Esther Miriam Zimmer Lederberg Stanford University laboratory
Dec. 18,1922 18,192 2 - Nov No v. 11, 2006
Estructura del fago λ
- pstM – – proteína de membrana interna- involucrada en transporte de fosfato Cambios contráctiles en fago T4
Adsorción de fagos fagos lambda a la membrana externa de E. coli
Ciclo vital del fago lambda
El fago lambda contiene un DNA lineal de 48.502 pares de bases, con una extensión 5’ de cadena simple de 12 bases en ambos extremos; estas extensiones llamadas extremos cohesivos o cos son complementarias entre sí. Durante la infección, la extensión 5’ derecha (cosR ), ), seguida por el genoma entero, entra en la célula hospedadora. Ambos cos son ligados por la DNA ligasa de E. coli , formando un DNA circular covalentemente cerrado, el cual, por acción de la DNA D NA girasa girasa de la bacteria, se convierte en una estructura superenrollada.
El DNA de lambda puede entrar en un estado durmiente (profago) integrándose en el genoma bacteriano en un lugar específico por recombinación específica de sitio, siendo propagado junto con el hospedador en la progenie subsiguiente. Este estado es llamado lisogenia. Diferentes condiciones de estrés (como la irradiación UV) pueden pueden activar al profago profago y desencadenar un ciclo lítico. attP (por attachment, unión) es la secuencia del fago que se recombina r ecombina con la
Placas de lisis formadas por el fago lambda
En el ciclo lítico, el genoma de lambda presenta dos modos de replicación
Una vez dentro de la bacteria, el DNA del fago se circulariza y es replicado bidireccionalmente (modo theta). Más tarde, cambia cambi a a un modo de círculo rodante (síntesis de DNA concatemérico lineal unido por extremos cos ). ). La molécula lineal es luego empaquetada en la cabeza después
Morfogénesis del fago lambda
host ligase
Mapa del genoma del fago lambda
Lysis and lysogeny are controlled by the proteins encoded by cro and cI genes. The lambda phage will remain in the lysogenic state if cI proteins predominate, but will be transformed into the lytic cycle if Cro proteins predominate
cI genes transcription and translation regulate lysis/lysogeny lysis/l ysogeny
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Morfogénesis de lambda
Vectores lambda • Para la producción de fagos viables, el tamaño del genoma de lambda debe estar entre un mínimo de 38 kb (78%) y 53 kb (105%). • El tercio central del genoma no es esencial para el crecimiento lítico. • Los vectores lambda pueden ser de dos tipos:
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Vectores de sustitución o de reemplazo: en ellos el fragmento central es removido y sustituído por un fragmento de DNA extraño. Aceptan fragmentos de 9 a 23 kb.
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Vectores de inserción: aceptan fragmentos de DNA pequeños (5-11 kb), que son introducidos sin la remoción del fragmento central no esencial.
Clonado en un vector lambda de sustitución
Los vectores lambda de sustitución contienen sitios de restricción flanqueando el fragmento central.
Clonado con un vector lambda de inserción
Vectores de inserción Contienen
sitio único para clonado de DNA Diseñados para ser empaquetados con o sin DNA insertado.
Vector lambda de sustitución EMBL3A Digestión del vector
Ligación selectiva de insertos de DNA digeridos con Sal I
Los sitios de múltiple clonado pueden ser separados de los brazos por precipitación diferencial con isopropanol (son pequeños y permanecen permanecen en el sobrenadante).
En este tipo de vectores se puede impedir la religación del fragmento central y de los brazos digiriendo el fago con dos enzimas de restricción diferentes en c ada uno de los dos sitios de múltiple clonado que flanquean el fragmento central. A su vez, la ligación de los brazos entre sí puede evitarse tratándolos con fosfatasa alcalina.
Digestión parcial de un fragmento de DNA con una endonucleasa de restricción de tipo II. Las digestiones parciales son realizadas usualmente variando variando ya sea el tiempo o la cantidad de enzima usada para la digestión. En algunas de las moléculas de DNA la enzima ha cortado en todos los sitios (marcados como RE1). En otras moléculas ha ocurrido un menor número de rupturas. El resultado deseado es una muestra con moléculas de DNA de todas las longitudes posibles.
Producción de fragmentos de restricción que se solapan mediante digestión parcial de DNA genómico con Sau 3A. 3A. El uso de estos fragmentos superpuestos aumenta aumenta la probabilidad de que todas las secuencias en el DNA genómico estarán representadas en una biblioteca de lambda.
Construcción de una biblioteca genómica usando un vector lambda de sustitución y digestión parcial con RI Eco RI
Construcción de una biblioteca genómica usando un vector lambda de sustitución y digestión parcial con 3A Sau 3A
Empaquetamiento in vitro
El empaquetamiento in vitro en la cápside del fago lambda puede r ealizarse usando una mezcla de lisados de dos lisógenos mutantes. Ninguno de los lisógenos aislados es capaz de empaquetar el DNA del fago. La proteína E es el componente principal de la cabeza del fago, y en su ausencia todos los componentes de la cápside se acumulan. La proteína D está involucrada en dos procesos acoplados: inserción del DNA en la precabeza precursora y en la subsiguiente maduración de la cabeza. Cuando los extractos se mezclan, partículas de fago maduras son producidas por complementación.
Otro método de empaquetamiento in vitro El fago lisógeno del extracto 1 presenta una mutación en el gen E. Este extracto contiene colas y la proteína A. Para formar cabezas, le falta E.
El fago lisógeno del extracto 2 tiene una mutación en el gen A. Este extracto contiene cabezas vacías (no pueden ser llenadas en ausencia de A).
Selección de fagos recombinantes En el caso de los vectores de sustitución, los dos brazos purificados no pueden ser empaquetados aunque se liguen entre sí (están por debajo de la longitud mínima para el empaquetamiento). Esto provee una selección positiva de los recombinantes. Si no se purifican previamente los brazos, se debe emplear un método que seleccione sólo los fagos recombinantes, eliminando eliminando los fagos no recombinantes (salvajes) reconstituídos (por ejemplo, infección de una cepa de E. coli lisogénica para el bacteriófago P2). Otro método de selección: gen lacZ en el fragmento central (selección azul-blanco).
En los vectores de inserción, para la distinción entre fagos recombinantes y no recombinantes generalmente se explota la inactivación insercional de alguna función biológica (gen cI del represor de lambda , gen lacZ, etc.)
Un método de selección de fagos recombinantes
El reemplazo del fragmento central de relleno conteniendo los genes red (formación de multímero) y gam (switch de replicación bidireccional a círculo rodante) en el vector de sustitución lambda EMBL3 con insertos que tengan extremos Bam HI HI compatibles de ~10-20 kb permite el crecimiento lítico de los fagos recombinantes en cepas de E. coli lisogénicas para el bacteriófago P2 (fenotipo Spi – , not sensitive to P2 inhibition). Para empaquetamiento necesitan
Selección por clonado insercional en el gen cI del vector de clonado lambda-gt10
Este vector de inserción puede aceptar insertos de DNA de ~1-5 kb. Los fagos recombinantes pueden ser seleccionados en cepas mutantes hfl (h igh igh f requency requency of l ysogeny) ysogeny) de E. coli . En mutantes hflA, la expresión del gen cII de lambda es elevada, lo que resulta en la inducción transcripcional del gen cI para el represor, promoviendo la vía lisogénica. La interrupción de la secuencia codificante de cI por inserción de DNA en el sitio Eco RI RI único del vector bloquea el camino lisogénico, lo que lleva lleva a lisis celular y formación de placas.
a) Inactivación por inserción del gen Lac Z´ Agar + x-gal + IPTG Placas claras = recombinantes Placas azules = no recombinantes
b) Selección usando el fenotipo Spi Profago P2 Solo los fago recombinante puede infectar fago no recombinante no
Physical Mapping Systems
Yeast Artificial Chromosomes (YACs) 200-2000 kb
Bacteriophage P1 90 kb
Cosmids 40 kb
Bacteriophage
9-23 kb
C l o n a c i ó n d e l D N A
Cósmido
Clonado en cósmidos
El cósmido es cortado en el sitio Bgl II II cercano al sitio cos . El DNA genómico donante es cortado usando Sau 3A, 3A, lo cual da extremos cohesivos compatibles con Bgl II. II. La mezcla de DNA DN A vector y donante resulta en concatémeros.
Clonado en cósmidos (continuación)
Luego de un empaquetamiento in vitro e infección con los fagos resultantes, los cósmidos se recircularizan dentro de la célula bacteriana y se comportan como plásmidos.
Clonado en cósmidos
Concatémero de cósmidos no recombinantes Segmentos de DNA extraño ligados entre sí Concatémero de cósmidos recombinantes
Vectores BAC (Bacterial Artificial Chromosome) Derivados del factor F, un plásmido monocopia de E. coli de alrededor de 100 kb. En el vector se conservaron sólo los genes que controlan el número de copias (parA y parB ), ), y la replicación (oriS y repE ). ). Se agregaron un gen de resistencia a antibiótico (para seleccionar las bacterias que reciben BAC), y un gen lacZ con un sitio de clonado en su interior. interi or. Esto permite una selección azul-blanco (los plásmidos recombinantes son blancos en placas con X-Gal. Los BAC pueden aceptar insertos de hasta 300 kb y se introducen en las bacterias por electroporación.
Clonado en BAC: los BAC recombinantes pueden ser distinguidos de los vectores ligados entre sí o de los fragmentos de DNA DN A extraño ligados entre sí (éstos no tienen resistencia antibiótica y mueren).
El vector derivado del f ago P1 permite el clonado de fragmentos de hasta 100 kb. Aquí se esquematiza el plásmido vector Ad10 que incorpora varios elementos del genoma de P1: pac , el sitio de empaquetamiento de P1, y los dos sitios loxP , reconocidos por la recombinasa del fago, producto del gen cre. El vector es digerido y se generan dos brazos, uno corto y otro largo. Fragmentos de DNA extraño, seleccionados por tamaño, son ligados. Empaquetamiento in vitro, con extractos conteniendo pacasa (rompe en el pac e inserta el DNA en la cabeza, hasta que ésta se llena. Se une la cola. En una cepa de E. coli con el gen cre , el producto de este gen actúa en los sitios loxP produciendo un plásmido circular de bajo número de copias, pero que puede ser amplificado induciendo el replicón lítico de P1.
Vectores eucarióticos Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs): Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura) Puede incorporar más de 500 kb de DNA •
Resistencia a antibiótico (p.e., amp r )
Origen de replicación del DNA de levadura (ARS) Región centromérica (CEN)
Origen de replicación bacteriano (ori )
Linealización (con endonucleasas) y adición de extremos teloméricos
Telómero
ampr
ori
CEN ARS
Telómero
Construcción de un YAC (Yeast Artificial Chromosome) SUP4
CEN, centrómero; TEL, telómeros; ARS1, secuencia de replicación autónoma; Amp, gen de resistencia a ampicilina; ori, origen de replicación que funciona en E. coli . Levadura hospedadora: AB1380, es roja (mutación en ade-2 , metabolismo de adenina, acumulación pigmento rojo). Vector lleva gen SUP4 , supresor ocre, restaura la actividad de Ade-2, dando colonias incoloras. Célula hospedadora tiene además mutaciones
Electroforesis de campo pulsátil (PFGE, Pulsed-Field Gel Electrophoresis)
El principio de la electroforesis de campo pulsátil es que los fragmentos grandes de DNA requieren más tiempo para reorientarse y cambiar de dirección en un campo eléctrico que los fragmentos pequeños. Alternando la dirección de la corriente durante la electroforesis es posible resolver fragmentos de 100 a 1000 kb.
Sistema de PFGE que usa una caja hexagonal que altera el ángulo de los campos eléctricos relativo al gel de agarosa.
Cromosomas artificiales de Levadura (YAC, Yeast Artificial Chromosome) como vectores
La electroforesis de campo pulsante (PFE) permite separar fragmentos de restricción de varios cientos de kilobases
La electroforesis de campo pulsante (PFE) puede ser usada para fraccionar por tamaño cromosomas enteros. Las bandas representan cromosomas separados de S. cerevisiae . Las flechas señalan YACs YACs con insertos del cromosoma humano 10.
Tamaños de DNA insertado comúnmente obtenidos con diferentes vectores de clonado Vector de clonado
Tamaño del inserto
Vectores plasmídicos de alto número de copia
0-10 kb
Bacteriófago l vectores de inserción
0-10 kb
Bacteriófago l vectores de reemplazo
9- 23 kb
Vectores cósmidos Bacteriófago P1
30- 44 kb 70- 100 kb
Vectores PAC (P1 artificial artific ial chromosome) chromos ome)
130- 150 kb
Vectores BAC (bacterial artificial chromosome)
up to 300 kb
Vectores YAC (yeast artificial artific ial chromosome) chromos ome)
0.2 2.0 Mb
