UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONÓMA DE NICARAGUA, MANAGUA RECINTO UNIVERSITARIO RUBÉN DARÍO FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERÍAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ASIGNATURA: ANÁLISIS INSTRUMENTAL PRÁCTICA DE LABORATORIO #1 Calibración del Espectrofotómetro Ultravioleta/Visible Perkin Elmer Lambda EZ201 I.
Introducción
La espectrofotometría ultravioleta/visible (UV/Vis) es una de las técnicas más comúnmente utilizadas de análisis instrumental. Por ejemplo, la espectrofotometría es empleada en química clínica, en la industria farmacéutica, en análisis industrial, en aplicaciones ambientales, en investigación y muy a menudo en el aseguramiento de la calidad. Las regulaciones para el control de calidad como las normas ISO 9000, Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL), Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) o procedimientos operativos estandarizados (POE) en la industria farmacéutica requeridos por las más importantes farmacopeas (EP, DAB, USP), exigen una regular comprobación del rendimiento de los espectrofotómetros utilizados. Estos chequeos incluyen la verificación de la resolución, la 1 exactitud de la longitud de onda así como también la examinación de luz difusa y exactitud fotométrica (Hellma, 2008). En adición a lo anterior, según la Norma ISO/IEC 17025:2005, para asegurar las
III. N° 1 2 1 3 6 4 2 2 10 1 10 6 1
Materiales y Reactivos Cristalería, Materiales y Equipo Cristalería Clase A Matraz volumétrico Pyrex® 1000 mL Matraces volumétricos Pyrex® 500 mL Matraz volumétrico Pyrex® 250 mL Matraces volumétricos Pyrex® 100 mL Matraces volumétricos Pyrex® 50 mL Buretas 50 mL Buretas 25 mL Buretas 10 mL Pipetas Pasteur Beakers 600 mL Pyrex® Beakers 50 mL Pyrex® Agitadores de vidrio Plato Petri
Materiales de Laboratorio 6 6 1 4
Soportes universal Pinzas para buretas Pipeta de asistencia magnética Espátulas
Equipos de Laboratorio 2
Balanzas analíticas 0.1 mg precisión
Reactivos Grado
Fórmula CuSO45H2O ACS, ISO; para análisis K2Cr2O7 H2SO4 HCl H2O dest.
ACS; para análisis; estándar primario ACS, para análisis de metales trazas ACS; para análisis ASTM tipo III (6 pisetas 1 L)
Cada equipo de trabajo debe traer: 1 Rollo de papel toalla 1 Marcador Sharpie® punta fina 1 Caja de papel Kleenex®
6. Se lleva únicamente la cristalería y el material de porcelana al horno a una temperatura de 60°C para su respectivo secado. El material de plástico se coloca en posición invetida y se deja secar por escurrimiento a temperatura ambiente. 7. Se deja enfriar el horno de secado para retirar cada pieza de material y ubicarla en el estante respectivo, con su tapa o envuelta con papel aluminio; los vasos de precipitados se colocan en posición invertida. Los crisoles de porcelana (si hubiesen) deben ser trasladados a un desecador hasta alcanzar la temperatura del laboratorio.
4.2.
Preparación de soluciones 3
a) Solución de H 2SO4 5 x 10-2 M. Prepare 500 mL de ácido sulfúrico 5 x 10 -2 M aforando con agua destilada. ¿Cuántos mL hay qué medir de H 2SO4 conc. (ρ = 1.84 g/mL, 96.7%)? b) Solución de H 2SO4 5 x 10-3 M. Prepare 500 mL de ácido sulfúrico 5 x 10-3 M utilizando la solución a) y diluya con agua destilada hasta el enrase. ¿Cuántos mL hay qué medir de Solución de H 2SO4 5 x 10-2 M? c) Solución 1 de K 2Cr2O7 al 0.005%. Prepare 100 mL de dicromato de potasio 4 estándar primario al 0.005% (m/v) diluyendo los miligramos pesados de la sal con la solución b) hasta el aforo. ¿Cuántos gramos hay que pesar de K 2Cr2O7 estándar primario? d) Solución 2 de K 2Cr2O7 al 0.01%. Prepare 100 mL de dicromato de potasio estándar primario al 0.01% (m/v) diluyendo los miligramos pesados de la sal con la solución b) hasta el aforo. ¿Cuántos gramos hay que pesar de K 2Cr2O7 estándar primario? e) Solución de H 2SO4 al 1%. Prepare 1 L de ácido sulfúrico al 1% (v/v) aforando con agua destilada. ¿Cuántos mL hay qué medir de H 2SO4 conc. (ρ = 1.84 g/mL, 96.7%)? f) Solución de CuSO 4 5H2O (patrón primario) al 2%. Prepare 100 mL de solución de CuSO45H2O al 2% (m/v) diluyendo los gramos pesados de la sal con la solución e) hasta el aforo. ¿Cuántos gramos hay que pesar de CuSO 5H O?
3 4 5 6
4.3.
? ? ? ?
mL mL mL mL
? mL ? mL ? mL ? mL
0.04 0.06 0.08 0.10
M M M M
Exactitud de la escala fotométrica (absorbancia) en la región espectral UV
1. Utilizando como referencia la solución b), ajuste la línea base del espectrofotómetro. Endulce las celdas de cuarzo (referencia y muestra) con la solución b) y ajuste a cero la línea base del equipo. 2. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar un barrido en la región UV del espectro electromagnético de 400 a 200 nm. 3. Para verificar el rango de absorbancia de 0.2 – 0.7 utilice la Solución 1 de K 2Cr2O7. Tome la celda de la muestra, vaciando su contenido en el beaker de residuos . Endulce la celda con agua destilada al menos tres veces, proceda de igual forma con la Solución 1 de K 2Cr2O7, la cuarta vez llene cuidadosamente la celda (de modo que no queden burbujas de aire en el seno de la solución). Limpie las paredes exteriores de la celda utilizando papel Kleenex® y coloque la celda en el portacelda de la muestra. Cierre el paso de luz hacia las celdas. 4. Utilizando el espectro obtenido por el espectrofotómetro, evalúe la precisión de la escala de absorbancia de 0.2 – 0.7. (Tabla 5.1) 5. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar un barrido en la región UV del espectro electromagnético de 400 a 200 nm. 6. Para verificar el rango de absorbancia de 0.4 – 1.4 utilice la Solución 2 de K 2Cr2O7. Proceda de la misma forma descrita en el enunciado 2. de este acápite. 7. Utilizando el espectro obtenido por el espectrofotómetro, evalúe la exactitud de la
5. Según la Guía Técnica las diferencias porcentuales (error relativo porcentual) deben ser menores del 2% para considerar como aceptables los resultados obtenidos.
4.5.
Prueba de Linealidad en la región espectral Visible
Soluciones de sulfato de cobre de diferentes concentraciones pueden utilizarse para comprobar la linealidad de la escala de absorbancia. El uso de las absorbancias a 600 nm y 650 nm es particularmente útil para examinar el borde inferior de la escala de absorbancia (IANZ, 2005). 1. Utilizando como referencia la solución e), ajuste la línea base del espectrofotómetro. Endulce las celdas de cuarzo (referencia y muestra) con la solución e) y ajuste a cero la línea base del equipo. 2. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar la lectura fotométrica del Set de Estándares de CuSO4 5H2O (0.00, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y 0.10) M a longitud de onda variable (multiwavelength). Establezca como primera longitud de onda λ1 = 600 nm y como segunda longitud de onda λ 2 = 650 nm. Asegúrese de configurar el instrumento para que lea cinco veces cada estándar. 3. El espectrofotómetro estimará e imprimirá una curva de calibración promedio a estas longitudes de onda, sin embargo se deberá comprobar el ajuste lineal de dicha curva ingresando los datos en una hoja de cálculo (Excel, Gnumeric, Minitab, etc…). 4. Construya la curva de calibración promedio graficando en el eje la concentración de los estándares de CuSO45H2O versus el eje expresando las ab sorbancias a λ2 – λ1 (Tabla 5.3 ). 5. Calcule el coeficiente de correlación y pruebe estadísticamente si existe una bondad de ajuste lineal significativa de los estándares de CuSO45H2O con el borde inferior de
Figura 5.1. Espectro típico de una solución 0.006% de K 2Cr2O7 en HClO4. Soluciones de dicromato de potasio en ácido sulfúrico o perclórico pueden utilizarse para verificar la escala fotométrica de la región UV. El K2Cr2O7 muestra un espectro con máximos picos característicos a 257 nm y 350 nm; y mínimos a 235 nm y 313 nm. Los valores de referencia de las absorbancias a estas longitudes de onda están dados en la Tabla 5.1. Fuente: Hellma, 2008, pág. 10.
Tabla 5.2. Valores de referencia de absorbancias para CuSO 4.5H2O (2%) en 1% H 2SO4. Longitud de onda (nm) 600 650 700 750
Absorbancia (Guía Técnica) 0.068 0.224 0.527 0.817
Absorbancia Experimental
Error relativo %
Fuente: IANZ, 2005, pág. 5.
Tabla 5.3. Absorbancias del Set de Estándares de CuSO 4.5H2O. N°
Concentración Absorbancias Absorbancias Absorbancias a λ2 – λ1 del Estándar λ1 = 600 nm λ2 = 650 nm
Bibliografía Hellma. (2008). Calibration standards for spectrophotometers. Müllheim: Hellma GmbH & Co. KG. IANZ. (Mayo de 2005). Technical Guide: UV/Vis Spectrophotometer Calibration Procedures. Auckland, New Zealand. Owen, T. (2000). Fundamentals of UV-visisible spectroscopy. Germany: Agilent Technologies.
