26.1. Defina: a) Elución Es un proceso en el cual las especies son lavadas a través de una columna cromatográfica por el flujo o la adición del solvente fresco. b) Fase móvil La fase móvil en cromatografía es el que los movimientos encima o a través de una fase inmóvil que se fija en su lugar en una columna o en la superficie de una placa plana. c) Fase estacionaria La fase estacionaria en una columna cromatográfica es un sólido o líquido se fija en su lugar. La fase móvil entonces pasa encima o a través de la fase estacionaria. d) Constante de distribución La constante distribución K en cromatografía es la relación de la concentración del analito en la fase estacionaria a su concentración (actividad) en la fase móvil cuando existe equilibrio entre las dos fases. e) Tiempo de retención El tiempo de retención para un analito es el intervalo de tiempo entre su inyección en una columna y la aparición de su pico en el otro extremo de la columna. f)
Factor de retención
El factor k de retención se define por la ecuación:
Donde es la constante de distribución de la especie , y móviles, respectivamente.
y
son los volúmenes de las fases estacionarias
g) Factor de selectividad El factor de selectividad α de una columna hacia las especies A y B es dada por , donde es la constante de distribución de las especies más fuertemente sostenidas y es la constante de distribución de las especies menos fuertemente sostenidas. h) Altura de pico La altura de la placa de una columna cromatográfica se define por la relación donde es la varianza obtenida de la Gaussiana en forma de pico cromatográfico y L es la longitud de la columna en centímetros. i)
Difusión longitudinal
Es una fuente de banda ampliar en una columna en el cual un soluto difunde desde el centro de concentración de la banda a las regiones más diluidas en ambos lados.
j)
Difusión en remolino
Es un fenómeno en el cual las moléculas de un analito llegan al final de una columna en diferentes momentos como consecuencia de viajar a través de la columna por las vías que difieren en longitud. k) Resolución de la columna La resolución de una columna hacia dos especies y está dada por la ecuación donde es la distancia (en unidades de tiempo) entre los picos de las dos especies, y anchuras (también en unidades de tiempo) de las cumbres en sus bases. l)
y
son las
Eluyente
El eluyente en cromatografía es la nueva fase móvil que lleva el analito a través de la columna. 26.2. Describa el problema general de la elución El problema general de elución surge cuando cromatogramas se obtuvieron en muestras que contienen especies ampliamente con diferentes constantes de distribución. Cuando las condiciones son tales que las buenas separaciones de las especies más fuertemente retenidas se realizan, se observa la falta de resolución entre las especies que se encuentran débilmente. Por el contrario, cuando se condiciones favorables que dan separaciones satisfactorias de los compuestos débilmente retenidas, banda severa ampliación y se encuentran largos tiempos de retención para las especies fuertemente unidos. El problema general de elución se resuelve a menudo en la cromatografía de líquido por gradiente de elución en cromatografía de gases y por la programación de la temperatura. 26.3. Enumere las variables que originan el ensanchamiento de banda en cromatografía. Las variables que conducen a la zona de ensanchamiento incluyen (1) diámetro de partícula grande para fases estacionarias; (2) columna de grandes diámetros; (3) altas temperaturas (importantes solamente en GC); (4) para líquidos fases estacionarias, gruesas capas del líquido inmovilizado; y (5) caudales muy altos o muy bajos. 26.4. ¿Cuáles son las principales diferencias entre la cromatografía gas – líquido y líquido – líquido? En cromatografía de gas-líquido, las fases móviles son los gases, mientras que en cromatografía de líquidos, son los líquidos. 26.5. ¿Cuáles son las principales diferencias entre la cromatografía líquido – líquido y líquido – sólido? En la cromatografía líquido-líquido, la fase estacionaria es un líquido que está inmovilizado por adsorción o unión química a una superficie sólida. Los equilibrios que causa la separación son equilibrios de distribución entre dos fases líquidas inmiscibles. En la cromatografía líquido-sólido, la fase estacionaria es una superficie sólida y los equilibrios implicados son equilibrios de adsorción. 26.6. ¿Qué variables tienen más probabilidad de afectar al factor de selectividad par de analitos?
correspondiente a un
Las variables que afectan el factor α selectividad incluyen la composición de la fase móvil, la temperatura de la columna, la composición de la fase estacionaria, y químicas interacciones entre la fase estacionaria y uno de los solutos están separados.
26.7. Explique la manera en que se puede manipular el factor de retención de un soluto. En GC, el factor de retención se varía mediante el cambio de la temperatura de la columna como se hace en la programación de la temperatura. En LC, las variaciones se logran mediante la alteración de la composición del disolvente como en el gradiente de elución. 26.8. Describa un método para determinar el número de platos de una columna. El número de placas en una columna se puede determinar midiendo el tiempo de retención un pico en su base . El número de placas de es entonces
y la anchura de
26.9. Mencione dos métodos generales para mejorar la resolución de dos sustancias en la columna cromatográfica. La disminución de las anchuras de los picos aumentará resolución será el aumento de la separación de los picos. El aumento de la separación se puede hacer por el alargamiento de la columna para aumentar el número de placas o el aumento de la selectividad. 26.10. ¿Por qué el mínimo en la gráfica de la altura de plato frente a tasa de flujo se encuentra a tasas de flujo menores en cromatografía de líquidos que en cromatografía de gases? Difusión longitudinal es mucho más importante en GC que en LC. Difusión longitudinal es una gran contribución a H a velocidades de flujo bajas. Los descensos iniciales de H en tramos de altura de la placa frente a la velocidad de flujo son, pues, en gran parte el resultado de la difusión longitudinal. Debido a que los coeficientes de difusión gaseosa son órdenes de magnitud más grande que los valores de líquidos, el fenómeno se hace evidente a velocidades de flujo más altas en GC que en LC. El mínimo a veces no se observa en todos en LC. 26.11. ¿Qué es la elución con gradiente? La elución en gradiente es un método de llevar a cabo cromatografía de líquido en el que la composición de la fase móvil se cambia continuamente o en pasos con el fin de optimizar las separaciones. 26.12. Elabore una lista de las variables cromatográficas que causan la zona de separación. La zona de separación está influenciada por (1) embalaje que producen coeficientes de distribución que difieren significativamente; (2) incrementos en la longitud de la columna; (3) variaciones en la composición de la fase móvil (LC); (4) optimización de temperatura de la columna (GC); (5) los cambios en el pH de la fase móvil (LC); (6) incorporación de una especie en la fase estacionaria que selectivamente complejos de ciertos analitos (LC). 26.13. ¿Qué efecto causaría en un pico cromatográfico introducir la muestra a una velocidad demasiado baja? Introducción lenta de la muestra conduce a la ampliación de la banda.
26.14. Los siguientes datos corresponden a una columna cromatográfica de líquidos: Longitud del relleno Tasa de flujo
24.7 cm 0.313 mL/min 1.37 mL 0.164 mL
Un cromatograma de una mezcla de las especies A, B, C y D proporciona los siguientes datos: Tiempo de retención, min Anchura del pico en la base , min 3.1 0.41
No retenida A B
5.4 13.3
1.07 1.16
C
14.1
1.72
D
21.6
1.72
Calcule a) El número de platos para cada pico Se emplea la siguiente ecuación: Para A, Para B, Para C, Para D, b) La media y desviación estándar de N
c) La altura de plato de la columna Usando la ecuación:
26.15. Con los datos del problema 26.14 calcule para A, B, C y D. a) el factor de retención Para ello usamos la siguiente ecuación: Para A:
(
Para B:
(
– –
) )
–
(
Para C:
–
(
Para D:
) )
b) La constante de distribución Para ello usamos la siguiente ecuación: [
] –
Para A: (
[
]
) –
)
Para C: (
–
)
Para D: (
–
)
Para B: (
⁄
26.16. Con los datos del problema 26.14, calcule para las especies B y C a) La resolución Se emplea la siguiente ecuación:
[
]
b) El factor de selectividad
c) La longitud de columna necesaria para separar las dos especies con una resolución de 1.5. √ √
√ √
Pero Entonces: d) El tiempo necesario para separar las dos especies con una resolución de 1.5.
26.17. Con los datos del problema 26.14 calcule para las especies C y D a) La resolución [
]
b) La longitud de columna necesaria para separar las dos especies con una resolución de 1.5
26.18. Los siguientes datos se obtuvieron mediante cromatógrafo gas – líquido con una columna relativa de 40cm: Compuesto Aire Metilciclohexano
1.9 10.0
0.76
Metilciclohexeno Tolueno
10.9 13.4
0.82 1.06
Calcule: a) El número de platos promedio a partir de los datos
b) La desviación estándar para el promedio en a)
c) La altura de plato promedio para la columna
26.19. En relación con el problema 26.18, calcule la resolución para a) Metilciclohexano y metilciclohexeno: b) Metilciclohexeno y tolueno: c) Metilciclohexano y tolueno: 26.20. Si fuera necesaria una resolución de 1.5 para separar metilciclohexano y metilciclohexeno en el problema 26.18, a) ¿Cuántos platos se necesitarían? b) ¿Qué longitud debería tener la columna si se utiliza el mismo relleno? c) ¿Cuál sería el tiempo de retención del metilciclohexeno en la columna del inciso b)? 26.21. Si para la columna del problema 26.18 son 19.6 y 62.6 ml respectivamente y el pico de aire no retenido aparece después de 1.9 min, calcule:
a) El factor de retención para cada compuesto: b) La constante de distribución para cada compuesto: c) El factor de selectividad para el metilciclohexano y el metilciclohexeno: 26.22. Las áreas relativas de pico para los cinco picos obtenidos por cromatografía de gases en la separación de cinco esteroides se indican a continuación. También se proporcionan las respuestas del detector para los cinco compuestos. Calcule el porcentaje de cada compuesto en la mezcla. Compuesto Deshidroepiandrosterona Estradiol Estrona Testosterona Estriol
Área relativa, de pico 27.6 32.4 47.1 40.6 27.3
Respuesta relativa, del detector 0.70 0.72 0.75 0.73 0.78
27.1. ¿En qué se diferencian la cromatografía gas – líquido y la gas – sólido? En la cromatografía de gas-líquido, la fase estacionaria es un líquido que está inmovilizado sobre un sólido. La retención de constituyentes de la muestra implica equilibrios entre una gaseosa y una fase líquida. En la cromatografía de gas-sólido, la fase estacionaria es una superficie sólida que retiene analitos por adsorción física. Aquí separaciones implican la adsorción / desorción equilibrios. 27.2. ¿Cómo funciona un medidor de flujo de pompas de jabón? En un medidor de burbuja de jabón, una película de jabón se forma en una bureta de gas a través del cual el efluente de una columna de GC está fluyendo. La velocidad de flujo se determina entonces a partir del tiempo requerido para la película de viajar entre dos de las graduaciones en la bureta. 27.3. ¿Qué es la programación de temperatura en cromatografía de gases? ¿Por qué se usa con tanta frecuencia? La programación de la temperatura consiste en el aumento de la temperatura de una columna de GC como una función del tiempo. Esta técnica es particularmente útil para las muestras que contienen constituyentes cuyos puntos de ebullición difieren significativamente. Constituyentes de bajo punto de Boilin están separados inicialmente a temperaturas que proporcionan una buena resolución. A medida que la separación, la temperatura de la columna se incrementa de manera que los constituyentes Boilin superiores vienen de la columna con buena resolución y en longitudes de tiempo razonables. 27.4. Defina: a) Volumen de retención: Volumen de retención es definido por la ecuación tasa de flujo volumétrico.
donde
es el tiempo de retención y
es la
b) Volumen de retención corregido: El volumen de retención corregido dentro de la columna. Es dada por
es el volumen de retención después de corregir la presión media donde es el factor de corrección de la presión.
c) Volumen de retención específico: El volumen de retención específica
es definido por la ecuación
de retención de una especie bien, en grados Kelvin.
es la masa de la fase estacionaria, y
donde
es el volumen
es la temperatura de la columna
27.5. ¿Cuál es la diferencia entre un detector sensible a la concentración y un detector sensible a la masa? ¿Los siguientes detectores son sensibles a la masa o a la concentración? Un detector sensible a la concentración responde a la concentración de analito en la fase móvil, mientras que una masa sensible detector responde a la cantidad de analito moléculas o iones que entran en contacto con el detector. Áreas de pico para un detector sensible a la concentración aumentan como la tasa de flujo disminuye porque el analito está en contacto con el detector durante un largo periodo. Áreas de pico para un detector sensible a la masa no son afectadas grandemente por caudal. Con CS para concentración sensible y MS para masa sensible, encontramos para cada uno de los detectores figuran: (a) térmica conductividad (CS),
emisión (b) atómica (MS), (c) termoiónica (MS), captura de electrones (d) (CS), (e) llama fotométrica (MS), ionización de llama (f) (MS). 27.6. Explique los principios de funcionamiento de los detectores que se encuentran en el problema 27.5. (a) el detector de conductividad térmica se basa en la disminución de la conductividad térmica del gas portador helio o hidrógeno provocada por la presencia de moléculas de analito. (b) el detector de emisión atómica se basa en la intensidad de las líneas de emisión atómica generados a partir de algunos de los elementos contenidos en las moléculas de analito. La atomización del analito y excitación de emisión atómica es propiciada por el eluyente atravesando un campo energético de microondas. (c) el detector termoiónico se basa en las corrientes de iones se produce cuando la fase móvil es quemado en una llama de hidrógeno y luego pasó del grano de silicato de rubidio calentada overa. Se utiliza principalmente para los analitos que contienen fósforo o nitrógeno. (d) el detector de captura de electrones se basa en la atenuación por moléculas de analito de un ion de pie actual generada por la ionización de las moléculas de la fase móvil con un emisor β en el efluente. 27.7. ¿Cuáles son las principales ventajas y limitaciones de cada uno de los detectores que se mencionan en el problema 27.5? (a) las ventajas, conductividad térmica: aplicación general, amplio rango lineal, la sencillez, no destructiva. Desventajas: baja sensibilidad. (b) Ventajas, emisión atómica: selectividad, amplio rango lineal, alta sensibilidad, aplicabilidad general. Desventajas: altos costos de equipos destructivos. (c) Ventajas, termiónicos: alta sensibilidad para compuestos que contienen N y P, buen rango lineal. Desventajas: destructiva, no es aplicable para muchos analitos. (d) Las ventajas, de captura de electrones: alta sensibilidad, selectividad hacia analitos con grupos funcionales electronegativos, no destructivos. Desventajas: la respuesta no lineal en algunas circunstancias, la gama limitada respuesta. (e) Ventajas, llama fotométrica: la selectividad hacia el S y P que contienen analitos, buena sensibilidad. Desventajas: destructiva, aplicabilidad limitada. (f) Ventajas: Ionización de llama aplicabilidad general, amplio rango lineal, buena sensibilidad, bajo ruido, baja sensibilidad a la mayoría de los gases portadores y el agua, la sencillez, la facilidad de uso. Desventaja: destructiva. 27.8. ¿Cuál es la diferencia entre un cromatograma de iones totales y un cromatograma de masas? Un cromatograma de iones totales se obtiene mediante la suma de las abundancias de iones en cada espectro de masas y el trazado en función del tiempo. Un cromatograma de masa se obtiene mediante la supervisión de un valor m / z durante el experimento de cromatografía y el trazado de la abundancia de iones en función del tiempo. 27.9. Analice por qué la combinación de cromatografía de gases y espectrometría de masas es tan potente. La combinación de GC con MS permite la identificación de las especies que eluyen de la columna cromatográfica. El cromatograma de iones totales proporciona información similar a un cromatograma GC convencional. Controlando otros iones, se puede obtener información acerca de las diferentes especies. Al analizar el espectro de masas durante el experimento de cromatografía, se pueden identificar las especies de elución en varias ocasiones. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas permite identificaciones aún más específicas a realizar.
27.10. ¿Qué son los métodos acoplados de cromatografía de gases? Describa brevemente dos de ellos. Métodos acoplados para GC con una técnica instrumental diferente, tal como la espectrometría de masas, FTIR, espectroscopía de RMN, o métodos electroquímicos. El efluente de la columna de la GC es tanto un seguimiento continuo por la segunda técnica o recogida y medida. 27.11. ¿Cuál es el material de relleno que se utiliza en la mayoría de columnas empacadas para cromatografía de gases? El material de relleno utilizado con mayor frecuencia son las partículas de tierra de diatomeas con diámetros que van desde 250 hasta 170 micras o 170 a 149 m. 27.12. ¿En qué se diferencian las siguientes columnas tubulares abiertas? (a) Una columna de trama (PLOT) es una capa de la columna tubular abierta porosa, que también se llama una columna de soporte recubierto tubular abierta (SCOT). La superficie interior de una columna parcela está llena de una película delgada de un material de soporte, tal como una tierra de diatomeas. Este tipo de columna contiene varias veces una fase estacionaria tanto como lo hace una columna de pared recubierto. (b) Una columna WCOT es simplemente un tubo capilar formado de sílice fundida, acero inoxidable, aluminio, cobre, plástico, o vidrio. Sus paredes interiores están recubiertas con una capa delgada de la fase móvil. (c) La columna SCOT se describe en el apartado (a) de esta pregunta. 27.13. ¿Cuáles son las columnas megacapilares? ¿Para qué se utilizan? Las megacolumnas son columnas tubulares abiertas que tienen un mayor diámetro interior columnas tubulares abiertas típicas, que varían en diámetro desde .
que
27.14. ¿Cuáles son las ventajas de las columnas capilares de sílice fundida en comparación con las columnas de vidrio o las metálicas? Las columnas de sílice fundida tienen una mayor resistencia física y flexibilidad de columnas tubulares abiertas de vidrio y son menos reactivos frente a analitos que el vidrio o las columnas metálicas. 27.15. ¿Qué propiedades debe tener una fase estacionaria líquida en cromatografía de gases? Las propiedades deseables de una fase estacionaria para GC incluyen: baja volatilidad, estabilidad térmica, inercia química, y las características de disolventes que proporcionan valores de k y α para los analitos a ser separados. 27.16. ¿Qué efecto tiene el espesor de la película de la fase estacionaria sobre los cromatogramas de gases? Espesor de película influye en la velocidad a la que los analitos se llevan a través de la columna, con la tasa de aumento a medida que disminuye el espesor. Menos ensanchamiento de la banda se encuentra con películas delgadas. 27.17. ¿Por qué las fases estacionarias en cromatografía de gases están con frecuencia enlazadas o polimerizadas? ¿Qué significado tienen estos términos? Fases estacionarias líquidas son generalmente unidos y / o reticulados con el fin de proporcionar una estabilidad térmica y una fase estacionaria más permanente que no se filtrará fuera de la columna. Vinculación implica la unión de una capa monomolecular de la fase estacionaria a la superficie de embalaje por medio de enlaces químicos. La reticulación implica el tratamiento de la fase estacionaria mientras se encuentra en la columna con un reactivo químico que crea enlaces cruzados entre las moléculas que componen la fase estacionaria.
27.18. Enumere las variables que originan a) el ensanchamiento de la banda y b) la separación de la banda en cromatografía de gas – líquido. (a) la ampliación de la banda se debe a valores muy altos o muy bajos de flujo, las partículas grandes que componen el embalaje, las capas gruesas de la fase estacionaria, la temperatura baja y las tasas de inyección lenta. (b) separación de las bandas se ve reforzada por el mantenimiento de condiciones para que k está en el intervalo de 1 a 10, el uso de partículas pequeñas para el relleno, lo que limita la cantidad de fase estacionaria por lo que los recubrimientos de partículas son finas, y la inyección de la muestra rápidamente. 27.19. ¿Qué son los índices de retención? Explique cómo se determinan. El índice de retención para un analito es una medida de la tasa a la cual se lleva a través de una columna en comparación con la tasa de movimiento de los alcanos normales dos, uno que se mueve más rápido que el analito y el otro más lentamente. Para obtener el índice de retención de un analito en una columna dada, se determinan el registro de los tiempos de retención ajustados para los dos alcanos y el analito. El índice de retención para butano es siempre 400 y 500 pentano. El índice de retención para el analito entonces se deriva mediante la interpolación entre los dos índices de retención logarítmica del alcano 27.20. El mismo compuesto polar se analiza por cromatografía de gases con una columna SE-30 (muy poco polar) y luego con una columna Carbowax 20M (muy polar). ¿Cómo variará entre las columnas? El coeficiente de distribución para un compuesto polar será mayor en la columna carbowax de 20 M que la columna SE-30 no polar. 27.21. Utiliza los datos de retención que se dan a continuación para calcular el índice de retención del 1hexeno. Muestra Aire n-pentano n-hexano 1-hexeno
Tiempo de retención, min 0.571 2.16 4.23 3.15
Para el 1-hexeno:
27.22. Se utilizó una columna de GC en las siguientes condiciones de trabajo: Columna: 1.10 m x 2.0 mm rellena con Chromosorb P; peso de fase estacionaria líquida añadida, 1.40g; densidad del líquido, 1.02 g/ml ; presiones: entrada, 26.1 psi por encima de la atmosférica; atmosférica, 748 torr; temperatura; ambiente, 21.2°C; columna, 102.0°C; tiempos de retención: aire, 18.0 s; acetato de metilo, 1.98 min; propionato de metilo, 4.16 min; n-butirato de metilo, 7.93 min; anchura de picos de los ésteres en su base: 0.19; 0.39 y 0.79, respectivamente. Datos:
Calcule: a) Tasa de flujo promedio en la columna Sustituyendo en la ecuación 27-3,
(
)
b) Volúmenes de retención corregidos para el aire y para los tres ésteres. y [ [
] ]
c) Volúmenes de retención específicos para los tres componentes. Usando la ecuación: ( ) ( ) ( ) d) Constantes de distribución de cada uno de los ésteres Se usa la siguiente ecuación:
e) Un volumen de retención corregido y tiempo de retención para el n-hexanoato de metilo
De la ecuación por regresión lineal
Para 7 átomos de C:
27.23. Con los datos del problema 27.22, calcule a) b) c) d)
factor de retención k para cada componente factor de selectividad para cada pareja de compuestos adyacentes número promedio de platos teóricos y la altura de plato de la columna resolución para cada par de compuestos adyacentes
Usando las siguientes ecuaciones: [
]
√
(
)(
)
( )
27.24. La fase estacionaria líquida de la columna descrita en el problema 27.23 era didecilftalato, un solvente de polaridad intermedia. Si en lugar de éste se hubiera utilizado un solvente no polar como aceite de silicona. ¿Los tiempos de retención de los tres compuestos serían mayores o menores? ¿Por qué? Dado que los tres compuestos son relativamente polares, serían menos compatibles con un disolvente no polar tal como un aceite de silicona que con didecilftalato. Puesto que menos tiempo se gastaría en la fase estacionaria para el aceite de silicona, sería más pequeño.
27.25. Un método de determinación cuantitativa de la concentración de constituyentes en una muestra analizada mediante cromatografía de gases es el de normalización de área. En este método se requiere la elución completa de todos los constituyentes de la muestra. El área de cada pico se mide después y se correlaciona con las diferencias en la respuesta del detector para los diferentes eluidos. Esta corrección requiere la división del área mediante un factor de corrección determinado de manera empírica. La concentración del analito se determina a partir del cociente de su área corregida respecto al área total corregida de todos los picos. En el caso de un cromatograma que contiene tres picos, las áreas relativas determinadas fueron 16.4, 45.2 y 30.2 en el orden en que se incrementa el tiempo de retención. Calcule el porcentaje de cada compuesto si las respuestas relativas del detector son 0.60, 0.78 y 0.88, respectivamente.
27.26. Determine la concentración de especies en una muestra a partir de las áreas de los picos y las respuestas relativas del detector para los cinco picos de cromatografía de gases de la tabla siguiente. Aplique el método de la normalización del área que se explica en el problema 27.25. Se indican también las respuestas relativas del detector. Calcule el porcentaje de cada componente en la mezcla. Compuesto
Área relativa del pico
Respuesta relativa del detector
A B C D E
32.5 20.7 60.1 30.2 18.3
0.70 0.72 0.75 0.73 0.78
27.27. ¿Cuál sería el efecto de los siguientes casos sobre la altura de plato de una columna? Explique su respuesta. a) Aumentar el peso de la fase estacionaria respecto al peso del relleno. Aumento de marcado en
conduce a un aumento en el espesor de la película y por lo tanto un aumento en el H.
. Este aumento provoca un aumento
b) Disminuir la velocidad de inyección de la muestra. La reducción de la tasa de inyección de la muestra dará lugar a la ampliación de la banda porque todas las moléculas no comienzan a atravesar la columna en el mismo instante. Reducción de la capacidad y un aumento en los resultados de H. c) Aumentar la temperatura de la portezuela de inyección. El aumento de la temperatura del puerto de inyección tenderá a disminuir H debido a la misma velocidad de evaporación se incrementará. Por lo tanto, la muestra se puede poner en la columna en una banda estrecha con zona menos propagación inicial. d) Incrementar la tasa de flujo. El aumento de la velocidad de flujo puede causar aumenta o disminuye en H dependiendo de la velocidad de flujo. e) Reducir el tamaño de la partícula del relleno. La reducción del tamaño de partícula aumenta la superficie y por lo tanto disminuye de espesor de película en el término de la en las ecuaciones 26-23 y 26-24. Una disminución en el tamaño de las partículas también hace que el término más pequeño. Ambos efectos conducen a una altura plato más pequeño (Tabla 26-3). f)
Disminuir la temperatura de la columna.
Disminuyendo la temperatura disminuirá las tasas de difusión . El término se convierte más pequeño y los términos de y se convierten más grandes con la disminución de los coeficientes de difusión. Esto puede conducir a un aumento de H Si dominan los términos y o una disminución de si domina el término . En la mayoría de los casos, H aumenta a medida que la temperatura disminuye. 27.28. ¿Qué tipo de mezclas se separan por cromatografía gas – sólido? La Cromatografía de gas-sólido se utiliza principalmente para separar bajas especies moleculares de masa gaseosas como dióxido de carbono, monóxido de carbono y óxidos de nitrógeno. 27.29. ¿Por qué la cromatografía gas – sólido no se utiliza tanto como la cromatografía gas – líquido? La cromatografía de gases-sólidos se ha limitado su aplicación porque los compuestos activos o polares se conservan más o menos permanentemente en la fase estacionaria. Además, se observa a menudo debido a las características no lineales del proceso de adsorción física.
28.1. Enumere los tipos de sustancias en los cuales son más aplicables los siguientes métodos de cromatografía: a) Gas – líquido Especies que son un poco volátiles y térmicamente estables. b) Absorción de líquidos No polares compuestos orgánicos de bajo peso molecular y especies orgánicas particularmente isómeros. c) Reparto líquido – líquido Especies moleculares que son permanentes o térmicamente inestables. d) Reparto en fase inversa Especies orgánicas de bajo o moderado peso molecular, no volátiles o térmicamente inestables. e) Intercambio iónico Sustancias que no son iónicas. f)
Penetración en gel
Compuestos de altos pesos moleculares que son solubles en disolventes no polares. g) Gas – sólido Gases de bajo peso molecular no polares. h) Filtración sobre gel Compuestos hidrofílicos de alto peso molecular. i)
Pares iónicos
Iones orgánicos e inorgánicos pequeños. 28.2. Describa tres métodos generales para mejorar la resolución en la cromatografía de reparto. Tres métodos para mejorar la resolución incluyen: (1) Ajuste de y mediante el empleo de una fase móvil de múltiples componentes y la variación de la revuelta de los disolventes de encontrar una mezcla óptima. (2) Variación en la composición química del sistema solvente de manera tal que α más grande. (3) Empleando un relleno diferente en que α es mayor. 28.3. Explique una forma de modificar el factor de retención de un soluto en la cromatografía de reparto. En cromatografía de reparto, k es variada convenientemente usando un sistema componente solvente de dos (o más) y variando la proporción de los solventes.
28.4. ¿Cómo se puede modificar el factor de selectividad en a) la cromatografía de gases y b) la cromatografía de líquidos? (a) en cromatografía de gases, α es generalmente variada variando la columna del relleno. (b) en LC, columna del relleno y composición química de la fase móvil pueden variar para producir mejores valores α. 28.5. Al preparar un gradiente con hexano – acetona para una columna de HPLC rellena de alúmina, ¿es deseable aumentar o disminuir la proporción de hexano a medida que progresa la elución en la columna? En cromatografía de adsorción con un relleno de alúmina, es generalmente mejor aumentar la polaridad de la fase móvil a medida que avanza la elución. Así la proporción de acetona con el hexano debe aumentarse a medida que avanza la elución. 28.6. ¿Qué significa el intervalo de respuesta lineal de un detector? El rango de respuesta lineal de un detector es el rango de concentración de analito o masa sobre el cual el detector responde linealmente. Es el mismo que el rango dinámico. 28.7. Defina: a) Elución isocrática En una elución isocrática, la composición solvente se mantiene constante a lo largo de la elución. b) Elución con gradiente En una gradiente elución, se utilizan dos o más solventes y la composición de la fase móvil va cambiando continuamente o en pasos a medida que avanza la separación. c) Inyección a flujo detenido En una inyección de flujo detenido, se detiene el flujo de disolvente, se elimina un accesorio a la cabeza de la columna, y la muestra se inyecta directamente en la cabeza de la columna. El accesorio se sustituye a continuación, y el bombeo se reanuda. d) Relleno de fase inversa Un relleno de fase inversa es un relleno no polar que se emplea en cromatografía de partición con una fase móvil relativamente polar. e) Relleno de fase normal En un relleno de fase normal, la fase estacionaria es polar y la fase móvil es relativamente no polar. f)
Cromatografía de pares de iones
En la cromatografía de pares iónicos un gran contra-ión orgánico se añade a la fase móvil como un reactivo de apareamiento iónico. La separación se consigue ya sea a través de la partición neutro par iónico o como un resultado de interacciones electrostáticas entre los iones en solución y cargas sobre la fase estacionaria que resulta de la adsorción de la orgánica contra-ión. g) Cromatografía iónica En la cromatografía de iones, la fase estacionaria es una resina de intercambio iónico y detección se logra normalmente mediante un detector de conductividad.
h) Detector de propiedades de la solución Un detector de propiedad de la solución responde a alguna propiedad de la fase móvil (tales como la conductividad térmica o eléctrica) que se ve alterada por la presencia de analitos. i)
Detector de propiedades del soluto
Un detector de propiedad del soluto responde a alguna propiedad de analitos, tales como la absorción o fluorescencia. j)
Purga
Purga es un proceso para la eliminación de gases disueltos desde una solución barriendo el líquido con un flujo de burbujas finas de un gas inerte de baja solubilidad. 28.8. ¿Qué es la columna de protección en la cromatografía de reparto? Una columna de protección es una columna corta a través del cual la fase móvil fluye antes que la región de la inyección y la columna de análisis de instrumentos de HPLC. La composición de la columna de protección es similar a la de la columna analítica, excepto que las partículas son generalmente más grandes para reducir al mínimo la caída de presión. El propósito de la columna de protección es para eliminar la materia en partículas y los contaminantes de la fase móvil y para saturar la fase móvil con la fase estacionaria de modo que las pérdidas de esa fase de la columna analítica se reducen al mínimo. 28.9. ¿En qué se parecen la cromatografía de reparto en fase normal y la cromatografía de adsorción? La cromatografía de reparto en fase normal y la cromatografía de adsorción son similares en el sentido que las fases estacionarias en ambos son polares, mientras que las fases móviles son relativamente no polares. 28.10. ¿Cuál es el orden en que los compuestos siguientes saldrán de una columna para HPLC que contiene un relleno de fase inversa? a) benceno, dietiléter, n – hexano
b) acetona, dicloroetano, acetamida
28.11. ¿Cuál es el orden de elución de los compuestos siguientes en una columna para HPLC con relleno de fase normal? a) acetato de etilo, ácido acético, dimetilamina
b) propileno, hexano, benceno, diclorobenceno
28.12. Enumere las diferencias fundamentales entre cromatografía de adsorción y cromatografía de reparto. En cromatografía de adsorción, las separaciones se basan en equilibrios de adsorción entre los componentes de la muestra y una superficie sólida. En cromatografía de partición, las separaciones se basan en equilibrios de distribución entre dos líquidos inmiscibles.
28.13. Enumere las diferencias fundamentales entre cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de exclusión por tamaño. En cromatografía de exclusión por tamaño las separaciones se basan en el tamaño y en cierta medida la forma de moléculas con poco las interacciones entre la fase estacionaria y los componentes de la muestra que se producen. En cromatografía de intercambio iónico, en contraste, las separaciones se basan en reacciones de intercambio iónico entre la fase estacionaria y los componentes de la muestra en la fase móvil. 28.14. ¿Qué tipos de especies se puede separar con cromatografía de líquidos de alta resolución pero no con cromatografía de gases? Por HPLC pero no por GC se pueden separar compuestos inestables al calor y no volátiles. 28.15. Describa las diferentes clases de bombas que se usan en la HPLC. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de cada una? Bombas neumáticas son simples, baratas y pulso gratis. Consisten en un contenedor plegable solvente ubicado en un buque que puede ser presurizado por un gas comprimido. Esta bomba tiene una limitada capacidad y presión de salida y no es adaptable a gradiente elución. Solvente viscosidad depende de la velocidad de bombeo. Bombas de jeringa impulsada por tornillo consisten en una jeringa grande en el cual el pistón es movido por un tornillo impulsado por motor. Son libres de pulso y la tasa de partos es variada fácilmente. Sufren por la falta de capacidad y son inconvenientes cuando deben cambiarse de solventes. Las bombas reciprocantes son versátiles y ampliamente utilizadas. Consisten en una pequeña cámara cilíndrica que se llena y luego vaciada por el movimiento de idas y venidas de un pistón. Las ventajas incluyen pequeño volumen interno, presiones de salida alta, adaptabilidad a gradiente elución y caudales constantes que son independientes de presión viscosidad y espalda. La salida de pulsos debe ser amortiguada. 28.16. Señale las diferencias entre la cromatografía de una sola columna y la cromatografía iónica de columna inhibidora. En columna inhibidora de cromatografía de iones es seguido por una columna supresora cuyo propósito es convertir los iones utilizados para la elución de especies moleculares que son en gran medida no iónicos y por lo tanto no interfieran con conductimétrico detección de la especie de analito. En una columna de iones, intercambiadores de iones de baja capacidad se utilizan para que las concentraciones de iones en la solución de elución puedan mantenerse bajas. Entonces la detección se basa en las pequeñas diferencias en conductividad causada por la presencia de componentes muestra eluido. 28.17. La espectrometría de masa es un sistema de detección extremadamente versátil para la cromatografía de gases. No obstante, acoplar un sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución con un espectrómetro de masa es una tarea a menudo difícil. Proporcione las principales razones por las que es más difícil combinar la HPLC con la espectrometría de masa que combinar la cromatografía de gases con la espectrometría de masa. Se necesita una muestra de la fase gaseosa por espectrometría de masas. La salida de la columna de LC es un soluto disuelto en un solvente, mientras que la salida de la columna GC es un gas y así directamente compatibles. Como un primer paso para LC/MS, el disolvente debe ser vaporizado. Cuando está vaporizado, sin embargo, el solvente LC produce un volumen de gas 10 - 1000 veces mayor que el gas portador en cromatografía gaseosa. Por lo tanto, también debe eliminarse la mayoría de los solventes.
28.18. ¿Cuál de los detectores de cromatografía de gases de la tabla 27.1 son apropiados para la HPLC? ¿Por qué algunos de los mencionados son inadecuados para la HPLC? Los detectores de GC que son adecuados para HPLC son el espectrómetro FTIR y posiblemente fotoionización. Muchos de los detectores de GC son inadecuados para HPLC porque necesitan el componente liberador de analito en la fase gaseosa. 28.19. Aunque la temperatura no afecta las separaciones en cromatografía de líquidos de alta resolución como lo hace en las separaciones por cromatografía de gases, puede desempeñar un papel importante. Analice cómo y por qué la temperatura podría no influir en las separaciones siguientes: a) separación cromatográfica en fase inversa de una mezcla de esteroides b) una separación cromatográfica por adsorción de una mezcla se isómeros muy relacionados. Una serie de factores que influyen en la separación es claramente constantes de distribución incluyendo dependientes de la temperatura y las tasas de difusión. Además, los cambios de temperatura pueden influir en la selectividad si los componentes A y B son influenciados diferentemente por los cambios de temperatura. Porque la resolución depende de todos estos factores, la resolución también será dependiente de la temperatura (a) Para una separación cromatográfica de fase inversa de una mezcla de esteroides, la separación podría ser influenciado por cambios dependientes de la temperatura en los coeficientes de distribución. (b) Para una separación cromatográfica de adsorción de una mezcla de isómeros, la separación podría ser influenciado por cambios dependientes de la temperatura en los coeficientes de distribución. 28.20. En una separación con cromatografía de líquidos de alta resolución dos componentes tienen tiempos de retención que difieren en 15s. El primer pico eluye en 9.0 minutos y los anchos de los picos son casi iguales. El tiempo muerto es 65s. Mediante una hoja de cálculo determine la cantidad mínima de platos teóricos que se necesitan para alcanzar los siguientes valores de resolución: . ¿Qué tanto cambiarían los resultados si el pico 2 tuviera el doble de ancho del pico 1?
28.21. Se perfeccionó un método de cromatografía de líquidos de alta resolución para separar y determinar ibuprofeno en muestras de plasma de rata como parte de un estudio del curso de tiempo del fármaco en los animales de laboratorio. Se sometieron a estudios cromatográficos varios patrones y se obtuvieron los resultados siguientes: Concentración del ibuprofeno, µg/ml 0.5 1.0 2.0 3.0 6.0 8.0 10.0 15.0
Área relativa del pico 5.0 10.1 17.2 19.8 39.7 57.3 66.9 95.3
Luego se administró por vía oral una muestra de 10mg/kg de ibuprofeno a una rata de laboratorio. Se tomaron muestras de sangre en diferentes tiempos después de la administración del fármaco se sometieron a análisis de HPLC. Se obtuvieron los resultados siguientes: Tiempo, h
Área del pico
0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0 8.0
0 91.3 80.2 52.1 38.5 24.2 21.2 18.5 15.2
Determine la concentración de ibuprofeno en el plasma sanguíneo para cada tiempo dado y grafique la concentración contra el tiempo. En porcentaje, ¿durante qué periodo de media hora (primero, segundo, tercero, etc) se pierde la mayor parte del ibuprofeno.
De la hoja de cálculo la mayor pérdida de porcentaje se produce entre 1,0 y 1,5 hrs. 28.22. En una columna de reparto en fase normal, se determinó que un soluto tiene un tiempo de retención de 29.1 minutos y una muestra no retenida tiene un tiempo de retención de 1.05 minutos cuando la fase móvil contiene 50% en volumen de cloroformo y 50% de n-hexano. Calcule a) para el soluto y b) la composición de solventes que disminuiría a un valor de alrededor de 10. Se usa la ecuación: (
Donde
)
y
son los índices de polaridad de cloroformo y n-hexano, respectivamente.
a) Usando la Ecuación:
b) Usando la Ecuación:
Sustituyendo en la ecuación (1): (
)
Tomando el logaritmo de ambos lados de esta ecuación da:
Sustituyendo
por
en la ecuación (3) da
Dónde:
Así la mezcla debe ser
el 71% y 29%
