FERTILISASI: AWAL PEMBENTUKAN ORGANISME BARU
Diterjemahkan dari Developmental Biology 8 th Edition Chapter 7. Fertilization: Beginning a New Organism oleh Scott F Gilbert
Dr. Abdul Gofur, M.Si Moch. Haikal, S.Si
UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI 2008
DAFTAR ISI
halaman Daftar Isi........................................................................................................ Isi............................................................................................................................. ..................... i Daftar Gambar .................................................................... ................................................................................................................... ............................................... ii Daftar Tabel ........................................................................ ....................................................................................................................... ............................................... iii PENDAHULUAN ................................................................ ............................................................................................................... ............................................... 1 STRUKTUR GAMET GAMET ......................................................................................................... ......................................................................................................... 1
Sperma ................................................................... .............................................................................................................................. ........................................................... 1 Sel Telur.............................................................................. Telur............................................................................................................................. ............................................... 7 Pengenalan Sel Telur Telur dan Sperma ............................................................................ .................................................................................... ........ 10 FERTILISASI EKSTERNAL EKSTERNAL PADA BULU BABI .............................................................. 11
Menarik Perhatian Perhatian Sperma: Sperma: Aksi dari dari Jauh ........................................................................ 12 Reaksi Akrosom .................................................................. ................................................................................................................. ............................................... 14 Pengenalan Spesifik Spesies............................................................................................. Spesies............................................................................................. 16 Fusi Membran Membran Sel Telur dan Sperma Sperma ........................................................................ ................................................................................ ........ 18 PENCEGAHAN POLISPERMI............................................. POLISPERMI........................................................................................... .............................................. 19
Blokade Polispermi Cepat................................................................ Cepat .................................................................................................. .................................. 21 Blokade Lambat Polispermi................................................. Polispermi................................................................................................ ............................................... 23 Kalsium sebagai sebagai Pemicu Pemicu Reaksi Granula Korteks ............................................................. 24 AKTIVASI METABOLISME METABOLISME SEL TELUR PADA BULU BABI........................................... 28
Respon Awal....................................................................... Awal ...................................................................................................................... ............................................... 28 Respon Akhir: Permulaan Permulaan Síntesis Protein dan DNA......................................................... 30 Fusi Materi Materi Genetik Genetik ........................................................................................................... 38 FERTILISASI MAMALIA ................................................................. ................................................................................................... .................................. 39
Membawa Gamet Menuju Oviduk: Oviduk: Translokasi dan Kapasitasi Kapasitasi ........................................ 40 Kejadian di Sekitar Sekitar Oosit: Hiperaktivasi, Termotaksis, Termotaksis, dan Kemotaksis............................. 44 Pengenalan pada Zona Zona Pelusita Pelusita .................................................................. ........................................................................................ ...................... 45 Fusi Gamet dan Pencegahan Polispermi................................................................. Polispermi ........................................................................... .......... 49 Fusi Materi Genetik......................................................................... Genetik ............................................................................................................ ................................... 51 PENUTUP ............................................................... .......................................................................................................................... ........................................................... 55 RANGKUMAN .................................................................... ................................................................................................................... ............................................... 56 DAFTAR RUJUKAN ....................................................................... .......................................................................................................... ................................... 58
i
DAFTAR GAMBAR
Gambar halaman 1. Bakal Janin Manusia Manusia dalam Sel Sperma yang yang Digambarkan Nicolas Hartsoeker ....... 2 2. Perubahan dari Sebuah Germ Cell Hingga Menjadi Sperma Sperma Hewan Mamalia............ 4 3. Apparatus Motil Sperma ........................................................................ .............................................................................................. ...................... 6 4. Struktur Sel Telur Bulu Bulu Babi saat Fertilisasi................................................................. Fertilisasi................................................................. 8 5. Tahapan Maturasi Sel Telur Saat Masuknya Sperma pada Berbagai Spesies Hewan .......................................................................... ......................................................................................................................... ............................................... 9 6. Permukaan Sel Telur Bulu Babi................................................................................... Babi................................................................................... 10 7. Keadaan Sel Telur Hamster Sesaat Sebelum Sebelum Fertilisasi ............................................. 11 8. Ringkasan Tahapan Menjelang Fusi Sel telur dan Membran Sel Sperma pada (A) Bulu Bulu Babi dan (B) Mencit.............................................................................. 12 9. Kemotaksis Sperma yang yang Terjadi pada Bulu Babi Arbacia punctulata ........................ 14 10. Model Peptida Kemotaksis pada Sperma Sperma Bulu Babi.................................................... Babi.................................................... 15 11. Reaksi Akrosom pada Sperma Bulu Babi.................................................................... 16 12. Pengikatan Spesifik Spesies Tonjolan Akrosom pada Permukaan Sel Telur Bulu Babi............................................................................................................. Babi...................................................................................................................... ......... 17 13. Lokalisasi Bindin Bindin pada pada Tonjolan Tonjolan Akrosom Akrosom ................................................................... 18 14. Reseptor Bindin pada Sel Telur Telur........................................................................... ................................................................................... ........ 19 15. Hasil Scan Mikrograf Elektron Elektron Masuknya Sperma ke Dalam Dalam Sel Telur Bulu Babi ....... 20 16. Perkembangan Menyimpang Menyimpang pada pada Sperma Bulu Babi Babi Dispermic ............................... 21 17. Potensial Membran Sel Telur Bulu Babi Sebelum dan Setelah Setelah Fertilisasi................... 23 18. Pembentukan Lapis Fertilisasi Fertilisasi dan Pelepasan Kelebihan Kelebihan Sperma.............................. 25 19. Eksositosis Granula Granula Korteks.................................................................. Korteks ........................................................................................ ...................... 26 20. Gelombang Pelepasan Ca 2+ dalam Sel Telur Bulu Babi selama Fertilisasi ................. 27 21. Retikulum Endoplasma yang Mengelilingi Granula Korteks pada Sel Telur Bulu Babi............................................................................................................. Babi...................................................................................................................... ......... 28 22. Postulat Jalur Aktivasi Sel Telur Telur pada Bulu Bulu Babi......................................................... Babi ......................................................... 30 23. Sintesis Protein dalam Jumlah Besar Saat Fertilisasi dari mRNA yang Terdapat pada Sitoplasma Oosit ......................................................................... ................................................................................................ ....................... 32 24. Peran Inositol Fosfat dalam Pelepasan Kalsium dari Retikulum Endoplasma dan Inisiasi Inisiasi Proses Perkembangan............................................................................. 35 25. Keterlibatan Protein G pada Masuknya Ion Kalsium ke Dalam Sel Telur Bulu Babi............................................................................................................. Babi...................................................................................................................... ......... 36 26. Kemungkinan Mekanisme Mekanisme Aktivasi Sel Telur............................................................... 37 27. Peristiwa yang Terjadi pada Nukleus pada pada Proses Fertilisasi Bulu Bulu Babi ..................... 40 28. Model Hipotetis Hipotetis Kapasitasi Sperma Mamalia Mamalia .............................................................. 43 29. Hasil Scan Mikrograf Elektron (dengan Pewarnaan Secara Artifisial) yang Menunjukkan Sperma Sapi saat Menempel pada Sel Epitel Oviduk O viduk Saat Menuju Ampulla ......................................................................... ........................................................................................................................ ............................................... 44 30. Ikatan Antara Sperma dan Zona.................................................................................. Zona.................................................................................. 46 31. Protein Zona 3 Mencit yang Berikatan Berikatan dengan Sperma .............................................. 47 32. Reaksi Akrosom pada Sperma Hamster...................................................................... Hamster...................................................................... 49 33. Masuknya Sperma Menuju Sel Telur Hamster Golden................................................ Golden................................................ 50 34. Gerakan Pronukleus Selama Selama Fertilisasi Gamet Manusia............................................. Manusia............................................. 53
ii
DAFTAR GAMBAR
Gambar halaman 1. Peristiwa yang yang Terjadi Selama Fertilisasi Fertilisasi .................................................................... 29 2. Eksperimen Transplantasi Pronukleus ........................................................................ 55
iii
PENDAHULUAN Fertilisasi adalah proses fusi sperma dan sel telur (keduanya juga disebut sebagai gamet) untuk mengawali penciptaan individu baru yang memiliki genom yang berasal dari kedua orang tuanya. Fertilisasi menjalankan 2 fungsi, yaitu sex (mengkombinasikan gen dari kedua induk) dan reproduksi (penciptaan organisme baru). Fungsi pertama fertilisasi adalah mentransmisi gen dari induk kepada keturunannya, selanjutnya yang kedua adalah menginisiasi proses fusi tersebut dalam dalam sitoplasma sel telur, sehingga sehingga tahap perkembangan perkembangan selanjutnya dapat dimulai. Rincian tahapan fertilisasi nampak berbeda pada berbagai spesies, secara umum proses konsepsi terdiri atas 4 tahap: 1. Terjadinya kontak dan pengenalan oleh sperma dan sel telur. Pada umumnya hal ini terjadi pada sperma dan sel telur dari spesies yang sama. 2. Proses regulasi masuknya sperma ke dalam sel telur. Aturannya adalah hanya satu sperma yang dapat memasuki sel telur, sedang sperma yang lain dihambat. 3. Fusi materi genetik dari sperma dan sel telur. 4. Aktivasi metabolisme sel telur untuk memulai proses perkembangan.
STRUKTUR GAMET Sel sperma dan sel telur memiliki interaksi yang kompleks. Sel telur mampu memicu metabolisme sperma untuk segera melakukan fertilisasi, dan sel sperma secara resiprokal juga memicu metabolisme sel telur untuk segera memulai proses perkembangan. Sebelum pembahasan tentang fertilisasi dimulai maka perlu diulas terlebih dahulu tentang struktur sel yang dirancang untuk kepentingan fertilisasi, yaitu sperma dan sel telur.
Sperma Peran sperma dalam fertilisasi baru saja terungkap dalam kurun waktu 130 tahun terakhir. Anton van Leeuwenhoek dari Belanda menemukan sel ini melalui mikroskop pada tahun 1678. Dirinya menganggap sel ini adalah hewan parasit yang ada dalam cairan semen (oleh karena itu sel ini disebut spermatozoa yang berarti hewan yang hidup dalam sperma). Leeuwenhoek pada awalnya beranggapan bahwa sel ini tidak berhubungan dengan proses reproduksi. Akan tetapi selanjutnya dirinya yakin bahwa dalam sperma terdapat “bakal embrio”. Pada tahun 1685 Leeuwenhoek menyatakan bahwa sperma adalah biji (sesungguhnya kata sperma dan semen berarti biji) dan kaum perempuan sebagai tanah yang menyediakan nutrisi
1
bagi “biji” yang ditanam. Dalam hal ini dirinya berkiblat pada teori prokreasi yang dinyatakan oleh Aristoteles 2000 tahun sebelumnya. Leeuwenhoek pada akhirnya kecewa karena keyakinannya tentang adanya bakal embrio dalam sperma tidak terbukti. Ilmuwan lain bernama Nicolas Hartsoeker yang juga turut menemukan sel sperma melukiskan keyakinannya tentang adanya ”manusia mini” dalam sel sperma seperti dalam Gambar 1.
Gambar 1. Bakal Janin Manusia dalam Sel Sperma yang Digambarkan Nicolas Hartsoeker.
Bukti pertama yang menunjukkan pentingnya peran sperma dalam reproduksi adalah rangkaian percobaan yang dilakukan Lazaro Spallanzani pada akhir tahun 1700-an. Spallanzani meletakkan katak jantan dalam kantong kain, selanjutnya Spallanzani melihat bahwa cairan semen katak yang disaring tidak mengandung sperma dan tidak dapat membuahi sel telur. Dirinya berpendapat bahwa harus ada kontak antara semen dan sel telur agar terjadi pembuahan. Namun seperti ilmuwan yang lain Spallanzani berkeyakinan bahwa sperma adalah hewan parasit dalam cairan semen, oleh karena itu dirinya berpendapat bahwa embrio manusia terdapat dalam sel telur dan membutuhkan cairan semen untuk mengaktivasi pertumbuhan embrio (Pinto-Correia, 1997). Ditemukannya lensa mikroskop yang lebih maju dan munculnya teori sel (bahwa semua bentuk kehidupan terdiri atas sel dan semua sel berasal dari sel sebelumnya) mendorong munculnya pendekatan baru tentang peran sperma. Pada tahun 1824, J.L. Prevost dan J.B. Dumas menyatakan bahwa sperma bukanlah hewan parasit, tetapi agen fertilisasi yang penting. Mereka mengungkapkan bahwa sperma ditemukan pada semua makhluk jantan dewasa dan tidak ditemukan pada individu yang belum dewasa atau menua. Hasil penelitian mereka dan kenyataan tentang hewan bagal (hasil perkawinan keledai jantan dan kuda betina) yang steril pada akhirnya semakin meyakinkan mereka bahwa ”terdapat hubungan yang nyata
2
antara keberadaan sperma dalam organ reproduksi dan kemampuan membuahi pada hewan”. Mereka mengumumkan bahwa sperma bergerak memasuki sel telur dan berperan secara material dalam menghasilkan generasi berikutnya. Pendapat ini pada mulanya belum diterima secara luas. Namun saat sekitar 1840-an seorang bernama A. von Kolliker menjelaskan tentang proses pembentukan sperma dari jaringan testis orang dewasa. Dirinya tidak dapat menerima pendapat umum bahwa cairan semen sebagai tempat hidup hewan parasit. Tetapi von Kolliker juga tidak sependapat dengan pernyataan bahwa terjadi kontak fisik antara sel telur dan sperma dalam proses pembuahan. Dirinya yakin bahwa sel telur bergerak menuju sperma seperti halnya batang magnet menarik besi. Pada tahun 1876 muncul ilmuwan Oscar Hertwig dan Herman Fol yang menunjukkan bahwa sel sperma bergerak memasuki sel telur dan fusi nuklei kedua sel tersebut. Hertwig mencari hewan yang cocok untuk pengamatan mikroskopiknya dan dirinya menemukan hewan Toxopneustes lividus (bulu babi mediterania/mediterranean sea urchin). Hal yang cocok, yaitu Toxopneustes ini disebabkan karena hewan tersebut mudah didapatkan dan fase dewasanya dapat dijumpai sepanjang tahun. Telur hewan ini jumlahnya sangat banyak dan nampak transparan meskipun diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat. Saat Hertwig mencampur suspensi sperma dan sel telur dirinya mengamati bahwa sel sperma bergerak memasuki sel telur. Dirinya juga menyatakan bahwa hanya satu sel sperma saja yang akan sel telur, dan nukleus yang dihasilkan saat proses fertilisasi selanjutnya berwujud sebagai nuklei embrio embrio.. Sementara itu Fol juga melakukan pengamatan serupa dan menyusun rincian mekanisme masuknya sel sperma. Pada akhirnya fertilisasi diartikan sebagai penyatuan sperma dan sel telur. Penyatuan gamet bulu babi adalah model terbaik untuk menggambarkan fertilisasi. Tiap sel sperma memiliki nukleus yang haploid, alat pendorong nukleus, dan kantung enzim yang berperan membantu nukleus memasuki sel telur. Pada hampir semua spesies (kecuali pada nematoda), seluruh sitoplasma meluruh saat maturasi sperma dan meninggalkan beberapa organel yang dimodifikasi untuk kepentingan sperma (Gambar 2). Selama proses maturasi sperma nukleus haploid menjadi makin ramping dan DNA terkompresi. Bagian depan dari nukleus haploid terkompresi ini terdapat vesikel akrosom atau disebut akrosom saja. Akrosom berasal dari aparatus golgi dan mengandung enzim yang mampu mengurai protein dan karbohidrat kompleks. Oleh karena itu akrosom sesungguhnya adalah vesikel sekretori. Enzim yang tersimpan dalam akrosom pada umumnya berperan melisis lapisan luar sel telur. Pada hampir semua spesies bagian protein aktin globular terdapat di antara nukleus sperma dan vesikel akrosom. Protein ini umumnya digunakan untuk merentangkan juluran akrosom 3
dari sperma pada tahap awal fertilisasi. Pada hewan bulu babi dan beberapa spesies lain, pengenalan sperma terhadap sel telur melibatkan molekul yang tersimpan dalam tonjolan akrosom. Secara bersama akrosom dan nukleus menjad bagian kepala sel sperma. Alat yang digunakan oleh sperma untuk melakukan dorongan tergantung pada bagaimana spesies yang bersangkutan menyesuaikan diri dengan lingkungannya. Pada sebagian besar spesies (perkecualian pada nematoda yang spermanya terbentuk di tempat terjadinya fertilisasi), tiap sel sperma bergerak dengan melecutkan flagelum. Bagian utama penyusun flagelum adalah aksonem, yaitu struktur yang dibentuk oleh mikrotubula. Mikrotubula berada memanjang dari sentriol di bagian dasar nukleus sperma (Gambar 3.A). Bagian inti aksonem terdiri atas 2 mikrotubula sentral yang dikelilingi 9 doublet mikrotubula tersusun berbaris. Sesungguhnya hanya satu mikrotubula dari tiap doublet yang berbentuk sempurna dan memiliki 13 protofilamen. Sedangkan lainnya berbentuk seperti huruf C dan hanya memiliki 11 protofilamen (Gambar 3.B). Interkoneksi antar protofilamen terjadi oleh karena protein dimer tubulin. Meskipun tubulin merupakan basis struktur flagelum, protein lain juga berperan dalam peran flagel. Tenaga dorong sperma dihasilkan dari dinein, yaitu protein yang melekat pada mikrotubula (Gambar 3.B). Dinein adalah ATPase, yaitu enzim yang menghidrolisis ATP, lalu mengubah energi kimia yang terlepas menjadi energi mekanik untuk mendorong sperma. Energi ini digunakan dalam gerakan geser mikrotubula doublet luar, sehingga flagel dapat bergerak menekuk (Ogawa dkk, 1977; Shinyoji dkk, 1998). Peran penting dinein dapat terlihat pada individu yang menderita kelainan genetik yang disebut triad Kartagener. Individu tersebut tidak memiliki dinein pada semua sel yang berlfagel dan bersilia. Hal ini menyebabkan sel tersebut immotil. Pria yang menderita penyakit ini menjadi steril (karena sperma yang immotil), rawan mendapat infeksi bronkhial (silia respiratori menjadi immotil), dan memiliki peluang memiliki posisi jantung yang tepat sebanyak 50% saja (karena silia immotil pada tahap embrio).
4
Gambar 2
Perubahan dari Sebuah Germ Cell Hingga Menjadi Sperma Hewan Mamalia. (A) Bagian sentriol menghasilkan flagel panjang yang akan menjadi ujung posterior sperma, dan aparatus golgi membentuk vesikel akrosom pada ujung anterior. Mitokondria yang berada di sekitar flagelum di dekat bagian basal nukleus haploid yang terkumpul dan membentuk bagian tengah (leher) sperma. Sitoplasma nampak berkurang massanya dan nukleus mengalami kondensasi. Ukuran sperma dewasa diperbesar untuk dibandingkan dengan fase yang lain. (B) Sel sperma sapi jantan. DNA ditunjukkan dengan warna biru melalui teknik DAPI, mitokondria berwarna hijau , dan tubulin flagelum berwarna merah. (C) Akrosom sperma mencit ditunjukkan dengan warna hijau dengan metode fusi protein proakrosin GFP. (Gambar A oleh Clermont dan Leblond; Gambar B oleh Sutovsky dkk, 1996, fotografi milik G. Schatten; Foto C milik K. S. Kim dan G. L. Gerton)
Susunan mikrotubula ”9+2” dengan lengan yang terbuat dari dinein dapat diamati pada aksonem milik semua sel eukariot. Hal ini menunjukkan bahwa susunan ini sangat cocok untuk mentransmisi energi untuk gerakan. ATP yang diperlukan untuk melecutkan flagel dan mendorong sperma berasal dari cincin mitokondria di bagian pusat sperma. Pada sebagian besar spesies (terutama mammalia) terdapat selapis serabut padat yang letaknya di antara lapisan mitokondria dan aksonem. Lapisan serabut ini berfungsi mengeraskan ekor sperma. Ketebalan lapisan ini akan makin menurun pada ujung ekor sperma. Hal ini mungkin
5
difungsikan agar bagian kepala sperma tidak tertampar lecutan ekor. Oleh karena itu sel sperma dapat melakukan modifikasi ekstensif untuk mendorong m endorong nukleus memasuki sel telur. Sperma hewan mamalia dilepaskan sat ejakulasi telah memiliki kemampuan untuk bergerak. Namun sperma ini belum memiliki kapasitas untuk melekat dan membuahi sel telur. Tahap final maturasi sperma mamalia, yang disebut kapasitasi, tidak akan terjadi hingga sperma memasuki saluran reproduksi hewan betina hingga periode waktu tertentu.
6
Gambar 3
Apparatus Motil Sperma. (A) Irisan melintang spermatozoa mamalia yang menunjukkan aksonem pusat dan serat eksternal. (B) Diagram yang menggambarkan susunan mikrotubulus ”9+2” dan komponen flagel yang lain. Diagram skematis flagel sperma bulu babi menunjukkan adanya asosiasi protofilamen tubulin pada doublet mikrotubula. Bagian pertama (”A”) doublet adalah mikrotubula normal yang terdiri dari 13 protofilamen. Bagian kedua (”B”) doublet hanya memiliki 11 (umumnya 10) protofilamen. Lengan dinein mengandung ATPase yang menyediakan energi untuk gerakan flagel. (Foto A milik D.M. Phillips; Foto B milik De Roberts dkk, 1975 dan Tilney dkk, 1973)
7
Sel Telur Semua materi yang diperlukan untuk mengawali pertumbuhan perkembangan harus tersedia dalam sel telur atau ovum. Sel sperma saat memasuki tahap maturasi akan meluruhkan sebagian besar sitoplasmanya, tetapi sel telur yang masih berkembang (disebut oosit sebelum sel ini mencapai tahap meiosis yang siap untuk fertilisasi) tetap mempertahankan jumlah materinya, dan bahkan mengakumulasikan lebih banyak. Pembelahan meiosis yang akan menghasilkan oosit akan tetap mempertahankan jumlah sitoplasma dan bukan untuk membagi sel menjadi setengah. Pada saat bersamaan oosit dapat melakukan 2 aktivitas, yaitu mensintesis atau mengabsorbsi protein seperti yolk yang berperan sebagai sumber nutrisi embrio. Telur burung adalah sel yang amat besar yang menggelebung karena yolknya. Sel telur lain yang yolknya sedikit nampak masih lebih besar daripada sel sperma. Volume sel telur bulu babi sekitar 200 picoliter (2x10 -4 mm3), 10.000 kali lebih besar daripada sel sperma (Gambar 4). Meskipun sel sperma dan sel telur bersifat haploid, sel telur mengakumulasi sejumlah besar sitoplasma saat maturasi (kandungan sel telur pada berbagai spesies adalah bervariasi). Sitoplasma tersebut memiliki kandungan: •
Protein. Protein. Perlu waktu yang lama bagi embrio untuk menyediakan nutrisi untuk dirinya sendiri atau mengambil nutrisi dari induknya. Sel embrionik pada tahap awal membutuhkan suplai energi dan asam amino. Pada sebagian besar spesies hal ini dilakukan dengan mengakumulasi protein yolk dalam sel telur. Sebagian besar protein yolk juga dihasilkan dari organ lain (seperti liver dan lemak tubuh) dan ditransportasikan dari pembuluh darah maternal kepada oosit.
•
Ribosom dan tRNA. tRNA . Embrio pada tahap awal perkembangan perlu menyusun RNA sendiri untuk dapat menghasilkan protein. Pada beberapa spesies sering terjadi sintesis protein dalam jumlah besar sesaat s esaat setelah fertilisasi. Sistesis protein dilakukan oleh ribosom dan tRNA dalam sel telur. Sel telur dalam tahap perkembangan memiliki mekanisme sintesis ribosom. Beberapa jenis oosit amphibia menghasilkan sekitar 10 12 ribosom selama tahap profease meiosis.
•
RNA Messenger . Oosit tidak hanya dapat mengakumulasi protein, sel ini juga mengakumulasi mRNA yang mengkode protein yang diperlukan pada tahap awal perkembangan. Saat ini diperkirakan sel telur bulu babi mengandung ribuan macam mRNA yang tersembunyi hingga tiba saat fertilisasi.
•
Faktor Morfogenetik. Morfogenetik. Molekul yang berperan dalam proses diferensiasi sel untuk menjadi sel bertipe lain juga terdapat dalam sel telur. Faktor ini dapat berupa faktor
8
transkripsi dan faktor parakrin. Pada sebagian besar spesies faktor ini terdapat pada tempat berbeda dalam sel telur. Pada saat pembelahan sel faktor ini juga mengalami segregasi pada sel-sel berbeda. •
Senyawa Pelindung Kimiawi. Kimiawi . Embrio tidak dapat bergerak menghindar dari predator atau lingkungan yang tidak nyaman. Oleh karena itu embrio juga dilengkapi dengan perlindungan terhadap ancaman tersebut. Sebagian besar sel telur memiliki filter ultraviolet dan enzim reparasi DNA yang berperan melindungi sel telur dari sinar matahari. Beberapa sel telur juga memiliki zat untuk menghilangkan selera hewan predator, bahkan beberapa jenis telur burung dilengkapi antibodi.
Gambar 4
Struktur Sel Telur Bulu Babi saat Fertilisasi. Gambar ini menunjukkan ukuran relatif sel telur dan sperma (Epel, 1977)
Volume sitoplasma yang sangat besar ini memiliki nukleus yang berukuran besar. Pada sebagian kecil spesies (seperti bulu babi), pronukleus betina telah berada dalam kondisi haploid saat fertilisasi. Sedangkan pada spesies lain (seperti cacing dan sebagian besar mammalia) nukleus sel telur berada dalam kondisi diploid karena sperma telah memasuki sel telur sebelum pembelahan meiosis tuntas (Gambar 5). Pada spesies ini tahap final meiosis sel telur terjadi saat materi nuklear sperma (pronukleus jantan) bergerak menuju pronukleus betina. Lapis luar sitoplasma adalah lapisan membran sel. Membran ini harus dapat berfusi dengan membran sel sperma dan meregulasi transport ion selama fertilisasi. Sisi luar membran sel adalah lapis ekstraselular yang membentuk hamparan berserabut di sekeliling sel dan berperan dalam hal identifikasi sel sperma. Pada hewan invertebrata lapis ini umumnya disebut lapisan vitelin (Gambar 6). Lapisan vitelin tersusun atas berbagai glikoprotein. Lapisan
9
ini dilengkapi dengan juluran glikoprotein membran dan batang-batang protein yang melekatkan lapisan vitelin pada membran sel. Lapisan vitelin berperan dalam pengikatan sperma secara spesies-specific.
Gambar 5
Tahapan Maturasi Sel Telur Saat Masuknya Sperma pada Berbegai Spesies Hewan. Perhatikan bahwa pada sebagian besar spesies, masuknya sperma terjadi sebelum nukleus sel telur belum menuntaskan proses meiosis. Vesikula germinal adalah nama yang diberikan bagi nukleus diploid besar oosit primer. Polar body yang tidak fungsional dihasilkan dari proses meiosis (Austin, 1965).
Pada hewan mamalia membran vitelin adalah terpisah dan berupa matriks ekstraselular yang disebut zona pelusida. Sel telur mamalia juga dilapisi lapisan sel yang disebut kumulus (Gambar 7) yang tersusun atas sel folikel ovarium yang bertugas menunjang keperluan sel telur saat terlepas dari ovarium. Sel sperma mamalia harus dapat menembus lapisan sel ini untuk membuahi sel telur. Lapisan dalam kumulus yang berdekatan dengan zona pelusida disebut korona radiata. Tepat di bawah membran sel terdapat lapisan tipis (ketebalan sekitar 5 µm) sitoplasma yang seperti jel dan disebut korteks. Sitoplasma di daerah ini lebih padat dibanding lapisan yang lebih dalam dan mengandung molekul aktin globular dengan kadar tinggi. Saat fertilisasi berlangsung molekul aktin ini melakukan polimerisasi dan membentuk juluran aktin yang disebut mikrofilamen. Mikrofilamen diperlukan dalam proses pembelahan sel dan meningkatkan luas permukaan sel dengan cara membentuk juluran kecil yang disebut mikrovili yang berperan membantu masuknya sel sperma ke dalam sel telur (Gambar 6.B dan 15).
10
Gambar 6
Permukaan Sel Telur Bulu Babi. (A) Hasil scan mikrograf elektron sel telur sebelum fertilisasi. Plasma membran terekspos dimana lapis vitelin terkoyak. (B) Mikrograf transmisi elektron dari sebuah sel telur yang belum dibuahi, gambar ini menunjukkan mikrovili dan membran plasma yang diselimuti lapis vitelin. Granula korteks terletak di bawah membran plasma (Schroeder, 1979; Foto milik T.E. Schroeder).
Bagian sisi dalam dari korteks terdapat granula kortikal (Gambar 4 dan 6.B). Struktur ini berikatan dengan membran sel, berasal dari aparatus golgi, mengandung enzim proteolitik, dan oleh karena itu homolog dengan vesikel akrosom dari sperma. Sel sperma bulu babi hanya memiliki satu vesikel akrosom, tetapi tiap sel telur bulu babi memiliki sekitar 15.000 granula kortikal. Granula kortikal selain memiliki enzim digestif juga memiliki mukopolisakarida, glikoprotein pelekat, dan protein hyalin. Enzim dan mukopolisakarda berperan mencegah terjadinya polispermi (mencegah masuknya sel sperma tambahan ke dalam sel telur setelah masuknya sel sperma pertama), sedangkan hyalin dan glikoprotein pelekat berperan melapisi embrio tahap awal dan sebagai penyangga bagi blastomer pada tahap pembelahan. Sebagian besar sel telur dilengkapi dengan lapisan jelly di luas lapisan vitelin (Gambar 4). Lapisan ini sesungguhnya adalah jaring-jaring glikoprotein yang mempunyai fungsi yang beragam, tetapi pada umumnya berperan menarik perhatian atau mengaktivasi sel s el sperma. Sel telur adalah sel yang dirancang untuk menerima sel sperma dan memulai proses perkembangan.
Pengenalan Sel Telur dan Sperma Interaksi sperma dan sel telur umumnya terjadi melalui 5 langkah berikut (Gambar 8; Vacquier, 1998): 1. Sel telur melepas molekul yang mudah larut untuk menarik sel sperma secara kimiawi. 2. Eksositosis vesikel akrosom untuk melepas enzim. 3. Pengikatan sperma pada lapisan ekstraselular telur (membran vitelin atau zona pelusida).
11
4. Sperma menembus lapisan ekstraselular sel telur. 5. Fusi membran sel telur dan sperma. Terkadang langkah 2 dan 3 dapat terjadi terbalik (seperti pada fertilisasi mamalia, Gambar 8.B), dan sperma terikat pada matriks ekstraselular sel telur sebelum melepas materi akrosom. Setelah melampaui kelima langkah tersebut sperm yang haploid dan inti sel telur dapat berfusi dan selanjutnya terjadi reaksi inisiasi proses perkembangan. Dalam buku ini dibahas proses perkembangan pada bulu babi yang melakukan fertilisasi eksternal dan mencit yang melakukan fertilisasi internal.
Gambar 7
Keadaan Sel Telur Hamster Sesaat Sebelum Fertilisasi. (A) Sel telur hamster atau ovum dilapisi zona pelusida dan selanjutnya dikelilingi oleh sel kumulus. Sebuah sel polar body yang dihasilkan dari proses meiosis juga nampak dalam zona pelusida. (B) Pada tingkat pembesaran yang lebih rendah sebuah sel oosit mencit nampak dikelilingi kumulus. Partikel karbon koloid (memakai tinta India) tidak nampak dalam matrix hyaluronidase (Foto milik R. Yanagimachi).
FERTILISASI EKSTERNAL PADA BULU BABI Proses pertemuan sperma dan sel telur pada sebagian besar spesies bukanlah perkara sederhana. Sebagian besar organisme laut melepas gametnya di alam bebas. Alam tersebut dapat berupa sebuah kolam atau lautan bebas (Mead dan Epel, 1995). Bersama dengan spesies lainnya, organisme laut melepas sel kelaminnya pada waktu yang bersamaan. Organisme ini akan menghadapi dua permasalahan, yaitu bagaimana sperma dan sel telur dapat bertemu dalam lingkungan yang berair dan bagaimana caranya agar sperma tidak keliru membuahi sel telur yang bukan spesiesnya? Dalam hal ini terdapat dua mekanisme penting untuk menjawab pertanyaan tersebut, yaitu daya tarik spesifik spesies dan aktivasi sperma spesifik spesies.
12
Gambar 8
Ringkasan Tahapan Menjelang Fusi Sel telur dan Membran Sel Sperma pada (A) Bulu Babi dan (B) Mencit. Fertilisasi bulu babi berlangsung secara eksternal. (1) Sperma secara kemotaksis tertarik dan teraktivasi sel telur, (2,3) Kontak dengan lapisan jelly sel telur memicu reaksi akrosom, hal ini menyebabkan akrosom menonjol dan membentuk enzim proteolitik untuk dilepas, (4) Sperma melekat pada lapis vitelin dan melisis lapis tersebut hingga terbentuk lubang, (5) Sperma melekat pada membran plasma sel telur dan berfusi. Pronukleus sperma sekarang dapat memasuki sitoplasma sel telur. (B) Fertilisasi mamalia berlangsung secara internal. (1) Zat-zat yang terdapat pada saluran reproduksi betina mengkapasitasi, menarik, dan mengaktivasi sperma. (2) Akrosom dari sperma yang telah menempel berikatan dengan zona pelusida yang lebih tebal daripada lapis vitelin bulu babi. (3) Reaksi akrosom terjadi pada zona pelusida. (4) Sperma menggali lubang pada zona pelusida. (5) Sperma melekat pada sel telur, membran sel kedua sel tersebut berfusi.
Menarik Perhatian Sperma: Aksi dari Jauh Peristiwa menarik menarik perhatian sperma spesifik spesies spesies dapat diamati diamati pada berbagai spesies, termasuk Cnidaria, Mollusca, Echinodermata, dan Urochordata (Miller, 1985; Yoshida dkk, 1993). Pada sebagian besar spesies sperma bergerak tertarik menuju sel telur spesiesnya melalui proses kemotaksis (bergerak berdasarkan gradien kimiawi yang dihasilkan sel telur). Pada tahun 1978 Miller mendemonstrasikan bahwa sel telur Cnidaria Orthopyxis caliculata tidak hanya melepas senyawa kemotaksis tetapi juga mengatur waktu sekresinya. Oosit yang masih dalam tahap perkembangan diamati di bawah mikroskop, kemudian dilepaskan sejumlah sperma pada jarak tertentu. Miller melihat bahwa bila sperma dilepaskan saat oosit belum menyelesaikan pembelahan meiosis II, maka tidak terjadi proses penarikan sperma. Tetapi bila proses pembelahan meiosis II tercapai dan sel telur siap dibuahi maka sel sperma bergerak menuju sel telur. Oleh karena itu pengendalian oosit tidak hanya berkaitan dengan sperma saja tetapi juga terkait dengan waktu dimana terjadi penarikan sperma oleh sel telur.
13
Mekanisme kemotaksis tidak sama pada berbagai spesies (Metz, 1978; Eisenbach, 2004), bahkan pada spesies yang berkerabat memiliki perbedaan jenis molekul kemotaksisnya. Pada bulu babi motilitas sperma terjadi setelah sperma dilepas ke perairan. Selama berada dalam testis sperma masih belum motil karena pH yang rendah (sekitar 7,2) karena tingginya kadar CO 2 di dalam gonad. Saat sperma dilepas menuju perairan, maka pH sperma meningkat menjadi 7,6. Hal ini menyebabkan aktivasi dinein ATPase. Pemecahan ATP memberikan energi untuk flagela sehingga dapat bergerak, dan sperma akhirnya dapat berenang. Kemampuan berenang sperma nampaknya tidak dilengkapi dengan kemampuan penentuan arah. Pada echinodermata arah gerakan sperma ditentukan oleh peptida kemotaksis yang disebut resact. Resact adalah rantai peptida dari 14 asam amino yang diisolasi dari lapisan jelly sel telur bulu babi Arbacia punctulata (Ward dkk, 1985). Resact bila ditambahkan dalam suspensi sperma Arbacia mengalami difusi dalam air laut dan mempunyai pengaruh yang kuat dalam kadar rendah. Bila setetes air laut yang mengandung sperma Arbacia diamati di bawah mikroskop nampak sperma tersebut berenang di sekitar lingkaran berdiameter 50 µm. Bila sejumlah resact diteteskan ke dalam tetesan tersebut maka dalam sekejap sel sperma bergerak menuju daerah injeksi dan berkumpul di sana (Gambar 9). Saat resact mulai berdifusi dari area injeksi, makin banyak sperma yang berkumpul sehingga kumpulan massa semakin membesar. Resact hanya spesifik untuk A. punctulata dan tidak untuk sperma spesies lain (senyawa analog yang disebut speract telah diisolasi dari bulu babi ungu Strongylocentrotus purpuratus). purpuratus ). Sperma A. punctulata memiliki reseptor di membran selnya untuk mengikat resact (Ramarao (Ramarao dan Garbers, 1985; Bentley dkk, 1986). Bila Bila reseptor di sisi ekstraselular berikatan dengan resact maka terjadi aktivasi siklase guanilil di sisi sitoplasmik. Hal ini menyebabkan sel sperma menghasilkan GMP siklik lebih banyak. Senyawa ini berperan mengaktivasi channel kalsium untuk influx ion kalsium dari air laut menuju sel sperma, sehingga juga berperan sebagai penentu arah. Beberapa penelitian terakhir menunjukkan bahwa proses pengikatan resact tunggal berperan sebagai penentu arah gerakan sperma yang berenang sepanjang gradien konsentrasi senyawa ini hingga dapat membuahi sel telur (Kaupp dkk, 2003; Kirkman-Brown dkk, 2003). Resact juga berperan sebagai peptida aktivasi sperma. Peptida aktivasi sperma akan memicu peningkatan respirasi mitokondria dan motilitas sperma. Peningkatan GMP siklik dan Ca2+ juga memicu apparatus pembangkit ATP di mitokondria dan ATPase dinein yang memicu gerakan flagel sperma (Shimomura dkk, 1986; Cook dan Babcock, 1993). Oleh karena itu saat
14
bertemu dengan resact sperma Arbacia akan diatur arah gerakannya dan diberi tambahan tenaga untuk bergerak.
Gambar 9
Kemotaksis Sperma yang Terjadi pada Bulu Babi Arbacia punctulata. Satu nanoliter larutan 10-nM resact diinjeksikan ke dalam 20 µl tetesan suspensi sperma. (A) Sebuah fotografi 1 detik menunjukkan sperma yang berenang dalam lingkaran sempit sebelum ditambahkan resaca. Posisi pipet injeksi ditunjukkan oleh garis putih. (B-D) Foto serupa yang menunjukkan migrasi sperma menuju pusat gradien resact pada 20, 40, dan 90 detik setelah injeksi (Ward dkk, 1985; foto milik V.D. Vacquier).
Reaksi Akrosom Bentuk hubungan ke-2 antara sperma dan lapisan jelly sel telur adalah reaksi akrosom. Pada sebagian besar invertebrata laut reaksi akrosom terdiri atas 2 komponen, yaitu fusi vesikel akrosom dengan membran sel sperma (eksositosis yang berperan melepas materi vesikel akrosom), dan penonjolan juluran akrosom (Dan, 1952; Colwin dan Colwin, 1963). Reaksi akrosom pada bulu babi diawali dengan kontak antara sperma dengan lapisan jelly sel telur. Terjadinya kontak memicu eksositosis vesikel akrosom sperma dan terlepasnya enzim proteolitik yang akan mengurai lapisan jelly hingga permukaan sel telur (Dan, 1967; Franklin, 1970; Levine dkk, 1978). Saat sperma telah mencapai permukaan sel telur juluran akrosom melekat pada lapisan vitelin dan menjadi jangkar pengait sperma menuju sel telur. Reaksi akrosom bulu babi dipicu oleh interaksi membran sel sperma dengan kompleks gula spesifik yang terdapat pada lapisan jelly sel telur. Polisakarida tersebut berikatan dengan reseptor spesifik yang terletak pada membran sel sperma tepat di atas vesikel akrosom. Senyawa faktor lapisan jelly yang memicu reaksi akrosom pada umumnya sangat spesifik untuk tiap spesies. Karbohidrat lapisan jelly dari satu spesies bulu babi belum tentu dapat memicu reaksi akrosom pada spesies lain yang masih berkerabat (Hirohashi dan Vacquier, 2002; Hirohashi dkk, 2002; Biermann dkk, 2004). Oleh karena itu aktivasi reaksi akrosom berperan sebagai barrier antar spesies dan menghalangi terjadinya kekeliruan fertilisasi.
15
Gambar 10
Model Peptida Kemotaksis pada Sperma Bulu Babi. (A) Resact dari jelly sel telur Arbacia berikatan dengan reseptornya di sperma. Hal ini mengaktivasi aktivitas guanilil siklase pada reseptor (reseptor’s guanylyl cyclase/RGC), selanjutnya membentuk cGMP intraselular pada sperma. cGMP membuka channel kalsium pada membran sel sperma dan menyebabkan Ca2+ memasuki sperma. Influx Ca2+ mengaktivasi motilitas sperma dan sperma berenang melintasi gradien resact menuju sel telur. (B) Kadar Ca 2+ pada berbagai daerah berbeda pada sperma Strongylocentrotus purpuratus setelah terekspos pada 125nM speract (analogi resact pada spesies ini). Warna merah menunjukkan kadar tertinggi Ca 2+, warna biru menunjukkan kadar terendah. Kepala sperma mencapai puncak kadar Ca2+ dalam 1 detik (Kirkman-Brown, 2003).
Reaksi akrosom bulu babi Strongylocentrotus Strongylocentrotus purpuratus dipicu oleh adanya polimer berulang fucose sulfat. Bila karbohidrat sulfat berikatan dengan reseptor pada sperma, maka reseptor memicu kerja protein membran sperma, yaitu (1) channel transport kalsium yang mengatur masuknya ion Ca 2+ menuju kepala sperma; (2) exchanger sodium/hidrogen yang bertugas memompa ion Na + ke dalam sperma dan ion H + keluar; dan (3) enzim pospolipase yang berperan menghasilkan sejenis second messenger, yaitu IP3. IP3 memiliki kemampuan melepas Ca2+ dari dalam sperma (mungkin dari dalam akrosom) (Domino dan Garbers, 1988; Domino dkk, 1989; Hirohashi dan Vacquier, 2003). Peningkatan kadar ion kalsium berperan memicu fusi membran akrosom dengan membran sel sperma, kemudian terlepasnya enzim yang melisis lapisan jelly hingga lapisan vitelin. Reaksi eksositotik seperti reaksi akrosom juga terjadi dalam pelepasan insulin dari sel pankreas dan pelepasan neurotransmitter dari terminal sinaps. Pada semua bentuk eksositosis terdapat fusi yang difasilitasi kalsium antara vesikel sekretori dengan membran sel. Kemiripan eksositosis vesikel sekretori dan vesikel sinaps cukup banyak. Penelitian tentang reaksi akrosom pada bulu babi dan mamalia menunjukkan bahwa saat reseptor ligand aktivasi
16
sperma berikatan terjadi depolarisasi membran yang membuka channel kalsium dependen voltase, hal ini nampak seperti transmisi pada sinaps. Bagian ke-2 dari reaksi akrosom adalah terjadinya pemanjangan juluran akrosom (Gambar 11). Proses penjuluran terjadi karena polimerisasi molekul aktin globular menjadi filamen aktin (Tilney dkk, 1978). Influx ion Ca 2+ diperkirakan mengaktivasi protein RhoB di bagian akrosom dan bagian tengah sel sperma bulu babi (Castellano dkk, 1997). Protein ini bersifat mengikat GTP dan membantu pengaturan sitoskeleton aktin pada berbagai tipe sel, dan diperkirakan menjadi aktif saat polimerisasi aktin dalam penjuluran akrosom.
Gambar 11
Reaksi Akrosom pada Sperma Bulu Babi. (A-C) Bagian membran akrosom yang terletak langsung di bawah membran plasma sperma berfusi dengan membran plasma untuk melepas materi vesikula akrosom. (D) Molekul aktin dirangkai untuk membentuk mikrofilamen yang terentang melintasi akrosom. Fotografi aktual reaksi akrosom pada bulu babi ditunjukkan di bawah diagram (Summers dan Hylander, 1974, foto milik G.L. Decker dan W.J. Lennarz).
Pengenalan Spesifik Spesies Kontak antara sperma dan lapisan jelly sel telur menjadi tahap pertama peristiwa pengenalan spesifik spesies. Namun terdapat peristiwa pengikatan lain yang penting saat sperma bulu babi menembus lapisan jelly dan juluran akrosom mengenai permukaan sel telur (Gambar 12.A). Protein akrosom yang berperan memfasilitasi pengenalan pada bulu babi disebut bindin. bindin. Pada tahun 1977 Vacquier dan stafnya mengisolasi protein dengan ukuran 30.500 Da yang nonsoluble dari akrosom Strongylocentrotus purpuratus dan menemukan bahwa senyawa ini mampu mengikat sel telur tanpa jelly dari spesies yang sama. Hasil selanjutnya menunjukkan bahwa interaksi senyawa ini dengan sel telur nampaknya spesifik spesies. Bindin yang diisolasi dari akrosom S.purpuratus berikatan dengan sel telur tanpa jelly
17
dari jenisnya sendiri dan tidak berikatan dengan sel telur tanpa jelly dari jenis S.fransiscanus (Gambar 12.B; Glabe dan Vacquier, 1977; Glabe dan Lennarz, 1979). Moy dan Vacquier (1979) menggunakan metode immunologis untuk menunjukkan bahwa bindin memang terletak tepat pada juluran akrosom, yaitu tempat terjadinya pengenalan sperma dan sel telur (Gambar 13).
Gambar 12
Pengikatan Spesifik Spesies Tonjolan Akrosom pada Permukaan Sel Telur Bulu Babi. (A) Kontak aktual tonjolan akrosom sperma bulu babi dengan mikrovilus sel telur. (B) Model in vitro pengikatan spesifik spesies. Aglutinasi sel telur tanpa jelly oleh bindin yang diamati dengan menambahkan agregat bindin pada sumur plastik yang diisi suspensi sel telur. Foto diambil setelah sumur digoyang dengan lembut selama 2-5 menit. Setiap bindin berikatan dan hanya menggumpalkan sel telur dari spesiesnya sendiri (Epel, 1977, foto milik F.D. Collins dan D. Epel; Foto B milik Glabe dan Vacquier, 1977).
Penelitian di bidang biokimia menunjukkan bahwa bindin yang berasal dari berbagai spesies bulu babi yang berkerabat adalah beragam. Penemuan ini menyatakan adanya reseptor bindin yang spesifik spesies pada membran vitelin sel telur. Reseptor tersebut juga dinyatakan oleh eksperimen Vacquier dan Payne (1973) yang menjenuhkan sel telur bulu babi dengan sperma. Pada Gambar 14.A proses pengikatan sperma tidak terjadi pada seluruh permukaan sel telur. Bahkan saat penjenuhan hingga mencapai sekitar 1500 sperma nampaknya masih tersedia tempat bagi kepala sperma di permukaan sel telur, sehingga terbukti bahwa tempat pengikatan terbatas jumlahnya. EBR1 adalah glikoprotein dengan ukuran 350 kDa yang menampakkan sifat seperti reseptor bindin, senyawa ini diisolasi dari sel telur bulu babi (Kamei dan Glabe, 2003). Reseptor bindin nampaknya beragregasi membentuk
18
kompleks lapisan vitelin, dan ratusan kompleks semacam ini diperlukan untuk menambatkan sperma pada sel telur (Gambar 14.B). reseptor untuk bindin sperma pada lapisan vitelin sel telur nampaknya mengenali komponen protein pada bindin secara spesifik spesies. Beberapa spesies bulu babi yang berkerabat (dalam satu genus) memiliki reseptor bindin yang berbeda, dan sel telur hanya dapat berpasangan dengan bindin dari spesiesnya sendiri (Gambar 14.C). oleh karena itu pengenalan spesifik spesies gamet bulu babi terjadi melalui penarikan sperma, aktivasi sperma, dan perlekatan sperma pada permukaan sel s el telur.
Gambar 13
Lokalisasi Bindin pada Tonjolan Akrosom. (A) Teknik imunokimia digunakan untuk menentukan lokasi bindin. Antibodi kelinci dapat bereaksi dengan protein bindin dan antibodi ini diinkubasi dengan sperma yang melakukan reaksi akrosom. Bila terdapat bindin, antibodi kelinci akan tetap berikatan dengan sperma. Setelah antibodi yang tidak berikatan dibilas, sperma diperlakukan dengan antibodi babi yang secara kovalen berhubungan dengan enzim peroksidase. Antibodi babi berikatan dengan antibodi kelinci dan menentukan letak molekul peroksidase dimana bindin berada. Peroksidase mengkatalisis pembentukan presipitat gelap dari diaminobenzidin (DAB) dan hidrogen peroksida. Oleh karena itu presipitat hanya terbentuk bila terdapat bindin. (B) Lokalisasi bindin menuju tonjolan akrosom setelah reaksi akrosom (33.200x). (C) Lokalisasi bindin menuju tonjolan akrosom pada junction antara sel telur dan sperma (Gambar B dan C milik Moy dan Vacquier, 1979; foto milik Vacquier).
Fusi Membran Sel Telur dan Membran Sel Sperma Setelah sperma bergerak menuju sel telur dan melakukan reaksi akrosom, fusi membran sel sperma dan sel telur dapat dilakukan. Proses masuknya sperma ke dalam sel telur bulu babi digambarkan pada Gambar 15. Fusi sperma dan sel telur memicu polimerisasi aktin dalam sel telur sehingga terbentuk kerucut fertilisasi (Summers dkk, 1975). Dalam hal ini dapat ditunjukkan adanya homologi antara sel telur dengan sperma, yaitu juluran akrosom yang terbentuk dari polimerisasi aktin. Aktin dari sel gamet membentuk koneksi yang memperlebar penghubung (bridge) sitoplasmik antara sel telur dan sperma. Nukleus sperma dan bagian ekor bergerak melalui penghubung ini. Seluruh bagian membran sel bulu babi mampu berfusi dengan sperma. Pada spesies lain hanya bagian tertentu yang dikhususkan untuk fungsi pengenalan dan fusi (Vacquier, 1979). Fusi adalah sebuah proses aktif yang difasilitasi protein fusogenik spesifik. Diperkirakan bahwa bindin sperma bulu babi memiliki peran sekunder sebagai protein fusogenik. Dalam hal 19
pengenalan sel telur bindin memiliki juluran asam amino hidrofobik di dekat bagian terminus, dan bagian ini mampu memfusikan vesikel fosfolipida secara in vitro (Ulrich dkk, 1999; Gage dkk, 2004).
Gambar 14
Reseptor Bindin pada Sel Telur. (A) Hasil scan mikrograf elektron sperma bulu babi yang berikatan dengan lapis vitelin sel telur. Meskipun sel telur dipenuhi dengan sel sperma, nampak masih terdapat ruang untuk sperma tambahan, hal ini menunjukkan adanya jumlah terbatas reseptor bindin. (B) Sperma Strongylocentrotus purpuratus terikat pada bola-bola polistiren yang dilapisi protein reseptor bindin murni. (C) Pengikatan spesifik spesies sperma bulu babi pada ERB1. Sperma S. purpuratus berikatan dengan bola-bola yang dilapisi reseptor bindin ERB1 yang dimurnikan dari sel telur S.purpuratus, hal ini tidak terjadi pada sperma S. fransiscanus. fransiscanus. tidak ada sperma yang berikatan dengan bola tanpa lapisan (Foto milik C. Glabe, L. Perez, dan W.J. Lennarz; Gambar B dari Foltz dkk, 1993; Gambar C milik Kamei dan Glabe, 2003).
PENCEGAHAN POLISPERMI Tepat saat sperma telah memasuki sel telur fusibilitas membran sel telur (yang berperan memasukkan sperma ke dalam sel telur) berubah menjadi materi yang berbahaya. Pada hampir semua jenis hewan memiliki sperma yang bila memasuki sel telur membawa nukleus haploid dan sentriol untuk sel telur. Dalam kondisi monospermi normal hanya ada s atu sperma yang memsuki sel telur, selanjutnya nukleus sperma dan sel telur yang haploid menyatu menyebabkan terbentuknya sel telur yang dibuahi (zigot) dengan nukleus diploid. Dalam hal ini jumlah kromosom spesies kembali seperti semula. Sentriol yang dibawa dari sel sperma terbagi dan membentuk 2 kutub spindel mitosis untuk proses pembelahan sel.
20
Gambar 15
Hasil Scan Mikrograf Elektron Masuknya Sperma ke Dalam Sel Telur Bulu Babi. (A) Kontak kepala sperma dengan mikrovilus melalui tonjolan akrosom. (B) Pembentukan kerucut fertilisasi. (C) Masuknya sperma ke dalam sel telur. (D) Mikrograf elektron transmisi yang menunjukkan masuknya sperma ke dalam kerucut fertilisasi. (Gambar AC dari Schatten dan Mazia, 1976, foto milik G. Schatten; Foto D milik F.J. Longo)
Masuknya multisperma (polispermi) ke dalam sel telur dapat menyebabkan gangguan pada hampir semua organisme. Fertilisasi oleh 2 sperma pada bulu babi menghasilkan nukleus yang triploid, dimana setiap kromosom berganda tiga dan bukan dua. Lebih jauh setiap sentriol sperma menghasilkan dua kutub aparatus mitosis. Hal ini menyebabkan bukannya terjadi spindel mitosis bipolar untuk memisahkan kromosom menuju 2 sel, tetapi kromosom triploid dapat membelah menjadi 4 sel. Tidak ada mekanisme yang memastikan keempat sel tersebut mendapatkan jumlah dan jenis kromosom yang tepat. Tiap sel tersebut mewarisi proporsi kromosom yang tidak sama, ada yang mendapat lebih dan ada yang mendapat kurang (Gambar 16). Theodor Boveri mendemonstrasikan hal ini pada tahun 1902 dan menyatakan bahwa sel semacam itu akan mengalami kematian atau perkembangan abnormal.
21
Gambar 16
Perkembangan Menyimpang pada Sperma Bulu Babi Dispermic. (A) Fusi tiga nukleus haploid, setiap nukleus memiliki 18 kromosom, dan pemisahan dua sentriol sperma untuk menghasilkan empat sentrosom (kutub mitosis). (B,C) Secara acak 54 kromosom bergabung membentuk empat spindel. (D) Pada tahap anafase pembelahan pertama, kromosom yang terduplikasi tertarik menuju empat kutub. (E) Terbentuk empat sel yang memiliki jumlah dan tipe kromosom berbeda, oleh karena itu menyebabkan terjadinya (F) kematian dini embrio. (G) Metafase pertama sel telur bulu babi dispermic terkait pada poin (D). Mikrotubula nampak berwarna hijau, DNA nampak berwarna jingga. DNA triploid terbagi pada empat sel yang tidak sama kromosomnya, bukan menjadi dua sel normal dengan kromosom yang komplemen. (H) Sperma dispermic manusia pada mitosis pertama. Empat sentriol nampak berwarna kuning, sementara mikrotubula pada apparatus spindel (beserta dua buah ekor sperma) berwarna merah. Tiga set kromosom terbagi pada empat kutub yang berwarna biru. (Gambar A-F dari Boveri, 1907; Foto G milik J. Holy; Gambar H dari Simerly dkk, 1999; Foto milik G Schatten)
Blokade Polispermi Cepat Proses blokade cepat polispermi dilakukan dengan mengubah potensial listrik membran sel telur. Membran sel tersebut memiliki barier selektif antara sitoplasma dengan lingkungan luar sehingga kadar ion dalam sel telur berbeda dengan di luar sel. Perbedaan
22
kadar ini terutama pada kadar ion sodium dan potasium. Air laut memiliki kadar ion sodium (Na+) yang tinggi, sementara di dalam sel telur memiliki kadar ion Na + yang relatif rendah. Pada ion K + berlaku sebaliknya. Hal ini dikendalikan oleh membran sel yang dengan tepat menghambat masuknya ion Na + ke dalam sel dan mencegah lepasnya ion K + menuju lingkungan luar. Bila ke dalam sel telur dimasukkan sebuah elektroda dan elektroda lain di sisi luar sel, maka dapat diukur perbedaan muatan sepanjang membran sel. Potensial istirahat membran secara umum adalah sebesar 70 mV, umumnya dinyatakan -70 mV karena muatan di dalam sel adalah negatif dibandingkan dengan di luar. Dalam waktu 1-3 detik setelah terjadi pengikatan dengan sperma pertama potensial membran berubah menuju level positif sekitar +20 mV (Longo dkk, 1986). Perubahan ini disebabkan influx ion Na+ dalam jumlah sedikit ke dalam sel telur (Gambar 17.A). Meskipun sperma memiliki potensial membran -70 mV proses fusi tidak akan terjadi karena potensial membran sel telur telah berubah menjadi positif sehingga tidak akan ada lagi sperma yang berfusi. Sejauh ini belum diketahui apakah peningkatan permeabilitas sodium sel telur disebabkan oleh pengikatan sperma pertama, atau karena fusi sperma dengan sel telur (Gould dan Stephano, 1987; McCulloh dan Chambers, 1992). Peran ion Na + dan perubahan potensial istirahat didemostrasikan oleh Laurinda Jaffe dan rekan-rekannya. Mereka menemukan bahwa polispermi pada bulu babi dapat diinduksi bila sel telur diberi aliran listrik yang menahan potensial membrannya tetap negatif. Sebaliknya fertilisasi dapat dicegah dengan menahan potensial membran tetap positif (Jaffe, 1976). Blokade cepat polispermi juga dapat ditahan dengan menurunkan kadar Na + di lingkungan luar sel (Gambar 17.B). Bila suplai ion sodium tidak mencukupi karena potensial membran berubah menjadi positif, maka dapat terjadi polispermi (Gould-Somero dkk, 1979; Jaffe, 1980). Sejauh ini belum diketahui bagaimana perubahan potensial membran yang terjadi pada sperma apakah dapat memblokade fertilisasi sekunder. Nampaknya sperma memiliki komponen yang sensitif terhadap tegangan listrik (mungkin protein fusogenik yang bermuatan positif), dan masuknya komponen ini ke dalam membran sel telur dikendalikan oleh muatan elektrik di sepanjang membran (Iwao dan Jaffe, 1989). Blokade elektrik terhadap polispermi telah dilaporkan pada katak (Cross dan Elinson, 1980), tetapi jarang terjadi pada mamalia (Jaffe dan Cross, 1983).
23
Gambar 17
Potensial Membran Sel Telur Bulu Babi Sebelum dan Setelah Fertilisasi. (A) Sebelum ditambahkan sperma, perbedaan potensial sepanjang membran plasma sekitar -70mV. Dalam waktu 1-3 detik setelah terjadi kontak antara sperma dengan sel telur, terjadi perubahan potensial ke arah positif. (B,C) Sel telur Lytechinus difoto saat pembelahan pertama. (B) Sel telur kelompok kontrol yang berkembang dalam 490 mM Na+. (C) Polispermi pada sel telur yang dibuahi dalam konsentrasi yang serupa dengan sperma dalam 120 mN Na+ (keberadaan kolin digantikan oleh sodium). (D) Tabel yang menunjukkan hubungan antara peningkatan polispermi dengan penurunan kadar Na +. Air laut mengandung sekitar 600 mM NaCl (Jaffe, 1980, foto milik L.A. Jaffe).
Blokade Polispermi Lambat Blokade polispermi cepat berlangsung dengan singkat karena potensial membran sel telur bulu babi menjadi positif hanya selama satu menit. Perubahan potensial yang singkat ini tidak cukup untuk mencegah polispermi secara permanen. Polispermi masih dapat terjadi bila sperma yang berada pada lapisan vitelin tidak dilepas (Carrol dan Epel, 1975). Pelepasan sperma dilakukan dengan reaksi granula kortikal. kortikal . Reaksi ini adalah mekanisme blokade polispermi secara lambat yang mulai aktif sekitar 1 menit setelah fusi sperma dan sel telur pertama (Just, 1919). Reaksi ini ditemukan pada hampir semua spesies terutama mamalia.
24
Tepat di bawah membran sel telur bulu babi terdapat sekitar 15.000 granula kortikal yang masing-masing memiliki diameter sekitar 1 µm (gambar 6.B). Saat sperma membuahi sel telur granula korteks ini berfusi dengan membran sel dan melepas isi granula di ruang antara membran sel dan lapisan protein fibrosa di lapis vitelin. Beberapa jenis protein dilepas oleh granula ini secara eksositosis. Jenis pertama adalah protease seperti tripsin yang disebut protease serin granula korteks . Enzim ini melarutkan protein yang menghubungkan lapis vitelin dengan membran sel, dan melekatkan reseptor bindin beserta sperma yang terkait (Vacquier dkk, 1973; Glabe dan Vacquier, 1978; Haley dan Weesel, 1999, 2004). Komponen granula korteks berfusi dengan lapis vitelin untuk menghasilkan lapis fertilisasi (Wong dan Wessel, 2004). Lapis fertilisasi ini terpisah dari membran sel karena dibatasi oleh mukopolisakarida yang dihasilkan granula korteks. Senyawa yang lengket ini menghasilkan gradien osmotik yang menggerakkan air menuju ruang antara membran sel dan lapis fertilisasi. Hal ini menyebabkan lapis fertilisasi mengembang dan menjauh dari membran sel (Gambar 18 dan 19). Enzim peroksidase yang dilepas dari granula korteks berperan mengeraskan lapis fertilisasi dengan cara merajut residu tirosin dari protein di sekitar (Foerder dan Shapiro, 1977; Wong dkk, 2004). Sebagaimana ditunjukkan pada Gambar 18 lapis fertilisasi mulai membentuk tempat masuknya sperma dan terus mengembang di sekitar sel telur. Proses ini berlangsung sekitar 20 detik setelah sperma melekat dan berakhir sekitar 1 menit setelah fertilisasi. Pada akhirnya protein keempat dari granula korteks yang disebut hyalin membentuk lapis pelindung di sekitar sel telur (Hylander dan Summers, 1982). Sel telur selanjutnya memperpenjang mikrovili yang ujungnya melekat pada lapis hyalin. Lapis ini memberi perlindungan untuk blastomer selama pembelahan.
Kalsium sebagai Pemicu Reaksi Granula Korteks Mekanisme reaksi granula korteks serupa dengan reaksi akrosom, dan mungkin melibatkan molekul yang serupa pula. Saat terjadi fertilisasi kadar ion Ca 2+ bebas di dalam sitoplasma sel telur meningkat tajam. Lingkungan yang tinggi kadar kalsium seperti ini membuat membran granula korteks berfusi dengan membran sel telur dan melepas isi granula (Gambar 19). Saat fusi granula korteks dimulai di dekat titik masuknya sperma, terjadi serangkaian eksositosis granula korteks di sekitar korteks di sisi luar sel telur.
25
Gambar 18
Pembentukan Lapis Fertilisasi dan Pelepasan Kelebihan Sperma. Dalam pembuatan foto ini ditambahkan sperma pada sel telur bulu babi, selanjutnya suspensi difiksasi dalam formaldehid untuk mencegah reaksi lebih lanjut. (A) Pada saat 10 detik setelah sperma ditambahkan nampak sperma memenuhi sel telur. (B,C) Secara berurutan saat 25 dan 35 detik setelah inseminasi, lapis fertilisasi terbentuk menyelubingi sel telur, hal ini diawali dari titik masuknya sperma. (D) Lapis fertilisasi telah sempurna dan kelebihan sperma telah terlepas (Vacquier dan Payne, 1973; foto milik V.D. Vacquier).
Pengaruh peningkatan kadar Ca 2+ pada bulu babi dan mamalia terhadap rekasi granula korteks bukan karena influx kalsium ke dalam sel, tetapi karena faktor sel telur sendiri. Pelepasan kalsium dari penyimpanan intraselular dapat diamati secara visual dengan pewarna berpijar khusus untuk kalsium seperti aequorin (yang diisolasi dari ubur-ubur berpijar) atau pewarna berpijar seperti fura-2. Pewarna semacam ini dapat mengeluarkan cahaya bila berikatan dengan ion kalsium bebas. Bila sel telur bulu babi diinjeksi dengan pewarna tersebut dan dibuahi, akan nampak gelombang pelepasan kalsium di seluruh sel telur (Gambar 20). diawali dari titik masuknya sperma akan nampak pita cahaya yang melintasui sel telur (Steinhardt dkk, 1977; Hafner dkk, 1988). Ion kalsium tidak berdifusi dari titik masuknya sperma hingga seluruh sel telur. Pelepasan seluruh ion Ca 2+ berlangsung selama sekitar 30 detik pada bulu babi, dan selanjutnya ion Ca 2+ bebas ditarik kembali. Bila 2 sperma memasuki sitoplasma sel telur pelepasan ion Ca 2+ akan terjadi dari dua titik terpisah pada permukaan sel (Hafner dkk, 1988).
26
Gambar 19
Eksositosis Granula Korteks. (A) Diagram skematis menunjukkan peristiwa menjelang pembentukan lapis fertilisasi dan lapis hyalin. Saat granula korteks melepas protease yang memecah protein yang menghubungkan lapis vitelin dan membran sel saat melakukan eksositosis. Mukopolisakarida yang dilepas granula korteks membentuk gradien osmotik yang menyebabkan masuknya air dan memperbesar ruang antara lapis vitelin dan membran plasma. Enzim lain yang dilepas dari granula korteks memperkeras lapis vitelin (yang berubah menjadi lapis fertilisasi) dan melepas ikatan sperma pada lapis ini. (B,C) Mikrograf transmisi dan permukaan beku yang menunjukkan korteks sel telur bulu babi yang belum dibuahi. (D,E) Mikrograf transmisi dan permukaan beku pada permukaan yang sama pada sel telur yang telah dibuahi, gambar ini menunjukkan mengembangnya lapis fertilisasi dan bagian-bagian dimana granula korteks berfusi dengan membran plasma sel telur (panah pada gambar D) (Gambar A dari Austin, 1965; Gambar B-E dari Chandler dan Heuser, 1979, foto milik D.E. Chandler).
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ion kalsium secara langsung berpengaruh terhadap reaksi granula korteks dan ion ini disimpan dalam sel telur. Sejenis obat yang dinamakan A23187 adalah sebuah ionophore kalsium (senyawa yang membawa ion sperti kalsium melintasi membran lipida dan menembus membran impermeabel lainnya). Bila sebuah sel telur bulu babi babi diletakkan dalam air laut yang mengandung mengandung A23187 akan menyebabkan terjadnya reaksi granula korteks dan mengembangnya lapis fertilisasi. Lebih jauh reaksi ini berlangsung tanpa adanya ion Ca 2+ dalam air. Oleh karena itu A23187 dipastikan memicu
27
pelepasan Ca 2+ yang disimpan dalam organel sel telur. (Chambers dkk, 1974; Steinhardt dan Epel, 1974).
Gambar 20
Gelombang Pelepasan Ca2+ dalam Sel Telur Bulu Babi selama Fertilisasi. Sel telur sebelumnya telah diwarnai dengan zat warna berpijar saat berikatan dengan Ca2+. Saat sperma berfusi dengan sel telur nampak gelombang pelepasan kalsium yang dimulai dari titik masuknya sperma dan meluas sepanjang sel telur. Gelombang ini terjadi selama 30 detik melintasi sel telur (Foto milik G. Schatten).
Ion kalsium pada bulu babi dan vertebrata (kecuali jenis siput dan cacing) yang memicu reaksi granula korteks tersimpan dalam retikulum endoplasma sel telur (Eisen dan Reynolds, 1985; Terasaki dan Sardet, 1991). Retikulum endoplasma pada bulu babi dan katak terletak di bagian korteks dan mengelilingi granula korteks (Gambar 21; Gardiner dan Grey, 1983; Luttmer dan Longo, 1985). Granula korteks sendiri menempel pada membran sel melalui serangkaian protein membran integral yang mengendalikan eksositosis yang difasilitasi kalsium (Conner dkk, 1997; Conner dan Wessel, 1998). Saat Ca 2+ dilepas dari retikulum endoplasma, granula korteks berfusi dengan membran sel di atasnya. Katak Xenopus Katak Xenopus memiliki retikulum endoplasma yang sepuluh kali lebih banyak selama maturasi sel telur. Retikulum endoplasma tersebut akan menghilang dalam waktu 1 menit setelah terjadi gelombang eksositosis granula korteks di seluruh bagian korteks. Pada saat terpicu, pelepasan kalsium akan terjadi dengan sendirinya. Kalsium bebas mampu melepas kalsium yang berada dalam tempat penyimpanannya. Hal ini menyebabkan gelombang pelepasan Ca 2+ dan eksositosis granula korteks.
28
Gambar 21
Retikulum Endoplasma yang Mengelilingi Granula Korteks pada Sel Telur Bulu Babi. (A) Retikulum endoplasmik diwarnai untuk memudahkan visualisasi mikroskop elektron transmisi. Granula korteks nampak dikelilingi retikulum endoplasmik yang berwarna gelap. (B) Seluruh sel telur yang diwarnai antibodi berpijar untuk channel pelepas kalsium yang dependen kalsium. Antibodi menunjukkan channel ini pada retikulum endoplasmik korteks (Gambar A dari Luttmer dan Longo, 1985, foto milik S Luttmer; Gambar B dari McPherson dkk, 1992, foto milik F.J. Longo)
AKTIVASI METABOLISME SEL TELUR BULU BABI Fertilisasi sering digambarkan sebagai cara penyatuan dua nukleus haploid. Sesungguhnya fertilisasi juga berperan besar dalam inisiasi awal proses perkembangan. Peristiwa ini terjadi dalam sitoplasma tanpa keterlibatan nukleus parental. Sel telur bulu babi yang matang sesungguhnya adalah sel yang laju metabolismenya tidak aktif kemudian diaktifkan oleh sperma. Aktivasi ini adalah stimulus yang akan membangkitkan program metabolisme. Respon sel telur terhadap sperma terdiri atas respon ”awal” (yang terjadi beberapa detik saat reaksi granula korteks) dan repon ”akhir” (terjadi beberapa menit setelah fertilisasi dimulai, Tabel 1).
Respon Awal Kontak atau fusi antara sperma dan sel telur bulu babi memicu dua blokade polispermi, yaitu blokade cepat yang dipicu influx sodium ke dalam sel dan blokade lambat yang dipicu pelepasan intraselular Ca 2+. Terjadinya pelepasan Ca 2+ berpengaruh terhadap reaksi granula korteks, selanjutnya reaksi ini juga berpengaruh terhadap dimulainya siklus sel dan reaktivasi sintesis protein. Kadar Ca2+ dalam sel telur meningkat dari 0,1 µM menjadi 1 µM. Pada sebagian besar spesies hal ini terjadi secara bergelombang di seluruh sel telur diawali dari tempat fusi sperma dan sel telur (Jaffe, 1983; Terasaki dan Sardet, 1991; Perhatikan Gambar 20).
29
Tabel 1 Peristiwa yang Terjadi Selama Fertilisasi Peristiwa RESPON AWAL Ikatan antara sperma dan sel telur Peningkatan potensial fertilisasi (blokade cepat polispermi) Fusi membran sperma dan sel telur Awal deteksi peningkatan kadar kalsium Eksositosis granula korteks (blokade lambat polispermi)
Perkiraan Waktu Post-inseminasia 0 detik Dalam 1 detik Dalam 1 detik 10 detik 15-60 detik
RESPON AKHIR Aktivasi NAD kinase Dimulai setelah 1 menit Peningkatan kadar NADP+ dan NADPH Dimulai setelah 1 menit Peningkatan konsumsi oksigen Dimulai setelah 1 menit Masuknya sperma 1-2 menit Eflux zat asam 1-5 menit Kenaikan pH (tetap tinggi) 1-5 menit Dekondensasi kromatin sperma 2-12 menit Migrasi nukleus sperma menuju pusat sel telur 2-12 menit Migrasi nukleus sel telur menuju nukleus sperma 5-10 menit Aktivasi sintesis protein Dimulai setelah 5-10 menit Aktivasi transport asam amino Dimulai setelah 5-10 menit Inisiasi sintesis DNA 20-40 menit Mitosis 60-80 menit Pembelahan pertama 85-95 menit Sumber utama: Whitaker dan Steinhardt 1985; Mohri dkk 1995. a Perkiraan waktu berdasarkan data dari S.purpuratus (15-17oC), L.pictus (16-18oC), A.punctulata (1820oC), dan L.variegatus (22-24oC). Perhitungan waktu tiap peristiwa dalam menit pertama berdasarkan jenis Lytechinus variegatus sehingga catatan waktu yang tercantum adalah untuk spesies tersebut.
Pelepasan kalsium mengaktifkan seluruh rangkaian reaksi metabolisme yang mengawali perkembangan embrio (Gambar 22). Salah satunya adalah aktivasi enzim NAD + kinase yang berperan mengubah NAD + menjadi NADP + (Epel dkk, 1981). Perubahan ini menghasilkan konsekuensi yang penting untuk metabolisme lipid. Hal ini disebabkan NADP + (bukan NAD+) yang dapat berperan sebagai koenzim biosintesis lipid. Oleh karena itu konversi NAD+ menjadi NADP + berperan dalam konstruksi membran sel baru selama tahap pembelahan. NADP + juga dapat digunakan untuk membuat NAADP (perhatikan Bagian Sidelights and Speculation hal ....) yang nampaknya berperan mempercepat proses pelepasan kalsium. Pelepasan kalsium sesungguhnya juga berpengaruh terhadap konsumsi oksigen. Reduksi oksigen (menjadi hidrogen peroksida) secara drastis terjadi selama fertilisasi. Proses ini berpengaruh terhadap pembentukan lapis fertilisasi. Enzim yang berperan dalam reduksi oksigen bersifat NADPH-dependen (Heinecke dan Shapiro, 1989; Wong dkk, 2004). Pada akhirnya NADPH berperan meregenerasi glutation dan ovothiol, keduanya molekul pengurai radikal bebas yang akan merusak DNA sel telur dan embrio tahap awal (Mead dan Epel, 1995).
30
Gambar 22
Postulat Jalur Aktivasi Sel Telur pada Bulu Babi (Epel, 1980; dan L. A. Jaffe berdasarkan komunikasi personal).
Senyawa kimia EGTA yang bersifat calcium-chelating diinjeksikan ke dalam sel telur bulu babi dapat menyebabkan gagalnya reaksi granula korteks, perubahan potensial membran, dan reinisiasi pembelahan sel saat fertilisasi (Runft dkk, 2002). Sebaliknya sel telur dapat diaktivasi secara artifisial tanpa adanya sperma dengan cara melepaskan kalsium bebas ke dalam oosit. Steinhardt dan Epel (1974) menunjukkan bahwa difusi sejumlah mikromolar ionophore kalsium A23187 ke dalam sel telur bulu babi mengakibatkan sel telur berperilaku seperti halnya sel telur yang dibuahi.
Respon Akhir: Permulaan Sintesis DNA dan Protein Respon akhir dalam proses fertilisasi adalah sintesis DNA dan protein baru dalam jumlah besar. Fusi sel telur dan sperma bulu babi mengakibatkan peningkatan pH intraselular. Kenaikan ini diawali dari influx ion sodium yang menunjukkan pertukaran satu banding satu antara ion sodium dari air laut dengan ion hidrogen dari sel telur. Hilangnya ion hidrogen menyebabkan kenaikan pH sel telur (Shen dan Steinhardt, 1978). Diperkirakan bahwa kenaikan pH dan kadar Ca 2+ terjadi bersama untuk memicu sintesis DNA dan protein baru (Winkler dkk, 1980; Whitaker and Steinhardt, 1982; Rees dkk, 1995). Bila sel telur yang belum dibuahi mengalami kenaikan pH seperti halnya sel telur yang dibuahi secara eksperimental, maka akan sintesis DNA dan membran nukleus nukleus akan tertahan seperti halnya sel telur yang dibuahi (Miller dan Epel, 1999). Ion kalsium berperan penting dalam sintesis DNA baru. Gelombang kalsium bebas menghambat kerja enzim MAP kinase dengan cara mengkonversi enzim ini dari bentuk fosforilasi (aktif) menjadi non fosforilasi (inaktif), dengan demikian dapat melepas hambatan sintesis DNA (Carrol dkk, 2000). Sintesis DNA dan protein akan dapat dilanjutkan.
31
Sintesis protein pada bulu babi umumnya terjadi dalam beberapa menit setelah masuknya sperma. Proses ini tidak tergantung pada sintesis RNA messenger baru. Bahkan proses ini memanfaatkan mRNA yang terdapat dalam sitoplasma oosit (Gambar 23). mRNA ini mengkode protein seperti histon, tubulin, aktin, dan faktor morfogenetik yang akan digunakan selama tahap perkembangan awal. Sintesis protein juga dapat diinduksi secara artifisial dengan cara memakai ion amonium untuk meningkatkan kadar pH sitoplasma (Winkler dkk, 1980). Mekanisme yang mengatur translasi informasi yang tersimpan dalam oosit nampaknya berupa pelepasan inhibitor dari mRNA. Pada bulu babi terdapat semacam inhibitor yang mengikat faktor inisiasi translasi eIF4E pada ujung 5” beberapa mRNA dan bekerja menghambat translasi mRNA. Terkait dalam hal fertilisasi, inhibitor ini (berupa 4E-binding protein) terfosforilasi dan terdegradasi. Hal ini memicu terjadinya translasi mRNA bulu babi (Cormier dkk 2001). Salah satu mRNA yang dibebaskan melalui degradasi 4E-binding protein adalah mRNA yang mengkode siklin B (Salaun dkk, 2003, 2004). Protein siklin B dapat bergabung dengan siklin Cdk1 sehingga menjadi Mitosis Promoting Factor (MPF) yang dibutuhkan dalam inisiasi pembelahan sel. Selanjutnya fertilisasi mengaktivasi berbagai proses yang bertujuan mendegradasi protein penghambat translasi dan membuka ujung 5’ mRNA agar dapat berinteraksi dengan protein yang menunjang translasi. Salah satu mRNA tersebut akan berperan mengkode protein utama untuk pembelahan sel. Dalam hal ini fertilisasi menginisiasi mitosis dan organisme bulu babi dapat mulai membentuk organisme multiseluler.
32
Gambar 23
Sintesis Protein dalam Jumlah Besar Saat Fertilisasi dari mRNA yang Terdapat padaSitoplasma Oosit. (A) Sintesis protein pada embrio bulu babi Arbacia punctulata yang dibuahi dalam kondisi ada dan tidak adanya aktinomisin D. zat ini adalah inhibitor transkripsi. Saat jam-jam pertama sintesis protein terjadi dengan jumlah transkripsi yang sedikit dari nuklei zigot atau embrio. Sintesis protein dalam jumlah besar tahap ke-2 terjadi pada tahap mid-blastula. Ledakan ini menunjukkan translasi dari informasi yang baru ditranskripsi, oleh karena itu tidak nampak saat pertumbuhan embrio dalam aktinomisin. (B) kenaikan persentase ribosom yang direkrut ke dalam polisom saat jam jam pertama perkembangan bulu babi, khususnya saat siklus sel pertama (Gambar A dari Gross dkk, 1964; Gambar B dari Humphreys, 1971).
PETUNJUK DAN SPEKULASI Aktivasi Metabolisme Gamet
Seorang embriologis dari Universitas Yale bernama Ross Granville Harrison pada tahun 1937 berkomentar bahwa saat ini jelas terdapat keterkaitan antara genetika dan embriologi, akan tetapi belum jelas bagaimana hubungan antara embriologi dan fisiologi. Nampaknya sebagian besar di antara peneliti masih ragu untuk menyusun keterkaitan berbagai disiplin ilmu. Jelas sekali pembahasan tentang gen yang mengendalikan kehidupan embrio mengabaikan aspek mekanisme fisiologis dalam proses pengendalian tersebut. Situasi ini dapat berubah karena terdapat informasi tentang hubungan antara jalur sinyal sel dengan sitoskeleton dan channel ion membran sel. Hal yang menarik dari integrasi ini adalah keterlibatan mekanisme ionik pada fertilisasi.
33
IP3: Pelepas ion kalsium Nampak jelas dari penjelasan di buku bahwa faktor utama aktivasi gamet adalah ion kalsium. Pelepasan ion kalsium yang menentukan terjadinya fusi membrane, eksositosis vesikel akrosom dan vesikel korteks, serta aktivasi sperma dan sel telur. Saat ini belum jelas mekanisme bagaimana penyatuan sperma dan sel telur memicu pelepasan Ca 2+ dalam jumlah besar dalam sel telur. Bagaimanapun juga dapat disimpulkan bahwa produksi inositol 1,4,5trifosfat (IP3) adalah yang menyebabkan pelepasan ion kalsium dari penyimpanan intraselular. Jalur kimiawi IP 3 ditunjukkan pada Gambar 24. Fosfolipid fosfatidilinositol 4,5-bifosfat (PIP2) di membrane sel diuraikan oleh enzim fosfolipase C (PLC) menjadi dua senyawa aktif IP 3 dan diasilgliserol (DAG). IP 3 mampu melepas Ca 2+ ke dalam sitoplasma dengan membuka channel Ca 2+ reticulum endoplasma. DAG mengaktivasi protein kinase C yang di sisi lain juga mengaktivasi protein yang menukar ion sodium dengan ion hidrogen untuk meningkatkan pH sel telur (Swann dan Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986). Pompa pertukaran Na +/H+ juga membutuhkan Ca 2+ dalam aktivitasnya. Hasil aktivitas PLC adalah pelepasan Ca 2+ dan alkalinisasi sel telur, serta pelepasan kedua senyawa yang dihasilkan (IP 3 dan DAG) yangdigunakan untuk inisiasi proses perkembangan. IP3 pada awalnya dibentuk pada titik masuknya sperma pada sel telur bulu babi dan dapat dideteksi dalam beberapa detik setelah proses fertilisasi. Inhibisi sintesis IP 3 menghambat pelepasan Ca 2+. (Lee dan Shen, 1998; Carroll dkk, 2000). Di sisi lain injeksi IP 3 dapat melepas Ca2+ yang tersimpan dalam sel telur. Hal ini memicu reaksi re aksi granula korteks (Whitaker dan Irving 1984, Busa dkk, 1985). Lebih jauh efek dari IP 3 dapat dihambat dengan preinjeksi sel telur dengan calcium chelating agents agents (Turner dkk, 1986). Channel kalsium yang merespon IP 3 telah diketahui berada di retikulum endoplasma. IP3 yang dibentuk pada titik masuknya sperma diperkiakan berikatan dengan reseptor IP 3 pada channel tersebut, selanjutnya selanjutnya hal ini berakibat pelepasan pelepasan local sejumlah sejumlah kalsium (Ferris (Ferris dkk, 1989; Furuichi dkk, 1989). Setelah dilepas, dilepas, Ca 2+ segera berdifusi atau memfasilitasi pelepasan Ca2+ lebih banyak dengan cara berikatan dengan resptoe pelepas kalsium. Reseptor ini juga terletak di retikulum endoplasma endoplasma korteks korteks (McPherson dkk, 1992). Pengikatan Ca Ca 2+ pada receptor tersebut melepas lebih banyak kalsium, dan kalsium yang terlepas berikatan dengan reseptor yang lain, hal ini terjadi berulang-ulang. Gelombang pelepasan kalsium ini menjangkau ke seluruh isi sel dan dimulai dari titik masuknya sperma. Granula korteks (yang berfusi dengan membran sel saat tingginya kadar kalsium) memberi respon atas adanya gelombang Ca 2+ dengan menciptakan gelombang eksositosis. Mohri dan rekan-rekannya (1995) menunjukkan
34
bahwa pelepasan Ca 2+ yang dilepas karena adanya IP 3 berperan penting dalam inisiasi gelombang pelepasan kalsium. IP3 juga terbukti memicu pelepasan Ca 2+ pada sel telur vertebrata. Gelombang IP 3 pada bulu babi diperkirakan juga menjadi media pelepasan kalsium dari tempat tertentu dalam retikulum endoplasma (Miyazaki dkk, 1992; Ducibella dkk, 2002). Blokade receptor IP 3 pada sel telur hamster dan mencit menghambat pelepasan kalsium saat terjadi fertilisasi. Xu dan rekan-rekannya (1994) menemukan bahwa blokade pelepasan kalsium yang difasilitasi IP 3 akan memblokade hampir semua aspek aktivasi sel telur (yang diinduksi sperma), termasuk eksositosis granula korteks, rekrutmen mRNA, dan inisiasi siklus sel.
Fosfolipase C: Generator IP 3 Kini muncul sebuah pertanyaan, yaitu apakah yang menginisiasi produksi IP 3? Dalam bentuk lain pertanyaan tersebut dapat berupa apakah yang mengaktivasi enzim fosfolipase C? pertanyaan tersebut sulit dijawab antara lain karena (1) terdapat beragam tipe PLC yang (2) dapat diaktivasi melalui berbagai proses, dan (3) spesies yang berbeda dapat menggunakan mekanisme yang berbeda untuk mengaktivasi PLC. Hasil dari berbagai penelitian terbaru pada sel telur bulu babi menunjukkan bahwa PLC pada kelompok hewan ini adalah anggota keluarga γ
(gamma) PLC (Carroll dkk, 1997, 1999; Shearer Shearer dkk, 1999). Inhibitor yang secara spesifik
memblokade keluarga PLC ini akan menghambat produksi IP 3 sekaligus proses pelepasan Ca2+. Lebih jauh, inhibitor ini dapat dilawan dengan melakukan mikroinjeksi IP 3 ke dalam sel telur. Mekanisme pembentukan IP 3 pada vertebrata masih Belem banyak terungkap, tetapi diperkirakan melibatkan melibatkan PLC yang berasal dari nukleus sperma (Kuretake dkk, 1996; Perry dkk, 2000).
35
Gambar 24
Peran Inositol Fosfat dalam Pelepasan Kalsium dari Retikulum Endoplasma dan Inisiasi Proses Perkembangan. Fosfolipase C memisahkan PIP2 menjadi IP3 dan DAG. IP3 melepas kalsium dari retikulum endoplasma, kalsium yang terlepas membuat DAG mengaktifkan pompa pertukaran sodium-hidrogen pada membran sel.
Kinase: Mata Rantai Penghubung Sperma dan PLC Adanya penemuan tentang kelas
γ
pada PLC yang berperan membentuk IP 3 saat
fertilisasi echinodermata menyebabkan para peneliti harus mengamati dengan tepat protein mana yang diaktivasi oleh kelas fosfolipase ini. Hasil penelitian mereka kelak akan berfokus pada keluarga Src pada protein kinase. Protein Src ditemukan pada sitoplasma korteks sel telur bulu babi dan bintang laut. Protein Src ini dapat membentuk sebuah kompleks dengan PLC
γ.
Inhibisi protein Src kinase akan menurunkan jumlah dan menunda pelepasan kalsium (Giusti dkk, 1999, 2003; Kinsey dan Shen, 2000). Oleh karena itu apakah yang membangkitkan aktifitas kinase Src? Sebuah kemungkinan adalah bahwa hal ini diaktifkan oleh protein G heterometrik di korteks sel telur (Gambar 25). Blokade protein G ini akan menghambat pelepasan kalsium (Voronina dan Wessel, 2003). Protein G tersebut diketahui mengaktifkan kinase Src pada sel somatis mamalia, hal ini memungkinkan fenomena serupa terjadi pada protein G pada sel telur bulu babi. Diperkirakan bahwa protein G tersebut mengaktifkan PLC secara langsung. Tentu saja terdapat lebih dari satu jalur kimiawi dan lebih dari satu mekanisme yang dapat memicu pelepasan kalsium.
36
Gambar 25
Keterlibatan Protein G pada Masuknya Ion Kalsium ke Dalam Sel Telur Bulu Babi. (A) Sel telur bulu babi dewasa yang diberi label imunologis untuk protein hyalin (warna merah) granula korteks (merah) dan protein G Gαq (hijau). (Overlap pada sinyal menghasilkan warna kuning). Gαq terlokalisasi di korteks. (B) Gelombang Ca 2+ nampak pada sel telur kontrol (gambar ini diedit oleh komputer untuk menunjukkan intensitas relatif, warna merah menunjukkan intensitas tertinggi), akan tetapi tidak terjadi pada sel telur yang diinjeksi inhibitor protein G αq. (C) Perkiraan model yang menunjukkan aktivasi sel telur melalui influx Ca2+. (Voronina dan Wessel, 2003, foto milik G.M. Wessel).
Bagaimanakah Peranan Sperma? Sinyal dari sperma dapat ditransmisikan untuk mengaktifkan sel telur dalam berbagai cara. Pertama, aktivasi jalur IP 3 dapat diinisiasikan melalui kontak sperma dengan sel telur (gambar 26.A). Kontak tersebut akan mengaktifkan reseptor, reseptor akan mengaktifkan protein G, dan Ca 2+ akan dilepas dari retikulum endoplasma.
37
Gambar 26
Kemungkinan Mekanisme Aktivasi Sel Telur. Pada semua kasus, fosfolipase C (PLC) menyebabkan IP3 menjadi aktif. (A) Reseptor bindin (mungkin melalui protein G) mengaktifkan kinase Src. (B) Protein G yang aktif, kinase Src, atau PLC pada membran plasma sperma mengaktifkan jalur kimiawi sel telur. (C) Pelepasan kalsium dan aktivasi sel telur oleh PLC aktif dari sperma atau zat yang berasal dari sperma yang mengaktifkan PLC sel telur.
Kemungkinan kedua adalah bahwa aktivasi jalur IP 3 bukan disebabkan kontak sperma dan sel telur, akan tetapi oleh fusi membran sel sperma dan sel telur. McCulloh dan Chambers (1992) mempunyai bukti elektrofisiologi bahwa sel telur bulu babi tidak diaktifkan estela sitoplasma sperma dan sel telur bercampur. Keduanya menyatakan bahwa komponen aktivasi sel telur terletak di membran sel sperma atau pada sitoplasma sperma. Diperkirakan mungkin saat terjadi fusi membran gamet, kinase atau PLC receptor pada sperma (diaktifkan oleh lapisan jelly sel telur untuk memicu reaksi akrosom) mengaktifkan susunan IP 3. hal ini menyebabkan pelepasan Ca 2+ pada sel telur. Dalam skenario ini, seperti tampak pada gambar 26.B, bindin berperan dalam adhesi sel dengan sel dan fusi membran, tetapi bukan untuk signaling. Sel telur akan mengaktifkan dirinya sendiri dengan adanya sperma. Masih terdapat kemungkinan lain bahwa agen yang aktif dalam pelepasan kalsium yang tersimpan adalah molekul Cecil dari sitosol sperma (Gambar 26.C). Dukungan untuk hipotesis datang dari prosedur klinis intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Prosedur ini digunakan sebagai perawatan infertilitas yang disebabkan rendahnya jumlah sperma pria. Dalam prosedur ini sperma manusia diinjeksikan secara langsung ke dalam sitoplasma sel telur. Injeksi ini menghasilkan aktivasi sel telur, pembentukan pronukleus jantan, perkembangan embrio yang normal, dan pertumbuhan akhir embrio untuk menjadi makhluk dewasa yang fertil (Van Steirtinghem, 1994). Kimura dan koleganya (1998) menunjukkan bahwa kepala sperma mencit yang diisolasi mampu mengaktifkan oosit mencit dan bahwa komponen aktif kepala sperma
38
nampaknya berupa protein yang mengelilingi nukleus haploid. Sebuah eksperimen menunjukkan bahwa faktor perinuklear aktif adalah bentuk PLC yang spesifik sperma (Saunders dkk, 2002). Protein ini disebut PLCζ (PLC-zeta), memicu gelombang Ca 2+ yang yang berbeda dibandingkan dalam fertilisasi normal. Pengambilan PLCζ dari ekstrak sperma mencit akan menghambat pelepasan kalsium pada sel telur. Pengamatan ini dikonfirmasi dan ditindaklanjuti dengan beberapa eksperimen (Fujimoto dkk, 2004; 2004; Swann Swann dkk, 2004), 2004), dan dan sperma yang dihambat (dengan teknik interferensi RNA) untuk membuat PLCζ tidak dapat menghasilkan osilasi kalsium kalsium normal pada oosit yang baru dibuahi (Knott (Knott dkk, 2005). Terdapat pula bukti bahwa nicotinic adenina dinucleotide phosphate (NAADP), yaitu dinukleotida linier yang diturunkan dari NADP berperan sebagai pelepas ion kalsium yang berasal dari sperma. NAADP membebaskan simpanan Ca 2+ dari vesikel membran selama kontraksi otot, sekresi insulin, dan pelepasan neurotransmitter (Lee, 2001). Saat terjadi kontak dengan lapisan jelly sel telur, kadar NAADP meningkat sepuluh kali lipat pada sperma bulu babi ingá mencapai level yang lebih dari cukup untuk melepas simpanan Ca 2+ dalam sel telur (Churchill dkk, 2003). Spesies yang berbeda mengembangkan berbagai cara untuk menghasilkan Ca 2+ selama fertilisasi. Kemungkinan terdapat spesies tertentu yang menggunakan lebih dari satu instrumen untuk menghasilkan pelepasan Ca 2+.
Fusi Materi Genetik Nukleus sperma bulu babi yang memasuki sel telur secara bersudut terhadap permukaan sel telur. Setelah terjadi fusi membran, nukleus dan sentriol sperma memisahkan diri dari mitokondria dan flagelum. Mitokondria dan flagelum sperma mengalami disintegrasi di dalam sel telur. Mitokondria yang tersisa dari sel sperma jumlahnya sangat sedikit dan hanya ditemukan di dalam organisme dewasa atau yang masih berkembang. Maskipun tiap gamet berkontribusi dalam bentuk genom haploid pada zigot, genom mitokondrial pada dasarnya diturunkan dari parental betina. Sebaliknya, pada hampir semua jenis hewan yang telah diteliti (kecuali pada tikus), sentrosom yang digunakan untuk menghasilkan spindel mitosis dalam proses pembelahan berasal dari sentriol sperma (Gambar 16; Sluder dkk, 1989, 1993). Fertilisasi terjadi setelah pembelahan meiosis kedua, sehingga telah terbentuk pronukleus betina haploid dalam sitoplasma sel telur saat penetrasi sperma. Saat sperma berada di dalam sel telur, nukleus sperma mengalami dekondensasi menjadi pronukleus pronukleus jantan haploid. Pada awalnya membran inti berubah menjadi kantung-kantung kecil dan memaparkan kromatin sperma pada sitoplasma sel telur (Longo dan Kunkle, 1978; Poccia dan Collas, 1997). 39
Selanjutnya protein yang bertugas mengikat kromatin sperma yang mengalami kondensasi dan inaktif diambil alih oleh protein protein lain dari sel telur. Pertukaran ini menyebabkan dekondensasi dekondensasi kromatin sperma. Selanjutnya DNA dapat mulai melakukan transkripsi dan replikasi. Dekondensasi kromosom sperma bulu babi dipicu oleh fosforilasi protein lamin pada membran inti dan fosforilasi dua histon spesifik yang berikatan dengan DNA. Proses ini diawali saat sperma kontak dengan glikoprotein tertentu di lapisan jelly sel telur yang mengakibatkan naiknya tingkat aktivitas kinase protein cAMP dependen. Kinase protein melakukan fosforilasi beberapa residu dasar histon spesifik sperma dan mempengaruhi ikatannya dengan DNA (Garbers dkk, 1980; Porter dan Vacquier, 1986; Stephens dkk, 2002). Proses penguraian ini mungkin memfasilitasi pelepasan histon spesifik sperma dengan histon lain yang tersimpan dalam sitoplasma oosit (Green dan Poccia, 1985). Setelah sperma bulu babi memasuki sitoplasma sel telur, pronukleus jantan berotasi 180 derajat sehingga sentriol sperma berada di antara pronukleus jantan dan betina. Kemudian sentriol berperan sebagai pusat pengendali mikrotubula, yaitu dengan cara memanjangkan mikrotubulanya sendiri hingga terbentuk aster. Mikrotubula bergerak memanjang melintasi sel telur dan berhubungan dengan pronukleus betina, tepatnya pada titik dimana dua pronuklei bergerak saling mendekat. Fusi keduanya akan membentuk zigot diploid (Gambar 27). Sintesis DNA dapat dilakukan pada saat tahap pronuklear (selama migrasi) atau setelah pembentukan nukleus zigot. Hal ini juga tergantung pada kadar Ca 2+ yang dilepas saat awal fertilisasi (Jaffe dkk, 2001).
FERTILISASI PADA MAMMALIA Nampaknya penelitian mengenai interaksi antara sperma dan sel telur mamalia saat pertama terjadi kontak masih sangat sulit. Salah satu alasannya adalah fertilisasi mamalia terjadi di dalam oviduk betina. Jauh lebih mudah menciptakan kondisi lingkungan untuk fertilisasi bulu babi, baik secara alami ataupun secara buatan. Saat ini belum diketahui beragam komponen faktor lingkungan yang dihadapi sperma mamalia saat bergerak menuju sel telur. Alasan kedua adalah bahwa populasi sperma yang diejakulasi ke dalam tubuh betina mungkin sangat heterogen, yaitu mengandung spermatozoa dari berbagai fase maturasi. Dari dari 280 x 10 6 sperma manusia yang diejakulasi hanya sekitar 200 yang mampu mencapai sel telur (Ralt dkk, 1991). Perbandingan sperma yang mampu mencapai sel telur tidak lebih dari 1:10.000, oleh karena itu nampaknya cukup rumit untuk mengamati molekul apa saja yang berperan bagi sperma untuk aktivasi dan bergerak menuju sel telur. 40
Gambar 27
Peristiwa yang Terjadi pada Nukleus pada Proses Fertilisasi Bulu Babi. (A) Fotografi berangkai yang menunjukkan migrasi pronukleus sel telur dan sperma yang saling mendekat pada sel telur Clypeaster japonicus. Pronukleus sperma dikelilingi aster dari mikrotubulus. (B) Dua pronukleus yang bermigrasi saling mendekat sepanjang juluran mikrotubulus (DNA pronuklear nampak berwarna biru dengan pewarna Hoechst). Mikrotubulus (berwarna hijau karena adanya antibodi berpijar untuk tubulin) menjulur secara radial dari sentrosom berasosiasi dengan pronukleus jantan (yang lebih kecil) dan mencapai pronukleus betina. (C) Fusi pronukleus pada sel telur bulu babi (Gambar A dari Hamaguchi dan Hiramoto, 1980, foto milik yang bersangkutan; Gambar B dari Holy dan Schatten, 1991, milik J Holy; Gambar C milik F. J. Longo)
Membawa Gamet Menuju Oviduk: Translokasi dan Kapasitasi Saluran reproduksi betina bukan sekedar arena balap yang tidak bergeming bagi sperma, tetapi berupa jaringan yang aktif meregulasi transport dan kematangan kedua gamet. Untuk dapat bergerak menuju ampulla (bagian oviduk dimana terjadi fertilisasi), gamet jantan dan betina berinteraksi secara biokimia dan secara fisik. Oosit mamalia yang baru dilepas dari ovarium dilapisi dengan matrix sel-sel kumulus (sel kumulus adalah sel folikel ovarium yang melekat pada oosit tahap perkembangan). Bila secara eksperimental lapisan matrix ini dilepas atau diganti sel lain, maka fimbriae oviduk tidak akan meraih kompleks sel oosit-kumulus. Selain itu kompleks oosit-kumulus juga tidak akan mampu memasuki atau melekat pada oviduk (Talbot dkk, 1999). Apabila oosit telah diraih, maka kompleks oosit-kumulus akan dibawa menuju posisi yang tepat untuk fertilisasi dengan bantuan gerakan silia dan kontraksi otot.
41
Translokasi sperma dari vagina menuju oviduk melibatkan berbagai proses yang bekerja pada saat dan tempat yang berbeda. Motilitas sperma (gerakan flagel) nampaknya menjadi faktor minor yang menggerakkan sperma menuju oviduk. Di sisi lain motilitas adalah faktor yang dibutuhkan sperma tikus untuk bergerak sepanjang lapisan mukus cerviks dan untuk melakukan kontak dengan sel telur di oviduk. Sperma tikus, hamster, marmut, sapi, dan manusia berada di oviduk selama 30 menit. Waktu ini dirasa terlalu pendek dibandingkan dengan kemampuan flagel sperma sesungguhnya (Storey, 1995). Nampaknya sperma dibawa menuju oviduk oleh gerakan otot uterus. Penelitin terakhir tentang motilitas sperma mengarah pada beberapa kesimpulan sebagai berikut: 1. Kontraksi otot uterus berperan penting dalam membawa sperma menuju oviduk. 2. Bagian oviduk sebelum ampulla berperan menahan migrasi sperma dan kemudian melepas secara perlahan. 3. Motilitas (flagel) sperma berperan penting saat sperma memasuki oviduk, sperma menjadi hiperaktif di sekitar oosit. 4. Kemungkinan sperma juga mendapat petunjuk arah berdasarkan gradien suhu pada berbagai daerah oviduk dan petunjuk kimia dari oosit atau kumulus. 5. Sperma mengalami maturasi dalam bentuk kemampuan untuk untuk membuahi sel telur selama melakukan perjalanan dari vagina menuju ampula oviduk.
Sperma mamalia yang baru diejakulasi belum mampu melakukan reaksi akrosom sebelum sperma berada di saluran reproduksi betina dalam jangka waktu tertentu (Chang, 1951; Austin, 1952). Rangkaian perubahan fisiologis yang menyebabkan sperma mampu membuahi sel telur disebut kapasitasi. Sperma yang tidak mengalami kapasitasi tertahan di bagian kumulus dan tidak mampu mencapai sel telur (Austin, 1960; Corselli dan Talbot, 1987). Materi yang dibutuhkan dalam kapasitasi pada tiap spesies berbeda. Kapasitasi dapat ditiru secara in vitro dengan menginkubasi sperma dalam medium kultur jaringan (contohnya adalah media yang mengandung ion kalsium, bikarbonat, dan serum albumin) atau dalam cairan yang y ang diambil dari oviduk. Wilcox beserta rekannya (1995) membuktikan bahwa hampir pada semua kehamilan manusia adalah hasil hubungan seksual pada periode 6 hari terakhir dari masa ovulasi. Hal ini berarti bahwa sperma yang membuahi sel telur membutuhkan waktu selama 6 hari untuk mencapai sel telur. Meskipun sperma manusia dapat mencapai ampulla dalam waktu setengah jam setelah berhubungan, tetapi sperma ”kilat” belum tentu dapat membuahi sel telur. 42
Eisenbach (1995) mengajukan hipotesis bahwa kapasitasi adalah peristiwa yang berlangsung dengan singkat dan sperma hanya mendapatkan panduan yang singkat dalam rangka membuahi sel telur. Sperma yang telah mencapai ampulla adalah sperma yang mampu memiliki kemampuan membuahi. Akan tetapi kemampuan ini akan hilang bila berada di ampulla dalam waktu yang terlalu lama. Sperma juga memiliki kemampuan bertahan hidup yang berbeda. Hal ini berhubungan dengan tempat dimana sperma tersebut berada di saluran reproduksi. Oleh karena itu sperma yang datang pada masa akhir memiliki kemampuan membuahi yang lebih baik daripada sperma yang datang lebih awal. Beberapa fenomena molekular yang terjadi selama proses kapasitasi (Gambar 28) belum terungkap seluruhnya. Akan tetapi terdapat 5 set perubahan molekular yang dinyatakan yang paling utama, yaitu: 1. Kolesterol yang terdapat pada membran sel sperma dilepaskan oleh protein albumin di saluran reproduksi betina (Cross, 1998). Efflux kolesterol dari membran sel sperma mengubah lokasi ”lipid rafts”, yaitu bagian yang terisolasi dari membran sel yang terkadang mengandung protein reseptor. Semula lipid rafts ini terletak di seluruh membran sel, selanjutnya lipid rafts terletak di bagian ujung anterior kepala sperma. 2. Protein atau karbohidrat tertentu di permukaan sperma akan hilang saat proses kapasitasi (Lopez ,dkk, 1985; Wilson dan Oliphant, 1987). Kemungkinan bahwa senyawa ini bersifat memblokade ”recognition site” untuk protein sperma agar dapat berikatan dengan zona pelusida. Hal ini juga mengisyaratkan bahwa dengan membuka recognition site sebagai salah satu efek pengurangan kolesterol (Benoff, 1993). 3. Potensial membran sel sperma menjadi elbih negatif saat ion potassium terlepas dari sperma. Perubahan potensial membran ini menyebabkan channel kalsium terbuka dan ion kalsium memasuki sperma. Ion kalsium dan bikarbonat sangat berperan dalam aktivasi produksi cAMP dan dalam memfasilitasi proses fusi membran selama reaksi akrosom (Visconti dkk, 1995; Arnoult dkk, 1999). 4. Terjadi prose fosforilasi protein (Galantino-Homer dkk, 1997). Secara khusus dua protein chaperone (heat-shock) bermigrasi menuju permukaan kepala sperma bila mengalami fosforilasi. Selanjutnya hal ini berperan membentuk reseptor untuk berikatan dengan zona pelusida (Asquith dkk, 2004, 2005). 5. Membran akrosom luar berubah dan berhubungan dengan membran sel sperma dalam rangka persiapan fusi (Tulsiani dan Abou-Haila, 2004).
43
Gambar 28
Model Hipotetis Kapasitasi Sperma Mamalia. Efflux potasium (yang mekanismenya belum diketahui) menyebabkan perubahan potensial istirahat membran sel sperma. Pelepasan kolesterol oleh albumin memicu channel ion memasukkan ion kalsium dan bikarbonat ke dalam sperma. Ion tersebut memicu aktivitas adenilat siklase yang memuat AMP dari cAMP. Kenaikan kadar cAMP mengaktivasi protein kinase A, hal ini selanjutnya mengaktivasi protein tirosin kinase (di sisi lain menonaktifkan protein fosfatase). Protein kinase fosforilat bersifat esensial untuk kapasitasi (Visconti dan Kopf, 1998).
Hingga saat ini masih belum jelas apakah peristiwa tersebut berjalan secara independen dan apakah sejauh mana masing-masing berperan dalam kapasitasi. Kemungkinan terdapat hubungan penting antara translokasi sperma dan kapasitasi. Smith (1998) dan Suarez (1998) mendokumentasikan bahwa sebelum memasuki bagian ampulla oviduk, sperma yang tidak mengalami kapasitasi berikatan kuat dengan membran sel oviduk di bagian saluran sempit (isthmus) (Gambar 29). ikatan ini bersifat temporer dan akan terpisah saat sperma mengalami kapasitasi. Lebih jauh diungkapkan bahwa usia sperma dapat diperpanjang dengan proses pengikatan ini dan proses kapasitasi akan ditahan. Pencegahan sperma untuk memasuki ampulla, proses penghentian kapasitasi, dan ekspansi usia sperma nampaknya memiliki konsekuensi yang besar (Topfer-Peterson dkk, 2002; Gwathmey dkk, 2003). Proses pengikatan dapat berperan memblokade polispermi dengan cara mencegah lebih banyak sperma mencapai sel telur pada saat bersamaan. Isthmus oviduk sapi yang dipotong terbukti meningkatkan peluang polispermi. Sebagai tambahan, penurunan tingkat
44
kapasitasi sperma dan penambahan usia sperma akan memaksimalkan peluang sperma untuk mencapai sel telur di ampulla, meskipun mesk ipun ejakulasi tidak terjadi bersamaan dengan ovulasi.
Gambar 29
Hasil Scan Mikrograf Elektron (dengan Pewarnaan Secara Artifisial) yang Menunjukkan Sperma Sapi saat Menempel pada Sel Epitel Oviduk Saat Menuju Ampulla (dari Levebvre dkk, 1995; foto milik S. Suarez).
Kejadian di Sekitar Oosit: O osit: Hiperaktivasi, Termotaksis, dan Kemotaksis Saluran reproduksi betina pada bagian tertentu mensekresikan molekul spesifik yang berbeda secara regional. regional. Molekul ini berpengaruh terhadap terhadap motilitas sperma seperti halnya kapasitasi. Secara singkat, sperma dari beberapa jenis mamalia (khususnya hamster, marmut, dan beberapa strain mencit) yang melintasi uterus menuju oviduk mengalami hiperaktivasi, yaitu berenang dengan kecepatan tinggi dan menghasilkan tenaga yang lebih besar. Proses hiperaktivasi ini nampaknya difasilitasi oleh channel kalsium spesifik yang terletak di ekor sperma (Quill dkk, 2003). Gerakan flagelum yang asimetris berubah menjadi lebih berirama dan cepat. Suarez dan koleganya (1991) menunjukkan bahwa meskipun perilaku ini tidak kondusif untuk melakukan perjalanan melintasi fluida dengan viskositas rendah. Akan tetapi nampaknya lebih cocok untuk melakukan gerakan linier dalam fluida yang relatif pekat yang akan dilintasi menuju oviduk. Hiperaktivasi bersama dengan enzim hyaluronidase di luar membran sel sperma membantu sperma sperma untuk mengurai matriks ekstraselular ekstraselular sel-se kumulus (Lin dkk, 1994; Primakoff dan Myles, 2002). Ada sebuah lelucon yang mengatakan bahwa mengapa pria mengejakulasikan jutaan sperma adalah karena tidak ada dari sperma tersebut yang tahu arah menuju sel telur. Tetapi apa yang sesungguhnya yang menjadi petunjuk arah bagi sperma? Penelitian terakhir menunjukkan bahwa sperma mampu mengenali perbedaan suhu sekitar 2 oC di antara isthmus oviduk dengan daerah ampulla yang lebih hangat. Bahat dan rekan-rekannya (2003) mengukur
45
perbedaan suhu antara kedua daerah tersebut di oviduk dan secara eksperimental mendemonstrasikan bahwa sperma kelinci dapat mengenali dan menentukan arah berenang dari daerah yang suhunya rendah ke daerah yang suhunya tinggi (termotaksis). Lebih jauh diungkapkan bahwa hanya sperma yang telah dikapasitasi yang mampu mengenali gradien suhu semacam ini. Saat sperma telah berada di daerah ampulla, terdapat mekanisme penginderaan kedua yang juga berperan, yaitu kemotaksis. Nampaknya oosit dan sel kumulus yang menyertainya mensekresikan molekul yang menarik sperma menuju sel telur. Hal ini terjadi pada tahap akhir migrasi sperma. Ralt dan koleganya (1991) menguji hipotesis menggunakan fluida folikel dari folikel manusia yang sel telurnya dipakai untuk fertilisasi in vitro. Para peneliti melakukan mikroinjeksi setetes cairan folikel ke dalam tetesan suspensi sperma. Setelah itu nampak beberapa sperma berubah haluan dan bergerak menuju sumber cairan folikel. Mikroinjeksi larutan yang lain tidak menunjukkan efek seperti ini. Selanjutnya penelitian ini mengungkap korelasi yang menarik. Sebanyak setengah dari cairan fluida yang digunakan untuk pengujian memiliki efek kemotaksis. Pada hampir semua kasus sel telur memiliki kemampuan untuk dibuahi hanya dan hanya jika fluida memiliki efek kemotaksis (P < 0,0001; Eisenbach, 1999; Sun dkk, 2005). Penelitian lebih lanjut menyatakan bahwa kemampuan sel folikel manusia untuk menarik sel sperma hanya terjadi bila sperma telah mengalami kapasitasi (Cohen-Dayag dkk, 1995; Eisenbach dan Tur-Kaspa, 1999; Wang dkk, 2001). Nampaknya dimungkinkan bahwa seperti sel telur invertebrata tertentu, sel telur manusia mensekresikan faktor kemotaksis hanya jika sel telur siap dibuahi. Di sisi lain sperma yang akan tertarik senyawa tersebut hanya bila telah mampu membuahi sel telur.
Proses Pengenalan pada Zona Pelusida Sebelum sperma mamalia dapat berikatan dengan oosit, sel tersebut harus memiliki kemampuan berikatan dan mempenetrasi zona pelusida. Zona pelusida pada mamalia memiliki peran yang analog seperti lapis vitelin pada invertebrata, hanya saja zona pelusida lebih tebal dan keras daripada lapis vitelin. Pengikatan sperma pada zona pelusida secara relatif bersifat spesifik-spesies (bukan absolut). Pengenalan gamet spesifik-spesies bukanlah permasalahan utama untuk fertilisasi internal. Nampaknya terdapat beberapa tahapan proses pengikatan sperma mencit yang bergerak menuju zona pelusida dan telah mengalami hiperaktivasi. Zona pelusida mencit terdiri atas tiga glikoprotein utama, yaitu ZP1, ZP2, dan ZP3 (zona protein 1, 2, dan 3). Ketiganya bersama dengan protein asesori terikat pada struktur integral zona. Matriks glikoprotein yang 46
disintesis dan disekresi dari oosit tahap perkembangan akan berikatan dengan sperma. Segera setelah terjadi pengikatan pada sperma, reaksi akrosom akan dimulai (Saling dkk, 1979; Florman dan Storey, 1982; Cherr dkk, 1986). Dalam beberapa tahun terakhir sebuah model baru pengikatan zona-sperma telah dikemukakan. Model ini menekankan pada rangkaian interaksi antara beberapa protein sperma dengan komponen zona (Gambar 30). Tahapan Tahapan pertama adalah adalah ikatan relatif relatif lemah yang terjadi saat protein sperma mengenali protein periferal yang melapisi zona pelusida. Hal ini selanjutnya diikuti dengan asosiasi kuat antara zona dan protein sperma SED1. Pada akhirnya sebuah protein sperma (mungkin disertai faktor yang lain) membentuk link yang kuat dengan protein zona ZP3. Pengikatan terakhir ini menyebabkan sperma mencit memulai reaksi akrosom secara langsung pada zona pelusida.
Gambar 30
●
Ikatan Antara Sperma dan Zona. (A) Perkiraan model protein yang terlibat dalam adhesi sperma-sel telur. Pada awalnya sperma berikatan dengan lemah tetapi secara spesifik pada protein ligan yang disekresi oviduk dan melapisi zona pelusida. Protein SED1 di permukaan sperma (yang terletak di daerah tertentu di kepala sperma untuk adhesi lateral sperma) berikatan pada kompleks ZP di zona. Galaktosiltransferase (GaIT) pada sperma berikatan dengan erat dan spesifik pada residu N-asetilglukosamin pada protein zona 3 (ZP3). Pengumpulan protein GaIT pada membran sel sperma mengaktivasi protein G yang membuka channel kalsium dan menginisiasi reaksi akrosom (tidak tercantum pada diagram). (B) mikrograf elektron yang menunjukkan ikatan sperma-zona pada hamster golden. (Gambar A berdasarkan data B. Shur, milik B. Shur; Gambar B milik R. Yanagimachi).
Tahap Awal Perlekatan Gamet Peristiwa pengikatan awal terjadi sebelum pengikatan spesifik yang kuat antara
sperma dan sel telur. Kemungkinan bahwa protein sperma dengan ukuran 250 kDa mengikat protein yang berasosiasi (bukan merupakan bagian integral) dengan zona pelusida
47
(Rodeheffer dan Shur, 2004). Protein ini dapat dibilas dengan teknik preparasi (mungkin hal ini yang menyebabkan belum pernah terungkap sebelumnya). Protein kedua adalah protein adhesi yang terletak di permukaan sel sperma yang disebut SED1, selanjutnya protein ini akan berikatan dengan kompleks protein zona (Ensslin dan Shur, 2003). SED1 ditemukan di tempat terpisah di sekitar membran sel sperma, di atas akrosom, dan haya akan berikatn dengan zona dari sel telur yang belum dibuahi (bukan pada sel telur yang telah dibuahi). Antibodi terhadap SED1 atau protein SED1 yang dilarutkan mampu menghambat ikatan sperma-zona. Sperma dari pejantan yang gen SED1-nya dipadamkan tidak mampu berikatan dengan zona pelusida.
●
Tahap Akhir Pengenalan Sperma-Zona: Pengikatan ZP3 Beberapa bukti yang menunjukkan bahwa ZP3 adalah glikoprotein pengikat sperma
yang utama di zona pelusida mencit. Ikatan sperma pada zona pelusida mencit dapat dihambat dengan terlebih dahulu menginkubasi sperma dengan glikoprotein zona terlarut. Bleil dan Wassarman (1980, 1986, 1988) menggunakan assay inhibisi untuk membuktikan bahwa ZP3 adalah kompetitor aktif terhadap lokasi pengikatan sperma (Gambar 31.A). Hal ini dikuatkan dengan penemuan ZP3 yang diberi label radioaktif (bukan ZP1 dan ZP2) berikatan dengan kepala sperma mencit dengan akrosom yang kokoh (Gambar 31.B).
Gambar 31
Protein Zona 3 Mencit yang Berikatan dengan Sperma. (A) Assay inhibisi menunjukkan penurunan spesifik ikatan sperma mencit pada zona pelusida. Nampak dari assay tersebut bahwa ZP3 murni (bukan ZP1 dan ZP2) dapat terikat pada sperma dan mencegah sperma berikatan pada zona pelusida. Assay juga menggambarkan peran penting porsi karbohidrat ZP3 pada reaksi pengikatan. (B) ZP3 yang diberi label radioaktif berikatan pada sperma mencit yang telah mengalami kapasitasi (Gambar A dari Bleil dan Wassarman, 1980; dan Florman dan Wassarman, 1985; Gambar B dari Bleil dan Wassarman, 1986, foto milik yang bersangkutan).
48
Membran sel yang terletak di atas kepala sperma dapat berikatan dengan ribuan glikoprotein ZP3 di zona pelusida. Lebih jauh terungkap nampaknya beberapa protein berbeda pada sperma mampu mengikat ZP3 (Wassarman dkk, 2001) Beberapa dari protein sperma ini berikatan dengan rantai karbohidrat yang mempunyai link treonin dan serin pada ZP3. Salah satu protein ikatan zona, yaitu sebuah galaktosiltransferase permukaan sperma dapat mengenali residu N-asetilglukosamin (Miller dkk, 1992; Gong dkk, 1995; Lu dan Shur, 1997). Kesimpulan yang menunjukkan bahwa setengah dari ZP3 berperan penting dalam perlekatan sperma terhadap zona dikuatkan oleh penemuan bahwa bila grup karbohidrat tersebut dilepas dari ZP3, maka ZP3 tidak akan berikatan dengan sperma sebagaimana ZP3 yang utuh (perhatikan Gambar 31.A, Florman dan Wassarman, 1985; Kopf, 1998).
●
Induksi Reaksi Akrosom oleh ZP3 ZP3 adalah glikoprotein spesifik pada zona pelusida mencit dimana terjadi perlekatan
sperma. ZP3 juga menginisiasi reaksi akrosom setelah sperma berikatan dengan ZP3. zona pelusida mencit adalah struktur yang tebal, tidak seperti lapis vitelin bulu babi. Saat melakukan reaksi akrosom di zona pelusida, sperma mencit akan mengkonsentrasikan enzim proteolitiknya secara langsung pada titik perlekatan dan bergerak menggali lubang pada lapisan ekstraselular ini (perhatikan Gambar 8.B). Sperma mencit yang melakukan reaksi akrosom sebelum mencapai zona pelusida tidak mampu melakukan penetrasi (Florman dkk, 1998). Reaksi akrosom mencit diinduksi saat ZP3 menggabungkan reseptor di membran sel sperma. Salah satu protein sperma yang digabung adalah galaktosiltransferase di permukaan sel sperma. Lokasi aktif enzim ini menghadap ke luar dan berikatan dengan residu karbohidrat ZP3 (perhatikan Gambar 30). Penggabungan ini mengaktifkan protein G spesifik di membran sel sperma. Hal ini menginisiasi struktur yang membuka channel kalsium di membran sel dan menyebabkan eksositosis yang difasilitasi kalsium di bagian vesikula akrosom (Gambar 32, Leyton dan Saling, 1989; Leyton dkk, 1992; Florman dkk, 1998; Shi dkk, 2001).
●
Melintasi Zona Pelusida Eksositosis vesikula akrosom melepaskan berbagai protease ayng akan melisis zona
pelusida. Enzim tersebut menciptakan lubang di sepanjang jalur yang akan dilewati sperma menuju sel telur. Bagian anterior membran sel sperma selama reaksi akrosom (bagian dimana terdapat lokasi pengikatan/binding sites ZP3) terkelupas dari sperma. Bila sperma bergerak mempenetrasi, maka bagian tersebut harus mempertahankan kemampuan melekatnya. 49
Kemampuan ikatan sekunder pada zona juga dilakukan dengan adanya protein di bagian dalam membran akrosom yang berikatan secara spesifik dengan glikoprotein ZP2 (perlu diingat bahwa membran akrosom dalam pada bulu babi mengandung protein bindin yang berperan penting dalam perlekatan sperma pada lapis vitelin) (Bleil dkk 1988). Sementara akrosom yang utuh pada sperma tidak berikatan dengan glikprotein ZP2, maka yang akan berikatan adalah sperma yang akrosomnya bereaksi. Antibodi terhadap glikoprotein ZP2 tidak akan menghambat ikatan akrosom utuh dengan zona, tetapi akan menghambat perlekatan sperma yang akrosomnya bereaksi. Struktur zona terdiri atas unit berulang ZP3 dan ZP2, pada saat tertentu terjadi penggabungan dengan ZP1 (perhatikan gambar 7.30). Nampak bahwa sperma yang akrosomnya bereaksi mentransfer lokasi ikatan dari ZP3 menuju molekul ZP2 terdekat.
Gambar 32
Reaksi Akrosom pada Sperma Hamster. (A) Mikrograf elektron transmisi sperma hamster yang melakukan reaksi akrosom. Membran akrosom nampak membentuk vesikel. (B) Diagram yang menunjukkan mikrograf elektron saat fusi membran sel dan membran akrosom pada kepala sperma (Gambar A dari Meizel, 1984, foto milik S. Meizel; Gambar B dari Yanagimachi dan Noda, 1970)
Fusi Gamet dan Pencegahan Polispermi Sperma mamalia melakukan kontak dengan sel telur bukan pada ujungnya (seperti pada bulu babi), tetapi pada sisi kepala sperma. Saat terjadi reaksi akrosom yang melepas materi enzim akrosom, bagian membran dalam akan diekspos ke arah luar. Hubungan/junction Hubungan/junction antara membran akrosom dalam dan membran sel sperma disebut daerah equatorial. Daerah ini adalah tempat fusi antara sperma dan sel telur dimulai (Gambar 33). Seperti pada fusi gamet bulu babi, sperma melekat pada daerah sel telur dimana aktin melakukan polimerisasi untuk memperpanjang mikrovili menuju sperma (Yanagimachi dan Noda, 1970).
50
Gambar 33
Masuknya Sperma Menuju Sel Telur Hamster Golden. (A) Hasil scan mikrograf elektron sperma yang menunjukkan fusi sperma dengan sel telur. Titik ”gundul” (tanpa mikrovili) adalah tempat dimana polar body menguncup. Sperma tidak menempel pada bagian tersebut. (B) Mikrograf elektron transmisi yang menunjukkan kepala sperma melintasi zona. (C) Mikrograf elektron transmisi yang menunjukkan sperma hamster berfusi secara paralel pada membran plasma sel telur. (D) diagram yang menunjukkan fusi sperma dan membran sel telur (Gambar A-C dari Yanagimachi dan Noda, 1970; dan Yanagimachi, 1994; foto milik R. Yanagimachi)
Mekanisme fusi gamet pada mamalia masih diperdebatkan (Primakoff dan Myles, 2002). Percobaan pemadaman gen menunjukkan bahwa fusi gamet mamalia tergantung pada interaksi antara protein sperma dengan protein CD9 yang berasosiasi dengan integrin di sel telur (Le Naour dkk, 2000; Miyado dkk, 2000; Evans, 2001). Mencit betina yang membawa gen pemadam untuk CD9 menjadi menjadi infertil infertil karena sel telur telur tidak berhasil berfusi dengan sperma. Kemandulan dapat dikembalikan dengan mikroinjeksi mRNA yang mengkode CD9 untuk manusia atau mencit (Kaji dkk, 2002). Nampaknya belum pasti bagaimana protein ini memfasilitasi fusi membran. CD9 juga dikenal berperan penting untuk fusi myosit (prekursor sel otot) untuk membentuk otot lurik (Tachibana dan Hemler, 1999).
51
Mengenai proses fusi pada sperma mamalia, Inoue dan koleganya (2005) menunjukkan adanya keterlibatan protein seperti globulin yang disebut Izumo (diambil dari nama sebuah kuil di Jepang yang didedikasikan untuk pernikahan). Sperma dari mencit yang mengalami mutasi kehilangan fungsi pada gen Izumo mampu untuk berikatan dan mempenetrasi zona pelusida, pelusida, akan tetapi tetapi tidak mampu berfusi berfusi dengan membran sel telur. Sperma manusia juga memiliki protein Izumo, antibodi yang bekerja terhadap Izumo menghambat fusi sperma dan sel telur. Nampaknya terdapat beberapa sistem operasi pengikatan sperma-sel telur, dan setiap sistem tersebut mungkin dibutuhkan namun belum cukup untuk memastikan pengikatan dan fusi gamet dengan tepat. Polispermi adalah suatu permasalahan yang dihadapi mamalia seperti halnya pada bulu babi (Gambar 16). Reaksi granula korteks pada mamalia tidak menghasilkan lapis fertilisasi, akan tetapi menciptakan hasil akhir yang sama. Enzim yang dilepas mengubah reseptor sperma zona pelusida sehingga tidak lagi terjadi pengikatan sperma (Bleil dan Wassarman, 1980). Granula korteks sel telur mencit terbukti mengandung enzim Nasetilglukosaminidase yang mampu mengurai N-asetilglukosamin dari rantai karbohidrat ZP3. N-asetilglukosamin adalah salah satu gugus karbohidrat dimana sperma akan berikatan. Miller dan rekan-rekannya (1992,1993) menunjukkan bahwa bila residu N-asetilglukosamin dihilangkan saat terjadi fertilisasi, ZP3 tidak akan berperan sebagai substrat ikatan sperma. ZP2 yang diberi protease granula korteks kehilangan kemampuannya untuk mengikat sperma lain (Moller dan Wassarman, 1989). Oleh karena itu saat sperma telah memasuki sel telur, maka sperma yang lain tidak dapat menginisiasi atau mempertahankan ikatannya dengan zona pelusida dan segera terhempas.
Fusi Materi Genetik Sebagaimana pada bulu babi, sperma mamalia yang telah memasuki sel telur membawa kontribusi genetiknya dalam bentuk haploid pronukleus. Proses migrasi pronukleus mamalia berlangsung selama 12 jam, berbeda dengan proses serupa pada bulu babi yang berlangsung 1 jam. Sperma mamalia bergerak masuk secara bersudut terhadap permukaan sel telur, bukan secara vertikal. Sperma juga berfusi dengan beberapa mikrovili (Gambar 32). DNA dari nukleus sperma dilapisi protein yang disebut protamin yang memadat karena ikatan sulfida. Glutation pada sitoplasma sel telur mereduksi ikatan disulfida ini dan menyebabkan penguraian kromatin sperma (Calvin dan Bedford, 1971; Kvist dkk, 1980; Perreault dkk, 1988). Sperma mamalia memasuki oosit saat nukleus oosit sedang tertahan dalam tahap metafase dari pembelahan miosis ke-2 (Gambar 34.A, perhatikan pula Gambar 5). Osilasi 52
kalsium yang terjadi karena masuknya sperma menghambat kinase MAP dan mengaktifkan sintesis DNA. Tidak seperti sel telur bulu babi yang telah berada dalam kondisi haploid, oosit mamalia masih memiliki kromosom di masa tengah metafase. Osilasi kadar Ca 2+ mengaktifkan kinase lain yang memicu proteolisis siklin (hal ini mengakibatkan sel melanjutkan siklus sel dan terjadinya pronukleus betina haploid) dan sekurin (protein yang mempertahankan penggabungan kromosom saat metafase) (Watanabe dkk, 1991; Johnson dkk, 1998). Nampaknya terjadi beberapa pelepasan gelombang Ca 2+ pada mamalia. Suatu peristiwa tertentu yang dipicu oleh sebuah gelombang Ca 2+ tidak akan berlangsung tuntas tanpa gelombang Ca 2+ lainnya (Ducibella dkk, 2002). Sintesis DNA terjadi secara terpisah pada pronukleus jantan dan betina. Sentrosom (sentriol yang baru) terletak berdampingan pronukleus jantan dan menghasilkan aster (sebagian besar berasal dari protein yang tersimpan di oosit). Mikrotubula bergabung dengan kedua pronukleus dan berperan dalam migrasi kedua pronukleus tersebut untuk saling mendekat. Saat kedua pronukleus bertemu, kedua membrannya terkelupas (Gambar 34.B). Pada bulu babi peristiwa serupa akan menghasilkan nukleus zigot, tetapi pada mamalia kromatin akan berkondensasi menjadi kromosom yang bergerak seiring dengan spindel mitosis (Gambar 34.C-E). Oleh karena itu nukleus diploid mamalia pada awalnya tidak nampak pada zigot, akan tetapi pada tahap dua sel. Selain membawa pronukleus, sperma membawa mitokondria, sentriol, dan sedikit sitoplasma kepada sel telur. Mitokondria dan DNA dari sperma terdegradasi dalam sitopalsma sel telur sehingga mitokondria yang baru secara individual diturunkan dari pihak maternal. Sel telur dan embrio nampaknya memusnahkan mitokondria paternal dengan cara dilarutkan dan dihancurkan (Cummins dkk, 1998; Shitara dkk, 1998; Schwartz dan Vissing, 2002). Akan tetapi pada sebagian besar mamalia sentriol sperma tidak hanya bertahan hidup, tetapi juga berperan sebagai agen pengatur pembentuk spindel mitosis yang baru. Beberapa protein dan mRNA yang terbentuk dari transkripsi pronukleus pada spermatosit akan terbawa ke dalam sel telur. Hal ini meliputi mRNA untuk transkripsi tertentu dan faktor parakrin (Krawetz, 2005). Bahkan sperma manusia membawa mikroRNA yang dapat berperan mengendalikan reseptor penting untuk pembelahan sel pada tahap awal perkembangan embrio (Ostermeier dkk, 2005). Besarnya peran RNA dan protein kecil ini masih diperdebatkan. Sebuah protein yang dibawa dari sperma yang perannya telah terungkap adalah PLCζ. Protein kecil ini terdapat di sekeliling kepala sperma dan berperan penting untuk aktivasi sel telur dan pelepasan Ca 2+ pada mamalia.
53
Gambar 34
Gerakan Pronukleus Selama Fertilisasi Gamet Manusia. Mikrotubula nampak berwarna hijau, DNA nampak berwarna biru. Tanda panah menunjukkan ekor sperma. (A) Oosit matur yang belum dibuahi menuntaskan pembelahan miosis pertama dan menampakkan kuncup polar body. (B) Saat sperma memasuki oosit (sisi kiri) mikrotubula berkondensasi di sekeliling saat oosit menyelesaikan pembelahan miosis kedua di bagian perifer. (C) Setelah 15 jam setelah fertilisasi, kedua pronukleus menyatu dan sentrosom memisahkan diri untuk mengatur susunan mikrotubulus bipolar. Ekor sperma masih tetap nampak (tanda panah). (D) Saat tahap prometafase kromosom sperma dan sel telur membaur pada bidang equator metafase dan spindel mitosis menginisiasi pembelahan mitosis pertama. Ekor sperma masih nampak (dari Simerly dkk 1995, foto milik G Schatten).
PETUNJUK DAN SPEKULASI Nonekivalensi Pronukleus Mamalia
Secara umum diasumsikan bahwa organisme jantan dan betina membawa genom haploid yang ekivalen. Tentu saja salah satu dari dogma genetika Mendel adalah bahwa gen diwariskan dari sperma yang secara fungsional ekivalen terhadap gen yang diwariskan dari sel telur. Pembentukan karakter (imprinting) genom dapat terjadi pada mamalia karena sperma dan sel telur yang mewarisi genom secara fungsional berbeda dan keduanya berperan saling melengkapi pada tahap perkembangan embrio. Proses pembentukan karakter ini diperkirakan
54
disebabkan adanya pola metilasi sitosin yang beragam pada gen. Bukti pertama tentang nonekivalensi berasal dari pengamatan tumor manusia yang disebut tahi lalat hydatidiform (hydatidiform mole) yang menyerupai jaringan plasenta. Sebagian besar tahi lalat seperti itu muncul saat sperma haploid membuahi sel telur saat tidak terdapat pronukleus betina. Setelah masuk ke dalam sel telur kromosom sperma menduplikasi dirinya sendiri untuk menciptakan jumlah yang diploid. Akan tetapi seluruh genom yang terbentuk berasal dari sperma (Jacobs (Jacobs dkk, 1980; Ohama dkk, 1981). Sel telur tersebut tetap tetap bertahan bertahan hidup, melakukan pembelahan, dan memiliki jumlah kromosom diploid. Namun perkembangan embrio berlangsung abnormal. Sel telur tidak membentuk embrio, tetapi membentuk jaringan seperti placenta. Perkembangan yang normal tidak akan terjadi bila seluruh genom berasal dari induk jantan saja. Perkembangan normal juga tidak akan terjadi bila genom diturunkan secara total dari sel telur saja. Kemampuan berkembang pada embrio tanpa kontribusi sperma disebut partenogenesis (Yunani, “kelahiran dari seorang perawan”). Sel telur dari hewan invertebrata dan beberapa vertebrata mampu berkembang secara normal tanpa kehadiran sperma. Mamalia tidak dapat melakukan partenogenesis. Sebuah eksperimen yang dilakukan dengan meletakkan oosit mencit pada medium kultur untuk mengaktifkan oosit secara artifisial dan di sisi lain menghambat pertumbuhan polar body ke-2 menghasilkan sel telur diploid yang memiliki gen secara eksklusif dari oosit (Kaufman dkk, 1977). Sel Sel telur tersebut tersebut melakukan pembelahan pembelahan untuk membentuk embrio yang dilengkapi korda spinal, jaringan otot, kerangka, dan organ, bahkan memiliki denyut jantung. Tetapi perkembangan ini tidak dapat berlanjut, pada hari ke-10 atau 11 (separuh dari periode gestasi mencit) embrio partenogenetik tersebut rusak. Baik perkembangan pada manusia ataupun mencit tidak dapat tuntas hanya dengan mengandalkan kromosom sel telur saja. Hipotesis yang menyatakan pronukleus jantan dan betina dibutuhkan untuk proses perkembangan yang normal juga dikemukakan dari eksperimen transplantasi nukleus (Surani dan Barton, 1983; Surani dkk, 1986; McGrath dan Solter, 1984). 1984). Pronukleus jantan dan betina betina diambil dari sel telur yang baru dibuahi, kemudian kedua pronukleus tersebut dipindahkan ke dalam sel telur lain yang juga baru dibuahi (kedua pronukleus dapat dibedakan karena pronukleus betina terletak di bawah polar body). Selanjutnya dapat diatur apakah zigot akan memiliki dua pronukleus jantan atau dua pronukleus betina. Sel telur tersebut dapat membentuk sel diploid yang melakukan pembelahan secara normal. Akan tetapi sel telur yang membawa gen dari nukleus sperma saja atau dari nukleus oosit saja tidak dapat berkembang hingga lahir.
55
Sel telur kontrol yang menjalani transplantasi (sel telur yang membawa satu pronukleus jantan dan satu pronukleus betine dari zigot lain) dapat berkembang dengan normal (Tabel 2). Oleh karena itu agar dapat terjadi perkembangan pada mamalia, kedua pronukleus dari sperma dan sel telur sangat berperan.
Tabel. 2 Eksperimen Transplantasi Pronukleus Kelas Rekonstruksi Operasi Zigot Bimaternal
Jumlah Transplantasi yang Berhasil 339
Jumlah Progeni yang Bertahan Hidup 0
Bipaternal
328
0
Kontrol
348
18
Sumber: McGrath and Solter 1984
Peran metilasi DNA terhadap partenogenesis didemonstrasikan oleh Kono dan koleganya (2004) yang mengembangkan mencit betina yang membawa gen secara eksklusif dari dua oosit. Penelitian ini dapat dilakukan dengan memutasi sistem metilasi DNA pada salah satu genom mencit agar serupa dengan genom mencit jantan, selain itu peneliti juga harus melakukan dua kali transfer nukleus. Berdasarkan penelitian tersebut para ahli membuat lelucon bahwa para pria tidak perlu khawatir akan kekurangan jumlah perempuan (Vogel, 2004).
PENUTUP Fertilisasi bukanlah sekedar peristiwa atau kejadian, tetapi adalah proses yang dikendalikan secara cermat. Hal ini meliputi kontak dan fusi gamet, fusi nukleus, dan aktivasi proses perkembangan. Fertilisasi adalah proses dimana dua sel, yang dalam keadaan tidak aktif, berpadu untuk menghasilkan organisme baru yang memiliki beragam tipe sel dan organ. Fertilisasi adalah awal dari rangkaian interaksi antar sel yang akan menentukan arah perkembangan hewan.
56
RANGKUMAN
1. Fertilisasi meliputi dua aktivitas terpisah, yaitu pembentukan jenis kelamin (mengkombinasikan gen yang diturunkan dari dua induk) dan reproduksi (pembentukan organisme baru). 2. Peristiwa fertilisasi umumnya meliputi (1) kontak dan pengenalan antara sperma dan sel telur, (2) regulasi masuknya sperma ke dalam sel telur, (3) fusi materi genetik dari kedua gamet, dan (4) aktivasi metabolisme sel telur untuk mengawali tahapan perkembangan. 3. Kepala sperma membawa nukleus haploid dan akrosom. Akrosom berasal dari aparatus Golgi dan mengandung enzim untuk menguraikan lapisan ekstraselular yang mengelilingi sel telur. Bagian tengah dan leher sperma membawa mitokondria dan sentriol (yang membentuk mikrotubulus flagelum). Energi gerakan flagel berasal berasal dari ATP mitokondria mitokondria dan ATPase dinein pada flagel. 4. Gamet betina dapat berupa sel telur (dengan nukleus haploid, seperti pada bulu babi) atau berupa oosit (pada tahap awal perkembangan, seperti pada mamalia). Sel telur (atau oosit) memiliki volume sitoplasma yang besar dan menyimpan ribosom, mRNA, dan protein nutrisi. mRNA lain dan protein yang akan berperan sebagai faktor morfogenetik juga tersimpan dalam sel telur. Pada umumnya sel telur juga memiliki agen protektif yang dibutuhkan untuk bertahan hidup dalam lingkungan tertentu. 5. Lapisan ekstraselular yang menyelubungi sel telur terkadang berperan dalam pengenalan sperma. Pada sebagian besar jenis hewan lapisan ini berupa lapis vitelin. Pada mamalia lapisan ini lebih tebal dan disebut zona pelusida. Granula korteks terletak dibawah membran sel telur. 6. Baik sel telur maupun sperma bukan lah pasangan kutub “aktif” dan “pasif”. Sperma diaktifkan oleh sel telur dan sel telur juga diaktifkan sperma. Keduanya melibatkan unsur kalsium dan fusi membran. 7. Bila fertilisasi terjadi pada lingkungan eksternal (seperti (seperti pada bulu babi dan hewan laut lainnya) sel telur mensekresikan mensekresikan molekul yang mudah berifusi untuk menarik perhatian dan mengaktifkan sperma. 8. Molekul kemotaksis spesifik spesies disekresikan oleh sel telur mampu menarik perhatian sperma yang mampu membuahi. Peptida kemotaksis resact dan speract pada bulu babi terbukti meningkatkan motilitas sperma dan memberi “petunjuk arah” menuju sel telur dari spesies yang sesuai. 9. Reaksi akrosom melepas enzim secara eksositosis. Enzim proteolitik ini menguraikan selubung protektif sel telur agar sperma dapat mencapai sel telur dan melakukan fusi membran sel. Reaksi ini pada sperma bulu babi dipicu oleh senyawa dari lapisan jelly sel telur. Polimerisasi aktin globular berperan merentangkan tonjolan akrosom. Bindin yang terletak pada tonjolan akrosom akan dikenali kompleks protein di permukaan sel telur bulu babi. 10. Fusi antara sperma dan sel telur diperkirakan dimediasi oleh molekul protein yang gugus hidrofobiknya dapat mengabungkan membran sel telur dan sperma. Pada bulu babi hal ini dimediasi oleh bindin. 11. Polispermi adalah akibat dari dua atau lebih sperma yang membuahi sel telur. Pada umunya hal ini bersifat lethal karena terbentuknya blastomer yang beragam jumlah dan tipe kromosomnya. kromosomnya. 12. Sebagian besar memiliki dua cara memblokade polispermi. Blokade cepat bersifat mendesak dan menyebabkan potensial membran membran sel telur meningkat. Sperma tidak dapat berfusi dengan sel telur. Hal ini pada bulu babi dimediasi oleh influx ion natrium. Blokade lambat atau reaksi granula korteks bersifat fisik dan 57
13. 14. 15.
16. 17. 18. 19. 20.
21. 22. 23.
24. 25.
dimediasi ion kalsium. Gelombang Ca 2+ yang terpancar dari titik masuknya sperma menyebabkan granula korteks berfusi dengan membran sel telur. Materi yang dilepaskan dari granula ini menyebabkan lapis vitelin mengembang dan mengeras menjadi lapis fertilisasi. Fusi sperma dan sel telur menyebabkan aktivasi reaksi metabolik yang penting dalam sel telur. Reaksi ini meliputi reinisiasi siklus sel telur dan pembelahan mitosis berikutnya, serta dimulainya sintesis DNA dan protein. Materi genetik dikandung oleh pronukleus jantan dan betina yang akan bergerak saling mendekat. Pronukleus jantan dan betina bulu babi bergabung dan membentuk zigot diploid. Replikasi DNA terjadi setelah fusi pronukleus. Hasil penelitian dari hampir semua spesies menunjukkan bahwa ion Ca 2+ bebas bersama dengan alkalinasi sel telur mengaktivasi metabolisme sel telur, sintesis protein, dan sintesis DNA. Inositol 1,4,5-trifosfat (IP 3) berperan dalam melepas Ca 2+ yang tersimpan di retikulum endoplasma. DAG (diasilgliserol) diperkirakan memicu peningkatan pH sel telur. IP3 dibentuk oleh fosfolipase. Spesies yang berbeda mungkin akan menggunakan mekanisme berbeda untuk untuk mengaktifkan mengaktifkan fosfolipase Fertilisasi pada mamalia terjadi secara internal dalam saluran reproduksi betina. Sel dan jaringan saluran reproduksi betina tidak bersifat pasif, jaringan tersebut secara aktif mengendalikan posisi dan kematangan gamet jantan dan betina. Translokasi sperma dari vagina ke dalam oviduk diatur oleh aktivitas muskular uterus, pengikatan sperma pada isthmus oviduk, dan petunjuk arah dari oosit (sel telur immatur) dan atau dari sel kumulus. Sperma mamalia harus dikapsitasi di saluran reproduksi betina sebelum dapat membuahi sel telur. Kapasitasi adalah hasil perubahan biokimiawi pada membran sel sperma. sperma mamalia yang telah dikapasitasi harus menembus kumulus dan berikatan dengan zonma pelusida sebelum melakukan reaksi akrosom. Proses pengikatan ini pada mencit dimediasi oleh Z3 (zona protein 3) dan beberapa protein sperma yang dapat mengenali. ZP3 menginisiasi reaksi akrosom pada mamalia di zona pelusida, yaitu tempat dimana enzim akrosom terkonsentrasi. Blokade polispermi pada mamalia berupa modifikasi protein zona oleh materi granula korteks sehingga sperma tidak dapat berikatan lagi pada zona. Kenaikan kadar Ca 2+ intraselular saat fertilisasi pada amphibia dan mamalia menyebabkan degradasi siklin dan inaktivasi MAP kinase, hal ini menyebabkan metafase meiosis kedua dapat dilanjutkan dan pembentukan pronukleus betina haploid. Replikasi DNA pada mamalia terjadi saat pronukleus saling mendekat. Membran pronukleus mengalami disintegrasi saat pronukleus saling mendekat dan kromosom tersusun berkumpul pada lempeng metafase. Pronukleus jantan dan betina pada mamalia tidak ekivalen. Bila materi genetik zigot hanya berasal dari salah satu induk, maka proses perkembangan embrio tidak dapat diselesaikan. Perbedaan antara genom jantan dan betina nampaknya merupakan akibat adanya pola metilasi gen yang berbeda.
58
DAFTAR RUJUKAN
Afzelius, B. A. 1976. A human syndrome caused caused by immotile cilia. Science 193: 317–319. Alves, A.-P., B. Mulloy, J. A., Diniz and P. A. S. Mourao. 1997. Sulfated polysaccharides polysaccharides from the egg jelly layer are species-specific inducers of acrosome reactions in sperms of sea urchins. J. Biol. Chem. 272: 6965–6971. Arnoult, C., I. G. Kazam, P. E. Visconti, G. Kopf, M. Villaz and H. Florman. 1999. Control of the low-voltage-activated calcium channel of mouse sperm by egg ZP3 and by membrane hyperpolarization hyperpolarization during capacitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6757–6762. Asquith, K. L., R. M. Baleato, E. A,. McLaughlin, McLaughlin, B. Nixon, and R. J. Aitken. 2004. Tyrosine phosphorylation activates surface chaperones facilitating sperm-zona recognition. J. Cell Sci. 117: 3645–3657. Asquith, K. L., A. J. Harman, E. A. McLaughlin, McLaughlin, B. Nixon and R. J. Aitken. 2005. Localisation and significance of molecular chaperones, heat shock protein 1 (Hspd1) and tumor rejection antigen gp96 (Tra1), in the male reproductive tract and during capacitation and acrosome reaction. Biol. Reprod. 72: 328–337. Austin, C. R. 1952. The “capacitation” “capacitation” of mammalian sperm. Nature 170: 327. Austin, C. R. 1960. Capacitation and the release of hyaluronidase. hyaluronidase. J. Reprod. Fertil. 1: 310– 311. Austin, C. R. 1965. Fertilization. Prentice-Hall, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ. Bahat, A., I. Tur-Kaspa, A. Gakamsky, L. C. Giojalas, H. Breitbart and M. Eisenbach. Eisenbach. 2003. Thermotaxis of mammalian sperm cells: A potential navigation mechanism in the female genital tract. Nature Med. 9: 149–150. Benoff, S. 1993. The role of cholesterol during capacitation capacitation of human spermatozoa, Hum. Reprod. 8: 2001–2008. Bentley, J. K., H. Shimomura and D. L. Garbers. 1986. Retention of a functional resact receptor in isolated sperm plasma membranes. Cell 45: 281–288. Ben-Yosef, D., Y. Oron and R. Shalgi. 1996. Intracellular pH in rat eggs is not affected by fertilization and the resulting calcium oscillations. Biol. Reprod. 55: 461–468. Bi, G.-Q., J. M. Alderton and R. A. Steinhardt. 1995. Calcium-mediated Calcium-mediated exocytosis exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131: 1747–1758. Biermann, C. H., J. A. Marks, A. C. Vilela-Silva, M. O. Castro and P. A. Mourao. 2004. Carbohydrate-based Carbohydrate-based species recognition in sea urchin fertilization: Another avenue of speciation? Evol. Dev. 6: 353–361.
59
Bleil, J. D. and P. M. Wassarman. 1980. Mammalian sperm and egg interaction: Identification of a glycoprotein in mouse-egg zonae pellucidae possessing receptor activity for sperm. Cell 20: 873–882. Bleil, J. D. and P. M. Wassarman. 1986. Autoradiographic visualization of the mouse egg’s sperm receptor bound to sperm. J. Cell Biol. 102: 1363–1371. Bleil, J. D. and P. M. Wassarman. 1988. Galactose at the nonreducing terminus of O-linked oligosaccharides oligosaccharides of mouse egg zona pellucida glycoprotein ZP3 is essential for the glycoprotein’s glycoprotein’s sperm receptor activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6778–6782. Bleil, J. D., J. M. Greve and P. M. Wassarman. 1988. Identification Identification of a secondary sperm receptor in the mouse egg zona pellucida: Role in maintenance of binding of acrosome-reacted acrosome-reacted sperm to eggs. Dev. Biol. 28: 376–385. Bogart, J. P., R. P. Elinson and L. E. Licht. 1989. Temperature and sperm incorporation in polyploid salamanders. Science 246: 1032–1034. Boveri, T. 1902. On multipolar mitosis as a means of analysis of the cell nucleus. [Translated by S. Gluecksohn-Waelsch.] Gluecksohn-Waelsch.] In B. H. Willier and J. M. Oppenheimer (eds.), Foundations of Experimental Embryology. Embryology. Hafner, New York 1974. Boveri, T. 1907. Zellenstudien en VI. Die Entwicklung dispermer Seeigeleier. Ein Beiträge zur Befruchtungslehre Befruchtungslehre und zur Theorie des Kernes. Jena Z. Naturwiss. 43: 1–292. Busa, W. B., J. E. Ferguson, S. K. Joseph, J. R. Williamson and R. Nuccitelli. 1985. Activation of frog (Xenopus laevis) eggs by inositol triphosphate. I. Characterization of Ca2+ release from intracellular stores. J. Cell Biol. 100: 677–682. Calvin, H. I. and J. M. Bedford. 1971. Formation of disulfide bonds in the nucleus and accessory structures of mammalian spermatozoa during maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. [Suppl.] 13: 65–75. Carroll, D. J. and D. Epel. 1975. Isolation and biological activity of the proteases released by sea urchin eggs following fertilization. Dev. Biol. 44: 22–32. Carroll, D. J., C. S. Ramarao, L. Mehlmann, S. Roche, M. Terasaki and L. A. Jaffe. 1997. Calcium release at fertilization in starfish eggs is mediated by phospholipase phospholipase Cγ. J. Cell Biol. 138: 1303–1311. Carroll, D. J., D. T. Albay, M. Terasaki, L. A. Jaffe and K. R. Foltz. 1999. Identification of PLCγdependent and independent events during fertilization of sea urchin eggs. Dev. Biol. 206: 232–247. Carroll, D. J., D. T. Albay, K. M. Hoag, F. J. O’Neill, M. Kumano and K. R. Foltz. 2000. The relationship between calcium, MAP kinase, and DNA synthesis in the sea urchin egg at fertilization. Dev. Biol. 217: 179–191.
60
Castellano, L. E., G. Martinez-Cadena, J. Lopez-Godinez, A. Obregon and J. Garcia-Soto. 1997. Subcellular localization localization of the GTP-binding protein Rho in the sea urchin sperm. Eur. J. Cell Biol. 74: 329–335. Chambers, E. L., B. C. Pressman and B. Rose. 1974. The activation of sea urchin eggs by the divalent ionophores A23187 and X-537A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 60: 126– 132. Chandler, D. E. and J. Heuser. 1979. Membrane fusion during secretion: secretion: Cortical granule exocytosis in sea urchin eggs as studied by quick-freezing and freeze fracture. J. Cell Biol. 83: 91–108. Chang, M. C. 1951. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature 168: 697–698. Cherr, G. N., H. Lambert, S. Meizel and D. F. Katz. 1986. In vitro studies of the golden hamster sperm acrosome reaction: Completion on zona pellucida and induction by homologous zonae pellucidae. Dev. Biol. 114: 119–131. Christen, R., R. W. Schackmann, Schackmann, and B M. Shapiro. 1982. Elevation of of the intracellular pH activates respiration and motility of sperm of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. J. Biol. Chem. 257: 14881–14890. Churchill, G. C., J. S. O’Neill, R. Masgrau, S. Patel, J. M. Thomas, A. A. Genazzani and A. Galione. 2003. Sperm deliver a new second messenger: NAADP. Curr. Biol. 13: 125– 128. Clermont, Y. and C. P. Leblond. 1955. Spermiogenesis Spermiogenesis of man, monkey, and other animals as shown by the “periodic acid-Schiff” technique. Am. J. Anat. 96: 229–253. Cohen-Dayag, A., I. Tur-Kaspa, J. Dor, S. Mashiach and M. Eisenbach. 1995. Sperm capacitation in humans is transient and correlates with chemotactic responsiveness to follicular factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11039–11043. Colwin, A. L. and L. H. Colwin. 1963. Role of the gamete membranes in fertilization in Saccoglossus Saccoglossus kowalevskii (Enteropneustra). I. The acrosome reaction and its changes in early stages of fertilization. J. Cell Biol. 19: 477–500. Conner, S. and G. M. Wessel. 1998. rab3 mediates cortical granule exocytosis exocytosis in the sea urchin egg. Dev. Biol. 203: 334–344. Conner, S., D. Leaf and G. M. Wessel. 1997. Members of the SNARE hypothesis are associated with cortical granule exocytosis in the sea urchin egg. Mol. Reprod. Dev. 48: 106–118. Cormier, P., S. Pyronnet, J. Morales, O. Mulner-Lorillon, Mulner-Lorillon, N. Sonenberg and R. Bellé. 2001. eIF4E association with 4E-BP decreases rapidly following fertilization in sea urchin. Dev. Biol. 232: 275–283.
61
Cook, S. P. and D. F. Babcock. 1993. Selective modulation by cGMP of the K+ channel activated by speract. J. Biol. Chem. 268: 22402–22407. Correia, L. M. and E. J. Carroll, Jr. 1997. Characterization of the vitelline envelope of the sea urchin Strongylocentratus Strongylocentratus purpuratus. Dev. Growth Diff. 39: 69–85. Corselli, J. and P. Talbot. 1987. In vivo penetration of hamster oocyte-cumulus complexes complexes using physiological numbers numbers of sperm. Dev. Biol. 122: 227–242. Cross, N. L. 1998. Role of cholesterol in sperm capacitation. Biol. Reprod. 59: 7–11. Cross, N. L. and R. P. Elinson. 1980. A fast block to polyspermy in frogs mediated by changes in the membrane potential. Dev. Biol. 75: 187–198. Cummins, J. M., T. Wakayama and R. Yanagimachi. 1998. Fate of microinjected spermatid mitochondria in the mouse oocyte and embryo. Zygote 5: 301–308. Dan, J. C. 1952. Studies on the acrosome. I. Reaction to egg-water and other stimuli. Biol. Bull. 103: 54–66. Dan, J. C. 1967. Acrosome reaction and lysins. In C. B. Metz, Jr., and A. Monroy (eds.), Fertilization, vol. 1. Academic Press, New York, pp. 237–367. Domino, S. E. and Garbers, G arbers, D. l. 1988. The fucose sulfate glycoconjugate that induces the acrosome reaction in spermatozoa spermatozoa stimulates inositol 1,4,5-trisphosphate accumulation. accumulation. J. Biol. Chem. 263: 690–695. Domino, S. E., S. B. Bocckino, and D. L. Garbers. 1989. Activation of phospholipase phospholipase D by the fucose sulfate glycoconjugate that induces an acrosome reaction in spermatozoa. J. Biol. Chem. 264: 9412–9419. 9412–9419. Ducibella, T. and 8 others. 2002. Egg-to-embryo transition is driven by differential responses to Ca2+ oscillation number. Dev. Biol. 250: 280–291. Eisen, A. and G. T. Reynolds. 1985. Sources and sinks for the calcium release during fertilization of single sea urchin eggs. J. Cell Biol. 100: 1522–1527. Eisenbach, M. 1995. Sperm changes enabling fertilization in mammals. mammals. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes 2: 468–475. Eisenbach, M. 1999. Mammalian sperm chemotaxis and its association with capacitation. Dev. Genet. 25: 87-94. Eisenbach, M. 2004. Towards understanding the molecular mechanisms of sperm chemotaxis. J. Gen. Physiol. 124: 105–108. Eisenbach, M. and I. Tur-Kaspa. 1999. Do human eggs attract spermatozoa? spermatozoa? Bioessays 21: 203–210.
62
Ensslin, M. A. and B. D. Shur. 2003. Identification of mouse sperm SED1, a bimotif EGF repeat and discoidin-domain protein involved involved in sperm-egg binding. Cell 114: 405–417. Epel, D. 1977. The program of fertilization. fertilization. Sci. Am. 237(5): 128–138. Epel, D. 1980. Fertilization. Endeavour N.S. 4: 26–31. Epel, D., C. Patton, R. W. Wallace and W. Y. Cheung. 1981. Calmodulin activates NAD kinase of sea urchin eggs: An early response. Cell 23: 543–549. Evans, J. P. 2001. Fertilin beta and other ADAMs as integrin ligands: Insights into cell adhesion and fertilization. BioEssays 23: 628–639. Ferris, C. D., R. L. Huganir, S. Supattapone and S. H. Snyder. 1989. Purified inositol 1,4,5trisphosphate trisphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted reconstituted lipid vesicles. Nature 342: 87–89. Florman, H. M. and B. T. Storey. 1982. Mouse gamete interactions: The zona pellucida is the site of the acrosome reaction leading to fertilization in vitro. Dev. Biol. 91: 121–130. Florman, H. M. and P. M. Wassarman. 1985. O-linked oligosaccharides oligosaccharides of mouse egg ZP3 account for its sperm receptor activity. Cell 41: 313–324. Florman, H. M., C. Arnoult, I. Kazam, C. Li and C. M. B. O’Toole. O ’Toole. 1998. A perspective perspective on the control of mammalian fertilizati fertilization on by egg-activated ion channels in sperm: A tale of two channels. Biol. Reprod. 59: 12–17. Foerder, C. A. and B. M. Shapiro. 1977. Release of ovoperoxidase from sea urchin eggs hardens fertilization membrane with tyrosine crosslinks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4214–4218. Fol, H. 1877. Sur le commencement de l’hémogénie chez divers animaux. Arch. Zool. Exp. Gén. 6: 145–169. Foltz, K. R., J. S. Partin and W. J. Lennarz. 1993. Sea urchin egg receptor for sperm: Sequence similarity of binding domain and hsp 70. Science 259: 1421–1425. Fujimoto, S. and 7 others. 2004. Mammalian phospholipase Cζ induces oocyte activation from sperm perinuclear matrix. Dev. Biol. 274: 370–383. Franklin, L. E. 1970. Fertilization and the role of the acrosome reaction in non-mammals. non-mammals. Biol. Reprod. [Suppl.] 2: 159–177. Furuichi, T., S. Yoshikawa, A. Miyawaki, K. Wada, N. Maeda and K. Mikoshiba. 1989. Primary structure and functional expression of the inositol 1,4,5-trisphosphate-binding 1,4,5-trisphosphate-binding protein P400. Nature 342: 32–38. Gage, S. L., S. Afonin, M. Grune and A. S. Ulrich. 2004. Interaction of the fusogenic peptide B18 in its amyloid state with lipid membranes studied by solid-state NMR. Chem. Phys. Lipids 132: 65–77. 63
Galantino-Homer, Galantino-Homer, H. L., P. E. Visconti and G. S. Kopf. 1997. Regulation of protein tyrosine kinase phosphorylation phosphorylation during bovine capacitation by a cyclic adenosine 3′,5′monophosphate-dependent monophosphate-dependent pathway. Biol. Reprod. 56: 707–719. Garbers, D. L., D. J. Tubb and G. S. Kopf. 1980. Regulation of sea urchin sperm cAMPdependent protein kinases by an egg associated associated factor. Biol. Reprod. 22: 526–532. Garbers, D. L., G. S. Kopf, D. J. Tubb and G. Olson. 1983. Elevation of sperm adenosine adenosine 3′:5′monophosphate monophosphate concentrations by a fucose sulfate-rich complex associated associated with eggs. I. Structural characterization. characterization. Biol. Reprod. 29: 1211–1220. Gardiner, D. M. and R. D. Grey. 1983. Membrane junctions in Xenopus eggs: Their distribution suggests a role in calcium regulation. J. Cell Biol. 96: 1159–1163. Giusti, A. F., K. M. Hoang and K. R. Foltz. 1997. Surface localization localization of the sea urchin egg receptor for sperm. Dev. Biol. 184: 10–24. Giusti, A. F., D. J. Carroll, Y. A. Abassi, M. Terasaki, K. R. Foltz and L. A. Jaffe. 1999. Requirement of a Src family kinase for initiating calcium release at fertilization in starfish eggs. J. Biol. Chem. 274: 29318–29322. Giusti, A. F., F. J. O’Neill, K. Yamasu, K. R. Foltz and L. A. Jaffe. 2003. Function Function of a sea urchin egg Src family kinase in initiating Ca2+ release at fertilization. Dev. Biol. 256: 367–378. Glabe, C. G. and W. J. Lennarz. 1979. Species-specific sperm adhesion adhesion in sea urchins: A quantitative investigation investigation of bindin-mediated egg agglutination. J. Cell Biol. 83: 595– 604. Glabe, C. G. and V. D. Vacquier. 1978. Egg surface glycoprotein glycoprotein receptor for sea urchin sperm bindin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 881–885. Glahn. D. and R. Nuccitelli. 2003. Voltage-clamp Voltage-clamp study of the activation currents and fast block to polyspermy in the egg of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 45: 187–197. Gong, X., D. H. Dubois, D. J. Miller and B. D. Shur. 1995. Activation of a G-protein complex complex by aggregation of β-1,4-galactosyltransferase β-1,4-galactosyltransferase on the surface of the sperm. Science 269: 1718–1721. González-Martínez, González-Martínez, M. T., A. Guerrero, E. Morales, L. de la Torre and A. Darszon. 1992. A depolarization depolarization can trigger Ca2+ uptake and the acrosome reaction when preceded by a hyperpolarization hyperpolarization in L. pictus sea urchin sperm. Dev. Biol. 150: 193–202. 193–202. Gould, M. and J. L. Stephano. 1987. Electrical response response of eggs to acrosomal protein protein similar to those induced by sperm. Science 235: 1654–1657. Gould, M. and J. L. Stephano. 1991. Peptides from sperm acrosomal acrosomal protein that activate development. development. Dev. Biol. 146: 509–518.
64
Gould-Somero, M., L. A. Jaffe and L. Z. Holland. 1979. Electrically mediated mediated fast polyspermy block in eggs of the marine worm, Urechis caupo. J. Cell Biol. 82: 426–440. Green, G. R. and E. L. Poccia. 1985. Phosphorylation Phosphorylation of sea urchin sperm H1 and H2B histones precedes chromatin decondensation and H1 exchange during pronuclear formation. Dev. Biol. 108: 235–245. Gross, P. R., L. I. Malkin and W. Moyer. 1964. Templates for the first proteins of embryonic development. development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51: 407–414. Gwathmey, T. M., G. G. Ignotz and S. S. Suarez. 2003. PDC-109 (BSP-A1/A2) promotes bull sperm binding to oviductal epithelium in vitro and may be involved in forming the oviductal sperm reservoir. Biol. Reprod. 69: 809–815. Hafner, M., C. Petzelt, R. Nobiling, J. B. Pawley, D. Kramp and G. Schatten. 1988. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with Fura-2. Cell Motil. Cytoskel. 9: 271–277. Haley, S. A. and G. M. Wessel. 1999. The cortical granule serine protease CGSP1 of the sea urchin, Strongylocentrotus purpuratus, purpuratus, is autocatalytic and contains a low-density lipoprotein receptor-like receptor-like domain. Dev. Biol. 211: 1–10. Haley, S. A. and G. M. Wessel. 2004. Proteolytic cleavage of the cell surface protein p160 is required for detachment of the fertilization envelope in the sea urchin. Dev. Biol. 272: 191–202. Hardy, D. M., T. Harumi and D. L. Garbers. 1994. Sea urchin sperm receptors for egg peptides. Semin. Dev. Biol. 5: 217–224. Harrison, R. G. 1937. Embryology and its relations. Science 85: 369–374. Hartsoeker, N. 1694. Essai de dioptrique. Paris. Heinecke, J. W. and B. M. Shapiro. 1989. Respiratory oxygen burst of fertilization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1259–1263. Hertwig, O. 1877. Beiträge zur Kenntniss der Bildung, Befruchtung, und Theilung des theirischen Eies. Morphol. Jahr. 1: 347–452. Hirohashi, N. and V. D. Vacquier. 2002. Egg fucose sulfate polymer, sialoglycan, sialoglycan, and speract all trigger the sea urchin sperm acrosome reaction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 296: 833–839. Hirohashi, N. and Vacquier, V. D. 2003. Store-operated calcium channels trigger exocytosis of the sea urchin sperm acrosomal vesicle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 285– 292. Hirohashi, N., A. C. Vilela-Silva, P. A. Mourao and V. D. Vacquier. 2002. Structural requirements for species-specific induction of the sperm acrosome reaction by sea urchin egg sulfated fucan. Biochem. Biophys. Res. Commun. 298: 403–407. 65
Holy, J. and G. Schatten. 1991. Spindle pole centrosomes centrosomes of sea urchin embryos are partially composed of material recruited from maternal stores. Dev. Biol. 147: 343–353. Humphreys, T. 1971. Measurements of messenger RNA entering polysomes upon fertilization in sea urchins. Dev. Biol. 26: 201–208. Hylander, B. L. and R. G. Summers. 1982. An ultrastructural ultrastructural and immunocytochemic immunocytochemical al localization of hyaline in the sea urchin egg. Dev. Biol. 93: 368–380. Inoue, N., M. Ikawa, A. Isotani and M. Okabe. 2005. The immunoglobulin superfamily superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs. Nature 434: 234–238. Iwao, Y. and L. A. Jaffe. 1989. Evidence that the voltage-dependent component component in the fertilization process is contributed by the sperm. Dev. Biol. 134: 446–451. Jacobs, P. A., C. M. Wilson, J. A. Sprenkle, N. B. Rosenshein and B. R. Migeon. 1980. Mechanism of origin of complete hydatidiform hydatidiform moles. Nature 286: 714–717. Jaffe, L. A. 1976. Fast block to polyspermy in sea urchins is electrically mediated. Nature 261: 68–71. Jaffe, L. A. 1980. Electrical E lectrical polyspermy polyspermy block in sea urchins: Nicotine and low sodium experiments. Dev. Growth Diff. 22: 503–507. Jaffe, L. A. and N. L. Cross. 1983. Electrical properties of vertebrate oocyte membranes. Biol. Reprod. 30: 50–54. Jaffe, L. A. and L. C. Schlicter 1985. Fertilization-induced Fertilization-induced ionic conductances in eggs of the frog, Rana pipiens. J Physiol. 358:299–319. Jaffe, L. A., A. F. Giusti, D. J. Carroll and K. R. Foltz. 2001. Ca2+ signaling during fertilization of echinoderm eggs. Semin. Cell Dev. Biol. 12: 45–51. Jaffe, L. F. 1983. Sources of calcium in egg activation: A review and hypothesis. Dev. Biol. 99: 265–277. Johnson, J., B. M. Bierle, G. I. Gallicano and D. G. Capco. 1998. Calcium/calmodulinCalcium/calmodulindependent protein kinase II and calmodulin: calmodulin: Regulators of the meiotic spindle in mouse eggs. Dev. Biol. 204: 464–477. Just, E. E. 1919. The fertilization reaction reaction in Echinarachinus parma. Biol. Bull. 36: 1–10. Kaji, K., S. Oda, S. Miyazaki and A. Kudo. 2002. Infertility of CD9-deficient mouse eggs is reversed by mouse CD9, human CD9, or mouse CD81: Polyadenylated Polyadenylated mRNA injection developed for molecular analysis of sperm-egg fusion. Dev. Biol. 247: 327– 334. Kamei, N. and C. G. Glabe. 2003. The species-specific egg receptor for sea urchin sperm is ERB1, a novel ADAMTS protein. Genes Dev. 17: 2502–2507. 66
Kaufman, M. H., S. C. Barton and M. A. H. Surani. 1977. Normal postimplantation development development of mouse parthenogenetic embryos to the forelimb bud stage. Nature 265: 53–55. Kaupp, U. B. and 8 others. 2003. The signal flow and motor response controlling controlling chemotaxis of sea urchin sperm. Nature Cell Biol. 5: 109–117. Kimura, Y., R. Yanagimachi, S. Kuretake, H. Bortiewicz, A. C. F. Perry and H. Yanagimachi. 1998. Analysis of mouse oocyte activation suggests the involvement of sperm perinuclear material. Biol. Reprod. 58: 1407–1415. Kinsey, W. H. and S. S. Shen. 2000. Role of the Fyn kinase in calcium release during fertilization of the sea urchin egg. Dev. Biol. 225: 253–264. Kirkman-Brown, J. C., K. A. Sutton and H. M. Florman. 2003. How to attract a sperm. Nature Cell Biol. 5: 93–96. Kono, T. and 8 others. 1994. Birth of parthenogenic mice that can develop to adulthood. Nature 428: 860–864. Knott, J. G., M. Kurokawa, R. A. Fissore, R. M. Schultz and C. J. Williams. 2005. Transgenic RNA interference reveals role for mouse sperm phospholipase Cζ in triggering Ca2+ oscillations during fertilization. Biol. Reprod. 72: 992–996. Krawetz, S. A. 2005. Paternal contribution: New insights and future challenges. Nature Rev. Genet. 6: 633–642. Kopf, G. S. 1998. Acrosome reaction. In E. Knobil and J. D. Neill (eds.), Encyclopedia Encyclopedia of Reproduction, vol. 1. Academic Press, San Diego, pp. 17–27. Kuretake, S., Y. Kimura, K. Hoshi and R. Yanagimachi. 1996. Fertilization and development development of mouse oocytes injected with isolated sperm heads. Biol. Reprod. 55: 789–795. Kvist, U., B. A. Afzelius and L. Nilsson. 1980. The intrinsic mechanism of chromatin decondensation decondensation and its activation in human spermatozoa. Dev. Growth Diff. 22: 543– 554. Lee, H. C. 2001. Physiological functions of cyclic ADP-ribose and NAADPas calcium messengers. messengers. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41: 317–345. Lee, S.-J. and S. S. Shen. 1998. The calcium transient in sea urchin eggs during fertilization requires the production of inositol 1,4,5-trisphosphate. Dev. Biol. 193: 195–208. Leeuwenhoek, A. van. 1685. Letter to the Royal Society of London. Quoted in E. G. Ruestow 1983, Images and ideas: Leeuwenhoek’s perception of the spermatozoa. spermatozoa. J. Hist. Biol. 16: 185–224.
67
Lefebvre, R., P. J. Chenoweth, M. Drost, C. T. LeClear, M. MacCubbin, J. T. Dutton and S. S. Suarez. 1995. Characterization of the oviductal sperm receptor in cattle. Biol. Reprod. 53: 1066–1074. Le Naour, F., E. Rubinstein, C. Jasmin, M. Prenant and C. Boucheix. 2000. Severely reduced female fertility in CD9-deficient mice. Science 287: 319–321. Levine, A. E., K. A. Walsh and E. J. B. Fodor. 1978. Evidence of an acrosin-like enzyme enzyme in sea urchin sperm. Dev. Biol. 63: 299–307. Leyton, L. and P. Saling. 1989. Evidence that aggregation of mouse sperm receptors receptors by ZP3 triggers the acrosome reaction. J. Cell Biol. 108: 2163–2168. Leyton, L., P. Leguen, D. Bunch and P. M. Saling. 1992. Regulation of mouse gametic interaction by a sperm tyrosine kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1164–1169. Lin, Y., K. Mahan, W. F. Lathrop, D. G. Myles and P. Primakoff 1994. A hyaluronidase activity of the sperm plasma membrane protein PH-20 enables sperm to penetrate the cumulus cell layer surrounding surrounding the egg. J. Cell Biol. 125: 1157–1163. Longo, F. J. and M. Kunkle. 1978. Transformation Transformation of sperm nuclei upon insemination. In A. A. Moscona and A. Monroy (eds.), Current Topics in Developmental Developmental Biology, vol. 12. Academic Press, New York, pp. 149–184. Longo, F. J., J. W. Lynn, D. H. McCulloh and E. L. Chambers. 1986. Correlative ultrastructural and electrophysiological electrophysiological studies of sperm-egg interactions of the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 118: 155–167. Lopez, L. C., E. M. Bayna, D. Litoff, N. L. Shaper, J. H. Shaper and B. D. Shur. 1985. Receptor function of mouse sperm surface galactosyltransferase galactosyltransferase during fertilization. J. Cell Biol. 101: 1501–1510. Lu, Q. and B. D. Shur. 1997. Sperm from β-1,4-galactosyltransferaseβ-1,4-galactosyltransferase-null null mice are refractory to ZP3-induced acrosome reactions reactions and penetrate the zona pellucida poorly. Development 124: 4121–4131. Luttmer, S. and F. J. Longo. 1985. Ultrastructural and morphometric observations observations of cortical endoplasmic reticulum in Arbacia, Spisula, and mouse eggs. Dev. Growth Diff. 27: 349–359. McCulloh, D. H. and E. L. Chambers. 1992. Fusion of membranes during fertilization. fertilization. J. Gen. Physiol. 99: 137–175. McGrath, J. and D. Solter. 1984. Completion of mouse embryogenesis embryogenesis requires both the maternal and paternal genome. Cell 37: 179–183. McPherson, S. M., P. S. McPherson, L. Mathews, K. P. Campbell and F. J. Longo. 1992. Cortical localization of a calcium release channel in sea urchin eggs. J. Cell Biol. 116: 1111–1121.
68
Mead, K. S. and D. Epel. 1995. Beakers and breakers: How fertilisation in the laboratory differs from fertisation in nature. Zygote 3: 95–99. Meizel, S. 1984. The importance of hydrolytic enzymes to an exocytotic event, the mammalian sperm acrosome reaction. Biol. Rev. 59: 125–157. Metz, C. B. 1978. Sperm and egg receptors involved in fertilization. Curr. Top. Dev. Biol. 12: 107–148. Metz, E. C. and S. R. Palumbi 1996. Positive selection and sequence rearrangements generate extensive polymorphism in the gamete recognition protein bindin. Mol. Biol. Evol.13: 397–406. Miller, B. S. and D. Epel. 1999. The roles of changes in NADPH and pH during fertilization and artificial activation activation of the sea urchin egg. Dev. Biol. 216: 394–405. Miller, D. J., M. B. Macek and B. D. Shur. 1992. Complementarity Complementarity between sperm surface β1,4-galactosyltransferase 1,4-galactosyltransferase and egg-coat ZP3 mediates sperm-egg binding. Nature 357: 589–593. Miller, D. J., X. Gong, G. Decker and B. D. Shur. 1993. Egg cortical granule Nacetylglucosaminidase acetylglucosaminidase is required for the mouse zona block to polyspermy. J. Cell Biol. 123: 1431–1440. Miller, R. L. 1978. Site-specific agglutination agglutination and the timed release of a sperm chemoattractant by the egg of the leptomedusan, Orthopyxis caliculata. J. Exp. Zool. 205: 385–392. Miller, R. L. 1985. Sperm chemo-orientation in the metazoa. In C. B. Metz, Jr., and A. Monroy (eds.), Biology of Fertilization, vol. 2. Academic Press, New York, pp. 275–337. Miyado, K. and 11 others. 2000. Requirement of CD9 on the egg plasma membrane for fertilization. Science 287: 321–319. Miyazaki, S.-I., M. Yuzaki, K. Nakada, H. Shirakawa, S. Nakanishi, S. Nakade and K. Mikoshiba. 1992. Block of Ca2+ wave and Ca2+ oscillation by antibody to the inositol 1,4,5-trisphosphate 1,4,5-trisphosphate receptor in fertilized hamster eggs. Science 257: 251–255. Mohri, T., P. I. Ivonnet and E. L. Chambers. 1995. Effect of sperm-induced sperm-induced activation current and increase of cytosolic Ca2+ by agents that modify the mobilization of [Ca2+]. I. Heparin and pentosan polysulfate. Dev. Biol. 172: 139–157. Moller, C. C. and P. M. Wassarman. 1989. Characterization Characterization of a proteinase that cleaves zona pellucida glycoprotein glycoprotein ZP2 following activation of mouse eggs. Dev. Biol. 132: 103– 112. Moy, G. W. and V. D. Vacquier. 1979. Immunoperoxidase localization localization of bindin during the adhesion of sperm to sea urchin eggs. Curr. Top. Dev. Biol. 13: 31–44. Mozingo, N. M. and D. E. Chandler. 1991. Evidence for the existence of two assembly domains within the sea urchin fertilization envelope. Dev. Biol. 146: 148–157. 69
Nishigaki, T., K. Chiba, and M. Hoshi. 2000. A 130-KdA. A 130-kDa membrane protein of sperm flagella is the receptor for asterosaps, sperm-activating peptides of starfish Asterias amurensis. Dev. Biol. 219: 154–162. Nishizuka, Y. 1986. Studies and perspectives of protein kinase C. Science 233: 305–312. Ogawa, K., T. Mohri and H. Mohri. 1977. Identification of dynein as the outer arms of sea urchin sperm axonemes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5006–5010. Ohama, K. and 7 others. 1981. Dispermic origin of XY hydatidiform moles. Nature 292: 551– 552. O’Rand, M. G. and 9 others. 2004. Reversible immunocontraception immunocontraception in male monkeys immunized with eppin. Science 306: 1189–1190. Ostermeier, G. C., R. J. Goodrich, J. S. Molenhauer, M. P. Diamond and S. A. Krawetz. 2005. A suite of novel human spermatozoal RNAs. J. Androl. 26: 70–74. Perreault, S. D., R. R. Barbee and V. L. Slott. 1988. Importance of glutathione in the acquisition and maintenance of sperm nuclear decondensing activity in maturing hamster oocytes. Dev. Biol. 125: 181–187. Perry, A. C. F., T. Wakayama, I. M. Cook and R. Yaganimachi. 2000. Mammalian oocyte activation by the synergistic action of discrete sperm head components: Induction of calcium transients and involvement of proteolysis. Dev. Biol. 217: 386–393. Pinto-Correia, C. 1997. The Ovary of Eve: Eggs and Sperm and Preformation. University of Chicago Press, Chicago. Poccia, D. and P. Collas. 1997. Nuclear envelope dynamics during male pronuclear development. development. Dev. Growth Diff. 39: 541–550. Porter, D. C. and V. D. Vacquier. 1986. Phosphorylation Phosphorylation of sperm histone H1 is induced by the egg jelly layer in the sea urchin Strongylocentrotus Strongylocentrotus purpuratus. Dev. Biol. 116: 203– 212. Prevost, J. L. and J. B. Dumas. 1824. Deuxieme mémoire sur la génération. Ann. Sci. Nat. 2: 129–149. Primakoff, P. and D. G. Myles. 2002. Penetration, adhesion, adhesion, and fusion in mammalian mammalian spermegg interaction. Science 296: 2183–2185. Primakoff, P., W. Lathrop, L. Woolman, A. Cowan and D. Myles. 1988. Fully effective contraception contraception in male and female guinea pigs immunized with the sperm protein PH20. Nature 335: 543–547. Quill, T. A., S. A. Sugden, K. L. Rossi, L. K. Doolittle, R. E. Hammer, and D. L. Garbers. 2003. Hyperactivated Hyperactivated sperm motility driven by CatSper2 is required for fertilization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 14869–14874. 70
Ralt, D. and 8 others. 1991. Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability. fertilizability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2840–2844. Ramarao, C. S. and D. L. Garbers. 1985. Receptor-mediated regulation regulation of guanylate cyclase activity in spermatozoa. J. Biol. Chem. 260: 8390–8397. Rees, B. B., C. Patton, J. L Grainger and D. Epel. 1995. Protein synthesis increases after fertilization of sea urchin eggs in the absence of an increase in intracellular intracellular pH. Dev. Biol. 169: 683–698. Rodeheffer, C. and B. D. Shur. 2004. Characterization of a novel ZP3-independent spermspermbinding ligand that facilitates sperm adhesion to the egg coat. Development 131: 503– 512. Runft, L. L., L. A. Jaffe and L. M. Mehlmann. 2002. Egg activation at fertilization: Where it all begins. Dev. Biol. 245: 237–254. Saling, P. M., J. Sowinski and B. T. Storey. 1979. An ultrastructural study of epididymal epididymal mouse spermatozoa binding to zonae pellucida in vitro: Sequential relationship to acrosome reaction. J. Exp. Zool. 209: 229–238. Salaun, P., S. Pyronnet, J. Morlaes, O. Mulner-Lorillon, Mulner-Lorillon, R. Belle, N. Sonenberg, and P. Cormier. 2003. eIF4E/4E-BP dissociation and 4E-BP degradation in the first mitotic division of the sea urchin embryo. Dev. Biol. 255: 428–439. Salaun, P., M. Le Breton, J. Morales, R. Belle, S. Boulben, O. Mulner-Lorillon Mulner-Lorillon and P. Cormier. 2004. Signal transduction pathways that contribute to CDK1/cyclin B activation during the first mitotic division in sea urchin embryos. Exp. Cell Res. 296: 347–357. Saunders, C. M. and 7 others. 2002. PLCζ: A sperm-specific trigger of Ca2+ oscillations in eggs and embryo development. Development 129: 3533–3544. Schatten, G. and D. Mazia. 1976. The penetration of the spermatozoon through the sea urchin egg surface at fertilization: Observations from the outside on whole eggs and from the inside on isolated surfaces. Exp. Cell Res. 98: 325–337. Schroeder, T. E. 1979. Surface area change at fertilization: fertilization: Resorption of the mosaic membrane. Dev. Biol. 70: 306–327. Schwartz, M. and J. Vissing. 2002. Paternal inheritance of mitochondrial DNA. New Engl. J. Med. 347: 576–580. Shearer, J., C. D. Nadal, F. Emily-Fenouil, C. Gache, M. Whitaker and B. Ciapa. 1999. Role of phospholipase phospholipase Cγ at fertilization and during meiosis in sea urchin eggs and embryos. Development 126: 2273–2284. Shen, S. S. and R. A. Steinhardt. 1978. Direct measurement of intracellular pH during metabolic depression depression of the sea urchin egg. Nature 272: 253–254.
71
Shi, X., S. Amindari, K. Paruchuru, D. Skalla, H. Burkin, B. D. Shur and D. J. Miller. 2001. Cell surface β-1,4-galactosyltransferase-I β-1,4-galactosyltransferase-I activates G protein-dependent protein-dependent exocytotic signaling. Development 128: 645–654. Shimomura, H., L. J. Dangott and D. L. Garbers. 1986. Covalent coupling of a resact analogue to guanylate cyclase. J. Biol. Chem. 261: 15778–15782. Shinyoji, C., H. Higuchi, M. Yoshimura, E. Katayama and T. Yanagida. 1998. Dynein arms are oscillating force generators. Nature 393: 711–714. Shitara, H., H. Kaneda, A. Sato and H. Honekawa. 1998. Selective and continuous elimination of mitochondria microinjected into mouse eggs from spermatids, but not from liver cells, occurs throughout embryogenesis. Genetics 156: 1277–1284. Simerly, C. and 7 others. 1995. The paternal inheritance of the centrosome, the cell’s microtubule-organizing microtubule-organizing center, in humans, and the implications for infertility. Nature Med. 1: 47–52. Simerly, C. and 7 others. 1999. Biparental inheritance of γ-tubulin during human fertilization: Molecular reconstitution of functional zygote centrosomes in inseminated human oocytes and in cell-free extracts nucleated by human sperm. Mol. Cell Biol. 10: 2955– 2969. Sluder, G., F. J. Miller, K. K. Lewis, E. D. Davison and C. L. Reider. 1989. Centrosome inheritance in starfish zygotes: Selective loss of the maternal centrosome after fertilization. Dev. Biol. 131: 567–579. Sluder, G., F. J. Miller and K. Lewis. 1993. Centrosome inheritance in starfish zygotes. II. Selective suppression suppression of the maternal centrosome during meiosis. Dev. Biol. 155: 58– 67. Smith, T. T. 1998. The modulation of sperm function by the oviductal epithelium. Biol. Reprod. 58: 1102–1104. Steinhardt, R. A. and D. Epel. 1974. Activation of sea urchin eggs by a calcium ionophore. ionophore. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1915–1919. Steinhardt, R., R. Zucker and G. Schatten. 1977. Intracellular Intracellular calcium release at fertilization in the sea urchin egg. Dev. Biol. 58: 185–197. Stephens, S. and 7 others. 2002. Two kinase activities are sufficient sufficient for sea urchin sperm chromatin decondensation decondensation in vitro. Mol. Reprod. Dev. 62: 496–503. Storey, B. T. 1995. Interactions between gametes leading to fertilization: The sperm’s eye view. Reprod. Fertil. Dev. 7: 927–942. Stricker, S. A. 1999. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev. Biol. 211: 157–176.
72
Suarez, S. S. 1998. The oviductal sperm reservoir in mammals: mammals: Mechanisms of formation. Biol. Reprod. 58: 1105–1107. Suarez, S. S., D. F. Katz, D. H. Owen, J. B. Andrew and R. L. Powell. 1991. Evidence for the function of hyperactivated motility in sperm. Biol. Reprod. 44: 375–381. Summers, R. G. and B. L. Hylander. 1974. An ultrastructural analysis of early fertilization in the sand dollar, Echinarachnius parma. Cell Tissue Res. 150: 343–368. Summers, R. G., B. L. Hylander, L. H. Colwin and A. L. Colwin. 1975. The functional anatomy of the echinoderm spermatozoon and its interaction with the egg at fertilization. Am. Zool. 15: 523–551. Sun, F. and 7 others. 2005. Human sperm chemotaxis: chemotaxis: Both the oocyte and its surrounding cumulus cells secrete sperm chemoattractants. Hum. Reprod. 20: 761–767. Surani, M. A. H. and S. C. Barton. 1983. Development of gynogenetic eggs in the mouse: Implications for parthenogenetic embryos. Science 222: 1034–1037. Surani, M. A. H., S. C. Barton and M. L. Norris. 1986. Nuclear transplantation in the mouse: Heritable differences between parental genomes after activation of the embryonic genome. Cell 45: 127–137. Sutovsky, P., C. S. Navara and G. Schatten. 1996. Fate of the sperm mitochondria and the incorporation, conversion, conversion, and disassembly of the sperm tail structures during bovine fertilization. Biol. Reprod. 55: 1195–1205. Swann, K. and M. Whitaker. 1986. The part played by inositol trisphosphate and calcium in the propagation of the fertilization wave in sea urchin eggs. J. Cell Biol. 103: 2333–2342. Swann, K., M. G. Larman, C. M. Saunders and F. A. Lai. 2004. The cytosolic sperm factor that triggers Ca2+ oscillations and egg activation in mammals is a novel sperm phospholipase: phospholipase: PLCζ. Reproduction Reproduction 127: 431–439. Swanson, W. J. and V. D. Vacquier. 2002. The rapid evolution of reproductive proteins. Nature Rev. Genet. 3: 137–144. Tachibana, I. and M. E. Hemler. 1999. Role of transmembrane 4 superfamily (TM4SF) proteins CD9 and CD81 in muscle cell fusion and myotube maintenance. maintenance. J. Cell Biol. 146: 893– 904. Talbot, P., C. Geiske and M. Knoll. 1999. Oocyte pickup by the mammalian oviduct. Mol. Biol. Cell 10: 5–8. Terasaki, M. and C. Sardet. 1991. Demonstration of calcium uptake and release by sea urchin egg cortical endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 115: 1031–1037. Tilney, L. G., J. Bryan, D. J. Bush, K. Fujiwara, M. S. Mooseker, D. B. Murphy and D. H. Snyder. 1973. Microtubules: Evidence for 13 protofilaments. J. Cell Biol. 59: 267–275.
73
Tilney, L. G., D. P. Kiehart, C. Sardet and M. Tilney. 1978. Polymerization Polymerization of actin. IV. Role of Ca2+ and H+ in the assembly of actin and in membrane fusion in the acrosome reaction of echinoderm sperm. J. Cell Biol. 77: 536–560. Tombes, R. M. and B. M. Shapiro. 1985. Metabolite channeling: channeling: A phosphocreatine shuttle to mediate high-energy phosphate transport between sperm mitochondrion and tail. Cell 41: 325–334. Tomes, C. N., M. Michaut, G. D. Blas, P. Visconti, U. Matti and L. S. Mayoga. 2002. SNARE complex assembly is required for human sperm acrosome reaction. Dev. Biol. 243: 326–338. Töpfer-Petersen, Töpfer-Petersen, E., A. Wagner, J. Friedrich, A. Petrunkina, M. Ekhlasi-Hundrieser, D. Waberski and W. Drommer. 2002. Function of the mammalian oviductal sperm reservoir. J. Exp. Zool. 292: 210–215. Tulsiani, D. P. and A. Abou-Haila. 2004. Is sperm capacitation analogous analogous to early phases of Ca2+ -triggered membrane fusion in somatic cells and viruses? BioEssays 26: 281– 290. Turner, P. R., L. A. Jaffe and A. Fein. 1986. Regulation of cortical vesicle exocytosis exocytosis in sea urchin eggs by inositol 1,4,5-trisphosphate and GTP-binding protein. J. Cell Biol. 102: 70–77. Ulrich, A. S., W. Tichelaar, G. Forster, O. Zschornig, S. Weinkauf and H. W. Meyer. 1999. Ultrastructural characterization characterization of peptide-induced peptide-induced membrane fusion and peptide selfassembly in the lipid bilayer. Biophys. J. 77: 829–841. Uzzell, T. M. 1964. Relations of the diploid and triploid species of the Ambystoma jeffersonianum complex. complex. Copeia 1964: 257–300. Vacquier, V. D. 1979. The interaction of sea urchin gametes during fertilization. Am. Zool. 19: 839–849. Vacquier, V. D. and G. W. Moy. 1977. Isolation of bindin: The protein responsible for adhesion of sperm to sea urchin eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2456–2460. Vacquier, V. D. and J. E. Payne. 1973. Methods for quantitating sea urchin sperm in egg binding. Exp. Cell Res. 82: 227–235. Vacquier, V. D., M. J. Tegner and D. Epel. 1973. Protease release from sea urchin eggs at fertilization alters the vitelline layer and aids in preventing polyspermy. Exp. Cell Res. 80: 111–119. Van Steirtinghem, A. 1994. IVF and micromanipulation techniq techniques ues for male-factor fertility. Curr. Opin. Obstet. Gynaecol. 6: 173–177. Visconti, P. E. and G. S. Kopf. 1998. Regulation of protein phosphorylation during sperm capacitation. Biol. Reprod. 59: 1–6.
74
Visconti, P. E. and 7 others. 1995. Capacitation of mouse spermatozoa. spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation on and capacitation capacitation are regulated by a cAMP-dependent cAMP-dependent pathway. Development 121: 1139–1150. Vogel, G. 2004. Japanese scientists scientists create fatherless mouse. Science 304: 501–503. von Kolliker, A. 1841. Beiträge zur Kenntnis der Geschlectverhältnisse Geschlectverhältnisse und der Samenflüssigkeit Samenflüssigkeit wirbelloser Thiere, nebst einem Versuch Über Wesen und die Bedeutung der sogenannten Samenthiere. Berlin. Voronina, E. and G. M. Wessel. 2003. βγ subunits of heterotrimeric G-proteins contribute contribute to Ca2+ release at fertilization in sea urchins. J. Cell Sci. 117: 5995–6005. Wang, Y., R. Storeng, P. O. Dale, T. Abyholm A byholm and T. Tanbo. 2001. Effects of follicular fluid and steroid hormones on chemotaxis and motility of human spermatozoa in vitro. Gynecol. Endocrinol. 15: 286–292. Ward, G. E., C. J. Brokaw, D. L. Garbers and V. D. Vacquier. 1985. Chemotaxis of Arbacia Arbacia punctulata spermatozoa spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101: 2324–2329. Wassarman, P. M. 1988. Fertilization Fertilization in mammals. Sci. Am. 256(Dec.): 78–84. Wassarman, P. M., L. Jovine and E. S. Litscher. 2001. A profile of fertilization in mammals. mammals. Nature Cell Biol. 3: E59–E64. Watanabe, N., T. Hunt, Y. Ikawa and N. Sagata. 1991. Independent inactivation of MPF and cytostatic factor (Mos) upon fertilization of Xenopus eggs. Nature 352: 247–249. Whitaker, M. and R. F. Irvine. 1984. Inositol 1,4,5-triphosphate microinjection microinjection activates sea urchin eggs. Nature 312: 636–639. Whitaker, M. and R. Steinhardt. 1982. Ionic regulation of egg activation. Q. Rev. Biophys. 15: 593–667. Whitaker, M. J. and R. Steinhardt. 1985. Ionic signaling in the sea urchin egg at fertilization. In C. B. Metz and A. Monroy (eds.), Biology of Fertilization, Vol. 3. Academic Press, Orlando, FL. pp. 167–221. Wilcox, A. J., C. R. Weinberg and D. D. Baird. 1995. Timing of sexual intercourse in relation to ovulation: Effects on the probability of conception, survival of pregnancy, and the sex of the baby. N. Engl. J. Med. 333: 1517–121. Wilson, W. L. and G. Oliphant. 1987. Isolation and biochemical characterization characterization of the subunits of the rabbit sperm acrosome stabilizing factor. Biol. Reprod. 37: 159–169. Winkler, M. M., R. A. Steinhardt, J. L. Grainger and L. Minning. 1980. Dual ionic controls for the activation of protein synthesis at fertilization. Nature 287: 558–560.
75
Wong, J. L. and G. M. Wessel. 2004. Major components of a sea urchin block to polyspermy are structurally and functionally conserved. Evol. Dev. 6: 134–153. Wong, J. L., R. Créton and G. M. Wessel. 2004. The oxidative burst at fertilization is dependent upon activation of the dual peroxidase Udx1. Dev. Cell 7: 801–814. Wood, C. D., T. Nishigaki, Nishigaki, T. Furata, S. A. Baba and A. Darszon. 2005. Real-time analysis of the role of Ca2+ in flagellar movment and motility in single sea urchin sperm. J. Cell Biol. 169: 725–731. Xu, Z., G. S. Kopf and R. M. Schultz. 1994. Involvement of inositol-1,4,5-trisphosph inositol-1,4,5-trisphosphateatemediated Ca2+ release in early and late events of mouse egg activation. Development 120: 1851–1859. Yanagimachi, R. 1994. Mammalian Mammalian fertilization. In E. Knobil and J. D. Neill (eds.), The Physiology of Reproduction, Reproduction, 2nd Ed. Raven Press, New York. Yanagimachi, R. and Y. D. Noda. 1970. Electron microscope studies of sperm incorporation into the golden hamster egg. Am. J. Anat. 128: 429–462. Yoshida, M., K. Inabar and M. Morisawa. 1993. Sperm chemotaxis during the process of fertilization in the ascidians Ciona savignyi and Ciona intestinalis. Dev. Biol. 157: 497– 507.
76
