11. Finalmente, el hecho de haber encontrado valores de p menores al 0,05 en la mayoría de protozoos, significa que los valores encontrados cuando se emplea la técnica de Willis respecto a la de Sheather son en realidad diferentes; es decir, en la mayoría de protozoos a excepción de los quistes de B. hominis, es preferible la utilización de la técnica de Sheather. Por el contrario, los valores de p en el caso de los helmintos es mayor al 0,05, lo que significa que no hay diferencia estadísticamente significativa pudiendo utilizarse una o la otra técnica con la misma eficacia para el diagnóstico de los mencionados helmintos intestinales, a excepción de A..
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lumbricoides que, como se lo señalan los otros parámetros, puede usarse la una o la otra con la misma expectativa.
REFERÉNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 2.
3. 4. 5.
6. 7.
8.
9.
10. 11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Hughes S, Kelly P. Interactions of malnutrition and immune impairment, with specific reference to immunity against parasites. Parasite Immun 2006; 28:577-588 Alvim-Matos SM, Oliveira-Assis AM, Strina A, Azevedo dos Santos L, Rego de Jesus S, LimaBarreto M. Giárdia duodenalis infection and anthropometric status in preschoolers in Salvador, Bahia State, Brazil. Cad Saúde Pública, Rio de Janeiro 2008; 24(7):1527-1535 Awasthi S, Bundy DAP, Savioli L. Helminthic infections. BMJ 2003; 327:431-433 Schaible UE, Kaufmann SHE. Malnutrition and infection: complex mechanisms and global impacts. PLoS Medicine 2007; 4(5):806-812 Beltrán M, Tello R, Náquira C. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de los parásitos intestinales del hombre. Serie de Normas Técnicas N° 37. Instituto Nacional de Salud. Lima Perú. 2003 World Health Organization. Basic laboratory methods in Parasitology. Geneva. 1997 Santos-Araujo AJU, Kanamura HY, De Sousa-Dias LC, Ferreira-Gomes J, De Moura-Araujo S. Coprotest quantitativo: quantificação de ovos de helmintos em amostras fecais utilizando-se sistema de diagnóstico comercial. Jornal Brás Patol Med Laboratorial 2003; 39(2):115-124 Mendoza D, Nuñez FA, Escobedo AA, Pelayo L, Fernández M, et al. Utilidad de 2 métodos coproparasitológicos y su empleo en un ensayo terapéutico antigiardiásico. Rev Cubana Med Trop 2003; 55(3):174-178 Lau-Chong C, Samalvides-Cuba F, Terashima-Iwashita A. Evaluación de técnicas parasicológicas en e diagnóstico de estrongiloidiasis por Strongyloides stercoralis. Rev Med Hered 2005; 16(1):11-18 Beltrán FM, Hara T, Tello CR. Evaluación de los métodos de Graham y Pin Tape en el diagnóstico de Enterobius vermicularis. Rev Peru Med Exp Salud Pública 2005; 22(1):76-78 Rodríguez-Alarcón RS, Amato-Neto V, Gakiya E, Becerra RC. Uma avaliação sobre a eficácia do método CSF no diagnóstico de helmintíases intestinais. Rev Soc Brás Med Trop 2007; 40(3):359-360 Machado RLD, Figueredo MC, Frade AF, Kudó ME, Gomes-Silva Filho, M, Povoa MM. Comparação de quatro métodos laboratoriais para diagnóstico da Giárdia lamblia em fezes de crianças residentes em Belém, Pará. Rev Soc Brás Med Trop 2001; 34(1):91-93 Rigo CR, Franco RMB. Comparação entre os métodos de Zielh-Neelsen modificado e AcidFast-Trichrome para pesquisa fecal de Cryptosporidium parvum e Isospora belli. Rev Soc Brás Med Trop 2002; 35(3):209-214 Neves-Santos LF, Lima-Cerqueira EJ, Matos-Soares N. Comparison of the tick smear and KatoKatz techniques for diagnosis of intestinal helminth infections. Rev Soc Brás Med Trop 2005; 38(2):196-198 Mendes CR, Sampaio-Teixeira ATL, Trevisan-Pereira RA, De Sousa-Dias LC. Estud comparativo de técnicas parasitológicas: Kato-katz e coprotest. Rev Soc Brás Med Trop 2001; 38(2):178-180 Intapan PM, Maleewong W, Wongsaroj T, Singthong S, Morakote N. Comparison of the quantitative formalin ethyl acetate concentration technique and agar plate culture for diagnosis of human strongyloidiasis. J Clin Microbiol 2005; 43(4):1932-1933 Ibáñez HN, Jara CC, Guerra MA, Díaz LE. Prevalencia del enteroparasitismo en escolares de comunidades nativas del Alto Marañón, Amazonas, Perú. Rev Peru Med Exp Salud Pública 2004; 21(3):126-133
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