1. DENEYİN AMACI Saccharomyces cerevisiae üretmek ve Kapalı sistemde çalışan 5 L hacimli bir biyoreaktörde Saccharomyces
gelişim sürecinde örnekler alarak büyüme eğrisi oluşturmaktır. 2. GİRİŞ ( TEORİK BİLGİ )
Canlı organizmaların insan hayatındaki yeri insanlık tarihi kadar eskidir. Tarih boyunca, mikro-organizma mikro-organizma dediğimiz küçük canlılar hem yararlı hem de zararlı organizmalar olarak insan hayatı ile iç içe olmuşlardır. Eski çağlarda çeş itli fermantasyon ürünleri gıda maddesi olarak tüketilmiştir. tüketilmiştir. Maya, üzerinde en çok çalışmanın yapıldığı, alkollü içecek üretimi ve ekmek hamuru kabartmada kullanılan tek hücreli bir organizmadır. Gelişen Gelişen teknolojik olanakların ve tarihsel olarak biriken deneyimlerin birleş imi sonucu bu küçük canlılar; gıda, içecek ve ilaç sektörünün temel teme l unsurları olmuşlardır. Bu yaşayan yaşayan hücreleri ve tepkimelerini anlamak, anlamak, biyolojik olarak davranışlarını incelemek, endüstriyel endüstriyel üretimlerini gerçekleştirmek gerçekleş tirmek ve proses kontrolünü yapmak önemli görevlerdir. Bu bakımdan biyoteknoloji denilen bilim dalı; biyolo ji, kimya ve mühendislik bilimlerinin kesişimi olarak bilinir .[1] Ticari değere sahip bir ürünün mikroorganizmalar kullanarak yapılan üretimi sırasında endüstriyel biyoteknoloji süreci genellikle 3 temel aşamaya ayrılır. Bunlar;
“Upstream processing”: Hedef mikroorganizma için besin kaynağı olarak kullanılabilecek ham maddenin hazırlanması. hazırlanması . Fermentasyon ve transformasyon: Büyük bir reaktör (100 litreden büyük) içinde
antibiyotik, amino asit, enzim gibi arzu edilen ürünün oluşumu (biyodönüşüm) ile sonuç lanan hedef mikroorganizmanın çoğalması. çoğalması .
“Downstream processing”: Arzu edilen ürünün hücre kütlesinden veya besi ortamından ayrılarak saflaştırılması. saflaştırılması. Mikroorganizmalarla yapılan biyoteknolojik süreçlerin çoğu genel olarak; Süreç Mühendisliği Mühendisliği Substrat + Mikroorganizma
ÜRÜN
şeklinde özetlenebilir.
Süreç mühendisliği üretim işlemleri (fermentasyon) ve bu işlemler sonucunda oluşan ürünün geri kazanılması ile ilgili yöntemlerin saptanması, geliştirilmesi ve optimize edilmesini içeren çalışmaları kapsar. [2] 1
Mayalar insanlar için; ekonomik, sosyal ve sağlık açısından oldukça önemli en eski evcilleştirilmiş organizmalardır. Alkollü içeceklerin üretiminde, ekmek yapımında hamurun kabarması için binlerce yıl öncesinden beri kullanılmaktadırlar. Gerçekte bira yapımı belki de dünyanın ilk biyoteknolojisini temsil etmektedir. Günümüzde mayalar geleneksel gıda fermentasyonunun dışında çok çeşitli alanlarda da kullanılmaktadır. Özellikle genetik mühendisliğiyle geliştirilmiş mayalar hastalıkların önlenmesinde ve tedavisinde kullanılan pek çok farmasötik ajanın üretilmesinde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır . •
Rekombinant DNA teknolojisi ile geliştirilen rekombinant mayalar tarafından üretilen biyolojik olarak aktif rekombinanat proteinlerin veriminin arttırılmasında iki önemli yaklaşım vardır: – moleküler genetik tekniklerin kullanımı – fermentasyon teknolojisi [3]
Yüksek verimle üretim için son yıllarda endüstriyel ve bilimsel çabalar yoğunlaşmıştır. Mayanın üretimi, yeni üretim yöntemlerinden biri olan, kimyasal teknolojide ve biyoteknolojide giderek genişleyen uygulama alanları bulan kabarcıklı kolon reaktörlerde gerçekleştirilir. Bunun nedeni gaz, sıvı ve katıların bulunduğu üç fazlı proseslerde basit ve etkin karışmayı sağlamalarıdır. Bu tip reaktörlerde, etkin gaz absorpsiyonunun olması, iyi ısı aktarımının sağlanması ve endüstriyel proseslerde uygulanan hızlı karışma gibi üstünlükler vardır. [4] Endüstriyel maya üretimi, ası balon, saf kültür, ana maya, ekim maya ve ticari maya fermantasyonları olmak üzere beş üretim aşamasından oluşur. Bu aş amalar laboratuvardan başlar, kesikli ve yarı kesikli fermantasyonlar ile devam eder. Biyoreaktör işletim şekillerine göre kesikli, yarı kesikli ve sürekli olmak üzere sınıflandırılabilir. • Kesikli işletim („Batch‟): Endüstriyel biyoreaktörler genellikle kesikli işletim ile çalıştırılırlar. Kesikli işletimde, biyoreaktör ilk önce fermantasyon sıvısı ile doldur ulur, hücreler ortama asılanır ve hücrelerin üremeleri için belli bir süre beklenir. Bu süre sonunda hücre yoğunluğunun veya ürün derişiminin belli bir değere ulaşması öngörülür. Bu süre sonunda reaktör boşaltılır ve yeni bir işlem için hazırlanır. Kesikli işletimde, reaktör hazırlama, hücre üremesi, reaktör boşaltma ve temizleme olmak üzere 4 evre söz konusudur. Fermantasyon islemi boyunca herhangi bir besleme veya ürün uzaklaştırma işlemi yapılmaz. Sadece havalı fermantasyon için hava beslemesi yapılır. R eaksiyon süresince substrat ve
2
biyokütle derişimi değişir. Reaksiyon boyunca substrat derişimi azalırken, biyokütle derişimi artar. • Yarı-kesikli işletim („Fed-batch‟): Yarı kesikli işletimde, biyoreaktöre fermantasyon boyunca substrat beslemesi yapılır. Reaktörden alınan örnekler dışında herhangi bir ürün uzaklaştırılması söz konusu değildir. Sürekli substrat beslemesi yapılması ve ürün uzaklaştırılmaması nedeniyle toplam reaksiyon hacmi zamanla artar. Yarı kesikli işletim, girdi beslemesi yapılarak kesikli işletimin devamı olarak çalıştırılabileceği gibi hücre büyüme ve çoğalma evreleri ayrı fazlar olarak kontrol edilebilir. Bunun yanında yarı kesikli işletimde farklı besleme şekilleri ile farklı kontrol metotları uygulanabilir. Bu işletimde yüksek derişimde biyokütle ve ürün elde edilir.
• Sürekli işletim („Continuous‟): Sürekli işletimde, bir taraftan reaktöre substrat beslemesi yapılırken, diğer taraftan da ürün uzaklaştırılır. Besleme ve uzaklaştırma hızları reaktör hacmi sabit kalacak şekilde yapılır. Sürekli işletimle çalışan reaktörlerde, reaksiyon başladıktan kısa bir süre sonra sistem yatışkın hale ulaşır. Bu işletim sekli arıtma endüstrisinde ve diğer bazı endüstrilerde
kullanılır.
Ayrıca
laboratuvar
çalışmalarında,
organizmaların
kinetiklerinin ve enzim reaksiyon kinetiklerinin belirlenmesinde de kullanılır.
3. Deneysel Yöntem 3.1.Deney Düzeneğinin Şematik Gösterimi ve Tanıtımı
Şekil1.Biyoreaktörde Maya Üretimi
3
[5]
üreme
3.2.Deney Koşulları Deney laboratuvar ortamında gerçekleştirilmelidir. Mayanın üretimi için gerekli şartlar biyoreaktörde oluşturulmalıdır. Biyoreaktörde bu şartların sağlanmasına engel bir arıza varsa giderilmelidir. 30 °C‟ de inkübasyon için önceden inkübatör 30 °C‟ ye ayarlanmalıdır. Kullandığımız deney tüpleri, ependorflar, mikropipetler, mikropipet uçları, besiyerleri ve diğer aparatlar steril olmalıdır. Deney sırasında mutlaka eldiven ve laboratuar önlüğü kullanılmalıdır. Biyoreaktöre ekim yapıldığında 48 saat içinde belli aralıklarla örnek alımına devam edilmelidir. Örneklerin spektrofotometrede 600 nm‟ de absorbansı ölçülmelidir.
3.3.Güvenlik Kaygısı Spektrofotometre, inkübatör ve biyoreaktör cihazı elektrikli cihazlar olduğu için dikkatli kullanılmalıdır. Saccharomyces cerevisia ekmek yapımında kullanılmaktadır. Maya mantarlarınının başka türleri meyve sularından şarap imalinde, süt endüstrisinde muhtelif süt ürünlerinin
üretiminde
kullanılır.
Görüldüğü
gibi
bu
mikroorganizma
gıdalarda
kullanılmaktadır, insan sağlığına zararı ner edeyse yok gibidir. Fakat temkinli olmak için deney sırasında yine de eldiven ve laboratuar önlüğü kullanılmalıdır. Biyoreaktör cihazından örnek alım işlemi yapılırken kapatılmalıdır ve örnek alma aparatı kullanılmalıdır. 4. Deney Öncesi Araştırılması Gerekli Sorular 1) Bir biyoreaktörün temel özellikleri nelerdir?
Biyoreaktör, sıcaklık, pH derecesi gibi çevre şartları kontrol edilen fermentasyon kabı olarak tanımlanabilir.[6] Biyoreaktörde yüksek ürün verimi elde edebilmek için pH, sıcaklık, çözünmüş oksijen derişimi, karıştırma hızı gibi parametrelerin optimum değerlerinde işletilmesi gerekmektedir. Bir biyoreaktörün tasarımında en önemli özellik , üretimin kesikli mi yoksa sürekli olarak mı devam edececeğini belirlemektir. Bunun dışında, son dönemlerde ucuz maliyeti nedeniyle torba tipi ya da balon tipi reaktör modelleride yaygınlaşmaktadır.
4
Biyoreaktörler;
Steril çalışmaya uygun olmak, Uygun karıştırma sağlanmalı, Steril katkılara elverişli giriş ve katkı sistemleri içermeli, Kontrol modüllerini içermesi gerekli, Biyoreaktörün gövdesi tercihen silindirik olmalı (temizlik açısından kolaylık sağlar), Kapağı olmak zorunda ve sterilizasyondan sonra kapak kesinlikle açılmamalıdır, Kapağın üzerinde madde transferi için delikler olmalıdır.
Biyoreaktörler işletim şekillerine göre kesikli, yarı kesikli ve sınıflandırılabilirler. (Besi yerinin akışına bağlı olarak biyoreaktörler)[7]
sürekli
olarak
Kesikli İşletim(batch): Endüstriyel biyoreaktörler genellikle kesikli işletim ile çalıştırılırlar. Kesikli işletimde, biyoreaktör önce fermantasyon sıvısı ile doldurulur, hücreler ortama aşılanır ve hücrelerin üremesi için belli bir süre beklenir. Kesikli işletimde, reaktör hazırlama, hücre üremesi, reaktör boşaltma ve temizleme olmak üzere 4 evre s öz konusudur. Reaksiyon boyunca substrat derişimi azalırken, biyokütle derişimi artar. Kesikli prosesin avantajı, kontrolü için az emek gerektirmesidir. Üretilecek ürün az miktarda isteniyorsa ekonomik olarak uygundur.
Yarı kesikli İşletim(Fed Batch): Yarı kesikli işletimde, biyoreaktöre fermantasyon boyunca substrat beslemesi yapılır. Reaktörden alınan örnekler dışında ürün uzaklaştırması söz konusu değildir. Bu üretimde yüksek derişimde biyokütle ve ürün elde edilir.
Sürekli İşletim (Continuous): Sürekli işletimde, bir taraftan reaktöre substrat beslemesi yapılırken, diğer taraftan da ürün uzaklaştırılır. Besleme ve uzaklaştırma hızları reaktör hacmi sabit kalacak şekilde yapılır. Hacmin sabit tutulabilmesi ve reaksiyonun kontrol altında tutulabilmesi bir “kemostat” hali yaratılabilir. Bunun anlamı reaktör içindeki her noktada reaktör bileşenlerinin konsantrasyonu eşittir. Buna bağlı çalışan prosesler vardır. Turbidıostatta ise giriş besleme hızı çıkış hücre derişimi ile kontrol edilir. Kesikli kültürden farkı olarak mikroorganizmlar belirli fazlarda bulunmazlar. Endüstriyel açıdan sürekli kültürlerle çalışmak kesikli kültürlere göre daha az maliyetlidir. Zaman açısından da sürekli kültürler avantajlıdır . Ancak uygulamada daha az tercih edilir.
5
2) Biyoreaktörü oluşturan ana elemanlar hangileridir?
[8]
1) Reaktör kabı 2) Ceket 3) İzolasyon sağlayıcı 4) Örtü 5) Mikrorganizma girişi 6) pH için giriş noktası 7) Karıştırıcı ve paletler 8) Gaz püskürtücü 9) Mekanik conta 10) İndirgeyici dişli kutusu 11) Motor 12) Ürün çıkış ağzı 13) Ceket bağlantıları 14) Buhar bağlantılı örnek kapakçığı 15) Görüş camı 16) Asit, alkali,köpük kırıcı kimyasal bağlantısı 17) Hava girişi 18) Çıkarılabilir başlık 19) Besiyeri ya da besleyici girişi 20) Hava çıkışı 21) Aygıt girişi(çeşitli) 22) Köpük kırıcı 23) Işıklı görüş camı ve buhar bağlantısı 24) Bağlantı koparıcı disk nozül bölümlerinden oluşur. [9] 3) Fermantasyon nedir? Fermantasyon: Bir maddenin bakteriler, mantarlar ve diğer mikroorganizmalar aracılığıyla,
genellikle
ısı
vererek
ve
köpürerek
kimyasal
olarak
çürümesi
olayıdır.
Fermantasyon anaerobik şartlarda,yani oksidatiffosforilasyon olamadığıdurumlarda, glikoliz y oluyla ATP üretimini sağlayan önemli bir biyokimyasal süreçtir.
6
Fermantasyon terimi biyokimyada oksijen yokluğunda enerji üreten reaksiyonlar için kullanılmasına karşın, gıda sanayisinde daha genel bir anlam taşır, mikroorganizmaların oksijen varlığında yaptığı parçalama reaksiyonlarını da kapsar (sirke fermantasyonu gibi). Biyoteknolojide bu terim daha da genel kullanılır ve büyük tanklarda büyütülen mikroorganizmalara yaptırılan her türlü üretime (proteinler dahil) fermantasyon denir. Fermentasyonun iki türü vardır: a)Glikoz Fermentasyonu
Glikoz fermantasyonu sırasında pirüvat çeşitli bileşiklere dönüşür: Alkol fermantasyonu pirüvatın alkol ve karbon dioksite dönüşümüdür. Laktik asit fermantasyonu iki tipli olabilir: pirüvattan laktik asit üretimidir; Bakteriler arasında Streptokoklarda (örneğin Streptococcus lactis ) ve laktobasillerde (örneğin Lactobacillus casei, L. pentosus ) görülür. Kaslar da yeterince oksijen almadıkları zaman laktik asit üreterek kısa süreli olarak enerji üretimini sürdürürler. Glikoz başına 2 ATP üretilir. * homolaktik
fermantasyon ,
* heterolaktik fermantasyon (veya heterofermantasyon) ise laktik asit ile diğer asit ve alkollerin üretimidir. Örneğin E. coli, fosfoketolaz yoluyla glikozdan laktik asit + etanol + CO2 üretip, bu yolla 1 ATP elde edebilir[3]
Şekil 3: Fermantasyon Çeşitleri b)Amino asit Fermentasyonu
Bu fermantasyon türü çürüme sırasında olur ve karbonhidrat yokluğunda, proteinden beslenen Clostridium cinsi bakteriler tarafından yapılır. Bazı amino asitler elektron alıcısı, bazıları da elektron vericisi olarak işler ve reaksiyon sonunda çeşitli kötü kokulu ürünler oluşur. Amino asit başına 3 ATP molekülü üretilir. [10]
7
4) Mikroorganizmalar hangi yollarla çoğalırlar ? Mikroorganizmalar, çıplak gözle görülemeyecek kadar küçük olan tek hücreli canlılardır. Bakteriler, mayalar, küfler, algler temel mikroorganizmalardır. Şapkalı mantarlar, yosunlar, likenler de aslında mikroorganizmalardır, ancak bunlarda farklılaşmış hücreler ve bunun yanında birleşmiş hücreler olduğu için normal bitkilere benzer görünmektedirler. Bakteri ve mayalarda bu şekilde birleşmiş veya farklılaşmış hücreler yoktur.
Tek bir hücreden
milyonlarcası çoğalarak koloni denilen ve çıplak gözle görülebilen yapıları oluşturur .[11] Mikroorganizmalarda üreme 2 tanedir.
1. Eşeysiz Üreme Bu tür üremede erkek ve dişi hücreler oluşmaz. Mikroorganizmalar ortadan bölünerek tomurcuklanarak veya sporlanarak çoğalırlar. · Ortadan Bölünme : Bacillus ve Spiral biçimdeki mikroorganizmalar kısa eksenleri yuvarlak şekilli bakterilerde herhangi bir çap boyunca ortadan bölünerek çoğalırlar. · Tomurcuklanma : Bazı bakteriler ve mantarlar tomurcuklanarak ürerler. Ana hücrenin bir tarafında oluşan giderek büyür ve olgunlaştıktan sonra ana hücreden ayrılarak bağımsız bir hücre haline gelir.Bazen de hücreler birbirine bağlı kalarak tesbih gibi bir görünüm alırlar. · Sporlanma : Bakterilerde oluşan endosporlar bir çoğalma aracı olmamasına karşın mantarların çoğu sporlar oluşturarak ürerler.
2. Eşeyli Üreme İki ayrı cins hücrenin birleşerek oluşturdukları zigot aracılığı ile sağlanır.Bu tür üreme tarzına bazı alglerde protozoalarda ve mantarlarda rastlanmıştır. Bakterilerde bu anlamda erke ve dişi hücreler oluşmaz. E.coli „de fertilite faktörü taşıyan F+ hücrelerdenbu faktörü taşımayan F hücrelerine pilusu aracılığı ile birlikte genetik bilgi aktarılmaktadır. Ancak bu aktarma olayı bir üreme tarzı değildir ve verici hücre ile alıcı aynı şekilde ortadan bölünerek çoğalır . [12]
8
5) Mikroorganizmalar laboratuar koşullarında üretilmek isteniyorsa nasıl bir yöntem izlenmelidir?
Mikroorganizmaların kalıtsal yapıları ve enzim mikroorganizmaların bir ortamda gelişebilmesi için;
sistemleri
farklıdır.
Fakat
tüm
Suya, Bir enerji kaynağına (ışık veya kimyasal), Bir karbon kaynağına (organik veya inorganik), Bir azot kaynağına (organik veya inorganik), Vitamin ve mineral maddelere gereksinimleri vardır.
Ototrof (kendi beslek) mikroorganizmalar çok basit ortamlarda üreyebilirler. Heterotrof (dış beslek) mikroorganizmaların, gelişebilmesi ve üretilmesi için ortama üreme faktörleri, organik ve inorganik bileşiklerin ilave edilmesi gerekir. Mikroorganizmalar mikrobiyoloji laboratuvarında uygun besi yerlerinde üretilir ve incelenir. Besiyerleri, mikroorganizmaları bulundukları ortam dışında ve laboratuvarlarda üretmek için formüle edilmiş, mikroorganizmaların gereksinimini olan besin ögelerini içeren, pH‟ı uygun, besleyici, katı veya sıvı, yapay ortamlardır. Besi yerlerine; ortam, vasat, kültür ortamı, kültür vasatı, kültür besi yeri gibi isimler de verilmektedir. Besiyerleri, mikroorganizmaların geliştirilmesi, izolasyon, identifikasyon, sayım, duyarlılık testleri, sterilite testleri, klinik örneklerin incelenmesi, gıda, su ve çevre kontrolleri, biyolojik ürünlerin elde edilmesi, antibiyotik ve vitamin analizleri, endüstriyel analizler vb. gibi çok farklı amaçlara yönelik olabilir Tüm mikroorganizmalar için uygun tek bir besi yeri formülü yoktur. Laboratuvarlarda, kullanım amacına, bileşimine, hazırlanış şekline göre uygun besi yeri seçilir. Besi yerleri bileşiminde mutlaka bulunması gereken maddeler:
Su, Karbohidratlar veya karbohidratlar bulunmadığı ya da yetersiz olduğunda proteinler gibi enerji kaynakları, Proteinler, peptonlar, amino asitler vb. organik bileşikler, KNO3, (NH4)PO4 vb. inorganik tuzlar gibi azot kaynağı maddeler, Vitaminler(özellikle B grubu), pürin ve primidin bazları, amino asitler gibi üreme faktörleri, Na, K, Cl, P, Ca, Fe, Mg, S vb. makro elementlerle, Zn, Mg, Br, Mo, Co, Cu, B
vb mikro elementler yani minerallerdir. [13]
9
6)Saccharomyc es cerevisiae nasıl bir mikroorganizmadır, özellikleri nelerdir?
Saccharomyces cerevisiae, tomurcuklanan bir maya türüdür. Eski çağlardan beri bira, şarap ve ekmek yapımında kullanılmasında dolayı en önemli maya türü olduğu söylenebilir. Moleküler biyoloji ve hücre biyolojisi alanlarında prokaryotlar arasında model organizma olarak ele alınan Escherichia coliye benzer şekilde, üzerinde en çok çalışılmış model ökaryotik organizmalar arasında da bu maya türü yer alır. Saccharomyces cerevisiae hücreleri yuvarl ak veya yumurta biçimlidir, çapları 5-10 mikrometredir. Tomurcuklanma olarak bilinen bir bölünme yoluyla ürer. S. cerevisiae hücre döngüsünün araştırılmasında çok kullanışlıdır, çünkü hem kültürlenmesi kolaydır, hem de, bir ökaryot olduğundan dolayı hayvan ve bitkilerin karmaşık hücre içi yapılarına sahiptir. Ökaryotlar arasında genomunun dizini ilk okunmuştur .[14] İnsan genomuna ortak yanları çok az olmasına rağmen çok önemli bir özellikleri vardır; •
Ökaryotik hücrelerdir.
•
S.cerevisiae hücrelerinin bölünmesi insan hücrelerine benzer bir şekilde olur.
•
Hızlı ve ucuz bir şekilde üretilir.
•
Patojen değildir.
•
İzole edilmesi kolaydır.
•
Birçok marker‟a sahiptir
•
Haploid ve diploid fazlara sahiptir.• S.cerevisiae nin genomu 1997 yıl
•
S.cerevisiae nin genomu 1997 yılında tamamlandı.
•
Maya hücreleri, genlerin birbirleriyle olan fonksiyonel ilişkilerini incelemekte ve yeni ilaçların denenmesinde kullanılır.
12 milyon baz çiftinden oluşan genoma ve 6000 gene sahiptir . [14]
10
Kaynaklar: 1) Keuler, M. 1993. Identification and control of a fedbatch process, Ph. D. Thesis, Technische Universiteit Eindhoven, Holland. 2) Biyoteknoloji
2008-2009,
Ayşegül
TOPAL
SARIKAYA,
İstanbul
Üniversitesi,Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü. 3) Bailey, J. E., and Ollis, D. F. 1986. Biochemical Engineering Fundamentals, 2. Edition,Mc Graw Hill, Newyork. 4) Merchuk, J.C. and Siegel, M.H. 1988. Air-lift reactors in chemical and biological, technology, J. Chem. Tech. Biotechnol., 41, 105-120 5) Emre İ. 2007, Yarı-Kesikli Fermantasyonda Besleme ve Havalandırma Profillerinin Optimizasyonu, Ankara Üniversitesi-Fen bilimleri Enstitüsü Doktora tezi, Ankara 6) http://biyoreaktor-nedir.cix1.com/ 7) http://www.researchgate.net/publication/27569066_MODEL_CONTROL_(IMC)_OF _A_) 8) http://www.belgeler.com/blg/2k1f/urun-gereksinimi 9) http://www.scribd.com/doc/37987476/biyoreaktor 10) http://tr.wikipedia.org/wiki 11) http://tr.wikipedia.org/wiki/Mikroorganizma 12) http://www.hayatnotu.com/haber/derslerodevler/bakterilerde-ureme-nasil-olur.html http://tr.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae 13) Prof. Dr. A. Kadir Halkman, Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları, Ankara Üniv. Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, 2005 14) http://yunus.hacettepe.edu.tr/~mergen/sunu/s_model.pdf
11
