Métodos histológicos El arte y la
"
ciencia tienen su punto de encuentro
La totalidad del conocimiento actual referido a la estructura y la función de los organismos biológicos tiene su fundamento en los métodos necesarios para la investigación de las células y los tejidos. tejidos.En En algunos casos, los grandes avances en la comprensión y el conocimiento fueron consecuencia directa del desarrollo de una nueva técnica. La creación de la los métodos de fraccionamiento celular, la inmunohistoquímica y la tecnología del DNA son ejemplos Es necesario contar con ciertos conocimientos respecto de los principios fundamentales de los métodos aplicados con mayor frecuencia, para que el estudio de la histología no sea tan sólo un aprendizaje de determinados hechos, sino que además permita adoptar una postura crítica frente a ellos. En consecuencia, se comenzará el estudio de la histología con un breve análisis de las generalidades de los métodos histológicos,si histológicos, si bien a menudo será de gran utilidad revisar algunos de estos métodos,
en el
método. Bulwer "
relacionados con el estudio específico de las células y los tejidos. En general, los métodos histológicos se clasifican en dos los que se basan en la observación directa de células y tejidos vivos, y los que analizan material muerto o inanimado. En u n lugar intermedio se ubican las técnicas de aislamiento de los componentes de células vivas mediante métodos de En todos los casos se comienza con el análisis microscópico, de importancia tal para todos los métodos histológicos.
Análisis microscópico El microscopio es el más en la histología, debido al pequeño tamaño de las analizadas. Cabe destacar que cuando en este texto se alude al término siempre se refiere al microscopio óptico, a menos que se especifique otra cosa.
Ojo Ocular Tubo Prisma Revólver Objetivo
Condensador Tornillo de centrado Filtro de luz diurna Brazo del condensador
Tornillo macrométrico Tornillo Fig. 2-1. Dibujo esque-
mático que muestra u n
óptico común. (Dibujo cedido
por Fa.
AG.)
Colector Espejo
Cuando la luz atraviesa un material biológico, ejemplo un preparado histológico, cambian sus caracterfsticas, y estas modificaciones se se hacen hac en visibles mediante los sistemas de lentes. El ojo puede diferenciar variaciones de de la luz (contraste entre luz y sombras) y de color (distintas longitudes de onda). En consecnencia, es necesario modificar la luz, para que el preparado se observe como por elementos más oscuros y más claros o de distintos Las células y los tejidos no coloreados se suelen captar con el microscopio como carentes de color y transparentes, porque no presentan suficiente contraste, Con la ayuda de tinciones histológicas se logra una absorción diferencial de la luz , de modo que se visualizan las distintas estructuras. Poder de resolución y Estos dos conceptos se emplean para determinar la utilidad de un microscopio y se deben diferenciar con claridad entre sí. Es
mucho más importante el poder de resolución d, que se define como la distan distancia cia que debe existi existirr entre dos del para qu quee se vi visu sual alic icen en separa separa-dos. La calidad de una imagen (claridad y riqueza de detalles) del pode r de resolución resol ución de un El aumento se define la entre el tamaño d e l a imagen y del objeto, valoress lineales. El aumento no depenvalore de del poder de resolución, pero se tiene en cuenta esta propiedad al elegir el aumento. En cuanto todos los detalles resueltos se visualizan con facilidad, aumento ulterior sólo hace más borrosa la imagen, porque no se incrementa el poder n o adquiere más de resolución. La detalles y se habla de aumento vacío. óptico
El microscopio está compuesto por partes mecánicas y ópticas. Los com-
ponentes ópticos constan de tres sistemas Microscopio de campo oscuro de lentes: condensador, objetivo objetivo y ocular (fig. 2-1). El condensador produce un haz El microscopio de campo oscuro se uti de luz que ilum ina el objeto objeto estudiado. El liza para analizar partículas pequeñas, objetivo aumenta el objeto y proyecta la que presentan muy escaso contraste con imagen image n sobre el ocular. El ocular aumenta la microscopia microscopia óptica o que se encuentran aun más la imagen y la proyecta sobre la en el límite del poder de resolución o por retina d el ojo del observador. debajo de éste. Para la microscopia de El aumento total resultante se determi - campo oscuro oscuro se emplea u n condensador na mediante el producto del aumento del especial, el cual impide qu e llegue llegue luz di objetivo por el aumento del ocular (even - recta al objetivo, objetivo, de manera q ue sólo inci tualmente se debe multiplicar por un fac - de en esta lente la luz desviada o esparci tor que depende del tubo). tubo). da por las pequeñas partículas que se de El poder de resolución depende de la sea investigar. Estas se observan lumino longitud longitud de onda de la luz utilizada y de sas sobre un fondo oscuro (del mismo molas aperturas numéricas del objetivo y el do que las partículas de polvo se visuali condensador (el ocular sólo actúa aumen- zan por la dispersión que realizan de la tando la imagen del objetivo, no mejora el luz de u n rayo rayo de sol). poder de resolución). En histología se utiliza a menudo el El máximo poder de resolución que se campo oscuro para el análisi anál isiss de prepara pero con los dos radioautográficos (véase más adelan pued pu edee obtener es de preparados de rutina habituales rara vez ex- te), mientra mientrass que es una importante aplicacede de 0,5 pm. ción clínica la determinación de la espiroComo se vio antes, los detalles resueltos queta de la sífilis, sífilis, el el Treponema pallidu m. se deben aumen tar lo suficiente para poder ser observados sin esfuerzo, lo cual se lo- Microscopio de contraste de fase gra con el aumento adicional del ocular. Para obtener el máximo poder de resolu Los tejidos n o coloreado coloreadoss producen muy ción, de alrededor de pm, se requiere escaso contraste, dado que no absorben un aumento de unas 1.000 1.000-1.400 veces, da- cantidades importantes de luz. Sin embar do que el poder de resolución del ojo, a la go, producen cierto retardo en las longitudistancia normal de observación (25 cm), des de onda, de acuerdo con la "densidad es de aproximadamente mm. Como re- óptica variable de los tejidos, es decir, los gla mnemotécnica vale que, para evitar el distintos índices de Este retraso aumento vacío nunca se debe emple arma - variable de las ondas sinusales produce yor aume au me nt o que 2.000 veces apertura cierto desfasamiento entre ellas. Mediante numéri ca del objetivo. objetivo. Por lo general, en el el microscopio de contraste de fase es posi objetivo están grabados el aumento y el ble transformar estas diferencias de fase, valor de la apertura numérica. numérica. Además, se no visibles, en diferencias de amplitud, es suele especificar la longitud del tubo y el decir, que las diferencias de refracción enespesor de cubreobjetos (en mm) para el tre los componentes del tejido se transforcual está corregido el objetivo. man en diferencias de intensidad, que pue Sobre la base del microscopio óptico den ser captadas por el ojo humano. De escomú n se han d esarrollado varios micros micros- ta manera es posible transformar en visibles copios especiales, cada uno de los cuales componentes de las células vivas que, de presenta ventajas y limitaciones específi - otra manera, sólo se observan en tejidos cas, según según veremos a continuac ión. muertos y teñidos 2-3). "
Fig. 2-3. Se observan dos fotomicrografías (A y B) de las mismas células vivas (fibroblastos de cultivo de tejido), A obtenida con un microscopio óptico común y B captada con un microscopio de contraste de fase. En la imagen de contraste de fase se observan con claridad el límite entre las células (flechas), el núcleo (N), los (Nu), alargadas (M), lisosomas redondos (L) y otros detalles que apenas se distinguen con el microscopio común. (Según Novikoff y Holtzman.)
iluminadas. La luz irradiada siempre presenta una longitud de onda más larga que la original. Algunos componentes biológicos (p. ej., la vitamina A) tienen fluorescencia natural y se denominan autofluorescentes, mientras que otros adquieren la fluorescencia después de un tratamiento con determinados colorantes tes, por ejemplo que emite una intensa fluorescencia verdosa al ser irradiada con luz azul. En el microscopip de fluorescencia se ilumina el preparado con intensa luz de la longitud de onda capaz de activar el colorante fluorescente empleado. Esto se lleva a cabo mediante un filtro del color adecuado que se coloca por debajo del condensador: se filtra la luz antes de que incida en el preparado. Además, se coloca un filtro por encima del objetivo con un color a la longitud de onda de la luz que emite el colorante utilizado cuando fluoresce. De esta manera se logra que la imagen se forme debido a emisión de la luz fluorescente. Las estructuras se destacan entonces en color sobre fondo oscuro (véasefig. que 2- 14), como fuentes luminosas, por es posible visualizar estructuras de dimensiones mucho más pequeñas que el poder de resolución del microscopio. En los últimos años se ha observado un notable incremento en el empleo de la mide fluorescencia, debido fundamentalmente a la aplicación de colorantes fluorescentes que se ligan a específicos, que reaccionan con determinados componentes tisulares (véase más adelante en este capítulo). Fig.
Imagen de las células productoras de en los islotes de del
creas, captada con microscopio de barrido confocal. Se distinguen gránulos que contienen mediante reacción con u n fluorescente azul contra se determina la de una molécula a la (denominada ra de glucosa)con u n anticuerpofluorescente ro jo y se observa una molécula localizada sobre el núcleo factor de transcripción para mediante anticuerpofluorescente verde. (Cedidapor L.-l. Larsson.) C A P I T U L O
2
Microscopiode barrido confocal
Una limitación de la de fluorescencia radica en la necesidad de que todo espesor del preparado emita fluorescencia, pero sólo es posible enfocar el objetivo en un plano del corte a la vez. En consecuencia, la luz emitida por fluorescencia desde zonas del preparado ubi cadas por encima y por debajo del plano puede restar nitidez a la imagen. Mediante el microscopio de barrido confocal se impide esta tendencia, dado que se excluye la luz no emitida por el plano El preparado se ilumina por un rayo láser que barre todos los puntos del plano mientras que la luz emitida por el preparado atraviesa una hendidura muy estrecha que detiene la luz emitida por otros niveles, distintos del plano De esta manera se logra obtener la información necesaria para formar una imagen bidi(fig. 2-5) que se registra sobre una pantalla de televisión. Al recoger con una computadora una serie de imágenes de distintos planos es posible reconstruir una imagen del objeto.
que se obtiene En imagen perficie
el microscopio óptico. puede lograr una definida de la su-
de
fotográfica
Fig. 2-9. Dibujo esquemático del principio de de rayos X. (Según Arnberson y Smith.)
de barrido
Con este es posible la estructura de la superficie de un pre parado hasta nivel atómico. El pio se basa en colocar una sonda delgada a distancia de hasta nm, por deba jo de la superficie del preparado. Se apli ca luego u n contacto eléctrico en el extremo de la sonda, al mismo tiempo barre por sobre la superficie del preparado. De este modo se crea u n túnel de electrones a través de la hendidura formada entre el preparado y la sonda. Mientras que se desplaza por sobre el preparado, se mantiene constante la corriente debido al movimiento de la sonda hacia arriba y hacia aba jo por las irregularidades de la superficie del preparado. La informacióp obtenida durante estos movimientos se registra en una computadora, la cual produce una "imagen" de la superficie del preparado. La microscopia de de barrido mite, entre otros adelantos, obtener imagen de las dos hebras de la molécula de DNA. La microscopia de túnel de barrido está limitada por la necesidad de que el preparado sea un conductor eléctrico. "
"
Difracción de rayos X
La difracción de rayos X es un paso adicional en dirección a la resolución detalles cada vez pequeños mediante la aplicación de rayos de longitud de onda más corta. Los X parecerían ser especialmente adecuados para el análisis microscópico, dado que se puede aumentar el poder de resolución, pero no existen lentes capaces de enfocar y sacar provecho de estas longitudes de onda corel tas. En lugar de lentes se debe análisis matemático, lo cual limita la lidad. El principio se basa en enviar un estrecho haz de rayos X a través de la muestra que se desea analizar (fig. 2-9). El haz se separa y se dispersa en un patrón de difracción rotura) que se registra en una fotográfica ubicada por debajo de la muestra. En la práctica es posible utilizar la difracción de rayos X en la investigación de estructuras muy ordenadas de naturaleza cristalina o cristalina (de allí que, en ocasiones, se denomina cristalografía de rayos X) dado que, en los casos, el patrón de
fracción obtenido es casi imposible de descifrar. Incluso en las ordenadas la falta de imagen formada hace que se pierda referida a las relaciones entre las fases y los rayos secundarios, por lo que el patrón de difracción no se corresponde con exactitud con el objeto investigado. En consecuencia se debe trabajar con aproximaciones e interpreta ciones, que sólo presentan la estructura más probable. Sin embargo, la difracción de rayos X fundamental en el ha tenido desarrollo de la y ha permitido obtener información esencial respecto a de 300 entre ellas la mioglobina, la hemoglobina y el DNA.
Métodos de observación de células y tejidos vivos Si bien el objetivo de la Mstología es la descripción y la comprensión de la estructura de las y de los tejidos vivos, lamentablemente, por motivos técnicos, a menudo ha sido necesario seguir el camino de la investigación de tejidos muertos y preservados. Los procedimientos utilizados implican muchas posibilidades de modificación del aspecto de las estructuras debidas a causas y dejan sin respuesta numerosas incógnitas referidas a los procesos celulares vitales. Además, es imposible un control más directo sobre el medio que circunda a la célula y crear experimentales del mismo. En consecuencia, existen claras venta jas en el estudio de células y tejidos vivos; a continuación se verán algunos de los métodos disponibles.
Fig. 2-16. Dibujo esquemático del procedimiento de fraccionamiento celular (véase el texto para los detalles).
teiido
Núcleos
g,
Complejo de
g,
1
t
proteínas solubles se unen a las y se en insolubles. cierta Al mismo tiempo se que los pasas sidel proceso de fijadores por ejemplo, y, en especial, el
do son
rido a la les. Estos de
transversales, más célula en
refede junto con también enlaces algunos de de la muy a las
que se observan con el microscopio de contraste de como control de la estructura de las células vivas. La fijación también produce la inactivación de de las enzimas celulares, las cuales de modo iniciarían la autoo autólisis y a la degeneración post mortem muerte). se eliminan bacterias y muchos otros microorganismos, que podrían destruir el tejido. En la práctica, l a fijación se lleva a cabo por inmersión de un pequeño trozo de tejido en e l fijador, apenas se haya tomado la muestra. Es conveniente realizar la extracción del tejido mediante pinzas y un a cuchilla afilada, y procurar no dañar tejido. Para los tejidos hu ma nos, esto se puede efectuar durante procedimientos quirúrgicos o por biopsia (gr. bios, vida; opsis, sin), es decir, una muestra de tejido extraída del organismo vivo. De los tejidos accesibles directos, como la piel, se puede tomar la muestra por corte con cuchillo, pero también es posible tomar muestras d e órganos internos como, ejemplo, el hígado o el riñón, mediante cánulas especiales. Las biopsias también se pueden extraer durante procedímientos como endoscopias (gr. dentro; ver), es decir estudios internos de cavidades mediante un instrumento munido de una fuente luminosa, el endoscopio. Después de la del tejido se lo en el fijador, en la fijación por a diferencia de la fijación por perfusión, que se puede aplicar a animales de experimentación. En este caso se inyecta el fijador en torrente sanguíneo del animal vivo anestesiado y el llega por vía hematógena rápidamente a todo el tejido. De esta manera se logra matar todas las células de un completo en casi instantánea después de in terrumpir la administración d e oxígeno, y se obtiene una fijación más rápida y uniforme. El método se aplica en traba jos muy exigentes, por ejemplo preparados para microscopia electrónica, en los que se destacan con nitidez incluso las pequeñas modificaciones estructurales post mortem. Inclusión y corte. El tejido fijado se corta en secciones delgadas, que permiten el paso de la luz. La mayoría de los preparados para microscopia óptica tienen un espesor de alrededor de 5-10 para lo que se requiere un micrótomo, instrumento en principio, a una cortadora de fetas. Para obtener la consistencia necesaria para poder cortar secciones tan delgadas es necesario incluir antes el tejido en un que, al sacarse, le confiera suficiente dureza. Las sustancias
Fig. 2-17. La ilustración muestra el de de tejidos incluidos en un
na. Tras el corte se reúnen los trozos en serie sobre una pequeña"cinta transportadora" y se colocan en el baño de agua caliente de la derecha para que se estiren.A se montan sobre portaobjetos y se procesan. Sola mesa s e ven 7 bloques de parafina, en los que se distinguen trozos de tejido incluidos. Cada bloque está fijado a un pequeño cudubo de madera que s e ajusta al rante el corte del bloque.
adecuadas para este fin, los medios de inclusión, son tipos de cera insolubles en agua, por lo general parafina. En consecuencia, antes de la inclusión, es necesario el tejido. Para ello se pasa el tejido por una serie d e soluciones acuosas de etanol en concentracioes crecientes, hasta llegar al El tejido se sumerge entonces en líquido miscible etanol y parafina, por ejemplo xileno, proceso denominado "aclaramiento". Desdel aclarainiento se coloca el tejido en parafina líquida, que disuelve el xileno y penetra así en el tejido. Al enfriar, se solidifica la parafina y junto con el tejido incluido, un bloque sólido o "taco", que es que se 2 - 17). A pesar de los cuidados, se producen ciertas modificaciones al procesar el taco. El alcohol y el xileno extraen grasas y el calentamiento de la inclusión inactiva muchas enzimas; además, a menudo el te jido se contrae de modo perceptible. Para evitar estos problemas, a veces se efectúa un corte por congelamiento de tejido fijado o no. Un taco de tejido congelado tiene consistencia suficiente para ser cortado en un (véase fig. 2 - 33, pág. 43). La técnica de es tan rápida que se pueden obtener seccianes en minutos. Se utiliza, por ejemplo, para determinar si el material de una biopsia extraída en un acto quirúrgico es benigno o El resultado de la biopsia se'obtiene mientras el paciente permanece
anestesiado, por lo que el cirujano puede decidir en el momento el alcance del procedimiento quirúrgico. Método de Con este método se inienta lograr que la variación estructural y la extracción qufmica sean las mínimas posibles, para conservar la actividad enzimática. Se congela rápidamente el trozo de tejido y se lo coloca en una cámara de vacío a ba ja temperatura, después se seca (se deshidrata) por evaporación lenta (sublimadel agua. En la congelación-sustitución se efectúa primero una moderada y un tratamiento con sacarosa, después una congelación rápida del tejido y a nuación una deshidratación a en puro. Una vez eliminada el agua se transfiere el tejido a de inclusión plástico adecuado, que se infiltra mientras se incrementa gradualmente la temperatura hasta alrededor de último se polimeriza por irradiación con luz ultravioleta el medio de inclusión, que se seca, y ya se puede cortar el taco terminado.
Fig. 2-18. Fotomicrograf fa que muestra las ga mas de color del métodode d e uso más frecuente, la coloración con he (HE). El corte de tejido es
-
-
por lo que se distingue u n islote de Langerhans,con células cuyo citoplasmase tiñe de color rosa claro con la eosina, y numerosas con células cuyo citoplasma se tiazul con la en la zoy de rosa c o la na ~ eosina,en la porción
Ácino
El método es muy poco agresivo con el tejido y es apropiado para muchos procedimientos más adelante). Los cortes de tejido se suelen montar sobre portaobjetos y se colorean. mayoría de los colorantes gicos se utilizan en solución acuosa, por lo que los cortes incluidos en parafina deben ser "desparafinados", mediante un y rehidratados por tratamiento con pasajes por concentraciones decrecientes de alcohol en agua, ante's de ser teñidos. Los cortes por congelación se pueden tratar con las soluciones acuosas inmediatamente después de seccionados. mayor parte de los métodos de ción se desarrollaron en función de su capacidad para teñir selectivamente los distintos componentes res. El método de tinción más utilizado es la combinación de hematoxilina y eosina (HE), que los componentes nucleares de azul mientras que casi todas las estructuras citoplasmáticas adquieren 2-18). En conuna tonalidad rosada secuencia, la tinción con HE muestra con y la estructura del nú nitidez la cleo, de la forma y la extensión de la célula. Cabe destacar, sin embargo, que la tinción histológica es un procedimiento químico y que se ha producido un gran desarrollo en los métodos que in forman sobre la composición química de las células y los tejidos. Esto se verá con mayor detalle en la sección sobre química. Después de la tinción, por lo general se deshidrata y se aclara nuevamente la muestra de tejido y entonces se monta, es decir, se cubre con una gota de medio de montaje (Depex, Por último se coloca un cubreobjeto para proteger el preparado. Algunos medios de montaje son miscibles en agua, por lo que se puede montar inmediatamente, sin necesidad de deshidratacióny aclaramiento. Preparación de tejidos para microscopia electrónica Debido al poder de resolución mucho mayor del microscopio electrónico, en este caso se las exigencias de mantener las estructuras originales del tejido. Para la fijación se suele utilizar dehído. También se puede emplear tetróxido de osmio que, además de fijar el tejido, se une con las membranas lipoproteicas y así logra mayor contraste en la imagen del microscopio electrónico. Esto se debe al aumento de la dispersión de electrones por la membrana, a causa del elevado número atómico del osmio. En consecuencia, se habla de tinción o contras"
"
Pig. 2-20. de u n corte tejido de la fijación se no tejido en plástico y se cortó en secciones de espesor, que se colorearoncon azul 1 de toluidina.
de la córnea. Es un de tejido incluido en resina
. y
.
.
. solución de acetato de uranilo. Por lo general no es necesario eliminar el de inclusión, dado que es neo y transparente, y además el preparado durante el análisis con el microscopio. Los ultrafinos se después de la sección sobre u n pequeño reticulada de cobre, denominado "grilla", que suele estar cubierto por una película plástica de sostén muy delgada. En la observación microscópica 2-19), el haz de electrones atraviesa el corte por los orificios de la grilla. La gran calidad técnica que se obtiene con la preparación de tejidos para la microscopia electrónica también se aplica para la microscopia óptica, con los cor tes de alrededor de de espesor, y la posterior tinción con, por ejemplo, azul de toluidina (fig. 2-20). Se usa azul de por su capacidad para penetrar en los de inclusión de resinas epoxi, lo cual no ocurre con los colorantes Mstológicos comunes. Los cortes también se pueden seccionar después de ser incluidos en resinas acrilicas (en lugar de resinas epoxi), que resultados de calidad muy similar y permiten la tinción, ejemplo, con y 2-21). freezeCongelación y o freeze - fracture). Es una técni-
de tejidos por Consiste en rápidamente el te jido en nitrógeno líquido y luego colocarlo en vacfo, para después con un cuchillo o navaja (de similar a como se parte un ladrillo). Se coloca entonces de platino sobre la su perficie de fractura, en ángulo inclinado, lo que forma una delgada plantilla de platino de esa superficie, o réplica, que acentúa las formas del relieve. Se la réplica de platino mediante la aplicación de partículas de carbón. A continuación se elimina el te jido con u n ácido fuerte y se monta la ré plica de platino sobre una grilla, para la observación con el microscopio electrónico de transmisión, dado que el haz de electrones es capaz de atravesar la réplica delgada. evitar las Las ventajas del método acciones de losfijadores químicos y de los medios de deshidratación y de inclusión, por lo que se han podido comparar las estructuras de tejidos fijados y no fijados con el microscopio electrónico 2-22). El método tiene aplicación especialmente importante en la investigación de las estructuras internas de las membranas (véase con detalle en el cap.-3). El poder de resolución es de alrededor de nm.
dé de un preparado
por y fractura, captada con
La imagen mues-
tra
cerebral) y con 8. Van
Métodos histoquímicos El elemento fundamental de los méto dos es la utilización de acciones físicas y químicas sobre preparados para determinar la lo calización de sustancias en las y los tejidos. Para la es esencial la localización, dado que el empleo de cortes de tejido dar in formación sobre la localización, imposi ble de obtener por'determinaciones químicas obtenidas de de tejidos. Antes de la reacción en sí es necesario efectuar una fijación y una preparación adecuadas, que conserven la sustancia estudiada y las estructuras celular y Los son solubles en solventes orgánicos el por lo que se deben evitar cuando se estudian esos compuestos. Debido a la acción desnaturalizante de los agentes dores sobre las proteínas, la mayoría de las se inactivan con la fijación pero, por otra parte, algunas son
solubles y se pierden si no se lleva a cabo una fijación previa a la La reacción
debe induc ir la de un producto insoluble consecuencia, debe ser coloreado o poder transformarse en fluores cente. Para la microscopia electrónica es necesario que posea electrondensidad suficiente. Se debe considerar la sensibilidad de la reacción histoquímica, dado que los re negativos no se pueden interpre tar de inmediato como ausencia de la propiedad buscada. Es posible que la canti dad presente sea demasiado pequeña para ser detectada, o que la sustancia se haya perdido o modificado durante la prepara ción previa. Se pasa gradualmente de los métodos de morfológicos a los procedimientos histoquímicos más específicos. Por lo tanto, se verán primero algunas reacciones más generales antes de analizar los principales métodos
y (Cedida por
Deurs.)
a
En
rean par
&
las de la
nos
2-26]
los
que
Las
Fig. 2-25. Dibujo esquemático la muestra la aareaación masia, aue
(p. ej., un
con
elevado
del
gran valor traste de
en un azul del colorante violeta
dado que el mayor conla de
los carbono, ne la oxidación. Los
lo que se detie-
con el
Fig. 2-26. Fotomicrogra-
fía de un corte de tráquea teñido con xilina-eosina,que tra un ejemplo de metacromasia. La ancha zona inlensamente rojo de la mitad de la imagen es cartílago cuya sustancia se tiñe por metacromasia. x 110.
Fig. 2-31.
El
muestra la forma en que habitualmentese produce la histoquímica con una enzima (véase el texto para los detalles).
te y los
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incluyen Pos medio
con
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utilidad delas nerviosas,
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y par
Fig. 2-12. de
para de resolución del
del
de mediante
en un corte de tejido las células, la ácida redondeadas
Dentro de en
Fig. 2-36. Dibujo esquemático del principio de la
. --
rro, ferritina, o a partículas de oro, que también se puede identificar con el mi2- 36). croscopio La especificidad de los métodos nohistoquímicos depende totalmente de que el utilizado se afsle sin mezclas con otras sustancias, para que sea posible producir puros con la inmunización. En consecuencia, la investigación del grado de pureza del antígeno es un importante control del método. Se obtiene un antígeno totalmente puro cuando se lo sintetiza, por ejemplo un polipéptido de secuencia de conocida, Es esencial señalar que no es necesario aislar el anticuerpo específico de la fracción mezclada de cuerpos en el conejo ni los anticuerpos específicos en la cabra (véase recuadro).
En los últimos años ha sido posible obtener gran cantidad de de anticuerpo totalmente iguales, los denominados anticuerpos La técnica para formarlos implica una fusión celular de células de mieloma (una celular transformada) con los denominados linfocifos B, productores de anticuerpo, del timo de ratones previamente inmunizados por la inyección del que se desea demostrar con el anticuerpo monoclonal. Después de la fu sión celular, las denominadas células de hibridoma (híbridas de rnieloma) formadas han adquirido la capacidad de las cé lulas del mieloma de desarrollar un creci prolongado en cultivos celulares y la capacidad de los linfocitos B de producir determinado anticuerpo. Después de la clonización de las células híbridas
presentan tres todos más usuales de de terminación d e proteínas específicas mediante marcados.
Corte de 5 que atraviesa una célula de
Fig. 2-42. Dibujo esquemático que muestra mo un corte fino entre un grupo de células sipuede presentar un aspecto te diferente cuando se observa el corte por el microscopio. (Según Ham.)
Fig. 2-43. Este dibujo esquemático muestra có-
mo cortes en a través de pueden presentar la misma estructura aspectos totalmente diferentes.
