Bioquímica de Harper Índice de Capítulos Capítulo 1: Bioquímica y medicina Capítulo 2: Biomoléculas y métodos bioquímicos Capítulo 3: Agua y pH
Sección I
Estructura y funciones de proteínas y enzimas Capitulo 4: Aminoácidos Capítulo 5: Péptidos Capítulo 6: Proteínas. Estructura y función Capítulo 7: Proteínas. Mioglobina y Hemoglobina Capítulo 8: Enzimas. Propiedades generales Capítulo 9: Enzimas. Cinética Capítulo 10: Enzimas. Mecanismos de acción Capítulo 11: Enzimas. Regulación de la actividad enzimática
Sección II
Bioenergética y el metabolismo de carbohidratos y lípidos Capítulo 12: Bioenergenética. La función del ATP Capítulo 13: Oxidación biológica Capítulo 14: Cadena respiratoria y fosforilación oxidativa Capítulo 15: Carbohidratos de importancia fisiológica Capítulo 16: Lípidos de importancia fisiológica Capítulo 17: Panorama del metabolismo intermediario Capítulo 18: El ciclo del ácido cítrico. Catabolismo de la acetil-CoA Capítulo 19: Glucólisis y oxidación del piruvato Capítulo 20: Metabolismo del glucógeno Capítulo 21: Gluconeogénesis y control de la glucosa sanguínea Capítulo 22: Vía de la pentosa fosfato y otras vías del metabolismo de las hexosas Capítulo 23: Biosíntesis de ácidos grasos Capítulo 24: Oxidación de los ácidos grasos. Cetogénesis Capítulo 25: Metabolismo de ácidos grasos insaturados y de los eicosanoides Capítulo 26: Metabolismo de acilgliceroles y esfingolípidos Capítulo 27: Transporte y almacenamiento de lípidos Capítulo 28: Síntesis, transporte y excreción del colesterol Capítulo 29: Integración del metabolismo y el suministro de energéticos tisulares
Sección III
Metabolismo de proteínas y aminoácidos
Capítulo 30: Biosíntesis de aminoácidos no esenciales en la nutrición Capítulo 31: Catabolismo de proteínas y del nitrógeno de aminoácidos Capítulo 32: Catabolismo de los esqueletos de carbono de aminoácidos Capítulo 33: Conversión de aminoácidos en productos especializados Capítulo 34: Porfirinas y pigmentos biliares
Sección IV
Estructura, función y replicación de las macromoléculas informativas Capítulo 35: Nucleótidos
Capítulo 36: Metabolismo de los nucleótidos de purina y pirimidina Capítulo 37: Estructura y función de los ácidos nucleicos Capítulo 38: Organización y replicación del DNA Capítulo 39: Síntesis, procesamiento y metabolismo del RNA Capítulo 40: Síntesis de proteínas y el código genético Capítulo 41: Regulación de la expresión genética Capítulo 42: Tecnología del DNA recombinante
Sección V
Bioquímica de la comunicación extracelular e intracelular
Capítulo 43: Membranas. Estructura, ensamble y función Capítulo 44: Acción de las hormonas Capítulo 45: Hormonas de hipófisis e hipotálamo Capítulo 46: Hormonas tiroideas Capítulo 47: Hormonas que regulan el metabolismo del calcio Capítulo 48: Hormonas de la corteza suprarrenal Capítulo 49: Hormonas de la médula suprarrenal Capítulo 50: Hormonas de las gónadas Capítulo 51: Hormonas del páncreas y vías gastrointestinales
Sección VI
Tópicos especiales
Capítulo 52: Estructura y función de las vitaminas hidrosolubles Capítulo 53: Estructura y función de las vitaminas liposolubles Capítulo 54: Nutrición Capítulo 55: Digestión y absorción Capítulo 56: Glucoproteínas Capítulo 57: Matriz extracelular Capítulo 58: Músculo Capítulo 59: Proteínas plasmáticas, inmunoglobulinas y coagulación sanguínea Capítulo 60: Eritrocitos y leucocitos Capítulo 61: Metabolismo de xenobióticos Capítulo 62: Cáncer, oncogenes y factores de crecimiento
Bioquímica y medicina Roberf K. Murray, MD, PhD
INTRODUCCIÓN La bioquirnica es la ciencia que estudia las diversas moliculas que ce presentan en las células y organismos vivos, asi como las reacciones quimicas que tienen lugar en los mismos. Una comprensibn más completa de todas 1% manifestaciones de la vida, demanda el conocimiento de la bioquímica. AdemBs, los estudiantes de que adquieren una base siilida de la bioquimica estarhn en una posición firme para enfrentarse, en la práctica y la investigación, a los dos intereses centrales de las ciencias de la salud: 1 ) la comprensión y conservación de la salud y 2) la apreciación y tratamiento eficaz de la enfermedad.
La bioquímica es la química de la vida La bioquimica puede definirse de manera más forma1 como la ciencia que se ocupa de la base química de la vida (del griego, bios: vida). La cblula es la unidad estructural de los sistemas vivientes. La concfderaci0n de este concepto conduce
a una definicion funcional de la bioquímica como la ciencia que se ocupa de los constituyentes químicos de las células vivas y de las reacciones y procesos que experimentan. Con esta definición, la bioquimica abarca extensas heac de la biología celular, la biología molecular y la genkitica moIecular.
El objetivo de la bioquímica es describir y explicar, en términos moleculares, todos los procesos químicos de las células vivas El interés principal de la bioquimica es la comprensión completa a nivel rnolecular de todos los procesos
químicos relacionados con las células vivas. Para lograr este objetivo, los bioquimicos han necesitado aislar las numerosa moléculas de que se componen las cé1u]a1 determinar sus e s t ~ - ~ c t u Yr a analizar la forma en que funcionan. Para dar un e j e m ~ l o10s ~ e~füermsde numerosos bioquímicos Para comprender la base mOlecular de la -proceso quc acompaiia de preferencia, pero no de manera exclusiva, a las células musculares- han emprendido la purificación de muchas moléculas, siniples y complejas, seguida por detallados estudios de esh-uctura-funcibn. A iraves de estos esfuerzos, se han encontrado algunas de los fundamentos muleculares de la contracción muscular. Un obietivo adicional de la bioqliímica es intentar la comprensión del origen de la vida; este fascinante tema aún se encuentra en la etapa embrionaria. El campo de la bioquimica es tan amplio como la vida misma. Dondequiera que hay vida, se prodiicm procesos quimicos. Los bioquimicos los estudian en microorganismos, vegetales, insectos, peces, aves, mamíferos y en el ser humano. Es lbgico que los estudiantes de ciencias biomédicas centren su interes en la bioquimica de los dos últimos grupos. No obstante, una apreciaci6n respecto a formas de vida menos complejas tiene a menudo relevancia directa con la bioquimica humana. Por ejemplo, las teorías contemporaneas sobre la regulación de las actividades de genes y enzima5 en el ser humano provienen de estiidios pioneros en pan enmohecido y bacterias. El campo del DNA recombinante surgió de estudios en bacterias y sus virus; su rapidez para la multiplicacibn y la facilidad para extraer su material genético los hace adecuados para análisis y manipulaciones gentticas. El cor,ocimiento logrado por el estudio de genes virales causantes de ciertos tipos de cáncer en animales (oncogenes viraIes) ha permitido avanzar profundamente-en el modo en que la célula humana se torna cancerosa.
2
Bioquim icu d~ JIarper
(Capitulo I )
El: conocimiento de la bioquímica es esencial en todas las ciencias de la vida, incluyendo la medicina
las ciencias de la salud, en particular médicos, son la comprensión y mnservacibn de la salud y la comprensión y tratamiento eficaz de las enfcmedades. !,a hioquimica tiene un impacto tremendo en ambos. De hecho, la interrelación entre bioquimica y medicina es un amplio camino de doble sentido. Los estudios bioquimicos han ilurriinado numerosos aspectos de salud y enfermedad y, de manera inversa, cl estudio de éstas ha abierto areas nuevas en bioquimica. En la figura 1-1 se muestran algunos casos de esta via de doble dirección. Por ejemplo, fue necesario el conocimiento de la estructura y Ilinción de las proteinas para dilucidar la sencilla diferencia bioquimica entre la hcmoglnbina normal y la de las células falcifonnes. Por otra parte, el analisis de esta última ha conwibuido de mancra significativa a la comprensibn de la estructura y función dc la hemoglobina normal y de otras proteínas. Podrian citarsc ejemplos análogos del beneficio reciproco entre bioquimica y medicina para los demhs pares de conceptos mostrados en la figura 1 -1 . Otro ejemplo es el trabajo pionero de Garrod, mkdico inglCs, a principios de este siglo. Estudió pacientes con cierto número de trastornos relativamente raros (alcaptonuria. alhinismo, pentosuria y cistinuria; descritos en loc últimos capítulos) y estableció que su origen era genciico. Garrod designb a estas enfemcdades como errores congdnitos del metabolismo. Sus punros de vista proporcionaron una base importante para el desarrollo del campo de la genktica bioquímica humana. La relaciún entre medicina y bioquímica tiene implicaciones filosóficas importantes para la primera. Hasta donde el tratamiento medjco se asiente en el conocimiento de la bioquimica y otras ciencias básicas pertinentes (como fisiología, microbiologia y nutricibn), la práctica de la medicina tendrá una base racional que puede acomodar nuevos conocimientos. Esto contrasta con culros de saliid no ortodoxos, que a menudo se elevan a poco más que un mito sin fundamento intelectual alguno.
Los fundamentos de la genética se apoyan en la bloquímica de los ácidos nucleicos; a su vez, los enfoques geneticos han dilucidado numerosas áreas de la bioquímica. La fisiologia, estudio de la función corporal, se traslapa casi por completo con la bioquimica. La inmunoIogía, por su parte, emplea numerosas técnicas bioquimicas y muchos de los aspectos inmunol0gicos han encontrado uso extenso eiitre bioquimicos. Asimismo, la farmacologia y la farmacia se apoyan en un co~iocimientosblido dc bioquimica y Ilsiologia; en particular, la mayoría de los firmacos son metabolizados por reacciones catalizadas por enzimas y las comple,jas interacciones entre fármacos se comprenden mejor desdc el punto de vista bioquimico. También los venenos actúan por medio de rcaccjones o procesos bioquimicos y este es el terna de la toxicologia. Cada vez más se emplean enfoques bioquimicos en el estudio de aspectos básicos de la patología (estudio de la enfermedad}, como inflamación, lesión celular y cancer. Muchos profesionales en rnicrobiologia, 7001ogía y botanica emplean métodos bioquímicos casi de manera exclusiva. Estas relaciones 110 sorprenden, debido a que la vida como se conoce dcpende de reacciones y procesos bioquirnicos. De hecho, han caído las viejas barreras entre las ciencias de la vida y la bioquirnica se toma cada vez mas su lenguaje común.
Una relación recíproca entre la bioquímica y la medicina ha estimulado adelantos mutuos Como se estableciii al principio de este capítulo, las dos preocupaciones principales de los estudiosos de
Actdos nucEelc05
geneticas
Proteína
Anemia de células falciforme5
t I t
Lípidos
Aterosclerosis
Carbohidratos
Diabetes
sacarina
MEDICINA
Figura 1-1. Ejemplos de la via de doble dirección (interrelación) que existe entre la bioquímica y medicina. El conocimiento de los Compuestosmostradosen la porci6n superior del diagrama ha esclarecido las enfermedades mencionadas en la porcion inferior; de manera inversa, análisis de los trastornos mostrados abajo han despejado numerosas áreas de la bioquimica Debe aclararse que la anemia de cklulas falciformes es una enfermedad genetica y que tanto la aterosclerosiscomo la diabetes sacarina tienen componentes geneticos
Bioquímicuy medicina
LOS PROCESOS BIOQU~MICOS NORMALES SON LA BASE DE LA SALUD La Organización Mundial de la Salud (OMS) define a la salud como un estado de "bienestar fisico, mental y social completo y no unicamente fa ausencia de enferrnedad o dolencia". Desde un punto de vista bioquimico estricto, puede considerarse a la salud como la situación en donde las miles de reaccioiies intra y extracelulares que tienen lugar en el cuerpo proceden a velocidades adecuadas a su supervivencia máxima en el estado fisialogico. Sin embargo, este es un concepto sumamente reduccionista; es necesario enfatizar que atender la salud de los pacientes no sólo requiere de un extenso conocimiento de los fundamentos biológicos sino tambien de principios sociales y psicolbgicos.
Cuadro 1-1. Principales causas de enfermedad. Tcd a s las cairsiisenunieradas actiian bajo tia dt! varios rnecanisnl o s bioquírnicos t la o t:n el cuerpo* ..
1.
2. 3. 4.
5.
6.
7.
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Agcnt cs f i s i c o s - ~ r a i i a t i s m or n e c á n i c o ~ tcinper aturas extremas, cambios repentinos cn la prcsióri atmosférica, radiacibn, choque elkctrico Aeente quirnicos y famacos: Ciertos comnuestos tvxicoc,, agentes terapéutica: ;, etcétera Agente hiológicos: Vinis. ri ckettsias, b lngos, fo rmas superiores de p:!~rásilos . ~ 5 i i c n c i de a o~igeno:Falta de Tumrnlsrro sangulneo, deficiencia en la capacidad sanpiiinea para t~mspori :ar oxigeno, intouicaciiin de las enzimns oxidativas Gen6tica: Alteraciones congenita~o rn,~ ,, oiies ininuiioliigicas: Anafilaxia nd nunológic; 1 iilihrio nut riconal: DÍ:ficiencia r :S,
-
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La investigación bioquimica tiene impacto en la nutrición y la medicina preventiva
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Dtsequilibrio en docrino: 1>eficiencias o excesos hurmonates -* i\dapiado con autori7acion ae KObblnS SL,Colram RS,Kizmm
8.
V Tlie Pafhologic Rasis ojDtseasr, 3rd ed. Saunders, 19R4
Un prerrequisito importante en la conservaci6n dc la salud es la ingestión óptima de cierto numero de compuestos qufmicos; de entre ellos los principales son vitaminas, varios aminoficidos, &cidos grasos, minerales y agua. Dado que el objeto de la bioquimica y la nutrición es precisamente el estudio de los diversos aspectos de estos compuestos, hay una selaci~n estrecha entre las dos ciencias. AdemBs, con la intenci6n de restringir 30s costos en aumento del cuidado médico, se enfatizan los esfiierzos sistemáticos para conservar la salud y anticiparse a la enfermedad, es decir, la medicina preventiva. Por tanto, cada vez tiende a considermsc m6s el aspecto nutricional, por ejemplo, en la prevención de aterosclerosis y c h c e r . El conocimiento de la nutricibn depende en alto grado de la bioquimica.
Todas las enfermedades tienen una base bioquímica Las enfermedades son manifestaciones de anorrnatidades de molécu tas, reacciones quimicas o procesos. En el cuadro 1-1 se enumeran tos principales factores como causa de padecimientos en el ser humano y los animales. Todos ellos afectan a una o más reacciones quimicas criticas Q rnaleculas del cuerpo.
Los estudios bioquimicos contribuyen al diagnóstico, pronóstico y trataltiiento Existe un caudal de información respecto al uso de la b i a q u i m i c a e n la prevención, d i a g n ó s t i c o y tratamiento de la enfermedad; muchos casos se citarhn
a Io Eargo del libro. N o obstante, aquí se presentan s61o siete ejemplos breves para ilustrar la envergadura del tema y estimular e1 interés del lector. I) Los seres humanos deben ingerir cierto numero de rnol&culasorgánicas comple,ja~llamadas vitaminas para conservar la salud. Si en la dieta hay deficiencia de determinada vitamina, se comprometen las reacciones en que participan. Esta situación puede manifestarse como una enfermedad por deficiencia como escorbuto o raquitismo (resultado de Ingestidn insufíciente de vitamina C y D, respectivamente). Dilucidar la actividad de las vitaminas o sus derivados con acción biolbgica ha sido una inquietud constante de bioquimicos y nutri6logos desde el principio del siglo. Una vez que el estado patologico por deficiencia de una vitamina se estableció, es racional tratarla mediante la administracidn de la vitamina apropiada. 2) El hecho de que numerosos vegetales en África son deficientes en uno o más aminohcidos esenciales (es decir, aminoacidos que deben ingerirse con los alimentos para conservar la salud) ayuda a explicar la desnutrición debilitante (kwashiorkor) que padecen quienes dependen de esos vegetales como fuente principal de proteínas. El tratamiento de deficiencias de aminoácidos esenciales es racional pero, desafortunadamente, n o siempre es posible. Consiste en proporcionar una alimentacibn balanceada que contenga cantidades suficientes de tales aminoácidos.
3) Los esquimales Tnuit de Gruenlandia consumen cantidades abundantes de aceites de pescado ricos en ciertos acidos grasos poliinsaturadosy se sabe que su concentración plasrnática de colesterol es baja, lo mismo que la frecuencia de aterosclerocis. Estas observaciones han estimulado el interés en el uso de esos Bcidos para reducir los valores plasrná~icosde colesteral. Las enfermedades por deficiencia vitamínica o de aminoácidos esenciales son ejemplos de desequi librios nutricionales (cuadro 1 -1 ). La aterosclerosis puedc considerar~eun desequilibrio de la nutricjon, pero tambikn intervienen otros factores (corno el genético). 4) El estado conocido como fcnilcetonuria si no se trata, puede cotiducir en la infancia a retraso mental grave. Desdc 1953, se conoce la base bioquimica de este trastorno, el cual está. detcrminado gencticarnente y se debe a la actividad escasa o nula de la enzima que convierte el aminoácido fenilalanina en tirosina. Esto, a su vez, eleva la concentración sanguínea de fenilalanina, lo que dafia al sistema nervioso central en desmollo. Cuando se descubrió la naturaleza del daAo bioquímico, se trató la enfermedad haciendo que los lactantes afectados ingirieran una alimentación pobre en fenilalanina. Una vez que se dispuso de pruebas bioquimicas selectivas para diagnosticar feni lcetonuria al nacimiento, pudo instituirse el tratamiento desde el principio en el niño afectado. 5 ) La fibrosis quistica es una enfermedad genMica común de las glindulas exocrinas y las glhndtilas sudoríparas ecrinas. Se caracteriza por secseciones anomalmente viscosas que obstruyen los conductos secretores del phncreas y los bronquiolos. Ademhs. los pacientes con esta afección muestran una concentración elevada de cloruro en el sudor. A menudo, las víctimas mueren a temprana edad por infecciones pulmonares. En 1989, se inform6 sohrc el aislamiento y la secuencia completa del gen causante de esta enfermedad. El gen normal codifica una proteína transrnembrana (regulador de la conductancia transmembrana en la fibrosis quísticaj formada de 1480 arninoacidos, la cual funciona como un conducto del cloruro. En 70% de los pacientes con la enfermedad se ha observado una deleción de tres bases en el gen, lo cual hace que en la proteina transmembrana falte el aminoacido 508, un residuo de fenilalanina. Se esth determinando la forma en que esta omisión altera la hnciún de la proteína transmembrana con produccion de moco demasiado denso. Este importante estudio facilitarii la identificacion de portadores del gen de la fibrosis quistica y se espera que conducirá a un tratamiento rnás racional dc la enfermedad que el existente hasta ahora, Por ejemplo, quizfi será posible desarrollar fhrrnacos que corrijan la anor-
malidad en la proteina transmembrana; de igual modo, podría introducirse un gen normal en las células pulmonares por manipulaciiin genética. Ida fenilcetonuria y la fibrosis quistica son ejemplos de enfermedades g e i a i c a s (cuadro 1-1 ). 6) El análisis del mecanismo de accihn de la toxina bacteriana que causa el cálera ha proporcionado infonacibn importante sobre el modo en que ocurren las manifestaciones clínicas de la enfermedad (diarrea copiosa y pérdida de sal y agua). 7) El hallazgo de que los mosquitos transmisores de parásitos (plasmodios) que causan el paludismo pueden desarrollar resistencia bioquímica a la acción de insecticidas, tiene consecuenciac importantes s o b r e los intentos para erradicar esta enfermedad. Este caso y el anterior, son ejemplos de enfermedades causadas por agentes bioliigicos (cuadro 1-1).
Muchos estudios bioquirnicos aclaran mecanismos patológicos y, a su ver, las enfermedades inspiran estudios en áreas especificas de la bioquímica Las observaciones iniciales reali~adaspor el mhdico inglés Archibald Garrod en un grupo pequeño de errores congknitos del metabolismo al principio del decenio de 1900, estimulb la investigación de las vias hiliqiiimicas afectadas en estas alteraciones. Los esfuerzos para comprender la base de la enfermedad genktica conocida como hipercolesterr)lemia familiar, que lleva a aterosclerosis grave a edad temprana, condujeron al notable progreso en el conocimiento de los receptores celulares de los mecanismos de captación ddel colesterol por las cÉlulas. Los estudios actuales de los onrogenes en células cancerosas han dirigido la atención a mecanismos moleculares que interv-ncn en el control de la inultiplicacibn celular normal. Estos y otros numerosos ejemplos posibles ilustran la forma en que el estudio de la enfermedad puede abrir areas enteras de la funci6n celular para la investigación bioquimica bhsica.
ESTE TEXTO AYUDARÁ A RELACIONAR CONOCIMIENTOS BIOQU¡MICOS CON PROBLEMAS CL~NICOS En cl texto se encuentran dispersas, breves descripciones de los mecanismos bioquímicos en que sc basan muchas enfermedades. En particular, las capítulos 63, 64 y 65 se refieren a las bases bioquimicas de varias enfermedades importantes. En el apcndice se analizan brevemente algunos conceptos basicos para interprctar los resultados de las pruebas bioquimicas de labo-
Bioyuimicu y medicina
5
Cuadro 1-2. Algunas investigaciones bialhgicas y pruebas de laboratorio aplicadas al estudio de las enfermedadi
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al tratamiento
ratorio y se presenta una lista de las mas empleadas junto con el intervalo en el cual varian sus valores normales. El propbsito global es animar at lector a dar a SU ~0nocitTlient0de bioquimica U n USO ~ l i n i c 0eficaz.
Las inve~tigacionesbioquimicas en relacion con las enfermedades se resumen en el cuadro 1-2. En
varias secciones de este libro se presentan ejemplos de muchos de estos usos.
RESUMEN La bioquimica es la ciencia que se ocupa del estudio de las diversas molkculas que componen las células y organismos vivos así c o n o de sus reacciones quimicas, Debido a que la vida depende de estas reacciones, la bioquimica se ha convertido en el lenguaje b;isico de todas las ciencias biológicas. bioquímica se interesa en la totalidad de las forma? vivientes, desde virus y bacterias, relativamente simples, hasta les cornpIejos seres humanos.
-
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Ejemplo
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1. Revelar, ;I ,,u,, Au,,uu,,,L,,,ules y los mccanicmos dc la enfermedad 2. Sugerir tratamientos racionales de las enfi con base en las causas mencionadas antes ( 3. Ayudar al diagnóstico de enfermedades especirlcas 4 , Actuar colmo pruebas para deteccibn y dlagnóstid:O tcmpranci dc ciertas cnfemedades 5 . Ayudar ein la vigilancia de le. evolucifin (por qemp,lo ,,,,,,,,,cien, empeoramiento. remisibn o recaid,,111 de ciertas en remidades 6. Ay udar a evaluar la respuesta dc las cnfcrmedad
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La bioquimica y la medicina tienen una relacion estrecha. La salud depende del equilibrio armonioso de [as reacciones bioquimicas que tienen lugar en cl ,,,mo,. y- la enfermedad en biornold~ulas, reacciones bioquimicas o procesos biológicos, Los adelantos en el conocimiento bioquirnico han iluminado numerosas áreas de la medicina. De modo inverso, a menudo el estudio de las enfermedades ha revelado aspectos previamente no sospechados de la bioquimica. Con frecuencia, un enfoque bioquímico es fundamental para aclarar las caus& de Ias enfermedades e idear terapéuticas apropiadas+ EE uso racional de varias pruebas bioquimicas de laboratorio es un componente integral del diagnhstico Y vigilmcia Un conocimiento sólido de la bioquimica y de otras disciplinas bQsicasrelacionadas es esencial para la practica racional de la medicina y ciencias de la salud afines. I
REFERENCIAS Garrod AE: Inhorn errors of metabolism (Croonian Lec-
tures). Lance[ 1908;2: 1.73, 142,2 14. Kornberg A: Basic rssearch: The lireline of medicine FASBB J 1992:6:3143.
Scriver CR et al. (editors): The Melabelfc andiIhlecular Bases nJ Inherited Disease, 7th cd McGraw Hill. 1995. Willilims DL, Marks V: Scient13c Fooundaiions of Biochemi.~tryin Clin~calPractice, 2nd ed. Bunenuorth1 leinemann, 1994.
RiornoAéculas y métodos bioquímicos
Este capitulo tiene cinca objetivos. El primero se refiere a la camposici6n del cuerpo y a las principales clases de moléculas que se encuentran en 61. El estudio de estas mol&culasconfonnagrnn parte de este texto. La ctluIa es la principal unidad estructural y funcional de la biología. La mayor parte de las reacciones químicas dentro del cuerpo tienen lugar en las c6lulas. Por tanta, el segundo objetivo es dar una descripci6n concisa de los componentes de las c&lulas y de la forma en que pueden aislarse; los detalles de las funciones de estos componentes constituyen gran parte de la estructura del libro. El tercer objetivo concierne al hecho de que la biquimica es una ciencia experimental. Es importante comprender y apreciar el enfoque experimental y los mbtodos usados en bioquimica, para permitir que su estudio se convierta en un ejercicio rutinario del aprendizaje. Más aún, la bioquímica no es un cuerpo inmutable de conocimiento, sino un campo en evolución constante. Los adelantos, como en otras lireas de la bioquímica, dependen de la innovación en el enfoque experimental y tecnológico. El cuarto objetivo consiste en resumir de manera breve los principales logros obtenidos en bioquímica. La visibn concisa de la ciencia, que se presentad aquí, ayudará a impartir en el lector un sentido de la direccibn global del resto del texto. El quinto objetiva se dirige a destacar lo poco que conocemos en ciertas Areas, por ejemplo, sobre el desarrollo, la di ferenciacidn y funcibn cerebral, el cáncer y muchas otras enfermedades humanas. Quizá esto sirva de estimulo a algunos lectores para contribuir a la investigacibn de estas Areas.
EL CUERPO HUMANO SE COMPONE DE UNOS CUANTOS ELEMENTOS QUE COMBINADOS FORMAN UNA EXTENSA VARIEDAD DE MOLÉCULAS Los principales elementos san carbono, hidrágeno, oxígeno y nitrógeno Se ha determinado la composición elemental del cuerpo humano y en el cuadro 2-1 se muestran los principales resultados. El carbono, oxígeno, hidrbgeno y nitrógeno son los constituyentes principales de casi todas las biomol&culas.El fosfato es un componente de los Iicidos nucleicos as1 como de otras moléculas y tambikn se distribuye ampliamente en su forma ionizada en el cuerpo humana. Por su parte el calcio tiene una funci6n importante en innumerables procesos biolbgicos y sobre él esta enfocada buena parte de la investigacibn. Los elementos enumerados en la tercera columna desempefían diversas funciones. Muchos de ellos se manejan casi diariamente en la prhctica mkdica al atender a pacientes con desequilibrios electroliticos (K', Na', C1- y Mg2+},anemia por deficiencia de hierro (Fe2+) y enfermedades de la tiroides (1-1.
Las cinco principales biomolécufas complejas son DNA, RNA, proteínas, polisacaráridos y Iípidos complejos Como se muestra en el cuadro 2-2, las principales biomol~culascomplejas encontradas en las células y tejidos de los animales superiores (incluyendo al ser humano) son DNA, RNA, proteínas, polisacfiridos
Biuqriim ica de Hrrrper
8
Cuadro 2-1. Composición ekemental aproximada del cuerpo humano (con base en peso seco)* -
Carbono
50
Ovigeno I lidrógeno N itrógcno
Azufre
alcio F.cjsforo
-- 0.00005 * Reproducido con autorizacibn de West ES. l o d d WR. T?xzbook ofRiochcmist~.3rd e d . Macmillan, 1961.
ques estructurales de los Iipidos, aunque éstos no son polimeros de acidos grasos. Al DNA, RNA, proteinas y polisacaridos se les conoce como hiopolimeros debido a que esthn compuestos de unidades repetidas de sus bloques estructurales (los mon6meros). Las rnol~culasantes mencionadas constituyen esencialmente el "ingrediente vital" de este texto; la rnayor parte se ocupa de describir sus características bioquímicas y las de sus bloques estructurales. Por lo general se encuentran las mismas moleculas complejas en los organismos inferiores, pero pueden diferir de los que se muestran en el cuadro 2-2. Por ejemplo, las bacterias no contienen giucogeno o triaci!gliceroles, pero poseen otros polisacaridos y Iípidos.
y lipidos. Lac moiéculac complejas se construyen a partir de biomoMculas simples, tainbien enumeradas. Los bloques estructurales del DNA y el RNA (Ilarnados colectivamente ácidos nucleicoc) son los desoxinucleótidos y los ribonucle6tidos, respcctivamente. Por su parte, las bases estructurales de las protehas con los arninoitcidos, mientras que los polisacaridos estan constituidos por carbohidratos simples; en el caso del glucógeno (polisacárido principal de los tejidos humanos), el carbohidrato es la glucosa. Los ácidos grasos pueden considerarse como los blo-
Proteínas, I ípidos, carbohid ratos, agua y minerales son los principales componentes del cuerpo humano Ya se mencionb cual es la composici6n elemental del cuerpo humano. Su composición quimica se muestra en el cuadro 2-3; proteina, grasa, carbohidrato, agua y minerales son los elementos principales. E1 agua coristituye la proporción mayor, aunque su cantidad varia ampliamente en los difcrentes tejidos. Su naturaleza polar y su propiedad de formar puentes de hidrogeno hacen al agua idealmente adecuada para su función como solvente en el cuerpo. En el capítulo 3 se presentan con mayor detalle las propiedades del agua.
Cuadro 2-2. Biomol&culas orghnicas comptejas principales de células y tejidos. Los &cidos nucleicos, proteinas y plisadridos son biopolimems, constrriidm a partir de las bases estructurales mostradas. Por lo general, tos lipidos no son biopolimaros y no bases estructurates todos tienen ácidos grasos como -. - .. -.
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La célula fue reconocida como la unidad fundamental de la actividad biológica por Schleidcn y Schwann y por otros pioneros como Virchow en el sigloXIX. Sin embargo, en los aRos posteriores a la Segunda Guerra
principales ~uncioni
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LA CÉLULA ES LA UNIDAD BÁSICA DE LA BIOLOG~A
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~ AminoAcidos ~ ~ Numerosas: ~ por ~ lo gene~ ral son las moEculas que
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Cuadro 2-3. Composici6n química normal d Sn que pesa 65 kg" . -. .-
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Proteínas
1
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' 4. I i 51I -- s .-i autor17ación de D:avidson SD, Parsmore R, d_
Milierales * Reproducido con
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1
1
branas y almaccnaje por tiempo prolongado dc energía como triacil-
aliccroles
Hrock JF: Iiuman ,l'uiri rion and Di ererrcs, 5th ed. Churchill Livingstone, 1973. El valor para el agua pucdc variar ampliamente entre los riircrentes tejidos, siendo tan bajo como 22 5% para e l hueso sin mtdula Además, el porcentaje dcf agua tiende a disminuir confunnc alimenta 13 grasa curpura)
Biomoléculas y métodos hioquímrcos * 9
Mundial, tres sucesos ayudaron al inicio de un periodo de actividad sin paralelo en la bioquimica y la biologia celular. Fueron: 1 ) la disponibilidad creciente del microscopio electrónico; 2) la introducci~nde rnktodos que permiten separar las células bajo condiciones relativamente poco agresivas de modo que se preserve su función: 3) el desarrollo y disponibilidad de una ultracentrifuga refrigerada de alta velocidad, capaz de generar fuerzas centrífugas suficientes para aislar los constituyentes de las celuias separadas sin sobrecalentarlos y, por tanto, sin desnaturali7arlos. El uso del microscopio electrónico reve16 muchos de los componentes ce!ularec que hasta entonces eran desconocidos o deficientemente observados, en tanto que la rotura de las células y la ultracentrifugación permitió su aislamiento y anhlisis in vitro.
Retículo endopllrsmico
h
Citoesqueleto
El hepatocito de rata muestra características comunes a muchas células eucariotas En la figura 2-1 se muestra un diagrama de la estrucmra de una ckIuEa hepatica (hepatocito) de rata; es
probabEe que ésta sea la célula m8s estudiada desde el punto de vista bioquímico, en parte por su disponibilidad en cantidades relativamente grandes, por su facilidad para fraccionarse y por la diversidad de siis funciones. El hepatocito contiene todos los organelos principales que se encuentran en [as células eucariotas (cuadro 2 4 ) ; es decir, niicleo, mitocondrias. retículo endoplásmico, ribosomas libres, aparato de Golgi, lisosomas, peroxisornas, membrana plasrnatica y ciertos elementos citotsque2eticos.
Para disgregar células y aislar moléculas intracelulares y organelos subcelulares se usan técnicas físicas Para estudiar con profundidad la funcidn de cualquier organelo, es necesario primero aislarlo en forma relativamente pura, sin contaminacion importante de otros organelos. El proceso habitual para conseguirlo se llama fraccionamiento subcelular y, por lo general, comprende tres procedimientos: extraccibn, homogeneización y centrifugaci6n. Gran parte de los trabajos iniciales en esta irea utilizaron higado de rata.
A. Extracción Como primer paso hacia el aislamiento de un organelo (o molécula) especifico, es necesario extraerlo de las cAulas en que se localiza. La rnayoria de los organelos y muchas ~iomoleculasson bastante Ihbiles y propensos a perder sus actividades biolbgicas. De acuerdo a ello, deben extraerse en condiciones poco agresivas
Membrana plasmalica
Peruxisoma
citoso1
Lisosoma
Figura 2-1. Representacibn esquematica d e una d l u l a hep8tica d e rata, con sus organefos principales
(es decir, usando soiuciones acuosas y evitando sitiiaciones extremas de pH, presibn osmótica y temperaturas altas). En realidad, muchos de los psocedimientos para aislar organelos se efectria aproximadamente entre 0 y 40 "C (por ejemplo, en un cuarto frlo o utilizando materiales conservados en hielo). A la temperatura ambiente puede haber pérdida significativa de la actividad, en parte por la acción de varias enzima5 digestivas (proteasas, nucleasas, etcktera), liberadas cuando se rompen las cdlulas. Una solución comun para la extraccion de organelos consiste en sacarosa 0.25 moVL (Esosmótica), ajustada a un pH de 7.4 con un amortiguador de hcido cIorhidrico-TRIS (tris [hidmimetil] am jnomewno), 0.05 moW, que contiene iones K' y Mg2' a concentraciones casi fisiol~gicas;a esta solución se le conoce con las siglas STKM (del ingles, Sucrosu, Tris, Kulium y Magnesiurn). No todos los solventes usados para la extraccibn son tan suaves como el STKM ; por ejemplo, para extraer lipidos y ácidos nucleicos se emplean solventes orghnicos.
10
Bioquimica de Harper
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(Cupitulo 2)
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Funcio'nes princi
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Mitoconorion -~ibosoma*
biut&nico d ~ h i d r o g ~ n ~ a Alta contenido de RNA
dirigida pc
lo c A ( t r r gosforilaci b n oxidativa-ASitio de la sínitesis protteí! icibn del mRNA a pro-
! teina) :f ículo endc
Glucosa.
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Li:
LoS rihosomas unidos a la mernbrama son un tanite de síntesis proteinica Siritesis de varios Iípidas Ox idación de n u m e ~ o s o s ~ e n ~ i 6 t i (c coist o c m m o _ i ~ 4 ~ o ~ io dc almacenaje de muchas hiilrolasas (e e alizan reacciones deg:radativas) .insporte dc molCculm dentro y tiuera dc las herencxa y comunicacibn interce Di:jtribucion intracelular de protein Reacciones de glucosilac:i6n Reacciones de sulfatación gradación iie ciertos ácidos gracos y amino iducción y degtadrtcíiin.-de - peroxido de h d ! crofilamentos, microtiÚbulos, filamentos intl u
ATPEI~
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Aparato de Golgi
Pe
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Cata! asa
Oxidasa del Qido iirica No tien!e marcadc + 'OS'
ieshidroge .. - -nasa Citosol* 1 En:zlmas-ae !a gtuco~isis,--síntesis de:-hcidos ". & * Un organelo se puedc dcfinir como una entidad. suba :eEulwquue está limiida oormembranav se aislarior ccntxifup aci6n a altas . ..
De acuerdo a Ia definicihn, los r i b m a 5 , ei crioesqueieto y ei citosoi no son organclos. Sin embargo, aqui se les considera junto con ellos dehido a que, por lo general. también se aislan p r centrifugacibn F'ueden ctasiiiicarse comcb entidades ci fracciones subcelulares Un organelo al sisl arse por un ciclo ii c ccetrifug aci6n diferencial rara vi2s: es puro; 1Jara obtener una fraccib n pura, habi tudmente eS necesario pnr lo menos, c ierto numerci de ciclos. fracciones de citoesqueleto se pi ieden recont xer por mii:roscopia el carxteristicñs que contiei1P"
Laq
B. Homogeneización Para extraer un organela (o biomolkcu1a) de las c&lulas, primero es necesario romperlas bajo condiciones suaves. Los 6rganos (hígado, rifion, cerebro) y las células que contienen se pueden separar de manera conveniente mediante el proceso de homogeneizacibn; éste consiste en girar manualmente o por medio de un motor, un agitador dentro de un tubo de vidrio de dimensiones adecuadas que contiene los fragmentos desmenuzados del &gano en estudio con un medio hornogeneizante apropiado como STKM. La rotacibn controlada del agitador ejerce una fuerza mechica en las dtulas y las rompe l i h d o sus constituyentes en la sacarosa. Resulta una suspensión que contiene muchos organelos intactos, la cual se conoce como homogenado.
C. Centn'fugacidn El subfraccionamiento del contenido de un homogenada por centrifugación diferencial ha sido una tkcnica de importancia capital en bioquimica. El mttodo
por análisis
oforesis de
S
clásico utiliza una serie de tres pasos de centrifugación diferencial, con velocidades sucesivamente mayores (figura 2-2) y cada uno produce un sedimento y un sobrenadante. El sobrenadante de cada paso es centrifugado en el siguiente. Este prmedimiento proporciona tres sedimentos, que son las fracciones nuclear, rnitocondrial y rnicrosbmica. Ninguna de las fracciones está compuestade organelos absolutamente puros. Sin embargo, se ha establecido con precisión por el uso del microscopio electrbnico y por mediciones de enzimas "marcadoras" adecuadas y de componentes químicos (por ejemplo, DNA y RNA) que los constituyentes principales de cada 1 de las 3 fracciones son nucleos, mitocondrias y microsomas, respectivamente. Una enzima o un compuesto químico "marcador" es aquel que esta casi exclusivamente confmado a un organelo particular, corno la fosfatasa hcida en los lisosomas y el DNA en el núcleo (cuadro 2 4 ) . Por tanto, sirve para indicar la presencia o ausencia, en una fracción determinada, del organelo en el que esth contenido. La fraccibn microsbmica (mi-
Biomol~culusy métodos biquimicos
-
Sobrenadante (1)
15 o00 g x 5
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Sobrenadante (3)
min
P
Fraccibn
Fraccibn microsbmica
nuclear
Figura 2-2. Esquema de separacibn de fracciones cubceluTares por centrifugaeibn diferencial. fl tejido hornogeneuado (por ejemplo, hepfitico) se sujeta primero a centrifugacibn a bala velocidad para obtener la fraccidn nuclear (que contiene tanto núcleo como dlulas enteras) y el sobrenadante (1). Este ultimo se decanta y sujeta a centrifugacion a veloadad intermedia para producir la fraccibn mitocondr~af(que contiene rnitocondrias, lisosomas y peroxisomas) y el sobrenadante (2) este se decanta y sujeta a centrifugacibna alta velocidad para obtener la fracción microsórnica (que contiene una mezcla de ribosomas libres y reticuio endoplAsmico liso y rugoso) y una soiucibn final clara, el sobrenadante (3). Este último corresponde aproximadamente al citocol o savia celular. Modificando de varias maneras el mktodo, por lo general, es posible aislar mda organelo en forma casi pura
crosomas) contiene principalmente una mezcla de
reticulo endoplásrnico liso, retículo endopliismico rugoso (es decir, que tiene adheridos ribosomas) y rEbosornas libres. E! contenido del irltimo sobrenadante corresponde a la savia celular (citosol). Las modificaciones a este proceso bácico, que utilizan medios diferentes de homogeneizacibn o protocolos distintos de centrifugacion (por ejemplo, el uso de gradientes, continuos o discontinuos, de sacarosa), han pem itido el aislamiento, en fonna más o menos pura, de todos los organelos ilustrados en la figura 2-1 y enumerados en el cuadro 2 4 . El esquema descrito anteriormente es aplicable en tkrminos generales a la mayoría de los 6rganos y las dlulas; sin embargo, los fraccionamientos celulares de este tipo deben ser valorados con mediciones de enzimas o de compuestos químicos marcadores y por el rnjcroscopio electrónico, hasta que el procedimiento global pueda considerarse estandarizado. La importancia de los estudios d e fraccionamiento subcelular en el desarrollo de la bioquímica y la biologia celular, no se exagera por su enfoque experimental y amplio uso, constituye una parte fundamental en el estudio de las funciones de los organelos celulares. La infomaci6n de estas funciones, resumida en el cuadro 2 4 , representa uno de los mayores logros de la investigac i 6n bioquimica (vkase despubs).
El enfoque experimental tiene tres componentes Los componentes principaEes del enfoque experimental son tres: 1) el aislamiento de biomoldculas y organelos (vdase Centrifugación, antes) contenidos en las células; 2) la deteminacibn de la estructura de las biomoléculas, y 3) el aniilisis, utiIizando diversas preparaciones, de la funcion y el metabolismo (es decir, sintesis y degradacibn) de las biornoltculas.
El enfoque experimental requiere del aislamiento de biomoléculas Como en el caso de los organelos, conocer la funci6n de cualquier biomoidcula requiere que primero se le aisle en fonna pura. En el cuadro 2-5 se resumen los mktodos principales empleados para separar y purificar biomolkculas. Aquí no se detall&, pero algunos se explicarán de modo breve en otras partes del libro. Para purificar una biomol&culase necesita casi siempre una cornbinaci6n de mitodos hasta lograr la homogeneidad (la forma pura sin contarninacibn por cualquier otra biomolécula). Es importante apreciar que los adelantos en bioquimica dependen del desarrolIo de ttscnicas nuevas
C u a d r o 2 -5. Prin cipales nmbtodas risados p ara separar y purificar biamoléc:ulas. Mu chos de e 110s son adecu:ados paríi analiza t los comr)orientes i4 "e 1 -- -... 1 - v eii _ - virus ..-existen en ius extractos celulart.~ matcriales bioq uimicos. El uso en secuenciaI de varias d e estas tbcnicas permiitirA, por 10 general1, la purifícacihn de In mmJaJ,,s ,a de las bilirliurrcuid~.Para maY ores deta lles respt: ~ f a cadla uno de los rnétodos d e investig,aci6n bioquimica, el lector d ebe dirigiirse sI los texto1s especiallimdos . ..-
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Fraccionarniento srli no (por ejemrnyilo, prec sulfato dc:amonio) Cromatogt-afia
En papel Por intercambio ibnrco (intercan Por afinidad En capa fina Gas-l1qu1do En fase li quida a alt Filtración itn gel Electroforr:sis
En papel Con alto vvltaje En agarosa En acetato de cclulosa En gel de almidiin En poliacrilamida Poliacrilamida y dot I!ltracentrifugacibn
--
I
sódico (S1
-
de anliIisis, purificacibn y determinación de estmcturas. Por ejemplo, el campo de la bioquimica de los Iípidos avanzó con rapidez gracias a la introduccibn de la crornatografia en capa fina y gas-liquido. El anklisís de la membrana y de muchas proteínas era extremadamente dificil hasta la introducción de la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (EGPASDS); el detergente dodecilsulfonato sódico permiti6 la "solubilización" para la electroforesis de muchas proteinas que antes no habían logrado disolverse. Asimismo, el desarrollo de métodos para la secuenciacihn y clonacion del DNA ha tenido un efecto revolucionario en el estudio de los ácidos nucleicos y de la biología en general.
El enfoque experimental requiere la determinación de la estructura de biomole~ulas Una vez que una biornoIecula ha sido purificada es necesario determinar su estnictura. De este modo puede hacerse una correlacion entre estnictura y función. En el cuadro 2 4 se enumeran los metodos principales en uso para analizar la estructura de las
CYuadro 2- 6. Principiales meto determinacibn de la1s estructi
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ados para la iomolécu las . . .
Anaiisis cielncntñl ....... . Espectroscopia ultrnvioleta, visilsle, infrarr o,ja y de resonancia magnética nuclear (RMt'4 Uso de hidrólisis ácida o alcalina para degrasdar la hiomolecula balo estudio en sus const,,,,,,,,,, 11so de una serie dc enz ¡mas de esplecificidad conocidapara degradar la biornolrScula (por ejemplo, piroteasas, r1 ucleaqas o glucosidast 1s) ~spectrometriade mas: Mdtodos es[)ecificos para secuenciaci6n (por cjcmplo, de protcinas o de ácido: ; nucleicos;b Cristalografiia de rayos X m
m
biornoléculas. El lector con algunos conocimientos de química orghnica los encontrara familiares. Ciertas enzimas cuya especificidad se conoce, son medios muy poderosos para revelar estas caracteristicas estructurales. El perfeccionamiento en la resolución respaldado por los adelantos tebricos y tecnolbgicos, está convirtiendo cada vez más a la espectrometria de masa y a la de resonancia magnetita nuclear (RMN), en los métodos de elección rutinarios para estos analisic. Las estructuras de las cadenas extremadamente complejas de los carbohidratos contenidos en ciertas biomoléculas, como las glucoproteinas, se pueden ahora aclarar por la elevada resolucibn de la espectrometría RMN. Una infomacion m8s detallada se logra con la difraccibn de los rayos X y la cristalografia. Su uso fue decisivo para revelar las estructuras dctalIadas de varias proteínas, enzimas y la naturaleza de la doble hélice de DNA.
El enfoque experimental requiere análisis de la función y metabolismo de biomoléculas, utilizando varias preparaciones La investigacihn bioquímica inicial en el ser humano y los animales se hizo con el anima1 intacto. Son ejemplos los estudios de la respiracibn y el destino de las sustancias ingeridas. Pronto se descubri6 que el animal íntegro erademasiado complejo para permitir dar respuestas definitivas a numerosas interrogantes. En concordancia, se hicieron preparaciones más sencillas in vitro, que eliminaron muchas de las complicaciones experimentadas con el animal intacto. El cuadro 2-7 resume los diversos tipos de preparaciones de que se dispone ahora para estudiar los procesos bioquimicos; la mayosia de tos conocimientos presentados en este texto se han obtenido gracias a su uso. El enlistado se
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Comentar
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rueaen sc. 1. Bxtirpaci6n de un 6rgano (por ejemplo. hepatectomia) 2. Alteraciones en la alimentación (por qjemplo, ayuno-posprandial) 3. AdministraciOn de un fármaco (por ejemplo. fenobarbital) 4. Administracihn de una toxina (por qemplo, tetracloruro dc carbono) 5. uso de iin anirrial cori una enferrned:id especific:a (por cjernplo, diabc:tes sacarina) 6. Emp leo de tecn icas sofistjcadas corrio espectri3scopia R:MN y tam ografia po:r emisibn dc nositrones .' .- - - .-. Los Cstiid~ub achrc n ~ v c sur1 i a rricnriuu iibiuiugicoh, pcru uueucri x r uiliciics CYCirricruretar debido a la intcracción orgánich mediada por la circulacion . ..-.-ia nervioso1 central - . En particular higado, ~oraz6ny rifiiin son adecuado: método permite el estudio de un organo aislado de la influencia dc otros o dcl sistema nervioso ..Este-Especfalnnente se ha n usado cortes de tejido hephtict) Aislíi los cortes tisu1ares de otras influencias. pero lar; preparaciimes tiende o . . de alguna 1s heras, cn parte debido al suministro inadecuado -. . . . .ac. .nutrientcs .... i . Aplicable en particular a lm células sanguínea, que pueden ser purificad 7.En m u c h a breas de la biología son indispensahles los culiivos de-teji . -. . -. -t . Asegura una prcparacibn qiie no contiene cklul;Ls .. ... :... .,. ... 2. Pueden agregarse o removerse comnuestos esneciiiuis rnor eiemniri. nur ui~hisisiv ehrudiar sus p .
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OrganeIos cetulares -. aislados -ente usadoS, por ejemplo, en cstudios de la funcibn mitocondrial Subfraccionamiento de organelos .....-.. ....Aislamiento aci=. t= pai rc v irni uLi aiiálisis de cualquier reacciiin o vía quirnica ri~acióndi:metabulinas -tos y emir " . Clonacidn de genes qu~ tl aislamiento del gen clonado es esencial para cstudtar los detalles de su estructura y rcgulaclbn: It la enzimia o proteinla n la que 1 codifican r t ambitn iuede revel ar b secuencia de am A
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presenta en orden decreciente de complejidad. Igual que el uso de animal integro tiene desventajas, las demás preparaciones tambiéin tienen sus limitaciones. De los procesos usados in vitro pueden derivar resultados erroneos (artefactos); por ejemplo, Ea homogeneizacién de las células puede liberar enzimas que digieran parcialmente a las moléculas celulares.
LAS ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE REACCIONES BIOQU~M~CAS SON COMPLEJAS Y EN MÚLTIPLES NIVELES Gran parte de esta obra se dedica a los procesos bioquimicos complejos (por ejemplo, slntesis de proteinas y contracción muscular), incluyendo las vías rnetabólicas. Una vía metabhlica es una serie de
reacciones responsables de la síntesis de un com-
puesto complejo a partir de uno o miis compuestos simples o de la degradación de una sustancia hasta su producto final. La existencia de un proceso bioquimico complejo o de cienas vias metabhiicas puede inferirse de las observaciones a nivel del animal intacto. Por ejemplo, observaciones directas de nuestros congeneres indican que los músculos se contraen. Sabemos que la glucosa sirve como fuente de energia para el ser humano y otros animales; por tanto, podemos deducir que debe ser degradada (metabolizada) en el cuerpo para producir energia. Sin embargo, la comprensi6n total de la forma en que la glucosa se metaboliza en las cklulac humanas -su conocimiento está aún lejos de ser completo- se requieren anhlisis a diferentes niveles. Lafiqura2-3 muestravarios tipos de observaciones y anhlisis utilizados en un intento por comprender los procesos bioquimicos, como la degradación inicial de la glucosa para producir ener-
14
(Capituio 2)
Bioquimiccr de Hurper
gia (proceso conocido como glucblisis). El esquema de la figura 2-3 se aplica en un nivel general a todos los procesos bioquimicos principales por lo cual representa una estrategia global para diIucidarlos; cada uno de los procesos (glucblisis, oxidación de los Acidos grasos, etcétera) debcdn tenerse en mente al estudiar el texto, aunque no siempre encontrarán lugar todos los puntos mencionados. Algunos puntos importantes del cuadro 2-7 y de la figura 2-3 ameritan discusión. 1) A pesar de la posibilidad de artefactos, es absohtamente necesario aislar e identificar cada uno de los componentes de un proceso bioquimico en forma pura para comprenderlo a nivel molecular. Más adelante se encontrarán numerosos ejemplos de esto. 2) También es importante ~ o d e reconstituir r in vitro el vroceso en estudio. mediante el ensamblaje sistemático de sus componentes individuales. Si el proceso no se realiza al ser reensambladas sus partes, una explicacibn puede ser que algun componente critico ha escapado a la identificaci6n y, por tanto, no se ha afiadido. 3) Los adelantos tecnologicos recientes (por ejemplo, en espectroscopia RMN y en tomografia por emisión de positrones [TEP]) han permitido la detección de ciertas biomoléculas a nivel del &gano intacto y la vigilancia de Eos cambios en sus cantidades con e1 tiempo. Estos desarrollos indican que se esti haciendo posible efectuar anhlisis sofisticados de muchos procesos bioquímicos in vivo. 4) Cuando los resultados obtenidos con el uso de varios planteamientos a diferentes niveles son congruentes, entonces sejustifica concluir que se ha logrado un progreso real en la comprensión del proceso bioquímico en estudio. Si utilizando diversos enfoques, se obtienen incongruencias imporiantes, en toncesdekn inrestigme sus causas hastaobtener explicaciones racionales. 5 ) Las preparaciones y niveles de anhlisis delineados pueden utilizarse para estudiar alteraciones bioquimicas en animales con estados metabólicos alterados (como ayuno o ingestión de alimentos) o enfermedades especificas (por ejemplo, diabetes sacarina, o cincer). 6) Muchos de los mktodos y enfoques indicados pueden aplicarse a estudios de ctlulas o tejidos humanos normales o enfermos. Sin embargo, debe tenerse cuidado de obtener material fresco y prestar atención particular a las consideraciones tticas que se aplican a la experimentaci6n en el ser humano.
Los Esótopos radiactivos pesados han contribuido de manera importante en el ecclarecimienta de procesos bioquímicos
La introduccibn del uso de isbtopos en la bioquimica en el decenio de 1930 tuvo un impacto notable; en consecuencia, su uso merece discusibn especial. Antes de su empleo, era muy dificil "marcar" las biomo-
Deduccibn de la existencia del proceso bioquímico de la vla metabólica por las observaciones hechas a nivel del animal intacto
& Anhlisis de sus mecanismos de control in vrtro
J Anhlisis de sus mecanismos de mntrol in vivo
.1 AnBltsis de bc efectos de enfermedades específicas sobre di (por epmpio. errores cong8nitos del metahlismo. cáncer)
& SU locallzaubn en uno o mas brganoc
1 Su localizacibn en uno o mAs organelos celulares o fracciones sub-
celulares
3.
Determinación del número de reacciones que intervienen en 81
4 Purificación de sus susb-atos. productos, enzimas y uifactores individuales u otros componentes
& Establecimientode los mecanismos de control utilizados en él
.1 Su reconstruccibn
L Estudios del proceso o vla a nivel genbnm por los mktodos de la tecnología del DNA recombinante
Figura 23. Esquema de la estrategia general utilizada para analizar un proceso bioqulmim o una vía metabblica. Los planteamientos enumerados no necesrtan efectuarse obligadarnente en la secuencia precisa indicada aquí Sin embargo, por lo general mediante su uso se han dilucidado los detalles de los procesos o vías bioquimicos Por tanto, &te es el esquema que se aplica de modo común a M a s las vias rnetabblicas principales explicadas e n los capítulos siguientes
Itculas de modo que sus destinos metabblicos pudieran vigilarse de modo conveniente. Los estudios iniciales, en particular los de Schoenheimer y sus colaboradores, se aplicaron a la utilización de ciertos isótopos estables (por ejemplo, D2 y NI5)combinados con su identificación por espectrometría de masa, para dilucidar muchos problemas bioquimicos. Por ejemplo, pudieron sintetizarse varios arninoAcidos, azúcares y iicidos gsasos que contenian un isótopo estable adecuado y, entonces, administrarse a un animal o agregarse a una preparacibn in vitro para trazar su destino metabólico (por ejemplo, vidas medias y conversi611 a otras biomoltculas). Los compuestos marcados con is6topos estables se utilizaron para investigar muchos aspectos del metabolismo de proteinas, carbohidratos y lipidos. De estos estudios, se dedujo que el metabolismo es un proceso muy activo, en donde Ea mayoría de los compuestos en una cdlula se estan sintetizando y degradando de manera continua, aunque a velocidades que difieren amplia-
mente. Schoenheimer llam6 a estos hallazgos "la naturaleza d i n h i c a del metabolismo". La introducción subsiguiente de los is6topos radiactivos y de instrumentos capaces de medirlos también fue muy importante. En el cuadro 2 4 se muestran los isdtopos principales, estables y radiactivos, usados en los sistemas biológicos. El uso de los dos tipos de isótopas es decisivo para el desarrollo de cada irea de Ia bioquimica. La investigación de las biomoléculas complejas y simples, in vivo o ipi vim, se apoya fweftemente en su empleo. El gran avance logrado en la secuenciacib de los hcidos nucleicos y en la rnedici~n de cantidades extremadamente pequeflas de compuestos que se encuentran en los sistemas biolbgims se debe a la radioinmunovaloración que también utiliza isotopos.
LOGROS IMPORTANTES CARACTERIZAN LAS CONTRIBUCIONES DE LA BIOQU~MICAA LA CITOLOG~A Y A LA MEDICINA Los siguientes piirrafos resumen los descubrimientos principales en el campo de la bioquimica, en particular en relacibn con la bioquimica humana. Gran parte de este texto desarrolla los temas que aquI se enumeran.
1) Se ha determinado la composición quimica global de c&lulas,tejidos y 6rganos; los compuestos principales se han aislado y sus estructuras se han establecido.
2) Se comprenden, por la menos a un nivel general, las funciones de muchas biomoléculas simples, las cuales se describirhn en los capitulas subsiguientes. Tambitn se han establecido las funciones de biomol&culas complejas. Es de capital interks el conocimiento actual de que el DNA es el material gendtico que transmite su información a un tipo de RNA (RNA mensajero, o mRNA) y este RNA a su vez dicta la secuencia lineal de los aminoácidos en
g. Isatopo,S princip investigaici6n bioc -.--
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las proteínas. E! flujo de 3a información del DNA puede ser representado convenientemente como DNA +RNA -+ proteina. Sin embargo, se conocen excepciones importantes de algunos de los enunciados anteriores. El RNA es el material gendtico de ciertos virus. Además, en algunas circunstancias la información contenida en el RNA puede transcrjbirse al DNA; este proceso se conoce como transcripción inversa y es usado, por ejemplo, por el virus HIV-1 (virus de inrnunodeficiencia humana-1), causa posible del SIDA. 3) El desarrollo de la tecnología del DNA recornbinante constituye un logro fundamental. Esta tecnologla revolucion6 el estudio de la estructura y funcibn de los genes y también tuvo un impacto revolucionario en todos los campos de la biologia, incluyendo la medicina. 4) Se han aislado los principales organelos de las células animales y establecido sus funciones principales. 5) Se sabe que casi todas las reacciones que tienen lugar en las células son catalizadas por enzimas; muchas de estas han sido purificadas y estudiadas y se han descubierto las caracteristicas generales de sus mecanismos de acción. Aunque la mayoría de las enzirnas son proteinas, en la actualidad se ha establecido de manera firme que ciertas moldculas de RNA tambidn tienen actividad biocatalitica. 6) Se han delineado las vías membólicas que intervienen en la síntesis y degradacibn de numerosas biomolCculas simples y complejas. En general, se sabe que 1a vía de sintesis de un compuesto es distinta de su via de degradacion. 7) Se han esclarecida algunos aspectos de la regulacidn del metabolismo, 8) Se han reconocido las características generales de la forma en que las cClulas conservan y utiIizan la energia. 9) Se comprenden muchos aspectos de la esmctura y funcion de las diversas membranas encontradas en la ctlula; sus componentes principales son proteínas y lfpidos. 1(3 Se dispone de información importante a nivel general sobre el modo de accibn de las hormonas. 11)Se han descubierto las bases bioqufmicas para un número considerable de enfermedades.
QUEDA MUCHO POR APRENDER Aunque es importante saber que es mucha la información que se ha acumulado, tiene igual relevanciaapreciar lo escaso del conocimiento en numerosas areas. Probablemente los dos problemas principales por resolver respecto al establecimiento de sus bases bioquirnicas son el desarrollo, la diferenciacibn y la función cere-
bral. Si bien está perfectamente asentada la naturaleza quimica del material genético, casi nada se sabe acerca de los mecanismos que activan y desactivan a los genes eucariotas durante el desarrollo. Comprender la regulación génica es tarnbitn un &ea clave en el aprendizaje de la forma en que las células se diferencian y toman cancerosas. El conocimiento de la división y el crecimiento celular -tanto normal como malignoy su regulaci6n es muy primitivo. Virtualmente nada se sabe can respecto a las bases bioquimicac de fenómenos neurolbgicos complejos como la conciencia y la memoria. Sólo se riene informacibn muy limitada de los mecanismos de la secrecion celular. A perar de cierto progreso, se desconocen los fundamentos moleculmes de la mayoria de las enfermedades genéticas principales, pero las tentativas proporcionadas por la tecnología del DNA recombinante sugieren que en los próximos afios se logrará un progreso notable en esta hrea. Es posible que en el año 2005 o antes se logre conocer la secuencia del genoma humano; la informacihn disponible gracias a este esfuerzo masivo tendrh un impacto tremendo sobre la biologia humana y la medicina.
RESUMEN El carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrbgeno son los constituyentes principales de gran parte de las biomoléculas. Ademls el calcio, fbsforo, potasio, sodio, cloro, rnagnesio, hierro, manganeso, yodo y otros elementos tienen gran importancia biol6gica y medica. El agua, DNA, R N A , proteínas, polisacaridos y lipidos son las moléculas principales de células y tejidos. Las células son las unidades biolbgicas hndamentales. Contienen v e o s organelos que desempeiian numerosas funciones especializadas. Estos organelos
pueden separarse por fraccionamiento subcelular y, de este modo, estudiar sus fiinciones en detalle. El avance de la bioquímica ha dependido del aislamiento de biomolkculas celulares. de la dcterminación de sus estructuras así como del an8lisis de su funcibn y metabolismo. Para investigar la estructura, funci6n y metabolismos d e las biomoléculas se han utilizado diferentes planteamientos, desde el anima! íntegro al gen aislado. En particular, el uso de isotopos. tanto estables como radiactivos, ha tenido tremenda importancia en el adelanto del conocimiento hjoquímico. La representacihn:
Transcripcibn
DNA-
Traslación RNA-Proteina
resume la fuerza propulsara de gran parte del esfuerzo contemporáneo en bíoquímica. No obstante, se han hecho muchos otros avances en el conocimiento de la bioquimica, como la apreciacibn de la ~omposicibn corporal y la comprensibn parcial de estructuras y funciones de enzimac, hormonas y membranas. Se han descubierto las bases bioquímicas y genéticas de numerosas enfermedades y la aplicación reciente de la tecnología del DNA recombinante ha acelerado enormemente el progreso en esta área. Sin embargo, aún es mucho lo que se desconoce; los retos principales para el futuro incluyen definir ("mapear") el genorna humano y proporcionar explicaciones moleculares de los mecanismos que intervienen en el desarrollo orghnico, la diferenciacibn celular y !a función cerebral. M
REFERENCIAS Freifelder D: Phys~calBiochemistry: Applicaiions to Rin-
c h e m i . r f and ~ MolecuIar Biolo~y.Freeman. T 982. Fruton JS: iWo/ectrJesaridLfe: HrSiorical fisqyson ihe Jnferplay ofChemisfryandBioln~. Wiley-lnterscience,1972. Green ED, Cox DR, Myers RM: The human genamc prajcct and its impact on ihe snidy of human discasc. In: Scriver CR et al. (editors): The Melabolic and MolecuIar Bases of lnhenfedDiseare. 7th ed. McGraw-Hill, 1995.
Radda GK. Control, bioenergetics, and adaptation in health and disease: Non-invasive biochemistry from nuclear magnefic resonance. FASEB J 1992;6:3032. Watson JD et al.: Recombinani DNA, 2nd ed. Scientific American Books, 1992. Wilson K, Walker J: Pnncipdes and Technáques ofPraciical Rinchemistty, 4th ed. Cambrídge Univ Press. 1994.
Victor W. Rodwell, PhD
Ld5 biomolecula~polarcs orghicas e inorgánicas de 1% células vivienles existen y reaccionan de manera priniariri en un ambiente acuoso El agua, una molécula notable esencial para la vida, solubiIi75~y modifica las características de biomoléculas coino hcidos nucleicos, protcinas y carbohidratos al formar puentes de hidr6geno con sil? grupos fi~nciotiales.Estas interacciones mridifican las propiedades de las biomoléculas y si15conformaciones en solucicin. ],os cambios le dan a las molkciilas ias propiedades esenciales para el ciclo de la vida. [,si$ biornoléculas -aun aquéllas relativamei1:e no pulares, tales como ciertos lipidos- tambiéti inodificw las propiedades del agua La comprensión de 3us mecanismos honieostáticos utilizados por los organismos para conservar un entorno intraceliilar relativamente constante debe considerar el pH y el amortiguarnierito en liquidos corporales y compartimienlos siibcelulares. Por ultimo, el comportamiento de disociación de los gmpos funcionales de biomol~culasen soJuci6n acuosa a diversos valores de pH e? critico cn la comprensióti de sus reacciones y propiedades tanto en células vivas corno en el laboratorio
IMPORTANCIA B I O M ~ D I C A Ida homeostasis, conservaci6n de la cornposic~óndel rnedio interno que es esencial para la salud, incluye considerar la distribucihn dcl agua en el cuerpo y la preservaci~n del ptl así como de concentmciones clecirol iticas apjopiadas. Dos terceras partes del agua corporal total (55 a 65% del peso corporal eri varones y alrededor de 10% menos en mujeres) cs liquido intracelular. Del liquido extracelular remanente, el plasma sanguineo constituye cerca de 25 por ciento.
La regulaciiin del equilibrio hídrico depende de mecanismos hipcitaláinicos para controlar la sed, de la hormona aiitidiurdtica y de la retención o excrecion del agua por los riilones. 1.0s estados de depleción de agua y exceso de Iíqiiido corporal son bastante comunes. En inuchos casos se acompañan de deficiencia o exceso de sodio. Las causas de dealecibn hidrica son a una disminución de la ingestión (por ejemplo, en estados de coma) e increniento de la perdida (por ejemplo, perdida renal en la diabetes sacarina, cuthnea por sudaciún intensa y gastrointestinal eii diarrea intensa en lactantes y en ctilera). Las causas de exceso de agua corporal se deben al incremento en la ingertión (por ejemplo, excesiva administración de liquidos IV) y excrecibn escasa (por ejemplo, en insuficiencia renal grave). Ciertos niecanismos osrnóticos y no osmóticos protegen el agua y la htirneostasis osrn0tica del liquido extracelular. Tanto la conservacibn del agua por la atitidiuresis como la ingestihn de liquido por la sed, sirven para mantener la homeostasis. Incrcmentos tan pequefios como 2% en la osmolaridad del liquido r:xtraceluIar pueden provocar sed y Iiberacihn de liorniona antidiurética (ADH) en la hipáfi~is.Un mecanismc) algo menos sensible desencadena la Iiheración no osmólica de ADH y la sed, cuando disminuye 10nAel volumen de liquido circulante extracelular. La diabetes insípida nefrogeiia, de origen genético, se caracteriza por sed extrema, ingest icin abundante de agua e incapacidad para concentrar la orina o para responder a cambios sutiles en la osmolaridad de liqiiido extracelular; esto se dehc a la incapacidad de los osmorreceptores de ADH en los túbulos renales para responder a la ADH. La conservación del liquido extracelular dcntto de un p1-E entre 7.35 y 7.45, cn donde el sistema amortiguador de bicarbonato tiene una funcihn importante, es cscncial para la salud. Las alteraciones del equilibrio acidobásico se diagnostican en el labora-
torio clínico por medicibn del pH de la sangre arteria1 y el contenido de COZde la sangre venosa. Las causas de la acidosis (pH sangutneo < 7.35) incluyen cetoacidosis díabdtica y acidosis 1Actica; mientras que las de la alcalosis (gH sanguineo > 7.45) comprenden el vbmito de contenido ácido gástrico o el tratamiento con ciertos diun5ticos. Un diagnóstico preciso y un rápido tratamiento del desequilibrio hidrico y de las alteraciones acidobiisicas se apoyan en gran medida en la comprensi6n de los conceptos considerados en este capitulo.
EL AGUA ES UN SOLVENTE BIOLÓGICO IDEAL El agua es una molécula tetraédrica ligeramente asimétrica La molCcula del agua es un tetraedro irregular con oxígeno en el cenúo (figura3-1). Los dos enlaces con hidrbgeno se dirigen hacia dos vértices del tetraedro, en tanto que los electrones no compartidos del oxigeno en el orbital 2sp3 híbrido ocupan los dos vertices restantes. El ángulo entre los dos Atomos de hidrogeno (105 grados) es algo menor que el Angulo del tetraedro (109.5 grados), formando una figura geomdtrica ligeramente asimktrica.
Las rnoléculas de agua forman dipolos Debido a la estructura tetraédrica asimktrica, la carga eléctrica no se distribuye de manera uniforme alrededor de la moltcula de agua. El lado de1 oxigeno opuesto a los dos hidrbgenos muestra cierta riqueza de electrones, en tanto que del otro lado, los núcleos
Figura 3-1. Estructura tetrabdrica del agua
de hidrógeno escasos en electrones forman una regi6n de carga positiva local. El término "dipoEoV se refiere a moléculas como el agua que tienen carga electrica (electrones) distribuida en forma desigual alrededor de su estructura.
El amoniaco también es dipolar y tetraédrico En el amoniaco, los angulos de enlace entre hidrbgenos (107 grados) se aproximan al ángulo del tetraedro aun miis que en el agua (figura 3-2). Muchos compuestos químicos son dipolos. Entre ellos se Incluyen alcoholes, fosfollpidos, aminohcidos y hcidos nucleicos.
LAS MOLÉCULAS DE AGUA FORMAN PUENTES DE HIDRÓGENO Los puentes de hidrogeno confieren una estructura macromolecular Debido a su caríicter dipolar, las moléculas de agua pueden asumir conf~rtmacionesordenadas (considerese un copo de nieve). Al igual que el hielo, el agua liquida muestra una estructura rnacromolecular ankloga a la disposicibn ggeom&tricade las molkculas de agua en el hielo. La propiedad de las moltculas de agua de unirse unas con otras tanto en estado líquido como sblido surge del carhcter dipolar del agua. Se conserva como liquido más que como sblido debido a la naturdeza transitoria de estos complejos macromoleculares (la vida media de asociacibn-disociacidn de las moléculas de agua es de alrededor de un microsegundo). En estado sdlido, cada moltcula de agua se une con otras cuatro. En estado liquido, el número es algo menor (mlis o menos 3.5). Con excepcibn de
Flgura 3-2. Estructura tetraMrica del amoniaw
Agua y pH
la naturaleza transitoria de las interacciones intermoleculares en el agua liquida, ksta se parece al hielo en su estructura macromolecular mSis de lo que en un principio se imaginaba. El cariicter dipolar de las moldculas de agua favorece los enlaces mutuos en conformaciones ordenadas con una geometría precisa dictada por la configuracibn interna de cada molécula de agua (figura 3-3). La interacción electrostAtica entre el nijcleo de hidrdgeno de una moldcula de agua y el par de ekctrones no compartidos de otra se denomina puente de hidrógeno. Comparados con enlaces covalentes, los puentes de hidriigeno son bastante debiles. Romper un enlace de hidrógeno en agua Iíquida requiere alrededor de 4.5 kcal de energía por mot -más o menos 4% de la energía que se requiere para romper el enlace O-H del agua ( 1 I O kcal/mol). Los puentes de hidrógeno estabiliran proteínas y ácidos nucleicos En tanto que el metano (peso molecular 16) y el amoniaco (peso molecular 17) son gases a la temperatura ambiente, e l agua (peso molecular 18) es un liquido. ¿Por quc es ast? L a respuesta se apoya en la capacidad del agua para formar puentes de hidrogeno, lo cual explica tambien su viscosidad y su tensibn superficial relativamente altas. La propiedad del agua de servir como solvente para iones y numerosas mol&culasorghnicas se debe a su carácter bipolar y a su capacidad para formar puentes de hidrhgeno. Las molCculas que pueden formar puentes de hidrógeno con el agua (por ejemplo, compuestos con radicales 4 N o S H , aminas,
Figura 3 3 . Izquierda: Reunibn de dos mol&culasdipolares de agua. La línea punteada representa un puente de hidrógeno. Nbtese que una mol8wla dada de agua puede actuar como donador o como aceptor de hidrbgeno, o ambas cosas a la vez Derecha: Unldn de una rnol6cula central de agua con otras cuatro mol6culas mediante puentes de hidrógeno. Esta estructura es típica deT hielo y, en menor grado, del agua líquida.
a
19
esleres, aldehidos y cetonas) se sotvatan con facilidad lo que por su solubilidad en agua aumenta. Así, las
proteinas solubles están recubiertas con una capa de agua formada por intercambio de enlaces de hidrbgeno intermoleculares superfjciales por puentes de hidrógeno intramoleculares del agua, lo que incrementa la solubilidad. El carácter dipolar del agua afecta profundamente sus interacciones con las biomoltculas, En el ambiente acuoso de las cClulas vivientes se producen muchas interacciones entre cargas y grupos polares de las biomoléculas. El DNA se pliega de modo que expone su azúcar y sus grupos fosfato polares a las moiéculas de agua. De manera similar, residuos polares de proteinas se presentan primariamente en la superficie biopolímera donde participan extensamente en interacciones con las moléculas de agua. La figura 3 4 ilustra la formacibn de puentes de hidrógeno entre el agua y grupos funcionales representativos de biomol~culas.N6tese que los alcoholes, del mismo modo que el agua, pueden participar como donadores y como aceptores de hidrógeno en la formación de puentes de hidrdgeno con agua o con otras biomoltsculas. Grupos apolares como aquellos presentes en hidrocarburos no tienen capacidad para formar uniones hidrbgeno y, por tanto, son insolubles en agua. No obstante, estos grupos no polares pueden afectar la estructura hidrica. Cuando se añaden el agua, las moléculas apolares forman gotas esfericas con una supeficie mínima expuesta al agua; este fenbmeno se ilustra con la tendencia del aceite de olivo en agua fria para formar una sola gran masa flotante. La reduccibn aE mlnimo de la superficie apolar expuesta al agua es un proceso gobernado entrópicamente. La presencia de moltculas apolares reduce el numero de posibles orientaciones (grados de libertad) de las rnol~culas
Figura 3-4. Fomacibn de puentes de hidrbgeno entre un alcohol y agua, entre dos molbculas de etanol y entre el oxigeno carbonilo de un pbptido y el hidrbgeno del grupo amino de otro pkptido adyacente.
'
adyacentes al agua por lo que se acompafía de un incremento en la entropía. La reducción al minimo del área de la superficie apolar expuesta permite el m k i m o grado de libertad (por ejemplo, desorden máximo) de las mo!éculas de agua cercanas y, por tanto, reduce al mínimo el incremento en entropía. En el agua. los hidrocarburos forman estructuras clatrato rígidas (semejante a cajas). De manera similar, en el ambiente acuoso de las ctlulas vivientes, las partes no polares de los biopolímeros tienden a situarse dentro de su estructura. minimiírando asi su contacto con el agua.
Las moléculas de agua presentan una tendencia ligera a disociarse, lo cual es fisiolciqicarnente importante La propiedad del agua de ioni~arse,aunque de modo ligero, tiene importancia capital para la vida sobre la tierra. Dado que el agua puede actuar como un hcido o como una base, es posible representar su ionizacibn como una transferencia protónica intermolecular, que foma un ion hidronio (I.I,O&)y un ion hidr6xido (OH-):
., En realidad, el protbn transferido est6 asociado con un racimo de: mol$culas de agua y existe en solucion, no siilo como H30- sino como algo semejante a HrOz' o H703'. Aunque para propósitos prhcticos este protbn ' al parecer 'Vesnudo" se escribe casi siempre como "H'",no debe olvidarse que de hecho esta fuertemente hidratado. Ya que los iones se recombinan de manera continua para formar rnolécu2as de agua y viceversa, no puede definirse si un hidrógeno o un oxigeno deterrninado tiene el estado de ion o de una parte de una moiécula de agua En un instante están como ion; un momento después como una parte de una mol6cula. Por fortuna, no es necesario considerar iones o molkculas individuales. Dado que 1 g de agua contiene 3.46 x moléculas, su ionización puede describirse por estadística. Es suficiente conocer la probabilidad de que un hidrbgeno estC presente como ion o como parte de una molécula de agua. Establecer que la probabilidad de que un hidrbgeno exista como un ion es 0.01 significa que un átomo de hidrhgeno tiene una oportunidad en 100 de estar como ion y 99 posibilidades en 100 de estar como parte de una rno4&culade agua. La probabilidad real de que un Atorno de hidrhgeno en agua pura exista coma ion hidr6geno es alrededor de 0.0000000018 o 1.S x 104. En consecuencia, la probabilidad de estar como parte de una rnotecula es casi la unidad. Definido de otra manera, por cada ion hidrbgeno y cada ion oxhidrilo en agua pura, hay 1.S bi tlones o 1 .X x
109 moléculas de agua. N o obstante, los iones hídr0geno y oxhidrilo contribuyen de modo significativo a las propiedades del agua. La disociacion del agua,
donde los t6rminos entre paréntesis representan concentraciones molares de iones hidrbgeno, iones oxhidrilo y rnolkculas de agua sin disociar*, rnlentras que la K es la constante de disociación. Para calcular este valor, recuérdese que una molkula de agua pesa 1& g. Por tanto, un litro (1 000 g) de agua contiene 1000 + I g = 55.56 moles. Asi, la concentración del agua pura es 55.56 molar. Ya que la probabilidad de que un hidrbgeno en agua pura exista como ion H' es de 1 .S x 1 Omy, la concentración molar de iones H' (e de iones OH-)en agua pura se calcula multiplicando la probabi tidad, 1.8 x 1 Q4, por la concentracion molar del agua, 55.56 moIL. Este resultado es 1 x 10" rnoYL. Ahora puede calcularse la K para el agua:
La elevada concentración de agua molecular (55.56 moYL) no se afecta de manera significativa por la disociacibn. Por tanto, resulta conveniente considerarla en esencia como una constante, que luego puede incorporarse a la constante de disociación, K, para crear una nueva constante, K,, designada el producto ibnico para el agua. La relación entre K, y K se muestra a continuación:
Nótese que las dimensiones de K son moles por litro y las de K, molesZpor litro2.Como su nombre sugiere, el producto iónico, K,, es en cifras igual al producto de las concentraciones rnolares de H ' y OH-:
* Estrictamente hablando, los tCrtninos entre parkntesis reprcsentan la actividad molar en lugar de la concentración molar.
m
A 25 OC,K, = (1 0-'j2 = I O-'' (molJL)'. A temperaturas que a menores a 25 O C , K, es menor de 10-'"mientras superiores a 25 O C , es mayor de 1 O-". Por ejemplo, a la temperatura del cuerpo humano (37 "C),la concentración de iones H' en agua pura es algo mayor de 1 mol/L. Dentro de las lim itaciunes establecidas por el efecto de la temperatura, K, = lW4 (mol/L)' para todas las soluciones acuosas, incluso las que contienen acidos o bases. Esta constante se usarii en el cálculo de valores de pH para soluciones ácidas y alcalinas.
EL pH ES EL LOGARlTMO NEGATIVO DE LA CONCENTRACI~NDEL ION HIDR~GENO El término pH fue introdiicido en 1909 por Sorensen. quien lo definió como el logaritrno negativo de l a concentraci~nde iones hidrúgeno:
Los siguientes ejemplos ilustran el modo de calcular el pH de soluciones ácidas y alcalinas. Ejemplo: cuál es el pH de una solución cuya concentracibn de ion hidrógeno es 3.2 x 1O-' mol/L? PH = - 109[H+] = log (3.2 x lo4) = - log (3.2) - log (104) = - 0.5 + 4.0 = 3.5
-
Ejemplo: ¿Cuál es el pH de una colucihn cuya concentracion de ion oxhidrilo es 4.0 x 1O4 mol/L? Para abordar este problema, hay que definir una cantidad pOH, que sea igual a -1og [OH-] y que puede derivarse de la definiciiin de Kw:
por tanto:
pH = - log [H']
Esta definición, aunque no es rigurosa*, es adecuada para la mayor parte de los estudios bioquimicos. Para calcular el pH de una solucihn se debe:
Para resolver el problema bajo estc enfoque:
1) Calcular la concentración del ion hidrdgeno,
W+l.
2) Calcular el logaritmo de base 10 de [w']. 3) El pH es el negativo del valor encontrado en el paso 2. Por ejemplo, para agua pura a 25 O C : pH = -lag [HJ = - log
= - (-7) = 7.0
],os valores de pH bajos corresponden a concentraciones elevadas de H- y los valores de pH altos a concentraciones bajas de H'. Los ácidos son donadores de protones y las bases son aceptores de pmtones. Sin embargo, se hace una distinción entre ácidos fuertes (por ejemplo, HCI, H:SOd), que se disocian completamente aun en soluciones muy ácidas (pH bajo) y los iicidos débiles, que se disocian solo de manera parcial en selucíones bcidas. Una distinción semejante se hace entre bases fuertes (por ejemplo, KOH, NaOH) y bases debiles (por ejemplo, Ca[OH]:). S610 las bases ruerics sc disocian a pH alto. Muchas sustancias bioquimicas son Bcidos ddbiles. Las excepciones son tos intermediarios fosforilados, que poseen el grupo acido fosfórico primario fuertemente acídico.
Ahora:
Ejemplo: ¿Cuales son los valores del pH de a) 2.0 x 1OA2mol/L de KOH y de b) 2.0 x 1 Oa m o l k de KOH? Los oxhidrilos proceden de dos fuentes: KOH y agua. Dado que el pH esta determinado por el [HA] totai (y pOH por el [OH-] total), es preciso considerar los dos orígenes. En el primer caso, la contribucion del agua al [OH-] total es despreciable. No puede decirse lo mismo en el segundo caso
Molaridad di:KOH
[OH-] de KC)H [OH-1 del agua
* pH = -log (actividad dcl H +).
2.0 x . -
(Capitulo 3)
Una vez que se ha comprendido el significado de la contribucihn del agua, el pM puede calcularse como se describid. En los ejemplos anteriores, se asurni6 que la base Fuerte KOH estaba completamente disociada en la solución y que, por tanto, la concentracion molar de iones OH-era igual a la concentración molar de KOH. Esta aseveración es válida para soluciones relativamente diluidas de bases o ácidos fuertes, pero no para soluciones de acidos o bases dbbiles. Dado que estos electrólitos dkbiles se disocian sólo un poco en soluci6n, se debe calcular la concentracidn de H ' (o de [OH-1) producida por una molaridad dada del hcido (o base) usando la constante de disociación antes de calcular [H'] total (o [OH-] total) y, posteriormente, calcular el pH.
Los grupos funcionales que son ácidos débiles tienen un gran significado fisiológico Numerosos compuestos bioqulmicos poseen grupos funcionales que son ácidos o bases dkbiles. En todas las proteínas y ácidos nucleicos existen uno o más de estos: carboxilos, aminos o fosfatos derivados de la disociación secundaria de esteres de fosfato; tambihn los hay en la rnayoria de las coenzimas y los metabolitos intermediarios. Por tanto, el comportamiento de disociacibn (equilibrios protónicos) de grupos funcionales débiles, hcidos o bhsicos, es fundamental -para comprender la influencia del pH intracelular en la estructiira y actividad bioquimica de estos compuestos. Su sepmtci&ne identificación en los laboratorios clinicos y de investigacidn se facilita tambidn cuando se conoce el comportamiento de disociacibn de sus grupos funcionales. A la forma protonada de un hcido (por ejemplo, HA o RNH?') se le designa como el hcide y a la forma no protonada (por ejemplo, A- o RNH?}, base conjugada. De igual modo, es posible referirse a una base (por e.jemplo, A-o RNH2) y su hcido conjugado (HA o RNH3'); la palabra proviene del latln, cuniungre: reunirse). Los hcidos débiles representativos (izquierda), sus bases conjugadas (centro) y tos valores de pK (derecha) incluyen lo siguiente:
Las potencias relativas de ácidos y bases dkbiles se expresan de manera cuantitativa como sus constantes de disociacibn, que expresan su tendencia a ionizarse. A continuacibn se muestran las expresiones de la constante de disociacidn (K) para dos ácidos débiles representativos, R-LOOH y R-NHJ-.
Dado que los valores numéricos de K para hcidos débiles son exponentes negativos, es conveniente cxpresar a K como pK, donde:
Nótese que la relacibn de pK con respecto a K es igual a la de pH con la concentracion de H'. El cuadro 3-1 enumera valores de K y pK ilustrativos para un ácido monocarboxílico, dicarboxílico y tricarboxílico. Observese que los grupos hcidos más fuertes tienen los valores de pK mas bajos. De las ecuaciones anteriores que relacionan K a [H']y a las concentraciones de un ácido no disociado y su base conjugada, nbtese que:
o cuando:
entonces,
En otras palabras, cuando las especies asociada (protonada) y disociada (base conjugada) están presentes
C u a d r o 3-1. Constantes de disociacibn y valores de1 pK para ácidos carhoxllicos r e ~ r e s e n t a t k o s
-
-.---
A
Acktico
Glutdrico Citrico
(primero) 8.40 x 1 O4 (segundo) 1.80 x 1
3.08
Agua y pH
en concentraciones iguales, la concentración prevalente de ion hidrógeno [H']es numh-icarnente iguat a la constante de disociacion, K. Si se obtienen los logaritmos de los dos lados de la ecuacibn anterior y la ecuación completa se multiplica por -1, las expresiones serfan las siguientes: K = [H']
23
Se multiplica todo por -1 :
- 109 [HT = - lag K - toa IH4 [A7
Se sustituye pM y pK en lugar de -log [Ht] y -lag K, respectivamente; luego:
- log K = - iog [HT Ahora, -log K se defínib como pK y -1og [H'] es la definicibn de pH. La ecuación puede quedar como:
es decir, el pK de un grupo 4cido es el pH al cual Ias especies protonada y no protonada esthn presentesen la misma concentración. El pK de un &ido puede determinarse de modo experimental agregando 0.5 equivalentes de iilcali por cada equivalente de acido. El pH resultante seri igual al pK del ácido.
El comportamiento de ácidos dkbiles y de amertiguadores se expresan par la ecuación de Henderson-Hasselbalch
Para eliminar el signo negativo se invierte el ÚItirno
La ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch ha probado ser una expresión de gran valor predictivo en equilibrios protonicos. Por ejemplo:
1) Cuando un hcido se ha neutralizado exactamente a la mitad [ A 7 = [HA]. En esta situacibn,
El pH de una solucihn que contiene un Bcido débil se relaciona con la constante de disociaci6n de dicho acido, como se mosirb antes para el agua como Acido débil. La relación puede establecerse en la forma convenientede la ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch, que se desarrolla desputs. Un acido ddbil, HA, se ioniza de la manera siguiente: HA = H+ + A-
1 pH = pK + log f[HlAI = p ~ + ~ o g ~ = p ~ +
Por tanto, con 50% de neutralizacibn, pH PK.
=
2) Cuando la proporci6n [A-JI[HA] = 100:1,
La constante de equilibrio para esta disociacibn se escribe:
3) Cuando la proporción [A-]/[HA]
Se multiplican los dos términos entre si: pki = pK
Se dividen ambos miembros entre [A-]:
(E)
log %o = PK
1 : 10,
+ (-1)
Si la ecuación se valora en varias proporciones de [A-]/[HA] entre los limites 103 y 1O-? y los valores de pH obtenidos se grafican, el resultado describe la curva de titulación para un a ácido débil (figura 3-5).
Se obtiene el logaritmo de toda la ecuacibn: log [H7 = log K
+
=
Las soluciones de ácidos debiles sus sales amortiguan el pH
y
Las sofuciones de ácidos dkbiles y sus bases conjugadas (o de bases dtbiles y sus k i d o s conjugados)
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Bioquinaica de Harper
Figura 3-5. Forma general de una curva de tlulacibn calculada con la ecuación de Hende~on-Hasselbalch.
exhiben la propiedad de amortiguar -tendencia de una solrici6n para resistir con inayor eficacia a un cambio en el pH después de la ztdicibn de un Cicido o una base fuertes que un volumen igual de agua. Los amortiguadores fisiol6gicos importantes incluyen bicarbonato (HCOi/H2C0i), ortofosfato inorgánico ( H ? P O ~ - tPQ4C2) '/~ y proteínas intracelulares. Los amortiguadores no fisiolbgicos usados en experimentacibn bioquirnica comprenden al TRIS (pK S.2) y al HEPES (pK 7.6). El efecto de amortiguador se observa mejor por titulacibn de un hcido o base débil utilizando rin potenciómetro (medidor de pH). De manera alterna, es posible calcular el desplazamiento del pH que acompaiia a la adición de Acido o de base a una solución amortiguada, En el ejemplo, el amortiguador (mezcla de un ácido débil. pK = a 5.0 y su base conjugada se encuentra inicialmente en 1 de los 4 valores de pH indicados. Se calculará el desplazamiento del pH que resulta cuando se agrega O. 1 mEq de KOH a 1 mEq de cadauna de estas soIuciones:
pH inicial
Obskwese que el cambio de pH por miliequivatente de OH- agregado varía de modo notable dependiendo del pH iniciai. A valores de pH próximos al pK, la soluciOn resiste los cambios con mayor eficacia y se dice que ejerce un efecto amortiguador. Las soluciones de ácidos débiles y sus bases conjugadas amortiguan mejor en valores de pH que oscilan alrededor de pK k 2.0 unidades de pH. Ecto significa q u e para amortiguar una solución a pH X, deberfi usarse un Acido o una base débil cuyo pK no se separe mas de 2.0 unidades de pIJ del pH X. En la figura 3-6 se muestra la carga neta en una rnoltcula del ácido como funcihn del pH. Una carga fraccionaria de -0,s no significa que una molécula individual posea una carga fraccionaria sino que 0.5 es la probabilidad estadística de que una rnolkcula dada tenga una carga negativa. La consideración de la carga neta de macromoléculas como funcibn del pH constituye Ia base para numerosas tkcnicas de separación, incluyendo la separacibn electroforética de aminohcidos, proteinas plasmhticas y hemoglobinas anormales.
RESUMEN El agua, que en !os estados liquido y sdlido existe como racimos rnoleculares unidos por hidrógenos, forma puentes tanto con sus propias rnol~culascomo con otros donadores o aceptores de protones. La tensión superficial, viscosidad, estado líquido a temperatura ambiente y potencia solvente del agua se deben a su capacidad para formar puentes de hidrógeno. Los compuestos que contienen O, N o S son solvatados por el agua, ya que tienen la propiedad de servir como aceptores o donadores de hidrdgeno para formar puen-
5.00
5.37 5.60 5.86 0.88 0.70 0.80 0.50 0.12 0.30 0.20 0.50 [HAI~nicia~ 7.33 2.33 4.00 i.00 ([A-]l[HA])inlclal La adición de O.T meq de KOH produce 0.98 0.80 0.90 0.60 [A-lfinai 0.20 0.10 0.02 0.40 [HAlfinai 49.00 4.00 9.00 1.50 ([A-[4HA])fina1 log ([A-]I[HA])n,,t 0.176 0.602 0.95 1.69 pHfinal " 5.18-_-5:60 5-95 6.69
[A-]inicial
L~PH
0.18---"6 0 -0 .
.
. ..
-
Figura 3 4 . Curva de titulación para un ácido del tipo HA El punto (m) ~ndicael pK 5.0.
tes con el agua. Las proteínas y otras rnacromoteculas se estabili~anpor intercambio de eniaces de hidrbgeno intermoleculares superficiales con los enlaces de hidrtigeno del agua. E1 agua modifica las propiedades de biomolkculas como las proteinas y los hcidos nucleicos que poseen gmpos funcionales polares y no polares. Las fuerzas entrópicas indican que las macrornoleculas en soluci6n acuosa se pliegan de modo que sus porciones polares entran en contacto con la interfasr acutisa, en tanto que sus porciones no polares se ocultan en el interior de la biomolCcula. El agua se disocia para formar iones hidrdxido y protones hidratados de modo masivo, los cuales de manera convenciona! se representan como protones desnudos (H'). El pH, logaritmo negativo de [H'], expresa la acidez relativa. Un pH bajo denota una solución ácida y uno alto una solución básica o alcalina.
REFERENCIAS Segel 1M: Riocochemicnl Calculations. Wiley, 1968
Los bioqulmicos consideran tanto a los hcidos carboxilicos (como el R X O O H ) como a las aminas (por ejemplo. R-NH,') como bcidos, y nombran a los aceptores protónicos correspondientes ( R - 4 0 0 - y R-NH2), las bases conjugadas de estos ácidos. Estos ácidos débiles desernpeíian actividades claves en el metabolismo. Su potencia heida se expresa de manera cuantitativa con el simbola pK, el cual es el logaritmo negativo de su constante de disociación. Los ácidos relativamente fuertes tienen pK bajo mientras que en los relativamente débiles es alto. Los amortiguadores resisten los cambios en el pH cuando se producen o consumen protones. La capacidad amortiguadora máxima a IT I unidad de pH en cualquier región de pK. Entre los amortiguadores fisiológicos importantes se encuentran el bicarbonato, e[ ortofosfato y las proteínas.
Estructura y funciones
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 . . Capítulo S.Yéptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 Capitulo 6 . Proteínas: estructura y función . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Capítulo 7 .Proteínas: mio~lobinay hemoglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Capitulo 8. Enzimas: propiedades generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Capitulo 9. Enzirnas: cinética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91 Capitulo 10.Enzirnas: mecanismos de acción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .111 Capitulo 11.Emzimas: regulacióln de actividades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Capítulo 4 Aminoácidos
Victor W Rodwell, PhD
Una de las múltiples funciones de los arninohcidos en las ~Clulasvivientes es la de servir como unidades monómeraq a partir de las cuales se sinteticen cadenas pEipéptidicas de proteinas. La mayoría de las proteinas contienen. cn proporciones diferentes, los mismos 20 1,-al fa-am inokidos. Muchas protcinas específicas contienen además aminoicidos 1.-alfa derivados de algunos de los 20 aminoacidos basicos mediante procesos que tienen lugar después de la fbrtnacibn del esqueleto fundamental del polipéptido. Estos aminohcidos "poco habituales" satisfacen funciones altamente específicas de la proteína en cuestidn. El tipo de aminoácido, el orden en que se unen y su relación espacia1 mutua estableceii las estructuras tridimensionales y las propiedades biológicas de proteínas simples y son determinantes importantes de la estructura 4 fiinción de proteinas complejas que contienen aderntis de aininoácidos, hem, carbohidratos, Iípidos, ácidos nucleicos, etcktcra. Este capítuIo estudia las estructuras, propiedades fisicas, estereoquim ica, reacciones químicas y equilibrios iOnicos de los L-alfaaminoacidos presentes en las proteínas.
trastornos graves. Varias enfermedades genéticas. Telativamente raras, del catabolismo de arninoácidos (como la fenilcetonuria y la enfermedad dc la orina de jarabe de rnaple) producen, si no se tratan, retraso mental y muerte temprana. Otros padecimientos genkticos pueden deberse a la alteración de la capacidad para transportar aminoácidos específicos a las células. Dado que estos defectos de transporte por lo común causan una excreción urinaria exagerada de uno a más amino8cidos, a menudo se designan como aminoacidurias. Además de sus actividades como proteinas, los 1,-arninoacidos y sus derivados participan en runciones intraceIuIares tan diversas como Ia transmisión nerviosa, la regulación del desarro110 celular y en la biosintesis de porfirinas, purínas, pirimidinas y de urea. IdosI .-arninohcidos de pkptidos de peso moIecular bajo actúan como hormonas y tanto los aminoicidos ri como los l. esthn presentes en 10% antihioticos polipeptidos elaborados por microorganismos.
PROPIEDADES DE LOS
AMINOACIDOS
El código genético específica 20 L - a l f a - a m i n o á c i d o s La alimentación humana debe coniencr cantidades adecuadas de 1 0 1,-alfa-aminoácidos esenciales, ya que, ni el ser humano ni los demás animales superiores pueden sintetizarlos en las proporciones necesarias para mantener el crecimiento infantiI o conservar la salud en los adultos. En forma de proteinas, los aminoAcidos realizin una multitud de funciones estructurales, hormonales y cataliticas esenciales para la vida. Por tanto, no sorprende que defectos genttícos en el metabolismo de los aminoacidos puedan conducir a
Aunque existen más de 300 arninoácidosdiferentes en la naturaleza, sólo un subconjunta de 20 constituye las unidades monomericas a partir de las cuales se construye el esqueleto básico de las proteínas polipeptidicsts. Un cbdigo genetico de tres letras no repetidas podría incluir más de 20 arninoacidos, pero la redundancia en el código genetico universal limita los codones de arninohcidos disponibles a los 20 arnino8cidos L-alfa que se presentan en e1 cuadro 4-1. Por consiguiente, todas las proteinas contienen diferentes pro-
30
(cupí6ulo 4)
Bioquimic.a de Harper
r i i s d rn 4-1.r.-alfa-~m~no"ácidos presentes -----
en las proteina~i --
I
iula estrur
Alanina
Lc---.:-'.
'
I,eu [l
i
.
-
-
- .
I--. 2.3
m
Con crdcnas laterales que tienen grupos bidroxila [OH)
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I -..---- 9.8
CkI2&.
I
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Treonina
I
2.1
9.1
Casi 13
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-.
Con cadenas laterales que contienen 4tomnr de azufr*
ci:
Cis [C
~n,-CH2-W
i Metionina -
8.3
CH,-CH-
SI
~
e [I t
-. - -- Con cadenas laterales que contienen grupos hcidos o sus amidas I
A
A--
"
ÁCido asphrtil
Asparagina
o[
Asn
Ac ido gIuiárnico Glu [E
Glutamina
A -
I
2 1.u
,Y.Y
-
u
Cuadro 4-f. t-milfa-Aminohcidos presentes en las proteínas (continuación) ---.*u..--. -A
"
A-----A
1 :on cadenais IatcralejI que conti
'
.
-."..".
NombriLI_- Silmbolo
1 A r e m1
1 1 istidina -iue contiei
Fistidina
1
Lis 1
icos 1 VCase desputs
F
Tirosina
rolina
porciones de estos 20 L-alfa-aminoAcidos. Sin embargo, ciertas proteínas contienen, además, aminohcidos L-alfa "poco habituales" originados en algunos de los 20 aminoácidos básicos mediante un procesamiento postraslacional (o sea, un proceso que tiene lugar despues de la fomaci6n de un esqueleto de polipép tidos). Un ejemplo frecuente es la cistina, que se produce por oxidacibn a partir de los grupos S H de dos cistefnas para convertirse en una unibn -S-S(disulfuro). Otros aminoficidos modificados menos comunes o "poco habituales" tambidn cumplen funciones muy especificas en las proteínas donde se encuentran. Algunos casos de modificaciones postraslacionales son la metitación, la formilaci6n, la acetilacibn, la psenilacidn, la carboxilacibn y la fosforilacibn (capítulo 40).
En las proteínas sólo existen L-alfa-aminoácidos Los aminohcidos contienen grupos funcionales amino y carboxilo. En un alfa-aminoAcido, ambos esthn unidos al mismo atomo de carbono (figura 4-1).
R-C-
NH,
I
COOH
R
o
Flgura 4-1. Dos representacionesde un alfa-aminoAcido.
(Capífulo 4)
Se dice que un átomo de carbono que tiene cuatro sustituyentes diferentes es un carbono quiral. Con excepcion de la glicina, para la cual R es un átomo de hidrógeno (figura 4-l), los cuatro grupos unidos al átomo de carbono alfa de los aminoácidoc son diferentes. Esta orientación tetraedrica de cuatro grupos distintos alrededor del carbono alfa le confiere actividad óptica (la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada) a 10s aminoácidos. A~inqueen las proteinas se han encontrado algunos aminoácidos dextrorrotatorios y algunos levorrotatorios a pI.1 7.0, todos tienen las configuraciones absolutas del bgliceraldehido por lo cual son L-alfa-aminoacidos. Dado que los u-aminoicidos existen en la naturaleza e inclusive en antibióticos polipeptldicos, ¿por q u e se encuentran sOlo L-aminoácidos en las proteínas? Los autores proponen la hipbtesis dc quc los L - a m i n o a c i d o s f u e r o n s e l e c c i o n a d o s por un fenómeno, en cierta manera fortuito, que tuvo lugar muy temprano durante la evolución de Ea vida.
Los aminoácidos pueden tener carga neta positiva, negativa o cero Los aminoácidos portan por lo menos dos grupos Bcidos débiles ionizables, un -COOH y un -NHq'. En solucibn, dos formas de estos grupos, una con carga y otra sin carga. existen en equilibrio protónico: R-COOH R-NH3'
-
R-COO-
e R-NH2
Figura 4-2. Estructura ionicamente correcta para un aminoacido a pH fisiológico o cerca de el (A). La estructura sin carga que se muestra en (B) no puede existir a ningún pH, pero es posible usarla por conveniencia cuando se describe la quimica de los aminoacidos
un grupo carboxilo estará presente como ion carboxi-
lato (R-COO-). Sin embargo, por conveniencia se utiliza la representación i3 para numerosas ecuaciones en las que no intervienen los equilibrios protbnicos.
Las fuenas relativas de los icidos débiles se expresan en términos de su pK, Las fuer7as relativas de los icidos dhbilec son expresadas en tkrminm de sus constantes de disociaci6n de ácidos, K,, o de su pK., que es simplemente el log negativo de la constante de disociación, esto es.
+ H'
+ H'
R-COOH y R-NHit representan los miembros protonados o acídicos en estos equilibrios. El R-COOy el R-NH2 son las bases conjugadas (es decir, los aceptores dc protones} de los ácidos correspondientes. Aunque el R X O O H y el R-NHj' son Acidos dhhiles, el R-COOH es un acido con mayor fuerza que el R-NH]'. Al pH de1 plasma sanguíneo o del liquido intracelular (7.4 y 7.1, respectivamente), los grupos carboxilos existen casi enteramente como iones carboxilato, R--COO-. A estos valores de pH, la mayoría de los grupos amino estfin predominantemente en la f o m a proíonada, R-NH?'. Las especies ionicas prevalentes de los aminoácidos en la sangre y en la mayoria de los tejidos, deberán representarse como se muestra en la figura 4-2A. La estructura E3 (figura 4-2) no puede existir a ningún pH. En un pH suficientemente bajo para ionizar al grupo carboxilo, el grupo amino con el Bcido rnh débil tambien se protonaría. A un pH dos unidades por debajo de su pK,, un hcido estarh protonado aproxiniadamente 99 por ciento. Si el pH se eleva de manera gradual, el protbn del ácido carboxílico se perderh mucho tiempo antes que el del R-NH3'. A cualquier pH bastante alto para que predomine [a base conjugada sin carga del grupo amino,
El cuadro 4-1 enumera los valores de pK para los grupos funcionales presentes en los 20 arninohcidos de las proteinas. Por conveniencia, el subindice a en K, y pK, queda implicito, pero se omitirá de aquí en adelante. La figura 4-3 iIustra Ias formas protonadas de los grupos R imidazol de la histidina y el grupo R guanidino de la arginina. Ambos existen como híbri-
NH
I C - NH,
!I
ONH,
-
NM
1 0 C=NHi,
I N'%
=
NH
i:.o
G~NH,
1:
NH2
Figura 43. Hlbridos de resonancia de las formas protonadas de los grupos R de histidina y arginina.
dos de resonancia, por lo que se pueden representar como se muestra a la derecha, con la carga positiva distribuida entre ambos nitrógenos (histidina) o sobre P los tres nitrogenos (arginina). La carga neta (la suma algebraica de todos los gnipos con cargas positivas y negativas que se encuentran presentes en la moléculaj de un aminoacido depende del pH o de la concentraci6n de protones de la solucihn en que se encuentren. La capacidad de alterar la carga de los aminoáicidos o de sus derivados por manipuIacíón del pH facilita la separación fisica de aminoácidos, péptidos y proteínas.
A su pH isoelectrico (pl), un aminoácido tiene una carga neta de cero Para un aminohcido aIifático como la alanina, la especie isoeléctrica es la forma que se muestra en la figura 4 4 . El pH isoeléctrico es el pH que esta en medio de los valores de pK de ambos lados de la especie isoeléctrica. Para un aminohcido con s61o dos grupos disociables, no puede haber ambigüedad posible, como se muestra abajo en el cálculo del p l para la alanina. Dado que p K l (R-COOH) = 2.35 y pKz(R-NH,') = 9.69, el pH isoeléctrico (pl) de la alanina es:
El calculo del pl para un compuesto con más de dos grupos disociables tiene una posibilidad mayor de m o r . Por ejemplo, considerando la figura 4-5, ¿cuál podria ser el pH isoeléctrico (p1) para el Acido aspartico? Primero, se escriben todas las estructuras ibnicas posibles para un cornpiiesto en el orden en el cual se presentan cuando se va de una solución fuertemente acida a una solución alcalina (por ejemplo, para el ácido aspártico en la figura 4-5). A continuación, se identifica la representaci6n isoibnica, zwitterionica o neutra (como en la figura 4-58). El pI es el pH que esta en medio de los vaiores de pK de ambos lados de las especies isoiónica.
II
O
Fiqura 4-4. Estructura isoeléctrica o "zwttteri6nica" de la alanina Aunque tiene carga, el zwitterlbn Presenta una carga neta igual a cero y por consiguiente no emigra en u n campo elkctrico de corriente directa.
En este ejemplo.
Este procedimiento es uti! para todos los aminoácidos con grupos disociables adicionales, como la lisina o la histidina. Qespuks de escribir las fórmulas para todas las especies cargadas posibles de los arninoacidos lisina y arginina, se observa que:
Para la Iisina, el pl es 9.7; para la arginina es 10.8. El ectiidiantc deberli determinar el pl para la histidina. Determinar por inspección de las estructuras cargadas, los valores de pK a ambos lados del zwitterion, no se limita a los aminoicidos. Puede ser aplicado al cálculo de la carga de una molécula con cualquier numero de grupos disociables. [,a capacidad de realizar cálculos de este tipo es valiosa en el laboratorio clínico para predecir la movilidad de los compuestos en los campos elkctricos y para seleccionar Iris arnortiguadores apropiados para Ias separaciones. Por ejemplo, un amortiguador a pH 7.0 podria separar dos moleculas con un pl de 6 y S, respectivamente, debido a que la molécula con pl = 6 tendrfi una carga negativa neta mayor a pH 7.0 que la molécula con pl = 8. Consideraciones análogas se aplican a la comprensión de separaciones sobre soportes ibnicos como las de polimeros con carga positiva o negativa (por ejemplo, celulosa DEAE o resina 1 Dowex).
La solubilidad y el punto de fusión de los aminoácidos reflejan su carácter iónico Dado que los aminoácidos poseen múltiples grupos con carga, se solvatan con facilidad y, por tanto, son solubles en solventes polares como agua y etanol, pero insoluhles en solventes no polares como benceno, hexano y &ter.Sus elevados puntos de fusidn (> 200 "C) reflejan la gran cantidad de energía necesaria para romper las fuerzas iónicas que estabilimn la red cristalina.
LOS AMINOAGIDOS PUEDEN CLASIFICARSE POR LAS POLARIDADES DE SUS GRUPOS R dividirse en dos Los aminoficidos proteinicos amplios grupos de acuerdo a la polaridad o no polari-
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Bioquimica de Hurper
(Capítulo 4)
En actdo fuerte (menor de pH 1); carganeta=+ 1
Aproximadamente pH6a8 carga neta = -1
Aproximadamente pH 3: carga neta = O
En hlcali fuerte (arriba de pW i1); carga neta = -2
Figura 4-5. Equilibrio protbnico del Bcido asplrtico.
dad de los grupos R adheridos a los átomos de carbono alfa (cuadro 4-2). Las abreviaturas de una sola letra (cuadro 4-1) se emplean para representar secuencias extremadamente largas de arninoacidos (por ejemplo, para anotar la secuencia completa de aminoacidos en una proteína). Los aminoácidos que se encuentran en estados libre o combinado (pero no en proteinas} desempefían funciones importantes en los procesos metabólícos. Por ejemplo, la ornitina, la cimilina y el arginosuccinato participan en la formación de la urea. Hay mas de 20 u-aminohcidos en la naturaleza, los cuales incluyen D-alanina y D-glutamato de las paredes celulares de ciertas bacterias y varios D-aminoácidos de antibióticos.
LOS GRUPOS ALFA-R DETERMINAN LAS PROPIEDADES DE CADA AMINOACIDO La glicina, el más pequefio de los aminoácidos, puede encajar en regiones de la estructura tridimensional de las proteinas inaccesibles para otros aminoácidos y se
Cuadro 6 2 . Ctasificaci6n de los alf fa-aminohcidos
presentes en las proteinas con base en su relativa liidrofilicidad (tendencia a asociarse con el agua) o hi dad (tcnd encia a asociarse a I qte no polar en lugar de agua) . -
- FIidrbfot.-LisA lanina Fr:niIalanina 1solcucina
Lc M PI Ti Triptófano Valina
l
-
"
"
-
"~
.. ..-.
1' w : 3 . . c E , . -
do aspártic o Áci do glutamico ,inina imagina Cisi:eina Glic:ina G lutamina
Histiclina Cisinia a -Serin. 1 reoriína
-.-
encuentra en regiones donde tos pdptidos se doblan en forma aguda. Los grupos R alifáticos de alanina, valina, leucina e isoleucina y los gmpos R aromáticos de fenilalanina, tirosina y triptdfano son hidrof6bicos, propiedad que tiene consecuencias importantes para el ordenamiento de !as moldculas de agua de las proteinas que estan en la vecindad inmediata. Es tlpica la presencia de estos aminohcidos en el interior de proteinas citosólicas. Los grupos R con carga, de los aminoácidos básicos y acidicos, estabilizan las conformaciones proteínicas especificaspor intermedio de la formación de enlaces salinos. Por ejemplo, la rotura y reconsúucciSn de enlaces salinos que acompafla a la oxigenación y desoxigenación de la hemoglobina (capitulo 7). Además, los aminokidos con grupos Rde cargapositiva o negativa funcionan en los sistemas de "transmisibn de carga" que las transportan a distancias considerables durante la catálisis enzimática. Por último, la histidina tiene funciones unicas en la catalisis enzimática, debido a que el pK de su protón imidazblico le permite, a pH 7.0, funcionar alternativamente como base o como acido catalitico. El grupo alcohol primario de la serina y el grupo tioalcohot primario (-SI+) de la cistelna son nucleófi los excelentes y pueden funcionar como tales en muchos procesos de la catklisis enzimhtica. Aunque el alcohol secundario de la treonina es tambitn un buen nucleófilo, no se sabe que se comporte como taI en la catálisis. Además de su papel catalitico, el grupo 4 H de la serina y de la tirosina actúa en la regulación de la actividad de ciertas enzirnas cuya acción catatitica depende del estado de fosforilación de residuos seril o tirosil especificas. Los arninohcidos no absorkn la luz visible (es decir, son incoloros) y, con excepcibn de los arninoficidos aromaticos triptófano, tirosina, fenilalanina e histidina, tampoco absorben la luz ultravioleta de una longitud de onda mayor de 240 nm. Varios aminoAcidos, particularmente el triptdfano, absorben luz ultravioleta de longitud de onda de alta frecuencia (250 a 290 nm) (figura 4 4 ) . Aunque el triptofano es relativamente
dos también reaccionan, pero con mayor lentitud que un alfa-aminoácido. La prolina y la 4- hidroxiprolina producen un color amarillo con ninhidrina. La fluorescamina (figura 4 - 9 , un reactivo aun más sensible, puede detectar nanogramos de un aminohcido. Igual que la ninhidrina, Sa fluorescamina f u m a un complejo con arninas de otros compuestos además de los arninoácidos.
VARIAS TÉCNICASAISLAN LOS AMINOACIDOS Crornatog rafía 240
260
280
Longitud de onda (nm)
Figura 4 4 . Espectrode absorcidn ultravioleta del triptbfano, tirosina y fenilalanina.
poco común en la mayoria de las proteínas, contribuye de manera importante a la capacidad de muchas de ellas, para absorber h z en la región de los 280 nm.
En todas las separaciones cromatográficas, las moldculas son separadas dentro de una fase estacionaria y una rnbvil. La separacion depende de la tendencia !elativa de tas moléculas en la mezcla para asociarse con mayor fuerza a una o a otra fase. Aunque estas tkcnicas de separacidn se describen principalmente en reIaci6n con aminoácidos, su uso de ninguna manera está restringido a estas moléculas.
Cromatografía en papel
LA NlNHlDRlNA O LA FLUORESCAMINA DETECTA LOS AMINOACIDOS
La ninhidrina (figura 4-7) descarboxila por oxidación los alfa-aminohcidos a Coz,NN3 y un aldehido con un htomo de carbono menos que el arninoficido precursor. Luego, la ninhidrina reducida reacciona con el amoniaco liberado, formando un complejri azul que absorbe al rnkirno la luz a una longitud de onda de 570 nm. Este color azul es la base de una prueba cuantitativa para alfa-aminohcidos que puede detectar cantidades de aminoAcidos tan pequeflas como 1 pg. Otras arninas distintas a los alfa-aminoicidos también reaccionan con ninhidrina dando un color azul, pero sin liberar Coz.Por tanto, la formación de COZindica Ea presencia de un alfa-aminohcido. El NH, y los pépti-
Para la cromatografia en papel, se coloca una gota de solucibn que contenga uno o mas aminokidos a unos 5 cm del borde de una tira de papel filtro. La tira se coloca en un vaso cerrado donde su extremo entra en contacto CUII un solvente, generalmente un alcohol de bajo peso molecular en solución saturada con agua que contiene un ficido o una base. Despds de la migración del solvente sobre el papel, se seca la tira, se trata con ninhidrina en acetona y se calienta un poco; entonces las posiciones de los arninoácidos aparecen como puntos de color purpura (figura 4-9). Los aminoácidos con grandes cadenas laterales no polares (Leu, Ile, Fen, Tri, Val, Met, Tir) emigran m& que los que tienen cadenas laterales mas cortas no polares (Pro, Ala) o cadenas laterales polares (TE, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lis, Cis) (figura 4-9). Esto
Figura 4-7. Ninhidrina.
Figura 4-8. Fluorescamina.
(Capítulo 4)
sentidode rnigracibn
1
1
del solvente
Cis
4 Tri
-origen
*
-Iir
)
Met
'
Figura 4-9. ldentificacibnde los aminoAcidos presentes en las proteínas DespuBc de crornatwrafia descendiente en papel, en A-butanol. ;ícido acético. agua, las manchas fueron vistas al añadir ninhidrina
refleja la mayor solubilidad relativa de las moltculas polares en la fase estacionaria hidr6fila y de las moI&culas no polares en solventes orgánicos. Para una serie no polar (Gli, Ala, Val, Leu), a mayor longitud de !a cadena lateral no polar se incrementa su caracter no polar lo cual aumenta su movilidad. La relacibn entre la distancia recorrida por un aminohcido con la distancia que viaja ei solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicacibn de la rne7cla de arninoácidos, se designa como valor RF (movilidad relativa con el solvente) de ese aminohcido. Los valores RFpara un aminohcido dado varían de acuerdo con las condiciones experimentales, por ejemplo, según solvente usado. Aunque es posible identificar tentativamente un aminohcido s61o por su valor RF,es preferible hacer la cromatografia estandar de aminoácidos conocidos de manera simultáneacon la mezcla desconocida. Luego, la movilidad puede expresarse en relacion a la de uo esthndar (es decir, como RI,m8s que como Rf). Las movilidades expresadas como relativas a un estAndar varían menos que los valores Rf de un experimento a otro.
Cromatografía en capa fina Hay dos tipos distintos de cromatografia en capa fina (CCF): CCF de partición (CCFP) y CCF de absorción (CCFA). En Ia CCF de partfcion, la resolucibn implica
particihn de los elementos de una mezcla entrz dos
fases liquidas: una estacionaria y otra móvil de polaridad diferente, conforme la fase móvil pasa sobre [a estacionaria. La separacidn se produce por la diferencia de solubilidad de los componentes en las fases estacionaria y móvil. En la CCFP nonnal, la fase ectacionana es el componente más polar. El solvente desarrollado contiene ambos elementos: polares y débilmente no polares, típicamente agua, un alcohol de 4 o de 5 carbones y un Acido débil o una base débil como ácido acético o arnoniaco. Conforme se desplaza sobre la placa de apoyo, el solvente cambia de composición debido a los elementos más polares que acornpairan a los grupos - O H polares de la celulosa. Por tanto, el solvente que avanza paulatinamente se convierte en más no polar. Los componentes más no polares de una mczcIa se desplazan mLs lejos que los componentes mas polares de igual tamafio. Por ejemplo, el glutamato y la lisina se retardan, en tanto que la leucina y la valina migran junto con el solvente. En la CCFP en "fase reversa", tanto las polaridades de las fases como las movilidades de los componentes de la mezcla se revierten respecto a la CCFP normal. La fase móvil suministra la fase polar. La fase estacionaria, por lo común celulosa recubierta con un líquido no polar como el aceite de silicon, suministra la fase más no polar. En contraste con la CCFP normal, los componentes polares rnigran con el solvente en tanto que se retrasa el desplazamiento de los componentes menos polares. En la CCF de absorción (CCFA), la separacidn se basa en un principio totalmente diferente. La resolucibn implica absorber los componentes de la mezcla en gel de sílice que se calienta para expulsar toda el agua fija. La fase móvil, típicamente una mezcla simple o binaria de calventes organices, desplaza los compuestos absorbidos compitiendo por los sitios de unibn sobre el gel de sltice. Primero se desplazan los componentes unidos con menor firmeza y asf se logra la resolucibn.
Cromatografía de intercam bia ionico El anhlisis de los residuos de aminolicidos despuks de la hidrólisis de un polipéptido, por la general involucra a la crornatografía automatizada d e intercambio i6nico. La separación, identificación y cuantiticación completas requieren menos de tres horas. EI procedimiento de Moore y Stein utiliza una columna corta y una larga las cuales contienen la forma ionizada de Na" de una resina de poliestireno sulfonatada. Cuando e3 ácido hidrolizado a pH 2 se apZica a las columnas, los arninoácidos se unen mediante el intercambio de cationes con el catión Na'. Las columnas se eluyen despues con citrato de sodio bajo condiciones prede-
Aminoácidos
terminadas de pH y temperatura. El material eluido se hace reaccionar con la solucibn de ninhidrina y las densidades de la coloración se miden en un colorimetro de flujo. Los datos aparecen en un tubo de sayos catbdicos con integración relacionada con cornputadora de las áreas pico (figura 4-1 0).
Electroforesic de alto voltaje (EAV) Las separaciones de aminoacidos, polipkptidos y otros anfhlitos (moléculas cuya carga neta depende del pH del entorno) en un campo el6ctrico de corriente directa tienen extensa aplicación en bioquimica. Para los aminoCicidos. las hojas de papel o capas finas de celulosa en polvo son las que se usan Con mayor frecuencia como soportes inertes. Para poliptptidos grandes o proteínas, se emplea gel de poliacrilamida con enlaces cruzados. Para oligcimeros de nuclehtidos se utilizan soportes de agarosa y poliacrilarnida. Las separaciones dependen de la carga neta del anfólito y del peso molecular de los compuestos que seran separados. Para molécuIas con carga idéntica, la de peso molecular más bajo emigra más lejos. Sin embargo, la carga neta es el factor mas importante que determina la separación. Esta técnica es htil para aminohcidos, polipeptidos de peso molecular bajo, ciertas proteínas, nucleótidos y fosfoazúcares. Las muestras se aplican a! soporte, que a continuación se humedece en una solución amortiguadora de un pH apropiado y se pone en contacto con reservorios de amortiguador
* 37
mediante tiras de papel. El papel puede cubrirse con una placa de vidrio o sumergirse en un hidrocarburo refrigerante. Al aplicar lacorriente, las mol&culascon carga negativa neta al pH seIeccionado, emigran hacia el Iinodo y aquellas con carga positiva neta, hacia el chtodo. Para visualizar la separacidn, el electroferograma ya seco es tratado con ninhidrina (aminohcidos, péptidos) o expuesto a la liiz ultravioleta (nuclebtidos). La elección de pH es dictada por los valores de pK de los grupos que se disocian en las rnol&culasde la mezcla.
LOS GRUPOS FUNCIONALES DETERMINAN LAS REACCIONES Q U ~ M ~ C ADE S LOS AMINOACIDOS Los grupos funcionales que poseen los aminoácidos gobiernan las reacciones quimicas en las que participan, las funciones Bcidas alfa-amino y alfa-carboxílica y los grupos Funcionales presentes en los grupos R. Cada grupo funcional puede participar en todas sus reacciones químicas características. Estas reacciones incluyen para los grupos del Iicido carboxílico, la ionización y ia formación de &teres. amidas y anhidridos ficidos. Estas reacciones incluyen la ionizaciiin, la acilacibn y la esteri ficacibn d e grupos amino, oxidacibn y alquilación de grupos -SH, y esterificacibn de grupos -OH, etcétera.
Figura 4-10. Anhlisis automatizado de los aminoácidos presentes en un hidrolizado de proteínas. Los arninoacidos se adsorben en una resina intercambiadora de cationes en una base de poliestireno, Dowex 50, se eluyeron con amortiguadores del pH indicado, se sometieron a reaccidn Con ninhidrina y se registr6 la absorbencia a 570 y 440 nrn (para detectar prolina). Las hreas máximas son proporcionales a la canttdad existente de cada aminoácido. Una columna corta (A) determina arninoAciUoc bastms a pH 5.28. La elución de una columna mBc larga (B) a pH 3.25 y 4.25, identifica los amino8cidos restantes. El aminohcido no proteinico norleucina sirve como estBndar intenso
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Bioquímica de Hurper
comprender la conversion previa en un cloruro de acido. En los procesos biolbgicos, la activación comprende una condensación inicial con ATP con la formacibn de un am inoaciladenilato.
RESUMEN
Figura 4-1 1. Aminoicidos unidos por un enlace peptídim (porei6n sombreada).
LA REACCION MAS IMPORTANTE DE LOS AMINOACIQOS ES LA FORMACIÓN DEL ENLACE PEPTIDICO En principio, la formacion del enlace peptídico comprende la eliminacion de un m01 de agua entre el grupo aIfa-amino de un aminoácido y el grupo alfa carboxilo de un segundo aminoácido (figura4-11). N o obstante, esta reacción no procede en esta direccibn, ya que la constante de equilibrio favorece con firmeza la hidrólisic del enlace peptídico. Para sintetizar la unibn entre dos aminohcidos, primero debe activarse el grupo carboxilo. Desde el punto de vistaquimico, esto puede
Sblo los L-alfa-aminoácidos forman las protelnas, aunque en la naturaleza existen o-aminoácidos y no al fa-aminoácidos. Todos los aminoácidos poseen por lo menos dos grupos funcionales acidos débiles, RNHH y R-CQOH, que, para los arninoacidos protelnicos, residen en el átomo de carbono alfa. Adernas, estos y otros grupos funcionares hcidos ddbiles ( 4 H , -SH, guanidino, imidazol) determinan que la carga neta en un aminoácido varíe con el pH. Por tanto, los arninoacidos son anfhlitos cuya carga neta a un pH dado depende de los valores de pK, de sus grupos funcionales. El pI es el pI4 en el que un amínohcido tiene una carga neta igual a cero y por ende no se mueve en un campo elkctric~de corriente directa. AdernBs de determinar las relaciones de carga y las clases de reacciones qulmicas que un aminohcido experimentará (por lo cual la formación del enlace peptidico es de suma importancia}, los grupos R y sus funcionalidades definen las funciones bioauimicas únicas para cada aminohcido. Las funcionalidades del grupo R proporcionan también una base para clasificar a los aminoácidos como básicos, ácidos, aramhticos, alifáticos y con contenido de azufre. Después de la separacion de mezclas de aminohcidos por particihn o cromatografia de intercambio iónico, estos compuestos pueden detectarse y cuantificarse por su reaccibn con ninhidrina. E
REFERENCIAS Barrett GC: Chemistty and Biochem~s~ty of rhe Amino Acids. Chapman & Hall, 1985. Davies JS: Amzno A c ~ d sand Peptides Chapman & Hall. 1985. Gehrke CW et al.: Amino Acid Analysis by Gas Chromatography. 3 vals. CRC Press, 1987.
Hancock WS: llandbook of IfPLCJnr the Sepuratinn of Amino Acids, Peptides, and Proteins. 2 vols. CRC Press. 1984. Hugli TE: Teckniques rn Protein C'herrnisfry.Acadcmic Press, 1989. Rattenbury 1981.
JM: Amrno Acid
Analysis. Halstcad Press,
Péptidos .
.
Vicior W. Rodwell, PhD
La polimerización de los L-alfa-aminoácidos por enlaces peptidicos constituye el marco estructural para las proteínas. Este capitulo describe las características de estos enlaces, las propiedades de los péptidos, los m&todos para deteminar la estructura primaria de los mismos y de las proteínas así como las tdcnicas para la sintesis de péptidos.
Idos pdptidos tienen un enorme inteds biornédico, en particular para endocrinologia. Muchas de las hormonas son péptidos y pueden suminislrarse a los pacientes para corregir deficiencias (como la administración de insulina a pacientes con diabetes sacarina). Ciertos antibibticos son peptidos (por ejemplo, la valinomicina y la gsamicidina A), igual que algunos agentes antitumorales (como la bleomicina). Por su parte, el dipéptido aspartame se utiliza como edulcorante en muchas bebidas. La dpida síntesis quirnica y la tecnologia de recombinacibn del DNA facilitan la producción de cantidades sustanciales de hormonas peptídicas que en el cuerpo existen solo en concentraciones rninimas, por lo cual son dificiles de aislar en cantidad suficiente para usarse en teraptutica. La misma tecnologia permite la slntesis de otras péptidos, también disponibles de fuentes naturales, pero solo en cantidades pequeilas (es eE caso de ciertos peptidos y proteínas viralec), para usarse en vacunas.
LOS L-ALFA-AMINOACIDOSSE UNEN MEDIANTE ENLACES PEPT~DICOS PARA FORMAR LOS PEPTIDOS En la figura 5-1 se muestra un tripkpcido constituido por alanina, cisteina y valina. Advierta que un tripdptido es aquél formado con tres residuos. no con tres enlaces peptidicos. Por convencion, las estructuras peptidicas se escriben con el residuo amino-terminal (el residuo con un gmpo de alfa amino libre) a ta izquierda y con el residuo carboxiío terminal (et residuo con un gmpo alfacarboxiIo libre) a laderecha. Este péptido tiene un solo grupo alfa amino libre y un solo grupo a3fa carboxilo libre. Sin embargo, en algunos péptidos, los grupos terminales arnino o carboxilo pueden derivarse (por ejemplo, una amina N-fomilo o una amida del gmpo carboxilo) y por tanto no están libres.
Alanil
Cisteinil
Valloa
Figura 5-1. Fbrmula estructural de un tripkptido. Los enlaces peptídicos están sombreados para enfatizarlos.
Las estructuras de los péptidos son fáciles de representar Por conveniencia, los peptidos se representan con su terminal amino a la izquierda y la terminal carboxilo a la derecha de la página. Para mostrar las estructuras de los péptidos, primero se dibuja la cadena principal o esqueleto y en seguida se agregan los grupos R apropiados. Escriba un zig-zag formado a partir de la secuencia de Atomos que se repite en el esqueleto o cadena principal: alfa-nitrbgeno, alfa-carbono, carbiin carbonilo.
Después, se completan las terminales atnino y carboxilo, se agrega un hidrogeno a cada uno de los alfacarbonos y a cada nitrógeno del pbptido; ademhs se añade oxígeno a los carbonos carbonilos.
alanilo, aspartilo, tirosilo). Los ptptidos reciben su nombre como derivados de la terminal carboxilo del residuo aminoacilo. Por ejemplo, el tmapéptido LisLeu-Tir-Gln se denomina como derivado de la glutamina y se le llama lisil-leucil-tirosil-glutamina.La terminación -ina en la glutmina indica que su grupo atfa-carboxilo no participa en la formación del enlace del péptido.
La estructura primaria afecta la actividad biológica La mutación del DNA que altera codones puede producir la inserción de grupos aminoacilo inapropiados en un polipkptido o proteina. Aunque a menudo no tiene el mayor efecto biolbgico, en ocasiones incluso una sola sustitución puede reducir o abolir la actividad bioE6gica con efectos resultantes leves (es el caso de la intolerancia al alcohol en muchos asihtiticos) o mhs serios {como la enfermedad de ckluIas falciformes). Muchos errores metab6licos hereditarios comprenden un cambio sencillo de este tipo. Ai respeczo. b s nuevos mdtodos para determinar la estructura proteinica y del DNA han incrementado de manera notable la comprensión de la bioquimica de numerosas enfermedades metabolicas hereditarias.
Para dar nombre a los aminoácidos existentes en los péptidos se utilizan abreviaturas Por ultimo, se incluyen los grupos R apropiados (con sombra) a cada átomo de alfa-carbono.
lC /c\ /N\ \ / COQN C
/ c\ / Ci-h
H
l
O
H/C\cY I
Se utilizan las abreviaturas de 3 y de 1 letras de los aminolicidos (cuadro 4-1) para representar las esmcturas primarias (figura 5-2). Las abreviaturas de tres letras ligadas por líneas rectas, qresentan una estructura primaria conocida e inequlvoca. Estas líneas se omiten para las abreviaturas de una sola l&a. Cuando hay incertidumbre acerca del orden preciso de una porción de un polipkptido, los residuos en duda se encierran en parentesis y separados por comas (figura 5-3).
Numerosos péptidos tienen actividad fisielogica La secuencia de aminoácidos determina la estructura primaria de un péptido Cuando el número, estructura y orden de todos los residuos de aminoácidos en un polipéptido se conocen, su estructura primaria ha sido determinada. Los aminoácidos cuyos grupos alfa-carboxilo participan en la formacibn de los enjaces del péptido se designan "residuos aminoacilo". Estos se denominan mediante la sustitucibn de las terminaciones -ato o -ina de los arninohcidos libres, por la terminación -ilo (como
Las cklulas animales, vegetales y bacterianas contienen diversos polipkptidos de peso molecular bajo
Glu-Ala-Lis-Gli-Tir-Ala
E A K G Y A Figura 5-2. Representacibn de 3 y 1 letra de un hexapbptido.
Figura 53. Heptapeptido que contiene una regidn de estruci tura primaria incierta (en el parbntesis)
(3 a 100 residuos aminoacilos) que tienen actividad fisioldgica importante. Algunos, incluyendo la mayoría de las hormonas polipeptidicas de tos marniferos, contienen solo enlaces peptidicos formados entre los grupos alfa-amino y alfa-carboxilo de los L-aifa-aminohcidos de las protelnas. Sin embargo, en los polipéptidos también pueden existir aminoacidos o derivados de aminohcidos proteinicas adicionales. El glutatihn (figura 541,en el cual el glutamato amino-terminal estB enlazado a la cisteína por un enlace alfa no peptidico, es requerido por varias enzimas. El glutatión y la enzima glutatibn reductasa participan en la forrnacibn de los puentes disulfuro correctos de numerosas hormonas proteinicas y polipeptidicas así como tarnbidn en el metabolismo de los xenobióticos (capitulo 6 1). Los antibióticos polipeptidicos elaborados por hongos contienen aminohcidos D y L así como otros no presentes en las proteinas. Ejemplos son la tirocidina y la gramicidina S, polipkptidos clcIicos que contienen n-fenilalanina y e[ aminohcido no proteinico ornitina. La hormona liberadora de tirotropina (TRH, del inglds, flyrotropin-releming hormone} (figura 5-5) ejemplifica otra variante más. El glutamato amino-termina1 experimenta ciclizaci6n a hcido pirogluthmico y el carboxilo del propilo carboxilo terminal se arnida. Un polipéprido de mamífero puede contener más de wn +pido con actividad fisiol6gicapotente. Denm de la estructura primaria de la beta-lipotropina (hormona hipofisaria que estimula la liberación de hcidos grasos del tejido adiposo) hay secuencias de aminohcjdos que son comunes a otras hormonas polipep-
CH,
O II
/C\N/CH\C/N\CH, CHz 1 I
7%
H 1
I
H
Flgura 5-5. TRH (pir~lutamilhistidiIprolinamida).
tidicas con actividades fisioldgicas diversas (figura 54). El poli@ptido grande es un precursor de los poIipkptidos menores.
Los peptidoc con polielectrólitos El enlace peptidico (mida) no estA cargado a cualquier pH de interés fisiolligico. Por tanto, la forrnacibn de péptidos a partir de arninohcidos a pH de 7.4 se acompafia de una pérdida neta de una carga positiva y una negativa, por cada en!ace peptidico formado. No obstante, a pH 5siolbgico los peptidos son maléculas con carga debido a sus grupos R ácidos o básicos.
El enlace peptidico tiene carácter de enlace doble parcial Aunque los péptidos se representan con un enlace sencillo que conecta los htomos alfa-carboxilo y alfanitrdgeno, este enlace tiene en realidad un caracter de doble ligadura parcial (figura 5-7). No posee libertad de rotación alrededor de[ enlace que conecta a los htomos C y N. En consecuencia, los cuatro iitornos mostrados en la figura 5-7yacen en el mismo plano, esto es, son coplanares. Esta semirrigidez tiene consecuencias importantes para órdenes de estructura proteínica superiores al primer nivel. Por el contrario, hay plena libertad de rotacibn alrededor de los enlaces remanentes del esqueleto polipeptidico. En la figura 5-8, que resume estos conceptos, los enlaces que tienen rotación libre estan circundados por flechas y los átomos coplanares se han sombreado.
Las fuenas no covalentes restringen II
O
I COO -
H-C-NH~+ I
COO -
Figura 6 4 . Glutatibn (gamma-giutarnilcisteinil-glicha).Obsérvese el enlace ara no peptldiw que une a la Glu con Cis
la conformación de los péptidos Un polipkptido puede tener un gran número de conformaciones (disposiciones espaciales). Sin embargo, en solución tiende a predominar un número mucho menor de conformaciones. Estas conformaciones favorecidas resultan de factores como bloqueo espacial,
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a
Biogulmica de H a r ~ e r
(Capitulo 5)
Metioninaencefalina
Figura 54. Estructura primaria de la beta-lipotropina. Los residuos 41 a 58 son la hormona estimulante de los melanocitoc (0-MSH). Los residuos 61 a 91 mntienen las estructuras primarias de las endorfinas sefíaladas.
interacciones coulómbicas, puentes de hidrhgeno e interacciones hidrbfobas. T m t o para que las proteinas, como para que los poli@ptidos (capítulo 6) tengan actividad fisiológica se reqviercn ~onformacionesespecíficas.
El m g o de variacibn de los residuos no consewados de una proteína entre especies indica la divergencia de
SECUENCIACI~NPROTE~NICA: DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA
La comparación de las secuencias de los peptidos muestra residuos clave e interrelaciones filogenéticas La comparacibn de las estructuras primarias de una proteína determinada entre organismos con reIacibn distante, proporciona indicios vitales respecto al modo en que una proteína puede servir como componente del citoesqueleto, transportador de electrones o catalizador.
Ffgun 5-7. La estabilrzacibn por resonancia del enlace peptidico le confiere un cardcter de doble enlace parcial, de ahi la rigidez en el enlace C-N.
Ftgura 5 4 . Dimensionesde una cadena polipeptidica completamente extendidas. Los cuatro $tomos que se encuentran en las áreas sombreadas, las cuales son coplanares, comprenden al enlace polipeptidico Los átomos en las áreas no sombreadas son los átomos alfa carbono, alfa hidrbgeno y el grupo alfa R de un aminofiado en particular. La libre rotacibn puede producirse alrededor de los enlaces que unen el alfa carbono con el alfa nitrbgeno y las funciones del alfa carbonilo (flechas azules). La cadena de polipéptido extendida es asi una estructura semirrigida con dos teroeras partes de los Btomos de la estructura unidos en una relación planar fijada La distancia entre los Btomos alfa carbono adyacentes es de 0.36 nm (3.6 A) También se muestra la distancia interatbmica y los Angulos de enlace, los cuales no son equivalentes (Redibujada y reproducida con autoriracibn de Pauling L, Corey LP. Branson HR, The structure o€ proteins Two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proc Natl Acad Sci USA 1957;37:205.)
las mismas durante la evolucibn. Las relaciones evolutivas estrechas se vinculan con un alto grado de semejanza de las secuencias. mientras que las relaciones mas distantes corresponden a más diferencias en las secuencias. Esta interrelacibn, que primero se documentb en el iibicuo residuo 104 a 1 11 del polipeptido transportador de electrones citocromo c, se mantiene como verdadera en un número cada vez mayor de proteinas.
Los peptidos se purifican antes
del análisis Los datos de secuenciacion de los pdptidos serlan ininterpretables a menos que la homogeneidad peptídica. valorada por EGPASDS. excediera de 95 por ciento. Por tanto, los pkptidos deben purificarse primero mediante tkcnicas convencionales de purificacibn de proteínas (capitulo 8).
Por lo general primero se determina la composición de los aminoácidos 1,a determinación de los aminoácidos que componen un péptído, por lo general, se lleva a cabo antes de iniciar la secuenciacion, para identificar los posibles escollos y, de manera subsiguiente verificar los datos de secuenciacidn. Primero se rompen los enlaces peptldicos que unen a los aminohcidos por hidrólisis. Luego, los aminoicidos liberados se separan e identifican por LLAR o cromatografia de intercambio i6nico. Ningun procedimiento hidroliza pkpcidos de manera total sin algunas pdrdidas. El mdtodo de: eIeccibn es la hidrdlisis de muestras repetidas en HCI 6N a 110 "C en tubos de vidrio sellados al vacío por 24, 48,72 y 96 horas. Esto destruye todos los Tri y Cis, y si estan presentes iones rnetblicos, se pierde algo de Met y Tir. I,a recuperacibn de Ser y Tre es incompleta. Los enlaces Val-Val, Ile-[le, Val-Ile e Ile-Val, son muy resistentes a la hidrdlisis, en tanto que Gln y Asn son desarninados a GIu y d s p . ¿Cómo se superan estas dificultades? Antes de la hidrdlisis, la Cis se convierte en hcido cisteico, un derivado ácido estable. El Tri se mide desputs de la hidrdlisis bhsica, proceso que destruye a la Ser, Tre, Arg y Cis. Los datos de Ser y Tre se extrapolan al tiempo cero de la hidrdlisis. La Val y la t e u se determinan de datos obtenidos a las 96 horas. Sobre los hcidos dicarboxilicos y sus arnidas se informan de manera colectiva como "Glx" o "Asx". Por ultimo, dado que las proporciones relativas de cada aminohcido deben expresarse en números enteros, las fracciones decimales se redondean al nhrnero entero más próximo.
Sanger fue el primero en secuenciar un polipéptido Casi cuatro ddcadas han transcurrido desde que Sanger detenni116 la estructura primaria completa de la hormona polipeptidica insulina. La idea de Sanger h e separar primero las dos cadenas polipeptídicas, A y 0, de la insulina y entonces convertirlas, mediante separación enzimhtica especifica, en péptidos más pequeílos que contuvieran regiones de secuencia sobrepuesta. Utilizando el reactivo l -fluoro-2,4-dinitrobenceno (figura 5-9), entonces removio e identificó, uno en cada ocasibn, los residuos aminoterminales de los aminokcidos de estos pkptidos. Por medio de la comparación de las secuencias de péptidos sobrepuestas. fue capaz de deducir una estructura primaria inequívoca para ambas cadenas, A y B. Las siguientes dos tkcnicas han revolucionado la determinación de las estructuras primarias de los polipkptidos (proteínas). La primera fue la introducci6n por Edman, en 1967, de un procedimiento para la separacion e identificación automfitica de residuos ítmino terminales de aminoácidos asi como sus derivados feniltiohidantoinicos. La segunda fue la introducción independiente por Sanger y por Maxm y Gilbert de tkcnicas para la secuenciación rápida del DNA. En la actualidad, la estrategia óptima consiste en utili7ar ambas técnicas de manera simulthnea.
Las estructuras primarias de los polipéptidos se determinan por la técnica automatizada de Edman Dado que numerosas protelnas están constituidas por más de una cadena polipeptidica ligada por fuerzas no covalentes o pos puentes disulfuro, es posible que el primer paso sea disociar y separar las cadenas poli-
Figura 5-9. Reacción de un arnino~cidocon 1-fluoro-2,4dinitrobsnmno (reactivo de Sanger). El reactivo recibe ese nombre en honor del bioqulmico Frederick Sanger, laureado con el premio Nobel en 1958. quien lo us6 para determinar la estructura primarta de la insulina.
peptídicas individuales. Los agentes desnaturalizantes como ta urea o el clorhidrato de guanidina destruyen los puentes de hidrógeno, y disocian polipéptidos unidos de modo no covalente. Por su parte, los agentes oxídantes y reductores rompen los puentes disulfuro (figura 5-1 0). Entonces los polipCptidos son separados pos cromatografia.
anhidrido citracbnico (una reacción reversible) para cambiar su carga de positiva a negativa, ahora la tripsina se separa solo despues de Arg. La obtención de residuos de arginina es menos útil, debido a la abundancia relativa de residuos de lisina. No obstante, resulta de utilidad en la divisihn subsecuente de fraprnentos obtenidos con CNBr.
Los polipéptidos largos se fraccionan antes de su secuenciación
C. o-Yodosobenceno
[,os instrumentos automáticos mas eficaces para Ia obtencibn de secuencias (secuenciadores) operan sobre polipéptidos de 20 a 60 residuos de longitud. Por tanto, es deseable una partición especifica y completa en sitios relativamente raros. Los reactivos siguientes cumplen con este requerimiento.
A. Bromuro de cianógeno (CNBr) Inicialmente, los residuos de cisteina son modificados con ácido yodoacético. Despuks, el CNBr rompe en el lado COOH de la Met. Puesto que la metionina es comparativamente escasa en los polipéptidos, por lo general se producen fragmentos peptidicos dentro de los limites de tamafio deseado.
B. Tripsina
El o-yodosobenceno fracciona los relativamente escasos residuos de Trí-X. No se requiere una proteccibn previa de los demas residuos.
D. Hidroxiiamina La hidrox i larn ina separa los enlaces comparativamente raros de Asn-Gli, aunque por 10 general no da resultados cuantitativos.
E. Proteasa V8 La proteasa V8 de Staphylococcus aureus separa los residuos Glu-X-pdptido con preferencia por condiciones en que X es hidrdfobo. La uni6n Glu-Lis resiste el fraccionamiento. Esta reaccibn es útil para la degadacibn subsecuente de fragmentos obtenidos con bromuro de cianógeno.
La tripsina rompe el lado COOH de los residuos Lis
y Arg. Si los residuos de lisina son obtenidos con
F. Hidróiisis con ácidos moderadamente débiles Esta separa el enlace raro ~sp-!+o.
La secuenciación requiere de múltiples digestiones Las 2 o 3 digestiones del polipdptido original, normalmente en Me[, Tri, Arg y Asn-Gli, combinadas con subdigestiones apropiadas de los fragmentos resultantes, por lo general permitir& la determinacibn de la estructura primaria completa del polipeptido. Exceptuando algunas dificultades extraordinarias en la purificacibn de los fragmentos, kstapuede efectuarse con unos pocos micromoles del polipéptido.
LAS MEZCLAS DE PÉPTIDOS DEBEN SEPARARSE ANTES DE LA SECUENCIACI~N
Figura 5-10. Separacibn oxidativa de cadenas polipeptldicas adyacentes enlazadas por puentes disulfuro (sombreado) por Bcido perfbrmrco (lzqulerda) o la separacidn reductiva con beta-mercaptoetanal (derecha) forman dos pbptidos que incorporan residuos de Acido eisteico o de cisteinilo, respectivamente.
La purificación de fragmentos se logra principalmente por filt~aci6nen gel en iicido acético o fbmico por cromatografia liquida de alto rendimiento de fase invertida (CLAR) o por cromatografía de intercambio i6nico en fosfocelulosa o en sulfofenil-Sephadex en soluciones de k i d o fosfbrico.
A. Cromatografia de intercambio iónico y electroforesis de alto voltaje (EA Estas técnicas (capitulo 4), que separan con base en la carga, se adican a polipkptidos de peso molecular bajo y también a aminoácidos. El valor de pK para el grupo carboxilo-terminal del hcido alfa-carboxilico de un polipéptido es más alto que el del grupo alfacarboxilo en el aminoAcido correspondiente (es decir, el COOH peptídico es un hcido mas dkbil). De m a n e p inversa, el grupo amino-terminal es un ácido rnhs fuerte (tiene un pK menor) que el aminoacido del cual proviene.
B. Filtracibn en gel La secuenciación automatizada utiliza cantidades pequeiias de polipéptidos grandestde30 a 100 residuos). Sin embargo, muchos polipkptidos de peso molecular alto desnaturalizados pueden ser insofubles debido a la exposicibn de residuos hidrófobos antes escondidos durante la desnaturalimciiin. Aunque la insolubilidad puede resolverse con urea, alcoholes, hcidos orgánicos o bases, estos restringen el uso subsiguiente de tCcnicas de intercambio ibnico para la purificacibn de péptidos. Sin embargo, la filtración en gel de ptptidos hidrbfobos grandes puede llevarse a cabo entre hcido formico o acético, I y 4 molar. Esta tkcnica separa moliculas de tamaflos diferentes con base en su exclusión o inclusión en los poros de un filtro molccular como Sephadex.
C. CLAR de fase invedida Una tdcnica potente para la purificación de péptidos no polares de peso molecular grande es la cromatografia líquida de alto rendimiento en material no polar con elucibn mediante solventes polares (CLAR de fase invertida). La filtracibn en gel y la CLAR de fase invertida se emplean juntas para purificar las mezclas complejas de péptidos obtenidas por digestibn parciai de proteinas.
D. EA V en filtros moleculares La filtracirin molecular puede usarse junto con la separacibn por carga para facilitar la particibn. Aunque es posible emplear almidbn y agarosa, el soporte mhs común es un polimero de enlaces cruzados de acrilarnida (CHi=CN-CONH2). Para la electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA), las soluciones de proteínas se vacian en tubos o se aplican en placas que contienen un amortiguador de poliacrilamida can 2 a 10% de enlaces cruzados por inclusibn de bisacrilamida de metileno (bis) (CHZ=CH-CONH~)~-CH~ o reactivos con enlaces cruzados similares. Luego se aplica corriente directa. La visualizacián se logra por tincibn con azul de Coornassie o Ag". Una variante popular es la EGPA bajo condiciones de desnaturalizacihn. Las proteinas se hierven y a continuacibn se
someten a etectroforesic en presencia del compuesto desnaturalizante dodecilsulfato sbdico (SDS). Ea molécula con carga negativa CH3-(CH2)ii-S012recubre a los pkptidos en la proporcibn aproximada de un SDS por cada dos enlaces peptidicos. Esto "sumerge*' la carga original de la proteina, volviendola fuertemente negativa. Así, las separaciones subsiguientes se basan de manera primaria en el tamaflo molecular. El EGPA-SDS se usa de manera extensa para determinar los pesos moleculares de péptidos por comparación de sus movilidades con la de esthdares de pesos moleculares conocidos.
Para la secuenciación se utiliza la reacción de Edman La secuenciación automatizada utiliza el reactivo de Edman, fenilisotiocianato. La reaccion de secuencia (figura 5-1 1) libera el aminohcido arnino-terminal como un derivado de la feniltiohidantoina, el cual se identifica mediante C LAR. E! prbximo arninoálcido por secuenciar entonces se deriva y se elimina; luego se repite el proceso. Una secuencia de 30 a 40, o, en ocasiones, 60 a 80, residuos aminoácidos se determina en una operación continua. Las reacciones de Edman se llevan a cabo en una pelicula delgada sobre la pared de una cámara de reaccibn giratoria o en una matriz s61ida a la cual el carboxilo terminal del pdptido se ha acoplado de manera covalente. La secuenciación en fase gaseosa, una técnica en fase sblida, emplea reactivos gaseosos y facilita la remoción de productos gaseosos. Los metodos de secuenciacibn en fase sólida son aplicables a cantidades muy pequefias de péptidos, en algunos de hasta 1 pg.
Deben secuenciarse varios péptidos sobrepuestos Conocer la secuencia de todos los peptidos CNBr de una proteina no proporciona, por si mismo, su estructura primaria completa ya que no se sabe el orden en que estos péptidos se encuentran en la proteína. Para deducir una estructura primaria inequívoca tambikn deben prepararse y cecuenciarse péptidos adicionales cuyas teminaies m i n o y carboxilo se sobrepongan con los de los peptidos CNBr. Estos ptrptidos adicionales se producen por tecnicas (por ejemplo, digestion con quimiotripsina) que dividen la proteina en otros lugares distintos aresiduos Met. Luego, La deduccibn de una estructura primaria inequivoca por comparación de secuencias peptidicas se efectiia por un proceso aniilogo al ensamblaje de un rompecabezas (figura 5-12). Para localizar los puentes disulfuro, los péptidos de protelna sin tratar y de proteina reducida u oxidada
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Bioquímica de H q e r
(Capítulo 5j
Fenilisotrocianato(reactivode Edrnan)
Pomi6n
y un peptido
C-terminal del peptido X
Porcibn
N-terminal del pbptido Y
Figura 5-32. Uso del peptido Z sobrepuesto para deducir que los pépttdos X y Y ectbn presentes en la proteina original enelom'enX~Y,noYtX.
La secuenciación de péptidos y de DNA son técnicas complementarias
metano
Una feniltiohidantolna y un peptido mds corto en un residuo
Figura 5-71. Reaccidn de Edman. El fenilisotiocianato reacciona con el amino-terminal de un residuo de un peptido para dar acido feniltiohidantotw El tratamiento con acido en un solvente hidroxilim libera una feniltiohidantoína la cual es identificada posteriormente mediante su movilidad crornatogrhfica y un phptido mas corto en un residuo. Entonces el proceso se repite
se separan por cromatografía bidimensional o por electroforesis y cromatografía (huellas dactilares). La visualizacidn con ninhidrina revela los piptidos mhs escasos en la digestión de protelna sin tratar y un pkptido adicional en la digestibn de proteina tratada. Con el conocimiento de la estructura primaria de estos péptidos, es posible inferir las posiciones de los puentes disulfuro.
Aunque la simplicidad y velocidad de la técnica de secuenciacibn del DNA (capítulo 42) ha revolucionado la forma en que se determinan las estructuras peptidicas; la secuenciación de péptidos y DNA son tecnicas complementarias más que mutuamente exclusivas, cada una con ciertas ventajas. En tanto que las estructuras primarias de las proteínas se pueden deducir mediante la secuenciación de los genes que Eas codifican, la secuenciacibn directa de las proteínas continúa siendo esencial para el anhlisis de su estructura. La secuenciación del DNA no puede mostrar la posición de los puentes disulfuro o la presencia de otras muchas modificaciones postraslacionales. Los codones triples y tas moléculas apropiadas de tRNA solo se encuentran disponibles para Eos 20 arninoacidos más comunes. Por tanto, la secuenciacjbn del DNA no puede revelar la presencia de propilo, hidroxilisil o un hutsped metilado, isoprentilado, fosforitado, esterifjcado u otros residuos aminoacilo postraslacionales modificados que efecttian funciones esenciales en proteinas especificas. Así, la técnica de Edman continuarii siendo fundamental para demostrar la determinación esrruct~ralde pkptidos y proteínas. Aunque la secuenciacibn de péptidos no presenta estas desventajas, muchos de ellos experimentan una o más modificaciones postraslación por procesamiento proteolítico. Por tanto, la secuenciacibn de DNA es una ayuda valiosa para detectar prepéptidos y prepropkptidos Ilibiles importantes en la cathlisis (capitulo 10) o en la sefializacibn de péptidos dirigidos a organelos subcelulares específicos.
La espectometria de masas puede utilizarse para secuenciar péptidos El bombardeo rápido de fitomos (BRA) unido a la espectrometria de masas (EM), en dos espectrómetros
de masa integrados. proporciona un camino alternativo para secuenciar péptidos con longitud de alrededor de 25 residuos. El bombardeo rápido por átomos de argon o xenbn, de los htomos de un péptido disuelto en glicerol forma un ibn pkptido con carga positiva. El primer espectt-ografo de masa limpia el ion gkptido de iones contaminantes, y luego lo transfiere a una celdilta en donde colisiona con atomos de helio. Debido a la energía que absorbe, el ion pkptido se fragmenta a partir de sus dos terminales con lo cual forma mliltiples iones de tamafío decreciente.Entoncw, en el segundo espectrómetro de masa se determina la masa molecular de estos fragmentos del ion. La comparacion de los iones de acuerdo con los incrementos sucesivos de masa,permite la identificación de todos los fragmentes aminoacilo y de la secuencia del péptido completo. La tkcnica BRA dirigida por computadora es muy rápida, no requiere pkptidos altamente purificados, identifica residuos modificados por traslacibn y, a diferencia de la tdcnica de Edman, puede cecuenciar péptidos cuyas terminales amino están bloqueadas (por ejemplo, aciladas). En comparación con los secuenciadores avanzados de Edman, las principales desventajas del BRA-EM son su alto costo y menor sensibilidad.
LOS PÉPTIDOS PUEDEN SINTETIZARSE MEDIANTE TECNICAS AUTOMATIZADAS Las péptidos que se obtienen mediante síntesis qulmica sirven como fArmacos o aditivos alimentarios. La capacidad para sintetizar conjuntos de peptidos similares, cuyas estnicturas primarias difieren sblo un poco, permite profundim en el conocimiento de la relacibn entre la estructura del péptido y la actividad bioldgica. La qufmica básica de la sintesis de los péptidos, desarrollada a fines del decenio de 1800 por el químico a l e m h Emil Fisisher, proporciona los elementos para la activaci6n de los grupos carboxilo y para la adición y eliminación de los grupos bloqueados, que evita reacciones colaterales indeseables. Muchos aAos despues, las tkcnicas de sintesis de los pbptidos fueron evolucionados por Bmce MerrifieEd (Premio Nobel 19841, quien desarrollb la síntesis en fase dlida. La tdcnica automeica de síntesis de Merrifield que produce ptptidos largos sintkticos en periodos cortos, inicib un renacimiento en la química de los péptidos.
Síntesis de peptidos en fase sólida La figura 5-1 3-muestrala sintesic de un dipéptido A-B representativo (en el cual A es la terminal m i n o y E
Figura 5-13, Representaubn sirnbblica de la sintesis de un dipéptido genérico por la técnica de fase s6Fida iniciada por MernReld Véase el texto para explicación de los simbolos.
la termina carboxito del residuo aminoacilo), rnediante la tkcnica en fase s6lida de Merrifield y resume las reacciones que se requieren para sintetizar un ptptido de cualquier tamaño deseado. Estos pasos son como sigue:
1) Proteger las terminales amino del aminohcido A (en blanco) y del arninoiicido B (en negro) con el grupo t-butiloxicnrboniIo (t-BOC) (m):
famando t-BOC-A y t-BOC-B. 2) Activar el gmpo carboxilo de t-BOC-B con diciclohexilcarbodiimida (DCC) (b):
48
3) Hacer reaccionar al grupo carboxilo del aminoácido A (que se convertírh en el residuo carboxilo4)
5)
6) 7)
(Capítulo 5)
Bioquimica de Hurper
terminal del peptido) con una resina activada de poliestireno insoluble @I Eliminar al grupo protector de r-BOC-A con ácido tnfluoroac&tico(TFA, F 3 C 4 0 0 N )a la temperatura ambiente. (Nota: En la prhctica, es posible omitir los pasos 3 y 4 puesto que ya se dispone en el comercio de resinas con cualquier aminoácido f-BOC conectado por un enlace éster a una moltcula "enlazadora" de fenilacetamidometilo, PAM, del inglks, p h e ~ lucetamidometkyí),adherida al pol iest ireno. Condensar el grupo carboxilo activado de t-BOCR con el grupo amino libre del inmovilizado A. Eliminar el grupo protector (d-BOC) con TFA (véase paso 4). Liberar el dipéptido A-13 de la particula de resina por tratamiento a -2 "C con hcido hidroflubico (HF) en diclorometano.
Los logros iniciales de la técnica de Merrifield fueron la síntesis de las cadenas A y B de inculina y de la enzima pancrektica ribonucleasa. Mejoras subsecuentes han reducido el tiempo para la sintesis y han incrementado el rendimiento de manera significativa. Esto ha abierto el campo para producir vacunas y hormonas polipeptldicas y aun puede pensarse en tratar errores congénitos del metabolismo seleccionados.
RESUMEN Los pkptidos, formados por la pérdida de agua entre los grupos carboxilo y amino de los aminohcidos, se designan de acuerdo al numero de aminoicidos presentes. Sus estructuras primarias (orden de aminoácidos listados desde la amino-terminal) determinan la actividad biológica y las conformaciones. Los péptidos
pequefios pueden contener enlaces diferentes a alfa-peptidilo y aminolcidos poco comunes. Como poiielectrblitos, los pkptidos se separan por crornatografia de intercambio iónico y técnicas electrofor&ticas. El carácter de doble ligadura parcial del enlace que une al carbono del COOH y al N de un péptido, hace que cuatro Iitomos del enlace peptidiw sean coplanares. Esto limita el numero de conformaciones peptidicas posibles. En solucibn. estas conformaciones son restringidas aún m8s por fuerzas no covalentes. Despuks de la hidrblisis Acida es posible deteminar la composición de los péptidos purificados, pero se requiere correccihn por perdida de ciertos aminolcidos. La determinacibn de la estructura primaria emplea tkcnicas de Edman automatizadas, que pueden realizar la secuenciacibn en cantidades tan pequefias de hasta microgramos de phptido purificado. Primero se oxidan o reducen los enlaces disuffuro. Las péptidos grandes se escinden en sitios raros con reactivos como CNBry los pkptidos resultantes se purifican por filtración en gel y CLAR. Luego pueden enlazarse por su terminal carboxilo a un soporte sólido para facilitar la secuenciacibn.Lar operaciones automáticas subsiguientes comprenden quimica de líquidos o reactivos y productos gaseosos que facilitan la recuperación y purificacibn de la muestra. Por lo general pueden secuenciarse hasta 40 residuos mino-tem inales sucesivos. Para definir el orden de ensamblaje de los ptptidos secuenciados en el polipéptido original. se determina la secuencia de péptidos sobrepuestos generados por diferentes ttcnicas de partición. De manera alterna, los enlaces entre péptidos pueden inferirse de la secuencia de DNA del gen apropiado. Por tanto, las tkcnicas de secuenciacion de DNA y péptidos son complementarias, no mutuamente excluyentes. Ademis, las tkcnicas automáticas permiten la síntesis inequívoca de pdptidos de estructura primaria conocida y actividad biol6gica completa..
REFERENCIAS Allen G:Sequencing of proteins and peptides. In: Laboratory Techniques rn Biochemistry rvnd Molecular Riulo&,
2nd edl Burdon RH,Knippenberg PH. Elsevier,
3989. Bhwon AS: ProieidPeptide Sequence Analysis: Current Meihodologies. CRC Press. 1988. Bienmann K: Mass spectrometry of peptides and proteins. Annu Rev Biochem 1992;61:977. Deutscher MP (editor): Guide bo Protern PuriJicabron. Methods in Enzymology, vol 182, 1990. Doolittle RF (editor): Makcular Evolirtion: Campufer A nalys~sofProlein nnd Nucleic AcidSeguences Methods in Enzymology, vol 183, 1990.
Doolittle RF: Reconstructing history with mino acid se-
quences. Protein Sci 1992;1:E 91. Fenselau C: Beyond gene sequencing: Analysis of proteín structure with mass spectrometry. Annu Rev Biophys
Biophys Chem 1991;20:205.
m, Strickler JE, W i b o n KJ: Contemporary methodology fos protein structure determination. Science 1984;226:304. Karger BL, Chy YH, Foret P: Capillary electrophoresis of proteins and nucleic acids. Annu Rev Biophys Biomol Struct 1995;24:579. Kent SBH: Chemical synthesis of peptides and proteins. Annu Rev Biochem 1988;57:957. Hunkapiller
MerrifieEd RB: S o l i d phasc s y n t h e c i s . Science 19&6:232:341. Ozols J : Amino acid analysis. Methods Enzymol 1990;182 587 Regnier FE,Gooding KM: High performance liquid chromatography of proteins. Anal Biochem 1980.103:1 . Sanger F:Sequences, sequences. and sequences. Annu Rev Hiochem 1988;57: 1 . Senko MW,McLafferty FW: Mass svctrometry of mac-
romolecules Has its time come now? Annu Rev Riophys Riomol Struct 1994:23.763.
Stellwagen E: G e l filtration. M e t h o d s Enzymol 1990:182:317 Stoscheck CM: Quanlilation of proteins. Methods Enzymol 1990,182:50. Strickler JE, Hunkapiller MW,Wilson KJ: Utility of the gas-phase sequencer for both liquid- and solid-phse degradaiion of proteins and peptides al law picomole levels. Anal Biochem 1984:140:553. Wilson KJ: Micro-leve1 protein and peptide separations. Trends Biol Sci 1989; 14:252.
Proteínas: estructura y función Victor W Rodwell, PhD
dc vilaminas, oxígeno y bióxido de carbono, ademAs de
Las características comunes a todas las proteinas incluyen restricciones en su conformación por enlaces covalentes y no covalentes. En este capítulo 5e analizan las estructuras secundaria, terciaria y cuatemarfa de las proteínas. con énfasis en las fuerzas que estabilizan estos ordenes m& elevados de estructum y los metodos físico5 empleados para examinarlos. Los principales temas iiicluyeii hdlice alfa, hoja beta, giro beta y asa; el modo en que estas estructuras características secundarias Sorman dominios y estructuras terciarias; así como el ensamblado de polipiptidos en subunidades de proteinas multiméricas. Además, se examinan las vias propuestas para que las proteíiias se plieguen y el papel de las chaperoninas {proteinas acornpafiantes)y de otras proteinas accesorias que facilitan el rápido y correcto plegamiento in vnJo Las ~amcterísticn~ y comentarios mencionados antes generalmente son validos para todas aunque algunas proteinas especificas pueden mostrar estructuras secundarias y terciarias peculiares que Ies confieren propiedades para cumplir funciones biologicas también especifica. Se ilustra la estrecha vinciilacilin entre estructura y funci6n biolhgica de estas rnolt5culas mediante dos proteinas fibrosas que tienen funciones estructurales: la fibroina de la seda y el colageno. Los capitulos subsecuentes amplian esta estrecha reIaci6n al estudiar las proteinar globulares mioglobina y hemoglobiiia así como las proteínas catalíticas conocidas como eiizimas.
IMPORTANCIA BIOMEDICA Los millares de proteínas presentes en el cuerpo humano realizan funciones demasiado numerosas para enumerarlas. Entre ellas están: servir como portadores
llevar a cabo actividades estructurales, cineticas, cataliiicas y de señalización. Por tanto, no deben sorprender las terribles consecuencias que pueden surgir de mutaciones en genes que codifican proteínas o en regiones de DNA que controlan la expresibn genktica Asimismo, pueden derivar consecuencias igualmente desastrosas de la deficiencia de cofictores csenciales para la maduración de una proteína. El sindrome de EhlersDanlos ilustra defectos geneticos en la rnaduraciOn proteínica y el escorbuto la deficiencia de un coiactor esencial para esta maduracion.
LAS PROTE~NASSE CLASIFICAN EN NUMEROSAS FORMAS Si bien no existe un sistema universal, las proteínas pueden clasificarse con base en su solubilidad, forma, función biolbgica o estructura tridimensional. Un sistema de uso limitado en bioquimica clinica las clasifica como "albiiminas", "globulinas". "historias", etcétera, dependiendo de su solubilidad en soluciones salinas acuosas. Tambikn pueden clasificarse bashndose en su fonna global. Así, las proteinas globulares (por ejemplo, numerosas enzirnas) tienen cadenas polipeptidicas enrolladas, plegadas cn forma compacta y proporciones axiles (proporciones dc longitud a anchura) menores de 10 y que iio exceden de 3 a 4 por lo general. Las proteinas fibrosas tienen proporciones axiles mayores de 10 Las proteinas pueden clasiticarse según sus funciones bioIogicas en: cnzimar (deshidrogenasas, cinasas), proteinas de alrnacenainiento (ferritina, mioglobina), reguladoras (proteínas unidas a DNA, hormonas peptídicas), estructurales (colligeno, proteoglucanos), protectoras (factores de coagulación sanguínea, inrnu-
52
(Capitulo ti)
Bioquírnicu de Harper
noglobulinas), de transporte (hemoglobina, Iipoproteinas plasnihticas) y contráctiles o dotadas de motilidad (actina. tubilina). Sistemas especialiados de clasificacibn distinguen ciertas proteinas complejas de interés médico elevado. De este inodo, las lipoproteinas plasmhticas se denominan de "origen", lipoproteinas alfa,, alfaz o beta de acuerdo con su movilidad elemforéticaap1-I 8.6;o como quilomicrones, VLDI,, 1-DL, HDL o VHDL basándose en sus propiedades de sedimentación en una ultracentri fugación (figura 6- 1 ). Las lipoproteínas puedcn clasi ficarse tam bien por deteminacibn inmunol0gica dc las apopruteinas presentes (A, B, C, D, E, F). Asimismo. las semejanzas en la estructura tridimeiisional. reveladas principa2rnente por cristalografia con rayos X. proporcionan una base potencialmente valiosa para la clasificación de proteinas. Por ejemplo, las proteinas qiie unen nuclcótidos comparten un dominio fijador de nucleiitido de estructura terciaria.
ESTRUCTURA PRIMARIA La estructura primaria de la cadena polipeptidica de una proteína es el orden en el cual los aminoacidos se
unen e incluye la uhlcacidn de los enlaces bisulhro. La estructura primaria se determina por métodos descritos para polipkptidos en el capítulo S. El nbrnero de las secuencias conocidas de proteínas es tan grande y crece con tal rapidez que, en la actualidad, en vez de disponer de formas impresas, los datos de las secuencias se depositan en bases de datos electrhnicac de secuencias de proteinas a las cuales se puede tencr acceso a través de Internet. Las bases de datos importantes continuamente actualizadas inc lu yen EM R L (Europeun Molecu~ur13ioloa Laboraiory Oaia I,ibrary), GenBank (Genefic Sequence Dafabank), y PIK (Protein fdenllficdron Resource S~quenceDufuhuse).
ESTRUCTURA SECUNDARIA Configuración y conformación El tkrtnino "configuracion" se refiere a las relaciones gcométricas entre un conjunto dado de htomos, La interconversión de alternativas diferentes de configuracibn (por ejemplo, !a conversión de 0- a L-alanina) sulo se puede logmr rompiendo y restableciendo uniones covalentes. fl importante término similar "conformación " se refiere a la arquitectura tridirnensional de una proteína. las relaciones espaciales de todos los itomos entre sí. La interconversión de estructuras conformadas no implica la rotura de uniones covalentcs sino la rotura y restablecimiento de fuerzas no covalentes (puentes de hidrógeno, puentes salinos, interacciones hidr~fobas)que estabilizan una conformaci6n dada Incluso después de excluir las ~onfonnacionesque las interacciones estcricas impiden, la rotación libre alrededor de las dos terceras partes de las uniones covalentes dc la cadena principal de un polipéptido (figura 5-81 permite clasificar por etapas un gran númcro de conformaciones posibles para una proteína d e t e n i nada. Sin embargo, para una cierta proteina s61o un pequefío número de posibles conformaciones tienen significacibn biolbgica.
Diferentes fuenas que estabilizan las estructuras proteínicas Tama Ao
Más graride
Figura 6-1. Magnitud y densidad de distribucibn de las lipoproteínas (CHYLO. quilomicrones; VLDL, lrpoproteinas de muy baja densidad, LDL. Iipoproteinas de baja densidad, HDL, lipoproteínas de alta densidad; Lp [a], Iipoproteina [a]) (Reproducida con autorizacibn de Segrest JP y colaboradores The amphipathic alfa-helix A rnultrfundionalstructural motrf in plasma Itpoproteins Adv Protein Chem 1995;45 303)
Varías interacciones no covalentcs que individualmente son dgbiles, pero formidables en número. estabilizan la conformacion de una proteina. Estas fuenas incluyen puentes de hidrhgeno, interacciones hidrófobas, interacciones electrostáticas y f u e r m ~de van der Waals.
Puentes de hidrógeno En la superficie de las proteinas globulares por lo general se encuentran residuos con grupos R polares,
Proteinus: esfrucfuray función
los cuales forman puentes de hidrógeno principalmente con moléculas de agua. Por otra parte, los residuos aminoacilo del esqueleto carbhnico forman puentes de hidrogeno entre si.
Interacciones hidrófobas Las interacciones hidrófobas implican a los grupos R no polares de los residuos arninoacilo que en las proteínas globulares típicas residen en el interior de Ea proteína. La formación de interacciones hidrhfobas es "conducida por la entropia". Una forma esférica regular reduce al mínimo el área de supedcie. [,a concentracibnde residuos no polares en el interior de la proteína disminuye cI número de residuos superficiales e incrementa al m b u n o la oportunidad para que la pelicula superficial de moldculas de agua formen puentes dc hidrhgeno entre si, uii proceso relacionado con un incremeiito de la entropia. Por cI contrario, el ambiente no polar dc las membranas biológicas favorece a los residuos hidrófobos de la superficie. cuyos grupos R no polares participan en interacciones hidrlirobas con las cadenas laterales alquil de los ésteres acilgrasos de las bicapas de la membrana.
Interaccionec electrostáticas Las interacciones eiectrosthticac o puentes salinos se forman entre grupos con carga opuesta, como los gmpos terminales amino y carboxilo de los péptidos y los grupos R cagados de los residuos aminoacilos. Aunque todos los gmpos con carga forma1 tienden a localizarse sobre la supesficie las proteínas globulares, hay excepciones, pues existen grupos polares específicos ejecut a n t e ~de funciones biológicas indispensables, los cuales es posible que residan en hendiduras quc penetran hasta el interior de la proteína. 13uesto que los residuos polares también pueden participar en interacciones ihnicas, la presencia de sales como KCI puede disminuir de manera significativa las interacciones iónicas entre los residuos de la superfície.
Interacciones de las fuerzas de van der Waals Las fuerzas de van der Waals, que son sumamente dkbiles y sblo actúan a distancias extremadamente cortas, incluyen componentes de airaccihn y de repulsión. Las fuerzas de atraccibn implican interacción enve dipolos inducidos formados por las occilaciones instanthneas en la distribucion de electrones en los htomos cercanos. Las fuerzas repulsivas entran en juego cuando dos Atomos se aproximan tanto que sus orbitales electrónicoc se superponen. La distancia a la cual la fuerza de atracciciii es rnAxima y la fuerza de
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repulsión es mínima se denomina distancia de contacto van der Waals. Los átomos tienen un radio van der Waals característico y la distancia de contacto óptima entre dos es la suma de sus radios van der Waals.
Uniones peptídicas que restringen las posibles conformaciones secundarias La rotacidn solo es posible alrededor de 2 de las 3 uniones covalentes que forman el esqueleto polipeptidico de las proteínas. El carhcter de doble unión parcial de la ligadura que unc el grupo carbonilo al nitrógeno alfa de la uniiin peptidíca restringe de manera significativa las confomaciones posibles de los átomos que la constituyen, la cual debe ser coplanar (figura 5-8). La rotación sólo puede darse alrededor de las unioncs entre eE carbón alfa (Cm) al carbbn carbonilo (C,) y al se nitrogeno. El ángulo alrededor de la unión C,-N denomina ángulo fi (m) y el que se encuentra alrededor de la unión C,-C, es el ingulo psi (Y). No e s t h permitidas las combinaciones de los IinguEos fi-psf qiie produ7can impedimento estérico entre los Atomos no s y unidos. Cuando se especifican todos los ~ g u l o fi psi, se conoce la conforrnaci6n de la totalidad de Atomos de la cadena principal o esqueleto de u n polipéptido. Por tanto, el anhlisis de los datos crista1ogr;ificos empieza con la deteminacilin de los principales ángulos fi y psi de la cadena. G.N. Ramachandran fue el primero en emplear una grhfica de los Angulos fi contra los ángulos psi para ilustrar tanto los valores permitidos como los numerosos, no permitidos (figura 61-21.Las combinaciones estéricamente permitidas caracterizan a la Ii&licealfa y a la hoja plegada beta y a la helice triple de colágeno w a l i ~ a d amás adelante.
Las conformaciones regulares e irregulares caracterizan a la estructura secundaria La conformacibn de los esqueletos polipeptidicos de las proteínas constituye su estructura secundaria. Al principio, la existencia de una estructura secundaria se propuso con bases exclusivamente teoricas, pero despuks los analisis cristalográficos de rayos X las confirmaron ampliamente. Los tipos de estructura secundaria esthn limitados por el carlicter de doble uni6n parcial de la unibn peptídica (figuras 5-7 y 5-8) y por el tarnaiio y la forma de los grupos R arninoácidos. Las estructuras secundarias incluyen, ademas de Ias unidades hélices alfa regulares repetitivas, las hojas beta y las incurvaciones beta con formaciones irregulares denominadas asas o bobinas.
Waals que pueden formar y estabilizar un tipo determinado de hdice. Las helices alfa tienen ángulos favorables fi y psi y un patrbn de uniones de hidriigeno que les conficre la máxima estabilidad. Las hklices alfa de proteínas contienen, en todas partes, de 4 a 50 residuos (en promedio cerca de 12 residuos). Los parametros relevantes de una helice-alfa (figura 6-3) son n = 3.6 residuos por vuelta y p = 0.54 nm (5.4 A). La distancia a 10 largo del eje de la hélice que separa htornos equivalentes en las cadenas principales, de los residuos adyacentes es de O. 15 nrn (1.5 A). Los grupos Rarninoacil se dirigen hacia afuera del eje de la hClice (figuras 6 4 y 6-51, lo cual reduce al mínimo la interferencia esterica.
Las uniones de hidrógeno y las f u e n a s de van der Waals estabilizan las hélices alfa
Q Figura 6-2. GrBfica de Ramachandrande 10s ángulac fi y pci de la cadena principal para 1000recidvos no giicina aproximadamente, en ocho proteinas cuyas estructuras fueron resueltas a resolución alta. Los puntos representan las mmbinaciones pemitidas y los espacios las combinaciones prohibidas de Bngulos fi-psi (Reproducida con autorización de Richardson JS. The anatomy and taxonomy of protein structures Adv Protein Chem 1981,34 167.)
Puesto que la hélice alfa es la confomacibn de menor Y más estable para una cadena de P ~ ~ ~ se forma de manera espontánea. La estabilidad de las
La hélice alfa Cuando se gira el esqueleto de iin polipeptido por una magnitud igual alrededor de cada carbón alfa, se forma una bobina o hélice. Los diferentes tipoc de hélices
formados cuando los giroc tienen dirección y extensibn diferentes se describen según el número (n) de residuos aminohcidos por vuelta y el paso Ip) o distancia por vuelta que la hélice se eleva alrededor de su eje. Las hélices polipeptidicas están formadas por aminoácidos quiraIes (estrwcturas que no pueden superponer su imagen en espejo, como las manos) y por tanto muestran quiralismo -o sea, son hélices con giros hacia Ea derecha o hacia la izquierda. Para visualizar una hElice derecha, se debe mantener la mano derecha con la palma hacia arriba, los dedos ligeramente curvados y el pulgar apuntando alejándose de uno mismo. El pulgar sefiala en la dirección del carboxilo terminal del polipeptido de hélice derecha, el cual avanza en la dirección de los dedos curvados. Aunque los polipéptidos sinteticos de D-aminoácidos pueden furmar hélices izquierdas, la interferencia estérica de los grupos R de los residuos L-arninoacilos determina que las hélices izquierdas no pueden tener lugar en las proteinas. Idos tipos de hilices polipeptidicas presentes en las proteinas, además están limitadas por factores cstéricos adicionales y por el numero de posibles puentes de hidrógeno e interacciones de van der
------ - -
I
0 54-nm paso (3 6 residuos)
1
- --
1 - -0 -1 5-n m- -
t
Figura 6-3. Orientacibn de átomos de la cadena principal de
u n peptido alrededor del eje de una h8lice alfa
P
Figura 6 6 . Vista superior del eje de una hélice alfa Las cadenas laterales (R) están en el exterior de la hélice Los radios de van der Waals de los Atomos son mas grandes que los mostrados aqui; por tanto. casi no hay espacio libre en el interior de la hélice (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacion de Stryer L Biochernistry, 2a ed Freeman, 1981. Copyright 1995 por W H Freeman y Cia.)
mente encaja en la primera vuelta de una hélice alfa En otro puiito produce una incurvación. Sin embargo, n o todas las incurvaciones en las hélices alfa son causadas por residuos prolilo. Las curvaturas también tienen lugar con frecuencia eii los residuos GIi. Figura 6-4. Puentes de hidrógeno (puntos) formados entre Alomos de H y O estabilizan un polipeptido en una conformación alfa helicoidal (Reimpreso con autorización de Haggrs GH y colaboradores Introducfronto Molecular Brology Wiley, 1964 )
hélices alfa se debe principalmente a la formación del máximo número posible de puentes de hidrúgeno. Los nitrógenos peptidicos actúan como donadores de hidrhgcno, y el oxigeno del carbonilo del cuarto residiio en linea posterior cn un sentido estructural primario actúa corno aceptador de hidrógeno (figura 6-4). Estos puentes de hidrógeno tienen una distancia N-a-O practicamente óptima dc 20 nm (2.8 A). Las interacciones van der Waals tambitn confieren mayor estabilidad, pues los átomos firmemente empaquetados en el núcleo de una hélice alfa están en contacto van der Waals con otros a través del eje de la helice alfa.
La prolina puede doblar una hélice alfa En las hélices alfa son residuosmas comunes Ala, Glu, Leu y Met que Gli, Pro, Ser, o Tir. Sin embargo, esta tendencia no es util para proncisticos cstructuraIes. Puesto que el nitrbieno pcptidico de un residuo proilo, no puede I'orrnar un pucn te tle tiidrógeno, la psoliaa sola-
Las hélices alfa pueden ser anfipáticas Aunque por lo común, las hClices alfa se encuentran en la superficie dc las proteinas, también pueden estar total o parcialmente integradas en el interior de una proteína La hélicc antipática, un caso especial en el cual los residuos alternan entre hidroSbbicos e hidrofilicos casi cada 3 o 4 residuos (figura 6 4 ) , tienc lugar donde las helices alfa forman interfase con un ambientc al mismo tiempo polar y no polar. Aiiinisrno, las hélices anfipáticas sc presentan en las lipoproteinas plasrnaticas y en ciertas hormonas polipí.ptjdas, venenos, antibihticos, glucoproteinas del virus de la inrnunodeficiencia humana y en proteínas cinasa reguladas por calmodulina.
Los aminoácidos de diferentes regiones forman hojas beta La segunda conforn~aciónregular, presente en la mayor parte de las proteinas, es la hoja plegada-beta. Se le llama beta porque fue la segunda estructura regular descrita. Por su parte, el término "110,ja plegada" describe su aspecto cuando se le obscrva con el borde hacia arriba. Los carbones alfa y sus grupos R relacionados alternati entre un plano ligeramente arriba
56
Bioquimica de Hurper
Figura 6-6, Representaciónespiral de aminoAcrdos en una hélrce alfa anfipLtica. Las hkiicec de las apolipoproteínas plasrn$ticas son anfrpSticas: es decir, una cara es polar y la otra no polar. Los residuos están gratificados con 100" de separación (360°13.6 residuos = 100" por residuo) mirando hacia abajo del eje de la hblice Los círculos negros representan residuos no polares y los circulos blancos, residuos polares.
y otro ligeramente abajo de la cadena principal del polipeptido (figura 6-71, Como las hklices alfa, las hojas beta tienen aningulos fi y psi repetitivos, estabilizados con el máximo número posible de uniones de hidrogeno. Los polipéptidos se alinean a lo largo, uno d e t r h de otro, y estan estabilizados por puentes de hidrógeno que se forman entre los hidrbgenos de los pbptidos nitrogenados y los de los carbonilos oxigenados de tiras adyacentes. Sin embargo, aunque las hklíces alfa contienen residuos adyacentes en un sentido estructural primario, las hojas beta implican t~amos de 5 a 10 arninoacidos de diferentes regiones estructurales primarias. A diferencia de las helices alfa compactas, el esqueleto peptidico de una hoja beta esti casi por completo extendido.
Las hojas beta plegadas pueden ser paralelas o antiparalelas La figura 6-7 ilustra tiras antiparalelas de laminas beta plegadas. Las cadenas adyacentes de polipkptidos de una lámina antiparalela proceden en direcciones opuestas; aquellas de láminas paralelas, en Ea misma direcciiin. Todos los posibles puentes de hidrbgeno se forman excepto para las tiras de los flancos (figura 6-81. Para estabilizar las hojas antiparalelas se en-
(Capítulo 6)
Figura 6-7. Modelo de una hoja plegada beta antiparalela. Tiras adyacentes corren en direccionesopuestas (veanse las flechas) Los grupos R se localizan arriba y abajo del plano de la hoja. Nbtese que los carbonos alfa sucesivos se localizan justo arriba y abajo de este plano, dando un efecto plegado. Los puentes de hidrogeno agrupados por pares estabilizan la conformación de hoja beta En hojas plegadas paralelas (no mostradas), las cadenas adyacentes corren en la misma dirección.
cuentran ubicadas de manera estrecha y amplia, pares alternos de puentes de hidrdgeno. Los puentes de hidrogeno que estabilizan cordones paralelos están regularmente espaciados pero angulados transversalmente a travks de las tiras. Casi todo los cordones de láminas beta están girados en el sentido de la mano derecha. Estos cordones girados de I h i n a s beta forman el núcleo central de muchas proteinas globulares. Una lámina beta puede estar conformada pw 2 a 15 cordones y son comunes las regiones donde hay laminas mixtas paralelas y antiparalelas. Qui7.á por SU estabilidad algo menor, las lhminas beta paralelas de cinco cordones son un poco más raras.
Las regiones en asa forman sitios de unión de antígenos
Más o menos la mitad de los residuos en una proteína globular típica se presentan en forma de h6Iices alfa o hojas beta. El recto reside en conformaciones "asa" o "bobina" que, aunque ordenadas de manera irregular no tienen menor importancia biolligica que las esiructuras secundarias regularmente ordenadas. Las asas o bobinas no se deben confundir con "bobinas al m",un término que describe las conformaciones desordenadas y con menos importanciabiológica de las proteinas desnaturalizadas. Regiones en asa de tamaiio y forma variables constituyen una de las principales carac-
Estas vueltas invertidas o incuracioncs beta, afectan cuatro residuos unidos por puentes de hidrbgeno era varias formas y se presentan de manera primaria en la superficie de las proteínas.
Las proteinas pueden contener regiones desordenadas Nonecesariamente todos los residuos se presentan como estructuras con ordenamiento secundario. Hay regiones especificas en muchas proteinas que tienen abundantes confomaciones en solucion, por lo que se presentan en verdad desordenadas Los ejemplos incluyen los grupos U largos de los residuos Lis y porciones de los amino o carboxilo terminales de muchos polipéptidos. Este desorden significa flexibilidad y puede decempefíar un papel biológico vital. Por otra parte, muchas regiones desordenadas pueden llegar a ser ordenadas cuando se les une un ligando especifico. Un caso común es la estabilizacibn de las regiones desordenadas de los centros cataliticos de muchas enzimtls cuando se unen a un ligando. Figura 6 4 . Distancia y ángulos de unibn de los puentes de hidrógeno entre hojas beta plegadas paralelas y antiparalelas Las flechas indican la dirección de cada tira. Los Atomos de nitrágeno alfa donadores de hidrógeno se muestran con eirculos azules. Para mayor claridad en la presentacidn, se omitieron los grupos R y los hidrógenos alfa. Arriba: Hojas beta antiparalelas. Los pares de puentes de hidrógeno alternan entre pares muy próximos y pares muy separados y esthn orientados en dirección perpendicular aproximada al esqueleto polipeptldico. Abajo: Hoja beta paralela Los puentes de hidrbgano están regularmente espaciados, pero oblicuos en direcciones alternas.
teristicas de superficie de las proteinas. Cuando se exponen a solventes, ricos en residuos cargados y polares, pero que carecen de estructura regular secundaria, las asas en gancho u horquilla se conectan con las hojas beta adyacentes antiparalelas. Con Erecuencia, el sitio para interacciones ligando, regiones de asa de estructura primaria y longitud variables forman los sitios de unibn de antigenos en los anticuerpos.
Las proteinas globulares contienen giros beta El cwActer compacto de las proteinas globulares se debe a mAs o menos 20 tramos rectos de residuos unidos por regiones de polisacáridos que bruscamente cambian de direccibn. Las tiras de hojas beta están conectadas por regiones de poliptptidos que, si son lo bastante largos, con frecuencia contienen hélices alfa.
ESTRUCTURA TERCIARIA
Los diagramas esquemáticos simplifican la esttuctura de las proteínas El alto contenido de informacibn de los diagramas o modelos en donde se incluyen todos los atomos de una proteína, dificulta el estudio de las características totales de la estructura proteinica. En consecuencia, empleamos representaciones simplificadas de manera convencional para exhibir las caracteristicas estructurales. Los símbolos qtie se emplean son cilindros para hélices alfa, flechas anchas para tiras beta y cordones semejantes a listones para las demas estructuras como asas y hojas beta.
Las estructuras secundarias pueden formar tipos supersecundarios En muchas proteínas globulares, las formas estmcturales secundarias de una hClice alfa o de una hoja beta plegada forman tipos reconocibles "supercecundanas". La figura 6-9 ejemplifica varios tipos supersecundarias: beta-alfa-beta, dos tiras de hoja beta conectados por una hdlice alfa; la horquilla o gancho beta, compuesta de hojas antiparalelas beta conectadas por una region corta de asa; y el motivo o figura "llave griega", asi denominada porque recuerda un motivo decorativo de un vaso griego antiguo. Las repeticiones de estas figuras supersecundarias pueden
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(Capitulo 6)
Uinqzdímica de Hut-per
maneras en las cuales las proteínas plegadas pueden reunir aminoácidos separados en un sentido estriictural primario y los enlaces que estabilizan estas confbrmacicincs.
Los polipeptidos grandes tienen dominios distintos Figura 6-9. Figuras supersecundarias Las hélices alfa y hojas plegadas beta de numerosas proteínas globulares estan ordenadas en untdades repetidas como las figuras supersecundarias d e clave griega (izquierda) o ~eta-alfabeta (derecha)
entonces formar estructuras como las unidades regularmente repetitivas beta-alfa-beta de toda una proteína (figura 6-1 0). El teririino "estructura terciaria" se refiere a las relaciones espaciales entre los elementos estructurales secundarios, [,as estructuras secundarias y s u p e r w cundarias de una proteina grande casi siempre están organizadas coma dominios -unidades compactas conectadas por el esqueleto polipeptidico. Por lo gcneral, el plegamiento de un polipéptido dentro de un dominio se prodiice dc mancra indcpcndienic del plcgamierito en otrni domiiiicis. Idas cstructiiras terciarias describen las relaciones entre estos dominios, las
La estructiira seciindaria-terciaria, en particular de lor polipeptidos grandes, se puede organizar en unidadcs relativamente independientes. pero estmcturaimente conectadas llamadas dominios, Ios cuales con frecuencia ejecutan funciones discretas tales como la unibn con ligandos específicos. Por su parte, los lipandos pucdcn cntrar en contacto con residuos formados de modo exclusivo por un solo dominio. Alternativamente. un ligando puede establecer contacto con residuos de más de un dominio y así residir rn la interfase entre los dominios. Por otro Eado, en las proteina~multimericas, los residuos de los dominios de diferente? subunidades pueden enlazarse con ligandos como las coenzimas en las interfases con subunidades cuyas superficies de contacto se derivan de residuos proccdentes de suburiidades diferentes.
Los enlaces electrostáticos unen los residuos de superficie Los enlaces salinos (electrosthticos) unen grupos R con carga opuesta de residuos y grupos al fa con carga de residuos terminales C y N. Por ejemplo, el grupa R de Lis (a pH fisiolhgico, carga neta + 1 ) y de aspartato o glutamato (carga neta -1 ), puede interactuar por fuerzas electrostáticas para estabilizar proteínas.
Las uniones de disulfuro confieren estabilidad adicional Además de los enlaces pcptidicoc, se pueden formar ~ i n i i ~ n c(IisuIfu h ni covalentes entre residuos de cfsteína presentes en el mismo o cn un polipéptido diferente. Estas uniones disulfuro confieren estabilidad adicional a la conformación especifica de proteínas tales como enzirnas (como la ribonucleasa) y proteínas estmcturales (ES el caso de la queratina).
lnteaacciones hidrofobas enlazan residuos interiores
Las cadenas laterales no polares de los aminoicidos Figura 6-1 0. Estructura terciaria. Triosa fosfato isornerasa, mostrada en una vista de frente, está constituida por cuatro beta-alfa-beta consecutivasen los dos sentidos estruciurales primario y terciario (Cortesia de 3 Richardson )
confluyen en el interior de las protelnas globulares. Estas uniones son individualmente muy debiles y no son estequiom&tricas. Su gran numero, sin embargo, determina su importancia para mantener la estructura de la proteina.
Proteínas: esfructura yfunción
La cristalografía con rayos X muestra la estructura secundaria y terciaria Los rayos X dirigidos a un cristal de proteína y de un derivado que contiene un metal pesado agregado, son dispersados en patrones que dependen de Ias densidades electrbnicac en diferentes partes de la proteína. Idos datos, obtenidos de placas rotográficas o detectores de área unidos a computadoras, se analizan por mitodos matemhticoc, se traducen a mapas de densidad electrónica y se emplean para construir modelos tridimensionalcs generados por computación. Aunque consume tiempo, es costosa y requiere personal adiestrado, la cristalografía con rayos X ha revelado vistas tridimensionaIes detalladas de mhs dc 1000 proteinas. Sus contribucio~iesa la comprensión de la estructura proteínica apenas pueden sobreenfatizarse. Las imágenes por resonancia magnética ORM), se han usado para resolver la estructura tridimensional de ciertas proteínas pequcfías y parece que es prometedora para aplicarse a proteinas de mayor tamaño.
Las bases de datos y los programas de computación perfeccionados facilitan el estudio y la manipulación de la estructura de las proteínas Un resumen coordinado de todor los Atomas de las proteínas cuyas estructuras se han determinado mediante cristalografia con rayos X es accesible a travCs de Intemet procedente de bases de datos eIectr0nicas. Estas coordinaciones pueden cargarse y enlazarse con programas de compuración perfeccionados -muchos del dominio públicc- que permiten generar y manipular modelos sobre la pantalla, girarlos en todas dirccciones, añadir o sustraer radicales, dominios o ligandos, cambiar ángulos de unión, etcétera en muchos casos utilizando simplemente una computadora personal Pentium.
ESTRUCTURA CUATERNARIA
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Las proteinas compuestas de 2 o 4 siibunidades sc denominan proteínas bimiricas o tetramtricas, respectivamente. Las hornodimeras, hornotetrámeras, etcétera, consisten en subunidades identicas; mientras que las IieterooligomCricas, de subunidades distintac. Las subunidades diferentes de proteinas heterooligoméricas ejecutan de manera tipica funciones discretas. Una subunidad o un conjunto de subunidades idénticas, puede efectuar una funcion catalítica; en tanto que otro conjunto de subunidades, se encargaria del reconocimiento de ligando0 tendría un papel regulador. Las diferentes orientaciones en el espacio de las subunidades les confiere propiedades diferentes en relación con el oligómero y permite a las proteínas multimkricas desempefiar papeles peculiares en la regulación intracelular.
Los desnaturalizantes de proteínas destruyen su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria Los reactivos como la urca, el dodecilsulfato de sodio (SDS), los bcidos ddbiles (H') y las bases débiles (OH-), rompen los puentes de hidrógeno, enlaces hidrbfobos y electrostáticos {peso no los enlaces peptidicos ni los puentes disulfuro). Por tanto, destruyen todos los 6rdenes de las proteinas, excepto su estruchrra primaria, y anulan su actividad biológica (figura 6-1 1)
Los métodos físicos determinan el peco molecular y la estructura cuatemaria La determinacion de la estructura cuaternaria de las proteínas oligoméricas comprende la identificación del número y clase de protómeros presentes, su orientación mutua y las interacciones que los unen. Si se prueba que los oligómeros no experimenten desnaturalizacion durante el procedimiento usado para determinar el peso molecular (PM), numerosos métodos pueden dar información de esta propiedad. Estas mismas técnicas pueden utilizarse para determinar el PM de los protómeros si primero se desnaturaliza el oligómero.
Las proteínas oligoméricas tienen cadenas polipeptidicas múltiples Se dice que las protehas que contienen dos o mas cadenas de polipbptidos unidos por fuerzas no covalentes muestran una estructura cuaternaria. En estas proteinas multiméricas, las cadenas polipeptidicas individuales se llaman protómeros o subunidades. Los puentes de hidrbgeno y las uniones electrostaticas formadas entre los residuos de superficie en unidades adyacentes estabilizan la unibn de las subunidades.
Enzima activa (nativa)
u
Enzima inactiva (desnaturalizada)
Figura 6-1 l.Representaeibn de la desnaturalizacibn de un iprotbmero.
A. Ultracentri fugaclon analítica Este procedimicnto. desarrollado por Svederg. mide Ea velocidad a la cual una proteina se scdimenta en un campo gravitacional de alrededor de 10' x R. Esta tkcnica física, excelente para la determinación de pesos moleculares. ha sido reemplazada en años recientes por métodos menos complejos.
B. Centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa Esta tecnica, análoga a la anterior, se aplica mejor a proteinas globulares. Las proteinas esthndares y las desconocidas se estratifican en un gradiente de sacarosa amortiguada de 5 a 20%, preparada por congeIación-descongelaci6n repetida de sacarosa a 20 por ciento. Después de centrifugar toda la noche a 10' x g, el contenido del tubo se retira en fracciones y se analiza la proteína contenida en cada fracción. La movilidad de la proteina desconocida se expresa en relación con la de estandares de PM conocido, luego se computa y se calcula su PM
C. Filtración en gel Coliimnas de Sephadex o matrices semejantes, que tienen "poros" de tamaño promedio definido, se calibran usando proteinas de PM conocido. Luego, el PM de una proteina desconocida se calcula de su posicibn en la elucidn, relativa a estos estándares. Puede haber errores importantes si la proteina es muy asimétrica o interactúa fuertemente con el material del que se ha manufacturado el filtro molecuIar.
D. Electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA) Proteínas desconocidas y esihndar se separan por electroforesis en gelcs de acrilamida con 5 a 15% de enlaces cruzados de diversa porosidad, que luego se tifien para la visualizacibn de la proteína usando colorante azul de Coomassie o Ag'. Para utilizar la tkcnica de EGPA-SDS, las proteinas oligomtricas se desnaturalizan primero hirviéndolas en presencia de betamercaptoetanol y el detergente ionico con carganegativa dodecilsulfato sbdico (SDS). Las proteinas desnaturalizadas, que quedan recubiertas con SDS en su totalidad y por tanto con carga negativa, se separan con base en su tamafio (no en su carga) por EGPA-SDS en geles que contienen SDS,
E. El microscopio electrónico visualiza complejos macromoleculares El microscopio electrbnico, que puede amplificar hasta 100 000 diiimetros, permite observar particulas virales, complejos~enzim~ticos, protelnas oligoméricns y oligbmeros de PM elevado.
CÓMOSE PLIEGAN LAS PROTE~NAS ¿Cómo puede un polipkptido plegarse en sus estados fisiolbgicos nativos en una fraccibn de segundo? Todavía no hay respuestas definitivas disponibles por lo que esta pregunta sigue siendo objeto de investigacihn activa. Sin embargo, pueden observarse algunos principios generales. El pIegamiento no puede proceder a traves de un enfoque "de búsqueda al azar"',es decir, que implique la exploracibn de todas las conformaciones posibles en la ruta hacia su estado nativo. Aun para polipéptidos comparativamente pequeños, jel plegamiento a travts de una via de búsqueda al azar requeriría no segundos sino un periodo mayor que el estimado para la edad del universo! Es claro que el plegamiento debe ser un proceso más altamente dirigido que implica vias intermedias muy conocidas entre el estado presentc y el estado fisiolbgico normal.
Principios generales Con base en el conocimiento actual, el plegamiento de los polipéptidos y de las proteínas multimGricas parece invoIucrar las siguientes etapas. Primero se forman tramos cortos de estnictura secundaria -re,-oiones de hCIices alfa, hojas beta, giros beta, etcétera. La difusión dirigida hace crecer estos tramos cortos y conduce en últiino termino a un dominio. En las proteinas de múltiples dominios, los dominios plegados se reunen para formar el denominado "glbbulo fundido" que tiene una estnictura secundaria extensa pero muy poca estructura terciaria ordenada. Los cambios de conformación exitosos convierten el gl6bulo fundido en una forma compacta con una estructura terciariaordenada. Por su parte los cambios menores de la conformación entonces, conducen a una estructura polipéptida original. Para las proteinas monomeras, el proceso de plegamiento ya en este momento es completo, mientms que, para proteínas con estructura cuaternaria, estos polipéptidos ordenados sirven como subunidades que se reúnen para formar multimeros.
Las proteínas desnaturalizadas pueden volver a naturalizarse Muchas proteinas desnaturalizadas se vuelven a plegar esponthneamente in v~trocon el restablecimiento subsecuente de su actividad biológica. Esto condujo a Anfinsen a concluir que la estructura primaria de los poliptptidos era en si misma suficiente para dirigir y orientar los plegarnientos de las protehas. Sin embargo, el repliegue espontán~otoma horas, lo cual es mucho más de lo necesario para explicar el plegamiento de las proreinas in vitro. La conclusilin de Anfisen de que Pa estructura primaria dirige el ple-
Proreinas: estructura y función
gamiento in vrvo todavía es vhlida, pero requiere modificaciones para incorporar la participacidn de las proteínas accesorias, las cuales aceleran el proceso de plegamiento y lo guían a lo largo de vías específicas. Estas proteinas incluyen las disulfuro isomerasa, proli-cis-frans-isomerasay las chaperoninas.
Proteina dicu lfuro isomerasa
[,as uniones disulfuro (-S-S-, o cistina) se fonrian bajo condiciones de oxidacidn dentro y entre los polipkptidos y estabilizan tanto la estructura secundaria como la terciaria. Un residuo cisteinil dado puede, sin embargo, formar muchos pares de enlaces, disulfuro diferentes, los cuales sólo uno es apropiado para el plegamiento biológico correcto. La proteina enzimática disulfuro isomerasa facilita el "barajeo" de las uniones -S-Sporque acelera el Indice al cual los disulfuros sufren intercambio neto y, por tanto, aumenta la velocidad de todo el proceso de plegamiento.
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cual se pueden acomodar polip&ptidosgrandes. Las chaperoninas favorecen la? vías que inhiben las interacciones inapropiadas entre superficies complementarias y facilitan las apropiadas. Sin embargo, todavia no se comprende bien el mecanismo mediante el cual las chaperoninas logran esto. Las chaperonhas incluyen las proteínas Hsp60 de choque tkrmino elaborada por las bacterias o los cloroplastos en respuesta a una elevación termica, la cual revierte la desnaturalizacidn y agregacibn de las proteínas que se produce a temperaturas elevadas. Las 14 subunidades idénticas de las proteínas HsplO y Hsp60, GroES y GroEL de E. coli y Cpn 10 y Cpn60 de ¡os cloroplastos-forman parejas de anillos de siete subunidades que rodean una espaciosa cavidad central en la cual se pueden acomodar polipéptidos grandes. Este ambiente protector contrarresta la tendencia de las regiones hidrrifobas expuestas a solventes de los polipCptidos parcialmente pegados o desnaturalizados a autorseunirse y formar agregados insolubles.
Prolil cís-trans isomerasa
LA FORMA DETERMINA LA FUNCIÓN
La configuraci6n de las uniones pdptido X-pro de los poIipéptidos recibn sintentizados es trans, pero mQs de 10% de las uniones X-pro de las proteinas maduras tienen coiifiguración cts. La enzima isomerasa prolil cis-fruns caializa esta isomerizacihn y, por tanto, facilita el proceso de plegamiento (figura 6-12).
El examen minucioso de proteínas representativas ilustra no sblo las estructuras únicas que han evolucionado para cumplir con funciones biologicas especificas sino también el estrecho nexo entre estructura proteinica y funcion biológica. La mayoría de las proteinas fibrosas desempefían funciones estructurales en piel, cejido conjuntiva o fibras como cabellos, seda o lana. Las secuencias atipicas de aminohcidos en las proteínas fibrosas definen estruchiras secundarias-terciarias especificas que confieren propiedades mecánica específicas.
Chaperonas maleculares Las chaperonas moleculares de bacterias, mitocondrias y cloroplastos son proteínas grandes de múltiples subunidades que aceleran el proceso de plegamiento porque suminism un ambiente protegido cuando los p lipéptidos se pliegan en sus conformaciones nativas para formar estructuras cuaternarias. Las chaperoninas incluyen las proteinas de choque térmico cuya estructura consta de dos anillos de subunidades idknticas dispuestas alrededor de un espacio central en el
Figura 6-1 t. lsornerizaeibn del enlace peptídiw prolil N-alfa1 de una configuración cis a una trans relacionada can el esqueleto del polipbptido.
Las fueizas hidrófobas estabilizan la hoja beta de la fibroína de la seda La fibroína de la seda, una proteína de un insecto, ilustra la estabilizacibn de una estructura secundaria por medio de fuerzas diferentes de los puentes de hidrbgeno. La composición de los aminoAcidos de la fibroina consiste casi por completo (85%) de residuos Gli que alternan con residuos Ala o Ser. Las cadenas plipeptidicas de Eibroina forman arreglos de hojas beta antiparalelas, en las cuales los gmpos R de residuos Gli (hidrbgeno} se extienden desde una superficie y los grupos R de Ala o Ser de la o m . Estos arreglos esthn estabilizados exclusivamente por interacciones hidrófobas enee los gmpos Rde Gli sobre una superficie y entre los grupos R de Gli o Ser de la otra. Pequetras cantidades de residuos como Val o Tir con gmpos R voluminosos aparecen con periodicidad e interrumpen las regiones de hojas beta y le confieren un poco
(Capitulo 6)
de flexibilidad. Regiones largas de fibroina estrechamente empaquetada, casi completamente extendidas en hojas antiparatelas beta resisten el estiramiento. pero todavía son muy flexibles debido al caracter no direccional de las fuerzas hidrófobas estabilizantes.
Estructura secundaria de las proteinas fibrosas La esrructura secundaria de las proteínas fibrosas, incluyendo las de la piel, tendbn, hueso y músculo que tienen funciones esmcturales protectoras y de motilidad, muestran caracteristiczs estructurales que contrastan notablemente con las de las proteínas globulares. A continuación se analiza la estructura secundaria de la proteina mas abundante de los mamíferos, la colhgena.
La colágena ejemplifica diversas relaciones entre estructura y función Las colagenas, que comprenden casi 25% del total de las proteinas de un mamífero, ilustran de manera notable las diversas relaciones entre estructura y función que caracterizan a las proteinas Eibrosas de tos vertebrados. La colagena de los tendones forma estructuras muy asimdtricas de fuerza tensil elevada; mientras que de la piel forma tramos laxos y fibras flexibles. Por su parte, la colagena de las regiones d u r a de los dientes y de [os huesos contiene hidroxiapatita, un polimero de fosfato de calcio. Finalmente, en la córnea del ojo está ordenada de manera casi cristalina y es transparente.
La tropocolágena es una molécula de triple hélice rica en Gli, Pro y Hip La tropocolágena consiste en tres cadenas de polipéptidos con 1000 residuos aproximadamente, organizadas como una Iidlice no alfa izquierda que tiene alrededor de tres residuos por giro. Tres hklices izquierdas se giran para formar una triple hdlice derecha o una superespiral, estabilizada con puentes de hidrdgeno formados entre (no dentro, como en la hdlice alfa) las cadenas individuales de polip6ptidos (figura 57-1). Esta triple superespiral helicoidal es sumamente fuerte. La superespiral resiste la distorsión debido a que sus tres polipéptidos están en espirales con direcciones opuestas, un principio que también se usa en los cables de acero para suspender puentes. Las fibras de colhgena maduras altamente asimbtricas miden 1.5 nm por casi 300 nm, lo cual refleja su conformacibn extendida estable.
Cada tercer residuo es glicina La figura estructural primaria de la colagena madura es (Gli-X-ProtHip),,. Cada tercer residuo es glicina, el único residuo con un grupo R lo bastante pequeño para encajarse dentro del núcleo central de la superhdlice. Cada glicina está precedida por un residuo prolil o hidroxiprolil. La repulsibn mutua entre los residuos prolil obliga al polipeptido a formar una hklice extendida con giro a la izquierda. Los residuos prolil e hidroxiproli1 son inflexibles en su conformaciún y confieren rigidez.
Muchas modificaciones postraslacionales caracterizan la maduración de la procolagena A diferencia de las superhelices de la colágena madura, las terminales carboxiI y m i n o del precursor de la mlágena procolagena tienen una composicibn de aminoácidos típica de una proteina globular. Durante la maduración de la procolhgena, estas extensiones terminales carboxilo y amino se retiran medianteproteólisis selectiva. Las modificaciones adicionales postraslacionales implican hidroxilacibn, oxidación, condensación de aldol, reducci6n y glucosiIación. La hidroxilacion de los residuos prolil y lisil es catalizadapor laproIiIhidroxiIasa y Iisilhidroxilasa, enzimas que requieren ácido ascorbico (vitamina C). Entonces, los residuos hidrosilil específicos son glucosilados por las transferasas galactosil y glucosil.
Los enlaces covalentes cruzados estabilizan las fibras de la colagena Las cadenas de tropocolAgena se reúnen para formar rnicrofibrillas de coIhgena. Al principio, las estabilizan puentes de hidrógeno dentro de la cadena y despuks, por enlaces covalentes formados entre y en el interior de las hdlices. Este proceso implica la participación de la enzima oxidasa lisil que requiere cobre, la cual convierte los grupos no alfa amino a de los residuos Iisil e hidroxil en aldehidos. A continuación estos aldehidos sufren una condensación aldol o se condensan con los grupos amino no alfa de la lisina o la hidroxilisina para formar bases Schiff. La reduccibn subsecuente foma enlaces covalentes cruzados estables que confieren una gran fuerza tensil.
Trastornos nutricionales y genéticos que pueden involucrar estructuras secundarias deficientes La importancia mddica de la estructura secundaria estable está ampliamente documentada por los trastor-
Proteinm. estructuru y función
nos de la biosintesis y maduracibn de la tropocolhgena. En la insuficiencia grave de vitamina C, las hidroxilasas prolil y iisil son inactivas, y la tropocolágena no puede sufrir las reacciones para f o m a r enlaces covalentes cruzados. Como consecuencia se produce el escorbuto, una enfermedad nutricional caracterizada clínicamente por sangrado dc las encías, deticiente cicatrización de las heridas y, en último término, la muerte. De mancra similar, la enfermedad de Menkes que se distingue por el pelo ensortijado y retardo del crecimiento. refleja una defíciencia en la dieta respecto a la IisiIoxidasa que requiere cnbrc. Los trastornos geneticos de la biosintesis de la colágena incluyen varias formas de osteogénesis imperfecta que, en clinica, se caracteriza por la fragilidad de los huesos, Además, pueden producirse formas geneticamente distinhs de la enfermedad, causadas por defectos en diferentes genes de la biosintesis de coIágena. De manera similar, varios tipos del sindrome de Ehlers-Ilanlos se distinguen clinicamente por articulaciones desplazadas y anomalias de la piel que muestran defectos eii los genes que codifican procolágeiiaalfa,. procoihgcna N-peptidasa, o l isi l hidroxilasa (capitulo 57)
RESUMEN Las caracterlsticas estructurales de las protehas se consideran bajo cuatro órdenes: primario, secundario, terciario y cuaternario (para proteínas oligoméricas'). La estructura primaria, secuencia de aminoácidos y ubicación única de cualquier puente disulfuro, está codificada en los genes. Las estructuras secundaria y terciaria, que conciernen a conformaciones proteíni-
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cas permitidas por los enlaces peptídicos, son dictadas Dor la estructura nrimaria. La estructura secundaria hescribe el plegaAiento de cadenas polipeptidicas en figuras unidas por pucntes de hidrbgeno rnuftiples como helice alfa y hoja plegada beta. Luego, combinaciones de estos motivos pueden f o m a r estructura^ supersecundarias (por ejemplo, beta-alfa-bcta). La estructura terciaria se refiere a las relaciones entre dominios estructurales secundarios v entre residuos bastante alejados desde el punín de vista de su estructura primaria. La estructura cuaternaria, presente sólo en proteinas que tienen dos o m& cadenas polipep~ídicas (proteínas oligomdricas), describe puntos de coniacto y otras relaciones entre estos polipéptidos o subunidades. En tanto que, la estructura primaria contiene enlaces covalentes. las iirdenes su~erioresse estabi lizan sólo por fuer7as dbbiles que incluyen puentcs de hidrhgena múltiples, enlaces salinos (electrostáticos) entre residuos de superficie y relación, no estequiometrica de grupos R hidrofobos en el interior de las proteínas. Los reactivos que rompen enlaces no covalentes (por ejemplo, urea o SDS) destruyen las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria con perdida concomitante de la actividad biolhgicn (desnaii~alizacion).Las técnicas físicas para estiidio de órdenes superiores de estructura proteinica incluyen cristalografía con rayos X (estructura secundaria v terciaria) mhs ultracetitrifugación, filtracf~nen gel y electroforesis en gel (estructura cuaternarial. El estrecho nexo entre la estructura proteinica y la función biológica se ilustra con dos proteínas fibrosas: fibroina dc la seda y colágena. Las enfennedades relacionadas con defectos en la maduración de la colagena comprenden al síndrome de Ehlers-Danlos y el escorbuto (enfermedad por deficiencia de vitamina C).
REFERENCIAS Advances zn Frolein Chemistw Academic Prcss, 1944 to
Georgopoulos C, Welch WJ: Role of major hcat-shock
date. [Annual publication.] Benncr SA et al.: Predicting the conformation of proteins from sequcnces: Progress and future progress. Adv Enzymc Regul 1994;34:269. Bollag DM,Edelstein Sd: Prntein Meihods. Wiley-Liss, 1990 Brrnden C, Tooze J: Introductzon lo Prorein Structure Garland. IY9 1. Burley SK, Petsko GA: Wrakly polar interactions in proteins. Adv Protcin Chem 39; 1989: 125. Copeland RA: hethods of protein analysis: A practica1 guidc to laboratury protocolc. Chapman & Hall, 1943. Creighton TE: Proteln Structuve A Practica1 Approach Oxford, 1990. Darby NJ, Creighton TE: Prorein Struchre. IRL Psess, 1993. Dunn MJ: Gel electrophoresis of Proteins Wright, 1986.
proteins as molecular chapcroncs. Ann Rcv Ccll Biol 1993;9:601 Gierasch LM, King J: Prolein Folding. Anierican Asso-
ciation for the Advancement of Science, 1990. llames BD, Rickwead D: Gel Eleczrophoresis ofFroteins A Pracaical Approacl~.IRL Press, 1990. l l a r t l FU, M a r t i n J, Neupert W: Protciii foIding in the cell: Thc role of inolecular chaperones Hsp70 and HspóO. Annu Rev Riophys Rinmol Struct 1992,21293 Hendrick JP, Hartl FU: Molecular chaperone functions of
heat-shock proteins. Annu Rev Biochcm 1993.62:349. Landry S J , Ciersach LM: Polypeptide interactions with molecular chaperones and their relationship ta in vivo protein folding. Annu REV Biophys Biomol Struct 1994;32:645. Matthews CR: Pathways of protein folding Annu Rev Biochem 1993;62:653.
64
4
Bioquím~cade Harper
Prockop DJ, Kiviriklo K3: Collagens: Molecular biology, diceases, and potentials for therapy. Annu Rev Biochem 1995;64:403. Richardson JS, Richardson DC: Principies and patterns of protcin conformation. In: Predzctinn of Proiein Structure arad fhe Prznciples oJProtein Conformaation Fasman GD. Plenum Press, 1989. Rose CR, Gierasch LM, Smith JA: Tums in proteins and peptides. Adv Protein Chern 1958;37: 3 . Schmid FX: Prolyl isomeraqe: Enzymatic catalysis of slow protein-rolding reactions. Annu Rcv Biophys Biomol Struct 1993;22: 123. Scholz JM,Baldwin RL: The mechanism ora-helix formation by peptides. Annu Rev niophys Biomol Struct 1992;21 95.
(Cupi!ulo 6)
Scopes RK: Profein Purificahon: Pr~nczpl~s andPractices Springer, 1993. Segrest JP et al: The amphipathic a-helix: A muliifunctional structural molif in plasma lipoproteins. Adv Protein Chem 45;1995.303. Stein RL: Mechanism of enzymatic and nonenzymatic prolyl c i s - t m isomeri7aiinn. Adv Protein Chern 1993;44: 1. Wligner C, Hyberts SE, Havel TF: NMR structure determination and solurion: h critique and comparison with x-ray crystallography. Annu Rev Biophys Uiornol Struct 1992;21:167. Weber PC: Physical principles of protcin crystalIization. Adv Protein Cbem 1 99 1:41: 1.
Proteínas: miogIobina y hemoglobina Víctor W. Rodweii, PhD
Como ejemplo de la relación estructura-función proteinica, este capitulo estudia la rnioglobina y la hemoglobina, proteinas importantes por derecho propio y porque en ellas puede apreciarse cómo las estructuras de las proteinas conforman o determinan sus funciones bioldgicas.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA Las proteínas hemicas intervienen en el transporte y fijacibn de oxígeno, en el transporte de electrones y en la fotosintesis. El estudio detallado de la hemorrlobina y la mioglobina ejemplifica aspectos estructuraIes comunes a muchas proteinas. En un sentido, su mayor significado médico consiste en que su conocimiento muestra, de manera elocuente, las relaciones estructurafuncibn de las proteínas. Ademiis, este conocimiento permite reconocer la base rnolecular de enfermedades genéticas como la enfermedad de cklulas falciformes (que resulta de la alteracibn de las propiedades de superficie de la cubunidad beta de la hemoglobina) y tas talasemias (enfermedades hemoiiticas familiares crbnicas, caracterizadas por defectos en la síntesis de la hemoglobina). El cianuro y el mon6xido de carbono son tbxicos debido a que interrumpen la función fisiolbgica de las proteinas hdrnicas, citocromo oxidasa y hemoglobina, respectivamente. Por último, la estabilizacEbn de la eshuctura cuatemariade la desoxihemoglobina por el 2,3-bisfosfoglicerato (BPG, del inglés, 2,3bisphosphoglicerafe)es esencial para comprender los mecanismos del mal de montafía y de la adaptacihn a las grandes altitudes.
-
EL HEM Y EL HIERRO FERROSO CONFIEREN LA PROPIEDAD DE ALMACENAR Y TRANSPORTAR OX~GENO La mioglobina y la hemoglobina poseen coma grupo prostdtico un tetrapirrol cicIico, el hem. La extensa red de enlaces dobles conjugados del hem absorbe luz en el extremo bajo del espectro visible, por lo que su color es rojo intenso. Los tetrapimoles constan de cuaao mol~culasde girrol (figura 7-1) enlazadas en un anillo planar por cuatro puentes al fa-metileno. Los sustituyentes beta deteminan si un tetrapirrol es hem o un compuesto analogo. En el hern, los grupos son metilo (M), vinilo (V) y propionato (Pr) y siguen el orden M, V, M, V, M, Pr, Pr, M (figura 7-2). En el centro de este anillo planar, hay un titorno de hierro ferroso ( ~ e ~ ' ) Otras . proteinas con grupos prostt5ticos tetrapirrdlicos (y sus iones methlicos relacionados) incluyen los citocromos (Fe2' y Fe3'), las enzima catalasa y triptófano pirrolasa y la clorofila (Mg2*).En los citocromos, la oxidación y la reducción del htorno de hierro son esenciales para su funci6n bioldgica. Por el contrario, la oxidación del Fe2'de mioglobina y hemoglobina destruye su actividad biológica.
Figura 7-1. Pirrol. Los carbonos alfa estdn unidos por puentes metileno en un tetrapirrol. Los carbonos beta sostienen a los sustituyentes característicos de un tetrapirrol específico, como el hern
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Rioquímica de Harper
Figura 7-2. Hem Los carbonos de los anillos pirrolicos y de los puentes de metileno son coplanares y el átomo de hierro (Fez+) esta casi en el misma plano. La quinta y la sexta posiciones de coordinacbn del Fe2+con perpendiculares y directamente arriba y abajo del plano del anillo hemico. Obsérvese la naturaleza de los grupos sustitvyentes en los carbonos beta de los anillos pirrblicos, el Btorno central de hierro y la ubicación del lado polar del anlllo hemica (casi a las siete horas del reloj) que se enfrenta a la superficie de la molécula de mioglabina.
La oxirnioglobina almacena oxígeno
(Capitulo 7)
embargo, su conformación es atipica. Para facilitar la referencia a regiones particulares de estructura secundaria o terciaria de un polipéptido, a cada hélice alfa, hoja beta o asa se le asigna un nhmero o letra a partir de la terminal amino del polipeptido. Aproximadamente 75% de sus residuos se distribuyen en ocho hhlices alfa (giro a la derecha) de 7 a 20 aminohcidos de longitud. Comenzando por la terminal amino, se denominan hklíces de la A a la H.Las regiones interRelicales se identifican con las letras de las dos hhlices que conectan. Los residuos individuales se designan por la letra de la hdlice en la que residen y un nrjmero que indica su distancia desde [a terminal amino de esa hélice. Por ejemplo, "His FX" se refiere al m v o residuo en la hClíce F e identifica a un residuo histidilo. Los residuos que en la esttuctum primaria se encuentran bastante alejados (por ejemplo, en hélices diferentes) pueden, no obstante, estar en sentido espacial muy juntos, por ejempIo, los residuos histidilo Fg (proximal) y E7 (dista]) (figura 7-3). La estructura secundaria y terciaria de la rnioglobina en solución es muy semejante a la de larnioglobina cristalizada. Exhiben virtualmente el mismo espectro de absorción; la cristalina fija oxígeno y la cantidad de hélice alfa en una solucibn (calculada por la dispersión óptica rotatoria y dicroísmo circular) se aproxima bastante a la mostrada por el análisis cristalográfico con rayos X.
La mioglobina del tejido muscular rojo almacena oxlgeno. Bajo condiciones de escasez (por ejemplo, en el ejercicio extenuante), el oxigeno almacenado se libera para usarse en las mitocondrias musculares para la síntesis de ATP dependiente de oxígeno.
Con dos excepciones, los residuos polares están en la superficie de la rnioglobina L a mioglobina, cadena polipeptfdica sencilla con peso moIecular de 17 000, no es excepcional respecto a sus 153 residuos aminoacídicos. Sin embargo, en su distribución espacial hay diferencias evidentes.La superficie es polar y el interior no polar, patrón típico de las proreinas globulares. Los residuos con regiones polares y no polares (por ejemplo, Tre, Tri y Tir) orientan sus partes no polares hacia el interior. Sin contar los dos residuos histidilos que funcionan en lafijacion del oxlgeno, el interior de la mioglobina s61o contiene residuos no polares (por e,jemplo, Leu, Val, Fen y Met).
La mioglobina es rica en hélices alfa La mioglobina es una molecula compacta, toscamente esférica, que mide 4.5 x 3.5 x 2.5 nm (figura 7-3). Sin
Figura 7 3 . Modelo de mioglobina de baja resolucibn S610 se muestran los Btomos de carbono alfa. Las regiones donde se localizan las hklices alfa se designan con las letras que van de la A hasta la H. (Basada en Dickerson RE en: The Proteins, 2nd ed vol. 2 Neurath H [Editor]. Academic Press, 1964 Reproducida con autorización )
Proteínw: miog/obinuy hemoglobina
En presencia del hem, la estructura primaria de la apomiogiobína determina un plegamiento proteínico correcto
His proximal (Fa)
P,
Cuando la apomioglobina (mioglobina sin el grupo hem) es preparada reduciendo el pH a 3.5, su contenido de h&licealfa decrece de manera notable. La adicibn subsecuente de urea elimina todo el contenido de hklices atfa. Si se retira la urea por diálisis y se agrega hem. el contenido completo de hélice alfa se recupera y la adiciirn de Fe2' restablece su actividad biolbgica (fijaci6nde oxigeno) integra. Por tanto, la infomacidn estnictural primaria contenida en la apomioglobina puede. en presencia del hern, especificar el plegamiento de la proteina a su conformacibn nativa con actividad biológica. Como se explic6 en el capítulo 6. este importante concepto se extiende a otras proteinas: la estructura primaria de una proteina dirige su conformacibn secundaria y terciaria.
Las histidinas F8 y E7 llevan a cabo funciones únicas en la fijación de oxígeno El hern de la mioglobina, que se encuentra en un surco entre las hélices E y F (figura 7-3), se orienta con sus propionatos polares en la superficie. El resto se proyecta hacia el interior de la rnolkcula de mioglobina en donde, con excepcidn de His E7 y de His FS, los residuos circundantes son no polares. La quinta posici6n de coordinacion del átomo de hierro se une al nitrógeno de un anillo de la histidina proximal, His F8 (figura 7 4 ) . Aunque no estit enlazada a la sexta posicion de coordinacidn del hierro, la histidina distal (His E7) permanece en el lado del aniilo hdrnico al otro lado de His F8 (figura 7-4).
El hierro se mueve hacia el plano del hern cuando se fija el oxígeno En la rnioglobina no oxigenada, el hierro del hern se encuentra aproximadamente a 0.03 nm (0.3 A) fuera del plano del anillo en direccidn a His F8. En la mioglobina oxigenada, un htorno de oxigeno ocupa la sexta posicion de coordinaci6n del iitorno de hierro y entonces &te se desplaza a 0.01 nm (0.1 A) fuera del plano del hem. Por tanto, la oxigenacibn de la rnioglobina va acornpaflada por el movimiento del átomo de hierro, y el consecuente desplazamiento de His FB y los residuos aminoacldicos enlazados por covalencia a CI, hacia el plano del anillo. Este movimiento produce una nueva conformacibn de ciertas porciones de la proteina.
67
4' HISdista1 (ET)
Figura 7 4 . Adicidn del oxlgeno al hierro hemico en la oxigenacibn Tambien se muestran las cadenas imidazólicas laterales de los dos resrduos importantes de histidina de la globina que se adhieren al hierro del hem (Reproducida con autoruacion de Harper HA y colaboradores Phys~ologische ChemEe. Springer-Verlag, 1975 )
La apomioglobina proporciona un ambiente adverso para el hierro hernico Cuando el oxigeno se une a la rnioglobina, el enlace entre este y Fe2' es perpendicular al plano del anillo hemico. Un segundo átomo de oxigeno se une en un dngulo de 121" con respecto al plano del hern y orientado alejándose de la h istidina dista1 (figura 7-51,
Figura 7-6. Anguios pceferidos para el enlace del oxfgeno y el rnonbxido de carbono al átomo de hierro del hern libre [línea gruesa)
El mon6xido de carbono (CO) se une al hem aislado con una afinidad aproximadamente de 25 000 veces mayor que la del oxigeno. Si la amibsfera contiene restos de CO y el catabolismo normal del propio hern produce cantidades pequefias de este gas, ¿por qué entonces no es el CO (en lugar del Oz) e[ que ocupa la sexta posicidn de coordinacibn del hierro hémico de la mioglobina? La respuesta se encuentra en el ambiente adverso del hem en la mioglobina. La orientacihn preferida del CO para enlazarse al hierro hkmico es con los tres átomos (Fe, C, O) en posición perpendicular respecto al anillo hémico (figura 7-5). Aunque esta orientacion es posible para el hem aislado. en la mioglobina la histidina dista! obstaculiza esttricamente a los enlaces de CO en este Angulo (figura 7 6 ) . Esto obliga al CO a unirse en una configuracibn menos favorabte y reduce la fuerza de la unión hem-CO en más de dos órdenes de magnitud, aproximadamente 200 veces la fuerza del enlace hem02. NO obstante, por lo común, una pequeila cantidad (m8s o menos 1%) de la mioglobina está presente en forma de mioglobina-CO.
LAS CURVAS DE DISOCIACIÓN DEL OX~GENOPARA LA MIOGLOBINA Y LA HEMOGLOBINA EXPLICAN SUS FUNCIONES FISIOLQGSCAS
como PO2 o presión parcial de oxigeno) en et entorno
inmediato del hierro h&rtico. Ea relacion entre PO? y la cantidad de oxlgeno unido puede graficarse como una curva de saturacibn de oxigeno (disociacidn del oxígeno). Para la mioglobina, la forma de la isotenna de absorción de oxígeno es hiperbblica (figura 7-7). Dado que la PO2 en el lecho capilar pulmonar es de 100 mm Hg, la miaglobina podria retener oxigeno de manera eficaz en los pulmones. Sin embargo, la POz de la sangre venosa es de 40 mm Hg y la del músculo activo aproximadamente de 20 mm Hg. Puesto que la mioglobina no puede liberar una fracción grande de su oxigeno unido aún a 20 rnm Hg, no sirve como un vehículo eficaz para el transporte del oxigeno de los pulmones a los tejidos perifkricos. No obstante, en la privacibn de oxigeno que acompaflñ al ejercicio físico extenuante, la PO2 del tejido muscular puede disminuir hasta 5 mrn Hg. A esta presión, la mioglobina cede con facilidad su oxigeno pare la síntesis oxidativa de ATP por las rnitocondrias musculares.
LA HEMOGLOBINA TRANSPORTA 0 2 , COZ Y PROTONES
¿Por que la mioglobina es inadecuada como proteina transportadora de oxígeno, pero eficaz para almacenarlo? La cantidad de oxigeno unido a la rnioglobina (expresada como "porcentaje de saturacibn ") depende de la concentracibn de oxigeno (expresada
La hemoglobina de los eritrocitos de los vertebrados llevan a cabo dos funciones biolbgicas principales: 1) transportar el 0 2 del aparato respiratorio a los tejidos perifericos y 2) transportar el C01 y los protones, desde los tejidos perifericos hasta los pulmones para ser excretados. Aunque la bioquímica comparativa de las hemaglobinas de los vertebrados constituye un campo fascinante, aqui sólo se describirkn las hemoglobina~humanas.
Figura 7 4 . Anguios para el enlace del oxigeno y e l rnonbxido de carbono al hierro hérnico de la mioglobina La histidina distal E7 obstaculiza el enlace del CO en su Angulo preferido (1 80 O) respecto al plano del anillo hbmico.
Flgura 7-7. Curva de fijecibn de oxlgeno para la mioglobina Obsérvese la relacibn entre el porcentaje de saturacidn y las presiones pardaks representativasen pulmones(lO0 mm Hg), tejidos (20mm Hg) y el músculo en trabajo activo (5 mm Hg).
LAS PROPIEDADES ALOSTÉRICAS DE LAS HEMOGLOBINAS SON CONSECUENCIA DE SUS ESTRUCTURAS CUATERNARIAS Las propiedades de cada hemoglobina son consecuencia inherente de su estructura cuaternaria, así como de la secundaria y la terciaria. La estructura cuaternaria Ze da a la hemoglobina propiedades adicionaIes sorprendentes (no existentes en la mioglobina) que la adaptan a su función biologica única y le permiten una regulacibn precisa de sus actividades. Ademas las propiedades alostéricas (del griego, allos: otros, steros: espacio} de la hemoglobina proporcionan un modelo para comprender otras proteínas alostericas.
A diferencia de la mioglobina, Za hemoglobina es una proteína tetramérica Las hemoglobinas son protcinas tetramdricas, compuestas de pares de polipbptidos diferentes (denominados alfa, beta, garnrna, delta, S, etcétera). Aunque semejantes en longitud global, los polipdptidos alfa (14 1 residuos) y beta (146 residuos) de la hemoglobina A (HbA) son codificados por genes diferentes y tienen estructuras primarias distintas. No asi, las estructuras primarias de las cadenas beta, delta y g a m a de las hemoglobinas humanas tienen estructuras primarias altamente conservadas. Las estructuras tekarnéricas de 1a.shemoglobinas comunes son: H1iA @emoglobina normal del adulto) = alfazbeta2, HbF memoglobina fetal) = alfaz,gammaz(a2,&), HbS pernoglobina de c&lulasfalciformes) = alfa2S2,y HbAz (una hemoglobina menor del adulto) = alfaz, deltaz (azSz.).
La mioglobina y las su bunidades beta de hemoglobina comparten estructuras secundarias y terciarias casi idénticas
La oxigenación de la hemoglobina se acompaña por cambios en la conformación de la apoproteína La hemoglobina fija cuatro rnol~culasde oxlgeno por tetrhmero (uno por cada subunidad hdmica), y sus curvas de saturacibn de oxigeno son sigmoideas (figura 7-8). Por tanto, la facilidad con la que el Ozse une a la hemoglobina depende de la presencia de otras moléculas de 0 2 en el mismo tetrámero. Si ya existe oxigeno unido, la fijacibn de subsiguientes moltculas del mismo tiene lugar con mayor facilidad. Por tanto, la hemoglobina muestra una cinética cooperativa de fijacibn, propiedad que le permite retener una cantidad máxima de oxígeno en los pulmones y ceder una cantidad, también rnkirna, con la POz baja que prevalece en los tejidos perifdrjcos. Por ejemplo, compdrense estas cantidades a la PO2 de los pulmones humanos (100 mrn Hg) y de tos tejidos (20 mm Hg) con las de la rnioglobina (figura 7-8).
La P50 compara las afinidades relativas de diferentes hemoglobinas para el oxigeno La PW es la presibn parcial de oxfgeno que satura la mitad de una moltcula de hemoglobina. Dependiendo del organismo, la Psopuede variar ampliamente, aun-
100 c 90
.g so 'O
-5 70 2 60
P a,
,50
p 40 30
20
A pesar de las diferencias en el tipo y niimero de aminoácidos presentes en la mioglobina y en el polipéptido beta de HbA, exhiben estructuras secundarias y terciarias casi idrlnticas. Esta semejanza que se extiende a la ubicacibn del hem y de las ocho regiones helicoidales, es consecuencia en parte de la presencia de aminohcidos de propiedades análogas en puntos equivalentes en las estructuras primarias de ambos. Ademh, el polipéptido beta es muy semejante a la rnioglobina a pesar de la presencia de siete hélices en lugar de ocho. Igual que en la rnioglobina, los residuos hidrofobos son internos y (de nuevo con excepci6n de los dos residuos His por subunidad), tos residuos hidrbfílos son características de la superficie en las subunidades alfa y beta de la HbA.
'lo ' 0
20
40
00
80
100
120
140
Presidn gaseosa del oxígeno (mrn Hg)
Flgura 7-8. Curvas defijacibn del oxígeno de la hemoglobina y la mioglobina. La tensión artenal de oxigeno es aproximadamente de 100 mm Hg, la tensión de oxígeno de la sangre venosa mezdada es de más o menos 40 rnm Hg, la tensibn caprlar (músculo activo) del oxígeno es de 20 mm Hg y la tensibn de oxígeno minirna requerida por las enzimac citocrómicas es de 5 mm Hg. La agrupacibn de cadenas en una estructura tetramkrica (hemoglobina) permite una cesibn mayor de oxígeno que la que sería posible mn cadenas sencillas. (Modificada con autorizacidn de Stanbury JB, Wyngaarden JB, Fredrrckson DS [editors]: The Metabolic Basis of lnhented Disease, 4th ed McGraw-Hill, f 978 )
70
(Capiau/o 7)
Bioquimica de Harper
que en todos los casos es superior a la PO?en !os tejidos periféricos del organismo en cuestihn. La hemoglobina fetal humana (H bl: del inglés, human~iaIhemoglohin) proporciona un ejemplo representativo. Para H bA, Pro = 26 mm Hg; para HbF, Pru= 20 mm Hg. Esta diferencia permite a la HbF extraer oxígeno de la HbA de la sange placentaria, Sin embargo, dcspuks del parto la HbF es inadecuada, ya que su elevada afinidad por el oxígeno la obliga a ceder menos O2a los tejidos. Al principio, el feto humano no sintetiza cadenas alfa ni beta sino reta y epsilon. Al final del primer trimestre, alfa ha reemplazado a las subunidades zeta y a 10s pCptidos Cpsílon. Asi, la hemoglobina F, que es la hemoglobina de Ia vida fetal tardía, tiene la camposici6n alFa: gammaz. Las cadenas beta, cuya sintcsis comienza en el tercer trimestre, no reemplala en su totalidad a gamrna hasta algunas semanas despues del nacimiento.
1 Forma T
wi
Forma R
Figura 7-10. Durante la trancicibn de la forma T a la R de la hemoglobina se produce Fa rotacibn da un par de subunidades rigidas (alfaZlbeta2) de 15 grados en relación con el otro par de subunidades rígidas (alfallbetal) El eje de rotacibn es excéntrico y además, el par alfa2lbeta2 derjva un poca hacia el eje. En el diagrama, el par aifallbetal no ect6 sombreado y se conserva f ~ oen , tantu que el par sombreado alfa2lbeta2 gira y se desplaza.
Grandes cambios de conformación acompañan la oxigenación de la hemoglobina La unión del oxígeno ocasiona la rotura de los enlaces salinos entre carboxilo de las cuatro subunidades (figura 7-9). La fijación subsecuente de O2se facilita ya que se requiere la rotura de un número menor de enlaces salinos. Estos cambios alteran lambidn de manera profunda las estructuras secundaria, terciaria y cuaternariade la hemoglobina. Un par de unidades alfdheta gira con respecto al otro par alfabeta, haciendo compacto al tetramero e incrementando Ia afinidad de los hemes por el O: (figuras 7-1 0 y 7-1 1 ). L a estructura cuaternaria de la hemoglobina parcialmente oxigenada se describe como el estado T (tenso) y el de la hemoglobina oxigenada (HbOz)
DESOXI (forma T)
0x1 (forma R)
Asn G41102)
His 94
/ n=
COO 4
ASP
NH,'
II,
Figura 1-9. Enlaces salinos entre las diferentes subunidades de la desoxihemoglobina Estas interaccioneselectrastáticas no covalentec son interrumprdas por la oxigenación (Ligeramente modtficada y reproducida con autorización de Stryer L. Brachemistry, 2nd ed Freernan, 1981.)
Figura 7-1 1. Cambios en el contado alfailbeta2 en la oxigenacion Et contacto se cierra de un Area en forma de cola de paloma a otra, comprende el cambio de un puente de hidrbgeno a otro distinto Los dernac enlaces son no polares (Reproducida con autorización de Perutz MF: Molecular pathology of human hemoglobin Stereochernical interpretation of abnormal oxygen affinities Nature 1971.232,408 )
como el estado R (relajado) (figura 7-12). La R y T se utilizan tambikn para describir las estructuras cuaternarias de las enzirnas alostkricas, donde el estado T tiene afinidad menor por el susírato.
bamato y liberando protones que contribuyen al efecto Bohr.
La oxigenación de la hemoglobina se acornpaiia de cambios de conformación en la vecindad del grupo hern
La conversión del amino terminal de una carga positiva a una negativa favorece la formacibn de un puente salino entre las cadenas alfa y beta, situación tipica del estado "desoxi". En los pulmones, la oxigenacibn de la hemoglobina se acompafía de la expulsi6n y la subsiguiente exhalación de COZ. Cuando la sangre recibe el Coa, laanhidrasa carbónica de Ios eritrocito5 cataliza Ia formación de ácido carbonico (figura 7-14). Este se disociacon rapidez en bicarbonato y un protón. Para evitar que se aumente la acidez en la sangre, debe existir un sistema amortiguador que absorba el exceso de protones. La hemoglobina retiene dos prorones por cada cuatro rnoltculas de oxigeno que pierde y de este modo aumenta la capacidad amortiguadora de la sangre (figura 7-15), En los pulmones, el proceso se invierte, es decir, conforme el oxígeno se une a la desoxihemoglobina, los protones se liberan y se unen al bicarbonato formando hcido carbónico. Con ayuda de la anhidma carbbnica, el hcido carb6nico forma Coz,que es exhalado. Por tanto, la fijacibn de! oxigeno obliga la expulsibn del COz. Este fenbmeno reversible se llama efecto Bohr: este efecto se acompafía por una desviacibn de la curva de oxigenacibn hacia la derecha, es decir, la hemoglobina se encuentra menos saturada a una presión parclal de oxígeno dada. El efecto Bohr es una propiedad de la hemoglobina tetramérica y depende de la interaccibn hem-hem o de efectos cooperativos. La mioglobina no muestra tal efecto.
En la oxigenación, los Qtomosde hierro de la desoxihemoglobina (que se encuentran alrededor de 0.06 nm fuera del plano del anillo hérnico) se mueven hacia este plano (figura 7-13). Este movimiento se tsansmite a la histidina proximal (Fg), que avanza hacia el plano del anillo y arrastra consigo a residuos adheridos a His F8.
Después de la liberación de oxígeno a los tejidos, la hemoglobina transporta COZy protones a los pulmones Además de llevar el oxigeno de los pulmones a los tejidos periféricos, la hemoglobina facilita el transporte del COz de los tejidos a los pulmones para ser exhalado. La hemoglobina puede un irse directamente al COI cuando cede su O? y aproximadamente 15% del CO1 acarreado por Ia sangre es transportado asi. El bióxido de carbono reacciona con los grupos amino terminales de la hemoglobina, formando un car-
m
CO~+H~-NH;=ZH'+
H ~b4-COO-
Estructura T
Estructura R
Figura 7-12. La Iransicibn de la estructura T a la estructura R es mfis probable conforme se oxigena cada 1 d e los 4 grupos hem de una hemoglobina tetrhmera En este modelo, los puentes salinos (lineas delgadas) que enlazan las sribunidades en la estructura T, se rompen progresivamente al unirse al oxigeno y aún aquellos enlaces salinos que no se han roto se debilitan cada vez m i s (lineas onduladas) La transicibn de T a R no tiene lugar sino decpu6s de q u e se han filado cierto numero de rnolewlas de oxigeno, pero se vuelve rnhs probable con cada oxígeno sucesivo que se une. La transición entre las dos estructuras es modificada por varios factores, incluyendo protones, bióxido de carbono, cloro y BPG. Mientras mayor sea su mncentracion, más oxígeno debe unirse para desencadenar la transiudn Aquí no se muestran mol&culac totalmente oxigenadas en la estructura T ni totalmente desoxigenadas en su forma R, debido a que son demasiado inestables para existir en cantidad significativa. (Modificada y redibujada Con autorizacidn de Perutz MF Hemoglobin structure and respiratory transport Sci Am [Dec] 1978:239,92)
(Capítulo 7)
Histidina Fa
ZCO, + 2HzO
1 lz3
2HXOs
Repulsibn
41 Plano de la porñrina
2HCO3-
x;;:>-03 TEJIDOS FERIFERICOS
Il
+ 2H
+
4%
(Amortiguador)
2HzCOa
PULMONES
Generado por el dcb de Krebs
Figura 7-13. El Btomo de hierro se mueve en el plano del hem durante la oxigenacibn La histidina F8 y sus residuos relacionadosson arrastrados con el fitomo de hierro. (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacibn de Stryer L Biochemistry. 2nd ed Freeman 1981.
Los protones que causan el efecto Bohr se generan por rotura de enlaces salinos durante la fijación del oxígeno Los protones que ocasionan el efecto Bohr, son generados por la rotura de puentes salinos durante la fijacibn del oxigeno a la estructura T. Estos protones, liberados de los itomos de nitrógeno de los residuos HC3 (His 146) de la cadena beta, conducen al bicarbonato hacia el acido carbbnico, el cual es liberado como C 0 2en la sangre alveolar (figura 7-1 5). Por otro lado, en la cesibn del oxigeno Ea estructura T y los puentes salinos se regeneran, y tos protones se unen a los residuos HC3 de la cadena k t a . Por tanto, la presen~iade protones en los tejidos periféricos favorece la formación de puentes salinos en la residuo His terminales de las subunidades beta. La regene-
Figura 7-14. Formacibn de á d o carbónico, mtatizada por Fa anhidrasa carbbnica eritroutaria y disociacibn del áudo carbbnico a ion bicarbonato y un protbn.
/'
Figura 7-15. Efecto Bohr El bibxido de carbono generado en los tejtdos periféricosse combina con el agua para formar Audo carbbnico el cual se disocia en iones bicarbonato y protones. La hemoglobina desoxigenada actúa como un amortiguador al fijar protones y liberarlos en los pulmones Aqui, la unibn del oxígeno a la hemoclobina desaloja a los protones; estos se combinan con el ion bicarbonato y regeneran al ácido mrbbnico el cual, cuando es dechidratadopor la anhtdrasa carbbnica, produce bibxido de carbono, que es exhalado desde los pulmones.
ración de los enlaces salinos propicia la liberacibn del O2 de la hemoglobina oxigenada (forma R). En resumen, un incremento en los protones estimula la liberacibn de oxígeno, en tanto que un incremento en el oxlgeno provoca la liberacibn de protones. El primer fenbmeno puede representarse en una curva de disociacibn del oxigeno por un desplazamiento a la derecha al aumentar la concentración de iones hidrbgeno (protones).
El 2,3-bicfosfoglicerato (BPG) estabiliza la estructura T de la hemoglobina En los tejidos perifericos, una escasez de oxigeno acumula el 2,3-difosfoglicerato (BPG)(figura 7-1 6). Este compuesto se forma a partir del intermediario de la vla glucolitica, 1,3-bisfosfoglicerato. Una molécula de BPG se une a cada tetrámero de la hemoglobina en una cavidad formada por residuos de las cuatro subunidades. La cavidad central es de tamaño suficiente para el BPG sblo cuando el espacio entre las hélices H de las cadenas beta es de una anchura adecuada, es decir cuando la molécula de hemoglo-
Proteinas: miogioblna y hemoglobina
Figura 7-16. Estructura del 2,3-bisfosfoglicerato(BPG).
bina esta en la forma T. El BPG es unido mediante puentes salinos entre sus Sitornos de oxigeno y las dos cadenas beta a travks de sus grupos m i n o arnino-termina1 (Val NAl ), Lis EF6 y His H21 (figura 7-17). Por tanto, el BPG estabiliza la forma T o desoxigenada de la hemoglobina por medio de enlaces cruzados con las cadenas beta y por contribuir con puentes salinos adicionales, que deben romperse antes de que se produzca la f o m a R. El BPG se une de manera más dtsbil a la hemoglobina fetal que a la hemoglobina del adulto debido a que el residuo H21 de las cadenas gamma de la hemoglobina fetal es Ser en lugar de His y no puede formar un puente salino con BPG. Por lo anterior el
73
BPG tiene un efecto menos profundo en la estabilización de la HbF y es causa de que esta parezca tener una mayor afinidad por el oxigeno que la hemoglobina del adulto. El desencadenante de la transicibn entre R y T de la hemoglobina es el movimiento del hierro dentro y fuera del plano del anillo de porfirina. Tanto los factores espaciales como los electrostáticos median ese desencadenamiento. Asi, un cambio minimo en la posición de Fe2' en relacibn al anillo de porfirina induce variaciones significativas de las confonnaciones de la hemoglobina y afecta de manera decisiva su función biolbgica en respuesta a una sena1 ambiental.
SE HAN IDENTIFICADO VARIOS CIENTOS DE HEMOGLOBINAS HUMANAS MUTANTES Las mutaciones en los genes que codifican las cadenas alfa y beta tienen potencial para afectar la functdn bioldgica de la hemoglobina. De los varios cientos de hemoglobinas humanas mutantes conocidas (lamayoría son muy raras y benignas), en seguida se descriixn algunas, cuya función biológica esti alterada. Cuando la alteracibn de la funcibn biolbgica se debe a una rnutacidn en la hemoglobina, el trastorno se conoce como una hemoglobinopatia.
En la hemoglobina M, Tir reemplaza a His F8 El hierro hdmico se estabiliza en el estado Fe", ya que forma un complejo i6nico firme con el anión fenolato de Tir, Larnetahemoglobinemia, donde el ion hierro del hem está en estado férrico en lugar de ferroso, puede ser adquirida (por ejemplo, con la oxidacirin de Fe2' a Fe3+por compuestos tales como las sulfonamidas), hereditaria (debido a la presencia de HbM) o causada por la disminuci6n de Ia actividad de la rnetahemoglobina reductasa, enzima que reduce el Fe" de MetHb a Fe2+.Puesto que la metahemoglobina no fija 01, no puede participar en el transporte de oxlgeno. En las variantes de la cadena alfa de la hemoglobina M, el equilibrio R-T favorece a la forma T. La afinidad por el oxigeno esta disminuida y no hay efecto Bohr. La cadena beta de estas variantes presenta cambio R-T y, por tanto, se produce el efecto Boht. Las mutaciones (por ejemplo, la hemoglobina Figura 7-17. Modo de enlace del 2-3-bisfosfoglieeratoa la Chesapeake} que favorecen la f o m a R muestran una deaoxihemoglobina humana. El BPG interactba con tres afinidad creciente por el oxigeno, por lo cual no lo grupos d e carga positiva en cada cadena k t a (Basada en Arnone A: X-ray diffraction study of binding of 2,341phospho- ceden en suficiente cantidad a los tejidos periftricos. glycerate to human deoxyhemoglobin Nature 1972;237.146. La hipoxia tisuIar que se produce lleva a policiternia (incremento en el número de eritrocitos). Reproducida con autorizacibn.)
En ia hemoglobina S, un residuo valil reemplaza al glutamato beta-6 En la hemoglobina S, Val reemplaza a Glu A2 (6)P, es decir. el residuo 6 de la cadena beta localizado en la superficie de la hemoglobina, expuesta al agua. Esta sustitución reemplaza el residuo polar glutamato por uno no polar y da lugar a una "zona adherente" en la superficie de la cadena beta. Esta zona existe en las formas oxigenada y desoxigenada de la hemoglobina S pero no en la hemoglobina A. En la superficie de la hemoglobina S desoxigenada hay un complemento para la zona adherente, pero en la hemoglobina S oxigenada este sitio complementario esta enrnascarado (figura 7-1 8).
Aunque la desoxihemoglobina A contiene los sitios receptores para ia zona adherente que existe en las hemoglobinas S, oxigenada y desoxigenada (figura 7-1 S), la uni6n de la hemoglobina S adherente a la desoxihernoglobina A no puede extender el polimero, ya que esta iiltírna no tiene zona adherente para promover a su vez la unibn de otra molCcula de hemoglobina. Por tanto, la uni6n de la desoxihemoglobina A a la forma R o a la forma T de la hemoglobina S terminará la polimerizacibn. EI polimero forma una fibra helicoidal torcida, cuya seccion cruzada contiene 14 moléculas de HbS (figura 7-1 9). Estas fibras tubulares distorsionan al eritrocito de modo que toma la forma de una hoz (figura 7-20) y son vulnerables a lisis cuando penetran a los intersticios de los sinusoides esplknicos.
La desoxihernoglobina S puede formar una estructura fibrosa que distorsiona los eritrocitoc Cuando la hemoglobina S está desoxigenada, su zona
adherente puede unirse a la zona complementaria de otra molécula S desoxigenada. Esta union hace que la hemogiobina S desoxigenada se polimerice, formando precipitados fibrosos largos que se extienden a través del eritrocito y lo distorsionan mecfinicamente causando lisis y mtiltiples efectos cllnicos secundarios. Asl, si [a hemoglobina S pudiera conservarse en su estado oxigenado, o si la concentracidn de la Forma desoxigenada lograra mantenerse en un mínimo, no se formarían estos polímeros y se evitaria la aparición de "células falciformes". Es evidente que la forma T de la hemoglobina S es la que se polimeriza.
0 x 1A
Desoxi A
Desoxi A
1) Mioglohinuria: Despues de lesiones multiples, [a mioglobina liberada de las fibras muscuIares rotas aparece en la orina, colorehndola de rojo oscuro. Aunque después de un infarto del mimardio es Q O S ~ ble detectar la mioglobina en el plasma, el andlisis de las enzimas skricas (capitulo 8) proporciona un indice m& sensible del daflo miocárdico. 2) Anemias: Las anemias comunes (reducciones en la cantidad de eritrocitos o de hemoglobina en la sangre) se deben al deterioro de la slntesis de hemoglobina (por ejemplo, en deficiencia de hierro; capítulo 59) o a la produccibn alterada de eritrocitos (es el caso de la deficiencia de ácido fólico o vitamina Biz; capitulo 52). El diagnbstico de las
Oxi S
Desoxi S
Desoxi S
Flgura 7-18. Representacidn de la zona adherente (A) en la hemoglobina S y su "receptor" ( A ) en las desoxihemoglobinas A y S Las superficies complementarias permiten que la desoxihernoglobina S po/irnerice en una estructura fibrosa, pero la presencia de la desoxihernoglobina A termina la polimerizacibn debido a que no posee zona adherente. (Modificada y reproducida con autorizaubn de Stryar L. Biochemrstry, 2nd ed Freernan, 1981.)
Proteínas: miog/ubina y hemoglobina
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3) Hemoglobinopatias: En tanto que la mutación de ciertos residuos crlticos de la hcmogIobina (como las histidinas E7 o F8) tiene consecuencias graves. es posible que la rnutacidn de muchos residuos
Figura 7-19. Reprecentacidn de la estructura helimidal propuesta de una fibra de desoxthamoglobina S agregada En este modelo, las esferas representan moléculas inviduales de HbS (Reproducida con autorizacibnde Maught II: A new understanding of sickle cell emerges Scienoe 1981,211 265 Copyright Q 1981 by the Arnerican Association for tha Advancement of Science )
anemias comienza con la deteminacidn espectrofotométrica de la concentración de hemoglobina sanguinea. Las talasemias y el uso de probadores de DNA para su diagnóstico se consideran en los capitulas 8 y 42.
superficiales, alejados del sitio de fijacion del hem, no se traduzca en anormalidades clinicas. Una excepcE6n notable es la anemia de cklulas falciformes, en donde todos los signos y sintomas (por ejemplo, crisis de céluEas Fatciformes y trombosis) provienen de la mutación de un solo residuo polar por uno no polar. 4) Hemoglobina glucosilada (HbAlr): Cuando la glucosa sanguínea entra a los eritrocitos, la hemoglobina es glucosilada de manera no enzimatica y su hidroxilo anomérico deriva los grupos amino presentes en los residuos lisil y en las terminales amino. La HbAic, puede separarse de HbA por cromatografía de intercambio ionico o electroforesis. La fraccibn de hemoglobina glucosilada, normalmente alrededor de 5%, es proporcional a la concentracibn de glucosa en la sangre. Por tanto, la medicibn de HbAic proporciona Pnfomaci6n util para el manejo de la diabetes sacarina. Dado que la vida media de un eritrocito es de 60 dias, la concentración de HbA i c refleja la concentración sanguínea promedio de glucosa en el periodo de 6 a 8 semanas precedentes. Asi, una HbA icelevada, que indica control deficiente de la glucosa sanguinea, puede guiar al mkdico en la seleccibn del tratamiento apropiado (por ejemplo, un control m i s riguroso de la alimentación o una dosificacibn mayor de insulina).
Figura 7-20. Micrografla electrdnica de barrido de un eritrocito normal (A) y uno falciforme {B).El cambio en la mol6cula de globina beta que causa esta alteracibn estructural, es consecuencia de la mutacibn de una sola base en el DNA Ttmina (T) por adenina (A), lo cual conduce a la sustitucidn de un residuo de valrna por uno de glutamina en la malécula de globina beta
Las talasemias se originan de la síntesis reducida de cadenas alfa o beta En las talasemias, la síntesis de las cadenas alfa (alfatalasemias} o beta (beta-tarasemias) de la hemoglobina estA disminuida. La consecuencia es una anemia que puede ser muy grave (capítulo 42).
RESUMEN Las proteínas globulares compactas, mioglobina (Mb) y hemoglobina (Hb), funcionan en el almacenaje y transporte de oxigeno. respectivamente. La ~b &S monomerica; Hb es un tetrhmero de dos tipos de subunidades (alfazbetaz en la hemoglobina del adulto, H1iA). La Mb y la subunidad beca de Hb, rica en hélices aIfa, comparten una estructura secundaria y terciaria vimialmente idtnticas (no así la Los residuos de arninoAcidos de sus seis (A a H) regiones helicoidales se denominan (por ejemplo) "His P8" -la histidina que es el octavo residuo en la hClice F o sexta. El grupo prostktico hem de Mb y I-Ib es un tetrapirrol ciclico, planar en esencia, un poco plegado, con un Fe" central. Cuando el grupo hem se agrega a una apomioglobina desnaturalizada (Mb sin hem), ésta se pliega de nuevo en su confomación nativa. Por tanto, la información estructural primaria impEicita en apoMb (y por extensidn, en otras proteínas) basta para definir la estructura secundaria y terciaria. El Fe2' del hem se une a los cuatro átomos de nitrogeno del hem y a los dos ligandos adicionales localizados arriba y abajo del plano del hem. Un ligando es la histidina FX. En la oxiMb y oxiHb, el sexto ligando es 02.En una intoxicacibn con monhxido de carbono, el sexto ligando es CO el cual, a pesar del obsthculo espacial por la presencia de His F7, se une con más fuerza al hierro que el 02. Las curvas de saturación muestran la captacibn y liberacirln del oxigeno. La curva de Mb es hiperbblica,
en tanto que con Wb es sigmoidea. Esta ultima forma es critica para una mol6cula transportadora de Oz que debe saturarse con oxígeno en los pulmones y liberarlo al m k i m o en los tejidos. Las afinidades relativas de las diferentes hemoglobinas se expresan como Pso, que es la presi6n parcial de O?a la cual se saturan la mitad de hemoglobinas con oxígeno. Las hernoglobinas se saturan a las presiones parciales de sus respectivos órganos respiratorios (por ejemplo, HbF se satura con la PO1 de la placenta). Los residuos His proximal (F8) y dista1 (E7) descansan en sitios opuestos del anillo hémico. Durante la oxigenacion, Fe2', His F8 y Pos residuos adyacentes se mueven hacia el anillo htmico. Por tanto, [a oxigenacidn de Hb se acompafía de cambies notorios en la conformación. La adición de Oza desoxiHb destruye los en taces salinos entre subunidades y dentro de ellas, volviendo laxa la estructura cuaternaria y facilitando la fijación de moliculas adicionales de oxigeno. En la cavidad central de la desoxiHb, el compuesto 2,3-bisfosfoglicerato (RPG) forma enlaces salinos con las subunidades beta, que estabilizan aún m8s la desoxiHb. Durante la oxigenacirln, la cavidad central se c o n h e , el BPG es expulsado y la estructura cuaternaria de nuevo queda laxa. La Hb tiene también la funcibn de transportar COI y protones desde los tejidos al pulmbn. La liberación de oxigeno de ra oxiHb (HbO2) a los tejidos se acornpaiía de captacibn de protones debido a la disminucirln del valor de pK. de un residuo His. Entre los cientos de mutantes de Hb (en gran parte benignos) se destaca la hemoglobina de las células falciformes (HbS), en la cual Val reemplaza a Glu beta6 de HbA. Esto crea una "zona adherente" que tiene un complemento sobre la desoxiHb (pero no en oxi Hb). En concentraciones bajas de oxigeno, desoxiHbS polimeriza, forma fibras y distorsiona los eritrocitos dándoles formas de hoz. Las talasemias al fa y beta son anemias causadas por disminución en la produccibn de subunidades alfa y beta de HbA, respectivamente.
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REFERENCIAS Bunn HF, Forget BG: Hemoglobin Molecular, Generic, and Clinical Aspects. Saunders. 1986. Eaton WJ, Holfrichter J: Sickle cell hemoglobin polym-
eritalion. Adv Protein Chem 1990;40:63. Embury SH et al.: Rapid prenatal diagnosis of sickle cell
anemia by a new method of DNA analysis. N Engl J Med 1987;316:56. Embury SH: The clinical pathology of sickle-celI disease. Annu Rev Med 1986;37:361. E v e r s ~J, Vandergriff KD, Winslow RM: Hemoglobins: Part B. Biochernical and analytical rnethods. Methods Enzymol23 1 :1994.
Everse J, Vandergriff Kü,Winslow RM:Hernoglobiiis: Pmt C. Biophysiml methods. Methods Enzymol232:1994. Friedman JM: Structure, dynamic, and reactivity in hemaglobin. Science 1985;228: 1273. Saiki RK et al.: Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sicklecell anemia. Scienm 1985;230:1350. Schacter L et al.: Altered amounr and activíty of superoxide dismutase in sickle celE anemia. FASEB J 1988;2:237. Weatheral! DJ et al.: The hernoglobinopathies. Page 2281 In: The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed. Scriver CR et al (editors). McGraw-Hill, 1995.
Enzirnas: propiedades generales
Despues del daflo tisular grave (por ejemplo, infarto del miocardio o pulmonar, trituracidn de un miembro) o posterior a la multiplicación celular descontrolada (como en el carcinoma prostktico), las enzimas propias de los tejidos específicos pasan a la sangre. Por tanto, la determinación de estas enzirnas intracelulares en el suero sanguineo proporciona a los m6dicos inforrnacidn valiosa para el diagnbstico y pronóstico.
Los temas considerados en este capitulo incluyen las clases de reacciones catalizadas por enzirnas, la participacibn de coenzimas en reacciones de transfemcia de grupo catalizadas por enzima y aspectos de la especificidad enzimiitica. Asimismo, se introducen los m ttodos para purificación, análisis y deteminacibn de la distribucilin intracetular de enzimas. Luego se describen las isoenzimas, el. diagnbstico y el significado pronóstico de las enzirnas dricas, concluyendo con el uso de endonucleasas restrictivas en el diagnostico de enfermedades geneticas.
LAS ENZIMAS SE CLASIFICAN POR TIPO DE REACCIÓN Y MECANISMO
IMPORTANCIA BIOMÉDICA
Hace un siglo s61o se conocían algunas enzimas, muchas de las cuales catalizaban la hidrbtisis de en-
Sin enzimas no sería posible la vida que conocemos. Igual que [a biocatálisis que regula [a velocidad a la cual tienen lugar los procesos fisiológicos, las enzimas llevan a cabo funciones capitales relacionadas con la salud y la enfemedad. Mientras que en estado de salud todos los -esos fisiológicos se llevan a cabo de una manera ordenada, regulada y se conserva la homeostasia, durante los estados patoldgicos, esta última puede ser perturbada de manera profunda. Por ejemplo, el dafío tisular grave que caracteriza a la cirrosis hepfitica puede deteriorar de modo notable la propiedad de las células para producir enzimas que catalizan procesos metabólicos claves como la sintesis de urea. La incapacidad celular para convertir el arnoniaco tbxico a urea no tóxica es seguida por intoxicacibn con amoniaco y, por último, coma hephtico. Un conjunto de enfermedades genbticas raras, pero con frecuencia debilitaiites y a menudo mortales, proporciona otros ejemplos impresionantes de las drásticas consecuencias fisiolbgicas del deterioro de la actividad enzirnhtica, incfusive de una sola enzima.
laces covalentes. Esm enzimas se identificaban por la adición del sufijo -asa al nombre de la sustancia o sustrato que hidrolizaban. De este modo, las lipasas hidrolizaban grasas (lipos, en griego); las amilasas, alrnidbn (amylon, en griego) y las proteasas, proteinas. Aunque hasta hoy persisten numerosos vestigios de esta terminología, demostr6 ser inadecuada cuando se descubrieron varias enzimas que catalizaban reacciones diferentes del mismo sustrato; por ejemplo, oxidacibn o reducción de la función alcohol de un azúcar. Aunque el sufijo -asa sigue en uso, en la actualidad los nombres de las enzirnas enfatizan el tipo de reaccidn catalizada. Por ejemplo, las deshidrogenasas catalizan la eliminacibn de hidrógeno y 1% transferasas, reacciones de transferencia de grupo. Con el descubrimiento de m&- y mhs enzimas, surgieron ambigtiedades inevitables y con frecuencia no estaba claro cukl era la enzima que un investigador deseaba estudiar. Para remediar esta deficiencia, la Uni6n Internacional de Bioquirnica (IIJB, del inglis, Internotional Union of Biochemistry) adoptó un sistema complejo, pero inequivoco, de la nomenclatura
enzimhtica basado en el mecanismo de reacción. Aunque su claridad y carencia de ambigüedad recomiendan a[ sistema de nomenclatura IUB para trabajos de invcstigación, nombres mis ambiguos, pero afortunadamente: bastante mhs cortos persisten en libros de texto y en el laboratorio clínico. Por esta razón, a continuación se presentan sólo principios generales del sistema IUR: 1) Las reacciones y las enzimas que las catalizan se dividen en seis cIases principales, cada una con 4 a 13 subclases. 2) El nombre de la enzima tiene dos partes. La primera es el nombre del o de los sustratos; Ia segunda, con terminación -asa, indica el tipo de reacción catalizada. 3) Infonnacion adicional, si es necesario aclarar la reacción, puede seguir en paréntesis, Por ejemplo, la enzima que cataliza ],-malato + NAD' = pinivato + COI + NADH t , ' H S/ denomina como 1.1.1.37 ~-malato:NAD oxidorreductasa (descarboxi lante). 4) Cada enzima tiene un número clave (E.C.) que caracteriza al tipo de reaccibn segun la clase (primer digito), subclase (segundo digito) y sub-subdase (tercer digito). El cuarto digito es para la enzima especifica. AsC, E.C. 2.7.1.1 denota la clase 2 (una transferasa}, subclase 7 (transferencia de fosfato), sub-subclase 1 (una función alcohol como aceptor de fosfato). El último digito denota a la enzima hexocinasa o ATP:D-hexosa-6-fosfotransferasa, enzima que cataliza la transferencia de fosfato desde el ATP al grupo hidroxilo del carbono 6 de la glucosa.
MUCHAS ENZIMAS NECESITAN UNA COENZIMA Muchas enzimas que catalizan la transferencia de grupos y otras reacciones necesitan, ademb de su sustrato, una segunda mol~culaorghnica conocida como coenzima, sin la cual son inactivas. Para distinguirlas de iones methlicos activadores y de las enzimas mismas, las coenzimas se definen como compuestos orgánicos termoestables, de peso molecular bajo, necesarias para ta actividad de las enzimas. La mayoda de las coenzimas se unen a las enzimas por fuerzas no covalentes. Las que forman enlaces covalentes con las enzirnas se denominan tambikn grupos prostkticos. Entre las reacciones que necesitan coenzimas están las oxidorreducciones, las reacciones de transferencia de grupo e isomerizacibn y las reacciones que forman enlaces covalentes (claves 1, 2, 5 y 6 de la
IUB). Las reacciones liticas que comprenden reacciones hidroliticas catali~adaspor enzimas digestivas no necesitan de coenzimas.
Las coenzimas pueden considerarse como segundo sustrato Puede ser útil considerar a la coenzima como un segundo sustrato por dos razones. En primer lugar, los cambios químicos en la cOenzima compensan exactamente a los que se realizan en el sustrato. Por ejemplo, en las reacciones de oxidorreducci6n (deshidrogenasa), cuando una rnolecula de sustrato es oxidada, una rnoIkcula de coenzima es reducida (figura 8-1). Una segunda raz6n para dar igual tiifasis a las reacciones de la coenzima es que este aspecto de lareacción es el que puede tener el mayor significado fisioPogico fundamental. Un caso es la importancia de la capacidad det músculo que trabaja en condiciones anaerobias para convertir el piruvato en lactato no reside en el piruvato ni en el lactato. La reacción sirve solamente para oxidar la coenzima reducida NADH a NAD'. Sin N A D ' la glucólisis no puede continuar y 3a sintesis anaerobia de ATP (y por tanto, el trabajo) tiene que cesar. En condiciones anaerobias, la reduccion del piruvato en lactato reoxida al NADH y permite la sintesis de ATP. Otras reacciones pueden servir iguaImente bien. Por ejemplo, en las bacterias o Fevaduras que crecen en un medio anaerobio, algunos metabolitos derivados del piruvato son utilizados como oxidantes para el NADH y ellos mismos son reducidos (cuadro 8-1).
Las coenzimas funcionan como reactivos en la transferencia de grupos Las reacciones bioquímicas de transferencia de grupo del tipo
, c-Lactato
o
x
NAD"
O piruvato
NADH + H+
Flgura 8-1. El NAD+ actúa como cosustrato en la reaccibn de la lactato deshidrogenasa
Enzimas: propiedades generales
Cuadro 8-1. Mecanismos para l a regeneración obia de iu A n+
-
-
-
-
ia viviente-
Pir :ctaldehido .,.La.,
u,,
dihidroxini
la. bacterias
L IVIUSLU
lácrica: Levadiira
-
Frr
ias lietert
79
Para la transferencia de grupos distintos del hidrógeno: Fosfatos de azucares. COA-SH. Pirofosfato de tiamina. 4 Fosfato de piridoxal. i Coenzimas del folato. * Biotina. Coenzimas de cobalamina (R 12). * Ácido lipoico. Para la transferencia del hidrbgeno:
en la cual un grupo funcional, G, es transferido de una moIecula donadora, D - G , a una moltcula aceptora. A, por lo gencral comprende la participaci~nde una coenzima como ultimo aceptor (por ejemplo, las reaccicne? de deshidrogenación) o como portador intermediario del grupo (como las reacciones de transaminacion). El esquema siguiente muestra el ultimo concepto.
Aunque esto sugiere la fomacion de un complejo sencillo C o E 4 , durante el curso de la reacción global, pueden intervenir varios complejos intermediarios C o E 4 en una reacción particular (como la transaminacibn). Cuando eI grupo transferido es el hidrhgeno, se acostumbra representar s61o la "mitad izquierda de la reaccion ":
NAD+, NADP+ FMN, FAD. Ácido lipoico. Coenzima Q.
Muchas coenzimas derivan de vitaminas B y del monofosfato de adenosina
Las vitaminas i3 forman parte de la estructura de numerosas coenzimas. Las nicotinamida, tiamina, siboflavina y iicido pantoténico son constituytntes esenciales de las coenzirnas para las oxidaciones y las reducciones bioIógicas mientras que las coenzimas Bcido fhlico y cobamida funcionan en el metabolismo de compuestos de un solo carbono. Numerosas coenzimas contienen adenina, ribosa y fosfato y se derivan del monofosfato de adenosina (AMP. del inglés, adenmine monopho.~phate).tos ejemplos incluyen NAD' y NADP' (tlgura 8-2). Las enzimas son catalizadores estereoespecificos
Que esto representa en realidad sólo un caso especial de la transferencia general de grupos puede apreciarse mejor en tkrminos de las reacciones que tienen lugar en las células intactas (cuadro 8-1 ). Se pueden representar de la siguiente manera:
Las coenzimas pueden clasificarse de acuerdo al grupo cuya transferencia facilitan BacBndose en este concepto, podrían clasificarse las coenzirnas del siguiente modo:
Casi todos los sustratos forman por lo menos tres enlaces con las enzirnas. Esta "adherencia en tres puntos" puede conferir asimetría a una moldcula por otro lado cimCtrica. La figura 8-3 muestra una molécula de sustrato, representada como un átomo de carbono que tiene tres grupos diferentes, pr6ximos a adherirse en tres puntos a un sitio de la enzima. Si el sitio puede ser alcanzado sblo desde un lado y únicamente los fitomoc compIementarios y los sitios pueden interactuar (ambas suposiciones válidas para las enzimas reales), la molécula se unira sólo en una forma. La reaccibn misma puede estar confinada a los Atomos unidos en los sitios 1 y 2 aun cuando los htomos 1 y 4 sean idénticos. Girando mentalmente la moldcula de sustrato en el espacio, nótese que puede adherirse en tres puntos a un costado del sitio planar con una sola orientaci6n. En consecuencia, los Atomos 1 y 4, aunque sean idénticos, vienen a ser distintos
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Bioquimica de Harper
MUCHAS ENZlMAS CATALIZAN UNA REACCION O UN TIPO DE REACCION ESPEC~F ICA L a capacidad de una enzima para catalizar una reacción específica y esencialmente ninguna otra, es qui7A su propiedad miis significativa. De este modo, las velocidades de procesos metabólicosespecificas pueden regularse por cambios en la eficiencia catalitica de enzimas específicas. Sin embargo, la mayoría de las enzima~catalizm el mismo tipo de reacción (transferencia de fosfato, oxidación-reduccióin, etcdtera) con un pequeflo numero de sustratos relacionados estructuralmente. Las reacciones con otros sustratos alternativos tienden a efectuarse si ellos se encuentran en altas concentraciones. Que todas las reacciones posibles ocurran en el microorganismo vivo depende de la concentracibn relativa de sustratos alternativos en las células y de la afinidad relativa de la enzima para esos sustratos.
Las enzimas muestran especificidad óptica Figura 8-2. NAD(P)+. En NAD', -R
= H; en NADP*, R =
0~03"'.
cuando el sustrato esta adherido a la enzima. Por tanto, un cambio químico puede afectar e1 &tomo 1 (pero no el Btomo 4) o viceversa. Si bien los sitios activos de las enzimas no son las supeficies planas que se muestran en la figura 8-3, la figura no puede mostrar la causa de que la reducción catalizada por la enzima del piruvato sin actividad bpticaproduzca L-lactato en vez de D, L-lactato
Excepto las epimerasas (racernasas), que.catalizan la interconversión de 10s idmeros bpticos, las enzimas por lo general muestran una especificidad bptica absoluta por lo menos para una porción de la rnoldcula de sustrato. Asi, las enzirnas de la via glucolitica y de la oxidativa directa catalizan la interconversibn de los D- pero no de los L-fosfoanjcares. Con unas cuantas excepciones (por ejemplo, la D-aminoacidooxidasa del riilon), la pan mayoría de las enzirnac de los marniferos actúan sobre los L-isbmeros de los aminohcidos. L a especificidad 6ptica se puede extender a una porción de la mol~culadel sustrato o a su totalidad. Las glucosidasas proporcionan ejemplos de ambos casos. Estas enzimas catalizan la hidrblisis de las uniones glucosidicas entre aziicares y alcoholes, y son altamente especificas para la porcibn azúcar y para la uni6n (alfa o beta), pero relativamente inespecíficas para la porcion alcohólica o aglicona. Las enzimas presentan un alta especificidad para el tipo de reacciiin que catalizan
Sitio enzimatim
Sustrato
Figura 8 3 . Representación de la adherencia en tres puntos de un sustrato a un sitio activo planar da una enzima.
Las enzimas líticas actúan sobre grupos de compuestos quimicos particulares, por ejemplo, glucosidas% sobre glucbsidos, pepsina y tripsina sobre los enlaces peptidicos y las esterasas sobe los ksteres. Un p a n numero de sustratos pueden ser atacados reduciendo asi, el número de enzirnas digestivas que de otro modo serian requeridas. Numerosas proteasas
Enzimm: propied~desgenerales
catalizan tarnbidn la hidrólisis de los tsteres. En tanto que esto es probablemente de importancia fisioldgica limitada, el uso de ésteres como sustratos sinttticos ha sido importante en el estudio del mecanismo de accion de las proteasas. Ciertas enzimas líticas presentan alta especiftcidad. La quimiotripsina hidroliza los enlaces peptidicos en tos cuales el grupo carboxilo es apostado por los aminohcido~aromhticos fenilalanina, tirosina o triptbfano. Las carboxipeptidasas y las aminopeptidasas desdoblan los aminoácidos I por 1 de la terminal carboxilo o de la amino de [as cadenas polipeptldicas, respectivamente. Aunque algunas oxidorreductasas funcionan igualmente bien, ya sea con NAD' o con NADP' como aceptores de electrones, la mayor parte de ellas usan exclusivamente uno o el otro. En general, las oxidorreductasas funcionales en los procesos biosintéticos de los sistemas de mamlferos (por ejemplo, en la síntesis de ácidos grasos o de esteroles) utilizan NADPH como reductor, mientras que las funcionales en los procesos de degradación (por ejemplo, la glucólisis, la oxidacibn de [os hcidos grasos) utilizan NADkomo oxidante.
LA ACTIVIDAD CATAL~TICA DE UNA ENZIMA FACILITA SU IDENTIFICACI~N
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o del NADPH (pero no del NAD' o del NADP') para absorber la luz a una longitud de onda de 340 nm (figura 8-41. La oxidación de NADH en NAD' se acompaíia de una disminucibn de la densidad bptica (DO) a 340 nm,proporcional a la cantidad de NAD que se oxida. De igual manera, cuando el NAD' se reduce, la DO aumenta en proporcion a la cantidad de NADH que se produce. Este cambio de DO, se puede utilizar para el anhlisis cuantitativo de cualquier NAD' o NADP' dependientes de deshidrogenasa, tal como sigue. Para una deshidrogenasa que cataliza la oxidación de NADH, mediante su s u s ~ oxidado, o la velocidad de decrecimiento de DO a 340 nm es directamente proporcional a la concentracibn enzimática.Por tanto, la medicibn de la velocidad de decrecimiento en DO a 340 nrn permite deducir la cantidad de enzima, expresada en unidades de actividad, presente en una muestra biológica dada como suero o extracto de tejido.
Muchas enzirnas pueden analizarse por acoplamiento de una reacción a una deshidrogenasa
En el ejemplo anterior se midi6 la velocidad de formaci6n de un producto (NADH} para determinar ta actividad enzimatica. TambEen es posible analizar la ac-
tividad de otras enzimas diferentes de las deshidrogenasas por la medicibn de la velocidad de aparición
Las pequeiías cantidades de enzimas presentes en la célula obstaculizan la rnedicidn de la cantidad de una enzima en liquidos o extractos de tejidos. Por fortuna, la actividad catitalitica de una enzima provee un dispositivo sensible y especifico para su propia medición. Para medir la cantidad de una enzima en una muestra de extracto tisular o de algún liquido biológico, se establece la velocidad de la reacción catalizada por ella. En circunstancias apropiadas, la velocidad medida es proporcional a la cantidad de enzima presente. Dado que es dificil determinar el número de mol&culaso la masa de enzima presente, los resultados se expresan en unidades enzimáticas. Las cantidades relativas de la enzima se pueden entonces comparar en diferentes extractos. Tales unidades se expresan mejor en micromoles (prnol; 1Q4 mot), nanomoles (nmol; lo4 rnol) o picomoles (pmol; 10-'' mol) de sustrato reaccionante o de producto formada por minuto. Las unidades internacionales enzimáticas correspondientes son pU,nU y pU.
Las deshidragenasas que dependen de NAO' puede analizarse a 340 nm En las reacciones que interviene el NAD' o el NADP' (deshidrogenasas) se utiliza la propiedad del NADH
1 1 200
1
233
I
1
300 350 Longitud de onda (nm)
600
Figura 8 4 ,Espectros de absorcibn del NADt y del NADH. Las densidades corresponden a una solucibn de 44 m g k en una celdilla de 1 m de paso de luz. El NADP* y el NADPH tlenen espectros semejantes a los de NAD* y NADH, respectivamente.
82
(Capitulo 8)
Rioquimicu de Harper
Glucosa
mecanismos reguladores que operan a nivel de la catálisis, derivan en gran medida de los estudios de enzima purificadas. La información fidedigna referente a la cinética, cofactores, sitios activos, estructura y mecanismo de acción tam bien nccesita cnzinias altamente purificadas.
1
ATP, ~ g "
[HEXC)CINASAI
ADP, h2+
Gluwsa 6-fosfato
La purificación incrementa la actividad especifica
GLUCO-SA6-FOSFATO DESHIDROGENASA
NADPH + H'
Figura 8-5. Andlisis acoplado para la actividad de la hexocinasa La reaccibn se acopla a la catalizada por la glucosa-6fosfato deshidrogenasa. Todos los reactivos, glucosa6-focfato deshidrogenasa, glumsa, ATP, y NADP*. se agregan en exceso. Entonces, la cantidad de hexocinasa presente determina la velocidad de la reacción acoplada global y. por tanto, la velocrdad de formación del NADPH, la cual puede ser medida a 340 nrn
de uii produclo (o, de modo menos común, la velocidad dc desaparición de un sustrato). Las propiedades fisictiquimicac del producto o sustrato determinan el mEtodo especifico seleccionado para la cuaníificacihn. A menudo es conveniente "acoplar" el producto de una reacción a una deshidrogenasapara la cual este producto representa un sustrato (figura 8-5).
ES ESENCIAL DISPONER DE ENZlMAS PURAS PARA COMPRENDER SU ESTRUCTURA, SU FUNCIÓN,~ SU MECANISMO DE REACCION Y SU REGWLACION E:l conocimiento de las reaccionecy los intermediarios quimicus en las vias meiabólicas así como de los
Cuai
El objetivo de la purificacihn de la enziina es aislar una proteina enzimhtica especifica dc un cxtracio crudo de celulas que contienen muchos otros compcinentes. Idas moléculas pequeiias pueden eliininarse por dialisis o por filtracidn en gel, los Licidos nucleicos por precipitacihn con el antibiótico estreptomicina, etcktera. El problema es separar la enzima deseada de una me7cla de cientos de proteínas quirnica y fisicamente semejantes. En el cuadro &-2 se muestra el progreso de la puri~~cación tipica de una enzima hepática con una recupcraci6n adecuada y una purificación de 490 veces. Nótese la forma en que se calcuEan la actividad especifica y la recuperacibn de la actividad inicial El objetivoes lograr la actividad especiiica máxima ( m i dades de enzima por miligramo de proteína) coi1 la mayor recuperación posible de la actividad inicial.
Para la purificación se emplean crornatografía de intercambio ionico y cromatografía con soportes de exclusion de tamaño Los procedimientos de purificacibn clásicos útiles incluyen la precipitacilin con concentraciones salinas variables (por lo general con sulfato de sodio o de amonio) o solventes (acetato o etanol), la dcsnaturalizacidn diferencial por calor o pH, Ia centrifugación diferencial, la filtracihn en gel y la electroforesis. La absorción celcctiva y la elucion de las proteínas en
iesumen de un esqluemn típico de pu rificación de una e
1 Actividad accibn dc ia
(mCJ)* 100 00(. 98 995 90 .,. OOC
~ii~irria
-
iteina tota
1
(mrr)
Hornogene izado criidc Liquido sol~rcnadante I'recipitado con (NIld Precipitado con acetorl a 20 a 350/u Fracciones 80 a 1 1 0 e ri, columna DBAE I'recipitado con (NH4)?SO443 a 4 8% Prirneroc cristales Recristalixacion 49 O00 . -* mlJ = milienzima: milimolcs de sustrato que cambian por minu
-
A,.A
"A--""
1
L ~ U
29
20 12
49
.- ..---
celulosa de intercambio aniónico, dietilarninoetilcelulosa (DEAE del ingles, diefhyIunainoe/hyoy en !a de intercambio catiónico carboximetilcclulosa (CMC. dcl inglds, carhox,vmeih~~/celJul~ tambien han sido extremadamente utiles para la purificación extensa y ripida de proteínas. Por ejemplo. un extracto acuoso de tejido hepático se ajusta a pH 7.5, valor en el cual la mayoría de las proteínas tienen una carga negativa neta. Luego, se adiciona la mezcla de proteínas solubles a una oolurnna de celulosa D E A E amortiguada a pH 7.5, valor al cual llt;,AE tiene carga positiva. Las proteínas con carga negativa sc Lincn a DEAE por interacción de cargas opuestas, eii tanto que las proieínas sin carga o con carga positiva fluyen libremente a traves de la columna. Luego, la coliimna se eluye, por lo común usando iin gradiente de NaCl que va de concentración ba,ja a alta, disuelto en amortiguador con pH 7.5. Dado que CI-compite con las proteínas por sitios de fijación cn cl soporte con carga positiva, éstas se eluyen de manera selectiva, primero las que se enlazan débilmente y, al último, las de enlace fuerte. Separaciones proteínicas an5logac emplean un soporte crin cargia negativa como carboximetiIceIulosa o fosfocelulosa a un p l l algo menor, para asegurar que ias proteínas tcngaii una carga m i s positiva Las separaciones de proteínas también pueden lograrsc sobre nrateriales porosos conocidos como -'filtros moleculares". Cuando una mezcla de proteínas fluye a través de una columna que contiene un filtro molecular, las proteinac pequeñas se distribuyen cn Iris espacios entre las partículas y en los espacios internos o poros del soporte. Conforme urja me7.cla de proteínas de diferentes tarnafios fluye al través de la columna, la movilidad de las protefnas pequeflas se retarda en relación con proteínas demasiado grandcs para pasar estos poros. Asi, las proteinas grandcs salen de la columna antes que las menores. E1 perfil de la clución presenta un patrón graduado que va desde las proteinas mas grandes hasta las pequefias. Sin embargo, los filtros rnoleculares tienen capacidad limitada y eil general sOlo se usan después de haber logrado una piirificación previa por otras técnicas.
Los soportes de cromatografía por afinidad sirven para identificar regiones específicas de las enzimas L,a característica sobresaliente de la cromatografia por afinidad es sil capacidad para remover selectivamente de una mezcla proteínica compleja, una protcína particular o un pequeiio número de ellas. La técnica emplea un ligando inmovilizado que interactúai cspecificamente con la enzima cuya purificacilin se desea. Cuando la mezcla proteínica se expone a este ligando inmovilizado, las iinicas proteinas que se unen son las que interactúan fuertemente con él. Por su parte
la proteína indeseada fluye a lo largo de la columna y descarta. La proteina deseada se eluye del Iigando inmovilizado, por lo general con una concentración elevada de sal o de la Coma soluble dcl ligando. Las pusificaciones logradas por las técnicas de cromatngrafia por afinidad son iinpresioriantes. a menudo superando las posibles por la aplicaci~nsucesiba de numerosas técnicas clásicas. Los ligandos favorecidos son derivados dc sustratos y coenzimas adheridos por covalencia a un soporte como Sephadex. en general por niedio de utia mtilécula enla7~dorade 3 a 8 carbonos de longitud Sin embargo, la introducción de Hn "ligando" hidrbfobo complica la scparacihn, al agregar a la cromatrigrafia ese elem~ntohidrdfoha (vCase después), Entre Ins ejemplos de aplicación exitosa de la cromatograt'ía por aiinidad se incluyen la purificación de muchas dcshidrogenasas diferentes sobre soportes dc afinidad de NAD'. Dado que numerosas deshidrogcnasas puedcn fijarse y ser eluidas juntas cuando la columna es tratada con NAD' soluble, el emplco subsiguiente de sustsato (mas que de coenzima) a los soportes afínes o la elución con una "mezcla ternaría abortiva" de un producto y un sustrato han probado tener éxito en muchos casos. 5e
La crornatografía de ligando colorante y ligando hidrófobo son técnicas análogas de cromatografia por afinidad La crornatografia de Iigando colorante en soportes como Sepharose azul, verde o rojo y Ea cromatografia de ligando hidrofobo como octil o fenil-Sepharose son técnicas con relación estrecha con la crornatografía pos afinidad. La primera emplea como ligando inmovilizado a un colorante organice que sirve como análogo del sustrato, coenzima a efecror alostCrico. En general, la elución se logra usando gradientes salinus. En la cromatografía de ligando hidrlifobo, un hidrocarburo alquil o aril se adhiere a un soporte como Sephadex. La retención de proteínas en estos soportes comprende interaccioncc hidrofbbicac entre la cadena alquil y ias regiones hidrófobas de la proteina. Las proteínas se adicionan a soluciones que contienen una concentración alta de una sal (por ejemplo, [NH4]2S04)y se eluyen con gradientes decrecientes de la misma sal.
La tecnología del DNA recombinante puede ser una fuente abundante de enzimas Hasta fechas relativaniente recientes, los únicos materiales iniciales disponibles para preparar enzimas purificadas eran las células de animales, plantas o
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Bioquímica de Harper
bacterias, en Ias cuales se encuentran dichas enzimas. La cantidad existente de una enzima dada en muchos casos era muy pequefía, lo que imponía un límite máximo z la cantidad de enzima purificada que se podía obtener con un costo razonable. Esta situación se ha modificado en gran medida por la tecnología del DNA recombinante, ya que [os genes que codifican muchas enzimas se han donado y secuenciado y pueden colocarse en un vector de expresibn derivado de pllismido o fago, bajo el control de un promotor fuerte. Estos vectores se trasladan al interior de d l u las, ya sea de Escherichia coli, levaduras o de cultivos de mamíferos. En presencia de un inductor apropiado, la maquinaria de síntesis proteinica de la célula huésped se [leva a la shtesis de Ea enzima deseada. La purificación subsecuente se facilita tanto por las cantidades relativamente grandes de la enzima recombinante como por el hecho de que, al provenir de una forma de vida diferente a la del hubsped puede diferir en grado significativo de las propiedades de las proteínas de éste, como serfa Ea estabilidad al calor. Las levaduras varían desde pocos, hasta cientos de miligramos de proteína homogCnea por litro de celdas de Escherichia coli, cantidades adecuadas para los amplios estudios de cristalografía de rayos X y otros anklisis fisicos necesarios para deteminar la estructura tridimensional.
La electroforesis en gel de po!iacrjlamida detecta contarninantec La homogeneidad de las proteínas se valora mejor por electroforesis en gel de poiiacrilamida (EGPA) bajo diversas condiciones. La EGPA unidimensional de la proteina original revelará, si se aplica suficiente muestra, la presencia de contaminantes protelnicos mayores y menores. En la EGPA bidimensional (O'Farrell), la primera dimensibn separa a las proteinas desnaturalizadas con base en sus valores pI, equilibrindolos en un campo eldctrico que contiene urea y se mantiene un gradiente de pH por los anfblitos polimerizados. Entonces, la segunda dimensibn separa a las protefnas, despuds de su tratamiento con SDS, con base en los tamailos moleculares de sus unidades protoméricas.
LAS EN2IMAS PUEDEN ENCONTRARSE EN ORGANELOS ESPEC~FICOS El ordenamiento espacial y la compartimentaiizacibn de enzimas, sustratos y cofactores dentro de las c&lulas son de importancia cardinal. Por ejemplo, en las cklulas hepáticas, las enzimas de la gluc6lisis están localizadas en el citoplasma, en tanto que [as del ciclo del
(Capitulo 8)
hcido cíirico están en las mitocondnas. La distribución de las enzimas entre !3s organelos subcelulares puede estudiarse despues de fraccionar los hornogeneizados de células mediante ultracentrifugación. Entonces, se examina el contenido enzimátiw de cada fraccidn. La localizaci6n de una enzima particular en un tejido o cdlula, en estado relativamente inalterado, se puede lograr frecuentemente por procedimientos histoquimicos (histoenzimologia}. Cortes delgados de tejido congelado (2 a 10 pm)son tratados con un sustrato para una enzima particular. En las regiones donde se encuentra la enzima se forma el producto de la reacción catalizada por ella. Si el producto es colorido e insofuble, permanece en el sitio de formaci6n y sirve como un indice para la localizaci6n de la enzima. La histoenzimologia proporciona una imagen grhfica y relativamente fisiológica de los patrones de distribucibn enzimática.
LAS ISOZIMAS SON FORMAS F~SICAMENTEDISTINTAS CON LA MISMA ACTIVIDAD CATALITICA Cuando se aplicaron las tdcnicas de purificación de enzirnas a la malato dechidrogenasa de diversas fuentes (por ejemplo, hfgado de rata y Escherichia coli), pronto se obsenib que, si bien la malato deshidrogenasa de hlgado de rata y la de E. coli, catalizan la misma reaccidn, sus propiedades físicas y quimicas exhibían numerosas diferencias importantes. Pueden existir formas físicamente distintas con la misma actividad catalitica en diferentes tejidos del mismo organismo, en distintos tipos celulares, en compartimientos subcelulares o en pr-otas como E coli Este descubrimiento fue una consecuencia de aplicar los procedimientos de separacidn electroforktica a la separaci6n de entidades electroforéticamente distintas de una actividad enzimktica particular. Mientras que el ttmino "isozima" (isoenzirna) podría utilizarse para englobar a todos los ejemplos anteriores de formas fisicarnente distintas con una actividad catalftica dada, en la prhctica, en especial en la medicina clínica, la "isozima" tiene un significado más restringido, es decir, las formas distintas y físicamente separables de una enzima dada, presentes en tipos celulares diferentes o en compartimientossubcelulares de un ser humano. Las isozimas son comunes en los sueros y los tejidos de todos los vertebrados, insectos, vegetales y microorganisrnos unicelulares. Tanto la clase como el número de enzima involucradas es igualmente diverso. Se han localimdo isozimas de numerosas deshidrogenasas, oxidasas, tramaminasas, fosfatasas, transfosforilasas y proteasas. Tejidos diferentes pueden contener isozimas distintas y tstas a su vez diferir en su afinidad por los sustratos.
Enzimas . propiedades generoles
La capacidad para separar e identificar isozimas tiene valor diagnóstico El interds mCdico en las isotimas fue estimulado por el descubrimiento de que tos sueros humanos contenían varias isozimas de la lactato deshidrogenasa y quesus proporciones relativascambian significativamente en ciertos estados patol~gicos.Posteriormente, se han descrito numerosos ejemplos adicionales de cambios en las proporciones de isozimas como consecuencia de una enfermedad. Las isozimas de la lactato deshidrogenasa del suero pueden demostrarsesometiendo una muestm de suero a laelectroforesis, usualmente a pH 8.6,usando un gel de almidon, agar o poliacrilamida como soporte. Las isozimas tienen diferentes cargas a este pH y emigran a cinco regiones distintas del electroferograrna. Luego, se localizan por medio de su capacidad para catalizar la reducción de un colorante incoloro a su forma colotida e insoluble. Una mezcla tipica para anhlisis de deshidrogenasa contiene NADA,un sustrato reducido, la forma oxidada de un colorante redox como nitroaml de tetrazolio (NBT, del ingles, litro blue lelrmolrum) intermediario necesario para la transferencia de eIectrones de NADH a NBT, amortiguador e iones activantes segun sea necesario. La figura 8 4 ilustra la aplicacibn de este tipo de anklisis para visualizar y cuantificar isozimas de lactato deshidrogenasa shica (LDH, del inglks, lactnle dehydrogenuse) en el laboratorio clínico. La lactato deshidrogenasa cataliza la transferencia de dos electrones y un ion hidrbgeno del lactato al NAD' (figura 8-1). La reaccibn procede a una velocidad mensurable s61o en presenciade la lactato deshidrogenasa. Cuando la mezcla se rocía sobre el electroferograma y se incuba a 37 "C,tienen lugar las reacciones coordinadas de transferencia de electrones s61o en aquellas regiones donde se encuentra la lactato deshidrogenasa (figura 8 4 ) . Las intensidades relativas de las bandas pueden ser cuantificadas por un foriimetra de barrido (figura 8-7). La isozima mas negativa, se denomina 1
Las isozimas son productos de genes estrechamente relacionados
Las enzimas oiigoméricas con varios protómeros disimiles pueden existir en diversas formas. Con frezuencia, un tejido produce un protornero de manera predominante y otro tejido sintetiza un prothmero diferente. Si es posible que Cstos se combinen de varios modos para construir una enzima activa (por ejemplo, un tetrhmero), se dice que se han formado isozimas de esa actividad enzirnática. Este fenómeno se representa despues mediante una enzima de importancia en el diagnóstico: la deshidrogenasa Ifictica.
(Lactato)
sH2 WCTATO S k D E S H IDROGENASAJ
85
(Pjruvatc)
FMS reducido
~~C'oxidado
NBT oxidado (incoloro)
(azul)
Flgura 8 4 . Reacciones acopladas para la demostración de la actividad de la lactato deshidrogenasa en un etectroferograma. (NBT nttroazuF de tetrazoilo, PMS, metoculfato de fenacina.)
Las isozimas de la laciato dcshidrtigeiiasa difieren en el orden de la estructura cuaternaria. La molécula oligomérica de la lactato deshidrogenasa activa (peso molecular de 130 000) consiste en cuatro protomeros de dos tipos. E-1 y M (peso molecular aproximado de 34 000). Sólo la molécula tetramirica posee actividad catalitica. Si cl urden no e i iinportante, estos prothmeros pueden Fer combinado'; de cinco maneras diferentes como se muestra en seguida:
HHHH HHHM HHMM HMMM MMMM
Market ha usado condiciones que se sabe disgregan y reforman la estructura cuatemaria para esclarecer las relaciones entre las isozimas de la lactato deshidrogenasa i,, o de la lactato deshidrogenasa Is. La separacidn y reconstitución no produce nuevas isozímas las cuales, por tanto, consisten en un solo tipo de protómeso. Cuando una mezcla de lactato deshidrogenasa I l y lactato deshidrogenasa 1s son sujetas al mismo tratamiento, tarnbikn se producen las lactato deshidrogenasas Iz, 1, e 14. Las proporciones aproximadas de las isozimas encontradas son las que resultarian si la relacibn fuera: lsazirna lactato
deshidrogenasa 11 12 13
14
15
Subunidades HHHH HHHM HHMM HMMM
MMMM
86
Bioquimica de Harper
(CapifuJo 81
NORMAL
Figura 8-7. Patrones normal y patolbgioode las isozimas de la laetato deshidrogenasa(LDH) en suero humano. Las isozimas de LDH del suero fueron separadasen acetatode celulosa a pH 8.6 y tenidas en busca d e la presencia d e enzimas. El fotbmetro de rastreo muestra la produccibn de las isozimas El patrbn A es suero de un pauente con infarto del rniocardio, B es suero normat y C de un paciente con enfermedad hsphtica. (Cortesía del Dr. Melvin Black y Mr. Hugh Miller, St Luke's Hospital, San Francisco.)
La sfntesis de subunidades H y M es controlada por distintos Iocr geneticos que estiin expresados de manera diferencial en diversos tejidos, por ejemplo, el coraz6n y el mUsculo esquel&ico. EL ANALISIS CUANTITATIVO DE CIERTAS ENZIMAS PLASMÁTICAS TIENE SIGNIFICADO DIAGNOSTICO Ciertas enzimas, proenzimas y sus sustratos se encuentran siempre en la circulacibn de las personas normales y realizan una funcibn fisiológica en la sangre. Algunas de estas enzimas plasmhticas funcionales son la lipoproteinlipasa, la seudocolinesterasa y las proenzimas de la coagulacibn sanguinea y de la disolución del cohgulo. Generalmente son sintetizadas en el hlgado, pero tarnbikn se encuentran en la sangre a concentraciones equivalentes o mayores que en los tejidos. Como lo dice su nombre, las enzimas plasmáticas no funcionales no desempeiian ninguna funcibn conocida en la sangre. Los sustratos de ellas con frecuencia faltan en el plasma y las propias enzimas se encuentran en la sangre de personas normales en
valores hasta de un mil1611 de veces inferiores a los de los tejidos. Su presencia en el plasma en cifras mayores que tos valores normales sugiere una velocidad aumentada de destruccibn tisular. Por tanto, la medicion de estos valores de enzimas plasmhticas no funcionales puede constituir para el médico una prueba valiosa de diagnóstico y pronóstico clínico. Las enzimas plasrnhcicas no funcionafes comprenden a las que existen en las secreciones exocrinac v a las enzimas intracelulares verdaderas. Las enzimas exocrinas, amilasa pancsektica, lipasa, fosfatasa biliar alcalina y fosfazasa ácida prostática, difunden en forma pasiva al plasma. Las enzimas intracelu lares verdaderas estiin normalmente ausentes de Ea circulacion.
La destrucción normal de c&lulas conduce a la presencia en plasma de concentraciones bajas de enzimas no funcionaIes Los valores bajos de enzima no funcionales que se encuentran por lo general en el plasma, aparentemente proceden de la desmiccibn rutinaria normal de los eritrocitos, leucocitos y otras cdlulas. Con la muerte acelerada de las c~lulas,las enzimas solubles entran
Enzimas. propiedades generales
en la circulación. Aunque los valores elevados de enzirnas plasmiiticas se interpretan generalmente como prueba de necrosis celular, el ejercicio intenso tambikn libera cantidades importantes de enzimas musculares.
Las enzimas plasmáticas no funcionales ayudan en el diagnóstico y pronóstico Por mucho tiempo, la práctica profesional médica ha usada la cuantificacibn de ciertas enzimas plasmaticas no funcionales. Esta valiosa inforrnacidn para el diagnóstico y el pronóstico se obtiene muchas veces con equipos totalmente automáticos. El cuadro 8-3 contiene una lista de lar enzimas principales utilizadas en el campo de la enzimologla para diagnóstico. En el Apendice se incluye la escala de valores normales de las principales enzimas usadas con propositos de diagnostico.
Cuadra 8-3. Principales enzimas séricas utitizadas en el diagnóstico clinico. Muchas de kstas no son cas para la enferm ncionada
-
-.
A
I Usa
Enzinna sérica
,-.-A-
--
uiirriuiriicu uriiiciuaI
A,minotrans!ferasas
Aspartat o aminoti ,* rerasa (rtST o SGOTI Alanina aminotr ferasa (A LT o SGR
."...
.,,.
-,,,,,-M
1 Infariu uei ~ n i u
. ....
-,
:reat~tisaguda
--
hepatote n-
'eruloplasniina
ticu
:rrnedad Ij c
-
-"
Creatinacine
stornos m usculares e infarto del mi0cardio
F
Carcinoma rnr la prhstata
iíio
de
-
Eosfatasa alcalina (isozi- Varias enfermedades bseas, tras'tornos he1 1smas) -
trucitivos
y-Glutamil t k m 1 3 p ~ C l ~1 ,Varias ~ ~ a entermcdades
L actato d e . . (isozirnas)
nasa Infarto del miocardio
--
--
Lipasa
-
he-
Pancreatitis aguda
--
* 87
LAS ENDONUCLEASAS RESTRICTIVAS FACILITAN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS El diagnbstico de las enfermedades genéticas ha recibido un impulso tremendo con la tecnología del DNA recombinante. Aunque desde hace tiempo se sabe que todas las enfermedades moleculares son consecuencia de una alteracibn del DNA, las técnicas para el examen directo de las secuencias del DNA s610 se han desarrollado en épocas recientes. El desarrollo de pruebas de hibridización para fragmentos de DNA ha conducido a técnicas de sensibilidad suficiente para investigar, desde antes del nacimiento, los trastornos hereditarios p r mapeo de enzirnasde mtricci6n det DN A derivado de las cklulas fetales en el líquido amnibtico. Las pruebas para el DNA pueden, en principio, ser preparadas para el diagnástico de la mayoría de las enfermedades gendticas. Por ejemplo, para la detección prenatal de talasemias (que se caracterizan por un defecto en la sintesis de las subunidades de la hemoglobina; capitulo 7), una prueba preparada contra una porcidn del gen para una subunidad de una hemoglcbina normal puede detectar un fmgmento de rwtnccibn acortado o inexistente, el cual proviene de unasupresidn en ese gen, como sucede en atgunas alfa talasemias y en ciertos tipos poco frecuentes de beta y beta, delta talasemias. De manera alternativa, se ha preparado un detector o probador de cDNA sintktico que se hibridiza a la secuencia de una beta-globina que contiene una rnutacidn sin sentido, presente en ciertas beta-talasemias, pero no en el gen normal de la beta-globina. La ausencia del inhibidor de la proteasa plasmática alfa,-antilipsina se ha relacionado con el enfisema y con la cirrosis hephtica infantil. La presencia de una alfa,-antitripsina inactiva se ha identificado por un probador construido contra el alelo inactivo que contiene una mutacián en un punto en el gen para la alfai-antitripsina. Los detectores de hibridizacidn tambitn pueden utilizarse para averiguar alteraciones genkticas que conducen a la pdrdida del sitio de una endonueleasa de restriccibn (capitulo 42). Por ejemplo, la mutación en un punto del coddn Glu (GAG) al codbn Y al (GTG) tipica de la enfermedad de c6lulas falcifonnes puede detectarse en el gen de la beta-globina en las células contenidas en cantidades tan pequeiías de hasta 10 mL de liquido amniótico usando la endonucleasa de restriccion MstII o SauI.
LA DIGESTIQN RESTRICTIVA DE PROBADORES PUEDE REVELAR GENES H O M ~ L O G O SCON DIFERENTES SECUENCIAS DE BASES Los detectores de DNA tambibn pueden usarse para encontrar secuencias de DN A íntimamente enlazadas
al gen que interesa, pero en realidad no dentro de 4. Los análisis pueden extenderse a la identificacibn de variaciones específicas de cromosomas (diferencias en la secuencia entre cromosomas hom6logos). La digestión del DNA con una endonucleasa de restricci6n genera diferentes mapas (patrones de fragmentos de DNA) de genes hornúlogos que contienen secuencias diferentes de bases. Este fenómeno se denomina "polilimorfismo d e la Longitud del fragmento de restriccibn" (PLFR). En una enfermedad genética ligada a un polimorfismo de la longitud de restriccibn, el portador de la enfermedad poseerá un cromosoma con un gen n o m a l y uno con un gen defectuoso. Cuando los fragmentos de restriccibn se analizan y sondean, se detectan dos bandas de hibndizacibn (que es distinto a una sola banda cuando ambos genes son idénticos). Los descendientes que heredan el cromosoma portador del defecto exhiben una sola banda de hibridizacibn que difiere de la producida por cromosornas normales. El fenbmeno de PLFR relacionado se ha aplicado al anhlisis de rasgo de las cdlulas falcifomes (bastsándose en un PLFR I-lpal relacionado) y de la beta-talasemia (ligada a un PLFR HindIII y BamHII. Se h a desarrollado una exploracibn basada en los PLFR para identificar la fenilcetonuria infantil (capítulo 32): Sin embargo, debe notarse que este enfbque general no es infalible, puesto que el PLFR no causa la enfermedad sino que simplemente se localiza cerca del gen defectuoso. Al parecer, la importancia firtura del PLFR radica en que es punto de partida para la identificacion del gen de las enfemidades relacionadas. Este enfoque que se ha empleado recientemente en la búsqueda de los fenómenos mutacionales que intervienen en la formación de los retinoblastomas y la enfermedad de Huntington. En el capitulo 42 se encuentran más ejemplos de los usos de las enzimas de restriccibn para diagnóstico.
RNA CATALITICOS Aunque es evidente que no son proteinas, ciertos ácidos ribonucleicos (RNA) presentan actividad catalitica altamente específica de sustrato. Estos RNA, que cumplen con todos los criterios clhsicos de la definicibn de enzirnas, se conocen como ribozimas. Aunque los sitios de accibn de las ribozimas se limitan a los enlaces fosfodiésteres de RNA, la especificidad de su acci6n se compara plenamente con la de las enzimas clksicas. Las ribozimas catalizan la trunsesterificacibn y, en iiltirna instancia, la hidrólisis, de los enlaces fosfodidcttres en moléculas de RNA. Estas reacciones son facilitadas por grupos libres --OH, por ejemplo, en residuos de guanosil. Las ribozimas inter-
vienen de manera clave en procesos de separacidn de intrones esenciales para la conversián de premRNA a m RNA maduro (capítulo 39).
RESUMEN Las enzimas son catalizadores protelnicos que regulan la velocidad a la cual se realizan los procesos fisiolbgicos. En consecuencia, las deficiencias en la función enzim htica con frecuencia causan patología. Las enzimas que catalizan reacciones que comprenden trasferencia de grupo, isomerimción, oxidomducción o sintesis de enlaces covalentes necesitan un cosustrato conocido como coenzima. Dado que numerosas coenzimas son derivados de la vitamina B, las deficiencias vitamínicas pueden afectar de modo adverso la funci6n enzimiitica y, por ende, la homeostasia. Varias coenzimas también contienen e[ nudebtido AMP. La mayoría de las enzimas tienen especificidad elevada por sus sustratos, coenzirnas y tipo de reaccion catalizada. Sin embargo, algunas proteasas tambiéri escinden esteres. Las enzimas que actúan sobre sustratos de peso molecular bajo, tambikn pueden reacciona. con análogos de sustratos, pero en general a velocidades bajas. La medicihn de la actividad enzimática es fundamental pam la cuantificacián de enzimas en investigacibn o en e3 laboratorio clínico. La actividad de deshidrogenasas dependientes de NAD(P)' s e analiza en espectrofotrimetro a través de la medición del cambio en la absorcion a 340 nrn que acompafla a la oxidacibn o reducción de NAD(P)+/NAD(P)H. Acoplar otras enzimas a las deshidrogenasas puede facilitar su análisis. En la investigacidn de su estructura, mecanismo de accián y regulacibn de su actividad, las enzimas deben purificarse a una homogeneidad mayor de 95 por ciento. Las tdcnicac para purificar enzimas incluyen precipitación selectiva por sales o solventes orgánicos y cromatografía en soportes de intercambio idnico, fi ttracibn en gel, afinidad por sustrato o interaccibn ligando colorante o ligando hidrbfobo, La capacidad para explotar tdcnicas de QNA secombinante en la expresión de enzimas en hutspedes utiles ha revolucionado la puriftcacibn de enzimas al proporcionar cantidades grandes de enzimas que en la mayorÍa de tos casos ya pueden purificarse hasta la homogeneidad. El progreso de una purificación se valora con la medición del incremento en la actividad especifica de la enzima (actividad por unidad de masa) y su homogeneidad final mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA). La localizacibn intracelular precisa de enzimas se infiere por medio de tbcnicas de histoquimica y fraccionamiento celular acopladas con análisis enzimático de cortes de tejido o de fracciones de hornogeneizados celulares. En todas las formas de vida y tejidos existen isozimas, que son formas fisi-
Enzrmas: propiedades generales
misma actividad catatítica. Patrones distintivos de isozimas de enzimas skricas no funcionales revelan daíio de tejidos humanos específicos y proporcionan informacibn valiosa para el diagnóstico y el pronostico. Por Ultimo, la propiedad de las endonucleasas restrictivas para detectar cambios sutiles en la estructura de los gcnes permite al médico el diagnhstico de enfermedades genkticas donde las mucamente distintas con la
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taciones conducen a sintesis de enzimas defectuosas o no funcionales. Aunque casi todas las enzirnas son proteínas, se conocen RNA catalíticos, como las ribozimas que catalizan de manera muy especifica la hidrolisis de enlaces fosfodiéster en el RNA. Estas reacciones son importantes en fenómenos de procesamiento que incluyen la maduración de pre-mRNA.
REFERENCIAS Advunces in Enzymolop. lssued annually. Acadcmic Press Aitken A: IdentiJcactron ofllrotein Lonsensus Sequelnces Active Site ,Wot!f~,Phospho~ialion,and Orher Posttramlatzonal .WodiJcatrons. Honuood, 1990. Bergmeyer H, Bergmeyer J, Grass M: Me,hocCF of Env m i c Analysis, Vol X I , Anta~ensanddntibodies. VCH
Puhlishers, 1986. Fersht A: Enzyme Srrucrure and Mechanism. 2nd ed. Frccman. 1985.
Freifelder D: Physical B~ochem~stv. Applicatiom lo Biochemi.~ty and MolecuIar Bioiom. Freeman. 1982
Kaiser T, Lamente DS,b k i t a SE The chernical modi Ii&m ofenzyme spo~ificity.Annu Rev Riochem 1985;54:597. .Wetkod.~in E y m n l n m . Over 130 volurnes, 1955-present Acadcrnic Press Naqui A: Where are the asymptotes of Michaelis-Menten? Trends 13iochem Sci 1986;1 1 54. Scapes R: Protern Purr$cation Principlcs nnd Praciice Springer-Verlag, 19R2. Suckling CJ: Eníymt Chemistry. Chaprnan & Hall, 1990. Tijssen P: Practice and Theoty of E w m e Immunoassays. Elsevier. 1985.
Uhlenbeck OC: Catalytic RNAs. Curr Gpinon Structural Biol 1991;1:459
Vicfor W Rodwell, PhD
Muchas caracterisiicas de la cinetica enzirnática provienen, por lógica, de conceptos propios de la cinbtica de reacciones químicas no catalizadas. Por tanto, este capitulo describe primero aspectos de la teoría de la velocidad de reaccidn, válidos para reacciones químicas en general y luego considera los factores exclusivos para reacciones cata1izadas por enzimas.
Todos los factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas (concentración de enzima y de sustrato, temperatura, pH y presencia de inhibidores) tienen interés en clínica. EI principio biológico principal del estado homeostático de buena salud requiere que la composición del medio interno corporal se conserve dentro de limites relativamente estrechos. Por tanto, la buena salud exige no sólo que se produzcan cientos de reacciones catalizadas por enzimas, sino que procedan a velocidades apropiadas. No lograrlo perturba el equilibrio horntostatíco de los tejidos, con profundas consecuencias potenciales. El medico debe comprender el modo en que el pH, la concentraci6n de enzimas y de sustrato así como los inhibidores influyen en las velocidades de esas reacciones. Algunos ejemplos escogidos ejemplifican sobre este puitto. La velocidad de ciertas reacciones catalizadas por enzirnas responde a las desviaciones sutiles del pH intracelular que caracterizan a la acidosis o alcalosis metabdlica. Además, dado que esta velocidad se eleva o baja en respuesta a las fluctuaciones correspondientes en temperatura, la fiebre y la hipotermia perturban
la homeostasia al modificar la velocidad de numerosas reacciones catalizadas por enzirnas. Sin embargo, eszos cambios mínimos pueden convertirse en ventaja para el mtdico. Por ejemplo, la disminucibn en la actividad de todas las enzimas que tiene lugar a temperatura corporal baja (hipotermia), puede explotarse para reducir la demanda rnetabolica global durante cirugia a coraz6n abierto o en el transporte de órganos para trasplante quirúrgico. Por su parte, la toxicologia y la farmacología aprovechan eI conocimiento de los factores que modifican la velocidad de reacciones enzimiticas. Los venenos metabiilicos como los mercuriales, el curare y los gases nerviosos ejercen su toxicidad mediante la inhibicibn de enzimas y en consecuencia toman lentas o anulan reaccionasmetaMlicas esenciales. Por ultimo, numerosos fármacos importantes en terapéutica actúan por reduccjon de las velocidades de reacciones metabblicas al competir con el sustrato natural por una enzima clave. A menudo estos medicamentos tienen una estructura anhloga a la del sustrato natural. Ejemplos son la lovastatina y la zidovudina (AZT), famacos usados para tratar la hipercolesterolemia y el SlDA, respectivamente. Ambos tienen efectos teraptuticos mediante la alteracion de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
LAS REACCIONES PROCEDEN A TRAVÉS DE ESTADOS DE TRANSICIÓN El concepto de estados de transicidn es fundamental para la comprensibn de las catfilisis de cualquier tipo, incluyendo la enzirnhtica. Por ejemplo, considkrese unareacción de desplazamiento donde un grupo L que
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Bioqrcím ica de IJarpw
se desprende, adherido en uii principio a R, es desplazado por la entrada del grupo E: E + R-L
=
E-R+
L
En realidad este desplazamiento pasa por un estado de transicion, E- R.. L, cuya íormacibn y desintegración subsiguiente puede representarse con dos ''reacciones parciales". cada una con un cambio caracteristico en la energia libre: E + R-L E..R*.L
= E. .R. . L = E-R+ L
AGF
reaccionar; y 2) para cada reaccion química. hay una barrera energetica que debe superarse para que la reacción tenga lugar. Para que una colisibn termine en una reacción, las moléculas reactantes deben poseer energia suficiente para sobrepasar esta barrera energhtica. Por tanto, cualquier cosa que: a) eleve la energía cinética de las nioléculas reactantes, b) abata la barrera energktica para la reacción o c) incrernente la frecuencia de colisión, deberá aumentar la velocidad de reacción.
Temperatura
Gn
AGF y AGD son 10s cambios de energia libre que se producen en la formación y dcsintegracibn del estado de transicibn, respectivamente. EZ AG, cambio de energía libre relacionado con la reacción global, es igual a la suma de las energías libres de Ea Iormacibn y degradación del estado de transicihn:
De la misma manera que en cualquier ecuación con dos tCrminos, no es posible inferir el signo o magnitud de AGF y AGn por observación del signo algcbraico y magnitud de AG. De otro modo, es iniposible, a partir de la concideracihn del cambio de energia libre en la reaccihn global, AG, inferir dato alguno respecto a los cambios de la energia libre relacionados con la f o m a ción y degradación de los estados de transición, Dado que la catalisis se relaciona de manera intima con AGF y AGn, se deduce que la termodinamica de la reacción global (AG) no puede proporcionar indicios del camino que una reacción sigue [es decir. su mecanismo). Esta es tarea de la cinética. Reacciones m i s complejas involucran varios y sucesivos estados de transición y proceden a travhs de una seric de reacciones parciales, cada una con un cambio de energia libre. Es importante observar que el cambio de energia libre para la reacción global, AG, es independiente del número de estados de transición. Esto se deriva del hecho de que AG es la suma algebraica de los cambios de energía libre para cada reacción parcial participante.
Elevar la temperatura incrementa el número de moléculas que pueden reaccionar, ya que aumenta la energia cincrica e incrementa la frecuencia de las colisioncs. Como se muestra en la figura 9-1, el numero de mol&culas cuya energia cindtica excede la barrera energktíca para la reaccion (barra vertical) aumenta cuando la temperatura sube desde un valor bajo (A) a travds de uno intermedio (B) a uno alto (C). Adernhs, cualquier elevación de temperatura, acelera el movimiento molecular y, por ende, la frecuencia de colisión. Los dos factores contribuyen al incremento en la velocidad de reacción que acompafia a un aumento dc temperatura. Sin embargo, este incremento de la velocidad de reacción no continua de manera indefinida, dado que finalmente se alcanza una temperatura a la cual las mol6culas reactantes ya no son estables. Esta temperatura limitante tiende a ser en extremo elevada para reactantes inorghtcos, modwadamente alta para gran parte de las rnolkculas orgánicas, pero bastante menor de 100 "C para la mayoría de las reacciones de interés biolbgico.
Concentración de reactantes A concentraciones elevadas de reactantes, tanto la cantidad de mol&culas con energia suficiente para reaccionar como su frecuencia de colisión son altas. Esto es verdad, ya sea que todas o s61o una fraccion de las mol&culasposean energia suficiente para reac-
Barrera de energia
NUMEROSOS FACTORES MODIFICAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN La teoria cinética o de colisión de la cindticaquimica, incorpora dos conceptos claves: 1) s61o las maltculas que chocan; es decir, que se acercan una de otra a distancias suficientes para formar enlaces, pueden
Figuta 3-1. Barrera energética para las reaeeiones químicas
cionar. Considtsrense reacciones que comprendan dos moléculas diferentes, A y R:
la expresidn apropiada de la velocidad es: Velocidad a [AnBd
La reversibilidad se presenta por flechas dobles: Duplicar la concentración de A o de 13 elevará la velocidad de reacción al doble, Dupticar la concentración de ambas. A y B, incrementarh cuatro veces la probabilidad de colision. Por tanto, la velocidad pe reacción aumenta al cuádruple. I,a velocidad de reaccihn es proporcional a las concentraciones de las moléculas reactantes. Los corchetes denotan concentraciones molaresk* cr sigriifica "proporcional a". La expresihn de la velocidad es:
Esta expresión se lee: "ri moléculas de A y m moléculas de B están en equilibrio con A,B,,". El signo "proporcional a" (E) puede reemplazarse con un signo de igualdad mediante la inserción de una constante de proporcionalidad, k, característica de la reacci6n en estudio. Para el caso general
Velocidad E [rnolbculas reactantes]
o Velocidad s: [A] [B]
las expresiones para las velocidades de reacción hacia la derecha (velocidad I ) y la izquierda (velocidad -I) son:
Para la situaciiin representada por:
la expresihn de la velocidad es: Velocldad m [A][B][B]
Cuando las velocidades de las reacciones hacia la derecha e iquierda son iguales, se dice que el sistema esta en equilibrio, es decir,
o Velocidad or [A][B]~
luego Para el caso general donde n moléculas de A reaccionen con m rnoldculas de B:
la expresibn de la velocidad es: Velocldad a [Aln[BIm
K,, es una proporción de constantes de velocidad Dado que todas las reacciones qulmicas son reversibles, para la reacci6n inversa donde A,B, forman n moléculas de A y m moléculas de B:
* Hablando de manera estricta, en lugar de concentraciones debería decirse actividades molares.
ki[AIn[B]"' = k-~[AnBrn]
Y
La proporción de ki a kise conoce como la constante de equilibrio, TG,. Deberh tenerse en mente las siguientes propiedades importantes de un sistema en equilibrio. 1) La constante de equilibrio es la proporción de las constantes de la velocidad de reacción, kik-1. 2) En el equilibrio, las velocidades (no las constantes de la velocidad} de las reacciones hacia la derecha y hacia Ia izquierda con iguales. 3) El equilibrio es un estado dinámico. Aunque en el equilibrio no existe un cambio neto en la concentracion de nioléculas reactantes o productos, A y B se están convirtiendo de manera continua a AnRm y viceversa. 4) La constante de equilibrio puede tener un valor numérico si se conocen las concentraciones de A, B y AnBm en el equilibrio.
94 a Bioauimica de Hur~er
AGO puede calcularse a parkir de K,, La constante de equilibrio se relaciona con AG' de la siguiente manera:
R es la constante de los gases y T, la temperatura absoluta. Dado que estas se conocen, el conocimiento del valor numérico de K, permite el chlculo del valor para AGa. Si la constante de equilibrio es > 1, la reacción es espontánea; es decir, se favorece la reacci6n según se ha escrito (de izquierda a derecha). Si es < 1, tiene lugar lo contrario; es decir, es mas probable que la reacción proceda de derecha a izquierda. Sin embargo, nbtese que aunque la constante de equilibrio para una reacci6n indica la direccidn a la cual una seaccibn es espontánea, no indica si tendra lugar con rapidez. Esto es, no informa acerca de la magnitud de la barrera energttica para la reacci6n (es decir, AGF, vkase antes). Esto se debe a que K, determina a AGO, que previamente se demostrb concierne sólo a los estados inicial y final. Las velocidades de reacción dependen de l a magnitud de la barrera energética, no de la magnitud de AGO. La mayoríade los factores que afectan la velocidad
de las reacciones catalizadas por enzirnas lo hacen mediante el cambio de la concentraci6n local de reactantes.
enzimas disminuyen la barrera energéticaen una reaccibn. En consecuencia, una proporcibn mayor de moléculas de sustrato son capaces de reaccionar. Sin embargo, nbtese que si bien las enzimas afectan a AGr;, no modifican a AG. La AGn de la reacci6n global es igual estt catalizada o no por enzimas. Debido a que la constante de equilibrio para una reacción química es una funcibn del cambio de energia libre estandar para una reacciiin
se deduce que en las enzimas y otros catalizadores no tienen efecto sobre la constante de equilibrio para una reaccibn.
Las enzimas catalisan la formación o rotura de enlaces covalentes Para la reacci6n de transferencia de grupo:
un grupo, el G, es transferido de un donador, D 4 , a un aceptor, A. La reacción global comprende tanto la rotura del enlace D-G como la forrnacidn de un nuevo enlace A-G. Las reacciones de transferencia de grupo, catalizadas por enzimas, pueden representarse de la siguiente manera:
Esto enfatiza tres características importantes de las reacciones de transferencia de grupo, caializadas por enzirnas:
Las enzimas proporcionan estados de transición alteinoc Igual que en toda catálisis verdadera, las enzimas se recuperan sin cambio después que la reaccibn termina. No obstante, durante el proceso, las enzimas participan de manera directa en la formación de estados de transición. De manera tipica, los estados de transicibn enzima-sustrato estan en niveles energeticos significativamente menores que los estados de transici6n cuando la misma reaccibn procede en ausencia de catalisis enzimhtica. Por tanto, un factor importante que contribuye a la capacidad de una enzima para acelerar la velocidad de una reacci6n dada es que el AGFpara formar un estado de transicidn enzima-sustrato sea bastante menor que el AGF para la reaccibn no catalizada correspondiente. De otra manera, Ias
1) Cada reaccibn parcial comprende tanto la rotura como 3a formacibn de un enlace covalente. 2) La enzima es un reactante coeguivalente con D-G y con A. 3) Si bien en la reaccidn global la enzima actiia de manera catalitica (es decir, se requiere 5610 en oligocantidades y puede recuperarse sin cambio cuando lareaccibn ha terminado), para cada reaccidn parcial, la enzima es un reactante estequiomktrico (esto es, se requiere en proporcibn molar 1: 1 con los demhs reactantes). Numerosas reacciones bioquímicas adicionales pueden considerarse casos especiaks de la transferencia de grupo en la cual D, A o ambas pueden estar ausentes. Por ejemplo, reacciones de isomerización (como la interconversión de glucosa 6-fosfato y glu-
Enzimus: cinética
cosa 1-fosfato) podrían presentarse como reacciones en las cuales tanto D como A estan ausentes:
en términos de la constante de disociacibn, &, para el complejo R-C o la constante de equilibrio para la reacción: R-C
Los complejos EnzS participan en la catálisis Las representaciones anteriores todavia no son suficientes para enfatizar otra característica fundamental de las reacciones catalizadas por enzimas, la participacibn en la reacción global de dos o más fonnas intermediarias del complejo EnzS y la participación consecuente de u11 canjunto de varias reacciones parciales secuenciales. Una representación de una reacción de transferencia de grupo que enfatiza estas características podria ser:
9j
R*C
Así, un valor bajo para Kd representa un complejo R - C fuerte. Una consecuencia importante es que cuando un reactivo se une a un catalizador, éste aumenta la concentracion del reactante en un Area localizada de la solución, por arriba de su concentracion en soluci6n libre. De este modo, ya no m m o s con una soluci6n quimica homogbnea, sino heterogknea. Si el catalizador para una reacción bimolecular (dos reactantes) se une a ambos, laconcentracibn local de cada uno aumenta en razún de un factor que depende de su afinidad individual (valor &) por el catalizador. Puesto que la velocidad de la reaccibn biomolecular global
es, como se ve, proporcional a la concentracibn de ambos, A y B, la fijación de los dos A y l3 por e! catalizador puede conducir a un incremento enorme (varias miles de veces) en la velocidad de la reacción
en la cual EnzG, EnzG* y EnzG* * representan sucesivamente los complejos EnzS formados durante la reaccion global.
global.
Las enzirnas incrementan la proximidad del reactivo y la concentración local
LA CATALISIS SE PRODUCE EN EL SITIO ACTIVO
Para que cualquiera de las reacciones anteriores tenga lugar, todos los reactantes deben encontrarse, uno del otro, a una distancia que posibilite la formacidn de enlaces (o su rotura). Para una solucibn quinrica homogenea, en ausencia de catalizadores, la concenación de las mol~culasreactantes es constante en toda la solución. Estacondición yano se cumple despuks de introducir un catalizador. Los catalizadores tienen sus propios dominios de superficie para unirse a las moIdculas reactantes. Aunque este enlace es un procese reversible, la constante global de equilibrio para la unión favorece fuertemente las formas enlazadas miis que las libres de mol6culas reactantes. De manera cualitativa, esto podria representarse asl:
Una propiedad esencial de las enzimas es su capacidad para fijar los reactantes la cual se acompafia de incremento en la soncenmación local de estos y, por ende, en la velocidad de la reaccihn. Las enzirnas son catalizadores extremadamente eficaces y muy selectivos. Para comprender estas propiedades distintivas de las enzimas, se ha introducido el concepto de sitio "activo" o "catalitico"*. El gran tamafío de las proteínas en relación con los sustratos condujo al concepto de que una region restringida de la enzima, el "sitio activo", se ocupaba de la catálisis. Inicialmente, era extremadamente enig-
Reactante + catarizador complejo reactante-catalizador
* Aunque en muchos textos se establece una equivalencia
Cuantitativamente, se podría expresar la fortaleza de la relación entre un reactante, R, y un catalizador, C,
entre los sitios activos y los catalíticos de las enzimas, hay
sobre éstas, otros sitios "activos" que se relacionan con la regulación de la actividad enzimática m& que con la enzimologIa intermediaria del proceso cataIítico.
matico para los bioquimicos el porqug las enzimas cran tan grandes ciiando s6Io una porción de su estmctura parecía requerirse para unirse con el sustrato y para la catAlisis. Hoy en día, se reconoce que una porcion mucho mayor de la proteina actua reciprocamente con el sustrato que la que se suponia antes. Cuando aparece también la necesidad de sitios alostdricos de igual ramaiio ya no debe sorprender e! tamafio de las enzimas.
El modelo de un sitio catalitico rígido explica muchas de las propiedades de las enzirnas El modelo de un sitio catalitico, propuesto por Emil Fischer, represenro la accion reciproca del sustrato y la enzima en tkrminos de la analogia de una "cerradura y Ilave". Este modelo dc cerradura y Ilave o modelo de plantilla rigida (figura 9-2), todavía es útil para entender ciertas propiedades de las enzimas, por ejemplo, la unión ordenada de dos o más sustratos (figura 9-3) o la cin6tica dc una curva de saturación del sustraio simple.
Los sustratos inducen un cambio de conformación en la enzima 1Jna caractcristica desafortunada del modelo de Ficher es que implica rigidez del sitio catalitico. Un modelo mis geneml es el del "ajiiste inducido" de Koshland, el cual ha recibido un considerable apoyo experimental. En elmodelo de Fischer se presume que el sitio catalitico esta prefigurado para adaptarse al sustrato. En el modelo de ajuste inducido, el sustrato induce un cambio en la conformación de la enzima. Esto aIlnea los residuos de aminoácidos y otros grupos de la enzima en ia orientación espacial correcta para la combinacion del sustrato, la cathlisis o ambas. En el ejemplo (figura 9 4 ) , los grupos hidrófobos [porción rayada) y los grupos cargados (área punteada) se encuentran implicados en la combinacibn del sustrato. Una fosfoserina (-P) y el -SH de un residuo de cisteina intervienen en la catálisis. Otros residuos, no implicados en proceso alguno, están representados
Figura 9-2. Reprecentacidn de la fomacibn de un complejo EnzS de acuerdo con la hipdtesis de la plantilla de Fischer
Figura 9-3. Representacibn de la absorcibn sucesiva de una uienzima (CoE) y de dos sustratos ($1 y $2) sobre una encima en término de la hipbtesis de la plantilla. Se supone que la coenzima porta un grupo esencial que se une al primer sustrato [Si), el cual a su vez es necesarbo para unir a S2
por los de lisina y metionina. En ausencia de sustrato. el grupo catalitlcci y el fijador de sustrato estíh separados por varios enlaces. Ida aproximación del sustrato induce un cambio en la conformacibn dc la proteína enzimatica, alineando los grupos correctamesite par.1 combinarse con el sustrato y para la catálisis. A1 mismo tiempo, las orientaciones espaciales de otras regiones tambikn están alteradas -la lisina y la metionina están ahora más juntas (tigura 9 4 ) . Los anhlogos del sustrato pueden causar algunos, pero no todos, los cambios en la confomacibn correctos (figura 9-5). Al adherirse el verdadero sustrato (A), todos los grupos (representados como circulos negros en todas las ilustraciones) son alineados correctamente. La adherencia de un análogo del sustrato que es demasiado "voluminoso'' (figura 9-5 B) o demasiado "delgadc" (figura 9-5C) induce una alineación incorrecta. Una caracteristica final es el sitio mostrado como una pequefia muesca a 12 derecha de la enzima. Tal vez se pueda imaginar una molécula reguladora uniéndose en este punto y "bajando" uno de los braz.0~ polipeptídicos que portan un grupo catat itico. Entonces puede producirse la uni6n del sustrato, pero no la catalisis. Como se puede observar en el modelo de ajuste inducido, los residuos qtie comprenden el sitio catalitico, pueder! estar niuy distantes entre si en la estructura primaria, pero especialmente cercanos cuando se considera la estructura tridimensional (terciaria).
Figura 9 4 . Representacibn bidimensional de un ajuste inducido por un cambio de conformación en la estructura de la proteina Obsérvenselas pastciones relativasde los residuos clave antes y despues de la unibn del custrato
cadena polipéptida de 129 residuos y tiene una profunda hendidura central que alberga un sitio catalitico con seis subsitios (figura 9 4 ) los cuares enla;ían
varios susrratos. Los residuos que originan la rotura del enlace se encuentran entre los sitios D y E, cerca de los grupos carhoxiIo de Asp 52 y Glu 35. Al parecer, Enz + S EnzS este último cede prolones al enIace acethlico de1 srisA B C @ato,en tanto que Asp 52 Con carga negativa estabiliza el ion c a r b ~ ndesde el lado posterior. El sitio catalItico de la ribonucleasa también Figura 9 4 . Representación de cambios de c~nformacibn~en la protelna enrimatica cuando ocurre la unión can el sustrato radica dentro de una hendidura semejante a la anterior, a (A) a análogos inactivos del sustrato (B) y (C). (Según través de la cual se encuenmn His 12 e FIis 1 19, residuos Koshland.) que, segiin la evidencia química, soii el sitio catalitico.
Muchos residuos arninoacilo participan en el sitio activo ¿Qué partes de una enzima conforman y participan eii su sitio activo? EI sentido de esta pregunta se entiende mejor mediante el examen de las estructuras tridimensionales de un complejo terciario (tres componentes) formado por unaenzima y dos sustratos. Sin embargo, incluso en el estado de cristales, si estan presentes todos los siistratos se producira la catAlisis, lo cual complica Ia interpretacihn de los datos. Por tamo, se ha dei.,ostrado que es iitil el examen de la estructura de los denoiniiiados complqjoc terciarios abortivos compuestos de un sustrato y uti producto, o de complejos enzima-sustrato anhlogos al inhibidor. Estos complejos, que no pueden pasarse por alto, propercionan una estrecha aproximacibn al sitio activo durante el paso inicial de erilace con el sustrato en la c a t á l ~ s i s .Estos estudios muestran que muchos residuos aminoacilo esthn en contacto con sustratos o coenzimas unidos y, por tanto, constituyen parte del sitio activo. El tamaiio amplio y 61 carhcter tridimensional de los sitios activos determinan su visualizacibn 6ptima en las pantallas de computadoras mediante programas que permiten girar la estructura en todas las direcciones, verlas en tres dimensiones y acercar las partes que interesan. Las limitaciones de la hoja impresa tan solo permiten una representacibn iinperfecta de los sitios activos. Sin embargo, se pueden establecer algunas generalizaciones.
Los sitios activos a menudo se localizan en hendiduras
Los sitios activos de enzimas multiméricas pueden encontrarse en subunidades de interface Para ciertas enzimas que contienen multiples polipkptidos o subunidades, el sitio activo se encuentra en la interfase entre estas. Los residuos aminoacilo de ambos sustratos contribuycn al sitio activo, al servir para enlazar sustratos o para funcionar en la cathlisis. Uno de estos ejemplos es la enzima HMG-COA reductasa, que es la enziina limitante de la velocidad de colesterologenesis (figura 9-7).
Los residuos cataliticoc se conservan mucho Ciertos arninoacidos, cn particular la cisteína y otros aminolicidos hidroxllicos, Cicídos o bhsicos tienen funciones claves en la catllisis. Estos residuos sirven como nucle6fi los, como catalimdores generales bhicos
Tri 63
'
Asn 46
Ser 36
h F,
Para las enzimas que consisten en una subunidad cnica, el sitio activo amenudo radica en una hendidura de la enzima. Un ejemplo es la lisozima, enzima presente en las lágrimas y en el moco nasal, la cual lisa las paredes celulares de muchas bacterias grarnpositivas trasmitidas por el aire. Está constituida por una soIa
Arg114
Figura 9-6. Representacibn'bidimencionaldel sitio catalitico en la regibn hendida de la Ircozima De la A a la F representan las fracciones glucosilo de un hexasadrido Algunos residuos en la región hendida se muestran junto con sus números en las secuencias en la Iisorima (Adaptado de Koshland )
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Bioauim ica de Hurper
~Cu~íieclo 9)
generos. El cuadro 9-1 muestra esta conservacibn de la estructura primaria en los sitios cataliticos de en7imas hidroliticas relacionadas, pero diferentes. Por su parte, el cuadro 9-2 aclara la conservaci0n de "tipos" estructurales primarios a través de los gkneros para la enzima biosintética H M G X o A reductasa. No obstante, dado que un "tipo" estructural terciario puede construirse a partir de varias estructuras primarias diferentes, la estructura primariaglobal de las enzimas esta mucho menos conservada que la terciaria.
MULTIPLES FACTORES INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS Figura 9-7. Estructurade una subunidad rjnica de HMG-COA reductasa de la bacteria Pseudomonasmevalonii La subunidad consta de dos dominios, el mAs pequeíio de los cuales (abajo izquierda) contiene un enlace nuclebtido doblado compuesto de hola beta y h6licec alfa Los residuos aminoacilo esun numerados para facilitar el trazo del polipéptido desde su terminal amino (N) hasta su teminal carboxilo (C). Observese que el polipéptido inicia en el dominio grande, entra al dominio pequeno y al final termina en el dominio grande (Rediseriada con autorizaubn de Lawrence CM, Rodwell VW, Stauffacher CV. Crystal structure of Pseudomonas mevalon~iHMG-COAreductase at 3 O angstrom resolution Science 1995:268 1758 )
o acicidos o como aceptores de un grupo que esth experimentando transferencia. Es probable que, para todas las formas de una enzima que cataliza una reacción o una ciase de reaccibn dadas, el mecanismo de reaccidn sea idéntico sin importar el tejido o forma de vida original. En consecuencia, los aminoácidos que tienen funciones altamente especificas en la cathlisis y, hasta cierto grado, Ios aminoácidos adyacentes, tienden a mostrar una conservación elevada, inclusive entre
Temperatura Aunque la elevación de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccihn cata1izada por enzimas, esto es verdad s610 dentro de limites estrictos de tempemtura (figura 9-81. Al principio, la velocidad de la reacci6n aumenta cuando latemperatura se eleva, debido al incremento en la energía cinktica de las moléculas reactantes. Sin embargo, al final, la energía cinetica de Ia enzima excede a la barrera energética para romper los enlaces dkbiles de hidr6geno e hidrdfobos que conservan su estructura secundaria-terciaria, A esta temperatura, predomina la desnaturalización con pérdida precipitada de la actividad cataiitica. Por tanto, las enzimas muestran una temperatura optima. No obstante, kste no es un parhmetro fundamental, ya que la temperatura óptima depende de la duración del analisis usado para determinarla, es decir, mientras mhs tiempo se conserve una enzima a una temperatura a la cual su estructura es apenas estable, mayor probabilidad tiene de experimentar desnaturalizacibn.
Cuadro 9-1. Swuenrrlaa de los aminohcidos en la vecindad de los sitios catalíticos de varias proteasas bovinas. Las regiones que se muestran son las situadas a cada lada de los residuos serilo S e histidilo J1l Sitio Ir'! -- ' '7
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Cuadre 9--2. La estructura primaria de algunas regiones d,e un sitio catalttico puede conservarse a través de 1os generris. Se piensa que los aminokidos, mostiar~uaaurit rodeando al residuo elutan n n la catá tisis realiizada por la e A reduc,tasa. L(i s residi10s subrayados se desvian de Ea secuencia consensual --.S--
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El factor por el cual la velocidad de un proceso biológico aumentacon un incremento de temperatura de 10 O C es el coeficiente de temperatura o Qio. La velocidad de numerosos procesos biolbgicos, como la contracci6n de un cosaz6n fuera de la cavidad toiricica, casi se duplica con una elevacibn de 10 "C en Ia temperatura (Qio = 2). La alteracidn en las velocidades de numerosas reacciones catalizadas por enzimas que acompaña a una elevacibn o caida de la temperatura corporal, constituye una caracteristica de supervivencia esencial para formas de vida como las lagartijas que no conservan constante su temperatura corporal. Por el contrario, organismos homottmicos como el ser humano toleran sblo alteraciones estrictamente limitadas en su temperatura. Por tanto, los cambios en la velocidad de reacción en el ser humano, debidos a
alteraciones en la temperatura tienen escaso significado fisiológico, excepto cuando hay fiebre o hipotermia. Dado que el aumento en el nhrnero de moléculas con energia cinética suficiente para superar la barrera energktica, ofkce escasas opciones para los organismos homotkrmicos, entonces, ¿cómo incrementan sus velocidades de reaccibn? La respuesta se apoya en la propiedad de las enzimas de abatir las barreras energéticas para las reacciones y elevar las concentraciones locales de reactantes. Para casi todas las enzimas, las temperaturas 6ptimas son iguales o mayores a las de las células en las que se encuentran. Las de los microorganismos adaptados para crecer en aguas termales o en áreas oceánicas termales profundas muestran temperaturas bptimas prbxirnas al punto de ebullición del agua.
Cuando se mide la actividad enzimAtica a diversos pH, la hptima generalmente se observa entre los valores de 5.0 y 9.0. Sin embargo, unas cuantas enzimas, como la pepsina, son activadas a valores de pH muy alejados de estos límites. La fomia de las curvas de pT-1 bptimo estii determinada por:
1) Desnaturalizaci6n de la enzima a valores de pH altos o bajos. 2) Alteraciones en el estado de carga de la enzima del sustrato o de ambos. Para la enzima, los cambios de carga pueden afectar la actividad, ya sea cambiando la estructura o la carga en un residuo que funciona para ligar el sustrato o en la catálisis. Para aclarar esto, considérese una enzima con carga negativa (Enz-) que reacciona con un sustrato cuya carga es positiva (SH*):
Temperatura dptime I
A pH bajo, la Enz-adquiere protones y pierde su carga negativa:
A valores de pH altos, SH' se ioniza y pierde su carga positiva:
Figura 9-8. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de una reaocibn hipotetia catalizada por enzimas.
Puesto que, por definicibn para este ejemplo, las unicas formas que interaccionan son SH' y Enz-, los valores extremos de pH disminuirán las concentraciones efectivas de Enz- y SH', con lo cual se reduce la
100
Rioquímica de Harper
mSH*
X
(Capítulo 99)
m Enz
Figura 9-9. Efectos del pH cobre la actividad enzimhtica.
velocidad de reacción (figura 9-9). Solamente en el área som breada con rayas cruzadas, se encuentran Enz y S en el estado ibnico apropiado y sus concentraciones rnliximas están correctamente cargadas a pH X. Ademh, las enzimaspueden experimentar cambios de conformación con las variaciones del pH. Podría ser necesario un grupo cargado dista1 a la región donde el sustrato se ha fijado, para conservar una estructura activa terciaria o cuaternaria. Conforme cambia la carga en este grupo, la proteína puede desenrollarse, volverse más compacta o disociarse en protiimeros, todo lo cual conduce a la pérdida de la actividad. Dependiendo de la gravedad de estos cambios, la actividad puede ser restablecida o no cuando la enzima regresa a su pH bptimo.
Las enzimas no afectan las constantes de equilibrio La enzima es un reactivo que se combina con el sustrato formando un complejo enzirna-sustrato, EnzS, que se descompone para formar un producto, P, y la enzima libre. En su f m a miis simple, esto puede representarse como:
Aunque las expresiones de la velocidad para las reacciones hacia la derecha e izquierda y global incluyen el tCrmino [Enz],
velocidad^ = kl [Enz] [S] Veloeidad.i = kl [Enz] [P]
en la expresihn de la constan.te de equilibrio glohaI la [Enz] se cancela.
Así, la concentración de la enzima no tiene efectas sobre la constante de equilibrio. Dicho de otra manera, puesto que las enzimas afectan a las velocidades y no a las constantes de velocidad, no pueden modificar a K,, que es una relacion de constantes de velocidad. Entonces, la K,, d e una reaccibn es la misma sin importar que se alcance el equilibrio con catálisis enzirnhtica o sin ella (recordar A G ~Las . enzirnas cambian la via de la reacci6n, pero no afectan las concentraciones de equilibrio inicial y final de los reactantes y productos, los cuales son los factores que determinan a K,, y AGO.
LA VELOCIDAD INICIAL ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA
La velocidad inicial de una reacción es la velocidad medida antes de que se haya formado suficiente producto para permitir que la reacción inversa ocurra. Además, la velocidad inicial de una reacción enzirnática es siempre proporcional a la concentracibn de la enzima. No obstante, obsdrvese que este enunciado se sostiene sole para velocidades in tiales.
LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATOAFECTALA VElOClDAD DE LAS REACCIONES En la explicación siguiente, las reacciones enzimáticas son tratadas como si tuvieran un solo sustrato y un producto unico. Aunque Cste es el caso de algunas reacciones catalizadas por enzirnas, la mayorla de ellas tienen dos o mas sustratos y productos. No obstante, esta consideración no invalida lo siguiente. Si se aumenta la concentracion del sustrato [S1 mientras que todas las demás condiciones se conservan constantes, la velocidad inicial medida, v, (la velocidad medida cuando m u y poco sustrato ha reaccionado), crece hasta un valor mfiximo, V,,,, y no mas (figura 9-1 0 ) . La velocidad se incrementa al aumentar la concentracibn del sustrato hasta el punto donde se dice que la enzima estli "saturada" con el mismo. La velocidad inicial medida alcan7a un valor máximo y no es afectada por el incremento ulterior en la concentraci6n del sustrato, debido a que este está presente en
Figura 9-10. Efecto de la ooncentracibn del suctrato sobre la velocidad de una reaacibn catalizada por enzimas.
un gran exceso molar con relación a la enzima. Por ejemplo, si una enzima de peso molecular de 100 000 actúa sobre un sustrato de peso molecular de 100 y ambos se encuentran a la concentración de 1 mg/mL; existen 1 O00 moles de sustrato por cada mol de enzima. Cifras mhs realistas serian: [Enz] = 0.1 pglmL = 7 0 molar ~ [S] = 0.1 mglm L = 1o4 molar
dando un exceso molar de lo6 de sustrato sobre la enzima. Incluso si [S] decreciera 100 veces, el sustrato todavia estaria presente en un exceso molar de 10 000 veces sobre la enzima. La situación en los puntos A, B y C de la figura 9-1 0 se aclara en la figura 9-1 1. En los puntos A y B solamente una porcihn de la enzima presente estl combinada con el sustrato, aun cuando haya muchas mhs molkculas de sustrato que de enzima. Esto se debe a que la constante de equilibrio para la reaccihn
Enz + S & EnzS (formación del complejo EnzS) no es infinitamente grande. En los puntos A o B al aumentar o disminuir [S], aumenta o disminuye la cantidad de Enz ligada con S como EnzS: de aquí que V I dependa de [S]. En C, esencialmente toda la enzima se encuentra combinada con el sustrato, de manera que un incremento ulterior en [S], aunque praduce un aumento en la frecuencia de las colisiones entre Enz y S, no puede causar incrementos en la velocidad de reacción, puesto que no existe enzima libre disponible para reaccionar. El caso B presenta una situacibn de mayor interés tebrico donde exactamente la mitad de las rnol&culas de enzima esthn "saturadas con" sustrato. De acuerdo con esto, la velocidad es la mitad dc la vclocidad rnbxima alcanzable {V,/2) a esa concentración particular de la enzima.
LAS ECUACIONES DE MICHAELIS-MENTEN DE HlLL REPRESENTAN LOS EFECTOS DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO La ecuación de Michaelis-Menten La concentraci6n del sustrato que produce la mitad de la velocidad mhxima, llamada valor K, o constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v, como funcibn de [S] (figura 9-10). La Km tiene las dimensiones de la concentracidn molar. Cuando [S] es aproximadamente igual a K,,, v, es muy sensible a los cambios en [S] y la enzima esta trabajando precisamente a la mitad de su vclocidad máxima. De hecho, muchas de las enzimas poseen
Figura 4-11. Representacibn de una enzima a concentraciones bajas (A), altas (C) y a la wncentracibn Km del sustrato (6) Los puntos A, B y C corresponden a los de la figura 9-1 0
valores de Km que se aproximan a la concentraci6n fisioliigica de sus sustratos. L a expresión de Michaelis-Menten
describe el comportamiento de muchas enzimas de acuerdo a las variaciones de la concentracibn de sustrato. Ln dependencia de la velocidad inicial de una reacción catali7ada por enzirnas en [S] y en Kmpuede aclararse valorando la ecuaci6n Michaelis-Menten como sigue: 1 ) Cuando ISI es mucho menor que Km(punto A en las figuras 9-1 O y 9-1 1). Aííadiendo ahora
[S]a Kmen el denominador, cambia muy poco su valor, de modo que el término [S] puede ser eliminado dcI denominador. Dado que tanto Vmav como Km son constantes, se puede reemplazar su relación por una nueva constante, K: yi
", ,v
Fl - vi = !!!?%N = be
K m + [SI'
Km
Km
[S]
"aproximadamente igual a"]. En otras palabras, esto significa que cuando la concenlracihn del sustrato es considerablemente inferior a la requerida para producir la miiad de la velocidad miixirna (el valor U,), la velocidad inicial v,, depende de la concentraci6n del sustrato [S]. 2) Cuando [S]es mucho mayor que Km(punto C, figuras 9-10 y 9-1 1). Agregando ahora Km a [S] en el denominador, el valor de [S] cambia muy poco, por lo tanto el tCrmino Km se elimina del denominador.
Esto establece que cuando la concentración del sustrato [S] excede con mucho el valor de Km,la velocidad inicial v,, es mhxima, Y,,. 3) Cuando [Si = Km (punto B, figuras 9-10 y 9-1 1). = 'V d x [SI Km + [C] '
Puesto que numerosas enzimas dan curvas de saturación que no permiten fácilmente la valoración de Vmex (y por tanto de Km),cuando la v, es graficada contra [S], es conveniente reordenar la expresión de Michaelis-Menten para simplificar la valoracihn de Km y V,,,. La ecuacihn de Michaelis-Menten puede ser invertida y factorizada como sigue:
Invirtiendo:
K [S]
[a significa
VI
Para determinar Kmy V,A, se usa una forma lineal de La ecuación de Michaelis-Menten
[SI - V m h [SI -Vrns! p] SI+ [S] 2 [SI - 2
Vdx = -
Esto expresa que cuando la concentracion del sustrato es igual al valor de Km, la velocidad inicial vi es semimáxima. Tambikn indica la forma de evaluar a Km, esto es, de determinar de manera experimental la concentracion del sustrato donde la velocidad inicial es la mitad de la rnhxirna.
Simplificando:
~ s t es a la ecuación de una linea recta:
donde:
Si y, o 1/v, se grafican en función de x, o de l/[S], la interseccion en y, b, es IIV,,, y la pendiente, a, es K,/V,h. La interseccibn negativa en x puede ser valorada haciendo y = O. Entonces
Esta gráfica es llamada gráfica del doble reciproco, por ejemplo, el reclproco de v,(l lv,) se grhfica contra el reciproco de [S] (l/[S]). El valor dc K,, puede: ser calculado a partir de la grhfica de Lineweawer-Burk o del doble reciproco (figura 9-1 2) usando la pendiente y la intersección en y o la interseccibn negativa en x. Puesto que el [S] está expresado en rnolaridad, las dimensiones de Km esthn en molaridad o moles por litro. La velocidad, v,, se puede expresar en cualquier tipo de unidad, puesto que Km es independiente de [Enzl. El
Kmpuede aproximarse a una constante de fijación La afinidad de una enzima por su sustrato es igual al inverso de la constante de disociación, Kd, para el comple.jo enzima-sustrato, EnzS.
Figura 9-12. Gráfica de Lineweaver-Burk o de/ doble reciproco, l l v , contra [S] usado para valorar Km y Vmh
Esto es, mientras menor sea la tendencia del sustrato
y de la enzima para disociarse, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato. El valor Kmde una enzima para su sustrato puede tratamienta por el doble recíproco requiere relativamente pocos puntos para definir Kmy es el método más utilizado para determinarla. De manera experimental, el uso de la grhfica de Lineweaver-Burk para valorar Km puede dar origen a una importancia no justificada de los datos reunidos a concentraciones bajas del sustrata. Éste cs el caso cuando las concentraciones del sustrato, seleccionadas para el estiidfo, difieren por un incremento constante. Este inconveniente puede superarse seleccionando las concentracioncs de sustratos, cuyos reciprocos difieren por incrementos constantes. Un enfoque alternativo a la evaluaci6n experimental de Km y V,,, es el de Eddie y Hofstee. La ecuación de Michaelis-Menten puede reordenarse a
Para evaluar Kmy V,,,, se grafica v,l[S] (eje y) contra v, (eje x}. Entonces la interstccidn en y es V,,,/K, y la intersección en x es Vmk.La pendiente es -1 /Km. Aunque la gráfica de Lineweaver-Rruk y el enfoque de Eadie-Hofstee son útiles en los ejemplos escogidos, la determinación rigurosa de Km y V,, rcquiere de tratamiento estadistico. Los valores de K,, son de importancia prActica considerable. A una concentracion de sustrato de 100 veces K,,, la enzima actuará esencialmente a velocidad mhxima y por tanto la velocidad mhxima (V,,,) reflejara la cantidad de enzima activa presente. Por lo general, en el análisis de enzimas esta situación es deseable. El valor de Km indica la cantidad de sustrato que debe usarse para medir V,,,,. Los tratamientos con el doble reciproca también tienen aplicacihn extensa en la cvaluacion de los inhibidorcs dc enzimas.
servir también corno una medida de su Kd. Sin embargo, para que esto sea verdadero, debe ser válida una hipótesis incluida en la derivacidn de la expresión de Mfchaelis-Menten. La derivación supone que el primer paso de Izt reacción catalizada enzimáticamente
es rapido y siempre esta en equilibrio. En otras palabras. la velocidad de dicaciacion de EnzS a Enz + S debe ser mucho mhs rápida que su disociación a enzima + producto.
En la expresion de Michaelis-Menten,
13
[S] que da
v,= V,8,/2 es: [S] =
kr
+
k-1
kl - Km
pero cuando
k-, >>
k2
entonces kz + k-.r
k-I
En estas condiciones, 1/K, = Kd = afinidad. Si kz es no a proximadamente igual a km,,entonces liK, subestima la afinidad, 1 /Kd.
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Bioquímica de Harper
La ecuación de Hill Ciertas enzimas y otras proteinas que -jan ligandos, como la hemoglobina, no muestran la cinética clásica de saturación de Michaelis-Menten. Cuando [S] ce grafica contra v,, la curva de saturacibn es sigmoide (figura 9-13). Esto indica, por lo general, el enlace cooperativo del sustrato a sitios múltiples. El enlace en un sitio afecta el enlace en otros como se describió en el capitulo 7 para la hemoglobina. Para la cinktica de saturacibn del sustrato sigmoide no son válidos los métodos dc evaluacibn gráficas de la concentración del sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, como se describib (no se producen rectas). Para valorar la sigmoide de Ta cinttica de saturacibn se utiliza una representacidn gráfica de la ecuación de Hill, que originalmente se derivó para describir el enlace cooperativo de moléculas de oxígeno a la hemoglobina. Escrita de manera lineal, la ecuacihn - de Hitl es log k'
donde k' es una constante compleja. La ecuación afirma que cuando [S] es baja comparada con k', la velocidad de reacción aumenta a la enésima potencia de [S]. La figura 9-1 4 presenta una gráfica de Hill de datos cinéticos para una enzima con cinbtica de enlace cooperativo. Una grAfica de v,/V,,, -vi) contra log [S] proporciona una recta con pendiente = n, donde n es un pariirnetro empírico cuyo valor depende del número de sitios de enlace del sustrato y del numero y tipo de interacciones entre los sitios de enlace. Cuando n = 1, los sitios de union achian de modo independiente uno del otro. Si pl 1 1, los sitios son cooperativos; y cuanto mayor sea el valor de n, tanto
Figura 9-1 3. Sigrnoide de la cinética de saturacibn.
mejor será el cooperativismo y, de este modo, será m& "sigmoide" la cinética de saturación. Si rr < 1, se dice que los sitios exhiben una cooperativismo negativo. A la mitad de la velocidad máxima (v, = V,/2), v,J(Y,,, - v,)= 1, y por tanto, log v,/(V,, - v,) = O. De este modo, para determinar S r o (concenlracibn del sustrato que produce la mitad de la velocidad maxima), se traza una Ilnea perpendicular al eje de las x desde el punto donde log v,J(V,a, - v,) = 0.
EL ANALISIS CINETICO DISTINGUE ENTRE INHIBICIÓN COMPETlTlVA Y NO COMPETITIVA Aunque de manera tebtica se distinguen los inhibidores de la actividad enzimática con base en si la inhibici~n se anula o no por el incremento de la concentraci6n del sustrato, numerosos inhibidores no muestran las propiedades ideales de inhibicibn competitiva o no competitiva puras que se describen despubs. Un criterio alternativo para la clasificación de inhibidores es su sitio de acción. Algunos se unen a la enzima en el mismo sitio que el sustrato (el sitio catalitico); otros lo hacen en alguna región alejada de &te (un sitio alostérico).
Los inhibidores competitivos típicos se asemejan al sustrato La inhibicibn competitiva clásica tiene lugar en el sitio de unión del sustrato (catalitico). La estructura qulmica de un inhibidor (1) analogo del sustrato (S)
Figura 3-14. Evaluación grafica de la ecuacibn de Hill para determinar la concentracibn de sustratos que produce la mitad de velocidad mhxima. Este método se emplea cuando la curva de la cinbtica de saturacibn del sustrato es un sigmoide
por lo general es similar a la de este. Puede, por tanto, combinarse de manera reversible con la enzima, formando un complejo enzima-inhibidor (EnzI) en lugar de un complejo EnzS. Cuando tanto el sustrato como este tipo de inhibidor están presentes, compiten por los mismos sitios de unión sobre la superficie de la enzima. Un caso muy estudiado de inhibición competitiva es el del malonato (1) con el succinato (S) por la succinato deshidrogenasa. La succinato deshidrogenasa cataliza la formaci6n de fumarato mediante la remacibn de un htomo de hidrbgeno de cada htomo de carbono alfa del succinato (figura 9-1 5). El malonato (DOC-CT-iz-C003 puede combinarse con la deshidrogenasa formando un complejo EnzI. Este no puede ser deshidrogenado, puesta que no hay manera de quitar ni siquiera un atomo de hidrógeno del único atomo de carbono alfa del malonato sin formar un átomo de carbono pentavalente. La única reaccion que puede experimentar el complejo EnzI es la descomposicibn regresiva en enzima más inhibidor. Para la reaccibn reversible, ki E R A + S $ Enz + I k-i
la constante de equilibrio Ki es:
La accibn de los inhibidores competitivos se puede entender en tkrminos de las siguientes reacciones: Enz + P
Enzl (inactivo)+
se fija firmemente a la enzima (K, = una cifra pequefla). Ahora hay una cantidad escasa de enzima libre (Enz) disponible para combinarse con S para formar EnzS y finalmente Enz + P. Así, la velocidad de reaccibn (formación de P) sera lenta. Por razones anhlogas, una concentración igual de un inhibidor unido con menor fuerza (K, = un numero mayor) no hará disminuir la velocidad de la reaccibn de manera tan marcada. Supbngase que a una concentración fija de 1 se agrega más S. Esto aumenta la probabilidad de que Enz se combine con S, en lugar de hacerlo con 1. La proporcion de EnzS a EnzI y la velocidad de reacción se incrementan. A una concentracibn suficientemente elevada de S, la concentración relativa de EnzI desaparecerá. Si esto es asi, la velocidad de la reacción catalizada sera la misma que en ausencia del inhibidor (figura 9-1 6).
La gráfica del doble recíproco facilita la evaluación de los inhi bidores La figura 9-1 6 representa un caso tipico de inhibición competitivamostrada gráficamente en la forma de una línea de Lineweaver-Burk. La velocidad de reacción (v,) a una concentración fija del inhibidor fue medida a diversas concentraciones de S. Las líneas trazadas a travds de los puntos experimentales coinciden en el eje de las y. Puesto que la jnterseccibn en y es lIV,,, esto dice que a una concentración infinitamente grande de S (l/S = O), v, es la misma que en ausencia del inhibidor. Sin embargo, la interseccibn sobre el eje de las x (que está relacionado a Km)varia con la concentración del inhibidor y se convierte en un número mayor (-1 K', es mayor que -1/K,) en presencia del inhibidor. Así, un inhibidor competitivo eleva la Km aparente (K',) para el sustrato; puesto
Enz
EnzS (activa)
-+
Enz + P
La velocidad de formacibn del producto depende sOIo de la concentracibn de EnzS. Sup6ngase que el inhibidor
H I
H -C -COO 1
-0012C-H
-
- 2H
--OOC-C-H
Succinato
H- C-COOII
Fumarato
Figura 9-1 5. Reaeeibn del suminato deshidrogenasa.
Figura 9-16. GrAfica de Lineweaver-Burk de la inhibicidn cornpetiwa c l h s k . O b s é ~ e s ela liberacibn de la inhibición a concentración alta [S] (1I[S] baja).
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nioquim ica de Har-p~r
Km es la concentración del sustraío a la cual la concentraci6n de enzima libre es igual a la concentración de enzima como EnzS, una cantidad sustancial de enzima libre estd disponible para combinarse con el inhibidor. Para la inhibicion competitiva simple, la intersección sobre el eje de las x es: que
El valor de Kmpuede ser evaluado en ausencia de 1, y K, también puede serlo usando Ia ecuación anterior. Si el nbmero de moles de 1 agregado es mucho mayor que el numero de moles de enzima presente [1] puede ser generalmente tomado como la concentracián agregada (conocida) der in hi bidor. Los valores de K,, para una serie de inhibidores análogos al susirato (competitivos), indican cuales son los mas eficaces. A una concentración baja, con los valores más bajos dc K, produciran el mayor grado de inhibición. Muchos medicamentos eficaces en clíiiica actúan corno inhibidores competitivos de actividades enzimkticas importantes en las células microbianas y animales,
Los inhibidores no competitivos reversibles reducen Vmax pero no afectan a K m En la inhibicibn no competitiva no hay competencia entre S e 1. Usualmente el inhibidor no muestra analogía estructural con S o esta es muy escasa y puede asumirse que se une a un espacio diferente en la enzima. Los inhibidores reversibles no competitivos disminuyen la velocidad rnfixima alcanzable con una cantidad dada de enzima (reducen V,,) pero por lo general no afectan a K,,. Puesto que S e I se pueden combinar en diferentes sitios es posibje la formacibn d e complejos En21 y EnzIS. Ya que EnzlS puede descompanerse para formar el producto a una velocidad menor que la de EnzS, la reaccihn puede retrasarse pero no impedirse Es posible que se presenten las siguientes reacciones de competencia:
Si S tiene igual afinidad par Enz y por En21 (1no afecta la afinidad de Enz por S), los resultados que se mues-
tran en la figura 9-1 7 son los que se obtienen cuando l l v , es graficado contra 1 /[S], en presencia y en ausencia de inhibidor. Se supone que no ha habido ninguna alteracion importante en la conformacibn del sitio activo cuando está unido 1.
Inhibidores irreversibles "envenenan" a las enzimas Unagran variedad de "venenos'knzimáticos tales como la yodoacetarnida, los iones de metales pesados (Ag', 1-Ig2'), agentes oxidantes, etcétera, reducen la actividad enzimhtica. Puesto que estos inhibidores no tienen semejanza estructural con el sustrato, un incremento en la concentración de éste, en general, es ineficaz para suprimir esta inhibicr~n.Sin embargo, la presencia de uno o más sustratos o productos pueden proteger a la enzima contra la inactivacion. Un análisis cinetico del tipo anteriormente tratado puede no distinguir entre venenos enzirnáticos e inhibidores no competitivos reversibles verdaderos. La inhibicidn reversible no competitiva cs, en todo caso, rara. Por desgracia, esto no se aprecia siempre, ya que tanto la inhibicihn no competitiva reversible, como la irreversible, muestran cinética serne.jantc.
La mayoría de las reacciones implica a dos o mas sustratos Ida exposición anterior de las reacciones enzimhlicas catalizadas considera 3610 las reacciones que involucran sustratos y productos únicos. Sin embargo, la mayoria de las reacciones bioquímicas implican dos o más sustratos y productos. Aunque el análisis detallado de la cinCtíca de los mecanismos de las reacciones de rnultisustrato esta m& allá dcl asunto de este capítulo, a continuación se comentan las reacciones de dos sustratos y de dos productos, denominadas "Bi Bi".
Figura 9-17. Gráfica de Lineweaver-Burk para inhibición reversible no competitiva.
Términos especiales describen las reacciones enzimáticas complejas Los siguientes términos convencionalec se emplean pasa caracterizar reacciones compIe,jas catalizadas por enzirnas. Idossustratos se denominan A. B, C y D de acuerdo al orden en que se agregan a la enzima. Dc igual manera. los productos se designan P, Q, R y S de acuerdo al o r d ~ nen que se separan de la enzima. Los diferentes tipos de la enzima se denominan E, F y G, en las cuales la E corresponde a la enzima libre. y Cuater (4) Los términos Uni ( 1 ), Bi ( 2 ) , Ter (3, denotan el número de reactantes y productos. Aun cuando muchas reacciones catalizadas por enzimas involucran mis reactantes y productos (por e.jernplo, reacciones Bi Ter), aquí sblo se consideran las reacciones Bi Bi, es decir, aquellas que tienen dos sustraios y dos productos.
Reacciones en secuencia o de desplazamiento unico En las reaccioncs en secuencia todos los sustratos deben combinarse con la enzima antes de liberar cualquier producto. Estas tambikn se denominan reacciones de desplazamiento unico porque el grupo sujeto a transferencia (G) se pasa directamente desde el sustrato donador A-G al sustrato aceptor B. Dependiendo del modo en el cual los sustratos se agregan a la enzima, se distingue entre reacciones en orden aleatorio y reacciones en orden compulsorio. En las primeras, cualquier sustrato puede agregarse primero para formar ya sea E-A o E-8, mientras que en las segundas solo A puede reaccionar con E, en tanto que B reacciona c61o con el complejo E-A (figura 9-1 8). Una explicación para un orden compulsorio en la adicibn de sustratos es que agregar A induce un cambio en la conformación que alinea residuos escnciales para el enlace de B.
Reacciones en ping pong El tkrmino ping pong se aplica a mecanismos en los cuales uno o más productos se desprenden de la enzima antes de la adicibn de todos los sustratos. Las reacciones Bi Ri ping-pong son reacciones de doble desplazamiento porque el grupo sujeto a transferencia ( G ) primero es desplazado de A 4 por E y a continuación de E-G por B, con formación del producto Q-G.
t o s datos cineticos sirven para distinguir los tipos de mecanismos
Los datos sobre el estado de reposo cinbtico y las ecuaciones apropiadas respecto a la velocidad se utili-
E
EA
P
E
t
EAB-EPQ
EA-FP
t
E
a
B
F
t
EQ
FB-EQ
t
E
Figura 9-18. Reprecentaci6n de tres clases de mecanismos de reacuones Bi Bi Las líneas representan la enzima y las
flechas la adición de sustrato y desprendimiento de productos Arriba: Un mecanismo Bi 61ordenado, característico de muchas oxidorreductasas dependientes de NAD(P) Centro: Una reacción BI Bi aleatoria, típica de algunas deshidrogenasas y cinasas. Abajo: Una reacción de ping pong, propia de l a s arninotransferasas (transaminasas) y de la quimiotripsina
zan para distinguir entre diferentes mecanismos. Aunque Ios t&rminocen estas ecuaciones cinéticas son m& numerosos, son análogos a los de la ecuación de sustrato único de Michaelis-Menten; incluyen: 1) V,,, velocidad de reacción media cuando están presentes tanto A como B en concentraciones saturadas; 2) las concentraciones de A y B que dan como resultado la mitad de la velocidad m k i r n a cuando el otro sustrato esth presente en concentracion saturada, y 3 ) las constantes de disociación para el desprendimiento de A y B de la enzima.
Las gráficas de doble reciproco diferencian entre los mecanismos ping pong y los secuenciales Para distinguir entre diversos tipos de mecanismos, se mide la dependencia de la velocidad inicial en la concentracihn del sustrato A en varias series de concentraciones diferentes (pero constantes) del sustrato B. Los datos se obtienen ahora considerando B coma el sustrato variable y A como el sustrato constante. Los patrones de las lineas cuando 10s datos se representan mediante grhficas del doble recíproco muestran el tipo de mecanismo. Por ejemplo, las lineas paralelas indican un mecanismo Bi Bi ping pong, y las lintas que se intersectan en el cuadrante negativo, un mecanismo Bi Bi ordenado.
108
Bioquímica de Harper
Los estudios sobre inhibición de producto se utilizan para completar estos anhlisis cintticos y para distinguir entre mecanismos Bi Bi ordenados y Bi Bi aleatorios. Por qjemplo, en una reacción Bi Bi de equilibrio m i d o , cualquier producto es un inhibidor competitivo de A con [B] constante y de B con [A] constante. 1,os patrones mfis complejos de inhibiciOn de las reacciones B i Bi ordenadas involucran patrones de inhibición tanto competitivos como mixtos, dependiendo del producto que se estudie, de3 sustrato que varia y del que permanece constante.
RESUMEN La temperatura, el pH, la concentración enzimática y de sustrato y los inhibidores alteran las velocidades de las reacciones catalizadas por entimas, con importantes implicaciones en la salud y la enfermedad. Las enzimas alteran las velocidades de reaccidn por medio de: 1) abatir la energía de activacidn para formar estados de transición, 2) servir como plantillas para incrementar las concentraciones tocales de sustrato y 3) proporcionar aminoicidos cuyos grupos funcionales cumplan con funciones especificas en la catiilisis. Aunque las enzimas modifican de manera profunda las velocidades de las reacciones, no afectan las constantes de equilibrio ni los cambios globales en la energía libre de esas reacciones. La catAlisis enzimática comprende estados de trancicibn de menor energía que los correspondientes en reacciones no catalizadas. De este modo, disminuye la barrera energetica para la reacci6n. La fíjaci6n y catalisis del sustrato se produce en el sitio activo (catalitico), región tridimensional de una enxima que, además de residuos de aminoacidos, puede contener coenzimas o iones metálicos. Los sitios activos con frecuencia radican en hendiduras en las enzimas o en la interfase entre subunidades de enzimas multimericas. Cuando los sustratos se aproximan, los sitios cataliticos experimentan cambios de conformación que pueden propagarse mhs allá del sitio catalitico (recukrdese la fijaci6n de 01a la hemoglobina). Estos cambios de conformaci6n inducidos por el sustrato pueden crear bolsas para su retenci6n y alinear residuos clave para la catálisis. Cuando la temperahira de una enzima se eleva, la velocidad de reaccion aumenta, pero sblo hasta que el nivel de la energia cinetica de la enzima excede a la de rotura de las ddbiles fuerzas no covalentes que mantienen su estructura secundaria y terciaria nativa. En este punto, la actividad decrece en forma precipitada. Cambios de temperatura mAs moderados también afectan la velocidad de reacciones catalizadas por enzimas in vivo, aunque a un grado estrictamente
limitado en organismos homotérmicos, como el ser humano. Los cambios moderados del pH (es decir, en Ia regibn de pH 5 a 9) afectan la actividad enzimktica al alterar la carga de grupos R bcidos o bhsicos dkbites de los arninoácidos que actúan en la caaisis, fijación de sustrato o conformaci6n del sitio catalltico. Las variaciones de pH t a m b i h pueden alterar la carga elkctrica de los sustratos. Por tanto, las enzimas tienen valores de pH a los cuales muestran actividad 6ptima (pI-l óptimo). Los extremos de pH desnaturalizan las enzimas al protonizar o desprotonizar residuos de arninoácidos acidicos o alcalinos, de modo que ya no pueden formar los enlaces salinos que conservan la estructura secundaria y terciaria de la enzima. En casi todas las situaciones de ínter&s fisio16gic0, la concentraci6n molar de una enzima [E] es de un orden de magnitud menorque laconcentración molar de su sustrato [S]. Dado que se dispone de abundante sustrato para reaccionar con la enzima libre, cualquier incremento o decremento en la concentración de la enzima va acornpaflado de un aumento o disminucidn en la velocidad de reacción. Sin embargo, los cambios en la concentraci6n del sustrato [S] afectan la velocidad de reacción sbIo cuando alrededor hay suficiente enzima libre para reaccionar. Cuando toda la enzima está unida como complejo EnzS (condiciones de V,,,), incrementos mayores de [S] ya no aumentan la velocidad de la reaccihn. Ida ecuacidn de MichaelisMenten describe los efectos de la concentracihn del sustrato sobre la actividad de numerosas enzimas. La constante de Michaelis (Km)es la concentracihn de sustrato que produce la mitad de lavelocidad de reaccibn mhxima (V,,,/2; la mitad de la enzima se encuentra como EnzS). Los valores de Km tienen dimensiones de molaridad y se determinan mediante grhficas. Para una gráfica de doble recipraco de 1 /v, contra I/[S], la intercepcidn en el eje horizontal es - 1 K y en el eje de Ins y es lIV,,,. El efecto de [S] sobre las velocidades de reacciones catalizadas por enzimas alostkricas es descritopor laecuacibn de Hill. Lamayoriade las reacciones c a t a l i d a s por enzimas implican dos o más sustratos o productos. Los criterios para establecer las diferentes clases de reacciones Bi Bi (reacciones que involucran dos sustratos y dos productos) son si el sustrato se enlaza en secuencia o al azar y si el producto se libera antes de que se una la totalidad del sustrato (reacciones ping p o n d . Los anhlogos de sustrato que se unen de manera reversible al sitio catalitico y actúan como inhibfdores competitivos de las enzima, incluyen muchos f h a cos de valor en medicina. La mayoria de los compuestos quimicos con poca o nula semejanza estructural con sustratos y que se unen al sitio catalitico o a algún otro, actúan como inhibidores no competitivos de la actividad enzimhtica. De manera breve, los inhibidores competitivos decrecen la Km,pero no tienen efecto sobre
Vmb,en tanto que los inhibidores no competitivos decrecen V , sin afectar a Km.Estos inhibidores pueden distinguirse por la medicion de la actividad enzimática a varias concentraciones de sustrato en presencia o ausencia del inhibidor. Luego, los dos conjuntos de datos se grafican como l/v,, contra lI[S]. En la inhibicibn competitiva clfisica, las dos líneas se intersec-
-
tan en el eje y (es decir, V,,, no cambia), pero la intercepcibn (-IJK,) disminuye por la presencia de inhibidor (es decir, en apariencia Kmha disminuido). En la inhibicidn no competitiva, la intercepción en y (l/V,,) aumenta en presencia del inhibidor (es decir, V,b disminuye), pero la intercepcibn en x no se modifica. I
-
REFERENCIAS Bcnder ML, Rergeron RJ, Komiyama M: The Rioorganic Chemistty ofEmynalic Latalysis. Wiley-Interscience, 1984. Freeman RB, Hawkins HC (editors): The Enzymolo~).'of Postiramlational ModEjicatinn ofProieins. Academic Press, 1985 Lawrence CM, Rodwell VW, Stauffacher CV: Crystal smicturc of Pseudomonas mevalnnii HMG-COArductaqe at 3.0 angstrom resolution. Science 1995368 1758.
Suckling CJ: Eníyme Chemzstv Chapman & Hall, 1990. Syrnons RH: Small catalytic RNAs. Annu Rcv Biochem 1992,61:641. Walsh CT: Suicide substrates, rnechanism4ased enzyme inactivators: Recent developments. Annu Rev Biochem 1984;53:493. Vtase tambikn las referencias del capitula T.
Enzimas: mecanismos de acción Victor W. Rodwell, PhD
INTRODUCCION Los mecanismos de la catAlisis enzimática reflejan muy de cerca 10s mecanismos de las reacciones químicas. Sin embargo, en contraste con la catálisis inorgánica o la orgánica más sencilla, las enzimas muestran un orden en extremo alto de especificidad al sustrato y una enorme eficiencia catalítica; esto es consecuencia del prolongado desarrollo evolutivo de sitios adaptados a la perfección pasa la cathlisis rripida y selectiva de reacciones individuales. Los caminos o vías por los cuales las enzimas convierten los sustratos en productos involucran una sucesión de intermediarios, mas que uno solo entre la enzima y el sustrato. El propósito final de los estudios de estos mecanismos es entender, a nivel molecular. por qud las cnzimas son catalizadores eficientes y específicos. Este objetivo todavía lejos de alcanzarse, requiere de: la identificacion de la etapa o fase limitante de la velocidad en la reaccibn global; la caracterización de todos Tos intermediarias enlamdos en la enzima; la identificación de los iones metálicos o grupos funcionales en los residuos de aminohcidos, coenzimas o grupos prosteticos que participan en el enlace de sustratos, productos e intermediarios en el sitio activo; y, de ellos, identificación del participante directo en la cathlisis. Por anaIogia con el estudio de los intcrmediarios en las vías del metabolismo intermedio, el de los intermediarios enlazados a las enzimas que se forman durante la cathlisis, se denomina con toda propiedad "enzimología intermediaria". En este capitulo los principales comportamientos de la catálisis enzimática se ejemplifican Gon la enzima quimotripsina, una proteína comparativamente sencilla que no contiene coenzimas, grupos prostéticos ni iones metAl3cos.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA Los fenbmenos moleculares que acompafian la conversibn de sustratos a productos constituyen el tema del mecanismo de acción enzimática. Estos estudios conducen a un enfoque racional para la terapéutica y la preparaciiin de medicamentos - á r e a s dc gran potencial de desarrollo en un futuro inmediato. La informacihn estructural de alta resolucion obtenida por cristalografía con rayos X, combinada con la información mecanicista, facilita ahora la preparación de farmacos que inhiben enzimas especlf'ícas como H M G X o A reductasa, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis del ~olesterol.Asimismo, los estudios de los mecanismos sugieren ciimo puede usarsc la tecnologia del DNA recombinante y la mutagenesis dirigida a un sitio, con el fin de modificar la especificidad enzimática o la eficiencia catalítica. En ultimo caso, estas técnicas facilitarán el diseflo y la introducción en seres humanos de enzimas con las propiedades especificas deseadas.
LA "ENZIMOLOG~AINTERMEDIARIA" DE LA QUHMOTRIPSINA MUESTRA LAS C A R A C T E R ~ T I C A SGENERALES DE LA CATÁLISIS ENZIMATICA La quimotripsina cataliza la hidrolisis de los enlaces peptidices en los que el grupo carboxilo es cedido por un aminohcido aromático (Fen, Tir, o Tri) o por uno con un grupo R voluminoso no polar (Met). Igual que muchas otras proteasas, la quimotripsina cataliza también la hidrólisis de ciertos ésteres. Aunque la propiedad de la quirnotipsinapara catalizar la hidriilisis de ésteres no tiene importancia fisiolbgica, si facilita el estudio del mecanismo catalitico.
1
O
D
e-5 Z
Fase de equilibrio
, Fase de "estallido'
Flgura 10-1. pNttrofenilacetato (PNPA) Tiempo (mseg)
El sustrato sintttico p-nitrofenilacetato (figura 10-1) facilita el análisis colorimétrico de la actividad de la quimotripsina, debido a que su hidrólisis libera p-nitrofenol. En un medio alcalino, Cste se convierte en el anión amarillo p-nitrofenilato.
LA CINÉTICA DE FLUJO INTERRUMPIDO REVELA LA "ENZIMOLOG~AINTERMEDIARIA" DE LA QUlMOTRlPSlNA La cinética de la hidrólisis del p-nitrofenilacetato por la quimotripsina puede estudiarse en un aparato de "flujo interrumpido". Estos experimentos utilizan cantidades equivalentes de sustrato (mas o menos cantidades equimolares de enzima y sustrato) y ponderan los fenómenos que tienen lugar en los primeros milisegundos desputs de hacer la mezcla. EI aparato tiene dos jeringas: una para la quimotripsina y la otra para el p-nitrofenilacetato. La mezcla instantanea de la enzima y el sustrato se logra con un dispositivo mecanice que expele con rapidez y de manera simulthnea, el contenido de ambas jeringas en un tubo angosto que pasa a cravts de un espectrofot6metro. La densidad 6ptica como función del tiempo despuds de la mezcla, se registra en un tubo de rayos catbdicos.
La liberación del anión p-nitrofenilato es bifasica La liberacihn del anión p-nitrofenilato tiene lugar en dos fases distintas (figura 10-2): 1) una fase de "esta-
CT + PNPA
Figura 10-2. CinBtica de liberación del anión p-nrtrofenilato cuando la quimotripsina hidroliza al p-nitrofenrlacetato en un aparato de flujo interrumpido. En esta grfifica, el "fenol liberado" se calwfb a partir de la densidad bptica del anión p-nitrofenilato.
Ilido", caracterizada por el desprendimiento mhs rApido del anión p-nitrofenilato y 2) una liberaci6n mhs lenta, subsiguiente, del mismo. El carhcter bifhico de la liberacibn del anión p-nitrofeniEato se comprende en tkrminos de los pasos sucesivos de la catdlisis mostrados en la figura 10-3.
La etapa lenta es la hidrólisis del complejo quimotripsina-acetato (CF-Ac) Una vez que toda la quimocsipsina disponible forma parte del complejo CT-Ac, ya no puede haber más desprendimiento dep-nitrofenilato hasta que se libera quirnotripsina mediante la remocibn hidrolitica lenta del ani6n acetato procedente del complejo CT-AC (figura 10-3). La fase de "estallido" (figura 10-2) corresponde a la conversion de toda la quimotripsina libre disponible en el complejo CT-Ac, con liberaci6n simultánea del ani6n p-nitrofenilato. El p-nitrofenilato (feno[PNPA del ingl~s~p-nifropknylafe) ~ +despds~ de la fase de "estallido" es consecuencia de la formación lenta de quimotripsina libre por hidrbtisis del cornplejo CT-Ac. Esta quimotripsina libre queda entonces disponible para la formación posterior de complejos
~
- tCT-& ucT CT-PNPA
Rapida
RBpida
Lenta
Flgura 1 0 3 . Pasos intermedios en la cathlicis de la hidrblisis del p-nitrofenifacetato por la quimotripsina (CT, quirnotripsina, PNPA,p-nitrofenilacetato; CT-PNPA,complejo quimotripcina-pnitrofenilacetata;CT-Ac, complejo quimotripsina-acetato;fenol, anrbn pnitrofenilato, A F , anibn acetato.) La formación de los complejos CT-PNPA y CT-Ac es rápida en relacibn a la hidrblisis del complejo CT-Ac.
Enzirnas: mecanismos de acci&
CT-PNPA y CT-Ac con iiberacibn concurrente del PNPA. En realidad, la magnitud de la fase de "estallido'' (es decir, los moles dep-nitrofenilato liberados) es directamente proporcional al número de moles de quimotripsina presentes inicialmente.
La señina 195 tiene una funcibn clave en la catálisis El grupo acil del intermediario acil-CT está enlaza'do a un residuo seril altamente reactivo -serina 195de la quimotripsina. La elevada reactividad de la Ser 195 se demuestran por su capacidad (aunque no por la de los 27 residuos seril restantes de la quimotripsina) para reaccionar con el diisopropilfosfofluorjdato ( D 1 P F , d e 1 in g Id S, diisopropylphosphoJuuridate) (figura 10-4). Reacciones análogas tienen lugar con otras proteasas de serina. La fomacihn de derivados de la Ser 195 inactiva a la quimotripsina. Muchas otras proteasas son inactivadas por el DiPF mediante un mecanismo analogo. Estas se conocen como "serina proteasas".
Un sistema relevador de carga funciona como una lanzadera de protones durante la catá!isis Este proceso utiliza tres residuos aminoacil que están bastante separados respecto a su estructura primaria, aunque a distancia suficiente para formar enlaces entre si, en el sentido de la estructura terciaria. Estos residuos son Asp 102, His 57 y Ser 195. Aunque la mayoría de los residuos cargados de la quimotripsina estan en la superficie de la molkcula, los que pertenecen n la "lanzadera" estan "enterrados" en el interior no polar de la mol~cula.Los tres residuos se encuentm alineados en e! orden Asp 102-His 57-Ser 195. Recuérdese que Ser 195 es el residuo acilado durante la catalisis por quirnotripsina. La aproximacibn del ani6n acetato (derivado del pnitrofenilacetato) al Btomo de oxígeno del grupo R de la Ser 195 desencadena el desplazamiento secuencia! de protones que se mueven como "lanzadera" de Ser 195 a travhs de His 57 a Asp 102 (figura 10-5).
'f
. Ol Enz-CH,OH+
F-P=O 4
A
DIPF
S"'
' Sus- (es decir. Ac-)
His
-C-O-H-
- .N
1 13
N-H
O-
A
Ser
Figura 10-5. Operacibn de la lanzadera de protones de la quimotripsina durante la acilacibn de Ser 195 por el sustrate (Sus3
Durante la desacilacion del intermediario acil-Ser
195, los protones se mueveii en direccidn contraria. Se cree que una serie análoga de desplazamiento de protones acompaña la hidrblisis de un sustrato fisio16gico de la quimotripsina, como la es un pCptido. Al igual que muchas proteasas, la quimotripsina se libera desde los ribosomas como precursor de la enzima sin actividad catalitica denominado preenzima o cirnógeno. Tal como se explicara en el capitulo 1 1, la conversibn de la preenzima quimotripsinbgeno en la enzima activa quimotripsina implica una serie de fenomenos proteoliticos selectivos cuyo resultado final es la formación del sitio activo y el alineamiento del sistema relevador de carga responsable de la catálisis.
Catálisis mediante fructssa-2,6-bifosfatasa La fructosa-2,6-bifosfatasa es una fosfohidrolasa (capitulo 21) que cataliza la remocibn mediante hidrdlisis del fosfato del carbono 2 de la fructosa2,6-bifosfato. La figura 10-6 muestra la funcibn de siete residuos de sitios activos en la catilisis efectuada por esta fosfohidrolasa. Igual que en la catálisis que producen las proteasas de serina, ésta implica una "triada catalitica", aunque una parte de ella consta de dos His y un residuo Glu. También se muestra la estabilizacibn por residuos de Arg y Lis con carga positiva, de la fuerte carga negativa del sustrato.
Y o
Enz-CH,-O-P=O
I I
A
Figura 1 0 4 . Reaccibn del hidroxilo primario de la Ser 195 de quimotripsina con el diisopropilfosfofluoridato (DIPF).
LAS COENZIMAS PARTICIPAN DIRECTAMENTE EN LA CATALISIS ENZIMÁTICA La participación directa de las coenzimas para las enzimas conocidas como arninotransferasas, o, con mayor frecuencia, como transaminasas se explican en
transaminacas implica los mecanismos de ping pong que se expusieron en el capitulo 9, con liberacion de un producto antes de agregar el segundo sustrato (figura 10-7).
E-P Fru-6-P
E Fru-2,6-P,
Arg
307
His
392 *rg 257
HIS asa
E-P H,O
EmP,
Catálisis por fructosa-2,6-bifosfatasa. (1) La mrga negativa cuádruple del sustrato unido se estabiltza por las interacciones d e carga a carga con brg 257. Arg 307, Arg 352 y LIS 356. Uno d e los integrantes de la trfada catalitica, Glu 327, estabiliza la carga positiva d e His 392 (2) La nucleofilica His 392 ataca al carbono 2 del grupo fosforilo, y transfiere el fosfato a His 258 con formación d e un fosfate intermedio Se desprende fructosa 6-fosfato d e la enzima (3) Un segundo ataque nucleofilico por una rnol&culade agua. posiblemente asistida por Glu 327 que actua como base, forma fosfato inorgánico. (4) Se desprende ortofosfato inorg8nim desde Arg 257 y Arg 307 (Reproducida con autorizaci6n de Pilkic SJ et al ,6-Phosphofructo-2-kinaselfrucose-2,6-bisphosphatase. A rnetabotic signaling enzyrne Annu Rev Biochem 1995,64:799 ) Figura 1 0 4 .
seguida. Las transaminasas catalizan el intercambio de grupos alfa amino de los aminoacidos por grupos alfa 0x0 de los alfa oxoacidos del piruvato, oxnlacetato o aIh cetoglutarata; estas reacciones son fundamentales para la biosintesis y el catabolismo de los aminoácidos (capitulas 30 y 3 1). Lo mismo que muchas reacciones que requieren coenzimas, la catálisis por medio de las
E-cHo
dcH0-E
'
A I ~
LOS RESIDUOS EN EL SITIO CATAL~TICOPUEDEN ACTUAR COMO CATALIZADORES ~ci~oaÁsicos Una vez que el sustrato se ha unido al sitio catalítice, los grupos funcionales cargados {o con posibilidad de tener carga) de las cadenas laterales de residuos aminoacil cercanos, pueden participar en la catálisis al funcionar como catalizadores Acidos o bhsicos, Existen dos amplias categorías de catllisis acidobásica efectuada por enzimas: la catálisis Acida (o blsica) general y especifica. Por otro lado, aunque las reacciones cuyas velocidades varían en respuesta a los cambios en la concentraci6n de M' o II3O1son independientes de las concentraciones de otros hcidos o bases presentes en la soluci6n, se dice que están Sujetas a catálisis ácida específica o bhsica especifica. Por su parte, se dice que las reacciones con velocidades sensibles a todos los ácidos (donadores de protones) o a todas las bases (aceptores de protones}en Ia solucibn,astán sujetas a catálisis hcida general o básica general.
Las variaciones del pH y de las concentraciones de amortiguador establece la diferencia entre catálisis acidobásica general y la especifica Si la velocidad de la reacci6n cambia como una función del pH a concentracion constante de amortiguador, se dice que es catálisis básica específica (cuando el pH es superior a 7) o catalisisiicida específica (con pH menor a7). Si seeleva lavelocidad de lareacci6n apH constante con los incrementos en la concentración del amortiguador, sediceque esthsujetaa catálisis bhsica general (cuando el pH es mayor de 7) o cathIisis hcida general (con pH inferior a 7).
N,
/CHzNHaLE-CH2~H2 \
Pir
-E
\
KG
E-cHo
\
Giu
Figura 10-7. Mecanismode ping pong de la transaminacibn. E-CHO y E-CH2NH2 representan los complejosenzima-fosfato de piridoxal y enzima-focfato de piridoxamina. respectwamente. (Ala, alanina; Pir. piruvato; KG, alfa-cetoglutarato, Glu,
glutamato.)
Como ejemplo de catálisis ácida especifica, considérese la conversihn de un sustrato (S) a un producto (P). El proceso tiene dos pasos, una transferencia de protones rápida y reversible,
seguida por un pasa más lento y, por tanto, determinante de la velocidad, de reordenamiento del sustrato protonado a producto:
El aumento de la concentracibn del ion hidronio [ H d 3 + jincrementa la velocidad de la reacción aI elevar la concentraci6n de SH', el acido conjugado del sustrato. que es a su vez el sustrato para el paso determinante de la velocidad en la reacción global. Expresado de manera matemhtica, Velocidad
=
dlpl dt
=
WH 7
donde P = producto, t = tiempo, k = constante especifica de la velocidad y [SH '1 = concentracion del acido conjugado del sustrato. Dado que la concentraci~nde SH' depende de las concentraciones de S y de &O', la expresibn general de la velocidad para las reacciones catalizadas ácido especificas es:
Nótese que un requisito de la catálisis hcida especifica es que la expresión de la velocidad contenga $610 términos para S y para h O + . Ademas, considbese que, en adicibn a la catlilisis ácida especifica descrita antes, hay también catalisis por el ian irnidazolio de un amortiguador imidazblico. Puesto que el imidazol es un ácido débil (pK, aproximadamente 7), es un donador de protones malo; por eso la reacción
es lenta y determina la velocidad para la reacción global. Nótese que el paso rhpido y el lento estan invertidos cuando el mecanismo cambia de catfilisis Bcida especifica a general. Las expresiones de velocidad para la cathlisis hcida general con frecuencia son complejas por lo cual no se describen aquí.
LA MUTAGENESIS DlRlGlDA A UN SITIO PROPORClONA NUEVAS PERSPECTIVAS Las técnicas de la biologia molecular proporcionan herramientas poderosas para la investigacion del me-
canismo de accibn de las enzimas. Destaca entre ellas la posibilidad de alterar a voluntad Ia secuencia de bases de nucleótidos de los genes y expresar las proteínas en huespedes unicelulases como células de mamíferos cultivadas o la bacteria EScherichia col[ En combinaci6n con estudios de la estmctura tridirnensional en solución por cristalografía con rayos X 'y con investigaciones cinkticas clasicas, estas tdcnicas moleculares proporcionan nuevas perspectivas sobre los mecanismos de accibn de las enzirnas. Cuando los datos físicos y cinhticos indican que un residuo aminoacídico dado desempefia una funcibn especifica en la catiilisis (es decir, que sirve como una base general o como un reactivo de transferencia de grupo), la posibilidad puede ser respaldada mediante el cambio del aminoacido por otro incapaz de ejecutar Ia funcián postulada. En algunos casos, esto puede lograrse con la modificaci6n química de la enzima. Sin embargo, un enfoque mhs general consiste en emplear la mutagenesis dirigida a un sitio para modificar el gen que codifica la enzima, luego expresarlo y caracterizar la enzima mutante. Por la alteración de la secuencia de bases de un codón especifico, la mutagknesic dirigida a un sitio, puede reemplazar un aminoácido dado por cualquier aminohcido proteínico deseado. Asimismo, la mutagénesis dirigida a un sitio puede producir numerosas mutantes en un punto. Un oligonuclebtido corto (es decir, un mer-F 9) que codifica un aminohcido mutante, generado por síntesis automatizada, es templado in vjtro al gen original aislado. Luego se produce un gen mutante por adición de DNA polisomerasa, DNA ligasa y trifosfatos de ribonucle6tidos. A continuación, ese gen se traslada a un vector para expresion detrfis de un promotor potente, se expresa y la enzima mutante que se obtiene es purificada para examinar SLIS propiedades.
LOS IONES METALICOS PUEDEN FACILITAR LA FIJACIÓN Y LA CATÁLISIS DEL SUSTRATO Mfis de 25% de las e n z i m a contienen iones metálicos firmemente unidos o los necesitan para su actividad. Las funciones de éstos se estudia por medio de la cristalografía con rayos X, e imágenes de resonancia rnagnktica (IRM), y resonancia del spin del electrón (RSE). Junto con el conocimiento de la formación y [a degradaci~nde los complejos metAlicos y de las reacciones dentro de las esferas de coerdinacion de los iones methlicos, proporcionan una perspectiva de sus funciones en la cathlisis enzimática, las cuales se considerarAn más tarde. Las rnetaloenzimas contienen una cantidad definida de un ion methlico funcional que es retenido
116
e
Binguímicade Harper
(Capíf u10 J O)
durante !a purificación. Las enzimas activadas por metales se unen con &.tos de manera menos firme, pero los necesitan para ser activas. Por tanto, la distinci6n entre rnetaloenzimas y enzimas activadas por metal radica en la afinidad de una enzima particular por su ion metálico. Los mecanismos que emplean los iones metAlicos para desempefiar sus funciones parecen ser semejantes en las metaloenzimas y en las enzirnas activadas por metal.
En la catálisis funcionan complejos ternarios con metales Para los complejos temario5 (de tres componentes) del sitio catalítico (Enz), un ion metálico (M) y el sustrato (S) que presentan estequiometría 1 : 1 : 1, son posibles cuatro disposiciones:
Complejo con puente de sustrato
Complejo con puente
methtico en la piruvatocinasa mantiene un sustrato (ATP) en su lugar y lo activa.
ATP
Piruvatocinasa-
\
Creatlna
B. Complejos cuyo puente es el sustrato (EnaSAfJ Al parecer, la fomaci6n de complejos ternarios de trifosfatos de nucleósido y enzima, metal y sustrato con puentes de sustrato, se atribuye al desplazamiento del HzO desde la esfera de coordinacibn del metal por el ATP: A T P ~+' M ( H ~ o ) ~ ~ATP'
M ( H ~ O )+~3H20 ~'
enzimatico Las enzimas entonces se enlazan, formando el complejo ternario:
Complejo can puente metálico cíclico
Complejo con puente metálico simple
Para las enzimas activadas por metal, las cuatro disposiciones son posibles, mientras que las rnetaloenzimas no pueden formar el complejo EnzSM, debido a que retienen al metal a travds de la purificacidn (es decir, ya son un complejo BnzM). Pueden enunciarse tres generalizaciones: 1) la mayoria, pero no todas las cinasas (ATP:fosfotransferasas) forman complejos con puente de sustrato del tip Enz-nuclebtido-M. 2) Las fosfotransferasas, que utilimn pinivato o fosfoenolpiruvato como sustrato, las enzimas que catalimn otras reacciones del fosfoenolpiruvato y las carboxilasas, forman complejos con puente rnethlico. 3) Una enzima dada puede formar un tipo de puente en el complejo con un sustrato y uno de tipo diferente con otro.
A. Complejos con puente enzimáfico (MEnzS) Se presume que los metales en los complejos con puente enzimático tienen funciones estructurales en el mantenimiento de la conformacibn activa (por ejemplo, la glutamina sintetasa) o forman un puente metiilico hacia el sustrato (por ejemplo, la piruvatocinasa). Ademhs de su función estructural, se cree que el ion
En las reacciones de las fosfotransferasas, los iones met8licos se consideran como activadores de los átomos de fbsforo que ast forman un complejo rigido pol ifosfato-aden ina, de conformación apropiada en el complejo cuaternario activo. C. Complejos con puente metálico
Los datos cristalogrhficos y de secuenciación han establecido que un residuo His interviene en la fijación del metal al sitio activo de muchas proteinas (por ejemplo, carboxipeptidasa A, citocromo c, mbredoxina, rnetamioglobina y metahemogfobina; capitulo 7). Para los complejos binarioc (dos componentes) E n N , el paso limitante de la velocidad es en muchos casos la separación del agua de la esfera de coordinación del ion methlico. En muchas peptidasas, la activación por los iones metklicos es un proceso lento que requiere muchas horas. Es probable que la reacciOn lenta sea et reordenamiento confomacional del compIejo binario EnzM para llegar a la forma activa, por ejemplo:
Enzimas - mecanismos de acciún
Unibn del metal: Rhplda
+
Enz + M(Hfl)s -+ Enz-M{H20)6.,
nH20
Reordenamiento a una conformacibn activa (Enz'): Lenta
En~-M(Hz0)6.~ +
un ion metklico puede "enmascarar" a un nuclebfilo y así prevenir una probable reaccibn secundaria. Finalmente, el control estereoquimico del curso de una reacción catalizada por enzimas, puede lograrse con la propiedad de la esfera de coordinacibn del metal para actuar como un molde tridimensiona! para mantener los grupos reactivos en una orientación espacial especifica (cuadro 10-1).
E l i f4 ! A ( H 2 0 ) ~ . ~
Sin embargo, en las metaloenzimas el compleio ternario con puente metfilico debe formarse mediante Ia combinación del sustrato (S) con el complejo binario EnzM :
Enz-iUi
117
+ S k Enz-M4
/
'. I
o Enz
S
Los iones metálicos desempeñan múltiples funciones en la catálisis
RESUMEN La quimotripsina proteasa (CT) ejempIifica numerosas características generales de la catalisis enzimática, las cuales incluyen la formación de intermediarios unidos a enzima (CT-PNPA y CT-Ac), la naturaleza escalonada del proceso (tres reacciones parciales}, el carácter limitante de la velocidad de una reaccibn parcial sencilla (hidrdlisis de CT-Ac) y Ia liberacihn en secuencia de productos (fenol seguida por acetato). Idas funciones.de aminohcidos p&iculares en el sitio catalitico se mostraron por la función de un residuo Ser (SeriYs)como aceptor de un grupo (Ac-) que es transferido a agua y por las funciones de los residuos Ser, 1-Iis y Asp específicos en la formación d e un sistema relevados de carga. Además, este sistema relevador de carga ejemplifica quc los residuos adicionales bastante separados en el sentido de una estructura primaria (Ser 195, His 57 y Asp 102)
1-0siones methlicos pueden participar en cada 1 de los 4 mecanismos con los que se sabe las enzimas aceleran la velocidad de las reacciones qufmicas: 1) catálisis acidobásica general, 2) catáIisis covalente, 3) aproximación de los reactantes y 4) induccion de rigidez o tension en la enzima o el sustrato. Además del hierro Cuadro 10-1. Ejemplos escogidos de funciones dc? y el manganeso que funcionan en las proteínas hémilos iones me. el mecani IS cas, los iones metálicos que intervienen más común:nzimas* mente en la catálisis enzimática son ~ g ~~ ' ,n " y ~ a ? 'aunque , otros iones metálicos (por ejemplo, K') Funcion uei iuii irieiaiicu son importantes para la actividad de ciertas enzirnas. IIisnaina riesarninasa Los iones metblicos, al igual que los protones, son Cinasas, liasas, pirii- I valo descarboxilasa ácidos de Lewis (etectr6filos) y pueden compartir un par de electrones para formar un enlace sigma. Ar rbbnica i Activaciiin de un nuclebfilo Ademhs, pueden ser considerados "superácidos", dado En ~rnldicas El meta! actiia como un nucieóque existen en soluci6n neutra, frecuentemente tienen una carga positiva > 1 y pueden formar enlaces pi. Pi ruvato cal-boxilasa, Asimismo (a diferencia de los protones), los metales carboxiplcptidasa, pueden servir como plantillas tridirnensionaies para la alcohol dr:shidrogeorientación de los grupos bhsicos en la enzima o el nasa sustrato. IWeinas ftmt sin k m Donación nes pi (n) -- m ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,, , . Por otro lado, los iones metálicos pueden aceptar Piruvato cinasa, pirue y orienia electrones a travhs de los enlaces sigma o pi para vato carlioxilasa, activar electrófilos o nucleófilos (catálisis acidobksica adeni latoci -- . general). Mediante la donaci6n de electrones, los Fosfotrancf crasa, Dnsionales metales pueden activar a los nuclebfilos o actuar como xilosa isi3rnerasa, nucleófi~osellos mismos. La esfera de coordinación .. i1 hemoproteirids -de un metal puede atraer a la enzima y al sustrato * Adaptado de Mildvan AS Meials in enzyme cat;alysis Vol 2. (aproximación) o crear una distorsión que produce Pagc 456 in The Enzymes Boyer P U, Lardy H , Myrhack K quelatos en una o en otro (rigidez o tensión). Ademas, (editors) Academrc Press 1970
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118 * Rioquimica de Hurper
pueden formar porciones contiguas del sitio catalítico de una enzima. La proteblisis selectiva de la preprotefna quimotripsinbgeno inactiva crea el sitio activo de la quimotripsina y lleva los tres residuos que conforman el sistema relevador de carga a una distancia, uno de otro, que permita formar enlaces. Durante la catllisis, los residuos del sitio catalitico pueden actuar como ácidos (Glu, Asp) o bases (His. Arp, Lis) generales. La adicion de sustratos y la liberación de productos pueden proceder en
{Capitulo 10)
forma ordenada o de una manera aleatoria. Bajo un mecanismo de ping pong (por ejemplo, transaminación), la reaccibn avanza a travks de los fenómenos alternos de adicibn de sustrato y liberacibn de producto. Los iones methlicos facilitan la fijación del sustrato y la catálisis mediante la creacibn de varias clases de complejos puente, constítuidoc por enzima, metal y sustrato. Los iones met8licos pueden actuar como catalizadores acidos generales o facilitar la aproximaci6n de los reactantes.
REFERENCIAS Coleman JE: Structure and mechanism of alkaline phosphataw. h u Rev Riophys Biomol Stnict 1992;21:MI. Fersht A: E q m e Structure and,Wechan~sm,2nd ed. Freeman, 1985. Freeman RB,Hawkins HC (editors): The E q m o l o L w of Post-translational ~ ~ o d ~ J i c a r iofo nProteins. Acadernic Press, 1985.
Purich DL (editor): Enzyme kinetics and mechanisms. Parts A and B in: Methods in Eyvmology. Vol 63, 1979; Vol 64, 1980. Academic Press. Regan L: Tne design of metal hinding sites in proteins. Annu Rev Riophys Biomol Struct 1993;22:257. Vease: tambitn las rcfcrencias de los capítulos 7 y 8.
Enzirnas: regulación de actividades Victor W. Rodwell, PhD
de un medicamento provoca cambios significativos en el metabolismo de otro (capitulo 61). En este capitulo, algunos ejempIos escogidos muestran los mecanismo^ que regulan los procesos metabólicos mediante la cantidad o eficiencia catalítica de las cnzimas. La intención es establecer las características de los patrones globales de regulación. En todo el libro se hace referencia a otros muchos ejemplos espectficos para mostrar las diversas caracterís-ticas de la regulación metabólica.
IMPORTANCIA BIOMEDICA ¿De qué manera Ias células y ios organismos íntegros regulan y coordinan el metabolismo global? Esta pregunta interesa a los trahaiadores en áreas de las ciencias biornkdicas tan diversas como chncer, cardiopatias, envejecimiento, fisiologia microbiana, diferenciación, rnetakorfosis, accihn h-onal y de Fármacos. En todas estas áreas, se han encontrado ejemplos importantes de regulaciiin n o m a l o anormal. Por ejemplo, muchas celulas canmrosas exhikn anormalidadesen Ia regulación de su complemento enzimático (carecen de induccion o de represiOn); caso que ejemplifica la conclusi6n ya establecida, de qtic las alteraciones del control qenktico son fen6menoS fundamentales en las c&lulascañcerosas. De nuevo, ciertos virus onctjgenos contienen un gen que codifica para una tirosina proteincinma. Cuando esta cinasa actúa en las células del hugsped, puede fosforilarmuchas proteínas y enzirnas que normalmente no lo estAn y, por tanto, conducir a cambios importantes en el fenotipo celular. Al parecer, un cambio de esta naturaleza es la base de ciertos tipos de transformacibn oncogenica vira!. La accibn de los famiacos proporciona otro ejemplo importante que comprende la regulación enzimática, pues la induccidn enzimática es una causa bioquimica importante en las interacciones medícamentosas, situaciones en las que la administracibn
LA R E G U L A C I ~ W DEL METABOLISMO LOGRA LA HOMEOSTASIA El concepto de regulación homeostática del medio interno emitido por Claude Bernard a finales del siglo XIX hizo hincapie en la facultad de los animales para mantener constante su medio intracelular a pesar dc los cambios en el exterior. Este concepto impIica que todas las reacciones necesarias catalizadas por enzimas se efectúan a velocidades que responden a cambios tanto en el medio interno como en el externo. Una cCIula u organismo pueden considerarse enfermos cuando no responden o lo hacen inadecuada o incorrectamente a una seiial interna o a un esmés externo. El conocimiento de los factores que afectan las velocidades de las reacciones catalizadas por enzirnas, es esencial para entender el mecanismo de la homeostasia en las células normales y para comprender la base molecular de la enfermedad.
El flujo de metabolitos tiende a ser unidireccional Todas las reacciones quirnicas, incluyendo las catalizadas pos enzimas, son en cierto grado reversibles*. Dentro de la celula viva, sin embargo, es posible que no se produzca la reversibilidad porque los productos
* Una reacciiin fácilmente reversible tiene un pequeao valor numérico de AG, micntras que una con un valor negativo grande para AG podría llamarse "realmentc irreveriihle" cn casi todas las siiuacioncs bioquimicas.
120
Bioquimica de Harper
de reacciiin son removidos con rapidez mediante reacciones adicionales catalizadas por enzimas. El flujo de metabolitos en una celulavivaes análogo al flujo de agua en un acueducto el cual aunque es capaz de transportar agua en ambas direcciones, en la prhctica el fiujo es unidireccional. El flujo de metabotitos en la d l u l a también lo es en gran parte. El equilibrio verdadero, lejos de ser característico de la vida, se alcanza s61o a la muerte de la célula. La célula viva es un sistema dinámico estacionario conservado por un flujo unidiseccional de metabolitos (figura 1 1-1). En las cklulas maduras, las concentraciones medias de los metabolitos permanecen relativamente constantes durante periodos considerables*. La flexibilidad del sistema estacionario s e manifiesta en los delicados desplazamientos y equilibrios mediante los cuales los microorganismos conservan constante el medio intemo, a pesar de Ias amplias variaciones en alimentaciiin, ingestibn de minerales y agua, rendimiento de trabajo o temperatura externa.
Las velocidades de reacción responden a las necesidades fisio~ogicascambiantes Para que la vida proceda de una manera ordenada, debe regularse el flujo de metabolitos a travks de las vías anabólica y catabólica. Es preciso que todos los fenómenos quimicos necesarios tengan lugar a velocidades congruentes con los requerimientos del organismo en relacidn con su medio. La produccidn de ATP, la sintesis de precursores macromoleculares, el transporte, la secreción y la resorción tubular, deben responder todos a cambios suti les del medio celular, del brgano y del animal integro. Se necesita que estos procesos sean coordinados y, además, respondan a cambios a corto plazo del medio externo (por ejemplo, la adicibn o la eliminaci6n de un nutriente), ncl como a sucesos intracelularcs periddicos (por ejemplo, la replicación del DNA). I-lasta ahora, los detalles moleculares de la regulacibn son mejor comprendidos en las bacterias, las cuales carecen de las complejidades del control hormonal o neurológico y en las cuales los estudios genéticos pueden llevarse a cabo con facilidad para analizar los acontecimientos moleculares. Sin embargo, nuestra comprensihn de la regulacibn rnolecular en la célula animal está en un estado de rhpida expansibn. En tanto que la regulacion metab6lica en los mamíferos difiere de modo signifi-
(Capibulo I 1)
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grandes
\m
Figura 11-1. Una oélula ideal en estado de estabilidad. Obsérvese que el flujo de rnetabolitos es unidireccional.
cativo, de los fenómenos superficialmente semejantes de las bacterias, la regulacibn de los procesos metab6licos en &as ser6 el ejemplo a discutir debido a que proporciona un marco conceptual de referencia para considerar la regulación en el ser humano
TRES MECANISMOS GENERALES REGULAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTI~A El flujo neto de carbono de una reacción catalizada enzirnAticamente podria ser influido: 3 ) cambiando la cantidad absoluta de enzima presente, 2) alterando el tamaiio del conjunto de reactantes distintos de la enzima y 3 ) alterando la eficacia catslitica de la enzima. Las tres opciones son utili~adasen casi todas las formas de vida.
Las velocidades de síntesis y degradación determinan la cantidad de enzima La cantidad absoluta de una enzima presente esta determinada por su velocidad de sintesis (k,) y por Ia velocidad de su degradación (b,} (figura 1 1-2). La cantidad de una enzima dentro de una celula puede
Enzima
Aminoácidos
* Sin emhargo, si ocurren osciiaciones de corta duración en las concentraciones del meiaholito y de la enzima y tienen gran importancia fisiológica.
Figura 11-2. La cantidad de enzima se determina por el balance neto entre la sintesic de la enzima su degradación Las K, y Kdegson las mnstantes de velocidad para el proceso completo de sintesis y degradacibn, respectivamente
Enztmar: regulación de uctividudes
elevarse ya sea por un incremento en su velocidad de síntesis (incremento de k,), por una disminución en su velocidad de degradacibn (disminucion de h,), o por ambos. De manera semejante, una cantidad menor de enzima puede resultar de una disminucihn de k,, de un incremento en kdq, O deambos procesos. En el ser humano se encuentran ejemplos de cambios tanto en k, como en k+. En todas las formas de vida, la síntesis de enzimas a partir de los aminoAcidos y su degradacibn hasta aminohcidos son procesos distintos catalimdos por conjuntos de enzimas por completo diferentes. La regulación independiente de la sintesis y de la degradacihn de las enzimas se logra asl, fhcilmente (figura 11-2).
Los inductores pueden estimular la síntesis de enzirnas Las celulas pueden sintetizar enzimas especificas en respuesta a la presencia de inductores especificos de peso molecular bajo. Por ejemplo, Escherichia colr cultivada en glucosa no cataboli~arala lactosa debido a la falta de la enzima beta galactosidasa, que hidroliza la lactosa a galactosa y glucosa, Si al medio de cultivo se agrega lactosa o algunos otros beta galactosidos, hay inducción de síntesis de beta gaIactosidasa y entonces el cultivo puede catabolizar la Iactosa. Aunque muchos inductores son sustratos para la enzima que inducen, ciertos compuestos estmcturalmente semejantes al sustrato pueden ser inductores, pero no sustratos; se les llama inductores gratuitos. A la inversa, un compuesto puede ser un sustrato, pero no un inductor. Frecuentemente, un inductor estimula a varias enzirnas de una ruta catabdlica(por ejemplo, tanto la beta galactosidopemeasa como la beta galactosidasa son inducidas por lactosa). Las enzimas cuya concentraci6n en una ctIula es independiente de un inductor agregado se denominan enzimas constitutivas. Una enzima particular puede ser constitutiva en una cepa, inducible en otra, y ausente en una tercera. Las células capaces de ser inducidas por una enzima particular, por lo general contienen una cantidad basa1 pequefía medible de esta enzima, aun en ausencia del inductor agregado. La herencia gendtica de la ctlula determina así, tanto la naturaleza como la magnitud de la respuesta al inductor. t o s términos "constitutiva'" e "inducible" son, por tanto, términos relativos, como "caliente" o "frio", que representan los extremos de un amplio espectro de respuestas. La induccibn enzimhtica tambitn existe en las células eucariotas. Ejemplos de enzimas inducibles en los animales son la triptbfano pirrolasa, la treonina deshidrogenasa, la tirosina alfa cetoglutaratotransaminasa, la invertasa, las enzimas del ciclo de la ula HMG-COA reductasa y el citocromo P450.
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Los productos finales reprimen la síntesis de enzimas La presencia de un metabolito biosintktico en el medio de crecimiento bacteriano, puede reducir la nueva síntesis del mismo por medio de la represión. Tanto en la induccion como la represión participan elementos cis, secuencias especificas de DNA ubicadas en la parte superior de la cascada de genes que codifican una enzima dada, y proteínas reguladoras trunTactuantes. Además, metabolitos especificos sirven corno correpresores o coinductores que al enlazarse a proteínas transactuantes, lo mismo fortalecen que debilitan su integracihn con un elemento cis. Por tanto, los valores intracelulares altos de un metabolito como una purina o un aminoácido pueden interrumpir la síntesis de las enzimas que participan en su propia biosíntesis. Por ejemplo, en Salrnonelh typhirnurrum, la adición de histidina reprime la síntesis de todas las enzimas que intervienen en su biosíntesis, mientras que la adicibn de leucina reprime la síntesis de las tres primeras enzimas peculiares para su biosíntesis. Despues de la eliminación o del agotamiento de un intermediario biosintético esencial del medio, de nuevo se produce la biosintesis enzirnitica. Esto constituye lo que se denomina dessepresión. Los ejemplos anteriores muestran la represibn por retroalimentación con el. producto, típica de Ias vias biosinttticas de las bacterias. Por otro lado, la represión por catabolito es un fenómeno relacionado que se refiere a la facultad de un intermediario en una sucesi6n de reacciones catabólicas catalizadas por enzimas para reprimir la sintesis de las enzimas catab0Iicas. Este efecto fue observado primero en cultivos de E. coli creciendo en una Euente de carbono (X) distinta de la glucosa. Se not6 que la adición de glucosa reprimía la síntesis de las enzimas encargadas de1 catabolismo de X y este fenómeno fue inicialmente llamado el "efecto de la glucosa*'. Puesto que otros nutrientes oxidables diferentes a este carbohidrato producen efectos semejantes, se ndopt6 el tdrrnino represidn por catabolito, la cual es mediada por el cAMP. Los mecanismos moleculares de la inducción, la represion y la desrepresidn se dcscribirhn en el capitulo 4 1.
EL RECAMBIO DE PROTE~NAS TIENE LUGAR EN TODAS LAS FORMAS DE VIDA Los procesos combinados de síntesis y degradacibn de [as enzimas constituyen el recambio enzimático reconocido como una propiedad característica de las c&IuIasde los tiamíferos, mucho tiempo antes de que
se mostrara que también tenia lugar en las bacterias. La existencia del recambio de proteínas en el ser humano se dedujo de experimentos dietkticos hace bastante más de un siglo, aunque fue hasta el trabajo clásico de Schoenheimer, justamente antes y durante la 11 Guerra Mundial, que se estableció concluyentemente. Midiendo las velocidades de incorporación de aminoácidos rnarcados con NI5 a las proteinas y los índices de pCrdida de NI5 de las proteinas, Schoenheimer concluyó que las proteínas están en un estado de "equilibrio dinamico", un concepto extendido desde entonces a otros constituyentes del cuerpo, incluyendo los Iípidos y los ficidos nucleicos.
Las velocidades de degradación de las enz'imas específicas están sujetas a regulación La degrada~ionde proteínas de mamfferos por vías que dependen de ATP y ubiquitina, asi como las independientes dc ATP, se describen en el capitulo 3 1. La susceptibilidad de una enzima a la degradacibn proreolitica depende de su ~onfomacibn.La presencia o la falta de sustratas, coenzirnas o iones metálicos, que pueden modificarla, alteran lasusceptibilidad proteolítica. De este modo, laconcenmci61-ide sustratos, de coenzímas y posiblemente de iones en las cklulas puede, influenciar las vclocidades a las cuales son degradadas enzimas especificas. La arginasa y la triptófano oxigenasa (tripthfano pirrolasa) e,jemplifican estos conceptos. La regulación de las cifias hephticas de arginasa puede incluir ya sea un cambio en k, o en L,. Despudc de la ingestidn de una dieta abundante en protehas, los valores hepriticos de arginasa se elevan debido a un incremento en la velocidad de su sintesis. Los mismos valores también aumentan en los animales hambrientos. Aquí, sin embargo, es la degradación de la arginasa la que está disminuida, en tanto que k, permanece inalterada. En un segundo ejemplo, tanto la inyeccidn de glucocorticoides como la ingestión de triptófano aumentan 30s valores de triptofano oxigenasa en los mamíferos. El efecto de las hormonas es la elevacibn de la velocidad de síntesis de la oxigenasa (aumento de k).El triptófano, sin embargo, no ejerce efecto sobre k, pero abate be, estabilizando la oxigenasa respecto a la digestibn proteolitica. Estos dos casos contrastan con la inducción enzimática en las bacterias. En el caso de Ia arginasa, el incremento en la ingesti6n de nitrhgeno por una dieta abundante en proteinas puede elevar las cifras hepáticas de arginasa (capitulo 3 1). El aumento en Ia velocidad de síntesis de la arginasa se parece así, superficialmente, a la induccibn por sustrato en las bacterias. En el caso de la triptdfano pirrolasa, sin embargo, aun cuando el triptbfano puede
actuar como un inductor en las bacterias (afecta k,), su efecto en los marniferos sc qjerce solamente sobre el proceso degradante (abate kd,,). Los valores enzimaticos en los tejidos de marniferos pueden ser alterados por una amplia gama de factores fisiologicos, hormonales o dietéticos. Se conocen ejemplos para una diversidad de tejidos y vias metabólicas, pero nuestro conocimiento es fragmentario acerca de los detalles molecularec que intervienen para producir estos cambios. Los glucocorticoides incrementan Ia con~entración de tirosina trancaminasa estimulando su k,. Este fue el primer caso cSaro de una hormona reguladora de la sintesis dc una enzima de mamíferos. La insulina y cl glucagbn, no obstante sus cfectos fisiológicos mutuamente antagbnicos, incrementan k,, de manera independiente, de 4 a 5 veces. El efecto del glucagón probablemente es mediado a través del cAMP.
La síntesis de ciertas enrimas
como precursores inactivos tienen ventajas en la regulación La actividad enzimatica puede regularse con la conversión de una proenzima inactiva a la forma catalítica activa. Para volverse catallticamente activa, la proenzima debe experimentar una proteólisis limitada, un proceso acompañado de cambios en la conformación que revelan o "crean" el sitio catalítico. Esto se mostrara después en relacibn con la enzima quimotripsina.
MUCHAS PROTEASAS SE SECRETAN COMO PROENZIMAS SIN ACTIVIDAD CATAL~TICA Ciertas proteinas se elaboran y secretan en forma de proteinas precursoras inactivas conocidas como proproteínas. Cuando son enzimas, las proproteinas se denominan proenzimas o cimógenos. La conversion de una proteína en proteina madura implica la proteólisis selectiva, proceso que convierte la proproteina en una forma que tiene la actividad típica de la proteina madura (su actividad enzimfitica} mediante uno o más "cercenamientos" proteoliticos sucesivos. Los ejemplos de proteinas elaboradas como proproteinas incluyen la hormona insulina (proproteina = profnsulina), las enzima5 digestivas pepsina, tripsina y quimotnpsina (proproteínas = pepsindgeno, tripsindgeno y quimotripsinógeno, respectivamente), varios factores de la cascada de la coagulacibn sanguínea y de la disolución del cohgulo (capitulo 59), y la proteina cotágena del tejido conjuntivo (proproteina = procoIágena}.
La conversibn de proquimotripsina (pro-QT), polipéptido de 245 residuos aminoacilo, en la enzima alfa quimotripsina activa implica tres cercenamientos y la formación de un intermediario activo conocido como piquimotripsina (pi-QT) (figura 1 1-3). En la alfa quimotripsina las cadenas A, B y C permanecen integradas en virtud de la presencia de dos enlaces disulfuro entre las cadenas (figura 1 1 4 ) .
estar disponible un conjunto completo de los aminohcidos precursores. Como consecuencia, cl proccso de secrecidn puede ser de lentitud relativa con relación a la demanda físiológica.
Las proenzimas facilitan la movilización rápida de una actividad en respuesta a la demanda fisiológica
forma madura con actividad fisiológica ejernplifica
¿Por qu$ cicrias proteínas se secretan en la forma inactiva? Algunas son necesarias practicamenlc en todo momento, mientras que otras (como las enzimas de la fomacidn y disolucilin del coágulo sanguíneo) se requieren sólo de manera intermitente. Más aún, cuando estas últimas se necesitan de urgencia, Ciertos procesos flsiologicos como la digestión son intermitentes, pero bastante regulares y predecibles (aunque éste pudo no ser el caso para los seres humanos primitivos). Otros, como la formacibn y disolución de coágulos sanguíneos y la reparación tisular, tan rolo deben estar "en Iinea", para responder a la presibn de una necesidad fisiológica o fisiopatológica. Puede apreciarse con facilidad que el proceso de formación y disoluci6n de coágulos sanguíneos debe ser coordinado en el tiempo para alcanzar Ia homeostasia. Además, la sintesis de proteasas como proteinas precursoras sin actividad catalítica sirve para proteger el tejido de origen (por ejemplo, el pfincreas) de la autodigestibn, lacual puede presentarse en lapancreaiitis. La sintesis de nuvo de las protehas que se requieren puede no efectuarse con la rapidez suficiente para responder a la presión de una demanda fisiopatolégica como es la pérdida de sangre. Más aun, debe
La activación de la proquimotripsina requiere de proteolisis selectiva El e.jernplo de conversihn de una proproteína a s u
los principios generales siguientes de tal conversión: 1) El proceso implica la proteblisis selectiva que, en algunos casos, sb10 requiere un cercenamiento proteolítico Único. 2) Los productos polipéptidos se pueden separar o permanecer integrados a la proteína madura. 3) El proceso puede (o no) cumplirse con cambio significativo en el peso molecular. 4) La principal consecuencia de la proteólisis selectiva es alcanzar una nucva conformación. 5) Si la proproteína es una enzima, el cambio mencionado en Ta conformación origina el sitio catalítico de la enzima.En taI virtud, la proteolisis selectiva de una proenzima puede verse como un proceso que desencadena cambios esenciales en la conformación que "crean" el sitio catalitico.
Obskrvese que mientras His 57 y Asp 102 se encuentran sobre el peptido B de la alfa quimotripsina, Ser 195 se encuentra sobre el peptido C (figura 1 1-3). La proteblisis selectiva de la proquimotripsina (quimotripsinógeno) facilita la aproximación de los tres residuos del sistema relevador de carga, lo cual muestra la manera en que la proteólisis selectiva da lugar al sitio catalítico. Nótcse que el contacto y los residuos
Figura 113.Convessi611de la proquimotripsina {pro-QT) a pi-quimotflpsina (pi-QT) y de manera subsecuente a la enzima madura alfa quimotripsina (alfa-QT) con actividad catalitica.
S-S
S-C
S-
S
Flgura 1 1 4 Enlaces de disulfuro intra e tntercadenas de la alfa quirnotripsina (alfa-QT).
cataliticos pueden localizarse sobre diferentes cadenas de péptidos, pero mantenerse a una distancia que permita formar enlaces con el sustrato enlazado.
EXISTEN MÚLTIPLES OPCIONES PARA REGULAR LA ACTIVIDAD CATAL~TICA Si una modificacibn fisiológica altera el grado de la actividad enzimatica, se puede preguntar si la cantidad de enzima ha cambiado o si la enzima es un catalizador más o menos eficaz. A todos los cambios de la actividad enzimatica sin modificación de la cantidad de enzima presente se les denominara como "efectos en la eficacia catalítica".
LA SEPARACIÓNDE ENZIMAS EN COMPARTlMlENTOS FACILITA LA R E G U L A C I ~ NDEL METABOLISMO No se puede pasar por alto la importancia de la disposicidn en compartimientos de Tos procesos metabhlicos en las ct5lulas eucariotas, que incluyen las de los mamíferos. La IocaZización de los procesos metabólicos especificas en el citosol o en los organelos subcelulares facilita la regulación de estos procesos independientemente de los que suceden en otras partes. La extensa formación de compartimientos de los procesos metabolicos tipicos de las formas superiores de vida confiere asi el potencial para un ajuste fino de la regulación del metabolismo. Al mismo tiempo, plantea problemas con respecto a lamovilizacion de metabolitos a través de las barreras de los compartimientos. Estos metabolitos pasan las barreras mediante "mecanismos de lanzadera", que convierten el metahlito en una forma permeable para la barrera del compartimiento, lo cual va seguido por el iransporte y la conversión a la forma original en el otro lado de la barrera. En censecuencia, estas interconversiones requieren, por ejemplo, formas citosólicas y mitocondriales de la misma actividad catalítica. Puesto que estas dos formas de la enzima están fisicamente separadas, su regulación independiente se facilita. En el capitulo 18 se
describe la función de los "mecanismos de lanzadera" para poder lograr el equilibrio de Ias confluencias metabblicas dc equivalentes reductores, del ciclo del hcido cltrico y de otros intermediarios anfibólicos.
LAS ENZIMAS PUEDEN FORMAR COMPLEJOS MACROMOLECULARES La organización de un conjunto de enzimas quecatalizan una secuencia de reacciones metabhlicas, coordina a las enzimas y a los canales intermediarios a lo largo de una via metabdlica. La alineacibn apropiada de las enzirnas puede facilitar la transferencia del producto entre las enzimas sin equilibrio previo con las confluencias metabblicas. Esto permite un modo más fino de control metabólico que el posible con los componentes aislados del complejo. Además, los cambios de confomacl6n en un componente del complejo puede transmitirse por interacciones de proteína con proDe este iriodo teína hacia otras ennimas del ~omple~jo. es posible laamplificacion de los efectos reguladores.
LAS CONCENTRACIONES LOCALES DE SUSTRATOS, COENZIMAS Y CATIONES PUEDEN REGULAR LAS ENZIMAS La concentracién intracelular media de un sustrato, una coenzima o un ion methlico puede tener escaso significado para el camportamiento rn vivo de una enzima. Es necesaria la informaci6n sobre las concentraciones de metabolitos esenciales en la vecindad inmediata de la enzima en cuestibn. Sin embargo, aun la medicibn de las concentraciones de metabolitos en compartimientos celulares diferentes no toma en cuenta las discontinuidades locales en su concentraci6n dentro de los compartimientos, causadas por factores como la proximidad al sitio de entrada o de producción de un metaboiito. Por último, generalmente se le da poca importancia a la discrepancia entre la concentracibn total y libre del metabolito. Por ejemplo, aunque la concentración total del 2,3-difosfoglicerato en los eritrocitos es extremadamente alta, la concentracidn
Enzimas: regulucidn de actividades
libre de bisfosfoglicerato (es decir, no unida a la h e m e globina) es comparable a la de otros tejidos. Consideraciones semejantes se aplican a otros metabolitos en presencia de proteínas que los fijan de modo eficaz y que reducen su concentracibn en estado libre. Una hiphtesis del enfoque cinético de MichaelisMenten es que la concentración del sustrato total es igual en esencia a la concentración del sustrnto libre. Como se anot6, esta suposicibn puede no ser vilida in vivo, donde es posible que las concentraciones de los sustratos libres se aproximen a las de la concentracibn de enzimas. Los iones metálicos que desempefian funciones catalíticas y estructurales en mas de una cuarta parte de todas las enzimas conocidas (capitulo 103, pueden tener tambien funciones reguladoras particularmente en las reacciones en que el ATP y otros polianiones son sustratos, Se observa la tlpica actividad mhxima cuando el cociente molar de ATP a metal es casi la unidad. El exceso de metal o de ATP son inhibitorios. Dado que los di y trifosfatos de nucleósidos forman complejos estables con los cationes divalentes, Ias concentraciones intracelulares de 30s nucle6tidos pueden influir sobre las concentraciones intracelulares de los iones methlicos libres y, por tanto, la actividad de ciertas enzimas.
CIERTAS ENZIMAS SON REGULADAS POR EFECTORES ALOSTÉRICOS La actividad catalítica de ciertas enzimas reguladoras es controlada por efectores alostericos de peso molecular bajo que por lo general tienen poca o ninguna semejan72 estructura1 con los sustratos o coenzimas para la enzima reguladora. La inhibición por retroalimentacibn se refiere a la inhibición de la actividad de una enzima inicial en una vía biosintktica, por medio de un producto final de esa vía. Para la biosíntesis de D a partir de A, catalizada por las enzimas En21 a Enq, Enzi EUQ
Eny
A+B+C-+
D
una concentraci6n alta de D, inhibitii de manera típica la conversion de A en B. Esto no implica un simple "retraso" de los intermediarios sino la capacidad de D para unirse a Enzl e inhibirla. Asi, D actúa como un efector alostérico negativo o inhibidor por retroalimentacihn de Enz,. Por tanto, la inhibicidn por retroalimentaci6n de Enzl mediante D regula la slntesis de D. De manera tlpica, D se une a la enzima sensible en un sitio alost4rico remato del sitio catalítico. La cinetica de la inhibición por retroaccion puede ser no competitiva, competitiva, parcialmente compe-
1.25
titiva, no acoplada o mixta. Es la más común en tas vias biosinttticas. Frecuentemente, el inhibidor por retroacciones es la ultima molkcula pequefia antes de una macromol~cula(por ejemplo, arninohcidos antes de proteínas o nucleótidos antes de ácidos nucleicos). La regulacibn por retroacción tiene Iugar generalmente en el paso mhs temprano, funcionalmente irreversible*, que es exclusivo para una serie biasintética particular. Un ejemplo muy estudiado es la inhibición de aspartato transcarbamilasa bacteriana por CTP (véase después y capitulo 36). Frecuentemente, una ruta biosintkticapuede estar ramificada, sirviendo la porción inicial para la síntesis de dos o mBs metabolitos esenciales. La figura 1 1-5 muestra los sitios probables de inhibición por setroacción simple en una vía biosintdtica ramificada (por ejemplo, para aminoácidos, purinas o pirimidinas). Los Si,S2y S3 son precursores de los cuatro productos finales (A, B, C y D). El S4 e5 un precursor de B y C y S, es precursor únicamente de D; de este modo, las secuencias:
constituyen sucesiones de reacciones lineales de las que puede esperarse sean inhibidas por sus productos finales. De nuevo, la biosintesis d e nucleotido (capitulo 36) proporciona ejemplos especificas.
Circuitos múltiples de retroalimentación regulan vías biosintéticas ramificadas Múltiples asas de retroalimentación (figura 3 1 4) proporcionan control fino adicional. Por ejemplo, si B se encuentra en exceso, disminuye el requerimiento de S.La capacidad de B para disminuir la producción de S2 confiere asi una ventaja biolbgíca. Sin embargo, si el exceso de B puede inhibir no 5610 la porción de la vía particular de su propia síntesis, sino tambitn porciones comunes a la de la síntesis de A, C o D, un exceso de B deberá reducir la síntesis de los cuatro productos finales. Claramente esto es indeseable. Sin embargo, existen mecanismos para evitar esta dificultad. En la inhibicidn por retroalimentación acumulativa, el efecto inhibidor de dos o mhs productos finales sobre una sola enzima reguladora es estrictamente aditivo.
* Uno favorecido fuertemente (en terminos termodinamicos) en una sola dirección, esto es, uno con un gran AG negativo
(Capítulo 11)
Flgura 11-5. Sitios de inhibicibn por cetroalimentaubn en una via biosintética ramificada. SI o S5 son intermediariosen la biosintesis de los prcdudos finales R a D, las flechas rectas representan las entimas que catalizan las conversiones indicadas. Las flechas curvas representan asas de relroalimentacibn e ~ndicanlos sitios probables de inhibicibn por retroalimentación medlante productos finales esnecificos.
En la inhibici6n por retroalimentaciónconcertada o multivalente, la inhibicibn completa se produce sólo cuando dos o más productos finales están presentes en exceso. En la inhibición por retroalimentación cooperativa, un solo producto final presente en exceso inhibe la enzirna regladora, pero la inhibición que se observa cuando se encuentran dos o m& productos finales excede, con mucho, a los efectos aditivos que se ven en la inhibición por retroalimentación acumulativa.
del ingles, cyfidine triphosphate}. Después del tratamiento con compuestos mercuriales, la aspartato transcarbamilasa pierde su sensibilidad a la inhibicion por el CTP,pero retiene su actividad completa para la slntesis del carbamilaspartato. Esto sugiere que el CTP esta unido a un sitio (alostérico) diferente del de cada sustrato. La ATCasa consiste en múltiples protómeros cataliticos y reguladores. Cada protómero catalitico contiene cuatro sitios aspartato (sustrato) y cadaprotbmero regulador por lo menos dos sitios CTP (reguladores}.
Los sitios catalíticos y alostéricos muestran diferencia espacial Monod observ6 la falta de semejanza estructural entre el inhibidor por retroalimentacibn y el sustrato para la enzima cuy a actividad regula. Dado que los efectos no son kocstéricos con un sustrato, sino alostéricos (ocupan otro espacio), este investigador propuso que las enzimas cuya actividad es regulada por efectores aIost&ricos(por ejemplo, los inhibidores por retroalimentacidn) fijan el efector en un sitio alostérica físicamente distinto del sitio catalítico. Las enzimas alostdricas son, pues, enzirnas cuya actividad en el sitio catalítico puede ser regulada por la presencia de efectores en un sitio atostérico. Varias pruebas apoyan
La enzima alosterica más estudiada es la aspartato transcarbamilasa La aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza la primera reaccibn peculiar a Ea biosintesis de las pirimidinas (figura 1 1-7). La ATCasa es inhibida por retroacción mediante el trifosfato de citidina (CTP, Carbami'-
fosfato
+
L-Aspartato
O
- o-C, II HzN
CHP I H
I
Figura ll4. lnhibicibn milltiple por retroalimentacidn por una via ramificada biocint&titica. Sobrepuestas a las asas de retroalimentaciónsimple (flechas curvas de guiones) estfin las asas de retroalimentacidnmúltiples (flechas curvas eontinuas) que regulan las enzirnas comunes a la biosíntesis de varios productos finales
4
o
'
c\
C
H
COO -
Figura 11-7. Reacción de la aspartato transcarbamilasa (ATCa sa) .
Emimus: regulación de actividades
127
la existencia de sitios alosttricos fisicamente distintos en las enzimas reguladas; entre ellas está la siguiente:
1 ) LE. eenzirnas reguladas, modificadas portkcnicac químicas o fisicas apropiadas, frecuentemente se vuelven insensibles a sus efectores alostkricos sin alteración de su actividad catalítica. La desnaturalización selectiva de los sitios alostéricos ha sido lograda mediante tratamiento con derivados del mercurio, con urea, rayos0X, enzima proteoliticas, fuerza ilinica o pH exmmos. envejecimientode O a 5 "C opor congelación o calentamiento. 2) Lo efectos alostéricos frecuentemente protegen el sitio catalitico de la desnaturalización en condiciones en las cuales los propios sustratos no lo hacen. Dado que parece inverosfmíl que un efector unido al sitio catalitico proteja cuando no lo hacen los sustratos, esto sugiere un segundo sitio alostérico en cualquier otra parte de la molkcula enzirnAtica. 3) En ciertas células mutantes, bacterianas y de mamíferos, las propiedades para ia regulacion de las enzimas reguladoras tienen modificadas sus propiedades para la regulacidn, pero sus propiedades catalíticas son idénticas a las del tipo nativo de donde deriv6 la mutante. Así, la estructura de Ios sitios alost&ricosy catalitica son geneticamente distintos. 4) Los estudios sobre uni6n de sustratos y de efectos alost&ricosa las enzima5 reguladas muestran que cada uno se puede unir independientemente del otro. S) En ciertos casos (por ejemplo, ATCasa), el sitio alostkrico se halla colocado en un protómero diferente al que posee el sitie catalitico.
Las enzírnas alostericas por lo general muestran una cinética sigmoidea de saturación con sustrato En la figura 1 1-8 se muestra la velocidad de reaccibn catalizada por una tipica enzima alosttrica medida a varias concentracianes del sustrato, en presencia y ausencia de un inhibidor alostdrico. Cuando este último falta, se observa una cindtica de saturacidn hioerbólica normal. En su presencia. la curva de sahraciiin por sustrato es dis&rsionada de una hipdrbola a una curva sigmeidea, que a concentraciones altas de sustrato puede coincidir con su forma hiperbdlica. Nótese la analogía de la relacion con las curvas de saturación de 0 2 de la rnioglobina y la hemoglobina (capitulo 7). El anhlisis cinktico de la inhibicibn por remalimentaci6n parece ser competitivo, no competitivo, pmcialmente competitivo de otros tipos. Si aconcentraciones
Figura 11-8. Curva sigmoide de saturación para el sustrato en presencia de un inhibidor alostérico.
elevadas de S, hay actividad comparable en presencia o ausencia del inhibidor aIostkrico, la cindtica superficialmente se parece a la de una inhibicibn competitiva. Sin embargo, dado que la curva de saturacibn por el sustrato es sigmoide y no hiperbólica, no es posible obtener resultados significativos graficando los datos para la inhibicibn alostérica por la tkcnica del doble recíproco. Este método de análisis fue elaborado para la inhibicibn competitiva con el suskato en el sitio catalítico. Puesto que los inhibidores alost&ricosactúan en un sitio diferente (alóstérico), el modelo cinético ya no es válido. El carácter sigmoide de la curva de v respecto a [S] en presencia de un inhibidor alostérico, refleja el fenómeno de cooperatividad. A bajas concentraciones de sustrato, la actividad en presencia del inhibidor es baja con relacibn a la que se observa en su ausencia. Sin embargo, cuando [S] aumenta, el grado de inhibición se vuelve m e w s intenso. Estas cinéticas son congruentes con la presencia de dos o más sitios de uni6n de sustrato que actuan reciprocamente, donde la presencia de una molécula de sustrato en un sitio catalitico facilita la unión de una segunda molkcula del mismo en un segundo sitio. La cooperatividad de la fijacibn del sustrato se describid en los capitulos 7 y 9: la curva sigmoide de saturación de Oz se forma a consecuencia de las interacciones cooperativas entre cuatro sitios de fljacj6n de oxígeno que se localizan en los diferentes protbmeros de hemoglobina y en el uso de la escala de Hill para cuantificar la cooperatividad.
(Capítulo I 1)
Los efectos alostéricos pueden ser en Kmo sobre,,Y , La referencia a fa cinktica de la inhibición como "competitiva'k ''no competitiva" respecto al sustrato lleva implicaciones mecanicistas que son desorientadoras. Es preferible referirse a dos amplias clases de enzimas reguladas, las de la serie K y las de la serie V. Para !as mzimas alostkricas de la serie K, la cinética de saturacibn por sustrato es competitiva en el sentido de que Kmse eleva sin efecto alguno sobre Vmk.Para las enzimas de la serie V el inhibidor alostdrico abate V , sin afectar la Km aparente. Probablemente las alteraciones en Kmo en V , resultan de cambios conformacionaies en el sitio catalitico, inducidos por Ia fijacion del efector alostérico en el sitio alostérico. Para una enzima alostérica de la serie K, este cambio en la conformación puede debilitar los enlaces entre el suctrato y los residuos que se fijan a &l.Para una de la serie V, es posible que el efecto primario sea alterar la orientacion o la carga de los residuos cataliticos, de modo que V,,, disminuya. Sin embargo, se pueden observar efectos intermedios sobre Kmy Y ,, consecutivos a estos cambios en la confomacibn.
LA REGULACIÓN POR RETROALIMENTACI~N,NO ES SINÓNIMO DE INHIBICIÓN POR WETROALIMENTACIÓN En ambas clases de ctlulas, de mamíferos y bacterianas, los productos finales retroalimensan y controlan su propia síntesis. En muchos casos, esto involucra la inhibicibn por retroalimentacibn de una enzima biosintCtica inicial. Sin embargo, se debe distinguir entre regulacibn por retroalimentaci6n, un termino fenomenol~gicoexento de implicaciones mecanísticas, e inhibición por retroalimentación, un mecanismo para fa regulación de numerosas enzimas bacterianas y de mamíferos. Por ejemplo, el colesterol de la dieta restringe la sintesis de1 procedente de acetatos en los tejidos de los mamíferas. No obstante, esta regulación al parecer no hace intervenir a la inhibicibn por retroalimentacidn de una enzima inicial de la biosintesis del ~olesterol.Una enzima inicial (HMG-COA reductasa) es afectada, pero el mecanismo comprende la interrupción de la expresibn de los genes que codifican para la formacibn de la HMG-Coh reductasa mediante el colesterol o un metabolito derivado de él. El colesterol agregado directamente a la HMG-COA reductasa no tiene efecto sobre su actividad catalitica.
La fijación cooperativa de un sustrato confiere una ventaja fisiológica Las ventajas de la cinCtica de fijación cooperativa de3 sustrato son anklogas a aquetlas que se producen por la fijación cooperativa del O? a Ia hemoglobina. h concentraciones bajas de sustrato, el efector alostérico es un inhibidor eficaz. De este modo, la regulación es más eficiente en el momento en que la necesidad es máxima, es decir, cuando la concentración intracelular de los sustratos es baja. Si se comienza a disponer de más sustrato, entonces es menos necesaria una regulación rigurosa. Cuando la concentración del sustrato se eleva, el grado de inhibicion disminuye y se formauna cantidad mayor de producto. Al igual que con la hemoglobina, la curva sigrnoide de saturacion del sustrato en presencia del inhibidor también asegura que cambios relativamente pequefíos en la concentraci6n del sustrato ocasionan grandes modificaciones en la actividad. Asl, se logra un control sensible de la actividad catalitica mediante cambios pequefios en la concentración del sustrato. Finalmente, por analogla con las diferencias en l a curvas de saturacion de 01 de hemoglobinas de diferentes especies, las enzimas reguladoras de orígenes distintos pueden tener curvas sigmoideas de saturacibn desplazadas a la izquierda o a la derecha para acomodarse a los llmites de las concentraciones de sustrato que prevalecen in vivo.
LA MODIFICACIÓMCOVALENTE REVERSIBLE REGULA ENZIMAS ESENCIALES DE MAM~FEROS La modulacibn reversible de laactividad catalitica de las enzimas puede producirse por la adherencia covalente de un grupo fosfato a uno o mhs residuos Ser, Tri, Tir o His. Las enzimas que experimentan modificacibn covalente con regulacilin concomitante de su actividad se denominan "enzimas interconvertibles". Las enzirnas interconvertibles existen en dos condiciones de actividad, una de eficacia catalítica elevada y otra de baja eficacia. Dependiendo de la enzima de que se trate, el catalizador más activo puede ser la fosfoenzima o la que no posee grupo fosfato (cuadro 1 1-1).
Las enzirnac pueden tener numerosos sitios de fosforilación Un residuo seril especifico es fosforilado, formando el O-fosfoseril o un residuo tirosil es fosforilado para formar el residuo O-fosfotirosil. Aunque una enzima interconvertible puede contener muchos residuos Ser o Tir, la fosforilación es sumamente selectiva y se produce s61o en un pequefio nUmero de sitios posibles. Probablemente estos sitios no f m e n parte del sitlo
E m i m m : reqialacihn de actividades
"
>
Cuadro 1 1-1. Ejemplos de enzimas dc mamíferos cuya actividad catalítica está alterar'acihn-de!
-
-
izime
A<
,arboxilasa
GI
ntasa
I'iruvalo deshrdrogcnasr HMG-COA ri Glucbpcno fc
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Rnjo
Alto
11.P 1;. 1'
f
Citratoliiisii l'cisforil¿isnb L I I I ~ M IIMG-COA reductnsa cinnsa
--
E. dcslosforocn7ima; EP, fosfuenzimn.
catalítico, ciiando menos en lo que se refiere a la estructura. primaria, por lo cual constituyen otro ejernplo de iin sitio alosterico.
Las prateinas cinasas y las fosfatasas son proteinas convertidoras La fosforilaci0n y la desfosforilacion son catalizadas por una variedad de proteínas cinasas y proteina fosfatasa (proteinas ctinvertidoras), respectivamente (figura I 1-9). l.a capacidad de estas proteínas cfnasac para reconocer figuras o patrones distintivos de la estructura primaria esta relacionada en parte, con su alta especificidad. En casos especificas, las mismas protefnas convertidoras pueden ser enzimas convertibles (cuadro 1 1 -1 ). De este modo hay proteína cinasa y prcrfeina cinasa fosfatasa que catalizan la interconversicin de estas ~roteinasconvertidoras. Las tiruebas de que las proteha fosfatasa sean proteínas interconvertibles son menos convincentes, aunque su actividad es regulada. La actividad de la proteina cinasaestli regulada y, lo mismo que la de la proteina fosfatasa, csth baja control hormonal y neurolbgico, si bien los detalles precisos por los cliales estos agentes actúan están lejos de ser claros en la mayor parte de los casos. ATP
129
ADP
La fosforilacion-desfosforilación consume ATP Las reacciones de la figura 1 1-9 se parecen a las de la interconversión de gIricasa y gIucosa 6-fosfato o de fructosa-6-frrsfatoy fnictosa- l,6-difosfato (capitulo 1 4). El resultado neto de la fosforilaci6n y luego de la desfocforilación de 1 m01 de sustrato (enzima o azúcar) representa la hidrálisis de 1 mol de ATP. Las actividades de Ias cinasas, que catalizan las reacciones 1 y 3 (abajo), y de lac fosfatasas, que catalizan las reacciones 2 y 4, deberhn, en sí mismas, ser reguladas, porque de otra manera podrian actuar juntas para catalizar de modo incontrolable la hidrolisis del ATP.
,-
* ATP
+
ADP
+
Glucoca-fi-P
2. HzO + Glucosa-6-P + Pi + Glucosa Neto: HzO + ATP 3. Enz-Ser4i-I
+ ADP * Pi + ATP +ADP * E n z 4 e r 4 - P
4. HzO + Enr-Ser-O-P
---
Neto: H2O + ATP
4 ADP
-+
Pi + E n z 4 e r 4 H
+ Pi
La modificación covalente regula el flujo del metabolito La regulación de la actividad enzimática por medio de la fosforilación-desfosforilación tiene analogías con la regulacion mediante la inhibicibn por retroalimentaci~n. Ambas proporcionan una regulación a corto plazo, fhcilmente reversible, del flujo de metabolitos en respuesta a señales fisioldgicas específicas; actúan sin alterar la expresión gendtica; actúan cobre enzimas tempranas de una prolongada secuencia metabólíca (a meniido biosintética} y en los sitios alostéricos más que en los cataliticos. Sin embargo, la inhibición por retroacciiin incluye a una sola proteina y carece de las caracteristicas hormonales y neuroIógicas. Por el contrario, la regulación de las enzimas de los marniferos por fosforilacilindesfosforil ación comprende a varias proteinas y ATP estk bajo directo control hormonal y ncurol6gica.
RESUMEN Figura 11-9. Modificacibn covalentede una enzima regulada por la focforilación-desfosfonlacibnde un residuo ser11
La regulaciiin de la actividad enzimática contribuye en gran parte a preservar la homeostasia que mantiene
1311
Bioquímiea de Hurper
un entorno intracelular e intraorganismo relativamente constante en presencia de arnpl iaq fluctuaciones en el medio ambiente externo (como cambios de temperatura, presencia o ausencia de agua o tipos específicos de alimentos). Para lograr la homeostasia, las velocidades de numerosas reacciones bioquímicas deben responder a la necesidad físiolbgica. ¿Cómo se logra este propósito? Las concentraciones locales de sustrato, Ia separacibn de enzimas en compartimientos y la secrecibn como proenzimas o cimiigenos (por ejemplo, quimotripsina) sin actividad catalitica, contribuyen a la regulacibn de los procesos metabólicos. Muchas proteasa y otras proteinac se secretan como proproteínas biol6gicamente inertes que deben someterse a un desprendimiento proteolitico selectivo para formar una enzima u hormona con actividad biológica. Los ejemplos incluyen quirnotripsina, insulina y las proteasas de las cascadas de la formacibn y disolucibn de los coagulos sanguíneos. La secrecibn, como precursor inactivo, protege contra su acci6n hasta que surge la necesidad, al mismo tiempo que facilita la movilización rhpida de una actividad sin que se requiera nueva sintesis de la proteina. Uno o más procesos proreoliticos desencadenan cambios en la conformación, los cuales aproximan y alinean 30s residuos previamente distantes para formar el sitio catalítico. Los pkptidos que se forman por la proteblisis selectiva pueden descartarse (qjernplo, dos dipéptidos de QT) o pueden permanecer unidos mediante enlaces disulfiro (los peptidos A, B, y C de la QT y las cadenas A y B de la insulina). Además, las alteraciones rhpidas y minimas en la actividad catalitica de enzimas clave reguladas tienen funciones importantes en la canalizacibn selectiva de metabolitos hacia uno u otro proceso metabólico. Las enzimas reguladas tienden a ser aquellas que catalizan una reaccibn inicial única (con frecuencia la primera) de una secuencia detenninada de reaccionw metaMlicas. La actividad catalitica de las enzimas reguladas puede modularse (por qjernpto, cambios repetidos entre estados bajo y alto de actividad catalitica) cuando no hay nueva síntesis ni degradaciiin proteinica. La modu-
lacibn se logra cuando metabolitos específicos se fijan a la enzima regulada, en general a sitios (alost&rfcoc) bastante separados del sitio catalitico. La modulación de la actividad enzimbtica por cambios en la conformación del sitio catalitico puede incluir la alteración de Kmpara un sustrato, de V,,, para la reacción global o efectos sobre los dos, Km y V,,. A menudo, las curvas de saturacibn de sustrato para la inhibición aIostéríca son sigmoideas, por lo cual no se aplica la ecuación de Michaelis-Menten. La evaluacibn cuantitativa de la cooperatividad de las enzimas alostericas utiliza la ecuacicin de Hill. Para procesos biosintéticos, la inhibicibn por retroalimentaciOn incluye metaboiitos reguladores, que se encuentran en la biocintesis "corriente arriba" de la enzima regulada (por ejemplo, inhibición de la aspartato transcarhomilasa por CTP). En secuencias de reacciones catabólicas, metabolitos "corriente abajo en la biodegradacion" de la enzima en cuestibn actúan como reguladores (como la inhibición de fosfofructocinasa por ATP o citrato). Cuando más de un metabolito puede regular por retroalimentación a una enzima dada, la accion de estos metabolitos reguladores múltiples puede ser acumulativa, cooperativa o multivalente. Adernris, un metabolito dado puede regular la actividad de varias enzimas, cada una de ellas única para una secuencia particular de reacciones rnetabálicas (asas múltiples de retroalimentacibn). En el ser humano y otros eucariotes, la actividad de numerosas enzimas es regulada por modificacibn covalente, siendo la forma más cornun la fosforilacibn dependiente de ATP con elirninaci6n hidrolitica de fosfato como ortofosfato inorgánico. La fosforilación selectiva y la desfosforilaciiin subsiguiente, cn parlicular de residuos específicos de Ser o Tír, son catalizados por proteínas cinasas y proteínas fosfatasas (cnzimas convertidoras). A su ve& la actividadde estas en7imasconvertidoras puede ser regulada. Por tanto, la enzima blanco y sus enzimas convertidoras pueden constituir una porcibn de una cascada reguladora que responde a una sefial disparada por una hormona o por un segundo mensajero como cAMP. II
REFERENCIAS Crabtree B, Newsholme EA: A systcmatic approach to
describing and analyzing metabolic control systerns. Trends Biochcm Sci 1987;12:4. Falfvey E, Schibler U: How are the regulators rcgulatcd? Ped Am Soc Exp Riol J 1990;5:309 Harris RA et al.: Molecular cloning of h e branched-chain a-ketoacid dehydragenase kinase and the COA-dependcnt methylmalonate semialdehyde dehydrogenase. Adv Enzume Regul 1993;33:255.
Johnson LN, Barford D: The effect ofphospho~lationon the structure and function of protcins. Annu Rev Riophys Biomol Stnict 1993;22:199. Kacser H,Porteus JW: Control of metabolism. What have we to rneasurev l'rends 13iochem Sci 1987;12:5. Kennelly PJ, Krebs EG: Consensus sequences as substrate sptcificity determinants for protcin kinases and protein phosphatascs. J Bio! Chem 199 1,266:15555.
Enzlmas: regulación de decf ividade.~ 13 1
Pilkis SJ et al.: 6-Phosphofructo-2-kinascJfructose-2,6-
bisphosphatase: A rnetabolic signaling enzyrne. Annu Rev I3iochem 1995;64:799. Roach FJ: Multisite and hierarchical protein phosphorylation. J Biol Chcm 1991;266 14239. Schlesinger MJ, Hershko A: The Ijhiquiiin System Cold Spring Harhour Press. 1988.
Scriver CR et al. (editors): The Metabolic Basis of lnheriied Disease, 6th ed. McGraw-1 lill, 1995 Soderling TR: Role of hormones and protcin phosphoryla-
tion in metabolic re@lation. Fed Proc 1982:41:2615. Stadtman ER, Chock PB (editors): CUrrent Topics in (:ellarlar Hegulatinn. Academic, 1969 to the preseni Weber G (editor): Advances in Enzyme Regulalion. Pcrgarnon Press, 1963-present.
Bioeneraetica: la función de AñP +ir
Peter A. Mayes, PhD, DSc
La bioenergética o termodinhrnica bioquimica, es el estudio de los cambios de energía que acompaíían a las reacciones bioqulmicas. Proporciona los principios que explican la causa de que algunas reacciones puedan producirse en tanto que otras no. Los sistemas no bioldgicos pueden utilizar la energia calorífica para realizar trabajo, pero los sistemas bioIbgicos son en esencia isotbrmicos y emplean la energla química para energizar el proceso de la vida.
IMPORTANCIA BIOQU~MICA Para proveer la energia que capacite a! ser vivo para llevar a cabo sus procesos normales, se requiere un combustible adecuado. Entender la forma en que los organismos obtienen esta energía de sus alimentos basico para comprender la nutrici6n y el metabolismo nomales. La muerte por inanicibn se produce cuando las reservas energeticas disponibles se agotan y ciertas formas de desnutrición se relacionan con un desequilibrio de la energía (marasmo). El índice de emisión de energía, medida por el indice rnetab6lic0, se controla por las hormonas tiroideas cuya disfuncion es una causa de enfermedad. El almacenamiento excesivo del suministro de energia produce obesidad, una de las enfermedades más frecuentes de la sociedad occidental.
Los sistemas biológicos cumplen con las leyes generales de la termodinámica La primera ley de la termodinhrnica establece que Ta energía total de un sistema, incluyendo la de su entorno, permanece constante, ksta es también la ley de la conservacibn de la energia. Implica que durante cualquier cambio dentro del sistema completo, w se pierde ni se gana energia. Sin embargo, dentro de ese sistema total, la energía puede transferirse de una parte a otra o puede transformarse a otm forma de energia. Por ejemplo, Ia energia química puede convertirse en calor, electricidad, energia radiante o energía mecánica en los sistemas vivos. La segunda ley de la termodinámica establece que si un proceso se produce espanthneamente, la entropia total de un sistema debe aumentar. La entropia representa e1 grado de desorden o lo fortuito del sistema y se torna mfixima en un sistema cuando &te se aproxima at equilibrio verdadero. En condiciones de temperatura y presibn constantes, la relaci6n entre el cambio de energia libre (AG) de un sistema en reacci6n y el cambio de la entropia (AS) estfi dada por la siguiente ecuación, que combina las dos leyes de la termodinhica:
LA ENERG~ALIBRE ES LA ENERG~A UTIL EN UN SISTEMA El cambio en la energia libre (AG) es esa porci6n del cambio de la energía total de un sistema que está disponible para realizar trabajo; es decir, la energía iitil, conocida tarnbikn en los sistemas químicos como potencial qilimica.
donde hH es el cambio de la entalpía (calor) y T es la absoluta. Bajo las condiciones de las reacciones bioquímicas, debido aque A-3 es aproximadamente igual a AE, que es el cambio total en la energía interna dc la reacción,
la relacibn anterior puede expresarse de la manera siguiente:
Si AG es de signo negativo, la reacción procede de manera espontánea con pdrdida de energla libre, es decir, es exergónica. Cuando, adembs, AG es de gran magnitud, la reaccicín se dirige virtualmente a su consumaci6n y es esencialmente irreversible. Por otra parte, si AG es positiva, la reaccidn procede s61o si puede ganarse energia, es decir, es endergónica. Si, ademas, la magnitud de AG es grande, el sistema es estable con poca o ninguna tendencia para que se produzca una reaccibn. Si AG vale cero, el sistema esta en equilibrio y ningUn cambio neto tiene lugar. Cuando los reactantes esthn presentes en concentraciones de 1 .O mol!L, AG' es el cambio de la energia libre esiandar. En las reacciones bioquímicas. una condicióti estándar se define con un pH de 7.0. El cambio de la energia libre estlndar a este pH se designa por AG". Puede calcularse a partir de la constantedeequilibrio K',
AG*'= - 2.303 RT log Ks, donde R es la constante de los gases y T es la temperatura absoluta (capítulo 9). Es importante destacar que la 3G real puede ser mayor o menor que AG", segiin la concentracion de los diversos reactantes, incluso el solvente, varios iones y proteinas. En un sistema de reacciones bioquimicas, debe apreciarse que una enzima s61o las acelera hasta liegar al equilibrio: esto nunca modifica la concentracion final de los reactantes en equilibrio después de su desprendimiento de la enzima.
calor, los t$minos químicos nomiales exotémico y endotermico no pueden aplicarse a estas reacciories. En su lugar, se emplean las palabras exergunico y endergbnico para indicar que un proceso se acornpafia con perdida o ganancia, respectivamente, de energía libre, independientemente de la forma de energia de que se trate. En la prhctica, un proceso endergónico no puede existir solo, sino que debe ser un componente de un sistema acoplado exergónico-endergónico donde el cambio neto global es exergonico. Las reacciones exergiinicas constituyen el cata bolismo (degradacion u oxidacián de moléculas combustibles), en tanto que las reacciones sintéticas que fuman sustancias se denominan anabolismo. El conjunto de procesos catab6licos y anabblicos constituye el metabolismo. Si la reacción mostrada en la figura 12-1 se mueve de izquierda a derecha, e\ proceso global debe estar acompaiiado por pérdida de energia libre como calor. Puede concebirse un mecanismo posible de acoplamiento si un intermediario comun obligatoria (I)toma parte en ambas reacciones, es decir,
En los sistemas biolbgicos, algunas reacciones exergónicas y endergbnicas estan acopladas de esta manera, DeberA apreciarse que este tipo de sistema tiene incorporado un mecanismo para el control biotogico de la velocidad a la cual se permite que se produzcan los procesos oxidativos, ya que la existencia de un intermediario común obligatorio para las dos reacciones, exergbnica y endergbnica, deja que la velocidad de utilizacibn del producto de la vla sintetica (D)determine por acci6n de masas Ea velocidad
Calor
LOS PROCESOS ENDERGONICOS SE LOGRAN POR ACOPLAMIENTO A PROCESOS EXERGON~COS Los procesos vitales -como las reacciones sintéticas, la contracción muscular, la conduccione~de impulsos nerviosos y el transporte activo- obtienen energía por enlace quimico o acoplamiento, con las reacciones oxidativas. De manera más simple, este tipo de acoplamiento puede ser representado como se muestra en la figura 12-1. La conversibn del metabolito A al metabolito B produce energia libre. Esta se acopla con otra reacción, en la cual se requiere energia libre para convertir el metabolito C al metabolito D. Como parte de la energia liberada en la reacci6n degradativa se transfiere a la reaccibn sinte-tica en forma diferente al
Energía qulmica
Figura q2-1. Aco'plamiento de una reaccidn exergbnica y una endergbnica.
n la cual A es oxidado. De hecho, estas relaciones proporcionan una base para el concepto del control respiratorio, proceso que evita que un organismo
fuera de control se incendie. Una extensión del concepto de acoplamiento lo dan las reacciones de deshidrogenación. que están acopladas a hidrogenaciones por iin portador intermediario (figura 12-2). U n metodo alterno de acoplar un proceso exergónico a unti enderghnico es sintetizar un compuesto con alto potencial energético en la reaccion exergonica e incorporar cstc nuevo compuesto a la cndergbnica, efectuando así una transferencia de energía libre de la via exerg~nicaa la endergónica. En la figura 12-3, -@ es un compuesto con un alto potencial energetico y @ cs el compuesto correspondiente con bajo potencial enercélico. I,a ventaja biológica de este mecanismo es que u -@, al contrario de 1 en el sisten~aanterior, no necesita tener una estructura seme-jante a A, R, C o D. Esto J actuara como transductor de energía perm itiria que K desde una amplia gama de reacciones exerglinicas a un igualmeiite extenso grupo de rcnccioncs o procesos endergónicos, como se muestra en la figura 1 2 4 . Por otro lado, en la cdlula viva, el principal compuesto intermediario o portador de alta energía (designado es el trifosfato d c adcnosina (ATP, del iriglés. ~r(ic~i7osine f ripho.~phate).
-a)
LOS FOSFATOS DE ALTA ENERG~A DESEMPENAN UNA FUNCIÓN PRINCIPAL EN LA CAPTURA X TRANSFERENCIA
DE ENERGIA Para conservar los procesos de la vida, todos los organismos debcn obtener suministros de energia libre a partir de su entorno. Los orgmisinos autótrofos acoplan su metabolismo a aEgiin proceso exergónico simple en su entorno; por .ejemplo, las plantas verdes utilizan la energía de la luz solar y ciertas bacterias autotrofas utilizan la reacción FeZ' -r Fe3'. Por otro lado, los organismos heterbtrofos obtienen energia libre mediante el acoplamiento de su metabolismo a la rotura de moléculas orghnicas cornple-jas procedentes de su
Figura 12-3. Transferencia de energla libre de una reacción exergonica a una endergbnica a travhs de la formación de un compuesto de alta energía.
entorno. En todos estos organismos, el ATP desempefia una funcihn en la transferencia de la energia libre de las reacciones exerg~nicasa las endergíinicas (figuras 12-3 y 124). El ATP es un nucleiitido especiaIizado que contienc adenina, ribosn y tres grupos fosfato. En sus actividades celulares, funciona como un complejo con Mp7+(figura 12-51. La imporiancia de los fosfatos en el metabolismo intermedio se hizo cvidente con el descubrimiento de los detalles quiniicos de Ia glucólisis y de la función del ATP, del difosfato de adenosina (ADP, dcI inglés, udenosine djphosphuie) y del fosfato inorghnico (P,) en este proceso (capítulo 19). El ATP se considerh
Proceso enderg6nlco
Excitacibn nerviosa
activo
Figura 12-2. Acoplamiento de las reacciones de deshidrogenactbn e hidrogenacrón mediante un portador tntermediario
Figura 12-4- Transduccibn de energla a los procesos biolbgiees que la requieren (endergbnims) a través de un compuesto común de alta energia
138
Bioquimica de Harper
se debe a la carga de repulsilin de los ritomos de oxigeno adyacentes, con carga negativa y a la estabilización de los productos de la reaccion, especialmente fosfatos, como híbridos de resonancia. Orros compuestoc de importancia bíologica que se clasifican como "compuestos de altaenergia" son tioésteresentre losquese encuentran ésteres de la coenzima A (por ejemplo, acetil-COA), proteínas acilportadoras, esteres de aminoácidns que participan en la síntesis proteínica, S-ad~nosilmetionina (metionina activa) UDPGIc (uridindifosfato glucosa) y PRPP (S-fosforrihosi 1-pirofosfato). Figura 12-5. El trifosfato de adenosina se muestra aquí como un complejo de magnesio. El ADP forma u n complejo similar con ~ g ~ ' .
como un medio de transferir radicales fosfato en el proceso de la fosfonlacion. La función del ATP en la energdtica bioquimica fue descubierta en experimentos que demostraron que el mencionado ATP y la fosf'ocreatina eran degradados durante la contraccion muscular y que su síntesis ulterior dependia del suministro de energia procedente de procesos oxidativos en el rnUcculo. No fue sino hasta que Lipmann introdu-jo el concepto de "fosfatoc de alta energia" y el de "enlace fosfato de alta energia", que la función de estos compuestos en hioenergdtica se apreció con claridad.
El valor intermedio para Ia energía libre de la hidrólisis de ATP comparado con el de otros organofosfatos tiene un importante significado bioenergético En el cuadro 12-1 se muestra la enesgla libre esthndar dc la hidrólisis de varios fosfatos importantes desde el punio de vista bioquirnico. Es posihEe obtener el c8lculo de la tendencia comparativa de cada uno de los grupos dc fosfatos para transferir energia a un aceptor adecuado, a partir de los AG"' de su hidrólisis (medido a 37 "C). En et cuadro se puede observar que el valor de la hidról isis del fosfato terminal del ATP divide la lista en dos grupos. Uno, de fosfatos de baja energía, e~jemplilicadopor los fosfoksteres intermediarios de la gIucolisis, tiene valores AGO' menores que el del ATP, en tanto que en el otro grupo, designado fosfatos dc alta energia, el valores igual o misalto queel del ATP. Los componentes de este ultimo grupo, incluyendo al ATP y al ADP, por lo general son anhidridos (pos ejemplo, el I -fosfato del 1,3-difosfoglicerato), enolfosfatos (corno el fos.foenolpiruva2o)y fosfoguanidinas (por ejemplo, focfato de creatina, fosfato de arginina). La posicicin intermedia del ATP le permite desernpefiar una fi~nciánimportante en la transferencia de energía. El alto cambio de energía libre en la hidrólisis de ATP
Los fosfatos de alta energia se designan por el símbolo
-@
Lipmann introdujo el slmbolo -@, para indicar la presencia del enlace fosfato de alta energia. El simbolo seiiala que cl grupo adherido al enlace, en la transferencia a un aceptor apropiado, traspasa la mayor cantidad de energia libre. Por esta razlin algunos prefieren el termino "potencial d e transferencia de griipo" al de "enlace de alta energia". Asi, el ATP cnntiene dos grupos fosfato de alta energia y el ADP contiene uno, mientras que el enlace fosfato del AMP (monofosfato de adenosina) es del tipo de baja energia ya que se trata de un enlace Cster normal (figura 1 2 4 ) .
Cuadra 12-1. Energía libre estlindar de la hidr6lisis de algunos fosfatos orgánicos e import:incia bioc -" --
--
---AA~
l
rompuesto
Fosfocnolpiruvato CarbamillFisFato 1,3-Diti)sfi~gIliccrato f a glicerato) Fosfocreatin~
I'P -+ ADP A11I' + AMI ,. .+
I'il '010S1iit0
Gl ucosa I-fo!sfato Friuctusa h-fosfato AFvil' G1ucosa 6-foi G1icerol 3-fo!
-
* P i, ortofosfatc
+ Valores de ATP y ntms rnbs tomados de Krebs y Krirnberg (1957). Los valores difieren entre investigadores según las situacioncs precisas bajo la cuales se efeclunron las mediciones.
I Adenosina - O -
P-0-P-O-P-0-
II
11
o
Fosfoenol piruvato
I
I
o
1,3-Difosfogliceratc
Fosforilación oxidativa
II
o
Trifosfato de adenoslna (ATP)
I
Adenosina - O - P - O
H
-
a o Adenosina
1
P- OII
O
-@-@
Disfosfato de adenosina (ADP)
I Adenoctna - O - P
11
- O-
o o Adenosina
- '@ Otras fosforilaciones,
Monofoslato de adenosina (AMP)
activaciones y procesos endergbn~cos
Figura 12-6. Estructuras del ATP, ADP y AMP que muestran la posición y el número de fosfatos de alta energía
(a)
\
//
Glicerol 3-fosfato Glucosa 6-fosfato Glucusa 1.6difosfato
LOS FOSFATOS DE ALTA ENERG~AACTUAN COMO LA "ENERGIA CIRCULANTE" DE LA CELULA Como consecuencia de su posición media en la lista de energías libres cstándar de la hidrblisis (cuadro 12-1 ), el ATP puede actuar como donador de fosfato de alta energía para formar aquellos compuestos que están después de él en Ia lista. Asimismo, el ADP puede aceptar fosfato de alta energía proveniente de aquellos compuestos que estén en la parte superior del cuadro, para formar ATP, siempre y cuando se disponga de la maquinaria enzimlitica adecuada. En efecto, un ciclo ATPIADP conecta los procesos que generan *a las reacciones que lo utilizan (figura 12-7). As[, el ATP se consume y regenera de manera continua. Esto tiene lugar a una velocidad muy rápida, dado que el depósito ATP/ADP total es en extremo pequeno y suficiente para mantener un tejido activo s61o durante algunos segundos. Hay tres ruentes principales de -@, que toman parte en la conservación o captura de la energía: 1) Fosforilaci6n oxidativa: Ésta es la fuente los organismos cuantitativa mayor de -@en aerobios. La energía libre para conducir este proceso procede de la oxidacibn de la cadena
Figura 12-7. Función del uclo ATPlADP en la transferencia de fosfato de alta energia. Obdrvese que @no existe en un estado libre sino que es transferido en las reacciones que se muestran
respiratoria empleando O? rnolecular dentro de Ias mitocondriats (capítulo 13). 2) GIucblisis: Hay una t'ormacibn neta de dos @como resultado de la formación de Iactato a partir de una mol8cula de glucosa, generados en dos reacciones catalizadas por la fosfoglicerato cinasa y la piruvatocina, respectivamente (figura 19-2). 3) Ciclo del hcido cítrico: En el ciclo se genera un directamente en el paso catalizado pos la succinil tiocinasa (figura 18-3).
a,
Otro grupo de compuestos fosfhgenos representado en el cuadro actúan como formas de almacenamiento de fosfato de alta energía. En éste se incluye a la fosfocreatina, que existe en el músculo esquelético, en el com6n, los ecpermatomides y en el cerebro de los vertebrados, y la fosfoarginina, que s61o se encuentra en el músculo de los invertebrados. En condiciones fisiológicas, esta reaccilin permite que las concentraciones de ATP se conserven en el m.iisculo, aunque esté utilizindose rhpidamente, porque la fosfocreatina
I4O Biquímica de Harper
(Capítulo 12)
sirve como fuente de energía para la contraccion muscular. Por otra parte, cuando el ATP es abundante, su concentración puede funcionar como almacén de fosfato de alta energia (figura 12-8). En el muscrilo, se ha descrito una lanzadera de fosfato de creatina que traslada fosfato de alta energía de las mitocondrias al sarcolema y que actua como un amortiguador del mismo {figura 14-16). En el miocardio, este amortiguador puede ser importante para proveer una protección inmediata contra los efectos del infarto. Cuando el ATP actiia como donador de fosfato para formar aquellos compuestos de menor energia libre de la hídrólisis (cuadro 12-11, el grupo fosfato es convertido invariablemente en otro de baja energía, por ejemplo:
-@)a
-@ Glicerol -@ + Adenosina - @ - @
Glicerol + Adenocina
de la glucosa. Tal reaccihn es la hidrblisis del fosfato terminal del ATP. (2) ATP
t ADP
+ P (AG"=
- 30.5 kJlmol)
Cuando (1) y ( 2 ) se acoplan en una reacción catalizada por la hexocinasa, la fosforilación de la glucosa avanza con facilidad en una reaccibn altamente exergónica que en condiciones fisiolbgicas dista mucho del equilibrio y, por tanto, es irreversible para propbsitos prhcticos.
Glucosa + ATP 9-
Glucosa 6-fosfato + ADP (AG"= - 16.7 kJlmol)
Muchas reacciones de "activación" siguen este modelo.
El ATP permite el acoplamiento de reacciones desfavorables en el aspecto termodinámico con otras favorables La energktica de las reacciones acopladas se describe con m& detalfe en las figuras 12-1 y 12-3. Tal reacción es la primera en la vía de glucólisis (figura 19-2), la fosforilación de la glucosa a glucosa 6-fosfato, que es endergónica por excelencia y que, en condiciones fisiológicas, podria no proceder en esa forma.
La adenilil cinasa produce la interconversión de nucleótidos de adenina La enzima adenilil cinasa (miocinasa) esta presente en la mayoria de las células. Cataliza la interconversion de ATP y AMP por un lado y de ADF por el otro:
( 7 ) Glucosa +. Pi + Glucosa 6-fosfato+ H20 (AG" = + 13.8 kJlrnol)
ATP + AMP >-
f
2 ADP
Para que tenga lugar, la reacci6n debe estar acoplada con otra que sea más exergbnica que la fosforilacibn
Esta reaccibn tiene tres funciones:
'Ha
HIC-N
\
G-N
1
ADP
?'a'
Coow
-
ATP
(dGO' -12.6 W/moll
Fasfato de creatina
cm Creatina
Flgura 724. Transferencia de fosfato de alta energla entre el ATP y la creatina.
1) Permite al fosfato de afta energia del ADP ser usado en la formación de A V . 2) Permite al AMP, formado como consecuencia de diversas reacciones de activacibn en las que interviene el A V , ser fosfosilade nuevamente para formar ADP. 3) Permite al AMP, el cual aumenta en concentracibn cuando el ATP se agota, actuar como una seflal metabblica (alostérica) para incrementar la velocidad de las reacciones catabólicas, las que a su vez llevan a la generacidn de rnhs ATP (capitulo 2 1).
Cuando el ATP reacciona para formar AMP, se forman pirofosfatos inorgánicos (PPi)
Otros trifosfatos de nucleósidoc toman parbe en la transferencia de fosfatos de alta energia
Este proceso tiene lugar, por ejemplo, en la activacibn de los ácidos grasos de cadena larga:
Por medio de la enzima nucle6sido difosfatocinasa. los trifosfatos de nucleósidos semeiantes al A'TP, pero que contienen una base distinta de la adenina, pueden ser sintetizados a partir de sus difosfatos, por ejemplo:
ATP + COA SH + R COOHAMP
* PPi + R
DIFOSFATOClNASA
COCCoA
La reaccibn se acompafía de perdida de energia libre en forma de calor, lo cual asegura que la reaccibn de activación se desplace hacia la derecha; esto es facilitado ulteriormente por la escisión hidrolitica del PP, catalizada por la pirofosfatasa inorghnica, reacción que por sí sola tiene un elevado AGO' de -27.6 kJ/mol. Obsérvese que la activacidn por la ruta del pirofosfato produce una perdida de dos en lugar de uno que es lo que se pierde cuando se forman ADP y P,.
A f P + UDP->
ADP + UTP
(trifosfato de uridina) ATP + GDP
ADP + GPT (trifosfato de guanosina)
ATP + CDP<> -
ADP + CTP (trifosfato de citidina)
a,
PIROFOSFATASA
La combinacibn de las reacciones anteriores hace posible que el fosfato pueda utilizarse de nuevo y que los nucleótidos d e adenina se intercambien (figura 12-9).
Todos estos lxifosfatos intervienen en las fosfonlaciones en la célula. De modo similar, las nucleósido monofosfato cinasas específicas de cada nucleósido de purina o pirimidina, catalizan la formación de difosfatos de nucleósido a partir de los rnonofosfatos cosrespondientes.
ATP + Nucleósido
-@
P
ADP
* Nucleósido -@ -@
Por tanto, la adenilil cinasa es una monofosfato cinasa especializada.
RESUMEN
I
ADP
Flgura 12-9. Ciclos del fosfato e intercambio de los nucledtidos de adanina.
1) Los sistemas biolbgicos son isotkrmicos en esencia y usan energia química para suministrar energía a los procesos de los seres vivientes. 2) Las reacciones son espontheas cuando hay pérdida de energia libre (AG es negativa); es decir, son exergiinicas. Si AG es positiva, la reaccibn tiene lugar 5610 si puede disponerse de energIa libre; es decir, es endergbnica. 3) Los procesos endergbnicos se efectúan sblo cuando se acoplan a procesos exerg6nicos. 4) El ATP actúa como la '"moneda circulante" o "corriente energktica" de la cdlula, transfiriendo energia libre derivada de sustancias con mayor potencial energético a las de potencial menor.
142 Bioqquimica de Hurper
(Capítulo IZ)
REFERENCIAS de Meis L: The concept of enetgy-rich phosphate comKlotz I M : lntroduction to Biornolecular Ensrge~ics.Acapounds: Water, transport ATPases, and cntropy endemic Press, 1986 ergy Arch Biochcin Riophys 1993;306:287. Krebs HA, Kornberg HL: Energi Transforma~ionsan Ernster L (editor): Rlnencrgeti~s Elseiier. 1984. I.iving Matter. Springer. 1957. H a r o l d F M : T h e l ' ~ t a l F o r c e A ~ ~ t ~ ~ u f B r o e n e r g e r iLehningerAt:Rioenergetics cs TheMolecularRasr~oj' Freeman, 1986. Diological Energy i'ransformaí~ons, 2nd ed Renlamin, 1971.
Oxidación biolóqica V
Peter A. Mayes, PhD, DSc
y, en ocasiones, la administración de oxigeno a presiones altas (terapéutica con oxigeno hiperbarica) ha proEn química, Ia oxidacidn se define como la pérdida de electrones y la reducción como la ganancia de ellos; esto se ilustra mediante la oxidación del ion ferroso en férrico. e- (electrón)
'i
En consecuencia, la oxidación está siempre acompaiíada por la reduccion de un aceptor de electrones. Este principio de oxidacibn-reducción se apiica del mismo modo a los sistemas bioquimicos y es un concepto importante en la comprensidn de la naturaleza de la oxidacion biolbgica. Se apreciar&que numerosas oxidaciones biologicas pueden tener lugar sin la participaciiin del oxígeno molecular, por ejemplo, las deshidrogenaciones.
IMPORTANCIA BIQMÉDICA Aunque ciertas bacterias (anaerobias) sobreviven en ausencia de oxfgeno, la vida de los animales superiores depende de manera absoluta de su suministro. ES uso principal de este es en la respiracibn, que puede ser definida como el proceso por el cual las cdlulas obtienen energía, en forma de A V , de la reaccibn controlada del hidrbgeno con el oxigeno para formar agua. Además, el oxigeno molecular es incorporado a una variedad de sustratos por las enzimas designadas como axigenasas; muchos medicamentos, contaminantes ambientales y carcinbgenos quimicos (xenobibticos) son metaboli7ados por enzimas de esta clase, conocida como el sistema del citocromo P450. La administración de oxigeno puede salvar la vida de pacientes con insufíciencia respiratoria o circulatoria
bado ser valiosa, aunque puede causar intoxicaciún.
LOS CAMBIOS DE ENERG~ALIBRE PUEDEN EXPRESARSE EN TÉRMINOS DEL POTENCIAL REDOX En las reacciones que implican oxidacián y reducción, el intercambio de energia libre es proporcional a la tendencia de las sustancias reaccionantes para donar o aceptar electrones. De este modo, además de expresar eI cambio de energía en términos de A G ' (capitulo ~ 1S), es posible, de manera análoga, expresarlo numkricamente como un potencial de oxidación-reduccibn o potencial redox (E'& FA usual comparar el potencial redox de un sistema (E,) contra el potencial del electrodo de hidrógeno, el cual, a pH O, se designa como 0.0 voltios. Sin embargo, para los sistemas biológicos es normal expresar el potencial redox (E',) a pH 3.0 en el cual el potencial del electrodo de hidrdgeno es -0.42 voltios. Los potenciales de oxidorreducci6n de algunos sistemas redox de interés especial en la fisiología de los mamíferos están indicados en el cuadro 13-1. La lista de potenciales redox que se muestran en el cuadro permite predecir la dirección del flujo de electrones de un par redox al otro.
LAS ENZIMAS QUE INTERVIENEN EN PROCESOS DE OXIPACIÓN Y R E D U C C I ~ NSE DENOMINAN OXIOORREDUCTASAS
En la siguiente descripcibn, las oxidorreductasas se clasifican en cuatro grupos: oxidasas, deshidrogenasas, hidroperoxidasas y oxigenasas.
(Capitulo 13j
Cuadro 13-1. .Algunos potenciales redox importaricia espm temas
de oxid acitin en -
-+"
IS
'
m
-
-
"nlt;nn
Figura 13-1. Oxldacibn de un metabolito catalizado por una oxidasa (A) que forma H20, ('B) que forma H202.
Citocromo Il hiquinon Citocromo
LAS OXIDASAS UTILlZAN OXÍGENO COMO ACEPTOR DEL HIDRÓGENO Las oxidasas catalirart la eliminacihn de hidrógeno be un sustrato iisando al oxígeno como aceptor de hidriigenoa. Forman agua o peróxido de: hidrbgeno como u n producto de la reacción (figura 13-1).
Algunas oxidasas contienen cobre Idacitocrorno oxidasa es una hemoproteínaamplíarnente distribuida en muchos tejidos, pues tiene cl típico grupo prostetico hem presente en la rnioglobulina, hemoglcibulina y otros citocromos (capitulo 7). Es el cornpcincnte terminal de la cadena de portadores rcspiratorios que se encuentran en las mitocondrias y resulta. de este modo, responsable de la reacción por la cual los electrones que provienen de la oxidación dc las moléculas del sustrato por las deshidrogenasac son transferidos a su aceptor final, e1 oxígeno. La enzima e5 envenenada por el monbxido de carbono, el cianuro y el bcido siilfhídrico. TamhiCn se le ha llamado ci~ocromoa,. A1 principio, se pensó que el citocromo a y el citocrorno a3 eran compuestos separados, dado que cada uno tiene un espectro distinto y propiedades diferentes con respecto a los efectos del monóxido de carbono y el cianuro. Estudios mhs recientes demuestran que los dos citocromos estiin combinados con la misma proteína y el complejo se conoce como ci-
*
Algunas veces el tkrmino "oxidasa" se utiliza indistintamente para nombrar n todas las enzimas que catalizan reacciones en que interviene oxlgeno rnolecular
tocromo uaf. Contiene dos moleculac de hem, teniendo cada una un &tomode Fe, que oscila entre Fe" y Fe2- durante la oxidacibn y la reduccién. Además, están presentes dos aíomos de Cu, ligado cada uno con una unidad hemica.
Otras oxidasas son flavoproteínas Las ~nzimasflavoproteinicascontienen rnononucle6tido de flavina (FMN,del ingl&s,flavin rnononucleotide) o dinucleliticlo dc flavina y adenina (FAD, del ingles, flavin adeninc u'inucleorrde) como grupos
prost&icos. El FMN (figura 52-2) y FAD (figura 52-31 se forman en el cuerpo a partir de la vitamina rihoffavina (capitulo 52). Por lo general, EMN y FAD están unidos estrcchamente -pero no por covalencia- a su respectiva proteina, apoenzima. Numerosas enzimas flnvoproteinicas contienen uno o mAs metales como cofactores esenciales y se conocen como metaloflavoproteinas. Las enzimas que pertenecen a este grupo de oxidasas incluyen a la ~ a m i n a a c i d ooxidasa, una enzima ligada al FMN que se encuentra en el riñiin con especificidad general para la desaminacibn oxidativa de los L-an~inoicidosque se encuentran en la naturaleza. La xantina oxidasa tiene una extensa distribución, pues se encuentra en la leche, en el intestino delgado, el rirlon y el hígado. Contiene molibdeno y desempefla una fincibn importante en la conversión de las bases púricas en ficido úrico (capitulo 36). Es de particular irnportaicia en el higado y los tifionec de las aves, las cuales excretan hcido úrico como el principal producto final nitrogenado, no sblo del metabolismo de las pwinas, sino también del catabolismo de las protetnas y aminodcidos. La aldehido deshidmgenasa es una enzima ligada al FAD que se encuentra en el hígado de los marniferos. Es una metaloflavoproteina que contiene molibdeno y hierro no h6mico la cual actúa sobre aldehidos y sustratos N-heterociclicos. La glucosa oxidasa, una enzima FAD especifica preparada a partir de algunos hongos, es de interés ya que se emplea para deteminar glucosa.
Oxidación biológica
Los mecanismos de oxidacibn y reducciiin de estas enzimas son complejos. Sin embargo, la evidencia seaala que la reduccihn del anillo de isoaloxacina se efectúa en dos pasos por la via de una serniquinona (radical libre) intermediaria (figura 13-2).
AH2 ,Red)-\/D
PoFtador (OX,
Portador-H2
O DEStIIDROGENASA
ESPECIFICA PARA A
LAS DESHIDROGENASAS PUEDEN USAR OXIGENO
NO
Son numerosas las enzimas de esta clase. Llevan a cabo dos funciones principales:
1) Transferencia de hidrdgeno de un sustrato a otro en una seaccibn de oxidacihn-reduccibn acoplada (figura 13-3). Estas deshidrogenasas son especificaspara sus sustratos, pero a menudo utilizan la misma coenzima o portador de hidrogeno qiie otras deshidrogenasas por ejemplo NAD'. Cuando las reacciones son reversibles, estas propiedades permiten que los eqiiívalentes reductores se transfieran con libertad dentro de la cklula. Este tipo de reacción, que habilita a un sustrato para ser oxidado a expensas de otro, tiene utilidad particular para permitir los procesos oxidativos en ausencia de oxígeno, como sucede durante la fase anaerobia de la gIuchlisis (figura 19-2). 2) Como componentes m una cadena respiratoria de transporte de electrones del sustrato al oxigeno (figura 13-43,
Muchas deshidrogenasas dependen de coenzirnas de nicotinamida Muchas deshidrogenasas son especiticas para dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD', del ingles, nicotinamideadenrne dinucleoride)o para fosfato de dinucieótido de adenina y nicotinamida (NADP', del inglés, nicotinamide adenine dhucleolide phosphare) como coenzimas. Sin embargo, algunas deshidrogenasas pueden usar en forma in-
145
DESHIDROGENASA ESPECIFICA PARA B
Figura f3-3. Oxidación de un metabolita catalizado por deshidroaenacas amaladas
distinta NAD' o NADP". Los NAD' y NADP' son formados en el cuerpo a partir de la vitamina niacina (figura 5 2 4 ) . Las coenzirnas son reducidas por el sustrato específico de la deshidrogenasa y oxidadas de nuevo por un aceptor de electrones adecuado (figura 13-5). A diferencia de FMN y FAD', tienen la peculiaridad de disociarse libremente y de modo reversible de sus apoenzimas respectivas. Por lo general, las deshidrogenasas ligadas al NAD cataban reacciones de oxidorreducciiin en la vía oxidativa del rnetaboIismo, particularmente e n la glucólisis, en el ciclo del Acido citrico y en la cadena respiratoria de la rnitocondria. Las deshidrogenasas ligadas al NADP se encuentran característicamente en la síntesis reductora, como en la vía extrarnitocondrial de la slntesis de los Acidos grasos y de los estecoides. También se encuentran como coenzimas de las deshidrogenasas en la vfa de la pentosafosfato. Por otro lado, se ha descubierio que algunas deshidrogenasas dependientes de las coenzimas de nicotinamida contienen cinc, de modo remarcable la alcohol deshidrogenaca del higado y la gliceraldehido-3-fosfatodeshidrogenasa del músculo esquelktico. No se considera que los iones cinc participen en la oxidacibn y reducción.
Otras deshidrogenasas dependen de la riboflavina Los grupos flavínicos relacionados con estas deshidrogenasas son semejantes a los FMN y FAD que se presentan en las oxidasas, Están, en gencral, más estrechamente unidas a sus apoenzimas que las coenzimas
Figura 13-2. Oxidorreduccibn del anillo isoaloxacina en los nucléotidoc de Ravina
146
Bio~uiminicade Harper
(Capitulo 13)
Figura 1 3 4 . Oxidacibn de un metabolito por deshidrogenasas y, finalmente, por una oxidasa en una cadena respiratoria.
de nicotinamida. La mayoría de las deshidrogenasas anaerobias ligadas a la riboflavina están implicadas en el transporte de electrones en (o hacia) la cadena respiratoria (capitulo 14). La NADH desbidtogenasa es un miembro de la cadena respiratoria que actliacomo un transportador de electrones entre el NADH y los componentes mhs electropositivos (figura 14-3). Otras deshidrogenasas, como la succinato deshidrogenasa, la acil-COAdeshidrogenasa y la glicerol-3fosfato deshidrogenasa mitocondrial transfieren equivalentes reductores de manera directa desde el sustrato a la cadena respiratoria (figura 14-4). Otro papel de las deshidrogenasas dependientes de la flavina es deshidrogenar el lipoato reducido (dihidrolipoil deshidrogenasa), un intermediario en la descarboxilacibn oxidativa del piruvato y el alfa cetoglutarato (figura 14-4). En este caso particular, debido al bajo potencial redox, la flavoproteína (FAD} actiia como un portador de electrones desde el lipoato reducido al
NAUt (figura 19-5). La flavoproteína que transfiere electrones es un transportador intermediario de electrones entre la acil-COA deshidrogenasa y la cadena respiratoria (figura 144).
Los citocromos pueden considerarse también como deshidrogenasas Excepto por la citocromo oxidasa (descrita previamente), los citocromos están clasificados como deshidrogenasas. Su identificación y estudio se facilitan por la presencia, en cl estado reducido, de banda5 características de absorción, 1% cuales desaparecen cn la oxidación. En la cadena respiratoria, intervienen como portadores de electrones desde las flavoproteinas por un lado hasta la citocromo oxidasa por otro (figura 14-4). Los citocromos son hemoproteinas que contienen hierro, en las cuales el &romode este metal
EzEcl ESPECIFICA PARA 6
Figura 13-5. Mecanismo de oxidación y reduccibnde las coenzimac de nicotinamida Hay estereoespecificidadalrededor de la posicibn 4 de la n~cotinamidacuando es reducida por un sustrato AH2. Uno de los átomos de hidrbgeno es removido del sustrato como un n~icleode hidrágeno con dos electrones (ion hídndo, H 2 y es transferido a la posicidn 4, donde puede adherirse en las posiciones A o B de acuerdo a la especificidad determinada por la deshidrogenasa particular que cataliza la reaccidn. El hidrbgeno remanente del par removido del cuctrato se conserva libre como ion hidrbgeno.
Oxidación hiolh~ica 147
oscila entre Fe3' y Fe2+durante la oxidación y la reducciirn. Varios citocromos identificables se encuentran en la cadena respiratoria, es decir, los citocromos b, CI, c, a y al (citocromo oxidasa). De estos, sólo el citocromo c es soluble. Además de la cadena respiratoria, los citocromos se encuentran en otros sitios, por ejemplo, el retículo endoplhrnico (citocromo P450 y Bs), las células vegetales, bacterias y levaduras.
La catalasa utiliza a l peróxido de hidrogeno como donador y como aceptor de electrones La catalasa es una hemoproteína que cantíene cuatro grupos hem. Ademfis de poseer actividad peroxídfisica, es capa? de usar una molécula de H20?como sustrato donador de electrones y otra molécula de H202 como oxidante o aceptor de electrones.
LAS HlDROPEROXlDASAS 'USAN PEROXIDO DE HIDRQGENO U OTRO PERÓXIDO ORGANICO COMO SUSTRATO Dos tipos de enzima entran en esta categoría: las peroxidasas y las catalasas. Estos dos tipos se encuentran en animales y en vegetales. Las hidraperoxidasas protegen al cuerpo de los peMoxidos nocivos. La acumulación de perdxidos pueden conducir a la generación de radicales libres, que a su vez destruyen membranas y son causa posible de cáncer y aterosclerosis (capítulos 16 y 53 para una descripción y resumen de los mecanismos de defensa contra los radicales librcs).
Las peroxidasas reducen peróxidos usando varios aceptores de electrones
1CATALASA --A En la mayoría de las condiciones in vivo, la actividad peroxidasica de la catalaca parece ser favorecida. La catalasa se encuenm en sangre, médula bsea, mucosas, rifiiin e higado. Se supone que su funcidn es la desmiccibn del: peróxido de hidrógeno formado por la accibn de las oxidasas. Los microcuerpos o peroxisomas se encuentran en numerosos tejidos incluyendo el hlgado. En ellos abundan las oxidasas y la catalasa, lo cual sugiere que puede haber alguna ventaja biológica al agrupar a las enzimas que producen H 2 0 2 con la enzima que la destruye (figura 2 3 4 ) . Ademhs de las enzimas peroxisomales, los sistemas mirocondriales y microsómicos de transporte de electrones asi como la xantina oxidasa se deben considerar como ruentes de H202.
Aunque consideradas originalmente como enzimas vegetales, las peroxidasas se encuentran en la leche y en leucocitos, plaquetas y otros tejidos que intervienen en el metabolismo eicosanoide(capítulo 25). El grupo prostético es el protohem, el cual, a diferencia de la mayoria de las hemoproteinas, esta débilmente unido a la apoproteina. En la reacción catali~adapor la peroxidasa, el perdxido de hidrdgeno es reducido a expensas de varias sustancias que actúan como dondores de electrones tales come el ascorbato, las quinonas y el citocromo c. La reacción catalizada por la peroxidasa es compleja, pero la reaccibn global es como sigue:
1
PEROXIOASA
1
En los eritrocito&y otros tejidos, la enzima glutatión peroxidasa, que c o n t i e n e selenio c o m o g r u p o prostktico, cataliza la destrucción del HzOz y los hidroperbxidos lipidicoc por el glutatibn reducido, protegiendo a los Iípidos de la membrana y a la hemoglobina contra la oxidacibn por los peróxidos (capítulo 22).
LAS OXlGENASAS CATALliAN LA TRANSFERENCIA DIRECTA Y LA INCORPORACI~NDE OX~GENO A UNA MOLÉCULA DE SUSTRATO Las oxigenasas intervienen en la síntesis o la degradacibn de numerosos tipos diferentes de metabolitos, más bien que m las reacciones que proveen de energía a la dlula. Las enzirnas de este gmpo calalizan la
A'H, 1
A 1
Figura 13-6. Función de la catalasa en la destruccibn de peroxido de hidrogeno.
148
Bioquimica de Harper
(Capítulo 13)
incorporacibn del oxigeno a una molécula de sustrato. Esto se efectiia en dos etapas: 1) la fijación del oxigeno al sitio activo de la enzima y 2) la reacción en la que el oxígeno unido se reduce o es transferido al sustrato. Hay dos subgrupos de oxigenasas:
enzimhticas conocidas ~olectivamentecomo ciclo de la hidroxilasa (figura 13-8).
~~ki*i,l; Fármaco-H
+ Oz + 2 ~ e +~2H-t*
Las dioxigenasas: incorporan los dos átomos de oxigeno molecular al sustrato
(P450)
F a m i a c o 4 H + HzO + Xe3' (P450)
La reacción básica es:
Ejemplos de ese tipo incluyen las enzimas que contienen hierro, por ejemplo, la homagentisato dioxigenasa (oxidasa) y la 3-hidroxiantranilato dioxigenasa (oxidasa) de la fracción sobrenadante del higado, y las enzimas que utilizan hem como grupo prostktico, por ejemplo, la btriptófano dioxigenasa (triptbfano pirrolasa) del hígado.
Las monooxigenasas (oxidasas de función mixta, hidroxilasas): incorporan sólo un átomo de oxígeno al sustrato El otro átomo de oxígeno es reducido a agua, por lo que es necesario un donador adicional de elecirones o cosustrato.
Los sistemas microsómicos de la monooxigenaca del citocromo P450 son importantes para la hidroxilacion de muchos fhrrnacos Estas monooxigenasas se encuentran en los microsomas del higado junto con el citocromo P450 y el
citocromo bs. Tanto el NADH como el NADPH donan equivalentes reductores para la reducci6n de estos citocromos (figura 13-71, los cuales son oxidados a su vez por sustratos en una serie de reacciones
NADH Amino oxidasa. etdtem
\
NADPH
FlavoPr~telna2
/
Flavopmteina3
+
Flavoproteina~
Entre los f i m a c o s metabolizados por este sistema están el benzopireno, la arninopirina, anilina, morfina y benzotelarnina. Muchos fármacos como el fenobarbital tierieri la capacidad de inducir la formación de enzimas rnicrosOmicas y de citocromo P450.
Los sistemas mitocondriales de la monooxigenasa del citocromo P450 catalizan hidroxilaciones de esteroides Estos sistemas se encuentran en tejidos esteroidogenicos como la corteza suprarrenal, los testlculos, los ovario y la placenta e intervienen en la biosíntesis de las hormonas esteroides a partir del colesterol (hidroxilaci6n en CZZy CZO en la separación de la cadena lateral y en las posiciones 1 1P y 18). Los sistemas renales catalizan las hidroxilaciones la- y 24- del 25hidroxicolecaIciferoI y el hígado cataliza Ia hidroxilaci6n en 26- en la biosíntesis de Acidos biliares. En la corteza suprarrenal, el citocromo P450 mitocondrial es seis veces mlis abundante que los citocromos de la cadena respiratoria.
LA TOXICIDAD DEL OX~GENO PUEDE DEBERSE AL RADICAL LIBRE SUPERÓXIDO La potencial toxicidad del oxigeno, se ha atribuido por tanto a la formación de H202.Sin embargo, recientemente, la facilidad con la que el oxigeno puede ser
-
CNEstearil-COA desaturasa
Cit bs
/l-
A
Cit P450
+
Hidraxilaabn
Figura 13-7. Cadena de transporte de electrones en los microsomas. El cianuro (CN-) inhibe el paso indicado
NADPH t H'
o,,
r A-OH
Figura 13-8. Ciclo de 3a citocromo P450 hidraxilasa en los microsomas El sistema mostrado es tipico de las hidroxilasas de esleroides de la corteza suprarrenal. La citocromo P450 hidroxrlasa microsórnica del higado no requiere de la sulfoproteina ferrica Fe2S2 El rnonoxido de carbono (CO) rnhibe el paso indicado
rcdiicido en los te-jidos al radical superóxido libre (Oz5}y la existencia de una supcróxido dismutasa en los rnicroorganisrnns acrobios (aiinque no en los aiiaerobios obligados) ha sugerido que latoxicidad del oxigcnri cs dcbida a su conversibn e n superóxidn. Se origina superóxido cuando las flavinas reducidas -por eiernplo. presentes en la xantina deshidrogenasa- son reoxidadas de modo univalente por el oxigeno molecular.
El superoxido puede reducir cl citocromo c oxidado 02'
+ Cit c ( ~ e ~4 ' )0 2 + Cit c (Fe2+)
o ser eliminado por la prcsencia de la enzima especifica superhxido dismutasa.
En esta ieaccicín el super6xido actúa como oxfdantc y como reductor; los efectos quimicos cn los tejidos son amplificados por las reacciones de las cadenas con i-ndicalcs libres (capítulo 16). Se ha propuesto que el
0 2 ' unido al citocromo f '450 es un intermediario en la activación del oxigenri en las reacciones de hidroxilación (figura 13-8). La runciiin dc Iri superhxidri disinutasa parece ser la de proteger a los microurganismos aerobios contra los efectos deletéreos potenciales del siiperoxído. La enzima se encuentra en varios cornpartimicntos difer~ntes de la célula. La enzima citosólica, está compuesta de do?subunidades similares que contienen cada una un equivalente de Cu" y Zn2', en tanio rlue la enzima mitocondrial contiene Mn". por lo que es similar a la enzima que se encuentra en la bacteria. Bstc dcscubrimiento apoya la hiphtesis dc que la? mitocondrias han evolucionado a partir dc uii procariota que entrb en simbiosis con un protoeucariota. La dismutasaesta presentc cn todos los principales te-jidos acrvhios. Si bien la exposición de los animales a una atmbsfera de 100% de O2 causa un incremento adaptativo de la enzima, particularniente en loc pulmones, la exposición prolongada ocasiona daRn puIrnonar y muerte. Los antioxidantes, por ejemplo, el alfa tocoferol (vitamina E), actúan como recolectorcs d e radicales Iibrcs y reducen la toxicidad del oxígeno (capitulo 53).
RESUMEN 1) En los sistemas biológicos, como en los qziímicos, la oxidacihn (perdida de electrones)
1SO
Rioquimica de Harper
se acompafia siempre con la reduccibn de un aceptor de electrones. 2) Las oxidorreductasas se clasifican en cuatro grupos: oxidasas, deshidrogenasas, hidroperoxidasas y oxigenasas. 3) Oxidasas y deshidrogenasas tienen diversas funciones en el metabolismo, aunque las dos clases de enzimas desempeiian actividades importantes en la respiración.
(Capilulo 13)
4) Las hidroperoxidasas protegen al cuerpo contra Iesion por radicales libres, mientras que las oxigenasas realizan la hidroxilaci6n de medicamentos. 5) La toxicidad del oxígeno puede ser causada por el radical libre super~xido.La enzima específica super6xido dismutasa protege a los tejidos del superóxido. I
REFERENCIAS Ronnett R: Oxygen activation and tetrapyrroles. Essays Biochem 1981:17:1. Coon MJ et al.: Cytochromc P450: Progress and predictions. FASEB J 1992,6:669 Ernster L (editor): Bioenergeticx Elsevier, 1984. Fleischer S, Packer L (editors): Biological oxidaiions,
microsomal, cytochrome P450. and uther hemoprotcin systerns. In: Methods in E~izyrnology. V o l . 5 2 . Biomcmbranes, part C. Acadcmic Press, 1978. Friedovich 1: Superoxide dismutases. Annu Rev Biochcm 1975;44:147.
Nicbolls DG: Cylochromes and Cell Respzraiion Carolina
I3iological Supply Company. 1984. Tolbert NE: Metabolic pathways in peroxisomes and glyoxysomes Annu Rcv Biochem 198 1,50: E 33. Tyler DD: The Mitochondrion in Health and Disease YCH Puhlishers, 1992. Tyler DD, Sutdon CM: Respiratoy cnzyme systerns in milochondrial mcmbranes. In: Mernbrane Strucfure and Function Vol. 5 Hittar EE (editor) Wiley, 1984 Yang CS, Brrdy JF, Hong SY: Dietary effects on cytochromes M50,xenohiotic metabolism. and toxicity. FASEB J 1992:6:737
Cadena respiratoria y fosforilación oxidativa Peter A. Mayes, PhD, DSc
La mitocondria ha sido llamada apropiadamente, la "casa de fuerza" de la célula, puesto que es dentro de este organelo en donde se captura la mayor parte de la energia derivada de la oxidacihn respiratoria. El sistema de las rnitocondrias donde la respiración se acopla para la generacion del Intermedio de alta energía, ATP, se denomina fosforilaci6n oxidativa.
La fosforilaci6n oxidativa capacita a los organismos aerobios para aprovechar la energía libre disponible de sustratos respiratorios en una proporción mucho mayor que los organismos anaerobios. La teoría quimiosmóiics ofrece una perspectiva de la forma en que esto ocurre. Cierto número de medicamentos (por ejemplo, amobarbital), y venenos (por ejemplo, cianuro y monbxido de carbono}, inhiben la fosforilación oxidativa, por lo general con consecuencias letales. Se han informado diversos defectos rnitocondriales hereditarios que comprenden componentes de la cadena respiratoria y de la fosforilación oxidativa. Los pacientes presentan miopatia, cncefalopatia y con frecuencia presentan lactacidosis.
ENZIMAS ESPEC~FICASACTÚAN COMO MARCADORES DE LOS COMPARTIMIENTOS SEPARADOS POR tAS MEMBRANAS MITOCONDRIALES Las mitocondrias tienen una membrana externa permeable a la mayor parte de rnetabolitos, una membrana interna con permeabilidad selectiva y moldeada
en pliegues o crestas y una matriz dentro de la membrana intema (figura 14-1). La membrana externa puede removerse por tratamiento con digitonina y se caracteriza por la presencia de monoamino oxidasa, acil-COA sintetasa, glicerofosfato aciltransferasa y fosfolipasa Az. En el espacio intermembrana se encuentran adenilil cinasa y creatina cinasa. El fosfolipido cardioiipina se concentra en la membrana intema. Las enzimas solubles del ciclo del icido citrico y las enzimas de la beta oxidación de Acidos grasos se Iocal izan en la matriz, requ irikndose mechnisrnos para el transporte de metabolitos y nucleótidos a travds de la membrana intema. La succinato deshidrogenasa se ubica en la superficie interior de la membrana interna, donde transporta equivalentes reducidos por las enzimas de la cadena respiratoria, siendo estas ultimas los constituyentes principales de la membrana interna. Ida 3-hidroxibutirato deshidrogenasa se fija t a m b i h en eI lado de la matriz de la membrana interna. La glicerol3 -fosfato deshidrogenasa se encuentra en la superficie exterior de la membrana interna, lugar adecuado para participar en la lanzadera de glicerofosfato(figura 14-1 S).
LA CADENA RESRlRATORlA COLECTA Y OXIDA EQUIVALENTES REDUCTORES Toda la energia útil liberada durante la oxidacidn de ácidos grasos, aminoheidos y virtualmente toda la que proviene de la oxidaci6n de los carbohidratos se vuelve disponible dentro de las rnitocondrias en forma de equivalentes reductores (-H o electrones). Las mitocondrias contienen la serie de cataliadores conocidos como la cadena respiratoria que colectan y transportan equivalentes reductores y los dirigen a su reacción final con el oxígeno para formar agua. Tambikn está en las mitocondrias la maquinaria que atrapa la ener-
MATRIZ
Particula submitocondrial formada por fragmentos de membrana interna
Figura 14-1. Estructura de las membranas mitocondriales Las partículas submitocondrialesestán "al revés" y permiten el estudio del sistema encerrado en la membrana. donde las subunidades fosforilantea estan en el lado externo.
gi'a libre producida como fosfato de alta energia. Éstas también contienen los sistemas enzimiiticos responsables de la producción de la mayor parte de los equivalente? reductores en primer lugar, es decir, las
ALIMENTO
- -
1
1
Lipidos -
2
PO
Carbohidratos
enzimas de la beta oxidación y del ciclo del acido citrico. Este último es la via mctabólica final corniin para Ea oxidacion de todos !os alimentos principales. Estas interrelaciones se muestran en la figura 14-2.
$
h
bcidos grasos
+
Glicerol
, beta-Oxidacibn \ --- - - - - - ---
ATP
\
t
Glucosa,etc
4-
Acetil-COA
E
:o ,A
/
.'
I I I MITOCONDRION
l
ADP
I
I
I Fuentes extramitouindrialesde
equivalentes reductores Figura 14-2. Funcibn de la cadena respiratoria mitocondrialen la conversión de energia de los alimentos a ATP La oxidación de los nutrientes principales genera equivalentes reductores (2H) que son capturados por la cadena respiratoria para la oxidac16ny formación acoplada de ATP
Cadena respiratoria y fosforilacih~l oxidutrvu
Los componentes de la cadena respiratoria están colocados por orden creciente de su potencial redox Los componentes principales de la cadena respiratoria se muestran en la figura 1 4-3. Los electrones o el hidrogeno fluyen a travÉs de la cadena de manera escalonada desde los componentes más electronegativos al oxigeno mas electropositivo, a traves de una expansión redox de 1.1 voltios dcl NAD'/NAUH al 0?/2Hz0 (cuadro 1 3-1). Ida cadena resuiratoria de las rnitocondrias está formada por cierto número de portadores redox que va desde los sistemas de deshidrogenasa unidos aNAD, flavoproteinas, citocromos, hasta llegar aI oxigeno molecular. No todos los sustratos esthn ligados a la cadena respiratoria a través de deshidrogenasas específicasde N AD: algunos, debido a que sus potenciales rcdox ron mhs positivos (por ejemplo, furnaratolsuccinato, cuadro 13-1 ), esthn ligados directamente a las deshidrogenasas flavoproteinicas, las cuales a su vez esthn ligadas a los citocromos de Ia cadena respiratoria (figura 1 4 4 ) . En aAos recientes se ha aclarado que se encuentra otro poriador adicional en la cadena respiratoria que une las flavoproteinas con ei citocromo h, el miembro de la cadena de citocromos de mBs bajo potencial redox Esta sustancia, que ha sido IIamada uhiquinana o Q (cwnzima Q; figura 14-51, existe en las miiocondrias en fuma de quinona oxidada en condiciones acrobias y en la forma de quinol reducido en condiciones anaerobias. La coenzima Q es un constituyente de los Iípidos mitocondriales, siendo los otros lipidos predominantemente fosfolipidos que conslituyen parte de la membrana rnitocondrial. La coenzima Q tiene una estructura muy semejante a la de las vitaminas K y E (capitulo 53). También es semejante a la plastoquinona que se encuentra en los cloroplastos. Todas estas sustancias se caracterizan por la posesi~nde una cadena lateral poli-isoprenoide. En las mitocondrias hay un gran exceso estequiométrico de Q coinparado con otros miembros de la cadena respiratoria; esto es compatible con Q actuando sobre un coinponente mhvil de la cadena respiratoria que recoge cquival entes reductores fijados a los complejos de flavoproteinas y los pasa a los citocromos.
A
NADH
153
Un componente adicional que se encuentra en las preparaciones de la cadena respiratoria es Ia proteína fierrosulfurada (FeS: hierro no himico), el cual esta relacionado con las flavoproteinas (metaloflavoproteínas) (figura 1 4 4 ) y con el citocromo h. Se cree que el azufre y el hierro intervienen en el mecanismo de oxidorreducción entre la flavina y la coenzima Q, que incluye el cambio de un sor0 e-; el atomo de hierro experimenta oxidorreduccibn entre Fe2' y Fe3 . El punto de vista actual acerca de los componentes principales de la cadena respiratoria se muestra en la figura 1 4 4 . En la terminal electronegativa de la cadena, las e n z i m a deshidrogenasas catali~anla transferencia de electrones desde los sustratos hasta el NAD de la cadena. Existen varias diferencias en la manera como esto se IIeva a cabo. Los alfa cetohcidos pirúvico y cetoglutarico tienen sistemas compIejos de deshidrogenasas que implican al lipoato y al FAD antes de1 paso de electrones al NAD de la cadena respiratoria. La transferencia de electrones de otras deshidrogenasas como las de L (+)-2-hidroxiacil-COA. D (-)-3-hidroxibutirato, prolina, glutamato, malato e isocitrato, al parecer se acoplan directamente con el NAD de la cadena respiratoria. El NADH reducido de la cadena respiratoria es a su vez oxidado por la enzima metaloflavoproteinica NADH deshidrogenasa. Esta e n ~ i m contiene a FeS y F M N , se encuentra unida con firmeza a la cadena respiratoria y pasa equivalentes reductores a Q. La Q es tambikn el punto de acopio en la cadena respiratoria para los equivalentes reductores derivados de otras sustancias que estan unidas directamente a la cadena respiratoria a través de las flavoproteína deshidrogenasas. Estos sustratos son succinato, colina, glicerol 3-fosfato, sarcosina, dimetilglicina y acil-COA (figura 1 4 4 ) . El componente flavina de todas estas deshidrogenasas parece ser el FAD. Los electrones fluyen desde Q a través de la serie de citocromos que se muestra en la figura 14-4, hasta el oxigeno molecular. Los citocromos están arreglados en orden creciente de su potencial redox. El citocromo terminal ua, (citocromo oxidasa) es el responsable de la combinacibn final de los equivalentes reductores con el oxigeno rnolecular. Se observa que este sistema de enzima contiene cobre, un compo'
2Fs2'
%O*
Figura 1 4 3 . Transporte de equivalentes reductores a traves de la cadena respiratoria.
Succinato Colina
Prolina
i
3-Hidr~~ia~il-Cd 3-Hidroxibutirato Glutamato
FP (FAW FeC
Malato Piruvato
Isocitrato
Cit b FeS
FP (FAD)
'
--t
Cit CI
-
Cit c
Cit aa3
Cu
FP (FTE)
t
FP FAD)
t
Acil-COA Saruisina Dimetilgliuna
FTE Flavoproteina transferida de electrones Fp Flavoproteína Q Ubiquinona Cd citocromo
Flgura 1 4 4 . Componentes de la cadena respiratoria en las mitomndrias mostrando las puntos de reunibn para las equivalentes reductores a partir de los sustratos importantes. FeS ocurre en la secuencia del lado del 02 de Fp o de Cit b
nente dc algunas oxidasas. La citocromo oxidasa tiene una afinidad muy elevada por el oxigeno, lo cual permite que la cadena respiratoria funcione a velocidad mkirna hasta que virtualmente se ha agotado el oxigeno en el tejido. Dado que &sta es una reaccidn irreversible (la única en la cadena), le imparte dirección al movimiento de los equivalentes reductores en la cadena respiratoria y a la producción del ATP a la que está acoplada. La organizacibn estructural de la cadena respiratoria ha sido un tema de considerable especulaci6n. De importancia es el descubrimiento de proporciones molares casi constantes entre los componentes. Funcional y estructuralmente, los componentes de la cadena respiratoria se encuentran en la membrana interna de la mitocondria corno cuatro complejos de la cadena respiratoria proteína-llpido que se extienden en la
Forma totalmente oxldada o quinbnica
Forma semiquindnica (radical libre)
membrana. El citocromo c es el unico citocrom~ soluble y al igual que Q, parece ser el componente m i s mbvil de la cadena respiratoria que conecta a los complejos fijados (figuras 14-7 Y 14-10).
LA CADENA RESPIRATORIA APORTA LA MAYOR PARTE DE LA ENERGIA OBTENIDA DEL METABOLISMO El ADP es una molécula que captura, en forma de fosfato de alta energia, algo de la energia libre resultante de los procesos catabblicos y que corno ATP pasa esta energia para impulsar aquellos procesos que la requieren. Asi, el ATP ha sida llamado la "liqujdez" energética de la cdlula (figura 12-7).
Forma reducida e qulndllca (hidroquinona)
Figura 14-5. Estructura de la ubiqulnona (0). n = número de unidades isoprenoides el cual es 10 veces mayor en animales, es decir, QIO.
Cadena resprratoriay f~~forilacrónoxidativa
12-1, el cual se obtuvo a partir de una concentracibn estándar de 1.0 mol/L). Debido a que un m01 de glucosa genera aproximadamente 2780 kJ en la combustibn completa, la energia capturada por fosforilación en la glucólisis es insignificante. Las reacciones del ciclo del ácido cítrico, la via final para la oxidacibn completa de la glucosa, incluyen s61o un paso de fosforilaci6n, la conversi6n de succinil-COA en succinato, lo cual permite la captura de dos fosfatos de alta energía m& por m01 de glucosa. Todas las fosforilaciones descritas hasta ahora ocurren al nivel del sustrato. E[ examen de las mitocondrias intactas respirando, revela que cuando los sustratos son oxidados por la r í a de las deshidrogenasas ligadas al NAD y la cadena respiratoria, se incorporan 3 mol de fosfato inorgáslico al ADP para formar 3 m01 de ATP por medio mol de O2consumido, es decir, la relacibn P:O = 3 (figura 14-7). Por otro lado, cuando un susirato es oxidado por la vía de una deshidrogenasa Iigada a flavoproteína, s61e se forman dos moléculas de ATP, es decir, P:O = 2. Estas reacciones se conocen como fosforilacidn oxidativa al nivel de la cadena respiratoria. Tomando en consideración las deshidroger&iones en la r í a del catabolismo de la glucosa, tanto en la gludlisis como en el ciclo de! &ido cftrico, más las fosforilaciones al nivel del sustrato, es posible ahora das cuenta de al menos 68% de la energía libre que resulta de la combustión de glucosa, capturada en la forma de fosfato de alta energia. Es evidente que la cadena respiratoria es responsable de una proporclbn importante del total de ATT formado.
Gis \
1j5
Pr
Figura 14%. El complejo hierro-azufre-proteína (Fe&) @, azufre lábil a los hudos. Pr, apoproteina, Crs. residuo de cisteina. Algunas proteínas fierrosulfuradas contienen dos Btornos de azufre y de hierro (FezS2).
Hay una capturaneta de dos grupos fosfato de alta energia en las reacciones glucoliticas (cuadro 19-1) que equivalen aproximadamente a 103.2 kJlmol de gfucosa.(ln vivo, el AG para la síntesis de ATP a partir de ADP se ha calculado que es de aproximadamente 5 1.6 kJ/mol, tomando en cuenta que este valor es a partir de las concentraciones actuales de los reactivos presentes en la cilula. Ésta es mayor que el AGQ'para la hidrolisis de ATP como se muestra en el cuadro
Maloneto
Complejo II Suocinato
TTFA
H2S
CO
BAL Antimiuna A
Complejo IV
Complejo r
FMN, FeS
-I
De=coliladores
4
Piencidina A ArnobarbAl
ADP + PI
esac copla dar es
Rotenona
1
ATP
I
ADP
T+
;PI
ATP
Oligomlcina
4
ADP IPI
ATP
Flgura 14-7. Sitios propuestos de inhibiUbnOds la cadena respiratoriapor medicamentos, compuestos qulmieos y antibidtieds especlfims. Los sitios que al parecer apoyan a la fosforilación estan indicados. BAL, drnercaprol: T F A es un agente quelante del hierro; wrnplejo I , NAOH ubiquinona oxidorreductasa; complejo II, sucunato:ubiquinona oxidorreductasa; complejo III, ubiquinol~ferricitocromoc oxidorreductasa; mmplejo IV, ferrocitocromo:oxigeno oxidorreductasa. Las demhs abreviaturas son iguales a tas de la figura 1 4 4 .
El control respiratorio asegura un suministro constante de ATP La velocidad de recpimci6n de las mitocondrias se puede controlar por la concentración de ADP. Esto se debe a íluc !a oxidacihn y la fosforilacibn están íntimamente nc,opladas; cs decir. la oxidaciiin no puede proceder por la vía de la cadena respiratoria sin la fo~forilacion ~oncornitantcdel ADP. Chance y Williams han definido cinco condiciones que pueden controlar la velocidad dc respiraciOn en las mitocondrias (cuadro 14-1 ). En general. la mayor parte de las células en estado de repriso se encuentran en el cstado 4, sicndo larespimcion controlada por la disponibilidad del ADP. Cuando se efectúa trabajo, el A'l'P es convertido en ADP, pemitiendo que ociirra m i s respiración, lo cual a su vez reabastece el depósito de A'I'P (figura 1 4 4 ) . Pareceria que eii ciertas condiciones la concentmcibn de fosfato iiiorgánico podria afectar tambiCn la velocidad de funcionamicnto de la cadena respiratoria. Conforme la frcciiencia respiratoria aumenta (como con el e.iercicio). la célula se aproxima al estado 3 o al 4 ya sea que la capacidad de la cadena respiratoria sc satura o la PO2 decrece a valores menores del Km para el citocromo 01. 'También existe la posibilidad de que el transportador de ADPIATP (figura 14-2), que tjcilita la entrada de ADP citosólico a la mitocondria, se convierta en el limiiante de la velocidad. Así. la manera en que lo? procesos oxidativos hiol6gicoc permiten que !a energía libre que resulta dc la oxidacicihn de los alimentos se vuelva disponible y sca capturada. es escalonada, eficaz (apmximadamcnte 68%) y conirolada, en lugar de explosiva, ineficaz y sin control como en muc2ios procesos no biológicos. 1.3 energía libre remanente, que no es capturada como fnsfato de alta energía se libera en forma de calor. Esta i~ecesidadno debe considerarse coma "despilfarro",
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Lados de control riiq?iratorio
Cuadro
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Condic iones que limitan la velocidad de res,plración
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Dispcinihil idud de su!
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Estado 3 1 [,a ripacidad de la cadena respiralorra misniii, cuantlo to dos los susiratus y componen les esthn psect>ntesen cantidades de, saturaci6r;I
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1
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Dispcinihildad de ADP solamca idad de ox Ipcnci solarnente
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dado que asegura que cl sistema respiratorio como iin todo sea suficientcrnente exerghico para alejarse del equilibrici y permite un flujo unidireccional cotitiriuo y una provisión constante de ATP. En el animal dc sangre calientc contribuye a la conservación de la temperatura corporal.
NUMEROSOS VENENOS INHIBEN LA CADENA RESPIRATORIA Mucha de la infot-rnaciiin de la cadena respiratoria ha sido obtenida por el uso de inhibidores y, a la inversa, esto ha aportado in Cormación sobrc el mecanismo de acción de algunos venenos. Este lugar dc accion propuesto se muestra en la figura 14-7. Con propósitos der;criptivos se pueden dividir en inhibidores dc la propia cadena respiratoria, inhibidores de la fcisforilacihn oxidativa y desacoplantes de la misma. Los inhibidores que detienen la re~piraciónbloqueando la cadena respiratoria parecen actuar en tres sitios. El primero es inhibido por los harbitíiricris como el amobarhital, porcl antibiótico piericidina A y por la rotenona, que es un insecticida y veneno de Deces. Estos inliibidores evitan la oxidación dc los sustratos que coinunican directamente con la cadena respiratoria por la via dc una desliidr-ugeilasa ligada al NAD al bloquear la transferencia de FeS a Q. A una dosis suficiente, son rnortaPcs in vivo. El dimercaprol y la antimicina A inhiben la cadena respiratoria entrc el citrocromo h y el citocromo c. Los venenos cl6sicos &S. rnonóxida de carbono y cianuro inhiben a la citocromo oxidasa. La carhoxina y el TTFA inhiben especificamente la transferencia de equivalentes reductores d e la succinato dcshidrogenasa a Q , en tanto que el malonato es un ínhibidor competitivo de la succinato dcshidrogenasa. El antibihiíco oiigomicina bloquea completamente laoxidación y la fosforilación en I& rnitocrindrias intactas. Sin embargo, en presencia del desacoplante dinitrofennl, la oxidación procede sin fosforilacibn, indicando que la oligomicina no actua directamente en la cadena respiratoria, sino en un paso subsecuente de la fosforilaci6n (figura 14-9). EI atractilásido inhibe la fosforilaci~noxidativa, la cual depende del transporte de nuclebtidos de adenina a t r a v h de la membrana interna de la mitocondria. Se considera que inhibe al portador de ADP en la mitocondria y el ATP fuera de ella (figura 14-1 2). La acción de los desacoplantes consiste en separar la oxidacibn de la fasforilaciiin en la cadena respiratoria y esta accibn puede explicar la toxicidad de estos compuestos in vivo. Esto da por resultado una respiracion no controlada, puesto que Ea concentracihn de ABP o P,ya no limita la velocidad de la
Cadena res~iraforia Y fo,sforiiación oxidatrva
157
Figura 14-8. Funcion del ADP en el control respiratorio.
respiración. El desacoplador que ha sido usado mis frecuentemente es el 2,4-dinitrofenol, pero otros compuestos actúan de una manera semejante, incluso al dinitrocresol, el pentaclorofenol y la CCCP (m-clorocarbonilcianuro fknilhidrazona). Este último compuesto, comparado con el dfnitrorenol, es cerca de 100 veces mBs activo.
ADP
1
Estado 4
LA TEOR~AQUIMIOSM~TICAEXPLICA EL MECANISMO DE LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA Se han emitido dos hipotesis principales tanto quirnica como quimiosm6tica para explicar el acoplamiento dc la oxidacion y la fosforilación. La hiphtesis quimica postula el acoplamiento químico directo en todas las etapas del proceso, como en las reacciones que generan ATP en la gtucblisis. No obstante, nunca lograron aislarse intermedios ricos en energíaque enlaman oxidación con fosforilacibn y la hipotesis se desacreditb.
La cadena respiratoria es una bomba de protones Desacoplamiento
1
1
2
3
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5
Minutos
Figura 14-9. Control respiratorio en las mitocondrias. El experimento A mllestra la situacibn básica de la respiraudn en el estado 4, la cual es acelerada por la adiubn de ADP. Cuando el ADP exdgeno ha sido fosforilado a ATP, la respiración regresa al estado 4. La adicrón de un desacoplante, por ejemplo, dinitrofenol, separa a la respiracidn de la fosforilacibn. En el experimento ES, la adicibn de oligomicina bloquea la fosforilacibn del ADP aAadido y por tanto tambibn a la respirac16n. La adición de un desacoplante separa nuevamente a la recpiractbn de ia fosforilaubn
La teorla quimiasmática de Mitchell postula que la energía de la oxidación de componentes en la cadena respiratoria genera iones hidrógeno que son expulsados al exterior de una membrana acopladora en la mitocondria; es decir, la membrana interna. La diferencia de potencial electroquímico que resulta de la distribución a~imétricade iones hidrógeno (protoncs, FI'j se emplea para dirigir el mecanismo responsable de la formacibn de ATP (figura 14-1 O). Cada uno de los complejos de la cadena respiratoria 1, III y 1V (figuras 14-7 y 14-10) actúan como una bomba de protones. La membrana interna es en general impermeable a iones, pero en particular a protones, que se acumulan fuera de la membrana, creando una diferencia de potencial electroquímico a travds de la membrana ( A ~ H + )Esta . diferencia consiste en un potencial químico (diferencia de pH) y un potencial elkcbico.No se conoce con certeza el numero preciso de protones bombeados por cada NADH oxidado, pero en la actualidad se calcula que el complejo
Membrana acopladora Oligommcina
Ubiquinona
Citocromo c
EXTERIOR
+ (APH)
Figura 14-10. Principios de la teoria quimiosmótica de la fosforitacrbn oxidativa El circuito protbnico principal es creado por el acoplamiento de la oxidacibn a la expulsibn de protones del interior al exterior de la membrana, conducida por los complejos 1, II y 1V de la cadena respiratoria, cada uno de los cuales actúa como una bomba de protones. Subunidades Fi y Fo de la proteina las cuales utilizan energfa de la gradiente de protones para promover la fosforilación Los agentes desacoplantes como el dinitrofenol permiten la fuga de iones H' a travbs de la membrana, colapsando asi, el gradiente electroquimico de protones. Específicamente la oiigcrmicina bloquea la conduccidn de H* a través d e Fo
el complejo IV,2. Por tanto, la relacibn P:O puede no ser un enterocabal, por ejemplo, 3, pero es posible que sea 2.5. Por simplificacibn, se continuarhn utilimdo en este texto un vaior de 3 para la oxidacibn del NADH + H ' y de 2 para la oxidacidn del FADH2.En la figura 14-1 1 se muestra un mecanismo posible para el bombeo de protones por el complejo 911; esto es, el ciclo Q. 1expulsa 3 a4. el complejo I I I , 4 y
Una ATP sintasa localizada en la membrana forma ATP La diferencia de potencial electroquimico se usa para impulsar a una ATP sintasa localizada en la membrana la cual en presencia de P, + ADP forma ATP (figura 14-1 0). Así, no hay intermediario de alta energta común para la oxidacion y la fosforilación como en la hipbtesis química. Esparcidas en la superficie de la membrana interna están los complejos fosforilantes responsables de laproduccibn de ATP (figura 14-1). Estos constan de varias subunidades de protehas que se conocen en
conjunto como la subunidad F,, la cual se proy ecta hacia la matriz y contiene a la A V sincasa (figura 14-1 0). Las subunidades están adheridas, posiblemente mediante un tallo, a una subunidad protetnica de la membrana conocida como Fo, que es probable se extienda a travks de la membrana (figura 14-10}, Los protones pasan a travks del complejo FOa F 1con formación de ATP a partir de ADP y P,. Es interesante observar que unidades fosforilantes similares se encuentran en el interior de la membrana plasrnitica de las bacterias, asi como en el exterior de la membrana de los tilamides en los cloroplastos. Es significativo que el gradiente de protones es de fuera hacia dentro en mitocondrias y bacterias, pero en sentido inverso en los cloroplastos. El mecanismo de acoplamiento de la expulsibn de protones al sistema de la ATP sintasa es una conjetura de la Ripdtesic. Los estudios sugieren que la sintesis de ATP, la cual puede tener lugar mientras se encuentra pegado a la enzima, no es el paso principal que requiere energja, sino más bien la liberacibn del ATP del sitio activo. En esta accibnpodrian intervenir cambios de confomaci6n de la subunidad FI.
Cadena resprratnriay JosforilaciOn oxidufrva
159
Figura 44-41. Ciclo "Q" generador de protones. La figura muestra corno los componentes del complejo III están organizados como bomba de protones. El QH' se anda a cada lado de la membrana a una proteína fijadora de Q, en tanto que. QH2 Y Q son móviles. Los citocromos se muestran como b y ci.
Los hallazgos experimentales respaldan la teoria quirniosmótica 1) La adicidn de protones (gcido) al medio extemo de mitocondriasconduce a la generación de ATP.
2) La fosforilaci6n oxidativa no ocurre en sistemas solubles donde no existe la posibilidad de una ATP sintasa vectorial. Debe haber una
membrana cerrada para obtener fosforilacidn oxidativa (figura 14-1 0). 3) La cadena respiratoria contiene componentes organizados lateralmente (asimetríatransversal) como los requiere la teoria quimiosm6tica.
La teoria quimiosrnótica puede explicar el fenómeno de control respiratorio La diferencia de potencial electroqulmica a travts de la membrana, una vez establecida como resultado de la translocacibn de protones, inhibe el transporte posterior de equivalentes reductores a travks de la cadena respiratoria a menos que se descargue por una translocación retrógrada de protones a traves de la membrana hacia la ATP sintasa vectorial. Esto a su vez depende de la disponibilidad de ADP y P,.
La teoría quimiosmótica explica la acción de los desacopladores compuestos ( ~ o r e j e m ~ ldinitrofenol) o, son mfiphticos (capitulo 16) e incrementan la permeabilidad de las mitocondrias a los protones (figura 14-10), reduciendo así el potencial electroquímico y el corto circuito de la ATP Por tanta, la procede focforilacibn,
La teoria quimiosmótica explica la existencia de sistemas transportadores de intercambio mitocondrial Estos sistemas son una consecuencia de la membrana acoplada que debe ser impermeable a los protones y otros iones para conservar el gradiente electroquimico (vkase adelante).
LA IMPERMEABILIDAD RELATIVA DE LA MEMBRANA MITOCONDRIAL INTERNA NECESITA DE INTERCAMBIO DE TRANSPORTADORES Los sistemas de difusidn para intercambio existen en la membrana para cambiar aniones por iones OH-y
(CapituloId) cationes por iones H'. Estos sistemas son necesarios para la captación y excreción de metabolitos ionizados en tanto se conserva la neutralidad eldctricn y osrnbtica. L a membrana mitocondrial bilipoide interior es totalmente pemeable a moléculas pequefias sin carga, como oxígeno, agua, C02 y NHI y a acidos monocarboxilicos, como 3-hidroxibutírico, acetoacético y acético. Los iicidos grasos de cadena larga son transportados al interior de la mitocondria por el sistema de la ornitina (figura 24-1) y existe también un transportador para piruvato que comprende un "simport" que utiliza el gradiente de ti' del exterior al interior d e la mitacondria (figura 14-12). Sin embargo, aniones diwboxilato y trimboxilato y amino8cidosrequieren un transportador especifico o sistemas de transportadores para facilitar su paso a rravks de la membrana. Al parecer, los ácidos monocarboxílicos penetran con mAs facilidad debido asu menor disociacibn. Se cree que Membrana interna de
EXTERIOR
la mitouindria
INTERIOR
los ácidos sin disociar o m& liposoluhles son la especie molecular que atraviesa mejor la membrana lipoide. El transporte de aniones dicarboxílicos y tricarboxilicos se relaciona de manera estrecha con el fosfato inorgánico, el cual atraviesa con facilidad como ion HzP04-enintercambio por OH-. La captacibn neta de malato por el transportador de dicarboxilato requiere fosfato inorghnico para intercambiar10 en direccion opuesta. La captacion neta de citrato, isocitrato o cisaconitato por el transportador de tricarhxilato requiere malato en intercambio. El transportador de alfa cetoglutarato tambikn necesita intercambio con malato. si, ~ o medio r de mecanisinos d c intercambio re conserva el equilibrio osmiitico. Dcbe apreciarse que el transporte de citrato a traves de la membrana mitocondrial depende no solo del transporte de malato sino tambien dcl intercambio de fosfato inorgánico. El transportador de nucleiitidos de adenina permite el intercambio de ATP y ADP, pero no AMP. Esto es esencial para dejar salir al ATP de las mitocondrias hacia los sitios de su utilización exn-arnitocondrial y permitir el regreso del ADP para la produccibn de ATP denm de la rnitocondria (figura 14-13). El Na' puede intercambiarse por H', cori ayuda del gradiente de protones. Se piensa que la captación activa de Caz' por las mitocondrias ocurre con transferencia de una carga neta con valor de 1 (Ca' "uniport"), quizá a traves de un antiport Ca2'/H'. ],a liberacion de calcio de las mitocondrias es facilitada por el intercambio con Na' .
EXTERIOR
Membrana interna de la
INTERIOR
mitoccndria
Figura 14-12. Sistemas transportadores en la membrana mitocondrial Transportador de fosfato @ Sirnportador de piruvato @Transportador de dicarboxilato.(a Transpertador de tricarboxilato. Transportador de alfa cetoglutarato. (@ Transportadorde nudeótido de adenina. Netilmaleimida, hidroxicinarnato y atratilbsrfo inhiben los sistemas indicados. TambiBn existen (pero aqui no se muestran) sistemas transportadorespara glutarnatolaspartato (fgura 14-1 5)-glutamina, ornitina, aminoácidos neutros y carnitina (figura 24-1)
8
($2
Figura 14-13. Carnbinacibn del transportador de fosfatosm con el transportador del nuclebtido de adeninacg en la sintesis del ATP. El simportador H+IP, es equivalente si antiportador PJOH que se observa en la figura 14-12. Tres o posiblemente cuatro protones penetran a la mitocondriapor cada ATP que sale. Sin embargo,penetra un protbn menos cuando el ATP es usado en el interior de la mitocondria.
Los ionóforos permiten a cationes específicos atravesar membranas [,os ionóforos reciben ese nombre por su capacidad para fonnar compIc,jos con cationes específicos y facilitar su transporte a través de membranas biológicas. Esta propicdad de fonoforesis se debe a su carácter l ipofílico, que le permite atravesar membranas lipoides como Ia rnitocondrial. Un qiernplo es el antibiótico valinomicina, que ayuda al paso de K ' a travCs de In niembrana mitocondrial y luego descarga el potencial de mernbrwa*del interior al exterior de la mitocondria. La nigericina actúa también como un ionhforo para K' pero en iiiicrcambio por HA. Por tanto, elimina el gradiente de pIl a travis de la membrana. Eri presencia de valinomicina y nigericina, tanto cl potcnc~aldc niembrana como el gradiente dc pll desaparecen y por tanto, la fosforilación es completarnente inhibida. De hecho, los desacoplantes clásiccis como dinitrorenol son ion6foros de proiones.
Una transhidrogenasa traslocadora de protones es fuente del NADPH intramitocondrial Esta trarishidrogenasri ligada a energía, que es una prciteina de la membrana mitocondrial interna, se acopla al paso de protones corriente abajo del gradiente electroqiifmico del exterior al interior de la mitocondria con transferencia de hidrhgeno del NADI-1 intramitocondrial para formar NADPH. Al parecer actua como un amortiguador redox ligado a energía y como fuente de N A D P H para la? enzimas intramitocondriales. como glutamñto deshidrogenasa e hidroxilasa, que intervienen en la slntcsis de esteroides.
La oxidacion del NADH extramitocondrial es mediada por lanzaderas de sustrato Aunque el NADH no piicde penetrar la mcnihrana mitocondria1, es producido continuamente en el cftosol por la 3-tos~oglfceraldehido deshidrogenasa, una enzima de la secuencia de la glucólisis (iigtira 19-2). Sin embargo, en condicione$ aerobias, el N A DH extram itocondrial no se acumula y sc supone que es oxidado por la cadena respiratoria cn las mitocondrias. Se han considerado varios mecanismos posibles quc permiten este proceso. Estos iinplican la transferencia de equivalentes rediictores a travis dc la membrana rnitocondrial por la vía de los parcs dc sustratos, ligados por deshidrogenasas apropiadas. Es necesario que se encuentre la deshidrogenasa especifica en ambos Iados de la mern brana mitocondrial. El mecanisrnv de transferencia que utili7a la lanzadera d e glicerofosfato se muestra en la figura 14-14. Debe advertirse que la enzima mitocondrial se enlaza a la cadena respiratoria a travCs de una flavoproteina en lugar de N A D y que en lugar de tres, shlo se fonnan dos moléculas de ATP por átomo de oxígeno consumido. En algunas cspccics, la actividad de la enzima ligada a FAD decrece despues de tiroidectomia y aumenta después de la administración de tiroxina. Aunque esta lanzadera existe en el músculo de las alas de IOF insectos, cerebro, tejido adiposo oscuro y cn cI miiscrilo blanco y podrta ser importante en el hígado; otros ie,jidos (por ejemplo, músculo cardiaco) muestran deficiencia de glic~rol3-fosfato deshidrogenasa. Se cree, por tanto, que iin sistcma de trancporte que implica al malato y al malato citos6lico y mitocondrial es de mayor utilidad universal. En la figura 1 4-1 5 se muestra el sistema lanzadera del malato. La com-
Figura 14-14. Lanzadera de glicerofosfato para la transferencra de equivalentes reductores desde el citosol al interior de la mltocondria.
162
Rioquímica de Harper
(Capitulo 14)
MEMBRANA
CITOSOL
INTERIOR
MITOCONORIA
MALATO DESHIDROGENASA
+
H'
transFigura 14-15. Lanzadera del malato para transferencia de equivalentesreductores del citosol al interior de la mitocondria portador del oetoglutarato, transportador de glutarnato-aspaflato (nótese el sirnportador protbnica con glutamato).
a
plejidad de este sistema se debe a la impermeabilidad de la membrana mitocondrial al oxalacetato, el cual debe reaccionar con el glutamato y ser transarninado a aspartato alfa cetoglutarato antes de su transporte a travks de la membrana rnitocondrial y reconstituido a oxalacetato en el citosol.
El transporte de iones en las mitocondrias se enlaza a la energia Las mitocondrias que respiran activamente en donde se lleva a cabo la fosforilacion oxidativa, conservan o acumulan cationes como K', Na', Ca2', MgZ' y P,. El desacoplamiento con dinitrofenol conduce a la pérdida de iones del interior de la mitocondria pero la captacibn de iones no es inhibida por la oligomicina. lo que sugiere que la energíano necesita ser suministrada por la fosforilacion del ADP, Se considera que una bomba primaria de protones dirige el intercambio catidnico.
La lanzadera de creatina fosfato facilita el transporte de fosfato de alta energía desde la mitocondria Esta lanzadera (figura 14-1 6) aumenta las funciones de la creatina fosfato como un amortiguador de energía al actuar en los tejidos activos como son el corazón y el musculo esquelético, como un sistema dinámico
para transferir fosfato de alta energia desde la mitocondria. En el espacio intemembrana de la mitocondria se encuentra una isoenzima de la creatincinasa (CK,)que cataliza la transferencia de fosfato de alta energia a la creatina a partir del ATP que surge del nuclebtido transporhdor de la adenina A su vez, el dna fosfato se transporta al interior del citosol mediante los poros de proteinas en la membrana mitocondrial exterior y queda disponible para la generación extramitocondrial de ATP. Diferentes isoenzimas de la creatincinasa median la transferencia de fosfato de alta energia hacia y desde los diversos sistemas que lo utilizan o generan, ejemplo, contraccion muscular, gluc6lisis (figura 14-1 6).
ASPECTOS CL~NICOS
M m t o m o de la miopatfa mitocondrialy la disfuncibn renal infantil mortal comprenden disminución grave, o ausencia, de la mayor parte de las oxidorreductasas de la cadena respiratoria. La MELA (miopatía, encefalopatía, lactacidosis y apoplej ia) es un estado hereditario causado por NADH: deficiencia de ubiquinona oxidorreductasa (complejo 1) o de citocromo oxidasa. Se han descrito las enfermedades que implican deficiencias de gran parte de la fosforilacibn oxidativa. Cierto numero de fhrmacos y venenos actúan por inhibicibn de la fosforilacibn oxidativa (vkase antes).
Cadena respiratoria yfo.sforilacidn oxidativa
/
P m s o s que requreren energía ejemplo. contraccibn rnuswlar
RESUMEN
\
ATP
..,.,.,.,.,,mi.:.; exterior
.;,;$ ,:;;:,
.. ....: ...;. .,, ,.
: ::p.. , -., - ::::
1) Virtualmente toda la energia liberada de la
ADP
.:,:,;,.,embrana mitomndria .: .......-. ;y..>.-,,. ,:>,:;,
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p
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ATP
\ ADP
163
Espacio
intermembrana
Figura 14-16. La lanzadera de creatina fosfato del músculo cardiam y esquelético La lanzadera perrnlte el transporte rhpido de fosfato de alta energia desde la matriz de la mitomndria al interior del citosol (Cka, es la creatina ctnasa que interviene en los grandes requerimientos de ATP, ejemplo. contraccibn muscular, C k , es la icoenzirna que mantiene el equilibrio entre la creatina y el fosfato de creatina con ATPIADP, C b es la isoenzlma que acopla la glucblisis a la slntecis de creatina fosfato, C b e3 la creatincinasa mitocondrial que media la creaci6n de fosfale de creatina a partir del ATP formado en la fosfoñilacibn oxidativa; P es el poro de la proteína en la membrana mitocondrial exterior.)
oxidación de carbahidratos, Iípidos y proteinas se vuelve disponible en las mitocondrias como equivalentes reducidos (-H o e-). Estos son canalizados a la cadena respiratoria, donde pasan corriente abajo por un gradiente redox de transportadores a su reaccibn final con oxigeno para formar agua. 2) Los transportadores redox se agrupan en complejos de la cadena respiratoria en la membrana mitocondrial interna. Estos usan la energía liberada en el gradiente redox para bombear protones al exterior de la membrana, creando un potencial electroquimico a través de ésta. 3) Atravesados de uno a otro lado de la membrana estan los complejos de ATP sintasa que usan la energía potencial del gradiente de protones para sintetizar ATP a partir de ADP y Pi. En esta forma, la oxidación se acopla en forma íntima a la fosforilacibn para proveer a las necesidades energdticas de la cklula. 4) Debido a que la membrana mitocondrial intema es impermeable a protones y otros iones, transportadores de intercambio especiales se extienden a travks de la membrana para permitir el paso de iones como OH-, P17ATP~-, A D P ~ -y rnetabolitoc, sin descargar el gradiente electroquimico a través de la membrana. 5) N u m e r o s o s v e n e n o s c o n o c i d o s , como cianuro, detienen la respiracibn mitocondrial por inhibicibn de la cadena respiratoria.
REFERENCIAS Balaban RS: Regulation of oxidative phosphorylation in the rnammal!an cell Arn J Physiol 1990;258:C377. Boyer PD: 'l'he unusual enzyiiielogy o f A'I'I' synthase.
Biochemistry 1987;26 8503. Cross RL:The mechanism md regulation o f ATP synthesis by Fi-A'TPases. Annu Rev Biochem 198 1 ;50:6&1. Barold FM: The I/i#olForce, A Sliru5, of Bioener~erics.
Freernan, 1986
Aatefi Y: The rnitochondrial electron transport and oxidativc phosphorylation system. Annu Rev Biochem 1985;54:1015. Mitchell P: Keílin's respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences. Science 1979;206:1 148. Morgan-Huges JA et al.: Mitochondrial myopathies: Clinical defects. Biochcm SOE Trans 1990;38:523. Nicholls DG: Bioenergetics. A n Introduction to !he Chemiosmotic T h e o ~Academic . Press, 1 982.
Prince RC: l'he proton pump nl' cytochromc oxidase Trends Biochcm Sci 1988: 13:159. Scholte HR, ct al.: Defecrs in oxidative phosphoqlation. Uiochcrnical investigatiuns in skelehl musclc and exprcssion o f the lesion in other cell5 J lnhcr Metab Dis IYX7.10,Suppl 1 :81
Tyler DD:The W~tochondrion in Iiealth andllrsease
YCH
Publishers, 1992. Wallimann T et al.: Intrrtcellularcomparírncniation, structurc and function of creatinc kinase isoeiiqmes in tisues with high nnd fluctuatiiig energy clernandq Hiocheiii J 1992;281:21
Carkohidratos de importancia fisiológica Peter A. Mayes, PhD, DSc
Los carbohidratos esthn ampliamente distribuidos en vegetaIes y animales, donde desempeñan funciones estructurales y rnetabólicas. En los vegetales, la glucosa es sintetizada por fotosintesis a partir de bióxido de carbono y agua y almacenada como almidón o convertida a celulosa que forma parte de la estructura de soporte vegetal. 1,os animales pueden sintetizar algunos carbohidratos a partir de Iípidos y proteinas, pero el volumen mayor de los carbohidratos de animales se d ~ r i v aen Última instancia de los vegetales.
LOS CARBOHfDRATOS SON DERIVADOS ALDEH~DOSO CETONAS DE ALCOHOLES POLIH~QRICOS Se clasifican como sigue:
1) Los monosacásidos son aquerlos carbohidrato~que no pueden ser hidrilizados en moleculas más sencillas. Pueden subdividirse en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, heptosas u octosas, dependiendo de la cantidad de ariíornos de carbón que contengan; y como aldosas y cetosas dependiendo si tienen o no grupo aldehido o cetona. En el cuadro 15-1 se dan algunos e-jemplos 2) Los disachridos producen dos moléculas del mismo o de diferentes monosacáridos cuando se hidrolizan: ejemplos de estos compuestos son la maltosa, que produce dos moléculas de glucosa, y la sucrosa, que produce una inolécula de glucosa y una de fructosa. 3) [,os oligosacáridos son los compuestos que por hidrólisis dan 2 a 10 moléculas de rnonosacirido. La maltotriosa* es un ejemplo. 4) Los polisachridos so11aquellos carbohidratos que dan, al ser hidrolizados, mhs de 10 moléculas de monosacaridoc. Los almidones y las dextrinas son ejemplos de polisacáridos que pueden ser lineales o ramificados. Segun la naturaleza de los monosacAridos a que dan origen por hidrblisis, en ocasiones se le designa como hexosanos o pentosanos.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA Para comprender su funci6n fundamental en la economia del organismo de los marniferos es esencial el conocimiento de la estructura y propiedades de los carbohidratos de importancia fisiologica. El azúcar glucosa es el carbohidrato más importante. La mayor cantidad del carbohidrato dietético pasa al torrente sanguíneo en forma de glucosa o es convertida en el hígado y, a partir de ella, pueden formarse los demás carbohidratos en el cuerpo. Es tarnbien el combusliblc principal de los mamíferos (excepto los rumiantes) y un combustible universal para el feto. En el organismo es convertida a otros carbohidratos que tienen funciones altainente especificas, por ejemplo, glucbgeno para almacenaje; ribosa en los ácidos nucleicos; galactosa en la lactosa de la leche y en ciertos Iípidas complejos y, combinada con proteinas en las glucoproteínas y los proteoglucanos. Las enfermedades que se relacionan con carbohidratos incluyen diabetes sacarina, galactosemia, enfermedades por almacenaje d e glucógeno e infolerencia a la lactosa.
*
Obsérvese que esla no es una triosa verdadera sino un trisacárido giic conticnc trcs rcsiduos de alfa glucosa.
Cuadro 15-1. Clasificaciónde aziicares importnntes ---L.
-"
--
1
--
ulosa ulosa
Para la mayor parte de los praphsito~,la fbrmula estructural puede ser representada como un simple anillo en perspectiva como lo propuso Haworth (figura 15-1 R). 131 anilisis por difracción de rayos X muestra que el anillo de seis miembro5 contienc un átomo de oxigeno y que en realidad tfenc la forma de una silla (figura 15-1 C).
ctosa
Los azúcares poseen varias formas de icornerismo
LA GLUCOSA ES EL MONOSACARIDO MÁS IMPORTANTE EN MEDICINA La estructura de la glucosa puede representarse de tres maneras Aunque la fhmula estructural de cadena lineal (aldohexosa, figura 15-1 A) puede ayudar a comprender algunas de sus propiedades, una estructura cíclica cs favorecida por razones temodinSimicas y expIica completamente el resto de sus propiedades quimicas.
o 11
'C-H
I
- OH HO -3C - H 1 H -4C - OH l H -=C -OH H -2C
1
1
6CH,OH
Figura 15-1. o-Glucosa A: Forma en cadena recta; B alfao-Glucosa proyección de Haworth; C: alfa-o-Glucosa forma de silla.
Los compuestos que tienen Ia misma formula estructural, pero que difieren en configuracibn espacial se conocen camo etercoisómeros. La presencia de atonios de carbono asimétricos (Atomos de carbono unidos a cuatro h~omoso grupos diferentes) permite la formación de isbrneros. El numero de isbrneros posibles de un compuesto depende de1 numero de htomos asimétricos de carbono (n) y es igual ri 2". La glucosa, con cuatro htomos asimttricos de carbono tiene, por tanto, 16 isomeros. Los tipos más importantes de isomeria que se encuentran en la glucosa son los siguientes:
1) lsomerismo D y L: La designación de un isiimero como 13 o de su irnagcn en espejo como la forma L está determinada por su relacion espacial con el compuesto progenitor de la familia de carbohidrato~,el azúcar de tres carbonos, la glicerosa (gliceraldehído). Las formas L y D de este azíicar se muestran en la Figura 15-2,jiinto con los correspondientes isdmeros de la glucosa. La orientacihn de los grupos -H y -0H alrededor del átomo de carbono adyacente al carbono con el ~ l c o h o lprimario terminal (por ejemplo, el Atomo de carbono cinco en la glucosa) determinan si el asicar pertenece a la serie D o a la l.. Cuando el grupo -OH en este carbono está a la derecha {como se ve en la figura 15-2), el azúcar es miembro de la serie D; cuando esti a la izquierda, pertenece a la serie L. La mayor parte de los monosacaridos dc los mamíferos tienen la configuracibn u y las enzimas qiie intervienen en su metabolismo son específicas para esta configuracibn. La presencia de átomos de carbono asimCtncos tambikn confiere actividad óptica a los compuestos. Cuando un rayo de luz polarizada en un plano se hace pasar a través de la soluciiin de u11Eshmero óptico, el plano de polarizaci0n girarA en el sentido de las manecillas del reloj si el isómero es dextrorrotatario (+), o en el sentido opuesto si es levomtatorio (-1. Un compuesto puede scr designado n(-), »(A), L(-) o c(+),indicando su rclación estructural con la glicerosa n o L, pero no necesariamente exhibiendo la misma rotacibn 6ptica. Por ejemplo, la forma de Fa fructuosa que ocurre en la naturaleza, es el isiimcro D(-).
C -H I
-OH
H-C I
Furane
O
ti
C -H
1
1
HO-
'C -H I
H-C
-0H 1
HO-C H-C
m-"
-H
I
'CH,OH
-51
I I
H-C
-0M
-0H
I
Figura 15-3. Formas piranosa y furanosa de la glucosa.
CH?OH
Figura 15-2. Isomeria o- y L- de la glucerosa y de la glucosa.
Cuando existen cantidades iguales de isomeros n y l,, la mezcla resultante no tiene actividad 6ptica puesto que las actividades de cada isbmero se anulan entre si. Tal mezcla se designa como racemica o mezcla ni.. [,os compuestos producidos por síntesis son necesariamente recdrnicos, ya que las oportunidades para la forrnacíón de cada ic6mero ~ p t i c oson idénticas. 2) Estructuras cíclicas piranosa y furanosa: Esta terminologia se basa en el hecho de que las estructuras ciclicas estables de los rnonosacáridos son sirnilms a las del pirano y del furano (figura 15-3). También las cetosas pueden presentar la forma ciclica (por e.jempi0, D-fsuctofuranosa o D-fn~cto~iranosa) (figura 1 5 - 4 ) . En el caso de la glucosa en solucit~n, m& de 99% esta en la forma piranosa; por tanto,menos de 1 % esta en la forma furanosa. 3) Anbrneros alfa y beta: La estructura ciclica de una aldosa es un sem iacética, puesto que esti formada por la combinacibn de un aldehído y un grupo aIcohol (figura 15-5). En forma semejante, la estructura cíclica de una cetusa es un semiacético. La glucosa cristalina es alfa-u-glucopiranosa. La estructura ciclica se conserva en solución, pero el isomerismo tiene lugar alrededor de la posicihn 1, el carbonilo o atorno anornérica d i carbono, prodriciendo una rnezcIa de alfa-u-glucopiranosa (38%) y beta-glucopiranosa (62%). Menos de 0.3% e s t $ representado principalmente por
anbmeros alfa y beta de la glucofuranosa. Este equilibrio se acompaña de rotacibn 6ptica (mutarrotación) cuando el anillo semiadtico se abre y se vuelve a formar con cambio de la posicibn de los grupos -H y 4 H del carbono 1. El cambio se efectua probablemente via una molécula hidratada, acíclica, dc cadena recta, aunque la polarografia ha mostrado que la glucosa existe en forma aciclica en una proporción de sólo 0.0025 por ciento. La desviación bpticade la glucosa en soIución es dextrorrotatoria; de aqul, el nombrc alterno de dextrosa que se usa con frecuencia en medicina.
Figura 15-4. Formas piranosa y furanosa de la fructosa.
(sedcheptiilosa), se forman en la degradacibn de la gliicosa por la vía alterna del fosfato de pentosa. Las pentosas son constituyentes importantes de nucleótidos, ácidos nucleicos y numerosas coenziinac (cuadro 15-2). De las hexosas, las fisiolúgicamente más importantes son Ja glucosa, galactosa, fructosa y manosa (cuadro 1 5-3). En la figura 15-8 se muestran las estructuras de los azúcares aldosas de importancia bioquimica. En la figura 15-7 se muestran cinco cetosas que son importantes en el metabolismo. También significativos so11 los derivados ácido carboxílicos de la glucosa como el D-glucuronato (importante en la formación de gliicurhnidos y prescnte en los glucosaminog~ucanos)y sus derivados metabolicos 1--iduronato (presente eii glicosarninoglucanos) (figura 15-9) y 1 ,-gulonato (un in iembro de la via del icido urhnico, figura 2 2 4 ) .
HOCH,
L. Forma de
aldehido aciclico
HO O'd H
0h
Figura 15-5. Mutarrotaciones de la glucosa.
Los azúcares forman glucósidos con otros compuestos y entre si
4). Evímeroq: 3.0s isomeros que difieren como con-
secuencia de variaciones en la configuracibn de los
4 H y -H unidos a los átomos de carbono 2,3 y 4 de la glucosa se conocen corno epimeros. Diológicarnente, los epimeros más importantes de la glucosa qon la manosa y la galactosa, formadas por epimerizaci6n en los carbonos 2 y 4, respectivamente (figura 15-45). S') lsom~rismoaldí)sa+etosa: La fructuosa tiene la tnisma formula niolecular de la glucosa, pero difiere en su fiirmula estructural, dado que hay un grupo cetosa potencial en la posición 2 dc la fmctuosa (figura 15-73 y un grupo aldehido potencial en la posición 1 dc la glucosa (figura 15-8).
Muchos monosacáridos tienen importancia fisiológica Los derivados de triosas se forman en el ciirso de la degradación metabolicade la glucosapor la vía de la glticólisis, en tanto que los derivados de iriosas. tetrosas. pentosas, a partir del azúcar de siete carbonos
HOCH,
Los glucósidos son compuestos formado< de la condensación entre el grupo hidroxilo del c ~ r b o n o anomérico de un monosaclirido o un residuo de monosacarido y un segundo compuesto que puede spr o no (en el caso de una aglucona), otro monosacarido. Si el segundo grupo es un hidroxilo, e1 enlace O-glucosidico es un enlace acetal debido a que resulta de utia reaccihn entre un grupo semiacético (formado de un grupo aldehido y un grupo -0H) y otro grupo -0H. Si la porcihn serniacética es la glucosa, el compuesto resultante es un glucbsido; si es la galactrisa, un galactosido, etdtem. Si el segundo grupo es iina arnina. se forma un enlace N-glucosídico, por c,jemplo, entre adenina y ribosaen nuclcbtidos como ATP (figura 12-5). Los glucósidos se encueiitran en muchos medicamentos, en las espccias y en las constituyentes de tejidos animales. El aglucano puede ser metanol, glicerol, un esterol o fenol, o una base como adenina. Todos los gluc6sidas que son irnportantcs en medicina, debido a su acci6n sobre el corazón (glucosidos cardiacos), contienen esteroides como
HOCH,
Figura 15-6. Epimerización de la glucosa
HOCH,
CHIOH I
C=O I
CH,OH
CH,OH
C-O
C=O
I
-H
1
I
H-C - 0 H
HO-C-H
1
I
HO-C-H
HO-C
C=O
I
I
H-C-DH
H-C
I
I
I
H-C
-0H
H-C
-0H
I
-OH I CHzOH
Dihidmxiacetona Figura 15-7. Ejemplos de cetosas de importancia fisiol6gica
LOS deoxiazúcares carecen
componente aglucona. Estos gluciisidas incluyen derivados de la digital y del estrofanto coma la oua baína, que es un in hibidor de Ea Na'f K' -PiTPasa de las membranas celulares. Otros glucósidos incluyen antibióticos como la estreptomicina (figura 15-?U).
de un oxígeno Son aqiiéllos en los cualcs un gnipo hidroxilo unido a la estructura cíclica ha sido reempla7ado por un atomo
CHO I
H-C-OH I
CH2OH ~Gllcerosa(Dgllceraldehldo)
$HO H-C - 0 H I H -C - 0 H I CHIOH .~Erltrosa
m
f . CHO
CHO
CHO I
I
I
1
HO-C - H
I HO-C - H H-C
CHO
l
H-C - 0 H
HQ-C -H
H-C - 0 H
4
I
H-C - 0 H
H-C - 0 H
-OH
&,OH ~Llxosa
-7
~Ribosa
~Xllosa
CHO [
H-C-OH HO -C -H
HO -C -H I
H-C - 0 H I
CH20H
CHO
CHO
HO-C - H
H-C-OH
I
I
I
HO-C -H
4 H-C-OH I
H-C
1
- OH
CHZOH
4
HO-C -H
H-c-OH H -C - 0 H I
CH20H
Figura T5-8. Relaciones estructurales de las aldosac de la serie o con importancia fisiológica La o-triosa no tiene importancia fisiológica. La serie se construye por la adicidn tebrica de una unidad CHzO al grupo -CHO del azúcar
Cuadro 15-2. Pentosas de importancia fisiolbgica .-.
.--
-
---- -
Import:ancia bio~uírnica
--
:mentas es1:ructuraIcs de los acidl . l a i ~ n ~.,e A las coen7imaq com 'P. NAD, f U'ADP, llav,{>proteínas S fosfatus de rihiisa !Fon intcrm rios en la i[la de la peintosn fosfa . 1 rormada cn los nroce.sus I f i i fosl'ato de :.rinuiusa es iin inxcrrn ) dia,,. .rio en la vi a de la pcntosa fosfati 1 rnetüb6licos nsiiluyente dc glucop.rvteintis ; ciruela Y de rd ~ G I C L ~ ~ v e gel iomas nstituyenie de glucop eptidogliucnnos Iiicosamint)gluc;inos un constit!~ y e n t cde u la cual ha Sido aislada diaco hum;m0 1 -I ' iterrnediario en la via aer aciao urnnico ae encucnira en ia orina cn l a -pentosuria cscncial eicos
YnbnbU,
1,
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T...,
--
--
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(ii&zi
-
A
de hidrógeiio. Un ejemplo es la desoxirribosa (figura 1 5-1 1) que existe en los hcidos nucleicos (DNA). Tambien se encuentran como un carbohidrato de glucoproteinas en forma de desoxi id-fucosa (figura 1 5-1 7 ) y la 2-desoxiglucesa es un inhibidor impartante del metnbolisma de la glucosa.
Los aminoazúcares (hexosaminas) son
componentes de glucoproteinas, gangliócidos y glucosami nog lucanos Ejemplos de aminoazúcares con la r~-glucosarnina (figura 15-12), la D-galactosamina y la D-ma-
Cuadro 15-3. Aexosas de importancia Tisiolligica -
-
A . -
--
-
-- --
I
ente
; Jugo
:
ar" del 1Prescntc cnI la orina (E
.
"lm;
maltosa y la lac
-
insporta leI sangre y el que incipalmente usan los tejidos
r
.,
.
de In g1ucosa santesgluce~ni; 3)
del azúcar de cziaa y de la i nulina con v k i r ~ i e1iglucosa J (pro1cedente de la alcachi]fa de foirma In lisa iel organisn Jem~
fructuosa r:ondiice a Iación dc c:cte cnrbrih 1izipogluceniia
Hidr ólisis de la
imposibilidad de metaboizarla caiisa galact oscmia y :ataratas zada cn las glándulas mamwias para formar la lactosade la leche. Es un constituyente de Ios glu-
D-1
-
-
-
3 lucosa
Hidrblisis del mank y gomas Es un ctinsliiuyente de muchas vegetales glucoproteinas
-
-
COO-
H
Figura 15-9. alfa-o-Glucuronato (izquierda) y beta-L-iduronato (derecha)
nosamina, las cuales han sido identificadas en la naturaleza. La glucosarnina es un constituyente del ácido hialurdnico. La galactosamina o condrosamina es un componente de la condroitina (capitulo 57). Varios antibióticos como la eritromicina y la carbomicina contienen aminoazúcares. Se cree que los aminoazUcares están relacionados con la actividad antibidtica de estos medicamentos.
LOS DISACARIDOS MAS IMPORTANTES SON MACTOSA, SACAROSA Y LACTOSA Los disacáridos son azucares compuestos de dos residuos de monosachrido unidos por un enlace glucosidico (figura 15-1 3). Su nombre quimice refleja sus componentes monosacáridos. Los disachridos fisiológicamente importantes son maltosa, sacarosa, trehalosa y lactosa (cuadro 1 5 4 ) . La hidrblisis de la sacarosa da una mezcla cruda que se denomina "azucar invertida" debido a que la fnictosa que se produce es fuertemente levorrotatoria y cambia (invierte) la previa accibn dextrorrotateria de la sacarosa.
5
HOCH,
Figura 15-17. 2-Desoxi-D-ribofuranosa (forma beta)
LOS POLISACARIDOS TIENEN FUNCIONES DE ALMACENAJE Y ESTRUCTURALES Entre los polisachridos figuran los siguientes carbohidrato~que son lisiol6gicamente importantes: El almidón esta formado por una cadena alfaglucosídica. Compuesto que siilo produce glucosa en la hidrólisis, es un homopolímero denominado gIucosano o glucano. Constituye la fuente más importante de carbohidrato$ de los alimentos y se encuentra en los cereales, las patatas, las legumbres y en otros vegetales. Los dos constituyentes principales del almid6n son: la amilosa (15 a 20%) que tiene estructura helicoidat no ramificada (figura 15-14), y la amilopectina (S0 a 85%), que consiste en cadenas muy rarnificadas, de 24 a 30 residuos de glucosa unidos por enlaces 1 -+ 4 en las cadenas y por enlaces I + 6 en los puntos de ramificación. El glucógeno (figura 15-15) es el polisacárido que se almacena en el organismo animal. A menudo se le designa como almidón animal. Es una estructura mucho más ramificada que la arnilopectina con cadenas de 12 a 14 residuos de alfa-D-glucopiranosa (con enlaces glucosidicos alfa-D-f l -% 41) y ramificaciones
Figura .15-10. Estreptomicina (izquierda) y ouabalna (derecha).
172 Rioquírnicu de Hurper
(Capitulo ISI MALTOSA
Figura 15-1 2. Glucosamina (2-amino-o-glucopiranosa) (forma alfa) La galactosarnina es Ea 2-amino-o-galactopiranoca Tanto la glucosamina como la galactosamina a menudo se presentan como derivados N-acetilo en carbohidrato~mas complelos, por ejemplo, glucoproteinas. SACAROSA
unidas por medio de enlaces glucocidicos al fa (1 +6). La inulina es un alrnidhn que se encuenbaen los tuMrcu los y raíces de las dalias, alcachofas y dcl diente de león. Por hidrólisis se obtiene fructosa y por tanto es un h c tosano. Este almidón diferente: al de la patata es fácilmente soluble en agua caliente y se usaen fisiología para determinar la velocidad de filtración glomenilar. Las dextrinas son sustancias que se producen durante el proceso de desintegración liidrolítica del a l m i d ~ nLas . dextrinas son los primeros productos que se forman cuando la hidrdlisis alcanza un cierto grado de las ramificaciones. La celulosa es el principal constituyente del armazón de los vegetales. No es soluble en los solventes ordinarios y consiste en unidades de beta-D-glucopiranosa unidas por enlaces beta (1 + 4) para Fomar cadena rectas, largas, reforzadas por enlaces cruzados de puentes de hidrógeno. L a celulosa no puede ser digerida por numerosos mamíferos, incluso el ser humano debido a la ausencia de una hidrolasa que ataca al enlace beta. Por tanto, es fuente importante del "volumen" en la alimentación. En el intestino de los rumiantes y otros hcrbivoros, hay microorganismos que pueden atacar el enlace beta, haciendo a la celulosa accesible para usarse como fuente energktica importante. Este proceso puede tener lugar a un grado limitado en el colon humano. La quitina es un importante polisacárida estructural de los invertebrados. Se encuentra, por ejemplo, en los exosqueletos de los crustáceos e insectos. Químicamente, la quitina está formada por unidades de h c e t i l - ~ - g l u c o s a m i n a unidas por enlaces beta (1 -r 4)-glucosídicos (figura 15-I6). Los glucosaminogiucanos ~mucopolisac~ridos) están constituidos por cadenas de carbohídratos complejos que se caracterizan por su contenido en aminoazúcares y iicidos urónicos. Cuando estas cadenas se unen a una molicula de proteína, el compuesro se conoce como un proteoglucano. A l igual que la sustancia fundamental o de envoltura, están relacionados
LACTOSA
H O Q H O H
H H
oH
H H
Figura 15-13. Estructuras de disacáridos representativos Los simboloc alfa y beta se refieren a la configuración en el átomo anomériw de carbono (*) Cuando el carbono anormerico del segundo residuo toma parte en la formación del enlace glucosidim, el residuo se convierte en un glucósido conocido corno furanósido o piranbsido Como el azúcar ya no tiene carbono anomerico con un grupo libre potencial, aldehido o cetona, ya no muestra propiedades reductoras, como la mayor parte de los demas azucares.
con elementos estructurales de los tejidos como el hueso, la elastina y la colhgena. Su propiedad de retener grandes cantidades de agua y de ocupar espacio, acojinando o lubricando otras estructuras, es auxiliada por el gran número de grupos 4 H y de cargas negativas de las molkculas, las cuales por repulsión conservan separadas a las cadenas de carbohidrato. Ejemplos son el ácido bialurbnico, el sulfato de
Cuadra 15-4. Disachridos -.
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Fuente +
A -
n can arnilasa n hir
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clínica
1
piicdc apnirccer eri l a I;n la deficienciade Iactasü, sii nialahsorciún crinduce a diarrea \. flatulencia Zzúcar de caria y betabcl. Sorgo. Pifia. kwahorias
En la deficiencia de sacarosa, la rnalabsorciiiii ,
flatulenci:
Jcar princ ipal de l a
condroitina y la heparina (figura 15-16}, descritos con detalle en el capítulo 57. Las gliicoproteínas (mucoproteinas) existen en muchas condicianes diferentes en los líquidos corporales y en los tejidos, incliiyendo las membranas celulares (capítulos 43 y 56). Son proteinas que contienen carbohidratos en diversas proporciones adheridos en fonna de cadenas cortas o largas (hasta 15 unidades), ramificadas o no. Estas se denominan cadenas oligosacáridas (aun cuando en ocaciones pueden exceder de 10 unidades). Los carbohidratos constituyentes se listan en el cuadro 15-5. Excepto en la colágena, la glucosa no se encuentra en las glucoproteinas maduras y, al contrario de los glucosaminoglucanos y peptidoglucanos, caTecen de acidos urónicos. Los acidos siirlicos son derivados N-acilo u Oacilo dcl icido neuraminico (figura 15-18). El hcido neurzimínico es un aziicar de nueve carbonos derivado d e la manosarnina (un epimero de la glu-
cosamina) y piruvato. Los ácidos siBlicos son constituyentes de gliicoproteínas y ganglicísidos(capítulos 16 y 56). Los gangliosidos tamhien son glucolípidos.
LOS CARBOHIDRATOS ESTÁN PRESENTES EN LAS MEMBRANAS CELULARES Y EN LAS LIPOPROTE~NAS La estructura lipídica de la membrana celular se describe cn los capítulos 16 y 43. Sin embargo, el análisis de componentes de membranas celulares de los marniferos indica que aproximadamente 5% de ellos son carbohidratos. presentes como glucoproteínas y glucolipidos. Los cm-bohidratos también estan presentes en algunas lipoproteinas, por ejemplo, las lipoproteinas de baja densidad (1,DL del ínglks, iow-de~sifvlipoproleiris). Su existencia en la superficie externa de la membrana plasmática (el glucocáliz) ha sido de-
Figura 15-14. Estructura del almidón. A: Amilosa, mostrando Fa estructura helicoidal. B: Amilopectina, mostrando un punto de ramificación 1+ 6.
1 74 Binqztitnica de Harper
(Capitulo I 5)
Figura 15-5. Molecula de glurkgeno A: Estructura general B: Amplifimcibn de la estructura en un punto de ramificación. La molécula es una esfera que se aproxima a los 21 nm de diámetro y puede visualizarse en el microscopio elecirbnim. Tiene una masa rnolecular de 10' Da y consta de cadenas polisacaridas cada una de las cuales contiene alrededor de 13 residuos de glucosa. Las cadenas son ramificadaso no ramificadas y se agrupan en 12 capas conoéntricas (enla figura sdlo se muestran cuatro). Las cadenas ramificadas (cada una tiene dos ramas) se localizanen las capas interiores y las cadenas no ramificadas en la capa externa (G.glumgenina, la primer molécula de la sintesis del gluc6geno)
mostrada con el empleo de las lectinas, vegetales que se fijan de modo especifico a ciertos residuos glucosilo. Por ejemplo, la concanavalina A tiene especificidad hacia r e s i d u o s alfa-glucosilo y alfa-manosilo. La glucoforina es la mas importante
Cuadro 15-5. Carbohidsatos que se encuentran en las g:lucoprot1 eínas . . . -. .. .
---
xosas
a( M 4 osa (Gal)
tilglucosmiina (GlcNAc) iilgalactosíimina (GalNAc)
Acetil hexr
samin, ntosas
Arabinosa (Ara)
neurhico, is Derivados K-acilc1 del ácidom h7-aceti' Ineurhico p r ejt:mplo, hciilo - . . . .. ....
,. figura 1 ,,predominante C)rlmii
A.c,
15-18), e l ácido sialico
glucoproteina integral de la membrana de los eritrocitoc humanos. Tiene 130 residuos de aminohcidos y se extiende por la membrana Eipidica, dejando porciones polipeptidicas libres tanto por el lado externo como por el interno (citoplismico) de la superficie. Las cadenas de carbohidrato únicamente están adheridas a la porcion arnino terminal del lado externo de la superficie de la membrana (capitulo 43).
RESUMEN 1) Los carbohidratos son constituyentes principales del alimento y los tejidos animales. Pueden caracterizarse por el tipo y número de residuos monosac8ridos en sus mol&culac. 2) La glucosa es el carbohidrato m b importante en la bioquirnica de los mamíferos debido a que casi todo el carbohidrato de los alimentos se convierte en glucosa por metabolismo adicional. 3) Los azúcares tienen un número elevado de estereoisbmeros debido aque contienen varios Atomos de carbono asjmétricos.
Quitina
Figura 15-77. beta-L-Fucoca(6-desoxi-p-L-galactoca)
4) Los monosacaridos de importancia fisiológica
Acido hlalurónico HOCH,
cm-
H
-
H
HN*CO*CH
OH
Condro~tin4-sulfato [Nofa:tambien hay 6-sulfatoj
HOCHZ
H
incluyen glucosa, que es el "azúcar sanguíneo", y ribosa, constituyente importante de nucleótidos y dcidos nucleicos. 5) Los disacaridos de importancia fisiolhgica son rnalíosa, intermedio importante en la digestión de alrnidbn y glucdgeno; sacarosa, irnportante como constituyente dietktico que se compone de h c l o s a y glucosa; y lactosa, hnico azticar encontrado en la leche y que contiene galactosa y glucosa. 6 ) El almidón y el glucógeno son polimeros de almacenaje de glucosa en vegetales y animales, respectivamente. Son fuentes importantes de energia de la alimentación. 7) Las carbohidmtos complejos contienen otros derivados como aminoazúcares, ácidos ur6nicos y ácidos sialicos. Incluyen a proteoglucanos y glucosaminoglucanos, que son elementos estructurales de los tejidos y glucoproteinas, que son proteínas que tienen adheridas cadenas de oligosacáridos; se encuentran en los organismos en numerosas ubicaciones, incluyendo la membrana celular. I
OH
Acido B-glucurónico
Suifato de N-acetiigaiactosamina
Heparina
Glucosamina sulfatada
Acido idudniw sulfatado
Figura 15-1 6. Estructura de algunos polisacaridos complejos y glucosaminoglucanos.
Flgura 15-1 8. Estructura del Bcido N-acetilneuraminico, un lcido siálico (Ac = CH3-CO-).
1 76
Bioq~iitnicade Hurper
(Capítulo 15)
REFERENCIAS Callins PM (editor): Carbohydrates.ChapmandZHall. 1987. El-Khadem HS: llarhohydrntc C h e r n z s t ~ Molaosnccha. rldes and their O1igomer.v Academic I'ress, 1988.
Ferrier RJ, Collins PM: ~IfonosaccharidrChernis!~Penguin I3onk5. 1972 Hughes RC: The complex carbohydnteq of mamaIian cell surfaces and their biological roles. Essays Biochem 1975,Il.l Lindaht U, Hiriik M: Cilycnsan~inoglycansand lheir hind[ng to bialogicnl macromolcculcs Annu Rev Brochem 1978,47:385
Melendes-Hevia E, Waddell TC, Shelton DE: Optimiraiion of rnolecular design in the evoluíion of metabolism: 'lhe glycogen molccule Riochem J 1993:295:477 Pigman WW, Horton B (editors): I'he Carhohydrates. Vols 1A ( 1 972) and 1B (1980) Acadcmic Press. Ress DA: Polysaccharide Shapes. Wiley. 1977. Sharon N: Carbohydrates. Sci Am 1980,245 90
Lípidos de importancia fisiológica Peter A. Mayes, PhD, DSc
LOS L~PIDOSSE CLASIFICAN COMO SIMPLES O COMPLEJOS Los Iípidos son un grupo heterogéneo de compuestos emparentados, real o potencialmente, por sus propiedades físicas. mis que por las químicas. Tienen la propiedad corntín de ser: 1 ) relativamente insoliibles en agua y 2) solubles en los solventes no polares como el Mer, el cloroformo y el benceno. Asi, los lipidos incluyen grasas, aceites, esteroides, c e r a y compuestos relacionados. Los lipidos son constituyentes importantes de la alimentación no cOlo por su elevado valor energitico, sino tarnbiin por las vitaminas liposolubles y los ticidos grasos escnciales contenidos en lagrasade los alimentos naturales.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA En el cuerpo, las grasas sirven como una fuente eficiente, directa y potencial, de energía directa cuando están almacenadas en el tejido adiposo. Sirven como aislante t&rmicocn los tejidos subcucaneos y alrededor de ciertos organos, y los Iípidos no polares actúan como alslantes clkctricos que permiten la propagacion rápida de las ondas dcspolñrizantes a lo largo de los nervios rnielinizados. El contenido de lipidos en el tejido nervioso es particularmente alto. Los lipidos y proteínas combinados (Iipoproteínas) son constituyentes celulares importantes que se encuentran en la membrana celular y en las rnitocondrias y sirven tambien como medios para transportar Iípidos en la sangre. El conocimiento de la bioquirnica de los Iípidos es importante en la comprension de muchas áreas biomkdicas de interés, por ejemplo, obesidad, aterosclcrosis y la fincibn de varios Acidos grasos poliinsaturadris en la nutrición y la salud.
La siguiente clasificaci6n de los lipidos modifica la de Eloor: 1 ) Lípidos simples: Ésteres de hcidos grasos con diversos alcoholes.
a. Crasas: h t e r e s de hcidos grasos con glicerol. Unagrasaen estado iiquido se conoce como aceite. b. Ceras: Esteres de icidos grasos con alcoholes rnonohidricos de peso molecular más elevado. 2) Lipidos complejos: Ésteres de ácidos grasos que contienen otros grupos quimicos además de un alcohol y del Acido graso.
a. Fasfolfpidos: Lipidos que contienen ademhs de hcidos grasos y un alcohol, un residuo de acido fosfdrico. Con frecuencia tienen bases nitrogenadas y otros sustituyentes, por ejemplo, en Ios glicerofosfolipidos el alcohol es el glicerol y en los esfingofosfolípidosel alcohol es la esfingosina, b. Glucolipidos (glucoesfingolípidos): Lipidos que contienen un ácido graso, esfingosina y carbohidratos. c. Otros lipidos complejos: Lipidos como sulfolipidos y aminolípidoc. También las lipoproteinas pueden colocarse en esta categoría.
3) Lipidos precursorm y derivados: Incluyen ácidos gracos, glicerol, esteroides, alcoholes diferentes al glicerol y los esteroles, aldehidos de las grasas y cuerpos cetónicos (capitulo 241, hidrocarburos, vitaminas Eiposolubles y hormonas. Debido a que no poseen carga eleictrica, los acilgliceroles (acilglicéridos), el colesterol y los esteres de colestenlo sc IIaman Iípidos neutros.
LOS ÁCIDOS GRASOS SON ACIDOS CARBOXFLICOS ALIFÁTICOS
Los acidos grasos saturados no contienen dobles ligaduras
Los ácidos grasas existen en grasas y aceites naturales en gran parte como ésteres, pero se les encuentra sin esterificar como acidos grasos libres, modalidad plasmritíca de transporte. Los que existen en las grasas naturales generaln~entecontienen un níimero par de átomos dc carbono porque sc sintetizan a partir de unidadcs de 2 carbonos. La cadena puede ser saturada (esdecir, sin dobles ligaduras) o no saturada (con una o más dobles ligaduras).
Los acidos grasos saturados teóricamente se puedcn considerar como provenientes del ácido acético (CI4,-COOH) que sería el primer miembro de la serie en la cual se adicionan progrer~vamente--CH?entre Ins grupos 4 O O H y el CI1,- termina1. Ejemplos de los ácidos de esta serie se muestran en cl cziadro 16-1. Se sabe que existen otros miembros de esta. serie con mayar número dc átomos de carbono,
" -
Los acidos grasos se denominan de acuerdo a los hidrocarburos correspondientes
Nombre común
a,[ noinenclatura cistemhtica usada mis frecuentemente
se basa en poner al icido graso el nombre del hidrocarburo con el mismo número de átomos de carbono, sustituycndo la. o final por la tenninacion -oico (sistema ginebrino). Así, los ácidos saturados terminan en -iinoico, por ejemplo el ácido octanoico, y los ácidos insatiirados cnn dobles ligaduras terminan en -cnoico, por ejemplo, el ácido octadecenoico (Acido oleico}. Los ritornos de carbono se numeran a partir del carbono mrboxilico(carbonoNo. 1). Al átomodecarbono adyacente al carbono carboxilico (No. 2) 5e le conoce también como el carbono alfah1,os itomos de carbono No. 3 y Nci. 4 son el carbono beta y el carbono gamma; el carbono metiiico terminal se conoce como carbono omega o carbono n. Se usan varios convencionalismos para indicar el numero y I A posicibn de las dobles ligaduras, por ejemplo, A'5ndica una doble ligadura entre Ios &tomos de carbono 9 y 10 del hcido graso; el símbolo m 4 indica una doble ligadiira en el noveno carbono contando desde el itomo de carbono omega. Una costumbre in iiy difiindida consiste en indicar el número de atitornos de carbono y el número y la posición de las dobles ligaduras como se muestra en la figura 16-1. En los animales, las dobles ligaduras adicionales se introducen solo entrc la doble ligadura existente (por ejemplo, (119,w6 u w3) y el carbono del carboxilo, conduciendo a Eses series de &cidos grasos, conocidas como las familias 09, m 6 y w3, recpcctivamente.
<
Cuadro 16-1. Ácidas grasos saturados
-. "
Numei
Interviene en cl metabiilisrno de las unidddes *'Cl (fomiato)
Fhrmice*
"
Acftico
2
1 Principal producto final de
L;i
' fcrmc:ntacion di: carbohidradel tos pi31. microor rilmcllt
-
1 1 1 ~ ~de1 la ferrncntaciiin de (;arhnhidra tos del-rumen -. -- noi u i i vlVLIUbLU
Caproico
.,>..&,:,l* ExisTcn mi ntrlueii~x . . irnr criiiii~iíadcs en ciertas grasas (cspccialmente: cn la mntitcquilln) Iln producto final ri e la Ikrrnentar:ihi 7 ne carnohidratos pnr
en cn peclueAas cnriti-
en mucnas grasas (iiiilla): cspccliil-
vegetal ,,311b1lllaliCLI*
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Nuez
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:quilla mes cn totins Iss Erasas
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Cerek
iceite de ciicahiia ,,,,, --, . , airIU1111. * r.c[ric[amcntc.no es un aerivauo TarnbiCn se forma en el ciego de los hcxbívor'os y cii menor cantidad en el colon de seres hurnni 10s. a -
1
' Figura 16-1. Acido oleim, n-9 (n menos 9) es equrvalente a (:19
Lipidos de importancia fisiol6:ica
2) Ácidos poliimburadm ( p o l i o i d e , polienoioo), que contienen dos o más dobles ligadurac. 3) Eicosanoides: Estos compuestos derivados de IOF Acidosm -, eeiosapolienoicos (20-421, mprenden a los prmtanoides y los Ieumtrienos (LT). Los prostanoides incluyen a las prostaglandinas (PG), prostaciclinas (PGI) y tsomboxanos (TX).
en especial en las ceras. Tambikn se han aislado algunos hcidos grasos de cadena ramificada de fkentes vegetales y animales.
Los ácidos grasos insaturados contienen una o más dobles ligaduras (cuadro í6-2) Se pueden subdividir según el grado de insaturacihn en:
Las prostaglandinas fueron descubiertas originalmente en el plasma seminal, pero ahora se sabe qiie
1) Ácidos monoinsaturados (rnonoetenoide, monoenoico), que contienen una doble ligadura.
mportencia fisiolhgica y nutricional
Cuadro 16-2. Ác idos grasi
--- .-.--
. --. .. . ... - --.--. .-
llUIrleruuiatomi~T de C y porricibn de as dobles Iligaduras .
"
J 79
-. - - .. .
.
--. .
-
-
Presencia
Yambre sir
común
-
oicos (una doble liga
--
I casi
todas las grasas
isiblemente el icido graso mas rnun en las grasas naturales laidico 1 7 a o nabo j
nicico
1 cir- 1 5 - ietracoseno
erv6nico ,,,.,,,,,,,," ,
+
IX:2;9.12 -
18:3;6,Y,12
,,,,..,,,
, ,,, ,,,
.
,,, ,,
,
I
.
los cerebr
Ácirlos dienoic:os (dos ,,,,,,,,,, do
,.
I
. .-
1 h d o s cis-Y,~ Z - O C ~ ~ ~ ~ C ~ Maíz, I C ~ cacahuate. O ~ C O semillas de aldhn, frijol de soju 1
i ac,cites vegct;ales
SS
-
-%
Ácidos trienoicos (tres dohles ligaduras)
gmrna-l ,i-
noico
nolenico & -
Todos ci.
1
AI gunas plantas; por gempio, aceite i de la hierba del asno; hcido graso i mi :nor en los animales --
1
ioico
Acidos tetrnenoicos (cuatro dobles lig
-1
r n q u i d b Todos c i co 1
"
"
A
"
-
Cc)n frecuencia se encuentra juntO con el áado linoleico pero en pa rtic ular en el eiceite de !iri a a m
encuentra en grasas animales y en aceite de i:acahuatc; cornponcnte A. pul iruiiG U< los fosfolipidos en los imales , , d , , , ,
Ácidos pentaenoiicos (cinco dobles lig
aceites de pescado, huevo, higado d e bacaIao,marcarda. shbaio, salmiin
22:5;7,30,13,16,19
1 tenoico
rehro icos (seis dlobles ligniiduras)
-
,%A
Lcr voriico
1 hexanoico I
17 16.19-ducuhn- . l r c e i i c b uc pcxauu. i u ~ i v ~ ~ l i i uuel us
uulii. crh-.t, t , I u
'
-
-1- cerebro . . .. .
existen virtualmente en todos los tejidos de marniferos y que actúan como hormonas locales; tienen importaiites actividades fisiolbgicas y farmacológicas. Son sintetizadas in vivo por ciclización del centro de la cadena de carbono de los ácidos grasos poliinsaturados 20-C (eicosanoicos) (por ejemplo, ácido araquidónico) para formar un anillo ciclopentano (figura 16-2 j. Una sene análoga de compuestos, los tromboxanos, descubiertos en las plaquetas, tienen el anillo ciciopentano interrumpido por un átomo de oxígeno (anillo oxano) (figura lb-3). Tres hcidos grasos eicosanoicos diferentes daii origen a tres grupos de eicosanoides caracteri7ados por el niirnere dc dobles ligaduras en sus cadenas laterales; por ejemplo, PGi, PG?, t'G3. Las variaciones en los grupos sustituyentes adheridos a los anillos originan tipos diferentes en cada serie de prostaglandinas y tromboxanos, denominados A, B, etcetera. Por ejemplo, el tipo "E" de prostaglandina (como en PGE:) ricnc un grupo cet6nico en la posición 9, en tanto que el tipo "F" tiene un grupo hidroxilo en esta posición. Los leucotrienos y las Iipoxinas son un tercer grupo dc derivados eicosanoidcs romados por la via de Ia lipoxigenasa mas bien que por ciclización de la cadena del ácido graso (figura 164). Descritos en un principio en los leucocitos, se caracterizan por la presencia de tres dobles ligaduras conjugadas, respectivamente.
La mayor parte de los ácidos grasos insaturados naturales tienen dobles ligaduras cls Las cadenas de carbono de los ácidos grasos saturados tienen un patrón de zigzag cuando se extienden, corno seria el caso a temperaturas bajas. A temperaturas mayores, algunos enlaces giran, haciendo que la cadena se acorte, lo cual explica por que las biornembranas se adelgazan cuando la temperatura aumenta. En los ácidos grasos insaturados existe un tipo de isomeria geométrica, dependiendo de la orientación de los átomos o grupos funcionales alrededor del eje de Ias dobles ligaduras. Si las cadenas acilo están en el mismo lado del enlace es ~ i scomo , en el ácido oleico; si estan en lados opuestos, es tran~, como en el acido elaidico, isómero del Acido olclico (figura 16-5). Los hcidos grasos insaturados de cadena larga que existen en la naturaleza son casi todos de la configuración cis, con
Flgura 46-2. Prostaglandina
E2
(PGE2).
Figura 1 6 3 . Tromboxano A2 (TXA2)
un "doblez" de 120" en la doble ligadura. Por tanto, el iicido oleico tiene forma de L, en tanto que el ácido elaidico se conserva "recto" en su doble ligadura Irunh. El aumento en el numero de doblcs ligaduras cis en un Bcido graso conduce a una diversidad de configuraciones espaciales prisi hles de la mulécula. por c,jcmplo, ácidri araquidonico, con cuatro enlaces dobles crs, puede tener "rizos " o una forma de U. Esto puede tener un significado profiindo e n el empaquetamiento molecular dentro de las membranas y en las posiciones ocupadas por los acidos grasos en moleculas más complejas como los CosfoIipidos. La presencia de dobles ligaduras trans alterará las relaciones espaciales. Algunos alimentos contienen hcidos grasas fraris.I,a mayor parte son subproductw en la saturacion de los ácidos grasos durante el proceso de hidrogenación o "endurecimieiito" de aceites naturales para fabricar margarina. Una contribución pequefia adicional proviene de la íngestihn de grasas de nirniantes que contienen ácidos grasos iruns procedentes de la acción de los rnicroorganismos en el rumen.
Las propiedades físicas y fisiolcigicas de los ácidos grasos están determinadas por la longitud de su cadena y por su grado de insaturación Por tanto, los puntos de fusión de ácidos grasos con un numero par de carbonos se elevan con la longitud de Ia cadena y bajan de acuerdo a la insaturacion. U n triacilglicerol que contienc todos los Bcidos gracos de 12 C omhc saturados, es s6lido a la temperaturacorporal, en tanto que, si los tres residuos de ácido graso son I&:2,es liquido por abajo de O "C. En la práctica, los acilgliceroles naturales contienen una mezcla de ácidos grasos que los adapta con precisión a sus funciones.
Figura 1 6 4 . Leucotrieno A4 (LTA4)
Lipidos de importancia fisinlb~ica 18J
puesto que se forma por tres residuos d e acido estearico esterificados por el glicerol. Un ejemplo de acilgliceroles mixtos se muestra en la figura 16-7.
Los átomos de carbono 1 y 3 del glicerol no son idénticos
:: (Bcido Forma cis oleico) \
'.
("H
cII
Y' coo -
Figura 16-5. lsomeria geometrica de los ácidos grasoc d9,I 8.1 (Acidos oleico y elaidico).
Los lípidos de la membrana, que deben ser líquidos a todas las temperaturas ambientales, son más insaturados que Ios lipidos almacenados. Los Iipidos que en los tejidos están sujetos a enfriamiento, por ejempIo, en hihernadores o en las extremidades de animales, son más insatusados.
Ciertos alcoholes se encuentran en los Fípidos naturales Los alcoholes relacionados con los lipidos incluyen el glicerol, el colesterol y los alcoholes superiores (por usualmente H), enejemplo, alcohol cetílico, C L ~ H ~ ~ Q contrados en las ceras y cl alcohol poliisoprenoide, dolicol (figura 16-26), LOS TRIACILGLICEROLEC (TRIGLICERIDOC)*SON LAS PRINCIPALES FORMAS DE ALMACENAJE DE LOS ÁCIDOS GRASOS
Cuando es necesario numerar de manera inequívoca a los carbonos del glicerol, se utiliza el sistema -sn(s~ereuchernrealnumhering = numcraciún estereoqu imica), por ejemplo, 1,3-distearil-2-palmitil-.m-gliceroI (que se muestran GQmOuna fbmula proyectada tarnbien en la tigura 16-81, Es importante comprender que los carbonos 1 y 3 de glicerol no son iddnticos cuando se ven en tres dimensiones. Las enzimas los reconocen con facilidad y son casi siempre especificas para uno u otro carbono; por ejemplo, el glicerol siempre es fosforilado en sn-3 por la glicerocinasa para dar 3-fosfato de glicerol y no 1-fosfato de glicerol. También se encuentran en los tejidos acilgliceroles parciales que consisten de mono y diacilgliceroles en los cuales dos hcidos grasos o solo uno esthn esterificados con el glicerol. Estos son de particular importancia en la síntesis e hidrolisis de los triacilgliceroles.
LOS FOSFOL~PFDOS SON LOS PRINC1PALES CONSTITUYENTES LIP~DICOSDE LAS MEMBRANAS Los fosfollpidoc comprenden los siguientes grupos: F j hcicido fosfatidico y fosfatidilgl iceroles, 2) fosfatidi lcolina, 3 ) fosfatidiletanolarnina, 4) fosfatidilinositol, 5) fosfatidilserina, 6j lisofosfolipidos, 7) plasmalógenos y 8) esfingomielinas. Todos &tos son fosfoacilgliceroles, diferentes de las esfingomielinas, las cuales no contienen glicerol. Pueden considerarse como derivados del hcido fosfafidico (figura 16-9), en donde el fosfato se esterifica con el - 0 H del alcohol adecuado. El ácido fosfatídico es muy importante como intermedio en la síntesis de triacilgliceroles y fosfollpidos, pero no se encuentra en gran cantidad en los tejidos. 4 S
Los triacilgliceroles son &eres del alcohol glicerol y ácidos grasos. En las grasas que se encuentran en la naturaleza, la proporción de rnoleculas de triacilgliceroles que contienen el mismo residuo de ácido graso en las tres posiciones esterificadas ES muy pequetia. Casi todos son acilgliceroles mixtos. En la figura I 6 4 , si los tres ácidos g a s o s representados por R fueran Bcido estchríeo, la grasa scrla la triestearina,
I)e acuerdv con la terminología estandarizadaactual dc la Uniún Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC.
del inglks, lnrernat~onal Union of Prwe and Applled Chemishy) y de la Unibn Internacional de Riuquiiiiica (IUB, del ingles. Inlernaiiunal IJniun nJ Bincirerni.~tg~). los monuglicéridos, digliceridos y triglirkridos se designarj, en adelante como monoacilglicerciles,diacilglicernles y triacilgliceroles, rcspcctivamentc. Stn embargo, la terminología anterior se utiliza con amplitud, cn particular en la medicina clinica.
(Capítulo 16)
18.2 0 Bioauimica de Harner
O II
O 'CH, - O-C-R, II R, -C -O 261-1 O II
I
T H , -O-C-R,
La cardiolipina es el principal Iipido de las membranas mitocondriales El hcido fosfatidico actúa como precursor del fosfatidilglicerol, el cual n su vez, da origen a la cardiolipina (figura 16-1 0) en las rnitocondrias.
Figura 16-6. Triacilglicerol.
Las fosfatiditcolinas (lecitinas) se encuentran en las membranas celulares
Figura 16-7. 1,3-Diectearopalmitina.
I H$-
O lf
O - C-R,
Figura 16-8. Triacil-snglicerol
Éstas son fosfogliceroles que contienen colina (figura 16-1 1 ). Son los fosfolipidos m6s abundantes de Ea membrana celular y constituyen la reserva corporal mhs importante de colina. Esta última se requiere como neurotransmisor y para almacenar grupos metilo libiles. La dipalmitil-iecitina es un agente activo de superficie muy eficaz y el principal constituyente de los surfactantes que impide la adherencia debida a la tensión superficial, de las superficies internas de los pulmones. Su ausencia en los pulmones de los Iactantesprernaturos causa el sindrome de insuficiencia respiratoria. Sin embargo, la mayor parte de los! fosfolipidos tienen un radical acilo saturado en la posicidn an-1 y un radical no saturado en la posición sn-2 del glicerol. La Fosfatidiletanolamina (cefalina) difiere de las lecitinas s61o en que la etanolamina reemplaza a In colina (figura 16-12). La fosfatidilserina, que contiene al aminokcido serina en lugar de ebnolamina, se encuentra en la mayor parte de los tejidos (figura 16-13), También se han aislado fosfolipidos que contienen tresnina.
E! fosfatidilinositol es un precursor de segundos mensajeros El inositol se halla como el estereois6mero mioinositol (figura 16-1 4). El 4,Hifosfato de fosfatidilinositoE es un constituyente importante de los fosfolipidos de la membrana celular, con la estimulaci6n por un agonista hormonal apropiado, se separa en diacilglicerol y trifosfato de inositol, actuando ambos como sefiaies internas o segundos mensajeros (capitulo 44).
O O rl
R2-
CH,I
C - O-CH I
II C-Rl
R
CH, - O - P - 0 I
0-
Figura 16-9. Acido fosfatidico.
Los lisofosfolípidos son intermedios en el metabolismo de fosfogliceroles Estos fosfoacilgliceroles contienen s61o un radical acilo; por ejemplo, la lisolecitina que es importante en el metabolismo y en la interconversibn de los fosfolipidos (figura 16-1 5).
Fosfatidil acilglicerol
Diosfatidil acilglicerol (cardiolipina)
Figura 16-10. Cardiolipina (difocfatidilgiicerol)
Los plaamalógenos se encuentran en el cerebro y los músculos o II
lp,-O-C-R,
9 T H , -0-7 -O-CI
R r C -02CH
F H 3
I
i- CH, \CH,
O-
c Colina
Estos compuestos llegan a constituir hasta 10% de los fosfolípidos del encefalo y del músculo. Estructuralmente, los plasmalogenos semejan a la fosfatidiletanolamina, pero poseen un enlace éter en el carbono SPI-1 en lugar del enlace &ter normal que se encuentra en casi todos los acilgliceroles. Clasicamente el radical alquilo es un alcohol insaturado (figura 16-1 6). En ocasiones la colina, la serina o el ínositol pueden sussituirse por la etanolamina.
Figura 16-1 1. 3-Fosfatidilcolrna
Las esfingomielinas también se presentan en el sistema nervioso u 11
l7HI -O-C-Rl
f
RrC-OLyH >CHl -O-P
1
CH,NHi
-O-CH2*
O-
Etanolamina
Las esfingomielinas se encuentran en grandes cantidades en el endfalo y tejido nervioso. Por hidrólisis de las esfingomielinas se obtienen un hcido graso, hcido fosfbrico, colina y un aminoalcohol complejo, la esfingosina (figura 16-17), N o hay glicerol. La combinación de la esfingosina con un Acido graso se conoce con el nombre de ceramida, estructura que también se encuentra en los glucosfingo1 ipidos (vkase adelante).
Figura 16-1 2.3-Fosfatidiletanolamina.
14
II
'yH2 -O-C -R1
c - o -%tiI
FH,
- O-P
HHa+ FI -0-CHp-Ctl-C00I F C
o-
J Y
Serina
Fígura 16-1 3. 3-Fosfatidilserina.
Figura 16-14. 3-Fosfatidilinositol.
LOS GLUCOL~PIDOS (GLUCQESFINGOL~PIDOS)TIENEN IMPORTANCIA EN TEJIDOS NERVIOSOS Y EN LA MEMBRANA CELULAR
7
CH2- O-C-R
Colina
Figura 16-15. Lisolecitina.
Etanolamina
Figura 16-1 6. Plasmalbgeno (fosfalidaletanolamina)
Ceramida
Acido fosfórico
1
0
I O=P-0
graso -
+
I
O-CH,-CHyN(CH,lI, Colina
Figura 16-1 7. Una esfingomielina
f
Los glucolipidos están distribuidos ampliamente en cada tejido del cuerpo, en particular en el tejido nervioso (como en el cerebro). En especial, se encuentran en la capa extenia de la membrana plasmática donde forman partc de los carbohfdratos d e la superficie celular. La glucolipidos principales en los tejidos animales son los glucoesfingolipidos. Contienen ceramida y una o mas anicares. Los dos más sencillos son galactosilceramida y glucosilceramida. La galactosilceramida es un glucoesfingolipido mayoritario del cerebro y otros tejidos nerviosos, pero se encuentra en cantidades relativamentebajas en el resto del cuerpo. Contiene cierto número de acidos grasos C:r caracteristicos. La galactosilceramida (figura 1 6-1 8) puede convertirse a sulfogalactosflceramida (el sulfato clasico), que abunda en la mielina. La glucosilceramida es el glucoesfingolipido sencillo predominante en los tejidos extraneurales, pero también existe en el cerebro en cantidades pequefias. Los gangliósidos son glucosfingolipidos complejos que se derivan de la glucosilceramida. Un ganglidsido es un glucoesfingolipido que contiene adernh una o más moléculas de un ácido sihlico. El ácido neurarninico (NeuAc; capitulo 15) es el principal &ido siálico encontrado en los tejidos humanos. Los gangliosidos están presentes también en el tejido nervioso en concentraciones altas. Al parecer tienen funciones de receptor y otras. El gangliósido m8s simple en los te.jidos es Gw, que contiene ceramida, una molécula de glucosa, una mol&culade
\
OH
1 CH,-(CH,),2-CH=
H
CH-CH-CH-N-C-
I
o 11
CH(0H) - (CH2)2i-CH, Ácido graso por ejemplo, Bcido cerebróniw
Galactosa
O-CH,
Figura 16-18. Estructura de galactosilcerarnida (galactocerebrbcido, R = H) y sulfogalactosllceramida (un sulfato, R = ~ 0 4 ~ 7 .
Ceramida-Glucosa4alaciosa-A-Acetilgalaosa
I
(Acilesfingosina)
NeuAc oí
Cer-Glc-Gal-GalNAc-Gal
I
NeuAc
Figura 16-19. Gangliosido G M ~un , rnonosfa10gangl1~sido que es el receptor en el intestino humano para la toxina del cólera.
galactosa y una molCcula de NeuAc. En la nomenclatura abreviada que se utiliza. (3 representa al ganglibsido; M es una especie que contiene un monosialice y el subindice tres es un numero arbitrario asignado con base en SU migración crornatográfica. La estructura de un gangliósido más complejo derivado de GVI, Ilamado GM~, se muestra en la figura 16-19. El GMIes un compuesto de considerable interés biolbgico ya que se sabe es el receptor en el intestino humano para la toxina del colera. Otros ganglibsidos pueden contener de 1 a 5 moléculas de Bcido sihlico, dando origen a di-, trisialogangliósidos, etcétera.
LOS ESTEROIDES DESARROLLAN NUMEROSAS ACTIVIDADES FISIOLÓGICAS IMPORTANTES El colesterol es quizá el esteroide mejor conocido debido a su relación con la aterosclerosis. No obstante, en bioquimica también tiene importancia debido a que es precursor de un gran numero de esteroides igualmente importantes que incluyen ácidos biliares, hormonas suprarrenales, hormonas sexuales, vitaminas D. glucósidos cardiacos, sitosteroles del reino vegetal y algunos alcaloides. Todos los esteroides tienen un núcleo ciclico semejante al del fenantreno (anillos A, B y C), al cual se une un anillo de ciclopentano (anilla D). Las posiciones de los carbonos en el núcleo esteroide se numeran como se muestra en la figura 16-20. Es impartante
comprender que en las fórmulas estructurales de los estcroidcs, un simple anillo hexagonal denota 1 de 6 carbonos completamente saturado, con todas las valencias satisfechas con ligaduras de hidrógeno a menos que se sefíale de otra manera, es decir, no es un anillo bencénico. Todas las dobles ligaduras se muestran como tales. Las cadenas laterales de metilo sc señalan como ligaduras sencilIas libres en el extremo (metilo) final. Esto sucede clásicamente en las posiciones 10 y 13 (constituyendo los atomes de CIs y Cis). Es comun una cadena lateral cn la posicihn 17, como sucede en el colesterol. Si el compuesto posee uno o m i s grupos hidroxilo y carece de grupos carbonilo y carboxilo, se trata dc un esterol y el nombre termina en -1.
Debido a la asimetría en la molécula esteroidea con posibles numerosos estereoisómeros Cada uno de los anillos de seis carbonos del núcleo del esteroide es capaz de existir en la conformacibn tridimensional de "silla" o de "barca" (fígura 16-2 1). En los esteroides que se encuentran en la naturaleza, virtualmente todos los anillos estan en forma de "silla" que es la conformaci6n m8s estable. Respecto uno del otro, los anillos pueden ser crs o trans (figura 16-22).
Forma de "silla'
Forma de "barca"
Figura 16-20. El nicle0 esteroide.
Figura 16-21. Conformaciones de los estereoisdmeros
Figura 16-22. Núcleo generalizado de los esteroides que muestra (A) una mnfiguracibn trans total entre andlos adyacentes, y (E) una configuración cis entre los an~llosA y B.
La union entre los anillos A y B pueden ser cis O trans en los esteroidec que se encuentran en la naturaleza. Aquélla entre B y C es trans y la unión C/Des truns excepto en los gluc6sidos cardiacos y los venenos de sapo. Las ligaduras que unen grupos de sustitucion por arriba del pIano de los anillos se indican con líneas negras continuas (beta), mientras que aquellas que unen grupos por abajo lo están con líneas punteadas (al fa). El anillo A de un esteroide Salfa está siempre en la forma trans con respecto al anillo B, mientras que es cis en un ecteroide Sbeta. Los grupos metilo unidos los C i n y CI3 esthn invariablemente en la configuración beta.
El colestro! es un constituyente importante de numerosos tejidos El colesterol (figura 16-23) se encuentra ampliamente distribuido en todas las cdlulas del organismo, pero especialmente en las del teiido nervioso. Es un constituiente de mayor importancia de la membrana celular y de las lipoproteinas plasmaticas. A menudo se encuentra combinado con ácidos grasos como &ter de colesterilo, cuando se esterifica el grupo hidmilo de la oosicibn 3 con un acido graso de cadena larga, Existe :n Ias grasas animales, pero no en las vegetales.
Figura g6-23. Colesterol, 3-htdroxi-58-colesteno.
El ergosterol es un precursor de la vitamina D El ergosterol existe en vegetales y levaduras y es importante por ser precursor de la vitamina D (figura 96-24). Cuando sc irradia con luz ultravioleta adquiere propiedades antirraquiticas debido a la abertura del anillo B (figura 5 3 4 ) .
El coprosterol se encuentra
en las heces El coprosterol (coprostanol) existe en las heces como producto de la reducción, por las bacterias intestinales, de la doble ligadura entre los carbonos 5 y 6 del colesterol.
Los poliprenoides comparten el mismo COrn~UestQ precursor que el Aunque estos compuestos no son esteroides, están relacionados debido a que se sintetizan al igual que el colesterol (figura 28-2) a partir de unidades de isop p n o de cinco carbonos (figura 16-25). En el10s se incluye la u biquinona (capitulo 14), un miembro de
Figura 16-24. Ergosterol.
Lípidos de in?portanciafisioIOgica 187
Figura 16-25. Unidad isoprenica. Figura 16-26. Dolicol a alcohol de 95 carbonos, Cgs.
la cadena respiratoria en la mitocondria y el alcohol de cadena larga, dolicol (figura 16-26), que toma parte en la síntesis de glucoproteínas transfiriendo residuos de carbohidratos a residuos de asparagina del polipkptido (capitulo 56). 1,os compuestos isoprenoides derivades de los vegetales comprenden el hule, el alcanfor, las vitaminas liposolubles A, D, E y K, y el beta caroteno (provitamina A).
rior. El proceso completo puede ilustrarse como sigue: 1) Inicio: ROOH + metal(")++ ROO' + metal("- l P + H' X'+KH+R0+XH
LA PEROXIDACIÓN DE LOS L~PIDOSES UNA FUENTE DE RADICALES LIBRES
R' + 0 2 + ROO' ROO' + RH -+ ROOH + R., etcétera
La peroxidación (autooxidacibn) de los Iípidos expuestos al oxígeno es la causa no sólo del deterioro de los alimentos (sancidez), sino tarnbidn del daflo a los tejidos rn vivo,donde pueden ser una causa di*chncer, enfermedades inflamatorias, aterosclerosis, envejecimiento, etcetera. t o s efectos deletéreos se inician por los radicales libres (ROO', RO' ,OH' ) producidos durante la formación de peróxido a partir de Qcidos grasos que contienen enlaces dobles de grupos metiIenos interrumpidos, es decir, de los Acidos grasos poliinsaturados que se encuentran en la naturaleza (figura 16-27). ~a pperoxidaci6n lipidica es una reacción en cadena que produce un suministro continuo de radicales libres que inician la peroxidacibn poste-
Rm
R
-LvH
H
H
3) Terminación: ROO' + ROO* -+ ROOR + 0 2 ROO'+ R" +ROOR R' + R ' + R R
Puesto que el precursor rnolecular para el proceso de inicio es generalmente el producto hidroperoxido ROOH, la peroxidación de los lipidos es una reaccidn en cadena ramificadora con efectos potencialmente devastadores. Para controlar y reducir la peroxidacion lipídica, tanto los seres humanos en sus actividades como la naturaleza, usan los anbioxidantes. El galato
R.
ROO*
Al&
/k:Hm
+Rm
H
H
Malondialdehldo,
Hidroperbxido ROOH
Figura 16-27. Peroxidadón de los lipidoc La reaccidn se inicta por la luz o por ionec metálicos. El malondialdehldo es el único compuesto formado por los Bcidos grasos con tres o mBs dobles ligaduras y se emplea como una medida de la peroxidacibn de los Ilptdos junto con el etano del carbono 2 terminal de los hcidos grasos omega3 y el pentano del carbono 5 terminal de los ácidos grasos omega6.
de propilo. butilato dc hidroxianisol (RHA, del inglCs, hutytated hdroq)unisole)y but ilato de h idrox itolueno (BI-ET,del inglés, hu~latedhydroxy~nluene) son antioxidantes usados como aditivos en los alimentos. Los antioxidantes naturales son la vitamina E (tocoferol), que ec liposoluble, y los uratos y la vitamina C que son hidrosolubIes. El heta caroteno es un oxidante cuando la PO: es baja. Los antioxidantes perttnccen a dos clases: 1) preventivos, que reducen la velocidad de iniciación de la cadena y 2 ) los interruptores de la cadena quc interfieren con su propagación Los antioxidantes preventivos incluyen a la catalasa y otras peroxidasas y reaccionan con ROOH y con quelantes de ionec metálicos como el dietilentriaminopentaacetato (DTPA) y etilendiaminotetraacetato (ED'I'A). Los antioxidantes interruptores de la cadena son a menudo fenoles o aminas aromat icas. /n vivo, los principales son: la superóxido dismutasa que actúa en la fase acuosa para atrapar a los radicales superóxido libres (O2-); ea1 ve2 el urato; y la vitamina E, que actúan en la rase lipídica para atrapar a los radicales ROO' (figura 53-9). La peroxidacion rn vivo se cataliza tam bien por los compuestos hemicos y por las lipoxigenasas que se encuentran en plaquetas y leucocitos, etcetera.
PARA IDENTIFICAR Y SEPARAR L~PIDOSSE UTILIZAN METODOS CRQMATOGRÁFICOS Los antiguos métodos de identificación y separacion de lipidos, basados cn procedimientos quimicos clasicos de cristaltzación, destilacion y extracción por solventes, se han reemplazado en gran parie por procedimientos cromatograficos. Particularmente util para la separación de las diversas clases de lipidos es la cromatografía en capa fina (CCF) (figura 16-28) y para la separación de los Acidos grasos individuales, la cromatografía gas-líquido (CGL). Antes de aplicar estas técnicas a los tejidos húmedos, los lipidos se extraen por un sistema de solventes usualmente basado en una mezcla de clorofomo-metano1 (2: 1).
LOS L~PIDOSANFIBÁTICQS SE ORIENTAN POR S! MISMOS EN LAS ENTERFASES ACE1TE:AGUA Forman membranas, micelas, liposamas y emulsiones En general, los lipidos son insolubles en el agua puesto que en SU contenido predominan los grupos no polares (de hidrocarburos). Sin embargo, los ácidos
Q
Triscilglicerolea
l
L
ente del ente
t
Ácidos grasos libres
Colesterol 1,3-üiacllgliceroles 1,Z-Diacilgliceroles
Figura 46-20. Separaciónde las principales clases de Ifpidos por cromatografia en capa fina. Un sistema adecuado de solventes para ellos seria hexano-&ter dietilico-acido famiice
(80~ O ' ~ V / V / V ) .
grasos, algunos fosfelipidos, esfingolipidos (las lipidos polares) y en menor grado, el colesterol, contienen grupos polares. Por tanto, parte de la molécula es hidrhfoba, o insoluble en agua, y parte es hidrófila o soluble en agua. Estas moléciilas se describen como anfipáticas (figura 16-29). En las interfases aceiteagua se orientan con el grupo polar en la fase acuosa y el no polar en la fase oleosa. Una capa doble de lales lipidos polarcs se considera como una estructura básica en las membranas biol~gicac(capitulo 43). Cuando se halla una concentración critica de estos lípidos en un medio acuoso, rorman micelas. Los agregados de salec biliares en micelas asi como Iiposomas, y Ia formacibn de micelas mixtas con las productos de la digestión de las grasas son importantes para facilitar la absorción de lipidos en el intestino. Los liposomas pueden formarse sorneticndo a un lipido anliphtico aultrasonido en medio acuoso. Consisten en esferas de dobles capas de Iipidos que encierran parte del medio acuoso. Tienen uso clínico potencial, particularmente cuando se combinan con anticuerpo5 específicos de los tejidos, como transportadores de fármacos en la circulacibn, orientados a órganos específicos, por ejemplo, en la terapéutica del cáncer. Ademas, se les utiliza como gen transferidor hacia el interior de las células vasculares y como porteadores para la administraciiin topica y transd6rmica de medicamentos y cosmeticos. Las ernalsiones son partículas mucho inhs grandes, usualmente formadas por lipidos no polares en un medio acuoso. Son estabilizadas por agentcs emulsionantes como los lipidos an fipáticos (por ejemplo, la lecitinn) los cuales forman una capa superficial que separa la masa principal del material no polar de la fase acuosa (figura 16-29).
Grupo polar o hidrdfilo Grupo no polar o hidrofob
Fase acuosa
Fase acuosa
Fase "olsosa"o no polar !
"k
000
Fase acuosa
DE ACEITE EN
AGUA O
Compat4rmientos
Bicapas Iipidicas
~CUOSOS
LlPOSOMA (UNICAMELAR)
LlPOSOMA (MULTILAMELAR)
E
F
Figura 16-29. Formacidn de membrana Iipidicas, micelas, ernulsiones y liposomas a partir de lípidos antipatims. por ejemplo, fosfolipido
RESUMEN 1) Los lipidos tienen la propiedad común de ser relativamente insolubles en agua (hidrofobos) pero solubles en solventes no polares. Sin embargo, los lipidos anfipaticos tienen agregado uno o mhc gmpos polares que los vuelve en particular adecuados como constituyentes de membranas en interfases 1ipidolagurt. 3) Los lípidos de mayor importancia fisiol6gica son los acidoc grasos y sus esteres, junto con colesterol y otros esteroides. 3) Los ácidos grasos de cadena larga pueden ser saturados, monoinsaturados o poliinsaturados, de acuerdo con el número de dobles ligaduras presente. Su fluidez disminuye de acuerdo con la longitud de la cadena y aumenta con el grado de insaturacion. 4) Los eicosanoides se forman de hcidos grasos poliinsaturados de 20 carbonos y constituyen un grupo
importante de compuestos activos en aspectos fisiológicos y farmacológicos, conocidos como prostaglandinas, iromboxano, leucotrienos y lipoxinas. S) Los Csteres de glicerol son respecta a su cantidad, los lipidos más importantes, representados por triacilglicerol ("grasa"), que tiene gran significado como constituyente principal de las lipoproteinas y como manera de almacenaje de Iípidos en el tejido adiposo. Los fosfoacilgliceroles son Iípidos anfipaticos y cubren numerosas funciones importantes; por ejemplo, constituyentes mayores de las membranas y de su capa exterior de Iipoproteínas, tensoactivos en el pulmón, precursores de segundos mensajeros y componentes importantes del tejido nervioso. 6) Los glucolipidos son tambiCn constituyentes significativos del tejido nervioso, como el encéfalo y la capa exterior de la membrana celular, donde forman parte de los carbohidratos de la superficie celular.
190 Broquímica de Hurpr
7) El colesterol, como lipido anfipático, es un componente importante de las membranas. Es la rnolecula precursora a partir de la cual se sintetizan los demás
(Capitulo 16)
estervides corporales. Éstos incluyen hormonas importantes como las suprarrenacorticales y sexuales, vitamina B y hcidos biliares. M
REFERENCIAS Christie WW: 1,iprd .ilnnlyris. 2nd ed. Pergamon Press.
I OH2 Cotgreave l A , Moldeus P,Orrenius S: 1-Iost hiachemical
defense mechanisrns against prooxidants. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1988;28:189. Frankel EN: Chernistp of Tree radical and singlel oxidarian of lipids. Prog Lipid Res 19X5;23:197. Cunstone FD, Aarwood JL, Padley FB: The Lipid lfandhnok Chapman & 1-Iall, 1986.
Ml, Harwood JL: Lipid Biuc~iemistry An Introduction, 4th ed. Chapman & Hall, 1991. Hawthorne JN, Ansell G R (editors): Phospholipidc Elsevier, 1982. Srnall DM: Lateral chainpacking in lipids and membranes. J Lipid Res 1984;25: 1490. Vance DE, Vance 3 E (editors): R~ockemisttyof Lipidr, Lipoproterns and iUernhranes. Elsevier, 199 1. Gurr
Panorama del metabolismo intermediario Peter A. Mayes, PhD, DSc
El destino de los componentes de [a dieta después de la digestidn y la absorción, constituye el metabolismo intermediario. Por tanto, abarca un campo extenso que no sólo describe las vias metabólicas seguidas por las moléculas individuales, sino que intenta comprender sus interrelaciones y los mecanismos que regulan el flujo de los metabolismos a través de ellas. Las vías metabóli cas pueden c tasificarse en tres categorías (figura 17-1): 1) Vías anabhlicss, se ocupan de la síntesis de los compuestos que constituyen la estruc-
tura y la maquinaria corporal. Una de ellas es la sintesis de proteinas. La energia libre requerida por estos procesos proviene de la categoría siguiente. 2) Vias catabólicas, realizan procesos oxidativos que producen energia libre, por lo general, en forma de fosfatos de alta energia o de equivalentes reductores, por ejemplo, la cadena respiratoria y la fosforilacibn oxidativa. 3) Vías anfibálicas, con mhs de una función y tienen lugar en las "encrucijadas" del metabolismo, cuando actijan como enlace entre las vías anabblicas y catabdlicas, por ejernplri, el ciclo del Acido citrico. Proteinas, carbohidratos, lipidos. Icidos nucleicos, etdtera
Mol&ulas del alimento
Digestidn
Vlas
Molbculas sencillas
aníibólicas
Otms endergdnicos
Figura 1 7 4 . Las tres categorlas princrpales de las vías metabblicas. Las vías catabblicas producen energía libre en forma de equivalentes reductores (2H) o fosfato de aRa energia para suministrarla a ias vías anabblicas. Las anfibblicas actuan como enlace entre las dos categorías anteriores.
(a)
192 a Bioquirnica de Harper
(Capítulo 17)
El conocimiento del metabolismo en el animal normal es rin prerrequisito para la comprensión profunda de las anomalías que se producen en muchas enfermedades. El metabolismo normal incluye las variaciones y adaptaciones necesarias en periodos de inanicihn, qiercicio, embarazo y lactancia. Los desequilibrios del metabolismo son consecuencia de, por ejemplo, una deficiencia nutricional, deficiencia de enzimas o la secreción alterada de hormonas. Un ejemplo importante de una enfermedad causada por metabolismo alterado ("enfermedad metabólica") es la diabetes sacarina.
LAS V ~ A SM E T A B ~ L I C A SBASICAS PROCESAN LOS PRODUCTOS PRINCIPALES DE LA DIGESTION La naturaleza de la alimentación define el patr6n btisico del metabolismo en los tejidos. Los mamíferos como el ser humano necesitan procesar los productos absorbidos de Ea digestión de carbohidratos, lipidos y proteínas de la dieta. Los principales son glucosa, Acidos grasos, glicerol y aminoácidos, respectivamente. En los rumiantes (y en menor extensihn en otros herbívoros), la celulosa proveniente de los alimentos la digieren microorganisrnos simbiontes a hcidos grasos de peso molecular bajo (acdtico, propiónico y butírico) pues en estos animales el metabolismo tisular se ha adaptado para utilizar ácidos grasos de cadena corta como sustratos principales. Todos estos productos de digestibn se procesan por sus vias metabólicas respectivas a un producto común, acetiE-CoA, que luego se oxida en el ciclo del icido citrico (figura 17-2).
El metabolismo de los carbohidratos se ocupa del destino de la glucosa (figura 17-31 Todas las cklulas de los mamíferos metabolizan la glucosa a piruvato y lactato por la vía de la glucóIisis. La glucosa es un sustrato único ya que la gluc6lisis puede realizarse en ausencia de oxígeno (anaerobia) y el producto final es el lactato. Por otro lado, Ios tejidos que pueden utilizar el oxigeno (aerobios) tienen la facultad de metabolizar el piruvato a acetilXoA, que puede entrar al ciclo del itcido cítrico para su oxidacibn completa a COI y HzO,con producción de gran cantidad de energia libre como ATP en el proceso de fosforilación oxidativa (figura 18-21. Asi, la glucosa es el combustible principal de numerosos tejidos. Ademis, con algunos de sus metabolitos, interviene en otros procesos, como los siguientes: 1) conversi611
Figura t7-2. Esquema de las vías para el catabolismo de carbohidratos, protelnas y grasas dietarias. Tpdas las vias conducen a la producudn de acetil-COA,la mal se oxida en el ciclo del ácido citrico, originando finalmente ATP en el procese de fosforilacibn oxidativa.
a su polimero de almacenaje, gluc6gen0, particularmente en el músculo esqueIético e hígado. 2) La vía de la pentosa fosfato que proviene de intermediarios de la glucólisis. Es una fuente de equivalentes reductores (2H) para la biosintecis -por ejemplo, de ácidos grasos- y es tambikn fuente de ribosa, que se utiliza en la formación de nuclebtidos y hcidos nucleicos. 3) La triosafosfato da origen a la fracción glicerol de los acilgliceroles (grasas). 4) El piruvato y los intermediarios del ciclo del acido citrico proporcionan los esqueletos de carbono para la sintesis de aminohcidos y la acetil-CoA es el bloque estructural para los hcidos grasos de cadena larga y para el colesterol, precursor de todos los esteroides sintetizados en el cuerpo. El proceso que produce glucosa a partir de precursores que no son carbohidratos, como los lact a n t e ~ ,aminoAcidos y glicerol, se denomina gluconeogénesis.
EI metabolismo de los fipidos se centra principalmente en los ácidos grasos y en el colesterol (figura 1 7 4 ) El origen de los hcidos grasos de cadena larga es la sintesis de novo de la a c e t i l 4 o A a partir de los carbohidratos o lipidos de los alimentos. En los teji-
Panorama del metabolismo rnlermedrarro
193
Giudgeno
Glucofosfatas
Vias de la pentosa fosfato 'O 3i
-+
Triosafosfatos
O
-----A-
Rtbosafosfato
Acilglicerol
Acetil-Co-A ---f Ácidos grasos Colesterol
l
Proteína
1
Figura 17-3. Esquema del metabolismo de los carbohidratos que muestra las prinupales vlas y productos finalec La gluconeog8nesis no se muestra.
dos, los acidos grasos pueden ser oxidados a acetilCOA(beta-xidación) o esterificadosa acilgficeroles, donde, como triacilgliceroles (grasas), constituyen la principal reserva calhrica de! cuerpo. La a c e t i l 4 o A formada por la beta-xidacibn tiene varios destinos importantes.
1) Como en el caso de la a c e t i l 4 o A proveniente de los carbohidratos, es oxidada completamente a Coz+ H 2 0 en el ciclo del ácido cítrico. Los ácidos grasos producen una can-
tidad considerable de energía en la beta oxidacibn y en el ciclo del Bcido cítrico y, por tanto, son combustibles tisulares muy efi-
caces. 2) Es una fuente de &tomos de carbono para el colesterot y otros esteraidcs. 3) En el hígado forma cuerpos cetónicos, que son combustibles tisulares hidrosolubles alternos, los cuales se convierten en importante fuente de energía bajo ciertas condiciones (por ejemplo, en inanicihn).
194
Bioqeciminica de Harper
(Capitulo 17)
Dieta
e'
Carbohidrato
\
Aminoácidos
Cuerpos cetónlcos
Figura 17-4. Esquema del metabolismo de Iípidos mostrando sus v[as y productos finales más importantes. Los cuerpos oetbnicos comprenden las sustancias acetoacetato, 3-hidroxibutirato y acetona.
Gran parte del metabolismo de los aminoácidos se enfoca a la transaminación (figura í 7 6 )
LAS V ~ A SMETABÓLICAS PUEDEN ESTUDIARSE A DlFERENf ES NIVELES DE ORGANIZACI~N
Los aminoácidos son necesarios para ta síntesis de proteinas. Algunos deben ser suminismdos de manera específica por los alimentos (aminoácidos esenciales), ya que los tejidos son incapaces de sintetizarlos. El resto, o aminohcidos no esenciales, también se obtienen de la dieta, pero pueden formarse a partir de intermediarios por transarninaci6n, utilizando el nitrbgeno arninico de otros arninoAcidos que estén en exceso. Después de la desaminacián, e3 exceso de nitrógeno aminico es eliminado como urea y los esqueletos de carbono que permanecen despuh de [a transaminación: 1) son oxidados a COIpor el ciclo del ácido cítrico, 2) forman glucosa (gluconeogCnesis), o 3) forman cuerpos cetónicos. Además de requerirse para la sintesis protelnica, los arninoácidos también son precursores de muchos otros compuestos importantes, como las purinas, pirirnidinas y hormonas como adrenalina y tiroxina.
Hasta la fecha s610 se ha visturnbrado el metabolismo como ocurre en el organismo intacto. La ubicación e integracihn de vias metabblicas se han identificado por estudios a niveles menores de organización, esto es: 1) A nivel tejida y 6rgan0, la naturaleza de los sustratos que entran y los metabolitos que salen de tejidos y brganos es definida y su destino final se conoce. 2) A niver subcelular, pues cada organelo (por ejemplo, Ia mitocondria) o compartimiento (como el citosol) posee funciones bioquimicas especificas que determinan un patrón subcelular de vías metabblicas.
A tisu lar y de órgano, la circulación sanguínea se integra al metabolismo Los aminohcidos obtenidos de la digestión de las proteínas procedentes de los alimentos y la glucosa
Panorama del rnetabo/isrno intermediario 195
Cuerpos cetdnlcos Nitrbgeno arnlnica en
del aado citrico
Figura 17-5. Esquema del metabolismo de aminoAcidos que muestran las vlas productos finales prinupales
que se produce durante la digestibn de los carbohidrato~,comparten una via común de absorcion por la vena portal hephtica. De este modo se asegura que ambos tipos d e metabolitos y otros productos hidrasolubles de la digestibn se dirijan inicialmente al hígado (figura 1 7 4 ) . El hígado tiene la funcibn rnetabólica primaria de regula la concentracibn sanguínea de la mayoría de los metabolitos, en particular de la glucosa y aminoácidos. En el caso de la glucosa, el exceso es convertido a glucbgeno (glucog~nesis)o a grasa (lipogénesis). Entre comidas el higado puede extraer sus reservas de glucbgeno para restituir la concentracibn sanguinea de glucosa (glucogen6Iisis) a, en colaboracibn con el rifíón, convertir metabolitos no carbohidratos como lactato, glicerol y aminohcidos en glucosa (gluconeog&nesis). La conservaci6n de una concentracidn adecuada de glucosa en la sangre es vital para ciertos tejidos en los que es combustible obligatorio, por ejemplo, el cerebro y los eritrocitos. Además, el hígado se ocupa de sintetizar las principales protelnas plasmáticas (por ejemplo, albúmina) y de desarninar a los aminohcidas que exceden los requerimientos, mediante la formación de urea, lacual es transportada por la circulacibn hasta el rifión para ser excretada. El mtsculo esqueletico utiliza glucosa como combustible, formando lactato y Coz. Almacena glucógeno que se utiliza como combustible en la contracci6n muscular y sintetiza proteínas musculares
a partir de aminaácidos procedentes del plasma. El musculo constituye aproximadamente 50% de la masa corporal y, en consecuencia, representa una reserva considerable de proteína que puede ser aprovechada para suministrar aminoácidos al plasma, en particular cuando la alimentación es escasa. Los Eipidos de la dieta (figura 17-71, principalmente triacilgliceroles, durante la digestibn forman monoacilgliceroles y acidos grasos, los cuales se recombinan con proteinas en las cdlulas intestinales; desputs se secretan, inicialmente al torrente linfático y de aht a la circulación como lipoproteínas,conocidas como quilomicrones. Todos los productos hidrófoims y liposolub~esde la digestibn, forman lipoproteínas para facilitar su transporte a los tejidos en un ambiente acuoso, el plasma. Al contrano.de la glucosa y los arninoácidos, tos triacilgliceroles quilomicrones no son captados por el hígado. Los tejidos extrahepáticos que poseen la enzima lipoproteína lipasa los metabolizan; esta enPma hidroli~ael triacilglicerol, liberando hcidos grasos que son incorporados a los tipidos tisulares u oxidados como combustible. La otra fuente principal de Acidos grasos de cadena larga es su síntesis (lipoghesis) a partir de carbohidratos, en particular en el tejido adiposo y en e[ higado. El trirtcilgliceral del tejido adiposo es la reserva de combustible mhs importante del organismo. Despuks de su hidrblisis Oiphlisis), los ácidos graso: pasan a la circulacibn como acidos grasos libres. Estos son captados por casi todos los tejidos (pero no por el
196
Bioquimicu de Jirarper
-
(Capitulo 17)
Roteinas plasmaticas
Figura i 7 4 . Transporte y destino de sustratos y metabolitos de los carbohidratos y aminoácidos principales. Nbtese que en el músculo hay escasa cantidad de glucosa libre, ya que es fosforilada con rapidez al entrar
cerebro y los eritrocitos) y esterificados a acilglicerofes u oxidados como combustible principal a Coz. Dos vías de importancia adicional existen en el hígado: I } el triacilglicerol en exceso procedente de la lipogenesis y de los Acidos grasos libres es secretado a la circulación como lipoprotelna de muy baja densidad (VLDL, del inglés, very Sow demi@ lipoprokin). Este triacilglicerol tiene un destino semejante al de los quilomicrones. 2) La oxidación parcial de los iicidos grasos libres conduce a la produccibn de cuerpos cetónicos (cetogenesis). Los cuerpos cetónicos son transportados a los tejidos extsahepáticos, donde actúan como otra fuente importante de combustible.
A nivel subcelular, la glucblisis se lleva a cabo en el citosol y el ciclo del ácido cítrico en las rnitocondrias
,
En el cuadro 2 4 se proporciona un resumen de las funciones bioquimicas principales de los componentes y organelos subcelulares. No obstante, la mayoría de la ceIulas e s t h especializadas en sus funciones y tienden a enfatizar ciertas vias metabólicas y a relegar
otras. La figura 17-8 esquematiza las vías metab6llcas principales y su integracibn en una c61ula del parenquima hephtico, con knfasis especial en su ubicacion intracelular. De inmediato se observa la funci6n central del mitocondrión, ya que actúa como base y encrucijada del metabolismo de carbohidratos, lípidos y aminoácidos. En particular, alberga las en7irnas del ciclo del ácido cítrico, de la cadena respiratoria y la ATP sintetasa, de la beta oxidación de los ácidos grasos y de la producción de cuerpos cet~nicos.Además, es sitio de depbsito para los esqueletos de carbono de arninoácidos después de la transminacion y suministra estos esqueletos para la sintesis de aminoicidos no esenciales. La glucólisis, la vía de la pentosafosfato y la sintesis de ácidos grasos tienen lugar en el citosol. Se observará que en la gluconeogénesis, sustancias similares, como lactato y piruvato que se forman en el citosol, deben entrar al mitocondrión y formar axalacetato antes de su conversion a glucosa. Las membranas del retlculo endopliismico contienen el sistema ensirnhtico para la sintesis de acil-
Panorama del mefaholi.~moinfermediario 19 7
Figura 17-7. Transporte y destino de los sustratos y rnetabofitos prrncipales de los Iípidos (AGL, ácidos grasos libres: LPL, Iipoproteina Iipasa, MG, monoacilglicerol, TG, triacilglicerol, VLOL, lipoproteina de muy bala densidad).
gliceroles mientras que los ribosomas se ocupan de la sintesis proteínica. Puede apreciarse que el transporte de metabolitos de diferentes tamaiíos, carga y solubilidad a travks de las membranas que separan a [os organelos requiere mecanismos complejos. Algunos se explicarhn en relacibn con la membrana mitocendrial (capitulo 14) y otros en los capítulos siguientes.
total de una via rnetabblica (capítulo 9) . Sin embargo, la temperatura y et pH son factores que influyen en la actividad enzimatica, se conservan constantes cn los vertebrados de sangre caliente y tienen poca irnportancia reguladora. (No obstante, recuérdese la variación de pH en el aparato gastrointestinal y sus efectos en la digestión; capítulo 55).
Las reacciones "no equilibradas" son puntos de control potenciales
EL FLUJO DE METABOLITOS EN LAS VIASMETABOLICAS DEBE REGULARSE DE MANERA COMBINADA La regulacion de todo el flujo a tmvis de una via metabblica a menudo se combina con el control de sólo l o quizá 2 reacciones clave en la vía, catalizadas por "enzimas reguladoras". Los factores fisicoqulmicos que controlan Ia velocidad de una reacción de cathlisis enzimática, como la concentraci6n de custrato son de primordial importancia en el control de la velocidad
En una reacción en equilibrio, las reacciones hacia adelante e inversa se llevan a cabo a velocidades iguales y por tanto no hay un flujo neto en cualquier dirección. Muchas reacciones en 7% vins metab6licas son de este tipo, es decir son reacciones equilibradas.
Por otra parte, In vrvo, bajo condiciones de "estado constante" habría probablemente un flujo neto de
CITOSOL
m
grasoe
Figura 1 7 4 . Ubicacibn rntracetular e integracibn de las vías metabblicas principales en una célula del parknquima hepdtico. (AA +, metabolismo de uno o m i s aminoAcidos esenciales, AA e,metabolismo de uno o más de los srninoácidos no esenciales)
izquierda a derecha debido al aporte continuo de A y la elirninaci~ncontinua de D. Esta via podria funcionar, pero tendría poco objeto controlar el flujo regulando la actividad enzirnhtica ya que un incremento de ia actividad s61o servirla para acelerar y lograr el equilibrio.
En Ea practica, en una vía metabolica hay invariablemente una o más reacciones del tipo no equilibrado en las que los reactantes se encuentran en concentraciones que están lejos del equilibrio. En un intento por alcanzarlo, se producen grandes pérdidas de energía libre en forma de calor, el cual no puede
Panorama del me fabolismo intermediario
ser utilizado de nuevo, haciendo que este ripo de reacción sea esencialmente no reversible, por ejemplo: Calor
Reaccidn no equilibrada
Esta vía tiene flujo y direccidn, pero se agotaria a si misma si no se ejerciera control. Las enzimas que catalizan reacciones no equilibradas suelen estar en concentraciones bajas y sujetas a otros mecanismos de control. Esto es similar a la apertura y cierre de una válvula "unidireccional" permitiendo controlar el flujo total.
La reacción de generación de flujo es la primera reacci6n en una vía saturada con custrato Puede identificarse como una reaccibn no equilibrada en la cual el Km de la enzima es considerablemente mas bajo que la concentracion normal de sustrato. La primera reacción en la glucólisis, catalizada por hexocinasa (figura 19-Z), es un paso generador de flujo debido a que su Km de 0.05 mmollL para glucosa es bastante menor que la concentracion sanguínea de glucosa de 5 rnmol/L.
LOS MECAN1SMOS ALOSTERICOS Y HORMONALES SON IMPORTANTES EN EL CONTROL METABÓLICO DE REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS En la figura 17-9 se muestra una vía metabdlica hipotktica, A, B, C, D, en la cual las reacciones A B y C t,D son equilibradas y B + C es una reacción no equilibrada. El flujo a travds de una via de este tipo puede ser regulada por la disponibilidad de sustrato A. Esto depende de su abastecimiento por la sangre, que a su vez esta sujeto a la absarcibn de alimento por el intestino o a ciertas reacciones clave que conservan y liberan sustancias importantes a la sangre; por ejemplo, las reacciones que generan flujo, cataliadas por la fosforilasa en el higado (figura 20-l ), la cual ataca las reservas de glucbgeno y proporciona la glucosa sanguínea y la lipasa hormona sensible en el tejido adiposo (figura 27-8), que suministra Bcidos grasos libres, principales combustibles para los tejidos. El
199
flujo tambikn depende de la capacidad del sustrato A para pernear la membrana celular. Adernhs, dependerh de la eficacia de la eliminacibn del producto final D y la disponibilidad del cosustrato o cofactores representados por X e Y. Las enzirnas que catalizan reacciones no equilibradas son a menudo proteinas alostéricas sujetas a la rhpida accibn de "retroalimentación" o "alimentacibn delantera" controladas por modificadores alostericos, a veces como respuesta inmediata a las necesidades de la dlula (capitulo 1 1). Con ft-ecuencia, el producto de una via biosintética, como la acetiI4oA de cadena larga, inhibirá la enzima que cataliza la primera reacción en la via, por ejemplo, la acetil-CeA carboxilasa. Otros mecanismos de control dependen de la acci6n de hormonas que responden a las necesidades del cuerpo como un todo. Estas actúan por varios mecanismos diferentes [capitulo 44). Uno es la modificacibn covalente de la enzima por fosforilaci6n y desfosforilacibn. Ésta ec rápida y con frecuencia mediada a través de la formación del segundo mensajero cAMP, el cual a su vez convierte una enzima inactiva eii activa. Este cambio es originado por la actividad de una protetna cinasa dependiente de cAMP que fosforila la enzima, o por fosfatasas especificas que desfosforilan [a enzima. La forma activa de la enzima puede ser la enzima fosforilada, como en enzimas catalizadoras de vías degradativas (por ejemplo, la fosforilasa a) o la enzima desfosforili7ada, como las enzirnas catalizadoras de procesos de síntesis (como la glucbgeno sintasa a). Algunas enzimas reguladoras pueden ser fosforiladas sin intervencibn del cAMP y proteína cinasa dependiente de cAMP. Estas enzima5 responden a otras sefíales metabhlicas, como la relacibn [ATP]/[ADP], por ejemplo, pimvato deshidrogenasa (figura 196), o la proteína cinasa dependiente de Ca2'/calmodulina, por ejemplo, la fosforilasa cinasa (figura 206). Las hormonas pueden afectar la sintests de las enzirnas controiadoras del ritmo. Ya que esto incluye [a síntesis de nuevas proteínas, no es un cambio rápida pero a menudo es una respuesta a variaciones nutricionales. Por otro lado, las hormonas pueden actuar como inductoras o represoras de la formaci6n de mRNA en el núcleo, o estimulantes de la fase de traslacibn de la sintesis de proteínas a nivel ribosbmico (capítulos 41 y 44). Una caracteristica importante que ayuda al control metabblico es que las vias que catalizan la degradacibn de una sustancia no son una simple inversi6n de la sintesis. Por lo general participan dos vias independientes por completo, lo cual permite el control separado de cada una, por ejernpio, la síntesis de glucbgeno y su desdoblamiento (figura 20-1 j.
200 Bioquim ica de Happer
(Capitulo 17)
Enzl
Inactiva
Membrana
celular
X
Y
Activa
D -c-
Activación alostArica
Inhibición afostkrica
"alimentacion delantera"
retroalimentacion
negativa
Producción en el núcleo de mRNA
Induccibn
Represibn
Mecanismos d e control de una reaccion catalizada por enzimas Los números en 10s círculos indican posibles sitios de actividad d e hormonas @ alteración de la permeabilidad de la membrana, inversibn de una enzima inactiva. por lo general involucra reacciones de fosforilaci6n, desfosforilacion, alteración d e la velocidad d e traslacibn del mRNA a nivel ribosomico, @ inducción de la formacibn del nuevo mRNA y @ represion de la formacibn de mRNA. @ y son formas rapidas, en tanto que @ a @ son mecanismos más lentos d e regular la actividad enzimatrca. Figura 17-9.
a
a
RESUMEN 1) Los productos de la digestion proporcionan a los tejidos. bloques estructurales para la bioslntesis de moleculas complejas, as1 como combustible para energizar los procesos vivientes. 2) Casi todos los productos de la digestión de carbohidrato~,lípidos y proteínas son catabolizados a un metabolito común. acetil
4) La glucosa proporciona esqueletos de carbono para la fraccibn glicerol de las grasas y para varios arninohcidos no esenciales. 5) Todos los productos hidrosolubles de la digestibn son transportados al hlgado a través de la vena portal hepática para procesamiento, el cual, a menudo, comprende la oxidacibn o sintesis de moltculas, algunas de las cuales son exportadas al resto del cuerpo; por ejemplo, las proteínas plasrnaticac. El hígado tiene una función directa en la regulaciiin de la concentraciór! de numerosos constituyentes sanguíneos, incluyendo glucosa y aminoAcidos, dado que su función primaria es servir a los tejidos extrahepáticos.
Panorama del metaboiismo rnb~rmediario 201
6) Además del núcleo, hay tres compartimientos metabblicos subcelulares primarios. El citosol contiene las enzirnas de las vías de glucblisis, glucogknesis, glucogenó2isis, del fosfato de pentosa o pentosafosfato y de la lipogénesis. Por su parte, !a mitocondria contiene las enzimas principales de la oxidacibn, incluyendo las del ciclo del ficido cítrico, beta oxidacibn de Iicidos grasos y cadena respiratoria. El metabolismo de aminoacidos tiene lugar no solo en el citosol y las mitocondrias, sino tambien en el retículo endoplásmico, donde en los ribosomas, los aminoacidos son
convertidos en proteínas. Además, las membranas del retículo endoplasmico contienen enzimas para otros numerosos procesos, incluyendo la formación de glicerolipidos y el metabolismo de fármacos. 7) Las vías metabblicas son reguladas por mecanlsmos rapidos que afectan la actividad de enzimas existentes, por ejemplo, Fa modificacibn alostérica y covalente. A menudo, esta ultima es iniciada por la acción de hormonas. Las hormonas regulan tambiCn mecanismos mhs prolongados o lentos. a través de la estimulaciiin o inhibición de la síntesis de protelnas enzimiiticas.
REFERENCIAS Cohen P: Conaro¡ o f l 3 r y m e Activiv 2nd ed. Chapman &
Hall, 1983. Hue L, Van de Werve C (editors): Short-Term Regulation of Lzver hdefaholism. EIsevieriNonh Holland, 198 1.
Newshome EA, Csabtree B: Flux-generüting and regulatory steps in rnetabolic control. Trends Bzochem Ser 1981;6:53. Newsholme EA, Start C: ReguIaiinn in iidetabolasm. Wilcy. 1973.
FiI ciclo del ácido cítrico: Petes A. Mayes, PhD, DSc
El ciclo del acido cítrico (ciclo de Krebs, ciclo de los icidos tricarboxilicos) es una serie de reacciones que se efectúan en las mitocondrias, las cuales llevan a cabo el catabolismo de los residuos acetilo, liberando equivalentes de hidrógeno, los que, durante la oxidaciiin, permiten la liberación y captura como ATP de la mayor parte de la energía libre de los combustibles tisulares. Los residuos acetilo estfin en forma de acetil4oA ( C H 3 - C o S-CoA, acetato activo), un &ter de la coenzima A. La COA contiene la vitamina acido pantoténico.
-
EL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO PREPARA EL SUSTRATO PARA LA CADENA RESPIRATORIA En esencia, el ciclo comprende la cornbinacibn de una molecula de acetilXoA con el oxalacetato, hcido dicarboxilico de cuatro carbonos, lo que da por resultado la fomacibn de citrato, un hcido tricarboxílico de seis carbonos. Sigue despuCs una serie de reacciones en el curso de las cuales dos mol~culasde Cozson liberadas y se regenera el oxalacetato (figura 18-1 1. Puesto que sólo se necesita una pequefia cantidad de oxalacetato para facilitar la cenversibn de una gran cantidad de unidades acetilo en Coz, se puede considerar que desempefia una función catalítica.
La función principal del ciclo del ácido cítrico es servir como vía comun final de la oxidación de carbohidrato~,lipidos y proteínas. Esto es porque la glucosa, los ácidos grasos y muchos arninoácidos son metabolizados a a c e t i l 4 o A o a intermediarios del ciclo. Además, desempefia un papel principal en la gluconeogénesis, en la transarninación, desaminacibn y lipogdnesís. Algunos de estos procesos se realizan en casi todos los tejidos, pero el hepatico es el único donde todos tienen importancia extrema. Por tanto, las repercusiones con profundas cuando, por ejemplo, gran número de células hepaticas esthn dafíadas o han sido reemplazadas por tejido conectivo, como en la hepatitis aguda y en la cirrosis, respectivamente. Un mudo testimonio de la importancia vital del ciclo del hcido citrico es que, respecto a los seres humanos, se ha informado muy pocas, si es que algunas, anoi-malidades genéticas de sus enzima, por lo que se presume que estas anomatías sean incompatibles con un desarrollo normal.
Ciirato (c6)
Figura 18-1. Cielo del dcido cltrim que ilustra la funcibn catalítica del oxalaeetato.
204
(Capitulo 18)
Bioquímica de Harper
El ciclo del hcido cítrico es una parte integral del proceso por el cual se hace disponible mucha de la energía Iibre liberada durante la oxidación de carbohidrato~,lipidos y amino8cidos. Durante el curso de la oxidacihn de la a c e t i l 4 o A en el ciclo, se forman equivalentes reductores en forma de hidrbgeno o de electrones como resultado de Ia actividad de deshidrogenasas especificas. Estos equivalentes reductores entran entonces en la cadena respiratoria donde son generadas grandes cantidades de ATP en el proceso de fosforilaci6n oxidativa (tigura 18-2 y capitulo 14). Este proceso es aerabfo por lo cuaI requiere oxígeno como oxidante final de los equivalentes reductores. Por tanto, la ausencia (anoxia) o deficiencia (hipoxia) de O1causa la inhibición total o parcial del ciclo. Las enzirnas del ciclo del ácido cítrico localizan en la matriz mitocondrial, ya sea libres o adheridas a la superficie interior de la membrana interna, lo cual facilita la transferencia de equivalentes reductores a las enzimas adyacentes de la cadena respiratoria, Ia que también esta situada en lamembrana mitocondrial interna.
LAS REACCIONES DEL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICOLIBERAN EQUIVALENTES REDUCTORES Y CO2 (figura 1 8 3 ) " La condensación inicial de acetil-CoA con oxalacetato para formar citrato es catalizada por la enzima condensante, citrato sintasa, que efectúa la sintesis de un enlace carbono a carbono entre el carbono del metilo de la acetil-CoA y el del carbonilo del oxalacetato. La reacción de condensación, que forma la citrilXoA, es seguida por la hidrólisis del enlace tioCster de la COA,acompafíada por una considerable pérdida de energia libre como calor, lo cual asegura que la reaccibn prosiga hasta su terminación. Acetil-CoA + Oxalacetato + HzO
+ Citrato + COA
El citrato es convertido en isocitrato por la enzima aconitasa (aconitato hidratasa), que contiene hierro en el estado Fe2' en forma de una proteina compleja
ferrosulíürada (Fe:S). Esta conversión tiene lugar en dos pasos: deshidratacibn hasta cis-aconitato, algo del cual permanece unido a la enzima, y rehidratación hasta isocitrato.
Citrato
Cirsconitato (unido a enzima) H20 HzO
La reaccidn es inhibida por la presencia de fluoroacetato, el cual en forma de fluoroacetil4oA, se condensa con el oxalacetato formando fluorocitrato. Este ÚEtimo inhibe a la aconitasa lo que ocasiona acumulación del citrato. Los experimentos con intermediarios marcados con C" indican que el citrato reacciona con la aconxtasa de manera asimktrica, con el resultado de que tsta siempre actúa sobre aquella parte de la molécula que deriva del oxaiacetato. Esto era desconcertante,ya que el ácido cítrico es un compuesto simktrico. Sin embargo, ahora se comprende (cuando la mol&culaes visualizada en tres dimensiones) que los dos grupos -CH2C00no son idinticos en el espacio con respecto a los grupos 4 H y 4 0 0 - . Las consecuencias de la acci6n asirnktrica de [a aconitasa, que es atraido por el enlace de tres puntos de la enzima hacia el sustrato (figura 8-31, puede apreciarse por referencia del destino de la acetil-COA,marcada en el ciclo del ácido cítrico, tal como se muestra en la figura 15-3. Es posible que el cis-aconitato no sea un intermediario obligatoria entre el citrato y el isocitrato, pero de hecho puede ser una rama lateral de la via principal. El isocitrato experimenta deshidrogenacibn en presencia de isacitrato deshidrogenasa formando oxalosuccinato. Se han descrito tres isocitrato deshidrogenasas diferentes. Una, que es NAD+-específica, se encuentra sblo en las mitocondrias. Las otras dos enzimas son NADP+-especIficas y se encuentran en las mitocondrins y en el citosol, respectivamente. La oxidación del isocitrato acoplada con la cadena respiratoria procede casi completamente a travbs de la enzima dependiente del NAD'. lsocitrato + NAD' e+Oxalosuccinato H (unido a la enzima)
*
De la circular No. 200 del Comitt de Editores de Hiochemical Journals Recommendations ( 1 975): "De acuerdo Con la regla bioquímica esthndar, la terminacibn -ato por ejemplo. en palmitato, denota cualquier mezcla de ácido libre y la(s) forma(s) ionizada(s) (segUn el pH) en la cual no cstán especificados los cationes". La misma regta se adopta en este texto para todos los ácidos carboxilicos.
alfa-Cetoglutarato + COI + NADH + H'
Sigue una descarboxilacibn a alfa-cetogiutarato, también catalizada por la isocitrato deshidrogenasa. El Mn" (o Mg2') es un componente importante de la reacción descarboxilante. Pareceria que el oxalosuccinato permanece unido a la enzima como un intemediario en [a reacci6n global.
El crclo del ácido citr'rrico: cutaholrsrnu de la acetilJoA
0
205
t
lsocitrato (Ce)
-
Fosforilacion oxidativa
-@
Q
~
r
5
e
s
p
M
Flavoproteina
anaerobiosis (hipoxia. anoxia)
Cit Citocromo
m@ Fosfato de alta energía
H,"
Figura 18-2. Ciclo del Bcido cítrico la vía catabblica principal para la acetil-COAen los organismos aerobies La acetil-COA, producto del catabolismo de carbohidratos, proteínas y Iipidos, es introducida al ciclo junto con H20, y oxidada a C02 con Iiberacibnde equivalentes reductores (2H) La oxidacibn subsiguientede 2H en la cadena respiratoria conduce al acoplamiento de la fosforilación de ADP a ATP Para una vuelta del crclo, se generan 11 -@ por medio de fosforilactón oxidativa y un surge a nivel de sustrate a partir de la conversion del succinil-COAen sucunato.
a
o COA SH
CH,- COO-
HO-CH
1
k ~ , - COOHO-C-COD-
-&O-
I
CH,-COO-
NAO*
k~,-~OO-
Citrato
L-Malato
Fluoroacetato
~ H ~ ~ o o i
c-coo-
1I CH-COO-
H- ¿ - ~ O O -
- 00;-g-
n
Cls-aconitato
Fumarato
A
J
I
H 0- C H - C 0 0 -
C H ~ ~ O O -
Isocitrato
Succinato
ADP + Pi
Arsenito
NADH + H* Oxalosuccinato
O Z C -coo-
Figura 18-3. El ciclo del ácido cltrico (de Krebs). La oxidación del NADH y del FADH2 en la cadena respiratoria wnduce a la generacibn de ATP a travks de la fosforilacibn oxidativa. Para seguir el paso del aeetil-COAa travks del ciclo, los dos Btomos de carbono del radical aoettlo se muestran marcados en el carbono del carboxilo (usando la designacibn y en el carbono del rnetilo (usando la desgnaubn [i]). Aunque se pierden dos &tornos de carbono como CO2 en una revolucrbn del ciclo, estos dtomos particulares no derivan de acetil-COAque ha entrado inmediatamente antes al ciclo sino que surgen de aquella porción de la moléwla de citrato que derivb del oxalacetato. Sin embargo, al completarse una vuelta del uclo, el oxalacetato que se regenera está ahora marcado; de él se forma el COZ marcado que se elimina en la segunda vuelta de uclo Debido a que el succinato es un compuesto simétrica y la suminato deshidrogenasa no distingue entre sus dos grupos carboxilo, se produce un "proceso aleatorio" del marcaje en este paso de modo que los cuatro Btomocde carbono del oxalacetatoaparecen marcados decpuks de una revolucibn del ciclo. Durante la gluwneogenesis, parte de la marca en el oxalacetato es rncarporado a la glucosa y el gludgeno (figura 21-1) Para una explicacibn de las aspectos estereoquimicos del ciclo del Bcido citrico, consultese Greville (1 968). Se indican los sitios de inhibicibn por fiuoroacetato, malonato y arcenito.
m)
E/ ciclo del úcido cjtrico. catahoiismo de la acetil-CoA
Luego, el alfa-cetoglutarato pasa por una descarboxilaci6n oxidativa de una manera anhloga a la del piruvato (figura 1 9-5), ya que ambos sustratos son aIfa-cetoacidos.
Succinil-COA+ COI + NADH + H'
La reacción catali~adapor un complejo de alfa-ceiogluhrato deshidrogenasa tarnbitn requiere de idénticos cofactorec -por ejemplo, difosfato de tiamina, lipoato, NAD', FAD y COA- y da por resultado la , rioéster de alta enerformación de s u c c i n i l ~ o Aun gía. El equilibrio de esta reaccibn está tan en favor de la fonnacibn de succinil
207
ferencia directa de hidrdgeno desde el sustrato a una flavoproteína sin la partictpacibn del NAD'. La enzima contiene FAD y proteína ferrosulfurada (Fe:S). Se f m a fumarato como resultado de la deshidrogenacibn. Los experimentos con isótopos han mostrado que la enzima es esteroespecifica para los Atomos de hidrógeno trans de los carbonos metileno del succinato. La adición de rnalonato o de oxaiacetato inhibe a la succinato deshidrogenasa competitivamente, dando por resultado [a acumulación de succinato. La fumarasa (fumarato hidratasa) cataliza la adicibi de agua al fumarato para formar malato. Fumarata + H 2 0o L-Malato
Además de ser especifica para el L-is6mero del malato, la túmarasa cataliza la adición de los elernentos del agua a la doble ligadura del fumarato en la confíguracibn tranrr. El malato es convertido en oxalacetato por la malato deshidrogenasa, reaccibn que requiere NAD'. L-Malato + NAD* e Oxalacetato
* NADH + H'
Aunque el equilibrio de esta reaccihn esta muy en
Éste es el único ejemplo en el ciclo del hcido citrico de la generación de un fosfato de alta energia a nivel sustrato y se produce debido a que la liberacibn de energia libre procedente de la descarbaxilacibn oxidativa del alfa-cetoglutarato es suficiente para generar un fosfato de alta energía además de la formación de NADH (que equivale: a 3 4. La matriz mitocondrial tambikn contiene una segunda succinil4oA sintetasa, especifica para nucleótidos de guanina, pero esta no interviene en el ciclo del ácido cihico. Una reacción alternativa en los tejidos extrahepaticos catalizada por succinilZoAacetoacetato COAtransferasa (tioforasa), es la conversión de la succinil-CoA en succinato acoplada con la conversión del acetoacetato en acetoacetil-CoA (capitulo 24). El succinato es metabolizado ahn mfis por medio de una deshidrogenacibn seguida por la adicibn de agua y, subsiguientemente, por una deshidrogenacihn más que regenera el oxalacetato. Succinato
* FAD
t,Fumarato
+ FADHz
La primera reaccidn de deshidrogenacidn es catalizada por la succinato deshidrogenasa, que está unida a la superficie interior de la membrana mitocondrial interna, al contrario de otras enzimas del ciclo, que se encuentran en la matriz. Es la única deshidrogenaci6n en el ciclo del k i d o cltrico que incluye la trans-
favor del malato, el flujo neto es en la direccibn del oxalacetato porque este compuesto, junto con el otro producto de la reacción (NADH) es eliminado continuamente en reacciones ulteriores. Las enzimas del ciclo del hcido citrico, excepto las alfa-~etoglutaratay succinato deshidrogenacas, tmbikn se encuentran fuera de la mitocondria. Aunque pueden cata1izar reacciones similares, algunas de las enzimas, por ejemplo, la malato deshidrogenasa, pueden no ser de hecho las mismas proteinas que las enzimas mitocondriales del mismo nombre, es decir, son isoenzimas.
POR CADA CICLO DEL ÁCIDO C~TRICOSE FORMAN 12 MOLECULAS DE ATP Como resultado de las oxidaciones cataljzadas por las enzimas deshidrogenacas del ciclo del ácido cítrico, se producen tres moléculas de NADH y una de FADHz por cada molécula de acetilXoA catabolizada en una vuelta del ciclo. Estos equivalentes reductores son transferidos a la cadena respiratoria situada en la membrana mitocondrial interna (figura 18-2). Durante el paso a lo largo de la cadena, tos equivalentes reductores del NADH generaran tres enlaces fosfato de alta energia por la esterificacibn del ADP en ATP en el proceso de Fa fosforilación oxidatira (capitu-
208
Bioquimica de Hurper
In 14). Sin embargo, el FADH? produce s61o dos enlaces fosfato de alta energía porque transfiere su poder reductor a la Q, evadiendo asi el primer sitio de iosforilaciDn oxidativa en la cadena respiratoria (flgiira 14-7). Un nuevo enlace de alta energia es generado a nivel del ciclo mismo (csto es, a nivcl del sustratci) durante Ia conversión de la succinilXoA en succinato. De este modo, 12 nuevos enlaces fosfato de alta energia son generados en cada vuelta del ciclo
(cuadro 18-1).
LAS VITAMINAS TIENEN FUNCIONES ESENCIALES EN EL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO Cuatro dc las vitaminas solubles del cornple-jo 3 intervienen de rnancra precisa en el funcionamiento del ciclo dcl hcido cilrico. Son: 1) Riboflavina en forma de dinucleótido d c flavina y adenina (FAD) cot'actor en el compleLiode la alfa
EL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO ACTÚA COMO P!VOTE EN EL METABOLISMO Algunas vías metabólicas terminan en un ctinstitiiyente del ciclo en tanto que otras se originan de C1.I;stas vias intervienen en los procesos de gluconeogcncsis, transaminación, desaminaci~ny sintesis de acidos grasos. Portanto. el ciclo del ácido cítrico interviene en ambos procesos, oxidativo y sintktico; es decir, cs anfihtilico. Sus actividades se resumen a continiiacion.
El ciclo del ácido cítrico interviene en Fa gluconeog6nesis, la transaminación y la desaminación Todos los miembros principaIes de ciclo, desde el citrato hasta el oxalacetato, son glucogénicos en potencia, puesto que pueden dar origen a una produccián neta de glucosa en el hígado o el riñbn, Organos quc contienen un Jiiego completo de enzima5 para la gluconeogénesis (capitulo 2 1). Laenzima clave que facilita la transferencia neta fuera del ciclo, hacia dentro de la via principal de gluconeogénesis es la fosfoenolpiruvato carhoxicinasa, que catalim la descarboxilación del oxalacetato para dar fosfocnolpiruvato, actuando el GTP como fuente de fosfato de alta cncrgia (figura 184). Oxalacetato + GTP + Fosfoenolpiruvato+ COZ+ GDP
-1. Cerieración (i e ATF p del ácido cítrico A-
E
Kcacció
catalizad~
Isocitrato
---;
..
- "- 11'1.
J.
1 uirieru
rolCculas d P formada
prodircci de -@
:
4
.
.,
ATP + COZ+ HzO + Piruvato +
.iuncirin iI>t l en la
ia rt'spiralc -idación del rDt l en la
Oxalacetato + ADP + Pi
1
ia respiratc
1 e1 uc -u"
.susui
-
--m
idacihn Di I2en la
2
respiratc -in
idacibn
IDH cn la ia respiratc. -
La transferencia neta al cicIo es resultado de varias reacciones diferentes. Entre las mas importantes está la fomacibn de oxalacetato por la carhoxilacicín del piruvato, calalizada por la piruvatn carhoxilasa.
, 1
Neto 12
Esta reacción se considera importante en conservación de concentraciones adecuadas de oxalacetato para la reacción de condensacibn con la acetil-CoA. Si ésta se acumula, actúa como un activador alosterico de la piruvato carboxilasa, Io cual asegura un abastecimiento de oxalacetato. El lactato, un irnportante sustrato para la gluconeogénesis, entra en el ciclo a través de la conversión en piruvato y oxalacetato. Las reacciones de la arninotransferasa (transaminasa) producen piruvato a partir de la alanina, oxalacetato del aspartato y alfa-cetoglutarato del ácido glutamico. Debido a que estas reacciones son reversibles, el ciclo tambikn sirve como fuente de
El ciclo del ácido clfrico: catabolismo de lu aceti/-CoA
Hidroxiprollna Serina Cisteina Treonina Glicina
\
-.
Glucosa
+-
Tirosina Fenilalanina
1
209
Lactato
.+
P-enolpiruvato
.
Oxalacetato
+ Fumarato
f
Aspartata Citraio
lsoleucina Metionina Valina
Propionato
COZ Histidina Pmlina Glutarnina Arginina
~[TRANSAMINASA
]
7 ) Glutamato
Figura 1 8 4 . Participacibn del ciclo del Bcido citriui en la transaminación y la gluconeog6nesic. Las flechas gruesas indican la via principal de la glumneog8nesis
esqueletos de carbono para la síntesis de aminohcidos no esenciales, por ejemplo, +
Piruvato t,Oxalacetato +
Grutamato + PiruMto e-, a-Cetoglutarab
+ Alani"=
Otros aminoácidos contribuyen a la gluconeogénesis debido a que el total o parte de sus esqueletos de carbono O ácido cítrico despuks de la desamientran al C ~ C ~del nacibn o la transaminacion. Ejemplos son la alanina, la cisteina, la glicina, la hidroxiprolína, la serina, la treonina y el triptdfano, los cuales forman piruvato; la arginina, la histidina, la glutamina y la prolina forman alfa-cetoglutarato por la vía del glutamato; la ícoleucina, la metionina y la valina forman succinilCOA; y la tirosina y fenilalanina forman fumarato (figura 18-4). Se debe notar que las sustancias que forman piruvato tienen la opción de oxidación completa hasta C 0 : si siguen la vía de la piruvato deshidrogenasa hasta acetilZoA o pueden seguir la
vla glucogenica a través de la carboxilación formando oxalacetato. De particular importancia para los rumiantes es [a conversión del propionato, el principal producto glucogCnico de la fermentación en el rumen, en succ i n i l 4 o A por la via de la m e t i l m a l o n i l ~ o A(figura 2 1-2).
El ciclo del ácido cítrico interviene en la síntesis de ácidos grasos (figura 1 8 4 ) La acetilXoA formada a partir del piruvaio es el principal bloque de construcción para la síntesis de Acidos grasos de cadena larga en los no rumiantes. (En los rumiantes, la a c e t i l 4 o A proviene directamente del acetato.) Dado que la pimvato deshidrogenasa es un enzima mitocondrial y las enzimas responsables de la síntesis de ácidos grasos son extramitocondriales, la cdlula necesita transportar acetil-CoA a traves de la membrana de la mitocondria, la cual es imper-
21 0 Bioquimica de Harper
Glucosa
* b
(Capítulo 18)
cido os grasos
t~iruvato
MEMBRANA MITOCONDRIAL
- JL, L ~
N
Figura 1 8 4 . Participación del ciclo del hado cítrico en la clntecic de Bcidos grasos a partir de la glucosa Véase tambien la figura 23-5
meable a este compuesto. Esto se logra permitiendo que la acetil4oA forme citmto en el ciclo del ácido cítrico, entonces se transporta el citrato fuera de la mitocondria y, por último, se hace que quede disponible acetilXoA en el citosol medianie escisihn del citrato en una reacción catalizada por la enzima ATPcitrato liasa. Citrato + ATP + COA + Acetil-COA+ Oxalacetato ADP + Pi
*
La regulación del ciclo del ácido cítrico depende principalmente del suministro de cofactores oxidados En la mayoría de los tejidos, donde la funcibn primaria del ciclo del ácido cítrico es proporcionar energia, hay escasa duda respecto a que el control respiratorio a travks de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa es el regulador dominante de la actividad del ciclo del acido citrico. Así, la actividad depende de manera inmediata del suministro de cofactores oxidados de la deshidrogenasa (por ejemplo, NAD), los cuales a su vez, debido al estrecho acoplamiento entre oxidacibn y fosforilación, dependen de la disponibilidad de ADP y por tanto, en ultima instancia, de la velocidad de utilizaciiin del ATP. De este modo, siempre que se disponga de la cantidad adecuada de 02,la velocidad de utilización de ATP para efectuar
trabajo determina el índice de respiracibn y de actividad del ciclo del Acido citrico. Ademhs de este control global y ordinario, las propiedades de algunas de las enzimas del ciclo indican que la regulación podria ejercerse tambidn n nivel del ciclo mismo para refoszar el control. Los sitios de regulación más probables son las reacciones sin equilibrio, las cuales son catalizadas por la piruvato deshidrogenasa, citrato sintasa, isocitrato deshidrogenasa ligada a NAD y alfa+etoglutarato deshidi-ogenasa. Todas estas deshidrogenasas son activadas por Caz', cuya concentraci6n aumenta durante la contracción muscular y secrecibn, cuando hay un incremento en la demanda de energia. En un tejido como el cerebro, que depende en gran medida de carbohidratos para el suministro de acetilXoA, el control del ácido cítrico puede producirse en el paso de la piruvato deshidrogenasa. En el propio ciclo, varias enzimas son sensibles at estado energético tal como se expresa en las proporciones [ATPlJrADP] y [NADI-I]/[NAD]. Por tanto, hay inhibición alostérica de citrate sintasa por ATP y por a c i l 4 o A de cadena larga. La activacibn alostérica de la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NAD mitocondrial por ADP es c o n m t a d a por ATP y NADH. A[ parecer, el complejo de la alfa-cetoglutarato deshidrogenasa esta bajo un control anilago al de piruvato deshidrogenasa (figura 1 9 4 ) . La succinaio deshidrogenasa se inhibe la presencia de oxalacetato y la disponibilidad de oxalacetato regulada por mala10 deshidrogenasa, de-
El ciclo del iicido cítrico: catubolismo de ¡a acetilXoA
pende de la proporcibn !?lADHJ/pAD']. Dado que la Kmpara oxalacetato de citrato sintasa es del mismo orden de magnitud que la concentración intramitocondrial, podria parecer que la concentración de oxalacetato interviene en el control de la velocidad de formación de citrato. Aún faSta por resolver cual de estos mecanismos (si es que se trata de alguno de ellos) opera rn vivo.
RESUMEN 1) El ciclo del Bcido cítrico es la vía final para la oxidaci~nde carbohidratos, Iipidos y proteínas. Cataliza la combinacion de su metabolito comilin, la acetil
2 11
Por una serie de deshidrogenaciones y descarboxilaciones, el citrato es degradado, liberando equivalentes reductores y 2CO2 y regenerando oxalacetato. 2) Los equivalentes reductores son oxidados por la cadena respiratoria con forrnacibn de ATP. Por tanto, el ciclo es ta vía principal para la generacibn de ATP y se ubica en la matriz de las rnitocondrias adyacente a las enzimas de la cadena respiratoria y la fosforilacibn oxidativa. 3) El ciclo del ácido citrico es anfbblico, dado que tiene otras funciones metabólicas además de Ia oxidaci6n. Toma parte en la gluconeogénesis, transaminación. desarninacion y en la síntesis de acidos grasos.
REFERENCIAS Baldwin JE, Krebs HA: The evolution of rnetabolic cycles. Nature 198 1;29 1 :38 1. Boyer PD (editor): The Erqvmes, 3rd ed. Academic Press. 1 0 7 1L . A , ,
Goodwin TW (editor): The Metabolic Roles of Cilate. Academic Press, L 968. Greville GD: Vol 1, p 297, in: Curhohydrate ~Wetabolism and Its Disorders. Dickens F. Randle PJ, Whelan WJ
(editors). Academic Press, 1968.
Kay J, Weitzman PDJ (editors): Krehs ' Ciric Acid Cycle-Hay a cenhity and StiIl Tnrning Rinchemical Society, London, 1987. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cvcle. Control and fimpartmentation. Qekker, 1969. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cycle. Vol 13 in. Methods in En;nzvmolo~.Academic Press, 1969. Srere Ph: Thc cnzymology of the formation and breakdown of citrate. Adv Enzymol 1975;43:57. Tyler DD: Ths Mrtochondrion in Healtk and Dilease VCII Publishers, 1992.
Gbucólisis y la oxidación del piruvato Peter A. Mayes, PhD, DSc
isquemia. Existe un número pequeño de enfer-
Hay una necesidad mfnima de glucosa en todos los te-jidos. Cn algunos casos, por ejemplo, en el cerebro,
la necesidad es sustancial; en tanto que en otros, como en los critrocitos, es casi total. La gIuciilisis es la via prii~cipalpara la utililación de la glucosa y se lleva a cabo en el citosol de todas las células. Es una via única, dado que pucde utili7ar oxigeno si estl disponible (aerohia) o fi~ncioiiaren su ausencia total (anaerobia). Sin embargo, para que la glucosa se oxide hasta la etapa terminal del piauvnto de laglucólisis, precisa no solaincnte oxigeno moleculas, sino también sistemas eiiziiiiáiicos rnitoccindriales, como el complejo piruvato deshfdrogenasa, e1 ciclo del iicido cítrico y la cadena respiratoria.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA L a glircólisis iio sólo es la ruta principal para el metabolisiiio de la glucosa que conduce a la producción de acetil-CoA y a su oxidacihn cn el ciclo del Iicido cítrico. sino que también proporciona una vía importante para metabolizar fiuctosa y galactosa provenientes de los aliineiitos. La capacidad de la gluc6lisis para proporcioiiai. ATP en ausencia de oxígeno tiene crucial significado biomedico, porque permite al musculo csqueletico trabajar con mucha eficiencia aun'cuando la oxidación aerobia se vuelva insuficiente. a Ea vez que IOF tc,iidos con capacidad glucolítica importante pueden obrev vivir a episodios de anoxia. Por el contraria, el músculo cardiaco, que esth adaptado al traba,jo acrobio. tiene capacidad glucolítica relativamenie deticicntc y escaw supervivencia en condiciones de
medades donde las enzimas de la gluciilisis (coino la pimvato cinasa) muestran actividad deficiente; estos trastornos se manifiestan principalmente como anemias hemolíticas o, si tienen lugar eii el niiisculo esquelético (por ejemplo, la fosfofructocinasa), coino fatiga. En las cClulas cancerosas que proliferan con rapidez, la gluc6lisis procede a una velocidad mucho mayor que la precisada por el ciclo del ácido cítrico. Por tanto, se produce inás piruvato que el que puede ser metaboli7,ado. El resultado es una producciiin excesiva de lactato. que favorece un entornti local relativamente ácido en el tumor, situacióii quc puede tener implicaciones con ciertos tipos de terapéuíicii contra e1 ciinccr. Tambien se produce acidosis lhctica debida a varios factores incluso a la deficiencia de piruvato desliidrogcnasa.
LA GLuCÓLISIS PUEDE FUNCIONAR EN CONDICIONES ANAEROBIAS Al principio del curso de las investigaciones sobre la gliichlisis, se comprendió que el proceso de fermentacihn en las levaduras es semejante a la degradacihn del gluciigeno en el m ~ s c u l oSe . notó que cuando iin musculo se contrae en un medio anaerohici, es decir excnlo de oxigeno, el glucógeno desaparece y sc forma Iactato como principal producto final. Cuando se intraducc el oxígeno, tiene lugar la recuperacióia aerobia y el glucógeno reaparece, mientras que el lactato desaparece. Sin embargo, si la contracción se produce en condiciones aerobias. no hay acuinulacion de lactato y el piruvato se convierte en el prodiicto
final principal; este hltitno es oxidado después a COZ y agua (figura 19-1 ). Como resultado de estas observaciones, se Iia hecho costumbre separar el rnetaboI ismo de los carbohidratos en una fase anaerobia y otra aerobia. .lo obstante, esta distinción es arbitraria ya que las reacciones de la gluclilisis son las mismas tanto en presencia de oxígenci como en su ausencia, excepto en su extensión y en siis productos finales. Cuando ci aporte de oxígeno es pequeño, se altera la reoxidación del NADH, formado a partir de NAD' dusaiite In glucóli~is.En estas circunstancias, el NADH es reoxidado al acoplarse a la reducción dcl piruvato en lactato y el N A D ' que resulta se utiliza para pcrnlitir qiie ulteriormente prosiga la glucólisis (figura 19-1). La glucólisis pucdc así efectuarse en condiciones anaerobiac. pero esto tiene un precio, ya que limita lacaiitidad de energía Iiberada por rnol&cula degli~cosaaxidada. Consecuentemente, mayor cantidad de glucosa debe intervenir en lagluciilisis anaerobiapara proporcionar la misma cantidad dc energía que la obtenida en condiciones aernbias.
Glucosa
Glua6geno
Cs
(CsIm
TriosatosfaZa
C3
o*
-
Triosalosfato
+H+ -
Figura 19-1. Resumen de la gluc61isis 0, bloqueado por condiciones anaerobias o por ausencia de mitowndrias que contengan las enzimas respiratorias claves, por ejemplo, como ocurre en los eritrocitas
LAS REACCIONES DE LA GLUCÓLISIS SON LA PRINCIPAL V ~ ADE UTILIZACION DE LA GLUCOSA La ecuacihn global para la gIucolisis desde gliicosa hasta lactato e$: Glucosa * 2ADP * 2Pi t 2L(+)-Lactato
* 2ATP + 2Hz0
Todas las enzimas de la vía de Ia gluchlisis (figura 1 9-2) se encuentran en la fracción soluble extirimitocondrial de la célula, el citoso!, aunque se acumula evidencia indicadora de que alguna de las enzimas puede estar integrada con estructuras subcelulares ranto en la celula como en e1 citosol. Ellas catalizan Ias reacciones implicadas en la gluclilisis de la glucosa, hasta piruvato y lactato. del modo siguiente: La glucosa entraen la vía gluctiIitica mediante su fosforilación a glucocad-iosfato, función que realiza la enzima hexocinasa. Sin embargo, en las células del parinquirna hephtico y en Ias dc los islotes pancreáticos, es realizada por la glococintisa, cuya actividad en el hígado puede inducirse y afectarse por los cambios en el estado nutricional, El ATP es necesario coma donador de fosfato y, como en muchas reacciones en que interviene la fosforilacihn, reacciona coino el complejo Mg-ATP. Se utiliza un enlace fosfato de alta energia del ATP y sc produce ADP. La reacciiin se acompana por una phrdida considerable de energia Eibre como calor y, par consiguiente, en condiciones fisiológicas, puede considerarse como irreversible. La hexocinasa es inhibida de modo alostérico por e1 producto glucosad-fosfato.
Glucosa + ATP
-
Glucosa-6-fosfato + ADP
x
que existe virtualmente en todas las J ~ i e n euna gran afinidad (K,, baja) por 't' su siistrato. laglucnsa. Su f u n c i ~ nconsiste en asegiirar $* el suministro dc glucosaa los tejidos, aiin en presencia q de concentraciones bajas de glucosa sanguínea, fusforilar lo cual mantiene un alto gradiente de cone e n t r a f i de glucosa entre la sangre y el medio intracelular. Actúa sobre ambos anómeros de la gii~cosa, el alfa y beta y puede también catalizar Ia fosforilación de otras hexosas, pero a una velocidad mucho menor que a la glucosa. La fiinciiin de la uelucocinasa cs la dc eliminar la glucosa de la sangre después de la ingestihn de alimentos. En cornparaci0n con la hexocinasa, ticne una Km alta para la glucosa y opera de modo dplimo en
Glucosa 1-fosfato CHz-O-
AfP
ADP tx- glucosa
(1- glucosa
6-fosfato
r+Fruciosa 6-fosfato
CINASA
~ F r u c t o s al,6-bisfosfato
EH,- O 4 C=O COO -
CINASA
Focfato de dihidroxiacetona
H-c=O H- C-OH
I
3
CH,-O-@ ATP
ADP
NAOH +H
+
NAD+ Gllceral-
1.3-bisfosfoglicerato
3-Fosfoglicerato
dehido
3-fosfatn Mitochondrial respiratory chain
FOSFOGLICERATOMUTASA
$00H-$-O-@ CHz0H
1
2-Fosfqlicerato
I
1I
I I
I
1
I
I
3ADP + p,
3ATP
Anaembiosi~ I
?O0 -
Fosfoenolpiruvato
Mg2+p;; $ -0-E)
Oxrdacibn en el ciclo del
CHI
plWvATo CINASA
CoOC
II
- DH
EspontAnea
I I I
I
I 1
I 1
I
I
I
q 1
t
acrdo cítrico l NADH+H+
$00-
I I
I
1 1
1
NAD'
$00 -
CH2
(Enol) piruvato
(Ceio) Piruvato
e),
L(+)-Lactato
Figura 19-2. Vía de la glucólisis - P O ~ ~ - ; PHQPQ~'-; ~, 0, inhibicibn *Los átomos de carbono 1 a 3 de bisfosfato de fructosa forman focfato de dihidroacetona, en tanto que los carbonos 4 a 6 forman gliceraldehido bfosfato El termino bis, como en bifosfato, indica que los grupos focfato están separados, en tanto que difosfato como en el difosfato de adenosina. indica que están juntos
concentracioriec dc glucosa sanguinea por arriba de loc 5 inmol/C (tigiim 2 1 -S). Es cstxcítica para la glucosa. I,a g1ucrisn4-frisfato es un compuesto irnportaiiic ~ L I Cti en el enironque de varias vías metabólicas (gl~icólisis.gluconeogénesis. v i n de la pentosafosfato. glucugérieiií y ~lucogenólisis).En la glucOlisis, cs cciiivcrtida a fiuctosa4-fosfato por la Frisfohexosa irornerssa, proceso que cainprcndc iina isomeriznción nldosa-cetosa. Shlo participa el anomero alfa de Ea glucosa4-losfato.
Ectn reacciiin e i scgiiida por otra focforilacibn con ATP, c:ilalitada por la eri7iina fnifofriictocinass (fosfofructocinasn-1) para prodiicir íiiiictosa 1.6-bisfosfato. I,a hifcifi.~ictocinas;ies otra cnziina inducibfe y alristérica, y se considera quc su actividad tiene uiia I'~ii1ciiinir~iportariteen la regulación de In velocidad de la gFuccilisis Tainbien la reacción de la fosfofructocinasa puede considerar~efiincionalmente irreversible cii cciiidiciones fisiológicas. D-Fructosa-6-fosfato + ATP -+ 0-Fructosa 1,6-bisfosfato
Ida fructoca 1 .(i-hisfoslato. es separada por la aldolasa (ftuctosa I .h-hisfc>sfato aldolasa) eii dos tricisahsfritos. cl zliceraldehído-3-fosfato y el fosfato de diliiclroxiacetonn.
actividad de la fo~fritrio~a isonierasa. el fosfato d e diliidroxiacetona es también oxidado ;i 1.3-bisfosfo~Iiceratopor 13 via dcE gliccraldchidn 3-fo~fato.
1,3-Bisfosfoglicerato + NADM + H'
La enziina que causa Iaoxidaci~n,gliceraIdehido-3fosfato dcsliidrogcnasa, depende del NAD'. Estruc-
tiiralmente consiste en cuatro polipéptidos identicos (rnonhmeros) que forman un terrhrnero. Se encueritran ciiiitro grupos -SH cn cada polipkptido, derivados dc los scsiduos de cisteina dentro de la cadena polipeplídica. Uno de estos grupos se localiza en el sitio activo dc la enziina (figura 19-3). Inicialmente, el sustrato se conibina con ese gmpi -SH, rominndo un tioliemiacctal qiie cs convertido en iin ester tiolico por oxidación: los hidrógenos removidos eii estaoxidacibn ce trancfiereii al NAD' unido a la enzii~ia.E1 NADH prtid~icidoen la eiizima no estiran íirnicincntc unido a clln como el NAD'. Eii consecuencia. el NADI Ies fácilmente desplazado por otra molécula de NAD'. Finalmente, se adiciona fosfato inorg5nicn (P,) mediante fosforolisis, formindose I,3-bisfosfnglicerato, y la en7ima libre, coi1 un grupo -SH rcctinstituido, .c-s La energia liberade durante la oxidacihn cs crinccrvada por la formación de un enlacc dc a ~ u f r cde alla cncrgía qiie se vuelve, despucis d c la rosforiilisis, uiz cnlacc i'isfato dc aIta energia en la posición I del I ,.3-bi~fosfnglicerato. Este fosfato de alta cncrgia cs capturado como ATP en una rcaccihn posterior con cl ADP, catali~adapor la fosfogliceratocinasa, desiando 3 fosfogliccrato. 1,3-Bisfosfoglicerato + ADP H 3-Fosfoglicerato + ATP
Fosfato de di hidroxiacetona
Sc hnii dcscrito diferentes aldola~asquc coiitienen
cuatro subiinidades. [,a aldciliisa A existe en la mayoría cle los te,jidoc 4. adcinis, la B se encuentra en el higado y el riñbti. I,oc fosfator; dc fructosa existen cn la célula principalinenle bajo la forma furanhsica, pero reaccionan coi1 la liisfohcxosa isomerasa, la fosfofructocinaca y la aldolasa en la configuracion de cadena abiertri. El gliceraldchida 3-fosfato y el fosfato de diIiidroxincetrin:i son interconvertidos por la enzima Fosfotriosa isomeraisa. O- Gliceraldehido 3-fosfato u
Puesto que se forman dos mol~culasd e triosafosfato por moléculas de glucosa que experimenta la glucolisis, en esta etapa se generan dos moléculac de ATP por molécula de glucosa, un e-jempl de fusrorilación "a nivel del sustrato". Si hay arscninto, competirá con el fosfato inorganico (P,) en las reacciones anteriores para prod~icir I -atscno-3-fosfoglicerato, que se hidroli7a en fnrniri espontanea para dar 3-fosfoglicerrito y calor, sin gcnerar ATP. Este es uri importante e.jeinplo dc IR propiedad del nrseniato para IIcvar a cabo el desacoplamiento de la ovidacihn y la Cosforílacibn. C1 3-fosfoglicerato que proviene de la5 reaccicincs anteriores, es convertidoen 2-fol;fogliceratopor la eninia fosfogliceratom~itasa.Es probable que el 7.3-bi~fr,sloglicerato (difosfoglicerato, L K P , en inglis, diphu,vpho~/yccvwie)sea un intermediario en esta seaccibi~.
Fosfato de dihidroxiacetona I,a yliicOli5i~prosigue por la oxidacihn del gliceraldeIiido 3-fosfato cn 1.3-bisfosfoglicerato y, debido a la
E1 piso siguiente es catatizado por la enolasa e iinplica unadeshidratacioi~y redistrihución de la energia
I
H-C-OH t
CH~O-Q
i
Gliceraldehido 3,fosfato
7
..
7
Complejo enzima-sustrato
Oxidación del sustrato por
I
H - C - OH I
Intermediario rico en energia
Figura 19-3. Mecanismo de oxidacrón del gliceraldehido 3-fosfato. (Enz, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa ) La enzima es inhibida por el yodoacetato, que es un veneno para el -SH, el cual de esta manera es capaz de inhibir la glucólisis
dei~trode la niolécula. lo cual eleva el fosfato de la posiciiin dos al estado dc alta energía, formándose así eE fosfocnolpiriivato. La enolasa cs inhibidri por C] flririruro, iina propiedad que puede usarse cualido se ncccsite impedir la glucólisis antes de calcular la gllicosa sangvinca. La eaizilna depende tambicn de la prcsencia de Mg2'o de Mnn+.
anaerobias, se eviia la reoxidacibn del N A U H mediante la transferencia de equivalentcs rcductores a través de la cadena respiratoria liasta el oxigeno. El pirtivato es reducida por el NADH hasta lactato. en una reaccibn catalizada por I n en7ima lactato deshidrogenasa. se han encontrado varias isoziinac de esta y iicnen importancia clínica (capitulo 8).
2-Fosfoglicerato t,Fosfoenolpiruvato + H20
Piruvato + NADH + H' ++ L(+)-Lactato + NAD'
El fosfato dc alta energía del fosfoenolpíruvato es transfcrido al A D P por la enzima piruvato cinasa, para generar en este estadio dos moléculas de ATP por inolécula de glucosa oxidada. En enolpiriivrtto que se forina eii csta reacciiin cs convertido cspontkneamentc a la forina ceto del piruvato. Esta es otra reacción sin equilibrio que se acompaña de una pérdida considerable de energía libre en forma de calor y debe considerarse fisi
La reoxidación del NADlI, por la via de la formación de lactato, permite que la gluc0lisis prosiga en auscncia de oxigeno al regenerar suficiente NAD' para otro ciclo dc la reacción calalizada por la gliceraldchído3-Tosfato deshidrogenasa. En condiciones aerobias, el piruvato se lleva al interior de las mitocondrias y, antes de su conversión en acetil-COA, se le oxida a CQ2 en el ciclo del ácido cítrico. Los equivalentcs reductores a partir de NADH - H- quc se forman en la gluc6lisis se introducen a las rnitocondrias por medio de 1 de las 2 lanzaderas que cc describen en el capitulo 14.
2 ¡S
Bruquimrca de Hrrrper
Tejidos que funcionan en circunstancias hipóxicas tienden a producir lactato (figura 19-2) Esto e5 particularmente cierto en el rnusculo csqueIético, donde la velocidad de trabajo del órgano IIO e s t i limitada por su capacidad de oxigenaci6n. Las cantidades adicionales dc lnctato producidas piiedcn ser determinadas eii los tejidos y en la sangre y la orina. Laglucólisis en los eritrocitos, aun en condiciones aerobias, termina siempre en lactato porque la ~nitocondria,que contiene la maquinaria enzirnhtica para la oxidación aerobia del piruvato no esta presente. El eritrocito de mamiferos es único en el sentido de qiie 90% de su necesidad total de energia es sumfnistrada por la gluc0lisis. Ademhs de las fibras blancas del niiisculo esqueletico, músculo liso y eritrocitos, otros te¡idos que nortnalrnente derivan la mayor parte de SLI cncrgia a partir de la glucólisis y producen Iactato, incluyen al cerebro, el conducto gastrointestinal, la in6diila renal. la retina y la piel. El hígado, riñones y corazón por lo general captan el lactato, pcro In producen shln en condiciones de hipoxia.
La glucólisis se regula en tres pasos que implican ecuaciones no equilibradas Aunque la mayoría de las reacciones glucolíticas son reversibler, tres de ellas son marcadamente exergbnic a i y, por tanto, deben considerarse fisiológicamente irrever5ibles. Estas reacciones con catalizadas por la herocinasa (y la glucocinasa), la fosfofructocinasa y el piritvato cinasa y son los principales sitios de regulación de la gluc6lisis. Las cClulas que son capaces de efectuar un movimiento total de metabolitos en la direccion de la síntesis de la vía glucolitica (gluconeogénesis) lo hacen debido a la presencia de diferentes sistemas enzimáticos, los cuales proporcionan rutas alternas de las reacciones irreversibles catalizadas por las enzimas mencionadas. Estas, junto con !a re&
En los eritrocitos, puede suprimirse el segundo sitia de glucólisis para generación de ATP E n los eritrocitos d e numerosas especies d e mamiferos, el paco catalizado por la fosfoglicerato cinasa. puede ser desviado por un proceso que disipa eficazmente, en forma de calor, la energía libre relacionada con el fosfato de alta energía del 1,3-bicfos-
(Capítulo I9j
H-c=O
t---Glucosa
I
H-C-OH
JNjADH + H'
ADP.
T
coo-
700H-C-OH
L--
+ Piruvato
Figura 1 9 4 . Ciclo del 2,3-b1sfosfoglFceratoen loseritrocitos.
foglicemto (figura 194). Una enzima adiciona!, !a bisfosfoglicerato mutasa, cataliza la convcrsfdn dcl 1,3-bisfosfoglicerato a 2,3-bisfosfoglicerato. El último es convertido en 3-fosfoglicerato par la 2,3bisfosfogliceratofosfatasa, actividad que tambien se atribuye a la fo.~fogliceer;ifurnuktsa. Lr7 p é d i d s de un fosfato de alta energía, Indicadora de que no hay produccihn neta de ATP cuando la gluchlisis toma esta vía, puede ser vent,josa para la economía del eritrocito, ya que permitiría que la glucólisis continuara cuando la necesidad de ATP fuera mínima. Sin embargo, el 2,;-bisfosfoglicerato, que se encuentra en concentracibn elevada, se combina con la hemoglobina, causando una disminucibn de la afinidad por el oxigeno y un desplazamiento hacia la derecha de la curva de disociación de la oxihemoglobina. Asi, su presencia en los eritrocitos ayuda a la oxihemoglobina a descargar oxigeno (capitulo 7 ) .
LA OXIDACIÓN DE PIRUVATO A ACETIL-CoA ES LA V ~ A IRREVERSIBLE DE LA GLUCOLISIS AL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO Aiitcs dc quc cl piriivato pueda entrar en el ciclo del acidocitricci debc Ilcvarsc al interior de lamitocondria 1.13 iin transportador especial de piruvato que a) uda a su paso a través de la membrana mitocondrial interna. E.itci crlmprcnde un mecanisnio simportador q ~ c c o t r i n ~ p o riin t a proton (figura 14-1 2). Dentro de la iiiitocondria, el piruvato es descarboxilado por oxirlaciiin a a c e t i l 4 o A . Varias enzima5 catalizan esta rc,i~cicin nperarido secuencialmente en 1111 comple-jo riiultieiiziinático. Se lec designa de manera colectiva coino cl cornple,jo piriivato deshidrogenasa y son ,iiialogas al comple.io de la alfa-cetoglutarato dcsliitlrogenasa del ciclo del hcido cítrico (figiira 18-3). t:l pirutato es descarboxilado por Ia piruvato dcshidrogenasa, componente del complejo de la en7inia ii un dcrivado hidroxietilico del anilla tiazhlico del riifosfatn de tiamina unido a la enzima, que a su veL i~accionacon la lipoamida oxidada, el grupo prnsiiiico dc l a riihidrolipolil transacetilasa, para formar ,icciil-liponrnida (figura 19-5). La tiamina es un imporiantc miembro del complc,jo de vitamina B (capitulo 52). EI aceti 1-Tipoamida reacciona con la cticnrinia A formando acetil-CoA y lipoamida rediicido. E1 ciclo de reacción se complcta ciiando el uliimo cs reoxidado por iina flavoprotcina conteniendo FAD. eii presencia de dihidrolipoil deshidrogenasa. rinnlmcnte, la flavoproteina reducida cs oxidada por cl NAD-, cI que a su ve7 transfiere equivalentes rediictores a la cadena respiratoria. Piruvato + NAD' + COA 4
Acetil-Cok + NADH + H'
+ CO2
CI coniplejo piruvato hidrogenasa consiste en cierto riiiinero de cadenas polipeptidicas de cada una de las tres en7imas componentes, organizadas en una config~iración espacial regular. El movimiento de las enzimas individuales parcce ser restringido y los intermediarios inctabiilicos no se disocian libremente, cino que permanecen unidas a las enzirnas. Tal complejo enzimatico, en donde los sustratos se manejan dc una enzima a la siguiente, incrementa la velocidad de reaccion y elimina reacciones secundarias, lo que eleva la eficiencia global. k.s de notarse que el sistema piruvato deshidrogenasa es suficientemente elecíronegativo con respecto a la cadena respiratoria que, además de generar tina coenzima reducida (NADH), tambien genera un cnlace tioester de alta energia en la acetilXoA.
La piruvato deshidrogenasa se regula mediante la inhibición por el producto final y la modificación covalente La piruvato deshidrogenasa cc inliiblda por siis productos. acetilCoA y N A D H (figura 1 9 4 ) Tamhibn Fe regula mediante la fosforilaciún de tres recidiios de serina dcl componente piruvato desl-iidrogcnasa del compleio multienzima con participacihii de una cinaa especifica de A'ff', la cual disminuye la actividad, y por medio de la fo~forilacionpor iina fosfiitasa quc iiicrtnientn la actividad de la deshidrogeriasa. La cinasa se activa cuando aumeiitan las proporciones de [acetil4oA]ilCoA], pADH]rmAD'l o [ATP]/[ADP]. Por tanto, la piruvaio dcshidrogenasa y, del mismo modo, la glucólisis se iiihiben no shlnpor un potencial energético eievado, sino también bajo condiciones de oxidación de acidos grasos, quc incrementan estas proporciones. Así, en la inanicihn, cuando se increnienta la concentración dc icidos graso5 libres. di+ rninuye la proporcihn dc Ia cnzima en la forma activa lo que ahorra carbohidratos. Un aumento en la actividad en el tejido adiposo ocurrc dcspiiks de la administración de insulina, pero no en el Iiigndo.
La oxidación de la glucosa produce hasta 38 moles de ATP en condiciones aerobias, pero sólo dos cuando no hay oxígeno Cuando un m01 de glucosa es qucmado e n un calorímetro hasta CO? y agua, se liberan aproximadamente 2780 kJ como calor. Cuando la oxidacion tiene lugar en los tejidos, algo de esta energia no se pierde inmediatamente como calor, sino quc cs "capturada" en enlaces fosfato de alta energía. Aprouimadamcnie 38 moles de A'TP son generados por molécula de glucosa oxidada hnsia CO? 4 agua. In vivo. se ha calculado que el AG para la reacción de la sintesis de ATP es de aproxiinadamente de 5 F . 6 kJ. Se asume que la energia total capturada en forma de A'I'P por las moleculas de glucosa oxidada es de 1961 kJ, o cerca de 68% de la energia de combustión. La mayor parte del ATP se produce como consecuencia de la fosforilación oxidativa resultantc de la reoxidación por la cadena respiratoria de las coenzimas reducidas. El resto es generado por fosCoriIacih a "nive1 de sustrato" (capítulo 14). En el cuadro 19-1 se muestran las reacciones responsablps de la forinacicín de fosfato de alta energia durante la oxidación de la glucosa y la producción total cn condiciones acrobias y anacrubias.
Figura 19-5. Descarboxilacion oxidativa por el complejo piruvato deshidrogenasa El acido Iipoico esta unido mediante un enlace amida al residuo de Iisina del componente transacetilasa del complejo enzimatico. Forma un brazo largo y flexible, permitiendo que el grupo prostetico del Acido Iipoico gire secuencialmente entre el sitio activo de cada una de la$ entimas del complejo (NADt. dinucleotido de adenina y nicotinamida, FAD, dinuclebtido de flavina y adenina. TDP, difosfato de tiamina.)
ASPECTOS CL~NICOS
La inhibición del metabolismo del piruvato produce acidosis Iáctica Los iones arsenito o mercuricos forman complejos con los grupos -SH del ácido lipoico e inl~ibena la piruvato deshidrogenasa, del mismo modo que una dcftcicncia diet4tica de tiamina, la cual permite la acurnulaciiin de piruvato. Los alcoh6licos privados de
aliinei~iostienen deficiencia de tiamina por lo que. cuando reciben glucosa, muestran una acumulacion ripida de piruvato y acidosis lactica, que con frecuencia es mortal. Por su parte, los pacientes con carencia hereditaria de piruvato deshidrogenasa, que puede deberse a defectos en uno o más de los componentes del complejo de la enzima, se preseiitan con una acidosis lactica similar, en especial después de una carga de glucosa. En virtud de su dcpeiidencia de este carbohidrato como combustible, cl ccrebro es uti tejido relevante para que este defecto metabblico se manifieste en trastornos neurol6gicos.
i-i-1
[ A~etil-COA]
!COA]
NADH + H+
W I
[NADH] [NAD']
[Aopl
M~''
PDH-a
fOESFOSF0-ENZIMA activa)
1
PDHFOSFATASA
M ~ ' +ca3+ .
1
\
Insulina
(en el tejido adrposo)
Figura 1 9 4 . Regulacion de la piruvato deshidrogenasa (PDH) Las flechas onduladas indican afectos alost8ricos. A: Regulación por inhibición d e producto final B: Regulación por interconverción de formas activa e inactiva
Se Fabe de mutaciones de virtualmente todas las enzimas del metabolismo de carbohidratos, cada una de el las relacionada con enfermedades Iiumanas. La deficiencia hereditaria de aldolasa A y de piruvato cinaFa en los eritrocitos causa anemia hemolítica. La capacidad de esfuerzo de los pacientes con deficiencia muscular dc frisfofriictocinasa es baja, en particiilar con dietas ricas en carbohidratos. Proporcionar iin coinbustible lipidico alterno. por ejemplo, durante iriaiiicihn. ciian'do hcida'; gmsos y cuerpos cetonicos auincntaii, inejora la capacidad para el trabajo.
RESUMEN 1) Ln glucolisis es la via para el metabolismo de
-rlucosa (o gliicbgeno) a piruvata y lactato, la cual
se efectúa en el ciiosol de todas las celulas de mamíferos. 2) Funciona de manera anaerobia mediante la regeneración del NAD' necesario en la reaccion de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, por acoplamiento de csta reacción a la reduccihn de piruvato a lactato. 3) El lactato es cl producto final de la glucolisis anaerobia(por ejemplo, en el músculo en ejercicio) o cuando la maquinaria inetabhlica no existe para oxidacion ulteriw del pituvato (comoen los eritrocitoc). 4) La glucolisis se regula por tres enzirnas qiie catalizan reacciones sin equilibrio, a saber, hexocinasa (o glucocinasa), fosfofiuctocinasa y pinivato cinasa. 5) En los eritrocitos, el segunda sitio donde se lleva a cabo la gluciilisis para producir ATP, puedc ser
222
(Capitulo 19)
Binquimfca de Harper
-
Cuadro 19-1. Generacibn de fosfato de alta energía en el catabolismn de la glucosa ción d e 4
acci6n cat
Gliceralaeniao-.+-tosrato deshiidrogenasa
rcspiratoria osforilacion ;iE nivel cle1 sirstrato osforilación al nivel cle1 sustrato
Fosfogliscerato cina Piruvato cinasa
Cantidad de ATP consumida por reacciones catalizadas por la hexocinasa y la fosfofructacinasa
clo del ido
Qxidacibn de 2 NADH en la cade rcspirato,ria Oxidacibn dc 2 NADH. en la cade respira10 0ixidacihn de 2 NADH: en la cadc licL respiratoria ixidacibn al nivel del sustrato . . ixidaciiin de 2 FADH2 en la cadena respiratolria ixidación de 2 NADH: en la cade
deshidrogi
rico
iglutmato r
nasa
o tiocinasa . ... Malato cleshidroger
-
-
respiratosria
,,S
Totai por moiecuia ae glucosa eti condiciones aerobias
Tc)tal por moslkculas de glucosa en condiciont -- Ia glucblisis St- c,urirs -.. el NADH
-
c---.l-
,
6
2 4
4
Total 30
,*"A""
as
-
las rnitocandiim ~ J IiiicJio de la l a n ~ ~ suci ai ~ a l a t o(figura 14-16) Si se emplea la lanzadera de glicerofosFato s61o podrian formarse 2 - P por mo1 de NADE1, siendo ent nnces la producción ñetrI total de 36 en lugar de 38 El calculo ignora la pequeiia perdida de ATP debido al transporte de H N con piruvato hacia la niitocondria ) un transporte semejante de H' en la operacibn de la lanzadera de malato, lo cual totali ra aproximridamente 1 rno1 del ATP'. Nótese qur que l a prodiicci6n total 43e fosfato dr hay un beneficio sustancial en condiciones anacrobiaf SI el glucbgeno es el punto de Iinicio, dado .. . . . alta cnergil en la glucíilisis se eleve de 2 a 3, puesto que e l ATP ya no se necesita para la reaccibn de hexocinaa. que
iiiiiiiiuiii c i i
tado hacia
L> L I ~ I W ~ U ~
esquivado, lo cual conduce a la formacibn de 2,3bisfosfoglicerato, importante para disminuir la afinidad de la hemoglobina por 0 2 . 6 ) El piruvato es oxidado a acetilXoA por un complejo multienzimatico conocido como piruvato
deshidrogenasa que depende del cofactor vitarnínico difosfato de tiamina. 7) Los trastornos que implican una incapacidad para metabolizar pimvato con frecuencia conducen a acidosis Iáctica.
REFERENCIAS Behal RH et al.: Regulation of the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex. Annu Rev Nutr 1993; 13:497. Boiteux, A, Hess B: Design of glycolysis. Phil T m s R Soc London R 1981;293:5. Boyer PD (editor): The E v m e s , 3rd ed. Vols 5-9. Academic Press, 1972. Fothergill-Gilmore LA: The evolution of the glycolytic pathway. Trends Biochem Sci 1986; 1E :47. Randle PJ, Steiner DF, Whelan W J (editors): Carbohdrate 1Metabolism and lts Dnsorders Val 3 . Academic Press, t 9R t .
Scriver C R (editor): Metabolic Basis oflnheritedDasease 7th ed. McGraw Htll, 1995. Sols A: Multirnodulation of enzyme activity. Curr Top Cell Reg 1981;19.77. Srere PA: Complexes of sequential metabolic enzymes. Annu Rev Biochem 1987;56:89. Veneziale CM (editor): The Regulation of Carbohydrnte Formation and L'til~z~tion in Mammals. Mniversiw Park Press, 1981.
El glucaghn es la principal forma de almacenaje de carbohidratos en los animales y corresponde al almidón de las plantas. Se encuentra en proporcibn mayor en el hígado (hasta 6%) y en el musculo, donde rara vez excede de 1 por ciento. Sin embargo, debido a su masa mayor, el músculo almacena 3 a 4 veces la cantidad de gluciigeno que tiene el hígado como reserva (cuadro 20-1). Al igual que el almidón, es un polimero ramificado de alfa-D-glucosa (figura 15-1 5).
El glucógeno muscular funciona como fuente de fácil disponibilidad de unidades d e hexosa para la glucblisis dentro del propio musculo. El glucógeno hepatico sirve en gran medida para exportar unidades de htxosa para la conservación de la glucosa sanguinea, en particular entre comidas. Despuds de 12 a 18 horas de ayuno, el higado casi agota su reserva de
dro 20-1. Almacenamiento de carbohidsatos II ser humano adulto normal (70 kg), después
glucógeno. Por su parte, el glucógeno muscular s61o disminuye de manera significativa después de un qjercicio vigoroso prolongado. Las enfermedades por almacenamiento de glucógeno son un grupo de trastomos hereditarios caracterizados por la deficiente movili7ación de glucógeno o por la deposicibn de formas de glucógeno anormales, originando debilidad muscular o, inclubo, la muerte.
LA GLUCOGENESIS SE PRESENTA PRINCIPALMENTE EN MÚSCULO E HIGADO La vía de biosíntesis del glucógeno utiliza un nucleótido de glucosa especial (figura 20-1) La glucosa es fosforilada a glucosa-6-fosfato, una reaccihn que es comun para la primera reacción en la vía de glucblisis a partir de la glucosa. Esta reacción es catalizada en el rnúscuto por la hexocinasa, y en el liigado por la glucocinasa. La glucosa-6-fosfato es convertida en glucosa-l -fosfato en una r e a c c i ~ nque catafiza la enzima fosfoglucomutasa. La enzima misma está fosforilada y cl gmpo fosf~ricoparticipa en una reacción reversible en la cual la glucosa-1,6bisfosfato es un intermediario.
Glucógeno hepi (ilucúgtno mus Glucosa extrace --..-m
i
del hlgado,
a muscular. 33 ~ g . imen total, 10 L.
En seguida, la glucosa-1-fosfato reacciona con el ,rifosfato de uridina (UTP, de1 ingles, uridine briphos-
Gjucbgeno (Unidades glucos~lo1
(Unidades glucosilo 1 +4),
4 y 1+6)
Insulina I
t
"Glucogeno
1 0 I
primordial"
Glucagon Adrenalina D~fosfato de uridina y glucosa
A la vla del Bcido v r 6 n i c ~
Glucosa liberada por la enzima desramificante
UDPW PPIROFO~~JFORIMSA,~
2 PI
Tnfosfato de uridina (UTP)
\
u
Glucosa-1 -fosfato
-
Glucosa-6-fosfate
To alyc0Wsis and mntoss bhmphaie pathway
CINAJA ATP
Glucosa
Figura 20-1. Vía de la glucog4nesis y glucogenblisis en el higado. Se emplean dos enlaces fosfato de alta energía en la incorporacion de 1 mol de glucosa al glucbgeno 0 , estimulacion, inhibición La insulina reduce la concentración de cAMP s61o después de que el glucagón o la adrenalina la han elevado, es decir. antagoniza su accibn El glucagon es activo en el músculo cardiaco pero no en el músculo esquelético. Al parecer, la glucanotransferaca y la desramificación son dos actividades separadas de la misma enzima.
e;
phcrrc) para formar el nucleótido a c t i v o difosfato de gliicosa de tiridina (UDPGlc, del inglés, uridine ~liphmphutepltrrn.re)* (figura 20-2).
La reacción entre l a glucosa-1-fosfato y el trifosfato de uridina es catalizada por la enzima UDPGIc pirofosforilasa.
UJP + Glucosa-1-fosfato
* hbc conoccii otros compuestos de ~iiiclc~sidos de dií'nsfatos
sriicar pucdc citar unido a diferentes nuclchtidiir Por cjcinplo. la glucosa puede enlazarse a los nuclcótidos de iiridina (cumu se muestra desput's), asi como a Iris de guatiosina. tiinidinn. adcnosina o citidina.
c-, UDPGIC+
PPi
La consiguiente hidrblisis del p i r o f o s f a t o inorzanico por la pirofosfiitasa inorganica impulsa la reacción la derecha la Gracias a la acción de la enzima gluchgeno sinta-9 el C I de la g l u c ~ s aa c t i v a d a de la UnPGlc forma un enlace glucosidico c o n e l C4 d e l residuo
En el mecanismo de ramificación hay desprendimiento de cadenas de glucógeno existentes O
L,a adición de un residuo de glucosa a una cadena previa de gluc6geiio o molkcula primordial tiene lugar eii el extremo externo no reductor de la molécula. de manera que las "rainas" dcl "árbol" de glucógerio se vayan alargando conforme se constitiiycn otroc enlaces 1 +4 (figura 20-3). Cuando la cadena se ha alargado como minimo a 1 I residiios d e glucosa, una segunda enzima. la enzima ramificante ([1+41=tl l k 6 ) amilotransgliicosidasa), transtiere tina parte de la cadena 1 4 4 (longitud rnfnima de seis residuos cfc glucosa) a una cadena vecina, para formar un enIace 1- 6, estableciendo de este niodo un punto de ramificación en la molécula. Las ramas crcceii por inis adiciones de unidades glucosilo 1 +4 con ramificacihn posterior. Ciiando el número de residuos terininales no redrictores aumenta, la cantidad total de ciclos reactivos en lamcil~ciilaF e eleva, lo cual acelera taiito la glucogCiiesis como 13 glucogen
I
---HO
Glucrisa
Cifosfato
Ribosa
OH
Uridina
Figura 20-2. Difosfato de glucosa de uridina (UDPGlc)
teriiiin;il de glucosa dcl glucogeno, liberando difosfato dc uridina (llDP). Debe haber una molécula preexisterite d e glucógeno o gluchgeno primordial para iniciar esta reacción. Ida molécula priinordial dc gliicrjgeno puede a su ycz haberse formado de una ~iroteinaconocida como glicogenina. UDPGlc
* (CE.1"
t
glucogeno
LA GLUCOGEN~LISISN 0 ES LA INVERSA DE LA GLUCOGENES~S
UOP + (Cs)n+i
glucogeno
SINO UNA V ~ ASEPARADA En la via de degradación interviene un mecanismo de desramificación (figura 20-1 )
Ln ~l,liicogeriiriaes una prntcina de 37 kDa qiie se glucohila sobre iin residuo especifico de timsina medinnte UDPGlc. Otros rcciduos adicionales deglucosa se adhiere11en la pocicibn 1 4 4 para hacer una cadena corta cpe se activa For la gluc6geno sintasa. En el iiiúsciilo esqueletico, la glucogenina pcrmancce adIierida en el centro de la molécula de glucógeno (figura 15-5 j, ~nicntiasqtic en el higado, el numero de moléculas tic :I~ic6gcnci supcra al de glucogenina.
O Residuos de glumsa no marcado OK3 Enlace glucosidico l+6
..
Es el paso catalizado pos In fosforilasa, que es liinitante de la velocidad en la glucogenhlisis: (C8)n +
Pr
+
glucogeno
, , .
CC'
(C&-1
+ Glucosa-1-fosfato
glucogeno
1
/
~~~-~lucosa adicionada
Figura 20-3. Biosintesis del glucogeno El mecanismo de la ramificación puede observarse por adición de glucosa marcada con C" a la dieta en animales vivos y examinando el glucbgeno hephtiw en posteriores intewalos
Esta enzima es especifica para la degradacion fosforolítica (fosforólisis confrontese hidrólisic) de Ios enlaces 1 4del glucbgeno para producir glucosa-l -fosIaro. Los residuos glucosilo de las cadenas más externas de la inolécula del glucógeno son separadas hasta qiie nihs o mcnns cuatro residuos de glucosa permanecen en cualquier lado de una rama 1 4 6 (figura 2 0 4 ) . Otra enzima (alfa-1 I +4]-+aIfa-[1-+4] glucano transferasa) transfiere una unidad trisachrida de una rama a la otra. exponiendo los puntos f+6 de la rama. La escisibn hidrnliticii de estos últimos enlaces requiere la acción de una enzima desramificante Q[1+61amilogliicosidasa). Con la eliminacion de la rama, pi~edeproseguir la accfiin de Ia fosforilasa. La accihn combiiiada dc la fosforilasa y de estas otras enzimas conduce a la degradación completa del gIucbgeno. La reacción catali7.ada por la fosfoglucomutasa e5 reversi hle, de modo quc puede formarse glucosa-h-fosfato a partir de la glucosa-l-fosfato. En e1 hígado y e1 riñiin (pero tio en el míisculo), hay una enzima específica, la glucosa-ti-fosfatasa, que rctira cl fosfato de la glucosa-6-fosfato, permitiendo que la glucosa libre difiinda de fa cklula a la sangre. Éste es el paso final de l a glucogenolisis hepática, la cual se refiqja en la elevación de fa glucosa canguinea.
EL AMP C~CLICOINTEGRA LA REGULACIÓN DE GLUCOGENOLIS~S Y GLUCOGÉNESIS Las principales enzimasqlic controlan el metabolismo del glucógeno -gluccigcno fosforilasa y glucógeno sintasa- están controIadas a sti vez por una serie compleja de reacciones que comprenden mecanismos alostéricos y modificaciones cova~entesdebidos a la fosforilacibn y desfosforilación reversible de la proteína enzimatica (capítulo 1 1). Muchas modificaciones covalcntes se deben a la acción del cAM P (ácido 3',5' -adenilico cidico; AMP cíclico) (figura 20-5). El cAMP es el compuesto intermediario intraccluIar o segundo rncnsajero, a travbs del cual actúan numerosas hormonas. Proviene dcl ATP mediante Ia acción de la enzima adenilato ciclasa, que se encuentra en la superficie interna de las membranas celulares. La adenilato ciclasa es activada por hormonas como la adrenalina y la noradrenalina que actúan a travCs de receptores beta adrenérgicos en la membrana ccEular y en el higado por medio de! glucagdn, que actúa a traves de un independiente receptor de glucaghn. E1 cAMF es destruido por una fosfodiesterasa y la actividad de esta enzima es la que, por lo c o m h , conserva baja la concentracihn de cAMP. Se sabc que la insulina incrementa su actividad en el liigado, disminuyendo por tanto la concentración de cAMP.
La fosforilasa hepática es diferente a la muscular En el higadn, la enzima existe en tanto en la forma activa como en Ia inactiva. L a fosforilasa activa (fosforilasa a) tiene uno de sus grupos hidroxiIo de seriiia fosforilado en un enlace éster. Con Ia acción de una fosfatasa especifica (proteína fosfatasa-ll ), la enzima es
cosa por enlaces glucosidi-
cos 1+4 Unibnde residuos de glucosa por enlaces glucosldicos 1+6
Figura 2 0 4 . Pasos en la glucogenólisis
Figura 2 0 6 . Ácido 3',5'-adenilico (AMP ciclico; cAMP).
Metabolismo di!¡g/i:cb,yyno
inactiv~daa fosforilasa b en una reacción que comprende In cliiiiinacion hidrolitica del residuo de serina. La rcaciivacion requiere una nueva fosforilaci6n con A 1'1' y u n a enzima especifica, la fosforilasa cinasa. 1.a f
El cAMP activa la fosforilasa muscular I .a fcisforilasa en el músculo es activada por la adreiialiiia (lisura 20-6). Sin embargo, esto ciicede no conio u11 cfccto directo cine por medio de la accion del cAMP. EI increinento en la concentraci6n del cA M 1' activa a iina enzima con especificidad amplia, la proteína cinasa dependiente de cAMP. Esta cinasa catali7a la foshrilación por el ATP de la fosforilasa cinasa b inact ¡va a la fosforilasa cinasa a activa, lacual, a SLI vez, por conducto de una fosforilacibn posterior. activü a la t'osforilasa b a fosforilasa a. La proteína cinasa inactiva depeiidiente de cAMP esti ctinslituida por dos partes de subunidades, cada par formado de una subunidad reguladora (R), que fija 2 moleculas de cAMP y una subunidad catalitica (C), que contiene cl sitio activo. La combinacihn con el cAM13 hacc que el cornple+joR2C2 se disocie, liberando los inonómeros C activos. R2C2 + 4cAMP o 2C + 2(R
inactiva
activa
El Ca2+sincroniza la activación de la fosforilasa para iniciar la contracción muscular La glucogenólisis aumenta cn el mucculo varios cientos de veces inmedia~amentedespués del comienzo de la ~nnlraccibn.Esto comprende la activación rhpida de la fosforilasa, caiisada por la activación de la fosforilasa c i n a ~ apor el Caz+, la misma sefía1 que inicia la contracción. La fosforilasa cinasa muscular tiene cuatro tipos de subunidades: alfa, beta, gamma y deIta en una estructura represcntada como (apyG)4. [,as subunidades alfa y beta contienen residuos de scrinn que son fosforilados por la proteina cinasa
22 7
dependiente de cAMP. La subunidad beta fija 4 Ca" y es identica a Ia pmtcina ,¡adora dc Caz+. la calmodulina {capítulo 44). La fijación del Ca2' activa el sitio cataIitico de la subunidad garnma en tanto que la molécula permanece en la configuracicin b desfnsforilada. Sin embargo, la f ~ m a fosforilada sólo es activada por completo en presencia de Caz'. Es un hecho significativo que la calmodulinn sea analoga cn estructura a la 'lpC. la proteina .jadora de Cal' en el mlisculo. Una segunda molecula de ca!modulina o dc TpC puede interactuar con la fosforilasa cinasa, aumentando la nctivacibn. Por tanto, la activaciiin de la contraccibn muscular y de la glucogcn6lisis son realizadas por la misma proteina tijadora de Caz-, 10 cual asegura su sincronizacidn.
La glucogenólisis en el hígado puede ser independiente del cAMP AdemBs de la importante accihn del gIucag6n en la formacibn del cAMP y en la activacion de la fosforilasa hepática, los csiudios han mostrado que los receptores alfa, son los principales mediadores de la estimulaci6n de las catecolaminas en la glucogenolisic. Esto implica una movili;r,acibn de Ca2-, independiente del cAMP, de las mitocondrias al citosol, segiiida por la estimulacion de una fnsforilasa cinasa sensible a Ca2t/ca1modulina. La gliicogenólisis independiente de cAMP es causada tambidn por la vasopresina, la oxitocina y la angiotensina 11 que acíiian a travds del calcio o de la via del bisfosrato de fosfatidilinositol (figura 44-7).
La inactivación de la fosforilasa es efectuada por la proteina fosfatasa-í Tanto la fosforilasa a como la fosfori lasa ciiiasa a son desfosforiladas e inactivadas por la proteína fnsfatasa-l. Esta ultima es inhihida por una proteina denominada inhihidor-l, el cual es aclivo siilo después de que ha sido fosforilado por una proteina cinasa dependiente de cAMP. Por tanto, el cAM13 controla tanto la activación como la inactivacibn d e la fasforilasa (figura 2 0 4 ) .
La actividad de la glric0geno sintasa y de la fosforilasa se regula de manera recíproca (figura 20-7) AI igual que la fosforilasa, la glucógeno sintasa existe en estado fosforilado y no fosforilado. Sin embargo, al contrario de la primera, la fbrma activa está desfosforilada (gliicógeno sintasa a) y puede ser inactivada a gliiciigeno sintasa b mediante la l'osforilaci6n en siete residuos de scrina por no metios dc
Adrenalina Receptor p
Adenilato
Adenilato ciclasa
clclasa inactiva
activa
Glu~&geno(~+i]
FQSFODIESTERAJA ATP
Figura 20-6. Control d (n = numero de
r-
CAMP
c 5'-AMP
1
La secuencia de reacciones ordenadas corno una cascada permite la amplificación de la seíial hormonal en cada paso
~ c i cproteina cinasas difcrcntcs. Los siete sitios dc fosfori laciijn ecthri coriten idos eii cada 1 de 4 subunitladts idkilticas. Dos de las proteína cinasas son depeiidientes de Caz-'calmodulina (una de estas es Ea frisforilasa cinasa). Otra c i In prolcliia ciiiasa depend i c i ~ t edc cAMP. que permite la accioli honnonal mediada por cAM13,de iiiliibir la síntesis de glucogeno dc inodo siiicronizado con la activación de la glucosenniisis. [ , a 5 cinasas rcstnntcs son conocidas como gliicogeno sintnsa cinasa-3, -4 y -5. La glucosa-ú-iosI';iio cs ti11 aclivador alostérico de la glucbgenci sintasa li. que C¿ILIWLIII~ wduccihn en Ia Klllpara la UDP-glucoca y que permite lii síntesis dcl gluctigeno por la cn~ii-tial i i s h i ilada. E l g l u c ~ g e n otatnbien e-jeerce una iiihibición sobre su propia forniacibii, y la insulina t;irnbi&i-i estiinula la ~ i n t e ~ de i s gluchgcno en cl iníisculo, al proinover la de~fosforiIaciiiri y activaciiin de Iri glucbgeiici sintasa b. Por lo general, la decfosfo-
rilacion de la glucOgeno sintasa b se efectUa por la acciiin de la proteina fosfatasa- 1 , la cual estd Iiajo el coritrol de la proteina cinasa dependicntc dc c A M I '
(tigura 20-7).
EL EQUILIBRIO DE LAS ACTIVIDADES ENTRE LA GLUCOGENO SINTASA Y LA FOCFORILASA REGULA EL METABOLISMO DEL GLUCOGENO (Figura 20-8) La glucógeno sintasa y fosforilasa estan baio control del su.;tratn (por alosterismo) asi coino boi. control horinonal. L a ioslorilasa sc activa no solo por uii aiinicnto en la ~oiicentraciónde c A M t' (por medin de uiia fci~ftirilasaciiiasa). sino quc al inisnio licinpo la
Adrenalina
Receptor p
@
Adenilatocicla~a inactiva
Adenilato ciclasa activa
ATP
4
cAMP
1 FOSFODIESTEWSA 1 t
5'-AMP
l
inactiva
DEPENDIENTE Inhibidor-1 (inactivo)
prr9mua Cl*& DEFf PI3 E
n
PROTEINA
DEPENDIENTE
ADP
Glucosa-6-tosfato
GlucbgenomF + UDPG Inhibidor-1-fosfato (activo)
PROTE~NA FOSFATASA-1
Figura 20-7. Control de la glucogeno sintasa en el musculo (n = número de residuos de glucosa) La secuencia de reacciones ordenadas en cascada permite la amplificacibn de cada paco. lo que hace que cantidades nanomolares de hormonas produzcan cambios importantes en la concentracibn de glucbgeno (GSC, glucógeno sintasa cinasa-3, -4 y -5. flecha ondulada. adivacion alostérica)
glucógeno sintasa se convierte en la forma inactiva; Im dos efectos son mediados por una proteína cinasa dependiente dc cAMP. Aqí, la inhibición de la glucogenblisis potencia la glucogenesis total y, a sir vez, la inhihiciOn de ésta incrementa Ia glucogenblisis total. Tn~iibiCi~ en la regulacihn del metabolismo del gluch~enoes importante el hallazgo de que la desfostorilación cie la fosforilasa a, de la fnsforilasacinasa g dc la gliicíigeno sintasa h cs llevada a cabo por una sola enziina de especificidad amplia-proteína iosfataw-l. A sii vez, esta ultima cs ínhibida por una ~xwteinacii~asadependiente de cAMP a tmvtSs del ilihibidor- I (Figura 20-8). Por tanto, la gliicogenolicis ~ ~ c krminarse d c y la glucog&nesis estimularse dc inanera sincrnnizada o viceversa, debido a que los dos prncecns se sincroilizan por la actividad de la proteína cinasa dependiente de cAMP. La dos cnzimas, fosfo-
rilasa y glucógerio sintasa, piicden iosforilarsc de mancrareversible en mhs de un sitio por de las cinasas y la acción de las fosfatasas separadas. Estas fosFnrilaciones secundarias modifican la sensibilidad de los sitios primarios para fosforilacion y desfrisforilaciiin, Io cuaI se conoce como fosfnril~cihnde sitios rnirltiples.
El factor principal en el control del metabolismo hepático del glucógeno es la concentración de fosforilasa a Esta cnzima controla no sOlo cl paso limitante de velocidad en la glucogentílisis, sino qiie tambien inhibe la actividad de la proteína fosfatasa- I y, de este modo, controla la sintcsic de glucogeno (figura 20-3). La inactivacibn de la fosforilasa es consecuencia de la inhibición alostérica por glucosa cuando In concen-
'J
/ /
PwTEINA CIHASP DEPEND~ENTE
PKOTEINA FOSFATASA-1
A
O
PROTE~M A FOSFATASA-í
DE cAMP
\
\ \
,'/
Y /
glucbgeno J
\ \
/ /
Glucosa 1-Fosfato
Giuwsa (higade)
Glucosa
Lactato ( m ú s w i ! ~ }
Figura 20-8. Control coordinado de glucogenólisis y glucog8nesis por proteina cinasa dependiente de cAMP Las reacciones que conducen a glucogenólisis como resultado de un incremento en la concentracibn de cAMP se muestran por flechas gruesas y las que inhiben por activacibn de la proteina focfatasa-1 se muestran por flechas interrumpidas Lo inverso ocurre cuando la concentración de cAMP disminuye debido a la actividad de la fosfodresterasa, conduciendo a glucogenesis
Metahdi~model nlucúgeno
glucogenosis se resumen en el cuadro 20-2. Asimismo, se tienen informes de deficiencias de adenilata cinasa y proteína cinasa dependiente de cAMP. Algunos de los trastornos descritos han me-¡orado con los trasplantes de higado.
tracibn de esta se eleva después de una comida. La activación es causada por 5'-AMP que responde a la depleción de ATP. La administración de insulina de inmediato inactiva a la fosforilasa, lo cual es seguido por activación de la glucdgeno sintasa. Los efectos de la insulina requieren la presencia de giucosa. No se produce regulación de las enzimas de rarnificación y desramificacidn.
RESUMEN 1) El glucógeno representa la rnhs importante forma de almacenaje de carbohidrato en el cuerpo del mamífero y se encuentra principalmente en hígado y músculo. 2) En el hígado, su función principal es servir a otros tejidos mediante la generación de glucosa sanguinea. En el músculo, cubre las necesidades s61o d e ese órgano, como una fuente de combustible metabólico lista para usarse. 3) El glucógeno se sintetiza a partir de glucosa y otros precursores por la vía de la glucogénesis. Es degradado por una vía separada conocida como glu-
ASPECTOS CL~NICOS Las enfermedades por almacenamiento de glucógeno son hereditarias El termino de "enfemedad por almacenamiento de glucógeno" es una expresidn genkrica que intenta describir a un grupa de trastornos hereditarios que se caracterizan por depósitos de un tipo o de una cantidad anormal de glucógeno en los tejidos. Las principales Cuadro :20-2. Enf -.
.
-- ...--- -
Noin b r e
Enfi
:von Gierke
iipo ir
hfemeaaa oe trompe
Tipo III
Dex trinosis Iírnite o enf: dad de Forbes o Cori
Tipo l V
iento de es por alrnacenam .. Causa del trasto rno
Deficiencia d e gIu fi
Deficiencia de fa glucosidasa alfa-1 +4 y 1 +6 l isosornal (maltasa ácida) iusencia dr inzima di
antc enzima
ris. cnfcrn ante:
Tipo V
Tipo VI
Deficiencia de miofosfoi sind:reme de McArdlc
23 1
fosforilasamuscular
..
'aracterist
-
. . . Las ctlulas hephticas y del túbulo renal cargad as con glu cbgcno. Hipogluceinia, cetosiS e hiperlipidemia acumulaci en los lis ~ c i cardia, a ; polisaciri
Acumula dos rami-
acterísticu:
Acumula S con puntos cioncle no esian muy ramificados. La muerte se debe a insuficiencia cardiaca o hepática en el primer ano de vida Disminliyc la tol erancia a 1 ,. ejercicio:; los musc UIOS tienen ---*--LA -Luiireriiuub aiiuiiirale~altos de glucbgeno (2.5 a 4.1%). POCO O nada de lactato en la sangre dcsputs de ejeercich 4
de fosfor ilasa he-
Alto coritcnido de gluchgeni hcphtíco , se tiendle hacia 1; hipogluclcmia
)eficienciaI de fosfo fructociasa en mil:rculos y eri trocitos
Como eri el tipo V , pero tm bitn eki ste la pos ibilidad di anemia h emolitica
Jeiicierrcla de
Lurrici cri
fosforilasn ciria-
el tino VI
cogenbli~is.E ~ t última a conduce a la formacion de gliicora cri el hígado y de lactato en el músculo dehiclo ¿i la prcsenciñ o aur;ericia respectiva de gluciisa-O-fosfataca. 4) El A M P cíclico integra la rcgiilacion de In glucog c ~ i ~ i l i s iys de l a glucogdnesis cn Iin patroii
recíproco nl pi*omovcr la ac~ivaciiinde la fosforilasa y la inhibiciún de In glucógeno ~intasa. 5 ) Dcficicncias Iiercditarias en enziinas c h p c c i f i ~ r i sde metabolismo en hígado y múcciilo ocasionan enfermedades por almacentlrniento de glucógeno.
REFERENCIAS 11 ctivih 2nd ccl Chnpinnn & E::ilicn 1': htirr,o/ o/ E~qvnli* 1 Iiil E. 1 9x3, C'cilicn 1': I'lic rrilc rit' prutein phrisphorylation in thc lirirri\iin;il control r i l ' eii/yiiie artivity. Elir S Biuchciii 19x5: l j l:130, 'rciiti N, Gnnnnn RIL, Nuttall FQ: Iricrirprirulitin cif glycogc~~¡iniiifo n hcpntic prciteoplycogen allcr nrnl ~Jti~oic: iidininistrati(~[~. d Riol Cliem 1994;269:2232R. Exton JH: Molccular mechanisrns i n v o l ~ c din cx-adrenerpic icsponses. M o l Ccll Endocrinti1 I 'IX 1 :23:233. Cierldes R: (;lq~cigcn:14 mctnbnlic viewpoinl. Iliosciencc I k p 198h:Ci:415.
Hers HC:: 'l'liecrinlrril cif~pliicngenmetaholistn
in itic livcr.
Annu Rcv Biochcm 1976:.15:167. Randle P.I. Steiner DF,Whelan W.T (editors): I 'rirhnl
de la glucosa sanquinea U
Peter A. Mayes, PhD, DSc
La gluconeogénesis es el temino que se iitiliza para incluir todos los mecanismos y vías responsables de convertir otras sustancias diferentes de los carbohidrato~a glucosa o glucbgeno. Los sustratos principales para la gluconeogénesis son los amínoacidos glucogknicos, lactato, glicerol y propionato. El higado y el riíión son Tos tejidos donde se realiza principalmente el proceso, ya que contienen el conjuntocompleto de enzirnas necesarias.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA La gliiconeogénesis cubre las necesidades corporales de glucosa cuando el carhhidrato no esta disponible en cantidades suficientes en la alimentacion. Se rcquiere un suministro constante de gtucosa como fuente de energia, en especial para el sistema nervioso y los eritrocitos. La insuficiencia L.L la gluconeogénesis es por lo general mortal. Por debajo de una concentraci6n critica de la glucosa sanguínea, hay disfunción cerebral que puede conducir a coma y muerte. La glucosa se requiere también por el te-jido adiposo como fuente de glidrido-glicerol y es probable que intervenga en la conservaci6n de la cifra de intermedios en el ciclo del acido cítrico en numerosos tejidos. Es evidente que aun en las situaciones en qiie la grasa puede suministrar la mayor parte del requerimiento calórico del organismo, hay siempre un cierto requerimiento basa1 de glucosa. Además, la glucosa es el unico cambustible que suministra energia al muscu!o esquelético en condiciones de anaerobiosis. Es precursora del azucar de la leche (lactosa)
en la glándula mamaria y se capta activamente por e! feto. Además, los mecanismos gluconeogénicos sc utiliran para depurar los productos dcl metabolismo de otros tejidos desde la sangre; por ejemplo, lactato, producido por el músculo y los eritrocitos, y glicerol, que se f o m a continilamente por el tejido adiposo. El pmpionato, principal ácido graso glucogénico producido por los rumiantes en la digestión de las carbohidratos, es un sustrato importante para la gluconeogénesis en estas especies.
LA GLUCONEOGENESIS INCLUYE LA GLUCOLISIS Y EL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO,MAS ALGUNAS REACCIONES ESPECIALES (Figura 21 -1) Las barreras termodinámicas impiden una inversión simple de la glucólisis Krebs seílaló que las barreras energeticas obstruyen la reversión simple de la gluciilisis: entre el pimvato y el fosfoenolpiruvato, entre la hctosa-l ,B-bisfoshto y la fnictosa-6-fosfato, entre la glucosa-6-fosfato y la glucosa, y entre la glucosa-l -fosfato y el gluc6geno. Todas estas reacciones no tienen equilibrio, liberan gran parte de energia libre como calor y por tanto son fisloliigicarnente irreversibles. Es posible esquivarlas mediante reacciones especiales.
A. Piruvato y fosfoenoIpiruvato En la mitocondria se locali7a la enzima piruvato carboxilasa, la cual, en presencia de ATP, la vitamina B biotina y CQ:, convierte al piruvato en oxalacetato.
234
capitulo 2 1)
Bioquím ica de Hurper
-
Glucosa HEXOCINASA
Glucosa 6fosfato Glucógeno AMP
A
1
Gliceraldehido 3-tosfato
Fosfato de dihidroxiacetona
3-Fosfato de glicerol
Fosfoenotpiruvato
Oxalacetato
Figura 21-1. Vias mayores y regulacibn de gluconeog8nesis y gluc6lisis en el higado. Los puntos de entrada de aminoácidos glucog&nicosse indican por flechas que salen de circulos (figura 1 8 4 ) . Las enzirnas gluconeogenrcas clave se muestran con un rectángulo doble El ATP requerido para gluconeog8nesis se suministra por oxidacibn de Budos grasos de cadena larga. El propionato s6lo tiene importancia cuantrtativa en los rumiantes. Las flechas onduladas significan efecto alost&rico, las flechas cortadas modificación covalente por fosforilacibn reversible Las concentraciones altas de alanina actuan como una "cefial gluconeogifnica" que inhibe la glucblisrs en el paso de piruvato cinasa
Gluconeogknesis y control de la gluco.~asan~uinea 235
La función de la biotinaes ligar el CO?del bicarbonato a la enzima antes de la adición del CO: al pinivato (figura 52-13). Una segunda enzima la fosf ~ e n ~ l p i r l l carboxicinasa, ~at~ cataliZí! la Conversi6n dcl oxalacetato en fosfoenolpinivato. En esta reacción se necesita fosfato de alta energía en la fonna de GTP o ITP v se libera CO,. Por tanto. con la avuda de estas dos enzimas que catalizan transformaciones endergbnícas y de la deshidrogenasa Iáctica, el lactato se puede convertir en fosfoenolpiruvato, a! rebasar la barreraenergetica entre el piruvato y el fosfoenolpinivato. En el higado de pichones, pollos y cone,jos, la fosfocnolpiruvato carboxicinasa es una enzima mitocondrial y el fosfoenolpiruvato se transporta al citosol para su conversión en 1,6-bisfosfato de fmctosa por inversión de la glucólisis. En la rata y el raton la enzima esta en el citosol, lo cual genera un problema ya que el oxalacetato no difunde al travCc de la membrana mitocondrial interior. Esto se resuelve mediante conversión a malato, el cual puede transportarse al interior del citosol y reconvertirse en seguida a oxalacetato mediante la malato deshidrogenasa extramitocondrial. En el ser humano, cobayoc y vacas, las enzima se distribuyen por igual en mitocondrias y citosol.
B. Fructosa 6-fosfato y fructosa 7,6-bisfosfafo La conversión de fnictosa 1,6-bisfosfato en fiuctosa6-fosfato, necesaria para lograr la reversión de la glucolisis, se cataliza por una enzima especifica, la fructosa-1 ,&bisFosfatasa. Esta es una enzima clave en el sentido de que su presencia determina si un tejido es o no capaz de sintetizar glucógeno a partir no s61o del piruvato sino tambiin de los triosafosfatos. Esth presente en el hígado y ridones y demostrada en eI músculo estriado. Se sostiene que esth ausente en los musculos cardiaco y liso.
C. Glucosa 6-fosfato y glucosa ~a conversión de glucosa h-fisfato en glucosa se cataIiza por otra fosfatasa especifica, la glucosa ó-fosfa-
h , no
Esta enzima se encuentra en higado y pero tejidos muscular y adjpoco, supresencia a un agregar glucosa a la sangre,
,,lo,
D. Glucosa .I-fosfatoy glucógeno La degradacihn del glucógeno Iiasta gl~icosa1 -fosfato se efectua por la fosforilasa. La sinresis de gluc6geno implica una vía enteramente diferente a travds de la formacibn de la difosfato de widina y glucosa y la actividad de la glucógeno sintasa (fígura 20-1). Estas enzimas esenciales que permiten la inversión de la glucólisis tiene una función importante en [a gluconeogenesic. Las relaciones entre e s t a enzimas claves de la gluconeogénesis y la vía glucoIitica se muestran en la fígum 2 1-1 . Decputis de la transarn inacidn o desaminacibn, los aminoacidos glucog~nicosforman ya sea piruvato o miembros del ciclo del ácido cítrico. Por tanto, las reacciones descritas pueden dar cuenta de la conversibn tanto de los aminodcidos glucog&nicos como del lactato, en glucosa o glucógeno. Asi. el lactato forma pinivato y dehe entrar las mitocondrias antes de convertirse en oxalacetato y en último término en glucosa. El propionato, que es la fuente principal de glucosa en los rumiantes, entra a la ruta gluconeog&nica principal por la via del ciclo del hcido cítrico despuis de su conversidn en succinil-COA. El propionato se activa primero con ATP y COA por una acil-COA sintetasa apropiada. La propionil-COA, producto de esta reacción, experimenta una reaccibn de fijacibn de COZpara formar D-metilmalonil-COA, catalizada por la propionil-COA carboxilasa (figura 2 1-2). Esta reaccion es anhloga a la fijacibn det C 0 2 en la
CO2 +H,O
CoA*SH
CARROXILASA
coo -
H -$- COO-
CO- S- COA
Propronato
ATP
lntermedlos del ciclo del Acido
cítríco
A M P + PPI
e
Propionil-COA ATP
ADP + p,
o-Metilmalonil-COA
I
CH,
C H ~ -C<>Pnlim.Bli~~~-tH 60-$-COA CO-S- COA SucclnilEoA
Figura 21 -2. Metabolismo del propionato.
L-Metilmalonil-COA
acetil-COA por la acetil-COA carboxilasa (capitulo 23) en que forma un derivado malonilo y requiere la vitamina biotina como coenzima. La D-metilmalonilCOA debe convertirse en su estereoisómero, I -me& rnalonil-COA, por Ea metilmalonil-COA racemasa antes de cu isomeracícin final a succinil-COA por la enzima metilmalonil-COA isomerasa, la cual requiere vitamina B 1 2 como coenzirna. La deficiencia de vitamina B17 en el ser humano y los animales conduce a la excrecion de grandes cantidades de metilmalonato (aciduria metilrnalhnica). Aunque la via hacia el succinato es su ruta metabólica principal, el propionato puede también utilizarse como cebo rnolecular para la sintesis, en el tejido adiposo y glandula mamaria. de los hcidos grasos que tienen un número impar de átomos de carbono en la molécula. Los acidos grasos C I qy C17se encuentran particularmente en los lipidos dc los rumiantes de donde constituyen una fuente importante de estos acidos grasos en la alimentación humana y por iiltimo se degradan en propionato en los tejidos (capitulo 24). El gIicerol es un producto del metaboIismo de[ tejido adiposo y sólo los tejidos que poseen la enzima activadora glicerol cinasa, lo pueden utilizar. Esta enzima, que requiere ATP, se encuentra entre otros tejidos, en el higado y riiiones; y cataliza la conversibn de glicerol en glicerol-3-fosfato.Esta via conecta con las etapas de triosafosfatode la vía glucolitica, porque el glicerol-3-fosfato puede ser oxidado a fosfato de dihidroxiacetona por el NAD' en presencia de la glicerol-3-fosfato desfiidrogenasa. Eb hígado y el riii6n son capaces de convertir el glicerol a glucosa sanguinea haciendo uso de las enzimas anteriores, de algunas de las enzimas de la glucólisis y de las enzimas especificas de la via gluconeogénica: fmctuosa-1,6hisfosfataca y glucosa-6-fosfatasa (figura 2 1-1).
TODA VEZ QUE LA GLUCOLISIS Y GLUCONEOGENESIS COMPARTEN LA MISMA V ~ APERO EN DIRECCIONES OPUESTAS, DEBEN REGULARSE DE MANERA REC~PROCA Los cambios en la disponibilidad de sustratos son responsables de manera directa o indirecta de lamayor parte de los cambios en el metabolismo. Las tluctuaciones de su concentración sanguínea por cambios en la disponibilidad dietética pueden alterar el indice de secrecidn de hormonas, que a su vez, influye en el patrón del metabolismo en las diversas vias, a menudo modificando la actividad de enzimas clave que intentan compensar el cambio original en Ia disponibilidad del sustrato. Tres tipos de mecanismos pueden identi-
ficarse como responsables de la regulacíon de la actividad enzimática en el metabolismo d e carhohidratos se muestran en el cuadro 21-1: 1 ) cambios en la velocidad de sintesis enzimática, 2) modificación covaientc por fosforilación reversible y 3) efectos alost~ricos.
La inducción y represión de la síntesis de ensimas clave no son rápidas sino que utilizan varias horas Algunos dc los cambios mejor estudiados de la actividad cnzimática que ociirre bajo diversas condiciones rnetaMlicas aparecen en el cuadro 2 1-1. La infmaci6n en este cuadro se aplica en gran parte a enzima? hepiiticas. Las enzimas catali7an reacciones de no equilibrio que fisiológicamente pueden considerarse como " una dirección'' más que ecuaciones balanceadas. h menudo 10s efectos se refuerzan dado que la actividad de las enzimas que catalizan los cambios en la dirección opuesta varían de manera recíproca (figura 2 1-1 1. Es importante observar que las enzimas clave que intervienen en una vía metabólica se activan o deprimen d e manera coordinada. El cuadro 2 1-1 muestra con claridad que éste es el caso. Todas las enzimas que intervienen en Sa utilízacibn de la glucosa (es decir, Ias de glucólisis y lipogenesis) son más activas cuando hay un exceso de sustrato y bajo estas condiciones las enzirnas responsables de la pl-oduccibn de glucosa por la vía de gluconeogénesis muestran escasa actividad. La secreción de insulina. que es sensible a la conccntraci6n sanguínea de glucosa, aumenta la sintesis de las enzirnas responsables de la glucólisis. Del mismo modo, antagoniza el efecto de los glucocorticoides y del cAMF estimulado por glucagón el cual induce la síntesis de las enzimas clave responsables de la gluconeogknesis. Se ha demostrado- la regulación d e las especies mRNA de estas enzirnas y la modulacion de la expresión de sus genes. Las dos deshidrogenasas de la vía de la pentosa fosfato pueden clasificarse como enzimas adaptativas, dado que aumentan su actividad en ct animal bien alimentado y cuando la insulina se administra a un animal diabético. Su actividad es baja en diabetes o en ayuno. La "enzima malica" y la ATP-citrato liasa se comportan de igual moda, 10 cual indica que estas dos enzimas intervienen en las lipog6nesis mas que en la gluconeogCnesis (capitulo 23).
La modificación covalente por fosforilación reversible es rápida El glucag6n y en menor grado la adrenalina, hormonas que disminuyen la glucosa en la sangre, inhiben la glucólisis y estimulan la gluconeogénesis en el hígado mediante el aumento d e la concentraci6n de
Gluconeo,~éncsisy control de la nIucosa sanguínea 237
Cuadro 21-1. Enzimas reguladoras y adaptativas de la rata (hephticas en gran parte) ....
;
Dieta con
,,,vi,
carbohidratns
-
r--
Activid
-- -
i
-
1-
J
diabetes -
-"A"
Enzimas de gluco~eno; ~knesis,glu
l
1
S istema de glucógeno sini;asa
--
i
fosfori geno
--
HLAVL~LLU~ C; -
Insulin
I
I
-" -
-.A-A--
.". Fosfofructot
-
Cilucagón I
Insulina
fructesa t5- Citrato (ácidos grasos, cuierpos cct& fosfato* n i c o s li * . A T P * ,
1
.Pi, fructo!;a
-
alanina
Piriitfatocin asa -
Piruvato dt:shidro-
bn (cAMI' ndrcnal ina -
-
1
1
g cnasa
NAD*, i rI- A c e t i l - C O A , ,ADP. pin1- NADH',ATP (ácidos grasos. cuer-
! 1
m n r o o t Xn;'.n"l
Enzimas ae
-
zenesrs
Piruvata c arboxi-
,
4,
1 . ~ 1
T
Glucor ticoides, glucagún, aatena-
-
t i c o i d e s , tnsulina 1, adrcnaglucagó~ lina (CAPdl=) ticoides, glucagh1, adrena-
F carnox~c~ -
F
gón? --
Glucagbn (cAMP
Al'l
:n
"-
r
Glucosa-h-t
ticoides, ~nsul~na
L
-E C
L
giucagui1, adrenalina (cAb L-.. c fosfatos ii e pen tosa y de lipop ras vias d8
,fosfato
t
dcshidrol
1'6 ato, AMP 3SB
7 h
t 1
l L 1 lnsulina
Insulina
h
Enzima m i -P,1P-C itratc .. II.
,
-.
A
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A C C LPL- ~A - LCCL WU"~
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h,cido grasn -
* AIOSIC~IC~
T
'En tejido adiposo pero nin en higado.
---
+
cAMP. Lo cual, a su vez, incrernenta la actividad de tina proteína cinasa dependiente de cAMP, conduciendo a fbsforilación e inactivacion de la piruvato cinasa. También afectan la concentracibn de fructosa 2.6-bisfosfato y por lanzo la glucólisis y la gluconeogenesis, como se expiica adelante.
La modificación alosterica tambien es rápida Se dispone de varios qjernplos del metabolismo de carbohidratos para ilustrar el control alostérico de la actividad de una enzima. En la gluconeogknesis, la síntesis de oxalacerato a partir de bicarbonato y piruvato que se cataliza por Ea enzima piruvato carboxilasa, requiere la presencia de acetil-COA como activador alostérico. La adición de acetil-COA conduce a un cambio en la estructura Terciaria de la proteína, que reduce el valor Km para el bicarbonato. Este efecto tiene implícaciones importantes en la autorregulación del metabolicrno intermedio, en donde, igual que acetil-COA se forma del pinivato, asegura de manera automática una produccién constante de oxalacetato y, por tanto, su oxidación ulterior en el ciclo del hcido cítrico por la pinivato carboxilasa. I,a activación de esta última enzima, y la inhibicibn recíproca de la piruvato deshidrogenasa por el acetil-COA formada de la oxidacilin de Bcidos grasos, ayuda a explicar la accibn "ahorradora" de esta oxidacibn de Bcidos grasos en el metabolismo del pinivato y en la estimulación de gtuconeog~nesishepatita. La relación recíproca entre la actividad de piruvato deshidrogenasa y pimvata carboxilasa en hígado y riiíón altera el destino metabólico del pinrvato cuando el tejido cambia de oxidación de carbohidratos por glucólisis a gtuconeogtnesis durante la transicihn de un estado de nutrición adecuada a inanicihn (figura 2 1-1). Una funcibn importante de la oxidacidn de Bcidos grasos en la promocibn de la gluconeogknesic es suministrar el ATP requerido en las reacciones de piruvato carboxilasa y fosfoenolpiruvato carboxicinasa, y también, invertir la reacción catalizada por fosfoglicerato cinasa en la gluc~lisis. Otra enzima que est6 sujeta a control por retroalimentación es Ia fosfoIructocinasa (fosfofructocinasa-1)Ocupa una posicion fündamental en la regulación de la gluc6lisis. La enzima fosfofnictocinasa-1 se inhibe por citrato y por ATP y se activa con AMP, El AMP actiia como un indicador del estado energktico de Ea cklula. La presencia de adenilato cinasa en el higado y muchos otros tejidos permite el equilibrio rápido de
la reacción: ATP + AMP
H
2ADP
Asi, cuando el ATP se usa en procesos que requieren energia y deja como subproducto ADP, la concentracihn de AMP silbe.Como [ATP] puede ser 50 veces mLs elevada que [AMP] en el equilibrio, una disminuci6n fraccionaria pequeña en [ATP] causará una elevacion importante en [AMPJ. Por tanto, un cambio g r a n d e en [ A M P ] a c t ú a c o m o a m p l i f i c a d o r metabólico de un cambio pequefio en [ATP]. Este mecanismo permite que la actividad de fosfofi-uctocinasa- 1 sea muy sensible inclusive a cambios mínimos en el estado energetico de la celula y controle la cantidad de carbohidratos que experimentan glucólisis antes de entrar al ciclo del ácido cítrico. El aumento en [AMP] tambikn puede explicar por qué la glucólisis se acelera durante la hipoxia, cuando [ATF] disminuye. De manera simultánea, la A M P activa una fosforilasa que incrementa la glucogen6lisis. La inhibición de la fosfohctocinasa-1 por citrato y ATP podria ser otra explicación del efecto ahorrador de la oxidación de ácidos grasos en el consumo de glucosa y también del efecto Pasteur donde la oxidación aerobia (por el ciclo del ácido cltrico) inhibe la degradacirin anaerobia de la glucosa. Una consecuencia de la inhibición de fosfofructocinasa- 1 es la acumulaci6n de glucosa6-focfato que, a su vez, inhibe la captacibn adicional de glucosa en tejidos extrahepáticos por inhibicibn alostérica de la hexocinaca.
ha fructosa 2,6-bisfosfato tiene una función exclusiva en la regulación de la glucólisis y la gluconegoénesis en el hígado El efector aloct6rico positivo más potente de la fosfohctocinasa-1 e inhibidor de la fnictosa-1 , 6-bifosfatasa en el hígado es la froctosa 2,6 bisfosfata. Alivia la inhibicibn de fosfofmct~inasa-1 por ATP e incrementa su afinidad por fructosa 6-fosfato, Inhibe la fructosa1,ó-bisfosfatasa por incremento de Km para h c t o s a 1,6-bisfosfato. Su concentmcibn esta bajo control del sustrato (alost&rica) y hormonal (modificación coralente) (figura 2 1-3). La fnictosa 2,6-bisfosfato se forma por fosforilación de la fmctosa 6-fosfato por acción de fosfofructocfnasa-2. La misma enzima es también responsable de su degradacidn, ya que posee actividad de fructosa-2,6bisfosfatasa. Esta enzima bifuncional esta bajo el cona01 alostérico de fnictosa 6-fosfato, el cual cuando aumenta de concentracirin debido a una abundancia de elucosa. es decir. en un estado de suficiencia de nuiientes,'estimula á la cinasa e inhibe a la fosfatasa. Por otra parte, cuando la glucosa escasea, el glucagbn estimula la producción de cAMP, activando a la ~ r o t e i n acinasa devendiente de cAMP la cual a su vezrinactiva a la fos'fofructocinasa-2 y activa a la fnictosa-2,6-bisfosfatasapor fosforilación.
:luconeogkne.~i~s y cnnfi-ni de la glucosa sanguinea
Glucosa
-
y glucbgeno
1
. Fnictosa 6-fosfato
-.
-
239
Los ciclos (vanos)de sustrato permiten un ajuste fino Puede apreciarse que muchos de los puntos de control y el metabolismo del gluciigeno comprenden un ciclo de fosforilación y desfosforilaci0n catalimdo por las enzimas siguientes: glucocinasa y glucosa-6-f'osfatasa; fosfofnictocinasa- l y h c t o s a I ,6-bisfosfataca; piruvato cina~a,pinivato carboxilasa y fosfoenolpiruvato carhoxicinasa; y glucógeno sintasa y fosforilasa, Si se permitiera a estos ciclos continuar sin freno, serian ciclos vanos (inutiles) cuyo resultado neto conduciría a la hidrólisis de ATP. Que esto no ocurra de manera extensa se debe a varios mecanismos de control que aseguran la inhibición de un extremo en tanto que el otro se estimula en cada ciclo, de acuerdo al requerimiento tisular y corporal. No obstante, es probable que haya alguna ventaja fisiológica en permitir cierta ciclizacibn. Por ejemplo, en el ciclo fosfofructocinasa~fructosa-l,6-bisfosfatasa, podria ocurrir una amplificación del efecto de un modificador alostérico. como fnictosa 2,6 bisfosfato, productor de un cambio algo mayor en el flujo total de mmbolitos en cualquier direccibn que el que ~ u r r i r i a en ausencia de la ciclizaci6n de sustrato. Este "ajuste fino" del control metabolico causa siempre cierta pérdida de ATP.
en la gluctilisic
ADP
tA CONCENTRACION DE GLUCOSA Fructosa 1,s-bisfosfato
t
Piruvato
Figura 21-3. Control de gluo61isic y glucuneogénesis en el higada por fnrctoca 2,6-bisfosfato y la enzima bifuncional PKFIF-2,6-Paca (6-fosfofructo-2-cinasalfructoca-2,6-bisfosfataca). (PFK fosfofructocinasa 16-fosfofructo-9-cinasa]; F16-Pasa, fructosa-l,6-brsfocfatasa. Las flechas onduladas indican efectos alost~riwsE
Por tanto, bajo abundancia de glucosa, la fnictosa2,6-bisfosfato aumenta su concentraci6n y estimula la gluc~lisispor activación de fosfofructocinasa-1 e inhibicion de fnictosa- l,6-bisfosfatasa.Cuando la glucosa escasea, se estimula la gluconeogénesis por disminucion de la concentración de fnictosa 2,6-bisfosfato, que desactiva la fosfofructocinasa- 1 y ddesinhibe a la fnictosa-1,6-bisfosfatasa.Este mecanismo tambi&nasegura que la estimulación de la glucogen6lisis hephtica por el glucag6n conduzca a liberación de glucosa y no a gluc6lisic. lnvestigac iones recientes indican que el 1,6-bisfosfato de glucosa desempeila una funcibn semejante en algunos tejidos extraheplticos.
SANGU~NEASE REGULA DENTRO DE L~MITES MUY ESTRECHOS Después de la absorción, la concentración dc glucosa sanguínea en el ser humano y muchos mamíferos se encuentra dentro de los límites de 4.5 a 5.5 mmollL. Cuando se ingiere una comida rica en carbohidratos, puede elevarse a 6.5 a 7.2. Durante el ayuno, los valores bajan entre 3.3 y 3.9. La glucosa sanguinea en ares es bastante mayor (14.0 rnrnollL) y en rumiantes considerablemente menor (alrededor de 2.2 mmollL en ovejas y 3.3 en el ganado vacuno). Al parecer estos valores bajos se relacionan con el hecho de que los rumiantes fermentan casi la totalidad del carbohidrato de los alimentos a hcidos grasos de cadena corta (volátiles) y estos reemplazan en gran parte a la glucosa como combuctible metabolico principal de los tejidos en estado de suficiencia de nutrientes. Una disminución repentina de glucosa sanguínea causa ~onvulsiones,como en una sobredosis de insulina, debido a la dependencia inmediata del cerebro de! suministro de glucosa. No obstante, si se permite una adaptación progresiva es posible tolerar concentraciones sanguínea mucho menores de glucosa; por ejemplo, r a t a adaptadas a dietas ricas en grasas parecen normales con una concentración sanguinea de glucosa tan baja como 1.1 mmol/L.
LA GLUCOSA SANGU~NEA DERIVA DE ALIMENTACI~N, GLUCONEOGENESIS Y GLUCOGENOL~SIS La mayor parte de los carbohidratos digeribles de la alimentación en última instancia forman glucosa. t o s carbohidmtos dietéticos que se digieren en forma activa contienen residuos de glucosa, galactosa y fnictosa que se liberan en el intestino. Éstas se transportan al higado por la vena portal. La galactosa y fnictosa se convierten con facilidad a glucosa en el higado (capitulo 22). La glucosa se forma a partir de compuestos glucogénicos su,jetos a gluconeogcnesis (figuras 1 8 4 y 21-1). Estos compuestos se agrupan en dos caxegorias: 1) los que tienen conversión neta directa a glucosa sin reciclamiento significativo, como algunos aminoácidos y propionato; y 2) aquellos que son productos del metabolismo parcial de lo glucosa en ciertos tejidos y se llevan a hígado y riflbn, donde se sintetizan de nuevo a glucosa. Asi, el lactato, formado por oxidacibn de glucosa en músculo esquelktico y eritrociios, se transporta al hígado y riflón para regenerar la glucosa, que está de nuevo disponible para oxidación en los tejidos. Este proceso se conoce como cicln de Cori o del heido Ihctico (figura 2 1 4 ) . El 3-fosfato de glicerol para la síntesis de triacilgliceroles en el tejido adiposo deriva de la glucosa sanguinea. Estos aciIgliceroles experimentan
hidrólisis en forma continua para formarglicerof libre. que no puede utilizarse por el tejido adiposo y por tanto, difunde a la sangre y sc convierte de nuevo a glucosa por mecanismos gluconeogenéticos en hígado y rifion (figura 71 -1 j. De los aminoácidos tmnsnortadosdesde el músculo al higado durante inanición, predomina la alanina. Esto tia conducido a la hipótesis de un ciclo glucosaalanina, como se muestra en la figura 2 1 4 , qiie tiene e1 efecto de un ciclado de glucosa desde hígado al musculo, con fonnaciiin de pinivato, seguida por transam inacihn a alan ina; luego, esta es llevada al h igado y sigue gluconeogénesfc de rcgreso a glucosa. Ocurre una transferencia neta de nitrógeno de amina del rnúsculo al higado y de energia libre del higado al músculo. La energia requerida para la síntesis hepática de glucosa a partir de piruvato deriva de la oxidacion de ácidos grasos. La glucosa tambien se genera a partir del gluchgeno hephtico por glucogenolisis (capitulo 20).
Mecanismos metabólicos y hormonales regulan la concentración sanguínea de glucosa La conservación de valores estables de glucosa en la sangre es uno de los mecanismos homeostá~icosregulado con mayor precisibn y en el10 toman parte el hígado, tejidos extrahepáticos y varias hormonas. Al parecer, las celulas hepaticas son totalmente per-
Figura 2 1 4 . Ciclo del ácido lactico (Cori) y ciclo de la glucosa-alanina,
Gliaconeogéne~z.~ -v control de la ~Iucosusanguíneu * 211
meables a glucosa (vía el transportador GLUT 2) en tanto las células de los tcjidos extrahepfiticos (excepto los islotes pancreiiticos) son relativamente impermeables. Debido a esto, el paso a traves de la membrana celular es la Iimitante de la veIocidad en la absorción de glucosa en tejidos cxtrahepáticos y la glucosa se fosfotila con rapidez por acción dc una hexocinaca al entrar a la célula. Por otro lado. es probable que la actividad de ciertas enzimas y la concentracibn de intermedios clave ejerzan un efecto mucho más direcm sobre la captación y salida de gliicosadel hígado. No obstante, la concentracidn de glucosa en sangre es un factor importante en el control del indice de absorcibn tanto en hígado como cn tejidos extrahepáticos. Ida funciiin de varias proteínas transporíadoras de glucosa que se encuentran en la membrana celular, cada 1 con 12 dominios transmembrana, se muestran en cl cuadro 2 1-2.
La glucocinasa es importante en la regulación de la glucosa sanguínea posprandial Debe recordarse que la hexocinasa se inhibe por glucosa 6-fosfato, de modo que es posible ejercer cierto control por retroal imentaci6n en la absorción de glucosa por tqjidos extrahepáticos dependientes de hexocinasa mediante la fosforilacihn de glucosa. El higado no esta sujeto a esta restriccion debido a que la glucocinasa no se altera con el 6-fosfato de glucosa, La glucocinasa, que tiene una Km (menos afinidad) mas elevada para la glucosa que la hexocinasa. aumenta su actividad con concentraciones de glucosa por arriba de los límites fisiol6gicos (figura 2 1-5) y al parecer, se ocupa de manera específica de la captacion de glucosa en el hígado bajo las elevadas concentracio-
.
nes encontradas en la vena portal después de una comida rica en carbohidraios. Su ausencia en los rumiantes, en donde entra poca glucosa a la vena porta procedente del intestino, es compatible con esta función. En concentraciones sanguineas nonnales de glucosa (4.5 a 5.5 rnmol:L) el hígado se comporta como un productor neto de glucosa. Sin embargo, cuando la glucosa se eleva, la excreción hepatica de glucosa cesa, de modo que a valores altos hay una captación ncta de glucosa. Se calcula que en la rata. los índices de absorción y los de excrecihn son iguales a la concentracion de glucosa en Ea sangre de la vena porta esto es, X.3 rnmol/L.
La insulina tiene una función central en Ea regulación de la glucosa sanguínea Adernis de los efectos directos de la hiperglucemia para amplificar la captación de glucosa en hígado y tejidos perifericos, la honiiona insulina interviene de manera critica en la regulacion de los valorcs sanguíneos de glucosa. Esta hormona se sintetiza en las ~Clulas13 de los islotes de Langerhansen el páncreas como una respuesta directa a la hipergiucemia. ],a célula del islote es permeablc a la gliicosa por la via del transportador GLUT 2 y se fosforila por tina glucocinasa de una Kmalta. Asi la concentración dc glucosa sanguinea determina el flujo por medio de la gluc6lisis, el ciclo del ácido cítrico y la generación de A'I'P. El aumento en las concentraciones de IZTP inhibe los canales de K' sensibles al ATP lo que da lugar a despolarizacion de la membrana de la célula B; esto, a su vez, incrementa el influjo de Ca" por la vía de canales de Ca2' sensibles al voltaje y estimula la exocitosis de insulina. Es de remarcarse que los medicamentos de Ia sulfonilurea que se utilizan para estimular la secrecidn de insulina en la diabetes sacarina de tipo 11 (diabetes sacarina no
Cuadro 21-2. Transportadores de ~lucosa
-
. . - .. -. ..--.
.
.
l l bitación tisula
--
--
'ransportadotes hidlreccionaleS facilitadi~ r e s
Y
Fu nciiincs
--
.-
-A+-
Cerebro. riilon, colon. placenta.-eritrociin .
itacibn de 1
;
t-ligado. céluln B pancrcitica, intestino del gatlo, cal rifiún Ccrcbro, I " - . .
GLVLJ
Miisculoscardiaco y esquelktico, tejido ad iposo Cal ! " --
l. Intestino
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:lucnsa est
ir insulina
-Imln.irln
LC,~L,UW
Transportadores unidireccionalesdepcnd
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1
itacihn nctiiva de gluc la luz intc: ..-A A - -*.. '.L..ltina1l .y Icariwi LICIII ut.~ I L I C ~ I ' CII ~ U CI IUUUIU p~11,\1nial renal contra el gradiente dc conccntraciún
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Vmai
100
Hexocinasa
endógeno (e insulina) se depura de la circulación por el hígado. Al c o n m i o de la adrenalina, el glucagón no tiene efecto sobre la fosforilasa muscular. También incrementa la glriconeogénesis a partir de aminolcidos y lactato. La glucogen0lisis y gluconeogénesis hepática contribuyen al tfccto hipergluccmiante del glucagón, cuyas acciones se oponen a las de la insulina.
Otras hormonas inftuencian la glucosa sanguínea
Glumsa sanguinea {mmolfL)
Figura 2 1 4 . Variacibn de la actividad fosforilantede glucosa de hexocinasa y glucocinasa con incremento de la concentración sanguinea de glucosa La K, para la glucosa de la hexounasa es de O 05 mmollL y de la glucocinasa es de 10 mrnollL.
insulinoclependiente; QSNID), actuan asi al inhibir los canales de K' sensibles al ATP. De esta manera la concentración de insulina en sangre va en paralelo con la glucosa sanguinea y sil administración conduce con rapidez a hipoglucemia. Otras susrancias que provocan la liberacibn dde insulina incluyen aminohcidos, ticidos grasos libres, cuerpos cetlinicos, glucagbn, secretina y el fármacoto!butarnida. Laadrenalina y la noradrcnalina bloquean la secreci~nde insulina. La insulina tiene un efecto inmediato de incremento en la captación de glucosa en tejidos como el adiposo y el músculo. Esta accirin se debe a una aceleración en el transporte de glucosa através de la membranacelular por reclutamiento de transportadores de glucosa (GLUT4) desde el interior de la cdlula a la membrana plasrnática. Por el contrario, no hay efecto directo de la insulina sobre ta penetración de glucosa a células hephticas, estos hallazgos concuerdan con el hecho de que el metabolismo de glucosa en higado no es16 limitado en velocidad por su permeabilidad a la glucosa. No obstante, la insulina incrementa de manera indirecta la captacion hepática a largo plazo de glucosa como resultado de sus acciones sobre la sintesic de las enzirnas que controlan la glucólisis, la gtucogénesis y la gluconeog~nesis.La insulina tiene un efecto inmediato al activar la glucógeno sintasa (capítulo 20).
El glucagón se opone a las acciones de la insufina El glucagón es la hormona producida por las células A de los islotes de Langerhans del pancreas. La hipoglucemia estimula su secrecion. Cuando alcanza al higado (por la vena porta), causa glucogenolisis por activacion de la fosforilasa. La mayor parte del g l u q ó n
La hip6fisis anterior secreta hormonas que tienden a elevar la glucosa san~uineay, por tanto. antagonizan la acción de insulina. Estas son hormonadel crecimiento. ACTH (corticotropina) y qui& otros principios "diabetogenos". La hipoglucemia estimula la secrecidn de hormona del crecimiento. Esta hormona reduce la captacion de glucosa en ciertos tejidos, por ejemplo. muscular. Es probable que parte de este efecto no sea directo, ya que moviliza acidoc &rasos libres del tejido adiposo que por si mismos inhihen la uti li7ación de la glucosa. La administración crhnica de hormona del crecimiento conduce a diabetes. Al causar hiperglucemia estimula la secrecihn de insulina y origina, por ultimo, agotamiento de las células B. Los glucocorticoides (1 1-oxiestcroidcs) se secretan en la corteza suprarrenal y lienen importancia en el metabolismo de carbohidratos. La administración de estos esteroides Encrementa la gluconeogénesis. Esto es consecuencia del catabolismo proteínico tisular excesivo, del incremento en la absorcion hepática de arninoacidos y del aumento de la actividad de aminotransferasas y otras enzimas que inservienen en la gluconeogénesis hepática. Además, los glucocorticoides inhiben la utilizaci6n de glucoca en los tejidos extraheptiticos. En todas estas actividades, los glucocorticoides actúan como antagonistas de la insulina. Idaad rerralina, secretada por la mddula suprarrenal como~sultndode estímulos intensos (temor, excitaciún, hemorragia, hipoxia, hipoglucemia, etcdtera), origina glucogenolisis hepática y muscular debido a activación de la fosforilasa. En el músculo, por ausencia de accihn de la glucosa-6-focfatasa, sobreviene glucogenolisis con formacibn de lactato, en tanto que en el hígado, la glucosa es el producto principal con elevacidn concomitante de la glucemia. La hormona tiroidea tambitn d c b r á considerase aquí por su efecto modificador de la glucosa sanguínea. Se tienen datos experimentales de que la tiroxina tiene accibn diabetógena y que la tiroidectomia inhibe el desarrollo de diabetes. También se observa que en animales tirotbxicos no existe glucbgeno hepático. En el ser humano, la glitcosa sanguinea en ayunas esth elevada en pacientes hipertiroideos y es baja en hipotiroideos. Sin embargo, al parecer las personas hipertiroideas utili7an la glucosa a una velocidad nomal o
;Iiiconeogkne.~isy control de la glucossa sanguinea 8 243
mayor, en tanto 10shipotiroideos muestran disminucidn en su capacidad para utilizar glucosa. Además. estos iiltfmos son mucho menos sensibles a la insulina que las personas normales o hipertiroideas.
ASPECTOS CL~NICOSADICIONALES Cuando el umbral renal para glucosa se excede se presenta glucosuria Cuando la glucosa sanguínea se eleva a valores relativamente altos, e! riñon también ejerce un efecto regulador. La glucosa se filtra de manera continua en los glomemlos pero, de ordinario, retorna en su totalidad a la sangre por el sistema de resorción de los tubulos renales. La resorción de glucosa contra su gradiente de concentración se enlaza con el suministro de ATP en las celulas tubulares. La capacidad del sistema tubular para resorber glucosa se limita a una velocidad de alrededor de 350 mg/minuto. Cuando la concentracion sanguínea de glucosa aumenta, el filtrado glomerular puede contener mis glucosa de la que logra resorber; el exceso pasa a la orina para generar glucosuria. En personas nomales, se produce glucosuria cuando la concentración de glucosa en sangre venosa excede de 9.5 a 10.0 mmol/L. Esto se conoce como umbral renal para la glucosa. En anirnaIes de laboratorio puede producirse glucosuria con florhicina, que inhibe al sistema de resorci6n de la glucosa en el túbulo. Esto se conoce como glucosuria renal. La glucosuria de origen renal puede deberse a defeoos renales hereditarios o es posible adquirirla por procesos patolbgicos. Con frecuencia, la presencia de glucosuria es indicador de diabetes sacarina.
La hipoglucemia se puede presentar durante el embarazo y en el neonate Durante el embarazo aumenta el consumo de glucosa por el feto y existe riesgo de hipoglucemia materna y posiblemente fetal, en particular si hay un intervalo largo entre las comidas o durante 3a noche. Aderniis, los niños prematuros o de bajo peso al nacer son mas susceptibles a la hipoglucemia toda vez que tienen escaso te-jidoadiposo para generar combustibles alternativos como son los ácidos gasos libres o los cuerpos cetónicos durante la tmnsicih del estado de dependencia fetal al de la vida independiente. Las enzimas dc la gluconeogénesis pueden no estar compl~tamentefuncionales en tal momento y el proceso depende del suministro de Acidoc grasos libres para la energía. El glicerol, que podría liberarse a partir del tejido adiposo. se encuentra menos disponible para glucaneoginesis.
La capacidad del cuerpo para utilizar glucosa puede investigarse por medición de su tolerancia a la glucosa La tolerancia a la glucosa se indica por la naturaleza de la curva de glucosa en sangre después dc la administraci6n de una dosis de prueba de este azúcar (figura 2 1 4 ) . La diabetes sacarina (tipo 1, o diabetes sa-
La deficiencia de fructcisa-1,6-bisfosfatasa causa lactacidosis e hipoglucemia El bloqueo de la glucogenog&nesispor deficiencia de esta enzima impide que el lactato y otras sustancias glucogenicas se transformen a glucosa en el hígado. El trastorno puede controlarse con dietas ricas en carbohidratos que contengan cantidad escasa de fnictosa así como sacarosa y evitando el ayuno.
El deterioro de la oxidación de ácidos grasos produce hipoglucemia Varios trastornos en los que la oxidacidn de los Bcidos grasos es deficiente se caracterizan por hipogliicemia. Esto se debe a la dependencia de la gluconeogénesis de una oxidacihn activa de estos ácidos (véase antes). Estos trastornos se describen en el capitulo 24.
Tiempo (hora)
Figura 2 1 4 . Prueba d e tolerancia a la glucosa. Curvas de la glucosa sanguínea de una persona nomal y de un dtabbtico después de administracibn oral de 50 g de glucosa Nbtece la elevacdn inicial de la concentracidn en el diabetico El criterio de normalidad es que la curva regrese a su valor inicial en dos horas.
carina insulinodependiente, DSID) se caracteriza por disminución de la tolerancia a la glucosa debida a secreción insuficiente de insulina en respuesta a una carga de glucosa, Esto se manifiesta por concentraciones altas de glucosa sanguínea (hiperglucemia) y glucosuria y puede acompañarse con cambios en el metabolisino de lipidos. La tolerancia a la glucosa declina no sólo cn diabetes tipo 1 sino tambien en estados donde el higado se Icsiona; en algunas infecciones; en diabetes sac'uina tipo 11 (diabetes sacarina no insulinodependiente, DSNID), que se acompaiia con obesidad y valores elevados de ácidos gasos plasmaticos; bajo la influencia de algunos fámacos y en ocasiones en aterosclerosis. TambiCn, cabe esperar que ocurra en preseiicia de hiperactividad de la hiphfisis o la corteza suprarrenal, debido al antagonismo de las hormonas de esta glándulas endocrinas a la acción de la insulina. La insulina incrementa la tolerancia a glucosa. La inyección de insulina reduce el contenido de glucosa en sangre e incrementa su utilización y su almacenaje en hígado y musci~locomo glucógeno. Un exceso de insulina puede causar hipoglucernia grave, quc prosigue a convulsiones e inclusive muertc a menos que se administre glucosa con prontitud. En insuficiencia hipofisaria o suprarrenal se observa un incremento de tolerancia a la glucoca, atribuible a una reduccidn en el antagonismo normal a insulinapor parte de 1% hormonas que estas glindulas sccretan de manera normal.
RESUMEN 1) [,a gluconeogénesis es el mecanismo que convierte compuestos no carbohidratos a glucosa o glucdgeno. Suministra glucosa al cuerpo cuando no dispone de carbohidratos dietéticos. Los sustratos importantes son aminohcidos glucogénicos, lactato, glicerol y propionato.
2) La vía de gluconeogenesis,que tiene lugar en el hígado y riñón, utiliza las reacciones de la glucólisis que son reversibles, mas cuatro reacciones adicionales que evitan las reacciones irreversibles de no equilibrio. Las enzimas que catalizan las reacciones adicionales son: piruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, fructuosa- l,6-bisfosfatasa y glucosati-forfatasa. 3) El lactato forma piruvato, que entra a la mitocondria por carboxilación a oxalacctata, antes de su conversión a fosfoenolpiruvato seguida por biosíntesis de glucosa en el citosol. 4) Dado que gluc6lisis y gluconeogenesis comparten la misma vía pero operan en direcciones opuestas, sus actividades deben regiilme de rnariera recíproca, Esto sc logra por medio de tres mecanismos principales: 1 ) induccilin o represión de la síntesis enzimática. 2) modificaci6n mvalentc por rosforilacibn reversible y 3) efectos aloctéricor. 5) La cilula hcpatica, qiie es permeable a glucosa, constituye el medio principal de regulación de la concentración sanguínea de glucosa debido a que contiene la glucocinasa dc Km alta que se adapta especificarnente a la disposición dc la glucosa ingerida. La insulina, que se secreta en respuesta directa a hiperglucemia, colabora con el hígado para el almacenaje de glucosa corno glucógeno y facilita la captacihn de glucosa en tejidos extrahepáticos. Por el contrario, el glucagbn se secreta en respuesta a hipoglucemia y activa la fosforilasa en el hígado, que desencadena glucogenólisis y liberacibn dc glucosa a la sangre. 6) Las enzirnas defectuosas de la vía de gluconeoginesis conducen a hipoglucemia y lactacidosis. El bloqueo de la oxidación de ácidos grasos es causa adicional del deterioro de la gluconeogenesis y de hipoglucernia. 7 ) Una deficiencia en la secreción de insulina conduce a diabetes sacarina tipo 1..
REFERENCIAS Boyle PJ, Shar SD, Cryer FE: Iiisulin. glucagon, and catccholamines in preventiun orhypoglycernia during fistinp. Arn J Physiol l9P9.25h:Eh51 Ruchalter SE, Crain MR, Kreisberg R: Reculation of lactate metabnlism in vivo. Diabetes Mctab Rcv 1989.5:379. Rurant CF et al.: Mammnlian gliicose transportcrs: Striictiire aiid rnolecular regulation. Recent Pro& Horm Rec 1991:47:339. Krebs HA: Gluctineogcnesiq. I'rnc R Soc London (Biol) 1964; 139.545. Lenzen S: Hexose recopnition mechanisms in pancrcatic R-cells. llliochem Soc Tran5 1990:18: 105.
Newsholme EA, Chaliss RAJ, Crabtree R: Substraie cyclcs: Thcir role in improving sensitivity in metabolic control. Trcnds Biochem Sci 1 984,9 277 Newshotme EA, Start C: &~u¡ation fn :Metnholism, Wilcy. 1973. Pilkis SJ, El-Maghrnbi MR, Claus TH: I-EormonaI regulatirin of hepatic gluconeogenesis and glycolysis. Annu Rcv Biochem 198857.755. Watford M: What is the rnetabolic Tait of dievaty glucosc? Trcnds Biochem Scl 1988;13329. Yki-Jarvinen H: Action of insulin cin glucuse rnetabolirm in \ ivo Balllieres Clin Lndocrinol Meiah 1993.7:903.
Vía de la pentosa fosfato y otras vías eel rnetaboAismo de hexosas Pefer A. Mayes, PhD, DSc
El ciclo d t la pentosa fosfato no genera A V , pero tiene dos funciones importantes: 1) La generacibn de NADPFI para la síntesis reductivas como la biosintesis de ácidos grasos y esteroides y 2) la fortnaci6n (provisirin) de ribosa para la biosintesis de nucle6tidos y de acidos nucleicos. La glucosa. fnictosa y galactosa son por su cantidad las hexosas más importantes que se absorben por las vías gastrointestinales. Derivan respectivamente del n l m i d ~ n ,sacarosa y lactosa dieteticos. Se han desarrollado vías especializadas en el cuerpo, en especial el hígado, para convertir fmctosa y galactosa a glucosa.
Las principales rutas metabblicac para la utilización de la glucosa son la glucólisis y la via de la pentosa fosfato. Las deficiencias de ciertas enzimas de la vía de pentosa fosfato son la causa principal de hemólisis, que conduce a un tipo de anemia hemolítica. La principal enzima afectada es la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Cerca de 100 millones de personas en el mundo pueden tener valores bajos de esta enzima, determinados gedticamente. Las principales vías metabhlicas para la utilización de glucosa son Ia gluc6lisis y el ciclo de la pentosa fosfa~o.De mayor significado, pero de importancia cuantitativa menor para la excreci6n de metabolitos y compuestos quim icos extraaos (xenobi 6ticos) como glucurbnidos, es la elaboracibn de acido glucurbnico por la vía del acido urtínico a partir de glucosa. Una
deficiencia en esta vía conduce a un estado conocido como pentosuria esencia1. La ausencia total de iina enzima particular de la via en todos los primatec explica el hecho de que en la alimentaci~nhumana se requiere hcido ascbrbica (vitamina C), no asi en la mayor parte de otros mamíferos. Deficiencias en enzimas del metabolismo de fructosa y galactosa causan enfermedades metabólicas como fructosuria esencial y gal~ctosemias.La fnictosa se usa para alimentación parenteral, pero en concentracibn elevada puede causar deplccibn de nucleótidos de adenina en el higado y necrosis hepática.
LA V ~ ADE LA PENTOSA FOSFATO GENERA NADPH Y RIBOSA FOSFATO (Figura 22-1) La vía de la pentosa fosfato (derivado de la hexosa monofosfato) es un camino alterno para la oxidacibn de la glucosa. Es un proceso multiciclico en el ciial tres mo!éculas de glucosa-6-fosfato dan origen a tres moléculas de COzy a tres residuos de cinco carbonos. Estos últimos se ordenan para regenerar dos moléculas de glucosa-6-fosfato y una del intermedio glucolítico glicemldehido 3-focfato. Dado que dos moldculas del gliceraldehido 3-fosfato regeneran a la glucosa- 6-fosfato de la vía puede efectuar la oxidacion completa de la glucosa.
Gliceraldehido 3-fosfato + GNADPH + 6H'
246
(Cupitulo 22)
Bioyuimicu dc Hurper
6-Fosfato de glucosa
6-Fosfato de glucosa
NADP*+ H20 DESHIDROGENASA
NADPH +
NADP'+ HIO
NADP'+ H10
NADPH + Hf
Ht
6-FOSf0-
o-F0SfOgluconato
gluconato
Cb
6-Fosfato de glucosa
P
* ;_
6~
NADPH + Hr
NADPH t H'
-
Ribulosa 5-fosfato
Xilulosa 5-fosfato
NADPH + H*
caz
Ribulosa 5-fosfalo
- - Ribulosa 5-fosfato
Ribosa 5-fosfato
- --
Xilulosa 5-fosfalo
Slniesls de nuckalidos, ANA, DNA Gliceraldehido 3-fosfato
Cedoheptulosa 7-Iosfato
TRANSACDOMSA
FructOSa 6-fosíato
1
Eritrosa 4-fosfato
C b '*,
6-Fosfato de glucosa
Gliceraldehído 3-fosfato
112 Fructosa 6-fosfato
4 112 Fructosa 6-fosfato
C6
Glucosa 6-losfato
~Glucosa-6-fosfato
C*
c,
'
'11 6-Fosfato de glucosa
c,
Figura 22-7. Diagrama de flujo de la via de la pentosa fosfato y sus conexiones con la vía de la gluc6lisis. Como se indica, la via completa consiste en tras ciclos intermneciados donde la glucosa-6-fosfato es tanto sustrato como producto final Las reacciones arriba de la línea punteada son irreversibles, en tanta que las inferiores con reversibles.
LAS REACCIONES EN LA V ~ A PENTOSA FOSFATO SE DESARROLLA EN EL CITOSOL
Las enzirnas de la via de la pentosa fosfato como en la gluciilisis se encuentran en el citosol. Como en ella, la oxidación se logra por deshidrogenacibn; pero en el caso de la vía pentosa fosfato. se usa NADP' y no NAD' como aceptor de hidrógeno. Idasecuencia de reacciones de la vía puede dividirse en dos fases: una fase irreversible oxidativa y una fase reversible no oxidativa. En la primera, la glucow6-fosfaío experimenta deshidrogenación y descarboxilación para dar una pentosa, rihulosa-S-fosfato. En la segunda fase, la ribulosa-5-fosfato se convierte nuevamente a glucosa-6-fosfato por una serie de reacciones en las que intervienen principalmente dos enzimas: la transcetolasa y la transaldolasa (figura 72-11.
La fase oxidativa genera UADPH (figuras 22-1 y 22-2) La deshidrogenacibn de la glucosa-6-fosfato a ó-fosfogluconato se efectúa por la via de la formación de 6-fosfogluconolactona, reacción catalizada por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, una enzima dependiente del NADP. La hidr~lisisde la 6-fosfogluconolactona se logra por la accibn de la enzima gluconolactona hidrolasa. Un segundo paso oxidativo es catalizado por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, la cual tambikn requiere NADP' como aceptor de hidrbgeno. Sigue la descarboxilación con la formación de la cetopentosa ribulosa-5-fosfato. La reacción probablemente se efectúa en dos pasos a través del intermedio 3-ceto-6-fosfogluconato.
La fase no oxidativa genera precursores de riboca La ribulosa 5-fasfato sirve ahora como sustrato para dos enzimas diferentes. La ribiilosa-Sfosfato 3-epimerasa altera la configuraci6n alrededor del carbono 3 , formando el epimero xilulosa-5-fosfato. que es otra cetopentosa. La ribosa 5-iosfato cetoisomerasa convierte el 5-fosfato de ribulosa a la aldopentoca correspondiente, esto es, el 5-fosfato de ribosa. mismo que es el precursor de los residuos d e ribosa que se requieren en la sintesis de nucleótido y ácido nucleico. La transcetotasa transfiere la unidad de dos carbonos, que contiene los carbonos 1 y 2 de una cetosa, al carbono aldehidico de una aldosa. Por tanto, efecnía la conversidn de una cetosa en una aldosa con dos carbonos menos y simultáneamente convierte una aldosa en una cetoca con dos carbonos más. La reacción requiere una vitamina B. tiamina, como la coenzima difosfato de tiarnina, además de iones Mf. El fragmento de dos carbonos transferido es probablemente el glucolaldehido enlazado al difosfato de
tiarnina, es decir, el "glucolaldehido activo". La transcetolasa catali7a la transferencia de la unidad de dos carbonos de la xilulosa-5-fosfato a la ribosa-5-focfato, aroduciendo la cetosa de siete carbonos sedoheatulosa5-fosfato y la aldoca gliceraldehído 3-fosfatg. Estos dos productos entran luego en otra reacción conocida como transaldolación. La transaldnlasa permite la transferencia de un grupo de tres carbonos, "la dihidroxiacetona activa" (carbonos I al 3) de la cetosa sedoheptulosa-7-fosfato a la aldosa gliceraldehldo 3fosfato para formar la cetosa fnictosa-6-fosfato y la aldosa de ciiatrci carbonos eritrosa-4-tbsfato. Una reacción posterior se efecíwa implicando otra vez a la transcetolasa, en la cual la xilulosa-5-fosfato sirve como donador del "glucolaldehido activo". En este caso, la eritrosa-4-fosfato, formada antes, actua coino aceptor y los productos de Ia reacción son fruct~sa-6-&fato y gliceraldehído-3-fosfato. Con el fin de oxidar a la glucosa completamente hasta CO? por la via de la p.entosa fosfato, es necesario que las enzimas esten presentes en el tejido para convertir el glicemldehido-3-fosfato en glucosa-6-fosfato. Esto implica que trabajan en sentido inverso las entimas de la vía d e glucólisis, ademas de la enzima gluconeogenicq fructosa-1 ,&bisfosfatasa. En ausencia de esta enzima, el 3-fosfato de gliceraldehido sigue la vía normal de la glucólisis a pimvata.
Las dos vías principales para el catabolisrno de glucosa tienen poco en común Aunque algunos metabolitosson comunes, por ejemplo, glucosa 6-fosfato, la ria de pentosa fosfatos es notablemente diferente de la glucolisis. En las primeras reacciones, que utilizan NADP en lugar de NAD, hay oxidacibn y COZes un producto caracterlstico, lo que no ocurre en toda la glucblisis. En la vía de pentosa fosfato no se genera ATP, en cambio esa es una funcibn principal de glucólisis. Los fosfatos de ribosa son el principal producto de la vía de la pentosa fosfato, pero no de la glucólisis.
En los tejidos especializados para síntesis reductivas se generan equivalentes reductores La valoracibn de la actividad de la vía de la pentosa fosfato en varios tejidos indica su importancia metab6lica. Es activa en hígado, tejido adiposo, corteza suprarrenal, tiroides, eritrocitos, testículos y glandulas mamarias en lactancia. No lo es en las glhndulas mamariaq si no hay lactancia y su actividad es baja en el m ~ s c u l oesquelktico. Todos los tejidos que tienen actividad de la vía utilizan NADPH en síntesis reductoras, por ejemplo, la síntesis de hcidos grasos, esteroides, aminohcidos por la ruta de la glutamato deshidrogenasa o glutatión reducido en los eritrocitos.
Bioauimica de Harner
248
HO
- C.-
H
NADPt
(Canírulo 221 NADPH + H '
HO-C-H .
i)
~ - i - o H
1
c l H9 0
I H-C
rdg2+ or cap' p
- OH
I HO-C-H
'\
79 -
HIt-OH DESHIDROGENASA
H- C
-
~ g ?:n2: or
100I
H-C-OH
I
HO-C-H I H-C-oH
I
HIDROLASA
H-C-OH
~H?-O-@ 6-Fosfogluconato
1
NADP'
[ !r:H ]m -
NADPt+ H'
CH,OH l CI = O
H-C-OH
'd-C-OH
I H-6-OH I CH,-O-@
H-C-OH
CH,-O-@ Forma enediol
3-Ceto-6-fost~luwnato
Ribulosa 5-fosfato
3-EPIMERASA
.................
'fH20H
'GH,DH 1 'G
H-C-OH E H-C-OH
H3C-OH I
*cH,-O-@
1
H-C-OH I CH,-O-@
Xriuiosa 5-tosfato
Seudoheptulasa 7-fosfato
Rtbosa 5-fosfato
ATL4
Tiamina-
AMP
M
~
@, ~
...............
H"C=O l H'G-OH 1
+
m
FH,
-O
I
H-C=O
-@
H-C-OH
I I
PRPP
H-C-OH I CH,-O-@
ZS
1 -
I
/
- OH
H -*c - OH
!
*GH2 - 0 -@
Fructosa 6-fosfato
HO-c-H
*c=o 1
HO
H -"
-
-
'CH,OH l
I
; *c=o I t IL . H.. O.. -. C.- H
TRANSALDOMSA
O
TH,M ,
I
*m,-O-B Gliceraldehido 3-fosfato
H - GI I
;
I t I8 H. O - C -. H +... .......I'
I H03C-H I
I H-C-OH
i
*C=O
j
=O
-G -H
~iamrna-@, ~ g ~
1
H-G-OH
Xilulosa 5-fusfato
'
H-C=O I H-C-OH
Gliceraldehido 3-fosfato
Figura 22-2. Via de la pentosa fesfato. (@,
I H-C-OH
I
H-C-OH
I CH,-O-@
Fructosa 6-fosfatu
PO^^-; PRPP, 5-focforribosi~-l-~irofocfato.)
Via de /u uentosu fosfato
Es probable que la presencia de lipogénesis activa o de un sistema que utiliza NADPH estimule una degradación activa de la glucosa por la vía de la pentosa rosfato. De este modo, se obtiene NADP' que normalmente es escaso debido a la naturaleza irreversible de las primeras reacciones en la vía. Tantbién puede inducirse la síntesis dc enzimas glucoca-6-fosfato deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa por la insulina durante circunstancias relacionadas con el "estado nutricional" (cuadro 2 1-1).
En casi todos los tejidos es posible la síntesis de ribosa La vía de la pentosa fosfato proporciona ribosa para la sintesis de nucleótidos y ácidos niicleicos (figura 22-2). La fuente es el intermedio ribosa-5-fosfato que reacciona para formar PRPP, utilizado en la biosintesis de nucleótidos (capitulo 36). El te-jidomuscular contiene cantidades muy pequeiías de glucosa-6-fosfato deshidrogenaa y 6-fosfogluconaro deshidrogenasa. No o'bstante,el musculo esquelético como miichos otros tejidos, es capaz de sintetizar ribosa 5-fosfato para la síntesis de nucleótidos. Es probable que esto se lleve a cabo por inversibn de la fase no oxidatíva de la vía pcntosa fosfato utilizando la fructosa-6-fosfato. Por tanto. no es necesario tener una via de pcntosa fosfato funcionando completamente para que un tejido cintetice ribosa fosfatos. La ribosa no ES un constituyente sanguíneo significativo de la circulacihn general. Por tanto, los tejidos deben satisfacer su propio requerimiento de este precursor importante de nucleótidos.
LA VIADE PENTOSA FOSFATO COLABORA CON G L U T A T I ~ N PEROXIDASA EN LA PROTECCIÓN DE LOS ERITROCITOS CONTRA HEM~LISIS La via de la pentosa fosfato en el eritrocito proporciona NADPH para la reducci6n del glutatitin oxidado a glutatión reducido catarizada por la glutation rcductasa,
y orrus vías dcl
mefaboltsmo de hexosns 218
una enzima flavoproteinica que contiene FAD. A su vez el glutariiin reducido remueve M:O2 del eritrocito en una reacción catalizadapor laglutation peroxidasa, una enzima que contiene el oligoelemento, seleniri (figura 22-3 j. Esta reaccihn es importante, ya quc la aciimulación de HzOz puede reducir la duración de la vida del eritrocito al incrementar la velocidad de oxidación de la hemoglobina a metahernoglobina.
EL GLUCURONATO, UN PRECURSOR DE PROTEOGLUCANOS Y DE GLUCURONIDOS CONJUGADOS, ES UN PRODUCTO DE LA VIA DEL ÁCIDO URONICO Aparte de las vias principales del metabolismo de la gliicosa-6-fosfato que se han descrito, existe una vía para la conversicin de glucosa en ácido glucurónico,acido ascórhico y pentosas, conocida come la vía del ácido uránico. Es tambibn una ruta oxidativa alterna para la glucosa, pero al igual que la via pentosa fosfato, no conduce a la generacibn de ATP. En la vía del acido uronico, el acido glucuronico se forma ñ partir de la glucosa por las reacciones que se muestran en la figura 2 2 4 . La glucosa-6-fosfato se convierte en glucosa-lfosfato, la cual reacciona entonces con el hifosfato de uridina ( U n ) formando el nuclebtido activo, difosfato de uridina y glucosa (UDPGlc}. Esta ultima reacción se cataliza por la enzima UDPGlc pirnfosforilasa. Todos estos pasos hasta aqui son los mismos señalados anteriormente en la vía de Ia glucogénesis hepática (capitulo 20). El UDPGlc se oxida en el carbono 6 por una operaci~nen dos pasos para convertirlo en acido glucurbnico. El producto de la oxidacihn, catatizada por una enzima dependiente del NAD, la UDPGlc deshidmgenasa, es por tanto UDP-glucuronato. El UDP-glucuronato es la forma "activa" del glucuronato para las reacciones que implican la incorporacibn de Bcido glucurónico a los proteoglucanor o para las reacciones en las cuales el glucumnato se conjuga con siistratos como las hormonas esteroides, ciertos medicamentos o la bilirrubina (figura 34-1 3).
FOSFATO DE -PENTOSA
PEROXIDASA
NADP*
2G-SH
Figura 22-3. Funcrbn de la via de la pentosa fosfato en la reaccibn catalizada por glutatibn peroxidasa de los eritrocitos. (G-S-S-G, glutatión oxidado; G-SH, glutatibn, Se, cofactor de celenro )
Bioquirnica de Harper
250
{Capitrrln 22)
H:c-o-QMUTPGA
1
H-C-OH
H-C-OH
-
1
o- - -
1
H-C-OW UTP
u
PP,
CH,OH
1
-
Gluwsa 1 -fosfato
/
2NADf 2NADH
CH.OH
+
Undindifosfatoglucosa (UDPGlc)
2H*
/
{-O O
Uridindfosfato glucuronato
GLUCUR~NIDOS H,O Pfokoglucanas UDP
n 7-0
NADH + H' NAO+
$ - O
~
~
q
-
0
~
~ - 5O 7 HO-5 - W
NADP' NAQPH + He
c=o H - 5 -0H HO-$ -H
m
'CH20H L-Xilosa
H-7-OH
H-C-OH HO-{ - H
3-Ceto-~~gulonatn
NADPH + Ht
PENTOSURIA
II
O
~Glucuronato
Oxalato
4 Glucolato
NAOP' BLOQUEO EN LA
C-O
'CH,OH L-Gulonato
Glucolaldehido
Gulonolactona BLOQUEO EN PRMATES Y COBAYOS O'
f
Y
BLOQUEO EN EL SER HUMANO
2-C~~PL-gulonolactona
wxiiosa 1-fosiato
-
?H,OH
t 'FHzDH
i
O 12Hl
HO-C-H
Xrlitol
HO-C-H
&CH,OH aXiioca 5-fosfato
L-Aswrbato
" CH,OH L-Deshtdroascorbato:
Via pentosa fosfato
Figum 22-4. Via del Bcido urbnico. (Indica el destino del carbono 1 de la glucosa, @
En una reacción dependiente del NADPH, el glucuronato se reduce a L-gulonato. Este último compuesto es el precursor directo del ascorbato en aquellos animales que son capaces de sintetizar esta vitamina. En el ser humano y otros primates, así come en los cobayoc, el hcido ascórbico no puede sintetizarse debido a la ausencia de la enzima ~gulonolactonaoxidasa. El gulonato se oxida a 3-ceto-L-gulonato que es entonces descarboxilado para formar la pentosa t-xilulosa. La L-xilulosa se convierte en el D-isomero mediante una reduccidn dependiente del NADPH que la convierte en xilitol, el cual entonces se oxida en una reaccion dependiente del NAD pasando a D-xilulosa; este último compuesto, después de convertirse en ~xilulosa-5-fosfatose metaboliza posteriormente en la vía pentosa fosfato.
PO^^-.)
LA INGESTIÓN DE CANTIDADES MASIVAS DE FRUCTOSA TIENE CONSECUENC~ASMETABOLICAS PROFUNDAS Las dietas abundantes en sacarosa o en jarabes de fnictosa alta (HFS), que se utilizan en la elaboración de alimentos y bebidas, conducen al ingreso en la vena porta de grandes cantidades de fructosa (y glucosa). La fmctosa se glucoliza por el hígado con mayor rapidez que la glucosa. Esto se debe al hecho de que no requiere el paso en e1 metabolismo de glucosa catalizado por fosfofnictocinasa, que es donde se ejerce el control sobre la velocidad del catabolismo de glucosa (figura 22-5). Esto ocasiona que la fmctosa
Vio de la pen~osufo.rfato y
orrm vías de¡ metabolismo
de hexo.sas
25 J
Dieta
t
[FRUGTUOCIMASA\ BLOQUEO EN LA FRUCTOSURlA ESENCIAL
AFP
FRUCTUOSA 1-P
Fructosa 1.6 bisfosfato
BLOQUEO EN INTOLERANCIA HEREDITARIA A LA FRUCTOSA
OIH1DROXIACETONA FOSFATO
TRIQSA 1SOMEWSA
ATP
GLICERALDEH~DO3-FOSFATO 4
t
DGLICERALDEH~DO
pEEiÑzq
Figura 22-5, Metabolismo de la fructoca La aldolasa A se encuentra en todos los tejidos a excepción del higado, donde sblo existe aldolasa B. (No se encuentra en el higado )
inunde Ias vías en el hígado causando incremento de la síntesis de hcidos grasos, de Ia esterificacih de &os y de la secreci6n de VLDL, que pueden elevar lo5 triacilgliceroles siricos y al fina! eleva las concentraciones de colesterol de LDL (figura 27-7). La cantidad adicional de glucosa captada por el torrente sanguíneo estimula Ia secrecibn de mhs insulina, que potencia todos estos efectos. Una cinasa especifica, la fructocinasa, se encuentra en el higado y efectúa la transferencia del fosfato desde el ATP a la hctosa, formando h c t o s a 1-fosfato. Tarnbidn se ha demostrado en el riilon e intestino. Esta enzima no fosforila a la glucosa y, a
diferencia de la glucocinasa, su actividad no se afecta por el ayuw o por la insulina, lo que puede explicar por qué la fructosa desaparece a una velocidad normal de la sangre de los pacienres diabdticoc. La Km de la enzima para la h c t o s a en el higado es muy baja, lo cual indica una gran afinidad de la enzima por su sustrato. Es probable que ésta sea la ruta principal para la fosforilacion de la fi-uctosa. La h c t o s a - 1 -fosfato se desdobla en D-glicesaldehida y fosfato de dihidroxiacetona por la aldolasa B, enzima que se encuentra en el higado. La enzima tambikn ataca a la fnictosa 1,6 bisfosfato. El D-gliceraldehido puede entrar en la serie de reacciones de la
252
Bioauim ica de H a r ~ e r
gluclilisis por medio de otra enzima presente en el hígado, la triocinasa, la cual cataliza su fosforilación a gliceraldehido 3-fosfato. Los dos triosafosfatos, el fosfato de dihidroxiacetona y el gliceraldehido 3-fosfato, pueden degradar por la vía de la glucólisis o comhinarsc por la influencia de la aldosa y convertirse en glucosa. Lo último es el destino de mucha de In fructosa metabolizada en el hígado. La hexocinasa cataliza la fosforilacion de la mayon'a de los anícares hexosas, inclusive la fnictosa. Sin embargo, en presencia de glucosa se inhibe en gran medida la fosforilación de la fnictosrt. Mhs aún, es probable que por esta vía parte de la fnictosa se pueda metabolizar en tejido adiposo y rnusculo. La fnictosa libre se encuentra en el plasma s ~ m i n ayl una cantidad significativa se secreta hacia la circulación fetal en los ungulados y ballenas donde se acumula en los líquidos amniótico y alantoideo. En todas estas situaciones representa una fuente potencial de energía.
LA GALACTOSA ES NECESARIA PARA LA S~NTESISDE LACTOSA, GLUCOL¡PIDOS, PROTEOGLUCANOS Y GCUCOPROTE~NAS La galactosa proviene de la hidrblisis en el intestino del disacarido lactosa, el anicar de la leche. En el hígado se convierte facilmente en glucosa. La facultad del hígado para llevar a cabo esta conversibn puede usarse como un examen del funcionamiento hepático en la prueba de tolerancia a la galactosa. La vía mediante la cual la galactosa se convierte en glucosa se muestm en la figura 2 2 4 . La galactosa se fosfwila mediante la galactocinasa usando ATP como donador de fosfato. El producto galactosa- 1 -fosfato, reacciona con el difosfato de uridina y glucosa (UDPGlc), para formar cl difosfato de uridina y galactosa (UDPGal) y glucosa- l -fosfato. En este paso, catalizado por una enzima llamada galactosa-1-fosfato uridiltrans-
Galactosa
t GalaCtOSa-l
I 7 UDPGlc?
BLOQUEO EN GAIACTOSEML':
-1osfato
FOSFOGLUCOMCITASA
-
6-FOSFATASA Glucosa-6-fosfato
B
UDPGlc
Glucosa
NAD'
-
Glucosa
UDPGal
Lactosa
6-Fosfato de giuwsa
-
Figura 22-6. Via de convercibn de A:
c 1-Fosfato de glucosa
Glucosa
Galactosa a glucosa en el hígado. B: Glucosa a galaciosa en la glandula mamaria
Yía de da pentosa fusfafo y otras vim del rnerubo/ismo de hexo.rus
ferasa, la galactosa se transporta a una posición en la
UDPGlc, reemplazando a la glucosa. La conversibn de galactosa en glucosa tiene lugar en una reacción del nucleótido que contiene galactosa catalizada por una epimerasa. El producto es UDPGlc. La epimerización probablemente implica una oxidacibn y reducción en el carbono 4, con N AD como coenzima. Finalmente, la glucosa se libera de la UDPGlc bajo la fonria de glucosa- 1-fosfato, probablemente desp~itsde !a incosporación al glucógeno seguida por fosforólisis. Debido a que la reaccihn con epimema es reversible, la glucosa pucde convertirse en galactosa, de modo que la gaiactosa preformada no es esencial en la dieta. La galactosa se necesita en el organismo no sólo para la formacidn de laciosa, sino también como un constituyente de los glucolipidos (cerebrosidos), proteoglucanos y glucoprotcinas. En la sintesis de lactosa en la glándula rnamaria, la glucosa se convierte en UDPGal por las enzima descritas anteriormente. La UDPGal se condensa con la glucosa para dar lactosa catalizada por la factosa sintasa (figura 2 2 4 ) .
La glucosa es precursor de todos los aminoazúcares (hexosaminas) Los aminoazúcares son componentes importantes de las glucoproteinas (capítulo 56), de ciertos glucoesfingolipidos (por ejemplo, gangliósidos) (capítulo 16), y de glucosaminoglucanos (capihllo 57). Los aminoazúcares principales son glucosamina, galactosamina y manosamina (todas éstas son hexosarninas) y el compuesto de nueve carbonos hcido siilico. El acido sihlico más importante que se encuentra en los tejidos humanos es el ácido IV-acetilneurarnínico (NeuAc). En la figura 22-7 se muestra un resumen de las interrelaciones entre los aminoazúcares; las siguientes son sus caracteristicas sobresalientes: 1) la glucosamina es el aminoanicar principal. Se forma como glucosamina 6-fosfato a partir de la fnictosa-6fosfato, utilizando a la glutamina como donador del grupo amino; 2) los aminoazúcares aparecen principalmente en la forma N-acetilada. El donador del radical acetilo es la acetil-COA; 3) la N-acetil manosarnina 6-fosfato se forma por epimerización de la glucosamina 6-fosfato; 4) NeuAc se forma por la condensación de rnanosamina 6-fosfato con fosfoenolpiruvato; 5) la galactosamina se sintetin por epimerización de UD?-A'-acetilglucosamina (WDPClcNAc) a UDPN-acetilgalactosamina (UDPGlcNAc); 6) los azúcares de nucleótidos son las formas en que Tos aminoazúcare5 se utilizan para la biosintesís de las glucoproteinas y de otros compuestos complejos; los anícares de nucl&tidos importantes, que contienen aminoazúcares con UDPGlcNAc, UDPGalNAc y CMP-NeuAc.
233
ASPECTOS CL~NICOS El deterioro de la vía de la pentosa fosfato conduce a hemolisis Una mutación presente en algunas poblaciones cauQ una deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidro,-enasa. con la consecuente perturbación en la formación de NADPH. Esta anormalidad se manifiesta como hemolisis cuando el individuo susceptible se sujeta a oxidantes, como el antipalhdico primacrina, aspirina o sulfonamidas o cuando ingiere habas (Y~ciafuvu -favismo), La glutatión peroxidasa es un antioxidante natural que se encuentm en numerosos tejidos y depende del suministro de NADPW. Ataca a perhxídos organices ademis del MzO?.Junto con la vitamina E, achía como parte de la defensa corporal contra la peroxidaciún lipidica (figura 16-27). Se tienen informes de cierta relación entre la frecuencia de algunos canceres y la presencia de concentraciones sanguineas bajas de selenio y de la actividad de la glutation peroxidasa. La medicí6n sanguínea de la actividad de la transcetolasa refleja el grado de deficiencia de tiamina. El unico trastorno donde su actividad se eleva es en la anemia perniciosa.
La interrupción de la vía del ácido urónico se produce por defectos enximáticos y por algunos fármacos En la pentosuria esencial, enfermedad hereditaria poco común, aparecen en la orina cantidades considerables de L-xilulosa. Este hallazgo puede explicarse por la ausencia cn pacientes pentosíiricos de la enzima necesaria para catalizar la reducción de L-xilulasa a xilitol. La administración parentera! de xilitol puede conducir a oxalosis que consiste en deposito de oxalato de calcio en encéfalo y rifiones. Esto se debe a la conversibn de n-xilulosa a oxalato a travCs de la formación de xilulosa l -fosfato. glucoaldehído y glucolato (figura 2 2 4 ) . Varios medicamentos incrementan de manera importante la velocidad de entrada de glucosa a la vía del ácido urónico. Por qjcrnplo, la administracibn de barbital o de clorobutanol a ratas causa un aumento significativo en la conversión de glucosa a glucuronato, 1.-giiIonato y accorbato. Se sabe que la arninopirina y antipirina aumentan la excreción de 1.-xilulosa en sujetos pentoslirícos.
La carga hepática con fructosa puede potenciar hipertriacilgliceralemia, hipercolesterolemia e hiperuricemla Ya se hizo referencia a los efectos de la fructosa sobre el metabolismo hepático en la promocion de la síntesis de triacilglicerol y secreción de VLDL e hipemiaciIglicerolemia, que puede 1levar a incremen-
254
Bioqtrimicu de Hurper
ATP GLUCOSA
(Capitulo 22)
GLUCOSA 1-FOSFATD ADP
t
GLUCOSA 6-FOSFATC
-
Ciclo del Bcido
citnco
Glucdl~sis FRUGTOSA 6-FOSFATO
PIRWVATO
CO1+H,O
UTP
GLUTAMATO Glucosamina
GLCICOSAMINA* p,
-
Acetil-COA
N-ACETICGLUCOSAM INA
N-ACETIL-
N-ACEflLGLUCOSAMINA
FLUCOSAMINA 6-FOSFATO
GLUCOSAMINOGLUCANOS (COMO HEPARINA)
1 -FOSFATO
b P>
N-ACETILMANOSAMINA
6-FOSFATO
UDP-
N-AC ETILGLUCOSAIAINA
FOSFOENOLPIRUVATO
NAO+
t Aciua N-ACETILNEURAM~NICO
1
-
GLUCOSAMINOGLUCANOS (AC100 HIALURGNICO) GLUCOPROTEINAS
1
-1
UDP N-AC ETILGALACTOSAMINA
9-FOSFATO
inhibitorio
ÁCIDO s r A ~ l c o GANGL16SlDOS GFUCOPROTEINAS
GLUCOSAMINOGLUCANOS (CONDROITINAS) GLUCOPROTE~NAS
Figura 22-7. Resumen de las interrelaciones en el metabolismo de los aminoazúcares ('Análogo al UDPGlc.) Es posible que otros nucleotidos d e purina o pirimidtna estén enlazados de manera similar a azúcares o aminoazúcares. Ejemplos son timidina de difosfalo (TDP)-glucosamina y TDP-N-acetitglucosamina
tos en las concentraciones de colesterol LDL, todo lo cual puede considerarse como potencialmente aterogénico (capitulo 28). Además, la sobrecarga aguda del higado con fructosa, como puede suceder con la infusión intravenosa o ingesta muy grande de ella, da lugar a secuestro de fosfato inorganico en el 1-fosfato de f r u c t o s a y disminuci6n de la síntesis de ATP. En consecuencia, se suprime la inhibicibn por el ATP de la enzima de la degradacibn del nuclebtido de adenina y se promueve la formacibn de hcido urico, produciéndose hipeniricemia, la cual es causa de gota
(capinilo 36). Estos efectos son de particular importancia en personas que tienen predisposici6n a la hipertriacilglicerolemia o hipemricernia.
Los defectos en el metabalismo de fructosa causan patología (figura 2 2 6 ) La carencia de fnictocinasa hepatica causa fructosuria esencial y la ausencia de aldolasa hepitica E, que
:a fos fato y otras vIas del rnetaholi.vmo de hexosas * 2.55 Vía de la pcnro~
degrada a la fmctosa 1-fosfato, conduce a intolerancia hereditaria a la fructosa. Las dietas deficientes en fructosa y sacarosa son benéficas en los dos trastornos. El defecto en la aldolasa €3 no afecta de manera tan nociva la actividad hacia el 1,ó-bisfccfato d e fructosa, así sólo hay ligero deterioro de la gluconeogenesis. Una consecuencia de la intolerancia hereditaria a fructosa y otro padecimiento causado por deficiencia de fructosa-l,dbisfosfatasa es una hipoglucemia inducida por fmctosa a pesar de la presencia de abundante resetva de glucógeno. Al parecer, la acumulaci6n de fructosa l-fosfato y fructosa 1,6-hisfosfato inhibe la actividad de la fosfori lasa hephtica por mecanismos alostéricos.
La catarata diabética se relaciona con la presencia de fructosa y sorbitol en el cristalino Normalmente, el cristalino humano contiene fructosa y sorhitol; la patogenia de la catarata diabética puede incluir un aumento en Ba concentracibn de éstas. La via del sorbitol (poIiol) (no localirada en el higaiio) es responsable de Ia fomacibn de fiuctosa a partir de glucosa (figura 22-5) y su actividad, aumenta confonne la concentración de glucosa aumenta en la diabetes, en aquellos tejidos que no son sensibles a la insulina; es decir, cristalinos, nervios periféricos y glomérulos renales. La aldosa reductasa cataliza la reducción de glucosa a sorbitol por la NADPH, seguida por oxidación de1 sorbitol a fructosa en presenciadeNAD4 y sorbitol rleshidrogenasa (polio1 deshidrogenasa). El sorbitol no se difunde con facilidad a través de las membranas celulares y, por tanto, se acumula para producir daño osmotico. De manera sirnulthnea, las concentraciones de rnioinositol bajan. La acurnulaci6n de sorbitol, disminucion de mioinositol y catarata diabctica pueden evitarse en ratas diabéticas mediante la adrninistraciiin de inhibidores de la aldosa reductasa, y se están oliteniendo resultados promisorios en la practica clínica. La aldosa reductasa se encuentra en la placenta de la oveja y ocasiona la secrecibn de sorbitol a la sangre fetal. La presencia de sorbitol deshidrogenasa en el hígado, incluyendo el fetal, conduce a la conversibn del sorbitol a hctosa. Esta vía es responsable tambidn de la presencia de fructosa en el liquido seminal. Cuando el sorbitol se administra por via intravenosa, se convierte a fructuosa y no a glucosa; por el contrario, si se administra por via oral, gran parte escapa a la absorción en el intestinoy se fermenta por las bacterias del colon a productos como acetato e hidrógeno. Los edulcorantes "exentos de azúcar" que contienen sorbitol pueden causar dolor abdominal (intolerancia al sorbitol).
Las deficiencias enzimáticas en la vía de la galactosa causan galactosemia En las galactosemias existe incapacidad para metabolizar esta hexosa y pueden deberse a deficiencia hereditaria de galactocinasa, uridilo transferasa o 4epimerasa (figura 22-6A), aunque la me-jor conocida es la deficiencia de uridilo transferasa. La galactosa, cuya concentracion sanguinea aumenta, se reduce por la aldosa reductasa en el ojo al polio1 con-espondiente (galactitol), que se acumula generando cataratas. El estado general es m& grave si la galactosemia se debe a deficiencia de uridilo transferasa, dado que hay acumulación de galactosa 1-fosfato y perdida de fosfato inorgánico hepatico. Por ultimo, ocurre insuficiencia hepática y deterioro mental. En la deficiencia de uridiE transferasa, la epimerasa eszá presente en cantidades adecuadas, por lo que la persona galactosémica aun puede formar UDPGal a partir de glucosa. Esto explica por qué es posible que los niiios afectados muestren crecimiento y desarrollo normales a pesar de la dieta exenta de galactosa para controlar los sintomas de la enfermedad. Se han descrito varios defectos gentiticos que causan deficiencia parcial m& que tofal, de la transferasa. Como normalmente la enzima esta presente en exceso, una reduccirin de su actividad de 50% o menos no causa síntomas o signos de enfermedad, por tanto, el defecto se identifica 5610 en homocigotos. Se han encontrado deficiencias eritrocitarias de epimerasa, pero en estos individuos aun existe en hfgado y otros drganos y aI parecer este tercer trastorno es asintomático.
RESUMEN 1) La vía de la pentosa fosfato, cuyas enzimas se encuentran en el citosol, puede realizar la oxidación completa de la glucosa y sus productos principales son NADPH y COL.La via no genera ATP. 2) Esta via tiene una fase oxidativa que es irreversible y genera NADPH y una fase no oxidativa, que es reversible y proporciona precursores de ribosa para la síntesis de nucle6tidos, incluyendo RNA y DNA. La vía completa existe s61o en los tejidos que requieren NADPH para slntesis reductorris; por ejemplo, lipogknesis o esteroidogenesis; en tanto que, la fase no oxidativa se encuentra en todas las dlulac que requieren ribosa. 3) En los eritrocitos, la vía tiene la importante hnci6n de evitar la hem6lisis ya que suministra NADPH para mantener al glutation en el estado reducido. A
su vez, el glutatión sirve como sustrato de la glutatiiin peroxidasa, que es esencial para eliminar a la H202, nociva para la celula. 4) La vía del acido urónico suministra ácido glucurónico necesario para la conjugacibn con numerosas sustancias endógenac y exógenas, que se eliminan en la orina como glucurbnídos. 5) La h c t o s a tiene fácil acceso a las vias metabolicas, esquivando el paso principal de control de la
gliicólisis. cata1izado por fosfofnictocinasa. Por tanto, estimula la síntesis de ácidos grasos y la secrecibn de triacilglicerol hepático. Igual que la galactosa, forma con facilidad glucosa en el higado. 6 ) La galactosa se sintetiza a partir de la glucosa en la glándula mamaria y en otros tejidos donde se requiere para la formacidn de glucolipidos, proteoglucanos y glucoprotetnas. I
REFERENCIAS Couet C, Jan Dehry G: !,actose and cataract in humans: A
Mayes PA: Intcrrncdiary mctabolism o fructose. Am J Crin
review. J Am Coll Nutr 1991:10:79. Cross NCP, Cox TM: H z r e d i t a ~fructose intoler;~ncc.Int J Riochem E990;22:k85 James H M et al.: Models l'nr ihc meiaholic production o f oxalate from xylitol in hiirnans Aust J Exp Biol Med Sci 1982:60: 1 17. Kador PF: The role af aldose reductase in the development of diabctic complications Mcd Rcs Rcv 1988;8.325. Macdonald 1, Vrana A (editors): ;We#abolicbfects nf Uietay I:arbol?ydrates Karger. 1 9Xh.
Nutr 1943,58,h54S. Randle PJ, Steiner DF, Whelan WJ (editors): Carbnhydrare ,I.ietaboiism and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, 1981. Scriver CR et al. (editors): The 81!etnbolic und ,I.loleculur Bulisr~xuflnheriied Diseme, 7th ed. McGraiu-Hill, 1995. V a n den Rerghe G : Inborn crrors of fr~ictosernetabolism Annu Kei Nutr 1994.14:41. W o o d T: TIie Pentose Phosphate Parhwq. Acadernic Press, 1983.
Biosíntesis de ácidos grasos Peter A. Mayes, PhD, DSc
A semejanza de muchos otros procesos degradativos y siniéticos (por ejemplo, glucogenólisis y glucogenesic). la slntesis de los ácidos grasos (lipogénesis) se consideraba como la inversa de la oxidacihn en la mitocondria. Sin embargo, parece claro que un sistema extrarnitocondrial activo es responsable de la cnmpleta síntesis de palmitato a partir de acetil-CoA en el citosol. Otro sistema para la elongacion de la cadena de ácidos gasos también está presente en el reticulo cndoplismico hepático.
IMPORTANCIA BIOMEDICA Existen amplias variaciones entre especies en la dispasicihn de las principales vías lipogknicas en los tejidos y en sustratos principales para síntesis de ácidos grasos. En la rata, una especie que ha proporcionado gran parte de la información acerca de lipogenesis, la vía se efectiia de preferencia en tejido adiposo e hígado, en tanto que en el ser humano el tejido adiposo puede no ser un sitio importante y el higado sólo manifiesta escasa actividad. En 1% aves, la lipogénesis se confina al higado, donde su importancia es pariicular para proporcionar lipidos utiluados en la formación del huevo. En muchos mamíferos, la glucosa es el sustrato primario para IipogtSnesis, pero en los nimiantes esta función la descrnpefia el acetato, que es la molécula combustible principal producida por la dieta. Dado que la via de lipogénesis puede ser de poca importancia en el ser humano no sorprende que se carelca de informes acerca de enfermedades criticas de ella. Sin embargo, las variaciones en su actividad pueden determinar la naturaleza y extensión de la obesidad y una de las lesiones causadas por la diabetes sacarina insulinodependiente o tipo 1 es la inhibicion de la lipogénesis.
LA PRINCIPAL V ~ APARA LA NUEVA S~NTESISDE ÁC~DOS GRASOS (LIPOGÉNESIS) OCURRE EN EL Clf OSOL Este sistema est8 presente en muchos tejidos, que incIuyen el hfgado, rifíbn, enckfalo, pulmbn, glándula mamaria y tejido adiposo. Sus requerimientos de cofactores incluyen el NADPI-I, ATP, biotina y HCOi(como fuente de CO:). La acetil-CoA es e1 sustrato inmediato y el palmitato libre es el producto final.
La producción de malsnil-COA es el paso inicial y de control en la sintesic de ácidos grasos El bicarbonato como fuente de COI resulta necesario en la reacción inicial para la carboxilacion de la acetilCOAa m a l o n i l ~ o Aen presenciade ATP y acetil-CoA carboxilasa. Estaultima requierc de la vitamina biotina (figura 23-1). La enzima contiene un numero variable dc subunidades idénticas, asi como biotina, biotina carboxilasa, proteína portadora de carboxibiotina y transcarboxilasa, y lambien un sitio alosterico regulador. Ec por tanto una proteína multienzimlitica. La reacciiin tiene lugar en dos pasos: 1) la carboxilacibn de la biofina (que utiliza ATP, figura 52-1 3) y 2) la transfercncia del carboxilo a la acetil-CoA para formar malonilXoA.
El complejo 5cido graso sintasa es un polipeptido que contiene siete enrimas activas Al parecer hay dos tipos de hcidos grasos sintasas. En las bacterias, plantas y formas inferiores, las enzimas individuales dcl sistema están separadas y los radicales aciro se encuentran en combinación con una proteina llamada proteina portadora de acilos
CH,
- CO-S
- COA
-
- O O ~-CH,
Acetil-COA
CO-S-
COA
Malonil-CGA
ATP + HCOT + Enz-biotina
Figura 23-1. Biosintesis de la malonil-COA.(Enz, acetil-COAcarboxilasa.)
eficacia y libertad de interferencia por procesos competitivos, y así se logra el efecto de compartimentalización de la actividad en la célula, sin necesidad de erigir barreras de permeabilidad. Otra ventaja del polipkptido multienzimático Único es que la sintesis de todas las enzimas del complejo es coordinada ya que todo está codificado por un solo gen. El complejode la hcidos graws sintasaes un dírnero (figura 23-21, En los animales, cada rnonómero es idkntico al otro, y están formados por una cadena
(ACP). Sin embargo, en las levaduras, los mamíferos y las aves, el sistema sintasa es un comple,jo multienzitnAtico que no puede subdividirse sin la pérdida de actividad y la ACP es parte de este complejo. Tanto la PPA como el complejo rnultientim~ticode las bacterias contienen la vitamina ácido pan totenico en la forma de 4'-fo~fo~anteteina(figura 5 2 4 ) . En este sistema la AC asume la función de la COA. La agregación de todas las enzima5 de una vía particular en una unidad funcional rnultienzimática ofrece gran
I
SH SH I
4'-Fosfopantetelna
\
\
- -- _ \ -
OivisiQn . de la subunidad
-- - - \
- - --
I SH -
-
y
- - --
SH
-
-
I I
Cvs
Figura 23-2. El complejo rnultienzimática de los Bcidos grasos sintasa. El complejo es un dírnero de dos rnonámeros de polipeptidoc idknticos, 1 y 2, cada uno constituido por seis adividades enzirnáticas y la proteina portadora de acitos (ACP) (El Cis-SH, y el Tiol cisteina.) El -SH de la 4'-fosfopanteteina de un rnonbrnero está en proximidad estrecha con el -SH del residuo de cisteina de la cetoacil cintasa de otro monomero, sugiriendo un arreglo "cabeza a cola" de dos monomeros. La secuencia detallada de las enzimas en cada rnonbmero es tentativa (basada en Wakil) Aunque cada mon6mero contiene todas las actividades parcialesde la secuencia de la reaccibn, la actual unidad funcional consiste en una mitad de un monbmero en interaccibn con la mitad complementaria del otro Así, dos cadenas acilo se producen simultáneamente.
polipeptidica notable que contiene las siete enzimns de la sintasa y una ACP con un grupo 4'-fosfopanteteína -SH. En proximidad estrecha esta otro ti01 de un residuo de cisteina adherido a la3
La acetil-CoA iitilizada como piintal forma los átomos de carbono 15 y 16 del palniita~o.La adicion de todas las iinidadec C: subsiguientes es a traves de la formación de rnaloníl
La fuente principal de equivalentes reductores (NADPH) para lipogenesis es la vía de la pentosa fosfato El NADPFI interviene Como coenzima en ambas reducciones. la de los derivados 3
La acetil-CoA es el bloque estructural de los ácidos grasos Se forma a partir de los carbohidratos a traves de la oxidaciiin del pinivato dentro de las rnitocondrias. Sin embargo, la acetil-COA no se difunde con facilidad en el interior del citosol extramitocondrial sitio principal de la sintesis de los ácidos grasos. La actividad de la ATP-citrato liasa extramitocondrial, al igual qiie la de la '-enzima malica", aumenta en condiciones dc buena nutricibn, en correlaci~nestrecha con la actividad del sistema de síntesis de ácidos grasos (cuadro 2 1-1). Se considera en la actualidad que la utilizacícin del pimvato para la IipogCnesis es mediante el citrato. La via involucra la glucrilisis seguida por la descarboxilación oxidativa del piruvato a acetil-CoA dentro de las mitocondrias, seguida por la condensacion con oxafacetato para formar citrato como parte del ciclo del ácido cítrico. A e ~ t osigue la translocación del
Acetil-COA
Malonil'-COA
+
Cntransferidos desde TRANSACILASA
Complefo multienzim8tim de la acldo graso sintasa
o 111
a
P
a
n
-
~
-
~
-
~
~
I
- IC'/~
~
~
-
Enzima Acil (aceti1)-malonila
Enzima 3-cetoacilo (enzima-acetoacetiio)
Enzima N-)-3-hidroxiacilo
-
SH O
II
=Pan-s
-c-
CH=CH-CH,
Enzima acilo 2,3-insaturado
o Despues de 7 ciclos
a trads de los pasos (1!a :$
11
~ P ~ ~ - S - C - C H . - C H ~ - C H ,
(C.)
Enzima acilo Palmttato
Figura 23-3. Biosíntesis de ácidos grasos de cadena larga. Detalles de la forma e n que la adicion de un residuo malonilo hace que la cadena acilo crezca cada vez dos átomos de carbono. (Cis, residuo de cisteina, Pan, 4'-fosfopanteteina.) En la figura 23-2 se muestran los detalles del dimero de la stntasa de los ácidos grasos. y @ representan los rnonbmeros individuales de la sintasa de hados grasoc.
a
Biosínresis de ácidos grasos
Palmilato
+
Acilgltceroles cstes de colesterrlo
u
ATP + COA
AMP
26 1
f
PP,
Estenficactbri
Palmitil-COA
/
\ Alargamiento de la cadena de desaturactbn
'r
1
Acil-COA
Figura 2 3 4 . Destino del palrnitato después de la biosintesis.
Palmitato
Glucosa
f
1
Glucosa 6-fosfato
rato
-
lsocitrato
Figura 23-5. El abastecimiento de aoetil-COA y NADPH para la lipogénecis. (VPF,vla de la pentoca fosfato; T, transportador del tricarboxilato, K, transportador del alfa-celoglutarato, P, transportador de piwvato.)
citrato dentro del compartimiento extrarnitocondria!, donde en presencia de COAy ATP sufre la ft-apentacihn a a c e t i l 4 o A y a oxalacetato, catalizada esta fragment a c i ~ npor la ATP-zitrato liasa. Laacetil-CoA se tiene después disponible para la fomacion de malonilCOA y la síntesis de palmitato (figura 23-5). El oxalacetato puede formar malato mediante la maIato deshidrogenasa enlazada al NADH, seguida por la generacion de NADPH a través de la enzima malica. A su vez, el NADPH se tiene disponible para la lipogknesis. Esta vía es un medio de transferir equivalentes reductores del NADH extramitocondrial al NADP. En forma alterna, el malato puede transportarse al interior de la mitocondria donde puede reformar el oxalacetato. Es de notarse que el transportador de citi2t~ (tricarboxilato) en la membrana mitocondrial requiere malato para intercambio con eE ciwato (figura 14-13). Hay poca ATP-citrato liasa o enzima malica en los rumiantes probablemente debido a que en estas especies el acetato (proveniente del mmen) es la fuente principal de acetil-CoA. Debido a que el acetato surge y es aczivado a a c e t i l 4 o A fuera de las mitocondrias, no hay necesidad alguna de transportar citrato fuera de la mitocondria y forme citrato antes de su incorporacion en los ácidos grasos de cadena larga. La generacion de NADPH via la isocitrato deshidrogenasa extramitocondrial es más importante en estas especies, debido a la deficiencia de enzima málica.
El alargamiento de la cadena de los ácidos grasos tiene lugar en el retículo endoplásmico La vía ("sistema micrnsomat") convierte a los compuestos acil-CoA de los Bcidos grasos a derivados acilo con dos átomos de carbono m6s, mediante la utilización de rnaIonil-CoA como donador de aceti lo y el NADPH como reductor y catalinda por las enzimas del sistema cromosómico de [a clongasa de los 4cidos grasos (figura 2 3 4 ) . Los grupos acilo que pueden actuar como moléculas cebadoras incluyen las series saturadas desde el CIOhacia adelante, al igual que hcidos grasos insaturados. El ayuno suprime principalmente el alargamiento de las cadenas. El alargamiento de la estearil-CoA en el encdfalo aumenta con rapidez durante la mielinizaci6n con el fin de proporcionar hcidos grasos con 22 y 24 átomos de carbono que estan presentes en los esfingolipidos.
EL ESTADO NUTRICIONAL REGULA LA LIPOGÉNESIS Muchos animales, incluso el ser humano, toman su alimento como comidas espaciadas y por tanto, deben
R ~ H ~ O C H - C H ' ~ - S-COA 2,s-Acil-COAinsaturada
NADPH
+
Ht
2.3-ACIL-COA INSATURADA
NADP+
Figura 23-6. Sistema microsbmiul de la elongasa para el alargamiento de las cadenas.
almacenar gran parte de la energía de su dieta para usarla entre alimentos. El proceso de lipogknesis se ocupa de la conversi6n de glucosa e intermedios como piruvato, lactato y acetilXoA a lipido, lo cual constituye ta fase anabblica de este ciclo. El estado nutricional del cuerpo y los tejidos es el factor
La concentración de citrato y acEl4oA regula a la acetil4oA carboxilasa
principal de control de la velocidad de Ea Eipogknesis. DE este modo. la velocidad es alta en el animal nutrido cuya dieta contiene una elevada proporcihn de carbohidratos. Se deprime en situaciones de ingestión caldrica restringida. con dietas ricas en Iípidos o cuando hay deficiencia de insulina, como en diabetes sacarina. Todos estos estados se acompañan de incremento en la concentración placmatica de acidos p q o s libres. La regulación del movimiento de icidos grasos libres del tejido adiposo se describe en el capitulo 27. Existe una r e l a c i ~ ninversa entre lipogenesis hephtica y la concentracion d r i c a de ácidos grasos libres (figura23-7). La inhibicibn mayor de la lipoghesis ociirre por arriba de los valores de Bcidos grasos libres (0.3 a 0.8 mmollmL de plasma) en los que Acidos grasos plasmáticos aumentan durante la transición de la alimentación a la Inanicibn. La grasa de la dieta también deprime la lipogénesis en el higado y cuando la alimentación contiene m&$ de t 0% de lipidos, es escasa la conversión de carbohidrato dieteitico a grasa. La lipogknesis es mayor cuando se ingiere sacarosa en lugar de glucosa debido a que la fructosa esquiva el punto de controt de fosfofmctocinasa en Za glucolisis e inunda la vía lipogénica (figura 22-51,
La reacción limitante de la velocidad en la vía lipogénica es el paso de la acctil4oA carboxilasa. Erta enzima es alosterica y se activa por citrato, cuya concentracion aumenta en estado de nutncion adecuada y es un indicador de suministro complcto de acetilCOA. Sin embargo. la inhiben moléculas a c i l X o A de cadena larga, un ejemplo de inhibición metablilica por retroaiimentacidn negativa por un producto de la secuencia de acciones s. Asi, si la a c i l 4 o A se acumula debido a que no se esterifica con suficiente rapidez, reducid de manera autornatica la sintesis de acido graso nuevo. De igual modo, si la acilXoA se acumula como resultado del aumento de lipolisis o del flujo de hcidos grasos libres hacia el tejido, también se inhibirá la formación de acido graso nuevo (figura 23-7). La activacibn alostCrica de la enzima implica Ia agregación de la configuraciiin dimerica en polimCrica de varios millones de masa molecular. La Acil-CoA puede inhihir tambikn al transportador mitocondrial de tricarboxilatos, e impedir de este modo la salida de citrato de las mitocondrias al citosol.
LA LIPOGÉNESISSE REGULA
La Acil-CoA regula también a la piruvato deshidrogenasa
CON MECANISMOS INMEDIATOS Y A LARGO PLAZO
La sintesis de ácidos grasos de cadena larga se regula a termino corto por modificación alostérica y covalente de enzimas y a largo plazo por cambios en la expresibn genica que regula las velocidades de sintesis enzimáticac.
Existe tambien una relacibn inversa entre la concentracirin de hcidos grasos libres y la proporcibn entre piruvato deshidrogenasa activa e inactiva que regula la disponibilidad de acetilXoA para lipoginesis. La AciIXoA inhibe a la piruvato deshidrogenasa por bloqueo del transportador del intercambio ATP-ADP de la membrana interna mitocondrial, lo cual conduce a incremento en las proporciones [ATP]/[ADP] dentro de la mitocondria y por tanto a conversibn de pimvato deshidrogenasa activa a inactiva (figura 19-6). AdemBs, ¡a oxidación de a c i l 4 o A por aumento de la concentracibn de acidos grasos libres puede elevar las proporciones [acetil4oA]qCoA] y FADH]/[NADt] en la rnitocondrias, y en consecuencia inhibir la piruvato deshidrogenasa.
Las hormonas también regulan la lipogénesic 0.2
0.5
I .a
2.0
3.0
AGL cbricos (~tmollmC)
Figurá 23-7. Inhibicibn directa de la lipogénesis hepatica por Acidoc grasos libres La lipog&necis ce deteminb de la incorp~racionde 3 ~ z a0 $cidos grasos libres en hígado de rata perfundido.AGL, bcidoc grasos libres. (Experimento del laboratorio del autor con DC Topping.)
La insulina estimula la lipogénesis por diversos mecanismos; acelera el transporte de glucosa al interior de la celula (por ejemplo, en tejido adiposo) y por consiguiente aumenta la disponibilidad de piruvato para la síntesis de hcidogmo y de glicerol 3-fosfatopara esterificación de estos ácidos grasos. La insulina convierte la forma inactiva de piruvato deshidrogenasa a la forma activa en el tejido adiposo, pero no en el
(Capitulo 23)
264 0 Bioquirnica de IJarper
hígado. Ademhs, la acetilXoA carboxilasa es una enzima que puede regularse por fosforilaci6n reversible. La insulina activa la a c c t i l Z o h carhoxilasa. Esta activación implica la desfosforilac i ~ por n una proteína fosfatasa acornpaflada por el cambio en la agregacibn de monomeros a partir de un octbmero a un estado más polimerico. Tarnbidn, la insulina, por 5u propiedad de deprimir la concentraci6n de cAMP intracelular, inhibe la lipolisis y por tanto, reduce la concentración de la acil-CoA de cadena larga, un inhibidor de la lipogénesis. Por este mismo mecanismo, la insulina antagoniza las acciones de glucagón y adrenalina, los cuales inhiben la a c e t i l 4 o A y por consiguiente la lipogénesis, por incremento de cAMP, que permite a la proteína cinasa dependiente de cAMP que inactlve a la enzima por fosforilacilin. Otra proteina cinasa dependiente de 5'-AMP también inactiva la enzima. En los rumiantes, el acetato y no la glucosa es el compuesto de inicio de la lipogénesis. Se infiere que, en estas especies, se evitan muchos de los mecanismos de control en los que intervienen mitocondrias y por tanto no son aplicables.
El complejo de ácido graso sintasa y a c e t i l 4 o A carboxilasa son enzirnas adaptativas Esto es, se ajustan a los requerimientos fisiolbgicos del organismo por incremento en la cantidad total en estado de nutrícibn adecuada y disminución en ayuno, dieta rica en Iípidos y diabetes. La insulina es una hormona importante que produce expresión génica e induce biosíntesis enzimática y el glucagán amagoniza este efecto. La ingestión de grasas que contienen ficidos grasos poliinsaturados regula la manera ordenada la inhibiciiin de la expresión de enzirnas criticas
de la gluctjlisis y la lipogénecis. Estos mecanismos para el control a largo plazo de la lipogénesis recién descritos emplean varios días para manifestarse en forma plena y aumentan el efecto directo e inmediato de ácidos grasos libres y hormonas como con la insu Iina y glucagón.
RESUMEN 1) La síntesis de hcidos grasos de cadenas largas (lipogenesis) se realiza por dos sistemas enzimá~icos presentes en el citosol de la célula: la acetilXoA carboxilasa y hcido graso sintasa. 2) La vía convierte la acetilXoA a palmitato y requiere NADPH, ATP, M#, biotina, ácido pantotenico y HCOt- como cofactorec. 3) El sistema de la a c e t i l 4 o A carboxilasa se requiere para la conversion de la acetil-CoA a malonilCOA. A su vez, la Bcido graso sintasa, cl complejo multienzim~ticode una sola cadena polipeptídica con siete actividades enzirnaticas separadas, cataliza el ensamble de palmitato a partir de una mol&culade a c e t i l 4 o A y siete de rnalonil4oA. 4) La lipogénesis se regula en el paso de la acetilCOA carboxi lasa por modifi cadoses alostéricos, modificación covalente e induccibn y represidn de Ia sintesis enzimhtica. El citrato activa la enzima; la a c i l 4 o A de cadena larga inhibe su actividad. A plazo corto, la insulina activa la acetil-CoA carboxilaca por desfosforilaci6n y a plazo largo, por inducción de la síntesis. El glucagbn y la adrenalina tienen acciones ovuestas a-la insulina. 5) El alargamiento de la cadena de los ácidos grasos tiene lugar en el retículo endoplhmico, cataliadapor el sistema enzirnhtico de la etongasa microshíca.
REFERENCIAS Goodridge AG: Fatty acid synthesis in eukatyotes. Page 143 in: B i o c h ~ m r s t yof Lzpids and ,Uernhrañes. Vance DE. Vance JE (editors). IlenjaminlCurnmings, 1985. Goodridge AG: Dietav regulation of gcnc expression: Enzyrnes involved in carbohydrate and lipid metaboIism. Annu Rev Nutr 1987;7:157. Haystead TAJ et al.: Roles of thc AMP-activated and cyclic-hMP4ependent protein kinascs in the ad-
rcnaline-induced inactivationof acetyl-COA carboxylase in rat adipoqtes. Etir J Biochem 1990;187:199. Jump DI3 et al.: Coordinate regulation of glycolytic and lipogenic gene exprcssion by polyunsaturated fatty acids. I I,ipid Kes 1994;35: 1076. Mabrouk C M et al.: Aciite hormonal control of ;ice@COA carboxylase. J Biol Chem 1990;265:6330. Wakil SJ:Faay acid synthaie. a proficient multifunctional enqrne. Biochemistry 1989;28.4523.
Oxidación de ácidos grasos: cetoaénesis Wd
Peter A. Mayes, PhD, OSC
Los ácidos gsasos son oxidados a acetil-COAy sintetizados a partir de la misma. Aunque la materia prima de un proceso es idéntica al producto de otro y las etapas químicas son comparables, la biosintesis de los acidos grasos no es simplemente la inversa de su oxidacihn, sino un proceso entemente distinto que tiene lugar en la célula en un compartimiento separado. La oxidacibn de Bcidos grasos separada de la biosíntesis permite que cada proceso se regule e integre de manera individual de acuerdo a las necesidades tisulares. La oxidacion de los ácidos grasos se lleva cabo en las mitocondrias; cada paso comprende derivados acil-COA catalizados por enzírnas diferentes, utiliza NAD' y FAD como coenzimas y genera ATP. Por el contrario, la biosintesis d e los ácidos grasos (Iipogenesís} se desarrolla en el citosol, comprende derivados acilo adheridos continuamente a un complejo multienzimatico, utiliza NADP' como coenzima y requiere de ionec bicarbonato y ATP. La oxidación de hcidos grasos es un proceso aerobio, que exige la presencia de oxígeno.
varios estados de deficiencia de carnitina o de las enzimas esenciales para la oxidacibn de los ácidos grasos (como la carnitina palmitoiltransferasa) o cuando la oxidacihn es inhibida por venenos (por ejemplo la hipoglicina).
LA OXIDACION DE LOS ÁCIDOS GRASOS SE PRODUCE EN LAS MITOCONDRIAS Los acidos grasos san transportados en la sangre como ácidos grasos libres
lAGL1 El término "acido graso libre" se refiere a los ácidos grasos que no esthn esterificados. Otras nomenclaturas son AGNE (ácidos gracos no esterificados) o AGSE (acidos p o s sin esterificar). En el plasma, los AGL de cadena larga se combinan con la albumina y en la célula están adheridos a la proteína fijadora d e hcidos grasos o proteína Z, dc modo quc en realidad nunca están "librec". Los acidos grasos de cadena corta son m8s solubles en agua y existen como acido no ionizado a como anion.
IMPORTANCIA BIOMEDICA El incremento de la oxidacibn de los hcidos grasos es tipico de la inanición y de la diabetes sacarina, donde ocasiona la produccibn de cuerpos cetónicos por el hígado (cctosis). Los cuerpos cetónicos son ácidos, cuya producción excesiva por periodos largos, como en la diabetes, causa cetoacidasis que finalmente es mortal, Debido a que la gluconeogénesis depende de la oxidacihn de Ios hcidos grasoc, cualquier alteración de dsta da lugar a hipoglucemia. Ésta se presenta en
Los ácidos grasos deben activarse antes de que puedan ser catabolizados A1 igual que en el metabolismo de la glucosa, los Acidos grasos primero deben convertirse mediante la reaccibn con el ATP a un intermediario activo, antes de que reaccionen con las enzimas responsables de su metabolismo ulterior. Esta es ia única a a p a en la degradación completa de un ácido graso que requiere energía a partir dcl ATP. En presencia de ATP y de la
266 Bioquimica de Harper
coenzima A. la enzima acil-COA slntetaqa (tiocinasa) cataliza la conversión de un ácido graso (o ácido graso libre) a un "ácido grasa activo" o acil-COA. acompanada por el gasto de un focfato de alta energia.
ciona con COA, por acción de carnitina palmitoiltransfersa 11, adherida al interior de la membrana intenia. En la matriz mitocondrial se desprende la camitina y se regenera acil-COA (figura 24-1). Acil-CoA + Carnitina e Acilcarnitina + Cob
Ácido graso + ATP + COA + Acil-COA + PP;+ AMP
La presencia de la pirofosfata~ainorghnicti asegura que la activacihn sea cornplrtta, facilitando la pérdida del fosfato de alta energia adicional del pirofosfato. De este modo, de hecho son dos fosfatos de alta energia los que se gastan durante la activación de cada molécula de ácido graso.
PIROFOSFATASA
Otra enzima, la carnitina acctiltransferasa, se encuentra presente en las mitocondrias, catalizando la transferencia de grupos acilo de cadena corta entre la COA y Ia carnitina. La función dc esta enzima es poco conocida, pero puede ser que facilite el transporte de grupos acetilo a través de la membrana de la mitocon-
ATP
AMP+ PPi
La acil-COA sintetasa se encuentra en el retículo endoplasmico y en el interior y sobre la membrana externa de las mitocondrias. Han sido descritas varias acil-COAsintetasas, especificas pasa cada ácido graso de diferente longitud de cadena.
tos acidos grasos de cadena larga atraviesan la membrana mitocondrial interna como derivados de carnitina La carnitina (beta-hidroxi-gamrna-trimeti!amoniobuikato), (CH&W -CH2-CH(Oi-WH:4OO-, está ampliamente distribuida y, en particular, es abundante en particular en el musculo. Es sintetizada en el hígado y el riñén a partir de lisina y metionina. La activación de los Acidos grasos mas pequefíos y su oxidacidn pueden ocurrir en el interior de las mitocondrias, independientemente de la carnitina, pero la acil-COA de cadena larga (o AGL} no penetrara a las mitocondrias y no es oxidada a menos que forme acilcarnitinas. Una enzima, la carnitina palrnituiltransferasa 1 esta relacionada con el lado exterior de la rnernbseina mitocondrial interna y convierte a los grupos acil-COA de cadena larga en acilcarnitina, la cual es capaz de penetrar la membrana interior de las mitocondrias y tener acceso al sistema de enzirnas de la beta oxidacibn (véase la reacción después), La carnitina-acilcarnitina translocasa actúa como un transportador de intercambio dc carnitina. La acilcarnitina se transporta al interior acoplada con la salida de una molecula de camitina. Luego, la acilcarnitina reac-
Carnitina
Acilcarnitina
I
!
COA
/
&brnitina
\ Carnitina Acil-COA
Aulwmitina
-
beta
ni da cid^
Figura 24-2. La funcibn de la carnitina en e4 transporte de los ácidos grasos de cadena larga a travec de la membrana interna de la rnitocondria La cadena larga de acetil-COA no puede atravesar la membrana interna de ta mitomndria, paro si su producto metabolico, la acilcarnitina
cual se encuentra en la membrana interna}. Estas * catalizan la oxidacibn de la acil-COA a acetil-COA, acopliindose el sistema con la fosforilación del ADP a ATP (figura 24-3). Después de que el residuo acilo penetra en Ia mernbma m itmondnal mediante el sistema transporAcetil-COA + Carnitina t,Acetilcamitina + COA tador de la carnitina y la reformacibn de acil-COA, sigue la eliminaciiin de dos átomos de hidrhgeno de los carbonos ?(alfa) y 3(beta), catalizada por la acilCOAdeshidrogenasa. Esto resulta en la formación de A'-trans-enoil-COA. La coenzima para la desh idrogenasa es una flavoproteina que contiene FAD como grupo prostttico, cuya nueva oxidacibn por la cadena LA BETA OXIDACION DE ÁCIDOS respiratoria requiere la mediación de otra flavoproteína. denominada flavoproteina transferenie de GRASOS IMPLICA SU electrones (capitule 13). Se afíade agua para saturar DESDOBLAM1ENñO SUCESIVO el doble enlace y formar 3-hidroxiacil-COA, cataliCON LIBERACION DE ACETIL-COA zada por la enzima A'-enoil-COA hidratasa. El derivado 3-hidroxi sufre una deshidrogenación posteEn la beta oxidación (figura 24-2), cada vez se rior sobre el carbono 3 (L(+)-3-hidroxiacil-COA separan dos carbonos de las rnol&culasde acil-COA, deshidrogenasa) para formar el compuesto 3-cecomenzando por e! extremo carboxilo. La cadena se toacil-COAcorrespondiente. En este caco, la coenzima rompe entre los Atomos de carbono alfa(2) y beta(3), dc aquí el nombre de beta oxidación. Las unidades de NAD interviene en la deshidrogenación. Finalmente, dos carbonos formadas son acetil-COA, por tanto, el la 3-cetoacil-Coa es fragmentada en la posición 2,3 palrnitoil-COA forma ocho molt5culas de acetil-COA. por una tiolasa (3-cetoacil-COA-tiolasa), la cual cataliza un desdoblamieiito tiolítico que afecta otra molécula de COA.Los productos de esta reacción son La secuencia de reacción cíclica la acetil-COA y un derivado acil-COA que contiene genera NADH y FADH2 dos carbonos menos que la motccula original de acilCOAoxidada. La acil-COA formada en la reacción dc Diversas enzimas conocidas colectivamente corno fragmentacion vuelve a entrar a la vía oxidativa en la "acidos grasos oxidasas" se localizan en la matriz reaccihn 2 (figura 24-31, De esta manera, un ácido mitocondrial adyacente a la cadena respiratoria (la graso de cadena larga puede ser degradado por completo a acetil-COA (unidades C:). Como la acetil-COA puede ser oxidada a COz y agua a través del ciclo del ácido cítrico (que se encuentra tarnbikn dentro de las mitocondrías}, se logra Ia oxidacion completa de los ácidos grasos. dria. Junto con fiuctosa y lactato, la acetilcarnitina es una fuente energdtica importante para el esperma, respaldando su movilidad.
La oxidacion de un ácido graso can un número impar de carbonos produce una molécula de acetil-COA y una molécula de propionil-COA 1
Remoción sucesiva de dos unidades C
Acetil-CoA
Figura 24-2. Esquema global de la beta oxidacion de los ácidos grasos.
Los acidos grasos con un número impar de átomos de carbono son oxidados por la vía de la beta oxidación produciendo acetil-COA hasta que quede un residuo de tres carbonos (propionil-COA). Este compuesto se convierte en succinil-COA, un constituyente del ciclo del ácido cítrica (figura 2 1-2). De aquí que, el residuo propionilo d e un ácido graso de cadena impar es la única parte glucogénica de 61.
d
Acido graso
R3CH,'CH$ I
0 II
AMP+ PP,
S1 NTETASA
Aul-COA (Acido graso activo)
R"CIi,
- --------------------
7CHrC-S-CoA
1
MEMBRCrN.4 MITOCONDRWL INTERNA C
+ - -
f-
-
-
-
-
-
-
L
-
-
-
-
-
-
L
-
-
-
-
-O -
-
Lado C (fuera) -e----------------
TRANSPORTADOR CARNITINA
+-
-
- .
-
-.
----------
Lado M (dentro)
o II
R ~ C H T ~ C H , - C -S-COA
I
Acv'-cOA DESHlOROGENASpl .
Cadena
NADH+H
Cadena
CCdo del af ido
Figura 24-3. Beta oxidacibn de los ácidos gracos La acil-COA de cadena larga participa en el ciclo a través de las reacciories 2 a 5, la acetil-COA es separada en cada cicla por la Ziolasa (reaccibn 5) Cuando el radical acilo tiene únicamente cuatro Atomos de carbono se forman dos moléculas de acetil-COA en la reaccidn 5.
La oxidación de los ácidos grasos produce un gran numero de msleculas de ATP
LA ALFA O X I D A C I ~ N Y LA OMEGA OXIDACIQN DE ACIDOS GRASOS SON V ~ A SESPECIALIZADAS
El transporte de electrones en la cadena respiratoria, procedentes del FADEI: y el NAD, conducira a la síntesis de cinco fosfatos de alta energia (capitulo 14) para cada una de las primeras siete rnolticulas de acetil-COAformados por la beta oxidacidn del palmitato (7 x 5 = 35). Se forma un total de ocho moles de acetil-COA y cada uno dar&lugar a 12 moles de ATP en la oxidación en el ciclo del ácido cítrico, obteniendoce 8 x 12 = 96 moles de ATP derivados de la acetil-COA formada a partir del pahitato; de éstos se restan dos por la activación inicial del ácido graso, rindiendo una ganancia total de 1 29 moles de ATP por mol de palmitato, es decir, un total de 129 x 5 1.6* = 6656 kJ. Como la energia libre de la combustión del ficido palniitico es de 979 1 kJlmol. el proceso captiira como fosfato de alta energia alrededor de 68% de la energia total de combustiiin del acido graso.
De manera cuantitativa, la beta oxidacion en las mitocondrias es la via mas importante para la oxidación de los acidos graos. Sin embargo, la alfa oxidación, es decir, la eliminación de un carbono a la vez. del extremo carboxilo de la molécula ha sido detectada en el tejido encefático. No necesita intermediarios COAy no conduce a la generación de fosfatos de alta energía. La omega oxidación se origina en el reticulo endoplAsmico por las enzímas hidroxilasas, interviniendo un citrocromo P450 (capitulo 13). El grupo -CHi se convierte en el 4 H l O I - I que posteriormente es oxidado a -COOH, lo cual forma un acido dicarboxiIico. Este es beta oxidado habituarmente a ácido adipico (Cbjy sub6rico (CR). los ciialcs se excrefan en la orina.
Los peroxisomas oxidan a ácidos grasos de cadena muy larga En los peroxisomas se encuentra una forma moditicada de la beta oxidacion que conducc a la formación de acetil-COA y HzOl (del paso de la deshidrogenasa ligada a flavoproteína). Por tanto, esta primera deshidrogenación no se vincula directamente con la fosforilación y la generación de ATP pero, mediante la activación inicial por la acil-COA sintetasa de cadena muy larga, facilita la oxidación de ácidos grasos cuya cadena tarnbikn es muy larga (por ejemplo, CZoy C2,). Estas enzimas se inducen por dictas abundantes en grasas y, en algunas especies, por fhrrnacos hipolipiddmicos como el ctofibrato. Las cnzimas en los peroxisomas no atacan a los ácidos grasos de cadenas más cortas; la secuencia de la beta oxidación termina en el octanoil-COA. A continuación los grupos octanoilo y acetilo se eriminan de los peroxisomas en la forma de octanoil carnitina y acetit carnitina y, más tarde, ambos son oxidados en las mitocondrias. Una funcihn posterior de la beta oxidación peroxisómica es acortar la cadena lateral del colesterol en la fomaci6n de hcido biliar (capítulo 28). Los peroxisomas también participan en la síntesis tanto de Cter glicerolipidos (capitulo 26), como del colesterol y del dolicol (figura 28-2). t o s peroxisomas no contienen carnitina palmitoiltransferasa.
*
AG para la reacción ATP. tal como se explica cn el capítulo 19.
LA OXIDACIÓNDE ÁCIOOS GRASOS INSATURADOS SE PRODUCE POR UNA V ~ AMODIFICADA DE LA BETA OXIDACION
Los ésteres COA de estos Acidos son degradados por las enzimas que normalmente se ocupan de la beta oxidacibn hasta que se forma un compuesto A'-cisacil-COA o un AA-cis-acil-COA,dependiendo de la posición de las dobles ligaduras (figura 2 4 4 ) . El primer coinpuesto es isomerizado (~"cis-tA~-irunsenoiS-COAisomerasa) a la etapa correspondiente A ~ tram-COA de la beta oxidación para la subsiguiente hidsatacidn y oxidacibn. cualquier d4-cis-acil-COAse conserva, como en el caso del hcido linoleico (figura 2 4 4 ) o entra a la via en este punto y es convertido por la acil-COA deshidrogei~asaa ~ ~ - t r a n s - ~ ~ - c i s - d i enoi 1-COA. Ésta es convertida a A3-irans-enoit-COA por una enzima que depende de NADP. ~ ~ - t s a n s - ~ ' ' c i s d ienoil-COAreductasa. La A 3 - c i ~ - f A Z ~ n s e n o i ~ o ~ isomerasa tarnbikn atacará a la doble ligadura A'-iruns para producir A~-rruns-enoil-COA,un intermediario en la beta oxidación.
LA CETOGÉMESIS SE PRESENTA CUANDO HAY UN ~NDICEELEVADO DE OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN EL HÉGADO En ciertas condiciones mctab6licas relacionadas con un índice alto de oxidación de ácidos pasos, el higado
cis
3
Ciclos de
B oxidacibn
-
0 S - COA
cis
C
0
3 AwtiI-CoA
a2-trans-i\6-c~s-Dienoi~-~o~
(A~-tmns-Enoil-COA estado de a-oxidación) Un uclo de
p oxidacibn
Acetil-COA
produce cantidades considerables de acetoacetato y de D(-)-3-hidroxibutirato (beta bidroxibutirato). El acetoacetato continuamente se descarboxila de manera esponthnea para dar acetona. Estas tres sustancias se conocen colectivamente como cuerpos cetánicos (se designan como cuerpos acetónicos o [incorrectamente*] "cetonas") (figura 24-5). El acetoacetato y el 3Aidroxibutirato son interconvertidos por la enzima mitocondrial D(-)-3-hidr~xibutirato deshidrogenasa; el equilibrio es controlado por la proporción mitocondrial del fNADt] a WADH], es decir, el estado redox. La proporcibn E-hidroxibutirato]/[acetoacetato] en la sangre varia entre 1 : 1 y 10:1 . La concentración de cuerpos cetónicos totales en la sangre de mamlferos bien arimentados por lo común no excede de 0.2 mmollL. En los rumiantes es algo mayor debido a la formacidn en la pared del mmen de 3-hidroxibutirato a partir del ácido butirico [un producto de la fermentación en los rumiantes). En general la perdida por la orina es menor de 1 mg por 24 horas en el ser Iiumano. In vivo, el hígado parece ser el Unico 6rgano en los no rumiantes que agrega una cantidad significativa de cuerpos cet6nicoc a la sangre. Los tejidos extrahepAticos los utilizan como sustratos respiratorios. Las fuentes extrahepáticas de cuerpos cetbnicos, por ejemplo, el epitelio del rumen en los rumiantes, no contribuyen de manera importante a la producción de cetosis en estas especies. El flu-jo neto de cuerpos cetónicos del hígado a tos tejidos extrahepaticos proviene de un activo mecanismo enzimatica en el hígado para la produccion de cuerpos cet6nicos acoplado con una actividad muy baja de las enzimas encargadas de su utilizacidn. La situacidn inversa tiene lugar en los tejidos extrahepaticos (figura 2 4 4 ) .
3-hidroxi-3-metilglutaril-COA (HMG-COA) es un intermediario en la vía de la cetogénecis
4 Ciclos de
p oxidacibn
!
5-Aoetil-COA
Figura 24-4. Secuencia de reacciones en la oxidacibn de Bcidoc grasos insaturados, por elernplo, Acido linoleiw. Los Acidos grasos h4-ciso los que forman n4-us-enoil-COA entran a la via en la posicibn que se muestra. El NADPH para el paso de la dienoil-COA reductasa es tomada de fuentes intramitocondriaies como la acción del glutamato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa y MAD(P)H transhidrogenasa
Las enzimas que forman cuerpos cet6nicos estan relacionadas principalmente con las mitocondrias. A l principio se creía que sólo se formaba una molécula de acetoacetato a partir de los cuatro carbonos terminales de un ácido graso despues de oxidacibn. Más tarde, para explicar tanto la produccihn de mlis de un equivalente de acetoacetato a partir de un hcido graso de cadena larga, como la formación de cuerpos cetbni-
*
El termino "ceionaq" no debe usarce debido a que el 3-hidroxibutirato no es iinacetona y ha! muchas ceicinas en la sangre que no son ciicrpos cetónicos, por ejemplo cl piniuato y la fructosa.
Oxidació~1de úcidos grasos. cet o~énesis 2 71
tiolasa donde dos moléculas de acetil-COA se con-
Acetoaoetato a[-FJ-HtPROXfBUTiWTO UADH + W f
CH,-
CH - CH,-
cm-
Figura 2 4 6 . Interrelaciones de los cuerpos cetbnicos. La o(-)-3-hidroxibutirato deshidrogenasa es una enzima mitoconcirial
cos a partir del acido acktico se propiiso que las unidades C2 formadas en la beta oxidación se condensaban entre si para formar acetoacetato. Esto puede ocurrir por una invessiíin de la reacci6n de la
densan para formar acetoacetil-COA. Así, surge la acetoacetíl-COA, que es el material inicial para la cetogénesis, ya sea directamente durante el curso de la beta oxidación o como resultado de la condensación de acetil-COA(figura 24-7). Esta vía implica la condencacion de acetoacetil-COA con oua molécula de acetil-COA para formar HMG-COA catalizada por la 3-hidroxi-3-metilglutaril-COA sintasa. La presencia de otra enzima en las mitocondrias, la 3bidroxi-3-metilglutaril-COA liasa, s e p a r a a la acetil-COA de la HMG-COA, dejando acetoacetato libre. Los átomos de carbono separados de la molécula de acetil-COA provienen de la molécula de acetoacetil-COA original (figura 24-71. Ambas enzimas deben estar presentes en las mitocondrias para que se lleve a cabo la cetogénesis. Esto sucede exclusivamente en el epitelio del mmen y en el hígado. Aunque la actividad de la HMG-COA liasa aumenta durante el ayuno, los resultados no sugieren que esta enzima sea limitante de la velocidad en la cetoh~nesis. El acetoacetato está en equilibrio con el 1i(-)-3hidroxi butirato catalirado por la n(-)-3-hidroxibutirato dcshidrogenasa, q u e s e e n c u e n t r a en la mitocondria d e muchos tejidos, incluyendo el hepático (figura 24-5). El n(-)-3-hidroxibutirato es, cuantitativamente, el cuerpo cetonico predominante en la sangre y orina en la cetosis. L
ronos
SANGRE -
Cuerpos cetaniws
--+.*,,
Cuerpos cetonicos
,,
EXTRAWEPATICOS
cuerpos cetonicos
del ácido cítrico
Figura 24-6, Forrnacidn, utilizacion y excrecion de los cuerpos cetbnims. (La vía principal está indicada por las flechas continuas )
AGL
'
Acii-COA
Ertefificacisn
I (Acetii-
+
r,k,,igiiceroi fosfolípido
beta Oxidacibn
COA^
Figura 24-7. Vias de cetogénesis en el hígado. (AGL, Bcidos grasos libres. HMG,3-hidroxi-3-metilglutaril )
Los cuerpos cetiinices se utilizan
como combustible para los tejidos extrahepáticos Aunque el hígado cuenta con un activo mecanismo enzimático para la producci6n de acetoacetato a partir de acetoacetil-COA, una vez que se forma, no puede ser reactivado directamente en este 6rgano excepto en el citosol de su5 cklulas, donde es precursor en la síntesis del colesterol, una via mucho menos activa. Esto explica la produccion total de cuerpos cet6nicos por el hígado. En los tejidos extrahepliticos, la principal via de utilizacion para la activacihn del acetoacetato a acetoacetil-COA irnptica a la succinil-COA y a la enzima succinil-COA-acetoacetato COA transferasa. E 1
acetato reacciona con la succinil-COA, y la COA se transfiere para formar acetoacetil-COA. dejando suc. cinato libre (figura 24-81. La acetoacetil-COA que se produce, es separada en acetil-COA por la tiolasa y oxidada en el ciclo del ácido cítrico como se muestra en la figura 2 4 4 . Los cuerpos cetónicos son oxidados en los tejidos extrahepáticos de modo proporcional a su concentraci6n en la sangre. Si esta se eleva, la oxidación de los cuerpos cetonicos aumenta hasta que, a una concentracibn de aproximadamente 12 mmol/L, saturan la maquinaria oxidatíva. Cuando esto ocurre, una gran proporcibn del consumo de oxígeno puede deberse a la oxidación de los cuerpos cetónicos. La mayoría de las pruebas sugieren que la cetonemia se dcbc a la elevadaproducci6n de cuerpos cetónicos por el higado, mas que a una deficiencia en
Oxidación de cicrdo.7
graso.^:
cerogénesis 2 73
Figura 24-8. Transporte de cuerpos cetbniws desde el hígado y mecanismos de utilizacion y oxidación eii los tejidos intra hepatioos.
su utilización por parte de los tejidos extrahepáticos. Sin embargo, los experimentos con ratas despancreatizadas apoyan la posibilidad de que la cetosis en la diabetes grave puede empeorar por una capacidad reducida para catabolizar los cuerpos cetónicos. Aunque el acetoacetato y el D(-)-3-hidroxibutirato se oxidan con facilidad por los te-jidos extrahepáticos, la acetona es difícil de oxidar ir? vivo y una gran cantidad se volatili~aen los pulmones. En ta cetonemia moderada, la pérdida dc cuerpos cetónicos a través de la orina es s610 un pequeño porcentaje de su produccidn y utilización. Coma hay efectos que semejan el renal (aunque no hay verdadero umbral), Ios cuales varían entre especies y personas, In medición de la cetonemia, no de la cetonuria, es el método preferido para valorar la gravedad de la cetosis.
LA CETOGENESIS ES REGULADA EN TRES PASOS CR~TICBS 1) Al principio, el control se ejerce en el tejido adiposo. La cetosis no ocurre in vivo a menos que
haya una elevación concomitante en la concentraci6n de hcidos grasos libres en la circulación que resulta de la lipólisis del triacilglicerol en el tejido
adiposo. Los ácidos grasos son los precursores de los cuerpos cetbnicos en el hígado. Este brgano, tanto en el animal alimentado como en ayuno, tiene la facultad de extraer 30% o más de lbs ácidos grasos libres que pasan a través de él por !o que, cuando hay concentraciones altas de Acidos grasos libres, el flujo por el hígado es sustancial. Por tanto, los factores que regulan la rnovi!i7acirjn de los ácidos grasos desde el tejido adiposo son importantes en el control de la cetogcnesis (figuras 24-9 y 27-9). 2) Uno de dos destinos esperan a los ácidos gracos libres despukc de su captacidn por el hígado y de ser activados a acil-COA: se oxidan en COz o en cuerpos cethnicos, o se esterifican en triacilglicerol y fosfoiipido. La capacidad de esterificaci6n como un factor anticetogénico depende de la disponibilidad, en el hígado, de precursores (figura 26-2) que suministran suficiente glicerol 3-fosfato. No obstante, la disponibilidad de glicerol 3-fosfato no limita la esterificacibn en hígados sin nutrientes. No se sabe si su disponibi1idadchepática es siempre el factor limitante en la esterificación; tamvoco se tiene información critica acerca de si las actividades in vivo de las enzirnac que intervienen en la esterificacibn son limitantes de la veloci-
t AGL
.................................. SANGRE
Cuerpos cetbnicos
Figura 24-9. Regulacibn de la cetogenesic. @ a @, muestra tres etapas cruciales en Ea via del metabolismo de los acidos grasos libres (AGL) que determinan la magnitud de la cetogenesis. (CPT-1, carnitina palmitoiltransferasa l.)
dad de reaccibn. Al parecer no es un proceso regulador ya que ni los hcidos grasos librec ni sus intermediarios en la via de esterificación a triacilglicerol (figura 26-2) se acumulan jamás en el hígado. Los hígados con riego sanguíneo de ratas hambrientas oxidaron considerablemente mlis hcidos grasos marcados con C" a ~ 0 ~ cI4 ' "cuerpos cetonicos y esterificaron menos como C'Lacilglicerol que los órganos de ratas nutridas. Estos resultados pueden explicarse por el hecho de que la actividad de la carnitina palmitoiltransferasa 1 en la membrana mitocondrial exterior, regula la entrada de gmpos acilo de cadena larga en las rnitocondrias antes de la beta oxidación (figuras 24-1 y 24-1 0 ) . Su actividad es escasa cuando hay una nutrición adecuada, cuando la oxidacion de hcidos grasos se encuentra deprimida; asimismo, se eleva en ayunas, cuando la oxidación de ácidos grasos aumenta. Malonil-COA es un intermediario inicial en la biosintesis de hcidos grasos (figura 23-l), el cual aumenta en estado de nutrición, .
inhibe a esta enzima, lo cual bloquea la beta oxidacibn. Partanto, cuando lanutrición es adecurula, hay lipogénecis activa y concentración elevada de malonil-COA, que inhibe la carnitina palmitoiltransferasa 1 (figura 24-10). Los ácidos grasos libres, cuando hay nutrición adecuada, entran a la célula hepática en concentraciones bajas y son ecterificados casi en su totalidad a acilgliceroles y transportados fiera del hígado cn Eipoproteinas de muy baja densidad (VLDL, del inglés vepy Iow c l e n ~ lipoproteins). i~ Sin embargo, conforme la concentración de Acidos grasos libres aumenta con el principio de la inanicihn, la acetil-COA se inhibe y malonil-COA disminuye, desinhibiendo a la eanitina palrnitoil-transferasa I. al ticmpo que permite que una cantidad mayor de acil-COA sea beta oxidada. Estos procesos se refuerzan en la inanicibn por una caída en la proporción insulinaJglucag6n. El resultado directo de este decremento es la inhibición de la acetil-Coh carboxirasa en el higado mediante fosforilación covaIente; cl indirecto es el aumento en la lipblisis en el tejido adiposo y la liberacibn dc ácidos grasos libres, los cuales,despuks de su capt a c i ~ n f, m a n acil-COA en el higado e inhiben la acetil-COA carboxilasa (figura 24-1 0). Por tanto, la beta oxidaciiin a partir de los ficidos gmos libres se controla por la compuerta de la camitina palmitoiltransferasa 1 en el interior de la mitocondria, y se esterifica el remanente de la captación de ácidos grasos libres no oxidados. 3) A su vez, la acetil-COA formada en la beta oxidacion se oxida en el ciclo del ácido cítrico o entra en la vía de la cetogénesis para formar cuerpos cetbnicos. Conforme aumenta la concentracibn de ácidos grasos libres séricos, un mayor número es convertido en cuerpos cetonicos de modo proporcional y una cantidad menor es oxidada por la ruta del ciclo del dcido cítrico a COZ.La reparticihn de la acetil-COA entre la via cetogtnica y la de oxidación a COIes regulada de tal modo que laenergia libre total que resulta de la oxidacibn de los hcidos grasos atrapada en e1 ATP, permanece constante. Es posible apreciarlo cuando se considera que la oxidacibn completa de un mol de palmita10 conduce a una producción neta de 129 moles de ATP por la via de la beta oxidacidn y la produccibn de COZen el ciclo del acido citrico (vease antes), en tanto que solo se producen 33 moles de ATP cuando el acetoacetato es el producto final y sólo 21 moles cuando es el 3-hidroxibutirato. Por tanto, la cetogenesis puede considerarse como un mecanismo que permite al higado oxidar grandes cantidades de hcidoc grasos dentro de un sistema de fosforilacion oxidativa al parecer estrechamente acoplado, sin aumentar su gasto total de energía. Se han planteado otras varias hipótesis para explicar la desviación de la oxidación de los acidos
Oxidaci&~de úciu'os grasos: cetog&ne.~is 275
t f
H~GADO
AGL Carbohidratos --)) Acetil-COA
Esterificac16n
Acll-CaA
Ac~lgliceroles
ACETIC-COA
.
-.
Insultna
Glucagon Malonil-COA
.
- - .F
CARNITIIVA PALM lTOlL TRANSFERASAj
I
,
Acil-CzA
.
.
-
beta Oxidacibn
Mitocondria
,
Acetil-COA
Coz
Figura 24-10. Regulacion de la oxidacibn de Bcidoc grasos de cadena larga en el higado (AGL, ácidos grasos libres; VLDL, lipoproteinas de muy baja densidad.} Los efectos reguladores, positivos @ y negativo O están representados por líneas punteadas y el flujo de sustrato por líneas continuas.
graso5 de la formaci6n de COzhacia la cetogdnesis. Teóricamente, una caída en la concentracibn de oxalacetato, en particular dentro de las mitocondrias, podria restar capacidad al ciclo del Acido cítrico para metabolizar la acetil-COA. Esto puede ocurrir debido a un incremento en la relacidn ~ADH]/[NAD'], producido a su vez por la elevación de la k t a oxidación, lo cual puede afectar el equilibrio entre el oxalacetato y el malato, con disminución de la concentración del oxalacetato. Krebs ha sugerido que, puesto que el oxatacetato se encuentra tambitn en la vía principal de la gluconeogénesis, lapotenciación de esta, que disminuye la concentración de oxalacetato, puede ocasionar las formas graves de cetosis que se encuentran en la diabetes, así como la cetosis del ganado. No obstante, Utter y Keech han mostrado que la piruvato carboxilasa, que cataliza la conversion del piruvato en oxalacetato, es activada por la acetil-COA. En consecuencia, cuando existen cantidades importantes de acetil-COA, debe haber suficiente oxalacetato para iniciar la reacciiin de condensacion en el ciclo del ácido cit~ico.
ASPECTOS CC~NICOS
La oxidación defectuosa de los ácidos gracos da origen a enfermedades que con frecuencia se acompañan de hipoglucemia
La deficiencia de carnitina puede presentarse en particular en recién nacidos -y de modo especial en lactantes prematuros- debido a hiosíntesis insuficiente o escape renal. Su pérdida también puede darse en hemdiálisis; los pacientes con aciduria pierden grandes cantidades de carnitina, que se excreta conjugada con los acidos orginicos. En algunos individuos, la deficiencia de carnitina indica un requerimiento dietético semejante al de las vitamina. Los signos y sintomas de deficiencia incluyen episodios peribdicos de hipoglucemia causados por la reduccion de la gluconeogénesis que resulta de una oxidación defectuosa de hcidos grasos y de cetogénesis en presencia de concentraciones plasmáticas elevadas de AGL, que conducen a la acurnulaci6n de lipidos con debilidad muscular. El tratamiento es mediante suplementación
oral de carnitina, Los síntomasson semejantes al síndrome de Reye (encefalopatía con degeneracidn grasa de las vísceras), pero en este hltimo las cantidades de carnitina son adecuadas y su origen se desconoce. Por otro lado, la deficiencia de carnitina palmitoiltransferasa 1 afecta sólo al hígado y conduce a reduccion de la oxidacihn de acidos grasos y cetogcnesis con hipoglucemia. Por su pme, la deficiencia de carnitina palmitoi~transferasaF1 afecta de manera primaria al músculo esquelético (debilidad y necrosis con mioglobiniiria) y, en su forma más grave, al hígado. En un patrhn semejante, las sulfonilureas hipoglucémicas (glihurida [glibenclamida]y tolbutamida) reducen la oxidación de iicidos grasos por medio de la inhibición de la camitina palrnitoiltransferasa. Los defectos hereditarios en las enzirnas de la beta oxidación también ocasionan hipoglucemia, coma e higado graso; por ejemplo. la deficiencia de !a beta oxidación-COA deshidrogenasa de cadena larga puede ser una causa de hígado graso agudo en el embarazo. Se conocen bien los defectos en Ios genes para la 3-cetoacil-COA tiolasa. También se han ohservado errores innatos de la cetogénesis, como es el caso de la deficiencia de H MC-COAliasa, la cual también afecta la degradacibn de leucina, un arninohcido cetogénico (capítulo 32). La enfermedad jamaiquina del vbmito es causada por comer fruta sin madurar del árbol a h e (Blighia sapidaj que contiene una toxina, hipoglicina, la cual inactiva a la acil-Co.4 deshidrogenasa de ácidos grasos de cadena media y corta, inhibiendo la beta oxidación y causando hipoglucemia con excreción de ácidos mono y dicarboxilicos de cadena media y corta. La aciduria dicarboxilica se caracteriza por la excreción de Bcidoc omega dicarboxilicos C ~ IyDpor la hipoglucemia no cetbtica. Su causa es la falta de acil-COA deshidroeenasa de cadena media en lar " mitocondrias. Esto altera la beta oxidacibn, pero incrementa la omega oxidación de acidos grasos de cadena larga y media, que luego son acortados por la beta oxidacibn, a ácidos dicarboxilicos de cadenas media y corta, !os cuales son excretados. En la actualidad se sabe de deficiencias de acil-COA deshidrogenasas de cadena larga y media, junto con deficiencias de hidroxiacil-COA deshidrogenasa y 2,4-dienoil-COA reductasa, la cual conduce a excreción urinaria de 2-truns-4-crs decadienoilcarnitina como consecuencia de la deficiencia de Ea beta oxidacibn de ácidos grasos pol iinsaturados. La enfermedad de Refsum es un trastorno neurolbgico poco común causado por acumulación de ácido fithnico, formado del fitol, un constituyente de la clorofila que se encuentra en alimentos vegetales. El ácido fithnico contiene un grupo metilo en el carbono 3 que bloquea la beta oxidación. Normalmente, una alfa oxidación inicial elimina at grupo metilo, pero las
personas con esta enfermedad tienen un defecto hereditario en la alfa oxidación que permite la aciimulaci6n del hcido fithnico. El sindrorne de: Zellwegcr (cerebrohepatorrenal) se presenta en individuos con una rara ausencia hereditaria de peroxisomas en todos los te,jidos. Este defecto causa la acumulación de ácidos poliénicos Ct6 a Cis en el tejido encefalico, debido a Ia incapacidad para oxidar ácidos grasos de cadcna larga en los peroxisomac, aunque también presenta una perdida generalizada de las funciones peroxisdmicas, como la deficiencia en la síntesis de hcido biliar y de &eres de Iípido~.
La cetoacidosis se debe a la cetosis prolongada La presencia en sangre u orina de cantidades de cuerpos cetónicos mayores de las normales constituye cetoancmia (hipercetonemia) o cetonuria, respectivamente. El trastorno global se llama cetosis. Los ácidos acetoacético y 3-hidroxibutirico son ácidos moderadamente fuertes y necesitan ser amortiguados cuando se presentan en la sangre o en los tejidos. No obstante, su excreción continua en cantidad produce cierta pbrdida de amortiguamiento catiónico (a pesar de la produccibn de e o n i a c o en el riñón) que agota de manera progresiva la reserva de álcali, causando cetoacidosis, que puede ser mortal en diabetes sacarina no controlada. La forma más simple de cetosis tiene lugar en la inanicihn y se debe a la deplecibn de los carbohidratos disponibles acoplada con la movilizacic5n de ácidos grasos libres. Al parecer, ningún otro trastorno donde se presenta la cetosis difiere cualitativamente de este patrbn general de metabolismo, aunque: en el aspecto cuantitativo puede exagerarse para producir los estados patológicos encontrados en diabetes sacarina, toxernia gravidica en ovejas y cetosis en vacas cn lactancia. Forrnas no patológicas de cetosis se encuentran en condiciones de alimentación rica en grasas y despues de ejercicio extenuante durante el periodo posabsorción.
RESUMEN 1) La oxidaci6n de los ácidos grasos en las mitocondrias produce cantidades abundantes de ATP por un proceso llamado beta oxidacibn, el cual escinde en secuencia las unidades de acetil-COA de las cadenas de acidos grasos. La acetil-COA se oxida en el ciclo del ácido citrico, con formación adicional de ATP. 2) La oxidación de hcidos grasos de un numero impar de carbonos produce acetil-COAmás una molkcula de propionil-COA, que es glucogenica.
OxidaciBn de ácidos grasos: cetogénesis
3) Los peroxisornas tienen la propiedad de oxidar ácidos grasos de cadena muy larga, pero siilo hasta octanoil-COA que luego debe ser transferido a las mitocondrias para oxidacihn ulterior. 4) Los cuerpos cetónicos (acetoacetato. 3-hidroxibutirato y acetona) se forman en las mitocondrias hephticas cuando hay un índice elevado de axidacion de hcidos grasos. La vía de la cetogknesis comprende la formacion y degradacion de 3hidroxi-3-metilglutaril-COA(HMG-COA) por acc i o n d e dos e n z i m a s c e t o g é n i c a s claves, HMG-COA sintasa y HMG-COA liasa. 5) Los cuerpos cetónicos son energéticos importantes en los tejidos extrahepáticos.
2 77
6 ) La cetogdnesis es regulada en tres etapas criticas: a) control de la movilización de acidos grasos libres del tejido adiposo; b) actividad de carnitina palmitoiltransferasa 1 en el hlgado, la cual determina la proporción del flujo de hcidos grasos hacia oxidación en lugar de esterificacilin; c) reparticion de acetil-COAentre las vías de cetog4nesis y ciclo del Acido cítrico. 7) Las enfermedades relacionadas con el deterioro de la oxidacion de ácidos grasos conducen a hipoglucernia, infiltración de grasa de órganos e hipocetonernia. 8 ) La cetosis es leve en la inanicihn, pero grave en diabetes sacarina y en la cetosis de rumiantes.
REFERENCIAS 3rd ed. Vol 16 of Lipid E ~ y m o l o pAcadcmic , f'ress. 1983. hlayes PA, Laker ME: Rcgiilation of ketogenesis in the liver. Biochcm Soc Trans 198 1 ;9 339. McGarry JD, Foster DW: Regulation ofhepatic fatty acid oxidatiun and ketone body production. Annu Rev Riochem 1980;49:395. Osmundsen H, Havik R: p-oxidation of polyunsatured fa@ acids. Biochem Soc l'rans 1988; 16 320. Poulos A: Lipid metabolism in Zellaeger's Syndrome. I'rog Lipid Rcs 1989;2&:35. Enyer PD (editor): The En-?mes.
Reddy JK, Mannaerts GP: Perovisomal lipid metabolism. Annu Rev Nutr 1994;14:343. Schoite HR et al.: Primary carnitine deficiency. I Clin Chem Riochem 1990;28:35 1 . Schulz H: Reta oxidation oT faiiy acids. Biochim Biophys Acta 1991;10R1:109. Scriver CR et al. (editors): The ,Metaholic and holeculnr Rrrces of lnherited fluear~,7th ed. McGraw-Hill, 1995. Treem WR et al.: Acute fatty livcr ef pregnancy and long-chain 3 - h droxyacy ~ 1-coenayme A dehydrogenase deficiency. Mepatology 1994; 19:339.
insa+.uñadosy de Aos eicosanoides Peter A. Mayes, PhD, DSc
Comparados con los vegetales, los tejidos animales tienen una capacidad limitada para desaturar a los ácidos grasos. Por esto requieren ingerir en los alimentos, ciertos ácidos grasos poliinsaturados derivados en última instancia de fuentes vegetales. Tales &cidos grasos esenciales dan origen a los acidos grasos eicosanoicos (&),de los que dwivan familias de compuestos conocidos como eicosanoides. Estos constitiiyen las prostaglandinas, los tromboxanos, los leucotrienos y las lipoxinas.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA El contenida de iicidos grasos insaturados en un lipido natural es un determinante principal de su punto de fusibn y, por tanto, de su fluidez. De modo similar, los fosfolipidos de la membrana celular contienen hcidos grasos insaturados importantes en la conservación de la fluidez de la misma membrana. Una proporción alta de ácidos grasos poliinsaturados a Acidos grasos saturados (proporcibn P:S) en la alimentación es un factor importante para reducir el colesterol plasmático por medios dietéticos y se considera benifico en la prevención de la enfermedad coronaria. Las prostaglandinas y tromboxanos son hormonas locales sinteti~adas con rapidez en el momento en que se necesitan y que actiian cerca de sus sitios de sintesis. Las principales actividades fisiol6gicac de las prostaglandinas son como reguladores de la acci6n de la adenililo ciclasa, por ejemplo, 1 ) en el control de la agregaclon plaquetaria y 2) en la inhibicibn del efecto de la hormona antidiuretica en el riR6n. Los antiinflamatorios no esteroides, como la aspirina, actiian mediante la inhibición de la síntesis dc prostaglandinas. Por su
parte, los leucotrienos causan contracción mizccular y tienen propiedades quimiotácticas, que sugieren una intervencicin importante en las reacciones aldrgicas y en la inflamacibn. Se ha identificado a la sustancia de reaccihn lenta de la anafilaxia (SRL-A} como una mezcla de leucotrienos. Variando las proporciones dietkticas de los diferentes Bcidos grasos poliinsaturados, es posible influir en el tipo de cicosanoides sintesiz,ados, lo cual indica que sería posible modifícar el curso de la enfermedad por medio de la alimentacibn.
LOS MAM~FEROSNO PUEDEN SINTETIZAR ALGUNOS ÁCIDOS GRASOS POLIINSATUMDOS POR LO CUAL SON ESENCIALES EN LA NUTRICIÓN
En la figura 25-1 se muestran algunos Iicidos grasos insaturados de cadena larga, de importancia en el metabolismo de los mamíferos. (Para una revisión de la nomenclatura de los ácidos p s o s , capitulo 16.) Otros ácidos grasos polienoicos de C2n, Cz: y Cz4 pueden detectarse en los tejidos. Estos pueden ser derivados de los ácidos oleico, linoleico y alfa linolénico mediante el alargamiento de las cadenas. Es de notarse que todos los enlaces dobles presentes en los ácidos grasos insaturados naturales en los mamiferos, son de la configuración cis. Los acidos palmitoleico y oleico no son esenciales en la alimentacidn, debido a que los te.jidos pueden introducir una doble ligadura en la posicidn A9 en el Acido graso saturado correspondiente. Los experimentos con el palmitato marcado han demostrado que la marca penetra libremente al interior
dobles ligaduras en las posiciones A ~ A, ~ A6 , y A' (contando desde la terminal carboxilo: capítulo 163. pero nunca más allá de la posición A'. Por el contrario, los vegetales pueden introducir dobles ligaduras en las posiciones &'l y A", y de esta manera pueden sintetizar acidos grasos esenciales en la nutrición.
LOS ÁCIDOS GRASOS MONOlNSATURADOS SE SINTETIZAN POR UN SISTEMA DE DESATURASA A' En cuanto a los ácidos grasos monoinsaturados no esenciales, se considera que varios tejidos incluyendo al hígado, se encargan de su forrnacibn a partir de ácidos grasos saturados. La primera doble ligadura introducida en un acido graso saturado es siempre en las cercanias de laposicibn A'. Un sistema enzimAtico, A9 desaturasa (figura 25-2), en el retículo endoplacEstearoil-COA+ Enzima
COOH 20
*Acido amquidbnico (cii6. 20.4, d5,B,11-14
Estearoil-Enz Ácido eicosapentaenoico ((03.20:5.A ~ ~ ~f ~ ' . ~ ~ , ~
Figura 25-1. Estructura de algunos ácidos grasos insaturados. Aunque los átomos de carbono en las moléculas ecthn numerados de manera convencianal, es decir, a partrr del carboxilo terminal, los números m (porejemplo, w 7 en el Acido pafmitoleico) se calculan desde el extremo opuesto (del metila terminal) de las mol8culas. La informacibn entre paréntesis muestra, por ejemplo, que el acida U-linolénica contiene dobles ligaduras comenzando en el tercer carbono desde el metila terminal, su cadena es de 18 carbonos w n tres dobles ligaduras en los carbonos novena, duodécimo y decimoquinto desde el carboxilo temlnal ("Clasificado como "hcido graso esencial".)
de los acidoc pahitolcico y oleico, pero se haya ausente de los ácidos Iinoleico, y alfa linolénico. Estos son los únicos ácidosgmos conocidosque son esenciales para lanutricion completa de muchas especies de animales. incluyendo al ser humano, por lo que deben incluirse en la dieta; en consecuencia se conocen como Acidos grasos esenciales en la nutrición.El acida araquidónico puede formarse a partir del hcido linoleico en la mayoria de los mamíferos (figura 2 5 4 ) , pero no en los felinos, donde debe clasificarse como ricido graso esencial. En la mayoria de 10s animalec, es posible introducir
COA SH hansferasa
Oleil-COA+ Enzima
Figura 25-2. Sistema de desaturasa rnicrosbmica 3"
Mefabolismo de los Ucidos
mico catalizara la conversi611 de palmitoil-CoA o estearoil-CoA en palmitoleil
LA S~NTESISDE ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS IMPLICA A LOS SISTEMAS ENZIMATICOS DE DESATURASA Y ELONGASA Los dobles enlaces adicionales introducidos en los ácidos grasos monoinsaturados siempre se separan uno de otro por un grupo metileno (intempcidn metilénica), excepto en las bacterias. En los animales, los enlaces dobles adicionales son introducidosentre el enlace doble existente y el grupo carboxilo, pero en las plantas pueden tambien ser introducidos entre el enlace doble existente y el carbono omega (metito terminal). Así, dado que los animales tienen una A' desaturasa, son
Acido
.r
;18.2
-
20:2
graso.^
iniaturadmy de los eico.~anni&s 28 1
capaces de sintetizar completamente la familia omega 9 (ácido oleico) de ácidos grasos incaturados mediante una combinación de alargamiento de la cadena y desaturacion (figura 25-3 ). Sin embargo. puesto que son incapaces de sintetizar ácidos linoleico (omega6) o alfa IinolCnico (omega3), al estar ausentes las desaturasas necesarias, estos hcidos necesitan ser surninistrados en la dieta para que se efectúe la síntesis de los demás miembros de la familia omega6 y omega3 de los ácidos grasos poliinsaturados. El linoleato puede convertirse en araquidonato (figura 2 5 4 ) . Al principio, la vía es por deshidrogenacibn del éster COA a aavks de gamma linolenato, seguida por la adición de una unidad de dos carbonos de la malonil-COA en el sistema microsiimico de alargamiento de las cadenas (figura 2 3 4 ) ) ,para producir eicosatrienoato (dihomo gamma linolenato). Este último forma araquidonato mediante una deshidrogenacibn ulterior. El sistema deshidmgenantc es semejante al descrito antes para los acidos grasos samrados. El requerimiento nutricional para el araquidonato puede, por tanto, omitirse cuando hay linoleato en la alimentación.
-*
20:J----+
22:3
m--+-
+ 22-4
la deficiencia de acidos grasos
esenciales
/@
20.2 E
I
I I Ácido a-linolbnico
Figura 2 5 3 . Biosintesis de las series w9,(06 y m3 de Bcidos grasos poliinsaturados.Cada paso es cataltzado por los cisternas rnicros6rnims de alargamiento de la cadena o sistema desaturasa. Los Bcidos grasos poliinsaturados m 9 sólo se vuelven cuanttativamente importantes cuando los ácidos Iinoleico y a-linol&nico se restringen en la dieta Esto se debe a que cada serie compite por los mismos sistemas enzirnátims y las afinidades decrecen desde la familia 0 3 a la 09. inhibicibn).
(e,
o II
C-S - C O A IB
O7
+
NADH
+ H+,,
1
(Maionil-COA,NADPH)
O7
+
NADH
+ Ht-,
DE AiARGAMIEN'TO
1
C-S
-COA
m
Figura 2 5 4 . Converstbn del linolealo en araquidonato. Los gatos no pueden reafizar esta wnversibn ya que no poseen ri6 desaturasa y deben recibir araquidonata en su atimentacibn.
La desaturacibn y el sistema de alargamiento de las cadenas están muy disminuidos en el estado de ayuno, en la administración de glucagón y adrenalina y ante la falta de insulina como en la diabetes sacarina tipo 1.
CUANDO LA DIETA CARECE DE ÁCIDOS GRASOS ESENCIALES (AGE), SE PRODUCEN SINTOMAS DE DEFICIENCIA En 1928, Evans y Burr notaron que las ratas alimentadas con una dieta purificada libre de lipidos a la cual se habían afíadido las vitaminas A y D, manifeszaban reduccibn de lavelocidad de crecimiento y deficiencia reproductiva. Trabajos posteriores mostraron que el sindrome de deficiencia se curaba mediante la adicibn de hcidos linoleico, alfa linolénico y araquidbnico a la alimentaci6n. Posteriores características diag-
n6sticas del sindrome incluyen piel con escamas, necrocis de la cola y lesiones en el sistema urinario, aunque el trastorno no es mortal. Estos ácidos grasos se encuentran en concentraciones altas en diversos aceites vegetales (cuadro 16-21 y en cantidades pequeiias en los canales de animales. Las funciones de los ácidos grasos esenciales parecen ser diversas, aunque no bien definidas, ademas de la fomaci6n de prostaglandinas y leucotrieno (vease después). Los hcidos grasos esenciales que se hallan en los lipidos estructurales de la cklula se relacionan can la integridad estructural de la membrana rnitocondrial. Las membranas celulares contienen hcido araquid6nico que constituye entre S y 15% de los hcidos grasos de fosfolípidos. El ácido docosahexaenoico (DHA; ornega3,2:6),que se sintetiza a partir de Acido alfa linolknico o se obtiene de manera directa de aceites de pescados, existe en concentraciones elevadas en la
Metaboll~mode los ácidos grasos insaturudosy de los eico.~anoides 283
retina,la cortezacerebral, tos testículosy e! esperma El DEIA se requiere en particular durante el desarrollo cerebral y es suministrado a través de la placenta y la leche. Los segmentos exteriores de los bastones de la retina contienen concentracionesmuy altas de DHA; la mayoria de los fosfolípidos contiene al menos rnolkculas de éste. Al parecer la gran fluidez resultante se necesita para el funcionamiento de la rodopsina, que consiste en activacion por un fotbn que produce movimientos laterales y rotatorios dentro de la membrana. En los pacientes con retinitis pigmentosa se encuentran valores sanguíneos bajos de DHA. Los recikn nacidos prematuros tienen una baja actividad de A4 desaturasa, lo cual reduce su capacidad para sintetizar DHA a partir de precursores de ácidos grasos n-3. En muchas de sus funciones estructurales, los ácidos grasos esenciales se hallan presentes en los fosfolipidos, principalmente en Ea posición 2. En la deficiencia de hcidos grasos esenciaIes, los hcidos pol ienoicos no esenciales de la serie omega9 reemplazan a los ácidos grzisos esenciales en los fosfolipídos, otros Iípidos complejos y membranas, en particular el hcido A'.*.' '-eicosatrienoico (figura 25-31, Pasa diagnosticar el grado de deficiencia de los ácidos grasos esenciales puede usarse la proporción trieno:tetraeno en los lipidos plasmáticos.
LOS EICOSANOIDES SE FORMAN DE ÁCIBOS GRASOS BOLllNSATURADOS C20 El araquidonato y algunos otros ácidos grasos Czocon enlaces interrumpidos por metilenos dan origen a los eicosanoides, compuestos activos de manera fisiológica y famacológica, conocidos como prostaglandinas (PC), trornboxanos (TX) y leucotrienos (LT) y aipoxinas (LX) (capítulo 16). En el aspecto físiológico, sc considera que actiian como hormonas locales que funcionan a travds de receptores enlazados a proteína G para estimular sus efectos bioquímicoc. El araquidonato, que habitualmente deriva de la posición 2 de los fosfolípidos de la membrana plasmhtica, como resultado de la actividad de la focfolipasa A2 (figura 26-6), es e[ sustrato para la síntesis de los compuestos PGz, TX2,LT4 y LXs. Sus vías metabólicas son divergentes, compitiendo la síntesis de las series PG2 y TX: (prostanoides) con la de LT4 y LX4 por el sustrato araquidonato. Estas dos vías se conocen respectivamente como la via de la ciclooxigenasa y la de la lipoxigenasa (figura 25-5). Hay tres grupos de eicosanoides (cada una conteniendo PG, TX, LT y posiblemente LX) que con sintetizados de ácidos eicosanoicos Czoderivados a partir de los ácidos grasos esenciales, linoleato y alfa tinolenato, o directamente del araquidonato y eicosapentaenoato en la dieta (figura 2 5 4 ) .
Los ácidos grasos trans pueden
competir con ácidos grasos cis Se han encontrado pequehas cantidades de ácidos p o s con insaturación truns en las grasas de los rumiantes, donde se originan por la accihn de los rnicroorganismos en et turnen; pero la presencia de cantidades abundantes de ácidos grasos trans-insaturados en los aceites vegetales parcialmente hidrogenados (por ejemplo, margarina) plantea la interrogante respecto a su seguridad como aditivos de alimentos. Sus efectos a largo plam en el ser humano son dificiles de valorar, aunque han estado en la alirnentaci6n humana por muchos aííos. Hasta 15% de hcidos grasos tisulares se han hallado en la configuracibn bram durante las necropsias. Sin embargo, hasta la fecha, ningún efecto grave ha sido comprobado. Son metabolizados más como hcidos saturados que como hcidos insaturados de forma cis. Esto puede deberse a su conformaci6n semejante de cadena lineal (capitulo 16). A este respecto, tiende a elevar las concentraciones de LDL y bajar las de HDL y por tanto se contraindican en relación con el incremento de aterosclerosisy enfermedad coronaria. Los hcidos grasos trans-poliinsaturados no poseen actividad de ácido graso esencial por lo que pueden antagonizar el metabolismo de los hcidos grasos esenciales y agravar su deficiencia.
LA S~NTESISDE PROSTANOIDES SE E F E C T ~ APOR LA V ~ A DE LA CICLOOXIGENASA La sintesis de prostanoides (figura 25-7) implica el consumo de dos moléculas de 0 7 catalitadas por la prostaglandina-endoperbxidosintasa, la cual posee dos actividades enzimhticas separadas, cidooxigenasa y peroxidasa. El producto de la vía de la ciclooxigmasa,, un endoperóxido (PGH), es convertido en las prostaglandinas D, E y F así como en el tromboxano (TXAz) y la prostaciclina (PGI2). Cada tipo celular produce una sola clase de prostanoide. La aspirina, la indometacina y el ibuprofeno inhiben a la ciclooxigenasa.
La actividad de los ácidos grasos esenciales y la producción de prostaglandinas está correlacionada Aunque existe una notable comlaci6n entre Ia actividad de ácido graso esencial en varios hcidos grasos y su propiedad de convertirse en prostaglandinas, al parecer los hcidos grasos esenciales no ejercen todos sus efectos fisiolbgicos a travds de la síntesis de estas últimas. La fÜnci6.n de los ácidos grasoc esenciales en
Fosfollpldo de la membrana
, Varios estimulos. oor
ejemplos, angiotensina II.
bradicinina,adrenalina. trombina
FOSFOLtPhm
o \
Corticosteroides antiinflamatorios
Leucotrienos y llpoxlnas
Brostaglandinas y tromboxanoc
Aspirina lndometacina Ibuprofeno
Figura 2 5 6 . Conversión del Acido araquidbnico en prostaglandinas y tromboxanos por la vía de la ciclooxigenasa y en leucotrienos y lipoxinas por la vía de la Iipoxigenasa. El esquema indica por q J los esteroides que inhiben la produoción total de los eicocanoides, son mejores agentes antiinflamatorios que los medicamentos análagos de la aspirina, los cuales sblo inhiben la via de la ciclooxigenasa. Se piensa que los antiinflamatorios esterordes inhiben la fosfolipasa A2 por ~nduccibnde una proteína rnhibidora llamada Iipocortina
la fortnacibn de membranas no se relaciona Con la formacidn de prostaglandinas, las cuales no alivian los síntomas de deficiencia de los hcidas prasos esenciales y un sindrome por esta deficiencia no es causado por inhibicibn crbnica de síntesis de prostaglandinas.
La ciclooxigenasa es una "enzima suicida" La "suspensibn" de la síntesis de prostaglandinas se logra en parte por una propiedad notable de la ci-
clooxigenasa: la de catalizar su propia destt-ucci~n;es decir, es una "enzima suicida". La inactivacibn de las prostaglandinas es ripida. La presencia de la enzima 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa en l a mayoría de los tejidos de mamíferos es quizh la causa principal. El bloqueo de la a c c i ~ nde esta enzima con sulfasalacina o indometacina puede prolongar la vida media de las prostaglandinas en el cuerpo.
Ieucotrienos. El primero en ser sintetizado es el Ieucotrieno As,que a su vez es metaboli~adoa leucotrieno R4 o a C4. Este ultimo se forma por la adicibn del péptido glutation mediante un enlace tioéter. L a eliminación subsecuente del glutamato y la glicina genera en secuencia a los leucotrienos Ds y L. Las lipoxinas con una familia de tetraenos conjugados tambKn presentes en los leucocitos. Se forman por la acciiin combinada de una lipoxigenasa, que introduce mas oxigeno en la molecuIa. Varias lipoxinas (LXA4 a LXE4) se forman de manera similar a la descrita antes para los leucotrienos.
ASPECTOS CL~NICOS
El ser humano también muestra síntomas cuando tiene deficiencia de ácidos grasos esenciales En seres humanos cuyas dietas carecen de los ácidos
LOS LEUCoTRIENoS Y LAS LIPOXINAS SE FORMAN POR LA VIA DE LA LlPOXlGENASA Los leucotrienos son una familia de trienos conjugados que se forman a partir de hcidos eicosanoicos en los leucocitos, cilulas de los rnastocitomas, plaquetas y macrófagos por la vTa de la Iipoxigenasa en respuesta a estimulos inmunologicos y no inmunoIógicos (figura 25-31. Tres diferentes lipoxigenasas (dioxigenasas) insertan oxigeno en las posiciones 5, 12 y 15 del ácido araquidbnico, dando origen a hidroperoxidos (HPETE). Solo la 5-lipoxigenasa forma
grasos esenciales, se-observan síntomas cutheos y deterioro del transporte de lipidos. En los adultos que subsisten con alimentacion ordinaria, no se ha informado de signos de deficiencias de Acidos graos esenciales. Sin embargo, lactantes a~imentadosconf6rmulas pobres en grasas, desarrollaron defectos cutaneos que se curaron mediante la administracibn de linoleato. Las deficiencias atribuibles a falta de ácido5 grasas esenciales. incluyendo ácido alfa Iinolénico, ocurren también en pacientes que reciben exclusivamente nutricion intravenosa pobre en lipidos por periodos Iargos. La deficiencia puede prevenirse mediante la ingestión de un ticido graso esencial de I a 2% del requerimiento calórico total.
Metabolismo de los ácidos graaTosinsulzarudo.~ y de los eicosanoides
285
Dieta
1 y-linolenato
kPC B , l l,l4-Eiwsatrienoato
(dihorno-7-linolenato)
f icosatstraenoato
Eicosatetraenoato \ Octadecatetraenoato
5,$,11,14,17-
Eiwsapentaenoato
t
Dieta
t
Dieta
Figura 2 5 6 . Los tres grupos de eicosanoides y sus orígenes biasint&ticos. (PG, prostaglandina: PGI, prostaciclina; TX, trornboxano; LT, leucotriene, U(,lipoxina; @ vía de la ciclooxigenasa; @ via de la Iipoxigenasa.) El subíndice denota el numero total de dobles ligaduras en la molécula y las series a las cuales pertenece el compuesto.
En varias enfermedades e! metabolismo de ácidos grasos esenciales es anormal Ademb de la deficiencia de icidos grasos esenciales y de los cambios en los patrones de acidos grasos insatwrados en la desnutrición crónica, se ha observado un metabolismo anormal de hcidos grasos esenciales, el cual puede estar conectado con insuficiencia dietktica en la fibrosis quisrica, acrodermatitis enteropatica, síndrome hepatorrenal, síndrome de Sjtjgren-Larsson, degeneracion neurona1 multisistimica, enfermedad de Crohn, cimsis y alcoholismo y en el síndrome de Reye. En los cerebros de pacientes con el síndrome de Zellweger (capítulo 24) se han encontrado concentraciones elevadas de ácidos polienoicos de cadenas muy
largas. Las dietas con una alta proporción P:S (ácidos grasos pol iinsaturados: saturados) reducen las concentraciones del colesterol sérico. en particular en las lipoproteinas de baja densidad. Esto se considera benéfico en vista de la retacion entre la concentración sbrica de colesterol y la enfermedad coronaria.
t o s prostanoides son potentes sustancias biológicamente activas
Los tromboxanos se sintetizan en las plaquetas y su liberación produce vasoconstricción y agregacibn plaquetaria. Las prostaciclinas (PG12) son producidas por las paredes de los vasos sanguíneos y son potentes inhibidorec de la agregación plaquetaria. Por tanto, tromboxanos y prostaciclinas son antagónicos
286 Bioquirnica de Harper
(Capítulo 23)
COOH
Araquidonato
*
-8Aspirina Indometactna
lbupmfeno
6-ceto PGFl,
COOH
OH
OH
OH
OH
Figura 25-7. Conversibn del heido araquidbnica en prostaglandinas y tromboxanos de la serie 2. (PG, prostaglandina. TX, tromboxano, PGI, prostaciclina, HHT, hidroxiheptadecatnenoato.)' (Lasdos adivklades se atnbuyen a una enzima, prostaglandina endoperbxido stntasa. Conversiones semejantes tienen lugar en las prostaglandinas y tromboxanos de la sene 1 y 3).
L,a escasa frecuencia de cardiopatias, la agregacibn plaquetaria disminuida y los tiempos prolongados de coagdacibn de los esquimales de Groenlandia se han atribuido a su elevada ingestion de aceites de pescado que contienen205 omega 3 (EPA o ácidoeicosapentaenoico), el cual da origen a la serie 3 de las prostaglandinas (PG3)y de los tromboxanos TX3 (figura 2 5 4 ) . La PG3 y el TX, inhiben la liberacibn de araquidonatos de los fosfollpidos y la ~onfomaci6nde PGz y TXz. La PGI, es tan potente como antiapgador plaquetario como la PGI2;pera el TXA3 es un agregador más dkbil que eE TXA2; par tanto, el equilibrio de la actividad est6 desplazada contra la agregacibn. Ademas, las concentraciones plasmhticas de colesterol, triacilglicerol y de las lipoproteinas de baja densidad y de muy baja densidad, son todas bajas en los esquimales, en tanto que las de lipoproteinas de alta densidad esthn elevadas; se considera que todos estos factores operan contra la aterosclerosis y el infarto del miocardio.
Concentraciones de prostaglandinas tan pequehas como de 1 ng/mL provocan la contraccibn del músculo liso en los animales. Los usos terapéuticos potenciales incluyen la prevencirin de la concepcihn, la induccibn del parto a tkrmino, la terminación del embarazo, la prevencibn o alivio de las úlceras gástricas, el control de la inflamacibn y de Ia presión arteria1 y el alivio del asma y de la congestión nasal. Las prostaglandinas aumentan el cAMP en las plaq w , tiroides, cuerpo lúteo, hueso fetal, adenohipófisis y pulmones, pero lo disminuyen en las dlulas de los tiibuloc renales y en el tejido adiposo (capítulo 27).
Los leucotrienos y las lipoxinas son potentes reguladores de muchos procesos patológicos
La sustancia de reaccibn lenta de la anafilaxia (SRL-A) es una mezcla de los leucotrienos G, D4y E4. Esta
Merahnlismn de los úcrdos grusos insaiurados y de los eicosunoides
287
COOH
+
COOH
Leucotrieno 8 4
-/
b
Leumtrieno &
Lipoxinas. es decir. LXA4
Giutat'6n
Acido glutamico
Cisteina
Leucntrieno C4
Leucotrieno D4
Leucotrieno E*
Figura 25-8. Conversidn del Acido araquiddnico a leucotrienos y Iipoximas de la serie 4 por la via de la lipoxigenasa Algunas conversiones similares se presentan en las serres 3 y 5 de los leucotrienos. (HPETE, hidroperoxieicosatetraenoato, HETE, hidroxieicosatetraenoato) @ peroxidasa, leucotrieno A4 epdxldo hidrolaca, @ @utatibn S-transferasa; @ y-glutamrRransferasa,@ ~isteinilglicina dipeptidasa.)
a
mezcla es entre 100 y 1000 veces más potente que la histamina o las prostaglandinas como constrictor de la musculatura de las vias respiratorias bronquiales. Estos leucotrienos junto con el Bd provocan también la permeabilidad vascular, la atraccibn y activacibn de los leucocitos y parecen ser reguladores importantes en numerosos trastornos que invoiucran reacciones inflamatorias o de hipersensibilidad inmediata como el asma. Los leucotrienos son vasoactivos y la 5lipoxigenasa se ha encontrado en las paredes arteriales.
Existen pruebas de que las lipoxinas participan en las funciones vasoactivac e inmunosreguladoras, por ejemplo, como contrarreguladores (chalonas} de la respuesta inmunitaria.
RESUMEN 1) La biosintesis de los iicidos grasos insaturados de cadena larga se logra por medio de la combinación
(Capitulo 25)
288 Bioquim ica de Harper
de enzimas desaturasas, que introducen dobles ligaduras, y enzimas elongasas, que alargan las cadenas acilo existentes en dos carbonos por vez. 2) Los animales estan restringidos a desaturasas A ~ , A', A' y A ~ lo , cual no les permite introducir dobles ligaduras m i s alla de la posición 9 de los hcidos grasos. La consecuencia es que no pueden sintetizar ácidos linoleico (o6)y alfa linolénico ( 0 3 ) y deben recibirlos en la dieta. Estos se conocen como acidos grasos esenciales. 3) Los acidos g a s o s esenciales dan origen a ácidos Czo(eicosanoicos) a partir de los cuales se sintetizan grupos muy importantes de compuestos con
actividad fisioIógica y farmacol6gica: los eicosanoides, los que comprenden prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos y lipoxinas. Los dos primeros se sintetizan por la vía de la glucooxigenasa (inhibida por la aspirina); tos leucotrienos y las lipoxinas se sintetizan en la vía de la lipoxi-
genasa. 4) Dado que a partir de los ácidos grasos esenciales se sintetizan grupos diferentes de eicosanoides, el equilibrio entre los efectos fisiológicos de los diversos eicosanoides puede ser manipulado cambiando la composición de acidos grasos de la alimentacihn.
REFERENCIAS Rrenner RR: Endocrine control of f a p acid desaturation, Hiochem Soc Trans 1990; 18:773. Fischer S: Dict;Uy polyinsaturat.atedfatty acids and eicosanoid furmation in humans. Adv Lipid Res 1989:23:169. Holman RT: Control of poli insaturated acids in tissue lipids. J Am Call Nutr 1986;5:183. Kinsella JE, Cakesh 6, Stone lb%:Dictary n-3 polyunsatutaied fatty acids and amelioration of cardiovascular disease: Possiblc mechanisms.Arn J Clin Nutr 1990;SZ.l. Legarde M, Gualde N, Rigaud M: Mctabolic inieractions betwcen eicosanoids in blmd and vascular cells. Biochem 1 1989:257:3 13.
Neuringer M, Anderson GJ, Connos WE: The essential-
ity of n-3 fatty acids for the devtlnpment and funciion of the retina and hrain. Annu Rev Nutr 1988;8:517.
Serhan CN: Lipoxin biosynthcsis and its impact in inflammatov and vascular events. Riochim t3ioph.s Acta 1994:121:2: t . Smith WL: The eicosanoids and rheir biochcmical mcchanisms of action. Biochem J 1989:259:315. Smith WL, Borgeat P: The eicosanoids. tn: Brochemistri: ofLipids ond .tlernbrunes Vancc DE, Vance JE (edi-
t o r ~ )Benjamin/Cumrnings, . 1'185.
Peter A. Mayes, PhD, DSc
Los acilgliceroIcs constituyen la mayoria de los lipidos en el cuerpo. Los triacilgliceroles son tambikn los lipidos principales locatizados en los depositos de grasa y en los alimentos. Además, los acilgllceroles, en particuiar los fosfolipidos, son componentes importantes de la membrana plasmhtica y de otras membranas. Por su parte, los fosfolipidos intervienen en el metabolismo de muchos lípidos. Los glucoesf3ngolipidos, que contienen esfingosina, residuos de azúcares y ácidos grasos, forman de 5 a 10% de los lipidos de la membrana plasrnática.
man parte del glucocáliz de la superficie celular y se consideran importantes: 1) en la comunicacián intercelular y contacto; 2) como receptores para las toxinas bacterianas (por ejemplo, la toxina que causa el cólera). y 3) como sustancias de los grupos sanguíneos ABO. Se ha descrito aproximadamente una docena de enfermedades por almacenamiento de glucolipidos (por ejemplo, la enfermedad de Gaucher y la de Tay-Sachs) que se deben a deficiencias en la enzima hidrosiiasa de la via que degrada los glucolipidos en los lisosomas,
EL CATABOLISMO DE LOS AClLGLlCEROLES NO ES EL PROCESO INVERSO DE LA BIOS~NTESIS La función del triacilglicerol en el transporte y almacenaje de los lipidos y en varias enfermedades como la obesidad, diabetes e hiperlipoproteinemia se describirá con detalle en los capitulas siguientes. Los fosfogliceroles, fosfoesfingolípidos y glucoesfíngolipidos, son todos anfipáticos y por tanto, idealmente adecuados como constituyentes lipidicos principales de la membranaplacrnatica. Algunos fosfolípidos tienen funciones especializadas; por ejemplo, la dipalmitoil lecitina es el componente principal del surfactante pulmonar, cuya ausencia en los lactantes prematuros provoca el sindrome de insuficiencia respiratoria del recien nacido. Los fosfolípidos de inositol actúan como precursores de los segundas mensajeros de las hormonas y el .factor activador de plaquetas es un alquilfosfolipido. Los glucoesfingolIpidos, que se encuentran en la capa externa de la membrana placmhtica con sus cadenas de oligosaclidos protuberante$, for-
El catabolismo del triacilglicerol comienza con la hidrólisis Los aiacilgliceroles deben ser hidrotizados a sus ácidos grasos constituyentes y glicerol por las lipasas antes de proseguir con su catabolismo. Gran parte de esta hidrhlisis tiene lugar en el tejido adiposo con la liberación de acidoc grasos libres en el plasma, donde se hallan combinados con la albúmina sérica. Esto va seguido por la absorcibn de ácido graso libre en los tejidos y la oxidacidn subsiguiente o su reesterificación. Muchos tejidos (incluyendo hígado, corazbn, rifiiin, mhsculo, pulmones, testiculos, encéfalo y tejido adiposo) tienen la capacidad de oxidar a los Acidos grasos d e cadena larga aunque el encéfalo no puede extraerlos fAcilmente de la sangre. La utilización del glicerol depende de la posesion por parte de dichos
290
Rioquimica de ffuvper
(Capítulo 26)
tejidos de la enzima activante glicerol cinasa. ],a enzima ha sido hallada en cantidad significativa en el higado, el riiihn. el intestino, el tejido adiposo pardo y la glhndiila mamaria en lactancia.
LOS TRIACILGLICEROLES Y FOSFOGLICEROLES SE FORMAN POR ACILACIÓN DE FOSFATOS DE TRIOSAS En la figura 26-1 se delinean las vías principales de la biosíntesis de triacilgliceroles y fosfogliceroles. A partir del glicerol 3-fosfato se forman numerosas sustancias importantes que desempeñan funciones vitales en el metabolismo celular. Estos compuestos van de reservas importantes de triacilgticerol a derivados fosfatidilos de colina, etanolamina, inositol y cardiolipina, un constituyente de las membranas rnitocondriales. Hay dos puntos de ramificacihn importantes en los pasos intermedios de fosfatidato y diacilglicerol. Del fosfato d e dihidroxiacetona derivan fosfogliceroles que contienen un enlace kter ( 2 - 0 4 - 1 , de los cuales los mejor conocidos son los plasmal6genos y el factor activador de plaquetas (PAF, del inglks, plo~eletaclivafing factor). Debe hacerse notar que el glicerol 3-fosfato o fosfato de dihldroacetona deriva, o es un miembro. de la via de la glucólisis, lo cual sefiala una conexibn muy importante entre los carbohidrato~y el metabolismo de los lípidos.
El fosfatidato es el precursor común en la biosíntesis de triacilgliceroles muchos fosfociliceroles Y cardiolipinas Aunque las reacciones en las que interviene la hidrdlisis de los triaciIgliceroles por la lipasa pueden Glicerol 3-fosfato
ser invertidas en el laboratorio, éste no es el mecanismo por el cual se sintetizan los acilgliceroles en los tejidos. 'ramo el glicerol como los k i d o s grasos deben ser activados por el ATP antes de incorporarse a los aci~glíceroles.La glicerol cinasa catalizará la activación de glicerol a sn-glicerol 3-fosfato. Si esta enzima se halla ausente, o esti baja en actividad como ocurre en el músculo o en el tejido adiposo, la mayor parre del glicerol 3-fosfato debe derivarse de un intermediario del sistema glucolítico, el fosfato de dihidroxiacetona, que forma glicerol 3-fosfato mediante reducción con NADH catalizada por la gliccrol3-fosfato deshidsogenasa (figura 26-2).
A. Biosintesis de triacilgliceroles Los ácidos grasos son activados a a c i l 4 o A por la enzima acil-CoA sintetasa, utilizando ATP y COA (capitulo 24). Dos moléculas de acil-COA se combinan con glicerol 3-fosfato para formar fosfatidato (1,2diacilglicerol fosfato). Esto se Ileva a cabo en dos etapas mediante la vía del lisofosfatidato, catalizada primero por glicerol 3-fosfato-aciltranskrasa y luego por la l~cilglicerol-3-fosfato~ciltransferasa. E1 fosfatidato es transformado por la fosfatidato fosfohidrolasa a 1 ,S-diaciIglicerol. Una nueva rnoldcula de acil-COA se esterifica con diacilglicerol para formar un triacilglicerol, catatizada por diaciIgliceml aciltransferasa. En la mucosa intestinal, existe una via del monoacilglicerol, mediante la cual este es convcrtldo en 1,24iacilglicerol como resultado de la presencia de monoacilglicerolaciltraneferacia. La mayor parte de la actividad de estas enzimas reside en el retículo endoplásrnico celular, pero parte se encuentra tambikn en las mitocondrias, por ejemplo. la glicerol3-fosfato aciltransferasa. La actividad de la fosfatidato fosfohidrolasa s e encuentra principalmente en la fraccidn sobrenadante libre de partículas pero tambien est8 iinida a la membrana.
T Fosfato de
Fosfatidato
~iac~lgliCer~l
1
Fosfatidiluilina. fosfatidiletanolamina
plasmalbgenos
Fosfatidilinositol
1
Triacilglicerol
dihidroxiacetona
PAF
Cardiolipina
\
4,5-Bisfosfato de fosfatidilinositol
Figura 26-2. Panorámica de la biosíntesic del acilgltcerol y fosfoglicerol (PAF, factor activador de ptaquetas )
\
ATP
H?p-OH
\ ),
NAD'
ADP
),,
H.?-0:
HO-C-H
NADW t Ht
;,y-OH
HO-C-H
I
H~C-OH
C=O
I
~ G L ~ C E R OCL~ N A S A ~
Glicerol
I
E_
H~C-O-B
3-fosfato
sn-Glicerol 3-íosfato
--
* GIucbI~sis
H,C-O-@
n~Fosfatod e ~ dlhidroxiacetona
dah'drOgenasa
Aul-COA (pnncipalmeniesaturada)
H2C-O-C-R,
I
m3-CH
n,c -OH
I
&-a-@
I
&-C-0-C-H
II
1-Acilglicerol 3-hfata (Ilsoíosfaiidam) m g(h e lrF ;-e F ;e n !t
I H~C-OH
O
2-Monoaolgliceml
insaturada\
7-Act@licemr
a~ittransbm
AUI-COA acl~ansfwesa
H,C-O-C-R1 Cn A
R2-C-O-C-H O
I I
II
n,c-O-@
1,2-DiaciiglicerolCdina
CTP
Fosfwolina HIC-O-C-R,
HPC-O-C-R,
I
I
&-C-O-C-H
H
I
O
H.WH
R,-C-O-C-H II I a H,C-O-@-@
1.2-Diacilgliceml
I INOStTOL
CMP H?C-O-C-R,
I
II
I
&-c-o-c-H
~~-c-a-c-n O
H2C-O-C-R,
I
'i
HIC-O-@
O
1
1
Colina
Triaalglwml
Fosfatdilcolina
Fosratdiletanolarnln.
o II
H,C-O-C-n3
Il
HIC-O-C-R, R,-C-O-C-H
II
O
H,C-O-C-R1
I
R,-C-O-C-H
I
H,C-O-@
I Inositol
I I
Lb
o ~~C-~-e)-l~~~it~l-@i 4-Fosfato de fosf&tidilrnositol
Fosfa~ilinositol
4DP
Fosfatdrkenne
H~C-O-C-A, I
&-C-O-C-H
II
O
I
-
H ~ C O-
@- fnasifol- @ I
@ 4,5=Bisfosfatode loslatidilinosiiol
0
Figura 26-2. Biocintesisdel triacilglicerol y f m b l í p i d o s Vía del monoaulglicerol. V í a del glicerol focfato. La fosfa tidiletanolam i n a puede formarse a partir de la e t a n o l a m i n a por una via srmilar a la mostrada p a r a formación de focfatidilcolina a partir de colina
(Capitulo 26j
B. Biosintesis de fosfogliceroles !:$tos festblipidos son sinteti7;idos a partir de fosfatidato: por ejemplo. el fosfatidilinositol, o a partir del 1,2-diacilglicerol como la fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolamina. En la sintesis de fosfaiidilinositul, tsifosfato de citidina (CTP, del ingles, cytidine friphosphate) un fosfato de alta energía, formado a partir de ATP (capítulo 12) reacciona con fosfatidato para formar citidina4ifosfato4iacilgiicerol (CDPdiacilglicerol). Finalmente, este compuesto reacciona con hositol, cataliziida la reaccibn por Ia enzima CDP-diacllglicerol inositol transferasa para formar fosfatidilinositol (figura 26-2). Por fosforilaciones sucesivas, el fosfatidilinositol es iransformado primero a fosfatidilinositol4-fosfato y despuds a fosfatidilinositol 4,5-bis~osfato. Este ultimo es desdoblado en diacilglicerol y trifosfato de inositol por las hormonas quc incrementan [Ca"], por ejemplo, vasopresina. Estos dos productos actúan como segundos mensajeros en la acción hormonal (capítulo 44). En la biosintesis de )a fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolarnina (lecitinas y cefalinas), la colina o la etanolamina deben primero convertirse a "colinaactiva", o a "etanolamina activa", respectivamente. Este es un proceso en dos etapas, que implica primero, una reaccibn con ATP para formar el monofosfato correspondiente, seguida de una reacción con el CTP para formar citidina difosfocolina ( C D P ~ o l i n a o) citidina difosfoetanolmina (C&P+tanolamina). En esta forma, cualquiera de ellas reacciona con el 1,24iacilglicerol de manera que una base fosforilada (ya sea fosfocolina o fosfoetanolamina) es transferida al diacilglicerol para formar fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina, respectivamentc. La citidina transferasa parece ser la enzima que regula la vía de la fosfatidilcolina. Se forma fosfatidilserina a partir de la fosfatidiletanolamina directamente por reaccibn con la serina (figum 26-2). La fosfatidilserina puede volver a formar fosfatidiletanolamina mediante descarboxilacibn. En el higado, una vía alterna permite a la fosfatidiletanolamina dar lugar directamente a rosfatidilcolina, mediante la metilación progresiva de residuo de etanolamina utilizando la S-adenosilmetionina como donador de metilo. A su vez, el grupo metilo de la metionina puede derivar de mefil-Ha fo'Iato(figura 52-1 5). A pesar de estas fuentes de colina, se considera un nutriente esencial en muchas especies de mamíferos, pero esto no se ha establecido en el ser humano. Un fosfolipido presente en las rnitocoridrias es la cardiolipina (difosfa~idilglicerol;figura 16-1 0). Se forma de fosfatidilglicerol, el cual a su vez se ha sintetizado de CDP-diacilg!icerol (figura 26-21 y glicerol 3-fosfato de acuerdo al esquema mostrado en la figura 26-3. La cardiolipina, ubicada en la membrana interior de la mitocondria, se requiere de manera específica para el funcionamiento del transportador de fosfazo y para la actividad de la citocromooxidasa.
C. Biosíntesis de fosfolipidos de glicerol éter Al parecer esta via se encuentra ubicada de manera exclusiva en los peroxisomas. El fosfato de dihidroxiacetons es el precursor del residuo fosfolípidos de glicerol &ter(figura 264). Este compuesto se combina con la acil-CoA para dar 1-acil4ihidroxiacetona fosfato. Se lleva a cabo una reacción de intercambio entre el grupo acilo y un alcohol de cadena larga para dar I -alquildihidroxiacetonafosfato(que contiene el enlace éter), el ciral en presencia de NA DPH se convierte a 1 -alquil-glicerol-3-focfato. Despues de acilacion ulterior en la posición 2, el 1 -alquil-2-acilglicerol-3-fosfato resultante (anhlogo al fosfatidato en la figura 26-2) es hidrolizado para dar el derivado del glicerol libre. Los p l a s m a lbgenos se forman por desaturación del derivado analogo 3-fosfoetanolamina (figura 2 6 4 ) . Gran parte de los fosfolipidos de las mitocondrias con plasmalbgenos. El factor de activacibn plaquetaria (PAF) se sintetiza a partir del derivado 3-fosfocolina correspondiente y ha sido identificado como 1-alquil-2-acetil-.~n-g1icerol-3fosfocolina. Los sintetizan muchas de las ctlulas y otros tejidos y causa agregación plaquetaria a concentraciones tan bajas de hasta lo-'' rnolk. También tiene propiedades hipotensoras y ulcerogenicas.e interviene en diversas respuesta biológicas incluyendo quimiotaxis y fosforilación de proteinas.
Las fosfolipasas permiten la degradación y remodelación de fosfogliceroles La degradación de muchas moléculas complejas en los tejidos es completa, por ejemplo, de proteínas a
Fosfatidilglicerofosfato
I
Fosfatidilglicerol
CMP Cardiolipina (difosfatidilgliceroi}
Figura 263. Biosintesic de la cardiolipina.
O H,COH
Acyi-COA
I
II HIC-O-C-R,
Al-ECHIIi- OH
NADPH +H'
NADP'
HiC-O-ICHiIl-R>
H,C-O-ICH~I~-R
I HO-C-H
---
HCIOr-R
O bI
H,C -O- ICH,I, I
- R,
C-O-C-H
&o-@
-a+cH2-NI
,-~p
1-Alquilgiiceroi 3-fosfatc
Fosfata de
Fosfato de 1-acildihidroxiaceton6
Fosfato de dihidroxiacetona
1-alqurldihidroxiacetona
Acil-COA
ACILTRANS.~
G
CDP-Etanolamina?
O H
R,-C -O-C-H
H,C-O-rCH,I,-R, I
RS-C-O -C-H
r
FOSFOHlbROMSA
H;C-OH
1
H?&-O
-@
1-Alquil. 2-acilgliceml 3-fosfato
FOSFOCOLIND~AC~LGLICEROL
Alquil. d~acilgiiceroies
TRANSFERASA
1-Alquil, 2-acilglicerol 3-fosfocolina
Colina Acetil-C*
\
1- ~ ~ q u i2-fisogltcerol f. 3-fosíom~ina
Coiina 1-Alquil. 2-acetilglkerol 3-fosfomlina
PAF
Figura 2 6 4 . Biosíntesis de éteres lipídicoc, plasmalogenos y del factor activador de plaquetac (PAF). En la vía de novo para sintesis de PAF, aoettl-COA se incorpora en la etapa", evitando los dos ultimos pasos de la vía que se muestra aqul.
aminoscidos. Por tanto, puede determinarse un tiempo de recambio para dicha rnolecula. Aunque los fosfolipidos son degradados activamente, cada porción de la molécula se recambia a una velocidad distinta; por ejemplo, el tiempo de recambio del grupo fosfato es diferente del tiempo de recambio del grupo l-acilo. Esto se debe a la presencia de enzimas que permiten la degradación parcial seguida por nueva slntesis (figura 26-5). La fosfolipasa A2 cataliza la hidrblisis del enlace dster en ta posicibn 2 de los glicerofosfolípid~spara formar un hcido graso libre y un Iisofosfolipido, los cuales pueden ser reacilados por Ia acil-COA en presencia de una aciltransferasa. De manera alterna, el lisofosfolípido (como [a lisolecitina) es atacado por la lisofosfolipasa (fosfolipasa B), eliminando el grupo 1-acilo residual y
formando la base glicerilfosforilo correspondiente, la cuat a su vez puede ser fragmentado poruna bidrolasa, liberando glicerol 3-fosfato mas una base. La fosfolipasa Ai ataca el enlace éster en la posicion 1 mientras que la fosfolipasa Az ataca el enlace en la posición 2 de los fosfolipidos (figura 2 6 4 ) . La fosfolipasa C ataca el enlace éster en la posición 3, liberando 1,2diacilglicerol miis una base fosforilo. Es una de la principales toxinas secretadas por bacterias. La iosfolipasa D es una enzima descrita principalmente en los vegetales, que hidroliza la base nitrogenada de los fosfolipidos. La IisoIecitina puede formarse mediante una vla alterna que involucra a la Lecitin:colesterol aciltransfcrasa (LCAT, del ingles, 1ecitin:cholestesol ucyltran.$era,~e). Esta enzima, que se: encuentra en el
plasma y es sintetizada en el hígado, cataliza la trmsferencia de un residuo de Acido graso de la posición 2 de la lecitina al colesterol para formar éster de colesterilo y se considera la causa de gran parte del &ter de colesterilo de las lipoproteinas del plasma. Idas consecuencias de la deficiencia de LCAT se describen en el cuadro 28-1. LEClflN:
COLESTEROL ACILTRANSFERASA
ACII-CQA
H,; - O
-@-
Lecitina + Colesterol P colina
Lisolecitina + Éster de colesterilo
Lisofusfatidilcolina (lisolecitina)
H,$-OH HO - C- H 4
H,C
-0 -L@-
Colina
Glicerilfoslocolina
t H,C
1
- OH
HO-C-H I
H,C
-0-e,
+
Se encuentran icidosgrasos saturados de cadena larga predominantemente en la posición 1 de los fosfoliptdos, mientras que los acidos poliinsaturados (por ejemplo, los precursores de las prostaglandinas) se incorporan mis en la posicitrn 2. La incorporacibn de los Bcidos grasoc a la lecitina tiene lugar por Ia sintesis completa del fosfolipido, mediante la transacilacion entre el ester colesterilo y la lisolecitina, y por acilacidn directa de lisolecitina por la acil-CoA. Por tanto, es posible un intercambio continuo de los Qcidos grasos, particularmente en relación con la introducciiin de hcidos grasos esenciales al interior de las molécuIas de fosfolípidos.
Colma
sn-Glicerol 3-fosfate
Figura 26-5. Metabolismo de la fosfatidilcolina (lecitina).
LTO FOSFOLIPASA A i
1 FOSFOLIPACA A ~ A
Figura 26-6, Sitios de la actividad hidrotitica de las fosfolipasas sobre un sustrato fosfolipido.
TODOS LOS ESF~NGOL~P~DOS SE FORMAN DE CERAMIDA La ceramida (figura 26-7), se sintetiza en el retículo endoplásmico. Primero, el aminohcido serina se activa mediante cornbinacibn con fosfato de piridoxal, se combina con palmitoil-COA para formar 3-cetoesfingonina. A su vez, este se convierte en dihidroesfingosina en un paso reductor que utiliza NADPH. Por una combinación con acil-COA, se forma dihidroceramida, seguida por desaturacihn para originar ceramida. Hay evidencia de que la cerarnida puede actuar como un mediador lipido (segundo mensajero), mediante la activacibn de una proteina cinasa y. por oposicihn, a algunas de las acciones del diacilglicerol (capítulo 44). El grupo acilo se presenta con frecuencia por cadenas largas saturadas o ficidos monoenoicos. Las esfingomielinas san fosfolípidos (figura 16-1 7) y se forman cuando la ceramida reacciona con fosfatidi! colina para formar esfingomielina más diacilglicerol (figura 26-8). Esto se !leva a cabo principalmente en el aparato de Golgi y en menor grado en la membrana plásrnica. En los organelos que participan en los procesos secretorios y endociticos, la esfingomielina está restringida a la región luminal.
Metabolismo de acilgliceroles y esfingolípidos 0 293
II
-
CH3-(CH,),,-C S -COA Palmitoil-COA
i_
I W O C - CH - CH,Serina
2
Fosfato de piridoxal, ~
n ~ '
NHj 3-Cstcesfinganina NADPH + Ht
3-CETOESFINGANINA NADP+
OH
NW;
I Dihidmesfingosina(esfinganina)
A~yl-COA
COA SH CH3-/CH,),,-CH2-CH,-
CH-CH
I
l
OH
-CH,-OH
NH-CO-R
Dihidroceramida
Figura 26-7. Bioslntesis de la ceramida.
OH
Los glucoesfingolípidos son una combinación de ceramida con uno o mas residuos de azúcar Es típico que los hcidos grasos de muchos glucoesfingolípidos sean C24,en particular en el cerebro (ácidos lignocérico, cerebrbnicoy nervhnico). El Bcido lignt>cérico (C23H47COOH) es sintetizado completamente a partir de acetil-COA. Por su parte, eE hcido cerebrónico, que es el derivado Z-hidroxi de! Bcido lignodrico, se forma a partir de &te. Por Último, el ácido nervhnico (C23H45COOH)run Iicido monoinsaturado, se sintetiza por alargamiento del ácido oleico. Los glucoesfingolipidos mas sencillos (cerebrásidos) son galactosilceramida (GalCer) y glucosilceramida (GIcCer). La GlcCer es un llpido importante de la mielina, en tanto que GlcCer es el glucoesfingol ipido principal de los tejidos extraneurales y un precursor de la mayoría de los glucoesfingolipidos más complejos. La difosfato de uridina y galactosa epimerasa (figura 26-9) utiliza la difosfato de glucosa de uridina (UDPGlc) como sustrato y epimeriza la fiacci6n de gtucosa en galactosa, formando asi difosfato de galactosa de uridina [UDPGal). La reacción en el cerebro es semejante a la descrita cn la figura 22-6 para el higado y la glándula mamaria. La galactosilceramida es sintetiada en una reacción entre ceramida y UDPGal. La sulfogalactosilceramida se formadesp d s de reaccionar con e1 31-fosfoadenosina-51-fosfosulfato (PAPS; "sulfato activo"). El PAPS interviene tambikn en la biosintesis de otros sulfolipidos, es decir, los sulfo(galacto)gtuccrolipidos y los sulfatos de esteroides. Los gangliúsidos son sintetizados a partir de la ceramida por la adicibn escalonada de azúcares activados (por ejemplo, UDPGlc y UDPGal) y un Acido sihlico, por 10 general el iicido N-mcetilneliramlnico (figura 26-10). Puede formarse un gran número de ganglibsidos de peso mdecular creciente. La mayoría de las enzirnas que transfieren los anjcares desde los nucledtidos (gIucosil transferasas) se encuentran en el aparato de Golgi.
UDPGlc
11-
Cerada
Esiingornielina
UDPGal Ceramida
Fosfatidilcolina
UDP
PAPs
Sulfogalactosil ceramida (sulfatido)
Diacilglicerol
Figura 26-8. Bioslntesis de esfingomielina.
Figura 26-9. Biocíntesic de galactosilceramida y su sulfo derivado (PAPS, "cuifato activo", focfoadenosina-5'-fosfosulfato.)
UDPGlc
Ceramida
UDP
\ /"
< f,
UDPGal GIUCOSII ceramida (Cer-Glc)
UDP
CMP-NeuAc
Cer-GIc-Gal
\
CMP
) , = Cer-Glc-Gal I NeuAc
UDP-N acetil galadosamina
(D;
Gangliósidos superiores(disiaio y trisialogangliósidos)
Cer-Glc-Gal-C~INAGG~I
I
NeuAc (GM~)
7Ga1
"Dp
4
Cet-Glc-GaCGaiiu~c I NeuAC (GMZ)
Figura 26-10. Biosíntesis de ganglibsidos (NeuAc, ácido N-acetilneurárnico.)
Los glucoesfingolipidos son constituyentes de la capa exterior de la membrana plasmática, y pueden ser importantes en la comunicación y el contacto intercelufar. Algunos son antigenos, por ejemplo, el anzígeno de Forssman y las sustancias de los grupos sanguineos ABO. Cadenas semejantes de oligosacáridos son constituyentes de las glucoproteinas de la membrana plasmática. Ciertos ganglibsidos actúan como receptores de toxinas bacterianas (por ejemplo, para la toxina del cblera, la cual de manera subsecuente activa a la adenilato ciclaca).
La deficiencia de surfactante pulmonar causa el síndrome de insuficiencia respiratoria El surfactante pulmonar es una secrecion con propiedades notables de tensoactivo, que se compone en gran parte de lipidos con cantidades pequeñas de proteinas y carbohidratos, el cual evita el colapso de los alveolos. La actividad del surfactante se atribuye principalmente a la presencia de un fosfolípido, la digalmitoilfosfittidilcolina, cuya síntesis comienza poco después del nacimiento en los lactante5 a tdrmino. La deficiencia pulmonar de surfactante en los pulmones de recién nacidos prematuros da origen al sindrorne de insuficiencia respiratoria. La administración de surfactante natural o artificial tiene beneficios terap6uticos.
Los fosfolipidos y los esfingolípidos contribuyen a la esclerosis múltiple y a la lipidosis Ciertas enfermedades se caracterizan por cantidades anormales de estos lipidos en los tejidos, a menudo en e! sistema nervioso. Pueden clasificarse en dos gmpos: 1) enfermedades desmiclinizantes verdaderas, 2) esfingolipidosis. En la esclerosis múltiple, que es una enfermedad desmiel inizante, hay pérdida de fosfol ipidoc (en particutar det plasmalbgeno etanolamina) y de esfingolipidos de la sustancia blanca, al grado que su composición se asemeja a la de la sustancia gris. Se pueden enconh-ar dsteres de colesterilo en la sustancia blanca, aunque por lo común es& ausentes. El liquido cefalorraquideo muestra elevadas cifras de fosfolipidos. La esfingolipidosis constituye un grupo de enfermedades hereditarias, que a menudo se manifiestan en la niAez. Estos padecimientos son parte de un grupo mayor de trastornos de los lisosomas. Las enfermedades por almacenamiento de lipidos muestran diversas características constantes: 1) En varios tejidos, hay una acumulación de lipidos cemplejos que tienen una porción de su estmctura en comijn, una ceramida. 2) La velocidad de síntesis del lipido almacenado es comparable a la de las personas normales. 3 ) EE defecto enzimático en cada una de estas enfermedades es una deficiencia ~pecfficade una enzima lkodmica hidrolitica necesaria para degradar al lipido. 4) El grado en que se encuentra disminuida
Metabolismo de aciiglicerolesy ~sfingolipidos 29 7
la actividad de la enzima afectada, es semejante en todos los tejidos de la persona enferma. Como resultado de estas consideraciones básicas unificadoras, se han creado procedimientos para ei diagnóstico de pacientes con estos padecimientos. Asimismo. ahora es posible descubrir a los portadores heterocigotos de las anormaIidades geneticas quc producen estos padecimientos, al igual que detectar en el feto la presencia de esfingolipodistrofia. Durante muchos afios se ha intentado la terapéutica de restituciiin de enzimas con escaso éxito; sin embargo, en época reciente, se han logrado tratamientos exitosos con enzimas cuya estructura química se han modificado para asegurar su fijacibn a los receptores de las células blanco, antes de endocitosis mediada por el receptor, por ejemplo, a los macrdfagos en el higado para entregar beta glucocidasa (glucocerebrocidasa) en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher. En la actualidad la terapiutica génica para los trastornos lisos6micos se encuentra en investigacibn. En el cuadro 26-1 se muestra un resumen de las lipidosis más importantes.
La deficiencia multiplc dc sulfatasa conduce a la acumulaci6n de sulf~galactosflceramida, los sulfaros de esteroides y peptidoglricanos, debido a una deficiencia combinada de las arilsulfatasas A, 3 y C y de esteroides sulfatasa (cuadro 5 7 4 ) .
RESUMEN 1) Los triacilgliceroles son los principales encargados del almacenaje de lipidos, en tanto que los fosfogliceroles, esfingomielina y glucoesfingolipidos son anfipáticos y cubren numerosas actividades, que van desde funciones estructurales en las membranas celulares a acciones especializadas; por ejernplo, precursores de segundos mensajeros para hormonas, surfactante pulnionar y factor activador de plaquetas (PAF). 2) Los triacilgficeroles y algunos fosfogliceroles se sintetizan por acilación progresiva de glicerol 3fosfato. La vía se bifurca a fosfatidato, que forma
Cuadro 2!6-1- Eje1mplos de esfingoliliidosis
..-
-
- .-----
.
zima deficientc
Enfer
. . . --
- -. -
.
Lipidii acumula -A-
- .
-
:r4ilc4aINAc4al-Fuc
ticidad mu:icular, piel gruesa
j 1Retraqo niental. crecimiento
Gai
generaiizac
nglihsido -:eTay-Sacl2s
Hexosamidinase
WJ~cIngliósido ~ 4 1 ~ 4 obósido m
I Variante d e enlerme Tay-Sachs de Sandho
: 1irn6tirn .-,-..--, deformación ' I tRetraso m
esque-
ental, cegilera debi-
lidad rnmusciilar
Enfermedad de Fabry -m,-
Cei-amida lact
nida lactc
:r-Glc4al Ceramida Iacthsidc
..
-Iinidmi<
Daao ccrcbral progre';ivo, creci, miento del hígado y brazn--
Cei
mida e Krabbc
Jalactosid;iea
Enfermeaaa ae ciaucner
1
~r
elina casi
neta-Glucosidas; ie les hur:sos largo S, retraso nentaI en 1:actantes
Enfermedad de NiemannP;,.L
e Farher
ina
lazo crecidos: retraso
:1 ,:,
&*I*l
osina a
L~~~~~ ubi
:A---
A-
1-
aermariris, deformabJqueleto, retraso men---
NeuAc = Ácido :Ir-acetilneuraminico: Cer = cernida; Glc = glucosa, Cid = galactosa; Fuc, 1
..A-,
"
.
Sitio de reaccibn enzrmática deficiente.
fosfolipidos de inositol y cardiolipina por un lado y triacilglicerol, colina y fosfolipidos de etanolamina, por otro. 3) Los plasmalhgenos y el PAF son éteres de fosfolípidos formados por acilación y alquilacion del fosfato de dihidroxiacetona. 4) Todos los esfingolípidos se forman de ceramida (N-acilesfingosina). La esfingomielina es un fosfolipido que se encuentra de manera típica en las membranas de los organelos que se ocupan de los procesos secre~orios(por ejemplo, aparato de Golgi). Los glucoesfingo~ipidosmás simples son una combinación de ceramída más un residuo anicar (por ejemplo, GalCer en la rnielina). Los gangliósidos
son glucoesfingollpidos rnbs complejos que contienen un número mayor de residuos azúcar más ácido siálico. Se encuentran en la capa externa de la membrana plasmatica, donde contribuyen al glucochliz y son importantes como antígenos y receptores celulares. S) Los fosfolipidos y esfingolipidos intervienen en varios procesos patol&gicos,incluyendo el sindrome de insuficiencia respiratoria (carencia de surfactante pulmonar), a esclerosis múltiple (desmielinización) y la esfingolipidosis(incapacidad para degradar esfingolipidos en los lisosornas debido a alteraciones hereditarias de enzirnas hidrolasas). I
REFERENCIAS Hannun YA: The sphingomyelin cycle and second messcnger function of ceramidc. J R i o l C h e m 1994269 3125. Aasthorne J N , Ansell GB (editors): Phospholipids. Elscvier. 1982. Koval M, Pagano RE: Intracellular transport and metabolism of sphingomyelin. Biochirn Biophys Acta
1991;1082:13. Neufeld EF: L) sosemal ctorage discases. Annu Rev Riochem t 991;60:257. Scriver CR et al. (editors): The ,WetaboJic and .MoIecular Bases of lnheriied Disease, 7th ed. McGraw-llill, 1995. Snyder F: Platelct-activating factor and related acetylated Iipids as potent biologically active cellular mediators. Am J Physiol 1990;259:C697.
Tijburg LBM, Geelen IWJH, van Golde LMC: Regulation o[ the biosynihesis of triacylgliccrol, phosphatidylcholine and pliosphatidyEcthanolamine in the
liver. Riochim Biophys Acta 1989;1004.1. Vance DE, Vance JE (editors): Metabolism o f trracyl-
glycerols; phospholipid metabolism; ether-linked glycerolipids; sphingolipids. In: Riochemistp of Ltpids and Hormones Henjamin/Cummings, 1985. van Echten G, Sandohoff K: Ganglioside metabolisrn. J Riol Chem 1993;2h8:5341. VanGolde LMG, Batenburg JJ, Robertson B: The pulmonary surfactant system. biochemical aspccts and functional significance. Physiol Rev 1988:68:374.
Transporte y aIrnacenamiento de Iipidos Peter A. Mayes, PhD, DSc
Las grasas absorbidas a partir de la alimentación y 10s lipidos sintetizados por el hígado y el tejido adiposo deben ser transportados a los diversos tejidos y organos para su utilizacién y almacenamiento. Dado que los lípidos son insolubles en el agua, es un problemael transporte en unmedio acuosocomo el plasma sangnineo. La solucibn consiste en asociar lípidos no polares (triacilglicerol y esteres de colesterilo) con lipidos anfipáticos (fosfolipidos y colesterol) y protefnas, para formar lipoproteinas rniscibles en agua.
AGL y la subutilizacilin de quilomicrones y VLDL lo cual provoca hipertriacilglicerolemia. La mayor parte de tos demás trastornos patoIbgicos que afectan al transporte lipidico, se deben de manera primaria a defectos hereditarios en la sintesis de la porcion apoproteinica de la lipoproteina, de las enzimas clave o de [os receptores de lipoproteinas. Algunos de estos defectos causan hipercolesterolemia y aterosclerosis prematura. Los depbsitos excesivos de grasa producen la obesidad. En particular, la obesidad abdominal es un factor de riesgo para aumentos en la mortalidad. hipertensibn, diabetes sacarina n o insulinodependiente (DSNID), hiperlipidemia, hiperglucemia y varias disfunciones endocrinas.
IMPORTANCIA BIOMEDICA En un ornnivoro consumidor de carne como el ser humano, se ingieren catorias en exceso en la fase anabólica del ciclo alimentario, seguido por un periodo de equilibrio calórico negativa en que el organismo utiliza sus reservas de carbohidrato5 y grasas. Las lipoproteinas median este ciclo transportando a los Iípidos del intestino como quilomicroncs y a los hephticos como lipoproteinas de muy baja densidad (VLDL}, para su oxidacibn en gran parte de los tejidos y al tejido adiposo para su almacenamiento. Los lipidos son movilizados de este último tejido como ácidos grasos libres (AGL) fi-jadosa la albúmina sérica. Las anormalidadesdel metabolicino de los lipidos se presentan en los sitios de producción o en los deutilización de las lipoproteinas, causando varios tipos de hipo e hiperlipoproteinemias. La más común es la diabetes sacarina, donde la deficiencia de insulina causa la movilízacibn excesiva de
LOS L~PIDOSSON TRANSPORTADOS EN EL PLASMA COMO LIPOPROTE~NAS
Existen cuatro grupos principales de Iípidos en las lipoproteinas La extraccion de los Iípidos del plasma con un solvente adecuado para lipidos y la subsiguiente separación del extracto en diversas clases de lipidos, muestra la presencia de triacilgliceroles, fasfollpidos, colesterol y &eres de colesterilo, además de una muy pequeiía fraccibn de ricidoc grasos de cadena larga no esterificados (acidos grasos libres} que cuman menos de 5% del total de ácidos grasos presentes en el plasma (cuadro 27-11. Se sabe ahora que esta última fracción, los hcidos grasos libres (AGL), son los Iipidos plasmaticos más activos en el metabolismo.
Se han identificado cuatro grupos principales de lipoproteínas plasmáticas
Cuadro 27-1. Llpidos del plasma sanguíneo
[meu'uF
Triacilglicerol Total de fosfolipidoc* -
Tot
:erol irc (no este1
C -
~ c i a o grasos s libres (no estcrifi- O cados)
0.2 a O.ht
I
-
El total de acidos grasos.45% son fnsfolipidos. 1 Soh Esteres de colesterilo y menos de 3% de ácidos graso5 libres. Est os limites pueden ex 1 sit~iacionesansormales o 1~atolhgicas )
* Analizado como fhqtoro lir1A;rn ' Varia con el estado niitricii
La grasa pura es menos densa que el agua; de esto se deduce que cuanda la proporción de lipidos a proteina aumenta en las lipoproteínas, Ia densidad disminuye (cuadro 27-2). Esta propiedad se utiliza para separar a las diversas Iipoproteinas plasmhticas mediante ultracentrifugacibn. La composición de las diversas fracciones lipoproteinicas obtenidas por ultmcentrifugación se muestra en el cuadro 27-2. Se ha observado que concurren varias clases de compuestos químicos en cantidades diferentes en la mayoria de las fracciones lipoproteinicac. Dado que las fracciones representan las entidades fisiologicac presentes en el plasma, el anhlisis químico simple de los lípidos plasmtiticos (sin incluir los AGL) aporta escasa informacibn sobre su función fisiológica. Sin contar los AGL, se han identificado cuavo grupos mayores de lipoproteinas fisiológicamente importantes y Útiles en el diagnostico clínico. Estos son: 1) q u ilom icrones, derivados de la absorción intestinal
Cuadro 27-2. Composicibn de las lipoproteinas en el niasma human
-
=====e--
Y-
,,, . ...
imposición
..
m
:I total de Ilipidos
1 UlZll
foli-
Qu i lomicroncs Intestinc L ~ioproteina F s Hígado
dr* co-
0.95
a l.OOh 2
ae muy naja (intestinr 3
.
densidad (VI,DL)
Lipoproteínas de densidad
intermedia
je'alta der sidad VLDL kli-1 lornicroines
Al1juminaAGL -
* Una unidad Sf (Svedberg) es igud a 1Ux" ACiL. kidos
t
-
crn/seg!dina/g a 16 'C libres. VHDL (lipoproteinasj :muy alta dewidad) es una fritccihn mnor que se encuenh a una densidad de enbe 1.21 y 1.25.
de triacilgEiceroles; 2) lipoproteinas d e muy baja densidad (VLDL o prebetalipoproteínas), derivadas del hígado para exportar los triacilgliceroles; 3) lipoproteínas de baja densidad (LDL, o betalipoproteínac). que representan una etapa final en el catabolismo de VLDL; y 4) lipoproteínas de alta densidad ([HDL] o alfa lipoproteínas), que intervienen en el metaboSismo de las VLDL y los quilomicrones y tambitn en el transporte del colesterol. El triacilglicerol es el lipido predominante en !os quilomicrones y en las VLDL,.cn tanto que el colesterol y los fosfolipidos predominan en las LDL y HDL, respectivamente (cuadro 27-2). A d e m b del uso de técnicas que dependen de su densidad, las lipoproteinas pueden separarse por sus propiedades electraforkticas en alfa, beta y prebetalipoproteinas (figura 27-1) y se identifican con mayor precisión por medio de inmunoelectroforesis.
Los Iípidos anfipáticos son componentes esenciales de las lipoproteinas Una Iipoprotelna tlpica - c o m o quilomicrones o VLDL- consiste en un nUcleo Iipidico formado en gm parte de triaciIglicero1no polar y Éster de colesterilo rodeado por una sola capa superficial de moléculas de fosfolípido anfipatico y colesterol. Estas se orientan de modo que sus grupos polares se enfrentan al medio acuoso, como en la membrana celular(capitu1o 16). La fraccidn proteinica de las tipoproteinas se conoce como una apolipoproteina o apoprotelna y constituye casi 60% de algunas HDL y sólo 1% de los quilomicrones. Algunas apoproteinas son integrales y no pueden ser removidas, en tanto que otras pueden ser transferidas con libertad a otras lipoproteinas (figura 27-2).
Densidad
Figura 27-1. Ceparacibn de Iipopmteínas del plasma por ekctroforesis en gel de agarosa.
Aproproteina periférim (por ejemplo, apo C)
Iipidos no polares principalmente
qzj:si Apoproteína
lipidos anfipaticos principalmente
Fígura 2 7 3 . Estructura generalizada de una lipoproteína plasm8tica. Se notan las semejanzas con la estructura de la membrana plasmhtica. Una pequefia cantidad de éster de colesterilo y tnacilglicerof, se encuentran en la capa cuperficial y algo del colesterol libre se ubica en el núcleo.
La distribución de apolipoproteinas caracteriza a la lipoproteína En cada lipoproteina hay una o mhs apolipoproteínas (proteínas o polipéptidoc). De acuerdo a la nomenclatura ABC, la apolipoproteina mayor de HDL (alfa lipoproteina) se designa A. La apoIipoproteina principal de LDL (beta lipoproteina) se designa B y también se encuentra en VLDL y quilomicrones. Sin embargo, Ia apo R de los quilomicrones ( B 4 g ) es m8s pequ&a que la apo B-l O0 de LDL o VLDL. La B 4 8 es sintetizñda en el intestino y B-l M) en el hígado. (Al parecer, en el higado de rata se f m a B-48 además de B-100.) La apo E-1 00 es 1a cadena polipeptidica sencilla más larga que se conoce, pues tiene 4536 arninoácidos. La apo B-48 (con 48% de la longitud de B-100) se sintetiza del mismo mRNA como apo E-100. Aparentemente, en el intestino, un codbn de detencibn que no está presente en el DNA genómico, se introduce por un mecanismo editor del RNA que detiene la traslación en el residuo aminoacidico~2153para liberar la apo B 4 O . Las apolipoproteinas C-1, C-II y C-111 son los polipkptidos más pequefios que se transfieren libremente entre varias lipoproteínas diferentes (cuadro 27-3). La apo B tiene un contenido aproximado de 5% de carbohidratosque incluyen manosa, galactosa, fucosa, glucosa, glucosarnina y ácido sialico. Por tanto, algunas lipoproteinas son también gliicoproteínas. En las lipoproteínas plasrnhticac se han cncon-
302
(Capítulo 27)
Bioquímica de Hurper
Cuadro 27-3. Apoproteinas de las lipoproteinas del plasma hurnan. - -- -- .--. .- . . --
Lipo proteína
polipopro .
[
--
-. . .-
.-----
s adiciona les
(Da)
ctiva~~ora ae
11,. quilom icrnnes
Apo A-
- .-
.-. -
FMasa mole
la ~ecitin:co~cstero~ aclltransrasa fl,CA'r).Ligandc1 para cirer:eptor HI31, p
.
L
.
A
-
.
ra Ia fornTan dos n?onómeros énticos uinidos por un puente disul ruro. -h:L:,l*~
V
Apo B-1
1
Sei:retado ccIn Pel.o
,.
1 C' A T'I
sociado co n la forma civn de tri acilglicero :o en lipolprotcinas. I'uncilin di:scnnocida
quilami
sc transfiere a I,IDL
n+at;"nA.. IILc.LIL.UUU
rinr
en el higr
IDL
1
nl ;nt,.r1 LII~V~J~I~O - - .CI
-
ao para e1
1, Apa B 4
,,,,,,,,,,
,,.
.uLk,nnnicrones
nanentcs Apo C-
iLCAT
mes
Apo C-1
.DL, HDL, q u i i v i i r r - i ,
ctivadnrn de Ia lipoproteinn lipa,
Apa C-1
,DL, HDL,
ariac. form;is polimórlTeas dcpendiendo del intenido dr:ácidos sialicos ucde actuar como proteina ae transferencia
Apo D
le HDL
: Iípidas -
Apo E
.DL: HDZ ilomicrnne
- . -
trado otras apolipoprotelnas. Una es la apolipoproteina E, rica en arginina, aislada de las VLDL y HDL; su contenido en arginina ec hasta de 10% del total de aminoacidoc y representa de 5 a 10% de las apolipoproteinas VLDL totales en personas normales, aunque existe en exceso en el espectro de las beta VLDL de pacientes con hiperlipoproteinemia tipo 111. Las apolipoproteinac tienen varias acciones: 1) Son cofactores de enzimas; por ejemplo, C-11 para lipoproteina lipasa, A-1 para lecitin:colesterol aciftrancferasa. 2) Pueden actuar como Iípidos para transferir proteinas. 3 ) Sirven como ligandos para interaccionar con receptores de lipoproteinas en los tejidos, por ejemplo, apo B-100, apo E para el receptor LDL, apo E para el receptor remanente y apo A-1 para el receptor de HDL.
LOS ÁCIDOS GRASOS LIBRES SE METABOLIZAN CON SUMA RAPIDEZ Los ácidos grasoc libres (AGL, hcidos grasos no esterificados, Bcidos grasos inesterificados) aparecen
(1-VLDI 1 inemia tipc .-,-,.A.e animales con hiperc~ iia inducid:3. nr de rema 3r la dicta. Ligando 1: do y para e 1 rntcs de qii ilomicrtine .-.. 1 receptor de LUL
resente en t s con hipt
is
en el plasma a partir de la lipblisis de los triacilgliceroles en el tejido adiposo o como resultado de la accibn de la lipoproteina lipasa durante la incorporación en los tejidos de los triacilgliceroles plasmaticos. Se encuenzran combinados con la albúmina del suera en concentraciones variables entre 0.1 y 2 pEq/mL del plasma y comprenden a los hcidos grasos de cadena larga que se encuentran en el tejido adiposo, es decir, acidos palrnitico, estclirico, oleico, palmitoleico, Iinoleico, otros Acidos poliinsaturados y cantidades mas pequeiías de otros Acidoc grasos de cadena larga. Se han descrito sitios de unión sobre la albúmina, de afinidad variable para los ácidos grasos. Se registran valores bajos de hcidos grasos libres en el plasma en estado de alimentacidn completa, elevándose a cerca de 0.5 pEqlmL en la posabsorción y entre 0.7 y 0.8 pEqlmL en el ayuno total. En la diabetes sacarina no controlada, la cifra puede elevarse a 2 pEqlmL. El valor cae inmediatamente después de comer y sube otra vez antes de la siguiente comida; mientras que en los que se alimentan de manera continua como los rumiantes, en donde hay constante afluencia de nutrientes a partir del intestino, los ácidos grasos libres permanecen eszables en un valor ba,jo.
Transuorfe y almacenamiento de linido,~ 303
La velocidad de eliminación de ácidos grasos libres de la sangre es muy rápida. Parte de la captacihn se oxida y suministra alrededor de 25 a 50% de los requerimientos energéticos durante el ayuno. El resto de la incorporación es esterificada. En la inanición, se oxida una cantidad de grasa considerablemente mayor de la que puede ser atribuida a la oxidacion de los acidos grasos libres. Esta diferencia se puede explicar por la oxidación de kipidos esterificados circulantes o de !os presentes en los tejidos. Se cree que Eo último e n particular se presenta en el corazón y el músculo esquelCtico, donde se encuentran depósitos considerables de lipidos en las células musculares. El recambio de ácidos grasos libres está directamente relacionado con su concentraci6n. Así, la velocidad de producción de ácidos &rasos libres en el tejido adiposo controla su concentraci6n en e[ plasma, la cual a su vez determina su captación por otros tejidos. El estado de nutriciiin no parece tener un gran efecto sobre la incorporacibn Fraccionada de los hcidos grasos libres por tos tejidos. Sin embargo, altera la proporción de la cantidad que es oxidada comparada con la fraccién que es esterificada, siendo mayor la oxidaci6n en el estado de ayuno que en el de nutrición. DesputSs de la disociacion del complejo Iicido grasoalbúmina en la membrana plasmiitica, tos ácidos gmsos se unen a una proteina membrana1 fijadora de Acidas grasos que actúa como un comansportador transrnembrana con Na'. Al entrar al citosol, los acidos grasos libres son retenidos por una proteína fijadora de Bcidos grasos o proteína Z. Se piensa que la función de ksta en el transporte intracelular es semejante al de la albúmina serica en el transporte extracelular de los ácidos grasos de cadena larga.
LOS TRIACILGLICEROLES SE TRANSPORTAN DESDE EL INTESTINO EN QUILOMICRONES Y DESDE EL H~GADOEN LIPOPROTE~NAS DE MUY BAJA DENSIDAD Por definición, los quilomicrones se encuentran en el quilo formado sólo por el sistema linfatico que drena el intestino. Se ocupan del transporte de todos los Iipidos diet6ticos en la circulaci6n. Hay partículas m& pequefias y m& densas que tienen características de la VLDL que tarnbikn se encuentran en el quilo. Se forman incluso en estado de ayuno, sus Iípidos derivan principalmente de las secreciones biliares e intestinales. Por otro.lado, la formacibn de quilomicrones aumenta con la carga de triacilglicerol absorbida. La mayoría de las VLDL plasmaticas es de origen hephtico. Ellas son el vehículo de transporte del triacilglicerol desde el hígado hasta los tejidos ex-
nales y el de las VLDL con las células del parénquima hepático (figura 27-3). La apolipoproteína B es sintetizada por los ribosomas en el retículo endopl~smico rugoso y ES incorporada a las lipoproteínas en el retículo endoplasmico liso, que es el principal sitio de sintesis de triacilglicerol. Las lipoproteínas atraviesan el aparato de Golgi donde más lipidoc y residuos de carbohidratos se agregan a la lipoproteina. Se liberan los qiiilomicrones y las VLDL ya sea de la célula intestinal o dc la hephfica por medio de la fusión de la vacuola secretora con la membrana celular {pinocitosis inversa). Los quilomicrones pasan a los espacios entre las células intestinales, abriéndose camino fínalmente hacia el sistema linfático (quiliferos) que drena el intestino. Las VLDL son secretadas por las células del parénquima hepático dentro del espacio de Disse y luego en los sinusoides hepaticos a través de las venranas del revestimiento endotelial. Las similitudes entre los dos procesos y los mecanismos anatómicos son sorprendentes porque, aparte de la glándula marnaria, los tejidos intestinal y hepatico son los únicos desde donde se excretan lipidos particulados. La incapacidad de un lipido particulado del tamafio de los quilomicrones y de las VLDL para pasar a través de las células endoteliales de los capilares sin una hidrolisis previa es probablemente la razbn por la que las grasas de los alimentos entran a la circulación a travks de los linfhticos (conducto torácico) y no por el sistema portal hepático. Aunque tanto los quilomicrones como las VLDL aisladas de la sangre tienen apolipoproteínas C y E, las Iipoproteinac recien secretadas o "nacientes" contienen poca o nada de ella, y pareceria que el cornplemento de polipéptidos de la apoproteina C y E es tomado por transferencia desde l& HDL una vezque los quiIomicrones y las VLDL han entrado en la circulación (figuras 2 7 4 y 27-5). Una descripcidn mas detallada de los factores que controlan la secreción hepática de VLDL se da despds. La apo B es indispensable para la formación de quilomicrones y VLDL. En la abetalipoproteinemia (una enfermedad poco frecuente), la apoB es incapaz de funcionar a causa de un defecto en una proteina transferidora de triacilglicerot que evita la carga de la apo B con lipidos; por tanto, no se forman las lipoproteinas que la contienen y las gotitas de lipidos se acumulan en el intestino y el higado.
LOS QUILOMICRONES Y LAS LIPOPROTE~NASDE MUY BAJA DENSIDAD SON CATABOLIZADAS RÁPIDAMENTE
trahephticos. Hay muchas semejanzas entre el mecanismo de
La depuracibn de la sangre de los quilomicrones marcados es rápida, pues su tiempo medio de desapariciones
fomaci6n de los quilomicrones con las cdlulas intesti-
del orden de minutos en los animales pequefios (como
3 04
A
* Bioauímica de Haraer
(Cmítulo 2 7)
Luz intestinal
B
Capilar sanguineo
Vasos Iinfaticos hacia el mndLicto
torAcico
E Luz del sinusoide sangulneo
Figura 27-3. Forrnacibn y secrecibn de (A) quilomicrones por una célula intestinal y (B) lipoproteinas de muy baja densidad por una dlula hep8tica. (RER, reticule endoplBsmiw rugoso, REL, reticulo endopl~smicoliso, G, aparato de Golgi: N, núcleo, Q , quilomicrones, VLDL, Iipoproteinac de muy baja densidad; E, endotelio, DE, espacio de Disee, que contiene plasma sanguíneo.) El esquema es una representacióndiagramática de sucesos que pueden observarse con microsmpio electrbniw.
Figura 2 7 4 . Destino rnetabdlimde los quilomicrones. (A, apolipoprofeina A; 8-48, apolipoproteina B d 8 ; 0,apolipoproteína C; E, apolipoproteina E; HDL, Iipoproteínasde alta densidad;TG, triaeilglicerol; C, colesterol y éster de colestetilo; P, fosfolípido: LH, Iipasa hephtica.) Se muestran $610 los Ilpidos más importantes
Transporte y alrnaceriamiento de lípidos
305
Figura 2 7 6 . Destino rnetabólico de las Iipoproteinas de muy baja densidad (VLDL) y producción de Iipoprotelnas de baja densidad (LDL) (A, apolipoproteina A: B-100, apolipoproteina B?00; Q, apolipoproteina C; E, apolipoproteina E: HDL, lipoproteina de alta densidad; TG, triacilglicerot; SDL, lipoproteína de densidad rntermedia; C, colesterol y ester de colesterilo: P, fosfolípidos ) Solamente se presentan los Iipidos mas importantes. Es posible que una parte de IDL sea metabolizada por la via del receptor para el remanente de quilomicrbn (apo E).
las ratas), aunque es mas largo en los animales grandes (como en el ser humano), en quienes todavía es menor de una hora. Las particu las más grandes se catabolizan más rapidamente que las mas pequefias. Cuando se administran, por la vía venosa, quilomicrones marcados en los acidos grasos del triacilglicerol, casi 80% de la marca se encuentra en el tejido adiposo, corazón y músculo, y aproximadamente 20% en el hígado. Como los experimentos con organo irrigado han demostrado que el hígado no mesaboliza de manera significativa los quilomicrones o las YLDL locales la marca en el higado debe ser un resultado secundario de su metabolismo en los tejidos extrahepáticos.
Los triacilglicerol de los quilomicrones y las V L D t se hidrolizan por acción de la lipoproteina lipasa Hay una corretacion significativa entre la capacidad de un tejido para incorporar ácidos graso5 de los triacilgliceroles de la lipoproteinas y la actividad de la enzima lipoprotefna lipasa. Se loca!iza en las paredes de los capilares sanguíneos, anclada por ca-
denas de peptidoglucano de sulfato de heparhn y se ha encontrado en extractos de corazhn, tejido adiposo, bazo, pulmdn, meduIa renal, aorta, diafragma, glhndula mamaria en lactancia y en el hígado del recien nacido; no es activa en el del adulto. La sangre noma1 no contiene cantidades apreciables de la enzima; sin embargo, después de una inyeccibn de heparina se libera la lipoproteina lipasa de su enlace al sulfato de heparán y entra en la circulacibn acompañada de la desaparicihn de la lipemia. Tmtiikn del higado se libera una lipasa, la lipasa hephtica, cuando hay grandes cantidades de heparina, pero esta enzima tiene propiedades diferentes de las de la lipoproteina Iipaca y no reacciona facilmente con los quilomicrones. Se encuentraen las células endotelialesdel hígado y se vincula con el quilomicrón remanente y el metabolismo de las HDL. Tanto los fosfolipidas como Ia apolipoproteina C-II se requieren como cofactores para la actividad de la lipoproteína lipasa. La apo C-Fl contiene un sitio específico de fijación de fosfolipido n través del cual se adhiere a la Iipoproteína. Por consiguiente, los quilomicranes y las VLDL proporcionan la enzima para su metabolismo con su sustrato y sus cofactores.
(Capitulo 27)
La hidrdlisis tiene lugar mientras las lipoproteinas esthn adheridas a la enzima en el endotelio. El triacilglicerol es hidrolizado de modo progresivo a travb de un diacilglicerol a iin monoacilglicer~lque finalmente se hidroliza a hcido graso libre y glicerol. Algunos de los Acidos grasos liberados regresan a la circi~lacion,unidos a la albúmina, pero el volumen mayor es transportado al tejido (figuras 2 7 4 y 27-5). La lipoproteína lipasa cardiaca tiene una Kmbaja para el triacilglicerol en tanto que la ICTl de la enzima en el tejido adiposo es 10 veces mayor. Conforme la concentraci~ndel triacilglicerol plasmlitico decrece en la transicion del estado de nutrición al de ayuno. las enzirnas cardiacas permanecen saturadas con sustrato, pero la saturación de la enzima disminuye en el tejido adiposo, con lo cual la captación se redirige del tejido adiposo hacia el corazbn. Un encausamiento semejante se produce d~iranteSa lactancia, en la cual la actividad del te-jido adiposo disminuye y Ia de la glándiila mamarla aumenta, permitiendo la captacibn de triacilglicerol can hcidos grasos de cadena larga, de las lipoprotelnas, para la sintesis de los lipidos lácteos. En tejido adiposo, la insulina incrementa la sintesis de lipoproteína lipasa y su traslado a la superficie luminal del endotelio capilar.
La acción de la lipoproteína lipasa forma lipoproteinas remanentes La reacción con la lipoproteína lipasa conduce a la pérdida de aproximadamente 90% del triacilglicerol de los quilomicrones y a la pérdida de apo C (la cual regresa a HDL) pero no la apo E (la cual es retenida). La IBpoproteina resultante o quilomicr6n remanente tiene un diámetro aproximado de la mitad del quilomimbn precursor y, en tkrrninos de porcentaje, su composicion se enriquece relativamente en colesterol y en Csteres de colesterilo por la perdida de triacilglicerol (figura 2 7 4 ) . Cambios semejantes tienen lugar en las VLDL con la formación de VLDL remanentes o IDL (lipoproteinas d e densidad intermedia; figura 27-5).
El hígado capta las lipoproteínas remanentes Los quilomicrones remanentes son captados por el higado a través de endocitosis mediada por receptor y los Csteres de colesterilo y los triacjlgliceroles son hidrolizados y rnetabolizados. Al parecer, la captacidn es mediada por un receptor específico para apo E (figura 2 7 4 ) . La infomacion actual sugiere que tanto el receptor de LDL (apo B-100, E) y el receptor remanente específico para apo E participan en la captación del remanente. La lipasa hepática tienc una funcion doble: 1) actuar como ligando para la lipoproteina y 2) hidrolizar sus triacilgliceroles y fosfolipidos.
Idos estudios que utilizan VLDL con apo B-100 mascada, han demostrado que las VLDL son precursoras de las IDL y que estas Últimas lo son de las LDL. Solamente una de la apo R-100 esta presente en cada particula de esta lipoproteína y se conserva durante las rransformaciones. Cada pariiculia de LDL deriva de una sola partícula de VLDL (figura 27-5). Dos destinos posibles esperan a IDL. Pueden ser captados de manera directa por el higado a través del receptor para LDL Capo 8-1 00, E) o convertirse en LDL. En la rata, la mayoria de las IDL se captan por cl higado, en tanto que en Ios seres humanos una proporcibn mucho mayor forma LDL, y participa así en la mayor concentración de LDL en éstos en comparación con la rata (y muchos otros marniferos).
LA LDL ES METABOLIZADA POR INTERACCIQN CON SU RECEPTOR A1 parecer, la mayoria de las LDL se forman a partir de las VLDL como se describió, pero existen evidencias de alguna producción efectuadadirectamente por e[ higado. El tiempo promedio de desaparición de la circulación de la apoproteína 0-1 00 en las LDL es d e alrededor de dos días. Los estudios en cultivos de fibroblastos humanos, linfocitos y celulas de músculo liso arteria1 han demostrado la existencia de sitios especiiicos de enlace o receptores para las LDL, los receptores (B-100. E). Se designa asi debido a que es específico para apo B-100, pero no para apo R-48 y bajo ciertas circunstancias captará lipoproteinas ricas en apo E. La Apo E 4 8 carece del dominio carboxilo terminal de B-100 que contiene el ligando para el receptor de LDL. Estos receptores son deficientes en la hipercolesterolemia familiar. Aproximadamente 30% de LDL es degradada en los tejidos extrahepáticos y 70% en el hígado. Existe una correlación positiva entre la frecuencia de la aterosclerosis coronaria y la concentracibn plasmática de LDL. Para descripcibn adicional de la regulación del receptor para LDL, véase capitulo 28.
LAS HDL INTERVIENEN EN EL METABOLISMO DE LOS TR1ACILGLICEROLES Y DEL COLESTEROL Las HDL son sintetizadas y secretadas tanto en el hígado como en el intestina (figura 2 7 4 ) . Sin embargo. las HDL nacientes (recitn secretndas) del intestino no contienen apolipoproteina C o E, solo apolipoproteína A. Así. la apolipoproteina C parece ser sintetizada en el hígado y transferida a las IlDL
Transporte y alrnacenumlento de 1i;aidos* 307
Figura 2 7 4 . Metabolismo de las lipoproteinas de alta densidad (HDL) (LCAT, lecitin:mlesterolaciltransferasa; C, colesterol, EC, Bster de colesterila, PL, fosfolípido; AGL, ácidos grasos libres; A-1, aproproteina A-l.) La figura muestra el papel de las tres enzimas lipasa hep8tica LCAT y LPL en el ciclo de las HDL postulado para el transporte del colesterol desde los tejidos al hígado HD4, HDL3, cuadro 27-2 Además de triacilgliceroles, la lipasa hepática hidroliza fosfolípidos de la superficie de HDL2, liberando colecterol para captación hepatita, lo que permite la formación de HDL3 más pequeños y más densos La actividad de lipasa hepAtica es incrementada por andrbgenos y disminuye por estrógenos, lo cual puede explicar los valores plasmáticos más elevados de HDL2 en mujeres.
intestinales cuando esths entran al plasma. Una funci6n importante de las HDL es actuar como reservorio de las apoproteinas C y E que son requeridas en el metabolismo de quilomicrones y VLDL (figuras 2 7 4 y 27-5). Las HDL nacientes consisten en dobles capas discoides de fosfolipidos que contienen apoproteinas y colesterol libre. Estas lipoproteinas son similares a las partículas encontradas en el plasma de pacientes can deficiencia de la enzima lecitin:colesterol~ciltransderasa (LCAT) y en el plasma de pacientes con ictericia obstructiva. La LCAT y la apolipoproteina activadora A-1 de dla, se unen al disco. La catllisis
por la LCAT convierte el fosfoIipido superficial y el colesterol libre en ésteres de colesterilo y en licolecitina. Los ésteres de coleszerilo no polares penetran en el interior hidrófobo de la doble capa, en tanto que la licolecitina es transferida a la albúmina del plasma. La reacción continúa generando un nucleo no polar que empuja a Ea doble capa hasta que se forma una HDL esferica seudomicélica, cubierta por una película superficial de lipidos y apolipoprotcinas polates. De este modo, el sistema de la LCAT interviene en la eliminación del CXGeSO de colesterol no esterificado de tas lipoproteinas y de las tejidos. El higado es el sitio final de degradacilin de los esteres de coleste-
rilo HDL. No se sabe con precisibn si en la endocitosis de HDL interviene un receptor verdadero para HDL O apo A-P. N o parece que el hígado capte las HDL que contienen apo A-1, de modo significativo. Las apo A-l son disociadas y eliminadas por el riirbn. Se ha propuesto un ciclo de las 1-IDLpara explicar el transporte del colesterol de los tejidos al hígado, un proceso conocido como transporte inverso de colesterol (figura 2 3 4 ) . El ciclo considera captaci~n y esterificación de colesterol mediante HDL,, que a su vez se toma menos densa formando aci HDL?. La lipasa hepática hidroliza fosfolípido HDL y triacilglicerol, permitiendo que la partícula libere su carga (colesteril Csrer hacia el hígado, donde la particula se condensa más, volvit5ndose a fonnar HDL, que asi se reincorpora al ciclo. Los valores de HDL varían reciprocamente con las concentraciones plasmaticas de triacilglicerol y de manera directa con la actividad de la lipoproteina lipasa. Esto se puede deber a los elementos de superficie, por ejemplo, fosfolipidos y apo A-1 liberados durante la hidrólisis de quilomicrones y que contribuye a la formacibn de HDL naciente. Las concenmiones de HDL p L 2 ) tienen relación inversa con la frecuencia de la aterosclerosis coronaria, posiblemente debido a que reflejan la eficiencia de la depuración del colesterol de los tejidos. La HDL, (HDL,) se encuentra en la sangre de los animales con hipercolestesolemia causada por la dieta. Es rica en colesterol y su Unica apolipoproteina es apo E. Es captada por el hígado por medio del receptor para la apo E remanente, pero también por los receptores para LDL. Es por esta razón que estos hltimos se designan en ocasiones receptores apo B-100. Parece que todas las lipoprotefnas plasrnáticas son componentes interrelacionados de uno o más ciclos metabolicoc que juntos son responsables del complejo proceso del transporte de los lipidos plasmAticos.
EL H~GADOTIENE UNA FUNC~ÓN PRINCIPAL EN EL TRANSPORTE Y METABOLISMO DE LOS L~PIDOS Al principio se pens6 que mucho del metabolismo de los lipidos del cuerpo era prerrogativa del higado. E! descubrimiento de que muchos tejidos tienen la facultad de oxidar completamente los acidos grasos y el conocimiento acumulado que demuestra que el tejido adiposo es metabólicamente activo en extremo, han tendido a modificar el Cnfasis anterior sobre la funci6n del hígado. Sin embargo, el concepto de una funcion central y única para el hígado en el metabolismo de los lipidos es todavía importante. Este brgano lleva a cabo las siguientes funciones principales en el metabolismo de los lípidos: l} Facilita su absorcion y
digestión mediante la produccibn de bilis, que contiene colesterol y sales biliares sintetizados en el propio higado de novo o de la captación del colesterol de las lipoproteinas (capítulo 28). 2) Tiene sistemas enzimliticos activos para la formacihn y oxidación de los Bcidos grasos (capítulos 23 y 24) y para sintetizar triacilgliceroles, fosfolípidos (capítulo 26). 3 ) Convierte los ácidos grasos en cuerpos cetonicos (cetoghnesis) (capitulo 24). 4) Desempefia una parte integral en el metabolismo de las lipoproteínas plasrnhticas (en este capítulo).
La secreción de VLDL hepaticas se relaciona con el estado nutricional y hormonal Ya se describieron las acciones celulares que intervíenen en la formación y secrecion de VLDL. Los triacilgliceroles hepáticos son precursores inmediatos de sus homblogoc contenidos en las VLDL plasmfiticas (figura 27-7). La sintesis de triacilglicerol proporciona el estímulo inmediato para la creación y secrecibn de VLDL. Los ácidos grasos usados en la síntesis de h a cilgliceroles hepáticos se derivan de dos fuentes posibles: 1) sintesis dentro del hígado a partir de ta acetil-CoA derivada principalmente de los carbohidratos (quizls no sea inlportante en los seres humanos) y 2) captación de bcidos grasos libres desde la circulacibn. La primera fuente predomina en estado de buena alimentacibn, cuando la síntesis de hcidos grasos es alta y el valor de acidos grasos libres circulantes es bajo. Como los triacilgliceroles no se acumulan normalmente en el hígado en este estado, se debe inferir que son transportados del hígado en las VLDL tan rápidamente como son sintetizados y que la sintesis de apo B- 100 no es limitante de la velocidad. Por otro lado, durante el ayuno, en las dietas ricas en -as oen la diabetessacarina, se eleva la cifra de hcidos grasos libres circulantes y mAs de ellos son captados por el hígado. En estas condiciones, la lipogenesis se inhibe y !os Qcidos graos libres son la fuente principal de ácidos gasos de los triacilgliceroles en el hígado y en las VLDL. Los mecanismos enzimáticos encargados de la síntesis de triacilgliceroles y fosfolipidos han sido descritos en el capitulo 26. Los factores que aumentan tanto la sintesis de triacilgliceroles como la secrecibn de VLDL por e! higado incluyen: 1 ) estado de nutrición adecuada más que ayuno; 2 ) la alimentación con dietas abundantes en carbohidratos (particularmente si contienen sacarosa o fmcrosa), que conduce a velocidades elevadas de lipogknesis y de esterificación de ticidos grasos; 3 ) altos valores de hcidos grasos libres circulantes; 4) la ingestibn de etanol; y 5) la presencia de concentraciones altas de insulina y bajas de glucagón, que incrementan la sintesis y esterificación de hcidos grasos e inhiben su oxidación.
Transporte y alrnucenamren~ode lipido.7
309
Figura 27-7. Sintesis de lipoproteinasde muy baja densidad (VLDL) y los posibles sitios de accibn de los factores que causan acumulacibn de triacilglicerolese hígado graso. (AGE, ácidas grasos esenciales, AGL, Sicidos rasos libres; HDL, lipoprotelnac de alta densidad;A p o apolipoproteina,MTP proteína microsomalde transferencia d e b l a s v i a s indicadasforman la base para los fenbmenos que se muestran en la figura 27-38. La reserva principal de triacilglicerot en el higado na está en fa via directa de sintesis de VLDL a partir de acil-COA.Por tanto, AGL, insulina y glucagbn benen efectos inmediatos sobre la secreción de VLDL ya que su concentracibn afecta directamente al depósito precursor pequeiio de triacilglicerol En el estado de alimentación total, se sintetiza apo 8-100 en exceso a los requerimientos de secrecibn para VLDL, y el exceso se destruye por vía hepática
(Capítulo 2 7)
El desequilibrio en la velocidad de formación y exportación de triacilglicerol causa la acumulación de grasa en el hígado Por muchas razones, los Iípidos, principalmente como triacilglicerolcs, se pueden acumular en el higado (figura 27-7). La acumulación extensa es considerada coma patolbgica. Cuando se hace crhnica, se producen cambios fibrsticos en las c&lulas, los que progresan hasta lacirrosis y el deterioro de las funciones hepáticas. La acumulaciún de grasaen el hígado se cla~ificaen dos categorías principales. La primera está relacionada con valores elevados de Acidos grasos libres plasmátkos qiie resultan de la movilizaciiin de kas grasas del tejido adiposo, dc la hidriilisis de triacilgliceroles de las lipoproteínas o de los triacilgliceroles de los quilomicrones por la acción de la lipoproteína lipasa en los tejidos extrahepiiticos. El higado incorpora cantidades crecientes de ácidos grasos libres y los esterifica. La producción de VLDL no va pareja con la afluencia de dcidos grasos libres, permitiendo que se acumulen los triacilgliceroles y dé por resultado un hígado graso. La cantidad de triacilglicerol que se encuentra en el higado aumenta de modo significativo durante la inanición y en la alimentacibn con dietas ricas en grasas. En muchos casos (por ejemplo, en inanicion), la capacidad de secretar VLDL también está deteriorada. Las causas pueden ser concentración baja de insulina y alteración en la sintesis de proteinas. En la diabetes sacarina no controlada, en la toxemia del embarazo de las ovejas y en la cetosis del ganado, la infiltración de grasa es suficientemente gravc para causar palidez visible (apariencia grasa) e hipertrofia del hígado, con posible disfuncion hepática. El segundo tipo de acumulación de grasa en el higado se debe generalmente a un bloqueo metabólico en la produccion de lipoproteinas plasrniticas lo cual ocasiona que se acumulen los triacilgliceroles. Tebricamente, la lesión se puede deber a: 1) un bloqueo en la sintesis de apolipoproteinas, 2) a un bloqueo en la síntesis de lipoproteína a partir de los lipidos y las apolipoproteinas, 3 ) a una falla en la provisibn de fosfolípidos que se encuentran en las lipoproteínac, o 4) a una falla en el propio mecanismo secretor. Un tipo de hígado graso que ha sido estudiado extensamente en las ratas se debe a una deficiencia de colina, la que por esto ha sido llamada factor lipotrdpico. Como la colina puede ser sintetizada usando grupos metílo Iábiles, donados por ta metionina en el proceso de transrnetiZacibn (capítulos 32 y 33), la deficiencia se debe básicamente a la escasez de ese grupo metilo. Se han sugerido varios mecanismos
para explicar la funcihn de la colina como agente Iipotrópim, incluyendo su ausencia, que cama alteraciones en la síntesis de los fosfolípidos lipoproteínicos. El antibibtico puromicina inhibe la sintesis proteinica y provoca la aparición de hígado graso y una marcada reducción en la concentracibn de VLDL en las ratas. Otras sustancias aue actúan en forma similar incluyen a la etionina (&ido alfa-amino-garnmnmercaptobutlrico), tetracloruro d e carbono, cloroformo, fosforo, plomo y arsénico. La colina no protege al organismo contra esos agentes pero parece que ayuda en la recuperación. Es muy verosimil que el íetracloruro de carbono afecte tambikn al mecanismo secretor mismo o a la conjugación del lípido con la apoprotcina de la lipoproteina. Su efecto no es directo. sino que m8s bien depende de la transfomacibn ulterior de la mol~cula,Esto probablemente implique ta formacicín de radicales libres que pueden desintegrar a las membranas 3ipidas en el reticulo endoplásmico mediante la formación de peróxidos de Ilpidos. La alimentacibn enriquecida con vitamina E proporciona cierta protección contra la peroxidacibn de los lipidos inducida por el tetracloruro de carbono. Se cree que la acción de la etionina es causada por una reduccidn en la disponibilidad del ATP. Esto resulta cuando la etionina, que reemplaza a la metionina en la S-adenosilmetionina, atrapa adenina disponible y así evita la síntesis de ATP. El icido orolico también causa la acumulaci6n de grasas en el higado; conforme se acumulan VLDL en el aparato de GoEgi, se considera que el ácido or6tico bloquea la glucosilacibn de Sa lipoproteína, inhibiendo, por tanto, su Iiberacibn y explicando la disminución notoria de las lipoproteinas plasrnáticas que contienen apo B. Una deficiencia de vitamina E aumenta la necrosis hepatica en el hígado graso por deficiencia de colina. La administración de vitamina E o una fuente de selenio tiene un efecto protector al combatir la peroxidación del lípidos. Además de la deficiencia proteinica, Eas deficiencias de Acidos grasos esenciales y vitaminas (por ejemplo, ácido linoleico, piridoxina y ácido pantoténico) pueden causar infiltracion grasa en el higado. Se cree que la deficiencia de ácidos grasos esenciales deprime la síntesis de fosfolípidos; por consiguiente, otras sustancias, como el colesterol, que compiten por los Acjdos grasos esenciales disponibles para"laesterificacihn, pueden también causar acumulación de grasas en el higado.
El etanol tambien causa acumulación de grasas en el hígado El atcoholismo tarnbien provoca la acumulaci6n de grasas en el higado, hiperlipidemja y, en ultima instancia, cirrosis. El mecanismo exacto de la acción del alcohol a largo pla7o es todavía desconocido. N o estB
Transportey almacenamiento de lbidos
claro si la movilización adicional de acidos grasos libres interviene en la acumulación de grasas, pero varios estudios han demostrado valores elevados de ácidos grasos libres en la rata despues de la adrninistración de una sola dosis intoxicante de etanol. Sin embargo, el consumo de alcohol por periodos [argos conduce a la acumulación de ácidos graso5 en el hígado los cuales derivan de la síntesis endógena m8s que del tejido adiposo. Después de la ingestibn de etanol no hay al~eraciánde la síntesis proteinica en el hígado. Existen evidencias de un incremento en la sintesis hepatica de triacilglicerol, disminucihn de la oxidaci6n de Acidos grasos libres y reducción d e la actividad del ciclo del ácido cítrico, causada por la oxidacihn del etanol en el citosol de las células hepaticas por la acción de la alcohol deshidrogenasa que conduce a la producción excesiva de NADH.
3I I
inhibe t a m b i h el metabolismo de algunos fatmacos, por ejemplo, barbituratos, al competir con las enzimas dependientes de citocromo P45O (capitulo 61).
C H z - C H 2 4 H + NADPH + H" + 0 2 Etanol CHj-CHO + NADP' + 2HzQ kcetaldehido
La alcohol deshidrogenasa se encuentra tarnbien en la mucosa gástrica, pero su actividad es 60% menor en mujeres que en varones. La elevada disponibilidad de etanol causada por esa escasa utilizacibn gástrica puede explicar por qué las mujeres son más susceptibles a los efectos del consumo de alcohol. DespuCs de La ingestión de etanol, algunas poblaciones asiaticas y de indios americanos muestran predisposiciiin a un incremento en las reacciones adversas a acetaldehido debido a un defecto genético de la aldehido deshidrogenasa mitocondrial.
! ALCOHOL
DESHIDROGENASA
CH3-CHz4H p C H 3 Ebnol NAD' NAOH + H'
2 H 0 Acetaldehido
El NADH generado compite con los equivalentes reductores de otros sustratos por la cadena resplratoria, inhibiendo su oxidacibn. El aumento de la proporción [NADH]I[NAD"] origina un desplazamiento a la izquierda en el equilibrio rnaIato = oxalacetato, que puede reducir la actividad del ciclo del ácido citrico. EE efecto total de inhibir la oxidacibn de los Acidos grasos es provocar mayor esterificacidn de los mismos en el triacilglicerol, lo cual parece ser la causa de la acumulación de grasa en el hígado. La oxidacion del etanol conduce a la fomación de acetnldehido, el cual e5 oxidado por la aldehído deshidrogenasa en las mitocondrias, y el acetato es el producto final. O t o s efectos del alcohol pueden incluir aumento de la lipogénesis y de la síntesis de colesterol a partir de acetilXoA. El mayor cociente de [NADH]/[NAD'] provoca también un mayor cociente de [lactato]/[pinivatoj que produce hiperlactiacidemia, la que a su vez disminuye la capacidad del rifibn para excretar acido úrico.Al parecer, esto último es la causa del agmvamiento de la gota por la ingestion alcohblica. Aunque la principal ruta del metabolismo del etanol es a través de la via de la atcoho! deshidrogenasa, algo del rnetabolismo se lleva a cabo mediante el sistema oxidante de etanol de los microsomas (MEOS, del inglds rnicrosomal ethanoi' oxidizing sistem) dependiente del citocromo P45O que involucrael NADPI-Iy al Oz.Este sistema aumenta su actividad en el alcoholismo crónico y explicaría la depuración metabblica acelerada en este trastorno, como lo indican las altas concentraciones sanguineas de acetaldehido y acetato. El etanol
EL TEJIDO ADIPOSO ES EL PRINCIPAL SITIO DE ALMACENAJE
DE TR\AC\LGL\CEROLEN EL CUERPO Los depisitos de tríacilglicerole~en el tejido adiposo estan continuamente experimentando lipólisis (hidrblisis) y reesterificaciiin (figura 27-8). Estos dos procesos no son las fases en ambos sentidos de la misma reoccibn. MAS bien con vEas enteramente diferentes en las que intervienen reactivos y enzimas distintos. Muchos de los factores nutritivos, rnetabólicos y hormonales que regulan el metabolismo del tejido adiposo acnian ya sea cobre los procesos de esterificacibn o en la lipblisis. La resultante de estos dos procesos determina la magnitud del depósito de ácidos grasos libres en el tejido adiposo, que a su vez es la fuente y determinante de la cantidad de ácidos grasos libres que circulan en el plasma. Debido a que la cifra plasmaticade acidos grasos libres tiene efectos m& profundos sobre el metabolismo de otros tejidos, particularmente el hepático y muscular, los factores que operan en el tejido adiposo y regulan la salida de ácidos grasos libres qiercen una influencia más alla del zejido mismo.
La provisión de glicerol 3-fosfato regula la esterifícación: la Iipóllsis es controlada por una lipasa sensible a hormona En el tejido adiposo, el triacilglicerol es sinteti~adoa partir de la acil-CoA y del glicerol 3-fosfato. segun
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Bioquimicade Hurper
(Capítulo 2 7)
Glrceml3-fosfato
TEJIDO ADIPOSO
Figura 27-8. Metabolismo del tejido adiposo. La lipasa sensible a hormonas es activada por la ACTH, la TSH, el glucagbn, la adrenalina. la noradrenalina y la vasopresina, e inhibida por la insulina, la pmctaglandina Ei y el lcrdo nicotínico. Los detalles de la forrnacibn d e glicerol 3-fosfato a partir d e intermediariosd e la gluCblisis se muestran en la frgura 26-2. (VPF, vía de la pentosa fosfato; TG, triacilglicerol,AGL, ácidos grasoc I~bres;VLDL, Iipoproteínas d e muy baja densidad.)
el mecanismo que se muestra en la figura 26-2. Debido rt la baja actividad de la enzima glicerol cinasa en el tejido adiposo, el glicerol no puede ser utilizado de manera amplia en la esterificación de acil-CoA. Para. la pmvisibn de glicerol 3-fosfato, el tejido depende de la gluc6lisis y de un suministro de glucosa. El triacilglicerol es cometido a hidrotisis por la tipasa sensible a hormona para formar ácidos grasos libres y glicerol. Esta lipasa es distinta de la lipoprotcina lipasa que cataliza la hidrólisis de los triacilgliceroles lipoproteinicos antes de su captacibn por los tejidos extrahepáticos (vCace antes). Puesto que este
tejido no puede aprovechar con facilidad al glicerol, este se difunde al plasma, desde donde ya puede ser utilizado por tejidos como el higado y el rifírjn, los cuales poseen una glicerocinasa activa. Los acidos grasos libres obtenidos en la lipdlisis pueden volver a ser convertidos dentro de1 tejido adiposo en acil
Transporte y almacenutnien~ode lbidos
libres se acumulan y difunden hacia el plasma, en donde se combinan con la albúmina y elevan laconcentracion de ácidos grasos libres plasmaticos. Estos son una fuente importante de energía para muchos tejidos.
Un metabolismo acelerado de glucosa reduce la salida de ácidos gracoc libres Cuando aumenta la utilizacibn de glucosa por el tejido adiposo, la salida de ácidos grasas libres disminuye. Sin embargo, la liberacion de glicerol continúa demostrando que el efecto de la glucosa no es mediado por la reduccion de la velocidad de lipólisis. Se cree que el efecto se debe a la provisión de glicerol 3-fosfato, e1 cual mejora la estesificacion de Lcidos grasos libres por la vía de la acil-CoA. La glucosa puede tomar varias rutas en el tejido adiposo, incluyendo la oxidacihn a COI por la vía del ciclo del ácido citrico, la oxidación en la vía de la pentosa fosfato, converci6n en ácidos grasos de cadena larga y formación de acilglicerol por la via del glicerol 3-fosfato. Cuando la utilizacihn de la glucosa es elevada, una mayor proporcion del consumo es oxidada a COI y convertida en ácidos grasos. Sin embargo, a medida que disminuye la utilización total de glucosa, es más grande la praporcibn de la misma que se dirige a la formacihn de glicerol 3-fosfato y para la esterificacibn de acil-CoA, los cuales ayudan a minimizar la salida de ácidos grasos libres.
Los ácidos grasos libres son captados debido a la actividad de la Fipoproteína lipasa Existe mm8s de un depbsito de AGL dentro del tejido adiposo. Se ha demostrado que el depósito de ácidos grasos libres (figura 27-8, depósito 1) formado por lipdlisis de triacilglicerol es el mismo que surte los kidos grasos para la reesterificacidn; también los libera hacia el medio externo (plasma). Los hcidos grasos captados del entorno como resultado de la accibn de la lipoproteina Eipasa sobre el triacilglicerol de quilomicrones y VLDL, no marcan al depbsito 1 antes de ser incorporados al triacilglicerol, pero viajan a travks de un pequeflo depbsito 2 de recambio rhpido.
LAS HORMONAS REGULAN LA MOVILIZACIÓNDE LIPIDOS La insulina reduce la salida de grasos libres La velocidad de liberación de los hcidos grasos libres desde el tejido adiposo es afectada por numerosas
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hormonas que influyen tanto en el indice de esterificacion como en el de lip6lisis. La insulina inhibe la liberacidn de acidos grasos del tejido adiposo, lo cual va seguido por una disminución de 6cidos grasos libres en el plasma circulante. El efecto es un incrementa de la lipogdnesis, de la síntesis de acilglicerol y de la oxidaciún de la glucosa a CO: por la vía de la pentosa fosfato. Todos estos efectos dependen de la presencia de la glucosa y pueden explicarse en gran parte con base en la capacidad de la insulina para acelerar la captacihn de glucosa por las células del tejido adiposo. Esro lo efectúa la insulina causando la traslocación de los transportadores de glucosa del aparato de Golgi a la membrana plasmhtica (figura 5 1-91. También se ha demostrado que la insulina incrementa la actividad de la piruvato deshidrogenasa, acetil-CoA carboxilasa y glicerofosfato aciltransferasa, que reforzaría los efectos que surgen del incremento en Ea captaciiin de glucosa sobre la amplificación de la síntesis de iicido graso y acilglicerol. Se sabe ahora. que estas tres enzimas san reguladoras par una rnodificacibn covalente, esto es, por mecanismos de fosforilaci6n-desfos€orilacion. Una acción principal de la insulina en el tejido adiposo es la de inhibir la actividad de la lipasa sensible a hormona, lo que reduce la liberación no sólo de Bcidos grasos libres sino tambibn la de glicerol. El tejido adiposo es mucho más sensible a la insulina qire otros muchos tejidos, lo cual sefíata al tejido adiposo como un sitio principal de la acción insulinica in vivo.
Un gran número de hormonas estimulan la fipolisis Otras honnonas aceleran la likracion de acidos gasos
libres del tejido adiposo y elevan el valor plasmático de kidos grasos libres aumentando la velocidad de lipólisis en los depósitos de t~iacilglicerol(figura 27-9). &m incluyen la adrenalina, la noradrenalina, el glucagbn, la hormona adrenocorticotr6pica (ACTH, del inglds, adrenocorticotropic hormone), hormonas alfa y beta estimulantes de los melanocitos (MSH, del inglks alfa y k t a - m e l a n ~ t e 1 ~ t i m u l a t i nhormones), g hormona estimulante de la tiroides (TSH), hormona del crecimiento (GH} y vasopresina. Muchas de éstas activan a la lipasa sensible a hormona. Para un efecto óptimo, la mayoría de estos procesos ljpoliticos requieren la presencia de glucocorticoides y hormonas tiroideas. Por si mismas, estas hormonas particulares noaumentan la lipólisis notablemente, pero actúan como facilitadoras o permisivas con respecto a otros factores endocrinos lipofíticos. Las hormonas que actúan rápidamente en la activncibn de la lipblisis, es decir, las catecolaminas, lo
Insulina, prostaglandina Eñ,
Adrenalina, noradrelina
Bloqueadores
gluwgdn
,Bcrdo nicotinico
'@d * , 1
p-adrenergtcos S
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Tria~ilglicero~ lipasa b
sen51ble a hormonas
Inhibidores de
sintests proteinica
, '
Adenosina
Glucocorticoides
'nhibidore$de la sintesis proteinica
Figura 27-9. Control de la lipblisis en el tejido adiposo (TSH, hormona estimulante de la tiroides; AGP, $cidos gracos libres ) Nbtese la secuencia en cascada de las reacciones que permiten la amplificacibn en cada paso. El estimulo lipolitico es "desconectado" por la eliminación de la hormona estimulante; la accidn de la Iipasa fosfatasa; la inhibición de la Iipasa y la adenilato uctasa por mncentraciones altas de AGL, la inhibtaón de la adenilil ucbsa por la densidad. y la depuraubn del dVMP por acción de la fosfodiesterasa La ACTH, TSH y glucagon no pueden activar a la adenilato ciclasa in viw dado que la concentrauon que se requiere in wtmde cada una de ectas homlonas es mucho mayor que la que se enaientra en la circulacibn. Los &dos reguladoresposrtivo @) y negatrvo están representados por líneas punteadas y el sustrato Ruye por las llneas gtuesas.
{e)
logran estimulando la actividad de la adenilil ciclasa que es la enzima que convierte el ATP en cAMP. El mecanismo es anhlogo al que se ocupa de la estimulacibn hormonal de la glucogenólisis (capitulo 20). Al parecer, el cAMP, mediante la estimulación de la proteína cinasa que depende de cAMP, convierte la triacilglicerol lipasa inactiva sensible a hormona, en Iipasa activa. La lipólisis en gran parte es controlada por la cantidad de cAMP presente en el tejido. Se deduce que los procesos que destruyen o preservan el cAMP tienen efecto sobre la lip6lisis. El cAMP es degradado a 5'-AMP por la enzima 3', S'-nucle6tido fosfodiesterasa cíctica. Esta enzima es inhibida por las rnetilxantinas como la cafeina y la teofilina. Es significativo que el tomar café, que contiene cafeina, produzca una elevación marcada y prolongada de acidos graso5 libres en el plasma humano. La insulina antagoniza la acci6n de las hormonas lipoliticas. En la actualidad, se considera que la lipólisis puede ser m6s sensible a los cambios en la
concentraci6n de insulina que lo que son la utilizacion de la glucosa y la esterifícación. Los efectos antilipoliticos d e insulina. acido nicotinico y prostaglandina El pueden explicarse por la inhibicion de la síntesis de cAMP en el sitio de la adenilil ciclasa, actuando a travds de una proteina Gi. Tambiin la insulina estimula a la fosfodiesterasa y a la lipasafocfatasa que inactiva a la lipasa sensible a hormona. Los mecanismos posibles para la accilin de las hormonas tiroideas incluyen un aumento en la concentracion de cAMP mediante la facilitacibn del paso del estímulo desde el sitio receptor en el exterior de la membrana celular al sitio de fa adenilil ciclasa en el lado interno de la membrana y una inhibición de la actividad de la fosfodiesterasa. El efecto de la hormona del crecimiento en la promocibn de la lipdlisis, es lento. Depende de la síntesis de las proteínas que intervienen en la formación del cAMP. Los glucocorticoides favorecen la lipólisis por medio de la síntesis de nueva proteina lipasa pero por una via independiente del cAMP. Este hallazgo tambitn ayuda a explicar la hnci6n de la
Transporte y almacenamrenfode lbidos
hipbfisis y de la corteza suprarrenal en el incremento de la movilización de lípidos. El sistema nervioso simphtico, a traves de la liberación de noradrenalina en el tejido adiposo, tiene una funciiin central en la movilización de ácidos grasos libres, al ejercer una influencia tónica aun cuando la actividad nerviosa no aumenta. Así, la lipolisis elevada, causada por muchos de los factores descritos previamente, se puede reducir o abolir por la desnervación del tejido adiposo, el bloqueo ganglionar con hexarnetonio o el agotamiento dc los depósitos de noradrenalina con reserpina.
Han evolucionado una variedad de mecanismos para el control fino del metabolismo en el tejido adiposo Es posible que el tejido adiposo humano no sea un sitio importante de lipogenesis. Esto se sehala por la observaci6n de que no hay una incorporaci6n significativa de radiactividad en los ácidos grasos de cadena larga, procedente de glucosa o de piruvato marcados y que a[ parecer no estri presente la ATP-citratoliasa, enzima clave en la lipogénesis, y tiene una actividad extremadamente baja en el higado. Otras enzimas, GOmO la glucosad-fosfato deshidrogenasa y Ia enzima málica, que en la rata experimentan cambios adaptativos coincidentes con un incremento en la Iipogenesis, no sufren cambios semejantes en el tejido adiposo humano. De hecho, se ha sugerido que en e1 ser humano hay un "síndrome de exceso de carbohidrato~"debido a una lirnitacion única en la capacidad para desechar por medio de la lipogénesis. En las aves, la lipoginesis esta confinada al hígado, donde tiene importancia particular en el suministro de lipidos para la f o m a c i b n del huevo, estimulado por los estrbgenos. El tejido adiposo humano no es sensible a la mayoria de las hormonas lipoliticas, excepto a las cateco2aminac. De mayor interés es la ausencia de respuesta lipolitica a la adrenalina en el conejo, cobayo, cerdo y pollo; el efecto lipolitico pronunciado del glucag6n en las aves, junto con la ausencia de efecto antilipolitico de la insulina y la carencia de sintesis de glicerol como aciIglicerol a partir de la glucosa en el pichbn. Al considerar e3 profundo desarreglo del metabolismo en la diabetes sacarina (que se debe en lo principal al incremento en la liberacidn de ácidos grasos libres de los depdsitos) y el hecho de que la insulina corrige esta situacibn en gran medida, se debe concluir que la insulina desernpefia una función prominente en la regulación del metabolismo en el tejido adiposo.
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EL TEJIDO ADIPOSO PARDO FAVORECE LA TERMOGENESIS EI tejido adiposo pardo interviene en el metabolismo, en partici~laren los momentos en que es necesaria la generación de calor. Así, el tejido es extremadamente activo en algunas especies al despertar de la hibernación, en animales expuestos al frío (temogCnesis sin escalofríos) y en la producción de calor en el animal recitn nacido. Aunque no es un tejido importante en el ser humano, recientemente se ha demostrado que es activo en los individuos normales, donde parece ser la causa de la "termogénesis inducida por los alimentos", que podría explicar ta causa de i u e algunas penonas puedan "comer y no engordar". Es conveniente hacer notar que en las personas obesas el tejido adiposo pardo es escaso o rio existe. Ademis, este tejido se caracteriza por disponer de un suministro sanguíneo bien desarrollado y un contenido elevado de mitocondrias y citocromos, pero poca actividad de ATP sintatasa. El enfasis metahblico está en la oxidacion tanto de la glucosa como de los Bcidos grasos. La noradrenalina liberada dc las terminaciones nerviosas simphticas es importante en el incremento de la lipdlisis tisular. La oxidacilin y la fosforilación no esthn acopladas en la mitocondrias de este teiido, puesto que el dinitrofenol no ejerce efecto alguno y no hay control respiratorio por el ADP. La fosforilación es a nivel del sustrato; es decir, en el paso de la succinato tiocinasa y en la gluc6lisis. Por tanto, la oxidación produce mucho calor y un poco de encrgia libre se atrapa como ATP. En teminos de la teoría quimiosrnótica (capitulo 141, podria parecer que el gradiente de protones normalmente presente a travh de la membrana mitocondrial interna de las rnitocondrias acopladas, es disipado de modo continuo en e[ tejido adiposo pardo por una proteina temogdnica, la termogenina, que actúa como una vía de conduccibn de protones a través de la membrana. Esto explicaría la aparente carencia de efecto de los desacopladores (figura 27-1 0).
RESUMEN 1) Dado que son insolubles en agua, los lipidos no
polares, como las lipoproteínas, deben combinarse con lipidos y proteínas anfipaticos para volverlos miscibles en agua para su transporte a los tejidos en el plasma sanguineo acuoso. 2) Se reconocen cuatro grupos principales de lipoproteínas; quilomicrones que transportan Iipidos que provienen de la digestión y absorcidn. Las lipoproteínas de muy bajadensidad (VLDL) que imnsportan triacilglicerol desde el hígado. Lipoproteinas de
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+
Bioquímica de Hurper
EXTERIOR
hormonas
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1
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Cadena respiratoria Triacil-
1
Figura 27-10. Termogénesis en el tejido adiposo pardo. La adividad de la eadena respiratoria produee calor adem6s de la traslocacibn de protones (capítulo 14). Estos protones disipan más calor por medio de la termogenina cuando regresan al compartimiento mitocondrial interno en lugar de generar ATP, como ocurre cuando regresan por medio de la Fi ATP sintasa. El paso da H* por medio de la termogenina es fnhibido por las nuclebtidos d e purina cuando el tejido adiposo parda no es estimulado. Bajo la influencia de la noradrenalina, la inhibicibn desaparece por el estimulo de la producci6n de dcidos grasos libres (AGL) y acil-COA. Ndtese el papel doble de la acil-COA en facilitar tanto la accibn de la termogenrna, como el suministro de equivalentes reductores para la cadena respiratoria. Efectos reguladores positivos (O)o negativos (O).
baja densidad (LDL), que son ricas en colesterol y provienen del metabolismo de las VLDL y lipoproteínas de alta densidad (HDL), que tambitin son ricas en colesterol, pero cuya actividad consiste en remover el colesterol de los tejidos y participar en el metabolismo de otras lipoproteinas. 3) Los quilamicrones y VLDL son metabolizados primero por hidrblisis catalizada por la proteina lipasa en tejidos extrahepáticos. Se remueve la mayor parte de triacilgliceroles y en la circulacidn queda un remanente de lipoproteina. Estos remanentes son captados por el hígado por endocitosis mediada por receptor, pero algunos remanentes (IDL) generados de VLDL forman LDL y por último son retirados de la circulacibn por el higado y otros tejidos mediante el receptor para LDL. 4) La fraccibn proteínica de las lipoproteinas recibe el nombre de apolipoproteina. Actiia como activador enzimitico (por ejemplo, apo C-II y apo A-1) o como ligando para receptores celulares (pos ejemplo, apo A-1, apo E y apo B-100). S) El desequilibrio en la velocidad desintesjshepatica de triacilglicerol y en la secrecibn de VLDL causa la acumulacibn de grasa en el hígado. Este efecto tiene importancia clínica ya que se presenta en el alcoholísrno donde prosigue a cirrosis y disfunción hepática. 6 ) El rriacilglicerol es el lipido de almacenaje principal en el tejido adiposo. Despuds de la hidrdlisis por acci6n de una lipasa sensible a hormonas, es eliminado a la ci~ulacibnen forma de Acidos grasos libres y glicerol. Los ácidos grasos libres se unen a la albúmina sCrica para su transporte a los tejidos, donde se utilizan como una importante fuente energktica. La lipasa sensible a hormona es estimulada por la adrenalina y la noradrenalina e inhibida por la insulina. 7) El tejido adiposo pardo es el sitio de "Eemogdnesis sin escalofríos". Se encuentra en animales en hibernacibn y recjkn nacidos y en cantidades pequefias en el ser humano, donde parece ser la causa de la 'Yermogénesis inducida por los alimentos". La termogtnesis se debe a una protelna, la terrnogenina, que actúa como una vía conductora de protones a travks de la membrana interna mitocondrial, que desacopla la oxidación de la fosforilacibn.
REFERENCIAS Boresztajn J (editor): Lipoprotein Lipase. Evener Publishers, 1987.
Brewer HB et al.: Apolipoproteins and lipoproteins in human plasma: An overview. Clin Chem 1988;34:B4.
Transporfey almacenamiento de Iipidos
Coppack SW et al.: Effects of insulin on human adipoqe tissue rnetabolism in vivo. Clin Sci 1989;TT:6&3
Eisenberg S: High density Iipoprotein metaholism. J Lipid Rcs 1914:25: 1017. Fietding CJ, Fielding PE: Metabolism of cholcstcrol and lipoproteins. Page 404 in: Biochemisity ofLipi& and ,Membranes. Vance DE, Vance JE (editors) BenjaminlCummings. 1985.
31 7
Kaikans KM, Rass N M ,Ockner RK: Functions of fatty acid hinding proteins. Experientia 1990,46: 617. Lnrdy H, Shrago E: Riochemical aspects of o b e s i ~Annu . Rev Biochem 1990;59:689. Lieber CS: Alcohol, liver, and nutrition. J Am Coll Nutr 1991;10:h02
Varios autores: Brown adipose tissue-role in nutritional energetics. (Simposium). Proc Nutr Soc 1989;41: 165.
Síntesis, transporte y excreción de! coIesteroI Peter A. Mayes, PhD, DSc
INTRODUCCIÓN El colesterol se encuentra en los tejidos y en las lipoproteínas plasmáticas como colesterol libre o, combinado con un Acido graso de cadena larga, como &ter de colesterilo. Es sintetizado en numerosas tejidos a partir de acetil
IMPORTANCIA BIOMEDICA El colesterol, como lipido anfiphtico, es un componente estructural esencial de membranas de la capa exterior de las lipoproteínas plasmAticas. AdemBs, 1% lipoproteínas transportan en la circulación colesterol libre, donde fitcilmente se equilibra con el de otras lipoproteínas y de las membranas. El ester de colesterilo es una forma de almacenamiento de colesterol que se encuentra en la mayor parte de los tejidos. Es transportado como cargamento en el centro hidrofobo de las lipoproteinas. La LDL es mediadora de la captación del colesterol y del &ter de colesterilo en muchos tejidos. El colesterol libre es removido de los tejidos por las HDL y transportado al hígado para su conversión en ácidos biliares en el proceso conocido como transporte inverso del colesterol. Es un importante constituyente de los cAlculos biIiares. Sin embargo, su principal función en los procesos patolbgicos es como factor de la gknesis de la aterosclerosis de arterias
vitales, causando enfermedad cerebrovascular, coronaria y vascular pesiférica. La aterosclerosis coronaria se correlaciona Con un alta proporcibn plasmhtica LDL:HDL colesterol.
EL COLESTEROL DERIVA DE LA ALIMENTACI~Ny LA BIQS~NTESIS POR PARTES IGUALES Un POCO mhs de la mitad del colesterol del organismo Se origina de su síntesis (cerca de 700 mddia) y el resto es proporcionado por una alimentacibn promedio. El higado sintetiza rnhs o menos 10% del total en los seres-humanos y los intestinos cerca de 10 por ciento. Prácticamente todos los tejidos que contienen cklulas nucleadas son capaces de sintetizar colesterol. La fracciiin microcómica (retículo endopl8smico) y el citosol se ocupan del proceso.
La a c e t i l 4 o A proporciona todos los átomos de carbono para el colesterol La biosintesis del colesterol puede dividirse en cinco etapas: 1) Se sintetiza mevalonato, un compuesto de seis c a h n o s , a partir de acetil-CoA (figura 28-11.2) Se forman unidades isoprenoides por pdrdida de C 0 2del mevalonato (figura 28-2). 3) Se condensan seis unidades isoprenoides para formar el intermediario, escualeno. 4) EI escualeno se c i e m en forma cíclica para dar origen al esteroide precursor, lanosterol. 5) El colesterol se forma de lanosterol después de varios pasos ulteriores, incluyendo la perdida de tres grupos metilo (figura 28-3).
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Bioquimica de Harper
Audo biliar miesterol
(Capítulo 28)
2NADPH + 2H* Mevastatina,
lovastatina, etdtera 2NADPt + COA SH
(3 Mevalonato O
6~~
.
" l .
O
-006-CH,-C-GH2-GH2-OH
II
OH
Mevalonato Figura 28-1. Biosíntesisdel mevalonato.(HMG, 3-hidroxi-3rnetilglutaril.)La sintesic de HMG-COAfedudasa es inhibida por los metabolitos rnicéticos mevastatina (cornpactina), lovastatina (rnevinolina},provastatina y simvastatina.
Paso 1. La acetilXoA forma HMG-COA y mevalonato: La via a travds de HMGXoA (3hidraxi-3-metilglutaril~oA)sigue la misma secuencia de reacciones que se describen en el capitulo 24 para la síntesis de los cuerpos cetónicos en las mitocondrias. No obstante, dado que la sintesis del colesterol es extrarnitocondrid, las dos vías son distintas. inicialmente, se condensan dos moléculas de acetilCOApara formar acetoacetil-COAcatalindas por una enzima citosólica, la tiolasa. Como altemativñ en el higado, el acetoacetato formado en el interior de la mitocondria en la via de cetogdnesis (capitulo 24) se difunde al citosol y puede ser activado a acetoacilCOApor la acetoacil-COA sintasa, que requiere ATP y COA. La ncetoacil-COA se condensa con otra moldcula de acetil-COA, reaccibn catalizada por la HMG-COA sintssa para formar HMG-COA. Este ultimo es convertido a mevalonato en una reducción de dos etapas por NADPH, catalizada por la HMG-COA reductasa, enzima micros6mica considerada como la que cataliza el paso limitante de la
velocidad en la vía del colesterol y es el sitio de a c c i ~ n de la clase más efectiva de farrnacos reductores del colecterol, esto es, los inhibidores de la HMG-COA reductasa, estatinas (figura 28-1). Paso 2. El mevalonato forma unidades isoprenoides activas: El mevalonato es fosforilado por el ATP para formar varios intermediarios activos (figura 28-2). Por medio de una descarboxilación, se obtiene la unidad isoprenoide activa, el isopentenil pirofosfato. Pasa 3. Seis unidades isoprenoides forman escualeno: Esta etapa comprende Ea condensación de tres mol~culasde isopentenil pirofosfato para formar farnesil pirofosfato. Esto sucede por la isomerización del isopentenil pirofosfato con desplazamiento de la doble ligadura que origina dimetilalil pirofosfato, seguido por la condensación con otra molkcula de isopentenil pirofosfato para formar el intermediario de 10 carbonos, geranil pirofosfato (figura 28-2). La condensacibn ulterior con isopentenil pirofosfato produce farnesil pirofosfato. Dos mol4culas de este ultimo se condensan en el extremo pirofosfato en una reacción que comprenden primer lugar, la elim inacion del pirofosfato para formar pre-escualenpirofosfato, seguida por una reduccidn con NADPH para eliminar el radical pirofosfato remanente. E: compuesto resultante es el escualeno. Puede haber una vía alterna conocida como "la desivacibn tr~ns-metilglutaconato",la cual elimina una proporcibn significativa (5% en higados nutridos, que se eleva a 33% en higados sin nutrientes) del dimetilalil pirofosfato y lo regresa, por la vía de la trans-3-metilglutaconato4oA, a HMGqoA. Esta vía puede tener potencial regulador respecto a la velocidad global de la sintesis del colesterol. Paso 4. El escualeno se convierte en lanosterol: El escualeno tiene una estructura muy semejante a la del niicleo de los estemides (figura 28-3). Antes de que el anillo se cierre, el escualeno en el reticulo endoplismico se transforma en 2,3dxido de escualeno por una oxidacibn de función mixta, la escualeno epo-xidasa. El grupometilo del Cides transferido al C i 3 yel del CB al Ci4cuandotiene lugar la ciclizacibn, catalizada por la oxidoescualeno: lanosterol ciclasa. Paso 5. El lanosterol se convierte en colesterol: En esta última etapa (figura 28-3), la formacih del colesterol a partir del lanosterol, tiene lugar en las membranacdel retfculo endoplásmico e implica cambios en el nlicleo esteroide y en la cadena lateral. EI grupo metilo del C14 es oxidado aCOz para formar 144esmetil lanosterol. De igual modo, se remueven otros dos grupos rnetilo del C d para producir zimosterol. A partir de este iiltirno se forma A7h24-colestadienol por la doble ligadura situada entre CS y C9 que se mueve a la posicibn entre CSy CI.En este punto se forma desmosterol por un desplazamiento ulterior de la doble ligaduraen el anillo B, para quedar entre Cs y C6 como
Sinlesis, Ircsnsporre y excreción del colesterol
ATP
ADP CH,
- OOC
- OOC
CH,
3.71
OH
' t '
CH,
Mevalonato
Mevalonato 5-fosfato
ADP
CH, CH? O-@-@ Mevalonato-3-fosfo-5pimfosfato
1
ADP
ATP
IzÑzq
- OOC CH,
CH?
O-@@
Mevalonato-5pimfocfato
h4 EVACONATO Denvacibn i I del trans-rnetiigluta- t - - C
CH,
/Y
, /\
mnato
CH,
CH
3pJ-Dimet~laiii irofosfalo
lsopentenil pirofosfato
, I t
lsopentenil tRMA
TRANSFERACA
Protelnas prenilatadas
Geranil pirofosfato 'FRANSFERASA
Cadena lateral de la
\
ubiquinona
-
Doticol
Famesri pirofosfato Hem a
Escualeno Figura 28-2. Biosintesis del escualeno, ubiquinona, dolicol y otros derivados de polisopreno. (HMG, 3 hidroxi-metifglutaril; &, citocinina. En el hem a d e citocromo oxidaca hay un residuo d e farnesilo. El carbono con asterisco* se wnviette en C i i o C12 en el escualeno. La eccuareno sintetaca es una enzima miuosbmica, todas las otras enzimas indicadas son proteínas citosblicac solubles.
322
(Capitulo 28)
Bioquimica de Harper
0 II
CH3-
OC
- S -COA+
o .
EH~
CH3 0 1 .
0
O
1
OH
Acetii-COA
1
.
O
CHJ-C=CH-CH2-
-0OC-CHz-C-CH1-CH20H O
Unidad isoprenotde
HzO
CO,
Mevalonato
\ 12
*CH Epdxido de
it
escualeno
,
I
1 .
1
1
CH3
CH
CH
FA D
CH, Eswaleno
LANOSTERQL-
HO 14-~esmetiC lanosterol
'-27
1s
Zimosterol
NADPH
NADPH
7
HO
510 Trlparanol Coiesteml
Desmosterol (24-deshidrocoksterol)
~~,~~-~oiestadienol
Figura 28-3. Biosíntesis del colesterol. Las posicFones numeradas son las del núcleo esteroide mientras que les circulos claros y oscuros indican el destino de cada carbono en la porción acetil de la cetil-COA Se refiere al marcale, del escualeno en la tigura 28-2
Síntesis, transporte y excreciún del colesterol
en el colesterol. Finalmente, se obtiene el colesterot, mediante la reducción de la doble ligadura de la cadena lateral, aunque ésta puede presentarse en cualquier etapa de la conversión global. No se conoce con certeza el orden exacto en que se presentan los pasos descritos. Es probable que los intermediarios desde el escualeno al colesterol. estén adheridos a una proteina portadora especial conocida como proteína portadora de escualeno y esteroles, la cual se une a los esteroks y a otros Iípidos insolubles, pemitikndoles reaccionar en la fase acuosa de la célula. Además, es probable que sea en la forma colesterol-proteína transportadora de esteroles que el colesterot reaccione para convert i s e en hormonas ecteroides y hcidos biliares y participe en la fomacion de membranas y Iipoproteinas.
323
LDt-co!esterol captado por medio de los receptores para LDL (receptores apo B-100, E). Tanto en Easintesis del colesterol como en la actividad de la reductasa se manifiesta una vnriaciún diurna. Sin embargo, hay efectos mhs rápidos sobre la actividad de la reductasa. que los que pueden explicarse únicamente por los cambios en la velocidad de la síntesis de proteinas. La administracibn de insulina o de hormona tiroidea incrementa la actividad de la FIMGXoA reductasa, en tanto que la de glucaghn o glucocorticoides la reduce. La enzima en las dos formas, activa e inactiva, pueden ser modificadas dc manera reversi ble por mecanismos de fosforilacion, algunos de los cuales pueden depender de cAMP y por tanto ser sensibles al glucagdn
El farnesil pirofosfato es el punto de bifirscacilin para la sintesis de los otros poliisoprenoides, dolicol y ubiquinona. El aIcohol poliisoprenil dolicol (figura 16-26 y capítulo 56) se forma por adición ulterior de hasta 16 residuos de isopentenil pirofosfato, en tanto que la cadena lateral de la ubiquinona (figura 14-5) se origina por la adición posterior de 3 a 7 unidades isoprenoides. Algunas de las proteinas fijadoras de GTP de la meinhrana celular pueden experimentar prenilacibn por combinación con residuos geranilo y famesilo. De este modo puede facilitarse el anclaje de proteínas prenilada en las membranas lipoides.
(figura28-4). El efecto de las variaciones de la cantidad de colesterol en la dieta sobre la de su producción endógena se ha estudiado en ratas. Cuando sólo había 0.05% de colecterol en los alimentos, entre 70 y 80% del colesterol dentro del organismo era sintetizado en el higado, intestino delgado y glándulas suprarrenales, en tanto que si la dieta contenía 2% de colesterol, se reducía la producción endbgena. Al parecer, sólo la síntesis hepática es inhibida. Los experimentos con hígado irrigado han demostrado que los quilornicrones remanentes ricos en colesterol, que son captados por el higado (capítulo 27), inhiben la sintesis de esterol. Los intentos para reducir el colesterol plasrnhti co en el ser humano mediante la ingestión dietetjca baja producen resultados variables. En general, una disrninucibn de 100 rng en el colesterol de los alimentos causa una reduccidn aproximada de 0.13 mmol/L en el suero.
LA REGULACIÓN DE LA HMG-COA REDUCTASA CONTROLA LA S~NTESIS DEL COhESf EROL
NUMEROSOS FACTORES INFLUYEN EN EL EQUILIBRIO TISULAR DEL COLESTEROL
La segulaci6n de la cintesis del colesterol se ejerce casi al principio de la via, en el paso de H M G X o A reductasa. En los animales en ayuno hay una notable declinacion de la actividad de la HMG-COA reductasa, que explica la reducción de la slntesic del colesterol en esa condición. Hay un mecanismo de retroalimentacibn, por el cual, la HMG-COA reductasa es inhibida en el hígado por el mevalonato, el producto inmediato, y por el colesterol, el producto principal de la vía. Puesto que no se ha demostrado una inhibici6n directa de la enzima por el colesterol, es posible que éste (o un metabolito como el esterol oxigenado) actúe por represión de la sintesis de reductasa nueva o por inducción de síntesis de enzimas que degraden a la reductasa existente. La sintesis del colesterol es inhibida tambiin por eI combinado
Se considera que, a nivel tisular, los siguientes procesos gobiernan eE equilibrio del colesterol celular (figura 28-5). El incremento se debe a: 1) captacion por los receptores de lipoproteinas que contienen colesterol, por ejemplo, el receptor LDL o por el receptor de limpieza; 2) captacibn de lipoproteinas que contienen colesterol por una viano mediada por receptores; 3) cap1aci6n de colesterol libre a partir del lipoproteinas ricas en colesterol, pasa la membrana celular; 4) sintesis de colesterol; y 5) hidrhlisis de Csteres de colesterilo por la enzima éster d e colesterilo hidrolasa. La reducción se debe a: 1) efusión de colecterol de la membrana a las lipoproteinas pobres en colesterol, en particular a HDL, o HDL naciente, promovida por LCAT (lecitin:colesterol aciltrans-
El farsenil pirofosfato origina otros compuestos isoprenoides importantes
324 * Bioquim ica de Harper
(Capiiulo 28)
ATP
REOUCTASB CINASA (inactiva)
PI
REDUCTASA ClNASA CTNASA
FOSFATASAS
I REDUCTASA AOP
CINASA
le I
H20
1
I
(activa)
Giucagbn
I
I ADP
ATP
Inhibidor-1
fosfato'
HME-COA
1 3
REDUCTASA
I
(inadiva)
I
HMG-COA
LDL coiesterol
HMECQA REDUCTAS4 (aaiva)
*N @
P
I H20
I I
1
S
Pl
I I
PROTEIN-
SIntesis
Figura 28-4. Mecanismos posibles de la regulacibn de la síntesis del colesterol por la HMG-COAreductasa. La insulina tiene una funcibn dominante comparada con glucagdn.Véase figura 206.
ferasa}; 2) esterificación del colesterol por ACAT (aciI-Cok:colesterol aciltransferasa); y 3) utilizaci6n del colesterol para la síntesis de otros esteroides, como hormonas o ácidos biliares en el higado.
El receptor para LDL tiene una regulación estricta Los receptores para LDL (apo B-100, E) se encuentran en la superficie celular en hendiduras del lado citosólico de la membrana plasmhtica con una proteína llamada clatrina. El receptor es una glticoproteina que se expande a travts de ia membrana, eskndo la regiiin fijadora B-100 en el extremo m i n o terminal expuesto. Despu&sde fijarse al receptor, la LDL es captada intacta por endocitosis. En los lisosomas es d e gradada por hidrólisis de la apoproteína y del éster de colesterilo, seguida por traslocacibn del colesterol dentro de la ciula. LOS receptores no son destruidos sino que retornan a la superficie celular. Esta entrada del colesterol inhibe a la HMG-CoA reductasa y la sintesis de colesterol, estimulando la actividad de ACAT. El nitmero de receptores para LDL en la
superficie celular es regulado por el requerimiento de colesterol para membranas y para síntesis de hormonas esteroides y de Iicido biliar. Por tanto, la salida de colesterol regula a la baja el número de receptores LDL (figura 28-51, El receptor para apo B-100 E es un receptor LDL de "elevada afinidad" que puede saturarse bajo diversas circunstancias. Al parecer, existen tambikn otros receptores de "baja afinidad" para LDL, adernls de la vía no mediada por receptor o "vía de limpieza", que no es regulada.
EL COLESTEROL SE TRANSPORTA ENTRE LOS TEJIDOS DENTRO DE LAS LIPOPROTE~NAS PLASMÁTICAS (Figura 284) En los seres humanos cuya subsistencia se basa en dietas de tipo occidental, el colesterol plasmático total es aproximadamente 5.2 mmollL y se eleva con la edad, aunque hay variaciones amplias entre los indi-
Sínresis, transportey excreción del colesterol
325
MEMBRANA CELULAR
Figura 28-5. Factores que afectan el equilibrio del colesterol a nivel celular La inversibn del transporte de colecterol puede ser inicrada por la fijaubn de HDL a su receptor (apo A-l), el cual por medio de la proteína cinaca C (capitulo 44) estimula la traslocacibn del colesterol a la membrana plasrnática. (C, colesterol, CE, ester de colesterlo, ACAT, acil-CoA:colesterol aciltransferasa; LCAT, lecitina:wlesterol aciltransferasa; A-1, apoproteína A-1, LDL, lipoprotelnas de baja densidad; VLDL, lipoproteínas de muy baja densidad.) Las LDL y HDL no se muestran a escala.
viduos. En su mayor parte esta esterificado, es transportado en las lipoproteinas del plasma y su mayor proporcion se encuentra en las LDL. Sin embargo, bajo ciertas situaciones en que predominan cuantitativamente las VLDL, aumenta la cantidad d e colesterol pla~m8tícoque reside en esta fracción. El colesterol dietetico tarda varios días en equilibrarse con el colesterol del plasma y algunas semanas para equilibrarse con el de los tejidos. Su recambio en el hlgado es relativamente rápido comparado con la vida media del colesterol corporal total. El calesterol libre plasmático y hepatico se equilibra en algunas horas, dado que se intercambia y transfiere con facilidad entre las membranas celulares, lipoproteinas plasmhticas y membranas eritrocitarias. El &ter de colesterilode los alimentos es hidrolizado en colesterol libre, que se mezcla con el colesterol libre dietdtico y biliar, antes de su absorcion desde el intestino junto con otros lipidos. Se mezcla cun el wlest m l sintetizado en el intestino para incorporarse a los quilomicrones. Entre 80 y 90% del colesterol absor-
bido es esterificado con ácidos grasos de cadena larga en la mucosa intestinal. Los ecteroles vegetales (sitosteroles) apenas se absorben. Cuando los quilomicrones reaccionan can la lipoproteína lipasa para formar quilomicrones remanentes s61o se pierde 5% de los ksteres de colesterilo, el resto es captado por el hígado cuando los remanentes reaccionan con el receptor apo E o LDL y son hidrolizados a colesterol libre. Las VLDL formadas en el higado transportan colesterol al plasma. La mayor parte del colesterol de las VLDL es retenido en tos remanentes de estas lipoproteinas (IDL)que con captadas por el higado o convertidas en LDL,las que a su vez son captadas por los receptores para LDL, de los hepatocitos y a [os tejidos extrahepáticos.
LCAT se ocupa de la mayoría de los esteres de cotesterilo plasmáticos La actividad de la LCAT en el plasma se encarga virtualmente de todo el &ter de colesterilo plasrnhtico
326
Biaquímica de Harpcr
en el ser hurnano. (No es asi en otras especies como la rata, donde hay actividad apreciable de ACAT en el hígado, permitiendo que se exporte un2 cantidad significativa de cster de colesterilo en las VLDL nacGntes.) La actividad de la LCAT ce relaciona con una especie de HDL que contiene apo A-1. Cuando el colesterol de la HDL se esterifica, crea un gradiente de concentración y extrae colesterol de los tejidos y de otras lipoproteínas (figuras 28-5 y 28-61, Se vuelve menos denso y forma HULi, de la cual se piensa que se ocupa de entregar el colesterol al hígado. Por consiguiente, las características de la HDL destacan el transporte inverso dcl colesterol, proceso en el que se lleva el colesterol tis~ilaral higado.
(Capitulo 28)
La riroteína de transferencia de esteres colecterilo facilita el movimiento de éstos de las HDL a otras lipoproteínas Esta proteína, que se encuentra en el plasma humano, pero no en el de rata, se relaciona tambien con la H UL. Facilita la transferencia del éster de colesterilo de HDL a VI,DL, lDL, LDL y, en menor extensibn, a los quilomicrones, lo cual permite al triacilglicerol desplazarse en direccihn opuesta. Por tanto, releva de la inhibicion por producto a la actividad de LCA'T en Eas HDL. Así, en el ser tiurnano. mucho del éster de colesterilo formado por LCAT en IlDL encuentra su camino al
Figura 284. Transporte del colesterol entre los tejidos en los humanos. (C,colesterol libre; CE. éster de colesterila; TG, triacilglicerol; VLDL. lipoproteina de muy baja densidad, IDL, Iipoproteina de densidad intermedia; LDL, lipoproteina de bala densidad. HDL, lipoproteína de alta densidad; ACAT, acil-CoA.colesterol aciltransferasa: LCAT, lecitin:colesterol aciltransferasa: A-1, apoproteína A-1, CETP, ester de colesterilo que transfiere proteínas, LPL, lipoproteina lipasa; LH, Itpasa hepatita.)
hígado por medio de los remanentes de VLDL (IDL) o de LDL (figura 2 8 6 ) . De manera simultanea, HDL;, que se ha enriquecido con triacilgliceroles. se descarga de este en el hígado desp~iksde reaccionar con la lipasa hephtica y se recicla como HDLj.
POR ÚLTIMO, TODO EL COLESTEROL DEBE ENTRAR AL H~GADOY EXCRETARSE EN LA BILIS, COMO COLESTEROL O COMO ÁCIDOS BlLlARES (SALES) Aproximadamente el cuerpo elimina 1 g de colesterol por dia. Cerca de la mitad es excretado en las heces después de su conversión en acidos biIiares. El resto se excreta Como colesterol. Gran parte de1 coiesterol secretado en la bilis es resorbido y se cree que por lo menos un poco del que sirve como precursor para los esteroles fecales deriva de la mucosa intestinal. El coprostanol es el estero1 principal en 1s heces; se forma del colesterol en la parte inferior del intestino por acci6n de la flora bacteriana que ahí reside. Una gran proporcibn de la excreción de sales biliares es absorbida a la circulación portal, captada por el higado y excretada de nuevo a la bilis. Este ciclo se conoce como circulacibn enternhepitica. L a sales biliares no resorbidas o sus derivados, se excretan en las heces.
El colesterol forma ácidos biliares Los hcidos biliares primarias son sintetiyados en el higado a partir del colesterol. El acido cólico, el ácido biliar más abundante en la bilis, junto con el ácido quenndesoxicólico, s e forman d e un precursor común, derivado a su vez del colesterol (figura 28-7). La 7 atfa hidroxilación del colesterol es el primer paso obligado en la biosintesis de 5cidos biliares y es la reaccibn limitante de la velocidad en la vía. La reacción es catalizada por la 7 alfa hidroxilasa, una enzima microsbrnica. Requiere oxígeno, NADPH y citocrnmo P450 y al parecer es una monooxigenasa típica; los pasos subsiguientes de la hidroxilaciiin tambikn son catalizados por monooxigenasa. La deficiencia de vitamina C interfiere en la formacibn de los hcidos biliares en el paso de la 3 alfa hidroxilacion y causa acumulaci6n de colesterol y aterosclesosis en los CObayos escorbúticos. La víade la biosíntesis de ácidos biliares se divide pronto en iina derivacibn que conduce s colil COA caracterizado por un grupo alfa OH extra en la posicidn 12 mientras que la otra derivación conduce a quenodesoxicolil COA.Sin contar esta diferencia, las dos vías comprenden reacciones de hidroxilacjón semejantes y el acortamiento de la cadena lateral (figura
28-7) para dar las estructuras típicas de los hcidos biliares con núcleo esferoide totalmente sanirado y gmpos alfa-OH en las posiciones 3 y 7. Estos Bcidoc biliares primarios entran a la bilis como conjugados de gllclna o de taurina. En el ser humano, la proporción de los conjugados de glicina a los conjugados de taurina es normalmente 3 :1. Puesto que la bilis contiene caiitidades importantes de sodio y potasio y su p H es alcalino, se presume que los acidos biliares y sus con.juugados están en realidad en r o m a de sales, de aqui el termino "sales biliares". Una proporción de los acidos biiiares primarios en el intestino esth wjeta a ciertos cambios ulteriores por la actividad de las bacterias intestinales. Éstos incluyen la desconjugacibn y la 7 alfa deshidroxilación, que producen los ácidos hiliares secundarios, acido desoxicólico del ácido chlico y acido litocólico dcl Acido quenodesoxiciilico (figura 28-71,
Casi la totalidad de ácidos biliiares retornan al hígado en la circulacíon enterohepática Aunqiie los productos de digestión de las grasas, inc!uyendo el colesterol, son absorbidos en los primeros 100 cm del intestino delgado, los ácidos biliares primarios y secundarios se absorben casi exclusivamente en el íleon, retornando al higado por la circulación portal cerca de 98 a 99% de los hcidos biliares secretados al intestino. Esto es conocido como la circulaciíin enterohcphtica. Sin embargo, el Bcido litociilico, por su insolubilidad, no es resorbido en cantidad apreciable. Una fracción pequeña de los ácidos biliares, quizh s610 400 mgtdía, escapa a la absorcihn por lo cual es eliminada en las heces. Aunque es una cantidad muy pequeña, no obstante representa una vía mayor para la eliminacibn dei colesterol. La circulacibn enterohepática de las sales biliares es tan eficiente que cada día el depósito relativamente pequelio de acidos biliarec (aproximadamente de 3 a 5 g) puede circular a través del intestino de 6 a 10 veces con sblo una pequefía pkrdida en las heces; es decir, de 1 a 2% por cada paso a través de la circulaci6n enterohepática. No obstante, cada dia, una cantidad de acidos biliares equivalcrite a la que se pierde en las heces es sintetirada a partir del colesterol en el higado, de modo que se mantiene constante e3 deposito de ácidos biliares. El proceso utiliza un sistema de control por retroalimentación.
La síntesis de acidos biliares se en
regula
paco de 7 alfa hidroxilasa
El principal paso limitante de la velocidad en la biosintesis de los ácidos biliares es la reacción de la 7 al fa hidroxilasa y en la biosintesis del colesterol es el
328
{Capitulo 28)
Bioquimica de Hmper
Vitamina C
7a-Hidroxicolesteml
Acidos biliares Deficiencka 2 COA SH
unna
(Vanos pasos)
NADPH + H* 2 COA SH
/++A LA
n
Acido tal.broc61ico (Acido biliar primario)
Giic
(&cidosbiliares primarios)
1
Deswnjugacibn + 7a-deshidroxilacibn
m
Acido gluc6lico @cid0biliar primario)
DesconjugaUbn + 7a-deshidroxilacion
Y ?
HO" Acioo desoxicblico (ácido biliar secundario)
Acido lito&!ico ($cid0 biliar secundario)
Figura 28-7. Biosintesis y degradaci6n de los hcidos biliares. Tatalizada por enzirnas microbianac.
paso de la HMG-COA reductasa (figura 28-1). Las actividades de estas dos enzimas a menudo cambian en paralelo, por lo que es dificil averiguar si la inhibicidn de la síntesis de los ácidas biliarec tiene lugar primariamente en el paso de la HMG-CoA reductasa o en la reacción de la 3 alfa hidroxilasa. Las dos enzimas experimentan una semejante variaciún diurna en su actividad. Se ha demostrado la induccibn del gen para la 7 alfa hidroxilasa mediante el colesterol dietético y
Ea supresjbn por medio de los acidos biliares. A este respecto, el retorno de las sales biliares al hígado por la circulacion enterohepática es un control importante que, si es interrumpido, conduce a la activación de la 7 aIfa hidoxilasa. Tanto esta enzima como la HMGCOA reductasa, pueden ser controladas por fosforilaci6n4esfosforilación covalente. En contraste con la HMG-Coh reductasa, es la forma fosforilada la que incrementa la actividad de la 7 alfa hidroxilasa.
Síntesi~,transporte y excreciún del colesteral
ASPECTOS CL~NICOS El colesterol sérico se correlaciona con la incidencia de aterosclerosis y coronariopatias De [os lipidos séricos, el colesterol es el que más a menudo ha sido sefíalado como el principal agente comprometido en esta relación. Sin embargo, otros parámetros, como la concentración de triacilglicesol en el suero, muestran correlaciones semejantes. Los pacientes con enfermedad arterial pueden tener cualquiera de las siguientes anormalidades: 1) concentraciones elevadas de VLDL, con concent~aciones normales de LDL; 2) LDL elevadas con VLDL normales; o 3) elevacion de ambas fracciones lipoproteínicas. Hay tarnbikn una relacihn inversa entre las concentraciones de HDL (HDL?) y la enfermedad coronaria y algunos consideran que la relacibn más predecible es la proporción CDL:HDL colesterol. Esta relación es explicable en terminos de funciones propuestas de las LDL en el transporte del colesterol a los tejidos y de las HDL que actuan como limpiadores del colesterol en e[ transporte inverso del compuesto. La aterosclerosis se caracteriza por la acumulacibn de colesterol y de ésteres de colesterilo y de lipoproteínas que contiene apo 8-100 en el tejido conjuntivo de las paredes artenales. Las enfermedades en las cuales se producen prolongadas concentraciones sanguineas elevadas de VLDL, IDL y remanentes de quilomicrón, o LDL (por ejemplo, diabetes sacarina, nefrosis lipidica, hipotiroidismo y otros padecimientos hiperlipidernicos) e s t h a menudo acompafiadas por aterosclerosis prematura o más grave. Los experimentos con inducción de aterosclerosis en los animales indican una amplia variación de susceptibilidad en las especies. El conejo, el cerdo, el mono y el ser humano son especies en las cuales la aterosclerosis puede ser inducida por alimentación con colesterol, mientras que la rata, el perro y el gato son resistentes. La tiroidectornia o el tratamiento con fármacos de tiouracilo permiten la indriccibn de aterosclerosis en el perro y en la rata. El colesterol sanguíneo bajo es una característica de hipertiroidisrno.
Los cambios en la alimentación tienen una función importante en la reducción del colesterol sérico Aunque los factores hereditarios tienen una fuerte ingerencia en la determinacián de las concentraciones sanguineas individuales de colesterol, las dietas y los factores ambientales que reducen el colesterol sanguíneo, la sustituci6n en los alimentos de hcidos
* 329
grasos monoinsaturados y poliinsaturados por algunos ácidos grasos saturados es muy benéfica. Los aceites naturales que contierien una proporci6n alta de ácidos grasos poliinsaturados incluyen aceites de girasol. semilla de algodhn, maíz, soya; el aceite de olivo contiene proporción elevada de ácidos grasos monoinsaturados. Pos otra parte, la mantequilla, la grasa de res y el aceite de coco contienen una proporción elevada de acidos grasos saturados. La sacarosa y la fmclosa tienen un efecto mayor en la elevación de los lípidoc sanguíneos, en particular tsiacilgliceroles, que otros carbohídratos. La razón del efecto decreciente de los ácidos grasos poliinsaturados sobre el colesterol na está clara todavia. Sin embargo, se han emitido varias hipbtesic para explicar el efecto, incluyendo la estimulacibn de la excreción del colesterol en el intestino y la estirnulación de la oxidacibn del colesterol en Bcidos biIiares. Las dietas ricas en palmitato inhiben la conversión del colesterol en hcidos biliarec. Hay otra prueba de que el efecto se debe en gran parte a un desplazamiento en la distribucion del colesterol del plasma hacia los tejidos, debido a un incremento en el índice catabólico en las LDL, a la regulación en alta del receptor para LDL por ácidos grasos poli y rnonoinsaturados y a regulación en baja por ácidos grasos saturados. Los acidos grasos saturados inducen la formación de partículas mhs pequefías de VLDL que contienen relativamente mlis colesterol y son utilizadas por los tejidos exhahepáticos a una velocidad más lenta que las particulas más grandes, tendencias que pueden ser consideradas como aterógenas.
El estilo de vida afecta la concentración sérica de colesterol Los factores adicionales que contribuyen en la enfermedad coronaria incluyen la hipertensión arterial, el tabaquismo, pertenecer al sexo masculino, la obesidad, la falta de ejercicio y la ingestibn de agua blanda en lugar de dura. La elevacibn de los ácidos grasos libres plasmhticos lleva tambikn a una secreción aumentada de VLDL por el hfgado, lo cual implica salida extra de triacilgliceroles y colesterol hacia la circulacihn. Los factores que conducen a concentraciones más altas o fluctuantes de hcidos grasos libres incluyen la tensibn emocional, la nicotina proveniente de los cigarrillos, el café y la distribución de pocas comidas abundantes en lugar de una alimentacidn más continua. Las mujeres premenopáusicas parecen estar protegidas contra muchos de los factores datiinos, posiblemente porque tienen concentraciones mayores de HDL que los varones y las mujeres posmenopáusicas. Es interesante que los estudios demuestren una correlación entre el consumo moderado de alcohol y una incidencia menor de enfermedad coronaria. Esto
se puede deber al aumento de las concentraciones de HDL, pero se manifiesta que el vino tinto es en par-
ticular benefico, quizi por su contenido deantioxidantes.
Cuando los cambios de dieta fallan, los medicamentos hipolipidernicos reducirán el colesterol sérico y los triacilgliceroles L,a hipercolesterolemia puede ser tratada mediante intempcion de la circulación enterohepatica de acidos biliares. Es posible lograr una reducción significativa de colestcrol piasrnatico con el uso de la resina colestiramina o por vía quirúrgica mediante exclusión ileal. Los dos procedimientos bloquean la resorción de los ácidos biliares. Luzgo. debido a la ausencia de la regulacion por retroalimentación, ejercida normalmente por los ácidos biliares. la conversión de colesterol en estos últimos aumenta de modo notable, en un esfuerzo por conservar el dephcito de Acidos biliares. En consecuencia, los receptores para LDL en el hígado son regulados en alta, lo ciral aumenta la captación de LDL con la subsecuente reducción del colesterol plasmático. El sitosterol es un fármaco hipocolesteroIémico que actíia bloqueando la absorción de: colesterol en las vías gastrointcstinales. Se conocen varios medicamentos que bloquean la formación de colesterol en varias etapas de la ruta biosintética. Los inhibidores misílticos de la IIMGXoA reductasa, mevastatina y lovastatina, reducen [as concentraciones de colesterol LDL mediante la regulación en alta de los receptores para LDL. El clofihrato y el gernfibrocilejercen parte de su efecto hipolipidémico (principalmente en los triacilgliceroles) al desviar el movimiento de ácidos grasos libres en el hígado de las vias de esterificación hasta las de oxidación, reduciendo ~i la secreción hephtica de triacilglicerol y colesterol en forma de VLDL. Adernhs, facilitan la hidrólisisde lostriacilglicerolesde las VLD1, por laacción de la lipoproteina lipasa. A1 parecer, el prohricol incrementa el catabolismo de LDL por vtas independientes del receptor, pero sus propiedades antioxidantes pueden tener m& importancia en la prevencibn del depiisito de LDL oxidado en las paredes arteriales. LaLDL oxidada puede ser una causa primaria de aterosclerosis. El ftcida nicotínico disminuye el flujo d e AGL por inhibición de la lipblisis en el tejido adiposo y, por tanto, la produccibn de VLDL en el hígado.
Los trastornos primarios de las lipoproteínas plasmáticas (dislipoproteinemias) son hereditarios Algunas personas en la poblacidn muestran defectos hereditarios en sus iipoprateinas que llevan a la con-
dición primaria ya sea de hipo o hipcrlipoproteinemia (cuadro 28-1). Muchos otros con enfermedades como la diabetes sacarina, el hipotiroidismo y aterosclerosis. muestran patrones secundarios anormales de lipoproteinas que son muy semejantes a una u otra de las condiciones hereditarias primarias. Prácticamente todas estas enfermedades se deben a un defecto en una o en otra etapa en el curso de la forrnacibn, transporte o catal?olismo de las lipoproteinas (figuras 2 7 4 , 28-5 y 2 8 4 ) . No todas las anormalidades snn nocivas.
RESUMEN 1) El colesterol es precufior de todos los demh esteroides
corporales, por ejemplo, corticostcroides, hormonas sexuales, ácidosbiliares y vitamina D. Tarnbihn es un lipido anfipático importante, que tiene una función en las membranas celulares y en la capa externa de lipoproteinas. 2) Et colesterol es sintetizado por entero en el cuerpo a partir de a c e t i l 4 o A por u n a vía compleja. Tres moléculas de acetil-CoA forman mcvalonato en una reacción limitantc de la velocidad de la vía, catalizada por HMG-CoA reductasa. Del mevalonato se forma una unidad isoprenoide de cinco carbonos, y seis de estas unidades icoprenoides se condensan para formar escuaIeno. E1 escualeno experimenta ciclizacilin para formar ct esteroide precursor, lanosterol que, despues de perder tres grupos metilo, forma colesterol. 3) La sintesis hepatica de colesterol es regulada de manera parcial por el flujo de colesterol dietetico transportado por remanentes de quilomicrbn ricos en colesterol. En general, en 10s tejidos se mantiene el equilibrio del colesterol entre los factores que causan ganancia de este compuesto (por ejempio, síntesis, captación por medio de LDL o receptores de limpieza, hidrrjlisis de ésteres de colesterilo) y tos factores que causan pérdida de coIester01 (por ejemplo, síntesis de esteroides, formaci0n de ésteres de colesterilo e i n v e ~ i h ndel transporte de GOlesterol por HDL). La actividad del receptor para LDL es regulada en baja por una concentracion celular elevada de colesterol y es regulada en alta cuando el colesterol se agota. 4) En el transporte Inverso del colesterol, HDL se adhiere al receptor apo A-1, haciendo que el colesterol experimente tsaslocaci6n a la membrana celular, donde es captado por HDL. Mediante la actividad de LCAT se conserva un gradiente de concentracibn, de modo que el colesterol es esterificadey depositado en el núcleo de la HDL. El ester de colesterilo en HDL es captado por el hlgado, ya sea en forma directa o después de Ia transferencia a VLDL, IDL
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Cuadro 28-1. Trastornos primarias de las lipoproteinas plasrnáticas (dislipoprriteinemias)* - ...- .. - --
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Hiperlipopreteinemias 9) 1)eficiencia de LFL, o h) pmducci Deficiencia 1de lipoprottina li- I.PI ,anormal, o c) deficiencia de apo paqa fami liar (tipo 1)
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de LDL y
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nento en IiI densidad < 1.019 en quilomiHiperiipoproileinemia fa1 deficiencia en la depuracicin del i tip u1 (cnfe& te por e l higado se debe a la anomi ies y VLDI-, que apariece a la elc:ctroforesis bei ---r n-rriu- I rii apa E la ciial por 10 w m u,.-n sc- CiiLuerim .- . _J_ L II ,,, n r Ocasiona nlia. e n f m-c-,1-1 udu w ~ u i zuiiu tai u iud aiiuia i r l c . r i YLUL). ;¡&del re,manen&,diskta- 1 pre:xnie en tnrs isofonnas. E2, E3 y E¿i.t o s ' hipc mas y ater lipoproteinemia familiar) icnres s61u tienen 1 2 rque no reac c i m a en a rinarias el receptor E. Existeter1 eipccies ; ~rnpietas
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Hipettnrtcilglicremlemia fz (tipo rV)
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Idos valores de colestrrol se elevan con la conwntracihn de VLDt. Las LDL y NDI, tienden a ser subnomales Este tipo dc patriin se relaciona por lo común con coronariopatia, diabetes sacarina tipo 11 no insu!inodependiente, obesidad, alcoholismo y adminishcirin de progestágenos
irepmduccihn de YLDL a menudo relacioilada con la iiitolcmncia a la glucosa e . hipiirinsulinemia, que puede deberse a la l -..L K D C O ~ ~ I C C ~ ~ I I
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iiipri~poproteinemiatamiiiar 1 ~ausadesconocidaque conduce aerevacih 1 IipertriaciIglicerolcmia e hipercolesterolemia LDI. y HDL bajas. Ricsgo elevado de coronatipo V les y VLDL alía en algunos pacientes
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elevadas de HDL
icficiencia de esta enzima puede ori rnulacibn de mucho? rcrnanenti L y VI.DL ricos en triacilglicerole
Deficiencia de !a lipasa tica
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1:ieficlencia iiecitin:cole.sterol La deficiencia de LCAT conduce a un aciltransf erasa (LCA,'Y) fa- blotque0 en el bansporte inverso de colcstemiliar m\. La HDL permanece como discos nacientes en empalizadas o pilas, incapmde sumir y esterificar el colesieroI
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*tornopoco frecucnte. en riparienc nara la saltid v lon~evidad gacientcs ti men xantoi
iariopatias
1 Las conoenrraciones plasmaticas
de Csteres de colecten10 j lisolecitinason bajas Se encuentra una fraccibn anormal de LDL, lipoproleina X que también se encuentran en pacicntes concolcstasis. VLDL es anormal (Lieia VI
xmatura p a) consiste en un mol dc LDL adherido ' Enfcrrnedad ci por inhibic molde apo(a). Laapo(a)rnanifi~horno- clerosis, mhs I as esúucturales con el plasniinhgeno fibrinblisis * Hay una correlacibn entre los pcientis que poscen el alero de Ia apo E4 y la incidencia dc enfermedad de Alzheimer. Al parecer, la apo E4 se enlaza con más avidez a los k t a amiloides quc se 1oc;ilizan en las placas neiirales. Exceso familiar de
teínas
lir
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(Capítulo 28)
o LDL por acción de la proteina de transferencia de dsteres de celesterilo. S) El exceso de celesterol es excretado desde el
higado en Ea bilis sin cambio o como sales biliares. Una gran proporción de las sales biliares se resorben a la circulaci6n portal y regresan al higado como parte de la circulaci6n enterohepática. 6) Las concentracionec altas de colesterol en VLDL, TDL o LDL se relacionan con aterosclerosis, en tanto que los valores elevados de HDL tienen un efecto protector.
7) En la población, unos cuantos individuos tienen defectos hereditarios en el metabolismo de las lipoproteínas que los conduce a un trastorno primario de hipolipoproteinemia o hiperlipoproteinernia. Muchos otros que padecen enfermedades como diabetes sacarina, hipotiroidismo, renopatia y aterosclerosis muestran patrones secundarios anormales de lipoproteínas que son semejantes a una u otra de las situaciones primarias.
REFERENCIAS Fears R, Sabine JR (editors): Cholesi~rolTu-HvdrqSase (ya-~Wonooxyg~nasej. CRC Press, 1 986. Fielding CJ, Fieldinpl PE: Metaholisrn of cholesterol and lipoproteins. Page 404 in. Biochemistty of Lipids and ,!dernbranes Vance DE, Vance JE (editors). BenjaminlCurnmings. t 985. ~ a n JB, e HnveI RJ: Treatrnent of hypercholesterolemia. Annu Rev Med 1986;37:427. Mahleg RW, Innerarity TL: Lipoprotein receptors and cholesterol homeostasis. Biochim Biophys Acta 1983;737:197. Mendez AJ, Oram JF, Bierrnan EL: Protein kinme C as amediator ofhigh density lipoprotein receptor dcpcndeni effiux of intracelluJar cholesterol. J Biol Chem 1991:266:10104.
Repori nf the ExpeH Panel un Deteciiori. Evaluation a ~ d Treatment of High Blood Cholesferolin Adulfs. N 11 I Fuhlication No. 88-2925. January 1988. Russell DW: Cholesterol biosynthesis and mctabolisrn. Cardiovascular Dmgs Therap 1992.6: 103. Russell DW, Setchell KDR: Hile acid biosynthesis. Biochernistry 1992,3 1:4737. Spady DK, Woollett LA, Dietschy JM: Regulation of plasma [>DI,-cholesterol levels by dietay cholcstcrol and fatty acid. Annu Rev Nutr 1993; 13:355. Rudney H, Sexton RC: Regularion of cholestero1 biosynthesis. Annu Rev Nutr 1986;6:245. Varios autores: The cholesterol facts-A summary of the evidence relating dietary fats, serum cholesterol, and coronary heart disease. Circulation 1990:81:1721. Varios autores: The hypertriglyceridemias: Risk and managcment. Am J Cardiol 199 1;h8: IA.
i.nteqración de! metabolismo v el! suminisitro de eneraéticos %
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Peter A. Mayes, PhD, DSc
Aunque los carbohidratos y lipidos desempeiían numerosas actividades estructurales y metabólicas, su fwncihn como proveedores de una gran proporción de las calorías dietktices es la que tiene el impacto mayor sobre el metabolismo y la salud. La regulaci6n de esta entrada de energkticos y la manera en que se integran con otros combustibles tisulares son de interés capital, dado que afectan a muchos otros procesos metabólicos e intervienen en el desarrollo de la enfermedad metabólica.
IMPORTANCIA BIOMEDICA En condiciones de equilibrio calbrico positivo, una proporcibn significativa de la ingestibn calbrica dietdica se almacena corno glucógeno o gasas. Si la dieta es sobre todo de carbohidratos, la glucosa será el principal combustible de los tejidos. Sin embargo, en muchos tejidos, inclusive en condiciones de nutrición suficiente, los acidos grasos se oxidan de preferencia a glucosa, en particular en estados de ddficit caldrico o inanicidn. El propasito es ahorrar glucosa para aquellos tejidos (por ejemplo, el cerebro y los eritroc i t o ~ )que lo requieren en todas las circunstancias. Así, los mecanismos reguladores, a menudo mediados por hormonas,, aseguran un suministro energético adecuado para todos los tejidos en todo momento, desde el estado de nutricibn completa hasta la inanicibntotal. La desorganimcionde estos mecanismos se debe a decequilibno hormonal (como la deficiencia
de insulina en diabetes sacarina}, a desequilibrio metabdlicopor lactancia excesiva (es el caso de la cetosis del ganado) o a demandas metabólicas altas en el embaram (por ejemplo, la toxemia gravidica en ovejas). Todas éstas son aberraciones patologicas del síndrome de inanicibn que es una cornplicaci6n de muchas situaciones médicas cuando el apetito disminuye.
NO TOPOS LOS ALIMENTOS SON INTERCONVERTIBLES (Figura 29-1) El hecho de que los animales puedan ser engordados con alimentacion que predominantemente contiene carbohidratos, demuestra la facilidad de su conversibn a grasas. Sin embargo, como ya se ha sehalado, el ser humano puede estar limitado en el grado al cual la glucosa puede convertirse en Acidos grasos, en particular en tejido adiposo. Una reaccidn más significativa a este respecto es la conversidn de pimvato en acetilCOA,ya que estaúItima es el compuesto de inicio para la sintesis de acidos grasos de cadena larga. No obstante, en cuanto al proceso inverso, la conversión de acidos grasos en glucosa, la reaccibn de la piruvato deshidrogenasa es en esencia irreversible, lo que evita la conversibn directa de la acetilXoA, en pinivata. AdemBs, no puede haber una conversión total de la acezilCoA en oxalacetato a través del ciclo del acido cítrico, ya que se requiere una molécula de oxalacetato paracondensarse con la acetil-CoA y sblo una molécula de oxalacetate es regenerada. Por razones semejantes, no puede haber una conversión total de Qcidosgrasos que tengan un número impar de
334
(Capítulo 29)
Biriquímica de Hurper
Carbohidratos
Grasas Triacilgliceml
T IJ- -5 Fructosa
Serina I
Trmsa fosfato
Glicerol (Giioeml 3-fosfatol
Acidos grasos
Figura 29-T. lnterconversibn de los principales alimentos.
Btomos de carbono (los cuales forman acetilXoA) en glucosa o glucógeno. S610 la porción terminal de tres carbonos de un ácido graso que tenga un numero impatnde Btomos de carbono es glucogdnica, ya que esta porci6n de la molécula formará propionil4oA hasta la betaoxidación. No obstante, es posible hallar finalmente a los átomos de carbono de los hcidos grasos marcados en el gluc6geno después de atravesar
el ciclo del hcido cítrico. Esto se: debe a que el oxalacetato es un intermediario en el ciclo del hcido cítrico y en la vía de la gluconeogtnesis. La fraccion glicerol de los triacilgliceroles formarh glucosa despues de la activacion aglicerol3-fosfato, y esto es una fuente importante de glucosa en la inanicidn. Muchos de los esqueletos de carbono de los aminohcidos no esenciales pueden ser producidos a partir
In!e~racidndel met,
de carbohidratos a través del cicIo del Iicido citrico y la transaminacion. Por reversi611 de estos procesos, los arninoacidos glucogénicos rinden esqueletos de carbono que son miembros o precursores del ciclo del acido cítrico. Por tanto, facilmente se convierten por las vías giuconeogénicas a glucosa y gluc6geno. Los aminoácidos cetogéaicos dan lugar a acetoacetato, el cual a su vez será metabolizado como cuerpos cetónicos. formando a c e t i l 4 o A en los tejidos extrahepáticos. Por las mismas razones que impiden la c o n v e r s h total de hcidos grasos en carbohidratos, es imposible la conversihn neta de Acidos grasos en aminoácidos g!ucogénicos. No es posible revertir las vías de dcgradaci~nde los aminoácidos cetogénicos y otros aminoacidos, los cuales se encuentran en la categoria de aminoficidos esenciales para la nutriciiin. La conversiiin de los esqueletos de carbono de los aminolcidos gIucog&nicosen ácidos grasos, es posible mediante la L~rmaciónde piruvato de acetil-COA o por la reversión de las reacciones no mitocondriales del ciclo del ácido cítrico a partir de alfa cetoglutarato hasta citrato seguidas de !a accibn de la ATP-citratoliasa, que resulta en a c e t i l 4 o A (capítulo 23). Sin embargo, por lo general la conversión neta de: aminoacidos en grasa no es un proceso significativo. Incluso en carnivoros con una dieta alta en proteinas, la ingestihn de grasas cambien es grande, lo que puede inhibir la lipogénesis.
LA ECONOM~ADEL METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Y L~PIDOS INCLUYE A TODO EL CUERPO La glucosa es una necesidad metabólica para el cerebro y les eritrocitos en todos los estados de nutrición Se han descrito muchos de los detalles de la interacción del metabolismo de los carbohidratos y de los lipidos en varios tejidos, en particular la sencilla conversibn de numerosas sustancias glucogénicas a glucosa y glucbgeno por gluconeog6nesis. Este último proceso tiene importancia particular debido a que ciertos tejidos y tipos celulares, incluyendo el sistema nervioso central y los eritrocitos, dependen de un suministro continuo de glucosa. Probablemente los tejidas extrahepáticos necesitan una provisibn minima de glucosa para mantener las concentraciones de oxalacetato y la integridad del ciclo del Acido citrico. Ademhs, la glucosa parece ser la fuente principal de glicerol 3fosfato en los tejidos carentes de glicerol cinasa como es el tejido adiposo. Hay por esto, una velocidad
minima obligatoria de oxidación de glucosa bajo todas las alteraciones. Asimismo, se necesitan grandes cantidades de glucosa para la nutricibn del feto y la sintesis de leche. Ciertos mecanismos, ademk de la gluconeogknesis, protegen los suministros esenciales de glucosa en tiempos de escasez, permitiendo que otros sustratos economicen su oxidacion.
La utilización preferencial de cuerpos cetonicos y ácidos grasos libres economiza glucosa para funciones esenciales Los cuerpos cetdnicos y los Asidos grasos libres ahorran la oxidación de la glucosa en el múscuto impidiendo su entrada en la célula, su fosforilacibn por la hexocinasa y por la fosfofructocinasa y la descarboxilacibn oxidativa del piruvato. Idaoxidacion de los ácidos grasos libres y los cuerpos cetbnicos eleva la concena-ación intsaceliilar del citrato. aue a su vez inhibe a la fosfohctocinasa de manera alostérica. La oxidacion de estos sustratos también hace que las proporciones [acetilCoA]/[CoA] y [ATP]/[ADP] aumenten, inhibiendo la actividad de la piruvato deshidrogenasa (figura 19-6). Estas y otras observaciones demostraron que el acete acetato era oxidado en el corazón irrigado, de preferencia a 10s ácidos grasos libres, justificando la conclusi6n de que en condiciones de escasezde carbohidratos, los combustibles disponibles son oxidados en el siguiente orden de preferencia: 1) cuerpos cetónicos (y probablemente otros ácidos grasos de cadena corta, como e l acetato), 2) hcidos grasos Iibres y 3) glucosa. Esto no quiere decir que cualquier combustible particular sea oxidado con la exclusihn total de cualquier otrc, ya que por lo comun se usa una mezcla de diferentes combustiblec (figura 29-2). Sin embargo, estos mecanismos son más importantes en los tejidos que tienen una elevada capacidad para la oxidación aerbbica de los iicidos grasos, por ejemplo, el coradn y los músculos de contraccibn lenta, que en los tejidos con baja capacidad, como el músculo de contraccidn rhpida. La combinacibn de los efectos de los dcidos grasos tibres en el ahorro de la utilizricibn de la glucosa en el músculo y corazón y el efecto de la glucosa ahorrada en la inhibicibn de la movilizaci6n de hcidoc grasos libres en el tejido adiposo, ha sido denominada ciclo glucosa-bicidosgrasos. En el ejercicio moderado, los lípidos son el combustible principal, pero en el intenso llegan a ser menos adecuados, por lo que los carbohidratos asumen la función de combustible principal hasta que se consume el glucbgeno muscular. Tienen importancia las reservas de triacilglicerol en las propias células musculares.
(Capítulo 29)
336 Bioquimica de Harper
Glicerol 3-fosfato
Acil-COA
*
TEJIDO ADIPOSO
Triacilgliaeroles (TG)
AGL
Glicerol
Cuerpos cetbniwc
kil-COA
Glicerol 3-fosfato Glucosa 6-fosfato
~cetil-COA
2C01
AminoBcidos, lactato
Glucbgeno
Figura 29-2. Interrelaaones rnetab6licas entre el tejido adiposo, el hlgado y los tejidos extrahepátiws. (LPL, lipoproteina Iipasa, AGL, Acidos grasos libres, VLDL, lipoproteinas de muy baja densidad.)
Integración del metabolismo y el suministro de energéticos tisulares 337
DURANTE LA INANICIÓN, LOS MECANISMOS PROPORCIONAN UN SUMINISTRO CONTINUO DE ENERG€TICOS A LOS TEJIDOS En animales alimentados con dietas ricas en carbohidrato~,la oxidación de ácidos grasos es economizada. Esto se debe a que la IipÓEisis del tejido adiposo se inhibe por las elevadas concentraciones sanguineas de glucosa e insulina, por lo cua! los v a l o r ~ sde icido graso libre permanecen bajos (figura 29-3). Durante la alimentación humana normal, las proporciones de los diversos nutrienzes calorificos oxidados son definidas por sus cantidades relativas en la dieta. A medida que el animal pasa del estado de alimentacibn al de ayuno, decrece la disponibilidad de gPlucosa y se emplea glucógeno hephtico en un intento por conservar la concentracibn de la glucosa sanguinea. La concentración de insulina disminuye en la sangre y se eleva la de glucagón. Cuando disminuye la utilización de glucosa en el tejido adiposo y el efecto inhibitorio de fa insulina sobre la lipólisis del tejido adiposo se hace menor, la grasa es movilizada como hcidos grasos libres y gticerol. Los primeros se transportan a los tejidos no adiposos donde son oxidados o esterificados. El glicerol se une al almacén de carbohidratos después de su activacibn a glicerol 3-fosfato, principalmente en el hígado y los riiiones. Durante esta fase en transici6n desde el estado de alimentacibn completa al de Glucagbn plasm8tim
ayuno completo, la produccidn end6gena de glucosa (a partir de los aminolcidos y del glicerol) no va al mismo paso con su utilizacidn y oxidación, ya que los depositos de glucágeno se llegan a agotar y la glucosa sanguínea tiende a caer. Asi, la grasa se moviliza a una velocidad siempre creciente y en varias horas los hcidos grasos libres plasmaticos y la glucosa sanguínea se estabilizan en el valor de ajuno (0.7 a 0.8 y 3.3 a 3.9 mmol/L, respectivamente). En este punto se debe suponer que el suministro de glucosa en codo el animal equilibra las demandas obligatorias para la utilización y oxidación de la misma. Esta se logra con un aumento en la oxidación de ácidos grasos libres y cuerpos cetónicos, ahorrando la oxidacidn no obligatoria de la glucosa. Este fino equilibrio es alterado en condiciones que demandan más glucosa o cuando su utilizacion estii deteriorada y, por tanto, conduce a mas movilización de grasas. La provisibn de carbohidrato5 por el tejido adiposo, en la forma de glicerol, es una iüncibn importante porque es s61o esta fuente de carbohidrato~,junto con aquélla proporcionada por la gluconeoghesis a partir de las proteinas, la que puede suministrar al organismo en ayuno la grucosa indispensable para aquellos procesos que la necesitan. En la inanición prolongada en el hombre, la gluconeogkneis a partir d e las proteinas esth disminuida debido a la liberaci6n reducida de aminohcidos, particularmente de la alanina del músculo. Esto coincide con la adaptación del encéfalo para reemplazar aproximadamente la mitad de la glucosa oxidada con los cuerpos cetónicos. En la inanicihn prolongada, la glucosa contribuye con menos de 5% del sustrato total oxidado en todo el cuerpo. Despubs de alimentar nuevamente con glucosa a los animales hambrientos, la glucog&nesishepática se produce a través de un intermediario de tres carbonos como el lactato, indicando que la gluconeogénesis continúa por algún tiempo después de reiniciar la alimentacidn.
La cetosis es una adaptación rnetabólica para la inanición
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Glucosa sanguínea
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Horas de inanicibn
Figura 24-3.Cambios relativos en los parárnetros metabolicos durante el inicio de la inaniucin.
La füncibn primaria de la cetogknesis es eliminar el exceso de carbonos de Acido graso del higado en una forma que es oxidada con facilidad por los tejidos extrahepáticos en lugar de glucosa. La cetosis surge a consecuencia de una deficiencia en el carbohidrato disponible; lo anterior implica las acciones siguientes en el fomento de cetogknesis (figuras 24-9 y 24-10): 1) Causa un desequilibrio entre esterificacibn y lipólisis en el tejido adiposo como resultado de bajas concentraciones de insulina, con la liberación subsecuente de hcidos g a s o s libres a la circulación. Estos ácidos son los sustratos principales para la formacidn de cuerpos cetónicos en el hígado; por tanto, todos los factores, metabblicos o endocrinos, que afectan esta
(Capitulo 29)
liberación de hcidos grasos del tejido adiposo, influyen en la cetogenesis. 2) En la entrada de hcidos gmsos libres al hígado, el equilibrio entre esterificación y oxidación es gobernado por camitina palmitoiltransferasa 1. cuya actividad aumenta de manera indirecta debido a la concentración de ácidos grasos libres y al incremento de la proporción glucagbn: insul ina. 3 ) Conforme aumenta el ácido graso que se oxida. se incrementa la fomacibn de cuerpos cetbnicos y disminuye ¡a degradaciún a COZ,regulado de manera tal que la produccibn total de ATP en el hlgado se mantiene constante (figura 24-9). Puede operar un mecanismo de retroaIirnentaciiin para controlar la salida de ácidos grasos libres del tejido adiposo en la inanicibn, como resultado de la accibn de los cuerpos cetúnicos y de los ácidos grasos libres para estimular directamente al phncreas para producir insulina. En la rnayoria de los trastornos, los ácidos grasos libres son movilizados en exceso a los requerimientos oxidativos, ya que una gran proporciones esterificada, aun durante el ayuno. Como el higado incorpora y esterifica una proporción considemble de la produccibn de ácidos grasos libres, desempeifa un papel regulador en laremoci61-1del exceso de tales ácidos de la circulacih. Cuando el suministro de carbohidratoses adecuado, casi todo lo que entra es ester'ificado y, en última instancia, retransportado desde el hlgado como VLDL para ser utilizado por otros te-jiidoc Sin embargo, ante un aumento de afluencia de iicidos gracos libres. se dispone de una ruta alternativa, la cetogénesis, que permite al higado continuar retransportando mucho del flujo de hcidos grasos libres en una forma que es flicilmente utilizada por los tejidos extrahepáticos en todas las condiciones de alimentacibn. Muchos de estos principios estBn seflaladoc en la fígura29-2. Se notara que hay un ciclo de carbohidratos que implica la liberación del glicerol del tejido adiposo y su conversión en glucosa en el higado, seguido de su regreso al tejido adiposo para complementar el ciclo. El otro, un ciclo de lipidos, comprende Ia liberación de ácidos grasos libres del tejido adiposo, su transporte al higado, su esterificación en é l y su regreso como VLDL al tejido adiposo.
LAS PRINCIPALES V ~ A SMETABOLICAS SON REGULADAS POR UNA O DOS ENZIMAS C U V E QUE CATALIZAN REACCIONES NO EQUILIBRADAS El cuadro 29-1 e$ un resumen de los reguladores principales de las vias metabrilicas mds importantes. Como se observo en capítulos previos, estas vías son controladas en 1 o 2 reacciones no equilibradas que tienen lugar por lo común al principio de la vía.
LOS PATRONES PRINCIPALES DE METABOLISMO EN ORGANOS O TEJIDOS INDIVIDUALES SON DETERMINADOS POR LA PRESENCIA O AUSENCIADE ENZIMAS CLAVE El cuadro 29-2 es un resumen de las características m l s importantes j, unicas de algunos órganos principales. Estos patrones rnetabólicos son determinados por la distribución de enzimas clave entre 6rganos y tejidos, que es el factor mas importante en la dcfinición del tipo de sustratos captados y de prodiictos formados, todo lo cual determina el flujo y dirección de los rnetabotitos en la sangre.
ASPECTOS CL~NICOS
La cetosis patológica se debe a la amplificación de los factores que causan cetosis en la inanici~n La cetosis que tiene lugar en la inanición y en la ingestión de grasas es relativamente leve comparada con el estado que se encuentra en la diabetes sacarina no controlada, toxemia gravidica en ovejas o cetosis del ganado en lactancia. Al parecer, la razón principal es que en situaciones graves, el carbohidrato es todavia menos disponible para los tejidos que en círcunstancias leves. Asl, en formas menos graves de diabetes sacarina, en ingestidn excesiva de grasa y en inaniciún crbnica, existe glucdgeno heplitico en cantidades variables y los valores de ácidos grasos libres son menores, lo cual es probable que explique la cetosis menos grave encontrada en estos estados. En la diabetes sacarina tipo 1, es probable qiie la carencia (o la falta relativa) de insu tina, afecte al tejido adiposo más que a otros tejidos, debido a su sensibilidad extrema a esta hormona. El requltado es que se liberan acidoc grasos en cantidades que elevan las concentraciones plasmaticas de ácidos grasos libres, más del doble de las que se encuentran en personas normales en ayunas con el correspondiente aumento en los valores de cuerpos cettinicos. Además, ocurren numerosos cambios en la actividad enzimáticadentro del hígado y estos cambios potencian la veiocidad de gluconeogénesis y la de transferencia de g2ucosa a la sangre, a pesar de: las ya elevadas concenzraciones de glucosa circulante. En la cetosis de rumiantes, hay una extraccibn grave de glucosa de la sangre debido a demandas fetales excesivas de gemelos o por lactación masiva (figura 29-2). Se produce hipoglucemia extrema, acoplada con cantidades despreciables de giucogeno en
ien de les principaltes reguladores de Ias vías rr
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L ikratu ( a c i d os grasos,
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hígado. 1'ructosa 1 ,6- cuerpi bisfosfato en el rnusculo cAMF.
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Piruvato carboxil asa -",.
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Intevación del metaBoiismo y el suministro de enesg&ticos rrslalures 34 1
el hígado. Conforme la hipoglucemia se desarrolla, la secrecibn de insutina disminuye, permitiendo no so30 una menor utilización de glucosa sino también el incremento de lipúlisis en el tejido adiposo. Las mujeres embarazadas con frecuencia presentan cetosis leve. En la diabetes sacarina tipo F sin tratar, la muerte se produce debido a complicaciones por acidosis causada por depIeci6n prolongada de bases para neutralizar los cuerpos cetónicos acídicos excretados en la orina (capítulo 65, caso No. 9: diabetes sacarina tipo 1 con cetoacidosis). En toxemia gravidica en ovejas, la mueste sobreviene con rapidez debido a hipoglucernia profunda.
RESUMEN 1) Muchos de los nutrientes principales son interconvertibles. Las carbohidratos se convierten en ácidos grasoc a través de la reaccibn catalizada por la piruvato deshidrogenasa. Dado que en esencia esta reaccihn es irreversible, no se puede producir el proceso opuesto. Tampoco puede haber conversión
neta de a c e t i l 4 o A (ni de sustancias formadoras de acetil-CoA) en glucosa a travks del ciclo del ficido citrico, dado que se consume una molécula de oxalacetato por cada molecula del propio oxalacetato convertida en glucosa. 2) Muchos de los esqueletos de carbono de los amindcidos no esenciales pueden generarse de carbohidratos por la via del ácido cítrico y la transaminacilin. La inversion de este proceso permite a tos aminoácidos glucogénicos entrar a la vía de la gluconeogénesis. 3) Durante la inanición, los ácidos grasos libres y los cuerpos cetbnicos son oxidados, de preferencia a glucosa, la cual es ahorrada por tejidas como el cerebro, que la requieren en todo momento. Esto se logra mediante la inhibicibn de fosfofnictocinasa y piruvato deshidrogenasa. Este efecto, acoplado con la inhibicihn obtenida por el sistema ahorrador de glucosa que moviliza hcidos grasos libres en el tejido adiposo, se llama ciclo glucosabcido graso. 4) La w s i s es una adapmci6n rnetabiilica para la inanici6n y se exacerba en situaciones patoldgicas como diabetes sacarina y cetosis de los rumiantes.
REFERENCIAS Brooks CA, Mercier J: Balance of carhhydrate and Iipid utilization during exercise: The "crossover" conccpt. J Appl Physiol 1994;76:2253. Capria S et al.: Oxidative fue! mctabolism during mild hypoglycemia: Critica1 role o f free fatty acids. Am J Physiol 1989;256-E413. Cohen P: Conlrol o f E ~ y m Acriviv, e 2nd ed. Chapman & Hall. 1983. Hue L, Van de Werve G (edi tors): Skort-Term Regulation afLiver Metabolism Elsevier/North l lalland, 198 1 .
RH et al.: Lipoprotein metabolism in pregnancy, fat iransport to the fetus and the effects o i diabetes. Btol Neonate 19X6;50:297. Randle PJ: Thc gliicose-fate acid cycle-hiochemical aspects. Atherosclerosis Rcv 1991.22: 183. Zorzrno A et al.: Bffects of starvation and exercise on concentrations of citrate, hexose phosphates and glycogen in skeletal musclc and heart. Evidence for selecKnopp
tive operation ofthe glucosc-faJ 1985;232:585.
acid cycle. Biochem
. . . . . . . . . . . . 345 Capitulo 31.Catabalisrno de proteinas y del nitrógeno de aminoGcidos . . . . . . . . . . 351 Capítulo 32. Cataholismo de los esqueletos de carbono de aminoácidos . . . . . . . . . . 363 Capítulo 33. Conversión de aminoácidos a productos especiaEizados . . . . . . . . . . . . 389 Capitulo 34 .Porfirinas y pigmentos biliarcs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .401 Capitulo 30.Biosintesis de aminoácidos no esenciales en la nutricihn
no esenciales en la nutrición Victor W Rodwell, PhD
Referirse a los aminolicidos fundamentales para la nutrici~ncomo "esenciales" o "indispensables" y a Ios que no lo son, como "no esenciales" o "dispensables" es engañoso (cuadro 30-1). Aunque en un contexto nutricional estos tkrminos son correctos, encubren la naturaleza biológicamente esencial de todos los 20 aminoácidos. Podria argiiirse que los aminoácidos nutricíonalrnente no esenciales, son m6s importantes para la célula que los esenciales puesto que los crganismos (por ejemplo, el ser humano) han evolucionado en el sentido de perder la capacidad para sintetizar estos últimos, pero no así los primeros.
Cuadro A -
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Las implicaciones mkdicas del material de este capitulo se relacionan con los estados de deficiencia de aminoácidos que pueden producirse si cualquiem de los arninoicidos esenciales para la nutricibn se omite en la dieta o se encuentra en cantidad insuficiente. Puesto que ciertos cereales son relativamente pobres en tBpt6fano y lisinz, en regiones donde In alimentacibn se basa principalmente en estos cereales para la ingestibn total de proteínas y no se complementa con fuentes tales como leche, pescado o carne, pueden observarse notables condiciones fisicas de deficiencia. El kwashiorkor, y el marasmo son endkmicos en ciertas regiones de Africa Occidental. El kwashiorkor se presenta cuando un niAo es destetado y queda a merced de una dieta de almidones escasa en proteína. En el marasmo, tanto la ingestilin calórica como la de arninoácidos especificos es deficiente.
LOS AMINOÁCIDOS ESENCIALES PARA LA N U T R F C I ~TIENEN N V~AS BIOSINTETICAS PROLONGADAS
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iiiiios. Innecesaria.para la sfntesis de proteínas pero formada durante e l .m..r
IMPORTANCIA BIOMEDICA
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Hiciroxilisinat Wi
"Nutricion . . almente remiiesenciales'
Dado que este libro enfatiza los procesos metabblicos de tejidos humanos, sólo se tratará de biosíntesis de aminoácidos no esenciales, no acerca de los no requeridos en nutrientes para vegetales y microorganismos.
c ~ i i i ~ c t i uc t u au,
procesamiento pasintetico de la wlagena.
La existencia de requerimientos nutricionales sugiere que la dependencia del suministro externo de un intermediario necesario puede tener un valnr superior
Bioqiairn ica de Harpcr
346
para la supervivencia que la capacidad para sintetizarlo. Si un intermediario específico existe en los alimentos, un organismo que puede sintetizarlo está reproduciendo y transfiriendo a las generaciones tuturas información genetica de un valor negativo para la supervivencia. Este valor es negativo más que nulo debido a que se están empleando ATP y nutrientes parasinteti~arDNA 'Ynnececario". El número de enzimas que requieren las cklulas procariotas para sintetizar aminoácidos nutrictonales esenciales es grande en relación a Iac necesarias para sintetizar aminoácidos no esenciales (cuadro 30-2). Esta observación indica que es una gran ventaja de supervivencia conservar la propiedad de fabricar aminoácidos "fáciles" aunque se pierda la capacidad para formar arninoBcidos '~diticiles".
LOS AMINOÁCIDOS NO ESENCIALES PARA LA NUTRICIÓN TIENEN V ~ A S BIOSINTÉTICAS CORTAS De los 12 aminoacidos nutricionalrnente no esenciales (cuadro 30-l), nueve son formados a partir de intermediarios anf bólicos. Los tres restantes (Cis, Tire Hil) se sintetizan a partir de arninoácidos esenciales para la nutrición. La glutamato deshidrogenasa, la glutamino sintetasa y las transaminasas ocupan posiciones centrates en la biosintesis de arninoácidos. Su efecto combinado consiste en catalizar la transformación del ion amonio 10-2. Enzimas requeridas p4ara !a r de los aminoácidos a parti r de nterrnediarios anfibblicos
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inorgánico en nitrógeno alfa mino o r g h i c o de varios aminoacidos.
1) Glutamato: La aminacibn reductoradel alfacetoglutarato es catalizada por la glutamato deshidrogenasa (figura 30-1). Además de formar ~d,lutamatoa partir del intermediario anfibólico alfa cetoglutarato, esta reaccidn constituye un primer paso clave en la biosintesis de muchos otrosaminoácidos. 2) Glutarnina: La bioslntesis de la gIutarnina a partir de glutarnato es catalizada por la glutamino sintetasa (figura 30-2). La reaccibn muestra tanto semejanzas corno diferencias con Ia reacción de la glutamato deshidrogenaca.Las dos "fijan" nitrógeno inorghico, una al enlace amino y la otra al amido. Ambas reacciones están acopladas a reacciones muy exerghnicas; para la glutamato deshidrogenasa, la oxidación de NAD(P)H y para la glutmina sintetasa, la hidrólisis del ATP. 3) AEanina y aspartato: La transaminacidn del pimvato forma ~ a l a n i n ay la del oxalacetato forma Laspartato (figura 30-3). La transferencia del grupo alfa amino del glutamato a estos intemediarios anfibblicos. ejemplifica la capacidad de una transaminasa para canalizar al ion amonio por medio del glutamato, al nitrbgeno aEfa amino de los aminoacidos. 4) Asparagina: La formación de asparagina a partir deraspartato, catalizada por la asparagina sintetasa (figura 3 0 4 ) , es semejante a la síntesis de glutamina (figura 30-2). Sin embargo, puesto que la enzima de los marniferos utiliza glut&ina en lugar de ion arnonio como fuente de nitrhgeno, la acparagina sintetasa de estas especies no "'fija" nitrbgeno inorgánico. Por el contrario, las asparagina sintetasas bacterianas usan ion amonio y por ende "fijan" nitrógeno. Igual que en otras reacciones en las que se forma pirofocfato (PP,,,la hidrblisis de PPi a P; por la pirofosfatasa asegura que la reacci6n sea fuertemente favorecida desde el punto de vista energktico.
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Figura 30-1. Reaccibn de la glutamato deshidrogenasa. La aminacibn reductora del atfa cetugiutarato por los radicales N H ~ 'se desarrolla a expensas del NAD(P)H.
Figura 30-2. Reaccibn de la glutamina sintetasa.
S) Scrina: La serina se forma a partir del interme-
diario glucoliíico D-3-fosfoglicerato (figura 30-5). El grupo alfa hidroxilo es oxidado a un grupo 0x0 por el NAD' y después transaminado para formar fosfoserina, que es desfosforilada a serina. 6) Glicina: La sintesis de Ea glicina en Ins tejidos de marnireros pueden producirse de varias maneras. El citosol del higado contiene glicina transaminasas que cataliixn la síntesis de la glicina a partir del glioxilato y del glutarnato o de la alanina. A diferencia de la mayoría de las reacciones de transaminawq, ésta favorece con fuerza la sintesis de glicina. En los mamíferos, dos vias importantes adicionales para la formacibn de la glicina parten de la colina (figura 3 0 4 ) y de la serina a través de la reaccibn de las serinhidtoxirneti ltransferasa (figura 30-7). 7) Prolina: En 30s mamíferos y en algunas otras formas de vida, la prolina se biosintetiza a partir del glutamato por reversion de las reacciones del cataholismo de la prolina (figura 30-8). 8) Cisteina: La cisteina, aunque no esencial para la nutrición por sí misma, se forma a partir de la metionina (nutricionalmente esencial) y la serina (no esencial para la nutrición). La metionina es convertida primero en homocisteina por la via de la S-adenosilmetionina y de la S-adenosilhomocisteina (capihilo 32). La conversihn de la homocisteína y de la serina en cisteína y homoserína se muestra en la figura 30-9.
Mg-AMP + PP,
Mg-ATP
Figura 3 0 4 . Reaccibn de la asparagina sintetasa Nótese las semejanzas y las diferencias con la reacciun de la glutamina srntetasa (figura 30-2)
Fosfohidroxipiruvato
FY
A:
NHI+
J Glu o Asp
U-Cetoglutarateu oxaiaaetato
Figura 3 0 3 . Formacidn de la alanina por transaminacidn del piruvato El donador de radicales amino puede ser el glutamato o el aspartata. As¡, el otro producto es el alfa celoglularato o el oxalacetato. Si el oxalacetato es el grupo ácido 0x0 en lugar del piruvato, la transferencia al grupo amino del glutamato, forma aspartato.
Figura 3 0 6 . Biosintesis de la serina. (a-M,a-aminohcidos; a-KA, a-cetoAcidos).
Metilen-
Colina
OH
Glicina
Serina
Figura 30-7. Reaccibn de la serinhidroximetiltransferaca. La reaccibn es libremente reversible (& folato = tetrahidrofolato )
no puede satisfacer el requerimiento nutricional de fenilalanina. El complejo de la fenilalanina hidroxilasa es una oxigenasa de función mixta presente en el higado de mamíferos, pero ausente de otros tejidos. La reaccibn involucra la incorporaci6n de un atomo de oxlgeno rnolecular en la posicibnpara
Betainaldehido O
CH3 I
H,C
- N+-CW3
Betaina
k O
O-
H~o-IC NADH+H+ NAO + O
Glicina
O Figura 3 0 4 . Formacibn de glicina a partir de calina.
9) Tirosina: La tirosina se forma a partir de la feni-
lalanina en la reaccibn catalinda por la fenilalaninhidroxilasa (figura 30-1 0). Asl, mientras que la fenilalanina es un aminoácido nutricionalmente esencial, la tirosina no lo es -siempre que la dieta contenga cantidades adecuadas de fenilalanina. La reacción no es reversible, de manera que la tirosina
Flgura 30-8. Bioslntesis de la prolina a partir del glutamato por reversibn de las reaccionesdel catabolismo de la prolina.
Biosíntesis de aminoácidos no esenciales en la nutrición 349
Tetrahidrobioptenna
Dlhiambiopterina
1
Cistationina
Figura 30-10. Reaccibn de la fentlalaninhidroxilasa Dos actnidades enzirnáticas distintas están involuuadas. La a c tividad II catalira la reduccibn de la dihidrobiopterina por el NADPH, y la actividad t , la reduccidn del Oz formando HzO y la mnversibn de la fenilalan~naen tirosina. Esta reacción está relacionada con varios defectos del metabolismo de la fenilalanina descritos en el capitulo 32.
Figura 30-9. Conversibn de la hornocistelna y de la serina
en homoserina y cisteina. Nbtese que mientras el azufre de la cisteina deriva de la metionina por transulfuracibn, el esqueleto de carbono es proporuonado por la serina.
de fenilalanina,en tanto que el otro htomo es reducido formando agua (figura 30-1 1). El poder reductor provisto en última instancia por NADPH, es inmediatamente aportado en forma de tecrahidrobiopterina, una pteridina que se parece al ácido folico. 10)HidroxiproIina: Puesto que la prolina sirve como un precursor de la hidroxiprolina, tanto la prolina como la hidroxiprolina son miembros de la familia de aminoácidos del glutamato. Aunque tanto la 3 como la 4-hidroxiprolina se encuentran en los tejidos de los mamíferos, lo que sigue se refiere exclusivamente a la rram4-hidroxiprolina, La hidroxiprolina como la hidroxilisina est8 casi exclusivamente ligada a la colágena,la proteína más abundante de los tejidos de mamifero. La colágena está compuesta de cerca de una tercera parte de glicina y una tercera parte de prolina e hidroxiprolina. La hidroxiprolina, la cual contribuye con muchos de los residuos aminoácidos de la colligena, estabiliza la triple hélice a la diges-
tibn por las proteasas. A diferencia de los grupos hidroxilo de la hidroxilisina, que sirven como sitios para la unihn de residuos galactosilo y glucosilo, los grupos hidroxilo de la hidroxiprolina de la colágena no están sustituidos. Un carhcter singular del metabolismo tanto de la hidroxiprolina como de la hidroxilisina es que los aminoácidos prefomados, de la proteína ingerida con los alimentos, no son incorporados a lacotágena. Parece no haber especies de tRNA capaces tanto a-Cetcglutarato
['%] Succinato
Figura 30-1 1. Rsaccibn de la prolil hrdraxilasa. El sustrato es un péptido rico en prolina. Durante el curso de la reacción, el oxígeno molewlar es incorporado tanto al sucunato como a la prolina (demostrado por el uso de oxígeno pesado, "02). La lisil hidroxilasa cataliza una reaccidn anailoga.
350 Bioquímica de H~urper
de aceptar la hidmxiprolina o la hidrcixilisina como de insertarlas en una cadena polipeptidica que se alarga. La prolina de la dieta es, sin embargo, un preciirsorde la hidroxiprolina de la colagena y la lisinade los alimentos es un precursor de la hidroxilisina de !a misma. La hidroxilaci6n de la prolina o de la lisina es catalizadla por la pralil hidroxilasa (figura 30-1 1) o por la lisil hidroxilasa, enzimas ligadas a la fraccion microsómica de una amplia variedad de tedidos (la piel. el hígado, los pulmones, el corazbn, el músculo esquelético y las heridas en granulación). Estas enzirnas son peptidil hidroxilasa, puesto que la hidroxilacibn tiene lugar sólo de manera subsiguiente a la incorporación de la prolina o la lisina alenlace polipeptídico. Ambas hidroxilasm son oxigenasas de f i n ciOn mixta que requieren, adernis-del sustrato, 01 rnolecular, ascorbato, ~ e "y aala cetoglutarato. La prolil hidroxilasa ha sido más extensamente estudiada, pero la lisil hidroxilasa parece ser una enzima enteramente anfiloga. Por cada mol de prolina hidroxilada, 1 mol de alfa cetoglutarato es descarboxilado y transformadoen succinato. Durante este proceso, un &tomode 0 2 rnolecular es incorporado a la prolina y otro al succinato (figura 30-1 1.). 6-hidroxicaproato) se encuentra en la colágena pero falta en la mayoria de las proteínas de mamíferos. La hidroxilisina de la colágena se origina directamente de la lisina de la dieta y no de la hidroxilisina de la misma. Antes de que la lisina sea hidroxilada, primero debe incorporarse en la uni6n peptídica. La hidroxilaciiin del lisil peptido es entonces catalizada por la licil hidroxilasa, una oxidasa de función mixta anAloga a la prolil hidroxilasa (figura 30-1 1).
Los cetoácidos de valina, leucina e isoleucina pueden remplazar a sus aminoácidas correspondientes en la dieta Aunque la leucina, la valina y la isoleucina son aminoácidos esenciales para el ser humano y otros animales superiores, las transaminasas tisulares de los mamíferos interconvierten de manera reversible 30s tres aminoáicidns a sus alfa cetoácidos correspondientes. Por tanto, estos alfa cetoacidas pueden reemplazar a sus aminoácidos en la dieta.
La histidina y la arginina son semiesenciales para la nutrición La arginina, un aminoacido nutsicionalmente esencia! para el crecimiento del ser humano puede ser sintetizada por las ratas. pero no en cantidades suficientes para permitir e1 crecimiento normal. La histidina. como la arginina, es semiesencia! para la nutricién. Las personas y las ratas adultas han sido conservadas en equilibrio nitrogenado diirante cortos periodos en ausencia de histidina. En cambio, el animal en crecimiento si requiere de la histidina en la dieta. Si se llevan a cabo estudios durante periodos más largos, es probable que en las personas adultas también se rnanifestarh un requerimiento de histidina.
RESUMEN Todos los vertebrados, incluyendo al ser humano, pueden sintetizar los 12 aminolcidos nutricionalmente no esenciales a partir de intermediarios anfibblicos o de otros aminoicidos provenientes de la dieta. Sin embargo, los venebrados no pueden biosintetizar los 10 aminoácidos reconocidos como nuíricionalmente esenciales. Aquí sólo se consideran los aminoacidos no esenciales. Los vertebrados biosintetizan aminoacidos de intermediarios anfibólicos por vias metabiilicas aue reauieñen cinco o menos reacciones catalizadas por enzirnas. Los intermediarios anfibólicos precursores y los aminohcidos a que dan origen son compuestos intermedios del ciclo del hcido cítrico, alfa oxoglutarato (Glu, Gln, Pro, Hip) y oxalacetato (Asp. Asn) y el intermediario glucolitico 3fosfoglicerato (Ser, Gli). Otros tres aminoácidos (Cis, Tir, Hil) se forman de aminoácidos esenciales ingeridos. Para la biosintesis de cisteína, la serina proporciona el esqueleto de carbono y la homocisteína el azufre; en tanto que la fenilalanina hidroxilaca convierte la fenilalanina en tirosina. Dado que no hay codón ni tRNA que dicte la inserción de Hip o Hil en los pkptidos, ni la hidroxiprolina ni la hidroxilisina de los alimentos se incorporan a las proteínas. Estos aminoácidos hidroxilados surgen por hidroxilación postraslacion mediante la acci6n de oxidasas de función mixta a partir de peptidilos Pro o Lis.
REFERENCIAS Mercer LP, Dodds SH, Smith DI: Dispensable, indispensable, and conditionally indi5pcnsable amino acid ratios in the di&. Chapter 1 in Vol. 1 of:Rhorption and L?iluation ofAmino Acids. Friedman M (editor), CRC Press. 1989.
Scriver CR et al. (editors): The .Wetabolic and ~idolecular Rmes oj Inherited Disease, 7th de. McGraiv-Hill, 1995.
proteínas v del nirtñóaeno de aminoácidos rl
INTRODUCCION En este capitulo se expondrh c6mo se elimina e] nitrógeno de los arninah~idosy se convierte en urea, asl como los problemas mkdicos que surgen cuando hay defectos en estas reacciones.
comprometida, como en personas con cirrosis masiva, o hepatitis grave, ei amoniaco se acumula en la sangre y conduce a signos y síntomas clínicos. Se ha informado sobre extraAos, pero nocivos, descirdenes en las cinco enzirnas del ciclo de la urea. En aquellos pocos nifios nacidos con una deficiencia en la actividad de una de las enzirnas del ciclo de la urea, el manejo apropiado requiere la comprensihn de los procesos bioquimicos
1MPORTANCIA MÉDICA
de su formacibn.
El balance de nitrógeno se refiere a la diferencia entre la ingestión total de nitrógeno y la perdida total del mismo en heces, orina y transpiración. Et balance positivo, esto es, mayor ingestión de nitsogeno que excreción es característico dc niilos en crecimiento y mujeres embarazadas. Los adultos normales se encuentran en equilibrio de nitr~geno,es decir, la ingestión de nitrbgeno igual a la excreta. El balance negativo, en el que la salida de nitrhgeno excede al ingreso puede presentarse después de la cirugía, en el cáncer avanzado, y en la insuficiencia en la ingestibn de proteínas adecuadas o de alta calidad (por ejemplo, en kwashiorkor y marasmo). El arnoniaco derivado principalmente del nitrbgeno alfaamino de los aminoácidos. es potencialmente tdxico para los seres humanos. Por tanto, inicialmente los tejidos humanos lo eliminan mediante su conversion en glutamina para ser posteriormente transportado al higado. En este brgano, la desaminación de la glutamina libera amoniaco, que luego es convertido de manera eficiente en compuesto no tdxico, rico en nitrbgeno, urea. Laeficiente biosíntesis de este compuesto es esencial para la conservacibn de la salud. En condiciones en las cuales la función hepAticaesthseriamente
EL RECAMBIO PROTE~NICO CARACTERIZA A TODAS LAS FORMAS DE VIDA El recambio proteinico, degradación y resíntesis continuas de todas las proteinas celulares, es un proceso ficiolbgico fundamental en todas las formas de vida. Aunque el recambio incluye síntesis y degradacibn de proteinas, en este capitulo se estudiará sólo el catabolismo de proteínas y aminolcidos. La sintesis de proteínas se detalla en el capitulo 40.
Cada día, los adultos degradan de uno a dos por ciento de su proteína corporal Cada día, el recambio de proteina corporal en los seres humanos, principalmente la proteina muscular, es de 1 a 2 por ciento. Luego, 75 a 80% de los aminoacidos liberados se utilizan de nuevo para sintesis de proteina nueva; el nitrdgeno del restante 20 a 25% forma urea. El esqueleto de carbono es degradado a intermediarios anfjbólicos (figura 3 1-1 1.
(Capitulo 31)
352 r Bioquímica de Harper
Degradactbn proteínica
Reutilización para sintesrs de proteina nueva
Amino3dos
sometidas a sintesis es de critica importancia. Los aminoácidos en exceso no se almacenan. Sin importar su origen, aquellos que no se incorporan de inmediato a proteína nueva se degradan con rapidez. Por tanto, el consumo de aminoácidos en exceso no sirve a ningún prop6sito útil que no pueda lograrse con carbohidratoc y lipidos y a menos costo.
1
i
Catabolismo
Flgura 31-1. Recambio de proteínas y amino8c1doc
Las proteínas son degradadas a velocidades diferentes Cada proteina se degrada a diferentes velocidades, 1% cuales pueden variar en respuesta a sus demandas fisiológicas. Altas velocidades promedio de la degradacibn de proteinas caracteriza a los tejidos sometidos a un mayor rearreglo estructural (por ejemplo, el tejido uterino durante el ernbaram o el tejido de la cola del renacuajo durante la metamorfosis; la degradación de proteinas del mYsculo esquelerico en inanición grave). La succeptibilidad de una proteina a degradacibn se expresa por su vida media, rln, que es el tiempo requerido para reducir su concentracibn a 50% de su valor inicial. Las vidas medias de las proteinas hephticas oscilan de menos de 30 minutos a más de 150 horas. Las proteinas con vidas medias cortas tienen secuencia PEST, regiones ricas en los aminohcidos prolina (P}, glutamato (E), serina (S) y treonina (T), que las seiíalan para degradacidn rápida. Muchas enzimas reguladoras claves tienen vidas medias cortas. Para la triptófano oxigenasa, la tirosina transaminasa y HMGXoA reductaca, tia = 0.5 a 2 horas. Estos valores contrastan de manera aguda con las vidas medias de más de 100 horas de laaldolasa. la lactato deshidrogenasa y los citocromos, En respuesta a la demanda fisiológica, las velocidades de degradación de enzimas reguladoras críticas pueden acelerarse o retardarse, alterando sus concentraciones y, por ende, la particibn de metabolitos entre vías rnetabólicas diferentes.
Los aminoácidos ingeridos en exceso son degradados, no almacenados Para mantener la salud, un adulto nomal requiere entre 30 y 60 g de proteína al día o su equivalente en aminoácidos libres. No obstante, la calidad de la pmteína, la proporcian de los arninalcidos esenciales en Ea comida, relativa a su proporcitrn en las proteinas
LAS PRBTEACAS Y PEPTIDASAS DEGRADAN PROTE~NAS A AMINOACIDOS Las proteasas intracelulares hidrolizan enlaces peptidicos internos de proteínas, formando péptidos. Luego, estos péptidos son degradados a arninoacidos libres por peptidasas. Las endopeptidasas separan enlaccs intemos en los péptidos, formando péptidos más cortos. M& adelante, aminopeptidasasy carboxipeptidasas remueven aminoácidos de las terminales amino y carboxilo C de los péptidos. Los productos últimos son aminoácidos libres.
Las proteínas se degradan por vías dependientes e independientes de ATP Dos vías principales degradan las proteinas intracelulares de células eucariotas. Las protelnas de la superficie celular ubicadas en las membranas y las proteinas intracelulam de vida larga son degradadas en organelos celulares llamados lisosomas, mediante procesos independientes de ATP. Por el contrario, la degradación de las proteinas anormales y otras de vida corta requiere ATP y ubiquitina y tiene lugar en el citosol.
Los receptores para asialoglucoproteínac fijan glucoproteinas desti nadas para degradación Para protelnas de la circulacidn como las hormonas peptidicas, la grdida de un residuo de Acido siálico de los externos no reductores de sus cadenas oligosachridas determina su degradacibn. Estas glucoproteinas asiiilicas son reconocidas e internatizadaspor el receptor para asialoglucoproteinade dlulas hephticas. Luego se degradan en lisosomas por proteasas designadas "catepcinas".
La ubiquitina señala numerosas proteínas intracelulares para su degradación La ubiquitina, una proteína pequeAa (8.5KDa) presente en todas las cdlulas eucarióticas, apunta muchas
CataboSismo de prot~inasY del nitrdaeno de arnínobcidos 353
proteinas intracelulares para su degradacidn. La estructura primaria de la ubiquitina se ha mantenido en alto grado. Solo 3 de los 76 residuos difieren entre la ubiquitina de levadura y la humana. Las vroteínas destinadas a degradacid; pos reacciones q;e dependen de ubiqujtina se derivan de de la misma, Estas se unen mediante reacciones que forman enlaces no al fa peptidicos entre el carboni]o temina] de la ubiquitina y gnipos epsitón aminos de residuos lisilo en la proteha (figura 3 1-2). Que una proteina 5ea dirigida por ubiquitina depende del residuo arninoacilo que exista en su terminal amino. La reaccibn con ubiquitina es retardada por metionilo o serilo y acelerada por residuos aspartilo o arginilo amino terminal.
LOS ANIMALES CONVIERTEN EL N I T R ~ G E N OALFA AMINO EN PRODUCTOS FINALES DIFERENTES Los animales excretan el nitrógeno de aminoácidos y 0tra.s fuentes como 1 de 3 productos finales: amoniaco, ácido úrico o urea. La prevalencia de un producto en distintos animales depende de la disponibilidad de agua en su nicho eco16~ico ocupado por cada uno. Los organismos amonotelicos, como el pez telebsteo, excretan nitrógeno como amoniaco. Su nicho acuoso, que los obliga a excretar agua de manera continua, facilita la expulsión inmediata de arnoniaco, compuesto muy tdxico. Por el contrario, los animales twre*es convierten el nitr6geno en ácido urico (organismo uricotélico) o en urea (organismo ureotélico). Las aves, que deben conservar agua y un peso bajo, son uricotélicas. El hcido usico, producto final relativamente insoluble, es entonces excretado como un semisblido guano. Muchos animales terrestres, incluyendo al hombre, son uredlicos y excretan urea, compuestoaltamente soluble. Las concentraciones altas de urea sanguínea en pacientes con enfermedad renal son a consecuencia, y n o una causa, de la enfermedad.
O 1.
UB-C-0-
BIOS~NTESISDE UREA
La biosintesis de la urea se puede dividir convenientemente para su estudio en cuatro etapas; 1) tran saminaci6n, 2 , desaminación oxidativa, 31 mnsPofie de moniaco, y 4) reacciones del ciclo de la urea. La figura 3 1-3 relaciona estas áreas al catabolisma global del nitrógeno de los
LOSgrupos affa amino son eliminados por transaminación Los aminohcidos libres provenientes de la dieta o de proteínas intracelulares son metabolizados de la misma manera. Primero, se elimina su nitrógeno alfa amino, por transaminacjdn o por desarninacibn oxidativa. Luego, el "esqueleto" de carbono resultante es degradado por vías que se estudian en el capitulo 32.
El nitrógeno del alfa aminoácido esi glutamato
Se
La transaminación interconvierte un par de aminokcidos y un par de cetohcidos; en general, un aminohcido alfa y un cetoicido alfa (figura 3 1 4 ) . Aunque la mayoria de los arninohcidos experimentan transaminacibn, las excepciones incluyen lisina, treonina y los iminoAcidos cíclicos ptolina e hidroxiprolina: Dado que las transaminaciones son libremente reversibles, las transaminasas (aminotransferasas)pueden cata1izar reacciones en ambos, catabolismo y biosintesis de aminohcidos. El fosfato de piridoxal reside en el sitio catalítico de todas las transaminasas y en muchas otras enzimas cuyo sustrato son aminohcidos. En todas las reacciones dependientes de fosfato de pindoxal de aminoácidos, el paso inicial es la formacibn de una base de Schiff intermediaria unida a una enzima que es O
+ E, -SH + ATP + AMP + PPi + UB-C-SE,
FFgura 31-2. Reacciones parciales en la adherencia de ubiquitina (UB) a protelnas. 1) El COOH terminal de ubiquitina forma un enlace ticéster can un SH de Ei en una ~eaccidndirigida por la conversibn de ATP en AMP y PP, La hidrblisis subsecuente de PP,, mediante una pirofosfatasa, asegura que la rea~56n1 proederh con facilidad en el centkio indicado 2) Una reacción de intercambio de tioesteres transfiere la ubiquitina activada a E2. 3) E3 cataliza la transferencia de ubiquitina a grupos E-lisilo de Fa proteína blanco.
354 * Bioquímicu de Harper
(Capitulo 31)
Desaminaci6o oxidatrva
I
Figura 31-5. Alanina transaminasa (arriba) y glutamato transaminasa (abajo).
+
Urea
Figura 31-3.Flujo global del nlrógeno en el catabolismo en arnino8cidos.
estabilizada por interacción con una región catibnica del sitio activo. Este intermediario puede reordenarse de varias maneras. Durante la transarninaci6n, unido a una coenzima sitve como portador de grupos amino. El reordenamiento forma un cetohcido y fosfato de piridoxamina unido a una enzima. Luego, este fosfato fijado forma una base de Schiff con un segundo cetoácido. La alanina-piruvato transaminasa (alanina transaminasa) y glutamato alfa cetoglutarato trancarninasa (glutamato transaminasa) presentes en la mayor parte de tejidos de mamíferos, catalizan la transferencia de grupos amino de numerosos aminoiicidos para formar alanina (del pimvato) o glutamate (del alfa cetoglwtarato) (figura 3 1-5). En algunos estados patológicos, se elevan las concentraciones s6ricas de transaminasas.
La trancaminasas son específicas sólo para un par de alfa aminoácido y alfa cetoácido Cada transarninasa es específica para un par de susti-atos, pero para el otro par. Puesto que la alanina también es un custrato para la glutamato transaminasa, todo el nitrógeno ammico proveniente de los aminoácidos que puede experimentar la transaminación, se puede concentrar en el glutarnato. Esto es importante porque e1 L-glutamato es el Unico aminoácido de los tejidos del mamífero que experimenta desaminación oxidativaa unavelocidad apreciable. La formación de arnoniaco de los grupos alfa amino se realiza, así, principalmente mediante la conversión del nitriigeno al fa amino del ~-glutamato.
Grupos amino diferentes a alfa pueden transaminarse La transaminacibn no se restringe a grupos alfa amino. El grupo delta amino dc la ornitina (pero no el grupo epsilon arnino de la lisina) se transamina fhcilmente formando glutamato-gamma-semialdehído (figura 32-3).
LA L--GLUTAMATO DESHlDROGENASA OCUPA UNA POSICIÓN CENTRAL EN EL METABOLISMO DEL NITRÓGENO
Las grupos amino de la mayoría de 30s aminohcidos Figura 3 1 4 . Trancaminación. La reaccibn se muestra para dos u-mino y dos a-ceto8cdos Los grupos a-arnino o no a-0x0 también participan en la transaminacion, aunque esto es relativamente rara La reaccibn es libremente reversible wn una constante de equilibrio cercana a 1.
con transferidos, en último termino al alfa cetoglutarato por transaminacion formando L-glutamato (figura 3 1-3). La liberación de este nitrdgeno como amoniaco es catalirada por la L+lutamato deshidrogenasa, una enzima ubiquitina de los tejidos de los
imn
mamíferos que utilizan NAD' o NADP- corno oxidante (figura 3 1 6 ) . Por tanto, la conversión total de grupos alfa m i n o a amoniaco requiere la acción coordinada de la glutamato transaminasa y la glutamato deshidrogenasa, La actividad de la glutamato deshidrogenasa hepática se regula por inhibidores alostéricos ATP, GTP yNADH y el activanteADP. E s t a ~ c i ó reversible n libre tiene lugar tanto en el catabolismo como cn la biosintesis de los aminoácidos. En el primero, lleva nitrógeno del glutamato a la urea. En el anabolicnio, -liza laarninacibndel alfacetoglumto por el arnoniaco libre (capitulo 30).
Las aminoácido oxidasas también extraen amoniaco a partir de los alfa aminoácidos La mayor parte del amoniaco liberado del 1--alfa-aminoiicido refleja la acci6n acopladora de los transaminacas y t-glutmato deshidrogenasa. Sin embargo, las aminoá no ácido oxidasa ectin presentes en el rifión y cl higado de los mamíferos. Estas flavoproteinas autooxidables oxidan los aminoácidos a alfa iminoacidos que adicionan agua y degradan el correspondiente al fa cetoácido con la liberación del ion amonio (figura 3 1-7). La flavina reducida se vuelve a reoxidar por moléculas de oxigeno formando perbxido de hidrógeno (H:02), el cual se desdobla en 0 2 y H 2 0 mediante la enzima catalasa localizada en muchos tejidos, especialmente hígado.
La intoxicación con amoniaco amenaza la vida El amoniaco generado por las bacterias entéricas es absorbido a la sangre venosa portal, que de este modo contiene concentraciones miic altas de arnoniaco que la sangre de la circulacibn general. Puesto que por lo cornijn et hígado remueve con prontitud este amoniaco de la sangre portal, la circulación periférica ect8 casi libre de arnoniaco. Esto es esencial, ya que inclu-
Figura 31-6. La reaccibn de la r-glutarnato deshidrogenasa La designación UAD(P)' signrfica que ya sea al NAD* o el NADP' pueden servir como msustrato. La reacubn es reversible, pero la constante de equilibriofavorece la fomación de glutamato.
de proreinm y del nitrógeno de aminoácidos
N H ~
NH,+
I
,c, R H
355
II
,oC II
U-Aminodcido
m Flauina
L/c-8N01
Flavina-ti2
u-lminohcld0
i.-i' 1..H.
Figura 31-7. Desaminación oxidativa catalizada por la L-ami-
noacido oxidasa (L-a-aminoácido.02 ox!dorreductasa). El a-arninoAcido, que se muestra en corchetes, no es un intermediario estable.
sive pequeiras cantidades de amoniaco con tbxicas para el sistema nervioso central. Si la sangre portal no entrara al hígado, el amoniaco se elevaria a valores tbxicos en la circulación general. Esta situación se presenta cuando se desarrollan comunicaciones colaterales entre las venas portal y sist6micas, como sucede en la cirrosis. Los sintomas de la intoxicación pos amoniaco incluyen temblor, balbuceos, visión borrosa y, en los casos graves, coma y muerte. Estos síntomas se parecen a los de sindrome del coma heplitico que se presenta cuando los valores de amoniaco de la sangre, y presumiblemente del encéfalo, esthn elevados. El tratamiento se dirige a reducir su concentracilin sanguínea.
La glutamina sintetasa fija el arnoniaco como glutamina Aunque el amoniaco sc produce de modo constante en los tejidos, tambien se elimina con rapidez de la circulación por el hígado y se convierte en glutamato, gliitarnina y, por último, urea, Por tanto, en condiciones normales, el arnoniaco existe sólo en pequeñas c m tidades en la sangre periferica (10 a 20 pgídL). Ademis de la fijación del amoniaco por la reacción caíalizada por glutarnato deshidrogenasa, la formación de glutam ina se debe a la glutamina sintetasa (figura 3 1 4 ) , una enzima mitocondrial presente en cantidades elevadas en el tejido renal. La síntesis del enlace amídico de la glutamina se lleva a cabo a expensas de la hidrólisis de un equivalente de ATP en ADP y P,. La reaccihn es así fuertemente favorecida en dirección de la sintesis de glutamina. Aunque el tejido encefálico puede formar urea, al parecer no interviene de manera significativa en la
356 Bioquimica de Harper
Figura 31-8. La reacción de glutamina sintetasa La reaccibn favorece fuertemente la sintesis de glutamina.
eliminación del amoniaco. En este tejido, el mecanismo principal para desintoxicaciiin de amoniaco es la formación de glutamina No obstante, si la concentracibn de amoniaco circulante se eleva, el suministro sanguineo de glutamato disponiblepara el cerebro es inadecuado pam la formací6n de glumina. Por tanto, el cerebro también debe sintetizar glutamato a partir de alfacetoglutarato. Esto agotaria con rapidez los intermediarios del ciclo del hcido citrico a menos que fueran reemplazados por fijacidn de C o l , lo cual convierte el piruvato a oxalacetato (capitulo 18). De hecho, en el tejido cerebral los aminohcidos fijan COZ.Después de la infusibn de amoniaco, los intermediarios del ciclo del Acido citrico son desviados a la síntesis de alfa cetoglutarato y a continuacidn de glutamina.
(Capitulo 31)
Figura 31-9. La reaccibn de la glutaminaca procede esencialmente de manera irreversible en direccibn de la formacibn de glutamato y radical NH4'. Nbtese que es eliminado el nitrkgeno arnidico y no el del a-amrno.
equilibrio acidobhsico y la conservacibn de cationes. Derivada de aminoAcidos renales intracelulares, en particular glutaniina, de la que se libera por acción de la glutaminasa renal, la producción de amoniaco aumenta en la acidosis metabólica y decrece en Ea alcalosis metabólica.
El intercambio entre Órganos mantiene los valores circulantes de amitioácidos El mantenimiento de concentraciones estables de aminoácidos plasrnbticos circulantes entre las comidas depende del balance total entre la liberación de las reservas
La glutarnina y la acparaginasa desaminaii la glutamina y la asparagina
La liberación hidrolttica del nitrógeno amidico de glutamina como arnoniaco, catalizada por glutaminasa (figura 3 1-9), favorece fuertemente la formacibn de glutamato. La glutamina sintetasa y la glutarninasa (figura 3 1-1 0 ) sirven para catalimr la interconversibn del ion amonio libre y la glutamina. Una reaccibn analoga a la catalizada por la glutaminasa, es catalizada por la 1--asparaginasa. Dado que ciertos tumores muestran elevados requerimientos anormales de glutamina y asparagina, la asparaginasa y ta glutamasa se han probado camo fármacoc antitumores.
La formación y secreción de amoniaco mantiene el equilibrio acidobásico
La excrecián urinaria del amoniaco producido por las crSlulas tubulares renales facilita la regulación del
Figura 31-10. Interwnversibn de amoniaco y glutamina catalizada por la glutamina sintetaca y glutaminasa. Ambas reacciones son intensamente favorecidas en la direcci6n indicada por las flechas. La glutaminasa sirve, as¡, solamente para la desaminacibn de la glutamina y la glutamina slntetasa únicamente para Ea síntesis de glutamina a partir de glutamato (Glu, glutamato)
'mo de proteinas y del nrir6,qeno de aminoúcidos
proteinicas endógenas y su utilización por diversos tejidos. El miisculo produce más de 50% de la reserva corporal total de aminoácidos libres, en tanto que el higado es cl sitio de Ias enzimac del ciclo dc !a urea necesarias para disponer del exceso de nitrbgeno. Así el múscuIo y el hígado tienen la importante función de mantener las concentraciones de los aminoácidos circulantes. La figura 3 1-1 1 resume el periodo de posabcorci6n. Los aminoácidos libres., en 'oarticular la alanina y la glutamina, son liberados desde el musculo a la circulación. La alanina, que parece servir de vehiculo para el transporte del nitrógeno en el plasma, es extraída bhsicamente por el hígado. La glutarnina e5 extraida por el intestino y el riñón; ambos convierten una porcibn significativa de la misma en alanina. La ~lutaminatambikn sirve como fuente de amoniaco para ser excretado por el rifion. Este drgano proporciona una fuente mayor de serina para ser captada por tejidos periféricos, incluyendo higado y músculo. Los aminohcidos de cadena ramificada, en especial la valina, son liberados por el muscuIo y captados predominantemente por el cerebro. La alanina sirve como precursor clave del aminohcido gluconeogbnico (figura ? 1-12). En el hígado, la velocidad de sintesis de glucosa a partir de alanina y serina es bastante elevada en retación con las que se observan en todos los demás aminokidos. La capacidad del higado para efectuar la gluconeogenesis a partir de alanina es enonne; no alcanza su saturación hasta que el valor de alanina es de unas 20 a 30 veces su concentración fisiológica. Después de una comida rica en proteinas, los tejidos esplácnicos liberan aminokidos (figura 3 1-1 3)
Cerebro
(
3
H LGADO
MUSCULO
Figura 31-12. El ciclo glucosa-alanina. La alanina sintetizada en el músculo por transaminación del piruvato derivado de la glucosa, es Iiberada al torrente sanguíneo y captada por el higado. En este órgano, el esqueleto carbonado de alanina es convertido de nuevo en glucosa y Iiberada al torrente sanguineo donde queda disponible para ser captado por el músculo y resintetizar alanina (Reproduc~iacan autorizacibn de Felig P: Amino acid metabolicrn in rnan. Annu Rev Biochem 1975;44:938 Copyright 8 1975 by Annual Reviews, Inc.)
en tanto que Ios musculos periféricos los extraen; en los dos casos predominan los aminoácidos de cadena ramificada. Por tanto, los aminoácidos ramificados tienen una funcibn especial en el metabolismo del nitrdgeno, tanto en ayunas, cuando sirven al cerebro con una fuente energetica, como después de la ingestibn de aiimenta, cuando son extraídos de manera preponderante por los musculos, siendo ahorrados por el higado.
Cerebro
Figura 31-11. Ent~rcambiointerorganico de aminoácidos en el hombre normal durante el periodo posterior a la absorcion de alimentos. Se muestra la funcibn clave de la slanina en la excreción de aminoácidos del músculo y del intestino y en su captacibn por el higado (Reproducida con autorizacibn de Felig P. Amino actd metabolicrn in man. Annu Rev Biochem 1975,44,937. Copyrtg hE O 1975 by Annual Reviewc, Inc.)
SANGRE
357
o\
Figura 31-13. Resumen del intercambio de aminoácidos entre los brganos, inmediatamente despues del consumo de alimentos
S58
Bioquimrca de Hílrper
LA UREA ES EL PRINCIPAL PRODUCTO FINAL DEL CATABOLISMO DE NITROGENO EN EL SER HUMANO Un ser humano moderadamenteactivo queconsumecerca de 300 g de carbohidratos, 100 g de grasa y 100 g de proteínas diariamente, debe excretar aproximadamcnic 16.5 g de nitrogeno al día, 95% en la orina y 5% en las heces. Para las personas que consumen dietas occidentaIes, la urca sintetizada en el higado, liberada hacia la sangre y depurada por los riiíones, constituye de 80 a 90% del nitrógeno excretado.
La urea se forma a partir de amoniaco, dióxido de carbono y aspartato La sintesis de un mol de urea requiere tres moles de ATP, un mol de amoniaco y el nitrógeno del alfa amino del aspartato, Cinco enzimas catali7an las reacciones numeradas de la figura 3 1-14. De los seis aminoicidos participantes, el N-acetilglutamato funciona únicamente como un activador enzimhtico. Los d e m k sirven como portadores de Btomos que en ijltima instancia se convierten en urea. En los mamíferos, la función metabúlica principal de la ornitina, la citrulina y la argininosuccinato está en la síntesis de urea. La biosintcsis de urea es un proceso ciclico. [,a ornitina consumida en la reacción 2 es regenerada en la reaccibn 5 y no hay p6rdida ni ganancia total dc ornitina, citrulina, argininosuccinato o arginina. Sin embargo, el ion amonio, C 0 2 ,ATP y aspartato si se consumen. Como sc muestra en la figura 3 1-14. algunas rcacciones de la síntesis de urea tienen lugar en la matriz mitocondrial en tanto que otras se realizan en el citosol.
La carbarnoil fosfato sintasa I inicia la biosíntesis de la urea La biosíntesis de la urea empieza con la condensaci6n de dihxido de carbono, amoniaco y ATP para formar carbamoil fosfato, que es una reacci6n catalizada por la carbarnoil frisfato sintasa 1 (figura 3 1-14). Los tejidos humanos contienen dos variantes de la carbamoil fosfato sintasa. Ida carbamoil fosfato sintasa 1, enzima funcional en la síntesis de la urea, es una enzima mitocondrial del higado, mientras que la carbamoil fosfato sintasa II es una enzima citocólica que utiliza glutamina en lugar de amoniaco como donador de nitrógeno y funciona en la biosíntesis de la pirimidina (capitulo 36). La formaci6n del carbamoi! fosfato requicrc dos moléculas de ATP. Una de ellas sirve como fuente de fosfaio. La conversión de la segunda en AMP y pirofosfato, junto con la hidrhlisis pareada del pirofosfato a ortofosfato, proporciona la fuerza conduc-
(Capitulo 3 1)
tora para la sintesis del enlace mida y del enlace mixta ácido anhidrico del carbamoil fosfalo. Idaaccíbn concertada de la glutamato deshidrogenasa y de la carbamoil fosfato sintasa I lanza nitrógeno al interior del carbamoiI fosfato, un intcrmedixio con elevada capacidad de transferencia de grupo. Esta compleja reacción se desanolla por etapas, probablemente de la siguiente manera: la reacción del bicarbonato y del ATP forma carbonil fosfato y ADP. En seguida. el amoniaco desplaza el ADP con produccihn de carbamato y ortofosfa~o.A1 final, la fosforilación del carbamato por el segundo ATP produce carbamoil fosfato. La carbamoil fosfato síntasa I es la enzima limit-intede la velocidad o marcapaso, del ciclo de la urea. Esta enzima reguladora es activa solo en presencia del activador alostérico Riacetilglutarnato cuyo enlazamiento induce un cambio en la conformación quc aumenta la afinidad de la sintetasa por el ATP.
El carbamoil fosfate más la ornitina forma la citrulina La i70rliitina transcsrhamoilasa catalizala transferencia de Ea mitad del carbamoil fosfato a la ornitjna, con !a formacion de citrulina + ortofosfato (figura 3 1-1 4). En tanto se desarrollan estas reacciones en la matriz de la rnitocondria, el citosol es el compartimiento donde se forma el sustrato ornitina y el producto citrulina se metaboliza más adelante. En el ingreso de la ornitina en las mitocondrias y en el kxodo de la citrulina de su interior participan, por tanto, sistemas de transporte de la membrana interior (figura 3 1-14).
Citrulina más aspartato forman argininosucl;inato La reacción argininosuccinato sintasa e n l m aFpartato y citrulina por la vía del grupo arnino del aspartato (figura 3 1-1 4) y proporciona el segundo nitrógeno de la urea. La reaccilin requierc de ATP y de la formación intermedia de citrulil-AMP. El desplazamiento siibsecuente del A M P por aspartato produce la citrulina.
El desdoblamiento del argininosuccinato forma argínína y fumarato El desdoblamiento del argininosuccinato, una reacción reversible de eliminación trans caíali7ada por la argininosuccinasa, retiene nitrogeno en el producto argina y libera el esqueleto aspartato como fumarato (figura 3 1-14). La adici6n de agua al fumarato produce 1.-malato, y la subsecuente oxidación dependiente de
H-C-NH,' 1
~
I
H
COO-
I C SINTASA
O
~
E-MH;H
h00-
-
yooH2N- C - H
7%
coo-
L-Amartato
Figura 31-14. Reacciones e intermediarios de la biosintecic de la urea. Los grupos que contienen nitrbgeno que contribuyen a la formacibn de la urea est'dn sombreados. Las reacciones O y @ ocurren en la matriz de las mttocondrias hepáticasy las reacciones@, @ y @ en el citosol de los hepatocitos. El COZ (mmo bicarbonato), el ian amonio y la ornitina así como citrulina penetran a la matriz mttocondrial con ayuda de portadores (m) específicos que existen en la membrana interna de la mitocondria hepatica.
NAD' del malato da lugar a oxalacetato. Ambas reacciones, en cuanto que anBlogas a las del ciclo del acido cítrico, se catalizan por la fumarasa citosiilica y la malata deshidrogenasa. En seguida, la transarninación del oxalacetato por glutamato rehace el aspartato. DespuCs, el esqueleto de carbono del aspartato, del fumarato o de ambos, actúa como portador para el transporte de nitr~genodel glutamato a[ precursor de la urea.
El desdoblamiento de la arginina libera urca y rehace la ornitina La reacción final del ciclo de la urea, esto es, el desdoblamiento hidrolitico del grupo guanidina de la arginina catalimda por la arginasa hepatica, Pibera urea. El otro producto, la ornitina, reingresa en las mitocondrias hepaticas para participar de nuevo en el ciclo de la urea. Cantidades menores de arginasa
360 + Rioquím ica de Harper
tambien se han encontrado en tejido renal, cerebro, glándulas mamarias, testiculos y piel. La ornitina y !a lisína son inhibidores competitivos potentes de arginasa con arginina.
La carbarnoil fosfate sintasa I es la enzima promotora del ciclo de la urea L a actividad de la carbamoil fosfato sintasa 1 es determinada por la concentraci6n constante de su activador alostérico N-acetilglutamato. A su vez, este valor constante es un reflejo de su síntesis a partir de acetilCOA y glutamato asi como de su hidrólisis a acetato y gluramato, reacciones catalizadas por la N-acetilglutarnato sintasa y N-acetilglutamato hidrolasa, respectivamente. Además, cambios mayores en la dieta de los modelos animales y posiblemente también en el ser humano, pueden alterar la concentracidn de enzimas individualesdel ciclo de laurea, de I O a20 veces. Por ejemplo, la inanicibn eleva las concentraciones enzimáticas, quizA para enfrentarse con kxito al aumento en la producci6n de amoniaco que acompafía a la degradación acelerada de las proteinas.
LOS TRASTORNOS METABQLICOS
CONOCIDOS SE RELACIONAN CON CADA REACCIÓN DEL CICLO DE LA UREA Los trastornos m~tab6licosde la biosintesís de la urea, si bien poco frecuentes, muestran cuatro principios mddícos relevantes: 1) Los defectos en muchas enzimac de la vía metabolica de una enzima pueden dar lugar a signos y síntomas clinicos iddnticos. 2) La acumulación de intermedios antes del bloqueo metabófico, o la acumulaci6n de productos, proporciona una vista al interior de la reacción deteriorada. 3) El dlagnhctico preciso requiere del análisis cuantitativo de la reaccibn catalizada por la enzima que se piensa deficiente. 4) La terapéutica razonada debe basarse en el entendimiento completo de las reacciones bioquímicas subyacentes en las personas normales y en las que presentan el trastorno. Debido a que el ciclo de la urea convierte el amoniaco thxico en el compuesto n o tóxico urea, todos los padecimientos de la síntesis de Ia urea provocan intoxicacihn por amoniaco. Esta intoxicación es más grave cuando e! bloqueo metabolico tiene lugar en la reaccidn 1 o 2, ya que algún enlazamiento covalente del arnoniaco al carbono ya ha ocurrido si la citrulina puede ser sintetizada. Los síntomas clínicos comunes a todos los padecimentos del ciclo de la urea incluyen el vómito en la lactancia, el rechazo de alimentos con
contenido elevado en protelnas, la ataxia intermitente, la irritabilidad, el letargo y el retraso mental. Las caracteristicas clínicas y el tratamiento de los cinco trastornos descritos en seguida son semejantes. La mejoría signifícativa es observable con una dieta baja en proteínas, con lo que puede evitarse gran parte dek daño al enckfalo. La ingestión de alimentos debe ser con comidas frecuentes en cantidades pequefías, para evitar incrementos repentinos en las concentraciones de amoniaco en la sangre.
1) Hiperamoncmia tipo 1 : Se tienen informes de alrededor de 24 pacientes con deficiencia de carbamoil fosfato sintasa 1 (reacción 1, figura 3 1-1 4). Es probable que sea un trastorno familiar. 2) Hiperamonemia tipo 2: La deficiencia de ornitina transcarhamilasa (reacc ion 2, figura 3 1- 14) causa este estado, que est5 ligado al cromocoma X. Las madres tambien mostraron hiperamonemia y una aversión a los alimentos con cantidad elevada de proteínas. El único hallazgo clínico consistente es la elevacibn de la glutamina en la sangre, en el líquido cefalorraquideo y en la orina. Esto refleja al parecer síntesis elevada de glutamina consiguiente al aumento de las cifras de amoniaco en los tejidos. 3) Citrulinemia: Es probable que esta enfermedad extraordinariamente rara se herede de manera recesiva. Se excretan grandes cantidades (1 a 2 gtdia) de citnilina en la orina, y sus valores en el plasma y el LCR son notoriamente elevadas. En un paciente, se observó la ausencia completa de actividad de la argininosuccinato sintasa (reaccibn 3, figura 3 1-14). En otro, el valor dc Kmpara la citrulina fue de 25 veces el normal. Esto sugiere una mutación que provoca una modificacion significativa, pero no mortal, del sitio catalitico. La citrulina y el argininosuccinato sirven como portadores alternos del nitrógeno deshechado, ya que contienen nitrógeno destinado para la síntesis de la urea. La arginina de la alirnentacion incrcmenta la excrecibn de citrulina en estas pacientes. De igual forma, el benzoato ingerido desvía al nitrógeno del amonio hacia hipurato por medio de la gIicina (figura 33-11. 4) A rgininosuccinicoacidu ria: Esta enfermedad herepor cifras eleditaria, recesiva y rara, se caracteri7~ vadas de argininosuccinato en la sangre, en el liquido cefalotaaquídeo y en la orina Con frecuencia está relacionada con la aparición de pelo friable al ensortijado (tricorrcxis nodular). Aunque se cabe que su aparicion puede ser temprana o tardía, la enfermedad se manifiesta siempre alrededor de los dos afioc de edad y por lo general tiene resultados funestos en corto tiempo. Laaciduria por Aciao argininosuccinico refleja la ausencia de argininosuccinasa (reacci~n 4, figura 31-14). Aunque el diagnóstico se hace con facilidad mediante cromatografia bidimen-
sional de la orina, aparecen manchas anormales adicionales en laorina que hasidodejadaensedimentacián, debido a la tendencia del argininosuccinato para formar adlídridos cíclicos. El diagnóstico confirmatorio se obtiene con la medición de activldad de la argininosuccinasa de los erimsrocitos. Esta prueba puede realizarse en sangre del cordón umbilical o en c&lulasde liquido arnniótico. lgual que en la citrulinemia, la arginina y el benzoato de los alimentos promueven la excrecibn de nitrdgenoen estos pacientes. 5) Hiperargíninemia: Este defecto en la sintesis de ta urea se caracteriza por [a elevacibn de las concentraciones de arginina en el LCR y en la sangre, cifras bajas de arginasa en los eritrocitos (reaccibn 5, figura 3 1-14) y un pambn de arninoácidos en la orina que se parece al de la tisincistinuria. Posiblemente este patrón refleje la competencia por la arginina con la lisina y la cistina para la resorcion en el ttibulo renal. Una dieta escasa en proteina reduce la concentración plasmatica de amoniaco y anula la lisincistinuria urinaria.
RESUMEN Para caracterizar los estados del nitrbgeno nutricional, los mddicos y nutriólogos se refieren a balance positivo o negativo del nitr~genoy a su equilibrio. En todas las formas de vida hay recambio proteinico, es decir, síntesis y catabolismo continuos de protelnas. Cada día, el ser humano degrada de 1 a 2% de su proteina corporal, en gran parte, del músculo esquelético. Los índices de degradación proteínica varian con amplitud entre proteinas y tambibn pueden variar en estados fisiológicos diferentes. Las vidas medias de las proteínas, tiempo requerido para degradar la mitad de la proteína existente, varia desde 30 minutos a miis de 150 horas. Con frecuencia las vidas medias muy cortas caracterizan a e n z i m a que realizan frinciones regulatorias fundamentales. Las proteasas y peptidasas degradan proteínas por vías dependientes e independientes de ATP. Con las g1ucoproteinas circulantes, los receptores para asialoglucoproteinas de la superficie de los hepatocitos, fijan e internan a estos compuestos destinados a la degradacihn por proteasas lisosbmicas. Con numerosas proteinas intracelulares, la adherencia de varias moléculas de ubiquitina las sefiala para ser
degradadas. Los aminoicidos liberados por el catabolismo proteínico o ingeridas en exceso en la alimentación, se degradan, no se almacenan. El arnoniaco es muy tóxico para todos los animales. Aunque los peces excretan tnamoniaco de manera directa, la necesidad de conservar agua excluye a ésta come una via mayor de eliminación de nitrógeno en aves o animales terrestres. Las aves destoxifican el amoniaco convirtiéndolo en ácido úrico. Los seres humanos y otros vertebrados superiores lo convierten en urea. En uno u otro caso, la seaccibn inicial en el catabolismo de aminoácidos es la remoci6n del grupo alfa arnino por transaminación, una reacción que requiere fosfato de piridoxal. Por tanto, Ia transarninaciiin canaliza al n ttrbgeno de los alfa aminoácidos aglutarnato. Lar-minoácido oxidasa también desarnina arninoácidos alfa, aunque esta vía tiene un significado fisiolbgico menor. La L-glutamato deshidrogenasa ocupa una posición central en el metabolismo del nitrógeno. Dado que la intoxicación con amoniaco amenaza la vida, la glutamina sintetasa convierte el amoniaco en glutamina no tóxica, que es transportada al hígado. Luego, la glutaminasa hepática libera de nuevo amoniaco de la glutamina para usarse en la sintesic de urca. El intercambio entre brganos mantiene las concentraciones circulantes de aminoacidos y el estado posabsorcidn se caracterizri por un complejo movimiento de cambios interorglinicos. La urea, producto final principal del catabolismo del nitriigeno en el ser humano, se sintetiza de amoniaco, bioxido de carbono y del nitrógeno amídico del aspartato. Las reacciones tienen lugar parte en la matriz mitocondrial y parte en el citosol. En las mitocondrias hcphticas se produce la síntesis de carbamoil fosfato a partir de ion amonio y COZ, igual que la condensación del carbamoil fosfato con ornitina para Formar citrulina. Las teacciones subsiguientes son citoshlicas. La reacción final catalizada por arginasa, escinde la omitina en urea y omitina y completa el ciclo. La reguIaci6n de la biosintesis de la urea comprende cambios en las concentraciones enzimiticas y efectos alost&ricosde N-acetilglumato sobre la carbamoil fosfato sintasa. Los errores congénitos del metabolismo pueden afectar a cada una de las reacciones del ciclo de la urea. Existen hiperamonemia tipos 1 y 2, citnilinemia, argininosuccinicaciduria e hiperargininemia. R
REFERENCIAS Curthoys NP, Watford M: Regulation of glutarninase acti-
Gebhardt R, Gaunitz F, Mecke D: H~erogeneous(posi-
vityandglu$minem~1'mismAnnuRwN~1995;15:l33.
tional) expression of hepatic glutarnine synthetase:
(C'upiluln 3 1)
362 Bioquim icu de Harper
Features, regulation and implications for carcinogenesis. Adk E n 0 me Regul 1994;34.27. Hershko A, Ciehanover A: The ubiquitin system for proiein dcgradíition. Annu Rev Biochem 199251:%l. Morris SM Jr: Rcpulation of enzymcs of urca and argininc hios) nthcsis. h n n u Kev Nutr 1992.1 2:81. Scriver CR et al. (editors): The ,\.letaholic andA.lolecular Hares ofInherited Divense, 7th ed. McGraw-Hill. 1995.
Torchinsky Y M: Transamination Its discoven., bioiogicnl and clinical aspects (1 937-1 987). Trends fiiochcm Scl
1887.12.135. Wilkinson KD: Rolc of ubiquitinylation in proteolysis and cellular regulation Annu Rev Nutr 1995,15: 16 1.
Gaitabolismo de los esqueletos de carbono de arninoácidos Victor W. Rodwell, PhD
El capitulo anterior describe el destino rnetabólico de los átomos de nitrógeno de los arninoácidos. Esta secciiin se ocupa de la conversión de los esqueletos de carbono de los r.-aminoacidos comunes en intemediarios anfibiilicos y de las enfermedades metabólicas o "errores congen itos del metabolismo" relacionadoscon estas vias catabiilicas.
IMPORTANCIA
BIOMEDICA
Ciertos trastornos del metabolismo de los aminokidos han desempcflado funciones principales en el esclarecimiento de las vias por las que estos compuestos son m~tabolizadosen las personas normales. Aunque la mayoría de estas enfermedades son poco comunes por lo que es improbable encontrarlas en la práctica rnedica, representan un reto formidable para el psiquiatra, pediatra, asesl~rgenkico o biologo molecular. Si no se tratan, muchas de estas enfemedades genéticas conducen a lesión cerebral irreversible y a mortalidad temprana. Por tanto, es esencial la identificacion prenatal o posnatal inmediata y una iniciaci6n rhpida del tratamiento apropiado, s i se dispone de el. Dado que algunas de las enzimas implicadas pueden detectarse en cultivo de células de líquido amniótico, es posible el diagnbstico prenatal de estas deficiencias por arnnioccntesis. El tratamiento consiste básicamente en dietas con bajo contenido de los arninoácidos cuyo catabolismo esta alterado. Sin embargo, la tecnología del DNA recombinante ofrece grandes posibilidades para complementar genes defectuosos por medio de la "terapeutica gknicaa'.
Las rnutacioncs en exones o en regiones reguladoras de un gen que codifica una enzima del catabolismo de aminoácidos puede producir una enzima no funcional o la ausencia completa de la sintesis de esa enzima. Mientras algunos cambios en las estructuras primarias de las enzimas pueden tener un pequeño efecto, otros modifican profundamente la estructura tridimensional de los sitios catalíticos o reguladores. L,a enzima modificada o mutante puede manifestar alteracion de la eficiencia catalítica (V,,, ba-jao Kmalta) o trastorno en su capacidad para ligarse a un regulador alostérico de su actividad catalítica. Una variedad de mutaciones puede originar la niisma enfermedad. Por ejemplo. cualquier mutación que cause una pérdida sustancial de la actividad catalítica de la argininsuccinasa ocasionad~ el desarreglo metabolico conocido Como acidemia argininsuccínica. Sin embargo, es rnhs improbable que todos los casos de acidemia argininsuccínica representen mutaciones en el mismo lociu genético. A nivel molecular hay distintas enferrnedades. Para complementar los trastornos en e1 metabolismo de los aminohcidos expuestos en este capitulo, el lector puede consultar los trabajos de las referencias más importantes como Scriver y colaboradores, 1995.
LOS AMINOÁCIDOS SE CATABOLIZAN A SUSTRATOS PARA LA BIOS~NTESISDE CARBOHI DRATOS Y LIPIDOS Estudios denutrjcibnen el periodo de 1920a 1940,reforzados por investigaciones que empleaban aminoácidos marcados con isotopos de 1940 a 1950, confirmaron
(Capírulo 32)
Bioquimica de Harper
364
la interconvertibilidad de los carbonos de lipidos, carbohidratos y proteínas y establecieron que todos los aminoácidos son convertibles a carbohidratos (1 3 arninoácidos), lipidos (un aminoacido) o ambos grupos (cinco arninoácidos)(cuadro 32-1 }. La figura 32-1 muestra los aspectos generales de estas interconversiones.
LA REACCION INICIAL CON FRECUENCIA CONSISTE EN ELIMINAR EL NITRÓGENO DEL GRUPO ALFA AMlNO
La glutamina y el glutamato forman alfa cetoglutarato El catabolismo de la glutamina y del glutamato procede como el de la asparagina y e! del aspartato, pero con la formación de alfa cetoglutarato (figura 32-2, abajo). Aunque el glutamato y el aspartato son suctratos para la misma transaminasa, la desamidación de la glutamina es catalizada por la glutaminasa. Posiblemente, por las razones aludidas antes para la asparagina y el aspartato, no se conocen defectos metabólicos de la vía catabólica glutamina-glutamato.
La prolina forma alfa cetoglutarato
Por lo general, la primera reacci6n metabólica es la reme ción del nitrógeno de! grupo alfa amino por transamlnacibn. Sin embargo, este no es el caso con la prolina; la hidroxiprolina o la lisina. Dependiendo de la necesidad fisiológica, el nitrógeno liberado puede ser utilizado de nuevo en procesos anabblicos como la síntesis de proteína o convertido en urea y as1 excretarse. El esqueleto de hidrocarburo oxidado que queda, entonces se degrada a intermediarios anfibólicos.
La asparagina y aspartato forman oxalacetato Los cuatro carbonos del aspartato y de la asparagina se convierten en oxalacetatopor Pavia sucesiva de reacciones asparaginasa y una transaminasa (figura 32-2, arriba). Quizá debido a que los defectos en las transaminasas que tienen funciones ana'b6licas críticas, pueden ser incompatibles con la vida, no se conocen deficiencias relacionadas con esta via catabólica corta.
dro 32-1,, Destino de tos esrlueletos carbono de los L-i J-aminoá icidos
i
En lugar de que sea cometidas transamjnacion directa, la prolina se oxida a deshidropolina, la cual adiciona agua, formando glutarnato-garnrna-sernialdehido. Éste es oxidado despues a glutamato y transaminado a alfa cetoglutarato (figura 32-3, izquierda). Dos hiperprolinernias autosomiizicamente recesivas han sido descritas. El retraso mental se presenta en la mitad de los casos conocidos, pero ningún tipo pone en peligro la vida.
A. Hiperprolinemia tipo 1 El sitio del bloqueo metabhlico en este defecto es la prolina deshidrogenasa (figura 32-3). El heterocigoto tipo 1 presenta s61o hiperprolinemia leve. Ne está relacionado el deterioro en el catabolismo de la hidroxiprolina.
B. Hiperprolinemia tipo 11 El bloqueo se presenta en la glutamato-gammasemialdehido deshidrogenasa (figura 32-31. Dado que la misma deshidrogenasa funciona en el catabolismo de la hidroxiprolina (figura 32-12), se afecta el catabolismo de ambos, prolina e hidroxiprolina. La orina contiene ~~-pirrolina-3-hidrexi-5~arboxilato, un catabolito de hidroxiprolina (figura 32-12). Al contrario de los heterocigotos tipo 1, los tipo 11 no manifiestan hiperprolinemia.
cornunies -
-
ConvertidLos a interimed iarios
S
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2lucbgeno Y Iíaidas glucog6nic cetogdnici
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1
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La arginina y la ornitina forman alfa cetoglutarato El catabolisrno de los arninohcidos de seis carbonos f o m a alfa cetoglutarato. Primero deben ser removidos un htomo de carbono y tres nitrógenos. Esto requiere, principalmente, el retiro del grupo hidrolitico del guanidino catalizado por la arginasa, formando ornitina, la cual posteriormente se somete a la transaminacibn de su grupo 5-amin0, formando glutamato-garnmasemialdehído que da lugar al aIfa cetoglutarato como se describib para la prolina (figura 32-3). Dos trastornos hereditarios producen hiperornitinemia.
Cataholamo de los esqueletos de carbono de aminoácidos
365
Glutarnato
Ala cis Gil HIP Ser
Pro
cr-Cetoglutarato lie Leu
Suocinil-COA
Acetil-COA
Tir
Fen Acetilacetil-COA
As partato Ceu LIS Fen Tn Tir
t
Asn
Figura 32-1. Intermediarios anfibólicos formados a partir de los esqueletos de carbono de los amino8udos.
L-Asparagina
coo L-Glutamina
L-Aspartato
cooL-Glutamato
Oxaiacetato
cooa-Cetoglutarato
Figura 32-2. Catabolismo de la L-asparagina (arriba) y de la L-glutamina (abajo) a intermediariosanfibóliws, (PIR, piruvato; AL4, L-alanina). En este esquema y en los subsiguientes,el sombreado sobre los grupos funcionales indica las porciones de las rnoleculas que están sujetas a rnodificacibn quirnica.
(Caplt u10 32)
366 Bioquimrca de Hurper
H2Nk
H c /N\CH,/
CH
2\CH,
II
6
II
O
NH +
L-Pmlina
DESHtDROGf NASA
NADH + H+
L-Arginina
U rea
Figura 323.Catabolismo de la L-prolina(izquierda) de la L-arginina (derecha a a-cetoglutarato. Los nu eros con circulos representan 10swtios de DS ciefecios m t a b d i m s en bhiperproiinernia tpo I.dhiperproiinernia tipo 11; y6hiperargininemia (capitulo 31).
A. Atrofia girada de la retjna Esta falla hereditaria autoc6mica recesiva implica degeneración coriorretiniana con pdrdida progresiva de la visibn perifirica. visión en túnel y, al final, ceguera. Las valorej plasmAticos de ornitina están elevados
seexcretan de 1 a 10mmol de ellaal dia. Eldefecto radica en Taornitina delta transaminasa. Se ha secuenciado la transarninasa humana y m;ls de 50 mutaciones se identifican como causantes de la atrofia girada. La terapéutica implica la resuicci6n dietética de arginina.
Ca~ubolismodc 10.7 eLvqueleto~ de carbono de ummobcidos 367
B. El sindrome de hipemrnitinemia-hiperamonemia Este trartorno genMico recesivo se caracteriza por valores sanguíneos altos de omitina y amoniaco; al parecer, se debe a la incapacidad de transportar omitina al interior de las mitocondrias. Esto produce incapacidad para la biosíntesis de la urea con las siibsecuentes amonemia (capitulo 30) y omitinemia. Es probable que el defecto implique un antiportador ornitina-citrulina anhlogo al que se purifica de las mitocondrias hepáticas de la rata. De ser así, este síndrome podria considerarse un defecto del ciclo de la urea. Urocanato
La histidina f o m a alfa cetoglutarato La desaminación de la histidina catali~adapor histidasa produce urocanato (figura 3 2 4 ) . Laadicihn dc H:O más una oxidoducción interna, catalizadapor la urocanasa, convierte laurocanato en 4-Unidazalona-5-propionaio. La hidrhlisis de este Último f o m a N-formirninoglutamato (Figlu, del inglks, N-f~rmimi~ioglu~amu~e), 1,a subsiguiente transferencia de un grupo formimino del Figlu al tetrahidrofolatoorigina el glutamato. En s e y i d a la transaminacihn del glutamato forma alfa cetoglutarato. En la deficiencia de ácido fólico, esta reaccicin es parcial o totalmente bloqueada y Figlu se excreta en la orina. Portanto, la excrecion de Figlu que sigue a una dosis de carga de histidina es una prueba de diagnóstico de la deficiencia de ácido fblico. Mientras que un incremento muy notorio en la excrecibn de histidina tipifica un embarazo normal, también refleja los cambios temporales en la función renal. Se conocen dos trastornos, en apariencia benignos. del catabolismo de Ia histidina.
Hs folato
?"S" A. Histidinemia Desde la primera descripcibn de la histidinemia en 1961, la deteccihn en más de 20 millones de recidn nacidos en todo el mundo, pone de manifiesto una incidencia de 1 :1 1 500. Se caracteriza por altos valores de histidina en sangre y orina y el síndrome es benigno en la mayoría de las personas. La enzima defectuosa es la h istidasa 10 que produce incapacidad para convertir la histidina en urocanato (figura 3 2 4 ) .
B. A ciduria urocánica En este trastorno en apariencia recesivo, la excrecidn alta de urocanato se produce por una urocanasa defectuosa (figura 32-4). Tal aumento en la excreción es el único signo de este trastorno que parecer ser benigno.
Figura 3 2 4 . Catabolismo de la L-histidina a a-cetoglutarato. (H4 folato, tetrahidrofolato.) La teaccibn catarizada por la histldina representa el sitio del defecto metabblico probable en la histidinemia.
(Capitulo 32)
3 68 Bioquímica de Harper
Metilen-
SEIS AMINOACIDOS FORMAN PIRUVATO
H4 folato
t
Todos los carbonos de glicina, alanina, cisteina y serina, pero sólo dos de los de treonina, forman pimvato. Este puede entonces convertirse en acetilXoA.
f
0-
H2p%cCCH \$N HO
O L-Sertna
L-Treonina
Hq folato
0 Glicina
Flgura 326. Reacción de la serina hidroximetiltransferasa, libremente reversible. (H4 folate, tetrahidrofolato.)
J. Glicina L-Serina
L-Cistina
L
B. Hiperoxaluria primaria
El catabiolismo de la glicina sigue la vía del sistema de desdoblamiento de la glicina
La principal hiperoxaluria se caraczeriza por una alta excreción urinaria de oxalato que no está relacionada con la ingestión de oxaiato en la dieta. Urolitiasis bilateral progresiva por oxalato de calcio, nefrocalcinmi S e infecci6n recurrente de las vias urinarias conducen a la muerte en la nifiez o al principio de la edad adulta por insuficiencia renal o hipertensión. Al parecer, el exceso de oxalato surge de la desaminación de glicina, formando glioxilato (oxalato semialdehido; fígura 32-1 2). El defecto en el metabolismo implica una deficiencia para catabolizar glioxilato, el cual entonces es oxidado a oxalato.
Aunque la glicina puede formar piruvato por conver-
La alanina forma piruvato
L-Alanina
+
.1
Piruvato t L-Cisteína
.1 Aceti LCoA
si6n inicial a serina (figura 32-5), la rotura de glicina (figura 3 2 4 ) probablemente constituya la principal vía para el catabolismo de serina y glicina en humanos y en muchos otros vertebrados. El complejo de la glicina sintasa, agregado macromolecular de las mitocondrias hepiticas, escinde la glicina en C o zy NH4+ y f o r m a ~JiI'O-metilentetrahidrofolatoen una manera reversible (figura 3 2 4 ) .
El piruvato, formado por transaminación de alfa alanina (figura 32-71? puede ser descarboxilado después a acetil-CoA. Posiblemente por las razones ya deccritas en el catabolismo del glutamato y el aspartato, no se conoce defecto metabhlico del catabolismo de la alfa alanina.
A. Glicinuria
La cerina se cataboliza por conversión en glicina
La glicinuria se caracteriza por la excreción urinaria de 0.6 a 1 g de glicina por día y una tendencia a la fomacion de calculos renales de oxalato. Puesto que las concentraciones de glicina en el plasma son normales, la glicinuria se atribuye a un defecto en la resorción de glicina por el tibulo renal.
El ser humano y muchos otros vertebrados degradan serina de manera primaria a glicina y M , Ni'-metilentetrahidrofolato. Esta reacción inicial se cataliza por la serina hidroximetiltransferasa (figura 32-5). El catabolisrno ulterior de la serina se combina entonces
HI. folato
~5~,p#$Aq folato
Glicina
Figura 326. Desdoblamiento reversible de la glicina por el complejo glicincintasa mitomndrial. (PLP, focfato de piridaxal.)
Caiabolismo de los esqueletos de carbono de arn inoúcidos * 369
Figura 32-7. Converstbn de la alanlna y de la serina en piruvato Tanto la alanintransarninasa como 13 serindeshidratasn requieren en sus reacciones de fosfato de piridoxal La reaccion de la serindeshidratasa procede s traves de la eliminación de H20 de la serina formando un amino8cido insaturado Este se convierte en un alfa imino8cido que se hidroliza espontáneamente en ptruvato y amoniaco (Glu, glutamato, a-KG, a-~etoglutarato)
con el catabollsmo de la glicina (figura 3 2 4 ) . Por el contrario, el hígado de los roedores convierte la serina en pinivato por acción de la serina deshidratnsa, una proteina de fosfaio de piridoxal, mediante una @dida de agua seguida por la eliminación hidrolítica de amoniaco (figura 32-7).
La cistina reductasa reduce la cistina a cisteína El ser humano excreta de 20 a 30 mmoles de azufre al día, la mayor parte como sulfato inorgánico. El destino catabólico principal de la cistina en los marniferos es su conversibn en cisteína, principalmente por la reacción catalizada por la cistina reductasa (figura 32-8). El catabolismo de la cistina se combina con el de la cisteina.
Dos vías convierten la cisteína en piruvato La cisteina es catabolizada por dos vias principales: 1) la vía oxidativa directa (sulfinato de cisteinaj y 2) la de transaminacion (3-mercaptopimvato). La conversi6n de la cistina a sulfinato de cisteina (figura 32-9, izquierda) es catalizada por lacisteina dioxigenasa, una enzima que requiere Fe2+y NAD(P)H: es probable que el catabolismo ulterior de sulfinato de cisteína
siga la via de transaminación a beta sulfinilpiruvato. La conversihn de beta sulfinilpinivato en piruvaro y sulfito, catalizada por desulfinasa, tiene lugar incluso en ausencia de catálisis enzimiitica.
La transaminaciiin inicial de la cisteína forma 3 rnercaptopiruvato La transaminación reversible de la cisteina a 3-mercrtptopintvato (tiolpiruvato) es catalizada por cisteína transaminasas especificas o por glutamato o asparagina transarninasas (figura 32-9, derecha). La reducción del 3-Lnercaptopiruvato por la L-lactato deshidrogenasa forma 3-mercaptolactato presente en la orina norrnal humana, como una mezcla de disulfuro con cisteina, la cual se excreta en cantidades importantes en pacientes con mercaptolactato~isteínadisulfiduria. Alternativamente, el 3-metcaptopiruvato experimenta desulfuración, formando piruvato y H:S (figura 32-9, derecha). El cuadro 32-2 resume los defectos conocidos del catabolisrno de estos aminoacidos.
A. Cistinuria (~i~f¡nliSjt?uria) En este trastorno metabolico hereditario, la excreción urinaria de cistina es superior a 30 veces lo normal. Tam bien hay un aumento notable de la excrecion de lisina, arginina y omitina, lo cual sugiere un defecto en los mccanismos de resorcibn renal para estos cua-
Figura 32-8. La reaccidn de la cistina redudasa.
Catahnli~mode los ek~qtrelctos de carbono de aminoucidos * 3 71
Cuadro 32-2. Errores cong6nitos del metabetismo d e los arninohcidos azufrados
- -
I
Nombre
Defecto
-.
Referenicia
na bcta sintasa .-
iuria 1
.,
reaucrasa .
' - 1 .
- -.
-
tetrahidrofidato-homt cisteinn transrnei1las;i dcbido a la incapacidad par
, sintrtizar mctilcohaImina-
6.
--
C'oncentr~ icibn bajadle3j6-metili
iuria TV
cisleintrai ismetilasa debido a u iinnl de la r:ohalamin¿ --
dato-homc cn lo absoi
Metinninadenosil transferasa hi
.."
A - . -
uria -. Cictarionasa , ,... I+-,.n:",~:+ iiir u L i J i G i i ~ ~ r i a )
opiruvato
_-
I
---.
Figura :32-9, pie dc la figura -
n de los lis nla funcih -topiruvato sulfotransf
Figura :
.rria
iíndrome
orcihn d e ,
rnetionir . " -.L. ... - .. ..
*
I amhltn puede presentarw cn ta
nd para abr
cictationrnuria, ia tirosineniiay ra intolerancia a la
tipo 1, los datos clinicos relacionados incluyen trornbosis, ostcoporosis, dis!ocaci6n de los cristalinos y con frecuencia retraso mental. Se conocen dos formas de esta enfermedad: Una sensible a la vitamina Bb Y otra forma que no responde a Psla. La ingestián de una dieta escasa en metionina y rica en cistina previene de modo eficaz los cambios ~~~~~~g~~~~ si se inicia a temprana edad. Otros tipos de homocirtinuria reflejan defectos en el ciclo de la remetilación (cuadro 32-2).
La treonina aldolasa inicia el catabolismo de la treonina La treonina es desdoblada en acetaldehido y gticina por la trconina aldolasa. Luego, el acetaldehído se oxida a acetato, que más adelante se convierte en acetiI-CoA (figura 32-2 1). El catabolismo de la glicina ya se describid.
CH, - S - S - C H ,
i-!$NH,+ C00-
u n a deshidrogenasa mitocondrial oxida la 4-hidroxiv o l i n a a ~-~'-pirrolina-3-hidroxi-~-carboxi]ato, la cual no estg en equilibrio enzimático con la gamma-
hidrori-~.-g]utamat+gamm~B~~mia]dehído (figura 32-1 Z), El remWdehido es oxidado al comwndiente gcido carboxílico, eritro-gamma-hidroxi-LLEIUtamat y transformado por transaminacibn en alfa-cetogamma-hidroxiglutarato. Un desdoblamiento de tipo aldiilico forma entonces glioxilato junto con pinivaio. El sitio del defecto metabblico en la hiperhidroxiprolinemia, un rasgo autosomico recesivo, es la 4-hldroxiprolina deshidrogenasa (figura 32-1 2). El tractorno se caracteriza por altas concentraciones plasrnhticas de 4-hidroxiprolina, pero no se acompañan de deterioro en el catabolismo de prolina, ya que sólo se encuentra afectada la funci6n enzimatica en el catabolismo de la hidroxiprolina. La condición no tiene efecto sobre el metabolismo de la colagena y, al igual que las hiperprolinemias, parece ser inofensivo.
?HI
HCNHi' I
coo (Cisteina)
La 4-hidroxiprolina forma piruvato y glioxilato
DOCE AMINOACIDOS FORMAN ACETIL- COA
(Hornocisteina)
Figura 32-10. Disulfuro mixto de ciateina y hornocisteina.
Todos los aminoAcidos que forman pinivato (alanina, cisteina, glicina, hidroxiprolina, serina y treonina) forman a c e t i l 4 o A por la vía piruvato deshidsogenasa
(Capitulo 32)
3 72 Bioguirnica de Harper
Glicina
f 510~~folato
HtOROXIMETlt4SA H4 folato
,C,C/s-coA II
O Acetil-COA
-xH
co?
FoAmSH
-
,C'c~C,o11 11
0 Piruvato
Figura 3 2 4 1 . Conversi6n d e la treonina y gliuna en serina, piruvato y acetil-COA tetrahidrofblim.)
(capitulo 19). AdemAc fenilalanina, tirosina, triprbfano, lisina y leucina forman acetil-CoA sin formar inicialmente pinrvato.
1) La transarninación de tirosina forma phidroxifenilpisuvato: La transaminaci6n de la tirosine ap-hidroxifenilpiruvato es catatizada por la tirosina-alta-cetoglutaratoti ansaminasa, una enzima inducible del tejido hepatico de marniferos. 2) La p-hidroxifenilpiruvato forma homogentisato: Esta reacción extraordinaria (figura 32- 13) comprende una hidroxilaci6n cíclica coordinada con migración de la cadena lateral. Dado que el reductor fisiolbgico es ascorbato, los pacientes eccorbuticos excretan productos del metabolismo de tirosina, oxidados de modo incompleto. En un principio se identificaron varios compuestos intermedios del metabolismo de la tirosina al alimentar con precur-
folato, ticido forrnil [5-101
(f5-I0~4
sores probables de homogentisato a pacientes que sufrían de alcaptonuria (véase despuhs), quienes a continuación excretaron homogentisato. 3) El homogentisato oxfdasa abre el anillo aromático: La rotura oxidativa del anillo bencénico del homogentisato, cata1izada por homogentisato oxidasa del higado de mamíferos, f o m a maleilacetoacetato. 4) La isornerización ch, ira~t,~ forma fumarilacete acetato: La isomerizacion de la rnaleilacetoacetato, catalizada por la rnaleilacetoacetato cis, frarrs isomerasa, forma fumarilacetoacetato. 5) La hidrólisis del furnarilacetoacetaZoforma fumarato y acetoacetato. La hidrólisis del fumarilacetoacetato, catalizada por la Fumarilacetoacetato hidrolasa, forma fumarato y acetoacetato. El acetoacetato puede entonces ser convertido en acetilCOA m8s acetato por la reacción de la beta cetotiolasa (capitulo 24).
CataBolismo de los esqueletos de carhono de aminoricidos
3 73
TIROSINEMIA, TIROSINU'RIA Y ALCAPTONURIA
y-Hidroxi-~-gIutamato-y-sem~aldehido
NADH + H+
O Glioxilato
o Piruvato
Figura 32-12. Intermediarios en e l catabolismo de la L-hidroxiprolina. (a-KA,a-cetoácido; a-AA, n-amino8cido.) Los números representan tos sitios de los defectos metabblicos probables en @ hiperhtdroxtprolinemia y @) hiperprolinemia tipo 11.
1) Tirosinemia tipo 1(tirosinosis): En la tirosinosic, la acumulación de metabolitos afecta adversamente las actividades de varios sistemas enzimáticos y de transporte, por lo cual su fisiopatologia es compleja. El defecto metab6lico propuesto esth en la iumarilacetoacetato hidrolasa (fígura 32-1 3) y posiblemente tarnbikn en la maleilacetoacetato hidrolasa. Las concentraciones plasmaticas de tirosina son elevadas (6 a 12 rngidL), al igual que las de otros aminoácidos, en especial la rnerionina. En la tirosinosis aguda, los lactantes manifiestan diarrea, vúmito, un olor "como de col" y deficiencias en el crecimiento. Si no se trata, puede presentarse la muerte por faltas en el higado cn un periodo de 6 a 8 meses. En la tirosinemia crónica los sintomas son similares pero se presentan con mediana intensidad; así, conducen a la muerte a los 10 afios de edad. E! tratamiento consiste en una dieta escasa en tirosina y fenilalanina y, en ocasiones, tambien en rnetionína. 2) Tirosinemia tipo m (síndrome de Richner-Han hart): El sitio probable del defecto metabólico en la tirosinemia tipo 11 esta en la tirosina transaminasa hephtica (figura 32-13). Los datos clinicos incluyen concentraciones plasmaticas alm de tirosina (4 a 5 mgldL), lesiones oculares y cutáneas típicas y retraso mental moderado. La tirosina es el único aminoácido cuva concentración urinaria es alta. Sin embargo, la depuración y la resorcion renal de la tirosina caen dentro de los límites normales. Los metabolitos excretados en la orina son p-hidroxifenilpinivato, phidroxifenil-lanato, p-hidroxifenilacetato, h7-acetiltirosina y tiramina (figura 32-14). 3) Tirosinemia neonatal: El trastorno se considera como el resultado de una deficiencia relativa de la p-hidroxifenilpiruvato hidroxilasa (figura32-13). Las concentraciones sanguíneas de tirosina y de fenilalanina son elevadas, al igual que los valores urinarios de tirosinqp-hihxifenilacetato, N-acetiltirosina y tiramina (figura 32-14). La terapeutica se basa en una alimentacion baja en proteínas. 4) Alcaptonuria: Este trastorno metabólico hereditario, señalado en la literatura mgdica desde el siglo XVI, fue caracterizado en 1859. La enfermedad tiene un interés histórico considerable, debido a que constituye la base de las i d e a de Garrod respecto a los trastornos metabólicos heredados. Su manifestaci6n clínica más sorprendente es el oscurecimiento de la orina al contacto con el aire. En la enfermedad avanzada, hay pigmentacibn generalizada de los tejidos conectivos (ocsonosis) y una forma de artritis, El mecanismo de la ocronocis comprende ia oxidacibn de hornogentisato por la polifenoloxidasa
101
,
Asmrbato cuZ+
'Coi 1
OH Hornogentisato
(reordenado)
Fumarato
+
HIDROIASA
Acetoacetato
Acetii-COA
Figura 32- 13. Intermediarios en ef catabolismo de la tirosina. Con excepuon de la correspondiente a la P-cetotiolasa, las reacciones se describen en el texto. LOSA ~ O ~ Ode S carbono de los intermediarios están numerados para ayudar al lector a observar el destino ultimo de cada carbono (&ase tambikn la figura 32- 1 5 . (a-KC, a-Cetoglutarato, G Y ,giutamato: Pi-P forfato de piridoxal ) Los nYrneros representan 10s sitios probables de los defectos meta bdlicnr en tirosinema tipo II: tiiorinemia neonatal; @ alcaptonuria y tirocinemia tipo I o tirosinosis
6
a
d
Catubolismo de los esqzaeletos de carbono de utnirroúcidos 3 75
p
con.
SH
OH Tiramina
O?+ W 2 0
NADM + H+
NH;
NADH + U+
+ H,O,
Figura 32-14. Catabolitos alternativos de la tirosina. El p-hidroxifenilaoetaidehido se forma como intermediario durante la oxidacibn de la tiramina a p-hidroxifenilacetato.
con formacihn de acetato de benzoquinona, que polimeriza y se fija en macromoléculas del tejido conectivo. El defecto metabótico reside en la carencia de hornogentisato 32-13)' ho* rnogentisato en la orina es entonces oxidado por el O2en el aire hasta un color negro-pardusco. Se ha informado de más de 600 cacos de este trastorno recesivo autosbmico. Se estima una incidencia de 2 a 5 por millón de nacimientos vivos.
La hidroxilación de la fenilalanina forma tiros jna en tirosina por la reaccion por la fenilalaninhidroxilarn (figura 30-1 0). El patrbn de marcacíhn, en los productos anfibólicos f u m m o y acetoacetato (figura 32-1 5), es idéntico al de la tirosina (figura 32-1 3). L,fenilalanina primero es
TRASTORNOS METABÓLICOS DEL CATABOLISMO DE FENllALANlNA
O Acetato de benzoquinona
Aunque que se han identificado los tipos adicionales (cuadro 31-31, los principales trastornos relacionados con el deterioro en la capacidad de convertir feni lalanina en tirosina (figura 30-10) se pueden clasificar en tres amplios grupos: 1) Defectos en la fenilalanina hidroxilasa (hiperfenil-alaninemia tipo 1, o fenilcetonuria típica); 2) defectos en la dihidrobiopterina reductasa (hipdenilalaninernia tipos I I y 111); 3) de-
(Capítulo 32)
3 76 Bioquimica de Harper
Fumarato
Acetoacetato
tratada es el retraso menta!. Ademiis, se incluyen los signos cllnicos, convulsiones, psicosis, eccema y un olor "a ratón". La intervención de una dieta apropiada puede aminorar el retraso mental. En la FC clhsica, un trastorno hereditario con una frecuencia de aproximadamente 1:10 000 de los nacimientos vivos, la concentraciiin del componente 1 de la fenilalanina hidroxilasa hepbtica (figura 30-10) es akededor de 25% de lo normal, y la hidroxilasa es insensible a la regulación de la fenilalanina. Dado que los pacientes no pueden convertir la fenilalanina en tirosina, se producen catabolitos alternativos (figura 32-1 6). Esto incluye al hcido fenilpinivico y al acido fenilhctico. Gran parte del fenilacetato se excreta como fenacetil glutamina (cuadro 3 2 4 ) . El deterioro mental de la fenilcetonurla en nifíos puede prevenirse mediante una dieta baja en fenilalanina. Esta dieta puede terminarse a los seis aRos de edad, cuando las concentraciones altas de fenilalanina y sus derivados no dafien m8s al cerebro. En la actualidad, es obligatorio someter a todos los reciCn nacidos a análisis en busca de EC. La fenilalanina plasmhtica puede medirse empleando sólo 20 pL de sangre. Sin embargo, los altos valores sanguíneos de fenilalanina en los lactante5 fenilcetonúricos pueden no aparecer hasta el tercer o cuarto día de vida, debido a su baja ingestión inicial de proteina dietetica. Además, pueden producirse: resultados falsos positivos en los niiios prematuros debido al atraso en la maduracibn de las enzimas requeridas para el catabolismo
Dibxido de carbono
Figura 32-15. Destino catab6lico final de cada Atomo d e carbono de la fenilalanina Loc números muestran patrón de la marcacibn icotdpica en los últimos catabolitosde fentialanina
(y tirosina)
fectos en la biosíntesis de dihidrobiopterina (hiperfeniIalaninemia tipos IV y V). Los genes humanos que codifican la fenilalanina hidroxilasa y la dihidrobiopterina reductasa se han clonado y secuenciado; come consecuencia, se confirma que e1 DNA esta disponible pam el diagnóstico prenatal de los defectos en cualquiera de estas enzimas. Las principales consecuencias de la hiperfenilalaninemia tipo I (fenilcetonuria clhcica o FC) no
Cuadro 324.Hiperfenilalaninemias* - ... .
Defecto "
' +
-
nto
-
fcnilaIanina Ausen cia de feni !hidroxilas, - . . .. . . ,. / ~ i s r n i n u c l ~den i t ~~eniiniaroxiiasa NlngUnO o terapeutrca aictetica tem?oral I 1 .. dc la hi- . 1lgual que en el tipo II ia en
""
;ipericni~a~aninemia persistente
aninemia It:ve transiito
0.
--
---
..
IV
Dcfíciencia de dihidrobiopterid
reductasa --
-.P.
:
-
cncia o aiiscncía de (iihidrop- l
idroxitriptbfano, carbi4 ireductasa -en ia biritesis de la ulrliurii- i~iiiti,J-riidroxitrr~tbfano.carbihpa biopte rina [ngestihnrleducida de fcnilalaniria ,olismo de la tirosina' --m
%
V
""
m
FunciOn anormal de ti
aninemi a Ff
-nronatal Erar
Inhibi,ción de IH vico-o
irosincmia hereditaria
encia: . . .* ..
1. p-~idrox~fcn~tpiriivico-o:
Vitamina C Dieta escasa en tirosina mas inyecciones de glutati '
2. Tirusinaminotransferasa mica 3. Fiimarilacetoacetato hidrolasa --* Modificado y reproducidocon niitorizaci6n de Tourian A. Sidburgy JR"Phenylketuniiria and hyperphenqlalnninemia.En: Scriver CR et
L
al (editores) IXe
I
.A
A
\4ctubolic Basis oflnherited nrreuse. 6th ed. McGraw-l lill, 1989
Catc~holismode los tisqueleio~de carbono de aminohcidos 3 77
La administracibn de fenilalanina a una persona fenilcetonurica deberh conducir a una elevación prolongada de la concentraci~nde este aminoácido en la sangre. Debido a que la tolerancia y los altos valores de fenilalanina en el ayuno tambien caracterizan de padres fenilcetonúriccis, los defectos geneticos causantes de la fenilcetonuria pueden detectarse en individuos heterocigotos con fenotipo normal.
a-Cetoglutarato
Glu
El nitrógeno de lisina no participa en la tranaaminación Los mamíferos convierten al esqueleto intacto de carbono de la L-lisina en alfa aminoadipato y alfa cetoadipato (figura 32-17), Este proceso implica a la sacaropina, la cual es un intermediario en la biosíntesis por hongos. La 1.-lisina se condensa primero con e l alfa cetoglutarato, fonnhndose una base de Schiff. Esta es reducida a sacaropina y luego oxidada por una segunda deshidrogenasa. La adición de agua forma ~-glutamatoy ~-alfa-aminoadipato~masemialdehído. Por tanto, estas reacciones imitan la remoción del nitrógeno épsilon de la lisina por transaminacibn, una reacciiin que en realidad no tiene lugar en los tejidos de mamíferos. La transaminacibn del alfa arninoadípato forma alfa cetoadipato, probablemente seguido por la descarboxilacion oxidativa que produce glutarilXoA. Cuando la lisina es glucogknica y cetogénica, la naturaleza de los subsiguientes catabolitos de la glutariI-CoA en los sistemas de mamíferos no se conoce. Un trastorno en la conversion de L-lisina y alfa cetoglutarato a sacaropina (figura 32-1 7)produce dos anormalidades metaboticas poco comunes.
coi
Figura 32-16. Vias alternas del catabolismo de la fenilalanina de importancia particular en la fenilcetonurra. Las reat; ciones mostradas también se producen en el tejido hepgtico de los individuos normales, pero son de menor significado si existe una fentlalaninhidroxilasa funcional (Glu, glutamato; Gln, glutamina.)
A. Hiperlisinemia periódica relacionada con hiperamonemia En la hiperlisinemiapcniidica,la ingestidn de cantidades nomales de proteínas desencadena la hiperlisinemia. Luego, la concentracion elevada de lisina en el hígado inhibe de manera competitiva a la arginasa,causando hi-
de la fenilalanina. Una prueba de selección Util, pero menos contiable, depende de la identificacibn de concentraciones urinarias elevadas de fenilpinivato con el cloruro fkrrico.
uadro 32--4. Metaholitos de la fenilalanina que se acumulan en e1 plasma de pacientes fenilcetonúricc3s
- .-
botito
--- - -
-1
-----.-..
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Orina (
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7
Norm u
30
(Capitulo 32)
Bioquimlca de Harper I
O\
UZO
4,u=o
1
+n
O\
o=o
+m
I I
z-o
1
I I Z-U
\w I
; x
amo de los esqueletos dc carhono de uminoácidos 3 79
peramonemia. La terapéutica con líquidos y la resiriccíbn en la ingestión dietética de lisina alivian la hiperamonemia y sus manifestaciones clínicas. Inversamente, la administraci~nde una carga de lisina precipita una crisis grave y coma.
B. Hiperlisinemia persistente sin hiperamonemia Algunos pacientes sufren retraso mental. No hay hiperamonemia concomitantc, ni aun en respuesm a una carga de lisina. Los catabolitos de la lisina pueden o no acumutarse en los líquidos biol0gicos. Se cree que la hiperlisinemia persistente se hereda como un rasgo autosómico recesivo. Ademb del trastorno en la conversión de la lisina y el alfa cetoglutarato en sacaropina, algunos pacientes no pueden desdoblar esta última (figura 32- t 7).
La triptófano oxigenasa inicia el catabolismo del triptófano Los átomos de carbono, tanto de la cadena lateral como del anillo aromhtico, pueden ser completamente degradados en intermediarios anfibblicos por la vía de la cinureninantranilato (figura 32-1 8) importante no s610 para la degradación del triptófano, sino tarnbien para la conversión de este en nicotinamida. La triptbfanmxigenasa (triptbfano-pirrolasa) cataliza el rompimiento del anillo indhlico con la incorporación de dos átomos de oxígeno molecular, formando N-formilcinusenina. La enzima oxigenasa es una metaloproteina fdrrica profirinica que es estimulada en el higado por los corticosteroides supravenales y por triptófano. Una porción considerable de la enzima recikn sintetizada esta en una forma latente que requiere activacibn. El triptófanotambiCn estabiliza a la oxigenasa hacia la degradación proteolitica. La triptófano-oxigenasa es inhibida mediante retroalimentacibn por los derivados del bcido nicotínico, incluyendo el NADPH. La eliminaci~nhidrolítica del grupo fomilo de la N-formilcinuremia, catalizada por la cinurenlna formilasa del higado de mamíferos produce cinurenina (figura 32-1 S). La cinoreninapuede ser desaminada por transaminacibn. E! cetoderivado resultante, 2-amino-3-hidroxibenzoilpiruvato, pierde agua y luego experimenta ciclizacibn espontánea formando ácido cinurdnico. El metabolismo posterior de la cinurenina implica su conversión en 34idroxiquinurenina, la cual a su vez es convertida en 3-hidroxiantranilato. La hidroxilación requiere de oxigeno molecular en una reaccibn dependiente de NADPI-I semejante a la hidroxilaci6n de la fenilalanina (figura 30-1 0).
El xanturenato se acumula cuando existe deficiencia de vitamina B6 La cinurenina y la hidroxicinurenina son coveriidas en hidroxiantranilato por la enzima cinureninasa, que contiene fosfato de piridoxal. Una deficiencia de vitamina Bbda por resultado algún grado de incapacidad pasa catabolizar estos derivados de la cinurenina, los cuales con convertidos en xanturenato {figura 32-1 9). Este metabolito anormal se encuentra en la orina cuando en la dieta la ingestión de vitamina Be es inadecuada. La ingestión excesiva de triptófano induce la excreción de xanturenato cuando hay deficiencia de vitamina Bb. En muchos animales, la conversibn del tript6fano en ácido nicotinico hace innecesario un aporte de la vitamina en la alimentacibn. El triptófano puede remplazar completamente a la vitamina B6 en la dieta de roedores, perros y cerdos. En el ser humano y otros animales, el triptófano incrementa la excrecibn urinaria de los derivados del acido nicotinico (por ejemplo, la N-metilnicotinamida). En la deficiencia de vitamina Rg, la síntesis de NAD' y NADP" puede ser deficiente, como resultado de la conversión inadecuada del triptófano en hcido nicotinico para la sintesis de tos nucleótidos. Si se proporciona un complemento adecuado de hcido nicotinico, la sintesis de nuclebtidos procede normalmente aun en ausencia de vitamina R6. La enfermedad de Hartnup, un rasgo recesivo autosdmico, se debe a defectos en el transporte intestinal y renal de aminoacidos neutros, incluyendo triptbfano. Los signos comprenden una aminoaciduria neutra general y, por lo común, también un incsemento en la excreción de derivados indólicos, que provienen de la degradación bacteriana intestinal del triptófano no absorbido. El trastorno de la absorcioii intestinal y la resorción renal de triptófano limita su disponibilidad para la biosintesis de niacina y explica los signos y síntomas semejantes a pelagra que acornpafian a la enfermedad.
LA METIONINA, LA ISOLEUCtNA
Y LA VALlNA SE CATABOLIZAN A SUCCINTL-CoA Mientras que la succinil-CoA es el producto terminal anfibólico del catabolismo de la metionina, isoleucina y valina, sólo una porción de sus esqueletos de carbono es convertida (figura 32-20). Cuatro quintas partes de los cabonos de la valina, tres quintas partes de los de la metionina y únicamente lamitad de los de la isoleucina, contribuyen a la fomacidn de succinilCOA.Los carbonos carboxilicos de los tres aminoacidos forman Coz. Los dos carbonos terminales de la isoleucina forman acetit-CoA y el grupo metilo de la metionina es eliminado como tal.
(Capitulo 32)
380 Bioquímica de Harper
0
1
a-u
+m
F:=~ O
31
",\P
Calubolismode los esqueletos de carbono de aminocicido.~ 381
Xanturenato
Figura 32-19. Forrnacidn de xanturenato en la deficiencia de vitamina b.La conversión del metabolito de tnptbfano 3-hidroxicinuren~naa 3-hidroxiantranilato esta alterada (figura 32-1 8). Por tanto, una gran porcdn se convierte en xanturenato.
(figura 32-21]. El grupo S-metilo activado puede transferirse a varios compuestos aceptores. La remoci6n del grupo metilo forma S-adenosilhomocisteina. La hidrolisis del enlace S-C produce l.-homocisteina .nhs adenosina. La homocisteína se condensa luego con serina formando cistntionina (figura 32-22). El desdoblamiento hidrolitico de la cistationina forma ~-homoserinay cisteína, de manera que el efecto neto es la conversión de la homocisteína en homoserina y de la serina en cisteína. Estas dos reacciones, por tanto, tambidn intervienen en la biosintesís de la cisteina a partir de la smina (capitulo 30). La hornoserina es convertida en alfa cetobutirato en una reacci6n catalizada por la homoserina desaminasa (figura 32-23). Después se produce la conversión del alfacetobutirato en propionil-CoA de la manera usual por la descarboxilaci6n oxidativa de los alfa cetolcidos (por ejemplo, pimvato, alfa cetoglutarato) para formar derivadas de la acil-CoA. En el cuadro 32-2 se muestran los trastornos metabólicos del catabolisrno de la metionina.
LAS DOS REACCIONES CAVABÓLFCAS INICIALES SON de metionina e isoleucina en propionil-CoA y de COMUNES A LOS TRES valina en m e t i l m a l o n i l ~ o A Las . reacciones que Ilevan de propioiiiI-CoA a traves de r n e ~ i l m a i o n i l ~ o A AMINOÁCIDOS CON CADENAS hasta succini t
Lo que sigue se relaciona sbta con la conversibn
hcidos grasos que contienen un número impar de htomos de carbono.
Los carbonos del metionilo forman propionil-COA La ~ m e t i o n i n ase condensa primero con ATP, formando S-adenosilmetionina, o "metionina activa"
-S
Metionina
- CHI - NH3
U-Cetobutirato
1-
COI coz - AcCoA lsoleuana---r Propionii-CM -
J.+ CQ* Valina
- CO,
* Metilmalonil-CoA
i
SuccinlCCoA
Figura 32-20. Catabolismo global de la metionina, isoleucina y valina.
El principio del catabolismo de la leucina, valina e isoleucina implica las mismas reacciones. Esta via común diverge y cada esqueleto de amino;icido sigue su propia vfa Unica para los intermediarios anfib6licos (figuras 32-24 y 32-25) cuyas estructuras determinan que la valina es glucogenica, la leucina es cetogknica y la isoleucina es ambas. Muchas de las reacciones que intervienen son estrechamente análogas a las de1 cazabolismo de los Bcidos grasos de cadena recta y ramificada En lo que sigue, los números de las reacciones corresponden a las figuras 32-25 a 32-28. El catabolismo de los aminokidos de cadena ramificada tiene lugar en el higado, rifion. músculo, corazón y tejido adiposo y se inicia con su ingreso a las cklulas a travks de un transportador de membrana celular. Después de la transaminación reversible, los alfa cetoicidos resultantes entran en las mitocondnas en donde se descarbaxilan de manera oxidativa por una dfa cetohcido descarboxilasa de cadena ramificada unica la cual es un complejo multienzim~ticopoco relacionado con la membrana mitocondrial interior. Los tidsteres de cadena ramificada de la alfa cetoacetil-COA que resultan se catabolizan en seguida por diferentes vias.
382 Bioquimica de Harper
(Capitulo 32) --
coo -
COO I
+
1
H3N-C-H
+H,N-C- H
-+CH,
Adenina ADENOSILTRANSFERASA
S-Adenocil-L-metionina ("metionina activa")
Figura 32-21. Formacibn de S-adenosilmetionina. El grupo -CH3 representa el elevado potencial de transferencia de la "rnetionina activa".
Una sola enzima transamina a los tres aminoácidos con cadena ramificada La transaminarilin (reacción 1, figura 32-25) de los tres aminoácidos ramificados es catalizada por una sola transaminasa. Debido a que esta rcaccidn es reversible, lacorrespondiente alfa cetoicido puede sustituir sus aminoacidos en la dieta.
La descarboxilación oxidativa de los alfa cetoácídos ramificados es análoga a la conversión de piruvato a acetil4oA Un complejo rnutienzim6tico intramitocondrial que cataliza la descarboxilaci~noxidativa del alfa cetoácido derivado de la Eeucina, icoleucina y valina (reacción 2, figura 32-25). La estructura y la regulacidn de su deshidrogenasa se aseme-ia mucho a la pinivato deshidrogenasa. Sus subunidades son un alfa-cetokido descarboxilastsa una transacilasa y un dihidrolipoil deshidrogenasa. El complejo es inactivado cuando se fosforila por ATP y una proteina cinasa y es reactivado por Caz' independiente de Ea fosfoproteina fosfatasa. La protelna cinasa es inhibida por el ADP, los productos de los alfa cetoacidos de cadena ramificada, los agentes hipolipidemicos clofibrato y dicIoroacetato y los tioésteres de la coenzima A.
La deshidrogenación de tioésteres acil-CoA ramificados es análoga a una reacción del catabolisrno de ácidos grasos La reacción 3 es analoga a la deshidrogenacidn de los tioésteres de acilXoA en el catabolismo de los hcidos grasos. La evidencia indirecta implica, por lo menos dos enzimas. En la acidemia isovalkrica, la ingestión de alimentos ricos en proteínas eleva las concentraciones sanguíneas de isovalerato, un producto de la desacilacion de la isovalerilCoA.
Tres reacciones son específicas del catabolismo de la leucina
A. Reacción 4L La cEavc para comprender el efecto cetogeno de la leucjna fiie el descubrimiento de que un mol de COZ era "fijado" por cada mol de grupos isopropilo (provenientes de la leucina) y convertido en acetoacetato. Esta fijaci6n de CO? (reacción 4L, figura 32-26) requiere de biotinil-C02 y forma beta metilglutaconil~oA.
B. Reacción 5L Hjdratación de la beta-metilglutaconil~o,4 forma beta-hidroxi-beta-metilglutaril-COA(HMG-COA), un precursor no s610 de cuerpos cetbnicos (reacciiia 6L, figura 32-26), sino tambihn del mevalonato y, por tanto, del colesterol y otros poliisoprenoides (capitulo 28).
C. Reacción 6L El desdoblamiento de HMG-CoA en acetil-CoA y acetoacetato por la HMG-CoA liasa de larnitocondria hephtica, renal y cardiaca participan en el intenso efecto cetogénico de la leucina. No sélo se forma 1 m01 de acetaacetato por mol de leucina, sino que otra medio m01 de cuerpus cttbnicos se puede formar indirectamente a partir del producto remanente, la acetil4oA (capitulo 24).
Cuatro reacciones son especificas del catabolisrno de la vatina
A. Reacción 4V La hidratación de la metilacrilil-CoA. Es catalizada por la crotonasa, una hidrolasa de amplia especificidad para los tioksteres de ~-beta-hidroxiacil
Cuiuboiismo de los esqueletos de carbono de aminoácidos * 383
NH3+
I
H,C,
S
C , H2,
CH,
,CH,
C
,o-
II
o L-Metionina
P, + PP,
o II
H3C,
-O/C,
CH
,CH2
CH,
,C,
,o-
C F I
O
Cistationina
Figura 32-23. Conversibn de la L-hornoserinaa a - ~ t o b u t i rato, catalizado por la homoserina desaminasa
o
O
II
II
CH
I
NH; L-Cisteina
N ;''
11 O U-Cetobutirate (figura 32-23)
B. Reacción 5V 13ebido a que la heta-hidroxiisobutiril4oA no es un sustrato para la reacci6n subsiguiente, es desacilada a beta hidroxiisobutirato.
C. Reacción 6V La oxidacibn reversible dependiente de NAD' del grupo alcohol primario del beta hidroxiisobutirato a un aldehido, forma el metilrnalonato semialdehido.
D. Reacción 7V Figura 32-22. Conversión de metionina a propienil-COA.
La transaminación de metilmalonato semialdehido forma alfa aminoisobutirato, un arninolicido urinario normal.
384 * Biwuim icu de Harper
(Capitulo 32)
B. Reacción 5L
Leucina, valina. isoleucina
La deshidrogenacion de la alfa-meti-beta-hidroxibutiril-COA. Es analoga a la reacci6n 5V del catabolismo de le valina.
t a-Cetoacidos wrrespondientes
C. Reacción 6L El desdoblamiento riolítico del enlace que une los carbonos 2 y 3 de la alfa-metilacetoacetiI-CoA se parece a la tiólisis de la acetoacetil-CoA por beta cetotiolasa. Los productos, las acetil-CoA (cetégena) y la propionil4oA (glucogenica), tienen participacibn cn las propiedades cetogena y glucógena de la isoleucina. Tioeisteres Acil-CoA a.p-insaturados correspondientes
Succinil. COA
Propionil-COA + acetil-COA
Figura 32-24. Cataboltsmo de los amrnoácidos de cadena ramificada en los marniferos. Las reacciones (. y @ san comunes a los 3 aminoBcidos; de ahi en adelante las vias divergen Las líneas gruesas que intewctan a las flechas marcan los sitios de bloqueos metabblicos en dos enfermedades humanas niras. en @ , la enfermedad de la orina de un defecto en el catabolismo de los tres arninoAcidos, y @ la acidemia isoval&rica, un defecto del catabolismo de la leucina
.
E. Reacción 8V De manera alterna, el semialdehido de metilrnalonato es acilado por oxidacibn a metilmalonil
F. Reacción 9V La isomerizacidn de la metilmalonil-COAa succinil-COA se cataliza por la enzima metilmalonil-COA mutasa, cuya coenzima es la adenusilcobalamina, detivada de la vitamina B i2. Esta reaccidn de isomenzacibn tambien funciona en la conversión en succinil-COA de la propionilCoA que deriva:de la isoleucina (figura 32-28). En la deficiencia de vitamina E11 se incapacita la actividad de la mutaca. Esto produce un "defecto metabolico dietktico" en los rumiantes que utilizan como fuente de energía al propionato a partir de la fermentación en el mrnen.
Tres reacciones son exclusivas del catabolismo de isoleucina
A. Reacción 4L La hidratación de la tiglil-CoA. Como la reaccián analoga en el catabolismo de la valina (reaccidn 4V) es catalizada por la crotonasa (figura 32-28).
TRASTORNOS METABÓLICOS DEL CATABOLtSMO DE LOS AMINOÁC~DOSDE CADENA RAMIFICADA 1) Enfermedad de la orina de jarabe de maple (cetonuria de cadena ramificada): El rasgo m8s sorprendente de esta enfermedad hereditaria autosomica recesiva (incidencia de I : I 85 000 en el mundo) es el olor tipico de la orina, que se parece al de la mieF de arce o al de azúcar quemada. Los valores placmAticos y urinarios de leucina, isoleucina y valina, asi como de sus correspondientes alfa cetohcidos están grandemente elevados. Cantidades menores de alfa hidroxiicidos de cadena ramificada, formados por reduccion de los alfa cetoacidos, también se encuentran en la orina. Los signos caracteristicos de la enfermedad son evidentes hacia el fin de la primera semana de vida extrauterina. El lactante es dificil de alimentar y puede vomitar y ser letárgico. El diagnostico antes de una semana de edad s610 es posible mediante el analisis enzirnático. En los niilos que sobreviven se presenta daño extenso del encefalo. Sin tratamiento, la muerte usualmente tiene lugar al final del primer aflo de vida. El defecto bioqulmico es la falta o la gran reducción de la actividad de la alfa cetoácido descarboxilasa (reaccibn 2, figura 32-25). El mecanismo de toxicidad se desconoce. El inicio del tratamiento en la primera semana de vida puede prevenir las consecuencias; implica la restitución de las proteinas en la dieta mediante una mezcla de aminohcidos excepto leucina, isoleucina y valina. Cuando los valores placrnáticos de estos aminohcidos se encuentran dentro de los limites normales, éstos son incorporados a la dieta en forma de leche u otros alimentos en cantidades adecuadas sin exceder la demanda metabólica. Cuando la mutacibn incapacita a la dihidrolipoato reductasa (E3), hay una incapacidad combinada para descarboxilar piruvato, alfa cetoglutarato y cetohcidos de cadena mmificada.Tomando
C~fuholismo de los esqueletos de carbono de aminoucidos * 385
/~CH2\CH,CH\C,*-
I CH,
O
CH,
tl
O
L-Valina
HzC
CH,
O
I
II
,CH,
CH,
,C,
S-COA
Figura 32-25. Las tres reacciones análogas iniciales en el catabolismo de la leucina, valina e isoleucina. Ob&niese tarnbien la analogía en las reacciones @ y @ del catabolismo de los Acidos grasos (capitulo 24). Esta iiltima analogia continúa, según se muestra en las fguras subsigutentes.
en cuenta la complejidad del sistema multienzimatico que convierte los alfa cetohcidos en tioesteres de la acil-COA, no sorprende que numerosas mutaciones, muchas de las cuales están identificadas, den lugar a la enfermedad de la orina de jarabe de maple. Por ejemplo, en la antigua orden menonita de los condados de Lancaster y Líbano en Pensilvania, en donde la incidencia de la enfermedad de la orina del jarabe de rnaple es de 1 :?75, 30 que impide la vinculación con las beta subunidades E l es una mutaci6n hornocigota de Tir 395 a Asn en la subunidad alfa de la descarboxilasa. 2) Cetonuria intermitente de cadena ramificada: Esta variante de la enfermedad de la orinadejarabe de maple probablemente refleje una modificación estructural menos drhtica de la alfa cetoicido
descarboxilasa. Puesto que las personas poseen una incapacitada, pero clara capacidad para catabolizar la leucina, la valina y la isoleucina, los síntomas de la enfermedad se presentan mlis tarde en la vida y s610 intermitentemente. El pronóstico para la teraphitica dietbtica es más favorable en estas personas. La enfermedad de la orina de jarabe de maple y la cetonuria intermitente de cadena ramificada ejemplifican las mutaciones que causan diferentes cambios en la estructura primaria de la misma enzima. Es probable que el espectro de actividades que va desde una enfermedad franca a traves de manifestaciones intermitentes hasta valores normales ocurre individualmente.
(Capitulo 32) -.
386 Bioquimica de Harper
CH,
O
I
II
H , C ~ C + C H / C ~S
- COA
o-Metilcrotonii-COA
Acetoaaetato
Acetil-COA
Figura 32-26. Catabolismo del P-rnetilcrotonrl-COA formado a partir de la L-leucina.*Atomos de carbonbderivados del Coz.
3) Acidemia isovalérica: La enzima defectuosa es la isovaleriE-CoA deshidrogenasa (reaccibn 3, figura 32-25). Así, la isovaleril-CoA se acumula, es hidrolizada a isovalerato y excretada en Ea orina y el sudor. Los slntomas incluyen un olor "a queso" del aliento y los líquidos corporales, vdmito, acidosis y coma precipitado por la ingestidn excesiva de proteína.
2) A c i d e m i a prepi6nica: L a deficiencia de propioniI-CoA carboxilasa se caracteriza por la elevacibn de los valores skricos de propionato. El tratamiento comprende una dieta baja en proteína y m e d i d a s p a r a contrarrestar ta acidosis metabólica.
RESUMEN TRASTORNOS DEL CATABOLISMO DE LA METILMALONIL-CoA 1) Aciduria metilmalónica: Una reaccidn depen-
diente de la coenzima vitamina B12 isomeriza metilma!onilXoA a succinil
Cuando los aminoácidos esta presentes en exceso a las necesidades methbolicas, sus esqueletos de carbono son catabolizados a intermediarios anfibolicos para usarse como energeticos o como sustratos para biosíntesis de carbohidratos y lípidos. En el catabolismo de aminohcidos, la reacción inicial más frecuente es la remoción del nitrógeno del grupo alfa m i n o . Las reacciones subsecuentes retiran cualquier nitrbgeno adicional y reestructuran el esqueleto hidrocarbonado remanente para convertirlo en intermediarios anf bólicos como oxalacetato, alfa cetoglutarato, pimvato y acetilZoA. Por ejemplo, la desaminacihn de la asparagina forma aspartato, que después de la transaminación se convierte en oxalacetato. Laglutamina y el glutamato forman alfa cetoglutarato por reacciones
Cu~abolrsmode 10.7 esqtiele/os de carhono de aminoácidos 387
H3
Metilmalonato sernialdehido
NADH t H +
Figura 32-27. Catabolismo subsecuente del metauilil-COA formado de la L-valina (figura 32-25). (a-KA, a-cetoAcido; @-M, a-aminoficido.)
O-H
O
1 ,H
Il
~ / C ~ c n / C \S-coa i
Flgura 32-28. Continuacdn del catabolismo del tiglil-COA formato de la L-rsoleucina.
análogas. No se conocen trastornos metabolicos selacionados con el catabolismo de estos cuatro arninoBcidos. Sin embargo, existen dos hiperprolinemias relacionadas con la vía catabólica que convierte la proltna en alfa cetoglutarato. La reaccibn inicial del catabolismo de la arginina es catatizada por arginasa, unaenzirnade la síntesis de urea Luego, latmnsrmiinacion del nitrdgeno delta de la orinitina forma glutarnatogamma-semialdehído, punto en el cual el catabolismo de arginina se fusiona con el de histidina. Seis aminoácidos forman el pimvato. Las enfermedades metabolicas relacionadas con el catabolismo de la glicina incluyen glicinuria e hiperoxaluria primaria. La transaminacidn de la alanina forma pimvato de manera directa, en tanto que la serina es catabolizada viaglicina. Después de la reducción de cistina a cisteina, dos grupos de reacciones catabólicas convierten la cisteina en pinivato. Las enfermedades metabhlicas relacionadas con el catabolismo de la cistefna comprenden cistina-lisinuria, la enfermedad por almacenaje de cistina y las homocistinurias. El catabolisrno de la
388 RioquIm icu de Hurper
treonina converge con el de glicina despuks que la treonina aldolasa separa la treonina en glicina y acetaldehído. La oxidación de este último forma acetato y mmls adelante acetil-CoA. Da hidroxiprolinernia se debe a un defecto en la capacidad para degradar 4-hidroxiprolina a pimvato y glioxilato. Doce aminoácidos forman acetil-COA. Después de la transaminación, el esqueleto de carbono de tirosina es degradado a fumarato y acetoacetato por medio de una secuencia compleja de reacciones. Las enfermedades metab6licas relacionadas con defectos erizirnáticos en el metabolismo de la tirosina comprenden tirosinosis, síndrome de Richner-Hanhart, tirosinemia neanatal y alcaptonuria. La hidroxilacion de la fenilalanina forma tirosina. Los trastornos metabólicos del catabolisrno de fcnilalanina incluyen fenilcetonuria (FC) y varias hiperfenilalaninemias. Ningún nitrbgeno de lisina experimenta transaminación. Por tanto, el nitrhgeno del grupo alfa amino es removido de manera indirecta pos medio de la sacaropina. Las enfermedades rnerabblicas del ca-
(Capitulo 32)
tabelismo de la lisina comprenden formas persistentes y periódicas de hiperlisjnemia, de amonemia o de ambas. El metabolito anormal de1 triptofano, xanturenato, se acumula cuando hay deficiencia de vitamina B6. La metionina, isoleucina y valina son catabolizadas a succinil4oA. El catabolismo de leucina, valina e isoleucina presenta numerosas analogías con el catabolismo de los Iicidos grasos. La descarboxilación oxidativa de alfa cetoácidos ramificados es anLloga a la conversibn de pimvnto en acetilXoA y la deshidrogenación de tiodsteres acil42oA ramificados es semejante a una reaccibn del catabolismo de los ácidos grasos. Tres reacciones son especificas del catabolismo de leucina, cuatro del catabolismo de valina y tres del catabolismo de isoleucina. Los trastomos metabólicos incluyen hipervalinemia, enfermedad de la orina de jarabe de maple, cetonuria de cadena ramificada intermitente. acidemia isovalérica y aciduria metilmalónica.
REFERENCIAS Cooper AJL: Biochemistry ofthe sulfur-coníaining amino
acids. Annu Rev Riochcm 1983,52.187. Harris FLi et al.: Moleculrtrcloningol'the branched-chain a-ketoacid dehydrogenasc kinase and the CoA-de-
pendent rneíhylmalonatc semialdehyde dchydrogenase. Adv En7yme Kegul 1993;33:255. Scriver CR et al. (editors): 7he 2:24etabolicRasis oflnherited Disease. 7th ed. McGraw-1 lill, 1995.
. .
Vjctor W Rodwell, PhD
Este capitulo presenta ejemplos de la biosintesis de compuestos nitrogenados importantes derivados deaminohcidos, distintos a proteína. Ademas de los topicos que aquí se presentan, la atenciiin del lector se dirige a procesos que se describen en detalle en otros capituloc de esta obra. Paradichos procesos los lectores pueden referirse a los capitulas apropiados que se citan. Así el material se m e con el de las vías metabiilicas expuesto en otra parte del libro.
IMPORTANCIA BIOMEDICA Los productos de importancia fisiolbgica, que derivan de los aminoácidos incluyen hem, purinas, pirirnidinas, hormonas, neurotransmisores y péptidos con accividad biológica. Además, muchas proteinas contienen aminoAcidos que se han modificado para una funcibn específica; por ejemplo, enlace de calcio o como intermedio que sirve para estabilizarproteinas, por 30 general estructurales, mediante enlace cruzado covalente subsecuente. Los residuos de amindcidos en esas proteínas sirven como precursores de residuos modificados. Por último, hay péptidos pequefioc o rnoleculac semejantes a pkptidos, que no son sintetizadas por ribosomas y que llevan a cabo funciones especificas en las cblulas. La amina biolbgicarnente activa, histamina, se forma por la descarboxilación de la histidina y tiene funcihn fundamental en numerosas reacciones atkrgicas. Los neurotransmisores tspecificos derivados de los aminohcidos, incluyen al gamma aminobutirato procedente del glutamato; 54idroxitriptamina (serotonina) apartir del tnptófano; y dopamina, noradrenalina
y adrenalina a partir de la tirosina. Ademhs, muchos medicamentos utilizados para tratar enfermedades neurológicas y psiquiátricas, afectan al metabolismo de los neurotransmisores mencionados.
LA GLlClNA PARTICIPA EN LA BIOS~NTESISDE CONJUGADOS DE GLICIMA, CREATINA, HEM Y PURlNAS 1 ) Conjugadosde glicina: Numerosos metabofitos y fármacos se excretan corno conjugados de glicina solubles en agua. Ejemplos son el conjugado biliar hcido glucocólico (figura 28-7) y el hcido hipúrico formado del aditivo de alimentos, benzoato (figura 33-1). La capacidad del higado para convertir benmato en hiaurato fue usada inicialmente como prueba de funcionamiento hepático. A d e m b del benmato, muchos medicamentos y sus metabolitos que contienen grupos carboxilo se excretan en la orina como conjugados de glicina. 2) Creatina: La sarcosina (N-metilglicina), componente de la creatinina, se deriva de la glicina y S-adenosil metionina (figura 33-10). Los temas abarcados en cualquier parte de esta obra incluyen lo siguiente: 3) Hem: El nitrógeno y el carbono alfa de la glicina se convierten en el nitrdgeno y los dos carbonos aIfa de los anillos pirrólicos y en los carbonos de los puentes metileno del hem (figura 34-5). En el capitulo 34 se describen los trastornos metabolicos del metabolismo del hem. 4) Purinas: La rnolecula entera de glicina constituye los atomos 4 , 5 y T de las purinas (figura 36-1).
390
(Capitulo 33)
Eioquimica de Harper
o Ergotioneína
Hipurato
O
Figura 33-1. Biosíntesis del hipurato. Anserina
LA ALFA ALANlNA ES EL PRINCIPAL AMINOACIDO PLASMÁTICO
I
I I
La alfa alanina, junto con la glicina, constituyen una fraccibn considerable del nitrbgeno arninico en el plasma humano. En las bacterias Ea ~-alaninajunto con la ~-aianinason los principales componentes de la pared celular.
LOS MAM~FEROSCATABOLIZAN BETA ALANENA MEDIANTE LA V ~ A MALONATO SEM~ALDEH~DO La mayor parte de la beta alanina de los tejidos de los mamíferos estl presente como coenzima A (figura 5 2 4 ) o como dipéptidos betaalanilo (vease adelante). En tanto que los microorganismos sintetimn la beta alanica por alfa descarboxilacibn del aspartato, en el tejido de marniferos surge principalmente del catabolismo de citocina (Figura 36-16), carnosina y anserina (figura 33-2). El catabolismo de la beta alanina en los marniferos comprende su transaminacibn a malonato sernialdehido, el cual entonces se oxida a acetato y de aquf a Coz.En el raro trastorno metabólico, hiper-beta-alaninemia las concentra-
Homocarnosina
Flgura 33-2. Compuestos reladonados con la histidina. Los componentes encerrados en rectángulo no se derivan de la histidina.
ciones de beta alanina, de taurina y beta aminoisobutirato esthn elevadas en los líquidos corporales y en los tejidos.
LA CARNOSINA ES UN DIPÉPTIDO BETA ALANILA La beta alanina se encuentra principalmente como el dipkptido del músculo esqueltitico humano camosina (figura 33-2). El dipdptido de beta alanila ancerina (N-metilcarnosina, figura 33-2), en el ser humano deriva de la dieta pero estB presente en el músculo
Covrversibn de aminocícidos en productos especralizados
esquelético que se caracteriza por una actividad contr'dCtiJ rhpida (extremidades de los cone,josy miisculo pectoral de las aves). Por tanto, la anserina puede cubrir funciones físiologicas distintas de la carnosina. El beta-alanil-imidazol actúa como amortiguador de pH en el músculo esqueletico que se contrae en anaerobtosis. Tanto la carnosina como la anserina activan a la miosinATPasa Ademas, ambos dipéptidos quelan al cobre e incrementan su captacion.
Los dipéptidos de beta alanina se sintetizan y degradan por vias cortas La bioséntesis de la carnosina se forma a partir de beta alanina y ~ A i s t i d i n aen una reacci6n que requiere ATP, catalizada por la carnosina sintetasa: ATP + L-Histidina + p-Alanina
+
391
La fosforilaci6n (por proteina cinasas) y subsecuente desfosforilación (por proteina fosfatasas) de residuos serilo especificos desemperia importantes funciones rcguladoras. La fosforilaci~nalcanza carnbios rhpidos en la actividad de enzimas metabblicas clave lo cual produce un flujo de metabolitos reversible con rapidez y bajo control sensible, a través de las vias de biosíntesis y degradacihn como son las del metabolismo de Iípidos y carbohidratos. La serina interviene en la sintesis de la esfingosina. (capitulo 26} y en la sintesic de purinas y pirimidinas. El carbono beta es una fuente de los grupos metilo de la timina (y de la colina) y de los carbonos en las posiciones 2 y 8 del núcleo de las purinas (figura 36-21. Dado que la treonina no experimenta transaminacion. ni su alfa cetokido asi como tampoco la ~ 4 r e o n i n apueden ser utilizados por los mamíferos.
AMP + PPi + Carnosina
Algunos animales, pero no el ser humano, usan S-adenosilmetionina para metilar carnosina, una waccibn cctabolizada por la N-rnetiltransferasa: S-Adenosilmetionina + Camosina +
La carnosina se hidroliza a beta alanina y ~ A i s t i d i n a por medio de la cinc metaloenzima carnesinasa (carnosinhidrolasa). Un tractorno hereditario, la deficiencia de carnusinass se caracteriza por carnosinuria que persiste aun excluyendo la camosina de la dieta.
LA S-ADENOSILMETlON!NA ES LA FUENTE PRINCIPAL DE GRUPOS METILO PARA BIOS~NTESIS La S-adenosilmetionina es la fuente principal de gmpos metilo en el organismo. AdernLs participa en la biosíntesis de la porcibn 34iarninopropano de las poliaminas espermina y espermidina (figura 33-5).
EL SULFATO URlNARlO DERIVA DE LA CISTE~NA
La homocarnosina es un dipeptido
del sistema nervioso central Presente en el cerebro humano, en donde su concentración varia entre regiones, la homocarnasina (figura 33-2) se relaciona en su estructura y metabolismo con la carnosina, pero está presente en concentraciones 100 veces superiores a las de esta ultima. La síntesis de la homocamosina en el tejido cerebral se cataliza por carnosina sintetasa. Sin embargo, la camosinasa sérica no hidroliza la homocarnosina. La hornocarnosinosis, trastorno genktico muy infrecuente que se presume debido a deficiencia de la carnosinasa sérica, se acom pafia con paraplej ia esplistica progresiva y retraso mental.
EXISTEN RESIDUOS FOSFOSERlLO Y FOSFOTREONILO EN LAS PROTE~NAS Mucha de la serina en las fosfoproteinas está en forma de O-fosfoserina. La treonina tambidn se presenta en ciertas proteínas como O-fosfotreonina.
El sulfato urinario se origina casi enteramente de la . embargo, el azufre de oxidación de la ~ x i s t e i n a Sin la rnetionina, come homocisteína, se transfiere a la serina (figura 30-9) y de esta manera contribuye indirectamente al sulfato urinario; esto es, por la vía de la cisteína. La ~ x i s t e í n asirve como un precursor de la porcibn tioetanolaminica de la coenzima A y de la taurina que se conjuga con los ácidos biliares como el ácido taurocólico.
LA DESCARBOXILACI~NDE HlSTlDlNA FORMA HlSTAMlNA La histamina se deriva de la histidina por descarboxilación, una reacción catalizada en tejidos mamíferos por una c-aminohcido aromhtico descarboxilasa. Esta enzima catalita tambitn la descat.boxilación de la dopa, el 5-hidroxitriptbfano.. la fenilalanina, la nirosina y el tripthfano ( d a s e adelante}. La alfa metil aminoiicido, que inhibe la actividad de la descarboxilasa, tiene aplicaciones clínicas como antihiperten-
(Capitulo 33)
3 92 0 Bioquirnica de Harper
sor. Una enzima diferente, la histidina descarboxiBasa presente en la mayor parte de las células, tambidn cataliza la descarboxilación de la histidina. Los compuestos de histidina presentes en el cuerpo incluyen a la ergotioneína, carnosina y anserina dietktica (figura 33-2). Es probable que la l-metilhistidina en la orina humana normal se derive de la anserina. La 3-metilhistidina, identificada en la orina humana en cantidades aproximadas a 50 mgldL, es extraordinariamente baja en la orina de personas con la enfermedad de Wilson (capítlrlo 59).
LA ORNITINA Y POR TANTO LA ARGlNlNA FORMAN POLlAMlNAS La arginina sirve como un donador de forrnidina para la sintesis de creatina en los primate5 (figura 33-1 0) y para la síntesis de la estreptomicina por S~rep!omyct.s. Otros destinos incluyen la conversibn, vía ornitina, a putreccina, espermina y espermidina (figura 33-3) y en el rnusculo de los invertebrados a fosfato de aqinina, un fosfágeno cuya funcibn como reserva de fosfato de alta energia es análoga a la del fosfato de creatina en el musculo de los vertebrados. A d e m h de su fiinciiin en la biosintesis de la urea (capitulo 3 11, la ornitina (con metionina) sirve como precursor de las ubicuas poliaminas de mamiferos y bacterias: espermidina y espermina (figura 3 3 4 ) .
Glutarnato~ semlaldehido
/
Los humanos normales biosintetimn aproximadamente 0.5 mmoles de espemina al dia. Tanto la espennidina como la espermina están implicadas en diversos procesos fisiol6gicos que comparten como una fibra comlin, una retación íntima con la multiplicaci~ny crecimientos celulares. Son factores de crecimiento de las cdlulas cultivadas de mamiferos y bacterias y se considera que intervienen en la estabilización de células intactas, organelos subcelularec y membranas. Las dosis fartnacol6gicas de las poliaminas son hipotkrmicas e hipotensoras. Como un resultado de sus multiples cargas positivas, las poliaminas se unen con facilidad a los polianiones como el DNA y los RNA y pueden estimular la biosíntesis del DNA y del RNA, la estabilizacibn del DNA y el empaquetamiento del BN A en los bacteribfagos. Las poliaminas también ejercen efectos diversos sobre la síntesis protefnica y actúan como inhibidores de enzimas en [as que se incluyen a las proteinas cinasas. Ciertos experimentos sugieren que las poliaminas son esenciales en el metabolismo de los mamíferos. La adición de inhibidores (por ejemplo, alfa metilornitina o difluorornetilornitina) de ornitina descarboxilasa, que cataliza la reaccibn inicial en las sintesis de poliaminas, a cklulas de mamíferos cultivadas (figura 33-5) desencadena la sobreproducciiin de esa enzima. Esto sugiere una funcibn fisiolbgica esencial para esta enzima, cuya única accibn conocida es la biosíntesis de poliaminas.
1
~~frescina, esoermdina,
Figura 3 3 3 . Metabolismo de la arginina, ornitina y prolina Las reacciones con flechas continuas ocurren todas en los tejidos de mamífero. La sintesis de la putreccina y de la ecpemiina suceden en mamiferos y bacterias por igual El fosfato de arginina existe en los músculos de los invertebrados donde funciona coma un fosfágeno análogo al fosfato de creatina de los tejidos de marniferos.
Comersión de amrnoácidos en urochrctos esnecializudos
393
Espermidina
(putrescina)
. . Esperrnina
1,5-Qiaminopentano (cadaverina)
Figura 33-4, Estructuras de las poliaminas naturales. Obsérvese que la espermidina y la espermina son polimeros del diaminopropano (A) y del diaminobutano (E). El diarninopentano (mdaverina) también existe en los tejidos de marniferos.
Las poliarninac son importantes en el crecimiento de células y tejidos La figura 33-5 resume la biosíntesis de poliaminas en los tejidos de mamíferos. Nbtese que la porción putrescina de la espermidina y esperminaderiva de la L Q ~ nitina y la porcibn diaminopropano procede de la ~ a e t i o n i n por a la via de la formacion de S-adenosilmetionina. La omitindescarboxilasa y la S-denosilmetionindescarboxilasa son enzimas índucibles cuya vida media es corta. En cambio, las espennina y esparnidina sintasas no son índucibles ni tampoco extraordinariamente Iábiles. De las enzimas de la biosintesis de poliaminas en los mamiferos, dos (ornitindescarboxilasa y S-adenosilmetionindescarboxilaFa)son de interés respecto tanto a su regulacibn como a su potencial para laterapéutica química dirigida por enzimas. La vida media de la omitina descarboxilasa,aproximadamente 1 O minutos, es mas corta que la de cualquier otra enzima conocida de los mamiferos y su actividad responde con rapidez y en forma sorprendente a numerosos ectímulos. Incrementos de 10 a 200 veces en la actividad de la ornitindescarboxilasa siguen con rapidez a la administracibn de hormona del crecimiento a cultivos de cdlulas de mamíferos, tarnbikn de corticosteroides, testosterona o factor epidermico de crecimiento. Las poliaminas agregadas a los cultivos celulares inducen la síntesis de una proteína que inhibe la actividad de la ornitina descarboxilasa. La S-adenosilmetienindescarboxilasa una enzima poco común que contiene piruvato en lugar
fosfato de piridoxai como cofactor y tiene una vida media de 1 a 2 horas y responde a los promotores del crecimiento celular de una manera cualitativamente análoga a la de la ornitino descarboxilasa pero menos ripido o dramAticamente. La actividad de la S-adenosilmetionindescarboxilasa (figura 33-5) se inhibe por la S-adenosilmetionina descmboxilada y activa por la putrescina.
Los catabolitos de la poliamina se excretan en la orina La figura 33-6 resume el catabolismo de las poliminas en los tejidos de rnamiferos. La enzima poliami na oxidasa, presente en los peroxisomas hepáticos oxida a la espermina a espermidina y a continuación a la espemidina a putrescina. Ambas fracciones minoprophnicas son convertidas a beta aminopropionaldehido. Despues, la putrescina se oxida parcialmente a radical NH4' y COZpor mecanismos que todavia no se han lucidado. Sin embargo, las mayores porciones de putrescina y espermidina se excretan en la orina como conjugados, principalmente derivados acetílicos.
La hidroxilacidn del triptófano a 5-hidroxitript6fano, catalizado por la fenilalanina hidroxilasa hephtica y una subsiguiente descarboxilacibn forma 5-
394
Bioguimica de Harpw
(Capitulo 33)
Metionina + Mg-ATP
CQO -
O H OH S-Adenosilmet~nina
Espenidina S-Adenosilrnetionina descarboxilada
\
Figura 336. Compuestos intermedios y enzimas que participan en la biosintesis de espermidina y espermina. Los grupos metileno se abrevian para facilitar la vtsualizacibn del procese global
Conversión de aminohcidns en productos especiaifizados 3 95
dolaceturato el ~on~jugado de glicina del SAidroxiindolacetato y la N-acetilserotonina conjugada con el ácido glucurónico. Dado que la conversion incrementada de triptofano a serotonina reduce la síntesis de Acido nicotinico, los pacientes con carcinoide pueden mostrar síntomas de pelagra.
La serotonina produce melatonina
Espermidina
La melatonina deriva de la serotonina por N-acetilacion seguida de O-metilación en la gEandula pineal (figura 33-7). La directa metilacibn de serotonina y 54iidroxi-indolacetato (figura 33-7) tambien ocurre. La serotonina y la S-rnetoxitriptamina se metabolizan a los acidos correspondientes por la monoaminooxidasa. La melatonina circulante se capta por todos los tejidos, inclusive el cerebro, pero se metaboliza rApidarnente por hidroxilacion en la posición 6 seguida de conjugacion con sulfato y con Bcído glucur0nico.
Los metabolitos de tript~fanose excretan por orina y heces +&N-NH,S Putrescina
El triptófano se convierte a varios derivados adicionales del indol (figura 33-7). El riA6n y el hígado de marniferos, así corno las bacterias de las heces humanas, descarboxilan al triptófano y lo convierten en triptamina, la cual puede ser oxidada, entonces, hasta indol-3-acetztt0, Los catabolitos urinarios normales principales del triptofano son 541idroxiindolacetatoe indol-3-acetato.
Figura 3 3 4 . Catabolismo de las poliaminas. Las estructuras se abrevian para facilitar su presentactbn.
LAS MEtANlNAS SON POL~MEROS DE CATASOLITOS DE TlROSlNA
hidroxitriptamina (serotonina) (figura 33-7), un poderoso vasoconstrictor y estimulante de la contraccibn del músculo liso. El catabolismo de serotonina se inicia por desaminacibn oxidativa cataliada por monoaminooxidasa a 541idroxiindolacetato (figura 33-7), que el ser humano excreta en su orina (2 a 8 mgldia). La estimulación psíquica que sigue a la administracibn de iproniacida se atribuye a su capacidad para prolongar la acci6n de la serotonina por inhibición de la monoaminooxidasa.
La figura 33-8 resume los intermedios conocidos en la biosíntesis de eumelanina y feomelanina en los melanosomas relacionados con la membrana de las dlulas pigmentadas (melanocitos). La reacción inicial se cataliza por la tirosina hidroxilasa una enzima dependiente de cobre. La formación del polimero eume Ianina se piensa que es mediante atrapamiento de radicales libres y despuks sometidos a una degradacibn parcial mediante H102 generado durante los procesos autooxidativos. Las feamelaninas y eumelaninas entonces forman complejos con las proteinas de la matriz melanosórnica, generando melanoproteinas.
La producción de serotonina aumenta en el carcinoide maligno
En el carcinoide (argentafinoma) la serotonina productora de cblulas tumorales en el tejido argentafin de la cavidad abdominal sobreproduce serotonina. Otros metabolitos de la serotonina identificados en la orina de pacientes con carcinoide incluyen el S-hidroxiin-
El albinismo se relaciona con la biocíntesic defectuosa de melanina El tkrmino albinismo abarca a un conjunto de sindromes clínicos caracterizados por hipomelanosic que surgen de defectos hereditarios en las cklulas pigmentarias [melanocitos) del ojo y de la piel. Mientras que
396 * Bioquímica de Harper
(Capítulo 33)
5-Hidrexitnptamina (serotonina) Acetil-COA
H,,C CoAiSH
5-Hidroxiindol-3-
Excretado como conjugados
H 5-Metoxttriptamina
acetato
IMAQJ
5-Metroxiindol-9
SMetawiindol-3acetato I
acetato
I
Excretado como
conjugados
Melatonina (N-acetil-5-metoxisemtonina)
EKcreisdo como conjugados
Figura 33-7. Biosintecisy metabolismo de la melatonina. ([NH~', por transaminaci6n; MAO, monoaminooxidasa.)
todas las 10 formas de aibinismo oculocut8neo puede diferenciarse con base en sus caracteristicas clinicas, bioqulmicas, ultraestruaurales y gen&icas en todas aparece un decremento en la pigmentacibn de piel y ojos. Varias de &as se describen a continuaci6n. Los albinos negativos a la tirosina hidroxilasa carecen completamente de pigmentacibn visual. Los follculos pilosos de estos pacientes no convierten en
pigmento la tirosina agregada y sus melanocitos contienen melanosomas sin pigmento. Los albinos positivos a la tirosina hidroxilasa tienen algún pigmento visible y el color del cabello oscila de blanco amarillento a ligeramente tostado. Los melanocitos de los folículos pilosos pueden contener melanosomas ligeramente pigmentados, que convierten a la tirosina en eumelanina negra rn vitro.
Comer,ribn de amrnoacido.~en productos especializados * 3 97
HO
HO
Dopa ( 3 ,(3.4-dihidmxifenilalanina)
-r reducido
Dopaquinona
Oopas
I I
glutattbn
I I
\ HO
Leucodopacmrno
I
I I
I
0-
I
/ / /
Oopacromo
0-
+H,N
H
--. Melanocromo 0-
0-
+H,M
5-S-Cisteinlldopaqulnona
O-
Indol-5,Bquinona
Quinoleimtna intermedio
0-
+H,N O
Bentotiacina intermedio
5 Figura334. Intermedioswnocidos y reaccionesde la biosintesis de eumelaninasy feomelaninas Los polimerosde melanina contienen eurnelaninas y feomelaninas en proporciones variables. Las flechas punteadas indican cuales intermedios contribuyen a la síntesis de eurnelaninas en diversas proporciones, Los números en clrculos indican probables reacciones reguladas de la via biosint8tica. La reaccibn catalitada por la tirosina, es defectuosa en el albinismo oculocutáneo negativo a la tirosinasa.
O,
3 98
(Capitulo 33)
Bioquimica de Hurpw
El alhinismo ocular ocurre como rasgo autos~mico recesivo y como rasgo ligado al cromosoma X. Los melanocitos de los albinos oculares heterocigotos enlazados al cmrnosoma X (pero no los autosómicos recesivos) tienen macrornelanosornas. Las retinas de las mujeres heterocigotas para el albinisrno ocular ligado al cromosoma X (variedad Nettleship) exhiben un patrón de mosaico en la distribución del pigmento debido a la inactivación al azar del cromosoma X. Se desconocen los defectos metabólicos precisos que conducen a la hipomelanosis en el albinismo ocular.
Y"'
" O O C H , ,C+kC,OII
La tirosina forma adrenalina y noradrenalina
Las células de origen neural convierten la tirosina a adrenalina y noradrenalina (figura 33-9). Aunque la dopa es un intermedio en la formación de melanina (figura 33-8) y de noradrenalina (figura 33-91, enzima5 diferentes hidroxilw la tirosina en los melanocitos y otros tipos celulares. L.a dopa descarboxilasa, una enzima dependiente del fosfato de piridoxal, forma dopamina. La última está sujeta a hidroxilacion ulterior por la dopamina beta oxidasa, una enzima que depende del cobre, la cual utiliza vitamina C para generar noradrenalina. En la médula s u ~ r m n a l .la enzima feni tetenolamina ~'metiltransfeLasautiliza S-adenosilmetionina para metilar a la amina primaria de la noradrenal ina y formar adrenalina (figura 33-9). La tirosina también es un precursor de las hormonas tiroideas tri yodotironina y tiroxina (capitulo 46).
BETA-OXIDASA
Vitamina C
LA CREATlNlFPA EXCRETADA ES UNA FUNCION DE LA MASA MUSCULAR La creatina y su forma de reserva energética, fosfocreatina, existen en MÚSCUIO, encdfalo y sangre. La creatinina el anhidrido de la creatina, se forma en gran parte en el músculo por deshidratacibn irreversible no enzimhtica de la fosfocreatina y perdida de fosfato (figura 33-10). La excrecibn de 24 horas de la creatinina en la orina de una persona es notablemente constante de un día a otro y es proporcional a la masa muscular. Tambikn es normal que se encuentren pequeflac cantidades de creatina en orina. La glicina, arginina y metionina participan en la bioslntesis de creatina. En el rihon ocurre transferencia de un grupo guanidina de la arginina a glicina, con fomaci6n de guanidoacetato (glucociamina), no asi en higado o músculo cardiaco. La síntesis de la creatina se completa por metilacirin del guanidoacetato por la S-adenosilmetionina en el higado (figura 33-10).
Figura 33-9. Conversibn de tirosina a adrenalina y noradrenalina en las células neuronales y suprarrenales. (PLP, fosfato de piridoxal.)
Corrvwsión de amirroácidos en productos t.specializah
399
(Rirldn)
NH,
/'
+
HN - CH,-
+HsN- CH, - COOI
coo-
Omitina
COO-
Glucociamina (guanidoacetato)
Giicina
(Hígado) S-Adenosilmetionina
METII-TMNCFERASA S-Adenosilhommisteina
NH -3
EN EL MUSCULO
f + P, H,O
ADP
1
N - CH,
HN=C\I CH3
- COO-
Focioaeatina
Creatinina
Figura 33-10. Bioslntesis de creatina y creatinina.
FORMACIÓNY CATABOLISMO DEL GAMMA AMINOBUTIRATO En tanto que ambas acontecen en el riñon y en las células de tos islotes pancrehticos, el hcido gamma aminobutirico (GABA} se encuentra sobre todo en el tejido cerebral en donde funciona como neurotransmisor inhibitorio mediante cambios en las diferencias de potencial transmembrana.
puede sufrir reduccíbn a gamma hidroxibutirato, reacción catalizada por t-iactato deshidrogenasa, u oxidaci6n a succinato y de ah3 a C02 y HIO por la via del intermediario del ciclo del hcido cltrico. Un trastorno muy poco frecuente del metabolismo del GABA implica una GABA transaminasa defectuosa, ésta es una enzima que participa en el catabolismo del GABA despuks de su liberación posinaptica en el tejido cerebral.
Biosíntecis El garnma aminobutirato (GABA) se forma por descarboxilacibn del ~%lutarnato,una reacción catalizada por la enzima dependiente del fosfato de piridoxal, Gglutarnato descarboxilasa (figura 33-1 1). Esta descarboxilasa está presente en los tejidos del sistema nervioso central, principalmente en la materia gris. Dos secuencias de reacciones convierten tambikn putrescina (figura 3 3 4 ) a gamma aminobutirato. En una hay decaminaci6n por la diamina oxidasa; la otra utiliza intemed ios N-acetilados, La importancia relativa de estas tres rutas de biosintesis del gamma aminobutirato varia entre los tejidos y con la etapa de desa~ollo.
Catabolismo La transaminacion del garnma aminobutirato catalizada por la gamma aminobutirato transaminasa f u m a succinato semialdehido (figura 33-1 1). Este
RESUMEN Además de cubrir funciones estructurales y funcionales especlftcas en proteínas y polip&ptidos,los arninoacidos participan en una amplia variedad de procesos biosintéticos descritos en todo el libro. Por ejemplo, la glicjna participa en la biosíntesis del hem, purinas y creatina y forma conjugados con Bcidos biliares y con los metabolitos urinarios de numerosos medicamentos. AdemAs de su función en la biosíntesis de fosfotipido y esfingosina, la serina proporciona los carbonos 2 y 8 de purinas y el grupo metilo de timina. El derivado de metionina, S-adenosilmetionina, que es donador de grupos metilo para numerosos procesos biosint&ticos,participa tambih de manera directa en la biosíntesis de espermina y espemidina. El glutarnato y ornitina forman al neurotransmisor gamma arninobutirato (GABA). La tioetanoiamina de la coenzima A y la taurina del ácido taurocólico y de
$00 * Bioquimica de Harper
(Capitulo 33) 700 -
H
-7- NH3+
L-Glutamato
CH,OH
CH, I
COO -
-H,N-CH,-CH,-CH,-
COO -
CI = O CH?
y-Hidroxibutirato
I
y-Aminobutirato
FHz
coo ,DH+Ha
CH7 I
NAD+
COO Su~cinatosernialdehido
NAQH+Ht
coo SUCCI~~~O
Figura 33-1 1. Metabolismo de gamma aminobutirato (a-KA,a-cetoAcidos; a-M,u-amino8cidos; PLP, fasfato de piridoxal.)
otros hcidos biliares conjugados con taurina proceden de la cistelna. La descarboxilacibn de histidina forma histarnina. La arginina sirve como donador de formamidinapara la biosintesis de creatina y, a travts de omitina, participa en la biosintesis de poliaminas. Los
.
metabolitos importantes de triptofano incluyen a serotonina y melanina. A su vez, el potente vasocons~ctor serotonina, sirve como precursor de melatonina. La tirosina forma adrenalina y noradrenalina y su yodatación crea la hormona tiroidea.
REFERENCIAS CR et al. (editora): The Metabolic Basis of Jnherired Diseme, 6th ed. McGraw-Hill, 1995.
Scriver
Tabor CW, Tabor H: PoIyamines. Annu Rev Biochem 1984;53:749.
PoñFirinas y picamenitos biliares W
Robert K. Muxray, MD, PhD
INPRODUCCION ,
En este capítulo se estudia la bioquimica de ]as porfirinas y de los pigmentos biliares. Estos temas se relacionan estrechamente, debido a que el hem es sintetizado a partir de porfirines así como de hierro y los productos de su degradación son los pigmentos biliares y el hierro.
tipica de las porfirinas es la de formar compl~joscon iones methlicos unidos a los átomos de nitrógeno de ]OS anillos pirrÓlic0~.Ejemplos Son la5 ferroporfiritales como el de la hemoglobina Y la ~orfirina que contiene magnesio, la clorofila, pigmento fotosintitic0 de 10s vegetales. Las proteínas que contienen hem (hemoproteínas) tienen una distribución amplia en la naturaleza. Los ejemplos de importancia en seres humanos y animales se muestran en el cuadro 34-1.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA El conocimiento de la bioquímica de las porfirinas y el hem es basico para la comprensi6n de las diversas funciones de las hemoproteinas (vease después) en el cuerpo. Las porfirias son un grupo de enfermedades causadas por anormalidades en la ruta biosintbtica de varias porfirinas. Son poco comunes, pero los médicos deben reconocerlas, en particular los dermatólogos, hepatólogos y psiquiatras, quienes encontrarán personas con estos trastornos, Una manifestacidn clínica mis común es la ictericia, ocasionada por laelevación de la bilirrubina en el plasma, debida a una producción excesiva de este pigmento o a una deficiencia en su excreci6n; se observa en numerosas enfermedades,que van desde la hepatitis vira1 hasta el cáncer del princreas.
HC-CH
II
HC,
II
C ,H
N
6
HC-
II
N
1
C+
,
l
c=c
LAS METALOPORFlRlNAS Y LAS HEMOPROTE~NAS SON IMPORTANTES EN LA NATURALEZA
wfirinas cic1ico5 por la unión de cuatro anillos pirrÓli~05enlaZ3do~ por puentes metenilo (-HC=; figura 34-1). Una propiedad
a
..,C=CH l
.
'-
H
H
8
5
Porfina (CzaHi4N4)
Figura 34-1. La molPcula de porfina Los anillos se designan can 1, II, Ill y IV. Las posiciones en donde pueden efectuarse sustituciones en los anillos estan numeradas 1,2, 3, 4,5,6, 7 y 8.LOS puentes metenilo (-HC =) se designan como u. p, u y s.
Cuadro 34-1. Ejemplos de aIgiinas hemoproteínas e y los an imales* importantes e n .-.--. -.. -
....... ..-.. I Proteina
Hemoglobina lb
Citocromo c
: '
1
'
C
C Triptniano pimiasa "
-
-
ransportc de oxlgeno en i a sangre A l ~ n a c e ni :j e dc o x , el rniisculo
, '1
Pnrtlc~pacionen ia caaena iransportadora de electro#mes Ilrdroxilaci On de xencibióticos D e g r a d a c i o r i del p it (
* Las funciones
h i d r b ~ e On . , - ,a aci rripiorü res se dej~ril
-
:os
capitulo~dcl ttxto.
Las porfirinas naturales tienen sustituyentes en las cadenas laterales del niclea de poríina
EL HEM SE SINTETIZA A PARTIR BE SUCCINIL-COA Y GLlClNA El hern se sinteti~aenlas cHuIas vivas por una vía que se ha estudiado en profiindidad. Los dos materiaIes iniciales son succinil-CoA que proviene del ciclo del
Las porfirinas que existen en la naturaleza son compuestos en los que los ocho átomos numerados de hidrágeno, han sido sustituidos por diversas cadenas taterales en el núcleo de la porfina que se muestra en la figura 34-1. Como un medio scncillo para mostrar estas sustituciones, Ficcher propuso una fiinnula corta para representar la molkcula de porfirina.en la cual se omiten los puentes metenil y en la que cada anillo pirrólico se presenta como una abrazadera rectangular con la posicibn de los ocho sustituyentes enumerados como se muesrra en la figura 34-2. En las figuras 34-2 a 34-4 se representan varias pofirinas. La disposición de los sustituyentes acetato (A) y propionato (P) en la uroporfirina que se muestra en la figura 34-2 es asimetrica (en el anillo [ V . el orden esperado de los sustituyentes acetico y propihnico, se encuentra invertido). Una porfirina con este tipo de sustitucibn asimétrica se clasifica como porfirina tipo 111. Una porfirina tipo 1 es aquella con un arreglo completamente sirnktrico de los grupos sustituyentes. En la naturaleza s610 existen las porfirinas tipos 1 y 111, y de estas la serie de tipo 111 es, con mucho. la más
Figura 34-2. Uropofirina III. A (acetato) = -CHzCOOH; (propionato) = -CH2CH2COOH.
abundante (figura 34-3) e importante, debido a que incluye al hem. El hem y su precursor inmediato, la protoporfirina IX (figura 344), son porfirinas de tipo 111 {es decir, los grupos metíiicos están asim4tricarnente distribuidos como en la coproparfirina de tipo 111). Sin embargo, en ocasiones se identifican como pertenecientes a la serie IX, debido a que fueron designados novenos en una serie de ishmeros postulada por Hans Fischer, el primer investigador en el campo de la química de las porfirinas.
P
Cicido cítrico en las mitocondrias y el aminoácido glicina. El fosfato de piridoxal es tarnbidn necesario en esta reacción para "activar" a la glicina. El producto de la reaccihn de condensacion entre la succinil4oA y la glicina es el ácido alfa-amino-beta-cetoadlpico, que al ser rápidamente descarboxilado se convierie en el delta-aminolevulinato (ALA; figura 34-5). Este paso cs catalizado por la enzima ALA sintasa. Esta parece ser la enzima que controla la velocidad en la biosintesis de pofirinas en el hígado de los mamíferos. La síntesis de ALA tiene lugar en las mitocondrias. En el citosol, dos moléculas de ALA son condensadas por medio de la enzima ALA deshidratasa para formar dos moleculas de agua y una de porfobilinógeno (PRG,del inglts, porphohilinogen; figura 34-53, La ALA dcshidratasa es una enzima que contiene cinc y es sensible a la inhibición por plomo, como se presenta en la intoxicación por el metal. La formaciiin de un tetrapirrol, es decir, una porfirjna, se presenta por condensacibn de cuatro mol~culasde PBG (figura 3461, las cuales se unen cabeza con cota para formar un tetrapirro1 lineal, hidroximetilbilano. La reacción es catalizada por la uroporfirinógeno 1 sintasa, conocida también como PRG desaminasa. El hidroximetilbilano adquiere estructura cíclica de manera espontinea para formar uroporfirinógeno 1 (izquierda en figura 3 4 4 ) o se convierte en uroporfirinhgeno 111 por accihn combinada de la uroporfirinogeno 1 sintasa y la uroporfirinbgeno 111 cosintasa (derecha, figura 3 4 4 ) . Hajo condiciones normales, el uroporfirinbgeno formado es casi exclusivamente el icómero 111, pero en algunas de las porfirias (descritas despu&), tambidn se forma un exceso del tipo de isomero 1 de porfirin6genos. Nbtese que ambos uroporfirinógenos tienen los anillos pirrólicos conectados por puentes metileno
Las uroporfirinas se encontraron pnrnero en la orina. pero no esián Iimitadas a la misma
P
A
P
Uroporfirina I
P
Flgura 34-3. UroporFirinas y coproporfirinas. A (acetato),
-), los cuales no forman un sistema de anillo conjugado. Por tanto, estos compuestos (como 10 son todos los porfirinbgenos) son incoloros. No obstante, los porfirinbgenos se autooxidan con facilidad a sus porfirinas con color respectivas. Estas oxidaciones son catalizadas por la luz y por las porfirinas formadas. El uroporfirinbgeno IIJ es convertido en coproporfirinógeno 111mediante la descarboxilaci6n de todos los grupos acetato (A), que los cambia a sustituyentes mettlo (M). La reacción es catali7ada por la uroporfirinbgeno descarboxilasa que también es capaz de convertir al uroporfirinógeno I en coproporfirin6geno 1 (figura 34-7). El copraporfirinbgeno 111 penetra entonces a las mitocondrias donde se convierte en protoporfrrin6geno 111 y luego en protoporfirina 111. Parece que hay varios pasos en esta conversibn. La enzima mitocondrial coproporfirin6geno oxidasa cataliza la descarboxilacibn y la oxidacibn de dos cadenas propidnicas laterales para formar protoporfirinógeno. Esta enzima es capaz de actuar solamente sobre el coproporfirinógeno del tipo 111, lo cual ( 4 H 2
Protoporlinna E1 l (IX) (porlima precursora del hem)
A
Uroporfirina i i
Las coproporfirinaa se aislaron primero de las heces, pero también se encuentran en la orina
P (propionato); M (rnetil)= 4 H 3 ; V (vinilo) = -CH = CH2.
explicaria porque no ha sido identificada una protoporfirina del tipo 1 en los materiales naturales. La oxidación del protoporfirinógeno a protoporfirina es catali~adaporotra enzima mitocondrial, la protoporfirintigeno oxidasa. La reacci6n de conversidn del coproporfirinógeno en protoporfirina en el higado de las marniferos requiere de oxígeno molecular.
La formación del hern comprende incoporacion de hierro a la protoporfirina El paso final en la síntesis del hem comprende la incorporación de hierro ferroso a la protoporfirina mediante una reacción catalizada por la hem sintasa o ferroquelatasa, otra enzima mitocondrial (figura 344). En la figura 34-8 se resumen los pasos en la biosintesis de los derivados porfirinicos a partir del PBG. La biosintesis del hern tiene lugar en la mayoría de los tejidos de mamíferos con la excepctbn de los eritrocitos maduros, que no contienen mitocondrias.
Hem (grupo prostéiim de la hemoglobina)
Figura 34-4. Adicidn de hierro a la protopofirina para formar el hem
404
*
Bioquímicade Hurper
(Capitulo 34)
COOH I
COOH
a-AminwP-aetoadipato
8-Aminolevulinato (AMI
I
(succinato "activo"}
piridoxal
COOH COOH I CH,
1
CHI I
COOH
j H 2 0
COOH I
yW1
CH~ZH.
CH2
II
CH CH,
Dos moléculas de S-aminolevutinato
N
Porlobilinógeno (primer precursor pirrblica)
Figura 34-5. Biosíntesisdel porfobilinbgeno Se encuentra la ALA sintasa en las rnrtocondnasmientras que la ALA deshidratasa se halla presente en el utosol.
Los porfirinógenos que se han descrito son incoloros, contienen seis átomos de hidrógeno más que las correspondientes porfirinas coloreadas. En la actualidad es claro que estas porfirinas reducidas (los porfirinbgenos) y no las porfirinas correspondientes, son los verdaderos intermediarios en la biosintesis de la protoportirina y del hem.
La ALA sintasa es la enzima reguladora clave en la biosintesis del hem La reaccihn limitante de la velocidad en Ea síntesis de hem es la catalizada por ALA sintasa (figura 34-5), la cual es una enzima reguladora. El hem, que actua al parecer a través de una molecula aporrepresora, funciona como un regulador negativo de la acumutacion de ALA sintasa. Este mecanismo de represi6n y desrepresibn se muestra esquematicamente en la figura 34-9. Es posible que haya una inhibici~nsignificativa por retroalimentación en esta etapa, pero el efecto regulador mayor del hem parece ser aquel en el cual la velocidad de acumulacián de la ALA sintasa aumenta grandemente en ausencia del hem y es disminuida en su presencia. El índice de recambio de la ALA sintasa por lo común es rápido (su vida media es aproximadamente de una hora) en el hígado de los mamíferos, propiedad que no sorprende para una enzima que cataliza una reacción limitante de la velocidad.
Muchos fámacos (capitulo 61), al ser administrados al ser humano, pueden aumentar de moda notorio la ALA sintasa hepiitica. La mayoria de estos compuestos son metabolizados por un sistema en el hígado que utiliza una hemoproteina especifica, el citocromo P450. Durantesu metabolismo, aumenta el consumo del hem por el citocromo P450, lo cual a su vez disminuye la concentración del hem intracelular. En consecuencia, se efectka una desrepresibn de la ALA sintasa con un aumento correspondiente de la velocidad de sintesis del hem para cubrir las necesidades de las células. Diversos factores afectan la desrepresión mediada por fámacos de la ALA sintasa en el hígado. En particular la administracion de glucosa puede evitarla, al igual que la administración de hematina (forma oxidada del hem). La importancia de estos mecanismos reguladores ser6 descrita posteriormente junto con las porfirinas.
LAS PORFlRlNAS TIENEN COLOR
Y PRESENTAN FLUORESCENCIA Los diversos porfirinégenos son compuestos incolo-
ros mientras que las distintas porfirinas son todas coloreadas. De gran valor en el estudio de las porfirinas o de derivados es el tipico espectro de absorción
HOOC
C00i.i +H.
A[
CH,
1.
tratamiento de ciertos tipos de chncer, un procedimiento llamado fototerapia del cáncer. A menudo, los tumores captan más porfirinas que los tejidos normales. Por tanto, la hematoporfirina u otros compuestos relacionados 5e administran a un paciente con un tumor determinada. Luego, el tumor se expone a un rayo láser de argón, que excita a las porfirinas, causando efectos citotóxicos.
1
La espectrofotometría se usa para analizar las porfirinas y sus precursores
1
1
C -
C
1
H, C-C
1
H
1
1
1
1
C
H, C-
C-C
C H
Uroporfirinbgeno tipo I
Las coproporfirinas y las uroporfirinas tienen interés clínico en virtud de que en las porfirias se excretan en cantidades aumentadas. Cuando estos compuestos se presentan en orina o en heces, pueden separarse uno de otro mediante la extraccion con mezclas apropiadas de solventes. Luego se identifican por metodos espectrofotornétricos. La ALA y PRG urinarios pueden medirse tambitn con métodos coIorímCtricos apropiados.
H
C-
C
P,
1
1
1
P
H, CP
A
C
Uroporfirinbgeno tipo fll
Figura 344. Converción del porfobilinbgeno a uropomrinbgenos. La uroporfirrnbgena sintase I se llama tarnbibn porfobilinogeno desaminasa.
que exhiben, tanto en la region visible del espectro como en la región ultravioleta. En la figura 34-10 se muestra un ejemplo de una curva de absorción de la porfirina disuelta en Bcido clorhídrico a 5 por ciento. Nbtese en particular el pico de la banda de absorcilin cerca de los 400 nm. Esto es un rasgo distintivo del anillo porfinico y es tipico de todas las porfirinas sin importar las cadenas laterales que existan. Esta banda se ha llamado la banda de Soret en honor de su descubridor. Cuando las porfirinas disueltas en acidos minerales fuertes o en solventes orghicos son iluminadas con luz ultravioleta, emiten una intensa fluorescencia roja. Esta fluorescencia es tan típica que frecuentemente se emplea para idenzificar pequeñas cantidades de porfirina libre. Las dobles ligaduras que unen los anillos pirrblicos en las porfirinac causan la absorcihn y fluorescencia tipicas de estos compuestos; estas dobles ligaduras no existen en los porfirin6genos. Una aplicación interesante de las propiedades fotodinarnicas de las porfirinas es su posible uso en el
LAS PORFIRIAS SON TRASTORNOS GENÉTICOS DEL METABOLISMO DEL HEM Las porfirias son un grupo de errores congenitos del metabolismo debido a mutaciones en los genes que dirigen la síntesis de enzimas que intervienen en la biosíntesis del hem. No son frecuentes, pero es imporrante considerarlas en ciertas circunstancias ipor ejemplo, en el diagndstico diferencial de dolor abdominal y de diversos hallazgos neuropsiquiátricos); de otro modo, los pacientes se someterAn a tratamientos inadecuados. Se ha especulado que el rey Jorge 111 de Inglaterra padecia porfiria variegada, lo que explica sus confinamientos periódicos en el Castillo de Windsor y quizh algunos de sus puntos de vista respecto a sus colonias americanas. Adembs, la fotosensibilidad (que favorece las actividades nocturnas) y la grave deformación mostrada por algunas víctimas de porfiria eritropoyktica congénita ha conducido a la idea de que estas personas pueden haber sido prototipos de los "hombres lobo".
La bioquímica sustenta las causas, diagnósticos y tratamientos de las porfirias Se han descrito seis tipos de posfiria, que se deben a depresiones en la actividad de cada una de las enzimas 3 a 8 mostradas en la figura 34-9 (cuadro 34-1). De modo que es importante el anhlisis de las acciones de una o mas de estas enzimas en un material apro-
UroporfirintgenoIII
Coproporfirtnógeno III
Figura 34-7. Descarboxilaudn de uroporfirinbgenosa coproporfirinbgenos en el citosol. (A, acetil; M, rnetil, P, propionil )
Portofilindgeno
Hidmximetilbilano
111
Luz
4.0.
Coproporfitina 111
geno HI
geno l
I
I
-'1 Capropom-
Luz
rinbena iii
Protoprlirina III
+
HEM
Figura 34-8. Pasos en la biosintesic de los derivados de porfirina a partir del porfobilinbgeno.
Porfirinm y pigmentos biliar-es
407
Hemoproteinas
Proteinas
4 Hem
----------
Aporrepresor
Protoporfirina III
Copmporfirinbgeno III
Hidroximetilbilano
Figura 34-9. Intermediarios, enzirnas y regulación de la sintesis det hern. Los números de las enzimas son los mencionados en el wadro 34-1. Las enzimas 1, 6, 7 y 8 se localizan en las mitocondrias, las dernds en el citocol Las mutaciones de las entimas 2 a 8 causan porfirias, aunque 5610 se ha informado sobre pocos casos por deficiencia de la enzima 2. La regulacidn de la síntesis del hem, se produce a nivel de ALA cintasa, por un mecanismo de represibn-desrepresibn, mediado por el hem y su aparrepresor hipotético. Las líneas punteadas indican la regulacibn negativa por la represibn.
(0)
piado (por ejemplo, los eritrocitos) para hacer un diagndstico definitivo cuando se sospeche porfiria. No se tiene información de personas con deficiencia o actividad escasa de la enzima 1 (ALA sintasa). Se sabe de personas que muestran depresión de la actividad de la enzima 2 (ALA deshidratasa) pero son muy pocas.
En general, las porfirias se describen como hereditarias de una manera autosórnica dominante, con excepcibn de la porfiria eritropoyética congénita, que se hereda de modo recesivo. Las anormalidades precisas en la biosintesis del hem se estan determinando por recnologia del DNA recombinante.
ALA
Succinil-COA+ Glicina
Como en el caso de numerosos errores congknitos, los signos y síntomas clínicos en personas con porfiria se deben a defíciencia de productos metabblicos adelante del bloqueo enzimático o a acumulación de rnerabolitos atris del bloqueo. Donde ta lesión enzimhtica ocurre en la via antes de la formacibrr de porfirinbgenos (por ejemplo, la enzima 3 de figura 34-9, en la porfiria aguda intermitente), ALA y PBG se acumularán en líquidos y tejidos corporales (figura 34-1 1). Uno o los dos compuestos pueden tener efectos tóxicos en los nervios abdominales y en el sistema nervioso central, lo cual produce el dolor abdominal y síntomas neuro-
Mutaciones en el DNA
Anormalidades de enzimas de la sintesis del hern
Acumulauon de ALA y PBG y10 dismlnucibn en el hem en celulas y liquidos
1 Longitud de onda (nm)
Flgura 34-10. Espectro de abcorcibn de la hematoporfirina (solución a 0.01% en el HCI a 5 por ciento).
psiquiátricos que se observan en este tipo de porfiria. Es posible que las bases bioquimicas para los síntomas sean que ALA puede inhibir a una ATPasa en el tejido nervioso e que ALA puede ser captada por el cerebro y de algún modo causar una parálisis de la conduccibn. Por otra parte, un bloqueo enzimhtico tardío en la via causa acumulacibn del porfirinbgeno indicado en las figuras 34-9 y 34-1 1. Sus productos oxidativos, los derivados porfirinicos correspondientes, causan fotosensibilidad, una reaccibn a la luz visible de alrededor de 400 nm. Las porfirinas, cuando se exponen a la luz a esa longitud de onda, al parecer se "excitan" y reaccionan con el oxígeno rnolecular para formar radicales de oxígeno. Estas ultimas especies lesionan a los lisosomas y otros organelos. Los lisosomas dailados liberan sus enzimas degradativas, causando grados variables de lesiones cutheas, incluyendo cicatrices. Las prfirias pueden clasificarse con base en el 6rgano o células mlis afectados. En general, &tos son órganos o células donde la síntesis de! hem es particularmente activa. La médula ósea sintetiza una cantidad considerable de hemoglobina al día y el higado muestra gran actividad en la síntesis de otra hemoproteína, el citocromo P450.Asi, una clasificación de las porfirias consiste en designarlas como eritropoyCticas, hepáticas y eritrohephticas (mixta); los tipos de porfirias agrupados en estas clases se indican en el cuadro 34-1. ¿Por quC tipos especlficos de porfiria afectan a ciertos órganos de manera más notable que a otros? Una respuesta parcial es que la concentraci~nde rnetabolitos nocivos (por ejemplo, ALA, PBG o porfirinas especificas) puede variar de manera importante en diferentes brganos y células, dependiendo de las actividades diferentes de sus enzimas formadoras de hem. Como se describib, ALA sintasa es la enzima reguladora clave de la vía de la biosintesis del hem. Aunque esta enzima no está implicada como causa de porfiria, es importante estudiar su regulación para
Acumulación de
corporales I Signos y sintomas neuropsiquiatnw~
Oxidacibn espontAnea de porfinnbgenos a porfinnas
Fotosensibilidad
Figura 34-1 l.Causas bioquimicas de los principales sLgnos y sintomas de las porfirias.
comprender algunas cmctcrlsrims de estas enfemedades. La ALA sintasa esta sujeta a inducción y represibn y su actividad puede aumentar de manera notable (hasta 50 veces) en ciertas condiciones. Gran número de fhrmacos inducen a la enzima (por ejemplo, barbitúricos y la griseofulvina). La rnayoria de ellos, lo hacen por activacibn del citocromo P450 (capitulo 61) que agota al hern y por tanto desreprime (induce) a ALA sintasa. En pacientes con porfiria, el aumento en la actividad de ALA sintasa conduce a un incremento de precursores hdmicos con potencial nocivo antes del bloqueo metabiilico. Por consiguiente, la ingestión de fármacos que inducen al citocromo P45O (inductores microsomicos) puede precipitar ataques de porfiria. En general, el diagnbstico de un tipo especifico de porfiria se establece por consideracibn de la historia clínica y familiar, del examen fisico y de pruebas de laboratorio apropiadas. Los datos principales en los seis tipos de porfiria se enumeran en el cuadro 34-2. Concentraciones elevadas de plomo pueden afectar al metabolismo del hem, ya que se combina con grupos SH de enzimas como ferroquelatasa y ALA deshidratasa. Esto afecta al metabolismo de la porfirina; de modo que se encuentran concentraciones altas de protoporfirina en los eritrocitos y valores elevados de ALA y coproporfirina en la orina. Se tiene la esperanza de que el tratamiento apropiado de las porfirias a nivel gknico se vuelva posible. Entre tanto, el tratamiento se aplica en esencia a los síntomas. En general, los pacientes deben evitar cualquier anestésico o fármaco, incluyendo alcohol,
iria
En:zima afect
esultados i de labor
Sintomas princi
ite aguda .
4. Uroporfinnbgeno 111 cosintasa
.
Dolor albdominal Neurop!jiquiátricor bin lotosensibilida d
Eritropoyctica carigtnrta (eritropoyética)
Fotosensihilidnd
rdia
5 -
roporfirina urinaria + Uroporfirina urinaria + PBG urinario
1 Utciporfirina urinaria + S urinario
5. Coprapi
no oxidasa
- -rrotoporrir inogcno oxidasa ..
'1.
!
Coproporfiria hereditaria (hephti ca)
Fotosensil Dolor abdomina1 Neuropdquiairico?
,
Porfiria variegada (hepiitica)
Fotosensibilidiid Dolor abdominal Neurop!
Fotosen
5 urinario , , ,r& U r c%P.V l lFl l; l~l~U . woporfirina fecal + 1
CLALI16LIIu
G urinario + iporfirina urinaria + toporfirina fecal +
,l -
Protoporfírina fecal + ,>m ...to~
*
.
Sblo se indican datos biioquimicos en las etapas iictivas de es'ttis enfermeclades. En las etapastar dias de algiino! se detectan otras anornial idades biciquirnicas. El número de las enzinlas en este c uadro corre?:ponde al us: ura 34-9. PBG, porfobilin6geno
que cause induccion del citocromo P450.La ingestibn de alimentos ricos en carbohidraros (una carga de glucosa) o la administracion de hematina (un hidróxido de hem) pueden reprimir a ALA sintasa, reduciendo la producción de precursores hérnicos nocivos. Las personas que padecen fotosensibilidad pueden beneficiarse por la adrninistraciOn de beta caroteno; at parecer este compuesto reduce la produccion de radicales libres, disminuyendo así la fotosensibilidad. Las cremas bronceadoras que filtran la luz visible tambidn son útiles para estas personas.
EL CATABOLISMO DEL H E M ~ PRODUCE BlLlRRUBlNA En condiciones funcionales, en el adulto humano se destruyen de 1 a 2 x 1 O8entrocitos cada hora. Por tanto, en un dia, un sujeto de 70 kg de peso recambia aproximadamente 6 g de hemoglobina. Cuando se destruye la hemoglobina en el cuerpo, laglobina se degrada hasta sus nminohcidos constituyentes, mismos que se reutilizan, y el hierro hémico se incorpora a la reserva de dicho metal, tambikn para su reutilizacion. La porción porfirinica libre de hierro del hern es degradada, principalmente en las células reticuloendoteliales del hígado, bazo y médula ósea.
+
-
irnos anterio~
C S
El catabolismo del hern de todas Iac hemoproteinas, al parecer se lleva a cabo en las fracciones microsbmicas de las células reticuloendoteliales mediante un sistema complejo de enzimas llamado hern oxigenasa. Para cuando el hern de las hemoproteínas llega al sistema hern oxigenasa, por lo general, el hierro ya ha sido oxidado a la forma fkrrica, constituyendo la hemina. El sistema hern oxigenasa es inducible w r sustratos. Está localizado en intima proximidad con el sistema microsómico de transporte de electrones. Como se muestra en la figura 34-1 2, la hemina se reduce con el NADPH, y con Ia ayuda de más NADPH se afiade oxígeno al puente alfa-metenilo entre los pirroles I y 11 de la porfisina. El ion ferroso nuevamente es oxidado a la forma fdrrica. Con la ulterior adición de oxígeno, se libera ion ferrico y se produce monúxido de carbono y una cantidad equimolar de biliverdina IX-alfa resulta de la fiagmentacion del anillo tetrapirrólico. En las aves y los anfibios, se excreta biliverdina IX-alfa de color verde; en los mamíferos, una enzima soluble, la biliverdina reductasa, reduce el puente metenilo entre los pirroles 111 y IV a un grupo metileno, produciéndose bilirrubina IX-alfa, un pigmento de color amarillo (figura 34-12). Se calcula que 1 g de hemoglobina rinde 35 mg de bilirrubina. La formacion diaria de bilirrubina en
110
(Capitulo 34)
Bioqzcímicade Harper
Hem
SE -"J 3
e?
a
NADPH
P
V)
~ e *(reutilizado)
-
I WN - F ~ $ ' - N
CO (exhalado)
JI~
0,
lml
I
P
Biliverdina IX-a
Figura 34-12. Representacibn esquemática del sistema hemoxfgenasa en los microsomas. (Modificada de Schmid R, McDonough AF en: The PorphyMs. Dolphin D [editor]. Academic Press, 1978.)
el ser humano adulto es aproximadamente de 250 a 350 mg, mismos que derivan principalmente de la hemoglobina, pero tambikn de la eriú-opoyesis ineficaz y otras protehas hkmicas como el citocromo P450. La conversi611quirnica de hem en bilimbina por las células reticuloendoteliales, puede ser observada in vivo, como el color rojo púrpura del hem en un hematoma que lentamente va cambiando al pigmento amarillo de la bilimbina.
La bilimbina que se forma en tos tejidos perifericos se transporta al higado por la albúmina plasmática. El metabolismo posterior de la bilirrubina tiene lugar primordialmente en ese órgano. Puede dividirse en tres procesos: 1) captación de la bilimbina por las células del parenquima hephtico; 2) conjugaci6n de la bilimitiina en el retículo endoplásmico liso, y 3 ) secreción de bilirrubina conjugada en la bilis. Cada uno de estos procesos será descrito por separado.
CAPTACION DE LA BlLlRRUBlNA POR EL HIGADO La bilirrubina es poco soluble en el plasma y en el agua, pero en el primero está ligada a proteinas, específicamente a la albúmina. Cada mol&cula de albúmina tiene al parecer un sitio de alta afinidad y uno de afinidad baja para la bilimbina. En 100 rnL de plasma, aproximadamente 25 mg de bilimbina pueden estar enlazadas estrechamente a la albúmina en su sitio de afinidad elevada. La bilimbina que sobrepasa esta cantidad puede enlazarse solo dbbilrnente y por tanto puede desprenderse con facilidad y difundirse en los tejidos. Numerosos compuestos, como los anti bidticos y otros medicamentos compiten con la bilimbina por el sitio de enlace de alta afinidad en la albúmina. De ese modo, estos compuestos pueden desplazara la bilimbina de la albúmina y, por tanto, tienen efectos clínicos significativos. En el hígado, [a bilimbina al parecer es eliminada de los hepatocitos por un sistema saturable mediado por un portador. Este sistema de transporte facilitado tiene una capacidad muy grande, de manera que inclusive en condiciones patológicas, el sistema no parece ser limitante de la velocidad en el metabolismo de la bilirrubina. Debido a que este sistema de transporte facilitado permite el equilibrio de la bilimbina a través de la membrana sinusoidal del hepatocito, esta captacibn neta de la bilirrubina será dependiente de la eliminacion de la misma por las vias metabblicas subsiguientes.
La conjugación de bilirrubina con ácido gluturonico tiene lugar en el hígado La bilimbina es no polar y puede persistir en las c&lulas (por ejemplo, iigada a lipidos) si no se convierte en hidrosoluble. Los hepatocitos la convierten en el tipo polar, que es la variedad que se excreta en
la bilis, mediante la adici6n de molecnlas de ácido glucurdnico. Este proceso se denomina tambien conjugacion y puede emplear otras molCculas polares aparte del hcido glucurónico (por ejemplo, el sulfato). Al prepararse para su excrecibn, muchas hormonas esteroides y fánnacos también se convierten en derivados hidrosolubles mediante conjugaci6n (capitulo 6 1). El hígado contiene por lo menos dos isofomas de glucuronosiltransferasa y ambas actúan sobre la bilirrubina. Estas enzimas se localizan de manera principal en el reticuloendotelio liso y utilizan ácido UDP-glucuriinico como donador de glucuronos~lo.E! glucurhido de bilimbina es un intermedio que en seguida se convierte en diglucurbnido (figuras 34-1 3 y 34-1 4). La mayor parte de la bilimbina que se excreta en la bilis de los marniferos lo hace como diglucurónido de bilirrubina. Sin embargo, cuando la bilimbina conjugada existe de manera anormal en el plasma humano (por ejemplo, en la ictericia obstmctiva) predominan los monog tucurónidos. La actividad de la UDP-glucuronosilcransferasa puede inducirse por ciertos fármacos de utilidad en la cIinica, incluyendo el fenobarbital. Posteriormente, en los comentarios sobre los trastornos hereditarios de la conjugación de la bilimbina se presentará mas informaci6n sobre [a glucuronosilacibn.
La bilirrubina es secretada en la bilis La secrecibn de bilirrubina conjugada en la bilis se lleva a cabo por un mecanismo de transporte activo, el cual es probable que sea el factor limitante de la velocidad para el procesa completo del metabolismo hepático de la bilimbina. El transporte hepatico de la bilirrubina conjugada hacia la bilis parece ser tambikn inducible por aqueIlos mismos medicamentos que son capaces de inducir la eonjugacion de la misma. Por tanto, los sistemas de excreción y de conjugación para la bilimbina se comportan como una unidad funcional coordinada.
Figura 34-13. Estructura del diglucurbnido de bilirrubina (bilirrubina conjugada de "reaccidn directa"). El hcido glucorbnico está insertado a trav6s de un enlace bster a los dos grupos del acido propibnico de la bilirrubina para formar un acilgluwrdnido.
4 12 * Bioquimica de Harper
1
UDP-GLUCOSA
(Cupitwlo 34)
1
1 DESHIDROGENASA 1 UDP-Gluwsa
ACMO UDPglucurónim
Monoglucurbnido de bilirrubina
+
UDP
Bilirrubina UDP-GLUCURONIL bcido U D P ~ I ~ C ~ ~ n i C o
Digghc~rbnidode brrubina Figura 34-14. Conjugacibn de
Monoglucurónido de bilirmbina 2 MonogIucu~nldos
,de bilirnibinas
kctdo VDF-giucur6nico
UDP
m f
id^ de blnnilina +
Bilirrubina
En condiciones fisiol6gicas, en esencia toda la bilimbina secretada en la bilis se encuentra conjugada. Sólo después de fototerapia, se puede encontrar en la bilis cantidades significativas de bilimbina no conjugada. En el hígado hay múltiples sistemas para secretar compuestos naturales y farmaduticos en la bilis después de su metabolismo. Algunos de estos sistemas secrctorios son compartidos por los diglucurbnidos de bilimbina, pero otros al parecer operan independientemente. La figura 34-1 5 resume los tres procesos principales que intervienen en la transferencia de bilimbina de la sangre a la bilis. También se indican los sitios que son afectados en diversos trastornos que causan ictericia (véase despues).
la bilirrubina can el acido glucurbniw. El donador de glucuronato, el ácido UDP-olucurdniw. se forma a aartir de la UDPglucosa co6o se muestra. Al men& dos isoformas de la glucuronosikransferasa que usan bilirrubtna como un sustrato esthn presentes en el higado humano
con color), que son excretadas en las heces (figura 34-16). El oscurecimiento de las heces al dejarlas al aire se debe a la oxidación de los urobilinógenos residuales a urobilinas.
La bilirrubina conjugada es reducida a urobilinogeno por bacterias intestinales Conforme la bilimbina conjugada llega al ileon terminal y al intestino grueso, los glucur6nidos son separados por enzimas bacterianas especificas (beta glucuronidasas) y el pigmento es reducido posteriormente por la flora fecal a un grupo de compuestos tetrapirrólicos incoloros llamados urobilinbgenos (figura 34-1 6). En el íleon terminal y en el intestino grueso, una pequeiia fracci6n de urobilindgeno es resorbida y excretada a travbs del hígado para constituir el ciclo intrahephtico del urobilinúgene. En condiciones anormales, en particular cuando se forma pigmento biliar en exceso o cuando la enfermedad hepatica interfiere con este ciclo intrahephtico, eI urobilinbgeno tambien puede ser excretado en la orina. Por lo común, la mayor parte de los urobilinogenos incoloros formados en el colon por la fiora intestinal, son oxidados ahí a urobilinas (compuestos
Figura 34-15. Representacibn esquemhtica de los tres procesos principales (captacibn, conjugacián y secrecibn) que intewienen en la transferencia de bilirrubina desde la sangre a la bilis. Ciertas proteínas intracelulares de hepatocitos, como la ligandrna y proteína Y, toman parte en la captacidn de la bilirrubina por estas &lulas. Tambien se muestra el proceso específico que tiene lugar en algunos trastornos que causan ictericia.
Porfirinas y pigmento. hiliares
4 13
Figura 34-16. Estructura de algunos pigmentos biliares.
LA HlPERBlLlRRUBlNEMlA CAUSA ICTERICtA Cuando la cifra de bilirmbina en la sangre excede de 1 mg/dL (17.1 pmoVL), existe Riperbilimbinemia. La hiperbilirrubinemia puede deberse a la produccidn de más bifirrubina de la que el higado norma! puede exmtar o a la insuficiencia de un hígado dañado paca excretar la bil irrubina producida en cantidades normales. Ante la ausencia de dario hephtico, la obstrucción de: los conductos excretorioc del hígado, previniendo la excrecion de la bilirrubina, también causará hiperbilirrubinemia. En todos estos trastornos, la bilimbina se acumula en la sangre y cuando alcanza una cierta concentración (aproximadamente 2 a 2.5 mgldL) se difunde dentro de los tejidos, los cuales adquieren color amarillo. Este trastorno se denomina ictericia. En los estudios ciínicos de la ictericia, la medición de la concentracibn de bilimbina en el suero es de gran valor. Un método para el anlilisic cuantitativo del contenido de bilirrubina del suero fue disefíado primero por Van den Bergh mediante la aplicación de la prueba de Ehrlich para determinar bilimbina en la orina. La reacción de Ehrlich está basada en el acoplamiento de acido culfanilico diazotizado (reactivo dirtzo de Ehrlich} con la bilimbina para producir un compuesto a m de color púrpura rojizo. En el procedimiento original descrito por Ehrlich, se utiliz6 metano! para proporcionar una solucibn en la cual la bilimbina y el reactivo diazo fueran solubles. Van den Bergh, de manera involuntaria, omitid el metano1 en una ocasión cuando se estaba haciendo el análisis del pigmento biliar en la bilis humana. Para su sorpresa, se produjo la aparición normal del color de manera "directa". Esta forma de bilimbina que puede reaccionar sin la d i c i 6 n de metano! fue denominada de "reaccibn directa". Se ha116 que esta misma reacción directa tambikn se presentaba en el suero de casos
de ictericia debida a obstruccion biliar. Sin embargo, todavía era necesario afiadir metanol para detectar la bilirrubina en el suero normal, o la que se hallaba presente en exceso en el suero de enfermos de ictericia hemolitica, en donde no se hallo evidencia de obstrucci6n. A la forma de bílimbina que podía ser medida sblo después de la adicihn de metano!, se le aplicb el término de 'keacci6n indirecta". Se hademostrado en la actualidad que la bilimbina indirecta esta "libre" (bilirrubina no conjugada) dirigiendose hacia el hígado desde los tejidos reticuloendoteliales, donde la bilimbina fue originalmente producida por el desdoblamiento de las hernoporfirinas. Debido a que la bilirrubina no es hidrosoluble, requiere del metanol para iniciar su acoplamiento con el reactivo diazo. En el hígado, la bilimhina libre se conjuga con el Iicido glucurónico y el conjugado glucurónido de bi tirrubina puede ser excretado en la bilis. Adernas, la bilimbina conjugada, al ser hidrosoluble, puede reaccionar directamente con el reactivo diazo, de manera que la "bilirrubina directa" de Van den Dergh es realmente un conjugado de bilirrubina (glucurbnido de bilirrubina). Dependiendo del tipo de bilirmbina presente en el plasma, es decir, no conjugada o conjugada, la hiperibilirrubinemia puede clasificarse como de retencibn, debida a la sobreproducci6n, y de regurgitación, debida al reflujo al torrente sanguíneo causado por la obstrucción biliar. A causa de sus cualidades hidrofobac, sblo la bilimbina no conjugada puede atravesar la barrera hematoenceftilica hasta el sistema nervioso central; por tanto, la encefalopath debida a hiperbilimbinemia (quernictero) solo puede presentarse cm la bilimbina no conjugada, como se encuentra en la bilimbina de retencihn. Por otra parte, debido a su solubilidad en agua, sblo la bilimbina conjugada puede apareceren la orina. Segun esto, la ictericia colusica (coluria =
4 14
Rioquirnica de Harper
presencia de derivados biliares en la orina) se produce sólo en la hiperbilimbinemia de regurgitación mientras que la ictericia acolurica tiene lugar únicamente en presencia de un exceso de bilimbina no con,jugada.
En algunos trastornos hay cantidades elevadas de bilirrubina no conjugada en la sangre
A. Anemias hemofiticas Las anemia? hemoIiticas son causas importantes de hiperbilimbinemia no con-jugada;inclusive en el caso de hemólisis extensa, la hiperbilimbinemia no conjugada sólo está algo elevada (< 4 rng/dL; < 68.4 p m o L ) dehido a la gran capacidad del hígado para manejar la bilimbina. Sin embargo, si su manejo es defectuoso por mastomo heredado o adquirido, puede presentarse hiperbilimibinemia no conjugada. Las causas mas comunes de este estado son las siguientes.
B. "lcterjcja fisioiogi'ca" neonatal Este trastorno transitorio es la causa mas comun de hiperbilimbinemia no conjugada. Resulta de una hemólisis acelerada y de un sistema hepatico inmaduro para la captación, conjugaci~ny secreci6n de bilirrubina. No sólo esta reducida la actividad de la UDP-glucuroniltransferasa, sino que al parecer también está reducida la síntesis del sustrato para dicha enzima, el ácido UDP-glucurbnico. Debido a que la bi limbina elevada es la no conjugada, es capaz de penetrar la barrera hematoencefhlica cuando su concentracion en el plasma excede a aquella que puede ser ligada por la albúmina (20 a 25 mg/dL). Esto puede resultar en una encefalopatia tox ica hiperbilirrubiném ica o auemictero. la cual ~ u e d eser causante de retraso rkntal. Debido a la'reconocida inductibilidad del sistema rnetabolizador de bilimbina, se ha admin isfenobarbital a nacidos con ictericia y es eficaz en este trastorno, ~ d ~ la~ e xfp o sij c i ~~n , a la luz vici bie (fototera pkutica) puede promover (por un mecan~smoque no se comprende} la excreción hep~ticade bi]imihina sin conjugar. convirtiendo parte de la bi]irnibina a otros derivados como fragmentos de maleimida e icómeros geomékicos que son e x c r e d o s en la bilis.
C. Síndrome de Crigier-Najar, tipo I; ictericia congénita no hemolítica El sindrome de Crigler-~ajjar tipo 1 es un trastorno autosomico recesivo raro del ser humano, debido a un defecto metabblico primario en la conjugaci6n de la bilirsubina. Se caracteriza por ictericia congknita grave debida a la ausencia hereditaria de actividad de la bilirrubina UDP-glucuroniltransferasa en los tejidas hepáticos. La enfermedad, por lo general, es mortal en el transcurso de los primeros 15 meses de vida, pero
(Capítulo 34j
se han visto casos de algunos adolescentes que no tuvieron dificultades sino hasta la pubertad. Estos niños han sido tratados con fototerapia. con alguna reducción en las cifras plasrnhtícas de bilirnibina. El fenobarbital no tiene efecto aIguno sobre Ia formación de glucuronidos de bilirrubina en los pacientes con el sindrome de Crigler-Najjar tipo 1. La concentración de bilimbina sdnca, por lo general, excede de 20 mgídL cuando no se trata.
D. Síndrome de Crigler-NaJar tipo 11 F.sre raro padecimiento hcredado parece deberse a un defecto más levc del sistema de conjugacihn de la bilimbina y tiene una evolución más benigna. Las concentraciones de bilirrubina sérica habitualmente no exceden de 20 mg/dL, pero toda la bilirrubina acumulada es del tipo no conjugado. De manera sorprendente, la bilis en estos pacientes contiene monoglucurónido de bilimbina, y se ha propuesto que e! defecto genktico puede implicar a la UDP-glucuronosiltransferasa hepática que ailade el segundo grupo glucuronilo al monoglucurónido de bilimbina. Los pacientes con este sindrome pueden responder a tratamiento con dosis elevadas de fenobarbital.
E. Enfermedad de Gilbert Es un grupo heterocig6tico de trastornos, muchos de los cuales han sido reconocidos en la actualidad como debidos a una hernblisis compensada, relacionada con hiperbilimbinemia no conjugada. Parece haber tarnbiCn un trastorno en la depuración hepática de la bilimbina, posiblemente debida a un defecto en la absorción de bilimbina por las células parenquimatosas del hígado. Sin embargo, Ea bilirrubina UDP-glucuronasilti-ansferasa tietie actividad reducida en el higado de estos enfermos.
F. H i ~ e & ~ ~ ~ ~ ~ u b itóxjca nemja La hiperbilimibinemia no conjugada puede resultar de una disfunción hephtica inducida por toxicidad como la pmvocada por clorof~mo~ arsfenmin*, tetracloruro de carbono, acetaminofeno, virus de la hepatitis, ciwosis e intoxicacion por los hongos Amuniiu. Aunque la mayoría de estos padecimientos adquiridos se debe" addodelascélulasdel~adnquimahe~htico,con frecuencia hay un componente de obstrucción del árbol biliar dentro del hígado que resulta en la gresencia de un poco de hiperbilimbinemia conjugada.
La obstrucción del árbol biliar es la causa más común de hiperbilirrubinemia conjugada A. Obstruccibn del árbol biliar La hiperbilimbinemia conjugada por lo común es resultado del bloqueo de los conductos heptiticos o del
colkdoco. En virtud de la obstruccibn no se puede excretar el diglucurónido de bilirrubina, mismo que regurgita al interior de las venas hephticas y aparece la bilirrubina conjugada en la sangre y la orina (ictericia colúrica). El t i m i n o ictericia colesthtica se utiliza para incluir todas los casos de ictericia obstnictiva extrahepática. El tkrmino tambikn comprende los casos de ictericia que manifiestan hiperbilimbinemia conjugada producida por la microobstrucclón de los canaliculos biliares intrahepáticos por hepatocito daiíados y edematosos (tal como puede presentarse en la hepatitis infecciosa).
B. Ictericia Sdiopátjca crónica (síndrome de D ~ b i nJohnson) Este trastorno autosómico recesivo consiste en hiperbilirrubinemia conjugada en la infancia o durante la edad adulta. La hiperbilirrubinemia se debe, al parecer, a un defecto en la secrecibn hepática de bilimbina conjugada en la bilis. Este defecto de la secreción de compuestos conjugados no se restringe a la bilirruhina, también afecta la secrecidn de estrógenos conjugados y productos que se utilizan en pruebas de laboratorio Como el colotante de sulfobromoftaleina.En los pacientes con este sindrome, los hepatocitos en la zona centrolobulitlar contienen un pigmento negro anormal que no se ha identifcado.
C. Síndrome de Rotor Éste es una cituacion muy rara que se caracteriza por hiperbilimbinemia co~jugadacrónica con histologia hepltica normal. No esta identificada su causa precisa, aunque puede deberse a un defecto del transporte de aniones orgánicos, incluso bilirrubina, por los hepatocitos.
Algunos conjugados de bilirrubina pueden unirse covalentemente a la albúmina Cuando las concentraciones de bilimbina se mantienen altas en el plasma, una f r a c c i ~ npuede fijarse covalentemente a la albúmina(de1ta bilirrubina). Debido a que esta unida de manera covalente a la albúmina, esta fraccidn tiene una mayor vida media en el plasma que la bilirrubina conjugada normal. Asi, permanece elevada durante la fase de reestablecimiento de la ictericia obstructiva después de que el resto del conjugado de bilirrubina ha disminuido hasta valores de concentraciones normales (lo cual explica por que parece que algunos pacientes siguen presentando ictericia después de que las concentraciones de bilimibina han regresado a su valor normal).
El urobilinógeno y la bilirrubina en la orina son indicadores clínicos Normalmente sala hay indicios de urobilinógeno en la orina. En la obstruccion completa del condircto biliar, no se halla urobilinógeno en la orina debido a que la bilimbina no tiene acceso al intestino para formarlo. En este caso, la presencia de bilirrubina (conjugada) en la orina sin urobiliniigeno sugiere ictericia obstructiva, ya sea intrahepática o poshepática. En la ictericia hemolitica, la producción elevada de bilimbina conduce a mayor producción de urobilinógeno, el cual aparece en la orina en grandes cantidades. Por lo general, no se encuentra bilimbina en la orina en la ictericia hemolitica (debido a que la bilimbina no conjugada no pasa a la orina), de manera que la combinación entre mayor cantidad de urobilinógeno y ausencia de bilimbina sugiere ictericia hemolitica. El aumento de la destruccihn de la sangre por cualquier causa (por ejemplo, anemia perniciosa), traerh como consecuencia un aumento en el urobilinógeno de la orina. E1 cuadro 34-3 resume los resultados de laboratorio que se obtienen en pacientes con tres causar diferentes de ictericia: anemia hemolitica (una causa prehephtica), hepatitis (una causa hepatita) y obstnicción del conducto biliar comun (una causa poshepática). Los estudios de laboratorio de sangre (para evaluar la posibilidad de anemia hemolitica) y suero (por ejemplo, actividad de las enzimas ALT y fosfatma1calina)tam'bikn san de importanciacomo auxiIiares para distinguir entre causas prehepáticas, hepaticas y poshepáticas de la ictericia.
RESUMEN Las hemoproteínas, como ,la hemoglobina y los citocromos, contienen hem. Esta es una hierroporfirina (Fe2+-protopofirinaIX) donde cuatro anillos pirrólicos estiin unidos por puentes metenilo. Los ocho grupos laterales (rnetilo, viniEo y propionilo) en los cuatro anillos pirrólicos del hem están ordenados en una secuencia especifica. La biosintesis del anillo hdmico se realiza en las mitocondrias y el citosol por medio de ocho pasos enzimaticos. Comienza con la forrnacibn de delta aminolevulinato (ALA) a partir de succinilZoA y glicina en una reacción catalizada por ALA sintasa, que es la enzima reguladora de la vía. Las anomalidades geneticas de 6 de las 8 enzimas que intervienen en la biocintesis del hem causan las pofirias hereditarias. Los eritrocitoc y el hígado son los sitios principales de expresidn metabblica de estos padecimientos. La fotosensibílidad y problema neurol6gicos son slntomas comunes. La ingestión de ciertas sustancias (corno plomo) pueden
4 16
Bioqu ím ica de Harper
(Capitulo 34)
Cuadro 34-3. Resultados de laboratorio en personas normales y pacientes con tres causas diferentes de icteri -:-
.-p.---
Bilirru bin
.-. .. . --
.
ibilinrigcn urinario
1
urir
-
Urobilin &geno fecr -.
Directa : 0.1 a 0.4 mgídl, husent 324 horas ' Indireciia: 0.2 a 0.7 rng/dI, Anemia hernoiirica i Elevaci6n de indirecta Aunientadn Ausent I CLIC.* l..inn: n:-* -:--.:,!* n*x,.n-i Hepatitis aciones de directa e i n *. d i ~ I , I ~~ I ~ ~ ~ CICSCIII II~IIIIIIuL~IU Icterrcia c ElcvvciOn dc dircc Aiisi Presenl )Iigocantidades a ausentc * Lar; causaLF m á-comu ~ n c dc ~ ictericia obstructiva (posnepatica) son cáncer ae ia cabeza del pBncreas y un calculo aln,iado en e1 conducto .
+ -
1
1
1
1
.-u-u
biliar común En ocasiones. la presencia de hilirmbina en la orina se refiere como culuria. por ende, l a hepatitis y la ohsbiiccifin del cvnducto biliar comíin causan ictericin colúrica. en tanto que l a ictericia derivada de anemia hemolitica se rcliere come xolurica
desencadenar porfiriac secundarias (adquiridas). El diagnóstico se facilita con la identificación de un incremento en la concentración de porfirinas o sus precursores en sangre y orina. El catabolismo del anillo hémico se inicia con la enzima hem oxigcnasa, que produce un tetrapirrol lineal. La biliverdina es un producto inicial del catabolismo y su reducción genera bilirrubina. Esta útirna se transporta por la al bumina desde los tejidos perifkricos al hígado, donde penetra a los hepatocitos. El hierro del hern y los aminoacidos de [a globina se conservan y utilizan de nuevo. En el hígado, la bilirrubina se vuelve hidrosotuble por conjugacibn con dos molCculas de dcido glu-
curbnico y es secretada en la bilis. La accion de las enzimas bacterianas en el intestino produce urobilinógeno y urobilina, que se excretan en heces y orina. La ictericia se debe a la elevación de la concentraci6n sanguinea de bilimbina. Las causas de la ictericia pueden clasificarse como prehepáticas (por ejemplo, anemias hemolíticas), hepáticas (por ejemplo, hepatitis) y poshepáticas (por ejemplo, obstruccibn del conducto biliar común). Las mediciones plasmáticas de la bilim b i n a total y conjugada, y las urinarias del urobiIinhgeno y la bilimbina, así como de ciertas enzimas séricas, y la inspeccibn de muestras de heces ayudan a diferenciar dichas causas. II
REFERENCIAS Chawdhury JR, et al.: Hereditary jaundice and dfsorders
of bilinibin metabolism. In: Tlie ,Veiabolic and MuIecular Hases nf lnheriied Bisease, 7th ed. Scriver CR et al (editnrs). McGraw-Hrll, 1995. Desnick M:The porphyrias. In: Harrison S Principles of InrernaI Medicine, 13th ed. Isselbacher KJ et al (editor~).McCiraxv-Hill, 1994. Elder GH: Haem synthesis and the porphyrias. In: Scienb$c Foundaiion.~nf Riochemrshy in Clinicab Psacfice, 2nd ed. Williams DL, Marks Y(editors). ButterworthIHeinemann, 1994. Goldberg A et al.: Porphyrin metabolism and the porphy rias. In: Oxford Textbook of Medicine, 2nd ed.
Weatherall DJ et al (editors). Oxford Univesity Press. 1987. Isselbacher l U Bilirubin metabolism and hyperbilirubinemia. In: Harrison S' Prznciples of IniernaI Medicine, 13th ed. Isselbachcr KJ el al (editors).
McGraw-Hill, 1994. Kaplan LM, lsselbrcher KJ: laundice. In: Harrison's Principles 5f Interna! .Medicine, E 3th ed. Isselbacher
KJ et al (cditors). McGraw-Hill, 1994. Kappas A et al.: The porphyrias. In: The .idetabolic and ;MoIecuiarBases oJIriheri~edDisea.~e.7th ed. Scriver CR ct al. (editors). McGraw-Hill, 1995.
y ren~icacl6nde las
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419 . Capitulo 36.Metabolismo de nudeótidos de purina y pirimidina . . . . . . . . . . . . . . 431 Capítulo 37.Estructura y funcion de los 4cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 449 Capítulo 38.Organización y repIicaci6n del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 461 Capitulo 39.Sintesis. procesamiento y metabolismo del RNA . . . . . . . . . . . . . . . . 485 Capítulo 40.Síntesis de proteinas y el código genético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503 Capítulo 41 .Regulación de la expresión génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 521 Capítulo 42 .Tecnología del DNA recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 541 Capítulo 35 Nucleótidos
-
-
Victor W. Rodwell, Ph D
Este capitulo introduce las bases heterociclicas aromáticas purina y pirimidina así como sus principales derivados, los nuctebsidos y nucleótidos que, ademas de suministrar las unidades monoméricas o bloques estructurales de los ácidos nucleicos, realizan diversas funciones esenciales para la vida y la salud. Las funciones princi~alesde los nucleotidos de purina y pirimidina incluyen las numerosas reacciones de transferencia de fosfato del ATP y otros trifosfatos de nucleiisidos, que por otra parte dirigen las reacciones exergdnicas. La UDP-glucosa y la UDP-galactosa intervienen en la hiosintesis de los carbohidratos y CDP-acile!icerol en la biosintesis. como "intermediarios de alta energia.' para la forma& de enlaces covalentes. Los nucleótidos forman parte de la estructura de coenzimas corno FAD, NAD', NADP', coenzirnas A y S-adenosilmetionina. Además, tienen funciones reguladoras. Las concenwaciones de ADP regulan el indice de fosforilación oxidativa mitocondrial; nucledtidos específicos actúan como reguladores alostéricos de la actividad enzimatica y el AMP cíclico y el GMP ciclico tienen funciones de "segundos mensaieros". Por Último. los trifosfatos de n"cle6sidos son las unidades monomkricas precursoras de los hcidos nucleicos RNA y DNA.
IMPORTANCIA BIOMEDICA La capacidad de los nucle6tidos para absorber la luz ultravioleta, una consecuencia de su estructura química, hace que la luz ultravioleta sea un mutágeno potente. En la quimioterapia del cancer, SIDA y en otras situaciones de intei-es médico se utiliza un conjunto de anhlogos de Ea purina y pirimidina sintetizados
quimicamente. Los ejemplos incluyen el alopurinol empleado para tratar la hipertensidn y la gota, y la azatioprina que se usa para suprimir la respuesta inmunolbgica durante la trasplantacion de or,"anos. Aunque tanto el Acido urico como el urato muestran solubilidad relativa a pH alcalino, son insolubles en orina bcida. Por tanto, los catabolitos de purina, xantina y Acido úrico pueden formar cáfculos en las vías urinarias. Los análogos sinthticos de bases, nucleósidos o nucleiitidos que existen de manera natural, utilizados para inhibir el crecimiento de las cbliilas cancerosas o de ciertos virus incluyen al 5-fluorouracilo, 5'-ydo-2r-desoxiuridina, 6-tioguanina, ó-mercaptopurina, 6-azauridina y arabinosil citosina- medicamentos que inhiben a enzima específicas o o p l a z a n nucleótidos naturales durante la sintesis de DNA o RNA. Ademiis, estos analogos son instrumentos valiosos en la investigacibn biomédica.
Q U ~ M ~ CDE A LAS PURINAS Y PIRIMIDINAS, SUS NUCLEÓSIDBS Y NUCLEOTIDOS
Las purinas y las pirimidinas son compuestos heterocíclicos Los compuestos heterocíclicos son compuestos de anillo (ciclicos) que contienen tanto Atomos de carbono como de no carbono (helero). Si bien los heterociclicos que contienen azufre u oxígeno son de importancia tanto bioldgica como terapéutica, el atomo hetero rnbs comun en biología es, por mucho, el nitrógeno. Las purinas y las pirimidinas constituyen una clase de heterociclicoc que contienen nitrdgeno de la mayor importancia biológica. Sus principales deri-
420
(Capítulo 35)
Bioquímica de Harper
vados son nucleosidos y nucleótidos, los cuales contienen azúcar ciclica, a menudo pentosa, ligada a un átomo hetero de nitrbgeno mediante un enlace beta N-glucosidico. Los nucledtidos contienen, además, uno o mbs grupos fosforilo eszerificados en los grupos hidroxi del azúcar.
Se utilizan diferentes sistemas para la numeración de purinas y pirirnidinas Obsérvese la paradoja de que la pirirnidina heterocíclica más pequeíia (seis htcimos) tiene el nombre mas largo, en tanto la purinn heterociclica mhs grande (nueve átomos) tiene el nombre m i s corto. Nótese también que la direccihn, en el sentido de 1% manecillas del relo-i, en que se numeran los átomos del anillo de la pirimidina, es opuesta a la direccihn, en sentido contrario de las maneciIlas, en la que se numeran los átomos de las purinas (figura 35-1).
Las pusinas y las pirimidinas son moléculas planas Vistas de perfil, las purinas y pirimidinas son moléculas, en lo fundamental, planas. En virtud del plegamiento de sus anillos, las bases de purina y pirimidina pueden apilarse con ~ i e r t alibertad en el interior de las hklices de doble cadena del DNA o de los hibridos DNARNA, con el resuhado de la pérdida de la estabiIidad de la hélice (capítulo 38).
Los ácidos nucleicos contienen cinco bases heterocíclicas mayores Las bases heterocíclicas mas abundantes o "principales" son las purinas adenina y guanina; y las pirimidinas citosina. timina y uracilo. Todos los ficidos nucleicos contienen adenina, guanina y citosina. El DNA (pero no el RNA} consta también de timina, mientras que los RNA (pero no el DNA} incluye uracilo (cuadro 35-1).
La mayoría de las purinas y pirirnidinas existen como nucleotidos en las células Los nucle6sidos constan de una purina o pirimidina y un azúcar ciclico, con mayor frecuencia D-ribasa o 2-desoxi-D-nbosa, ligada a través de un enlace covalente beta N-glucos~dico,ya sea al N-9 de una purina o al N-1 de una pirimidina. La numeracihn de los átomos de amicar emplea un signo de prima (por ejemplo, 3'o 5'-) para distinguir los átomos de azúcar de los de la base heteroclclica. Los nucleósidos se denominan ribonucle~tidoso desoxirribonucleótidos con base en si el anicar es una ribosa o una 2-desoxirribosa.
t o s grupos heterocíclicos oxoy amino- existen como mezclas tautoméricas En el capitulo 15 se describe el tautomerismo cetoenol de los grupos 0x0- e hidroxi- de las aldosas y cetosas. En virtud del carhcter aromático de las purinas y las pirirnidinas, dstas participan en los tauzomerismos ceto-enol y amina-imina cuando están presentes custituyentes 0x0- o arnino- (figura 35-2). Por tanto, estos grupos funcionales existen como mezclas tautoméricas de pares de amino-imino 0x0-hidroxi que difieren con respecto a la posicibn de un fitorno de hidrbgeno y ciertos electrones. Aunque las condiciones fisiolbgicas favorecen fuertemente las formas amino y las Tacthicas, las tautomén'casmenos favorecidaspueden participar en procesos mutAgenos (capítulos 39 y 4 1).
Los N-glucósidos heterocíclices existen en conformadores syn y antí Ya que la confomaci6n estearica originada por la base heterociclica, establece, una vez ya formada, que no hay libertad de rotacidn alrededor del enlace betaN-glucosidico, que une a los anicarec con las purinas o pirimidinas. Asi, los nuclebsidos y nucle6tidos existen como conformadores no convertibles syr? y unii (figura 35-3), los cuales s610 se pueden interconvertir mediante rotura y refomacibn de la u n i h glucosídica. En tanto que ambos conformadores existen en la naturaleza, predominan los aati, y son estos conformadores anii predominantes los que participan en el pareamiento normal de bases en el DNA de doble tira (capitulo 38).
Los ácidos nucleicos también contienen bases "menores" o
"inusuales'" Figura 35-1. Estructuras de purina y pirimidina. La posicibn de los Btomos está numerada de awerdo con el cisterna internacional
Además de las bases principales, los DNA y RNA de procariotes y eucariotes contienen cantidades considerablemente menores de purinac y pirirnidinas adi-
Cuadro 35-1. Principales bases, nuclebsidos y nucledtidos
p . p .
....----- -----. -
-
Bast
X=l
ianina
-. .. . .
. . . ..-- ..---. .
1
- --- I ---A----
NUC X=f
ucleósido a o desoxii
Adenosini
b
A
A
inde ibosa
> de adenosina
Guanosin; G
lonoftisfato de cítidinii 'MP
mina
cionales, que se denominan bases "menores" o "inusuates". Ninguno de los términos es adecuado en particular, ya que estas bases son importantes funcionalrnente y, por tanto, no tienen una importancia fisiotogica menor y se encuentran distribuidas ampliamente en la naturaleza. La 5-metilcitosina (figura
Figura 35-2. Tautomerismo de los grupos funcionales oxoy amino- de las purinas y pirimidinas.
lonofosfato de timidina
3 5 4 ) existe tanto en el DNA de humanos como de bacterias. Bases adicionales menores que existen en los RNA de marniferos incluyen a p-metiladenina, nibfl-dimetiladenina y P,N7-metilguanina de RNA mensajeros (figura 35-5) y varias bases derivada de RNA de transferencia (tRNA). En los ácidos nucleicos de bacterias y virus existen de manera exclusiva otras bases menores, como por ejempio la 5 hidroximetilcitosina del DNA del bacteriófago. Los nuclebtidos que se encuentran en estado libre en las celulas incluyen la hipoxantina y la xantina (figura 35-61, intermediarios de la xantina en el metabolismo de adenina y guanina, y acido urico, el producto final oxidizado del catabolismo de la purina que los seres humanos excretan por la orina.
422 * Binquímica de Harper
(Capitulo 35)
"fd
Anti
OH
OH
Figura 35-3. Los confomadorec syn (izquierda) y anti (derecha) de adenosina.
Las purinas metiladas de vegetales tienen propiedades farrnacologicas Los vegetales contienen varias bases heterocíclicas adicionales que son de interés farrnacológico. Los ejemplos incluyen los derivados cafeinados de la xantina metilada (1,3,7-trimetiilxancina)del café, la teofilina (1,3-dimeti lxantina) del té y la teobromina (3,7-dimetilxantina) de la cocoa (figura 35-7).
semejantes. Como se describió, la 2-desoxi-D-ribosa se adhiere por medio de un enlace beta N-glucocídico al N-9 (purinas) o N-1 (pirimidinas).
Los nu~leótidosson nucleósidos fosforilados
Los ribonucleósidos adenosina, guanosina, citidina y uridina constan de n-ribosa o 2-desoxi-n-ribosa ligada, por medio de un enlace beta N-glucosidico, ya sea al N-9 de una purina o al N-l de una pirimidina (figura 3 5-8). Las estructuras de los 2'-desox irribonucledsidos, desoxiadenosina, desoxiguanosinn, desoxicitidina, desoxiuridina y (desoxi}timidina son
Los mononucle6tidos son nuclebsidos con una fosforilacibn en grupos hidroxilo del anjcar (figura 35-9). Por ejemplo, el AMP (monofosfato de adenosina) es adenina + ribosa + fosfato. El cuadro 35-1 enumera las purinas y pirim idinas principales y sus nuclebs idos y nucle~tidosderivados. El proceso de rnodificaci6n postraslación de las bases presentes en los polinuclebtidos preformados puede generar bases adicionales. En la seudouridina @si,y), la D-ribosa se adhiere al carbono 5 del uracilo por un enlace carbono-a-carbono. Su mononucle~tido,el hcido seudouridllico (iyMP), se fonna por reordenamiento despubs de traslación del bcido uridilico en el tRNA preformado. De igual modo, el TMP (monofosfato de timidina), que contiene ribosa en lugar de decoximbosa (figura 35-10) se sintetiza cuando el UMP (monofosfato de uridina) de un tRNA preformado es rnetilado por la S-adenosilrnetionina.
Flgura 3 5 4 . Dos estructuras diferentes que se presentan en las pinmidinas naturales.
Figura 35-5. Dos bases purlnicas atipicas que ocurren en la naturaleza.
LAS PURINAS Y LAS PIRIMIDINAS FORMAN NUCLEOSIDOS Y NUCLE~TIDOS Los nucleosidos contienen monosacáridos
Xantina (2,6-dioxipurina)
Hipoxantina (6-oxipurina)
Figura 3 5 4 . Estructuras de hipoxantina y xantina
Nomenclatura Las abreviaturas A, G, C, T y U denotan las bases, tanto libres y presentes en los nucle~sidoscomo en los nucleotidos, de adenina, guanina, citosina, timina y uracilo, respectivamente. Cuando estfi presente el prefijo "d" (desoxi) indica que el anjcat es 2'-desoxiD-ribosa, es decir, dGTP. Los nuclebsidoc fosforilados sobre los carbonos 3'- o 5'. de la ribosa se denominan nucleócidos 3'monofosfato y 5'-monofosfato, respectivamente. Un ejemplo es el 3'-monofosfato de adenosina o 3'-AMP (figura 35-1 1). Sin embargo, toda vez que el 5'hidroxilo es el que se esterifica con mayor frecuencia,
se omite por conveniencia el "5'-" cuando se denominan los nucleótidos 5'-. Por tanto, abreviaturas como "UMP" o "AMP" denotan que el fosfato esta esterificando al carbono 5 de la pentosa. Los fosfatos adicionales adheridos al anicar del mononucleótido por enlace anhidrido de ácido forman di y trifosfatos de nuclebsido como ADP (difosfato de adenosina) y ATP (trifosfato de adenosina) (figura 35-1 2).
Los nucleótidos atienden diversas funciones fisiolbgicas Nuclebtidos específicos participan en reacciones que satisfacen con plenitud funciones fisiologicas tan diversas como la síntesis proteinica y de ácidos nucleicos, cascadas reguladoras y señales intracelulases e in~crcelularesde transduccion. A continuación se describen ejemplos representativos.
Los trifosfatos de nucleósido tienen potencial de transferencia de grupo alto Los anhldridos acidos, a diferencia de los ésteres de focfato, tienen un alto potencial de transferencia de gmpo. La AGOpara la hidrólisis de ambas terminales de fosfato de todos los trifosfatos de nucleósido es de alrededor de 3 kcallmol. El alto potencial de transferencia del grupo de los trifosfatos de nucleósido de la purina y pirimidina les permite participar como reactivos de transferencia de grupo en numerosas reacciones que f m a n enlaces covalen~es.En estas reacciones, la sepamcihnde un enlace anhidrido ácido se acompaÍla con un proceso altamente enderghriico como es la síntesis de enlaces covalentec. Un ejemplo notable es la piimerizacibn de los principales trifosfatos de nucleósido para formar hcido nucleico.
A. Derivados de la adenosina Teofiiina (1 -3-dimetilxantina)
N
*'yA>
C)
I
Teobromina (3.7-dirnelilxantina)
N
Figura 35-7. Metilxantinas presentes en los alimentos
El ADP y el ATP son sustratos y productos, respectivamente, en la fosforilación oxidativa y el ATP es el principal transductor intracelular de energía libre. La concentración intracelular media de ATP, el nuclehtido libre miis abundante en las celulas de los mamiferos, es aproximadamente 1 mrnoVL. El fosfoditster ciclico cAMP (3'-5'-monofosfato de adenosina), formado de ATP en una reaccihn catalizada por adenilil ciclasa (figura 35-13). La actividad de la adenilil cicfasa es regulada por interacciones complejas, muchas de las cuales comprenden a receptores para hormonas (capitulo 44). El "segundo mensajero'' cAMP participa en diversas funciones reguladoras de las cklulas; por ejemplo, la regulacihn de la actividad de la proteína cinasa dependiente de cAMP. Como mol6cula reguladora, se requiere una
424 * Bioquímrca de Harper
(Capitulo 35)
OH
OH
Guanosina
Citidina
Uridina
Figura 35-8. Estructuras de los ribonuclebsidos La adenosina y guanosina se muestran como los m8s comunes conformadores syn.
cantidad relativamente pequefia de cAMP. En consecuencia, su concentracitin (alrededor de 1 nmol/L) es tres veces menor de la de ATP. Las concentraciones de cAMP se conservan por la interaccibn de adeni lato ciclasa y cAMP fosfodiesterasa, que catalizan la hidrblisis de cAMP a 5'-AMP (figura 35-13). La adenosina 3'-fosfato-5'-fosfosulfato (fosfoadenosina fosfosulfato) o "sulfato activo" (figura 35-14) es el donador de sulfato para la formación de proteoglucanos sulfatados (capítulo 57) o de metabolitos urinarios de medicamentos excretados como conjugados de sulfato. La S-adenosilmetionina (figura 35-15), una forma de metionina "activa", sirve como donadora de
metilos en muchas reacciones diversas de metilacibn y como fuente de propilamina para la síntesis de poliaminas (capitulo 33).
Figura 35-9. Acido adenflico (AMP) (izquierda) y &cid0 2-desoxiadenllico (dAMP) (derecha).
Figura 35-10. A ~ d ouriditico (UMP) (izquierda) y áudo timidilico (TMP) (derecha)
B. Derivados de la guanosina Los nuclebtidos de guanosina participan en la conversión de succini [-COAa succinato, una reaccibn que se acopla a la fasforilaci6n a nivel sustrato de GDP a GTP. El GTP es necesario para la activacibn de la adenilil ciclasa por algunas hormonas y sirve como un regulador alostérico y como fuente de energía para la síntesis de proteínas.
ATP
Figura 35-1 1. 3'-Monofosfato de adenosina (izquierda) y 2'-desoxiadenosina-5' rnonofosfato (derecha).
~o...II~'o El C M P ciclico (cGMP o 3',5'-monofosfato de guanesina; figura 35-16) es tambikn, una seaal intracelular, o segundo mensajero de los sucesos extracelulares. El cGMP puede actuar en forma antagonica al cAMP. La guanilil ciclasa forma cGMP a partir de GTP por una reaccion análoga a la catatizada por adenilil ciclasa. Igual que adenilil ciclasa, la guanilil ciclasa es regulada por varios efectores, incluyendo hormonas. Como el cAMP, una fosfodiesterasa hidroliza la cGMP produce su respectivo 5'-monofosfato, GMP.
C. Derivados de la hipoxantina El ribonucleótido hipoxantina (IMP), es un precursor de todos los ribonucleótidos purínicos (capitulo 36), se genera por desaminacibn de AMP, una reaccibn que en el tejido muscular forma parte del ciclo de nucleótidos de purina (figura 35-1 7). La aminación de IMP,
AMP
Figura 35-13. Fomiacibn de cAMP a paitir de ATP por actividad de adenilil ciclasa e hidrólisis de c4MP catalizada por cAMP fosfodiesterasa.
reforma AMP, mientras que la desfosforilacibn de IMP forma el nuclebsiclo de inosina (ribósido de hipoxantina), un intermediario del ciclo de recuperaci6n de la purina (capitulo 36).
D. Derivados de uracilo Los derivados de UDP-anicar participan en la epimerimción de carbohidratos, tales como la interconversi0n de glucosa 1-fosfato y de galactosa 1-fosfato. La UDP-glucosa es el donador de glucosilo para labiosintesis de glucbgeno y disachridos de gtucosilo. Ademis, los UDP-anicares participan en la biosintesis de oligosacAridos para glucoproteinas y proteoglucanos
AMP-P-P
( ATP Ribosa HO- P-O-P-
O-P
HO
>
soe7-
OH P-P
ADP
5'-Monolosfato de adenosina (AMP) 5-Difosfato de adenosina (ADP) 5-Trifosfato de adenosina (ATP)
Figura 35-12. ATP, su difosfato y su monofosfato.
Figura 35-14. Formacibn de adenosina-3'-fasfato-5'-fosfosulfato,
426
Bioquim ica de Hurper
{Capirula S j)
A AMP
-HO
Metronina
JIADENILOSUCC~NAT~
~ADENILSYCCIMAMJ
OH
Figura 35-17, El ciclo de los nuclebtidos purinicos
Adenosina
Figura 35-15. S-Adenosilmetionina
(capitulas 56 y 57). Por ultimo, UDP-ácido glucurhnico es el donador de hcido glucosidica para reacciones de conjugación que forman los glucurónidos urinarios con.jugado5 de bilimbina (capítulo 34) o fármacos como la aspirina.
E. Derivados de la citosina E1 CTP e5 requerido para la biosintesis de algunos focfoglicéridos en los te-jido animales. Las reacciones donde interviene la ceramida y la CDP-calina provocan la formacihn de la esfingomielina y otras ecfingosinas sustituidas (capitulo 26).
dor de 6.2) de los mononucleótidos aseguran que los nucleotidos porter1 Iina carga negativa a pH fisiológico. Por el contrario, los nucleósidos o las hases purinicas y pirirnidínicas libres sc muestran sin carga a pH fisiológico. Sin embargo, pueden actuar como donadores o aceptores de protones a valores de pH dos o más unidades alejados de la neutralidad. Cuadro 35-2. Muchas coenzimas y compuestos análogos d e r i v a n del monofosfatode adenosina
Adenina
Muchas coenzimas son derivados de nucleótidos Numerosas coenzimas incorporan nuclehtidos y también estructuras aniilogas a nucleótidos de purína y pirimidina (cuadro 35-2 y capítulo 8).
Los nucleótidos son ácidos polifuncionalec Los pK de los grupos fosfato primarios (pK alrededor de 1.O)y los de gmpos fosfato secundarios (pK alrede-
p . -
-.
-
.
A
- 7---
p .
-- -.--.
-
h -
Adenilntos de ami- 1 nohcido--
--
Sulfato actn
-
3' -
m
iclico
N
-
N FAU COA-SH Figura 35-16. Estructura del Y,8-monofosfato de guanasina clcliw (GMPcidico; cGMP).
Remplaza al ,,u,u ,,;fa,,. R e< un derivado de la vit~minaB
Los nucleótidos absorben luz ultravioleta Las dobles ligaduras conjugadas de las bases heterocíclicas de purinas y pirimidinas garantizan que los nucleósidos, nucleotidos y polinucleírtidos absorban la luz ultravioleta. Sus espectros dependen del pH, dado que la protonación y desprotonacibn afectan la distribucihn de la carga. No obstante, a pW 7 todos los nucletitidos comunes absorben Ea luz a una longitud de onda priixima a los 260 nm. Por tanto, las concentraciones de nucleótidos y ácidos nucleicos con frecuencia se expresan en terminos de "DO a 260 nm". Los nucle6tidos muestran espectros diferentes de acuerdo a las variaciones del pH, de modo que estos espectros dependientes de pH ayudan a la identificación de cada nuclebtido. El hecho de que la luz ultravioleta sea un rnutágeno obedece también a la propiedad de los nucleotidos presentes en el DNA de absorber esa luz.
LOS ANALOGOS DE LOS NUCLE~TIDOSSINTÉTICOS SE UTILIZAN EN QUIMIOTERAPIA Los anhlogos de purinas y pirimidinas sintetizados por medios químicos, sus nucleosidos y nucleótidos, tienen numerosas aplicaciones en la medicina clínica y en la investigación cientifica. El enfoque f a m a cológico utiliza un análogo en el cual se haya alterado ya sea la estructura del nijcleo heterocíclico o la h c c i b n anjcar, de tal manera que se introduzcan efectos tóxicos cuando el análogo sea incorporado a diversos constituyentes celulares especificas. Muchos de estos efectos reflejan uno de dos procesos: 1) inhibición, por el medicamento, de actividades enzimaticas específicas esenciales para la sintesis de ácidos nucleicoc o 2) incorporaci6n de metabolitos del medicamento en los ácidos nucleicos, donde alteran el apareamiento de las bases, esencial para la transmision exacta de la informacion. La famacopea oncolbgica incluye un sinnf~merode anhlogos sintéticos de purinas, pirirnidinas y sus nucleosidos. La mayoria de las aplicaciones se apoyan en la funcidn de los nucledtidos como precursores de acidos nucleicos y en el hecho de que la cblula a punto de dividirse replica su DNA. Algunos ejemplos incluyen a los 5-fluoro o 5-yodo derivados del uracilo o de la desoxiuridina, los cuales sirven como anhlogoc de la tirnina o tirnidina, respectivamente (figura 35-1 8). Tanto la dtioguamina como la 6-mercaptopurina, en donde los grupos tioles sustituyen a radicales oxhidrilos en la posición 6, se utilizan de manera extensa en ~Ilnica.Análogos como 5- o 6-azauridina, 5- o Gazacitidina y 8azaguanina (figura 35-1 9), en los cuales un carbono
del anillo heterocíclico se ha remplazado por un Btomo de nitrógeno, tambidn tienen uso en clinica. El analogo de las purinas 4-hidroxipiramlopirimidina (alopurinol), utilizado en el tratamiento de hiperuricemia y gota. inhibe la biosintesis de novo de las purinas y la actividad de la xantino oxidasa. El nuclebido citarabina (arabinosilcitosina, ara-C) en el cual la arabinosa remplaza a la ribosa, se usa en la quimioterapéutica del cincer y de las infecciones virales (figura 35-20). La azatioprina, que es catabolizada en á-mercaptopurina, es útil en el trasplante de órganos como supresora de los fenómenos que intervienen en el recham inmunitario. Uno de los análogos de nucleósidos con actividades antivirales, la 5-yododesoxiuridina (vCase antes), es eficaz en el tratamiento local de la queratitis herpktica, una infección de la c6rnea causada por herpesvims.
Los análogos no hidrolirables de trifosfato de nucleósido son Útiles en investigación Los anhlogos no hidrolizables sintkticos de trifosfatos de nucleósidos proporcionan herramientas valiosas en la investigacion médica. Estos anhlogos de nuclebtido (figura 35-2 F ) permiten a los inveszigadores determinar si los efectos de los di o trifosfatos de nucleésidos requieren hidrblisis o si sus acciones son mediadas por ocupacibn de sitios específicos fijadores de nucleótidos en enzimas o proteínas reguladoras.
Flgura 35-18. Anhlogos de pirimidinas y purinas sint&tlcos.
438
Bioquímica de Harper
fCapítulln 35)
Figura 35-1 9. 6-Azauridina (izquierda) y bazaguanina (derecha).
El 5'-fosfato mterifi~adode un nucleátido puede esterificar un segundo grupo funcional alcohol ( - O H ) , formando un diéster. Lo mas común es que este segundo grupo -0H reside en la pentosa de un polinucleotido. Por ejemplo, en el nucleótido cíclico cAMP, tiene una esterificacihn dable al 5 ' 4 y~el 3 ' 4 de ~ Ea misma porción de n-ribosa. De manera alterna y más común, el segundo grupo 4 H pertenece a la pentosa de un segundo polinucleotido. El resultado es un dinuclebtido donde las fracciones pentosas estln unidas por un enlace 3 I t 5 ' fosfodikster. El enlace 3'+5' forma e[ "esqueleto" de polinucle6tidos como RNA y DNA.
K,, favorece la hidrolisis de los fesfodiésteres Aunque es posible representar la formación de un nucleótido come la eliminacihn de agua entre un par de mon0meros, en un medio acuoso K,, favorece la hidrblisis del fosfodikster. Este hecho podria sugerir que el enlace fosfodiéster tiene una estabilidad insuficiente para persistir en las cWulas por periodos prolongados; la realidad es lo contrario. Debido a la alta barrera energética de la reaccibn hidrolítica, en ausencia de catálisis por las enzimas conocidas como fosfodiesterasas, la hidrólisis es un proceso extremadamente lento. En consecuencia, el DNA persiste por periodos
Trifosfato de nucle68ido precursor
Arabinosil
cfiocina
Derivado p.pimino
H
Azatioprina
Figura 35-20. 4-Hidroxipirazolopirimidina (alopurinol), de arabinosil citosina (citarabina) y de la azatioprina.
Flgura 35-21. Derivados sintéticos de los trifosfatos de nuclebsido que no tienen la propiedad da experimentar liberaubn hidmlítica del grupo fosfato terminal. (B, una base purina o pirrrnidtna, R, ribosa o desoxirrtbosa.) Se muestran el trifosfato de nuclebsido precursor (hidrolizable) (arriba) y los derivados no hidrolizables p, y-metileno (centro) y p, y-imino (abajo).
considerables e incluso se ha detectada en fósiles. Sin embargo, en presencia de catalizadores, la hidrblisis de los enlaces fosfodiesteres es ritpida, es decir, cuando los hcidos nucleicos son digeridos.
Los polinucleótidos son macromoléculas direccionadas Dado que el enlace fosfodiester une los carbonos 3' y 5' de monómeros adyacentes, cada extremo de un polímero es distinto. Por tanto, es posible referirse al "extremo 5"' o al "extremo 3'" de los polinucle6tidos. Por ejemplo, el extremo 5' es el lado con un oxhidrilo 5' libre o fosforilado.
Los polinucleótidos tienen estructura primaria El carácter individual de los potinucleiitidos deriva de la secuencia de sus bases constituyentes, es decir, de su estructura primaria. Hay varias formas de representarla. En los siguientes ejemplos, P o p representan el enlace fosfodiéster, las bases se simbolizan con letras simples y las pentocas con una linea vertical. Donde todos los enlaces fosfodiéster son 5' +3', es posible utilizar una notacibn más compacta:
La representación anterior implica que el oxhidrilo 5' estii fosforilado y el oxhidrilo 3' no tiene sustituyentes, es decir no está derivado. En la representacibn mas compacta, que s610 muestra la secuencia de bases, el extremo 5' se coloca a la izquierda y el extremo 3' a la derecha: CGATCA
--
RESUMEN Los grupos m i n o y 0x0 de pusinas, pirimidinas y sus derivados existen como pares tautoméricos amino e irnino (-NHiI=NHI o ceto y en01 (4H2-CHOICH=CH-OH). En condiciones fisi~lógicas.predominan los tautrimeros amino y 0x0. Igual que sus derivados nucleotidos, las purinas y pirimidinas desempeilan diversas funciones rnetabiilicas. Los acidos nucleicos contienen, ademhs de las purinas adenina (A) y guanina (G) y las pirimidinas citosina (C), tirnina (T) y uracilo (U), pequeñas cantidades de derivados como 5-rnetilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, seudouridina ( y ~ o) diversas bases N-metiladas. Los nucleósidos contienen un monosackido, con frecuencia Bribosa o 2-dexosi-~ribosa,unido a N- l (pirimidinas) o N-9 (purinas) por un enlace beta glucocidica cuyos conformadorec syn predominan. Los nucleótidos son &eres fosforados de nucleósidos. En los mononucleritidos, un solo .-OH de un anicar es esterificado por un fosfato. Cuando se nombra a los rnononucleotidos, un signo prime localiza al fosfato (3'-AMP, 5'-GMP), aunque de manera tipica 5' sueEe omitirse. La esterificación por el mismo fosfato de un segundo -OH del mismo azúcar forma 10s fosfodiesteres cíclicos cAMP y cGMP, que actúan como "segundos mensajeros" intracelulares. Los fosfatos adicionales, unidos al primero por enlaces anhidrido de hcido fotma di y trifosfatos de nuclebsidos. Los segundos y terceros fosfatos de los trifosfatos de nuclebsido tiene un elevado potencial de transfesencia de grupo y participan en la sintesis de enlaces covalentes. Los mononucle6tidos unidos por enlaces fosfodiéster 3' 4 5' forman polinuclebtidos, que son macromoleculas con dirección y extremos 3' y 5' distintos. En ausencia de fosfodiesterasas, que catalizan su hidróljsis, los enlaces fosfodikster son estables. La secuencia de bases de los polinucleotjdos constituye su estructura primaria. Para las notaciones pTpGpTp oTGCATCA,el extremo 5'q t p a r e c e a la izquierda y todos los enlaces fosfodiesteres son 3' + 5'. Varios anilogos sintkticos de las bases purinas y pirimidinas y de sus derivados se usan en quimioterapia como medicamentos anticancerosos. E
-
REFERENCIAS Adams RLP, Knowler JT,Leader DP: The Biochemisiry of the 12'ucieic Acids, 10th ed. Chapman & Hall, 1986. Blackburn GM, Gait M3: :Vucleic Acids in Chemistv 13
Biolrily. TRL Press, 1990.
Bugg CE,Carson WM,Montgornery JA: Dmgs by design. Sci Arn 1992;269.92. Saenger W: Principlcs ofLVucleicAcidStrniclure. SpringerVerlag, 1984.
WetaboIismo de nuclleótidos de purina y pirirnidina -. .-
Victor W, Rodweli, PhD
Este capitulo estudia la digestión, la biosintesis y el catabolismo de nucleótidos de purinas y pirimidinas y las enfermedades escogidas que se relacionan con defectos geneticos de estos procesos.
IMPORTANCIA BIUMÉDICA Aun cuando los humanos consumen una dieta rica en nucleoproteinas, las bases purina y pisimidina dieteticas, no se incorporan a los hcidos nucfeicos tisulares. Los seres humanos biosintetizan las purinas y pirimidinas de los acidos nucleicos tisulares, ATP, NAD ', coenzima A. etcétera a tiartir de intermedios anfibblicos. Sin embargo, aná¡ogos de purina o pirirnidina incluso f h a c o s potencialmente anticancerosos inyectados pueden ser incorporados al DNA. I,a biosintesís de purina y pirimidinas oxi y desoxirribonucleótidos (NTF y dNTP) son fenbmenos regulados con precisibn coordinados mediante mecanismos de retroalimentaci6n que aseguran Ia prciduccion de estos compuestos en cantidades y tiempos apropiados para la variable demanda fisiológica (por ejemplo. la divisi611 celular). Las enfermedades humanas que se deben a las anormalidades en el metabolismo de purinas y pirimidinas incluyen gota, síndrome de Lesch-Nyhan, deficiencia de adenosindesaminasa y deficiencia de purinucleosidofosforilasa. Las enfermedades de la biosintesis de pirimidinas, aunque mas raras, incluyen acidurias oroticas. Dado aue. al contrario de los uratos. los productos del catabolismo de pirirnidinas son muy solubles (bióxido de carbono, arnoniaco y beta-aminoisobutirato), hay menos trastornos importantes en clínica en este proceso. 1
,
LAS PURINAS Y PlRIMlDlNAS SON NO ESENCIALES EN LA ALIMENTACIÓNHUMANA Aunque los humanos ingieren en Gi dieta acidos nucleicoc y nucleótidos, la supervivencia n o depende de su absorción y utilización. El ser humano y la mayor parte de los animales pueden sintetizar graiides cantidades de nucleótidos de punna y pirimidina de nuvo (es decir, a partir de intermedios anfibólicos).
Los ácidos nucleicos ingeridos se degradan a purinas y pirimidinas Los dcidos nucleicos liberados en el intestino de nucleoproteinas ingerida se degradan a rnononucleótidos por ribonucleasas, desoxirribonucleasas y polinucleotidasas. Las nucteotidasac y fosfatasas hidrolizan los mononucleótidos a nucleósidos, que se absorben o experimentan degradacion adicional por la fosforilasa intestinal a bases purinicas y pirimidínicas. Las bases purinicas se oxidan a acido úrico, que puede absorberse y mas adelante excretarse en la orina. En tanto que una cantidad escasa, o ninguna, de purina o pirimidina provenientes de la dieta, se incorpora a hcidos nucleicos tisulares, los compuestos que se administran por vía parenteral si se incorporan. En consecuenci& la incorporacion directa de [3ET]-tirnidina inyectada es una técnica de uso extenso para medir la velocidad de síntesis de DNA tanto in vivo como in vitro
432
(Capitulo 36j
Bioquim~cade Harper
BIOS~NTESISDE Nuc LEÓTIDOS DE PURlNA
Con la excepción de los protozoarios parhitos todos los tipos de vida sintetizan nucleótidos de purina y pirimidina. Lasíntesis a partir de intermedios anfi bólicos procede a velocidades controladas apropiadas para todas las funciones celulares. Toda vez que la demanda de nuclelitidos de trifosfato puede variar -por ejemplo, durante el crecimiento, o cuando los tejidos se regeneran y las celulas están por dividirse- las velocidades de síntesis de purina y pirimidina estan sujetas a mecanismos intracelulares que perciben y regulan de manera eficaz el tamaiio de las reservas de estos intermedios de la síntesis de ácido nucleico. La comprensidn de las vias biosintéticas de la sintesis de nucleótidos y su regulación en seres humanos se bosqueja con base en investigaciones del mismo proceso en aves y en Escherichia coli. En los animales uricotélicos (aves, anfibios y reptiles) los nucledtidos tienen la funcion adicional de ser precursores del hcido purinúrico, el cual es el producto final del catabolismo del nitrógeno proteínico (capitulo 3 1). La excrecibn por las aves de grandes cantidades de Qcido úrico fue explorada en estudios recientes de la síntesis de la purina. La alimentacibn de pichones con precursores isotópicos estableció la fuente de cada 6tomo de la base de purina (figura 36-1) e inici6 el estudio de las reacciones e intermedios de la biosíntesis de la purina. En fecha mas reciente las aves se utilizaron de nuevo para donar genes que codifican enzimas de la biocintesis de la purina y de las proteínas reguladoras que controlan la velocidad de la biosíntesis de la purina. Los tres procesos que contribuyen a la biosíntesis de nucleotidos de purina son, en orden decreciente de
COZ respiratorio Aspartato
hidrofolato
1
Giicina
J
v
Amida de la glutamina
Figura 38-1. Las fuentes de los átomos de nttrbgeno y carbono del anillo purínim. Los Atamos 4, 5 y 7 (sombreadus) derivan de gliuna
importancia: 1) síntesis de intermedios anfibólicos (síntesis de novo), 2) fosforribosilaciOn de pilrinas y 3 ) fosforilacion de los nuclehsidos formados.
EL MONOFOSFATO DE INOSINA (IMP) SE ORIGINA A PARTIR DE INTERMEDIOS ANFIBOLICOS El monafosfato de inosina (IMP) es el nucleótido "progenitor" del cual se forman tanto el AMP como el GMP. La síntesis del IMP se inicia con el intermedio anfibólico alfa-D-ribosa-5-fasfato e implica una secuencia lineal de 1 1 reacciones (figura 36-2). A continuacibn la vía se ramifica, una rama lleva del IMP al AMP y la otra del IMP al GMP (figum 36-31, Los números arabigos de los plrrafos que siguen de inmediato, corresponden a las reacciones numeradas de las figuras 36-2 y 36-3 y los números romanos indican las estructuras en 1~ figura 36-2, 1) Ademhs de ser el primer intermedio que se forma en la vía de novo de la biosintesis dc la purlna, el 5-fosforri bosil-l -pirofosfato (PRPP}(11) es un intermedio en la via de recuperacibn de la purina, en la biosíntesis de NAD' y NADP', y en la biosintesis de nucleótidos de pirimidina. La sintesis de PRPP implica la transferencia de pírofosfato del ATP al carbono 1 del alfa-D-ribosa-5-fosfato (1) la cual se cataliza por PRPP sintetasa. 2) La sintesis de un enlace N-glucocídico utiliza la gIutamina como donador de nitriigeno y forma la 5fosfo-beta-n-ribosilamina(111). La reacción de la 5'-fosforibosilglicinamida sintetasa invierte la configuracibn en el carbono anomtrico del anícar de alfa a beta. La reacción favorece en gran medida la liberación concomitante de pirofosfato y su hidrólisis subsecuente a ortofosfato inorghnico catalizada por pirofosfatasa. 3) La condensación de la 5-fosfo-beta-D-ribosilamina (111) con la glicina forma el glicinamida ribosil-5fosfato (IV). En esta reaccion la glicina aporta lo que serán los carbonos 4 y 5 y el nitrógeno 7 del IMP. 4) El carbono 8 del IMP proviene del grupo formilo del N 5 ,N E0-rnetenil-tetrahidrofolato(V), una reaccibn catalizada por la glicinamida ribosil-5-fosfatofomil transferasa. S) La ú-ansferancia a (V) de la nitrógeno amida de la glutamina forma el formilglicinamidina ribosil-5fosfato (VI). Catalizada por la fomilglicinamida ribosil-5-fosfato cintetasa, esta reaccibn agrega el átomo que sera el nitsogeno 3 del IMP. 6 ) En la reaccibn catalizada por la aminoimidazol ribosil-5-fosfato sintetasa, Ia pdrdida de agua con-
Metaholisrno de nucleúiidos de purina y pirimidina
t
1
=/%-e 5 /
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o= 0 f
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Eo
433
H2
1
+
#
GTP.
I
I
R-5-63
A-5-@
Monofosfato de inosina
Adenii$uccinato [AMPS)
O
Glutamina
Glutarnato
I
R-5-@
Monofostato de adenosina (AMP)
O
ATP H
I
I
A-,-@
A-5-@ Monofosfato de xantosina (XMP)
Monofosfatode guanosina (GMP)
Flgura 36-3. Cenversibn del IMP en AMP y GMP.
comitante con el cierre del anillo forma e[ aminoimidazol ribosil-5-fosfato (VII). El evento inicial es la transferencia de fosforilo desde el ATP a la función 0x0 de (VI). El ataque neofilico subsecuente por eI nitrogeno adyacente resulta en el cierre del anillo y liberacibn de ortofosfato inorgánico. 7) La adicibn de Coza (VII) agrega el átomo que serli el carbono 6 del IMP. La reaccibn, catalizada por la aminoimidazol ribosi t-S-fosfato carboxilasa. n o requiere ATP ni biotina y forma el aminoimidazot carboxilato ribosil-5-fosfato (VIrI). 8) La condensación de aspartato con (Vltl), catalizada por la succinilcarboxamida ribosil-5-fosfato sintetasa, forma el aminoimidazol succinil carboxamida ribosil-5-fosfato (1x1. 9) La liberación de[ grupo succinilo de (IX) como fumarato, catar izada por la adenosilsuccinasa, forma el aminoimidazol carboxamida ribosil-5-fosfato (X).Obskrvese que las reacciones 8 y 9, las cuales agregan el nitrógeno que sera el I dej JMP, igualan las dos reacciones del ciclo de la urea que convierten la omitina en arginina (figura 3 1-1 4). 1U)El carbono 2 del IMP se agrega en una reaccibn que implica un segundo derivado del tetrahidrofolato y una segunda forrniltrancferasa. La transferencia
a (X) del grupo formilo del h"'fonni~-tetrahidrofolato forma el formímidoimidazol carboxamida ribosil-5-fosfato (XI). EI)EI cierre de! aniIlo de (XI) que se cataliza por Ia IMP cicEohidro1as.a forma el primer nuclebtido de la purina, esto es, el monofosfato de inosina o IMP (XII). Conversihn del IMP a A M P y GMP: Despu&sde la sintesis de IMP, la vía se ramifica y dos cortas reacciones en secuencia llevan a la formación de AMP y GMP (figura 36-3). W L a adicibn de aspartato a IMP forma adenilsuccinato. Aunque esta reacción, catalizada por adenilosuccinato sintasa, semeja de manera superfícial la reaccihn 8, requiere GTP específicamente, exigencia que proporciona un lugar potencial para reguIaci6n de la síntesis de nucleotidos de adenina. 13)La liberación de fumarato forma 5'-monofosfato de adenocina (AMP). Esta reacci6n es catalizada por adenosilosuccinasa, la misma enzima que cataliza la reacción 9. 14)La oxidacihn de IM P por N ADL, catalimda por IMP deshidrogenasa, forma monofosfato de xantosina (XMP, del ingles, xarrthusine mnnophosphute). 15)La transaminación por el nitrógeno amidico de gluíamina procede por analogía a la reacción 5.
lWetaholismo de nuclehtidos de purina y pirirnidina
LA TRANSFERENCIA DE FOSFORILO DESDE EL ATP CONVIERTE MONONUCLEÓTIDOS EN NUCLEÓSIDOS DE DI Y TRIFOSFATO Los mononucleótidos AMP y GMP se convierten a sus nuclebsidos de difosfato (ADP y GDP)por la via de la transferencia de fosforilo desde el ATP catalizada por la nucleósido rnonofosfato cinasa. Entonces el GDP se convierte en GTP por la nucleiisido difosfato cinasa a expensas de otro ATP (figura 364). La conversión del ADP en ATP se alcanra principalmente por fosforilación oxidativa y de manera secundaria por reacciones de gluciilisis en el ciclo de1 Bcido cítrico.
En la biosíntesis de nucleótidos de purina participan catalizadores mutifuncionales En procariotes, cada reacci6n de la figura 36-2 se cataliza por un polipéptido diferente. Sin embargo, en eucariotes, la fusibn de genes ha conducido a la evolucihn de pol ipéptidos unicos con funciones cataliticas multiples. En la biosintesis de purina intervienen tres catalizadores multifuncionales, para las reacciones 3, 4 y 6, las reacciones 7 y X y las reacciones 10 y 11, respectivamente. La multifuncionalidad confiere varias ventajas. Lw sitios cataliticos adyacentes facilitan la transferencia rápida y completa de intermedios y la fusibn de genes asegura una producción igual de actividades catalíticas diferentes.
Los barmacos antifolato o análogas de glutamina bloquean la biosintesis de nucleótidos de purina Los dos carbonos insertados en las reacciones 4 y 10 (figura 36-2) proceden de M,Nlu-metenil y N''-formil-tetrahidrofolato. Inhiben la formación de los compuestos de tetrahidrofolato y así es posible bloquear la síntesis de purina. t o s análogos inhibidores de glutamina y las reacciones que estos inhiben incluyen: azaserina (reacción 5), diazanorleucina (reaccion 2), 6-mercaptopurina (reacciones 13 y 14) y ácido micofen6lico (reaccihn 14).
435
La deficiencia de purina es rara
en los seres humanos Los estados de deficiencia de purina en los seres humanos se debe principalmente a carencia de ácido fólico y ocasionalmente a deficiencia en la vitamina B I 2cuando esto resulta en una deficiencia secundaria de derivados del folato.
LAS REACCIONES DE "SALVAMENTO" CONVIERTEN A LAS PURINAS Y SUS NUCLEÓSIDOS EN MONONUCLE~TIDOS La canversion de purinas y nuclebsidos de purina en forma directa a mononucle6tidos por reacciones de "salvamento" requiere mucho menos energía que la sintesis de novo. Cuantitativamente, el mecanismo mas importante involucra al fosforribosllación de una purina libre (Pu) por PRPP, que forma un 5'-mononucleótido (Pu-RP).
La fosforilacilin de purina que depende de PRPP se cataliza por la adenina fosforribosiltransfmsa (convierte la adenina a AMP; figura 36-51 e hipoxantinaguanina fosforribosiItransferasa (transforma la hipoxantina o guanina a IMP o GMP; figura 366). U n segundo mecanismo de salvamento comprende fosforilación directa de un ribonucleósido de purina (PuR) por ATP: PuR + ATP + PuR-P
+ ADP
La adenosina cinasa cataliza la fosforilacibn de adenosina o desoxiadenosina a AMP o M M P , en tanto que desoxicitidina cinasa fosforila desoxicitidina, a dCMP, desoxidadenosina y 2'-de~oxi~uanosina dAMP y dGMP, respectivamente.
y"'
PRPP
PP,
IH7
H
AOENlNA FOSFORRfBOSll TRANSFERASA ATP
Nuclebsidode
1
1
ATP _ ~ u c m i d ode \
ADP
\9
rnonofosfato CINASA
difosfato , ,
ADP
j*
(CINASA]
~ucletisidode tnfosfato
Figura 3 6 4 . Convercibn de los monofosfatosde nuclebsido en difosfatos y trifosfatos de nucleósido.
I
HO
I
HO
AMP
Figura 364. Fosforribosilacibn de la adenina catarizada por la adenina fosforribosiltransferasa.
(Capitulo 36)
PRPP
1
H
Hipoxantina
La retroalimentación con AMP y GMP regula a PRPP glutamilamidotransferasa
IMP
I
nucleósidos de purina es [a concentración de PRPP, un parámetro que refleja las velocidades relativas de síntesis, utilización y degradacion de PRPP. La velocidad de sintesis de PRPP depende de la disponibilidad de ribosa 5-fosfato y de la actividad de PRPP sintetasa. Esta enzima es sensible a la concentracihn de fosfato y a los ribonucleótidos de purina que actúan coma reguladores alostéricos (figura 36-71,
I
La PRPP glutamilamidotransferasa (reaccibn 2, figura 36-21, [a primera enzima restringida de manera exclusiva a la sintesis de purinas, es sensible a inhibición por retroalimentación con nuclebtidos de purina, en particular AMP y GMP, que la inhiben de manera competitiva con PRPP (figura 36-7). No obstante, es probable que la regulacion de síntesis de purina por la amidotransferasa tenga una importancia fisiol~gica menor que la reguIación de PRPP sintetasa.
HO HO GMP
Figura 364. Fosforribosilacibn de la hipoxantina y la guanina para formar IMP y GMP, respectivamente.Ambas reacciones se catalizan por la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa
Ribosa 5-fosfato + ATP
01 \
PRPP
I
El hígado de los marniferos, sitio principal de sintesis de nucle6tidos de purina, proporciona bases purínicac y sus nucleOsidos para ser rescatados y utilizarse por tejidos incapaces de sintesis propia. Por ejemplo, el tejido cerebral tiene concentración baja de PRPP amidotransferasa y es probable que el enckfalo humano dependa en parte de purinas exágenas. Entrocitos y leucocitos polimorfonucleares no pueden sintetizar 5-fosfomibosilamina y por ende deben utilizar purinas exógenas para formación de nucleótidos de purina. No obstante, los linfocitos perifbricos poseen cierta capacidad para sintetizar purinas de nnovo.
LA BIOS~NTESISHEPATICA DE NUCLEOTIDOS DE PURINA SE REGULA DE MANERA ESTRICTA El volumen de los depósitos de PRPP regula la biosintesis de nucleotidos de purina Debido a que la sintesis de IMP a partir de intermedios anfibolicos consume glicina, glutamina, derivados del THF, aspartato y ATP. Es dc suma importancia que las células regulen la biosíntesis de purina. El principal determinante de la tasa global de sintesis de novo de
ADP
GDP
ATP
GTP
'
Figura 36-7. Control de la velocidad de la slntesis de mvo da nuclebtidas de purinas Las líneas continuas representan el flujo de Compuestos quimims y las de guiones el de inhibiabn de retroalimentacibn (0 ) por productos finales de la via Las rea&nes@ y @ce m l i z a n pw PRPP sintetasa y por PRPP glutamilamidotransferasa (fgura 36-2), respectivamente.
Metabolzsmo de nucl&tidos de purina y pirimidina
La retroalimentación con AMP y GMP regula su formación a partir de IMP Dos mecanismos regulan la conversión de IMP a GMP y AMP (figura 36-8 1. La retroalirnentacibn por AMP regula a adenilosuccinato sintctasa y la retroalimentacion por GMP inhibe la IMP deshidrogenasa. Ademas, la conversion de IMP a adenilosuccinato en camino al AMP requiere GTP y la conversión de xiantinilato (XMP) a GMP requiere ATP. Por tanto, la regulación cruzada enme las vias del metabolismo de IMP sirve para reducir la síntesis de un nucleófido de purina cuando hay deficiencia del otro. El AMP y GMP inhiben también a la enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa(convierte hipoxantina y guanina a IMP y GMP; figura 3 6 4 ) .
Difosfato de
43 7
Difosfato de
ribonucleósido
T~irredoxina reducida
Tirredoxina oxidada
NADP'
NADPH + H+
Figura 36-9. Reducubn de los difosfatos de ribonuclebsido a difosfatoc de 2'-desoxirribunuclebsdos.
LA REDUCCION DE NDP FORMA dNDP La reduccibn en el carbono 2' de ribonucleotidos de purina y pirimidina catalizada por el complejo de rihonuclebtida reductasa (figura 36-9) forma el difosfato de ri bonucleósido (dNDP). Este sistema es activo sólo en células que sintetizan DNA con rapidez en preparacibn a la divisidn celular. La reducciiin requiere tiorredoxina (un cofactor proteínico), tiorredoxina reductasa (una flavoproteina} y NADPH (y en ciertas bacterias, aunque no en mamíferos, la cobalamina o vitamina B12).La tiorredoxina reducida, que se forma de tiorredoxina oxidada por cathlisic con NADPH:tiorredoxina reductasa, es el reactante inmediato del NDP (figura 36-91,
La reduccidn de difosfatos de ribonucleiisido (NDP) a difosfatos de desoxinihnucle6sido (dNI3P)esta sujeta a una regulación compleja (figura 36-1 O}, que logra una producción equilibrada de desoxirribonucleótidos para síntesis de DNA.
CDP
.);
+
+
,
2'dCDP-
2'dCTP
u@qJ I
I
I
l 1 1 : I
l
I I i 1
f
I I (
l
L.--+--
I \
'----AMP
l
/': r
II
11 II (1 l 1 I II
ATP
I I
I I
I I
\
I
l
I
I I l\-
1
GMP----
+ ADP
t
ATP------'
GDP
.' '-- 4 I
GTP
Figura 36-8.La regulacibn de la interconversion del IMP en nuclebtidos de adenosina y nuclebtidos de guanosina. Las lineac continuas representan el flujo de compuestos químiw c y las de guiones la regulacidn por retroalimentacióntanto positiva (@) corno negativa
(O)
Figura 36-10. Regulación de la reducción de los ribonuclebtidos purínicos y pirimidinicos a sus respectivos 2'desoxirribonucleót:dos Las IFneas continuas representan el flujo de compuestos quimiws y las de guiones la regulacibn por retroalimentación negatwa o positiva (O).
(a)
438
Bioquímica de Hurpcr
La biosintesis de nucleósidos pirimidínicos y purinicos abarca varios precursores comunes: PRPP, glutamina, Coz,aspartato y para nucleótidos de timidina, derivados tetrahidrofolatos. Sin embargo, en tanto que el fosfatode ribosaesun reactante temprano en lasintesis de nuclebtidos de purina (figura 36-2), Ia unión de la fraccihn de fosfato de ribosa a N-3 de la base pirimidinica ocurre mucho después que en la biosintesis de la purina (figura 36-1 1). 1) La sintesis del anillo de: pirimidina comienza con la forrnacion de fosfato de carbamoil a partir de glutamina, ATP y COZen una reacción catalizada por carbamoil fosfato sintasa 11 citas6lica, una enzima diferente a la enzima mitocondrial carbamoil fosfato sintasa funcional en la síntesis de urea (figura 3 1-1 4). Esta compartirnentalizacibn asegura suministros independientes de carbamoil fosfato para estos procesos. 2) La condensacibn de fosfato de carbamoil con aspartato forma carbamoii aspartato en una reacción catabolizada por aspartato h-anscarbamoilasa. 3) El cierre del anillo con perdida de agua, catalizado por dihidroorotasa, forma ácido dihidroorótico. 4) La sustracción de hidrógenos de los carbonos 5 y 6 por NAD' introduce una doble ligadura y forma ácido orhtico. Esta reaccibn la cataliza dihidroorotato deshidrogenasa, una enzima rnitocondrial. Las demris enzimas de la sintcsis de pirirnidinas son citosblicas. S} La adicion de fosfato de ribosa, derivado de PRPP, forma el monofosfato de orotidina (OMP) es catalin d a por orotato fosfombosiltmnsferasa.La fomacibn de en taces beta-N-glucosídicos de esta manera es aniilogo a las reacciones de transribosilación de la figura 3 6 4 . Solamente la penúltima reacción de la sintesis de UMP en el anillo de pirirnidina fosforribosilado. 6) La descarboxilacibn de Orotidilato forma monofosfato de uridina (UMP), primer ribonuclebtido de pirimidina verdadero. 7 y 8) La transferencia de fesfato desde ATP produce UDP y UTP en reacciones análogas a la fosforilacihn de monofosfatos de nucleósidos de purina (figura 36-4). 9) El UTP es aminado a CTP por glutamina y ATP. 10)La reducción de difosfatos de ribonucleótidos WDP) a sus dNDP correspondientes se produce por reacciones análogas a los nuclebtidos de purina (figuras 36-9 y 36-1 0).
1I)El dUMP puede aceptar un fosfato del ATP y formar dUTP (que no se muestra). En forma altema, y dado que el sustrato para sintetizar TMP es dUMP, dUDP se desfosforila a dUMPi 12)La metilacibn de dUMP en C-5 por ~ - , ~ ' " - m c t i len-tetrahidrofolato, catalizada por timidilato sintetasa, forma rnonofosfato de tirnidina (TM P).
Proteínas multifuncionales catalízan las reacciones tempranas de la biosíntesis de novo de pirimidina En el humano y otros animales, cinco de las primeras seis enzimas de la biosintesis de la pirimidina se organizan m& bien como poliptptidos funcionales que como enzimas distintas. La única excepción es la dihidroorotato deshidrogenasa (reacción 4). Un solo gen codifica CAD, un polipéptido de 220 KDa que contiene las tres primeras enzimas; carbamoil fosfato sintasa (CPS), asparatato transcarbamoilasa (ATS) y dihidroorotasa (DHO). Esta enzima multifactorial, denominada CAD (por CPS, ATC, DHO), consiste de tres dominios cataliticos diferentes dispuestos en orden NH2-DHO-CPS-ACT-COOI-1. La estrecha relación de estas actividades asegura que se canalice casi todo el carbamoil fosfato producido por ATC, que se denomina ATC-11 para distinguirlo de ATC-1 funcional en la bioslntesis de urea (capitulo 3), hacia la biosintesis de pirimidina. La UMP sintasa, una proteína bifuncional anhloga, contiene las actividades para orotato fosforribosiltransferasa (reacción 5) y orotidina 5'-monofosfato descarboxilasa (reacción 6).
SE RESCATAN LOS RIBO Y DZSOXIRRIBONUCLE~SIDOS DE URACILO Y CITOSINA Aunque las cklulas de marniferos carecen de medios eficientes para rescatar bases pirimidinicas libres, las reacciones de salvamento convierten [osribonuclebsidos pirimidinicos (uridína y citidina) y los dos desoxirribonucle6sidos (timidina y desoxicitidina) a sus nucleotidos respectivos (figura 36-1 2). La 2'-desoxicitidina se fosforila por desoxicitidina cinasa, enzima que también fosforila a desoxiguanosina y desoxiadenosina. Orotato fosforribosi ltransferasa (reacción 5, figura 36-1 l), una enzima de la sintesis de nucleótidos de pirimidina, puede rescatar ácido orotico y transformarte a OMP.
Metabolismo de nuclebtido.~de purinu y pirimidina.--* 439 - --.
COZ+ Glutamina + ATP
O
O
O
H
TRANSCAR-
HN'
I
Acido aspartico
H - -
Acido asphrtico de carbamoil (CAA)
1 DIHIDROOROTATO 1
1 DESHIDROGENASA
-9
PP,
PRPP
"1
A-,-@
1
R-5-@
UMP
TRANSFERASA
1
OMP
NADPH + Ht
NADPt
-
UDP
dWDP (1 Difosfato desoxiurtdina
RIBONUCLE6SIDO
A,
4 UTP
~ ~ , ~ ' ~ - r n e t i Wl eP n folato o
H2 folato
I
R-s-@-@-@ CTP
C ' H,
1 d~-5-@
TMP
Flgura 36-11. Vía biosint&ticapara los nuclebtidoc de pirimidina.
I
,,
05c,N/c~
conFosfato de carbamoil (CAP)
!
coo-
~ c i d odihidroor4tico (DHOA)
340
Bioquirn ica de Harper
ATP
Citidina
(Cupih~lo36)
ADP
REGULACIÓN DE LA B I O S ~ T E S I S DE LOS NUCLEÓTIDOS DE RlRlMlDlNA
d 1
AOP
\
f
ATP
Desoxicitidina
\
ATP
cMp
ADP
Tanto la expresión del gen y la actividad enzlmatica están reguladas Las dos primeras enzimas de esta biosintesis son sensibles a regulacibn alostérica. Respecto a la regulación de la expresión genética, las tres primeras y las dos ultimas enzimas de la via se regulan aparentemente por represibn y desrepresidn coordinadas. CarbamoiE fosfato sintasa 11 (reaccibn 1, figura 36-1 1) se inhibe en presencia de UTP y nucleótidos de purina, pero se activa por PRPP (figura 36-1 3). La aspartato tmnscahmoilasa (reacción 2, figura 36-1 1) se inhibe por CTP y activa por ATP, un ejemplo clasico de alosterismo.
dCMP
DEWXiClTIDlNA C1NAW
Figura 36-1 2. Las reacciones de la nuclebsidode pirimidina Unasa responsables de la fomlacibn de los respectivos rnonofosfatos de nucleósidos pirimidínicos.
El metotrexato, bloquea la reducción del dihidrofolato
,: ---1 ,
I
':
,
)-,
La reacción 12 de la figura 36-1 1 es la unica de la biosintesic de nucleotidos de pirimidina que requiere un tetrahidrofolato. Durante el proceso de transfetencia, el grupo metileno de fl,N1tmetilen-tetsahidrofolato se reduce a un grupo metilo y el transportador tetrahidrofolato se oxida a dihidrofolato. Para que la síntesis continúe, el dihidrofolato debe reducirse de nuevo a tetrahidrofolato en una reacción catalizada por dihidrofolato reductasa. En consecuencia, las células en división, que requieren generar TMP y dihidrofolato, son en especial sensibles a los inbibidores de esta enzima. Uno de esos inhibidores es metotrexato, farmaco de uso extenso contra cáncer.
Algunos análogos de pirirnidina son sustratos para las enzimas de la biosíntesis de nucleotidos de pirimidina En tanto que orotato fosforribosil transferasa no puede usar bases pirimidinicas normales como sustratos, cataliza la conversi6n del medicamento alopurinol (4-hidtoxipirazolopiramidína) a un nucleotido en donde el fosfato de ribosilo se adhiere aN-1 del anillo pirimidínico del alopurinol. El fármaco anticáncer 5-fluorouractlo tambidn es fosforribosilado por orotato fosforribosiltrancferasa.
1
ATP + Ribosa 5-fosfato
1
Aspartato I
"
;
I
I
ATP+ COZ + Gtutamina
l I
X
..-------'(L
1
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I I
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OMP
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#
\
\
TDP
\,
-
UMP
i
UDP
# '
~UDP
Flgura 36-13. Control de la síntesis de nucleótidos pirimidíniws Las líneas continuas representanel Rujo de compuestos químtws y las de guiones la regulación por retroalimentacibn posttiva (O)y negativa (0)
MctaAoiismn de nucleóticlos de purina y pirimidina
La biosintesis de nucleétidos de purina y pirimidina son procesos regulados de manera coordinada Mol por mol, la biosintesis de pirimidina va en paralelo con la de purina, sugiriendo la presencia de un control coordinada. La PRPP sintetasa (reaccion 1, figura 36-Z), forma el precursor inicial de los dos procesos, esth sujeta a inhibición por retroalimentación con nucIe6tidos de purina y pirimidina y por activación de PRPP.
EL SER HUMANO CATABOLIZA LAS PURINAS A ÁCIDQ VRICO El ser humano convierte los nucle6sidos de purina, adenosina y guanosina, al producto final excretado, Acido hrico, a travds de los intermedios y reacciones rnastrados en la figura 36-1 4. Primero, la adenosina se desarnina a inosina por la adenosina desaminasa. La fosfor6lisis de los enlaces N-glucosidiws de inosina y guanosina, catalizada por nucleósido de purina fosforilasa, libera ribosa I -fosfato y una base purlnica. A continuacibn, en hipoxantina y guanina forman xantina en reacciones catalizadas por xantina oxidasa y guanasa, respectivamente. Luego, la xantina se oxida a ficido úrico en una cegunda reacción catalizada por xantina oxidasa. Por tanto, la xantina oxidasa proporciona un sitio potencial para intervencion fannacologica en pacientes con hiperuricemia y gota (véase adelante). La excrecihn total de acido úrico total en el ser humano normal promedia 400 a 600 m 0 4 horas. Numerosos compuestos farmacológicos y naturales influyen en la absorcibn y secrecion renal de urato de sodio. Por ejemplo, dosis altas de aspirina inhiben de manera competitiva tanto laexcrecion como laresorci6n de los uratos. En otros marniferos distintos de los primates superiores, la enzima uricasa escinde al acido úrico y forma el producto final muy hidrosoluble, alantoina (figura 36-1 5). No obstante, dado que el ser humano carece de uricasa, el producto final del catabolismo de purinas en trste es hcido urico. Al igual que en el ser humano, los anfibios, aves y reptiles carecen también de uricasa y excretan iicido úrico y guanina como productos finales del catabolismo de las purinas.
Los uratos son más solubles que el ácido urico Igual que con cualquier hcido dkbil, las proporciones relativas de ácido no disociado hcido urico, y su base conjugada urato dependen del pH. Solo el primer protón disociado (pKi = 5.8) necesita considerarse aquí, ya que el pKz para el segundo protbn es 10.3, un
44 1
valor que esta muy por arriba de cualquier liquido fisiologico. Por consiguiente, sblo acido úrico y su sal monosódica se encuentran en líquidos corporales. Los uratos son bastantes más solubles que el Bcido úrico. La orina a pH 5 puede disolver d o alrededor de un décimo de los uratos totales ( 1 5 mg/dL) que se exrretan si la orina tiene pH 7 (1 50 a 200 mg/dL) y por lo común, el pH normal de la orina es 5.8. Los cristales en el sistema urinario son urato sódico en cualquier sitio proximal al lugar de acidificación (en el tubulo distal y los conductos colectores), pero habrh hcido úrico en cualquier sitio dista! a ese lugar. Dado que la mayor parte de cálculos de! sistema colector urinario son de hcido úrico, su fomaci6n puede reducirse por alcalinización de la orina.
LA GOTA ES UN TRASTORNO DEL CATABOLISMO DE PURINAS En la hiperuricemia, la concentración sérica de uratos excede el límite de solubilidad. La cristalización resultante de urato de sodio en tejidos blandos y articulaciones forma los depósitos limados tofos, que causan una reacción inflarnatoria, artritis gotosa aguda, que puede progresar a artritisgotosa cr6nica La visualización en microscopio de luz polarizada de cristales en forma de aguja intensamente birrcfringentes negativos de urato de sodio en líquido articular es diagnóstico de gota. Los cristales se ven amarillos cuando su eje longitudinal es paralelo al plano de luz polarizada y azules cuando es perpendicular.
Los métodos isotópicos miden depósitos miscibles de uratos La dilucibn de ácido urico ["N] administrado intravenosamente puede utilizarse para calcutar el dcp6sito de urato miscible. Este depósito promedió 1200 mg en varones adultos normales y 600 mg en mu.jeres adultas normales; 2000 a4000 mg en pacientes gotosos sin tofos y valores tan elevados como 3 1 000mg en personas con gota tofasa grave.
OTROS TRASTORNOS EN EL CATABOLISMO DE PURINA Aunque los estados de deficiencia de purina son raros en el ser humano se han caracterizado numerosas trastornos genéticos del catabolismo de purinas. El cuadro 36-1 resume los principales sintomas y patrones heredados de varias enfermedades relacionadas con el catabolismo de purinas. Las hiperuricemias pueden diferenciarse con base en la excrecion de canti-
442
Bioqiaim ica de Harper
OH
(Capitulo 36j
OH Adenosina
OH
b'd Guanosina
Rrbosa 1-fosfato
H,O Hipoxantina
fo* H,02 i
0 A N H L N L
t
Xantina
Guanina
Acido brico
Figura 36-14. Fomacidn de ácido úrim a partir de los nuclebsidos de purina por la via de las bases purínicas hipoxantina, xantina y guanina. Los desoxirribonucle~sidosde purina se degradan por la misma via catabdlica y las mrsmas enzimas, todas las cuales existen en la mucosa de las vías gastrointestinalesde los mamíferos
il.letabolisnin de nucieLridos de purina y pirimidina
443
dades nomalec; o excesivas (mis de 600 rngí24 h) de uratos totales (cuadro 36-2). Algunos trastornos retlejan defectns enzimiiticos @specificos. En otros, la hiperuricemia es secundaria a procesos patologicos coma cáncer o psoriasis, que incrementan el recambio tisular.
El síndrome de Lesch-Nyhan El síndrome de Lesch-Nyhan que es una hipemricetiiia por sobreproduccion con litiasis frecuente de ácido úrico y un sindrome raro de autornutilación, se debe a una hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa no funcional, una enzima del salvamento de purinas (figura 364). La elevacidn concomitante del PRPP intracelular, que se economiza de la vla de salvamento, conduce a la sobreproduccibn de purinas. Lñc mutaciones menos nocivas que s61o causan reducciori de la actividad entimática se caracterizan por hiperuricemia grave, pero sin síntomas neurológicos.
Alantoína
Figura 36-15. Conversión del Bcido úrim a alantolna. La reaccibn no ocurre en los seres humanos
.--
Cuadro 36-1. Trastornos hereditarios del metabolismo de las purinas y sus annrmalidades enzimáticas relacionadas --
--
.
Trrstr clíni
. ..--
- -- .-
turalezoi l defecto
Enzima di
ctiva (L da) Rcsistericia a la i
Gota
RPP sintet;
Gota
aricterístil rastorno c
...-
--- -
Patrón hereditario +
hiur-
excrecihn de puirinas
1 K a e s i v o ligado a X -
in e hiper- R
ligado a X
irinas
rsa
Gota
1fosfato
I
Probablemente recesiva irinas 1;+ligado , aX ligado a X in e hiperirinas
excri
Deficienicia parcial
Gota
-
~1
Km baja para ribos
purinac
-
icia com
Deficienicia grave munii
l
xiadenosinuria ciencia de
Deficien
t
mirnit
.
.
-1
nurirL guanositiuria, de soxilyanosinui"ia, hipo uricc:mia
,denina fosforri bosi ansfcrasa
Litiasis 1
icia complt:ta icia compli
Xantinui
* HGPRTasa
co recesivi
>. .+
-
Liíiaisis renal dihiclroxiadenin sis renal pc
1 nipoiuricemia hipoxantin-guaninfosfomibosii-trmsferaca(figura 364i) ,
+
444
(Capítulo 36)
Bioquimica de Harper
Cuadro 36-2. Clasificacibn de los pacientes coni hiperuri cemia . -.
. . - -.. .-
-.
- . -- --
--
--.... ...- p .
- -. e
A
1.
Excrccibn n o m :al de ~rato:trastorno rcnal respoim.. . blc del iirato serico elevado
11.
Excrc:ci6n excesiva dc urato debida a luccibn A. 1Fonsecuti~ 'a a otras enifermedade P~O, . . cancer. psoriasls Defcctus enimhticos conocidos responsables de la sobreproduccihn 1, Anormalidades de la PRPP sintetasa 2. Deficiencias de la hipoxantina-.guaninfos forribosil transferasa 3. Deficiencias de la glucosa-6-f'osfatasa Defectos no reconocidos
Enfermedad de von Gierke En la enfermedad de von Gierke (deficiencia de glucosaGfosfatasa) la sobreproduccibn de purinas y la hiperuricemia son secundarias al incremento en la generación de ribosa 5-fosfato precursor de PRPP. Además, la acidosis lictica concomitante eleva el umbral renal para la secreción de urato, lo que contribuye a la acumulaci6n de urato corporal total.
Hipouricemia Hipouricemia y excreción aumentada de hipoxantina y xantina se observan en deficiencia d e xantina oxidasa, debido a un defecto genetico o a lesién hephtica grave. En deficiencia importante de la enzima, los pacientes pueden mostrar xantinuria y litiasis por xantina.
Deficiencia de adenosina desaminasa y nucleosidos de purina fosforilasa La deficiencia de adenosina desaminasa se acompaRa con inmunodeficiencia combinada grave en donde los linfocito5 derivados del timo (ctlulas T} y linfocitos derivados de mtdula ósea (cklulas B) son escasos y disfuncionales. La deficiencia de nuclebsidos de purina fosforilasa se acornpaíia con una grave deficiencia de linfocitos derivados del timo con funcionamiento aparentemente normal de las células B. Los dos son trastornos recesivos autosomicos. Al parecer, las disfunciones bmunologicas se deben a la acumulaci6n de dGPT y dATP, que inhiben de manera alostérica la ribonucleótido reductasa y por tanto, las celulas se quedan sin precursores de DNA, en particular dCTP.
EL CATABOLICMO DE PlRlMlDlNAS GENERA PRODUCTOS HIDROSOLUBLES En contraaste con los productos apenas solubtes del catabolismo de las purinas, los productos finales del catabolismo de pirimidinas son muy solubles en agua: COZ, NH,, beta-alanina y beta-aminoisobutirato (figura 36-1 6). La excrecion de beta-aminoisobutirato aumenta en leucemia e irradiacidn intensa con rayos X debido a la destmccibn acelerada de DNA. En descendientes heterocigotos de individuos normales, ocurre excrecién anormal alta de beta-aminoisobutisato, rastseable hasta un gen recesivo. Alrededor de 25% de personas estudiadas con ascendientes chinas o japoneses, excretan ,gandes cantidades de beta-aminoisobutirato. Por analogía con otros animales, es probable que el ser humano experimente tmnsaminaci6n de beta-arninoisobutirato, con formación de metilmalonato sernialdehido, que luego forma succinil-COA (figura 2 1-2).
La seudouridina se excreta sin cambio Dado que ninguna enzima humana cataliza la hidriilisis o fosfor6lisis de seudouridina, este nuclebsido poco común, que se identificb primero en la orina humana, se excreta sin cambio por las personas normales.
LA SOBREPRODUCCI~NDE CATABOLITOS DE PlRlMlDlNA RARA VEZ SE ACOMPANA DE ANORMALIDADES CL~NICAS SIGNIFICATIVAS Los productos del catabolisme de pirimidinas, son muy solubles en agua. Por tanto, la sobreproducción de pirimidinas produce muy pocas anormalidades detectables en clinica (cuadro 36-3). En hipemricemia que acompaiia a sobreproducción excesiva de PRPP, lo5 nuclebtidos de pirimidina aumentan y t a m b i h la excrecibn de beta-alanina. Dado que la sintesis de timidilato requiere NSfl'O-metilen-tetrahidrofolato, los trastornos en el metabolismo de folato y vitamina B I conducen ~ a deficiencia de TMP. Es probable que la aciduria orbtica que acompafia al stndrome de Rere sea secundaria a la incapacidad de las mitocondrias muy daiiadas para utilizar fosfato de carbamoil, que luego se vuelve disponible para sobreproducción citosolica de ácido orótico.
Me~aholirrnnde n~icleútidosde purinu y pirimidina
445
Citosina
NADPH + H*
-4
H Uracilo NADPH t M+
NADP+
p-Ureidopropionato (N-carbamoil-p-alanina)
Dihidrouracilo
N
C?z,~~3 IXH
P
H,N+
P-Ueidoisobutirsto (N-carbamoil-p-amrnoi sobutirato)
- CH, - CM, - COO-
CH, COO-
1H~N+ CH? - CH-
COO-
I
Figura 36-16. Catabolisma de las pirimidinas.
La aciduria orótica responde a los nucleósidas de pirirnidina en Da dieta El tino 1 de aciduria or6tica refl eia una deficiencia de oiotato f o s f o i ~ i b o s i l t r a n s f e rorotidilato ~ descarboxilasa (reacciones 5 y 6, figura 36-1 1) y la poco cornUn aciduria or6tica tipo 11 refleja una deficiencia solamente de la orotidilato descarboxilasa (reacci6n 6 , figura36-1 1, ~0~pacientes con tipos 1 o 11 responincremento den a la uridina oral después de un en la actividad de la aspartato transcarbamoi]asa y la dihidroorotasa en pacientes con aciduria ordtica tipo 1se normaliza.
La deficiencia de una enzima del ciclo de la urea se acompaña de excreción de precursores de pirimidina mitocondrial En pacientes con deficiencia de la hephtica ornitina transcarbamoilasa se ha descrito un incremento en la excrecibn de hcido orhtica, uracilo Y uridina. €1 sustrato subutilimdo, fosfato de carbamoil, sale al citosol donde estimula la biosintesis de nuclebtidoc de pirimidina. El resultado es aciduria ordtica leve que aumenta cuando 10s pacientes ingieren alimentos ricos en nitrógeno.
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Rioqzaím ica de Harpw
(Capitulo 36)
Cuadro 36-3. Trastornos hereditarios del metabolismo dr?las pirimidinas y sus anomalidades enzimhticas relacionadas
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Los medicamentos pueden precipitar aciduria orótica El analogo de purina alopurinol (figura 35-20) un sustrato para la orotato de fosforribosiltransferasa (reaccibn 5, figura 36-1 11, compite con la fosforilación por el sustrato natural, ltcido orótico. Ademb, el producto nucleótido resultante inhibe a orotidilato descarboxilasa (reacción 6. figura 36-1 I ) y causa aciduria orbtica y orotidinuria. Dado que ta via para la biosintesis de nucleótidos pirimidínicos se ajusta a esta inhibición, las personas experimentan sólo una deplecion transitoria de estos nucledtidos en las primeras etapas del tratamiento. La dazauridina, después de su conversibn a aazauridilato, inhibe de manera competitiva la orotidilato descarboxilasa (reacción 6, figura 36-1 1) e incmenta bastante la excrecibn de acido or6tico y orotidina,
RESUMEN Las purinas y pirimidinas no son esenciales en la alimentaci~nhumana y la deficiencia de purina es rara en el ser humano. Los Acidos nucleicos provenientes de: la dieta se degradan en las vías gastrointestinales a purinas y pirimidinas. Aunque las reacciones de "salvamento" convierten las purinas y sus ribo y desoxirribonuclebsidos directamente a los mononucleótidos correspondientes, la mayor parte de purinas, pirimidinas corporales y sus derivados se forman por biosintesis a partir de intermedios anfibólicos. La biosíntesis del nucleótido de purina precursor, rnonofosfato de inosina (IMP) se lleva a cabo a través de una secuencia compleja de reacciones, algunas de ellas catalizadas
igado a X
falopatia hephtica y ligera aciduria orotica
por sistemas enzimhticos multifuncionales. Dado que en esta secuencia de reacciones participan derivados folatos y glutamina, los medicamentos antifolatos o los anhlogos de glutarnina inhiben la biosíntesis de purinas. La oxidación y desaminacidn del IMP forma A M P y GMP y latransferencia subsecuente de fosfato desde el ATP forma ADP y GDP. La transferencia subsecuente de fosforilo del ATP a[ GDP forma GTP. El ADP se convierte en ATP por fosforilacibn oxidativa. La biosíntesis hepática de nuclebtidos de purina se regula de manera estricta, en gran parte de acuerdo al tamaao de la reserva de fosforribosil pirofosfato (PRPP) y por inhibición por retroalimentaci6n de la PRPP-glutam i l amidotransferasa por los productos finales, AMP y GMP. La reducción de los NDP forma trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNDP). Aunque en la uridina y citídina, hay rescate de los nucleótidos de pirimidina proceden de manera primaria de biosíntesis a ~artirde intermediarios anfibólicos. El proceso comprende un conjunto complejo de mcciones diferentes a la biosíntesis de purinas, pero una vez que los mononucleótidos se forman las reacciones son semejantes. Ciertos anhlogos de pirimidinas son sustratos para enzimas de la biosintesis de nucletitidos de pirimidina y por ende la inhiben. La regulacion de esta biosintesis se apoya en el control de la exprccidn genética y de la actividad enzimhtica. La regulacibn coordinada de la biosíntesis de nucleótidos de purina y pirirnidina asegura su presencia en proporciones adecuadas para la sintesis de ácidos nucleicos y otras necesidades metabólicas. En tanto que las reacciones e intermedios de la biosintesis de la putina y pirirnidina son las mismas en humanos y en bacterias, las enzimas que catalizan estas reacciones se organizan diferente. En la bacteria cada reacción se cataliza por una proteína diferente.
Metahalismo de nuclehtido.~de purina y pirimidinu
En contraste, algunas enzimas de la biosintesis de novo de la purina y pirimidina en humanos son polipdptidos hultifuncionales que catalizan reacciones contiguas. Las ventajas aparentes de los polipéptidos multifunciona~esincluyen coordinar la expresibn de varias actividades cataliticas y la canalización en secuencia de los productos de una reacción a la siguiente sin disociación desde una enzima. El ser humano cataboliza las purinas a Acido urico (acido debil, pK 5.8) que, dependiendo del pH irinario, se encuentra como hcido relativamente insoluble (en pH acidico) o como su sal urato shdico mas soluble (en pH próximo a la neutralidad). Los cristales de urato son diagnostico de gota, un trastorno metabólico del catabolismo de las purinas. Otros trastornas de este catabolismo san el síndrome de Lesch-Nyhan, enfermedad de von Gierke y las hípouricemias.
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Al contrario de hcido úrico y uratos, productos bastante insolubles del catabolismo de purinac, los productos finales del catabolismo de pirimidinas, COI,NHj y beta-aminoisobutirato, son muy solubles en agua. Sin embargo, la seudouridina se excreta sin cambio. En general, la sobreproducción de catabolitos de pirimidina no se relaciona con anormalidades importantes en clinica. Los pacientes con aciduria or6tica responden a nucleósidos de pirimidina provenientes de la dieta. También ciertos medicarnentos pueden precipitar aciduria orbtica. No obstante, la excrecion de precursores de pirimidina conduce a deficiencia de la enzima del ciclo de la urea ornitina transcarbamoilasa, dado que se dispone del fosfato de carbarnoll economizado para la biosintesis de pirimidina.
REFERENCIAS Benkovic SJ: The transformiilasc ennrnes in de novo purine hiosynthcsis Trcnds Riochem Sci 1584:9:320. Holmgren A : T h i o r e d o x i n . Annu R e v B i o c h e m 1985;54:237. Schinke RT: Methotrexate resistance and gene arnplificat i o n : M e c h a n i s m s a n d implicatlons. Cancer 1986;57:1912.
Scriver CR, et al. (editors): The ,Meiabolic Rasis ofJnherited Disease, 7th ed. McGraiv-1 lill, 1995. Seegmiller JE: Overview ol'the possiblerelation ofdefects ~npurine metabolism to immune defíciency. Ann NY Acad Sci 1985:45:9. Zalkin M, Dixon JE: Denovo purine nuclcotide synthesis. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1992:42:259.
Estructura y función de los ácidos nucleicos Daryl K. Granner, MQ
EL DNA CONTIENE LA INFORMACIÓN GENETICA El descubrimiento de que la infomaci6n genética esta codificada a lo largo de una molkcula polimerica compuesta por sólo cuatro tipos de unidades rnonomericas, es uno de los logros científicos más importantes de este siglo. Esta molécula polirndrica, el DNA, es la base química de la herencia y está organizada en genes, unidades fundamentales de ta infomaci6n genkiica. Los genes controlan la síntesis de varios tipos de RNA, que en su mayor parte están involucrados en la síntesis de proteínas. Las genes no funcionan de manera autónoma; su replicacibn y funcionamiento se ccntrolan por varios productos de gen, a menudo en c o l a b o r a ~ i con ~ n componentes de varias vias de transducción de seiiales. El conocimiento de la estructura y función de los ácidos nucieicos es esencial para comprender la genitica y muchos aspectos de la fisiopatología de la enfermedad, así como los fundamentos genkticos de la enfermedad.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA La base química de la herencia y de las enfermedades genéticas se encuentra en la estructura del DNA. Se ha dilucidado la vía de información bhsica (esto es, el DNA dirige la síntesis del RNA, que a su vez regula la sintesis de proteínas). Este conocimiento se estg usando para definir la fisiologia celular normal y la fisiopatologia de la enfermedad a nivel molecular.
La demostracidn de que el DNA contiene la inforrnaciOn genética se hizo por primera vez en 1944 en una serie de experimentos realizados por Avery, MacLeod y McCarty, quienes mostraron que la deterrninacibn genktica del carhcter (tipo) de la chpsula de un neurnococo especifico podia ser m s m i t i d a a otro neumococo de un tipo capsular diferente introduciendo DNA purificado del primer tipo en el segundo. Estos autores se referlan al agente (despues mostraría ser el DNA) que efectuaba el cambio como el "factor de m s f o m a ción". Subsecuentemente, este tipo de manipulacion genetica se ha hecho común. Recientemente se han realizado experimentos similares utilizando levaduras, d l u l a s de mamíferos cultivadas, embriones de insectos y roedores como receptores y DNA clonado como el donador de la informaci6n gendtica.
El DNA está constituido por cuatro desoxinucleótidos La naturalem química de las unidades desoxinuclebtidas monorntkicacdel DNA 4esoxiadenilmt0, desaxigurinilato, desoxicitidilato y timidilato- se describe en el capitulo 35. Estas unidades monom~ricasdel DNA se conservan en la forma polirnérica por puentes 3 ' 3 ' fosfodiéster constituyendo una sola tira, según se observa en la figura 37-1. El contenido informativo del DNA (el código genético) reside en la secuencia en que se ordenan estos rnoniimeros 4esoxirribonuclebzidos de purina y pirimidina. El polimero según se observa en el esquema posee una polaridad; un
450 Bioquím~cade Hurpr
(Capitulo 37)
Figura 37-1. Segmento de la estructura de la rnokwla de DNA en la cual las bases purinicas y pirtrnidínicas, adenina (A), timina (TI, citosina (C) y guanina (G)se mantienen juntas por un esqueleto fosfodiéster entre ros fragmentos Z'desoxirribosilo adheridos a las nucleobases por un enlace Nglucosldico Nbtese que el esqueleto tiene polaridad (es decir, direccibn) Esto, por lo general, se representa en la orientación 5' a 3'.
extremo tiene terminal 5'-hidroxilo o fosfata, en tanto que el otra tiene a una fiacción 3'-fosfato o hidroxilo. La importancia de esta polaridad se hará evidente en las secciones posteriores. Dado que la informacibn geakica reside en el orden de las unidades rnonomhricas en los polimeros, debe existir un mecanismo para reproducir o replicar esta infamación específica con un elevado grado de fidelidad. Ese requerimiento, junte con los datos de difraccion con rayos X de Ea molécula del DNA y con la observacibn de Chargaff de que en las mol~culasde DNA la concentraci6n de los riucle6tidos de desoxiadenosina (A) es igual a 3a de los nucle6tidos de timidina (T) (A = T), en tanta que la concentracibn de los nucleótidos de desoxiguanosina (G) es igual a la de los nuclebtidos de desoxicitidina (C) (G = C), condujo a Watson, Crick y Wílkins a proponer al principio del decenio de 1950 el modelo de una mo!ecula de doble tira del DNA. El modelo que propusieron se muestra en la figura 37-2. Las dos tiras de esta rnoldcula de doble hélice con giro a la derecha
se mantienen juntas por puentes de hidrdgeno entre las bases purinicas y pirirnidinicas de las respectivas moléculas lineales. La paridad entre los nuclebtidos de las tiras opuestas es sumamente especifico y depende de los enlaces de hidrbgeno de A con T y de C con C (figura 37-3). En la rnolkcuIa de doble tira, las restricciones impuestas por la rotación alrededor del enlace fosfodikster, la configuracibn favorecida anti del enlace glucosidico (figura 35-81 y los tautómeros predominantes (figura 35-3) de las cuatro bases (A, G , T y C), permiten a A parearse sblo con T y a G solo con C segun el dibujo de la figura 37-3. Esta restriccion de pareamiento de bases explica la observación anterior de que en una rnolecula de DNA de doble tira, el contenido de A es igual al de T y el contenido de G es igual al de C. Las dos tiras de la molécula de doble hilice, cada una de las cuales posee una polaridad, son antiparalelas, es decir, una tira corre en direccion 5' a 3' y la otra en direccibn 3' y 5'. Esto es anhlogo a dos
E,~tructura yfiinción de los dcidos nucIeicos 441
Hendidura menor
Adenoslna
Hendidura mayor
Figura 37-2. Diagrama del modelo de Watson y Crick de la estructura helicoidal doble de la forma B del DNA La flecha horizontal indica ia anchura de la doble hélice (2 O nm) y la Recha vertical la distancia ocupada por una vuelta completa de la dobk Wlioe (3 4 nm). Una vuelta del DNA 8 incluye 10 pares de haces Su eje central se indica por un bastón vertical. Las flechas cortas designan la polaridad de las tiras antiparalelas (A, adenina; C, utosrna, G, guanina; T, timina, P, fosfato, S, azúcar [desoxinibosa] )
calles paralelas, cada una con un solo sentido, pero con el movimiento del trlinsito en direcciones opiiestas. En las moléculas de DNA de doble tira, dado que la información genetica reside en la secuencia de nucleótido? de una, la tira codificadnra; la opiiesta se considera la tira na codificadora debido a que es complementaria de la transcripcibn de RNA que codifica proteínas. Las dos tiras, en donde las bases esthn opuestas, se conservan juntas por puentes de hidrbgeno, giran alrededor de un eje central para formar una hélice doble. El DNA de tira doble existe en seis formas por lo menos (A a E y 2). Bajo condiciones fisiol6gicas (escasa sal, grado elevado de hidmtacidn}, la forma B es la habitual. Una vuelta de DNA de la forma B alrededor del eje de la moldcula contiene 10 pares de bases. La longitud de expansibn de ese giro es de 3.4 nm. Su anchura (diámetro helicoidal) es de 2 nm. Según el esquema de la figura 37-3, tres puentes de hidrógeno unen al nucleo~idodesoxiguanosina con el niicleótido desoxicitidina en tanto que el otro par, el A-T, se conserva junto por dos piientes de hidrógeno. Por tanto el enlace G 4 es más fuerte, aproximada-
Figura 5 7 3 . El pareamiento de bases entre desoxiadenocina y timidina implica la formacibn de dos puentes de hidrbgeno. Entre desaxicitidina y desox~guanosinason tres los enlaces. Las líneas punteadas representan los puentes de hdrbgeno.
mente en 50 por ciento. Debido a esta fuerza adicional y también por las interacciones de las columnas, las regiones de DNA ricas en enlaces G 4 son mucho mfis resistentes a la desnaturalizaci6n o "fusihn" que las regiones ricas en A-T.
La desnaturalización (fusión) del DNA se utiliza para analizar su estructura Esta estructura de doble tira puede fundirse en solución incrementando la temperatura o disminuyendo la concentracibn salina. No sblo se separan las dos pilas de bases, sino que las bases mismas pierden su cofocacion en tanto todavía esthn conectadas en el polimero por el esqueleto fosfodiéster. Concomitante con esta desnaturalizacibn de la molécula del DNA, hay un incremento en la absorbancia óptica de las bases purinicas y pirimidinicas, f e n ~ m e n oconocido como hipercromicidad de la desnaturalizacibn. Debido al apilarniento de Ias bases y a los enlaces de hidrhgeno entre las pilas, la moldcula de DNA de doble tira exhibe las propiedades de fibra rigida y, en solución, es un material viscoso que pierde su viscosidad al desnaturalizarse.
Las tiras de una molécula dada de DNA se separan dentro de ciertos límites de temperatura. El punto medio se llama temperatura de fusibn o Tm.La T, se modifica por la composición de bases del DNA y por la concentración salina de la soluciún. El DNA rico en pares G - 4 , que tiene tres puentes de hidrbgeno, se funde a una temperatura superior al que es rico en pares A-T, que tiene dos puentes de hidrbgeno. Un incremento de I O veces en la concentración de un catión monovalente eleva la T, en 16.6 "C. La formamida, de uso común en los experimentos de recombinación de DNA, desestabiliza los enlaces de hidrogeno entre las bases y, por tanto. reduce la Tm.Esto permite separar a las tiras de híbridos de DNA o de DNA-RNA a temperaturas mucho menores y reduce a un minimo la rotura de las tiras que ocurre a altas temperaturas.
estii desenrollado. La energía necesaria para alcanzar este estado está, en cierto sentido, almacenada en los superenrollarnientos. Por tanto, la transici6n a otra forma que requiera energía, se facilita por el desenroIlmíenzo. Una de estas transiciones es la separación de las tiras, el chal es un prerrequisito para la replicacibn y la transcripción del DNA. Así, el DNA superenrollado en una forma preferida en los sistemas biolbgicos. Las enzimas que catalizan los cambios topológicos del DNA se llaman topoisomerasas. Las topoisomerasas pueden extender o insertar superensollamientos. La mejor caracterizada es la girasa bacteriana, que induce superenrollamiento negativo en el DNA utilizando ATP como fuente de energia.
Hay hendiduras en la molécula de DNA
EL DNA PROPORCIONA UNA PLANTILLA PARA REPLICACI~N Y TRANSCRIPCI~N
El examen cuidadoso del modelo dibujado en la figura 37-2 revela una hendidura mayor y una hendidura menor en el enrollamienio de la molécula, paralelo a los esqueletos fosfodiestéricos. En estas hendiduras, las proteínas pueden interactuar de modo específico con los 6tomos expuestos de los nucIeótidos (generalmente por el enlace H) y por tanto reconocer y unirse a las secuencias específicas de nucleótidos sin destruir el pareamiento de bases de la molécula helicoidal doble del DNA. Como se describe en los capítulos 39 y 41, las proteínas reguladoras pueden controlar la expresión de genes específicos por medio de estas interacciones.
El DNA existe en las formas relajada y superenrollada En algunos organismos como bacterias, bacteríófagos y numerosos virus animales que contienen DNA, los extremos de las rnolécuias de DNA se unen para crear un circulo cerrado sin termino. Esto por supuesto no destruye la polaridad de las moléculas, pero elimina todos los grupos libres hidroxilo y fosforilo, 3' y 5'. En las formas relajadas o en las superenrolladas existen círculos cerrados. Las superenrolladas ocurren cuando una molkcula cerrada se tuerce alrededor de su propio eje o cuando se retuerce una pieza lineal de DNA dúplex, cuyos extremos estan fijos. Este proceso, que requiere energía, coloca a la molécula bajo tensi6n y mientras mayor sea el número de: superenrol~amientos,mas elevada sera la tensibn o torsión (hagase la prueba con una banda de hule). Los superenrollamientos negativos s e forman c u a n d o una molécula se tuerce en direccilin opuesta a las manecillas del reloj; dirección esta Ultima, de la hklice doble con giro a la derecha del DNA-B. Se dice que este DNA
La infomaciiin gendtica almacenada en la secuencia de nucleótidos del DNA sirve a dos propCisitos. Es la fuente de información para la síntesis dc todas las moléculas de proteínas de la célula y del organismo y provee la infomacibn heredada por las cklulas hijas O la progenie. Ambas funciones requieren que lamolkula del DNA sirva como plantilla, en el primero de los casos para la transcripción de informaci6n al RNA y en el segundo caso para la replicación de la informacibn en las molkculas hijas de DNA. La cornplementariedad del modelo de doble tira del DNA de Watson y Crick sugiere fuertemente que la replicacibn de la molécula de DNA ocurre de manera semiconservadora. Asi, cuando cada tira de la molkcula completa se separa de su complemento durante la replicación, cada una sirve como plantilla sobre la cual se sintetiza una nueva tira complementaria (figura 3 7 4 ) . Las dos moleculas hijas de DNA de doble tira reciCn formadas, conteniendo cada una, wnade las tiras (complementaria más que idéntica) de la moltcula original doble, pueden entonces distribuirse entre las dos células hijas (figura 37-5). Cada célula hija contendrá rnoldculas de DNA con informaci6n idéntica a la que poseia la célula progenitora; aunque en estas cklulac hijas, la rnol&culade DNA de la célula original solo se ha semiconservado.
LA NATURALEZA QU~M~CA DEL RNA DIFIERE DE LA DEL DNA El hcido ribonucleico (RNA) es un polímero de ribonucleotidos purínicos y pirimidínicos enlazados por puentes 3',5'-fosfoditster análogos a los del DNA
*
Estructuru yfunción de los ácidos nucleicos * 453
ORIGINAL
ORIGINAL
Mol&ula progenitora original
Moléculas hijas de la segunda generacibn
Figura 37-5. La replicacibn del DNA es semiconseniadora. Durante la primera serie de replimcibn, cada una de las dos tiras de DNA se usa como molde para la síntesis de una tira complementaria nueva.
(figura 3 7 4 ) . Aunque comparte muchas caracteristicas con e1 DNA, el RNA posee varias diferencias especificas:
Figura 3 7 4 . Estructura de doble tira del DNA y la funcidn de molde de cada tira original sobre la cual se sintetiza una tira complementaria nueva (sornbreada). (Mdifiwda de J a m s D Watson Mo(ecular Bidogy of the Gene, 3rd ed.Copyright 8 1976,1970,1965 por W.A. Benjamin. Inc: Menlo Park, Calif )
1) E1 anjcar en el RNA al cual se adhieren los fosfatos y las bases purinicas y pirimidinicas es la ribosa en lugar de la 2'-desoxirribosa del DNA. 3) Los componentes pirimidinicos del RNA difieren de aqukllos del DNA. Aunque el RNA contiene los ribonucleótidos de denina, guanina y citosina, no posee timina exceptoen un caso raro que se menciona adelante. En lugar de la timina, el RNA contiene el ribonucleótido de uracilo. 3) El RNA existe como tira sencilla y no como mol&culahelicoidal de doble tim, como e[ DNA. Sin embargo dada la secuencia de bases complementarias apropiadas con polaridad opuesta, la tira sencilla de RNA, es capaz de doblarse sobre s i misma, como se muestra en la figura 3'7-7, como una hotnquilla y adquiere asi características de tira doble.
434
Bioqulmica de Hurper
(Capitulo 3 7)
Figura 3 7 6 . Segmento de una mol&cula de hcido ribonucleiw (RNA) en el cual las basas puríniws y pirimtdínicas, adenina (A), uracilo (U), cttosina (C) y guanina (G), se mantienenjuntas por enlaces focfoddster entre las fracciones ribosilo adheridas a las nucleobases por enlaces ni-glucocidiws N6tece que el polimero tiene polaridad como lo indican los fosfatos adheridos en las posiciones 3' y 5'
4) Dado que la rnolkcula de RNA es una tira sencilla compEementaria sbto a una de las dos tiras de un gen, su contenido de guanina no es necesariamente igual a su contenido de citosina, ni el contenido de adenina es necesariamente igual al de uracilo. 5 ) El RNA puede hidrolizarse por los Alcalis a 2',3'didsteres ciclicos de los mononucleótidos, compuestos que no pueden formarse del DNA tratado con hlcali debido a la falta de grupos 2'-hidroxilo. La labilidad del RNA en los álcalis es útil tanto en los diagnósticos clinicos como en los procesos analíticos.
La información en la tira sencilla del RNA se contiene en su secuencia ("estructura primaria'" de nuclebti-
dos purinicos y pirimidínicos dentro del polimero. La secuencia es complementaria a la tira codificadora del gen, del cual fue transcrita. A causa de esta complementariedad, una molécula de RNA puede unirse especificamente siguiendo las reglas del pareamiento
de bases a su tira codificadora de DNA; no se unirá (no "generará hibridos") con la otra tira (codificadora) de su gen. La secuencia de la moldcula de RNA (excepto para U que remplaza a Tj es la misma que la de la tira no codificadora del gen (figura 37-8 j.
Casi todas las especies de RNA intervienen en aspecto de la síntesis de proteínas Aquellas mol6culas citeplásmicas de RNA, que sirven como moldes para la sintesis de proteinas (es decir, que transfiere la infomaci6n gendtica de DNA a la maquinaria sintetizadora de proteinas) se designan como RNA mensajero o mRNA.Muchas otras moléculas citopllismicas (RNA ribosómico o sRNA) tienen papeles estructuralec donde contribuyen a la fonnacion de los ribosomas (los organelos que constituyen la maquinaria utilizada para la sintesis de proteinas) e sirven como molCculas adaptadoras (RNA de transferencia o tRNA) para la traducción de la infonna-
Estrucrum yjÚnci8n d~ los licrdus niicltricm * 455
C-G G-C A-U A-U A-U U G U
C
Tallo
C
G-C U-A U-A
pueden actuar en el procesamiento del RNA y en la arquitectura celular. Estas moléculas relativamente pequeñas varían en tamaño de 90 a ap~oximadamente 300 nucleíitidos (cuadro 37-1 ). El material genktico para algunos virus de animales y vegetales es RNA en lugar de DNA. Aunque algunos virus con RNA nunca tienen su inforrnaciiin transcrita dentro de una molecula de DNA, numerosos vinis con RNA de los animales -en especial retrovirus (el vinis HIV o del SIDA, por ejemplo) - se transcribe por una DNA polimerasa dependiente de RNA, la asi llamada trariscriptasa inversa, para generar una copia de DNA de tira doble de su genoma RNA. En numerosos casos, el DNA de doble tira resultante transcrito es integrado al genoma del huésped y a continuaci6ri sirve como molde para la expresión genktica y de la cual pueden transcribirse naevos genomas virales de RNA.
El RNA se organiza en varias estructuras únicas
Figura 37-7. Representación esquemática de la estructura secundaria de la molécula de tira sencilla de RNA en la que se ha formado un tallo con asa u "horquilla" y que es dependiente del pareamienta intrarnotecular de bases.
En todos Ios organismos eucariotes y procariotec, existen tres clases principales d e moléculas de RNA:RNA mensajero (mRNA), RNA de transferencia (tRNA} y RNA ribosómico (rRNA). Cada clase difiere de las demás en tamairo, funcidn y estabilidad general.
A. RNA mensajero (mRNA) Es el más heterogeneo en tamaño y estabilidad, todos ción del RNA en secuencias especificas de aminoácidos polimerizados. Algunas rnol&culas de RNA tienen actividad catalitica intrínseca, un ejemplo es la funciiin del RNA en la catilisis del procesamiento de la transcripcion primaria de un gen a RNA mensajero maduro. La mayor parte del RNA sintetizado de rnoIdcs de BNA en las células eucariotas, incluyendo las de marniferos, se degrada dentro del núcleo y nunca sirve como entidad estructural o informativa en el citoptasrna celular. En celulas humanas cultivadas hay especies de RNA nuclear pequeno (snRNA) que no intervienen directamente en la síntesis de proteínas pero que
los miembros de esta clase funcionan como mensajeros transportando la iiiformaciiin de un gen a la maquinxia qiie sintetiza proteínas, donde cada uno sirve como molde sobre la cual se polimeriza una secuencia especifica de aminoácidos para formar una molecula de proteína específica, producto último del gen (figura 37-91, L a moléculas de RNA mensajero particularmente en los eucariotes, tienen algunas camcterísticas químicas únicas. El extremo 5' del rnRNA esti "rematado" por un trifosfato de 7-metilguanosina que se une a un 2'-O-rnetilribonucle~sidoadyacente a su 5'-hidroxilo a traves de los tres fosfatos (figura 37-10). Las moléculas de mRNA con frecuencia contienen ó-metil-
Tiras de DNA
C ~ ~ I ~ ~ C ~ ~ O ~ ~ - - ~ ' - ~ G G A A T T G T G A G C G ( ; A T A A Y A A T T T C A C A C A G G A A A C A G C T A T G A C C A T G P ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ - , ~ ' - A C C T T A A C A C T C G C C T A T T G T T A A A G T G T G T C C T T T G T CG G GA TA TC A -CS T'
RNA
5'
pAUUGUGAGCGGAU A A C A A U U U C A C A C A G G A A A C A G C U A U A
3'
transcrito Figura 37-8. Relación entre las secuencias de un RNAtranscrito y su gen. en la cual se muestran las tiras codificadas y molde c o n sus polaridades. El RNA transcrito con una polaridad 5' a 3' es wmplementario de la tira molde con su polaridad 3 a 5' Notesa que la secuencia en el RNA transcrito y su polaridad son las mismas que en la tira codificadora, excepto que el U del RNA transcrito remplaza a la T del gen.
456 Bioquirnica de Harper
(Capitulo 3 7)
Cuadro 37-1. Algunas de las especies de RNA pequenas y estables encontradas en las células de mamífe ros .
-
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,ongitud Molbculas
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i Nuclcolc ; Niiclcop ! Nucleop i Grhnulo;, u*.VLr iciiimüiina1 Níicleo )1 citoplasma Níicleo ! citoplmm a
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..
I
ladenilatos internos y otros nucleótidos 2'-O-ribosa metilados. Es probable que el remate intervenga en el reconocimiento del mRNA por la maquinaria de sintesis y ayude a estabilizar al mRNA y evitar así el ataque can 5'-exonucleasas. Esta maquinaria sintetizadora de proteinas comienza traduciendo el mRNA a proteinas en el extremo 5' o capuchbn. En la mayor parte de las moléculas de mRNA, el otro extremo, el 3'-hidroxilo, tiene adherido un polimero de residuos adenilato de 20 a 250 nucleotidos de longitud. La funcidn especifica de la "cola" pall(A) en el extremo 3'-hidroxilo de los mRNA no se comprende enteramente, pero al parecer conserva la estabilidad intracelular del mRNA especifico y evita el ataque de las 3'-exonucleasis. Algunos RNA mensajeros, incluso los utilizados para las historias, no contienen poli(A). La cola de poli(A), debido a que formará un par de bases con los oligopolimeros de desoxitimidina adheridos a un sustrato solido como celulosa, puede utilizarse para separar mRNA de otras especies de RNA, inclusive moléculas de mRNA que carecen de esta cola.
En las cdlulas de mamíferos, incluso l a humanas, las moléculas de mRNA presentes en el citoplasma no son los productos sintetizados en ese momento del molde de DNA, sino que se forman por el pmcesamiento de una molecula precursora antes de pasar al citoplasma. Así, en los núcleos de los marniferos, los productos inmediatos de la transcripción genética constituyen una cuaria clase de moléculas de RNA. Estas moléculas nucleares de RNA son muy heterogkneas en tamaño y bastante largas. Las moleculas nucleares heterogkneas de RNA (hnFüVA) pueden tener un peso molecular elevado de 1 07,en tanto que el peso molecular de las rnol~culasde mRNA, por lo general, es menor de 2 x 1.'O Como se describe en el capitulo 39, las moltculas de hnRNA se procesan para generar las moléculas de mRNA que entonces paran al citoplasma para servir como moldes en la síntesis de proteinas.
B. RNA de transferencia (tRNA) Las moléculas de RNA de transferencia (tRNA) están constituidas aproximadamente por 75 nuclebtidos. Tarn bien se genemn pos procesamiento nuclear de una molécula precursora (capítu to 39). Las moléculas de tRNA sirven como adaptadores para la traducción de la información contenida en la secuencia de nucleotidoc de mRNA a aminohcidos específicos. Hay por lo menos 20 especies de moltculas tRNA en cada célula y cuando menos una [y a menudo varias) corresponde a cada 1 de los 20 aminohcidos necesarios para la sintesis de proteinas. Aunque cada tRNA específico difiere de los demás en su secuencia de nucleótidos, las moléculas de tRNA como clase tienen numerosas características en comun. La escnictura primaria, es decir la secuencia de nuclebtidos, de todas las moKculas de tRNA permite un plegamiento extenso y una complementariedad intratiras pasa generar una estructura que semeja una hoja de trebol (figura 37-1 1). Todas [as moleculas de tRNA tienen cuatro brazos principales. El brazo aceptor consiste en un tallo de bases pareadas que termina en la secuencia CCA
DNA
3'
5' 3'
5'
Sintesis de oroteinas sobre el molde det mRNA
5' Ribosoma
Figura 37-9. Expresidn de la informacibn genbtica Molecula contenida en el DNA en la forma de un mRNA de proteina transcrito Este es subsecuentemente traducido por teminada
los ribosomas a una molécula de proteína
especifica.
Figura 37-10. La estructura de remate adherida al extremo 5' de la mayor parte de las moléculas de RNA mensajero de eucariotes. Un trifosfato de 7-metifguanocrna se adhiere al extremo 5' de mRNA, el cual por lo general contiene un nucleótido 2'-O-metilpurina.
Los grupos carboxilo de los aminoBcidos se adhieren mediante un enlace Cster al grupo hidroxilo 3' de la porción adenosilo. Los demás brazos tienen tallos de bases pareadas y asas de bases sin parear (figura 37-7). El brazo anticodbn en el extremo de un tallo de bases pareadas reconoce al codón o tripleta de nucleótidos (capitulo 40) del molde de rnRNA. Tiene un secuencia de nuclebtidos complementaria para el cod6n y responde por la especificidad del tRNA. El brazo D recibe su nombre de la presencia en dl de la base dihidrouridina y el brazo TyC de la existencia de la secuencia T, seudouridina y C. El brazo adicional es la característica m& variable del tRNA y proporciona la base para la clasificación. La (5' a 3').
clase 1 de los tRNA (aproximadamente 75% del tRNA total) tiene un brazo adicional de 3 a 5 pb de longitud. En la clase 2 hay un brazo adicional de 13 a 2 1 pb de longitud y a menudo tiene una estructura de tallo y asa. La estructura secundaria de las molCculas de tRNA se conserva por el pareamiento de bases en estos brazos y esta es una camcteristica consistente. El brazo aceptor tiene 7 pb, los brazos TiyC y anticod6n tienen 5 pb y el brazo D tiene 3 (o 4) pb. Aunque los tRNA son bastante estables en los procariotes, manifiestan menos estabilidad en los eucariotes. Lo opuesto sucede con los mRNA los cuales son bastante inestables en los procariotes pero, por lo general, son estables en los organismos eucariotes.
458
-
(Capítulo 3 7)
Bioq ~ i iccx m de Hurper
Los componentes de los ribosomac de mamíferos, que tienen un peso molecular de aproximadamente 4.2 x 1Ob y una velocidad de sedimentación de SOS (unidades Svedberg), se muestran en el cuadro 37-2. Los ribosomas de mamiferos contienen dos subunidades nucleoproteinicas principales, una mayor de peso molecular de 2.8 x I O" ( 6 0 s ) y una subunidad pequefla de peso molecular 1.4 x 1 Oh (40s). La subunidad 60s contiene un RNA ribosómico 5S (rRNA), un rRNA 5.8s y un rRNA 28s; hay también probablemente más de 50 polipkptidos especfficos. La subunidad 40s es menor y contiene un rRNA 1 8S sencillo y aproximadamente 30 cadenas polipeptidicas. Todas las moléculas de RNA ribosómico excepto el rRNA 5 S , son procesadas a partir dc un RNA precursor scncillo 45s en el nuclt5olo (capítulo 39). El rRNA 5S aparentemente tiene su propio precursor, que es transcrito en forma independiente. Las moleculas de RNA ribosórnico altamente metiladas, están empacadas en el nucleolo con las proteinas ribosómicas especificas. En e: citoplasma los ribosomas son bastante estables y capaces de realizar numerosas traducciones. Las funciones de las moléculas del R N A ribns6mico en la partícula ribosómica, no se comprenden enteramente, pero son necesarias para el ensamblaje ribosbmico y parecen tener papeles clave en la fijación del mRNA a los ribosomas y en su traducción. Los estudios recientes sugieren que un componente de! rRNA realiza la actividad de la peptidiltransferasa y en ese caso es una enzima (una ribozirna).
Brazo acaptor
de hidrógeno entre
pares de beses
Brazo D Brazo adicional
U
Punna alquilada
Brazo anticoddn
Figura 37-11. Un tRNA aminoacílico típico, en el cual el aminoácido (aa) está adherido al extremo 3' ACC. Están indicados los brazos antimdbn, TqiC y dihidrouracilo (D), así como las posiciones de los puentes de hidrbgeno intramoleculares entre los pares de bases. (Da James D. Watson, Molecular Biology of the Gene,3rd ed Copyright 8 1976 1970, 1965 por W.A. Benjamin, Inc, Menlo Park. Cal*.)
D. RNA estable y pequeño En las células cucariotas se encuentra un número grande de especies discretas de RNA estable, pequefío y altamente conservado. La mayoria de estas moleculas existe como ribonucleoproteinas y esthn distribuidas en el núdeo, en el citoplasma o en ambos. Su tamaiío oscila de90 a300 nucleótidos y están presentes en 100 OM3 a un millon de copias por célula. Los RNA nucleares pequeños (snRNA) pueden estar implicados de manera importante en la regulaci6n del gen. De los diversos snRNA, los U 1 , U2, U4, U5 y U6 esthn implicados en la remocidn del
C. RNA ribosómico (rRNA) Un ribosoma es una estructura citoplhmica de nucleoproteina quc actúa como la maquinaria para la síntesis dc proteínas a partir de los moldes de mRNA. En los ribosomas, las molCculas de mRNA y tRNA interactúan para traducir en una moKcula de proteina especifica la infnmacion transcrita del gen.
Cuadro 37-2. Componentes de ribosomas 4 .. .-
-..
-.. .
Y -
1
i
* x .
Masa
ews* .--
.. ..
RNP
Mas:
7 x 10'
.
* A
ilustra la masa total (nit) de cada una. Tambiin se muestra el niirneto de protei~iacúnicas y su marn total (mt) correspondiente y los coinponentes de RNA de cada subunidnd en iamafio (unidades Stedberg), masa y mmposicibn de bases.
E.~rructuray función de los ucidos nucleicos
intron y en el procesamiento del h n W A en mRNA (capitulo 39). Al parecer el snRNA U7 interviene en la produccion correcta de extremos 3' de la histona del mRNA. (La cual carece de cola poli A.) Los snRNA U4 y U6 pueden requerirse para procesar al poli(A).
RESUMEN Los ácidos nucleicos DNA y RNA son rnolkculas poliméricas. El DNA consiste en cuatro bases, A, G , C y T, que se conservan en un ordenamiento lineal por enlaces fosfodikster a través de las posiciones 3' y 5' de residuos de desoxirribosa adyacentes. El DNA se organiza en dos tiras unidas por pareamiento de las bases A a T y G a C en las tiras complementarias. Estas tiras forman una helice doble alrededor de un eje central. Las 3 x 10Yparesde bases del DNA humano se organizan en un conjunto haploide de 23 cromoso-
459
mas. La secuencia exacta de estos tres mil millones de
nucleótidos define la característica de único de cada individuo. Una fúnciori del DNA es proporcionar un molde o plantilla para replicación y, por tanto, conservacibn del genotipo. Otra es proporcionar una plantilla para Fa transcripción de los casi 100 000 genes que codifican las diversas moléculas de UNA. Al contrario del DNA, el RNA existe en varias estructuras de tira sencilla diferentes, la mayor parte ocupada en la síntesis de proteínas. El ordenamiento lineal de nucleótidos en el RNA está constituido por A, G, C y U y la porción azúcar es ribosa. Las formas principales de RNA son: RNA mensajero (mRNA), RNA ribosómico (rRNA) y RNA de transferencia (tRNA). Estos RNA varían en tamaiio desde el tRNA, que consiste en alrededor de 75 nucleótidos al mRNA, formado por varios miles de nuclebtidos. Las funciones específicas de estos RNA se estudian en capítulos subsiguientes.
REFERENCIAS Guthrie C, Patterson B: Spliceosomal snRNAs. Ann Rev Cienet 1988:22:387. Hunt T: D.VA MalcPs RVA hfakes Protein. Elsevier, 1983. Noller HF: Ribosomal RNA and translation. Annu Rev
Uiochcm 1991.hO: 191.
Watson JD, Crick FHC: Nolecular qtructurc of nuclcic acidi Nature 1953; 17 1 737. Watson JD: The DorrhIe Hela. Atheneum, 1968.
Oñaanización * y ñepllicación ole! RNA
en una célula germina1 sera transmitida a la descendencia (llamada transmisión vertical de enfem edad hereditaria). Algunos factores como virus, productos químicos, luz ultravioleta y radiación ionizante, incrementan la velocidad de mutaciones. Estas a menudo a f e m a las celulas sornaticas y, por tanto, se transmiten a generaciones sucesivas de células dentro de un organismo. Es evidente que cierto número de enfermedades y quizi la mayoría de los cknceres, se deben a la iransmisthn horizontal de mutaciones inducidas.
En 30s organismos procariotes el DNA generalmente no se combina con otras proteinas que no sean las que intervienen en la replicación o en la transcripción del propio DNA. Una buena parte del DNA de los organismos eucariotes está cubierto de diversas proteinas. Estas proteinas y el DNA forman una estructura compleja, la cromatina, que deja espacio para una diversidad de configuraciones de la molCcula y tipos de control, Unicos de los organismos eucariotes. La información genktica en el DNA de un cromosoma puede transmitirse por replicacihn exacta o puede intercambiarse por una serie de procesos, que incluyen entrecruzamiento, recombinacibn, m s p o s i ción y conversi6n. Esto provee medios que aseguran la adaptabilidad y la diversidad de los organismos, pero también puede desembocar en enfermedad. La replicacidn del DNA, un proceso altamente complejo y ordenado, sigue la polaridad 5' a 3' clkica de la síntesis del ñNA y de las proteinas descritas en otros capítulos. En cClulas eucarihticas la replicación del DNA en un cromosoma comienza en sitios múltiples y avanza simulthneamente en ambas direcciones. Para la sintesis y reparación del DNA se requiere de varias enzimas y ambos procesos siguen las reglas de pareamiento de bases de Watson y Crick.
La cromatina* se compone de moléculas de DNA muy largas, de doble tira, y de una masa casi igual a las proteinas bksicas más pequefías llamadas histonas, asi como de una cantidad menor de proteínas no histónicas (la mayor parte de las cuales son acidógenac y mas grandes que las hictonas), y de una pequeiia cantidad de RNA. La hdlice DNA de doble tira en cada cromosoma tiene una longitud cientos de veces mayor que el diámetro del nucleo celular. Una finalidad de estas moléculas, en particular las histonas, es
IMPORTANCIA BIOMEDICA
* En lo posible. la descripcibn de este capitulo y Iw de los
Las mutaciones se deben a un cambio en la secuencia de bases del DNA. Estas pueden deberse a errores de replicacibn, movimientos o reparacion del DNA y ocurrir con una frecuencia de alrededor de una en cada lohdivisiones celulares. Un producto genktico anormal puede ser consecuencia de mutaciones en la regi6n codificadora o en la reguladora del DNA. Una mutacidn
LA CROMATlNA ES EL MATERIAL CROMOSÓMICO EXTRA~DO DENÚCLEOSDECÉLULAS DE ORGANISMOS EUCARIÓTIGOS
capitulos 39 a 41 se referirin a los organismos de: mamíferosque están, por supuesto, entre los eucariotes superiores. A veccs es necesario referirse a observaciones hechas en organismos procarióticos como las bacterias y los virus, pero cuando tal ocurra se reconoce como información que debe extrapolarse a los marniferos. Ida divisidn de material presentado en los capítulos 37 a 41 es un tanto arbitraria y no significa que los prcccsos descritos no están completamente integrados y sean interdependientes.
condensar el DNA. Los estudios de la cromatina con microscopio electrdnico muestran partículas esfkricas densas llamadas nucleosomas que tienen aproximadamente 10 nm de diametro y están conectadas por filamentos de DNA (figura 38-1). Idos nucleosomas se componen de DNA enrollado alrededor de un conjunto de molkculas de histona.
Las histonas son las proteínas cromatínicas más abundantes Las histonas s w un tanto heterogdneas y consisten en una serie de proteinas bitsicas íntimamente relacionadas. Entre las histonas, las histonas H1 son las menos fuertemente unidas a la cromatina y son, por tanto. fhcilmente removidas con una soluci6n saIina. despuks de lo cual la cromatina se vuelve soluble. Los nucleosomas aislados de! centro contienen cuatro cIaces de histonas: HZA, H2B, H3 y H4. Las estnicturas de las histonas ligeramente ricas en lisina, H2A y H2B, parecen haberse conservado significativamente entre las especies, en tanto que las estructuras de las histonas ricas en arginina. H3 y H4, se conservan predominantemente entre las especies. Esta conservacion rígida implica que la función de las histonas es idéntica en todos los eucariotes y que la molécula entera esti implicada completa y especificamente en llevar a cabo esta función. Los dos tercios C-teminales de las mol6culas tienen una corn~osici6nordinaria de aminoácidos, mientras que sus tercios amino t e m i nales son ricos en aminoácidos bbicos. Estas cuatro histonas del centro esthn sujetas a cinco tipos de modificaciones covalentes: acetilación, metilacion,
focforiIaci6n. ADP-ribosilación y fijación covalente (sólo H2A) a la proteína nuclear, ubiquitina. Estas modificaciones de las histonas es probable que desempeiien alguna acción en la estructura y función de la cromatina, pero en la actualidad se conoce poco acerca de esto. Lac histonas interactúan entre si de maneras muy especificas. Las H 3 y H4 se agregan para formar un tetrhmero que contiene dos moleculas de cada una de ellas (H3/H4I2, en tanto que H 2 A y' H2B forman dim eras (H2A-H2B) y complejos o1igomérícos superiores ([H2A-HG2B1,). En condiciones fisiológicas, dos de estos tetrárneros de histona se unen para formar el octámera de histona.
El nucleosoma es una estructura que contiene histona y DNA Sin embargo, cuando el tetrárnero H32-H4~y los dimeros H2A-H2B se mezclan con DNA purificado de doble tira, se forma el mismo patriin de difracción de rayos X que el observado en la cromatina aislada recientemente. Los estudios de microscopia electriinica confirman la existencia de nucleosomas reconstituidos. Ademas, la reconstitucibn de los nucleosomas a partir del DNA y de las histonas H2A, H2R, H3 y H4 es independiente del origen orghnico o celular de los diversos componentes. La histona H 1 y las proteinas no histónicas no son necesarias para la reconstitución del centro del nucleosoma. En el nucleosoma, el DNA está superenrollado en una helice hacia la izquierda sobre la superficie de la histona en forma de disco, que es un octhrnero campuesto de un tetriimero central de H3-H4 (HJ/H4)2 y dos dímeros de H2A-H2B (figura 38-2). Las histonas del centro interactiian con el DNA en el interior de la superhélice sin formar protuberancias.
histona
Figura 38-1.. Micrografia electrbnica de nucleosomas conectados por tiras de bcdo nucleim {La barra representa 2 5 pm.) (Reproducida can autorizacibn de Oudet P, Gross Bellard M, Chambon P. Eledron rnicroscopic and biochemical evidencie that chromatin structure is a repeating unit. Cell 1975;4:28?.)
Figura 38-2. Modelo para la estructura del nucleosoma, en el cual el DNA está enrollado alrededor de la superficie de un cilindro plano de proteina constando de dos de cada una de las hisfonas H a , H28. H3 y H4. Los 146 pares de bases del DNA, que consisten de 1.75 giros de superhélice, estan en contacto con el octhrnero de histona. Esta protege al DNA de digestibn por una nucleasa.
Organización y r~plicucicindcl DArA
Los tetrameros H3:-Hd1 por si mismos le pueden conferir propiedades de nucleosoma al DNA y así tiene una función central en la formaci6n del mismo. La adiciiin de dos dirneros HLA-H2B estabiliza la particula primaria y enlaza firmemente dos medias vueltas adicionales de DNA previamente unidas en forma laxa al (H3JH4)2. De este modo, 1.75 vueltas de superhC?licede DNA están enrolladas alrededor de la superficie de! octiimero de histonas, protegiendo 146 pares de bases de DNA y formando el centro 'de nucleosoma (figura 38-21, Es probable que el ensamble de los nucleosomas esté mediado por una proteína nuclear aniónica, la nucleoplasmina. Las histonas, que son fuertemente catiiinicas, pueden unirse en forma no especifica al DNA fuertemente anihnico mediante la formación de puentes salinos. Es evidente que tal interacción no especifica de las histonas y el DNA seria nociva para la formacibn de nucleosomas y para la funcibn de la cromatina. La nucleoplasmina es una proteína anionica pentarnérica que no se une al DNA ni a la cromatina, pero puede interactuar de modo reversible con un octhmero de histonas de tal manera que &as ya no se adhieren en forma no especifica a superficies con carga negativa como las del DNA. Al parecer de este modo la nucleoplasmina mantiene en el nucleo un ambiente i6nico conducente a la interacción específica de las histonas y el DNA y al ensambte de los nucleosomas. Una vez que el nucleosoma se forma, la nucle~plasminadebe ser liberada de las histonas. Al pareces los nucleosomas muestran preferencia por ciertas regiones en rnolécula^ especificas de DNA, pero ta base para estadictribuciiin no aleatoria, denominada ajuste d e fase se desconoce, aunque es probable que se relacione con la flexibilidad física relativa de ciertas secuencias de nuclebtidos que son capaces de acomodarse en las regiones con torceduras dentro de la superhélice. El superempacamiento de los nucleosomas en el núcleo es en apariencia dependiente de la interacciiin de lac histonas H 1 con nucleosomac adyacentes.
mas con 6 a 7 nucleosomas por vuelta para formar la Eihra de 30 n m de cromatina (figura 38-3). Cada vuelta del superenrollamiento sería relativamente plana y las caras de los nucleosomas de vueltas sucesivm podrian ser casi paraleIas una con otra. Las histonas H1 parecen estabilizar la fibra de 30 nm, pero su posicihn y la del DNA espaciador de longitud variable no esth clara. Es posible que los nucleosomas formen cierta variedad de estructuras de empaque. Para formar un cromosoma rnitbtico, la fibra de 30 nm debe reducirse en longitud otras 100 veces (vCase adelante). En los cromosomas interfhsicos, las fibras de cromatina parecen estar organizadas en asas o dominios de 30 a 100 millares de pares de bases ancladas en un andamiaje (o matriz de soporte} en el nucleo. En estas dominios,algunas secuencia de DNA no estan IocaliPrlas al arar. Se ha sugerido que cada dominio en forma de asa de la cromatina puede corresponder a una funci6n genetica separada, que contiene tanto regiones codificadoras como no codificadoras del gen.
ALGUNAS REGIONES DE CROMATlNA SON LLACTtVAS" Y OTRAS "INACTIVAS" Generalmente, cada célula individual de un metazoario contiene la misma informacihn genktica en forma de las mismas secuencias del DNA. Así, las diferencias entre tipos celulares distintos en un mismo organismo deben explicarse por la exprecidn diferencial de la información gen&tica comiin. Se ha demostrado que la cromatina que contiene genes activos (es decir, crornatina activa para la transcripci6n) difiere en varias formas de aquClla de las regiones no activas. La estructura nucleosómica dc la cromatina activa parece estar
ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR PROPORCIONAN LA COMPACTACI~N DE LA CROMATlNA
de la fibra
m
La microscopia electrónica de la crornatina revela dos órdenes superiores de estructura, la fibrilla de 10 nm y la fibra de 25 a 30 nm de cromatina, más allá de aquélla del propio nucleosoma. La estructura nucleosómica discoidal tiene un dihmetro de 10 nm y una altura de 5 nm. Al parecer la fibrilla de 10 nm consta de nucleosornas ordenados con sus bordes tocbndose y sus caras planas paralelas al eje de la fibrilla (figura 38-3). Es probabIe que esta fibrilla de 10 nrn se superenrolle
163
.
lOnm
V
Fibra de 30 nrn
Figura 3 8 3 . Estructura propuesta de la fibra de cromatina de 30 nm formada de superhélices de seis nucleosomas de fibrillac de 3 O nm, El eje de la fibra de 30 nm es perpendicular al plano de la página.
(Capitulo 38)
alterada o aún ausente en las regiones sumamente activas. El DNA en la cromatina activa contiene grandes regiones (aproximadamente 100 000 bases de longitud) que son sensibles a la digestibn por una nucleasa como la DNasa 1. La sensibilidad a la DNasa 1 de las regiones de cromatina que estan transcribiéndose activamente, refleja solo un potencial para la transcripcibn m& que la transcripción en si y en varios sistemas puede correlacionarse con una falta relativa de la 5-metil-desoxicitidina en el DNA. Dentro de regiones grandes de cromatina activa existen estrechamientos m& cortos de 100 a 300 nucle& tidos que exhiben una sensibilidad aún mayor (otras 10 veces) a la DNaca 1. Es probable que estos sitios hipersensiblcs se deban a una conformación estructural que favorezca el acceso al DNA de la nucleasa. En general, estas regiones se localizan próximas corriente arriba del gen activo y corresponden a una estructura nucleosomica interrumpida debido a la fijacibn de proteinas no histonas (capítulos 39 y 41). En muchos casos parece ser que si un gen es capaz de ser transcrito. debe tener un sitio hipersensible a la DNasa en la cromatina seguidamente corriente arriba. Las proteinas que intervienen en la transcripción y las que se ocupan-de conservar el acceso a la tira molde, definen la formación de sitios hipersensibles. Con frecuencia los sitios hipersensibles proporcionan la primera pista acerca de la presencia y ubicación de un elemento de control de la transcripcion. La cromatina inactiva para la transcripción está empaquetada más densamente durante la interfase segun se observa por estudios con el microscopio electrrinico y se le conoce como heterocromatina; la cromatina activa para la transcripción se tifíe con menor densidad y se le conoce como eucromatina, Generalmente, la eucromatina 5e replica antes en el ciclo celular de los mamiferos (véase adelante) que la heterocromatina. Hay dos tipos de heterocrornatina, la constitutiva y !a facultativa. La hcterocromatina constitutiva siempre esta condensada y, por tanto, inactiva. Se encuentra en regiones cercanas al centromero del cromosorna y en 10s extremos crornos~micos(tel6meros). La heterocromatina facultativa en ocasiones esta condensada, pero otras veces es transcritaactivamente y, por consiguiente, no condensada, apareciendo como eucromatina. De los dos miembros del par de cromosoma X en las hembras de los mamíferos, un cromosoma X es casi completamente inactivo para la transcripcihn y es heterocromático. Sin embargo, durante la gametogdnesis, el cromosoma X heterocromático se separa y se vuelve activo para la transcripci6n durante la embriogknesis temprana; por tanto es heterocromatina facultativa. Ciertas células de insectos,por ejemplo, Chironomw, contienen cromosomas gigantes que se han replicado
durante E0 ciclos sin separación de las cromátidas hijas. Estas copias del DNA se alinean lado a lado en registros precisos y producen un cromosoma con bandas que contiene regiones de cromatina condensada y bandas mas ligeras de cromatina mas extendida. Las regiones activk para la transcripcibn de estos cromasomas politénicos están especialmente extendidas en los "puffs", en los cuales es posible demostrar las enzimas necesarias para la transcripción y que son los sitios de sin~esisdel RNA (figura 38-41,
EL DNA SE ORGANIZA EN CROMOSOMAS En la metafase, los cromosomas de los mamíferos poseen una simetría doble, con cromátidas hermanas identicas conectadas a un centrómero, la posición
Figura 3 8 4 . Correlacibn entre la actividad de la RNA polimerasa II y la slntesis de RNA. Cierto número de genes se activan mando las lamas de Chironomus tentans se someten a choque tbrmiw (39 ' C durante 30 minutos) A: Distribucidn de la RNA polimerasa B (llamada tambien tipo II) en el cromosoma IV aislado de la glandula cabval La enzima fue identificada por inrnunofluorescencia mediante un anticuerpo drrigido contra la polimerasa. Las bandas 5C y BR3 con especificas del cromosoma IV y las flechas indican los abultamientos 6 :Autorradiograma de un cromosoma IV incubado en presencia de 3~-uridinapara marcar al RNA. NotBce la correspondencia de la inrnunofluorescencia y la presenciadel RNA radractivo (puntos).Barra = 7pm. (Reproducida con autorizacidn de Cass H: RNA polymerase B in polytene chromosomes. Cell 1982;28.274. Copyright 8 1982 by the Massachucetts Institute of Technology )
Orgunlzacich y repiicacirin del DNA
relativa de las cuales es caract~rfsticapara un cromosoma dado (figura 38-51, Cada cromátida humana contiene una molécula de DNA de doble tira. Durante la interfase, el empacamiento de la molécula de DNA es menos denso que como se encuentra en el cromosoma condensado durante la metafase. Los cromosomas en la metafase son inactivos para la transcripcidn. Et genoma haploide humano consiste de 3 x 1 09 pares de bases o pares de nucleótidos alrededor de 1.7 x 1 O7 nucleosomas. Por tanto, cada una de las 23 cromátidas en el genoma haploide humano contendrá un promedio de 1.3 x 10' nucleótidos en una molkcula de DNA de doble tira. La longitud de cada molkcula de DNA debe comprimirse aproximadamente 8000 la estructura de un cromosoma veces para metafhico condensado. En los cromosomas en la metafase, las fibras de cromatina de 25 a 30 nm tambikn estan plegadas en una serie de dominios en forma de asa, cuyas porciones proximales estan ancladas a un soporte proteináceo no histdnico. En el cuadro 38-1 se resumen los índices de empaquetamiento de cada une de los órdenes de la estructura del DNA. El empaquetamiento de las nucleoproteinas dentro de las cromatidas no es al azar, según evidencias de los patrones caracteristícos observados cuando los cromosomas se tiiien con colorantes específicos como la quinacrina o el colorante de Giemsa ('igura 3 8 6 ) .
a
463
Cuadro 38-1. Proporciones de empaquetamiento
de cada uno de los ordenes de estructura del DNA - --
.---
-
Propo rci6n de -
Forma tl e Ir cromrtina
ernpnquetamiento
.-.-.
DNA desnudo dc doblc hdlice Eibrilla dc 10 nrn de nuclcusornas Fibra de 25 a 30 nm de croinatina de niicleosomas superenrul lados Cromosoma rnetiifAsicii condensado de las asas
1 .O 3 ; i
10 60
80í
De individuo a individuo dentro de una misma especie, el patron de tefíido (formacibn de bandas) de todo el complemento del cromosoma es altamente reproducible; no obstante, difiere de manera significativa en otras especies, aun en aquéllas íntimamente cmparentadas. Así pues, el empacamiento de las nucleoproteinas en los cromosomas de los eucariotes superiores debe depender, de alguna manera de caracteristicas clspecificas de las especies moleculares del DNA. Una combinación de técnicas de tincibn especializadas y microscopia de alta resolucibn permite a tos genetistas mapear con bastante precisión miles de genes de regiones especificas en cromosomas humanos y del ratón.
Con frecuencia, las regiones codificantes están separadas por secuencias intercaladas
Figura 3 8 6 . Dos crornátidas hermanas del cromosoma humano No 12. Amplificación 27 850x. (Reproducda con autorización de DuPraw EJ: DNA and Chrornosomes. Holt, Rinehart & Wiston, 1970 )
Las regiones codificadoras det DNA, cuyas transcripciones finalmente aparecen en el citoptasma como moléculas unicas de mRNA, esthn interrumpidasen el genoma par grandes secuencias intermedias d e DNA que no codifica. De acuerdo a esto, las transcripciones primarias del DNA, hnRNA, contienen secuencias intermedias n o codificadoras de RNA que deben retirarse en un proceso en el cual además se reúnen los segmentos codificadores apropiados para formar el mRNA maduro. Casi todas las secuencias codificadoras para un mRNA sencillo, están inten-umpidas en el genoma (y par tanto en la transcripción primaria} por cuando menos una, y en algunos casos hasta 50, secuencias intermedias no codificadoras (intrones),En la mayor parte de los cacos los inmnes son mucho mhs largos que las regiones codificadoras continuas (exones). El procesamiento de la iranscripción primaria, que comprende la remoci6n de intrones y [a escisibn de exones adyacentes, se describe con detal te en el capitulo 39.
Figura 5 8 4 . Canotipo humano (de varon con una constitucibn normal 46,XY), en el cual los cromosornas se tiheron por el método de Giemsa y alineados de acuerda con la Convencrón de Paris. (Cortesía de H Lawce and F Conte )
No esta muy clara la funci6n de las seczicncias intermedias o intrones. Pueden servir para separar dominios funcionales (exones) de inforrnaci6n codificadora, en una forma que permita se produzca el reordenamiento genetico por recombinacibn con más rapidez, que si todas [as regiones codificadoras para una función genetica dada estuvieran contiguas. Tal aumento en la velocidad del reordenamiento genktico de los dominios funcionales permitiría una evolucion mas rhpida de la función biolhgica. En la figura 38-7 se muestran las relaciones entre DNA crornosiimico, racimos de genec en el cromosama, la estructura exonintrón de los genes y los productos mRNA finales.
MUCHO DEL GENBMA MAM~FERO ES REDUNDANTE Y MUCHO NO SE TRANSCRISE El genoma haploide de cada cdlula humana esth constitiido de 3 x 1~ ' ~ a r edec bases de DNA, subdivididas en 23 cromosomas. El genoma haploide complcto contiene suficiente DNA oara codificar casi 1.5 millones de pares de genes. sin embargo, los estudios de los índices de mutacibn y de la complejidad de los genomas de organismos superiores sugieren fuertemente que los humanos tienen solo aproximadamente 100 000 proteinas esenciales. Esto implica que la
mayor parte del DNA no codifica, cs decir, su informacibn nunca es traducida en una secuencia de arninoácidos de una molécula de proteína. Es verdad que parte de las secuencias de DNA en exceso sirven para regular la expresion de los genes durante el desarrollo, la diferenciación y la adaptación al ambiente. Evidentemente parte del exceso se utili7a para ~onstniirlas secuencias intermedias que separan las regiones codificadoras de los genes, pero al parecer la mayor parte del exceso está compuesto de numerosas familias de secuencias repetidas para las cuales no se ha definido claramente iina funcihn. El DNA en un genoma eucari6tico puede ser dividido en diferentes "clases de secuencias". Éstas son secuencia iinica o no repetitiva y secuencia ñepetitira. En el DNA de secuencia única del genoma haploide, en general se incluyen genes de copia única que codifican proteínas. El DNA repetitivo del genoma haploide incluye secuencias que varían en número de copias desde 2 hasta lo7por célula.
de la mitad DNA en organismos e u c a r i ó t i c ~son ~ secuencias Únicas 0 no
repetitivas Esta apreciación (y la distribuci~nde secuencias repetitivas en el DNA) se basa en estudios con diversas tdcnicas de hibridización UN A-RNA. Técnicas seme-
Org~nizuciOny replicación del Bh'A
Cromosoma (2 a 4 K 1o3 genes)
Agrupación de genes (-20 genes)
C.
467
,3 1.5 x lo8 pb
5 5 I 5 x l 0 ~ ~ b
Gen
Tmnscripcibn primaria
Figura 38-7. La relación entre el cromosoma DNA y mRNA. El complemento del haploide DNA humano de 3 x %ogpares de bases (pb) esta distribu~doentre los 23 cromosomas. Los genes esthn agrupados en estos cromosomas Un gen promedio puede tener una longdud d e 20 000 pb, incluyendo la regidn reguladora (diagonal-) la cual, por lo general, se localiza en el extremo 5' del gen La regibn reguladora se presenta aquí como adyacente al sitio donde se inicia la transcripcidn (flechas). La mayor parte de los genes eucaribtiws tienen alternancias de exones e intrones. En este ejemplo, exrsten nueve exones (negro) y ocho intrones (áreas azules). Los intrones se retiran de la transcripdón primana mediante la reaccián d e procesamiento y los exones es!an unidos juntos en una secuencia que forma el mRNA maduro (nt, nucleótidos)
jantes se utili7an para calcular el numero de genes activos en una población de los DNA de secuencia unica. En la levadura, un eucariote inferior, se expresan aproximadamente 4000 genes. En tejidos clásicos de un eucariote superior (por ejemplo, higado y riñbn de mamíferos), se expresan entre 10 000 y 15 000 genes. En cada tejido de un organismo se expresan diferentes combinaciones de genes y la forma en que esto ocurre es una de las interrogante5 mayores aún sin respuesta en la biología.
En DNA humano, por la menos 20 a 30% del genoma consiste en secuencias repetitivas
E1 rJNA de secuencia repetitiva puede clasificarse de una manera general como moderado o altamente repetitivo. Las secuencias altamente repetitivas ectan constituidas por S a 500 pares de bases de longitud, repetidas muchas veces en tándem. Estas secuencias están usualmente agrupadas en los centrbmeros y tetomeros del cromosoma y esthn presentes apsoximadarnente en 1 a 10 millones de copias por cada genoma haploide. Estas secuencias son inactivas para la transcripcidn y pucden tener una funcilin estructural en el cromosorna. Las secuencias moderadamente repetitivas, las cuales se definen por estar presentes en menos de 1 Oh
copias por genoma haploide, no est6n agrupadas sino que se encuentran iritercaladas con secuencias unicas.
En muchos casos, estas repeticiones largas intercaladas se transcrihen por la RNA polimerasa 11 y contienen remates o coronas indistinguibles de las del ntRNA. Según su longitud, las secuencias que se repiten con moderacion se clasifican como secuencias largas intercaladas repetitivas (LINK) o secuencias cortas intercaladas repetitivas (SINE). Ambos tipos parecen ser retroposones, esto es, surgen de movimiento desde una locación a otra (transposicióln) a través de un RNA intermedio por la acciiin de la transcriptasa inversa que transcribe un modelo de RNA dentro del DNA. Los genomas de mamíferos contienen 20 a 50 mil copias de 6 a 7 kb de LINE. Estos representan familias especificas de especie o elementos repetitivos. Las SINE son m& cortas (70 a 300 pb) y puede haber m& de 100 000 c o p i a por genoma. Una familia de las SENE en el ser humano, la familia .41u, esta presente en alrededor de 500 000 copias por cada genoma haploide y representa cuando menos 5 a 6% del genoma humano. Los miembros de la familia Aln humana y de sus análogos íntimamente relacionados en otros marniferos, se transcriben como componentes integrales del hnRNA o como rnol~culasdiscretas de RNA, incluso RNA 4.55 y 7S que están bien estudiados. Estos miembros particulares de la familia están sumamente conservados dentro de una especie así como entre las especies de mamíferos. Las estructuras de las repeticiones inter-
(Capitulo 38)
caladas cortas, incluyendo los miembros de la familia Alu, son semejantes a la misma repeticion terminal larga de los retrovirus y es probable que sean elementos mhviles capaces de entrar y salir de varios sitios dentro del genoma (vkace después).
Secuencias repetitivas microsatelita!es Una categoria de secuencias repetitivas existe en forma tanto de arreglos dispersos como agrupados. Las secuencias consisten en 2 a 5 pb que se rcpiten hasta 50 reces. Estas secuencias microsatelitales se encuentran con mayor frecuencia como dinucleótidos repetitivos de AC sobre una tira de TG en la tira opuesta, pero se presentan otras diversas modalidades. Se estima que estas secuencias AC repetitivas se presentan en 50 000 a t 00 000 lc~.acionesen el genoma. En cualquier locws, el número de estas repeticiones puede variar sobre los dos cromosomas y, por tanto, otorga heterocigocidad del número de copias de u n número rnicrosatelital particiilar en un individuo. Este es un rasgo hereditario y, en virtud de su número y facilidad para detecrarlas mediante fa reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (capirulo 42), las repeticiones AC son muy útiles en la constniccion de mapas de linaje genetico. La mayoria de los genes se acompafla con uno o más marcadores catelitales, asi puede establecerse la posición relativa de los genes en los cromosomas al igual que la correlación de un gen con una enfermedad. Mediante la PCR pueden revisarse un gran número de integrantes de una familia para la detección de un cierta polimorfismo rnicrosatelital. La concomitancia de un polirnorfismo especifico con un gen en los miembros afectados de una familia, y la falta de esta concomitancia en los no afectados, puede ser el primer indicio acerca de las bases gendticas de una enfermedad. Las secuencias de trinuclebtido que aumentan en número (inestabilidad rnicrosatelital) pueden causar enfermedad. La secuencia repetitíva inestable p(CCG)n se correlaciona con el síndrome de X frágil. Otras repeticiones trinuclebtidas que conllevan mutación dinámica (por lo general, un aumento) se correFacionan con la corea de Huntington, distrofia miotónica y atrofia muscular bulbomedular.
La recornbinación cromosómica es una forma de reordenamienta de material genetico La información genética puede intercambiarse entre cromosomas similares u homologos. El fen6meno de intercambio o recombinaciún ocurre primordialmente durante la meiosis en las c6Iulas de mamíferos y requiere de la alineación de cromosomac homólogos, alineaciiin que casi siempre ocurre con gran exactitud. Hay un proceso de entrecmzamiento como lo muestra la figura 38-8. Esto da por resultado un intercambio recíproco y equivalente de información gendtica entre cromosomas homólogos. Si los cromosomas homólogos poseen diferentes alelos de los mismos genes, el entrecruzamiento producirá diferencias de unión genetica notables y hereditarias. En el raro caso en el que la alineación de cromosomas homOlogos no sea exacta, el feniimeno de entrecruzamiento o de recombinación
EL MATERIAL GENETICO PUEDE ALTERARSE Y REORDENARSE Una alteración en la secuencia de las bases purínicas y pirimidinicas en un gen, debida a un cambio, remoción o inserción de una o más bases, da por resultado un producto alterado de gen que la mayor parte de las veces es una proteína. Tal alteracibn en el material genktico da por resultado una matacibn, cuyas consecuencias se describen en detalle en el capitulo 40.
Figura 38-8. Proceso de entrecruzamiento entre uomocomas homólogos para generar cromosomas recombinantes.
Organización y replicacidn del DNA
Figura 38-9. Proceso de entrecruzamiento desigual en la regidn del genoma de marniferos que aloja los genes estructurales para la hemoglobina y la generación de productos recombinantes desiguales delta-beta Lepore y beta-delta anti-Lepore. Los ejemplos dados muestran las ubicacrones de las regiones de entrecruzamiento entre residuos de aminohcidos. (Redibujada y reproducida con autorización de Clegg JB, Weatherall DJ (lOThalammia:Time for a reappraisal? Lancet 1974:2.133.)
f
I
G~
469
ANTI-
LEPORE
B
-F.,
puede dar por resultado intercambio no recíproco de información. Un cromosoma puede recibir menos material genktico y asi ocurre una supresibn, en tanto que el otro compafiero del par de cromosomas recibe más material genetico y de este modo se presenta una insercibn o duplicacidn (figura 38-8). El entrecmzamiento desigual ocurre en los humanos, como es probado por la existencia de las hemoglobinas denominadas Lepore y anti-Lepore (figura 3 8 4 ) . El entrecruzamiento desigual afecta los arreglos en tándem de las repeticiones de DNA, ya sea que se trate de genes de globina relacionados, como en la figura 38-9 o de DNA repetitivo más abundante. El entrecruzamiento desigual a travds del deslizamiento en el pareado puede conducir a la expansión o a la contracción en el numero de copias de la familia repetitiva y puede contribuir a la expansión y fijacibn de miembros variantes a lo largo del arreglo.
-4
J-4 GY
*Y
LEPORE
feribmeno de recornbinacihn anhlogo al que ocurre entre cromosomas hornúlogos. Sin embargo, algunos bacteriófagos sintetizan proteínas que unen sitios específicos en los cromosomas bacterianos con un sitio no hom6logo específico de la molkcula del DNA del bacteribfago. La integración ocurre en tal sitio y se dice que es '"específica de sitio". Muchos virus animales, particulamente los virus encógenos, ya sea directamente o, en el caso de las virus de RNA sus transcripciones de DNA, pueden integrarse en los cromosomas de la celula de marniferos. La integracihn del DNA del virus animal dentro del genoma animal generalmente no ec "especifica de sitio".
En algunos virus ocurre integración cromocómica Algunos virus bacterianos (es decir, los baczeriófagoc) son capaces de recornbinarse con el DNA de una bacteria huésped de tal manera que la información genética del bacterihfago se incorpora en un patrón lineal dentro de la informacibn genética del huesped. Esta integración, que constituye una forma de recornbinacibn, ocurre por el mecanismo simplificado en la figura 38-10. El esqueleto del genoma circular del bacteriófago se rompe, así como el de la moltcula de DNA del huksped; los extremos apropiados se sellan de nuevo con la polaridad apropiada. El DNA del bacteribfago es figurativarnente enderezado ("linearizado") a medida que se integra en la molécula de DNA bacteriana, frecuentemente tambiiln un circulo cerrado. El sitio en el cual el genoma del bacteriófago se integra o se recombina con el genoma bacteriano se elige por 1 de 2 mecanismos. Si el bacteriófago contiene una secuencia del DNA homóloga a la secuencia de la molCcula del DNA del huesped, entonces puede suceder un
Figura 38-10. lntegracibn de un genoma circular (con los
genes, A, B y C)en una molkcula de DNA de un huksped (con los genes 1 y 2) y el consiguiente ordenamiento de los
genes
La transposición puede originar genes procesados En lar dlulas eucariotas, los elementos pequefios de DNA que evidentemente no son virus son capaces de transponerse por si mismos denwo y fuera del genoma del huésped en forma que afectan la funcidn de las secuencias vecinas de DNA. Estos elementos rnbviles denominados algunas veces "saltadores de DNA" pueden flanquear las regiones del DNA y, por tanto. afectar profundamente su evolucibn. Como se rnencion6, la familia APu de secuencias moderadamente repetidas de DNA tiene características esmicturales semejantes a los extremos de los retrovirus que tienen la capacidad de moverse dentro y fuera del genoma de los marniferos. La prueba directa de la transposicion de elementos pequefios de DNA en el genoma humano se ha logrado por el descubrimiento de los "genes procesados" para molkculas de inmunoglobulina y de alfa globina y varias otras. Estos genes procesados consisten en secuencias de DNA idknticas o casi identicas a las del RN A mensajeropara el productogenaico apropiado. Esto es, Ia regibn 5' no transcrita, la regibn codificadora sin la representacibn del incbn y la cola 3' poli(A), están presentes en disposición contigua. Este ordenamiento particular de secuencias de DNA debe haber resultado de la transcripción inversa de una mol&cula de RNA mensajero apropiadamente procesada, de la cual se retiran las regiones intronicas y se agrega la cola poti(A). El único mecanismo reconocido que esta transcripción inversa puede utilizar para integrarse en e[ genoma seria un fenbrneno de transposicihn. En realidad, estos "genec procesados" tienen repeticiones terminales cortas en cada extremo, como las secuencias de transcripci6n conocidas en organismos inferiores. Algunos de los genes procesados han sido alterados aleatoriamente durante la evolucibn, de modo que ahora contienen codones sin sentido que impiden su expresión (capítulo 40). Por tanto, se le conoce como CL~cudogene~''.
Intercambio de cromátidas hermanas En los organismos eucariotes diploides como los humanos, después de que 1% células pasan por la fase S tienen un contenido tetraploide de DNA. Este se encuentra en la forma de cromátidas hermanas de pares de cromosornas. Cada una de estas cromatidas hermanas contiene idéntica infomacion genktica, puesto que cada una es el producto de la duplicaci6n semiconservadora de la molkcula progenitora original de DNA de ese cromosoma. El entrecruzamiento ocurre entre estas cramátidas hermanas genéticamente EdCnticas. Por supuesto, estos intercambios de cromhtidas hermanas (figura 38-1 1) n o tienen consecuencia genética en tanto el intercambio sea el resultado de un entrecruzamiento uniforme.
Reordenamiento de genec para inmunoglobulinas En las celulas de mamiferos, ocurren normalmente algunos rearreglos interesantes de genes durante el desarrollo y la diferenciación. Por ejemplo, en los ratones, los genes VLy CLpara una sola molécula de inmunoglobulina (capitulo 41) esthn ampliamente separados de la línea germina1 en el DNA. En el DNA de las cClulas (plasmáticas) productoras de inmunoglobulinas diferenciadas, los mismos genes VL y CL se juntan fisicamente en el genoma, y dentro de la misma unidad de transcripcion. Sin embargo, aun asl, esta redisposicibn del DNA durante la diferenciacidn no ocasiona contigIlidad de los genes VL y CL en el DNA. En cambio, el DNA contiene una secuencia intermedia o interrumpida de 1200 pares de bases, aproximadamente, en la unión de lasregiones V y C o cerca de la misma. La secuencia intercalada es transcrita en el RNA, junto con los genes YLy CLy la información intermedia se elimina del RNA durante su procesamiento nuclear (capitulos 39 y 4 1).
La conversión degenes produce reordenamientos
LA S~NTESISY REPLICACIÓN DEL DNA SE CONTROLAN EN FORMA R~GIDA
Al lado del entrecruzamiento desigual y la transposicibn, un tercer mecanismo puede efectuar cambios rápidos en el material gendtico. Secuencias similares en cromosomas homiilogos o no hornólogos, pueden ocasionalmente parearse y eliminar cualquier secuencia dispareja entre ellas. Esto conduciría a la fijación accidental de una variante u otra a mvés de una familia de secuencias repetidas y, por tanto, homogeneizaria las secuencias de los miembros de las familias riipetitivac de DNA. Este último proceso se conoce como conversión de genes.
Se entiende que la función primaria de la replicacián del DNA es la provisibn de progenie con la informacibn genktica poseida por el progenitor. Asi, la replicaci~n del DNA debe completarse y llevarse a cabo con alta fidelidad para conservar la estabilidad genitica denbo del organismo y de las especies. El proceso de la replicación del DNA es complejo e incluye muchas funciones celulares y varios procedimientos de verificación para asegurar la fidelidad en la replicación. Alrededor de 30 proteinas están implicadas en la replicacibn del cromosorna de Escherichia coli y este proceso es casi
Ori
Proteina ori fijadora
Regibn rica en A+T
(91
o
-
Desnaturaluacibn
de la region A+T
Enlace de SSB ( 0 )
/
/
,'
Y
/
Enlace de factores. fomnactón de la
- - --. \
horquilla de replimcibn,inicio 7 de la replicacibn
/
/ retrasada
/
I
1
Polimerasa Helicasa
1 \
Primasa
\ \ 5'2 3'
\
Ti ra conduclora
5'
--
= Polimerasa = DNA naciente
i i=
Horquilla de repticacibn
m A *m4
RNA cebado1
= Helicasa = Primasa = SSB
Figura 38-12. Pasos implicados en la replicacibn del DNA La figura describe la replicación del DNA en Escher~ch~a mh, pero 10s pasos generales son similares en los eucariotes. Una interacción especifica de una proteína [la proteína 0) en el sitio de origen de la replicación (ori) resulta en la escisibn del DNA adyacente a una regibn rica en A+T. El DNA en este sitio se mantiene en la conformación de lira única {ssDNA) por preteinac enlazadoras de tira única (SSB). Esto permite que dwersas proteinas que incluyen helicasa, primasa y DNA polimerasa enlazar e iniciar la sintesis de DNA. La horquilla de replicación procede conforme avanza la sintesis continua del DNA (flecha gruesa) sobre la tira conductora y diswntinua (flecha fraccionada) en la tira retrasada.
Escisión del DNA La interacción de las proteínas con ori define el sitio de arranque de la replicación y proporciona una pequefia region de SSDNAesencial para iniciar la sintesis de la tira naciente de DNA. Este proceso requiere la formación de algunas interacciones proteína-proteína y proteína DNA. Una etapa critica se proporciona por una DNA helicasa que permite la escicibn procesada del DNA. En las cklulas no infectadas de Escherichia coli esta funci6n la proporciona un compleja de dnaB helicasa y la proteina dnaC. Las proteinas enlazadoras de DNA de tira unica (SSRs} estabilizan este complejo. En Escherichia coli infectada con fago lambda, la proteina Pdel fago enlaza al dnaB y el complejo Po dnaB enlaza a orilambda por interñccién con la proteina O. El dnaB
no es una helicasa activa cuando se encuentra en el complejo P-dnaR.0. Tres proteínas de golpe de calor de Eschericia coli (dnaK, d n d y GrpE) cooperan para retirar la proteina P y activar la dnaB helicasa. En cooperación con SSR esto conduce a la escisión del DNA y activa la replicacibn. En esta manera, la replicación del fago lambda se completa a expensas de la replicacién de la célula hospedera de Escherichia coli.
Formación de la horquilla de replicación Una horquilla de replicación consiste en cuatro componentes que se forman en la secuencia siguiente: 1) la DNA helicasa escinde un segmento corto de la dupleta de DNA progenitor; 2) una primasa inicia la sintesis de una molécula de RNA para iniciar la sintesis de DNA;
-
3 ) la DNA polimerasa inicia la síntesis de la tim hija naciente, y 4) SSBs se enlaza a dsDNA y evita la conversión prematura de ssDNA a dsDNA. Estos cornponentes se demueswan en la figura 38-1 2. La holoenzima polimerasa 111 (el producto del gen dnaE en Escscherrchia coli) enlaza la plantilla de DNA como parte de un complejo multiproteínico que consta de varios factores accesorios de la polimerasa (beta, gamma, delta, delta' y teta). Las DNA polimerasas 5610 sintetizan DNA en las posiciones 5' a 3' y $410 uno de los diversos tipos de polimerasas participa en la replicación de la horquilla. En virtud de que las tiras del DNA son antiparalelas (capitulo 37), la polimasa funciona de manera asimktrica. Sobre la tira conductora Canterograda), el DNA se sintetiza de manera continua. Sobre la tira retrasada (retrógrada), el DNA se sintetiza en fragmentos cortos (1 a 5 kb), estos son los denominados fragmentos Okazaki. Deben sintetimse en secuencia varios @asta 250) fragmentos por cada replicación de la horquilla. Para asegurar que esto sucede, la helicasa actija en la tira retrasada para escindir el dsDNA en dirección de 5' hacia 3" La helicasa se reúne con la primasa para afrontar el ultimo acceso adecuado al modelo. Esto permite hacerlo al RNA cebador y, a su vez, a la polimerasa iniciar la replicación de! DNA. Esta es una secuencia de reaccibn importante ya que las DNA polimerasas no pueden iniciar la síntesis de nwo de DNA. El complejo movil entre helicasa y primasa se denomina primosoma. Conforme se completa la sintesis de un fragmento Okazaki y la polimerasa se libera, se ha sintetizado un nuevo cebador. La misma molécuta de polimerasa permanece integrada con la replicacibn de la horquilla y procede a sintetizar el siguiente fragmento de Okazaki.
El complejo DNA polimerasa La primera enzima implicada en la replicacibn del DNA es la DNA polimerasa 111 la cual, en Escherichia coli, es un producto de 132 kDa del gen dnaE. Esta holoenzima (tarnbikn denominada polimerasa alfa) es incapaz de copiartiras largas del ssDNA. El complejo funcional consiste en 10 diferentes protelnas: alfamas otras nueve subunidades. Estas varían en tíunafío desde 12 a 7 1 kDa y el complejo final es > 1 MDa. Este complejo conforma una enzima con gran capacidad de proceso cap. de polimerizar 0.5 mb despuks de un evento primario en la tira conductora. El comple-¡o tiene algunas otras actividades que permiten la lectura de verificación y la reparacibn en el caco de efectuar un error de copiado. En las células de mamíferos, la polimerasa es capaz de polimerizar alrededor de E 00 nucleótidos por segundo, velocidad al menos 10 veces menor que la
Organizaciriny replicación del DNA
4 73
de polimerizacihn de desoxinucleótidos por el complejo bacteriano de DNA polimerasa. Esta velocidad reducida puede ser el resultado de interferencia por nucleosomas. Se desconoce la manera en que el complejo de replicación se relaciona con los nucleosornas.
inicio y elongación de la
del DNA
El inicio de la síntesis del DNA (figura 38-12) requiere preparación por un eslabbn corto de RNA, de 10 a 200 nucleótidos de longitud. Este proceso de cebado implica el ataque nucleofílico por el grupo 3'-hidroxilo del RNA ceebdor cobre el alfa fosfato del DNA pasa introducir un trifosfato de desoxinucleósido (N en la figura 38-1 3) con separacibn del pirofosfato. El gmpo 3'-hidroxilo del monofosfato de desoxirribonucleósido recientemente agregado es entonces libre de llevar a cabo un ataque nucteafilico sobre el siguiente trifosfato de desoxirribonuclebsido (N + I en la figura 38-13), otra vez en su fracción alfa fosfato con la separacidn de pirofosfato. Por supuesto, la s e l e c c i h ~de! desoxirribonucleo~idoapropiado cuyo grupo 3'-hidroxilo terminal va a ser atacado de~ la otra pende del pareado apropiado de las b a s con tira de la molécula de DNA, de acuerdo con las reglas propuestas originalmente por Watson y Crick (figura 38-14). Cuando una fracción de adenindesoxirribonuclebsido monofosforilo estB en la posicion de molde, entra un trifosfato de timidina y su fosfato alfa es atacado por el grupo 3'-hidroxilo del desoxirribonucleósido monofosforilo mas recientemente agregado al polimero. Por este proceso gradual, el molde dicta que trifosfato de desoxirribonucle6sido es complementarioy lo conserva en su lugar por puentes de hidrdgeno, mientiric que el gmpo 3'-hidroxilo de la tira en crecimiento ataca e incorpora al nuevo nucleotido en el polimero. Estos fragmentos de DNA agregados a un componente del RNA cebador fueron descubiertos por Okazaki, por tanto, son referidos corno fragmentos de Okazaki (figura 38-1 5). En los mamifcros, después de que se generan muchos fragmentos de Okazaki, el complejo de replicacidn comienza a retirar los RNA cebadores, para llenar los huecos dejados por su retiro con el desoxinucleotido de bases pareadas apropiado y luego sellar los fragmentos del DNA recientemente sintetizado por enzima referidas como DNA ligasas.
La replicación muestra polaridad Como ya se hizo notar, las moleculas de DNA son de doble tira y las dos tiras son antiparalelas, esto es, corren en direcciones opuestas. La replicaci~ndel DNA en los procariotes y loseucariotes ocurreen ambas tiras sirnult8neamente. Sin embargo, una enzima
4 74
(Capítulo 38)
Bioquimica de Hai-per
I
1 N]
OH
o Primer dNTP entrante
O OH
segundo dNTP entrante
O \P
H
Od\O-
'
051
H
Figura 38-13. Inicio de la síntesis de DNA sobre un cebador de RNA y la subsiguiente adherencia del segundo trrfosfato de desoxirribonuclebtido.
Organizaciíiny replicación del WNA
Figura 38-?4. Sintesis de DNA preparada por RNA que muestra progenitor.
4 75
la funcion de molde de la tira complementaria del DNA
adelante. Replica la otra tira ("tira rezagada") de manera discontinua, mientras polimeriza los nucleotidos en hilos cortos de 150 a 250 nucleótidos, una vez más en la direccibn 5' a 3', pero al mismo tiempo se vuelve hacia el extremo posterior del RNA cebador precedente y no hacia la porcibn no replicada. Este proceso de sfntesis semidiscontinua de DNA se muestra diagramaticamente en la figura 3X-12.
capaz de polimerizar el DNA en la direccibn de 3' a 5' no existe en organismo alguno, de manera que ambas tiras de DNA replicadas recientemente no pueden crecer en la misma dirección simultáneamente. Sin embargo, la misma enzima parece replicar ambas tiras a1 mismo tiempo. La enzima individual replica una tira ("tira conductora") en fama continua en la dirección de 5' a 3' con la misma direccibn global hacia
DNA molde
5'
3'
1
I
Fragmentos de Okazaki
Figura 38-1 5. Polimerizacibn discontinua de los desoxirribonuc~btidosy la forrnacidn de fragmentos de Okaraki.
En el genoma nuclear de Ios mamiferos, casi todos los RNA cebadores se eliminan finalmente como parte del proceso de replicacidn, mientras que después de la replicación del geooma mitocondrial la piela pequeila de RNA permanece como parte integral de la estructura cerrada circular de DNA.
~
~de burbujas ~ de replicación ~
~
La replicación avanza a partir de un simple ori en el cromosoma circular bacteriano. Se replica el genoma entero de los mamiferos en nueve horas. el periodo promedio requerido para la formación de un genoma temploide a partir de un genoma diploide en una c6lula que se replica. Esto requiere de la presencia de orígenes mUltiples de replicación del DNA, que aparecen en racimos hasta de 100 unidades de replicación. La replicación se realiza en ambas direcciones a lo largo del c r o m o s o m a y e n ambas tiras simulthneamente. Este proceso de replicacibn genera "burbujas de replicación" (figura 38-16). Los múltiples sitios que sirven como origenes para la replicación del DNA en los eucariotes estltn escasamente definidos, excepto en unos cuantos virus animales y en levaduras. Sin embargo, es evidente que el inicio se regula tanto en el espacio como m el tiempo, ya que los racimos de sitios adyacentes inician et proceso de forma sincrhnica. Se ha propuesto que los dominios funcionales de la cromatina se replican como unidades intactas, lo cual implica que los orígenes de la replicacibn están localizados con especificidad respecto a las unidades de transcripción. Durante la replicacion del DNA, debe h a k r una separación de las dos tiras para permitir a cada una servir como un molde por el que se forman enlaces de hidrbgeno entre sus bases nucleotidicas y tas moléculas de trifosfatos de nucle6sido que están llegando. La separación de la doble hdlice del DNA se mantiene por mol~culasde proteínas especificas que estabilizan
la estructura de una cola tira en tanta qiie la bifurcacihn de replicación avanza. Estas proteínas estabilizadoras se unen en forma estequiométrica a las tiras sencillas sin interferir con la capacidad de los nucle6tidos para servir como moldes (figura 38-12). Además de la separación de las dos tiras de la doble hklice, debe ocurrir un desenrollamiento de la molecula (un giro cada 10 paresde ~nuclebtidos) ipara permitiró la separación ~ de las tiras. Dado el t i e m ~ odurante el cual la re~licación del DNA debe ocumk, es necesario que en segmentos. Hay numerosas "placas giratorias" o "alacranes" intercalados en las rnol~culasde DNA de todos Pos organismos. La funci6n de lanzadera se proporciona por enzimas especificas que introducen "mellas" en una tira de la doble hblice desenrollada, permitiendo por tanto que el proceso de desenroIlamiento prosiga. Las mellas se sellan rápidamente sin requerir entrada de energia, debido a la fomaciiin de un enlace covalente de alta energia entre el esqueleto fosfodikster mellrtdo y la enzima que cataliza ambos procesos: e! melado y el cierre de la mella. Las enzimas que mellan y sellan se denominan DNA topoisomerasas. Este proceso se presenta en forma esquemhtica en la figura 3 8-17 y es comparable at resello que depende de ATP realizado por las DN A ligasas. ¡,as topoisomerasas tienen capacidad para desdoblar DNA superenrollado. Este DNA superenrollado es una estructura de orden superior que existe en moléculas circulares (o extraordinariamente largas) de DNA enrolladas alrededor de un centro, como se observa en la figura 38-1 8. En una especie de virus animales (retrovirus) existe una clase de enzimas capaces de sintetizar una moltculade DNA de una sola tira y luego unade doble tira a partir de un molde de RNA de una sola tira. Esta polimerasa, la DNA polimerasa dependiente de RNA o "transcriptasa inversa'hintetiza primero una molkcula hibrida de DNA-RNA utilizando genoma de RNA como molde. Una enzima especifica, la RNasa H, degrada la tira de RNA, y la tira de DNA remanente a su vez sirve como moIde para formar una molécula Origen de la replicacibn
"Burbujas de replicacibn"
en las horquillas de
replicación
1
-Direcciones de
la replrcacibn
Figura 38-1 6. Generacibn de "burbujasde replicacibn" durante el proceso de sintesis de DNA Se representan la replicacibn bidireccional y las posiciones propuestas de las proteinas que desanrrollan en las horquillas de replicacibn.
OrganizaciOny replicacidn del DNA
DNA ligasa = E
DNA toooisomerasa I = E
E+ATP
3a
4 77
generada por enzima
i -E
A
B@
Una sola tira de mella
Paso 2
Formacibn de un enlace de alta energía
Paso 3
Mella arreglada
1
Mella arreglada
Flgura 38-17. Comparacibn de dos tipos de reacciones de sellado de mellas sobre el DNA. La serie de reacciones de la izquierda se cataliza por la DNA topoisomerasa 1, y a la derecha por la DNA Iigasa. (Ligeramente mcdtticada y reproducida con autorización de Lehninger AL: Biochemistry, 2nd de. Worth, 1975.)
de DNA de doble tira que contiene la informacion originalmente presente en el genoma de RNA del virus animal.
Reconstrucción de la estructura de la cromatina Hay pruebas de que la organizacibn nuclear y Ia estructura de 1a.cromatina participan en la determinación de laregulacibn e inicio de la sintesisdel DNA. Como se menciona antes, la velocidad de palimerizacibn en las ~élulaseucariotas, las cuales tienen cromatina y nucleosomas, es 10 veces menor que la de ctlulas procariotas que tienen DNA desnudo. También está claro que la estructura de la cromatina debe rehacerse despuds de la replicacihn. El DNA recién replicado se
ensambla con rapidez dentro de los nucleosornas y los octárneros de la histionapreexictentes y recién ensarnblados se distribuyen al azar en cada brazo de la horquilla de replicacibn.
La síntesis de DNA ocurre durante la fase S del ciclo celular
En las cdlulas animales, incluyendo las humanas, la replicación del genoma de DNA ocurre solamente en un periodo especifico durante la vida de la qélula. Este periodo se indica como fase sintdtica o S. Este, por lo general, estB separado temporalmente de la fase mitótica por periodos no sinteticos referidos como intervalo 1 (G1) e intervalo 2 (G2), que se presentan antes y despuds de la fase S , respectivamente (figu-
Mitosis
Figura 38-1 8. Superenrollamiento del DNA Un superenroIlamiento toroidal (selenoidal) a la izquierda,se convertirá en un superenrollado entrelazado a la derecha, cuando se retira el centro cilindrim Tal transición es análoga a la que ocurre cuando los nucleosomas se destruyen por la extraccibn de las histonas de la cromattna con soluciones salinas concentradas
ra 38-1 9). La cdlula regula la sintesis de DNA burdamente, permitiéndole yire ocurra sólo en periodos específicos y en SU mayor parte en células en preparacibn para dividirse por un proceso mitotico. Al parecer, todas las células eucari6ticac tienen productos genéticos que gobiernan la transición de una fase de! ciclo celular a otra. Las ciclinas son una familia de proteínas cuya concentración aumenta y disminuye a travks del ciclo celular, de ahí su denomiriación. Las ciclinas activan, en el momento apropiado, diversas proteínas cinasas dependientes de ciclina (CDK)que fosforilan sustratos esenciales para la progresion del ciclo celular. Por ejemplo, las concentraciones de la ciclina D aumentan en la fase G I tardia y permiten la progresión mis allá del punto de arranque (levaduras) o punto d e restricci6n (mamíferos), punto en el que la celula procede a la fase S o de sintesis de DNA. La ciclina D activa CDK4 y CDK6. Estas dos cinasas tambidn se sintetizan durante la fase G1 en célula bajo divisibn activa. Las ciclinas D y CDK4 y CDK6 son proteínas nucleares que se ensamblan como complejo en la fase G1 tardía. EI complejo es una proteína cinasa de serina-treonina. Un sustrato para estacinasa es la proteina del retinoblastoma (Rb).
Figura 38-$9. Ciclo de las células de mamifero. La fase de cintesrs del DNA (fase S) está separada de ta mitosis por los La flecha fuera del circulo indica intervalos 1 (G1) y 2 (G2). el avance del údo celular La punta de flecha blanca indica el inicio (levadura) o punto de restricción (marniferos)en donde actúa CDK4 o CDK6 despuPs de su adivacibn por cictina D. Esta proteína cinaca anula una inhibición, quiz8 mediante el producto del gen Rb y el avance del ciclo celular comienza. La punta de flecha negra indica et momento en que se alcanza la concentración máxima del complejo de ciclina BICDKI . De este modo la célula puede experimentar mitosis.
La Rb es un regulador del ciclo celular porque se liga a, e inactiva, un factor de transcripcion (E2F) necesario para la transcripción de genes y la progresibn de la fase G 1 a la S. La fosforilacibn de Rb por CKD4 o CDK6 produce la liberación de E2F de Rb, activacibn de gen (por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa) y la progresibn en el ciclo celular. Otras ciclinas y CDK están implicadas en diferentes aspectos de la progresion del ciclo celular (cuadro 38-3). La ciclina E y CKD2 forman un complejo en la G 1 tardia. La ciclina E se degrada con rapidez y la liberacidn de CDK2 forma entonces un complejo con la ciclina A. Esta secuencia es necesaria para el inicio de la sintesis de DNA en la fase S. Un complejo
Cuadra 38-3. Ciclinas y cinasas dependientes de ciclinas implicadas en la progresión del ciclo celular ... .
C
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D
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5
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6 Progresi rido el puntc> de restriccion cn ia rrontera +
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i entre G
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-
1 Inicio di:la síntesis de DNA er1
la fase 5 ,,,,
Transici
,,,,,
Organizacihny replicacidn del DYA
entre la ciclina B y CDKI es limitante de la velocidad de la transici6n G2/M en las células eucariotas. Muchos de los virus que producen cáncer (oncovirus) son capaces de aliviar o de interrumpir la aparente restriccion que normalmente controla la entrada de las células de los mamíferos desde G 1 a la fase S. A partir de lo mencionado, se puede suponer que la produccirin en exceso de una ciclina o la producción en un momento inapropiado. puede resultar en la division anormal irrestricta de la célula. En ette contexto e5 una observacjón enriquecedora que el oncogen hcl concomitante con el linfoma de células B parece ser el gen de la ciclina D l . Durante la fase S, las células de marniferos contienen cantidades mayores de DNA polimerasa alfa que durante las fases no sintéticas del ciclo celular. Además, las enzimas responsables de la fonnacibn de los sustratos para la sintesis de DNA, esto es, de trifosfatos de desoxirribonucle6sido, tambikn tienen aumento en su actividad y dsta disminuye después de la fase sintética hasta la reaparicibn de la seiial para la sintesis renovada de DNA. Durante la fase S, el DNA nuclear es replicado completamente una vez y s61a una. Al parecer la cromatina se marca una vez replicada para impedir una réplica ulterior hasta que pasa nuevamente por la mitosis. Se ha sugerido que la rnetilación de DNA puede servir como un marcador covalente. En general, un par dado de cromosomas se replicarh simÜltfineamente y dentro de una porcibn fija de la fase S en cada replicación. En un cromosoma, se replican en forma coordinada grupos de unidades de replicación. Se desconoce la naturaleza de las sehales que regulan la síntesis del DNA a estos niveles, pero al parecer, la regulacihn es una propiedad intrinseca decada cromosoma individual. -
El DNA dañado se repara por enzimas La conservación de la integridad de la información en las molCculas de DNA es de suma importancia para que sobreviva un organismo particular, asi como para la supnlivencia de las especies. Así, se podría concluir que las especies sobrevivientes deben haber desarrollado mecanismos para la reparacibn d d dafio infligido al DNA como resultado de errores de replicacion o de agresiones ambientales. Come se describe en el capitulo 37, la mayor responsabilidad por la fidelidad de replicacibn reside en el pareamiento especifico de las bases de los nuclebtidos. El pareamiento apropiado depende de la presencia de los tautbmeros favorecidos de los nuclebtidos purínicos y pirimídinicos, pero el equilibrio en el cual un tautómero es más estable que otro es sólo de lo4 o \O5 aproximadamente, en favor de aquel con mayor estabilidad. Aunque esto no es suficientemente favorable para asegurar la alta fidelidad que es nece-
4 79
saria, el favorecimiento de los tautlimeros preferidos, y, por tanto. del pareamiento de bases apropiadas, podría asegurarse mediante verificacion por dos veces del pareamiento. Tal verificación doble parece ocurrir en ambos sistemas, el bacteriano y el de los mamiferos; una vez en el momento de la insercibn de los trifosfatos de desoxirribonucleósido y mBs tarde por un mecanismo complementario que utiliza energia y que elimina todas las bases impropias que puedan presentarse en la tira recién formada. Esta doble verificaciiin no permite que ocurran emres de mal pareamiento debido a la presencia de los tautbmeros no favorecidos con niayor frecuencia, que ocurren una vez cada 1 O'"a 10" pares de bases. La moldcula encargada de este rnecanism e de verificación es la actividad de exonucleasa 3' + 5' dentro de la DNA polimerasa en E. coli pero las DNA polimerasas de los marniferos no poseen de manera evidente esa funcihn de corrección de pruebas de una nucleasa. Otras enzimas catalim esta función de reparación. Los errores de replicacibn, aún con un cisterna de repat-acibn muy eficiente, conducen a la acumulacibn de mutaciones. Un ser humano tiene 10" células nucleadas, con 3 x 10' pares de bases por cklula. Si durante la vida se producen 10" divisiones celulares y 1O-'' mutaciones por par de bases por escape de reparación de generación celular. finalmente podria haber tantas como una mutacion por 1 en el genoma. Por fortuna, gran parte de esto ocurrírá probablemente en DNA que no codifica proteinas o no afectarli la funcibn de protehas codificadas y que, por tanta, no son de consecuencia. Ademlis, debe repararse el DNA dafiado de manera espontanea o quimica. Cuadro 38-4. Tipos -de dafio al DNA -- -. ..--
-
---..A"
--
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.
l. Alterac:ión dc una1 sola base h. Despurinacihn B.Desminacibn L. uzsaminación ae aaenina a nipoxantina D. Alqurlaciiin de una base E. inserción o supresión de 1 F. Incorporacibn de un anhlogo ae Date
--
11.
Alterar:iÓn de dos bases A. Di, iero timina-timina inrlucido por luz ultravi 0leta D
C-l.
1L.-+*
L:r..".
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de la cadana iaciún ionizante
^:L- . --A!--&:-.Inicmauon raulauiva :-i----
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cb(;ttLcntus del esuue-
leto
IV. Enlace cniz*tdo A. Entre bases en ia misma tira o en riras opuestas B. Entre el DNA y molkculas de proteinas (por ejemplo, histonaql
480
(Cap Ítzdltlo 3 8,
Bivquirnrca de Hmper
El daño al DNA por agentes ambientales, físicos y químicos puede clasificarseen cuatro tipos (cuadro 3 8 4 ) . Las regiones morniales del DNA, ya sea por errores dc copiado y daiio del DNA, se remplazan por medio de tres mecanismos: 1) repamcion por desigualdad, 2) reparación por escisi6n de base y 3) reparación por escisidn de nucleotido (cuadro 38-5). Estos mecanismos se basan en la redundancia de la informacibn inherente cn la estructura de la doble htlice del DNA. La región defectuosa en una de las tiras puede ser reintegrada a su forma original ateniendose a la infomacion comptementaria almacenada en la tira no afectada.
DE LA TIRA UNICA POR GATC ENOONUCCEASA CH3
Reparación por desigualdad La reparacidn por desigualdad corrige errores hechos cuando se copia el DNA. Por ejemplo, una C puede insertarse opuesta a una A, o la polimerasa puede brincar o entrecortar e insertar 2 a 5 bases adicionales no pareadas. Proteínas específicas verifican el DNA recién sinteti~adoutilizando la metilacibn de la adenina en el interior de una secuencia GATC como punto de referencia (figura 3X-20). Si se encuentrauna desigualdad o asa pequefia, una GATC endonucleasa corta la tira que lleva la mutación en un sitio que corresponda a la secuencia GATC. En seguida una endonucleasa digiere Ia tira desde la secuencia GATC hasta la mutacibn, y por tanto remueve el DNA fallido. Esto puede suceder desde cualquier terminal si al defecto lo apuntan dos sitios GATC. A continuacibn el defecto se llena por las enzirnas celulares normales de acuerdo con las reglas de pareo de las bases. En Escherichia coli se requieren mes proteinac (Mut S, Mut C y Mut H) para reconocer y desnudar la tira. Otras enzimas celulares que incluyen ligasa, polimerasa y SSB retiran y rernp l a n la tira. El proceso es algo mLs complicado en las células de los mamíferos, toda vez que implica a seis proteinas en los primeros pasos. La reparacibn por desigualdad defectuosa se vincula con el ctincer colónico no poliposo heredimio (CCNPH),uno de los cánceres hereditarios m6s frecuentes. Los estudios genéticos vinculan el CCNPH
---
Re
--
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POR POLfME!XA$A CH3
5'
3'
Ez?Il POR L I G A S
Figura 38-20. Reparacibn por desigualdad del DNA Este mecanicme corrige la desigualdad tinica de un par de bases (por ejemplo, C con A en vez de T con A) o una porcibn corta de DNA no pareado. La regibn defectuosa se reconoce por una endonucleasa que efectúa un corte unico de la tira adyacente a una secuencia GATC metilada. La tira de DNA se retira a lo largo de toda la mutacibn, se repara y reune.
en algunas familias a una regi6n del cromocoma 2. Después se demostro que el gen localizado, que se denomina hMSH2, en apariencia es el hornologo humano de la proteina Mut S de &ckrichia coli implicada en la reparación por desigualdad (vtase antes). El
Cuadro 38-5. Mecanismos de reparación del DNA A
-
Mecrnism
--
I
or desigual dad
--
--
-
--.--
-
P
ProbIema --
So
Errores de copiado (base iiiiica o asas : le latiragu iado por rnt:tilo, digespareadas de 2 a 5 bases) ir exonucleasa y repmiición :o, químicc o por radj,a- 1 Remoc:i6nde la h ase por IV-E;lucosilasa, s espondn~ cibn a una sola base remoci6n dsl aziicar sin baise, reposip -
Reparación por escisión de base -
l
cibn
-
-
Reparacibn por escrsion de nucle0tido Uarlo csponthneo, quirnico o por radia- Kemocibn de un oiigomero de cerca de ción a un segmento del DNA 30 nucleótidos y reposicion
Organizaciríny replicacibn del DNA
hMSH2 representa 50 a 60% de los casos de CCNPH; otro gen, el hMLH 1, se relaciona con muchos otros casos. El hMLH 1 es el análogo humano del gen Mut L de la reparación por desigualdad en la bacteria. iC6m0 es que la reparacihn por desigualdad defectuosa produce cáncer colónico? Los genes humanos se localizaron porque se detectó inestabilidad microsatelital. Esto es, las células cancerosas tienen un microsatelite de diferente longitud del que se encuentra en las células normales de un individuo. Al parecer la celula afectada, misma que desarrolla una enzima hMSW2 o hMLH I mutada. es incapaz de retirar las asas pequefias del DNA no pareado y entonces el microsatelite aumenta de tamaflo. Esto debe afectar la funcion de una protcina crítica en la vigilancia del ciclo celular en tales células del colon.
Reparación por escisión de base La despurinación del DNA, que ocurre esponthneamentc debido a ta terrnolabilidad del enlace N-glucosídico de las purinas, se produce en una proporcion de 5000 a 10 000/célulddia a37 "C. Enzimas especificas reconocen un sitio despurinado y remplazan directamente la purina apropiada, sin í n t e m p c i ~ ndel esqueleto fosfodikster. Ambas bases, citosina y adenina, en e[ DNA se desaminan en forma espontánea para formar uracilo e hipoxantina, respectivamente. Puesto que ni uracilo ni la hipoxantina existen normalmente en el DNA, no es de sorprender que las N-glacosilasas especificas puedan reconocer estas bases anormales y remover a la base misma del DNA. Esta eliminaci6n marca e! sitio del defecto y permite auna endonucleasaapurínica o apirimidinica hacer una incision en el esqueleto apropiado, cerca del defecto. A continuacidn se repone la base apropiada por una DNA polimerasa beta de reparacion y una Iigas~retorna al DNA a su estado original (figura 38-2 1). A esta serie de fenómenos se le denomina escisibn-reparacibn de base. Mediante una serie similar de pasos que involucran el reconocimiento inicial del defecto, pueden eliminarse las bases alquiladas y los anzilogos de base del DNA para hacer que éste retorne a su contenido original de información. Este mecanismo es adecuado pard remplazo de una base unicaperonoes efectivo en remplazarregiones de DNA dafiado.
Reparacidn por escisión de nucleotido Este mecanismo se utiliza para remplazar regiones de DNA dafiado con longitud de hasta 30 bases. Los ejemplos frecuentes de daAo del DNA incluyen la luz ultravioleta(UV), la que induce la formaci6n de dimeros de ciclobutano pirimidina-pirimidina y el tabaquismo que causa la formaci6n de adultos de la benzo[a]pirenoguanina. La mdiacibn ionimnte, los quimioterapéuticos
3'
A T C G G C T C A T C C G A T
181
5'
I I I I I I I I I I I I I I I 5' T A G C C G A G T A G G C T A g
I
Energía caldrica A T C G G C T U A T C C G A T
1 1 1 1 ~ I I I I I I I I I I T A G C C G A G T A G G C T A
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[URACILO DNA GLUCOSILASA~
Ir A T C G G C T * A T G G G A T
I I I I I I I I I I I I I I I T A G C C G A G T A G G C T A
A T C G G C
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I I I I I I
I I I I I I
T A G C C G A G T A G G C T A 1
A T C G G C T C A T C C G A T
I I I I I E I I I I I I I I I T A G C C G A G T A G G C T A
Figura 38-21. Esdsihn-reparacibn de base de DNA La enzima uracila DNA glucosilasa retira al uracilo creado por desaminación espontánea de la citosina en el DNA Una endonucleasa secciona el esqueleto cerca del defecto, luego, otra elimina algunas bases que incluyen el error, el espacio se llena por accibn de una polimerasa reparadora y las tiras se unen por una Iigaca. (Cortesla de B Atberts )
del c h c e r y diversas sustancias químicas del ambiente causan modificaciones en la base. roturas de tiras. enlaces cruzados entre bases y las ti& opuestq o entre el DNA y proteína, y otros diversos efectos. Estos se reparan mediante un proceso denominado reparacirjn por escisión de nucléotido (figura 38-22), Este proceso complejo que implica más productos génicos que los otros dos tipos de reparacihn, en lo esencial se logra mediante la hidrólisis de dos enlaces fosfodiéster en la tira que contiene el defecto. La tarea se realiza por una nucleasa especial de escisibn (exinucleasa) que en E~cherichiacoii consta de al menos tres subunidades y en el humano de 17 polipéptidos. DespuCs de que la tira se retira se le repone, de nuevo por un pareada exacto de las bases, mediante otra polimerasa (deitalépsilon en humanos) y las terminales se unen a las tiras existentes de DNA mediante DNA Eigaca. Algo sorprendente es la observación reciente de que las proteínas reparadoras del DNA pueden atender otros propósitos. Por ejemplo, algunas enzimas reparadoras tambikn se encuentran como componentes
(Capíhlo 3 8)
En los pacientes con ataxia-telangiectasia, una enremedad autocómica recesiva de los humanos que da por resultado la aparición de ataxia cerebelosa y neoplasmas linforreticulares, parece existir una sensibilidad aumentada al daño por los rayos X. Los pacientes con anemia d e Fanconi, una anemia autosomica recesiva caracterizada por un incremento en la frecuencia de cáncer y por inestabilidad cromosómica, probablemente tengan reparacibn defectuosa del dafio por enlace c n i ~ a d o . Estos tres sindiomes c tinicos esthn relacionados ESClSloN DEL QLIGI~NUCLE~TII~~) a uii incremento en la frecuencia de cancer. Es POR CORTE EN DOS,SITtOS verosímil que en el futuro se identifiquen otras enfermedades humanas resultantes de las capacidades alteradas de reparacibn del DNA.
RESUMEN
Figura 38-22. Reparacibn por escisibn de nucle6ttdos. Este rnecanisma se emplea para corregir grandes defectos en el DNA y por lo general implica m i s proteínas que las reparaciones por desigualdad y por escisibn de bases Despues de reconocer el defecto y escindir el DNA en la porcidn defectuosa, una nucleaca de eccisidn (exinucleasa) corta el DNA arriba y abajo de la porción defectuosa Una polimerasa (&/E en humanos) llena a continuacibn el espacio y reúne las porciones
del gran complejo TFIIH que desempefia una funcion central en la tmnccripcibn ghnica (capitulo 39). O í ~ como ponente del TFIIH participa en ia regulación del ciclo celular. Por tanto, estos procesos ceIulares fundamentales pueden vincularse mediante el uso en común de proteinas. También se tienen bastantes datos de que atgunas enzimas de reparaciiin participan en los reacomodos g h i c o s que acontecen de manera normal. La xerodermia pigmentosa es una enfermedad gendtica autosiimica recesiva. (VCase tarnbitn Caso No. 1 en capítulo 65,)El síndrome clínico incIuyemarcada sensibilidad a la luz solar (ultravioleta) con la subsiguiente formacihn de múltiples cánceres curaneos y muerte prematura. El riesgo de desarrollar c h c e r incrementa de 1000 a 2000 veces. El defecto hereditario parece implicar la reparacibn del DNA dafiado. Las cPllulas cultivadas de pacientes con xerodemia pigrnentoca presentan actividad disminuida de los nucleótidos del proceso de escisibn-reparación. Estan identificados siete grupos de complementaci6n mediante anlillsis con celulas híbridas asi como seis genes de xerodermia pigmentosa.
El DNA de células eucarióticas se relaciona con diversas proteínas para f u m a r una estructura conocida como cromatina. La helice de t ira doble de DNA en la cromatina de cada cromosoma eucariótico tiene una longitud que es varios miles de veces mayor que el diámetro del núcleo celular. Gran parte de este DNA se combina con proteinas histonas para formar una estructura llamada nucleosoma. Los nucleosomas sirven para hacer compacto al DNA. Otras estructuras de orden superior, la fibriIla de 10 nrn y la fibra de 30 nm, hacen más compacta al DNA. En estas condiciones, hasta 90% del DNA es inactivo respecto a la transcripción. El DNA de los nucleosomas no es sensible a la digestibn por nucleasas. El DNA activo para transcripción es sensible a! ataque de las nucleasas y algunas regiones son excepcionalmente sensibles. Con frecuencia se ha encontrado que estas regiones hipersensibles contienen sitios de control de transcripci6n. El DNA activo para mscripciOn (los genes) se encuentra a menudo en conglomerados en ciertas regiones de cada cromosoma. Dentro de estas regiones, los genes pueden estar separados por DNA inactiva en estructuras nucleosbmicas. Una subdivisi~nadicional ocurre dentro de los upenes. La unidad de transcripci~n,que es la porcihn de un gen copiado por RNA polimerasa, consiste en regiones codificantes del DNA (exones) interrumpidas por secuencias intercaladas de DNA no codificante (intrones). Durante el procesamiento del RNA, los intrones se retiran y los exones se unen para formar el mRNA maduro que aparece en el citoplasma. El DNA eucariote de c6lulas en reposo (no en divici6n) se localiza en cromosomas, que en forma clhsica se agrupan como pares id6nticosl El DNA de cada cromosoma se reeiica exactamente de acuerdo con las reglas del p a r e a r k m de bases durante la fase S del ciclo celular. Cada tira de la doble hetice se r e ~ l i c ade manera simufthea, pero por mecanismos algo diferentes. Un complejo de proteínas, incluyendo DNA polimerasa, replica la tira conductora en forma continua
en la direccibn 5' a 3'. La tira rezagada se replica en forma discontinua, en fragmentos de 150 a 250 nucleótidos, en la direccibn 3' a 5'. Éstos son unidos por DNA ligasa. La rep]icacién de] DNA comienza en varios sitios a la vez, llamados burbujas de replica-
cibn, en cada cromosoma. En una celula clásica el proceso entero dura alrededor de nueve horas. Una diversidad de mecanismos, que utilizan diferentes enzirnas, reparan el DNA cuando se daña por exposici" a m ~ ~ g e l I 0~ S U ~ X ~ C OO radiacíbn S ~lWa~i01eta.
REFERENCIAS D, Laskey RA: Regulation of cukayotic DfdA rcplicafion. Annu Kev Biochern 1994:63:745. DePamphilis ML: Origins of DNA rcplication in metatuan chromosornes. J Riol Chem 1993;268 1 Gross DS, Carrard WT: Nuclease hypersensitive sitcs in chromatin. Annu Rev Riochem 1988;57: 159 Igo-Kemenes T, H o r z W, Zachru HG: Chrornatin. Annu Rev E3iochem 19x2:s 13.89. Marians KC: Prokaryotic DNA replication. Annu Rev t3iochem 1992:61:673. McGhee JD, Felsenfeld C:Nuclcosome stnicture. Annu Rev t3iochem 1980;40 1 115. Modrich P: Mismatch repair. genetic stability, and cancer. Science 19Y4;Zhh: 1959. Coverly
Sancar A: Mechanisms of DNA excisiíin repair Science
3 994:266:1954. Shesr CJ: Mammalian G1 cyclins and cell cycle proges-
sion. Proc Assoc Amer l'hys 1995;107:I R I . Stillman B: Iniliation of chromosomal DNA rcplication in
eukaryotes. J Biol Chcm 1994:269:7047. Wang TS: Eukaryotic DNA polymtraqes. Annu Rev Biochem 199 1 :60:5 13. Weiner AM, Deininger PL, Efstratiadis A: Nonviral retroiransposons: Gcncs, pseudogenes and transposablc clcrncnts generated by the severse flor+of genetic intbmaticin. Ann Rev Biochcm 1986;55:63 1.
Síntesis, procesamiento y metabolismo del RMA Dar9 K. Granner, MD
La sintesis de una molécula de RNA a partir de DNA es un proceso muy complejo en el que interviene una enzima del grupo de la RNA polimerasa y cierto numero de proteínas relacionada. Los pasos generales requeridos para que se lleve a cabo !a síntesis de la copia primaria son: inicio, alargamiento y terminación. La mayor parte del desarrollo conocido corresponde al inicio. Ya se tienen identificadas ciertas re,'olones del DNA (por lo general, localiadas corriente arriba del sitio de inicio) y los factores de proteínas que se unen a estas secuencias para regular el comienzo de la transcripciún. El proceso se comprende mejor en procariotes y virus, pero se han hecho avances considerables en descifrar la transcripción en las cklulas de mamíferos en los últimos aÍíos. Ciertos ácidos ribonucleicos, en particular rnRNA, tienen duraciones de vida muy diferentes en una célula. Es importante comprender los principios básicos del metabolismo del RNA, ya que a modulación de este proceso conduce a la alteración de la velocidad de sintesis de proteinas y, por tanto, a una variedad de cambios metabólicos. Ésta es la forma en que los seres vivos se adaptan a los cambios del medio. Tambikn la forma en que estructuras y funciones celulares diferenciadas se establecen y conservan en los metazoarios superiores. Las rnoteculas de RNA sintetizadas en las cklulas de mamifero son a menudo muy diferentes a las formadas en los procariotes, en particular las copias que codifican mRNA. El mRNA procariótico puede trasladarse conforme se sintetiza, en tanto que en las células de mamíferos la mayor parte del RNA se
f o m a como moIéculas precursoras que tienen que procesarse a RNA activo y maduro. El procesamiento y empalme erróneos de las copias de mRNA son causa de enfermedad, por ejemplo, ciertos tipos d e talasemias (capitulo 42).
EL RNA SE SINTETIZA DE UN MOLDE DE DUA POR UNA RNA POLIMERASA El proceso de sintetizarRNA a partir de un molde de DNA se ha caracterizado mejor en los procariotes. Aunque en las células de mamífero la regulación de la síntesis y el procesamiento de las copias de mRNA son diferentes de las de procariotes el proceso de sinresis del RNA per se, es bastante similar en ambos. Por tanto, la descripción de la síntesis del RNA en los procariotes es aplicable a los eucariotes, aunque las enzimas que intervienen y las senales reguladoras sean diferentes. La secuencia de ribonuclebtidos en una molPcula de RNA es complementaria dc la secuencia de desoxirribonucleotidos en una tira de la molécula de DNA dúplex (figura 37-31. La tira que se transcribe en una molécula de RNA se conoce como tira codificadora del DNA. La otra frecuentemente se describe como tira no codificadora de ese gen. Se denomina así debido a que, con excepción de U que cambia por T, corresponde con exactitud a la secuencia de la transcripcion primaria, la cual codifica al producto protcinica del gen. En el caso de una molecula de doble tira de DNA que contiene numerosos genes, no es necesario que la tira codificadora para cada gen sea la misma tira en la doble héiice de DNA (figura 39-1). Por tanto, una tira
(Capitulo 39)
GenA
Gen 0
Gen C
.,
;
\-_---
Tira molde
Gen D
i
Figura 3 9 4 . Este esquema ilustra que los genes pueden transcribirse de ambas tiras de DNA. Las cabezas de flecha indican la dirección de la transcripcibn (polaridad). Recubrdese que la tira molde se lee siempre en la diredbn 3' a 5'. La tira opuesta se desgna wmo tira codificadora debido a que es idhntica (excepto en el cambio de U por T) a la transcripción (primaria en dlulas eucariotas) que codifica el producto proteinico del gen.
dada de una molécula de doble tira de DNA sirve como codificadora para algunos genes y como n o codificadora para otros. Nbtese que la secuencia de nuclebtidos de un RNA transci ito es la misma (excepto que U reinplaza a T) que la de la tira no codificadora. La información en la tira molde se lee en la dirección 3' a 5'. La RNA polimerasa dependiente del DNA es la enzima responsable de lapolimeri7aci6n de ri bonucledtidos en una secuencia complementaria a la tira cdificadura del gen (figuras 39-2 y 39-3). La enzima se adhiere a un sitio especifico, el promotor, en la tira codificadora. A esto sigue el comienzo de la síntesis de RNA en el punto de inicio y el proceso continúa hasta alcanzar una secuencia de terminacibn (figura 39-3). Una unidad de transcripción se define como aquella región de DNA que se extiende entre el promotor y el RNA transcrito
Complejo RNAP
Figura 39-2. La RNApolimerasa(RNAP) cataliza la polimerizacdn de los ribonuclebtidosen una secuencia de RNA que es complementaria a la tira molde del gen. La transcripción de RNA tiene la misma polaridad (5' a 3') que la tira codrficadora, pero contiene U en lugar de T. E. mli RNAP consiste en un complejo central de dos subunidades alfa y dos subunidades beta (P y p).La holoenzirna contiene la subunidad sigrna cuando este prbxirna al sitio de inicio de transcripción (dentro de -1 0 pb) pero luego la transcripci6n procede con todo el complejo La burbuja de transcripcibn es un área de f 7 pb de DNA fundido y el complejo entero cubre 30 a 75 pb, según la conformaubn de RNAP
terminador. El producto de RNA, que se sintetiza en direccihn 5' a 3', es la copia primaria. En Iw procariotes, dsta puede representar el producto de varios genes contiguos; en las células de mamífero, por lo general, es el producto de un solo gen. Los extremos 5' de la copia primaria de RNA y del RNA citopliismico maduro son identicos. Por tanto, el punta de inicio de la transcripci6n corresponde al nucleótido S' del: mRNA. ~ s t se a designa posición +1, igual que el nucleótido correspondiente en el DNA. La numeración aumenta en la secuencia si se sigue corriente a bajo. Esta forma convencional facilita la localización de regiones particulares, como por ejemplo, límites de intrones y exones. El nucleotido en el promotor adyacente al sitio de inicio de trrinscripihn se designa -1 y estanumeraci6n negativa aumenta si la secuencia se sigue corriente arriba, alejándose del sitio de inicio. De este modo se tiene una forma convencional de definir la ubicación de los elementos reguladores en el promotor. Las copias primarias por la RNA polimerasa II se rematan con rapidez con trifosfato de 7-metilguanosina (figura 37-1 O), remate que persiste y finalmente aparece en el extremo 5' del mRNA citoplrismicomaduro. Se presume que estos "remates" son necesarios para el procesamiento subsiguiente de la transcripcibn primaria a rnRNA, para latraduccidn y para la psoteccibn del mRNA conm ataque exonucleolitico 5' 4 3'. La RNA polimerasa (RNAP) dependiente del DNA de la bacteria Escherichia coli existe como una rnol~culacentral compuesta de cuatro subunidades; dos de éstas son idénticas entre sí (las subunidades alfa) y las otras dos son semejantes en tamafío una a la otra, pero n o idénticas (subunidad beta y subunidad beta'; figura 39-21, La RNAP también tiene dos molécutas de cinc. La RNA polimerasa central utiliza un factor proteínico especifico (el factor sigma [o]) que ayuda a la enzima central para unirse con mayor fuerza a la secuencia específica de desoxinucleótidos de la regibn promotora. Las bacterias contienen multiples factores sigma y cada uno actúa como proteína reguladora que modifica la especificidad de reconocimiento de' promotor de la RNA polimerasa. La aparición de diferentes factores sigma puede correlacionarse temporalmente con varios programas de expresión genética en los sistemas procarióticos, tales como desarrollo de bacteriófagos, esponrlacibn y la respuesta al choque térmico.
LA S ~ ~ T E S DE I S RNA COMPRENDE INICIO, ELONGACI~NY TERMINACIÓN El proceso de sintesis del RNA, representado en la figura 39-3, incluye primero la unión de la molkuta de la RNA holopolimerasa con el molde en el sitio pro-
Sintesis, procesamien f.o y metabolismo del RNA * 48 7
Factorw de mntrol negativo. represores FactorEs de control positivo activadores
Holoenzima RNA polimerasa
' 0
+ATP + XTP
2. lniclo de Fa cadena RNA 4. Terminaclbn de la cadena RNA y liberación de enzimas
3. Elonaacidn de la cadena RNA
facturas
Figura 39-3. Ciclo de tranccnpcibnen bacterias La transcripcibn de RNA bacteriano, se describe en cuatro pasos. 1) Unibn al molde: la RNA polimerasa (RNAP) se une al DNA y focaliza al promotor 2) Inicio de la cadena: la holoenzima RNAP (centro + factores cigma) cataiiza el acoplamiento de la primera base (por lo general, ATP o GTP) a un segundo trifosfato de ribonuclebsido para formar un dinuclebtido. 3) Elongación de la cadena: ce agregan residuos sucesivos al 3'-OH terminal de la molécula naciente de RNA; los factores sigma se separan de la holoenzima, despues que se alcanza una longitud de cadena de casi 10.4) Terminación de la cadena y Ilberación: la cadena terminada de RNA y la RNAP se liberan del molde La holoenzima RNAP, se forma de nuevo, encuentra un promotor y se repite al ciclo. (Ligeramente modificada y reproducida con autorización de Chamberlin M. Bacteria1 DNA-dependent RNA polymerases Página 85 en The Enzymes, vol XV. Academic Press, 1982.)
motor. A la uni6n sigue un cambio en la conformaciiin de la RNAP; luego, el primer nuclehtido (casi siempre una purina) se une al sitio de inicia en la subunidad beta de la enzima. En presencia de los cuatro nucleiitidos, la RNAP se mueve a la segunda base en el molde, se forma un enlace fosfodiéster y ahora, la cadena naciente se adhiere al sitio de polimerízación en la subunidad beta de RNAP (debe notarce aquí la analogia de los sitios A y P en el ribosoma; figuras 40-7 y 40-8). El inicio de la fomaci6n de la moI6cula de RNA en su extremo 5' va seguido por la liberacibn del factor alfa, en tanto que el alargamiento del RNA de 5' a 3' continua antiparalelo a su plantilla. La enzima polimeriza los ribonuclelitidos en una secuencia específica dictada por la tira molde e interpretada
segun las reglas de pareamiento de bases de WatsonCrick. En la reaccibn de polimerizacibn se libera pirofosfato. Tanto en procariotes como en eucariotes es comun que en la n?oldcula de RNA se polimerice primero un ribonucleótido de purina. Confome el complejo de alargamiento que contiene a la UNA polimerasa central, progresa a lo largo de la molécula de DNA, debe ocurrir un desenrollamiento del DNA para proporcionar el acceso a la base apropiada que se parea a los nucledtidos de la tira codificadora. La extensión del desenrollamienta del DNA es constante a lo largo de la transcripcibn y se caIcula que es de 17 pares de bases por molécula de polimerasa, Por tanto, parece que el tamaño de la regi6n desenrollada del DNA lo dicta la polimerasa y es independiente de la secuencia del DNA en el com-
488 * Biuquímica de Harper
(Capitzilo 39)
plejo. Esto sugiere que la RNA polimerasa se relaciona con una actividad "desenrollasa" que abre la hélice del DNA. El hecho de que la doble hélice del DNA deba desenrollarse y las tiras partirse por lo menos transitoriamente para la transcripcion implica cierto rompimiento de la estructura nucleosomica de las células eucariotas. Laterminación de lasíntesis de la molCcuIa de RNA se señala por una secuencia en la tira codificadora de la molkcula de DNA, seiial que se registra por una proteína de terminacion, el factor rho (p). Posterior a la terminacihn de la sintesis de la mol&culade RNA, la enzima central se separa de la plantilla de DNA. Con la ayuda de otro factor sigma, Fa enzima central reconoce entonces un promotor, en el cual se inicia la síntesis de una nueva moldcula de DNA. De manera simulthea, más de una molécula de polimerasa de RNA puede transcribir la misma tira codificadora, pero el proceso se ejecuta en fases y espaciado de tal manera que en todo momento cada una está transcribiendo una parte distinta de la secuencia del DNA. En la figura 3 9 4 se muestra una microfotografia electrónica de la sintesis de RNA.
LAS CELVLAS DE LOS MAM~FEROS POSEEN VARIAS RNA POLIMERASAS DEPENDlENTES DE DNA Las propiedades de polimerasas de mamíferos se muestran en el cuadro 39-1. Cada una de estas RNA polimerasas dependientes del DNA parecen ser causantes de Ia transcripcibn de diferentes grupos de genes. Los tamafioc de las RNA polimerasas para las tres clases principales de RNA eucaridtico oscilan entre 500 000 a 600 000 de peco molecular. Todas estas enzimas comparten la organización estnictural subunitaria bhsica de la RNA poiimerasa bacteriana. Todas poseen dos subunidades grandes y varias subunidades más pequeiias. Los trabajos recientes de clonacibn y secuenciamiento del DNA indican que las RNA polimerasas eiicaribticas tienen extensas homologlas de aminoácidos con las RNA polimerasas procarioticas. Aún no se comprenden las funciones de cada una de las subunidades. Es probable que rnuchaspudieran tener funciones reguladoras, como sewir de asistentes de la polimerasa en el reconocimiento de secuencias específicas tales como las promotoras y las sefíales de terminación. Una toxina del hongo Amani%aphalloides,la alfa amaniltina, es un inhibidor especifico de la RNA polimerasa nucleoplasmica dependiente de DNA eucariótico (RNA polimerasa 11) y como tal ha probado ser un instrumento poderoso en la investigación (cuadro 39-1). Se considera que la alfa amanítina bloquea la translocación de la RNA polimerasa II durante la transcripcibn.
Figura 394. Micrografía electrónica de copias múltiples de genes de RNA ribosbmico de anfibio que están en proceso de transcripcibn. La arnplificacibn es -6000 x. Ndtese que la longitud del copiado aumenta a medida que las rnaléculas de RNA polimerasa avanzan a lo largo de los genes individuales del RNA ribos6mico. De esta manera, las copias cortas se encuentran unidas al extremo proximal del gen transcrito, en tanto que las copias largas se encuentran unidas a su extremo distal. Las flechas indican la direccibn (5' a 3') de la transcrip cibn. (Reproducida con autorizacibn de Miller OL Jr, Beatty BR Porta~tof a gene. J Cell Phyciol 1969:74[Suppl 1]:225.)
CIERTAS SECUENCIAS DE DNA SON IMPORTANTES COMO SENALES DE TRANSCRIPCI~N El analisis de la secuencia del XTNA de genes especificos obtenidos por la tecnología del DNA recombinante ha permitido el reconocimiento de un número Cuadro 39-1. Nomenclatura y localizaci6n de las RNA polimerasas dependientesdel DNA en animak - - - - ..--.
.a
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Clase [ dt: enzima!
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amanitina
Síntesis, proce.~amimtoy metabolismo del RNA
de secuencias importantes en la transcripción gknica. A partir del gran número de genes bacterianos estudiados es posible construir modelos acordes del promotor de la transcripcion y de las sefiales de terminación. La pregunta '"Como encuentra la RNA polimerasa el sitio correcto de inicio de la transcripcidn?", no es trivia! cuando se considera la complejidad del genoma. Esckrichia colitiene 2 x 1O7 sitios de inicio de transcripci6n en su DNA con 4 x 10' pb. La situación es aun mas compleja en el ser humano donde algo asi como 1 Q5 sitios de inicio de transcripciiin se reparten en su DNA de 3 x 10' pb. La RNAP puede unirse a varias regiones del DNA, pero revisa la secuencia de DNA a una velocidad de lo3 pbtseg, hasta que reconoce ciertas regionw, a las cuales se une con mayor afinidad. Esta región se denomina promotor, y es la unión de la RNAP con el promotor, lo que asegura un inicio preciso de la transcripci6n. Los promotores bacterianos son de aproximadamente 40 pares de nucleotidos (40 pb o cuatro giros de la doble hélice del DNA) de longitud, región suficientemente pequefia para ser cubierta por una molécula de RNA holopolimerasa de E. coli En esta región de familias de promotores están dos elementos cortos de secuencia conservada. Aproximadamente 35 pares de bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción hay una familia de secuencia de ocho pares de nucleótidos 5'-TGTTGACA-3', mostrada en [a figura 39-5. Más cercana al sitio de inicio de la transcripción, aproximadamente 10 nucleotidos corriente arriba, está una secuencia de seis pares de nucleótidos, rica en AT (5'-TATAAT-3'). La úItima secuencia tendrá una temperatura baja de fusión debido a su deficiencia de pares de nucle6tidos GC. Por tanto, se piensa que la caja TATA (genes eucari6ticos} o caja Pribnow (genes procarióticos) facilita la disociación entre las tiras codificadora y no codificadora, de modo
que la RNA polimerasa unida a la regi6n del promotor puede tener acceso a la secuencia de nucleótidos de su tira codificadora adyacente, corriente abajo. Otras bacterias tienen combinaciones (cajas) diferentes pero en general todas poseen dos componentes para el promotor; estos tienden a estar en la misma posición relativa al sitio de inicio de transcripción correspondiente y en todos los casos las secuencias entre las cajas no tienen semejanza. Las seiíales de terminación de la transcripcion dependientes de rho en E. coli también parecen tener una familia de secuencias distintiva, como se muestra en la figura 3 9 4 . Puede observarse que la familia de las secuencias conservadas, la cual también tiene una longitud aproximada de 40 pares de nucledtidos de longitud, contiene una repetición invertida separada o interrumpida, seguida por una serie de pares de bases de AT, Conforme prosiguc la mccripcibn a a v é s de la repeticion invertida separada, la copia generada puede formar la estructura intramoleeular en horquilla esquematizada tarnbidn en la figura 39-6. La transcripci6n continúa dentro de la región AT y con la ayuda de un factor proteinico de terminación llamado rho (p) la RNA polimerasa se detiene y se separa liberando la copia primaria.
Las señales de transcripción en células de mamíferos son más complejas Es evidente que las sefíales en el DNA que controlan la transcripcion en cklutas eucariotas son de varios tipos. Dos clases de elementos en la secuencia son promotores proxirnales. Uno de Pstos define dónde comenzará la transcripción a lo largo del DNA y el otro determina can qué frecuencia ocurriri el fenbrnena. Por ejemplo en el gen de la timidina cinasa del herpes simple, que utiliza factores de transcripcibn Inicio de la tmnscripci6n
4
Promotor
4841
Regldn codiílcadora del gen
-
Figura 39-5. Promotores bacterianos, como los que se muestran aqui de E. mli, comparten dos regiones de secuencias de nuclebtidos altamente conservadas. Estas regiones se localtsan 35 y 10 pb corriente arriba (en dirección 5' de la tira codificadora) desde el sitio de inicio de la transcripcidn, la cual se indica como + l . Por convencibn, todos los nuclebtidas corriente arriba del sitio de inicio de transcripcibn (en +1) se numeran en un sentido negativo. Tarnbien por mnvenci6n, los elementos de secuencias reguladoras de DNA (caja TATA, etcétera) se describen en la direccibn 5' a 3' y cume siendo de la tira codificadora Sin embargo, estos elementos s610 funcionan en DNA de tira doble.
490
Bioqdm ica de Harper
Tira codif~adora
Tira molde
(íbpírulo 39)
AECCG¿J f CGGGCG
-. GCGGGCT
-- CGCCCGA
TTTTTTTT AAAAAAAA
DNA
íTTTTTrr
Tira &ificadara
3\-
Tira molde
AAAAAAAA
DNA
Figura 39-6. La seiial de teminasidn de transcripcibn bacteriana en el gen, contiene una repetición separada invertida (las dos áreas en cajas) seguida por una extensión de pares de bases (esquema superior). La repetiubn invertida, cuando se transcribe a RNA, puede generar la estructura secundaria en el RNAde transcripcibn como se muestra en el esquema inferior.
de su huisped mamífero para la expresión de sus genes, hay un sitio unico de inicio de la transcripción y la precisión de la misma desde este sitio depende de una secuencia localizada 32 nucleótidos corriente arriba de dicho sitio (figura 39-7). Esta regibn tiene la secuencia TATAAAAG y muestra una hornologia notable con la caja TATA, que se localiza aproximadamente a 10 pb corriente: arriba del punto de inicio del mRNA procariótico. La mutacibn o inactivación de 3a caja TATA reduce de manera notable la transcripciiin del gen del herpes simple. La mayoria de los genes de marniferos zienen una caja TATA que, por lo común, se localiza cerca de 15 pb hacia arriba de Ea corriente desde el sitio de inicio de la transcripcion. La secuencia de consenso es TATAAA, aunque se han caracterizado numerosas variaciones, que por lo general implican cambios en T o A. La caja TATA enlaza la proteina enlazadora TATA VBP)de 30 kDa la cual,
a su vez, enlaza otras proteínas denominadas factores relacionados con TBP (TAF). Este complejo de TBP y TAF, antes denominado TFIID, representa el primer paso en la formacibn del complejo de transcripcitin sobre el promotor. En un reducido número de genes falta la caja TATA. En tafes casos, un iniciador de secuencia (lnr) dirige la RNA polimerasa 11 al promotor con lo cual se asegura que la transcripci6n basa1 arranque en el sitio correcto. Los elementos de Inr alcanzan el sitio de arranque (desde -3 hacia +5) y consiste de la secuencia de consenso general (Pi)? A+iNT/A(Pi),, misma que es semejante a la secuencia del sitio de inicio. (La A+, indica el primer nucleótido transcrito.) Aur, no se identifican las proteínas exactas que se enlazan a Tnr para dirigir el enlace de pol il. Los promotores que poseeñ una caja TATA y un Inr pueden ser mas poderosos que aquellos que s610 tienen uno de estos elementos.
Figura 39-7. Elementos de transcripcibny factores de unibn en elgen de timdina cinasa (tk). La RNA polimerasa II dependiente de DNA se fija corriente abajo de la regidn de la caja TATA (la cual se une al factor de transcripubn TFIID) para iniciar la transcripcibn en un nuclebtido sencillo. La frecuencia de este suceso aumenta con la presencia corriente arriba de elementos que actilan o s (las calas GC y CAAT). Estos elementos se unen a los factores de transcripcidn que actúan Zrans Spl y CTF, respectivamente y pueden funcionar en orientacidn inversa (flechas).
Sintesis. ~rocesamientoY metabolismo del RR,A
Secuencias alejadas corriente arriba del sitio de inicio forman un elemento funcional sencillo encargado de determinar con que frecuencia ocurre este fen6meno de transcripcibn. Las mutaciones en cualquiera de estas regiones, reducen ia frecuencia de inicios transcripcionales de 10 a 20 veces. Estos elementos DNA se conocen como cajas GC y CAAT, debido o las secuencias de DNA implicadas. Como se ilustra en la figura 39-7, cada una de estas cajas se une a una proteina, Spl en el caso de la caja GC y CTF (o CIEPB, NFl, NFY) para la caja CAAT. La frecuencia de inicio de transcripcibn es una consecuencia de estas interacciones proteina-DNA, mientras que la interaccion proteina DNA en la caja TATA, asegura la fidelidad del DNA. Se dice que estos elementos DNA actuan cAF, porque se encuentran localizados en la misma molecula de DNA que el gen bajo regulacion. Para los factores proteinicos, se dice que actúan trutts, debido a que se originan de genes localizados presuntamente en diferentes cromosomas. Estos elementos promotores basales que confieren fidelidad y frecuencia al inicio tienen requerimientos estrictos en cuanto a posicibn y orientacibn, en particular la caja TATA. t o s cambios de una sota base tienen efectos notables sobre la funcibn; el espaciamiento respecto al sitio de inicio es critico y, por lo general, no funcionan si se invierte la orientacidn 5' a 3' (figura 3 9 6 ) .
Cuadra 39-i. Algunos de loa elementos de confi] de la tran'scripción y los factores que los unen, los cuaEes se encuentran en genes transcritos par la R N A polimerasa 11. El asterisco significa que . . luier nuc ri5 suficie
-
-
sentido 3;tja TATA
-.
:aja CAAT
-(
lz -L-
Mio Octfvnerode Ig A T O AP 1 -
1
,2,4.6*
TGAl SCCCATA
-Choque térmico (NtiAAN)3
Fos, ATF*
:sta
or de transcripción del choque
49 1
Una tercera clase de secuencias de elementos puede incrementar o reducir la tasa baml de la velocidad inicial de transcripcibn de genes eucdrióticos. Estos elementos se llaman amplificadores o silenciadores, segun el efecto que tienen. Pueden encontrarse en diversas ubicaciones corriente arriba o corriente abajo del sitio de inicio. Al contrario de los elementos promotores proximales y corriente arriba, los amplificadores y silenciadores pueden ejercer sus efectos aunque se encuentren cientos o miles de bases lejos de unidades de transcripcibn localizadas en el mismo cromasoma (enlaces crs). De manera sorprendente, amplificadores y silenciadores pueden funcionar en una modalidad independiente de la orientacion. Están descritos docenas de estos elementos. En algunos casos los requerimientos de secuencia se encuentran muy constreñidos; en otros se permiten considerables variaciones en la secuencia. Algunas secuencias enlazan sSlo a una proteína única, pero la mayotia enlaza varias protehas. De manera semejante, una proteina wnica puede enlazar a más de un elemento. Los elementos de respuesta a hormonas (para esteroides, Ti, ácido retinoico, pkptidos, etcétera) actiian en conjunto con amplificadores y silenciadores (capítulo 44). Otros procesos que aumentan o disminuyen la expresión del gen, tales como la respuesta a: choque térmico, metales (Cd2- y Zn2') y algunos compuestos quimicos tbxicos (por ejemplo, dioxina) son mediados por elementos reguladores específicos. La expresión de genes de tejidos específicos, por ejemplo, el gen de la albúmina en el hígado, se media por secuencias tarnbikn específicas del DNA. Las sefíales para terminar la transcripción que ejecuta la RNA polimerasa 11 eucariótica, son muy poco comprendidas. Sin embargo, parece que las seiíales de terminacibn existen b a s m t e lejos corriente abajo de la secuencia codificadora de los genes eucarióticos. Por ejemplo, la seÍíal de terminacibn de la transcripción para la beta globina del ratón ocurre en varias posiciones, de 1000 a 2000 bases mhs allii del sitio en el cual la cola de poli(A) ser6agregada fmalmente. Poco se sabe del proceso de terminación o de si estan Envolucrados factores especificas de terminacibn se'mejantes al factor rho bacteriano. Sin embargo, ahora se sabe que el extremo 3' del mRNA se genera después de la transcripcibn, al parecer en dos etapas. Después de que la RNA polimerasa 11ha recorrido la regibn de la unidad de transcripci6n codificando el extremo 3' de la copia, una ñNA endonucleasa abre la copia primaria en una posición que ectii aproximadamente 15 bases en direccibn 3' hasta una secuencia de tamo AAUAAA, que probablemente sirve como una seííal de escisidn en las copias eucaribticas. Por iiltimo, el extremo 3' recikn formado es poliadenilado en el nucleoplasma, como se verA adelante.
492
Broyziimica de Harper
Expmsibn regulada *
I
(Capitulo 39)
.
Expresión basal
Elementos
regui~dores
amplifimdores f+) y stlenaadores (-1
(wia Cppin
(caja TATA)
Figura 39-8. Esquema que muestra las regiones de control de transcripcibn en gen eucari6tico de clase teórica II (productor de mRNA) Como un gen funcional puede dividirte en sus regiones estructurales y reguladoras,wmo lo define el sitio da inicio de la transcripcibn (flecha) El gen estructural contiene la secuencia de DNA que se tranccribe a m R W , que por ultimo se traduce a proteína La region reguladora consiste de dos clases de elementos Una clase es responsable de asegurar la expresion basal, este elemento por lo general tiene dos componentes El componente proximal, por lo general, la caja TATA, dirige a la RUA polimerasa II al sitio correcto (fidelidad) En promotores sin TATA, un elemento iniciador (Inr) que ocupa el sitio de inicio (+1), puede dirigir a la polimerasa hacia este lugar Otro componente. el elemento corriente arriba, espeufica la frecuencia de inicio De estos, el mejor estudiado es la caja CAAT, pero varios otros elementos (Spl , NF1 , AP1 , et&tera) pueden utilizarse en genes diversos La expresión regulada estA mnstrtuida por elementos que amplifican o silencian la expresibn y por otros que median la respuesta a varias sehales, incluyendo hormonas, choque tkrrniw, metales y compuestos quimicos Tambibn, la expresibn especifica de tejrdo comprende secuencias especiales de esta clase. Es posible que estas dos regiones reguladoras se traslapen en su funcion (línea de mnexibn) La dependencia de la onentaci6n de todos los elementos se indica por las flechas dentro de las cajas Por ejemplo, los elementos proximalesdeben estar en la orientacibn 5'a 3' Los elementos mrriente ariba trabajan mejor en la orientacion 5' a 3', pero algunos pueden estar invertidos Las líneas punteadas indican que algunas elementos no están fijos respecto al sitio de inicio de la transcripubn Efectivamente,los elementos responsables de la expresibn regulada pueden localizarse intercaladoscon otros elementos corriente arriba o se localizan abajo del sitro de inicio De hecho, algunos elementos responsables de la regulación de la expresibn pueden localizarse ya sea esparcidos con los elementos corriente arriba, o estar lecalizados mrriente abajo del sitio de inicio
EL COMPLEJO DE TRANSCRIPCIÓN EUCARmTE Un aparato complejo, consistente en hacta 50 proteínas únicas, proporciona transcripción precisa y regulable de los genes eucariotes. Las enzimas de la RNA polimerasa (pol 1, pol 11 y pol III para los genec de clase 1, I I y 11 1, respectivamente) transcriben información contenida en la tira molde del DNA dentro del RNA. Estas polimerasas pueden reconocer un sitio especifico en el promotor para iniciar la transcripcibn en el nucleotido apropiado. Sin embargo, las RNA pvlimerasas no son capaces de discriminar entre las secuencias promotoras y otras regiones del DNA; por tanto, otras protelnas facilitan el enlace con el promotor especifico de estas enzimas. En las bacterias esta función se cumple por una diversidad de los denominados factores sigma. Un complejo factor sigma-polimerasa enlaza selectivamente con el DNR en el promotor bacteriano.
Formación del complejo de transcripción basal La situación es mas compleja en los genes eucariotes. Como ejemplo se describen los genes de clase 11, o sea, aquellos transcritos por pol II para hacer mRNA. En los genes de clase 11 la fwncibn de los factores sigma la asumen varias proteínas, La transcripcibn
basa1 requiere, ademhs de pol ii, varios factores denominados A, E, D, E, F, H y J, algunos de los cuales se componen de varias subunidades diferentes. Estos factores se abrevian por conveniencia como TFIIA, TFIIB, etcetera (del inglés transcriptionfucior) para el gen del factor de transcripcibn clase 11. El TFiiü que enlaza la caja TAT4es el hnicodeestosfactores capaz de enlazarse a secuencias específicas del DNA. Como se menciona antes, TFIID consta de proteína enlamdora de TATA (TBP) y varios factores relacionados con TBP (TAF). El TBP se enlama la caja TATA en laestria menor del DNA (la rnayoria de los factores de transcripción se enlazan a la estría mayor). Este evento señala un promotor especifico para la transcripcibn y, en secuencia, se enlaza el TFIIh (arriba de la corriente de TFIlD), a continuación se enlaza el TFIIB (abajo de la corriente desde TFIID), seguido por el complejo TFIIF pol 11 y decpubs el TFIIE (figura 39-9). Cada uno de estos eventos de enlace extiende el tamaño del complejo que al final alcanza a cubrir 75 pb (desde -45 hasta +30, con relación a +1, siendo este el nucle6tido desde donde comienza la transcripcibn). Los TFIlH y TFIU se agregan a la superficie del complejo, el cual estái ahora completo y capaz de transcripción basal a partir del nucle6tido correcto. Esta colección de componentes, ensamblados se denominacornpIejo preinicb. En los genes carenzes de caja TATA, se requieren los mismos factores, incluso TDP. En tales casos un iniciador de secuencia (inr) coloca en posición al complejo para el inicio preciso de la transcripción.
Síntesis, procescrmientn y me~aboiismodel RNA * 493
Figura 39-9. El complejo eucariote de transcripción basal. La forrnacibn del complejo de transcripcibn basal inicia cuando TFllD se enlaza a la caja TATA. Esto dirige el ensamble de diversos componentes por interaccianes DNA-proteína y proteína-proteína. El complelo completo cubre el DNA desde la posrcibn 4 5 a +30 con relación al sitio de inleio (+1, seiialado por la flecha).
La función de los activadores y coactivadores de la transcripción Al principio se considerb que el TFIID era una psoteina iinica. Sin embargo, diversas porciones de información llevan al descubrimiento de que el TFI ID es en realidad un complejo consistenteen TBP y varios TAF. La primera evidencia fue que el TBP se enlaza a un segmento del DNA de 10 pb, inmediatamente sobre la caja TATA, en tanto que TEIID cubre una porción de 35 pb (figura 39-9). La segunda, el TBP tiene una masa rnolecular de alrededor de: 30 kDa, en m t o que el complejo TFIID tiene una masa de cerca de 700 kDa. Por ultimo, y quizá la rnk importante, el TBP apoya la transcripci6n basal pero no aumenta la transcripcion que proporcionan ciertos activadores; por ejemplo, Spl ligado a Ea caja GC. Por otra parte, el TEIID apoya ambas, la transcripción basal y la aumentada por Spl, Oct 1, API ,CTF, ATF, etcetera (cuadro 39-2). Los TAF son esenciales para esta transcripcibn aumentada por activador. En el presente no esta claro si hay una o varios tipos de TFlJD que puedan diferir en sus componentes de los TAF concomitantes con TBP. Es concebible que diferentes combinaciones de TAF con TRP puedan enlazarse a diferentes promotores, y esto puede representar la activacibn selectiva que se observa en varios promotores y la diferente fuerza de otros. Toda vez que los TAF se requieren para la acci6n de los activadores, a menuio sr? deniminan coactivadores. Por tanto, hay tres clases de factores de transcripción implicados en la regolacion de los genes de clase 11: factores basales, coactivadores y activadores-represores (cuadro 39-3). Una representacibn de c&mo varios activadores pueden incrementar la tranccripci6n de un gen se muestra en la figura 39-1 0. Tarnbikn se considera que
las hormonas, al promover la interacción de los receptores y otros factores con elementos específicos del DNA, influencian la transcripcidn a traves de mecanismos de activador-coactivador. La represicin de la transcripcibn, no tan estudiada. podría cumplirse mediante Ia interferencia en el ensamble de TAF con TBP o mediante la intempci6n de un activaclor dc complejo TAF.
LA UBICACIÓN DE ELEMENTOS DEL DNA QUE ACTUAN EN POSICION CIS ES INTRAGENICA EN GENES CLASE III La RNA polimerasa 111 dependiente de DNA, que transcribe los genes para el tRNA y genes de RNA de bajo peso molecular (capitulo 3 3 , reconoce a un promotor que esth en el interior del gen que se va a expresar, m k que corriente arriba del punto de inicio de la transcripción. En el caso de los genes eucaribticos para tRNA, existen dos bloques separados internos (A y B) de secuencias que actúan como un promotor intraginico. Las secuencias de los bloques A y B existen en la molécula madura de tRNA en regiones que e s t h altamente conservadas y participan en la formacion de los brazos D y TylC, respectivamente
Ire 3 9 3 . Tres clases de faci :transcripcibn en genes clase .
---..- --. -.
-.
-
-"-F C
-omponente
-
- "
c.c.,.t;.,aAn~,
i ThF
~liabr'vauuii
i
Activadores
: SPI, ATF, CTF. AP1. etcétera
Gornplejo de transuipu6n
Velocidad de transcnpción
Figura 39-1 O. Vista hipot4tica de cdmo pueden incrementar la transcripcibn los activadores y coadivadores de la transcripción. Todos los componentes del complejo de transcripción basal que se muestran en la figura 39-9 en esta figura se muestran como un ovalo grande El componente TBP del TFItD se muestra unido a la caja TATA Unos pocos TAF se awmpalian con TBP. En este caso un activador de la transcrtpcibn, el CTF, se enlaza a la caja CAAT y forma un complejo de asa por ~nteraccibncon un TAF
(figura 37-1 1). Manipulando la estructura de los genes para el tRNA, se ha demostrado que para la funcibn de promotor, la distancia óptima entre los bloques A y B es de 30 a 40 pares de bases y que el punto de inicio de la transcripción ocurre entre 10 y 16 pares de bases corriente arriba del bloque A. Para el gen SS de RNA, el cual también es transcrito por la RNA polimerasa 111, parece haber un factor proteínico especifico de mnscripci6n el cual, una vez que se une al promotor intragknico para ese gen, probablemente interactua con una molécula de RNA polimerasa 111 para colocar sus sitios ca~líticossobre el punto de inicio de la transcripcidn del DNA. Un mecanismo semejante, que utiliza factor(es) de transcripcihn específico(s) que actha(n) como irans, puede intervenir en la transcripcibn de genes para tRNA.
A MENUDO, LAS MOL~CULAS DE RNA SE PROCESAN ANTES DE VOLVERSE FUNCIONALES En los organismos procaribticos, las copias primarias de los genes que codifican el mRNA comienzan a servir como moldes de traslación aun antes de com-
pletar su transcripción. Es probable que esto se deba a que el sitio de b-anscripcion no está compariirnentalizado en un núcleo como ocurre en organismos eucari6ticos. Por tanto, transcripcibn y traslacibn esthn acopladas en las células procarioticas. En consecuencia, el mRNA procariotico esta sujeto a escasa modificación y procesamiento antes de llevar a cabo su funcion propuesta en la síntesis de proteínas. Las moléculas de rRNA y tRNA de los procariotes se transcriben en unidades considerablemente mayores que la molécula final. En efecto, muchas de las unidades de transcripción del tRNA contienen más de una molécula. Asi, en los procariotes se requiere eF procesamiento de estas molkulas precursoras de rRNA y tRNA para la generacibn de las moléculas finalmente funcionales. Casi todas las copias primarias de RNA en eucariotes experimentan un extenso procesamiento entre el momento de su síntesis y ei momento en que sirven para su funcion última, ya sean mRNA o moléculas estructurales como el tRNA, el RNA 5s o el rRNA. El procesamiento ocurre primariamente dentro del nucleo. Este incluyeel remate, reacciones nucleolttlcas y de ligadura, adiciones terminales de nuclebtidos y modificaciones de nucleásidos. Sin embargo, es evidente que para las células de los mamlferos, 50 a 75% del RNA nuclear, con terminaciones 5' rematadas, no contribuye al mRNA citoplhsrnico. Este RNA nuclear perdido es notablemente mayor que el que puede explicarse razonablemente por la phrdida de las secuencias intercaladas solas (vease adelante). Por tanto, la función precisa de las copias aparentemente excesivas en el núcleo de las ctlulas de rnarnifera se desconoce.
LAS PORCIONES CODIFICADORAS (EXONES) DE LA MAYOR PARTE DE GENES EUCARIQTES ESTÁN SEPARADAS POR INTRONES Como consecuencia del avance en las técnicas para clonación y secuenciamiento del DNA, es ahora aparente que dentro de porciones que cifran aminohcidos (exones) de numerosos genes, existen intercaladas largas secuencias de DNA que no contribuyen a la infomacidn gen6tica traducida en última instancia en la secuencia de aminoácidos de una molécula de proteina (capitulo 38). De hecho, estas secuencias interrumpen en realidad la región codificadora de genes estructurales. Estas secuencias intercaladas (intrones) aparecen en el interior de la mayor parte, pero no en todos los genes de los eucariotes superiores. Las copias primarias de los genes estructurales contienen RVA complementario a las transcripciones de secuencias intercaladas. Sin embargo, las secuencias de intrones
sin fe si^, prcicesam iento y me~uhnlr.~rno del RNA Enbn 1
Capucn(m
S ~ A ~ G - GG P-r
495
Ex6n 2
Intrbn
Transcnpcibn pnrnana 3.
1 capuchan +=&-G
J
Corte en el extremo 5'
del intrbn
1
r An
1,'
#
Ligadura del extremo 3' del exbn 1 al extremo 5' del exon 2 El intron se digiere
'-,M
Figura 39-11. Procesamiento de [a transcripcibn primaria (hnRNA) para mRNA. En esta transcripcidn tebnca el extremo 5' izquierdo del intrbn se corta (1) y se forma un lazo entre G en el extremo 5'del intrbn y A prbxima al extremo 3'en la secuencia con sentido UACUAAC. Esta secuencia se denomina el sitio de rama y es la posicibn 3' m8s cercana de A que forma el enlace Y-2' m n G. Luego, se arta el extrwno 3' derecho del intrdn (4). El lazo ce libera y digiere, y el exbn 1 se une al exbn 2 en residuos G.
de RNA se separan de la copia y los exones de la misma se empalman de manera apropiada en el núcleo antes de que la rnolkcula de m R N A resultante aparezca en el citoplasma para la traslación (figuras 39-1 1 y 39-1 2). Se est5n aclarando los mecanismos por los cuales los intrones se retiran de la copia primaria en el
núcleo, los exones unidos para formar la molécula de mRNA y la molecula de mRNA transportada al citoplasma. Aunque las secuencias de nucleótidos en los intrones de diversas copias de eucariotes son muy heterogéneas, hay secuencias razonablemente conservadas en cada una de las dos uniones exon-intrón (empalmadas), y en el sitio de ramificacidn que se localiza de 20 a 40 nucle6tidos corriente arriba del sitio 3' de empalme (véase secuencias de consenso en
la figura 39-12). Una estrwcrura especial, el "empalmesoma" participa en llevar la transcripción primaria al mRNA. El empalmesoma consiste en la transcripcih primaria, cinco RNA nucleares pequeiios (Ul, U2, U4, U5 y U6) y un número indeterminado de proteinas. La reacción de empalme arranca con un corte en la unión del ex6115' (donador o izquierdo) y el intrbn (figura 39-1 1). La terminal 5' libre forma entonces un asa o estructura de lazo que es unida por un enlace 5'-2' at sitio de la A en la mma PiNPiPiPuAPi (figura 39-1 2). El sitio en la rama identifica el sitio 3' de empalme. En la unión del intron con el exbn 3' (aceptor o derecho) se hace un segundo corte y se libera e hidroliza la estructura de lazo que contiene el intrbn. Los exones 5' y 3' se ligan para f m a r una secuencia continua.
Secuencias de consenso
Exdn
-1
Intrbn
1-
Exbn 3'
Figura 39-42. Las secuencias de consenso en las uniones de empalme. Se muestran las secuencias 5' (donador o izquierdo) y 3' (aceptor o derecho). TambiBn se muestran las secuencias de consenso para el sitio de rama (UACUAAC) en la levadura. En las dlulas de marniferosesta secuencia de consenso es PiNPiPiPuAPi donde Pies una piridina, Pues una purina y N es un nuclebtido. El sitio de rama se localiza 20 a 40 nuclebtidos arriba de la corriente desde la posiubn 3'.
(Capítulo 39)
Los snRNA y las proteinas concomitantes se requieren para la fomaci6n de las varias estructuras e intermedios. El U 1 se enlaza primero, por pareo de base, a la terminal S' del intrón. En seguida U2 se enlaza al sitio de la rama y tarnbidn parece dirigir el enlace de U1 a este sitio, quiza mediante proteínas concomitantes con U 1. La interaccibn U I í ü 2 en el sitio de la rama forma et asa y acerca los dos sitios de empalme. Un complejo trimerico de U5 y la combinacibn U4AJ6 se enlaza entonces al complejo. El U4 se libera y, despukc de una serie de movimientos y reñcomodos, las dos terminales se reúnen, quizii por el complejo U2lU6. Es importante observar que el RNA sirve como agente catalitico. A continuación se repite esta secuencia en los genes que contienen múltiples intrones. En tales casos se sigue un patron definido para cada gen, y los intrones no necesariamente se retiran en secuencia: el 1 , luego el 2, luego el 3, etcktera. Recientemente, se descubrib que durante e[ proceso de remoción de la secuencia intrrin del premRNA, ahi se forma una molécula exkdordinaria de RNA sernejante a un lazo. Al parecer el exkemo 5' de la secuencia intermedia se une por medio de un enlace 2'-5' fosfdiéster aun residuo de adenililo de 28 a 37 nucle6tidos corriente arriba del extremo 3' de la secuencia intermedia. Este proceso y la estructura se esquematizan en la figura 39-1 1. Al parecer, se ha resuelto el misterio de la relacion entre el hnRNA y e[ correspondiente mRNA maduro en las ctlulas cucariotas. Las moléculas de hnRNA son las copias primarias m l s sus productos procesados iniciales, los cuales despues de la adicidn de capuchones y de colas de poli(A) y de la remoción de la porcion correspondiente a los intrones, se transportan al citoplasma como moleculas de mRNA maduro.
El empalme alternativo proporciona una modalidad de regulación El procesamiento de las rnolécuIas de hnRNA es un sitio potencial para la regulación de la expresión génica. De hecho se ha demostrado que los patrones alternativos del empalme del RNA están sujetos a un contro t de desarrollo. Podrian citarse numerosos e.jemplos, pero con tres basta para establecer el punto. Por ejemplo, los mRNA citoplbmicos para la alfa arnilasa en la glandula saliva1 de la rata y en el hígado de esteanimal, difieren en su secuencia5'de nuclebtidos, en tanto que el resto de los genes para mRNA que contiene la regibn codificadora y los sitios de adici6n de poli(A) son idknticos. Un análisis posterior revelé que aunque las copias primarias son enormes y traslapantes, se utilizan diferentes sitios de emplame para unir dos secuencias diferentes de remate y guía al mismo "cuerpo" de rnRNA. Además, se utilizan patrones alternativos de empalme del RNA para generar
dos cadenas pesadas diferentes de RNA de inmunoglobulinas, uno que codifica para iina cadena pesada de proteina unida a la membrana y otro que codifica para una proteina de secreción de cadena pesada (capitulo 4 1). Por tanto, el empalme del RNA frecuentemente es necesario para la generación de rnoleculac de RNA mensajero y la función de empalme tambien proporciona un sitio para la regulación diferencial de la expresión del gen. Por lo menos una forma de beta talasemia, enfermedad en [a cual el gen beta globina de la hemoglobina estli gravemente reprimido, parece consecuench de un cambio de nuclebtido en una unión exón-intrón, que impide la remoción del intrón y, por tanto, conduce a una dismincuión o ausencia de sintesis de la cadena be@. Esto se debe al hecho de la intercepcibn del marco normal de lectura de traslación del mRNA. Está claro que un defecto en este proceso fundamental (empalme) recalca la precisión que el proceso de empalme RNA-RNA debe aIcarizar.
El RNA editor cambia el mRNA después de la transcripción El dogma central establece que, para un gen y gen producto dados, hay una correlaci6n lineal entre la secuencia codificadora en el DNA, la sechencia en el mRNA y la secuencia proteinica (figura 38-7). Los cambios en la secuencia del DNA podrían reflejarse en un cambio en la secuencia del mRNA y, dependiendo del uso de codbn, en la secuencia proteinica. En fecha reciente se han documentado unas pocas excepciones a este dogma. Se puede cambiar la infomaci6n codificadom a nivel del mRNA por RNA editor. En tales casos la secuencia codificadora del mRNA difiere de la del DNA consangulneo. Un ejemplo es el gen de la apolipoproteína B (apo E) y el rnRNA. El gen apo B unico codifica un mRNA de 4563 codones el cual se traslada en el higado al interior de una proteina de 5 12 kDa. La modalidad intestinal de apo B es de cerca de 250 kDa. Es idknticaa la proteína hepática hasta el mdbn 2153, donde se detiene. Este tnincarniento surge de sustitución de una C por T en el codón 2153, el cual convierte el codón CAA = glutamina en un c d 6 n de paro U A A. Este cambio de C a U se presenta postranscripcional por mecanismos aún no bien definidos. Otros ejemplos incluyen un cambio de glutamina a arginina en el receptor de glutamato y diversos cambios en los mRNk mitocondriales del tripanosoma que, por 10 general, implican la deleción o adición de uridina.
EL RNA PUEDE ACTUAR COMO CATALIZADOR Además de la acci6n catalitica otorgada por los snRNA en la fomaci6n de mRNA, se atribuyen al RNA otras diversas Funcionesenzimáticas. Las ribozimas
Síntesis, procesamiento y metabolismo del RNA
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son moléculac de RNA con actividad catalitica. Esto,
en el extremo 3'. Se desconoce la funcion exacta dc
por lo general, implica reacciones de transesterificación y la mayoria se relaciona con el metabolismo del RNA (empalme y endorribonucleasa). En fecha reciente se observó que un componente del RNA ribodmico hidroliza un ester aminoacilo y por tanto desempeila una funcibn central en el enlace péptido. Estas observaciones, hechas en organelos de plantas, levaduras, virus y células eucarióticas superiores, muestran que el RNA puede actuar como una enzima. Esto ha revolucionado el pensamiento acerca de la acción enzimltica y del origen de la vida misma.
estas secuencias, pero se les implicaen el procesamiento, transporte, degradacibn y traducción del KNA.
EL RNA MENSAJERO ErnRNA) SE MODIFICA EN LOS EXTREMOS 5' Y 3' Como se mencion6 las moleculas de mRNA de mamífero contienen un capuchhn en su terminal 5' y una cola de poli(A) en la terminal 3'. La estructura de capuch6n se agrega al extremo 5' del precursor mRNA recién transcrito, en el núcleo antes de su transporte al citoplasma. Las colas poli(A) (cuando las hay) parecen afiadirse en el núcleo o en el citoplasma. Las metilaciones secundarias de las molécular; de mRNA, las de los grupos 2'-hidroxi y el N6 de los residuos de adenililo, ocurren después de que la molécula de mRNA aparece en el citoplasma. Al parecer se requiere el capuchón S' de la copia de RNA para la fonnacibn del complejo de ribonucleoprotelna necesario para las reacciones de empalme y puede estar involucrado en el inicio de la traslacibn y transporte del mRNA y protege al extremo 5' del mRNA del ataque por exonucleasas 5' -,3'. La funcibn de la cola poli(A) se desconoce pero al parecer protege el extremo 3' del mRNA del ataque exonucleasas3' +5*.De cualquier modo, su presencia o ausencia no determina que una molécula precursora en el núcleo aparezca en el citoplasma porque no todas las moltculas de hnRNA con cola de poli(A) contribuyen al mRNA citoplhsmico, ni todas las moléculas del mRNA citoplhsrnico contienen colas de poli(A) (a este respecto, las historias son más notables). Los procesos citoplásmicos en las células de marnifero pueden f m t o agregar como remover residuos de adenilato de las colas dc poli(A); esto se ha selacionado con una alteración en la estabilidad de mRNA. El tarnrtño de las mol~culasde mRNA citoplasmico aún despuds de retirar la cola de poli(A) es todavía considerablemente mhs grande que el requerido para su codificacibn por la proteína específica, la cual sirve como plantilla frecuentemente por un factor de 2 o 3. Los nucleótidos adicionalesse presentanen las regiones no traducidas tanto 5' como 3' hacia la regibn codificadora; por lo general, las secuencias mhs largas esthn
Los RNA de transferencia (tRNA) están bastante modificados Las moléculas de tRNA, como se describen en los capítulos 37 y 40, sirven como moldculas adaptadoras para la maduccihn del mRNA en secuencias de proteínas. Los tRNA contienen muchas modificaciones de las bases esthndar A, U, G y C. Algunas son simplemente derivados metilados y otras poseen enlaces glucosidicos reordenados. Las molkculas de tRN A se transcriben tanto en procariotes como en eucariotes como precursores de gran tamafío, que con frecuencia contienen la secuencia para más de un tRNA, los cuales son luego cometidos a un procesamiento nuclecilitico y reducidos en trimaiío por una clase especifica de ribonucleasas. Además, los genes de algunas moleculas de tRNA contienen, muy cercano a la porcion que corresponde al asa anticodón, un intron sencillo de 10 a 40 nucleótidos de longitud. Estos intrones en los genes del tRNA se transcriben; así el procesamiento de los precumom tranccsitos de numerosas rnolkculas de tRNA debe incluir la remocibn de intrones y el empalme apropiado de la región del anticodón para generar una moltlcula adaptadora activa para la sintesis de proteínas. En apariencia, las enzimas de procesamiento nucleolltico de precursores de tRNA, reconocen la estructura tridimensional y no sb10 secuencias lineales de RNA. Por tanto, este sistema enzimltico procesa sólo rnoldculac capaces de plegarse en productos funcionalmente competentes. La modificación subsecuente de las moléculas de tRNA incluye alquilaciones de nucleótidos y la fijacibn de la terminal caracteristica CiCmA en el extremo 3' de la molécula. El 3' OH de la ribosa A es el punto de adherencia para el aminoácido especifico que va a entrar en la reaccibn de polirnerizaci6n de la síntesis de proteinas. La metilación de los precursores del tRNA de mamíferos probablemente ocurra en el nucleo, en tanto que la rotura y la adherencia de C*C-A son funciones citoplasmicas puesto que los extremos experimentan recambio con m b rapidez que las propias moléculas de tRNA. Las enzimas del interior del citoplasma de las cf lulas de mamífero se requieren para la adherencia de los aminoAcidos a los residuos C*Ca A.
El RNA ribosórnico (rRNA) se sintetiza como un precursor grande En las cdlulac de mamífero, las dos mol6culas mayores y una molécula menor de rRNA se transcriben como parte de una sola mol&cufa precursora grande (figura 39-13). El precursor se procesa en seguida en
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Bioquitnica de Harper
(Capitulo 39)
18s
58s
5'
285
j 3'
Precursor 45s
Figura 39-13. Representacibn diagramhtica del procecamiento del RNA ribesdmiw a partir de las rnolbculas de RNA precursor. La transcripción prirnana tiene un tarnario de 45s y cerca de 13 000 nuclebt'idos como longitud. Es sintetizado de 5' a 3' por la RNA polimerasa I (círculos vacios). Los genec densamente aglomerados se transcnben a gran velocidad, de modo que el alargamiento de las mokculas de RNA, visto con facilidad en preparaciones de cromatina, semela los "Arboles" de la rnicrografia electronica de la figura 394.Los productos finales se forman a travbs de una serie de reacciones catalizadas por endonucleasas y exonucleasas, algunas de ellas ribonucleasasespecíficas de rRNA En la figura se muestra una secuencia posible de reacciones indicadas por circulos numerados y flechas. También se muestran el tarnarlo y longitud de la tira de nuclebtidos de tos productos 1 BS, 5.8s y 28s. El rRNA 18s se incorpora a la subunidad ribosbmica pequena. Los rRNA 28s y 5.85se incorporan a la subunidad grande
et nuclColo para proveer el RNA a las subunidades ribos6micas del citoplasma. Los genes de rRNA se localizan en los nucléolos de las celdas de mamlfero. Cientos de copias de estos genes ectan presentes en cada cklula. Este elevado número de genes es necesario para sintetizar copias suficientes de cada tipo de rRNA que formen los lo7 ribosomas requeridos para cada replicación celular. En tanto que una sola mol&culade mRNA puede copiarse en 1O' molkculas de proteína,
lograndose una gran rnultiplicaci0n, los rRNA son productos finales. Esta ausencia de multiplicaci6n exige un gran numero de genes. Los genes de rRNA se transcriben como unidades, cada una de las cuales codifica (de 5' a 3') un RNA ribosbmico 1 RS, uno 5.8s y uno 28s. La copia primaria es una molécula 45s que es altamente metilada en el nucléolo. En el precursor 45S, el segmento final 28s contiene 65 grupos metilo-ribosa y cinco
Shresis, procesamienro y metabolismo del RNA
grupos metilo-base. S610 las porciones del precursor que finalmente llegan a ser moIéculas de rRNA son metiladas. El precursor 45s se procesa por nucleólisis, pero las sefiales de procesamiento son claramente distintas de las usadas en el hnRNA. Por tanto, el pmesamiento del rRNA se logra mediante una serie de reacciones endonucleolíticas y exonucleolíticas (vkase adelante) y no por la reacción catalizada por RNA clbica de la formacion de mRNA (figura 39-1 1). Casi lamitad de lacopia original se degrada como se muestra en la figura 39-13. Durante el procesamiento del rRN A ocurre metilación ulterior, y al final en los nucléolos, las cadenas 28s se autoensamblan con proteinas ribosbmicas y forman la subunidad miis grande 60s.Lamolkculade rRNA 5.8S, tambih formada a partir del RNA precursor 455 en el nucléolo, se convierte en una parte integral de Ia subunidad ribosómica más grande. Las subunídades ribosómicas más pequefias (40s) se forman por la agrupación de proteínas ribosómicas adecuadas con la molécula de rRNA 18%
LAS NUCLEASAS ESPEC~FICAS DIGIEREN LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Durante muchos $os se han recqnlicido enzima capaces de degradar acidos nucleicos. Estas se pueden clasificar de varias maneras. Las que muestran especificidad para el ácido desoxirribonucleico se refieren como desoxirribon ucleasas. Aquellas que especificamente hidrolizan los ácidos ribonucleicos son ribonucleasas. Dentro de ambas clases se encuentran enzimas capaces de romper los enlaces fosfodikster internos para producir ya sea una terminal 3'-hidroxilo y una 5'-fosforito o una 5'-hidroxilo y una 3'-fosforilo. Éstas se designan como endonucleams. Algunas son capaces de hidroli~arambas tiras de una molécula dcplex, en tanto que otras sólo pueden desdoblar tiras individuales de hcidos nucleicos. Algunas nucleasas pueden hidrolizar sblo tiras individuales no pareadas, m ientsas que otras son capaces de h i d r o l i ~ tiras a individuales que participan en la furtnacibn de una molkcula de doble tira. Hay clases de endonucleasas que reconocen secuencias especificas en el DNA; la mayor parte de Cstas son las endonucleasas de restriccibn, que en años recientes se han convertido en importantes instnrmentos para la genética molecular y las ciencias médicas. Una lista de las endonucleasas de restriccidn ordinariamentereconocidas se presenta en el cuadro 42-2. Algunas nucleasas son capaces de hidrolizar un nuclebtido sólo cuando se encuentra en una terminal de una moldcuta; éstas se refieren como exonucleasas. Las exonucteasas pueden actuar solo en una dirección (3' + 5' o 5' + 3'). En las bacterias, una exonucleaca
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3' + 5' e5 parte integral de la maquinaria de replicación del DNA y alii sirvc para corregir el desoxinucleotido adicionado más recientemente por errores en el pareamiento de bases.
REGULAR LA DEGRADACIÓN ES OTRO MECANISMO PARA CONTROLAR LA CANTIDAD DE RNA MENSAJERO Aunque ta mayor parte de mRNA en células de mamíferos es muy estable (su vida media se mide en horas), algunos tienen un recambio muy rapido (vidar medias de 10 a 30 minutos). En ciertos casos, la estabilidad de mRNA estb sujeta a regulación. Ésta tiene implicacionw importantes dado que, por lo general, hay una relacibn directa entre la cantidad de mRNA, y la translacibn de ese mRNA y su protefna anhloga. Por consiguiente, cambios en la estabilidad de un mRNA especifico tienen efectos mayores en los procesos biológicos. Los RNA mensajeros existen en el citoplasma como partículas ríbonucleoproteínas (RNP). Algunas de estas proteinas protegen al mRNA de digestibn por nucleaw, en tanto que oims pueden, bajo ciertos estados, favorecer el ataque de la nucleasa. Se considera que RNA mensajero se estabiliza e inestabiliza por interaccibn de proteínas con estas estructuras o cecucncias diversas. Ciertos efectores, como hormonas, pueden regular la estabilidad de mRNA por aumento o disminucibn de la cantidad de estas proteinas. Al parecer, los extremos de mol&culasde RNA mensajeros intervienen en la estabilidad del mRNA (figura 19-1 4). La estmctura de capuchón 5' en mRNA eucari~ticoimpide el ataque por 5' exonucleasa y lacolapoli(A)prohibe laacción de exonucleasas 3'. Se presume que moltculas de mRNA que poseen estas últimas estructuras un corte endonucleolítico único permite a las exonucleasas atacar y digerir la molécula entera. También se considera que otras estructuras (secuencias) en la porcidn 5' no codificante(NCS 5'), la región codificante y NCS 3', promueven o evitan esta accibn endonucleoIitica inicial (figura 39-1 4). Se citarán unos cuantos ejemplos ilustrativos. La supresión de NCS 5' conduce a una prolongrici6n de 3 a 5 veces la vida media del mRNA del gen c-myc. El acortamiento de la region codificante del mRNA para histona prolonga su vida media. Una forma de autorregulacibn de la estabilidad de mRNA comprende indirectamente a la regibn codificante. La tubulina libre se une a los cuatro primeros arninoácidos de una cadena naciente de tubulina conforme surge del ribosoma. Al parecer, esto activa a una m a s a relacionada con el ribosoma (RNP) que a continuación digiere al RNA para tubulina.
500
Bioquíin ica de Hurper
Remate
(Capi/zalo 39)
-
Figura 39-14. Estructura de un mRNA eucaribtiw clásrco que muestra elementos que inieniienen en la regulacidn de la estabilidad de mRNA. El eucariótico clásico posee una secuencia de 5' no codificadora (NCS 5'1, una region codificadora y una NCS 3'. Todas esten rematadas en el extremo 5' y la mayor parte posee una secuencia de polradenilato en su extremo 3' E A capuchon 5' y la cola poli(A) 3' protegen al mRNA contra el ataque de exonucleasas. Las estructuras circulares en NCS 5' y 3' las caracteristicas de la secuencia codificadora y la regtbn rica en AU del tntron 3' se consideran importantes en la estabilización de mRNA
Las estructuras en el extremo 3', que incluyen la cola poli(A), potencian o disminuyen la estabilidad de RNA mensajeros específicos. La ausencia de cola poli(A) se acompaña de degradación rápida de mRNA y la eliminación de poli(A) de algunos RNA solubles causa su inestabilidad. El mRNA soIuble para histona carece de cola poli(A) pero tiene una secuencia próxima al extremo 3' que puede formar una estructura de tallo anular que al parecer proporciona resistencia al ataque exonucleolRico. Por ejemplo, mRNA para la histona H4, se d e p d a en la dirección 3' a 5', pero s61o despuks de que ocurre un corte endonucleolitico único a una distancia aproximada de nueve nucleótidos del extremo 3', en la regilin de la estructura anular putativa. Estas estructuras de tallo circular en la secuencia no codificante de 3 ' tam bign son criticas para la regulación, por hierro, del mRNA que codifica al receptor para transferrins. AdemBs, se relacionan con la estabilidad de mRNA en bacterias, lo cual indica que este mecanismo puede ser de uso comUn. Otras secuencias en el extremo 3' de ciertos mRNA solubles eucariotes al parecer intervienen en la desestabilizacion de estas moléculas. De interés particular son regiones ricas en AU, muchas de tas cuales contienen la secuencia AUUUA. Esta secuencia aparece en mRNA solubles que tienen una vida media muy corta que incluyen el producto de varios oncogenec y citosinas. La importancia de esta regibn ha destacado por un experimento donde una secuencia que corresponde a la región 3' no codificante del mRNA para el factor estimulante de colonia (CSF, del ingles, colony stimulating factor) cuya vida media es corta y que contiene AUUUA, se agreg6 al extremo 3' del mRNA para beta globina. En lugar de volverse muy estable, este mRNA híbrido ahoratenia la vidamedia característica de mRNA para CSF. De los ejemplos citados, es evidente que con varios los mecanismos que se usan para reguIar la estabilidad de mRNA; de igual modo que son diversos
los rnecrinisrnoc utilizados para regular la sintesis de
mRNA. La regulación coordinada de estos dos procesos provee la notable adaptabilidad de las celulas.
RESUMEN El RNA se sintetiza de una plantilla o molde de DNA por accion de la RNA polimerasa. Hay tres tipos de RNA polimerasa: el tipo 1 transcribe RNA ribosómico; el tipo 11, RNA mensajero y el tipo 111, RNA de transferencia. Las mhltiples subunidades de las enzirnas polimerasas se adhieren a la región promotora de un gen y transcriben la secuencia de la tira molde de DNA (unidad de transcripción) a una tira complementaria de RNA (transcripción primaria). Los promotores de genes procariotes son simples. En general, consisten en 40 pares de bases de DNA, que contienen dos elementos: una caja TATA, localizada I O pb corriente arriba del sitio de inicio de transcripcibn y un segundo e lemento, localizado 35 pb en ta direccibn 5' corriente arriba. Los promotores eucariotes son mmBs comple.jos y en general contienen varios efementos. Un conjunto de elementos asegura que la transcripcibn comience en el sitio correcto. Los elementos de este conjunto, que a menudo incluyen una caja TATA, también proporcionan un índice basa1 de inicio y, por lo general, se ubican en las 100 a 200 pb que están inmediatas corriente arriba del sitio de inicio dc Ea mscripci0n. Owo grupo de elementos, en general localizado más lejos en dirección 5' del sitio de inicio, puede amplificar o nulificar la transcripción. Estos actúan o sirven como elementos específicos de tejido o de seiial de respuesta. El proceso de transcripción puede subdividirse en inicio, alargamiento y terrninacihn. Cada paso requiere varias enzimas o factores además de RNA polimerasa. En las cdlulas eucariotas, la transcripcibn primaria por lo general consiste en fragmentos codificantes de arninoAcidos (exones) separados por
.%161?si.~, procesamzento y
secuencias intercaladas (intrones) que se eliminan duranfe su procesamiento a mRNA madura. El RNA ribosómico también se sintetiza como una molécula precursora grande 45s que se procesa a las formas maduras 2XS, IXS y 5.8% Las molkculac de mRNA experimentan recambio con vidas medias que varian de algunos minutos a
metuholkmo del RNA * 501
dias. Por tanto, la regulacibn de la estabilidad del mRNA es un paso de control importante. Varias secuencias en las regiones no codificantes 5' y 3' y en la región codificante s e consideran responsables de la estabilidad del mRNA. Estas secuencias, junto con proteínas fijadoras pueden dirigir nucleasas al mRNA o protegerlo contra el ataque de éstas..
REFERENCIAS Faisst S, Meyer S: Compilation of vertebrate-encoded transcription factors. Nucleic Acids Res 1992;20:3. Guthrie C: Mescenger RNA splicing in yeast. Science 1991;253,r 57. Javahery R et al.: DNA sequence requirements for transcriptional initiator activiiy in mammalian cells. Mol Ccll Biol 1994;14:1116. Pace NR: New horizons for RNA cataiysis. Science 1992;256:1402. Patrusky B: The intron story Mosaic 1992;23:22. Ross J: l'he turnovcr of messenger RNA. Sci Am 1989;260:48.
Shmpiro DJ et al: Regulation ol'mRNA stabil~tyin cukaryotic cells. Rioessays 1987;6:221 . Tjirn R: Molecular machines that control genes. Sci Am 1995;272:54. Wobbe CR, Struhi K: Yeast and human TATA-binding proteins have nearly identical DNA sequence rcqueri-
ments for transcription in vitro. Mol Cell nini 1990;10:3859. Yaung RA: RNA polyrnerase 11. Annu Rev Biochem 1991;60:589.
Sinitesis de proteínas Datyl K. Granner, MD
Las letras A, G , T y C corresponden a los nuclebtidos encontrados en el DNA. E s t h organizadas en palabras clave de tres letras llamadas codones y el conjunto de los codones constituye el código genetico. Un ordenamiento lineal de codones (un gen) especifica la síntesis de varias moléculas de RNA, la mayor parte responsables de algún aspecto de la síntesis de proreinas. Este proceso se lleva a cabo en tres etapas principales: inicio, alargamiento y terminación. Es semejante a la replicacihn y tranccripcidn del DNA en sus caracteristicas generales y en el hecho de que también sigue la polaridad 5' a 3'.
Antes de dilucidar el c6digo genético era imposible comprender la síntesis proteínica o explicar las mutaciones. El c6digo genético proporciona la base de ta explicaci6n en que los defectos de las proteínas pueden causar enfermedad y sirve para el diagnóstico y quizii para el tratamiento de las enfermedades geneticas. Ademhs, la fisiopatologia de numerosas infecciones virales se relaciona con la capacidad de &os de interrumpir la síntesis proteínica en la cklula huésped. Muchos antibacterianoc son efectivos porque interrumpen la síntesis proteínica en la c&lula invasora.
LA INFORMACION GENÉTICA FLUYE DEL DNA AL RNA Y DE ESTE ULTIMO A LA PROTE~NA L a información genetica contenida en la secuencia de nucleótidos del DNA es transcrita en el núcleo celular a la secuencia específica de nucleótidos de una molécula de RNA. La secuencia de nucle6tidos del RNA es complementaria de la secuencia de la lira molde de su gen en concordancia con las reglas del paseamiento de bases. Varias clases diferentes del RNA se combinan para dirigir la sintesis de proteinas. En los procariotes hay una correspondencia lineal entre el gen, el RNA mensajero (mRNA) transcrito del gen y el producto polipeptídico. La situación es más complicada en las cclulas eucariotas superiores, en las cuales la transcripcián primaria, RNA nuclear heterogéneo (hnRNA), es de mayor tarnafio que el RNA maduro. El hnRNA contiene regiones codificantes (exones) que formarán at RNA maduro y secuencias intercaladas largas (intrones) que separan a los exones. El hnRNA se procesa en el nucleo y los intrones, que a menudo constituyen una porcion mayor del hnRNA que los exones, se retiran. A continuacibn, los exones sen empalman para formar mRNA maduro, que se transporta al citoplasma, donde se traduce a proteína. La cdlula debe poseer la maquinaria necesaria para traducir de manera precisa y eficiente la inforrnaci6n de la secuencia de nucleótidos de un mRNA, en la secuencia de aminoácidos de la correspondiente proteina específica. Para aclarar nuestra comprensión
404
(Capif u10 40)
Bioquimica de Harper
de este proceso. al que se denomina traduccihn, se esperaba al descifrado del código genktico. Pronto fue comprendido que las moléculas de mRNA no tienen, por si mismas, afinidad para los aminokidos y, por tanto, que latraduccion de la información de la cecuencia de nuclehtidos del mRNA en la secuencia de aminoficidos de una proteina requiere de una rnol&cula adaptadora intermediaria. Esta molCcula adaptadora debe reconocer una secuencia especifica de nuclebtidos por una parte, así como un arnin~5:ido especifico por la otra. Contal molCcula adaptador& !a célula puede dirigir un aminoacido específico hacia la posición secuencia1 apropiada de una proteína como lo dicta la secuencia de nuclehtidos del mRNA específico. De hecho, los grupos funcionales de los aminoácidos en realidad no se ponen en contacto con el molde de mRNA.
LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DE UNA MOLÉCULA DE mRNA COMSISTE EN UNA SERIE DE CODONES QUE ESPECIFICAN LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOC DE LA PROTE~NACODIFICADA Las moldculas adaptadoras que traducen los codones en la secuencia de arninohcidos de una protelna son las molkculas de RNA de transferencia (tRN.4). El ribosama es el componente celular sobre el cual interactiian estas diversas entidades funcionates para ensamblar la molécula de proteina. Muchas de e s t a unidades subcelulares (ribosonias) puede agregarse para traducir simultáneamente una sola molécula de mRNA y, al hacerlo. forman un potirrihosoma. El reticute endoplásmico rugoso es un compartimiento de mernbranai con p~lirribosomasadheridos que se ocupa de la síntesis de proteinas integrales de la membrana y de proteinas para secrecibn. Las estructuras polirribodrnicas tarnbikn existen libres en el citaplasma, donde sintetizan proteínas que permanecen dentro de la ceiula. Veinte amino8cidos diferentes se requieren para la síntesis de proteinas y, así, debe haber por lo menos 20 codones distintos que comprendan la clave genetica. Puesto que s61o hay cuatro nucleirtidos diferentes en el mRNA, cada codón debe consistir de m& de un solo nucleótido purlnico o pirimidinico. Los codones que consisten de dos nucledtidos cada uno s61o proveen 16 (42) codones específicos, en tanto que los codones de .tres nucle6tidos proveen 64 (43 codones especificos. Ahora se sabe que cada codbn, consiste en una secuencia de tres nuclebtidos, esto es, un código de tripleta~.El desciframientodel d d i g o genetico se apoy6 en gran parte en la síntesis química de polímeros de nucledtidos, en particular tripletas.
EL CODIGO GENÉTICO ES INEQU~VOCO,N 8 TRASLAPANTE, SIN PUNTUACIÓN, DEGENERADO Y UNIVERSAL Tres codone; no codifican para aminoácidos específicos; éstos se denominan codones sin sentido. Por lo menos dos de ellos se utilizan en la d l u l a como sefiales de terminacion; estas especifican dbnde detener la polimcrización de los aminoLidoc en la molecula de proteina. Los 61 codones restantes codifican para 20 aminoácidos (cuadro 40-1). Asi, debe haber una "degeneración" en cl código genético; es decir, varios codones deben codificar para el mismo aminoacido. Algunos amínoacidoc son codificados por varios codones; por qjemplo. seis codones diferentes especifican serina. Otros aminoacidos, como metionina y triptdfano. sblo tienen un c o d ~ n .En general el tercer nucleótido en un codón es menos importante que los otros dos para determinar el aminoacido especifico por ser incorporado y esto da cuenta de la mayor parte de la degeneración del cbdigo. Sin embargo, para
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na iiuLiGvririO~ individuhrc, iricir,ta 1J = nuclcviiuu =idina. C = nuclebtsdo de citosina, A =nuclelitido de adema; G =nuclebtido de guanina Met = cwdnn iniciador de cadena; C T = codbn teminador de cadena, AUG, quc codifica parn Md,sirve como codbn ~ini~iador en ctlula~de los m¿miicro~(Las &reviatura~de los aminoacidos Fe explican en el capitulo 4). t En Ins mitocondrix de los mamíferos,AUA codifica ywninetimina UGA para hiptbfmu > AliA y ACfi wmo t w m i n x k m de cackna l*" ....*lbA,;. iiii
cer nucleótii
cualquier codón especifico s61o esta indicado un aminohcido único; el codigo genético no es am higuo; esto es, dado un codon especifico, sólo un aminoácido esta determinado. La distinción entre am bigücdad y degeneracibn es un concepto importante. El código no ambiguo, pero degenerado, puede ser descrito en términos molecularec. El reconocimiento de codones específicos en el mRNA por las moléculas adaptadoras de tRNA depende de su regibn anticodón y de las reglas de pareamiento de bases. Cada molécula de tRNA contiene una secuencia especifica, complementaria de un codíín, que se llama su anticodón, Para un codlin dado en el mRNA, sólo una unica especie de molécula de tRNA posee el anticodón apropiado. Dado que cada molkcula de tRNA puede cargarse con un solo arninohcido, cada codlin, por tanto, especifica unicamente un aminoAcido. Sin embargo, algunas moléculas de tRNA pueden utilizar el anticodón pasa reconocer más de un codbn. Con algunas excepciones, para un codbn específico, s61o un aminoácido específico será incorporado; aunque, dado un aminoácido especifico, mhs de un c o d h puede requerirlo. Como se describe adelante, la lechira del cbdigo genktico durante el proceso de la síntesis de proteínas no incluye traslape alguno de codones. Por tanto, el código genético no se traslapa. Además, una vez que se comienza la lectura en un codón especifico, no hay puntuación entre los codones y el mensaje es leido en una secuencia continua de tripletas de nucleótidos hasta que se alcanza un codbn sin sentido. Hasta hace poco, se considerabaque el c&ligogenético era universal. En la actualidad está demostrado que el conjunto de moléculas de tRNA en las mitocondrias (las cuales poseen su propia y distinta maquinaria de traduccibn) de eucariates inferiores y superiores, incluyendo al ser humano, leen cuatro codones de modo diferente a las molCculas de tRNA del citoplasma, aun en las mismas cklulas. Como se indica en el cuadro 40-1, el codón AUA se lee como Met y el UGA codifica para Tri en las mitocondrias de los marniferos. Además, los codones AGA y AGG se leen como paro o terminación de cadena miis que como arginina. Como consecuencia, las mitocondrias s61o requieren 22 moléculas de tRNA para leer su código genktico en tanto que el sistema citoplásmico de traducción posee un complemento total de 3 1 especies de tñNA. Anomdas estas excepciones, el código genético es universal. La frecuencia de uso de cada codbn para aminoacidos varia considerablemente entre las especies y en los diferentes tejidos de una misma especie. Los cuadros del uso de los codones se hacen cada vez más exactos conforme aumenta el secuenciamiento de los gencs. Su importancia es grande debido a que con kecuencia los investigadores necesitan deducir la estructura del
mRNA a partir de la secuencia primaria de la proteína para sintetizar una sonda de oligonucleotidos e iniciar un proyecto de clonación de DNA recombinante. Las principales características del ciidigo gendtíco se listan en el cuadro 40-2.
EXISTE POR LO MENOS UNA ESPECIE DE RNA DE TRANSFERENCIA (tRMA) PARA CADA 1 DE LOS 20 AMI NOÁCIDOS Las moléculas de tRNA tienen funciones y estructuras tridimensionales extraordinariamente similares. La función adaptadora de las moléculas de tRNA requiere de la carga de cada tRNA especifico con su aminoacido especifico. Puesto que no hay afinidad de los bcidos nucleicos para grupos funcionales específicos de los aminoácidos, este reconocimiento debe llevarse a cabo por una rnolecula de proteína capaz de reconocer tanto a una rnoIécula de tRNA especifico como a un minoBcido especifico. Por lo menos 20 enzirnas específicas se requieren para estas funciones de reconocimiento y para la adherencia apropiada de los 20 aminoacidos a las molécutas de tRNA especifico. El proceso de reconocimiento y unibn (carga) se realiza en pasos por una enzima para cada 1 de tos 20 aminoácidos. Es- enzima~se llaman aminoaciLtRNA Ellas forman un intermedio activado del complejo amino-acilAW-enzirnq como se presenta en la figura 4&1. El complejo específico arninoacil-AMP-emima reconoce entonces, un tRNA especifico al cual se adhiere la fraccion aminoacil en la terminal 3'-hidroxiladenosina. El aminoficido permanece adherido a su tRNA específico en una unibn éskr hasta que se polimeriza en una posición específica en la fabricacion de un precursor polipeptidico de una rnoldcula de proteína. Las regiones de la rnol~culade tRNA descritas en el capitulo 37 (e ilustradas en la figura 37-1 1) se hacen ahora importantes. El brazo timidina seudouridina-citidina (TvC) interviene en la combinacibn del aminoacil-tRNA a la superficie ribosdmica en el sitio de la síntesis de proteínas. El brazo D es uno de los sitios significativos para el reconocimiento apropiado de una especie dada de tRNA por la aminoacil-tRNA sintetasa correspondiente. El brazo aceptor, locali-
Cuadro 40-2. Caracteri'iticas del c6digo genético -- -. .. --
-
--
-
egenera o es ambig o se sobre]
. -v. o punruiiri: s universal
(Capitulo 40)
,706 Bioquimicu de Hurper
ATP
PPi
O
HOOC
- HC - R
Enz
b~
I
H2 N
O
- Adenina - Ribosa -O-F II -O-C 11 -CHI -R
Enzima (Enr)
EnzAMP-&A (aminoacido activo)
NHz
AMP + Enz
H
tANA
tRNA-AA
Complejo arninoacilAMP-enzima Figura 40-1. Formacidn de aminoacil-tRNA. Reacción en dos pasos que involucra a la enzima aminoacil-tRNA sintetasa, que conduce a la forrnacibn de aminoacik-tRNA La primera reacción implica la forrnacibn de un uimplelo AMP-aminoácido-enzima A continuacibn, este aminobcido activado se transfiere a la mol&culacorrespondiente del tRNA. El AMP y la enzima se liberan y esta ultima puede utilizarse de nuevo
zado en el extremo 3'-hidroxiladenosilo, es eI sitio de adherencia del aminoácido especifico. La región del anticoddn consiste en siete nuclebtidos y reconoce al cod6n de tres letras en el mRNA (figura 40-2). La secuencia leida en la dirección 3' a 5' en esa asaanticcdón consiste deuna base variable-purina modificada -~~~-pírimidina-pirimidina-5'* Nótese que esta direccidn para leer el anticodón es de 3' a 5', en tanto que el cbdigo genético en el cuadro 40-1 se Ice
5 ' - u * ~ r ~
*
A
A
A
,Pu ' N
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Anticodón
3,
*Pi Brazo del
PI
A
cc Fen
Figura 40-2. Reconocimiento del codón por el anticodbn. Uno de los cddones para fenilalanina es UUU. Un tRNA cargado con fenilalanina (Fen) tiene la secuencia mmplementaria AAA; por tanto, forma un complejo de bases pareadas con el cadbn. Clhsicamente la regibn del anticodon consiste de una secuencia de siete nucleótidos; variables (N), purinas modificadas (Pu*), X, Y, Z y dos pirimidinas (Pi) en la direccdn 3' a 5'.
de 5' a 3', ya que las asas codbn y anticodón de las moléculas del mRNA y tRNA, respectivamente, son antiparalelas en su complementariedad. La degeneracidn del c6digo genético reside en su mayor parte en el ultimo nuclehtido de la tripleta codón, sugiriendo que el pareamiento de bases entre este ultimo nucleotido y el nuclehtido correspondiente del anticdbn no es estricto. Este fendmeno se refiere como bamboleo; el pareamiento del c d S n y anticodón puede "bambolearse" en este sitio de pareamiento especifico de nuclehtido a nucteótido. Pos ejemplo los dos codones para la arginina, AGA y AGG, se pueden unir al mismo codón que tiene uracilo en su extremo 5'. De manera semejante, 3 codonespwa la glicina, GGU, GGC y GGA pueden fonnarun par de bases a partir de un anticodbn CCI. La 1es un nucleótido de inosina, otra de las bases peculiares que aparecen en las moléculas de tRNA. El reconocimiento del codón por una molécula de t R N k no depende del aminoBcido que estk adherido a su terminal 3'-hidroxilo. Esto ha sido ingeniosamente demostrado cargando un tRNA especifico para cisteina (tRNA,,,) con cisteina marcada radiactivamente. Entonces, por medios químicos, el residuo cisteinilo fue alterado para generar una rnol&cula de tRNA específica para la cisteina, pero cargada, en cambio, con alanina. La transformaci6n quimica de la fraccibn cisteinilo en alanilo no alteró la porción anticoddn de la mol&culade tRNA específica para la cisteina. Cuando esta alanil-tRNAo, se usb en la traduccidn de un mRNA de hemoglobina, se incorporo una alanina radiactiva a lo que normalmente era un sitio de cisteina en la moKculaproteínica de hemoglobina. El experimento democtr6 que el derivado aminoacílico de una mofecula de aminoacilo-tFWA no desempeiia una funcibn en el reconocimiento del codbn. Como ya se observb, la fracción de aminoacilo nunca se pone en contacto con el molde de mRNk que contiene los codones.
Sintesis de proreinas y el códrgo gené~ico 30 7
SE PRODUCE UNA MUTACION CUANDO OCURREN CAMBIOS EN LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS Aunque el cambio inicial puede no ocurrir en la tira codificadora de la molCcula de DNA de doble tira para ese gen, despuks de la replicacibn, las motéculas hijas de DNA con mutaciones en la tiracodificadora. se segregaran y aparecerán en la población del organismo.
Algunas mutaciones se deben a sustitución de bases Los cambios de bases individuales (mutaciones puntuales) puede ser transiciones o transversiones. En las primeras, una pirimidina dada se cambia a la otra pirimidina o una purina se cambia a la otra purina. Las transversiones son cambios de una purina acualquiera de las dos pirimidinas o el cambio de una pirimidina en cualquiera de las dos purinas, como se muestra en la figura 40-3. Si la secuencia de nuclebtidos del gen que contiene la mutacion se manscribe en una rnoldcula de RNA, entonces esta tendrá un cambio de base complementaria en este locus correspondiente. Los cambios de bases individuales en las molkculas de mRNA pueden tener uno de varios efectos cuando se traducen en proteinas: 1) Puede haber efecto no detectable debido a la degeneracidn del código. Esto es mis probable si la base cambiada en la molécula de mRNA fuera en el iercer nucleótido de un codón. Debido al bamboleo, la traduccibn de un codon es muy poco sensible a un cambio en la tercera posicidn. 2) Un efecto de sentido errbneo acontece cuando un aminoácido diferente se incorpom en el sitio correspondiente de la molécula de proteína. Este aminoacido equivocado o de sentido esrbneo, segiin su localización en la proteina específica, puede ser aceptable, parcialmente aceptable o inaceptable para la función de esa m o l ~ w l ade proteina. A partir de un examen cuidadoso del codigo genktico, se puede concluir que la mayor parte de los cambios
TC -
AG -
Transiciones
'
T A -
A-T
X X
CG -
E-C
Transvemiones
Figura 403. Representacidn diagramática de las rnutaciones de Iransicibn y transversión.
de bases individuales, dan por resultado el remplazo de un aminohcido por otro con grupos funcionales bastanre semejantes. Éste es un mecanismo eficaz para evitarun cambio d r h t ico en laspropiedades fisicas de una molécula de proteina. Si ocurre un efecto de sentido errbneo aceptable, la mol&cula proteínica resultante puede no ser distinguible de la normal. Un sentido erróneo parcialmente aceptable da por resultado una moiécu la proteínica con funci6n parcial, pero anormal. Si se presenta un efecto de sentido erróneo inaceptable, entonces la rnoldcula de proteina no e5 capaz de funcionar en su papel asignado. 3) Puede aparecer un c d 6 n sin sentido que luego da por resultado la terminacibn prematura de la incorporación de aminohcidos en una cadena peptidica y la producción de sólo un fragmento de la pretendida molCcula de proteina. Es elevada la probabilidad de que una rnolécu ta de protelna o fragmento peptidico terminado prematuramente no funcione en su papel asignado.
La molécula de hemoglobina ilustra los efectos de cambios de una cola base en eE gen estructural para hemoglobina Algunas mutaciones no tienen efecto aparente. La falta de efecto de un cambio de base Única sería demostrable sólo con el seguiniiento de la secuencia de los nucleotidos en las mol&cri!asde RNA mensajero o de los genes estructuralec para la hemoglobina, provenientes de un gran numero de humanos con moIeculas normales de hemoglobina. Sin embargo, se puede deducir que el coddn para la valina en la posición 67 de la cadena beta de la hemoglobina no es identico en.todas las personas que poseen la cadena beta normal. La hemoglobina Milwaukee tiene hcido gluthico en la posición 67, la hemoglobina Bristol contiene Acido asphrtico en esta misma posición. Para dar cuenta del cambio de arninohcido por el cambio de un solo residuo de nucleótido en el codOn para el aminohcido 67, se debe inferir que el mRNA codificador de [a hemoglobina Bristol poseía un codbn GUU o GUC antes de un cambio ulterior a GAU o GAC, codones ambos para ácido asph-tico (figura 404). Sin embargo, el mRNA codificadorde la hemoglobina Milivaukee tendría que poseer un codon GUA o CUG en la posición 67 para que el cambio de un solo nuclebtido pudiera producir la aparicibn de I'os codones de ácido g l u t h i c o GAA o GAG. La hemoglabina Sydney, que contiene alanina en posicibn 67, pudo haber surgido por el cambio de un solo nucleótido en cualquiera de los cuatro codones para valina (GUU,GUC, GUA o GUG), a los codones de alanina (GCU, GCC, GCA o GCG, respectivamente).
508 Bioquímrca de Hurper
(Capitulo 40)
Hb Mihaukee
Hb Bristol
fi47 Glutamato
P-67 Aspartato
Hb A (normal) P-67 Vaiina
Hb Sydney P-67 Alantna
GCU GCC
GCA GAG
GCG
Figura 40-4. La valina normal en posicibn 67 de la cadena beta de la hemoglobina A puede codificarse por 1 de los 4 codones que se muestran en el recthngula. En la hemoglobina anormal Milwaukee, el amino8cido en posición 67 de la cadena beta contiene glutarnato, codificado por GAA o GAG, cada uno de los cuales pudo resultar de una transversibn de un solo paso de los mdones para valina GUA o GUG De manera semejante, la alanina presente en la posicibn 67 de la cadena beta de la hernoglobrna Sydney pudo resultar de la trancicibn de un solo paso de cualquiera de los cuatro ccdones para la valina. Sin embargo, el residuo de aspartato en la pociubn 67 de la hemoglobina Bristol pudo resultar de la transvetci6n de un solo paso únicamente de los codones para la valina GUU o GUC
La sustitución de aminoácidos causa rnaitacienes sin sentido A. Mutaciones erróneas aceptables Un ejemplo de unamutación de sentido errhneo aceptable (figura 40-5, arriba) en e3 gen estructural para la cadena beta de la hemoglobina podría detectarse por la presencia de una hemoglobina electroforéticamente alterada en los esitrocitos de un ser humano aparentemente saludable. La hemoglobinaHikari se ha encontrado en por 10 menos dos familias japonesas. Esta hemoglobina tiene asparagina sustituida por lisina en la posición 61 de la cadena beta. La transversibn comespondiente podría ser AAA o AAG cambiadas a AAU o AAC. La sustitucibn especifica de licina por asparagina, aparentemente no altera la funci6n normal de la cadena beta en estas personas.
B. Mutaciones erróneas parcialmente aceptables Una
de sentido parcialmente aceptable (figura 40-5, cenüo) esra mejor ejemplificada por la hemoglobina S, hemoglobina de los drepanocitos, en la cual el aminosicido normal en posicion 6 de la cadena beta, el hcido glutiimico, se remplaza por la El cambio de nuclebtidoindividual en el codbn seria GAA o GAG de] ácido glu&ico a GUA o GUG de la valha, Claramente esta mutacidn de sentido errtineo dificulta la funci6n normal y da por resultado la anemia de c&lulasfalcifomes
cuando el gen mutante está presente en el estado homocjgótico. El cambio de glutamato a valina se considera parcialmente aceptable porque la hemoglobina S fija y libera oxigeno aunque de manera anormal.
C. Mutaciones erróneas inaceptables Una mutación de sentido errbneo inaceptable (figura 40-5, abajo) en un gen de hemoglobina genera una molécula de hemoglobina no funcionante. Por ejernp80, las mutaciones de la hemoglobina M generan molécu1as que permiten que el Fe7-de la fracción hem se oxida a ~ e ~para . , producir rnetahernoglobina. La metahemoglobina no puede transportar oxigeno (capitulo 7).
Las mutaciones por desplazamiento de marca se deben a supresión o inserción de nucleótidos en el gen que genera moléculas alteradas de mRNA La delecibn de un solo nucledtido de la tira codificadora de un gen, da por resultado un marco de lectura alterado en el mRNA. La m a q u i n ~ a que traduce el mRNA no reconoce que falta una base, puesto que no hay puntuacibn en Ia lectura de los codones. Asi, resulta una grave alteraci6n en la secuencia de aminoácidos polimerizados, como se representa en el ejemplo 1 de la figura 40-6. La alteracibn del marco de lectura d d a por resultado una traduccihn alterada;del mRNA dista1 a la deleción del nucledtido individual.
Síntesis de proteínas y
el código genL;tico 509
Hb A. cadena P Sentido errbneo
Hb Hikari. mdena p
Sentido erróneo
Hb A. cadena u Sentido errdneo
inaceptable Hb M (Boston), cadena a
Tirosina
UAU
0
UAC
Figura 40-5. Ejemplos de tres tipos de mutaciones por sentido errdneo que dan por resultado cadenas anormales de hemoglobina. Se indican las alteraciones de los aminoácidos y las posibles alteraciones en los codones, respectivamente. La mutacibn de la mdena beta en la hemoglobina Hikari aparentemente tiene propiedades fisiológicas normales, pero está electroforéticamente alterada. la hemoglobina S tiene una mutacidn de cadena beta y funcibn parcial; la hemoglobina S se liga al oxígeno, pero precipita cuando se desoxigena La hemoglobina M Boston, una mutaci6n de la cadena alfa, permite la oxidacibn del hierro ferroso del hem al estado férrico y de esta manera no se liga al oxigeno.
No solo la secuencia de aminoácidos distal a esta deleci6n resulta mutilada, sino tambikn la lectura del mensaje puede dar por resultado la aparición de un codbn sin sentido y, de esta manera, la produccidn de un polipéptido prematuramente terminada y mutilado cerca de su extremo carboxilo (ejemplo 3 , figura 404). Si tres nuclebtidos o un múltiplo de tres se suprimen de una región codificadora, el correspondiente RNA mensajero proporciona, al ser traducido, una proteina en la cual falta el número correspondiente de aminoicidos (ejemplo 2, figura 40-6). Debido a que el marco de lectura es una tripleta, la fase de lectura no se perturba para aquellos codones distales a la deleción. No obstante, si la delecibn de 1 o 2 nuclebtidos ocurre just,ment antes o dentro del codon d e terminacibn normal (codón sin sentido), la lectura de la seííal d e la terminacibn normal: se perturba. Tal deleción puede dar por resultado la lectura a travCs de una seAal de terminacibn hasta que se encuentra otro codón sin sentido (ejemplo 1, figura 40-6). Excelentes ejemplos de este fenomeno se describen en la presentación de las hemoglobinapatias.
Las inserciones de 1, 2 o de no rniiltiplos de tres nuclebtidos en un gen, darán por resultado un mRN A en el cual el marco de lectura está distorsionado despues de la traduccibn y los mismos efectos que ocurren con 19s deleciones se reflejan en la traducción del mRNA. Estos pueden ser secuencias alteradas de aminohcidos dictares a la inserción, y la generacihn de un codón sin sentido en la insercion o distal a ella, o quiza lectura a travds del codbn de terminación normal. Después de una delecidn en un gen, una jnserci6n (o viceversa} puede restablecer el marco de lectura apropiado (ejemplo 4, figura4 0 4 ) . El mRNA correspondiente, cuando se traduce, contiene una secuencia alterada de aminoácidos entre la insercidn y la deleción. Más alla del restablecimiento del marco de lectura, es correcta la secuencia de aminohcidos. Uno se puede imaginar qu6 diferentes combinaciones de deleciones, de inserciones o de ambas, daria por resultado la formacihn de una proteina en la cual una parci6n es anormal, pero que está rodeada por la secuencia nomal de aminohcidos. Tales fen6menos han demostrado convincentemente en el bacteribfago T4, descubrimientoque contribuyb significativamente a evidenciar que el marco de lectura es una tripleta.
1 TIOOsikestre 1
Normal
mRNA
UAG
GGC UAU AGU AGU CJAG ... -
UUUG Met -Ala -Ser
Polipéptido
1- [ UAG
-Lys
9
Ejemplo 1
mRNA
-Cvs
GCC
UUUG
-Gly -Tyr -Ser -Ser Terrninacibn
AAG
GCU
GUA GUU -
AUA
AG ... -
Alterado
Ejemplo 2
1mANA
UAG
UUUG
Polipkptido
AUG
1-1
Ejemplo 3
mRNA
UAG
E...
AAA GGC UAU AGU - -
Terminacion
Met-Ala-Ser-Cys-Gly-Tyr-Ser-Ser
UUUG
PolipBptido
e
9CUC -
Met -Ala-bu-
UUG
%
AGG CUA -
bu-Gln-Arg-bu
UAG
UUAG...
Terminacibn
" Alterado
Ejemplo 4
mRNA
UAG
UUUG
Potipkptido
-
AUG GCC YCU UUG CAA Met-AlaSer -Leu-Gtn-
& ü
Arg-Tyr-Ser
AGU
AGU
-Ser
s.. Terminacibn
Alterado
Figura 40-6. Demostracdn d e los efectos d e las deleciones y las inserciones en un gen en la secuencia de la transición del mRNA y d e la cadena polipeptldica traducida de ahí Las flechas rndican los sitios de las deleciones o las inserciones y las cifras en los círculos indican el número de residuos de nuclebtidos suprimidos o insertados.
Las mutaciones supresoras reducen los efectos de mutaciones con sentido erróneo, sin sentido y por desplazamiento de marco La descripci6n anterior de los productos proteinicos atterados por las mutaciones genéricas, se basa en la presencia de moléculas de tRNA que funcionan normalmente. No obstante, en los organismos procariotes y eucariotes inferiores, se han descubierto moléculas de tRNA que funcionan anormalmente, las cuales en
si mismas son resultado de las mutaciones. Algunas de estas mol6culas anormales de tRNA son capaces de suprimir los efectos de las mutaciones en genes estructurales distantes. Estas moleculas supresoras de tRNA, usualmente formadas como resultado de alteraciones en sus regiones anticodbn, son capaces de suprimir las mutaciones por sentido erróneo, las mutaciones sin sentido y las mutaciones producidas por desplazamiento de marco.Sin embargo, dado que las rnoliculas supresoras de tRNA no son capaces de distinguir entre un cod6n normal y uno resultante de una
mutacibn, su presencia en una célula usualmente da por resultado una viabilidad disminuida. Por ejemplo, las moléculas supresoras sin sentido de tRNA pueden suprimir las sehales de teminaci6n normal para permitir la lectura a través de ellas cuando ésta no es deseable. Las moléculas de tRNA supresoras de desplazamiento de marco pueden leer un cod6n normal mas un componente de un codon yuxtapuesto, para proveer un desplazamiento de marco cuando dste no es deseable. Es posible que las rnoldculas de ~ R N A supresor existan en las células de mamíferos puesto que hay transcripción a traves de la lectura.
LA S~NTESISDE PROTE~NASPUEDE DESCRIBIRSE EN TRES FASES: INICIO, ALARGAMIENTO Y TERMINACIÓ'N Las caracteristicas generales de la estructura de los ribosomas y su proceso de autoensamble se describen en el capitulo 39. Estas entidades particuladas sirven corno maquinaria sobre la cual una secuencia de nucleotidos del mRNA se traduce en la secuencia de aminoacidos de la proteina especificada. La traducción del mRNA comienza cerca de su terminal 5' con la fomacion del correspondiente amino terminal de la molecula de protelna. El mensaje se lee en dirección 5' a 3', y concluye con la Formacibn de la terminal carboxilo. De nuevo se muestra el conceptode polaridad. Como se describe en el capitulo 39 la iranscripcion de un gen en el correspondiente mRNA o su precursor forma primero la terminal 5' de la molkula de RNA. En los procariotes esto permite el comienzo de la traducción del mRNA antes de que la transcripción del gen este completa. En los organismos eucariotes, el proceso de transcripción es nuclear; la traduccibn del mRNA ocurre en el citoplasma. Esto excluye la transcripcidn y traduccibn simuttaneas en ellos y hace posible el procesamiento necesario para generar mRNA maduro a partir del hnRNA, producto de latmnscripción primaria.
El inicio requiere varios complejos proteína-RNA (figura 40-7) El inicio de la síntesis de proteina requiere la selección de una molkula de mRNA para su traslacibn por un ribosoma. Una vez que el mRNA se une al ribosoma, este último encuentra el marco de lectura correcto en el mRNA y la traslacibn a traducción comienza. En este proceso intervienen tRNA, rRNA, mRNA y por 30 menos I O factores de inicio eucariotec (eIF), algunos de ellos con subnnidades rniiltiples (3 a 8). Tambikn intervienen GTP,ATP y aminoacidos. E! inicio puede dividirse en cuatro etapas: 1) disociación del ribosoma
en sus subunidades 40s y 60s; 2) fijación de un
complejo temario formado por met-rRNA, GTP y elF-2 al ribosoma para formar un complejo de preinicio; 3) unibn del mRNA con el complejo de preinicio 405 para formar un complejo de inicio 40s y, 4) combinación del complejo de inicio 405 con Ea subunidad 60s para formar el complejo de inicio 80s.
A. Disociación ribosómica Dos factores de inicio, el F-3 y eIF-1 A. se unen a la subunidad 405. Esto favorece la disociacibn del rihosoma 80s en sus subunidades 40s y 60s e impide su reunidn. La fijacibn de eIF-3 a la subunidad 60s tambien evita que se unan de nuevo.
B. Formación del complejo de preinicio 405 El primer paso en estp proceso comprende la fijación de GTP en eIF-S. Luego este complejo binario se une a mez-tRNAi, un tRNA especifico para unirse el codbn de inicio AUG. Este complejo binario se une a la subunidad ribosiimica40S para formar el complejo de preinicio 40S, que se estabiliza al unirse con elF-3 y elF-I A. El eIF-2 es 1 de los 2 puntos de control de la sintesis proteinica en las célulac eucariotas y consta de subunidades alfa y beta. Se focforila (sobre la sesina 5 1) por una proteina cinasa independiente de cAMP que se activa cuando la célula esta bajo tensión y cuando e! gasto de energía que se requiere para la síntesis proteinica puede ser deletkreo. Tales situaciones incluyen caquexia de aminoácidos y glucosa, infección viral, deprivación sérica, hiperosmolaridad y choque de calor. El eiF-2alfa fosforilado se enlaza con fuerza, e inactiva, al eIF-2beta reciclador de prozeína GTP-GDP. Esto evita la formacibn del complejo preinicio 40s y bloquea la sintesic proteínica.
C. Formación del complejo de inicio 40s Las terminales 5' de la mayor parte de moIéculas de mRNA en las c&lulaseucariotas están "coronadas" o "rematadas", según se describe en el capitulo 39. Este capuchón de trifosfato de metil-guanosito facilita la fijacibn del mRNA al complejo de preinicie 40s. Una proteina fijadora del capuchón, elF-4F, se une al capuchon a travds de una de sus subunidades. Luego, eIF-4A y elF-4B se unen y es probable que reduzcan la es~ctumsecundaria~om~lejadel extremo5'del ~ R N A a travbs de sus actividades respectivas de ATPaca y helicasa. Es indudable que la integración de mRNA con el complejo de preinicio 405 para formar el complejo de inicio 405 requiere la hidrdlisis de ATP. El e1F-3 es una proteina clave debido a que se une con gran afinidad a mRNA y a la subunidad ribosómica 40s. Después de la fijación del complejo de preinicio 40s al capuchón del mRNA y de la reduccion ("fusi6nn)
/Capiiulo 40)
512 + Bioquím ica de Harper
Formacilin del complejo iniciador 80s
Farmacidn del complejo
temario
Activación del mRNA
ternario
Complejo de preinicio
1
ADP + P,
Met
Mei
r-
ATP
ADP + P,
Complejo de inicio
Met
inicio 80s
Figura 40-7. Reprecentacibn diagramatica del inicro de la sintesis de proteinas sobre el molde de mRNA que contiene un eapuchbn 5' (GmTP-5')y un extremo poli(A) 3' [3'(A)n]. Este proceso se desarrolla en tres etapas: 1) activaubn del rnRNb, 2) fomaci6n del complejo ternario que consiste en mRNAmet, el factor de inicio e IF-2 y GTP y 3) fomacdn del complejo de inicio 80s aetivo. (Vbace los detalles en el texto.) El GTP,*; GDP, O . Los d ~ e r s o sfactores de iniuo aparecen en forma abreviada como circulos e cuadrados; por ejemplo, elF-3(@; elF-4F
(m).
de la estructura secundaria prdxima al extrcmo 5' del mRNA, el complejo recorre al mRNA en busca de un codbn de inicio adecuado. En general, Piste es la mayor parte de los AUG 5', pero el codón de inicio preciso se determina por las llamadas secuencias de consenso de Kozak que circundan al AUG:
Al parecer se prefiere la presencia de una purina en las posiciones -3 y +4 en relación a AUG. El complejo eIF-4F (4F) es en particular importante en el control de la velocidad de traslacibn de la proteína. Ei 4F es un complejo que consta de eIE-4E (4E) que se enlaza a la estructura de remate m7G en la terminal S' del mRNA, de elF-4A que es una ATPasa dependiente de ñ N A que ayuda a escindir el RNA, y de p220 cuya función exacta se desconoce (figura 40-8). El 4E es importante porque el enlace del capuchón es un paso limitante de la velocidad en la traslacion. La
sobreexpresión de 4E produce transfomación maligna de las células, y la subexpresión resulta en una prolongación del cicro celular y desagregación de polisomas. Este proceso está bajo regulación en das niveles. La insulina y tos factores de crecimiento mitógeno producen fosforilacibn de 4E (sobre la serina 53) y activacibn de la proteína. Una familia de protelnas reciCn descubiertas se enlaza, e inactiva, al 4E. Estas proteinas incluyen 4E-BPl (y la protelna muy relacionada PHAS-3) y 4E-BP2. La fosforilacibn de estas proteínas, de nuevo por insulina o factores de crecimiento por vía de la estimutación de la proteína cinasa de la serina, produce la disociación de la proteína enlazada desde 4E, el ensamble de 4E y otros componentes al complejo 4F en el capuchdn del mRNA y e l inicio de la síntesis proteinica (figura 40-8). Esta observación explica cómo la insulina causa un notable aumento postranscripcional de la síntesis proteínica en el tejido adiposo y el musculo.
D. Femacjon del complejo de inicio 80s La unibn de le subunídad 80s y el complejo de inicio 4 0 s comprende la hidrólisis del GTP adherido a elF-2 por eIF-5. Esta reacción libera a los factores de inicio unidos al complejo correspondiente de 40s (luego, estos factores se reciclan) y produce la unión rápida de las subunidades 4 0 s y 60s para formar et ribosoma 805.En este punto, met-tRNA está en el sitio P del r i b soma, listo para que comience el ciclo de alargamiento.
El alargamiento es también un proceso de etapas rnUltiplec (figura 40-9)
Complejo elF4F
A. Adherencia de arninoacil-fRNA al sitio A
i,
t4fl
El alargamiento es un proceso cicljco que comprende varios pasos catalizados por proteinas designadas factores de alargamiento (eEF). Estas etapas son: 1) adherencia de minoacilo-tRNA al sitio A, 2) fomacion del enlace peptidico y 3) traslocacibn.
cap
LAUG++ ~i. En el ribosorna ROS completo
Figura 4 0 4 . Activau6n del elF-4E por la insulina y fomaubn del elF-4F de enlace del capuchbn. El complejo 4Fcapuchbn-mRNA se representa corno en la figura 40-7. El complejo 4F consta de elF-4E (4E), erF-4A y p225. El 4E se mantiene inactivo mientras liga mn una de una familia de proteinas de enlace (4E-BP). f a insulina y factores rnitogkniws activan una proteína cinasa de la serina y esto produce la fosforilacidn da 4E-BP El 4E-BP fosforilado se disocia de 4E y este último es entonces capaz de formar el complejo 4F y enlazarse al mRNA det capuchbn.
formado durante el proceso de inicio, el sitio A está libre. La ftjacibn del aminoacilo-tRNA apropiado en ese sitio requiere el reconocimiento del cod6n correcto. El factor de alargam tento eEF-1 alfa forma un complejo con GTP y el aminoacilo-tRNA entrante (figura 40-9). En estr! forma compleja, el árninoaci1-tRNA puede entrar al sitio A con liberación de eEF-lalfa-GDP y fosfato. Luego, como se muestra en la figura 40-9, el eEF-1 alfaGDP regeneran a eEF- lalfa-GTP con ayuda de otros factores proteinicos solubles y GTP.
GOP
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Figura 40-9. Representacibndtagram8tica del proceso de alargamiento del péptido en la síntesis de proteínas. Los pequenos circulos marcados con n-l , n, n+l, etoétera, representan los residuos de aminoácidos de la molécula de proteína recien formada. Los eEF-lava y eEF-2 representan los factores de alargamiento 1 y 2, respectivamente.Los sitios de peptidil-tRNA y del aminonacil-tRNA sobre el ribocoma se representan por el sitio P y el stiio A. respectivamente.
,Síntesis de proteínas y el cridigu genéiico
B. Formación del enlace peptídico Et grupo alfa-amino del am inoacil-tKNA nuevo en el sitio A lleva a cabo un ataque nucleofflico sobre el grupo carboxilico esterificado del peptidil-tRNA que ocupa el sitio P. Esta reacci6n sc cataliza pos un componente proteínico, peptidiltransferasa, de la subunidad ribosómica 60s. Esta actividad enzimatica puede realizarse por algún RNA integrante del ribosoma, quizá el rRNA 235. Este es otro ejemplo de la actividad riboshmica e indica una función directa importante y previamente insospechada del RNA en la síntesis proteínica (cuadro 40-3). Debido a que el aminoácido del arninoacil-tRNA ya está "activado", no se requiere una fuente adicional de energía para esta reacción. El resultado es la adherencia de la cadena peptidica en crecimiento al tRNA en el sitio A.
C, Tras/ocaciÓn Al separarse la parte peptidil del tRNA del sitio P, el tRNA sobrante se disocia riipidamente del sitio P. El factor de alargamiento 2 (eEF-2) y GTP son responsables de la traslocacibn del peptidil-tRNA recién formado en el sitio A al sitio P que habia quedado vacio. El GTP, utilizado como fuente energetica por eEF-2, se hidroliza a GDP y fosfato durante el proceso de tra~locación.Al pasar el peptidil-tRNA recikn formado a su codiin correspondiente en el sitio P, el sitio A queda libre para otro ciclo de reconocimiento de coddn por el siguiente aminoacil-tRNA apropiado y alargamiento. Al removerse la fracción peptidil del tRNA en el sitio P, el tRNA desprendido se disocia con rapide7 de ese sitio. La carga de la molécula de tRNA con un fragmento amlnoacílo requiere la hidrólisis de un ATP a AMP, lo cual equivale a la hidrirlisis de dos ATP a dos ADP y dos fosfatos. La entrada del aminoacil-tRN A al sitio A causa Ea hidrblisis de un GTP a GDP. La traslocaci6n del peptidil-tRNA recien formado del sitio A al sitio P por eEF-2 tambidn requiere la hidrólisis de un GTP a GDP y fosfato. Por tanto, los requerimientos energéticos para la fomaciiin de un enlace peptídico exigen el equivalente de dos rnoleculas de ATP a ADP y de 2 moléculas de GTP a GDP; esto
Cuadro 40-3. Evidencias de que el rRNA es una peptidiltransft . -- .--m a s pueden hacer i 1 cuanoo las preteinas se retiran o inxrivan t8n basta ntc Cicrtas partes de la síxucnc ia d~:1 i conservadas en toda: ; las especies :n la supcrTales regiones conseiyadas se e nc A ," "n ficic de la molt5cuIa 1>hT O El RNA pi~ e d ser e cataiitico a Las mutaci ones que produccn re:jistencia a los antibibticos en el riivel de la síntcsis pr otelnica se encuentran mas a menudo cn ei rKIYi\ que en los componentes proteinicos - . - del rihosoya 1
n - 7 .
5I5
es. la hidrolisis de cuatro enlaces fostato de alta energia. Este proceso ocurre con rapidez. Un ribosoinrt eucariote puede incorporar hasta seis aminohcidas por segundo; los ribosomas procariotes incorporan hasra 1 8 aminoácidos por segundo. Así, el proceso de sintesis de péptidos se realiza con gran velocidad y precisidn hasta alcanzar un codón de terminacion.
La terminación ocurre cuando se reconoce un codón sin sentido (figura 40-1 0 ) En comparación con el inicio y alargamiento, la terminacibn es un proceso relativamente simple. Después de múltiples ciclos de alargamiento que culminan en la polimerización de los aminoácidos específicos en una molkcuIa de proteína, el codón sin sentido o terminal del mRNA (UUA, UAG, UGA) aparece en el sitio A. Normalmente n o hay tRNA con un anticodhn capaz de reconocer tal señal de terminacibn. Los factores liberadores (eRF)son capaces de reconocer que una seaal de terminacibn reside en el sitio A (figura 40-1 0). El factor liberador, conjuntamente con el GTP y la peptídiltransferasa. promueve la hidrdlisis del enlace entre el pkptido y el tRN A que ocupa el sitio P. Así se adiciona una molécula de agua, en lugar de un arninoácido. Esta hidrólisis libera la proteína y el tRNA del sitio P. Después de la hidrblisis y laliberación, el rihosrna 80s se disocia en sus subunidades 40s y 60S, la cuales se reciclan. Por consiguiente, los factores de liberacibn con proteinas que hidrolizan el enlace peptidil-tRNA cuando un codón sin sentido ocupa el sitio A. Luego, el mRNA se desprende del ribosoma, que a su vez 5e disocia en sus subunidades tomponentes 40s y 60s y puede comenzar otro ciclo.
Los polisomas con ribosomas ensamblad~s La misma molécula de mRNA puede ser traducida o trasladada por muchos ribosomas de manera simultánea. Debido a su tamaño relativamente grande, las partículas ribosdmicas no pueden adherirse a un mismo mRNA sino con una separacibn de 80 nucleótidos por lo menos. La fijacibn de numerosos ribosomas en la misma molécula de mRNA forma un polirribosoma o "polisoma". En un sistema sin restricciones, el numero de ribosomas adheridos a un mRNA (y por tanto, el tamafío del polirribosoma) se correlaciona de manera positiva con la longitud de la molkcula de mRNA. Desde luego, la masa de la moI&culade mRNA e5 bastante pequefía comparada inclusive con la de un solo ribosoma. Un solo ribosoma de mamifero es capaz de sintetizar aproximadamente 100 enlaces peptidicos por minuto. Los polirribosomas que activamente sintetizan proteinas, pueden exislir como partículas libres en
51 6 Bioquímica de Harper
(Capitulo 40)
Codbn de terminación (sin sentido)
Factor liberador
-i GTP
N
Péptido
c f
/+=+ tRNA
Figura 40-10. Representacibn diagrarnhtia del proceso de terminacibn de la síntesis de proteinas. Los sitios de peptidil-tRNA y del arninoacil-tRNA se indican como sttios P y A, respectivamente. La hidrólisis del complemento peptidil-tRNA se muestra por la entrada del H20. Las N y C indican los amtno;jcidos teminal y carboxilo terminal, respectivamente, e ilustra la polaridad de la síntesis de proteínas
Sintesis de proteínas y el cddigo genébico 5 17
el citoplasma o pueden estar adheridos a laminas de material citoplasmico membranoso conocido como rettculo endoplásmico. La adherencia de las partículas de los polirribosomas al retículo endoplasrnico es responcable de su aspecto "rugoso" como sc observa por rnicroscopia electronica. Las proteinas sintetizada por los polirribosomas adheridos se introducen a las cisternas del retículo endoplasmico rugoso y exportadas desde alli. Algunos de los productos proteínico5 del retículo endoplasmico rugoso se empaquetan por el aparato de Golgi en partículas de cirndgeno para su eventual exporiaci6n (capitulo 43). Las pariiculas polirribos6mica.s libres en el citosol son responsables de la sintesis de las proteinas requeridas para las funciones iniracelulares.
trbnicas a partir de una mol&cula larga de mRNA. Estas rnolkculas de proteinas son subsecuentemente desdobladas en sitios específicos para proveer las diversas proteínas específicas requeridas para la función viral. En las células animales, muchas proteinas se sintetizan a partir del molde del mRNA como una molecula precursora. que más adelante debe ser modificada para ser proteína activa. El prototipo es la insulina, que es una proteína de peso rnolecular bajo con dos cadenas polipeptidicas unidas por puentes disulfuro intercatenwios e intracatenarios. La mol~cula se sintetiza como un precursor de cadena única o prohormona, que se pliega para permitir la formacidn de los enlaces disulfuro. Una proteasa especificaelimina el segmento que conecta a las dos cadenas para formar la molécula funcional de insulina (figura 5 1-3). Muchos otros p&ptidos se sintetizan como proLa maquinaria de la síntesis de proteínas proteinas que requieren de modjficación antes de obtener puede responder a riesgos ambientales su actividad biologica. Muchas de Eas modificaciones o modificarse para convertirse en parte posteriores a la traducción incluyen la remocibn de de un mecanismo patológico residuos de aminohcidos amino terminal por aminopeptidasas especificas. La colagena, una proteina abunLa ferritina, proteína fijadora de hierro, impide q u ~ dante en los espacios extracelulares de los eucariotes superiores, se sintetiza como procolágena, Tres el hierro ionizado (Fe2-)alcance concentraciones tbxicas mol~culasdel polipeptido procoligcna, frecuentemente dentro de las células. El hierro estimula la síntesis de no idénticas en secuencia, se alinean de una manera ferritina por activacibn de una o más proteínas citoplhsque depende de la existencia de pdptidoc aminotermimicas que luego pueden unirse a una regibn específica nal especificas. Entonces, enzimas especificas llevan a en la zona 5'no trasladada de mRNA para ferritina. Esta cabo hidroxilaciones y oxidaciones de residuos de interaccion proteina-mRNA activa al RNA mensajero aminoácidos especifícas dentro de las moléculas de p r e parafem'tina y se inicia su traslacidn. El mecanismo proporcionaun control rhpido por síntesis de unaproteina colagena para proporcionar enlaces cruzados para una (fenitina) que secuestra a ~ e " ,molécula con potencial mayor estabilidad. Los ptptidos aminoterminal se t6xico. separan de la rnol6cula para formar eP producto final. La maquinaria de sintesis de proteínas tarnbign unamol~culadecolageriaestablce insoluble(capítulo57). puede modificarse en formas nocivas. Los virus se Ocurren muchas otras modificaciones en las proteinac replican utilizando los procesos celulares del huésped, posteriores a la traducciiin. Por ejemplo, es comun la inclusive la síntesis de proteínas. Algunos mRNA modificacidn covalente por acetilación, la fosfovirales se traducen con mayor eficiencia que tos de la rilación y la glucosilacibn. céIula huksped (por ejemplo, virus Mengo y virus de encefalomiocarditis). Otros como reovirus y virus de estomatitis vesicular, se replican en abundancia y sus MUCHOS ANTIBIOT~COSACTÚAN mRNA tienen una ventaja competitiva sobre los de !a DEBIDO A QUE INHIBEN DE MANERA cClula huésped para factores de traduccion limitada. SELECTIVA LA S~NTESIS Otros virus inhiben la síntesis celular de proteínas al DE PROTE~NASBACTERIANAS impedir la fijaci6n del mRNA en el ribosoma 40s. El virus de la polio efectúa esto por activación de una proteasa celular que degrada al componente 220 kDa Los ribosomas de las bacterias y de las mitocondrias del complejo remate-fijador eIF-4F descrito antes. de los cucanotes superiores difieren del ribosoma de marnifere descrito en el capitulo 37. E4 ribosoma bacteriano es más pequefio (70s en lugar de 80s) y EL PROCESAMIENTO tiene un complemento de RNA y de moléculas proPOSTRANSLACVONAFECTA teínicas diferente y algo mas sencillo. Esta diferencia LA ACTIVIDAD DE NUMEROSAS ha sido explotada para propbsitos clínicos, debido a 'PROTE~NAS que muchos antibihticos interactúan de manera especifica con las proteinas de los ribosomas proAlgunos virus animales, notablemente el poliovirus carióticos inhibiendo así la síntesis de proteinas. La (un virus de RNA), sintetizan largas proteínas policisconsecuencia es una detención en el crecimiento o
3 18 Bioquimica de Harper
la muerte de la bacteria. Los más útiles antibióticos de esta clase (por ejemplo, tetraciclinas, lincocina, eritromicina y cloranfenicol), no interactúan con las proteínas de los ribocomas eucaribticos y, por tanto, no son tóxicos para organismos eucariotes. Los antibihticos de la clase macrhlida actúan mediante su enlace a rRNA 23S, lo cual es interesante en vista de la función recién apreciada del rRNA en la formacihn de enlaces péptidos. Otros antibihticos inhiben las síntesis de proteinas en todos los ribosomas (puromicina) o s61o en los de cklulas eucariotas (cicloheximida). La puromicina, cuya estructura se muestra en la figura 40-1 1, es un analogo estructural del t i m s i n i l - t ~ ~ ~ . purornicina -l,a se incorpora a través del sitio A de! ribosoma en la posicibn terminal carboxiiica de un pkptido, pero causa la liberacibn prematura del polip6ptido. La puromicina, como análogo del tirocinil-tRNA, inhibe eficazmente la síntesis de proteinas tanto en los procariotes como en los eucariotes. En eucariotes la cicloheximida inhibe a la peptidiltransferasa en la subunidad ribosómica 60S, al parecer mediante enlace a un componente del rRNA. La toxina diftkrica, una exotoxina de Covnehacterium diphtheriae infectada ron un fago lisogknico especifico, cataliza la ADP ribosilacibn del eEF-2 en la; células de marnifero, Esta modificación inactiva al eEF-2 y por ello inhibe específicamente la sintesis de proteinas en los mamíferos. Muchos animales (como el ratbn} son resistentes a la toxina diftkrica. Esta resistencia se debe a la incapacidad de la toxina para cruzar la membrana celular y no a la insensibilidad del eEF-2 de ratón a la ribosilacilin del ADP catali~ada por la toxina diftkrica por medio de NAD. Muchos de estos compuestos, en particular la puromicina y lacicloheximida, no son útiles en la clínica pero han tenido importancia en el descubrimiento del papel de la sintesis de proteinas en la regulación de los procesos metabblicos, en especial, en la inducción enzimaticrt por hormonas.
RESUMEN El flujo de [a información genética obedece a la secuencia DNA + RNA + proteina. La inforrnacion genética de la región escnicLura1 de un gen se transcribe en unamoldculade RNA de modo que la secuencia de este último es complementaria de la del DNA. En la sintesic de proteina inteniienen tipos diferentes de RNA que incluyen RNA ribosómico (rRNA), RNA de transferencia (t RNA) y RNA mensajero (m RNA), q u i b con una función catalitica directa en el caso del rRNA. En la información contenida en el mRNA hay un ordenamiento en thndem de codones, cada uno de ellos de tres nuclebtidos de longitud. Estos codones
Figura 40-1 1. Las estructuras mmparativas del antibibtim puromicina (arriba) y de la porcibn 3' terminal del tirosintltRNA (abajo).
tripleta no se traslapan y no hay puntuaci6n entre ellos; el mRNA se lee en forma continua desde un codbn de inicio (AUG) a uno de teminacibn (UAA, UAG, UGA). Estos codones agmpan o definen cada sección del marco abierto de lectura del mRNA, que es una serie de codones cada una de las cuales especifica a cierto aminohcido y la cual determina la secuencia precisa de aminoácidos de la proteína a ser sintetizada. Algunos arninohcidos se especifican por un solo codhn (metionina, miptdfano), en tanto que otros pueden ser codificados hasta por seis codones diferentes (leucina,
serina). La síntesis de proteína, igual que la de DNA y RNA, sigue una polaridad 5' a 3' y puede dividirse en tres procesos: inicio, alargamiento y terminacion. Cada proceso es complejo. Por ejemplo, el inicio de la sintesis de proteinas, ademlis de requerir ribosomas, que consisten ellos mismos de varios tipos de RNA y
docenas de proteinas, necesitan el mRNA especifico, los tRNA correspondientes a los 20 amino8cidos, 10 factores de inicio por 10 menos (algunos de los cuales son complejos de miiltiples subunidades) ATP y GTP. A pesar de esta complejidad, se ha logrado un entendimiento general del proceso ordenado que lleva a1 inicio, alargamiento y terminacion de la síntesis de proteínas y es posible describir los factores separados que intervienen en las ves fases. La información resumida antes hace más fhcil la comprensión de la forma en que surgen mutantes. Las
custituciones de bases sencillas puede conducir a codones que especifican un aminohcido dif-Orente en una posición dada o en un codhn de paro que lleva a una proteína truncada. Las adiciones o supresiones de bases alteran el marco de lectura, por tanto se leen codones diferentes. Esto condube también a una secuencia anormal de aminoácidos o a una proteina truncada si se crea un codbn de terminacion. Diversos compuestos que incluyen varios antibidticos, inhiben la sintesis de proteína al alterar una o más de las etapas antes descritas.
REFERENCIAS Crick F et al.: The genetic codc. Nature 196t ;192:1227. Farget BC: Molccular genetics o f human hemoglobin synthesis. Ann Int Med 1979;91:605
Hershey JWB: Translational control in mammalian cells. Annu Kev Biochcm 1991:60:717. Hinnebusch A: Translational contra1 of GCN4: An in vivo barumeter o f initial-factor activiv. Trends Riochem Sci 1994;371:762. Komk M: Structural features in e u k q o t i c mRNAs that modulate ihe initiation of translation. J Riol Chem 1991;266: 1986.
Noller HF: Ribosomal RN4 and translation. Annu REY Riochem 199 1 ;M:191. Pause A et al.: Insulin-dependent stimulation of protein synthcsis by phosphorylation of a regulator of 5' cap function. Nature 1994;371:762 Rhomds RE: Regulation of eukavotic protein synthesis by initiation factors. J Biol Chem 1993:268:3017. Schneider RJ, Shenk T: Irnpact of virus infection on host ceZl p r o t e i n s y n t h e s i s . A n n u R e v B i o c h e m 1987i56.3 17. Shatkin AJ: mRNA cap binding proieins: Essential factors for initiating translation. Ccll 1985;40:223.
Reaulación de A a expresión génica ai
Los organismos se adaptan a cambios ambientales mediante la modificación de la expresión génica. Este proceso se ha estudiado con detalle en bacterias y virus y, por lo general, implica la interacción de proteinas fijadoras especificas con varias regiones del DNA en la vecindad inmediata del sitio de inicio de la transcripci6n. Esto puede tener un efecto positivo o negativo sobre la transcripci6n. Las ctlulas eucariotas usan este sistema basico, pero además emplean otros mecanismos para regular [atranscripción. Entre otros se utilizan procesos como ta amplificación y el reordenamiento de los genes, el cambio de clase y las modificaciones posteriores a la transcripcion para controlar la expresión génica.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA Muchos de los mecanismos que controlan la expresion de los genes se usan para responder a las hormonas y a los genes terapéuticos. La comprensibn de estos procesos puede conducir al desarrolla de medicamentos que modifiquen los mecanismos fisiopatológicos o que inhiban la funci6n o detengan la proliferacibn de los microorganísmos patógenos.
PARA DESARROLLO, DIFERENCIACI~N Y ADAPTACIÓN SE REQUIERE REGULACIÓN QE LA EXPRESIÓN G~NICA
La infomaci6n genetica presente en cada celula sornática de un metazoaria es prficticamente idkntica. Las excepciones se encuentran en aquellas pocas células
que tienen genes amplificados o reordenados para llevar a cabo funciones celulares especializadac. La expresión de la información genktica debe regularse durante la ontogenia y diferenciación del individuo y de sus componentes celulares. Además, para que &te se adapte a su media y conserve la energía y los nutriences, la expresibn de la infomacibn gendtica debe responder a las sefiales extrinsecas. A medida que los sistemas biolbgicos han evolucionado, han aparecido rnecanismos reguladores mas complejos para dotar al ente y sus células de la capacidad de respuesta necesaria para la supervivencia en su complejo medio. Las células de mamifero poseen sólo cerca de 1000 veces m& informacibn genktica que la bacteria E.~ckerichiucoli; sin embargo, mucha de esta información genética adicional, probablemente interviene en la regulacibn de la expresihn de los genes durante la diferenciacidn de tejidos y procesos biológicos en el organismo multicelular y en asegurar que le sea posible responder a los complejos estimulos ambientales. En t h i n o s simples, sólo hay dos tipos de regulación de los genes: la reguIación positiva y la regulacibn negativa (cuadro 41-1). Cuando la expresión de [a información genética esti cuantitativamente aumentada por la presencia de un elemento regulador especifico, se dice que la regulacibn es positiva; en tanto que si la expresidn de la infomacibn genktica está disminuida por la presencia de un elemento regulador específico, se dice que es negativa. Se dice que el elemento o moldcula que media la regulacibn negativa es un regulador negativo; el que media la regulacion positiva es un elemento regulador positivo. Sin embargo, un doble negativo tiene e! efecto de actuar como positivo. Así, un efector que inhibe la función de un regulador negativo parecerá llevar a cabo una regulacion positiva. Muchos sistemas regulados que parecen inducidos son, de hecho, desreprimidos a nivel molecular. (Véase capitulo 11 para una descripción de estos términos.)
Cuadro 41-1. Efectos de la regulación positiva hre la ex]
.-
--
índice d
rión génirr
legulación positiva
mentada
- -
Tiempo
Seaal
EN LOS SISTEMAS BIOLOGICOS HAY TRES TIPOS DE RESPUESTAS TEMPORALES A UNA SENAL REEULADORA Existen tres respuestas representadas esquemhticarnente en la figura 41-1 como la velocidad de la expesidn ginica en respuesta temporal frente una sefíal inducida. La respuesta d e tipo k se caracteriza por una velocidad incrementada de la expresion génica, que depende de la presencia continua de la seRal inductora. Cuando se elimina la seflal inductora la velocidad de expresion ghnica se reduce a su valor original, pero repetidamente aumenta en respuesta a la reaparicidn de la seiral especifica. Este tipo de respuesta se observa comhnmente en muchos sistemas superiores despues de exposiciones a inductores como las hormonas esteroides (capitulo 44). Una respuesta de tipo B muestra una velocidad incrementada de la expresión gknica, que es transitoria aun con la presencia continua de la seilal reguladora. DespuCs de que termina la sefial reguladora y se permite que la chlula se recupere, puede observarse una segunda respuesta transitoria subsiguiente a una seAal reguladora. Este fenomeno de respuesta-desensibilizacion-recuperacibn caracteriza la acción de muchos agentes farmacol6gicos, pero tambikn es una característica de muchos procesos naturales. Este tipo de respuesta puede ocurrir comúnmente durante el desarrollo de un individuo cuando sólo se requiere de la aparición transitoria de un producto específico del gen, aunque persista la seflal. El patrdn de respuesta de tipo C muestra, en respuesta a la sefial reguladora, una velocidad aumentada de expresidn de1 gen que persiste indefinidamente aun despuds de la terminación de la sefial. La sefial actiia como un disparador en este patrón. Una vez iniciada la expresidn del gen en la célula, no puede terminarse, incluso en las cClulas hijas; por tanto, es una alteración irreversible y hereditaria.
Figura 41 -1. Representaciones diagramáticas de las respuestas de la velocidad de expresrón génica ante seflales reguladoras especificas como las hormonas.
Los procariotes proporcionan modelos para el estudio de la regulación de la expresión gbnica en células de mamíferos En los ÚFtimos 20 afios, con la comprensibn de como fluye la informacidn desde el gen a través de un RNA mensajero hasta una rnoldcula de proteina especifica, se ha elaborado un conocimiento bastante complejo de los detalles sobre la regulacidn de la expresión gknica en las celulas procariotas. La mayor parte del conocimiento detallado acerca de los mecanismos moleculares se había limitado hasta años recientes, a
los sistemas procarióticos y eucarióticos inferiores. Esto se debi6 a los anlilisis geneticos más avanzados primero disponibles para los seres primitivos. LOS avances recientes en la tecnología del DNA recombinante han permitida el inicio de un análisis profundo de la expresión génica en los marniferos. En este capitulo la exposición inicial se centra principalmente en los sistemas procariiiticos. No serán descritos los impresionantes estudios genéticos, sino m& bien la que puede denominarse la fisiologia de la expresión genica. No obstante, casi todas las conclusiones acerca de esta fisiología derivan de estudios gentticos. Antes de que la fisioiogia pueda ser explicada, deben definirse unos cuantos términos geneticos especializados para los sistemas procarióticos. El cistr6n es Ea unidad más pequefia de expresidn genktica. Como se describe en el capitufo I 1, algunas enzimas y otras moléculas proteinicas e s t h compuestas de dos o más subunidades no idkntícas. Asi, ahora se cabe que el llamado concepto de "un gen, una enzima" no es necesariamente válido. El cistrón es la unidad genttica que codifica para la estructura de la subunidad de una molecula de proteína al actuar, seghn lo hace, como la unidad mQs pequefia de expresión genética. As1 pues, la idea de un gen, una enzima puede considerarse más exactamente como el concepto: un cistrón, una subunidad. Un gen inducible es aquel cuya expresion aumenta en respuesta a un inductor; una seAal reguladora especifica. La expresibn de algunos genes es constitutiva, lo cual significa que se expresan a una velocidad razonablemente constante y no estbn sujetos a regulacion conocida. Como resultado de una mutacibn, algunos productos induclbles del gen se expresan constitutivamente. Una m u t a c i ~ nque da por resultado la expresibn constitutiva de lo que antes era un gen regulado, se llama mutación constitutiva.
EL ANÁLISIS DEL METABOLISMO DE LACTOSA EN E. COL1 CONDUJO A LA HIPOTESIS DEL OPERÓN Jacoh y Monod describieron en 1961 su modelo de operiin en un trabajo clhisico. Su hipotesis se fundamenta, en gran parte, en observaciones sobre la regulacibn del metabolismo de la lactosa por la bacteria intestinal E. coli. Los mecanismos rnolecularec responsables de la re;ulaci6n de los genes involucradosen el metabolismo de la lactosa están ahora entre los mejor comprendidos en cualquier sistema. La beta galactosidasa hidroliza a la beta galactbsido lacrosa, en galactosa y glucosa (figura 4 1-2)- El gen estructural (el gen Z lac) para la beta galactosidasa esta agrupado con los genes responsables de la permeabilidad de la galactosa al interior de la cklula (Y) y de la galactbsido acetilasa (A), cuya funcihn no se comprende. Los genes estnicturales para estas tres enzimas e s t h físicamente ligados y constituyen el operhn lac como se presenta en la figura 41-3. Esta disposicibn gen&i¢a de los gcnes estructurales y sus genes reguladores permite la expresión coordinada de l a tres enzimas encargadas del metabolismo de la lactosa. Cada uno de estos genes enlazados es transcrito en una gran molécula de ñNA que contiene codones miiltiples, independientes del inicio (AUG) y paro (UAA) de la traduccibn paracada cistrbn. Este tipo de mol&cula de mRNA se llama m R N A policistrónico. El mRN A policistrdnico se encuentra en f o m a predominante en los procariotes. Cuando E. coli se expone con lactosa o algunos analogos específicos de &a, la expresi~nde las actividades de la beca galactosidasa, de la galactósido pemeasa y de 1%galactósido acetilasa se aumenta de 10 a 100 veces. Esta es una respuesta de tipo A, como se observa en la figura 41 -1. Despues de eliminar la sefiaE, esto es, el inductor, la velocidad de síntesis de las tres enzimas declina. Puesto que no hay degradacibn significativa de estas enzimas en las bacte-
Enlace P-gluwsldiw
Galactosa
Figura 41-2. La hidrblisis de la lactosa a galactosa y glucosa por la enzima p-galactosidasa.
Glucosa
primero metaboliza la glucosa y luego temporalmente cesa de crecer hasta que se inducen los genes del operón lac para proporcionar la capacidad de metaboGen i Gen Z Gen Y Gen A lizar la lactosa. Aunque la lactosa esta presente desde I t I l. -. . el comienzo de la fase de crecimiento bacteriano, la Ooerbn lac cklula empieza a inducir las enzirnas necesarias para el catabolismo de la lactosa hasta que se agota la glucosa. Primero se consideró que este fenbmeno era atribuible a Figura 41-3. Relaciones de pocicibn de los genes estructula represi6n del operbn de la lactosa por algun cataborales y reguladoresdel operbn lac. El gen Z codifica la p - g a l a ~ lito de la glucosa, de aqui que fuera llamado represi6n tosidasa, el gen Y mdifica una permeasa y el gen A codrfica por catabolito. Ahora se sabe, que en efecto, la una acetilasa El gein i codtfrca la proteina represora para el "represión por catabolito" es mediada por una proteína ouerdn lac activadora del gen del catabolito (CAP, del inglés. catabol~tegene activaror prorern) junto con el AMP ciclico (cAMP) (figura 20-5). La expresibn de muchos sistemas de enzimas inducibles u operones en rias, la concentracion de beta galactosidasa así como E. col; y otros procariotes, es sensible a la represibn de las otras dos enzimas sigue siendo la misma a por catabolita, como se describe adelante. menos que se diluya por división celular. La fisiología de la induccidn del operdn lac se Cuando E. col$ se expone tanto a lactosa como a comprende bien a nivel molecular (figura 414). La glucosa como fuentes de carbono, el microorganismo srtio
Y-
Operador Gen i
A.
I
~-xKiZF
Subunidades
del represor
y
l
La RNA polimerasa no puede iranscnbrf los genes operadores o drsta-
"t---a
Represor
l
B.
Gen Y
i L l l
I
2
Y
!
)
sin glucosa
Genes que son transcntospor las RNA polrmerasas rnRNA
'-/',
lnductores
Proteina fi-galactosidasa
Proteina
Proteina
permeasa
acetilasa
Figura 4 1 4 . El mecanismo de represión y desr-presibn del operbn lactosa. Cuando no está presente el inductor (A), los productos del gen i que se sintetizan wnstitu?ivarr!onte forman una molécula represora que se une al iocus operador para ~mpedirla unibn de la RNA polimerasa en el Iocus promotor:, así impedir la cubsiguientetranscripcibnde los genes estructurales Z, Y y A Cuando estA presente el inductor (B), el gen i constitutivamenteexpresadoforma mol&wlas represoras que se inadivan por el inductor y no se puede unir al locus operador. En presencia de cAMP y su proteína enlazada (CAP), la RNA polimerasa puede transcribir los genes estructurales Z, Y y A, y la mol&cula poticistrbnica de mRNA formada puede traducirse en las correspondientes moléculas proteinicas p-galactosidasa, permeasa y acetilasa, permitiendo el catabolismo de la lactosa.
expresidn del gen i normal del oper6n lac es constitutiva; se expresa a una velocidad constante, dando por resultado la fonnacibn de las subunidades del represor lac. Cuatro subunidades idénticas de peso molecular 38 000 se ensamblan en una molCcula del represor lac. La moldcula de proteína represora, producto del gen i, tiene una elevada afinidad (&aproximada de 1WlZ m o K ) para el locus operador. El lncus operador es una r e g i ~ nde DNA de tira doble de 27 pares de bases de longitud con una simetría de rotacion de doble pliegue (indicada por líneas continuas a los lados del e-je punteado) en una zona que tiene 2 I pares de bases de longitud, como se muestra en seguida: -
-
- -
-
5'-AATTGTGAGC G GATAACAATT 3'-TTAACACLCE C TAT T -
El tamaiío mínimo efectivo de un operador para la fijación del represor lac es de 17 pares de bases (letras en negrillas en la secuencia anterior). En un momento dado, sólo dos subunidades de los represores parecen unirse al operador dentro de la regibn de los 17 pares de bases, por lo menos una base de cada par interviene en el recanocimierito y fijación del represor lac. La unión ocurre en su mayor parte en el surco mayor sin interrumpir la naturaleza de doble hélice de bases pareadas del DNA operador. El Iilcus operador está entre el sitio promotor, en el cual se adhiere la RNA polimerasa dependiente del DNA para comenzar la banscripcibn, y el sitio de inicio de la transcripcibn del gen 2, e6 gen estructural para la beta galactosidasa (figura 41 -3). Cuando se adhiere al 10cu.s operador, la rnólécula represora impide la transcripcibn del lmui operador, así como la de los genes estructurales distales Z, Y y A. Así pues, la molécula represora es un reguladornega2ivo; en su presencia (y en la ausencia de inductores, vhase después) se impide la expresibn de los genes Z, Y y A. Normalmente se encuentran presentes 20 a 40 moléculas tetrárnetas del represor y un loci operador par célula. Un anilogo de la lactosa que es capaz de inducir al oper6n lac, aunque 151mismo no sirve como sustrato para la beta galactosidasa, es un ejemplo de inductor gratuita. Un ejemplo es el isopropiltiogalactosido (IPTG). Laadición de lactosa o de un inductor gratuito a bacterias que crecen en una filente de carbono escasamente utilizada (coma el succinato) da por resultado la pronta induccidn de las enzimas del operon lac. Pequeiías cantidades de3 inductor gratuito o de lactosa son canaces de entrar en la célula aun en ausencia de perm&a. Las molkulac represoras, tanto las adheridas a los loci operadores como las libres en el citosol, tienen afinidad por et inductor. Launihn del inductor con una rnol~cularepresara adherida al loclas operador inducll-á un cambio de conformaci6n en laestructura del
represor y hará que se separe del DNA. Una vez que se adhiere la RNA polimerasa dependiente de DNA a la tira codificadora en el sitio promotor, comienza la transcripción. La polirnerasa genera un mRNA policistrdnico, la terminal 5' la cual es complementaria a la banda molde de la tira codificadora del operador. De esta manera, un inductor desreprime el oper6n tac y permite la transcripcibn de los genes estructurales para la beta galactosidaca, la galactósido permeasa y la galactbsido acetilasa. La traduccihn del mRNA policistronico puede ocurrir aun antes de que la transcripci6n se complete. La desrepresión del operbn lac permite a la cdlula sintetizar las enzimas necesarias para catabolizar la lactosa como fuente de energía. Para que la RNA polimerasa se adhiera al sitio promotor, también debe estar presente la proteína activadora del gen del catabolito (CAP) a la cual está adherido el cAMP. Por un mecanismo independiente, la bacteria acumula cAMP solo cuando se le priva de una fuente de carbono. En presencia de glucosa o de glicerol en concentraciones suficientes para el crecimiento, las bacterias carecerfin de suficiente cAMP para unirse a CAP. Asi, en presencia de glucosa o de glicerol, falta la CAP saturada de cAMP, de manera que la RNA polimerasa dependiente del DNA no puede comenzar la transcripción del operón lac. En presencia del complejo CAP-cAMP, el cual se une al DNA por arriba del sitio promotor, ocurre entonces la transcripcibn (figura 4 1 4 ) . Asl, el regulador CAP-cAMP actúa como un regulador positivo porque su presencia se requiere para la expresión del gen. Por ende, el operón lac esta sujeto a ambac regulaciones, positiva y negativa. Cuando se muta el gen i de manera que su producto, el reprecor lac, no es capaz de unirse al DNA operador, el individuo exhibira expresihn constitutiva del oper6n lac. Por el contrario, un organismo con una rnutacion en el gen i que impide la fijacion de un inductor al represor permanece reprimida aun en presencia de la molecula inductora debido a que ésta no puede fijarse al represor sobre el locus operador para desreprimir al operón. Las bacterias que alojan mutaciones en su Iocw operador que hagan las veces de la secuencia del operador no se unen a una molkcula represora normal y son constitutivas para la expresión de los genes del operón lac.
El cambio genético del bacteriófago lambda (A) proporciona un paradigma para interacciones proteína-DNA en células eucarietas Algunas bacterias albergan virus que pueden residir en estado latente dentro del cromosoma bacteriano o pueden replicarse en la bacteria y finalmente conducir
(Capitulo 41)
a la lisis y muerte de la bacteria huésped. Algunas E. coli albergan a un virus "moderado", el bacteriofago lambda (lb}. Cuando un lambda infecta a una bacteria E. col! sensible, inyecta su DNA lineal de doble tira de 45 000 pares de bases al interior de la célula (figura41-5). Según el estado nutricional de esta, el DNA lambda se integra en el genorna del huésped (via lisogenicaj y permanece latente hasta que se activa (vease adelante) o comienza a replicarse hasta que 5e hayan formado aproximadamente 100 copias de vims completos, empacados en protclna, momento en el que efectúan la lisis de la bacteria (vía litica). Las particular virales recidn generadas pueden entonces infectar a otros huespedes sensibles. Cuando se integra en su estado latente al genoma del hudsped, el lambda permanece en ese estado hasta que se activa por exposicidn de SU huésped bacteriano lisogénico a agentes que lesionan el DNA. En respuesta a tal estimulo nocivo, el bacteriiifago latente resulta "inducido" y comienza a transcribir y subsecuentemente a traducir aquellos genes de su propio genoma que son necesarios para su separacibn del cromosoma de la bacteria, para la replicación de su DNA y para la síntesis de su envoltura proteínica y sus enzirnas liticas. Este suceso acttia como disparador o como una respuesta tipo C (figura 4 1-1); esto es, una vez que el bacteriofago lambda se compromete en el proceso de inducción ya no puede retroceder: la d l u l a se lisa y el bacteribfago replicado se libera. Este cambio de un estado de profago o latente a una infección Iítica se comprende mejor a nivel gmttico y molecular y se describe aqui en detalle. El fenómeno del cambio en el larnbda se centra alrededor de una región de RO pares de bases en su molécula de DNA de doble tira conocida como el "operador derecho" (OR)(figum 41 4 A ) . El operador derecho está flanquedo a su izquierda por el gen estructural para el represor lambda y en su lado derecho por el gen estructural para otra protelna reguladora llamada cro. Cuando el lambda esta en estado de profago, es decir, integrado en el genoma del huesped el gen represar es el único gen lambda expresado. Cuando el bacterihfago experimenta crecimiento lítico, el gen represor no se expresa pero el gen cro, así como muchos otros genec del larnbda SI lo son: es decir, cuando el gen represor es activo, e[ gen cro es inactivo y viceversa. Como veremos, estos dos genes regulan mutuamente su expresibn y, por tanto, en última instancia, ladecision entre crecimiento lítico y licogenico del lambda. Esta decisi6n entre la transcripcihn del gen represor y la transcripcibn del gen cro es un ejempla de cambio moleculsr. La región del operador puede subdividirse en tres sitios definidos cada uno de los cuales consta de 17 pares de bases de una secuencia de DNA similar, pero no iddntica, juntas una con otra (figura 4 1 d B ) . Cada
IisogCnica
lítica
Radiación
Figura 4 1 6 . La infeccidn de la bacteria E. col¡ por el fago lambda comienza cuando una particula viral se adhiere a la célula bacteriana (1) e inyecta su DNA (drea sornbreada) al rnterior (2,3). La infeccibn puede seguir dos cursosd!ferentes dependiendo de cuál de los dos conjuntos de genec virales ect4 en servicio. En la vía lisogénica, el DNA viral se integra al cromosorna bacteriano (4, 5), donde se replica pasivamente mnforme la célula se divide. El virus latente se denomina profago y la célula que lo alberga Iisog8nica. En la modalidad alterna de infeccibn Iítica, el DNA viral se replica por si mismo (6) y dirige la sintesis de las proteinas virales (7). Se forman cerca de 100 partiwlas virales nuevas. Los virus proliferantes lisan o hacen estallar a la célula (8). Un profago puede serUinducido"por un agente como la radiacibn ultravioleta (9). El agente inductar produce un cambio, de modo que se pone en cerviao un conjunto diferente de genes, El DNA viral forma un asa que se desprende del cromocoma (10) y se replica; el virus prosigue por la via titica. (Reproducida con autorizacibn de Ptashne M, Johncon AD, Pabo C0: A genetic switch in a bacteria1 virus Sci Am [Nov] 1982;247.128.)
Gen para el represor (ci)
A
a
RNA represor I
-0 ~ 3 _ ---
-- - - - -- _ -- - --
--u
-
-"*
Oa2 ..-
-
S
Oal
13rornotordel represcr
Figura 4 1 4 , El operador de la derecha (OR)se muestra can gran detalle en esta serie de dibujos. El operador es una regibn del DNA vira1 de aproximadaente 80 pares de bases de longitud (A) A su izquierda se encuentra el gen que codifica para el represor lambda (cl), a su derecha el gen (cm) que codfica la proteina reguladora cro Cuando la regibn del operador se amplifica (E), se observa que incluye tres subregiones, 0 ~ 1 0, ~ y20 ~ 3cada , una de 17 pares de bases de longitud. Son sitios de rewnocimiento a los cuales pueden unirse el represor y cro Los sitios de reconocimfento traslapan dos promotores. secuencias de bases a las cuales la enzima RNA polimerasa se une para transcribir un gen en mRNA (líneas onduladas), al cual traduce a una proteina. El sitio 0 ~ esta 1 amplificado (C) para mostrar su secuencia de bases Obsérvese que en la regibn del cromosoma lambda las dos tiras de DNA actúan mmo molde para transcripción (capitulo 39). (Reproducida con autorización de Ptashne M, Johncon AD, Pabo CO. A genetic swftch in a bacteria1 virus. Sci Arn [Nov] 1982;247.128 )
una de: estas tres subregiones, OR1, OK2y 0 ~ 3pueden ,
fijar ya sea las proteinas represoras o a la proteina cro en el surco mayor de la doble htilice del DNA. La región del DNA entre los genes cro y represortambién contiene dos secuencias promotoras que dirigen la unión de la RNA polimerasa en una orientacibn especifica, donde comienza la transcripcidn de los genes adyacentes. Un promotor dirige a la UNA polimerasa para comenzar la transcripción en dirección hacia la derecha y, por tanto, para transcribir al gen cro y otros genes distales, mientras que el otro promotor dirige la transcripcibn del gen represor en dirección hacia la izquierda (figura 4 1 4 B ) . El productodel gen represor, la proteína represora de 236 arninoAcidos y 27 kDa, existe como una molécula con dos dominios, mla cual el dominio aminm terminal se une al DNA operador y el dominio carboxilo-terminal promueve la unibn de una proteina represora con otra para formar un dimero. El dímero de moléculas represoras se une al DNA operador mucho mas íntimamente que l a forma monomkrica (figura 4 1-7A a C). El producto del gen cro, o sea la proteina cro de 66 aminoii~idos~y 9 kDa tiene un dominio Unico, pero m b i h se une al DNA del operador tan estrechamente como un dimero (figura 4 1-7D).Obviamente, el dominio Unico de la proteina cro media tanto la fijacidn al operador como su dimerizacibn. En una bacteria Iisogtnica, es decir una bacteria que contiene un profago lambda, el d h e r o represor lambda se une de manera preferente a Oal, pero al
hacerlo, por una interaccion cooperativa, incrementa la fijaci6n (por un factor de 10) de otro dimero represor OR2(figura 41-81. La afinidad del represor para 0 ~ es3 la menor en relación con las tres subregiones del operador. La unión del represor 0 ~ 1 tiene dos efectos principales. La ocupaciiin de ORI por el represar bloquea la fijacibn de la RNA polimerasa al promator del lado derecho y, por tanto, impide la expresihn del gen cro. En segundo lugar, como se mencionó, el dímero represor unido a OR1incrementa la unibn de los dímeros represores a OR2.Este ultimo suceso tiene el importante efecto adicional de intensificar la fijacihn de la RNA polimerasa a l promotor del lado izquierdo que traslapa a 03 y por ende incrementa la transcripción y la expresiiin subsecuente del gen represor. En apariencia, este incremento de la transcripcihn es mediado por interacciones directas de proteina a proteina, entre la RN A polimerasa unida al promotor y el represor unido a OR2. Así, el represar lambda es al mismo tiempo un regulador negativo, al evitar la transcripcibn del gen cro y un regulador positivo, por incrementar la transcripción de su propio gen, el gen represor. Este doble efecto del represor es la causa de la situación estable del bacteribfago lambda latente; no s610 el represor impide la expresión de los genes necesarios para lisis, sino tambikn promueve la expresi6n de si mismo para estabilizar este estado de diferenciacibn. En caso de que la concentracidn de la proteina represora Ilegue a ser excesiva, el represor puede unirse a 0 3 y de ese modo hace que disminuya la mnscripcibn del gen represor del promotor del lado
AminoAcidos
1 a 92
Figura 41 -7. Estructuras rnolecularesesquemáticasde CI(represor lambda, mostrado en A, B y C) y cro La proteína represora de lambda es una cadena polipeptidica de 236 aminoácidos de longitud La cadena se pliega sobre sí misma en forma de pesas con dos subestructurac. un dominio aminoterminal (NHz) y un dominio carboxilo terminal (COOH) Los dos dominios se enlazan por una región de la cadena susceptiblea escisión par proteasas (indicado por las dos flechas en A) Las moléculas simples de represor (monbmeros} tienden a unirse para formar dimeros (S), un dimero puede disociarse para regenerar monbmeros de nuevo. Los dimeroc se conservan unidos principalmente por contacto entre los dominios carboxilo terminal (sombreado). Los dimeros de represor se unen a (y pueden desprenderse) los sitios de reconocimiento en la region del operador; su mayor afinidad es por el sitio ORI (C) Es el dominio aminoterminalde la rnol6cula represora la que hace contacto con el DNA (sombreado) Cro (D) tiene un solo dominio Con sitios que promueven la dimerizacibn y otros que favorecen la untbn de los dirneros con el operador, de preferencia a 0 ~ 3(Reproducida . con autorizacion de Ptashne M, Johnson AD. Pabo CO. A genetic swttch in a bacteria1virus. Sci Am [Nov] 1982,247.128 )
izquierdo, hasta que la concentración del reprcsor disminuye y se separa por si mismo de OR3. Cuando una seflal dañina al DNA como la luz ultravioleta cae sobre la bacteria lisogknica huésped se generan fragmentos de DNA de una sola tira que activan a una proteasa especifíca codificada por un gen bacteriano referido como recA (figura 4 1-8). La proteasa activada recA hidroliza la porción de la molkcula de proteina represora que conecta los dominios arninotenninal y carboxiloterminal. Tal escisión de las dominios del represor causa la separación de sus dimeros, lo cual a su vez produce una separacihn de las molkulas de ORZ y por último de 0~1. Los 2 efectos de remover al represor de OR1 o 0 ~ pueden predecirse. Inmediatamente, la RNA polimerasa tiene acceso al promotor situado a la derecha y comienza a transcribir al gen cro y se pierde el efecto favorecedor del represor en 03 sobre la transcripci6n hacia la izquierda (figura 4 1-8). La proteína cro traducida desde el gen cro recién transcrito también se une a Ia región del operador como dimero, pero su orden preferencial es el opuesto del explicado para el represor (figura 4 t -8). Esto es, cro se une m4s fuertemente a 0 ~ 3pero , hay efecto 3 la fijación del no cooperativo de cro sobre 0 ~ en propio cro a 0 ~ 2A. concentraciones aumentadas de cro, la proteina se unira a 0 ~ y2finalmente a OR1. La ocupacibn de OR3por cro desconecta inmediatamente la transcripción del promotor situado hacia la izquierda y, por tanto, impide cualquier expresión ulterior del gen represor. De este modo
se efectúa el cambio completo; ahora se expresa el gen cro y el gen represor queda totalmente desconectado. Este fenómeno es irreversible y comienm la expresibn de otros genes lambda como parte del ciclo Iítico. Cuando la concentraci6n del represor cro llega a ser bastante elevada, ocupa también 0 ~ 1 y al hacerto reduce la expresión de su propio gen, proceso que es necesario para efectuar las etapas finales del ciclo lltico. La estructura tridimensional de la proteina cro y de la proteina represora lambda se han determinado por cristalografía can rayos X y están probados los modelos propuestos para su enlace y mecanismo de ejecución de los fénomenos molecu tares y genéticos antes descritos. Ambos enlazan al DNA mediante el mecanismo de hélice-vuelta-h6lice (vkase adelante). A la fecha, este sistema proporciona el mejor entendimiento de los eventos moleculares que participan en la regulacihn genica.
LA REGUCACIÓNGENICA EN PROCARIQES Y EUCARIOTES DIFIERE EN VARIOS ASPECTOS IMPORTANTES Ademlis de la transcripcidn, las células eucariotas utilizan varios mecanismos para regular la expresión génica (cuadro 41-2), La membrana nuclear de las celulas eucariotas separa físicamente la transcripcihn de los genes de la traduccibn, ya que los ribosomas existen sólo en el citoplasma. Existen muchos pasos
Profago 0 ~ 3
OR2
0 ~ 1
nnn
Promotor del repiesor
f.
I
Promotor cro
u Promotor del represor
A
5
l
l
,>
5 ::
>
A
'
(
Promotor cra
A '
Radiación ultravioleta 0 ~ 3
nr
Induccibn (2)
0 ~ 2 0 ~ 1 i
I
Crecimiento litico temprana
Promotor del represor
0 ~ 3
Promotor cro
0~2
O R ~
nnn
l
I
Promotor del represor
RNA nolimerasa
i
Promotor cro
Figura 41 -8. La coníiguracibn del cambio de estado (de activo a inactivo y viceversa) se muestra en cuatro etapas del ciclo de vida del bacteridfago larnbda. La via lisogénica (en la cual el virus permanece latente como profago) se selecciona cuando un dirnero represor se une a 0 ~ 1haciendo , por tanto posible que 0 ~ sea 2 cubierto inmediatamente por otro dimero. En el 2 que la RNA polimerasa se una al promotor profago (parte superior), los dírneros represores unidos a ORI y a 0 ~ impiden de la derecha y bloquean en esta forma la síntesis de cro (control negativo) Los represores también intensifican la fijación de la polimerasa al promotor de la izquierda (control posttivo) con ei resultado de que el gen represor se transcribe y produce el RNA correspondiente (línea ondulada) y se sintetiza más represor, que mantiene el estado lisogeniw El profago es inducido cuando la radiacibn ultravioleta activa a la proteasa recA, la cual escinde los rnonómeroc del reprecor. El equilibrio de rnonómeroc, dimeros libres y de dimeros unidos se desplaza y los dimeros abandonan los sitios en el operador. La polimerasa ya no se estimula para unirse al promotor de la izquierda. de modo que ya no ce sintetiza más represor Conforme la ~nduccion prosigue, todos los sitios en el operador quedan vacantes y de este modo la polimeraca puede unirse al promotor de la derecha por lo que se sintetiza la proteína cro. Durante las fases iniciales del crecimiento litico, un dímero cro sencillo se une a 0 ~ 3 , sitio por el cual tiene la mayor afinidad. Ahora la polimeraca no puede unirse al promotor de la izquierda, pero el promotor de la derecha permanece accesible. La polimeraca continua unikndose ahi, transcribiendo a cro y a otros genes tempranas del ciclo litico. Sobreviene el desarrolle litico. (Reproducida con autorización de Ptashne M, Johnson Ad, Pabo CO: A genetrc switch in a bacteria1virus Sci Am [Nov] 1982,247 128 )
j30
Bioquimicu de Harper
Cuadro 41-2. La expresión genica se regula por transcripcidn y por otros muchos mecanismos en las céliilas eiicariotas 1
.-
.-
.
Otres métodos de regulrción g
-
cacibn gCn icu iamiento gknico miento de RN A
dc c m,-*l..,* p u i l lUAl *~IL i~i i i \ i ~ f i Transporte del mRNA del núcleo al citoplasma Regulacion dc la estabilidad dcl mRNA - -. r~irciiru~iva~
mhs, en especial en el procesamiento del RNA, involucrado en Ea expresibn de los genes eucaribticos que en los procaribticos; estos pasos proporcionan sitios para influencias reguladoras que no pueden existir en los procariotes. El procesamiento del RNA en los eucariotes incluye el capuchón del extremo 5' de la transcripcihn primaria, adernás de una cola de poliadenilato para el extremo 3' de la transcripción y la separacihn de las regiones de intrones para generar exones unidos en la moldclula madura del rnRNA. Hasta la fecha, los análisis de la expresión gknica en las eucariotes proporciona Ea prueba de que la regulacibn ocurre a nivel de la transcripcibn, el procesamiento del RNA nucIear y la estabilidad del mRNA. Además, está demosmdo que la amplificacibn del gen y su reordenamiento son sucesos que ocurren e influyen en la expresibn genica. Debido ar advenimiento de la tecnología del DNA recombinante se avanza enormemente en los UItimos años en [a comprensión de la expresión de los genes. Sin embargo, a causa de que la mayor parte de los eucariotes contienen m& información genetica que los procariotes y la manipulacion de sus genes es mucho mfis timitada, los aspectos rnoleculares de la regulación génica son menos comprendidos en los primeros. Esta seccihn describe brevemente unos cuantos tipos diferentes de reguEaci6n gknica tucaribtica.
Los genes eucariotes pueden amplificarse durante el desarrollo, o en respuesta a medicamentos Durante el desarrollo temprano de los metazoarios, hay un incremento abrupto en la necesidad de moltculas especificas corno los RNA ribosómicos y el RNA mensajero para proteínas que construyen estructuras tales como el cascarhn del huevo. Una forma de incrementar la velocidad a la cual tales molkculas pueden crearse, es con el aumento del numero de genes disponibles para la transcripcidn de esas moléculas especificas. Entre las secuencias repetitivas de DNA estan cientos de copias de los genes para el RNA
ribosiimico y el tRNA. Estos genes preexisten en forma repetida en el material genómico de los gametos y, por tanto, se transmiten en un elevado nUmero de copias de generación a generacibn. En algunos seres especificos, como la mosca de la fruta (Drnsophida), durante la ovogknesis ocurre una amplificación de unos cuantos genes preexistentes, como las proteínas del corion (cascarón del huevo). A continriacidn, estos genec amplificados, a[ parecer generados por un proceso de inicios repetidos durante la sintesis del DNA (biirbujas de replicacirin compuestas) proporcionan mliltiples sitios para la transcripcion del gen (figuras 38-1 5 y 41-9). En años recientes es posible promover la amplificaciiin de regiones genéticas especlfícas cn ctSlulas cuitivadas de mamífero. En algunos casos puedc l o g m e un incremento de varios miles de veces-en el numero de copias de genes específicos durante un periodo en que intervienen dosis crecientes de medicamentos selectivos. En realidad esti dzrnostrado en pacientes que reciben metotrexato para el tratamiento del cáncer, que las cdlulas malignas pueden desarrollar resistencia al medicamento mediante el aumento de los genes para la d ih tdrofolato reductasa, el blanco del metotrexato. Los fenómenos de amplificación del gen como tctos, ocurren espontáneamente in vivo, es decir, en ausencia de agentes selectivos exbgenos y estas series extra de replicación no preparadas, pueden "congelarse" en el genoma bajo presiones selectivas apropiadas.
La formación de genes activos para inrnunoglobufinas comprende reordenamiento selectivo del DNA Algunas de las cuestiones mhs interesantes y confusas planteadas por los biblogos en estos últimos decenios, se refieren a las bases gen6ticas y rnoleculares de la diversidad de los anticuerpos (capítulo 59). Ademas, los avances en inrnunología han hecho patente que,
3in amplificar
s36
$38
Figura 41-9. Reprecentacibn esquemática de la arnplmcaubn de los genes s36 y s38 de las proteinas cortbniws. (Reproducida con autorización de Chisholm R Gene amplification during development Trendc Biochem Sci 2982,7 161.)
conforme las células del sistema inmunitario humoral se diferencian, producen anticuerpos con Ia misma especificidad pero con funciones efectoras diferentes. En estos Últimos afios, numerosos laboratorios han contribuido en gran medida al entendimiento de las bases genhticas de la diversidad de los anticuerpos y de la regulacibn de la expresion génica destinada a codificar las inrnunoglobulinas durante el crecimiento y la diferenciacihn. Como se explica en el capitulo 39, los SegmentbS codificadores responsables de la generacibn de moltculas de proteinas especificas, con frecuencia no estan contiguos en el genoma de los mamíferos. Los segmentos que codifican a Ios dominios variables y constantes de la cadena ligera de las inmunoglobulinas (anticuerpos) fueron los primeros en que se reconocio su separacibn en el genoma. Como se ve can mayor amplitud en el capítulo 59, las moIéculas de inmunoglobulinas están compuestas de dos tipos de cadenas polipeptidicas: cadenas ligeras (C) y cadenas pesadas (H) (figura 59-8). Las cadenas L y H están a su vez divididas cada una en regiones aminotemina! variables (V) v regiones carboxiloteminal constantes (C}. Las regiones V se ocupan del reconocimiento de los antigenos (moléculas extraflas) y las regiones conctantes de funciones efectoras que determinan c6mo dispondrá del antigeno la molécula anticuerpo. Hay tres familias no relacionadas de genes responsables de la estructura molecular de las inmunoglobulinas. Dos familias se ocupan de las cadenas ligeras ([as cadenas lambda y kappa) y una familia, de las cadenas pesadas. Cada cadena ligera se codifica por medio de tres segmentos distintos, el segmento variable (VL),de la sección de unibn (JL) y de la constante (CL). Para cada una de las cadenas ligeras lambda y kappa, existen aproximadamente 300 segmentos variables (VL),y 5 o 6 segmentos JL. Las cadenas ligeras lambda derivan de menos de I O regiones CL,en tanto que las cadenas ligeras kappa provienen de un segmento CL único. Durante la diferenciacihn de una célula Iínfoide B, un segmento VLse lleva de un sitio distante en el mismo cromosoma a una posición rnhs cercana a la región del genoma que contiene los segmentos JL y CL. Este reordenamiento del DNA permite entonces que los segmentos VL,JL y CLsean transcritos como un colo precursor de mRNA y a continaución procesado para formar mRNA y para una cadena ligera de un anticuerpo especifico. De este modo, por reordenamiento de los diversos segmentos VL, JL y CL en el genoma, el sistema inmunitario puede generar una coleccibn de moltculas (millones) de inmunoglobulinas especificas de antigeno. Este reordenamienta del DNA se refiere como unión V-J de la cadena ligera y se ilustra en la figura 4 1-10. La cadena pesada se codifica por cuatro segmentos de gen: el YH, D (diversidad), JH y CMdel segmento de DNA. En los humanos existen cerca de
1000 segmentos Vlr, 12 o más segmentos D y cuatro segmentos J. La regi6n variable de la cadena pesada se genera por la unión VkI con un D y un segmento JH. La región de DNA resultante VH-D-JHce une a su vez a un gen CH,de los que hay nueve. Estos genes CH(C,,, Cg, Cy3.L1, C, 1, Gt, Cys,CF.y C d ) detem inan la clase o subclase -IgM, í;G, IgA, etcétera, de la moECcula de inmunoglobulina (capitulo 59). Dado el gran número de segmentos V, D y J y del hecho de que existen nueve regiones constantes en lugar de una, las pocibilidades de recomhinacihn con mayores para las cadenas pesadas que para las ligeras.
Las opciones en el procesamiento del mRNA es otro mecanismo de control Ademb de afectar la eficiencia de utilizacion del promotor, las células utilizan opciones en el procesamiento de1 RNA para controlar la expresión génica. Esta puede ser la consecuencia de usar promotores alternos, sitios de empalme intrbn-exbn ci sitios de pl iadenilacihn. En ocasiones conduce a heterogeneidad dentro de una ctlula, pero es miis común que la misma transcripción primaria se procese de modo diferente en tejidos distintos. Adelante sc presentan algunos ejemplos de cada uno de estos tipos de regulacion. El uso de sitios alternos de inicio de transcripción lleva a un ex6n 5' diferente en el mRNA que corresponde a la amilasa y la cadena ligera de miosina del raton, la glucocinasa de rata y la alcohol deshidrogenasa y actina de Bro.~ophr/a. Los sitios alternos de poliadenilacibn en la transcripcibn primaria para la cadena pesada mu de ínmunog~obulinacrea un mRNR que es 2700 bases mas largo (p,) o 2400 bases más largo (p,). Esto causa la formacibn de una regi6n carboxílo teminat diferente de las proteinas codificadas de modo que la proteina p, permanece adherida a Irt membrana del linfocito E y la inmunoglobulina p5se secreta. Las alternativas de procesamiento y empalme conducen a la formación de siete mRNA únicos para alfa tropomiosina en siete tejidos diferentes. No se sabe con precisihn la forma en que se tornan las decisiones para procesamiento/empalme o si estos pasos pueden regularse.
La regulación de la estabilidad del RNA mensajero proporciona otro mecanismo de control La estabilidad de las mo!dculas del RNA mensajero en el citoplasma puede afectar claramente el grado de expresión gknica en dirección, positiva o negativa. La estabilización del rnRNA, dada una velocidad fija de transcripción, conduciría a una acumuiación íncrementada y viceversa. Los mecanicmos que intervienen en la regulación de la estabilidad del mRNA se estudian en el capitulo 39. Cada uno de estos es un sitio potencial de control que puede ser influido por hor-
532 Bioquimica de Harper
(Cupitu10 4 1)
+ DNA de
la célula B
Reordenamiento
3'
5'
Transcripción
Transnpcibn primaria
Procesamiento
+ Protelna (cadena ligera K)
NH2
Traslación COOH
Figura 41-10. Fenbrnenos de remmbinacibn que conducen a la cadena ligera kappa V2J2. En un ordenamiento Iineat del cromosoma existen 500 segmentos VL (region variable), 5 a 6 JL (unidn) y uno CL (región mnstante) Estos componentes se expanden varios millares de pares de kilobases Al recibir una seiial de diferenciacibn, el DNA de la célula B experimenta reordenamiento de modo que el extremo 3' de V2 se liga al extremo 5' de J2. La transcrrpcidn comienza a travbc de un promotor en el extremo 5' de V2 y procede a lo largo de C. Para producir un mRNA V2J2 C, la secuencia desde el extremo 3' de J2 al extremo 5' de C se desprende, luego VzJ2 se empalma a C. Así, este mRNA puede trasladarse a una cadena ligera kappa que contiene la secuencia de arninoAcidos codificada por V2J2 y C. El mismo procedimiento general puede producir cadenas kappa constituidas por cualquier combinación de segmentos V y J wn C
monas y otros efectores. Algunas hormonas modifícan la síntesis y degradación de mRNA especificas. Por ejemplo, el estradiol prolonga la vida media del mRNA para vitelogenina de algunas horas a m8s de 200 horas. Esro, acoplado con el hecho de que los estrbgenos amplifican el índice de transct-ipcibn de este gen de 4 a 6 veces, resulta en un incremento tremendo del mRNA para vitelogenina.
LOS EFECTOS DlFERENClALES SOBRE ESTRUCTURAS CROMATINICAS PUEDEN INTERVENIR EN DESARROLLO Y DIFERENCIAC~QN La mayor parte del DNA de células procariotas se organiza en genes y los moldes siempre pueden trans-
cribirse. Una situaci6n muy diferente existe en las ctlulas de mamíferos. Aquí, una cantidad relativamente pequefía del DNA total se organiza en genes y sus regiones reguladoras relacionadas. La función del resto del DNA se desconoce (esta es una de las razones por las que existe tanto interés en la secuenciaci6n del genoma humano entero). La estructura cromatinica proporciona un nivel adicional de control. Como se estudia en el capitulo 38, hay extensas regiones de cromatina sin actividad en transcripcibn, en tanto otras son activas o muestran potencial para ello. Con escasas excepciones, cada cklula contiene la misma dotación de genes (las células productoras de anticuerpos son una excepción notable). El desarrolla de células, tejidos y 6rganos especializados asi como su funcibn en el organismo intacto dependen de la expresión diferencial de los genes.
Regulación de la expresión génica-533
Parte de esta expresi6n diferencial se logra debido a que se dispone de regiones cromatínicas diferentes en cklulas de diversos tejidos. Por ejemplo, el DNh que contiene el racimo de genes para beta globina se encuentra en la cromatina "activa" en el reticuPocito, pero esta en la cromatina "inattiva" en la dluta muscular. Se desconoce el mecanismo que determina cromatina "activa" contra "inactiva", pero es probable que intervengan interacciones proteína-DNA. Adernh, como se describe en el capitulo 38, se sabe que la metilaci6n de residuos de desoxicitidina 3 'el) DNA puede efec(en la secuencia 5 ' - " ~ ~ ~ - en tuar cambios masivos en la cromatina de modo que anulan su transcripción activa. Por ejemplo, en el higado de raton sblo los genes ribosdmicos no metilados pueden expresarse y hay prwebas de que muchos virus de animales no se transcriben cuando se metila su DNA. No obstante, no es posible generalizar que el DNA metilado es inactivo desde el punto de vista de la transcripcibn, que toda la cromatina inactiva esta metilada o que el DNA activo no está metilado. El DNA eucatmiote, que es una región "activa" de la cromatina, puede transcribirse. Igual que en cdlulas procariotas, un promotor dicta dbnde la RNA polimerasa inicia la transcripcion, pero este promotor no puede definirse de manera clara como una caja -35 y -1 0, en particular en células de mamíferos (capitulo 39). Además, los factores de transacción en general provienen de otros cromosomas (como los que actúan en fram),en tanto que esta consideraci6n es discutible en el caco de células procariotas que contienen cromosomas sencillos.La complejidad adicional la proporcionan elementos o factores que potencian o silencian la transcripción y que modulan las acciones de numerosas rnot&culasefectoras.
CIERTOS ELEMENTOS POTENCIAN O SILENCIAN LA TRANSCRIPCION DE GENES EUCARIOTES Ademh de los cambios extensos en la cromatina, que afectan la actividad de transcripción, hay la certeza creciente de que existen elementos del DNA que facilitan o amplifican el inicio en el promotor. Por ejemplo, en el virus 40 del mono (SV40)existe cerca de 200 pb corriente arriba desde e1 promotor de los genes tempranas una región de dos secciones de longitud identica de 72 pares de bases en thndem, que puede incrementar enormemente la expresión de los genes in vivo. Cada uno de estos elementos de 72 pb puede subdividirse en una serie de elementos menores; de aquí, quemuchos potenciadores tienen una estructura muy compleja. Estos Harnados elementos amplificadores difieren del promotor en dos aspectos importantes. Pueden ejercer su influencia positiva sobre la
transcripcibn aunque estén separados por miles de pares de bases de un promotor y trabajan corriente arriba (5') o corriente abajo (3') del promotor. Los amplificadores son promiscuos; pueden estimular a cualquier promotor cercano. qor ejemplo, el elemento amplificador del SV40 puede ejercer una influencia cobre la transcripción de la beta globina al incrementar su transcripcibn 200 veces en las células que contienen tanto el gen amplificador como el gen de la beta globina en el mismo plásmido (vease antes y figura 41-1 1). El elemento amplificador no parece producir un compuesto que a su vez achie sobre el promotor, puesto que es activo s610 cuando existen dentro de la misma moltcula de DNA en la que se encuentra (es decir, cis a) el promotor. En la actualidad se ha logrado aisIas las proteinas que se fijan al amplificador y estas ayudarán a dilucidar la forma en que actua. Los elementos amplificadores parecen transmitir la hipersensibilidad de la nucleasa a aquellas regiones donde residen (capitulo 38). En el cuadro 41 -3 se resumen las propiedades de los amplificadores. ñarnbikn se tienen identificados elementos de actuación cis que decrecen o silencian la expresión de genes especlficos. Son pocos los elementos de este tipo estudiados, de modo que no es posible establecer generalizaciones acerca de su mecanismo de acción.
De la acción de amplificadores o sifenciadores puede obtenerse una expresi~nespecifica de tejido En la actualidad se reconoce que muchos genes albergan elementos arnplificadores en varias ubicaciones relativas a sus regiones de codificación. También son capaces de amplificar la transcripción génica, es evidente que algunos de estos elementos poseen la capacidad de hacerlo de una manera específica al tejido. Por tanto, el elemento amplificador reIacionado con los genes para inmunoglobulinas entre las regiones 9 y C incrementa la expresibn de aquellos genes preferentemente en las ctlulas Iinfoides. Los elementos amplificadores relacionados con los genes para las enzimas bancreáticas son capaces de potenciar aún a genes no relacionados pero fisicamente ligados, en forma preferencial en las d l u las pancrehticas de ratones en los cuales lasconstrucciones genkticas especificamente disefladas se introdujeron por microcirugia en la etapa embrionaria de una sola cklufa. Este criterio del animal transgénico es de probada utilidad en el estudio de la expresión genica especifica de tejido. Por ejemplo, cuando un DNA que contiene un potenciador especifico de tejido de cklulas B pancreáticas (del gen de la insulina) se liga a un vector para el antigeno T grande del polioma, produce tumores de celulas B en ratones transgknicos. Los tumores no se desarrollan en otros tejidos. Por tanto, la expresihn gknica especifica de tejido puede dirigirse por elementos amplificadores o anhlogos.
(Capitulo 41)
534 Bioquimicu de Harpcr
Elementode respuesta
Promotor
Gen estructural
Los genes de fusión se utilizan
para definir amplificadores y otros elementos reguladores
ERG
D
Por la unión de regiones de DNA que se sospecha albergan secuencias reguladoras para varios genes relatores (fusión o formación del gen quimérico) (figuras 4 1-1 1 y 4 1-1 2), es posible determinar cuhlec regiones en la vecindad de los genes estructurales tienen influencia en su expresión. Fragmentos de DNA qiie se piensa albergan elementos reguladores se ligan a un gen relator adecuado y se introducen en una cdlula huksped (figura 41 -1 1). La expresitin basa1 del gen relator aumentará si el DNA contiene un
CAT DFQPK
Figura 41-11. Explicacibn esquemática de la accidn de amplificadores y otros reguladores de accion cis Este gen quimérico modelo, consiste en un gen relator (estructural) que codifica una proteína que puede analizarse con facilidad, un promotor que asegura el inicio de la transcripción y elementos reguladores putativos. Los ejemplos A y B rlustran el hecho de que los amplificadores (por ejemplo, SV4O) actúan en las dos orientaciones y en un promotor heterblogo. El ejemplo C ilustra que elelementoregulador metalotioneina (mt) (que bajo la influencia de cadmio o cinc induce la transcripcibn del gen mt endogeno y por ende a la proteína mt fijadora de metal) actúa a través del promotor de timidina tinasa (tk) para potenaar la h n m p a b n del gen de la homona del crecimiento humano (hGH). Construcciones de ingeniería genetica rnanrpuladas se introdujeronen pronucieos rnasculnnos de embriones de ratbn de una sola dluia y los embriones se miocaronen el útero de un ratbn hembra para desarrollarse como animales transgknicos. Se generb descendencia bajo estas condiciones y en algunos, la adición de iones cinc a su agua para beber logra un efecto de aumento en la hormona del crecimiento hepática En este caso, estos animales transgenicos responden a las conoentrauoneselevadas de hormona del crecimiento y adquieren un tamano del doble de sus compaAeros de camada. El ejemplo D ilustra que un elemento de respuesta a glucocorticoides(ERG) actúa a travks de promotores homblogos (gen PEPCK) a heterólogosy que el promotor del gen PEPCK tambien contiene un elemento que funciona como amplificador a nivel basal y como elemento de respuesta a AMP cíclico (ERC)
-
Cuadro 41-3. Resumen de las pro^riedades de amplificadores Propiedat
-
Actúan cuiando se 104 IIIVLVL
.
ilificadore
rgas distan cias del pro-
.
Actúan cuiando e s m corriente: arriba y co
del prornti tor Actlian auinque se orienten en cualquier di . Hcruan n través de promotores heterblogos Actúan por fiiaci0n a una a mas proteínas
.
jo
Promotor de prueba PEPCK
, ,
Gen relator
7-'
1
CAT
GEN DE FUSION
I
EL PROMOTOR PEPCK
TRANCFECCI~N MEDMNTE DNA PRECIPITADO CON CaPOa
h
Cklulas H411E Control
Hormonas
COSECHAR 24 HORAS DESPUES PARA ANALIZAR ACTIVIDAD OE CAT
Ic~entificacibn de elementos de coniml Figura 41-1 2. USOde genes defusibn para definir elementos reguladores de DNA Se piensa que un fragmento DNA del gen promotor de la fosfoenolpiruvatocarboxrunaca (PEPCK) contiene uno o más elementos reguladores que se ligan en el intenor de un vector plásmido que, a su vez, contiene un gen relator utilizable, esto es, la enzima bacteriana cloranfenicol transferasa (CAT). Esta enzima no existe en dlulas de marniferos; por tanto, la identificacibn de su actividad en un extracto de dlulas significa que fue exitosa la transfección del pl8smido Un incremento en la adrvdad de CAT sobre el nivel basal, por ejemplo, decpu8s de la adicibn de una hormona glucocortiwide, significa que la regibn de DNA rnsertada contiene un elemento de respuesta a hormona glucocorticoide (ERG). Pueden construirse e insertarse para delinear al elementa de respuesta, fragmentos sucestvamente más cortos de DNA, regiones con supresiones internas a fragmentos con mutaciones en un punto.
R e ~ l a c i b nde la expresión génica
53.5
amplificador. La adicibn de una hormona o un metal pesado al medio de cultivo incrernenta la expresión del gen relator si el DNA contiene un elemento de respuestaa hormona o metal (figura4 1-1 2). La ubicacion del e lemento puede localizarse si se usan fr;igmentos cada vez más cortos de DNA, supresiones o mutaciones en un punto (puntuales) (figura 4 1-1 3). Esta estrategia, que usa células manipuladas (transfección) y animales transgknicos, ha conducido a la identificación de docenas de amplificadores, silenciadores, elementos específicos de tejido, elementos que responden a hormonalmetaI/medicamento, etcétera. La actividad de un gen en un momento cualquiera refleja la interaccihn de los numerosos elementos de DNA que actúan cis con sus respectivos factores que actúan trans. El reto es deducir la forma en que esto ocurre.
problema en virtud de que se tiene el arreglo de la cromatina en unidades que restringen patrones de expresión gknica. Esto se logra porque la cromatina forma una estructura con la matriz nuclear u otras entidades fisicas. De manera alterna, algunas regiones se controlan por elementos complejos del DNA dcnominados regiones de control del Iocus (RCL). Una de éstas, con proteínas de enlace concomitante, controla la expresion de un racimo de genes. La regihn de control del locw mejor definida regula la expresi~n de la familia de genes de la globina sobre una larga regibn del DNA. Otro mecanismo lo proporcionan los aisladores. Estos elementos del DNA, también acompaííados de una o más proteinas, evitan que un aumentador actúe sobre un promotor en el lado opuesto de un aislador, en otro dominio de transcripción.
Los dominios de transcripción
VARIQS MOTIVOS 1NTERVlENEN EN LA F~JACIONDE PROTE~NAS REGULADORAS AL DNA
pueden definirse por los aisladores y las regiones de control del locus
El gran número de genes en las ctlulas eucariotas y el arreglo complejo de los factores de regulación de la transcripcibn presentan un problema de organización. ¿Por que en una célula dada hay algunos genes disponibles para transcripción, en tanto que otros no? Si los auvlentadores pueden regular varios genes y no dependen de posicibn u orientacibn, phrto pueden precaverse de disparar de manera aleatoria la transcripción? Se llega a una parte de la soluci6n de este CONSTRUCCIONES CON GENES 06 FUS16N
INOUCCI~N DE CAT
Hormona: A
+
-1 ooa
-500
B
+
C +
+Z
Pasicidn del nucleótido
d
HRE
HRE
A
0
HRE C
Figura 41-13. Ubicacibn de los elementos sensibles a hormona (HRE) A, B y C usando el criterio de gen de fusióntrancfeccidn. Un gen de fusión, construido como se describe en la figura 41-12, puede introducirse (transfección) a una d l u l a receptora. Al analizar cuándo se pierde la respuesta a ciertas hormonas en comparacibn con la supresión 5'. pueden localizarse elementos de respuesta a hormonas
La especificidad que existe en el control de la transcripcibn requiere que las proteinas reguladoras se unan, con elevada afinidad, a la regibn c m c t a del DNA. Se sabe que tres factores (motivos) unicos hélice-giw hélice, 4bdedode cinc" y "cierre de leucina", explican muchas de estas interacciones especificas proteinaDNA. Ejemplos de proteinas que contienen estos factores se observan en el cuadro 4 14. La comparación de actividades fijadoras de las proteínas que contienen estos factores conduce a varias generalizaciones importantes. 1) La fijacion debe tener elevada afinidad para e! sitio especifico y baja afinidad para el resto del DNA. 2) Regiones pequefías de la proteína hacen contacto directo con el DNA; el resto de la proteha puede asegurar la información apropiada del sitio de reconocimiento del DNA o intervenir en la dimerización de monómeros de la proteína fijadora. 3) Las interacciones proteina-DNA se conservan por enlaces de hidrhgeno y fuerzas de van der Waals. 4) Los factores encontrados en estas proteinas son únicos; su presencia en una proteína de función desconocida sugiere que la proteina puede unirse al DNA. 5) Proteínas con factores hélice-giro-hdlice o cierre de leucina forman dímeros simétricos y sus sitios de fijacibn en DNA respectivas son palindromos simétricos. En proteínas con factor "'dedo de cinc", el sitio de fijacibn se repite 2 a 9 veces. Estas características permiten interacciones de coopcracibn entre sitios de fijacibn y aumentan el grado y afinidad de la unión.
(Capítulo 4 1)
536 Llioquámica de Harper
Cuadro 4 1 4 . Ejemplos dc proteínas reguladoras de transcripción que contienen los d' ores de fi, -. ..- . - ..
I
Proteína regulador a
Represor Iric CAP . . Represores cro, ramnda, tripibfnno y 3434 I'roteínas de In c a j a homeo Pit-." 1, Oct 1, Oct2 Proteína de:1 gcn 32 ""
Dedo de cinc
-"
E coli Levadura Cal4 Drosophila Casualidad ,jorobado TFIIIA ,Yenopirs Mamiferos Familia de rcccprores ae -Irsteroides. Sn l
F=
1
Mamiferos CIERP, fos, Jun, Era-1, proteina fijadora de CRE. c-myc, n-myc, 1-myc -
--
El motive hblice-giro-hélice El primer motivo (factor} descrito y el más estudiado, es el MIice-giro-hdlice. El anhlísis de la estructura tridimensional de cro revela que cada monomero consiste en tres hojas beta antiparalelas y tres helices alfa (figura 41-14]. El dihmetro se forma por la uni6n de las hojas antiparalelas beta3. Las hklices alfa, forman la superficie de reconocimiento del DNA y al parecer, el resto de la molécula interviene en la estabilimcibn de estas estructuras. El dírnero promedio de una htlicc alfa es 1.2 nm. que es el ancho aproximado de la hendidura mayor en la forma B del DNA. El dominio de reconocimiento del DNA de cada rnonbmero cro interactúa con 5 pb y los sitios de fijacion del dímero se extienden 3.4 nm, lo cual le permite ajustar en medios giros sucesivos de la hendidura mayor, en la misma superficie (figura 4 1-1 4). El anhlisjs del represor lambda, de CRP (proteina receptora para cAMP de Escherichla colr], del represor de triptófano y del represor del fago 434 confirman esta estructura helicegiro-hélice dimérica.
I'
/' ' Eje de
%\
-- - .
plegado
Figura 41-14. Esquema de la estructura trtdimensional de la proteína cro y su frjacibn a DNA por el factor hélice-giro-hklice. El monomero ua esta formado de tres hojas beta antiparalelas (beta~a beta~)y tres hélices alfa (alfar a al fa^). El factor hélicegfro-hélice se forma debido a que las h4lices alfa3 y alfa2 se ubican en un ángulo de 90 grados una respecto a la otra por un giro de watro aminoacidos. La hélice alfas de cro es la superficie de reconocimiento (sombreado). Dos monomeros se unen a travhc de las hojas antiparalelas betas para formar un dírnero que tiene un ele de simetria de dos pliegues (derecha). Un dimero cro se une al DNA a travbc de sus hélices al fa^, cada una de las cuales hace contacto con 5 pb m l c o menos, en la misma superfjciede la hendidura mayor La distancia entre puntos comparables en las dos hélices alfa de DNA es de 3.4 nm, que es la distancia necesaria para una vuelta completa de la doble hélice. (Cortesia de B Mathews.)
El motivo dedo de cinc El dedo de cinc fue el segundo factor de fijación a DNA que se dilucid6. Se cabía que la proteína TFllIA, que es un regulador positivo de la transcripcibn de RNA 5S, requería cinc para su actividad. Anrilisis esrructurales y biofísicos revelaron que cada rnoltcula de TFIIIA contiene nueve iones cinc en un complejo coordinado repetido formado por residuos de cisteína-cisteinamuy prdximos seguidos, 12 a 13 aminoacidos más adelante, por un par de residuos de histidina (figura41-1 5). En algunos casos,notablemente la familia de receptores tiroideos para esteroides, el doblete His-His se remplaza por un segundo par Cis-Cis. La proteína que contiene motivo de cinc (dedos de cinc) al parccer descansa en un coctido de la hélice de DNA, con interdigitaciones sucesivas que se colocan de manera alterna en cada giro en la hendidura mayor. Como en el caso del dominio de reconocimiento de la proteína hélice-giro-hélice, cada marcador de cinc TFIIL4 hace contacto con 5 pb del DNA. La importancia de este factor en la acción de hormonas esteroides se subraya por un "experimento de la naturaleza". Una rnutacidn de un solo aminokido en los dos "dedos de cinc" de la proteina receptora para calcitriol conduce a resistencia a la accibn de esta hormona y al síndrome clinico de raquitismo (capítulo 47).
El motivo "cierre de leucina" El análisis cuidadoso de una secuencia de 30 aminoácidos en la regi6n carboxilo terminal de la proteina potenciadora C/EBP revela una estructura novedosa. Como se observa en la figura 4 1-1 6, esta regibn de la proteina forma una hélice alfa en donde hay una
i Dedo de cinc Cis-Cis
Dedo de cinc Cis-His
Figura 41-15. Los dedos de ctnc son una serie de dominios repetidos (2 a 9) en donde cada uno se Centra sobre una coordinactbn tetraédrrca con cinc. En el casa de TFHIA la coordinactbn la proporciona un par de residuos de cisteina (C) separados 12 a 13 amino8cidos de un par de histidrnas (H). En otras proteinas oon esta configuracibn, el segundo par también consiste en dos residuos de cistelna. Los dedos de cincse fijan en la hendidura mayor, con dedos adyacentes que hacen contacto con 5 pb a lo largo del mismo costado de la h8lice.
repeticion periódica de residuos de leucina cada s&ptima posición. Esto ocurre durante ocho giros de hélices y cuatro repeticiones de leucinas. Estructuras semejantes se encuentran en cierto número de proteinas relacionadas con la regulaci6n de la tmnscripcibn en celulas de mamíferosy levaduras. Se cree que esta estructura permite que dos monomeros idénticos o heterodimeros (por ejemplo, FosiJun o bien JuneJun) cierren juntos en una cauda enrollada y formen un complejo dimerico estrecho (figura 41 -16). Esta interacción proteina-proteina puede servir para favorecer la unión de dominios fijadores de DNA separados con su objetivo (figura 4 1-1 6).
Los dominios de fijación y trans-activación de DNA de estas proteínas reguladoras están separados y no interaccionan La fijación a DNA puede conducir a un cambio general en la confomacibn que permite a la proteina unida activar la transcripcibn o estas dos funciones pueden manejarse por separado y en dominios independientes. Los experimentos de trueque de dominios indican que lo ultimo es el caso. El producto del gen Gall interviene en el rnetabolismo de galactosa en las levaduras. Este gen se regula de manera positiva por la proteína Gd4, que se une a una secuencia activadora corriente arriba (UAS) a través de un dominio terminal amino. Los 73 aminoácidos del extremo fijador de DNA de Ga14 se removieron y remplazaron con el dominio fijador de DNA de IexA, una proteina de E. coli. Esto produjo una molécula que no fijó a Gall UAS y, por supuesto, no activ6 al gen Gal 1 (figura 41 -17). Sin embargo, si en la regibn promotora del gen Gal se inserta el operador IexA, la proteina hibrida se unirh a este promotor (en el operador IexA) y activará la transcripción de Gal l . Este experimento, que se ha repetido varias veces (incluyendo protelnas de fusión para el receptor de glucocorticoides-texA que transactiva a los genes sensibles a glucocorticoides), proporciona pruebas firmes de que la regibn carboxilo terminal de Ga14 activa la transcripcibn. Al parecer, los dominios de fijacibn y transactivacidn del DNA son independientes y no interaccionan. Las regiones carboxilo terminal se aprecian como concentraciones densas de amino-Acidos con carga negativa. Se presume que estos dominios, a menudo mencionados como "burbujas hcidas" o "cabezas negativas", interactiian con regiones de carga positiva de algiin componente del complejo de transcripcibn.
RESUMEN La informacibn gendtica de cada cdlula somhtica es practicamente idéntica. La distincibn entre una cklula cerebral, muscular o hephtica depende del patrdn de
538 Bioquimicu de Harper
(Capitulo 41)
I
3
------
---- -
I
COOH
NH2
Figura 41-16. El factor cierre de leucina. La figura A muestra un anilisis de la rueda helimidal de una porción carboxilo terminal de la proteína fijadora de DNA ClEBP La secuencia de aminoacidos ce despliega extremo a extremo bajo el eje de una h6lice alfa esquemática La rueda helicoidal se forma de siete bolsas que corresponden a los siete amino8cidos comprendidos en dos giros de la hélice alfa Nbtese que los residuos de la leuuna (L) ocurren cada séptima posicibn Otras proteínas con cierre de leucina tienen patrdn análogo de rueda helicoidal & muestra un modelo esquemAtico del dominio fijador de DNA de ClEBP Dos cadenas polipeptídicas ClEBP idénticas se sostienen en forma de dimero por el dominio del cierre de leucina de cada polipéptido (representados por los rectángulos y b s óvalos adheridos). Al parecer, se requiere esta relacibn para sostener los dominios fijadores de DNA de cada polrpéptido (rect6nguFos sornbreados) en la mnformacibn apropiada para la fijaci611del DNb (Cortesía de S McKnight )
A
UAS ld-GAL4
B
4 UAS
-
Gen M L i
+t
lnact~vc Gen GALí
Activo
lex A Operador
Gen GALl
Figura 41-17. Los experimentos de trueque de dominio muestran lo separado del sitio de ftjaubn de DNA y de acttvacibn de transcripcibn. El promotor del gen Gall contiene una secuencia activadora corriente arriba (UAS) que se une a la proteina reguladora Ga14 (A). Esta interaccibn causa estimulaubn de la transcripcidn del gen Gall. Una proteina de fusibn, en donde el dominio de fjacibn de DNA del extremo arnino-terminalde Gal4 elimrna y remplaza con la región fijadora de la proteina de E. mlt IexA, no logra estimular la transcnpcibn de Gall debido a que el dominio lexA no puede UniBe al UAS ( 0 ) .La proteina de fusibn lex A Ga14 incrementa la transcripcibn de Gall cuando el operador le* (su objeto natural) se inserta en la región promotora de Gall (C).
genes expresado en estas cdlulas, la así llamada expresión especifica de tejido. La capacidad de un organismo para responder a retos del ambiente depende de su capacidad para regular, en forma positiva o negativa, cuhles genes serán expresados. Los propósitos en una u otra direccibn se logran a través de la interaccicin de proteinas especificas con regiones particulares del DNA denominadas promotores. En general, los promotores se Iocalizan hacia eI extremo 5' y están adyacentes al segmento codificante de un gen. Bastante se ha aprendido acerca de la forma en que las proteínas se ponen en contacto con el DNA y estAn descritas diversas clases de esas interacciones. lnciuyen mo~ I Y O S(interacciones) hélice-giro-hélice, dedo de cinc y
cierre de leucina. Las interacciones proteina-proteina, en particular entre miembros dc la familia cierre de leucina, también son importantes. Las proteínas que regulan la transcripción gknica deben tener dos dominios cuando menos; un dominio de reconocimiento para fijación al DNA o a otra proteina y un dominio que afecta algunos aspectos del aparato de transcripción. Estos dominios son distintos, según se demuestra por experimentos en donde se prueban mol6culas hibridas. Se dispone de amplia información acerca de la forma de regulación genica en E. coli y en el bacteridfago lambda. Estos modelos se esthn aplicando al proceso mucho miis complejo de regulacibn gdnica en celulas eucarióticas, que aun es un enigma. I
REFERENCIAS B: Alternativc splicing A ubiquitous rnechanism for the generation of rnultiple protein isoforms from single genes. Annu Rev Biochem 1987;56:467. Chung JH,Whiteley M,Felsenfetd G: A 5' element o f the chickcn b-globin domain serires as an insulator in human erythroid cells and protccts against position effcct in Drosophila. Cell 1993:74:505. Jacob F, Monod J: Genetic regulatos. mechanisms in proteinq synthesis. 1 Mol Biol 1961;3:318. Johnson PF, McKnight SL: Eukaryotic transcripiianal regulafory proteins. Annu Kev Biochem 1989;58:799. Landschulz WH, Johnson PF, McKnight SL: The leucine zipper: A hypothetical structure cornmon to a new class 01' DNR binding proteins. Science 1989:240:1759. Breitbart RE. Andreadis A. Wadal-Ginard
Lieber MR: The inechanism o f V(D)J reccirnhinatinn. A halance of diversity, specifity and stabiliv. Cell
1992;70:873. Ptashne M: A Genetic Switch. 2nd ed. Cell Press and Ulackwell Scientific I'ublications. 1992. Pugh BF, Tjian R: Diverse transcriptiona! functions of thc multisuhunit tukaryoiic TFlID ~ornple:,.J Rinl Chern 1992;267:679. Struhl K: Promoters, activator protcins and the mechanism of transcriptional initiaiion in yeast. Cell 1987;49:295. Tjian R: Molecular machincs that control penes. Sci Am (Feb) 1995:272:54. Wu R, Bahl CF, Narang SA: Lactose operator-repressor intcraction. Curr Top Ccll Regul E 978,13: 137.
-
Tecnobaía de DNA recombinante
La tecnologia del DNA recombinante ha revolucionado a ta biología y su impacto es cada vez mayor en la medicina clinica. Mucho es lo aprendido acerca de las enfermedades genéticas humanas a partir del anhlisis genealdgico y del estudio de las proteinas afectadas, pero en los numerosos casos en que se desconoce el defecto gen6tico específico, no es posible usar estos mktodos. La nueva tecnologia supera estas limitaciones al ir directamente a la molécula del DNA para obtener informacibn. La manipulación de una secuencia del DNA y la construccibn de moltculas quiméricas, llamada ingeniería genetica, proporciona un medio de estudiar la manera en que actúa un segmento específico del DNA. Este capitulo se dedica a esclarecer este tópico complejo. Presenta los conceptos bksicos de la tecnología del DNA recombinante, sus aplicaciones a la medicina clinica y un glosario. Con objeto de integrar el capitulo en un todo, se encuentra cierta repeticidn de temas tratados en otros capitirlos.
IMPORTANCIA BIOMEDICA Es importante comprender la tecnología del DNA recombinante por vanas razones: E ) La explosión informativa en esta área es asombrosa. Para comprender y mantenerse dentro de este campo, uno debe tener una apreciacibn completade los conceptos fundamentales que intervienen. 2) Ofrece un enfoque racional para entender Ias b ~ e rnaleculares s de un número de enfermedades (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar, anemia de cblulas falcifomes, talasemias, fibrosis quistica, distrofia muscul@. 3) Mediante la tecnologia
del DNA recombinante, las proteínas humanaspueden producirse en abundancia con fines teraputicos (por ejemplo, insulina, hormona del crecimiento, activador del plasminógeno). 4) Pueden obtenerse proteínas para vacunas (por ejemplo, anti-hepatitis B) y para pruebas de diagnbstico (por ejemplo, prueba del SIDA). 5) Es posible usar la técnica del DNA recombinante para diagnosticar enfermedades existentes y predecir el riesgo de desarrotlo de una enfermedad dada. 6 ) Tecnicas especiales han conducido a avances notables en medicina forense. 7) Puede idearse la terapéutica gknica para 1a enfermedad de celulas falcifomes, las talasemias, la deficiencia de adenosina desaminasa y otras enfermedades.
EL DESCUBRIMIENTO DE LAS CARACTER~STICASBÁSICAS DEL DNA CONDUJO A LA f ECNOLOG~ADEL DNA RECOMBINANTE El DNA es un biopolirnero complejo que se organiza como una hélice dable El elemento fundamental es Ia secuencia de bases purinicas (adenina [A] o guanina [G]y pirirnidinicas (citosina [C] o timidina [TI).Estas bases estan unidas a la posici6n C-1' del anjcar desoxinibosa y se conservan juntas a travh del enlace de los residuos de azúcar en sus posiciones 3' y 5' por medio de un enlace fosfodi6rer (figura 37-1). La alternancia de los gnipos fosfato y desoxirribosa forma el esqueleto de la doble h&lice(figura 37-2). Estos enlaces 3'-5' definen tarnbien la orientacidn de una tira dada de la rnol6cula de DNA y puesto que las dos tiras corren en dirección opuesta, se dice que con antiparalelas.
El pareamiento de bases es un concepto fundamental de la estructura y función del DNA La adenina y la timina siempre forman un par por medio de puente de hidrógeno: lo mismo ocurre con guanina y citosina (figura 37-3). De estos pares de bases se dice que son complementarios y el contenido de guanina de un fragmento de DNA de tira doble siempre será igual a su contenido de citosina; del mismo modo, el contenido de timina y adenina es igual. El pareamiento de bases y las interacciones hidrbfobas de las pilas de bases conservan juntas a las dos tiras del DNA. Estas interacciones pueden disminuir por el calentamiento del DNA, que lo desnaturaliza. Las ieyes del parearniento de bases predicen que dos tiras complementarias de DNA se realinean exactamente en la misma posición al recuperar su forma natural, lo que sucede cuando la temperaiura de la solución se reduce lentamente a la normal. De hecho, el grado de cotnplementai-iedad (o su falta de parearniento) puede calcularse por la temperatura requerida para el proceso de desnaturalizacibn-naturalizacibn.Los segmentos con grados altos de complementariedad de bases, requieren de más energía (calor) para que se logre su desnatusalizacibn o, dicho de otra manera, un segmento estrechamente pareado necesitara mas calor para separar las tiras. Esta reaccion se utiliza para determinar si hay diferencias significativas entre dos secuencias de DNA y en ella se basa el concepto de hibridacihn, que es fundamental para los procesos que se describen adelante. Hay aproximadamente 3 x lo9 pares de bases (pb) en cada genoma haploide humano. Si la Iongitu$ de un gen promedio es de 3 x 10' pb (3 kilobases [kbj), el genoma podría consistir en lo6 genes, asumiendo que no hay traslape y que la transcripcibn procede en una sola dtreccibn. Se piensa que existen aproximadamente lo5 genes en el genoma humano y que s61o 10% del DNA codifica para las proteinas. La funcibn del 90% restante aun no está definida. El DNA de doble hPlice esta empacado en una estructura muy compacta formada por cierto niimero de proteinas, las mAs notables son las proteínas bhsicas llamadas historias. Esta condensación puede tener una funcibn reguladora y con certeza, un propósito práctico. Si el DNA presente dentro del núcleo de una cdlula humana, se extendiera, tendria aproximadamente un metro de longitud. Las proteinas cromosomicas condensan esta tira larga de modo que el DNA pueda empacarse en un núcleo con un volumen de unos cuantos micrones cúbicos.
El DNA se organiza en genes En general, los genes procaribticos consisten en una pequefia región reguladora (100 a 500 pb) y de un largo
segmento codificador de proteinas (500 a 10 000 pb). Con frecuencia los diversos genes se controlan por una sola unidad regutadora. La mayor parte de los marniferos son mhs complicados, ya que las regiones codificadoras se interrumpen por regiones no codifícadoras, las que se eliminan cuando la transcripcihn primaria del RNA se procesa en el RNA mensajero (mRNA) maduro. Las regiones cdificadarñs (aquellas regiones que aparecen en las especies de RNA maduro) se llaman exones, y las regiones no codificadoras, que interrumpen o se interponen entre los exones, se denominan intrones (figura 42- 1 ). Idosintrones siempre se eliminan del RNA precursor antes de que ocurra su t~ansporteal citoplasma. El proceso por el cual los intrones se retiran del RNA precursor y los exones se enlazan juntos, se conoce como escisibn del RNA. El procesamiento incorrecto de la transcripcion primaria en el mRNA maduro, puede conducir a trastornos en el ser humano (viase mas adelante); esto recalca la importancia de los pasos posteriores al proceso de transcripción. En el cuadro 42-1 se ilustra la diversidad en tamaflo y complejidad de algunos genes humanos. Aunque hay una diferencia de 300 veces en el tamaiio de los genes ilustrados, las dimensiones del mRNA varían sdlo alrededor de 20 veces. Esto se debe a que en los genes la mayor parte del DNA se encuentra como intrones y muchos de éstos tienden a ser de gran tamaiio en comparación con los exones, Las regiones reguladoras para genes eucari6ticos específicos, por lo regular se localizan en el DNA que flanquea el sitio de inicio de la transcsjpcibn en e! extremo 5' (secuencia del DNA S' flanqueadora). En ocasiones, éstas se encuentran en el propio gen o en la regibn prdxima a su extremo 3'. En las células de los mamíferos, cada gen tiene su propia regibn reguladora. Muchos genes eucarióticos (y algunos de virus que se replican en las células de marniferos) tienen regiones especiales, Ilamadac amplificadoras, que incrementan la velocidad de la transcripción. Además algunos genes tienen secuencias de DNA, conocidas como silenciadoras, que disminuyen la transcripcion. Ec obvio que los genes de los mamíferos son estructuras complicadas con múltiples componentes.
Los genes se transcriben en el RNA
La informaci611, por lo general, pasa del DNA al mRNA y de este a la protelna, como se ilustra en la figura 42-1 y se describe con m& detalle en el capitulo 41. Este es un proceso controlado rígidamente que implica un cierto número de pasos complejos, cada uno de los cuales es sin duda regulado por una o más enzimas o factores; la función deficiente de cualquiera de ellos puede causar enfermedad.
Tecnologiu del DNA recombinante
Región promotora basal
Regibn reguladora
-1
DNA 5'
{-l
CAN
~-1
SRio de
Sitio de adicion de POli(A)
inicio de la transcripcibn
$
-
6x6"
~
5' Regibn na diticadora
543
Exón
A
A 4.c
intron
T
A
A
3'
~
3' Regibn no mdificadom
NUCLEO Transcripcibn primaria de RNA
AAA--A Cola de poli(A)
Transcripcion modificada Remate
I
Remocidn de inlrones y seperacibn de exones AAA---A
mRNA nuclear procesado
-- -
-- - - - +
-.
- - - - - -- - -- - -
ClTOPLASMA ~ R N A
----1m-AA
1
Transporte transmcmbsena
Traducción
Proteína
Flgura 42-1. Organización de una unidad eucaribtica de trancuipcidn y vía de la expresión gbnica eucaribtica. tos genes eucaribticos tienen regiones es2ructuralec y reguiadoras. La regibn estructural estA constituida por secuencias de DNA wdificadoras y no codificadoras 5' y 3'. Las regiones wdificadoras se drviden en dos partes: 1) exones, que finalmente producen RNA maduro y 2) intrones, que al ser procesados salsn de la transcnpcidn primaria. La regibn estructural está flanqueada en su extremo 5' por el sitio de inicio de la transcripción y en su extremo 3' por la adición de poliadenifatoa sitio de terminacidn La región promotora que contsne secuencias específicas del DNA que interactúan con varios fadores proteínicos pata regular la transcripcibn, se explica con detalb en los capítulos 39 y 41. La transcripcibn primaria tiene una estructura especial, un remate en el extremo 5 9 una prolongaabn de adeninas en el extremo 3'. Esta transaipcidn se procesa para eliminar los intrones y el mRNA maduro es entonces transportado al citoplasma, donde es traduado a proteina.
LA TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE COMPRENDE SU AISLAMIENTO Y MANIPULACIÓNPARA FORMAR MOLÉCULAS QUIM~RICAC El aislamiento y manipulación del DNA, inclusive la uni6n de extremo a extremo de maldculas de fuentes muy distintas para formar moléculas quiméricas (por ejemplo, que contienen secuencias de DNA humano y bacteriano para formar una molkcula con patriin propio), es la esencia de la investigaci6n del DNA recombinante. En ella se utilizan varias técnicas y reactivos Únicos.
Enzirnas restrictivas cortan las cadenas de PNA en sitios específicos Ciertas endonucleasas, enzimas que cortan al DNA en secuencias especificas dentro de la mufkculm (contrario a las exonucleasas, que digieren a las rnohiculas de DNA por sus extremos) son una herramienta clave en la investigacidn del DNA recombinante. Esm enzimas originaimente ce llamaron enzirnas d e restsicci6n debido a que su presencia en una bacteria dada restringía el crecimiento de ciertos virus bacterianos denominados Bacteriúfagos. Las enzimas de restriccidn separan al DNA en fragmentos cortos
Cuadro 42-1. Variaciones en tamaño y complejidad "- algunos genenes.-y-.mRNA humanos* -. - - - . ---- .--. -.
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r! t Rcceptor padre- :
1.5 1.7
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de
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del
intrones
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RNA (kb)
Cuadro 42-2. Endonucleasas de restriccidn seleccionadas y sus especificidades de secuencias* ..
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j Racillus
BamHI
amyloIrquefuciens 1 I
nt'rgico Albúmina Receptor paira LDL Factor VI1 r Tiroglobul --Ina * Las dimensi ones de los 1;enes esthn r:n kilobases (kh) c inclu! algunas ser:uenciac de. regiones reguladoras y del pronia proxirnal; en general, ectaq ticnen ci mismo tamano en todos los genes. Los genes varim de alrededor de 1500 p m s de b a w (pb) amás de 2 x 1O6 pb. TambiCn existe gran variacihn enel número de intrones y exoneq. El gen dcl receptor p-adrenergico no contiene intrones. en cambio el een nara tiroplobulina mqcc 36. Como pucd e aprcciamc por la peqrir:Aa diferenc ia e n el tamano de los mRP4A, los intrlnnes cnnstiruyen la malior pane de la secuencia gknica.
1
iA T C T
1
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sichia cr
.
L
,
de una manera específica de secuencia, al contrario de
casi todos los métodos enzimhticos, químicos o fisicos que lo seccionan al azar. Estas enzimas defensivas (se han descubierto mis de 200) protegen e[ DNA de la bacteria huésped del DNA de microorganismos extrafíos (primariamente fagos infecciosos). Sin embargo, solo están presentes en ctlulas que tienen además una enzima acompañante que metila al DNA del hubsped y lo convierte en un sustrato inadecuado para ser digerido por la enzima de restricción. Por tanto, las DNA metilasas de sitio especifico y las enzimas de restricción siempre esthn por pares en una bacteria. Las enzimas de restricción reciben su nombre de la bacteria de la que fueron aisladas por ejemplo, Eco RI de Escherichi coli Bam HJ de Bacillus myioIi~miem (cuadro 42-2). Las tres primeras letras en e[ nombre de la enzima, corresponden a la primera del gknero (E) y a las dos primem de la e s p i e (co). Estas pueden ir seguidas por la designacibn de una cepa (R) y un número romano (1) para indicar el orden del descubrimiento (por ejemplo, Eco M,Eco RII). Cada enzima reconoce y separa una secuencia especifica de DNA de tira doble de 4 a 7 pb de longitud. Estos cortes en el DNA producen extremosromos (Hpal)o extremos traslapados (adherentes) (BamHr) (figura 42-S), según el mecanismo usado por la enzima. Los extremos adherentes son particularmente útiles en la constnicción de rnoldculas de DNA hibridas o quiméricas (vkase mas adelante). Si en una moltcula dada de DNA los nucleótidos esthn distribuidos al azar. es posible calcular con cuanta frecuencia una enzima dada podria cortar cierta longitud de DNA. Para cada
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4 GT'TAAC
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NAbG ANTCC 1
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1 1 Providencia Thermtw aquaricus YTI
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A, adenina;C, cimsina, G, panina, T, iiminii Las flechas muestran el sitio da la escisiún; dependiente de este sitio pueden formarse e x k m o s adherentes ( B u ~ I MoJexh-ernw mmos ( H m . La longitud de la xcuencia de reconocimiento puede ser de 4 pb (Taql), 5 ph (EroRII). 6 pb (EcoRI),o 7 pb (.Wsill)Por . convencibn, Cstas se escriben en la direccibn 5' a 5 ' p a r a l a ' tira suprior de cada secuencia de reconocimiento y la tira inferior se m m @ acon la polaridadopuesta(es decir, 3' a 53. Nbi~cequelameiyorParte de secuencias de reconocimiento son palindromoc (esto es, la secuencia se lee igual en ambas direcciones m las dos tiras). Un residuo designado N signifim que está pemiitido cualquier nucleútido.
Tecnología del DNA recornhinante 543
-
G G A T C C -
Figura 42-2. Resultados d e la digestibn por endonucleasas de restriccion. La digestrbn con estas enzimas puede producir fragmentos de DNA con extremos adherentes (A) o extremos romos (B) Esta es una cancideracibn importante al idear estrategias de clonacibn.
posición en la molecula, hay cuatro posibilidades (A, C, G o T); por tanto, una enzima de restricción que reconoce a una secuencia de 4 pb cortara, en promedio, una vez cada 256 pb (44),en tanto que otra que reconoce una secuencia de 6 pb, cortarh una vez cada 4096 pb (4'). Una fraccion dada de BNA tendrá un ordenamiento lineal caracterlstíco de sitios para las diversas enzirnas; por ende, puede construirse un mapa de restricción. Cuando una enzima dada digiere el DNA, los extremos de todos los fragmentos tendrhn la misma secuencia. Los fragmentos producidos pueden aislarse por electroforesis sobre agarosa o poliacrilamida [véase más adelante la descrito sobre transferencia de la mancha); dste es un paso esencial en la clonacibn y un uso importante de estas enzimas.
+
BamHl
Exfremos,rcmos
-G T T A A C -C A A T T G -
-G
GATCC-
+
H P ~ I -GTT
AAC-
+
-CAA
TTG-
Otras enzimas que actiian sobre el DNA y el RNA son parte importante de la tecnologia de secombinación. En &te y los capitulas subsiguientes [cuadro 42-3) se describen muchas de ella.
Las enrimas restrictjvas y DhlA ligasa se emplean para preparar moléculas quiméricas d e DNA Ticnicamente es fhcil unir el extremo adherente, pero a menudo se reqiiieren algunas técnicas especiales para superar los problemas inherentes a este enfoque. Los extremos adherentes de un vector pueden conectarse de nuevo por si mismos, sin ganacia total de DNA. Los extremos adherentes de fragmentos tam-
Cuadro 42-3. Enzirnas usadas en Ini investigación del DNA recombin .---.-.-. . . .--. -----. -
----. . .-
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--Reacción
,-M
Degrada los dos cxtrernoq 3,' y 5' del I:INA
-1)NA ligasa
I>NApolim -
1
I ' Catali za los enla:es entre rr -Sintetiza DNA de doble tir
l
Uso pi ---ivo de las I
: DNA Initin de.-m loblc tira: traducción de h t e s i s de a i mella cic tira1 sencilla -. L tn condiciones apropiadas, producc mcllas en 7 raauccion oe mellas: mapas ae sitios h~perensibles las tiras sencillas de DNA IS cibn d e 1DNA; maipeo de Ias iucleótidos de los extremos 3' S
c DNA
A
-
E
'
I
lacibn de n del DI'JA
FOS~ atasa a'r91inn
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-
-"
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-
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;tira senci
-.-- Jara evitar una autolig:adura je "horqii illas" en Ia síntesis de .. . ... ,. 0
xtremos, 5
-Polinucle6tido cinasa
sa inversa
Transferma terminal
ferencia del fosfato terminal (1 H 5' de IXdA la) del ATP a los grupcis 4 ;intesis de 1;I)NA a pa le mapco d,el RN A (eiitremo 5')
aza DNA cle una plan
1--Agrega nilclebtidos a los extremos .. 3' de] DNA 1 Colocacion de colas .- de nornOpOllmerOs "--
* Adaptado y ~producidown aiitorizacion dc Emery AEH: pigina 41 en. An Inh-oduction !o ficombinant DiVA
Wilcy. 1984.
5415* Bioquímica de Harper
(Capit u10 42)
biCn pueden templarse de modo que forman insertos hcterogéneos en thndem. Además, 10s sitios de los extremos adherentes pueden estar en posici6n inapropiada o no disponible. Para superar estos problemas se utiliza una enzima que genera extremos romos y se agregan extremos nuevos mediante la enzima terminal transferasa. Si se agrega poli d(G) a tos extremos 3' del vector y poli d(C) a los extremos 3' del DNA extraño, las dos rnoléculac sólo pueden templarse una a la otra, pasando asi por alto los problemas enumerados. Este procedimiento que se denomina agregación de colas de homopolímeros,tambitn genera un sitio de restricción Smal, de modo que es fácil recuperar el fragmento. En ocasiones, los ~Iigonucleiitidossintéticos enlazadores, con una enzima de restriccibn de secuencia apropiada, se ligan al DNA de extremos romos. La unión directa al extremo romo se realiza mediante el uso de la enzima DNA ligasa del bacteriófago T4. Esta técnica, aunque más difícil que la unibn al extremo adherente, tiene la ventaja de juntar cualquier par de
DNA plasmidial circular
extremos. Las desventajas son que no existe control sobre la orientacion de la insercion, o sobre eE niimere de msléculas templadas juntas y no hay una forma fAcil de recuperar el inserto.
La clonación amplifica al DNA Una clona es una población grande de moltculas, bacterias o células idénticas que surge de un ancestro común. La clonacihn permite la producción de un número grande de rnoldcvlas idtsnticas de DNA, que a continuación pueden caracterizarse o utilizarse para otros propbsitos. Estas técnicas se basan en el hecho de que las mol6culas de DNA quimérico o hibrido pueden construirse en vectares de clonación, clásicamente plácmidos, fagos o chsmidos bacterianos, que más tarde continúan replichdose en una célula huesped bajo sus propios sistemas de control. De esta manera se amplifica el DNA quimkrico. El procedimiento general se ilustra en la figura 42-3.
DNA nlasmidial lineal con extkrnos adherentes
"Remido" o "temple"
Endonucleasa restrictiva Eco R1
TTRA
DNA
ligasa
Fragmento de DNA humano cortado con la misma nucleaca restrictiva y que posee los mrsmos extremos adherentes
Molkula de DNA plasrnidial con insercibn de DNA humano (rnolkuiade DNA recombinante)
Figura 42-3. Uso de nucleasas de restriccibn para construir moléculas nuevas de DNA recombinante o quimérico. Cuando se inserta nuevamente en una dlula bacteriana (por el proceso llamado transfonnacibn), el DNA plasrnidialse replica no sólo bl mismo, sino tarnbEn el inserto de DNA nuevo flcicamente enlazado. Dado que en la recombinacibn los extremos adherentes, mmo se muestra, regeneran la misma secuencia de DNA reconocda por la enzima de restriccibn original, el inserto de DNA donado puede cortarse limpiamente fuera del circulo del plAsrnido recombinante con esa endonucleasas. Si una mezcla de todos los fragmentos de DNA creados por tratamiento de DNA humano total con una misma nucleaca de restricubn se emplea como fuente de DNA humano, puerle obtenerse un rnillbn, o más tipos diferentes de moléculas de DNA recombinante, cada una purrficada en su propia clona bactcriana. (Modificada y reproducida con autorización de Cohen SN: The rnanipulation of gene. Su Am [JuS] 1975;23334.)
Tecnoloríu del QNA recomBinante 547
L o s ~ l h s m i d o sbacterianos son moléculas pequeiias de DNA dhplex circular, cuya función natural es conferir resistencia a los antibióticos a la célula huksped. Los plhsmidos tienen varias propiedades que los hacen exkemadamente útiles como vectores de clonacion. Existen coma copias únicas o múltiples dentro de las bacterias y su replicacibn es independiente de[ DNA bacteriano. Se conoce la secuencia completa del DNA de muchos pldsrnidos; por consiguiente, se dispone de la ubicacibn precisa de b s sitios de separacibn de las enzimas de restriccihn para insertar el DNA extrarlo. Los plhmidos son más pequefios que el cromosoma del hudsped y, por tanto, se separan con facilidad de éste y el DNA deseado se remueve al cortar el plksmido con la enzima especifica para el sitio de restricci6n en el que se insertó la pieza original de DNA. Los fagos, por lo general, tienen molécuIas lineales de DNA en las que puede insertarse DNA extraiio en diversos sitios de ennimas de restriccidn. El DNA quimérico se recolecta despubs de que el fago pasa a través de su cicio litico y produce partículas fagícas infecciosas maduras. Una ventaja importante de los fkgos como vectores, es que en tanto losplásmidos aceptan piezas de DNA de 6 a 10 kb de longitud, los fagos pueden aceptar fragmentos de 10 a 20 kb, limitacibn impuesta por la cantidad de DNA capas de empacarse en la cabeza del fago. Fragmentos aún mayores de DNA pueden clonarse en cósmidos, los cuales combinan las mejores caracteristicas de plhmidos y fagos. Los cósmidos son pt8smidos que contienen las secuencias de DNA Ilamadas sitios cos, requeridas para empaquetar el DNA larnbda en la particula del fago. Estos vectores crecen de igual manera que los plBsmidas en las bacterias, pero dado que se ha retirado una buena parte del DNA lambda innecesario, puede empacarse mas DNA quimérico en la cabeza de la particula. No es raro que los cósmidos transporten insertos de DNA quimérico con una longitud de 35 a 50 kb. En el cuadro 42-4 se hace una comparación de estos vectores. La insercion de DNA en una región funcional del vector interfiere con la actividad de esa regibn, de modo que debe tenerse cuidado de no interrumpir una funci6n esencial de este. Sin embargo, el mismo concepto puede explotarse para proporcionar una técnica selectiva. El plhsmido vector común pBR322 tiene
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Cuadra 42-4. Vectores comunes para clonaci6n -. .-- -- ..-
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1 del
ida 4A
inset-to de DNA
los genes de resistencia para tetraciclina (tet) y ampicilina (amp). Un sitio sencillo PstI dentro del gen de resistencia arnp se usa comunmente como sitio de inserción para una pieza de DNA exbaño. Además de tener extremos adherentes (cuadro 42-2 y figura 42-2), el DNA insertado en este sitio interfiere en la funcibn del gen de resistencia amp y hace a la bacteria m o r a de este plhsmido, sensible a la ampicilina (figura 42-4). Por tanto, el plhsmido precurcor, que proporciona resistencia a los dos antibióticos, puede separarse con facilidad del plásmido quimkrico, que es resistente sOlo a la tetraciclina. La c o n f i m a c i ~ nadicional del logro de la inserción deriva de la medición del DNA del plksmide obtenida por recombinación putativa en un gel de agarosa, ya que la molecula de DNA quimérico es ahora m8s larga que la del DNA vector hudsped.
Una biblioteca es una colección de donas recombinantes La combinacidn de las enzima de restriccion y de varios vectorec de clonacibn, permite que el genorna completo de un organismo se empaqueta e n un vector.
Una serie de estas clonas diferentes recombinadas, se llama biblioteca. Una biblioteca genbmica se prepara a partir de una línea celular o de tejido. La biblioteca de cDNA representa la poblacibn de los mRNA en un tejido. Las colecciones gendmicas se preparan por digestión parcial del DNA total, con una enzima de restriccibn que corta con frecuencia al DNA (por ejemplo, SauKlJA). La idea es generar fragmentos grandes, de modo que la mayor parte de los genes estCn intactos. Se prefieren vectores fágicos para estas coleccionec porque aceptan fragmentos grandes de DNA (más de 20 kb). El ob.jetivo es lograr unacolecci6n completa. El numero de fragmentos que se requieren para alcanzar este objetivo esti en relacidn inversa con su tamafio y en proporción directa con el tamafko del genoma (cuadro 42-5). Una biblioteca humana que contenga 1O6 fiagrnentos recombinantes de gran tarnaiio, tiene 99% de probabilidad de estar completa. Por tanto, la oportunidad de obtener cualquier copia sencilla de un gen es excelente. La biblioteca de cDNA se prepara aislando primero todos 10s RNA mencajerosen un tejido y entonces copiando estas moléculas en un DNA de doble tira, utilizando (en forma secuencia]) las enzimas transcriptaca inversa y DNA polimerasa. Por razones tdcnicas, rara vez se obtienen copias de la longitud total del DNA y, por tanto, se clonan fragmentos más pequefíos de DNA. A menudo, los plhsmidos son tos vectores favoritos para las cotecci&ec de: cDNA, debido a que es mucho m8s conveniente trabajar con ellos que con fagos o cbsmidos, aunque varios fagos lambda vectores tienen ventajas especiales para la clonacihn del cDNA
548
(Capif uio 42)
Bioquimica de H a r p
Gen de resistencia
Gen de resistencia
a la arnpicilina
a la tetraciclina
1
e resistencia traciciina
corteabierta con Pst l
\ \
1 1 Insercion del corte
/ /
Pst I d e UNA
Figura 4 2 4 . M6tod.o de examinar recornbinantes para fragmentos insertados de DNA Mediante el plásmido pBR322, se lnserta una pieza de DNA en el sitio único Pstl Esta inserción interrumpe la codificacióndel gen para una proteina que provee a la bacteria huésped de resistencia a la ampicilina. Por consiguiente, el plfismido quim&rico no sobrevive cuando se coloca en un medio de cultivo que contiene este antibibtico. Así, la sensibilidad diferencial a tetraciclina y ampicilina puede usarse para distinguir clonas del plAsmido que contiene un inserto.
Un vector por el cual la proteina codificada por el gen introducido por la tecnologia del DNA recombinante es de hecho sintetizada, se conoce como vector de expresión. En la actualidad estos vectores se utilimn comúnmente para detectar moléculas especificas de cDNA en las bibliotecas y para producir proteínas por técnicas de ingeniería genbtica. Estos vectores se construyen especialmente para contener promotores inducibles muy activos, codones de iniciacidn apropiados en fase de traduccibn, señales de transcripción y de fin de la traduccion, y seiiales apropiadas de procesamiento de proteinas, si son necesarias. Algunos vectores de expresibn incluso contienen genes que codifican para inhibidores de proteasas, de modo que se amplifica el rendimiento final del producto. El vector gammagtl 1 es popular para la construccibn de colecciones porque acepta rnolkculas grandes de cDNA que se replican y traducen a proteinas; por tanto, las colecciones de recombinación con gammagt 1 F pueden examinarse con sondas de cDNA o de anticuerpos.
Las sondas investigan bibliotecas para genes específicos o moféculasde cDNA Diversas moldculas pueden usarse para "sondear" colecciones en la búsqueda de un gen especifico o una molécula de cDNA, o para definir y cuantificar DNA o RNA sepimdos por electroforesis a través de varios
geles. Por lo general, las sondas son fragmentos de DNA o ñNA marcados con un nuclebtido que contiene P2. La sonda debe reconocer una secuencia complementarfa para ser efectiva. Un cDNA sintetizado de un mRNA especifico puede utilizarse para examinar una biblioteca de cDNA en busca de un cDNA más largo, o una coIección genóm ica en busca de un secuencia complementxia en la region codificadora de un gen. Una tkcnica popular para hallar genes especificas toma una secuencia corta de aminoácidos y, mediante el codon habitual para esa especie (capitulo 40), fabrica una sonda de oligonucle&idos que detecta el fragmento correspondiente de DNA en una biblioteca genomica. Si las secuencias encajan exactamente, las sondas de 15 a 20 nuclebtidos de longitud se hibridan. Las sondas de cDNA se usan para detectar fragmentos de DN A en las transferencias de mancha Southem y para detectar y cuantificar RNA en la transferencia de mancha Northern. Tarnbikn es posible usar anticuerpos específicos como probadores, siempre que el vector usado sintetice moléculas que éstos reconozcan.
Las técnicas de la mancha e hibridación permiten visualizar segmentos específicos La viswalizacibn de un fragmento específico de DNA o RNA entre las miles de molkculas "contaminantes", requieren la convergencia de cierto numero de tecni-
Ciiadro 42-5. Composicion de colecciones ' icss coml
Southern
Northern
Western
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Colecciiin
E coli 11, vvadura D vosophiiu Wlarnilerus
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.o,.,. 1 5 i i c i iiugiiir;ii~i> 4500 rragnier 50 000 iragmer 000 fragmer -800-
i l d ~ l l r ~ l i ~aIeatorios ~7F
(clonas í i n i ~ u yur )
, .-..
-una
coleccibn d e k tener para asegurar quc cualquier gen sencillo es16 rcprcscntado, e s i i en relncibn inversa con cl tamailo promedio de l n fragmentos ~ usndus para constniir Tñ coleccihn y en relaciun directa con el númcro de genes del organismo Lai cifrx, dadas en el cuadro reprcsenian c l número (Ir fragmentos (clonas indepcndieiites)necesariospara lograr una probabilidadde %Lde hallar unawcmciade DNA dada en unacoleccioridc DNA recornhinado. coi1 un tarnaiici promcdiu de insertos de 2 x 10" nuclcbtidos. Las difrren cias representan la< var la complqiidad gcnhmica cintrc las ~ s pcies. c El número de clono neccinrias se ca1cula la siguiente
dcinde P es 1 dad desead, fracciíiii del .. * genurna iurai en una sola clnna Fn ei caro oe ia coleccilin gcnC da antes. dada la pmscncia dc ? x 10' nu hapIoidc. la ecuaciún queda: . . L . .
Ida ventaja d, ..,.i colección , ,iii~ctir)s E' andes dc LINi\ salta a la vista si rsta ecueción sc resuelve usando fragmentm con uiI tamairo prornedio 5 x lo3nucleótido'S Cti lugd (le 2
x
1u4.
cas, que se denominan de manera colectiva transferencia de mancha. La figura 42-5 ilustra los procedimientos de transferencia de mancha Southern (DNA), Northern (RNA) y Wcstern (proteína). (El primero se llama así por la persona que ide6 la t6cnica; Ios demas nombres comenzaron como jerga de laboratorio, pero ahora son términos aceptados.) Estos procedimientos son útiles para determinar cuantas copias de un gen están en un tejido dado, o si hay grandes alteraciones en alguno (deleciones, inserciones o reordenamientos). En ocasiones, si hay cambio de una base especifica y un sitio de restriccion estl altendo., estos procedimientos pueden detectar una mutación puntual. Las tccnicas de transferencia de manchas Northern y Western se emplean para medir y cuantificar molCculas especificas de RNA y proteína, respectivamente. La hihridacilin en colonia o placa es el rnt%cinpolm el que se identifican y purifican clonas determinadas. Las bacterias se cultivan en colonias sobre una placa de agar y se cubren con un papel filtro de nitrocelu-
Transferencia a papel
1
rDNIa
1
CONA'
I
Anticuerpo'
,4dicibn de la sonda
Figura 42-5. Procedimiento de transferenua de mancha El DNA aislado de una línea celular o un tejido es digerido con una o más enzirnas de restriccibn.Esta mezcla se coloca con pipeta en un pozo en gel de agarosa o poliacrilarnida y se expone a una corriente eléctrica directa. El DNA, que tiene carga negativa, rnigra hacia el diodo, los fragmentos más pequenos se mueven con mayor rapidez. Después de un tiempo adecuado se desnaturaliza al DNA por exposicián a un álmli diluido y se transf~rea papel de nrtrocelulosa, en una replica exacta del patrbn sobre el gel, por la técnica de la mancha ideada por Southefn. El DNA se fija en el papel por wlor y entoncesseleexpone a la sonda de &N4 radiomarado, el cual forma hibridos con los fragmentos complementarios sobre el fiitro. Después de lavado meticuloso, el papel se expone a una pelicula de rayos X que se revela para mostrar las diversas bandas especificas que corresponden al fragmento de DNA que reconoció las secuencias existentes en la sonda de cDNA El sistema Northern para el RNA es conceptualmente similar El RNA se somete a efectroforecis antes de transferir la mancha Aqui se refieren algunos pasos diferentes a tos de la transferencia de DNA, básicamente, para asegurar que el RNA permanece intacto y el método por 10 general es un poco más dificil En la mancha de proteina de Western, se utilizan electroforesis y transferencia a nitrocelulosa y después se sondea con un anticuerpo especifico o con otra molécula sondeadow.
losa. Las células de cada colonia se adhieren al filtro y ademiis se fijan d r manera permanente por medio de calor. lo cual con un tratamiento con NaOH también lisa las células y desnaturalim aI DNA de modo que 5e hibrida con la sonda, Una sonda radiactiva se
agrega aI filtro y después se lava, el cornplcio híbrido se localiza por exposición del filtro a una placa de rayos X. Pareando la mancha en la autorradiografía con una colonia, esta última puede ser recogida de la placa, Una estrategia semejante se utiliza para identificar
fragmentos en bibliotecas de fagos. Rondas sucesivas del procedimienro conducen aun aislado clonal (colonia bacteriana) o a una placa individual de fagos. Todos los procedimientos de hibridacion descritos en esta sección, dependen de las propiedades especificas del pareamiento de bases de las t irac complementanas de los ácidos nucleicos ya mencionados. Las parejas perfectas se hibridizan con facilidad y se conservan a temperaturas altas en las reacciones de hibridación y lavado. Los complejos se forman tambien en presencia de concentraciones salinas bajas. Los pareamientos que no sean perfectos no toleran estas condiciones estrictas (es decir, temperaturas elevadas y concentraciones salinas bajas); por tanto, la hibridacidn nunca ocurre o se destruye durante la etapa de lavado. Familias de genes, en las que hay cierto grado de homología, pueden identificarse alvanar las exigencias de tos pasos de hibridación y lavado. Mediante este metodo también pueden hacerse comparaciones de un gen dado en especies cruzadas.
Existen técnicas manuales y automáticas para determinar la secuencia del DNA Los segmentos especificoc de mol~cuIasde DNA, obtenidos por tecnologia de recombinaci6n de este
Bcído, pueden analizarse por su secuencia de nucle6tidos. Este método depende de la obtencibn de un número grande de moléculas de DNA idénticas. Este r e q u e h i e n t o puede satisfacerse por clonación del fragmento que interesa, mediante las tecnicas descrita antes. El mPtodo enzimático manual (de Sanger) utiliza desoxinucleótidos especificos que terminan la sintesisde la tirri de DNA en determinadasbases confonne la tira se sintetiza sobre moldes de ácido nucleico purificado. Las reacciones se ajustan para obtcner una población de fragmentos de DNA que representan la terminación en cada nuclebtido. Teniendo un marcador radiactivo en el extremo opuesto al sitio de terminación es posible separar los fragmentos de acuerdo a su tarnarlo mediante el uso de electroforesis en el gel de poliacrilamida. S e hace una autorradiografía y cada uno de los fragmentosproduce una imagen (banda) en una placa de rayos X. Estas se leen para dar la secuencia del DNA (figura 4 2 4 ) . Otro método manual de Maxam y Gilbert, u t i l i ~ amétodos quimicos para escindir moléculas de DNA donde contienen nuclebtidos específicos. Las técnicas que no requieren el uso de radioisótopos se utilizan por lo común en el secuenciamiento automático del DNA. El que se utiliza con más frecuencia es un procedimiento en el cual se
Secuencia de la tira original
Q -A-G-T-C-T-T-G-G-A-G-C-T-38
Bases terminadas
Figura 4 2 4 . Secuenciacibn del DNA por el método ideado por Sanger. Los ordenamientosescalonadosrepresentande abajo a arriba todos los fragmentos en orden creciente de la tira original de DNA. Conociendo cual reacubn especifica de didesoxtnucleot~dose efectuó para producir cada mezcla de fragmentos. es posible deteminar ta secuencia de nuclebtidos del extremo marcado hacia el no marcado por lectura hacia arriba del gel Las reglas de pareamiento de bases de Watson y Crick (A a T, G a C) dictan la secuencia de la otra tira (complementaria).
Tecnología del DNA recombinanre m 5 j 1
utilizan cuatro marcadores fluoreccentes diferentes, cada uno de los cuales representa un nuclebtido. Cada uno emite una seiíal especifica a la excitación con un haz de
Ihser, lo cual puede registrarse en una computadora.
La sintesis de oligonucleótidos es ahora una técnica sistemática La sintesis química, automatizada, de oligonucleótidos de longitud moderada (-100 nuclebtidos) de secuencia precisa es ahora un procedimiento sistemático en el laboratorio. Cada ciclo sintético utiliza algunos minutos de modo que una mold~ulaentera puede hacerse en horas a diac dependiendo de su longitud. Los oligonucteótidos son indispensables para secuenciaci6n de DNA, selecci6n de bibliotecas, análisis de movilidad del DNA, reaccibn en cadena de la polimerasa (vdase adelante) y otras numerosas aplicaciones.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica las secuencias de UNA La reacción en cadena de lapolimerasa (PCR,del inglés, poLvmerase chain reacfion)es un método de arnpt ificar una secuencia objetivo de DNA. La PCR proporciona un medio sensible, selectivo y en extremo r6pido de amplificación de una secuencia de DNA determinada. La especificidad se basa en el uso de dos oligonuclebtidos cebadores que se hibndizan con secuencias complementarias en tiras opuestas de DNA y flanquean la secuencia que se desea (figura 42-7). Primero, la muestra de DNA se calienta para separar las dos tiras, se permite que los cebadores se unan al DNA y cada tira se copia por una DNA polimerasa, que comienza en e[ primer sitio. Cada una de Ias dos tiras de DNA sirve como molde para la síntesis del nuevo ácido nucleico apartir de los dos cebadores. Ciclos repetidos de desnaturalizacibn porcalor, ' k ~ ~ ~ i od"temple" o" de los cebadores a sus secuencias complementarias y extensibn de los cebadores "templados" con DNA polimerasa conducen a amplificación exponencial de segmentos de DNA de longitud definida. Las primeras reacciones PCR usaron una DNA polimerasa de E. eoli que se destruía en cada
Figura 42-7. La reaccibn en cadena de la polimerasa se usa para amplificar secuenuas genéticas especificas. El DNA de doble tira se calienta para separarlo en tiras rndividuales. Estas se unen a dos cebadores distintos que se dirigen a seaienuas especificas en tiras opuestas y que definen el segmento a ser amplificado (muttiplicado) La DNA polimerasa extiende los cebadores en cada dirección y sintetiza dos tiras complementanas para el original 2. Este ciclo se repite varias veces, dando un producto amplificado de longitud y secuencia definida
CICLO 3
4 CICLOS 4-n
ciclo de desnaturalización con calor. La sustitución por una DNA polirnem termoestable de Tkrmusaquaticz~~, microorganismo que vive y se replica a JO u S0 "C. evito este problema y permite que la reaccibn sea automatica, dado que las reacciones con la polimerasa pueden correrse a 70 "C. Tarnbih mejoraron la especificidad y el rendimiento de la producción de DNA. Secuencias de DNA tan cortas de hasta 50 a 100 pb y tan largas de hasta 2.5 kpb pueden amplificarse. Veinte ciclos dan una amplificacion de 1 Q6 y 30 ciclos de lo9. La PCR permite amplificar y analizar el DNA contenido en ima sola célula, un foliculo piloso o esperma. Así, la aplicacibn de PCR a !a medicina forense es evidente. La PCR se usa también: 1) para detectar agentes infecciosos, en especial virus latentes; 2) hacer diagnósticos genéticos prenatales; 3) detectar polimorftsmoc a!élicos; 4) establecer tipos tisulares precisos para trasplantes, y S) estudiar la evolución, mediante DNA de muesms genealógicas. Existe un número igual de aplicaciones de PCK a problemas en ciencia b b i c a y no se duda de que aparezcan nuevos usos.
LAS APLICACIONES PRACTICAS DE LA TECNOLOG~ADEL DNA RECOMBINANTE VAN EN AUMENTO El aislamiento de un gen especifico de un genoma completo, requiere de una tCcnica que descrimine una parte de un millón. La identificacíon de una región reguladora que puede tener sólo 10 pb de longitud, hace necesaria una sensibilidad de una parte en 3 x loB;una enfermedad como la anemia de celulas falciformes se causa por el cambio de una sola base, o sea una parte en 3 x 10" La tecnologia del DNA recombinante es lo suficiente poderosa para hacer todas estas cosas.
. .-.-
p .
--
El rnapeo génico localiza genes específicos para cromosomas distintos Por tanto, la localización de gents puede definir un mapa del genoma humano. Ya produce infomacion muy útil en la definición de la enfermedad humana. Ida hibridación de células sornáticas y la hibridación in situ son dos tkcnicas usadas para lograrlo. En la hibridacihn insinc el procedimientomás sencilloy directo, una sonda radiactiva se agrega a una dispersihn de crornosomas metafjsicos en un portaobjetos. El Area exacta de la hibridacibn se localiza colocando una emuIsi6n fotográfica sobre la laminilla y d e s p d s de su exposición, recubriendo la superficie granulosa con alguna identificación histológica del cromosoma. La hibridación in sirtc de la fluorescencia (FISM) es una técnica muy sensible que también se utiliza con este proposito. Con frecuencia esto colwa al gen en una ubicacion sobre una banda o una regi6n dada del cromosorna. En el cuadro 4 2 4 se enumeran aEgunos genes humanos localizados por esta tdcnica. El cuadro representa s61o una muestra, puesto que ya se han ubicado m8s de 100 genes. Este mapa humano sera más completo en los prhximos años y se encuentra en pleno desarrollo la secuenciación del genoma humano completo. Por ahora es posible extraer las conclusiones siguientes: 1) Los genec que codifican para proteínas con funciones semejantes pueden estar colocados en cromosomas separados (alfa y beta globina). 2) Genes que forman parte de una familia tambikn pueden estar en cromosomas separados (hormona del crecimiento y prolactina}. 3) Los genes que intervienen en muchos trastornos hereditarios que se s a k causados por deficiencias proteinicas especificas incluye anormalidades ligadas al cromosoma X, estan de hecho localizados en sitios específicos. Quizá de mayor interés, es el hecho de que debido a la dis-
Cuadro. 4 2-4 ..Localización de .genes humanos'
-
--- --
-- -. .. -.
Cromosoi
--
w.
#----A-A
A
Insulina Prolnctina
Hormona aei crecim a-Cilobin; p-Globina Adcnoslnh uc3uiiiiiici Fenilalanina hidroxilasa trnnsferasa Hipoxantin-guaninfc~sforribosil~ Segmento GII de DN A
'1q21-qter '4 p12-pter
U p12
a ql3-qter
a q24
S 426-927 4P
Detlcienck IIVLIIIVlle. UC.L a-Talasen ia ! P-Talasemia, etlulaq falciformec ; Dcficicncia de adenosina desam . Fenilcetoni Sindromc r yhan Eorca de H LIL1*
.
* Esic cuadro indica l a ubicacihn cmmosbmica de varios genes y las enrermeaaaes causada por ia sinresis ariicicnic o ariurrIiai ut: los
productoi ginicos El cromnqnmñ implicücio w indica con el primer numero (siibrayrdo) o letra Los dernhs números y letras se refieren a la
Tecnologia del D,VA recombinanre
ponibilidad de fragmentos rectrictivos definidos y clonados, se esta lopando la ubicación cromosomica de muchos trastornos cuya deficiencia proteinica se desconoce. par ejemplo, la corta de fIuntington en el cromosoma 4; la fibrosis quistica en el cromosoma 7; la enfermedad poliquistica renal del adulto en el cromosoma 16 y la distrofia muscular tipo Duchenne en el cromosoma X. Una vez que el defecto se localiza en una regi6n del DNA que tiene la estructura camcteristica de un gen (f1gura42-11, es posible construir un gen sintbtico y expresarlo en un vector apropiado para valorar su función o puede sintetizarse un pkptido putativo, que se deduce del marco de lectura abierto en la región codificadora. Los anticuerpoc dirigidos contra este pkptido pueden utilizarse para valorar si este se expresa en personas normales y si no existe en aquellas con el síndrome genttico.
Es posible producir proteínas para investigación y diagnóstico Un obietivo práctico de la investigacihn del DNA recombinante es la produccicin de materiales para aplicación biomédica. Esta tecnología tiene dos mhitos distintos: I ) Puede suministrar cantidades abundantes de material que no podrían obtenerse por métodos convencionales de purificación (por ejemplo, interferbn, factor activador del plasminógeno). 2) Puede proveer material humano (por ejemplo, insulina, hormona del crecimiento). Las ventajas en ambos casos son obvias. Aunque el objetivo primario es suministrar productos; por lo general, proteínas, para tratamiento (insulina) y diagnostico (prueba del SIDA) de enfermedades humanas y otras de animales y para la prevenci~nde la enfermedad (vacuna contra la hepatitis R), hay otras aplicaciones comerciales reales y potenciales, especialmente en la agricultura. Un ejemplo de esto último es el intento de la ingenieria vegetal de aumentar la resistencia a la rigidez o a temperaturas extremas, o mejorar su eficiencia para fijar nitrdgeno.
La tecnologia del DNA recombinante se utiliza en el análisis molecular de !a enfermedad A. Variaciones génicas normales Hay una variación normal de la secuencia del DNA del mismo modo que existe en aspectos más obvios de la estructura humana. Las variaciones de la secuencia del DNA, polimorfismos, ocurren aproximadamente una vez en cada 500 nucle6tidos, o cerca de lo7veces por genoma. Hay, sin duda, supresiones e inserciones de DNA asi como tambien sustituciones sencillas de bases. En personas sanas, es evidente que estas alteraciones ocurren en regiones no codificadoras del DNA,
553
o en sitios en los que no causan cambios en la función de la proteina codificada. Este polimorfismo de la estructura del DN A puede relacionarse con ciertas enfermedades y utilizarse para Ia búsqueda del gtn específico involucrado, como se ilustrara adelante. También puede utilizarse en diversas aplicaciones para medicina forensc.
B. Variaciones génicas que causan enfermedades La genetica clásica ensefiaba que la mayor parte de las enfermedades genéticas se debían a mutaciones puntuales que conducian a la sintesis de una proteína anormal. Esto puede ser aun verdad, pero si durante la lectura de las secciones iniciales de este capitulo se predijera que la enfermedad genktica podria resultar de la perdida del ordenamiento de cualquiera de los pasos ilustrados en la figura 42-1. podría hacerse una valoración apropiada. Este punto se ilustra exactamente por un examen del gen de la beta globina. Este se localiza en un racimo del cromosoma 1 1 (figura 42-8) y en la figura 42-9 se ilustra una version amplificada del gen. La producción deficiente de beta gEobina conduce a diversas enfermedades y se debe a muchas lesiones diferentes en y alrededor del gen correspondiente (cuadro 42-7).
C. Mutaciones puntuales El ejemplo cikicico es la anemia de dlulas falciformes, que se causa por la mutaci6n de una base en 3 x 10" en el genoma, una sustitución de T a A en el DNA, que a su vez conduce a un cambio de A a U en el mRNA correspondienteal sexto d ó n del gen de la heta globina (figura 7-20). El codón alterado especifica un aminoicido diferente (valina en lugar de acido glutámico) y esto causa una anormalidad estructural de la molécula de beta globina, Otras mutaciones puntuales en el mismo gcn o alrededor de él, disminuyen o en algunos casos, anulan la producción de la beta globina; la beta talasemia es consecuencia de estas mutaciones. (Lastalasemias se carnerizan por defectos en la síntesis de subunidades de la hemoglobina y así, la beta talasemia es resultado de la prodwccibn insuficiente de beta globina.) La figura 42-9 muestra que las mutaciones puntuales que afectan a cada uno de los numerosos procesos implicados en la generación de mRNA normal (y, por tanto, de una proteina normal) se han considerado causa de la beta talasernia.
D, Supresiones, insercianes y reordenamientos del DNA Los estudios en bacterias, virus, levaduras y moscas de la fruta, muestran que los fragmentos de DNA pueden moverse de un lugar a otro dentro de un genoma. La supresión de un fragmento critico de
554
Bioquimica d~ Harper
(Capitulo 42)
Hemoglobina Lepore
Figura 42-8. Representacibn esquemática del racimo de genes de la P-globina y algunos trastornos genéticoc. El gen de la P-globina se localiza en el cromocoma 11 en undn estrecha con dos genec para la y-globina y del gen de la 6-globina La familia del gen sigue el orden 5'-~-Gy-Ay-iyb4-p3'El locus E se expresa pronto en la vida embnonaria (a,~,).Los genes y se expresan en la vida fetal, para sintetizar hemoglobina fetal (HbF, a,y,). La hemoglobina del adul!o consiste de HbA (a,b,) o HbA, (a$,) El i ~ es p un seudogen que tiene homología de secuencia con P pero cantiene mutaciones que irnpide
DNA, el reordenamiento del DNA dentro de un gen o la inserción de un fragmento en una región codificadora o reguladora, pueden causar cambios en la expresibn gdnica que desemboquen en algún proceso patolbgico. De nuevo, un análisis molecular de la beta talasemia produce numerosos ejemplos de estos procesos, en particular supresiones, como causa de enfermedad (figura 424) .Al parecer los racimos de genes de globina tienen predisposicibn particular a esta lesion. Las deleciones o supresiones en el racimo de la
alfa globina, localizado en el cromosoma 16, causan alfa talasemia. Existe una fuerte relación etníca con muchas de las supresiones, de modo que individuos del norte de Europa, filipinos, negros y del Mediterraneo, presentan lesiones diferentes que conducen a la ausencia de hemoglobina A y a la alfa talasemia. Un analisis semejante podría hacerse para otras enfermedades. Las mutaciones puntuales, por lo general, se definen por la secuenciación del gen en cuestidn, aunque en ocasiones, si la mutación destruye e crea
Flgura 42-9. Mutaciones en el gen de la P-globina que causan p-talasemia. El gen se muestra en la orientacibn 5' a 3'. Las áreas con myas diagonales indican las regiones 5' y 3' no traducidas. Leyendo en la direccrbn 5'a Y,las áreassombmdas son los exonec de 1 a 3 y los espacjos claros son los intrones 1 y 2. Las mutaciones que afectan el control de la transcnpcion ( e ) se ubican en el DNA en la regldn que flanquea a 5'. Se han identificado y están indicados ejemplos de mutaciones sin sentido mutaciones en el procesamiento de RNA @! y mutaciones durante el corte del RNA (O). En algunas regiones se han descubierto numerosas mutaciones Estas se muestran con corchetes [ 1.
Tecnologia del DNA recombinante
Cuadro 42-7. Alteraciones estructurales; de! gen de P-globiil a
- - .-
-. . . ..-. .-. p . -
- .-
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Alteracidn + h n c i 6 n afectzida
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Enfermedad -
Inr 1 E-F.. .,A,A , IV~VIIIUU~IUIIC~ nun- Plenamiento de IC. 1 I.IIILI iiiLuau por cs falcifoA es Pri~teinas Control de la tri cri pc16n ascmia
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Supresión
1 1
1
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a-Tal u-moglobina de
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tcpo lasemia ti,
dctiTi 1 III
un sitio para una enzima de restriccibn, puede usarse la técnica de analisis del fragmento restrictivo para delimitar la lesibn. Las supresiones o inserciones de fragmentos de DNA m6s grandes que 50 pb pueden identificarse a menuda por el procedimiento Couthern de transferencia de la mancha.
E. Andlisis genealogico De nuevo, la enfermedad de celulas falcíformes proporciona un ejemplo excelente de la forma en que la tecnología del DNA recombinante puede aplicarse al estudio de la enfermedad humana. La sustitución de T por A en la tira codificadora de DNA en el gen de la beta globina cambia la secuencia en la región que corresponde al sexto codón de
J. C C TG AGG G GA c@c C
Tira codificadora Tira molde
CCT G T GG GGA C@CC
Tira codificadora Tira molde
t
y destruye un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Mstll (CCTNAGG; denotada por las pequeRas flechas verticales, cuadro 42-1). Otros sitios Mslll 5' y 3' desde ese sitio (figura 42-10) no se afectan y por tanto serhn cortados. Asi, la incubacibn de DNA de individuos normales (AA), hetesocigotos (AS) y homocigotos (SS) produce tres patrones diferentes en la transferencia de mancha Southem (figura
335
42-1 0). Éste es un ejemplo de c6mo se puede establecerse la genealogía del DNA usando los principios expuestos en este capitulo. El analisis genealógico se ha aplicado a cierto número de enfemedades genkticas y su utilidad es mayor en las que se causan por supresiones e inserciones, o en los casos poco frecuentes en que se afecta un sitio de rotura de una endonucleasa de restriccidn, como en el ejemplo citado en este phrrafo. El análisis se facilita con la reaccibn PCR, que puede proporcionar suficiente DNA para análisis a partir de unos cuantos eritrocitos.
F. Diagnóstico prenatal Si la 1esiOn genética se comprende y se dispone de una sonda especifíca, es posible el diagnlistico prenatal. El DNA de las células colectadas de cantidades tan pequeñas como 10 mL de liquido amniótico (o por biopsia de las vellosidades coriónicas) puede analizarse por transferencia Southem. Un feto con el parrón restrictivo A A de la figura 42-10 no tiene la enfermedad de celulai falciformes ni es portador. Un feto con el patrbn SS desarrollará Ia enfermedad. En la actualidad se dispone de sondas para este tipo de analisis de numerocas enfermedades genéticas.
E. Polimorfisrno de la longitud del fragmento de restricción (PLFR) Las diferencias en la secuencia de UNA citadas antes pueden conducir a variaciones de los sitios resbiaivos y por tanto de la longitud de los fragmentos. Las diferencias hereditarias en el patr6n de restricción (por ejemplo, una variacidn de DNA que ocurre en más de 1 % de la poblacion general) se conocen como polimorfismo de la longitud del fragmento de sestriccidn o PLFR. Se ha construido un mapa PLFR bastante extenso del genoma humano que esta probando ser útil en el proyecto de secuenciamiento del genoma humano, y es una pieza importante en el esfueno de comprender varias enfermedades únicas y rnultigknicas. Este polimorfismo es consecuencia de cambios de una sola base (por ejemplo, la enfermedad de cklulas fatcifomes) o deleciones o insercionec de DNA en un fragmento restrictivo (por ejemplo, las talasemias} y han comprobado ser una herramienta iitil para diagnóstico. Se han descubierto en loci genkticos conocidos y en secuencias que no tienen funcion conocida, por tanto, el PLRF puede interrumpir la funcibn de un gen o no tener consecuencias biológicas. Los PLFR son hereditarios y se segregan en un patrlin mendeliano. Un uso importante del PLFR (en la actualidad se conocen cerca de cientos) es en la definición de enfermedades hereditarias en [as que se desconoce la deficiencia funcional. Los PLFR pueden usarse para establecer grupos ligados, lo cual a su vez, por el proceso del cromosoma ambulante, definira finalmente el Iocus de la enfermedad. En el cro-
A.
Sitios de restricción Mst II alrededor y en el gen de la P-globina
Normal (A)
Falciforme (S)
5,
3'
5'
3-
B. Anáiisis genealogico
Tamaño del fragmento
AS
AS
SS
AA
AS
AS
Fenotipo
Figura 42-10. An~lisisgenealogico de la anemia por células falciformes. La parte superior de la frgura (A) muestra la primera porciondel gen de la p-globinay lossitiosde ataque de la enzima de restricci6n Mstl! {A) en losgenes de la p-globina normales (A) y los de las cblulas falciformes (S) La digestión con la enzima de restriccibn Mstll produce fragmentos de DNA de 1.15 y O 2 kb ae longitud en los individuos normales El cambio de T a A en los individuos con anemia por oélulas falciformes excluye 1 de los 3 sitlos MstlI alrededor del gen de la P-globtna; por consiguiente, se genera un solo fragmento restrictivo de 1 35 kb de lonqitud en respuesta a Mstll Esta diferencia en tarnaiio se detecta con facilidad sobre una mancha Southern (B) (El fragrnn ito de 0.2 kb corre en el gel y no se muestra en esta ilustración). En analisis genealdgico muestra tres posibilidades: AA = normal (O). AS = heterocigoto(a1, SS = hornocrgoto (M). Este método permite el diagnostico prenatal de la enfermedad por dlulas falciformes a su caracterización (@)
mosorna ambulante (figura 42-1 l ) , una pieza que representa un extremo de un fragmento largo de UNA se utili7a para aislar otrn que se traslapa con el primero pero que lo excede. La dirección de la extensión se detemina por la formacion del mapa restrictivo y el procedimiento se repite sucesivamente hasta obtener la secuencia deseada. Las enfermedades ligadas al cromosoma X son en particular susceptibles a este metodo, dado que s61o se expresa un alelo. Por tanto,
20% de los PLFR definidos están en el cromosoma X y existe un mapa de enlaces razonablemente completo de este cromosoma. Los trastornos ligados al cromosoma X como la distrofia muscular tipo Duchenne, se han descubierto mediante los PLFR. De igual modo. el defecto en la coma de Huntington se ha localizado en la región terminal del b r m corto del cromocoma 4 y el defecto que causa la enfemedad poliquistica renal está ligado al locus de Ea alfa globina en el cromosoma 16.
Tecnoiogilr del DNA recombinante
3'
ONA lnlacto 5'
Fragmentos
Sonda
53'7
1' r-
inicial Figura 42-1 1. Tecnica del cromocoma ambulante. El gen X va a ser aislado de una pieza grande de DNA Se desconoce la ublcacion exacta de este gen, pero se dispone de una sonda (* -) dirigida contra un fragmento de DNA (mostrado en el extremo 5' de este esquema), ya que es una colección que contiene una serie de fragmentos traslapados de DNA En aras de la simplicidad, sólo se muestran cinco de ellos. La sonda inicial formara hibridos sólo con las clonas que contienen el fragmento 1 , el cual puede entonces aislarse y utilizarse como sonda para detectar el fragmento 2 , el procedimiento se repite hasta que el fragmento 4 forma un hibrido con el fragmento 5, el cual contiene la secuencia completa del gen X.
H. PLFR y VNTR en medicina forense La variable niirnerica de repeticiones en tandem (VNTR) son un tipo comwn de "inserci6nm que resulta en un PLFR. t a s VNTR pueden heredarse, y tal caso resulta de utilidad para establecer reEaci6n genctica en una familia o pariente; o pueden ser únicas para un individuo y eii ese caso sirven como huella "digital" moleciilar de esa persona. l. Terapéutica génica Las enfermedades causadas por deficiencia de un producto genico (cuadro 4 2 4 ) son susceptibles de tratarse con terapéutica de restitución. La estrategia consiste en clonar un gen (por e-jemplo, el gen que codifica a la adenosína desaminasa) en un vector que pueda captarlo con facilidad e incorporarlo en el genoma de una célula huésped. Se estBn investigando las céiuIas precursoras de la médula Dsea para este propósito, debido a qiie existe In posibilidad de reintegrarlas a la mCduIa y que el gen se replique ahi. El gen introducido podría comenzar a dirigir la expresión de su producto proteínico y así se corregirh la deficiencia en la célula huésped.
J. Animales transgénices Es obvio que esta restitucihn del gen en una cblula somatica no podria heredasse a la descendencia. Se han ideado otras estrategias para alterar las líneas de céluIas germinales pero s61o se han probado en animales de laboratorio. Un determinado porcentaje de genes inyectados en un ovulo fecundado de ratón se incorporarán en el genoma y podrán encontrarse tanto en las células somáticas como en las germinales. Se han establecido cientos de animales mansgtnicos, mismo que demuestran ser útiles para el análisis de efectos tisulares específicos sobre la expresihn genica y de los
efectos de la sobreprod~icciónde productos génicos. (por e.jemplo, aquellos del gen de la hormona del crecimiento o de los oncogenes) y en el dcccubrimiento de los genes que intervienen en cl desarrollo, proceso que hasta ahora ha sido difícil de estudiar. El mCtodo transgtnico se emplea recientemente para corregir una deficiencia genetica en los ratones. Los ó w l o s fecundados obtenidos de ratones con hipogonadismo genético fueron inyectados con DNA que contenia la secuencia codificadora de la proteína precursora de la hor,nona liberadora de gonadotropina (GnRH). Este gen fue expresado y regulado normalmente en el hipotálamo de cierto nUmero de los ratones resultantes y estos animales fueron normales en todos los aspectos. Ademas, su descendencia no mostró deficiencia de GnRH. Portanto, Ésta es una prueba de la expresión en las células somAticas del transgen y de su conservación en las celulas germinales.
Disyunción dirigida del gen
o nocaut En animales transgenicos una es la adición de un gen al genoma y no hay manera de controlar en cual de los genes puede radicarse. Un camino complementario, y mucho mhs dificil, implica la remocibn selectiva de un gen del genoma. El nocaut genico en animales, por lo general, ratones se realiza mediante la creación de una rnutacibn que disyunta completamente la función de un gen. Esto se utiliza a continuaci~npara remplazar 1 de los 2 genes en una cdlula del tallo embrionario para crear un animal heterocigoto cransgénico. El cruce de tal par de animales, mediante la genética mendeliana, produce una mutacion homocigota en
25% de la progenie. Se tienen desarrollados varios cientos de ratones con nocaut gknico.
RESUMEN En la actualidad piteden aplicarse varias tecnicas muy sensibles al aislamiento y caracterizaci0n de genes y a la cuantificaci6n de los productos genicos. Un concepto fundamental para estas tecnicas es que los pares de bases complementarias forman puentes de hidrógeno entre si (A con T y G con C) en forma inequívoca. En la clonacirin de DNA, un segmento particular de este se desprende de su entorno normal mediante una de las numerosas endonucleasas restrictivas. Luego, el segmento se introduce en alguno de los diversos vectores conocidos donde puede amplificarse y producirse en abundancia, Es relativamente fácil aislar al DNA clonado; luego, puede investigarse su secuencia y usarse como sonda en una de las diversas reacciones de hibridizaci~npara detectar otros fragmentos de DNA relacionados o adyacentes o para cuantificar productos génicos como mRNA. La manipulación del DNA para cambiar su estructura, designadacomo ingeniería genética, es un elemento fundamental de la clonación (por ejemplo, construccidn de moléculas quiméricas) y tambien puede usarse en el estudio de la funcibn de un fragmento dado de DNA y para analizar la forma de regulacidn de los genes. Las rnolkulas quirntricas de DNA se introducen en las ctlulas para transinfectarlas o en el oocito fecundado para formar animales transgknicos. Estos enfoques se utilizan para estudiar la regulacidn génica en el contexto de la cdlula normal y alterar sus funciones. Técnicas que emplean DNA clonado son útiles para localizar genes para regiones especificas en los cromosomas, para identificar genes causantes de enfermedades y cada vez mhs, para tratar las propias enfermedades genéticas.
GLOSARIO ARS: Secuencia authnoma replicante, el origen de la rcplicacion en una levadura. Autorradiogrsfia: Identificaciiin dc molCculas radiactivas (por ejemplo, DNA. RNA, proteína) por visualizaci6n de sus efectos en una placa fotogrhfica. Bacteribfago: Un virus que infecta a una bacteria. Biblioteca: Conjunto de fragmentos clonados que representan un genoma completo. Las bibliotecas pueden ser de DNA genbmico (cn las cuales están representados tanto intrones como exones) o de cDNA (en las que solo estan representados los exones). Clenli: Niimero grande de células o molCculas que son idtnticas y provienen de una sola cClula o molécula precursora. Cbsmido. Un plásmido en el cual sc insertan secuencias de DNA del bacteriiifago lambda necesarias para el empaqueramiento del DNA (sitios cos); esto permite que el UNA del plhmido sea empaquetado in vitro. DNA con extremos romos: Doc tiras de un DNA dúplex que tienen extremos que se igualan una con la otra,
DNA con extremos adherentes: Tiras sencillas complementarias dc DNA que sobresalen de los extremos opuestos de un DNA duplex o de los extremos de moléculas dúplex difcrcntes(vCase DNA con extrcmos
romos). DNA recom bina nte: DNA alterado por la inserción de una
secuencia de dcsoxinucIe6tidos por medios enzimáticos o quimicoi que prek ictmente no cstaban contenidos en la moli.cula dc DNA. cDNA: Molecula dc DNA de tira qencilla que es complemeniaria de una molCciila de mRNA y se sintetiza por la accibn de la transcriptasa inkcrsa. Endanucleasa: Enzima que separa enlaces internos en el UNA o en el RNA Enzima de restricción: Endodesoxinucleasa que separa las dos tiras del DNA en sitios altamente específicos por la secuencia de bases. Excinucleasa: La nucleasa de cscisibn implicada en la rcparación del DNA por recambio dcl nuclehtido. Exhn: Secuencia de un gen que se representa (exprcca)como mRNA. Exonucleasa: Enzima que separa nuclebtidos de los extremos 3' o 5' del DNA o del RNA. Hibridación: Reunión especifica de tiras complementarias de los hcidos nucleicos (DNA con DNA, UNA con RNA, o RNA con RNA). Horquilla: Dilataciirn dcl DNA de doble hklice, formada por cl pareamiento de bases entrc secuencias complementarias vecinas de una tira sencilla del DNA o KNA Huella digital: E1 uso dc PLFR o secuencia repetida del DNA para establecer el patrón Unico de fragmentos del rlNA para un individuo determinado. Inserto: Una longitud adicional de pares de bases en el DNA, introducidas por lo general portecnologíadel DNA recombinante. Jntrón: Secuencia de un gen que es transcrita, pero que se separa antes de la traduccibn. Ligadura: Union catalizada por enzimas en el enlace fosfodikster de dos dfstensiones de DNA o RNA en una; las enzima! respectivas son DNA ligasa y RNA ligasa. Cines: Secuencias largas repetidas intercaladas. Mancha: Northesn: Método para transfcrir RNA de un gel de
agarosa a un filtro de nitrocelulosa, en el cual puede identificarse el RNA con una sonda adecuada. Southern: Método para transferir DNA de un gcl de a g m s a a un filtro de nitrocelulosa,en el cual el DNA puede ser identificado por una sonda adecuada {por ejemplo, DNA o RNA cornplement&rios). Western: Mktodo para transferir proteína a un filtro de nitroceIulosa, en el cual, ésta puede ser identificada con una sonda adecuada (por ejemplo, un anticuerpo). Molécula quimbrica: Una rnoltcula (por ejemplo, DNA, RNA. proteína) que contiene secuencias derivadas de dos especics diferentes. Oligonucleótidos: Secuencia corta, definida. dc nuclebtidos unidos por el enlace fosfoditster típico. O r i : El origen de la replicación en procariotes. Palindrorno: Secuencia de DNA que es igual cuando las dos tiras se leen en direcciones opuestas.
Tecnología del BNA recombinanre * 359
es resistente a la drgestibn por las cnzimas DNasa. Cuando se practica una reacciún de secuencia con la utilizacibn dc dicho DNA, sc detecta una zona protegida que representa la "pi~ada" de la protcina enlazada. P14smido: Molécula circular extracromosbmica pequcaa de DNA que se replica en forma independiente del DNA del huéspcd. Polimerasa, reacción en cadena con Ir (PCR): Método cnzimatico para copia repetida de 1% dos tiras de DNA que constituyen una sccuencia gtnica especifica. Polimorfismo microsatelital: Heterocigocidad de una determinada repetición microsatélite cn un individuo. Primosoma: El complejo mhvil de heIicxa y primasa implicado en la replicaciún del DNA. snRNA: El RNA nuclear pequeno. Esta familia de RNA se conoce mejor por su funcibn cn cl proccsamicnto del mRNA. Secuencias repetidas microsateliaIes: Secuencias, ya sea aisladas n en grupo, de 2 a 5 pb que se repiten hasta 50 veces. Pueden presentarse en 50 a 100 mil localidades del gcnorna. Seiial: Producto final ohsevado cuando se detecta una sccuencia especifica de DNA o RNA, por autorradiografía o por algún otro mttodo. La hibridación con un polinucle~tidoradiactivo complementario (por e,jcmplo. por el sistema de mancha Souihern o Northern) es una forma común de generar la sefial. Separacibn: Climinaciíin de intrones del RNA acompaflada por la union de sus exones, Separosoma: El complejo macromolecul~trrespnsable de la separación del mRNA precursor. El separosoma consta dc al menos cinco RNA nucleares pequehos (snRNA; U], U2, U4, U5 y UA) y muchas protelnas. Pisada: El DNA con enlace proteínico
Seudogen: Segmento inactivo de DNA que surge por mu-
taciún de un gen activo precursor Sines: Secuencias cortas repetidas intercaladas. Sonda: MolCcula usada para detectar la presencia de un
fragmento específico de DNA o RNA; por ejemplo, en una colonia bacteriana que se forma de una coleccibn gtnica o por Ias técnicas de transferencia de mancha; las sondas comunes son moléculas de cDNA, oligodesoxinucleótidos sintéticos de secuencias definida o anticucrpos para proteínas cspccíficas. Tándem: Término usado paradescribir las copias múltiples de la misma secuencia (par ejemplo, DNA) que son adyacentes. Traduccibn: Síntesis de proteínas que utili7a mRNA como plantilla. Traduccibn con mella: Tdcnica para marcar DNA basada en la propiedad de la DNA po?imerasade E. col1 para degradar una tira de DNA que ha sido mellada y sintctizarln de nuevo; si se emplea un trifosfato de nucleósido radiactivo, la tira reconstruida qucda marcada y puede utili7arse como una sonda mdiactiva. Transcripcibn: Cintesis de UNA dirigida por DNA. Transcripcibn inversa: Síntcsis dc DNA dirigida por RNA y cabali~adapor la transcriptasa inversa. Transferasa terminal: Enzima que agrega nuclehtidos de un tipo (por e,jernplo, residuos de decoxiadenonuclehtidos) al extremo 3' de las tiras de DNA. Transginico: Describe la introduccibn de DNA nuevo en las ctlulas germinales por su inyección en el núcleo del huevo. Vector: Un plfismido o un bacterihfago en el cual puede introducirse DNA extraiio con el propbsito de preparar una clona. I
REFERENCIAS Lewin B: Cenes :k Oxford Univ Press, 1994. Maniatis T, Fritsch EF, Sam brook J: ~Uolecular Claning, 2nd cd. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Martin JR, Gusella JF: Huntington's disease: Pathogenc-
sis and management. N Engl J Med 1986;3 15: 1267.
de: Scientific American Books. Freeman, 1992. Weatherall DJ: The ;Vew Genetics and Clinical Practice, 3rd ed. Oxford Univ Prcss, 1991. Watson JD et al.: Recomhinant D4W.2nd
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Capítulo 43 Membranas: estructura. ensamble y función Capítulo 44 Acción de las hormonas
Capítulo 45.Hormonas de higólisis e hipotálamo
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Capitulo 46 Hormonas tiroideas
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Capitulo 47 Hormonas que regulan el metabolismo del calcio Capitulo 48.Hormonas de la corteza suprarrenal
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631
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Capítulo 49 Hormonas de la médula suprarwnal Capitulo 50 Hormonas de lsts gónadas
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Capitulo S1 Hormonas de pjincreas y vías gastrointestinales
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683
Membranas: estructura, ensamble v "unción d-
Las membranas son estructuras sumamente viscosas aunque pllsticas. Las membranas plasmftticas forman compartimientos cerrados alrededor del citoplasma para separar una célula de otra y así permitir su individualidad. La membrana plasrnática tiene perrneabilidad selectiva y actúa, por tanto, como una barrera para mantener las diferencias de composición entre el interior y el exterior de la célula. La permeabilidad selectiva la proporcionan conductos y bombas d e iones y sustratos así como receptores específicos de sefíales (por ejemplo, homonas}. Las membranas plasrnaticac también intercarnbian material can el ambiente extracelular por exocitosis y endocitosis y en las estructuras de membrana hay Areas especiales, las uniones de aberiura, a través de las cuales, células adyacentes intercambian material. AdemAs, las membranas tarnbihn forman compartimientos especializados dentro de la célula. Estas membranas intracelulares crean numerosas estructuras morfológicamente distinguibles (organelos), por e-jemplo, mitocondrias, retículo endoplismico, reticulo sarcoplásmico, aparato de Golgi, gránulos secretores, lisosomas y la membrana nuclear. Las membranas localizan enzima, funcionan como clernentos integrales en el acoplamiento de la excitacibn y fa respuesta, y proporcionan sitios de transducción de energía, como en la fotosintesis y la fosforilacihn oxidativa.
iones y, por tanto, a todos los procesos celulares. Las deficiencias o trastornos específicos de ciertos componentes de las membranas conducen a diversas enfermedades. Los ejemplos incluyen la ausencia en los lisosomas de alfa glucosidasa, que causa la enfermedad por almacenamiento de gluctigeno tipo 11; la carencia de un transportador de yodo, que origina el bocio congénito (figura 46-2) y la endocitosis anormal de Iipoproteínas de baja densidad que conduce a una hiperco testerulemia acelerada y a enfemedad de arterias coronarias. Es obvio que una funcihn celular normal comienza con la presencia de membranas nomaIes.
LA C O N S E R V A C I ~ NDE UN ENTORNO INTRACELULAR Y EXTRACELULAR NORMAL ES FUNDAMENTAL PARA LA VIDA La vida se origino en un medio acuoso; por tanto, las reacciones enzimiiticas, los procesos celulares y subcelulares y asi sucesivamente, han evolucionado para funcionar en dicho ntedío. Puesto que la mayor parte de los mamíferos viven en un medio gaseoso, Lcbmo se conserva el estado acuoso? Las membranas se ocupan de ello al incorporar y dividir eri cornpartiniientos el agua corporal.
El agua corporal interna esta compartimentalizada
IMPORTANCIA BIOM~DICA Las alteraciones extensas de la estnictura de la membranapueden afectar el equilibrio hidrico y el flujo de
E[ agua constituye cerca de 56% de la masa corporal magra del cuerpo humano (capítulos 2 y 3 ) y está distribuida en dos grandes compartimientos.
j64
Bioquirnica de Hurptr
(Capitulo 43)
A. Liquido intracelular ( L E )
forme el mar cambió gradualmente a una composici6n
Este compartimiento contiene las dos terceras partes del agua total y proporciona el medio para que la célula: 1) genere, almacene y utilice energía; 2) se regenere: 3 ) se replique, y 43 efectúe funciones especiales.
rica en Na' y Ca". Se hubieran reqiierido vastos cambios para evolucionar a un conjunto completamenie nuevo de mecnnicmos bioquimicos y fisiológicos; en su lugar, las células desarrollaron barreras, membranas en combinación con '*bombas", para conservar su microambiente interno.
B. Líquido extracelular (LEC) Este compartimiento tiene un tercio del agua total y se distribuye entre el plasma y los compartimientos intersticiales. El liquido extracelular es un sistema de transferencia. Lleva a la celula nutrientes (por ejemplo, glucosa, ácidos grasos, aminoácidos), oxigeno, varios iones y oligominerales además de diversas rnoleciilas reguladms (hormona) que coordinan las funciones de cklulas alejadas entre si. El liquido extracelular remueve Coz, productos de desecho y materiales tóxicos o destoxificados del entorno inmediato a la celula.
La composición iónica del liquido intracelular difiere bastante de la propia del líquido extracelutar Como se muestra en el cuadro 43-1, el medio interno es rico en K' y Mg2' y el fosfato es su ani6n principal, en danto que el liquido extracelutar se caracteriza por un alto contenido de Na' y Ca2',y de C1- como ani6n principal. Nbtese tambiin que la glucosa se concentra más en el líquido extracelular que en la c.6lula mientras que con las proteínas ocurre lo conmrio. ¿A quC se debe esta diferencia? Se considera que el mar primordial donde se originó la vida era rico en K' y Mg2-, por lo que las reacciones enzimáticas y otros procesos biológicos evolucionaron hacia una función mhs eficaz en ese medio, de aqui las altas concentraciones de estos iones en el interior de las células. Más tarde, las células se enfrentaron con una fuerte presión de seleccibn con-
Cuadro 43-1. Comparaclbn de la conceritracion media de varias sustancias en el exte rior y el inteirior de una céliila de miimlf ero
-
--
.-...
-
m
Sustancia
,iC,Ui""
.
racelular
-
1i
CI-
HCO3P043Glucosa
2.:
CBiuias he@m
ticas de raton
Bastones retinales (bovino)
Eritrocito humano
Células HeLa
Membrana exterior de la rnttocnndria
intr acelular
-7
Cal+ (libre) M$+
Membranas diferentes, entre y en el interior de las células, tienen distin~ascomposiciones como se refleja en el cociente prateínaílipido (figura43-1). Esta diferencia no sorprende debido a las muy diversas funciones de las membranas. Las membranas son eslructuras cerradas semejantes a láminas asimérricas con una siiperficie interior y otra exterior. Estas estructuras laminares ensambladas en forma no covalente, son
1 iyuiuv
Nr
K'
iAS MEMBRANAS SON ESTRUCTURAS COMPLEJAS COMPUESTAS DE L~PIDOS, PROTE~NAS Y CARBOHIDRATOS
O. t
Retículo sarwplásmiw Membrana mitocnndrial interna
t.: 5 mmol/L
1
1
100 mmol/L
Proporcibn de proterna a lipido
27 mmoIi'L 2 mmotk
Figura 43-7. Proporcibn de proteínas a lipidos en membranas distintas. Las proteinas igualan o exceden la cantidad de lipidos en casi todas las membranas. U n a notable excepcibn es la mielina, un aislante eli5ctrico encontrado e n muchas fibras nerviosas.
Memhranm: estructura,
estables desde el punto de vista termodinámico y metabólicnmente activas. Las mol~culasde proteínas específicas estad ancladas en las membranas, donde realizan las funciones especificas del organclo, la cklula o del organismo.
Los lipidos principales en membranas de mamíferos son fosfolípidos, glucoesfingolípidos y colesterol
j65
brósidos y los gangliósidos difieren de la esfingomielina por la fracción adherida al grupo hidroxilo primario de la esfingosina. En la esfingomielina, el grupo alcohol se une a una fosforilcolina. Un cerebrosido contiene una fraccibn única de hexosa, glucosa o galactosa unida en ese sitio. Un ganglihsido contiene una cadena de tres o mas azucares, de los cuales por lo menos uno es acido siálico, adheridos al alcohol primario dc ta esfingosina.
C. Esteroles
A. Fosfolípidos De los dos grupos principales de fosfolipidos presentes en las menihranas, los fosfogliceridos son los mas comunes y están constituidos por Iin esqueleto de glicerol al cual se adhieren en enlace ester dos icidos grasos y un alcohol fosforilado (figura 43-2). Los icidoc grasos constituyentes son, por lo general, molcc~ilasde igual número de carbonos, la mayor pane de las veces contienen 16o 1 8 carbonos. No se ramifican y pueden ser saturados o insaturados. El fosfoglicérido mas sencillo es el Acido fosfatidico, el cual es un 1,2-diacilgliceroI 3-fosfato, un intermedio clave en la formación de todos los demás fosfolipidoc (capitulo 26). En otros fosfolipidos, el fosfato en la posición 3 ect8 estesificado por un alcohol, como etanolamina, colina, serina, glicerol o inositol (capitulo 16). La segunda clase de fosfolípidos son las esfingor mielinas, las cuales contienen un esqueleto de esiingosina en lugar del glicerol. Un Cicido graso se une por un enlace amidico al p p o amino de la esfingosina. El p p o hidroxilo primario de la esfingosina ce esterifica con la fosforilcolina. Las esfingornielinas, como su nombre indica, son abundantes en las vainas de rnielina.
B. Glucoesfingolipidos Los gIucoesfingolípidos son lipidos que contienen azúcares tales como los cerebrosidos y los gangliósidos que también derivan de [a esfingosina. Los cere-
Acidos grados
-Glicerol
ensamble y-funcióti
Almhot
Figura 43-2. Un focfoglicerido que muestra los ácidos grasos (RI y R2), el glicerol y los componentes fosforilados del alcohol En el ácido fosfatidico, R3 es htdrbgeno
E1 esterol más comiin en la membranas es e1 colesterol, el cual existe en forma casi exclusiva en las membranas plasrnitticas de las células de los mamíferos, pero también puede encontrarse en menor cantidad en las mitocondrias, aparato de Golgi y membranas nucleares. Por lo generaI, el colesterol abunda mis hacia la parte externa dc la membrana plasmática. El colesterol se intercala entre los fosfolipidos de la membrana, con su gmpo hidroxilo hacia la interfase acuosa y el resto de la molécula en el interior de la hqjuela. A temperaturas superiores a la de transicirjn (vCase modelo de mosaico fluido, adelante) su anillo rígido de estero1 interactúa con las cadenas acilo de los fosfolipidos, limita su movimiento y, por tanto, disminuye la fluidez de la membrana. Por otra parte, cuando la temperatura se aproxima a la de transición, la interaccion del colesterol con las cadenas acilo interfiere con su alineamiento;este fenómeno abate la temperatuma la cual se produce la transición liquido + gel y ayuda así a conservar fluida la membrana a temperaturas menores.
Las membranas son anfipáticas Todos los lípidos principales de las membranas contienen tanto regiones hidrofilicas como hidrofóbicas y, por tanto, se denominan anfipaticar. De aquí que las membranas tarnbien lo sean. Si la regiones hidrofbbicas fueran separadas del resto de la inolecula, seria insoluble en agua pero soluble en aceite. Por el contrario, si la región hidrofilica estuviera separada del resto de la molécula, sería insoluble en aceite pero soluble en agua. Los lipidos anfipáticos de la membrana tienen una cabeza polar y colas no polares; como se representa en la figura43-3. Los kcidos grasos saturados tienen colas rectas, en tanto los ácidos grasos insaturados que, por lo general, se encuentran en las membranas en la conforrnacibn cis, forman colas plegadas. Mientrac más dobleces estén insertados en las colas, la membrana queda empaquetada menos apretada y por tanto es mas fluida. Los detergentes son moléculac anfiphticas que tienen importancia en bioquimica y en el hogar. La estructura molecular de un detergente no es diferente a la de un fosfolipido. Ciertos detergentes son de amplio uso para disolver las pro-
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Bioquímica de Hurper
(Capitulo 43)
Colas hidrocarbonadas no polares
Figura 43-3.Esquema de un focfollpido u otros Iípidos de membrana El grupo polar de la cabeza es hidrofilico y las colas hidrocarbonadas son hidrofbbicas o lipofilicas. Los ácidos grasos de las mlas son saturados (S) o insaturados (I), los primeros. adheridos, por lo general, al carbono 1 del glicerol y los segundos al carbono 2
teínas de la membrana como paso inicial en su purificación. La terminal hidrofóbica del detergente enlaza con las regiones hidrofbbicas de las proteínas y desplaza la mayoría de los lipidos ligados a ellas. La terminal polar del detergente queda libre y lleva a las proteinas a su soluci0n en forma de complejos detergente-proteina, que por lo general contienen tambidn algunos ipidos residuales.
Los Iípidos membranales están organizados en bicapas El carácter anfiphtico de los fosfolipidos sugiere que las dos regiones de la molécula tienen solubilidades incompatibles; sin embargo, en un solvente como el agua, los fosfolipidos se organizan de manera que satisfacen las condiciones termodiniimicas de ambas regiones. Una micela (figura 4 3 4 ) es una estructura en la que las regiones hidrofbbicas estan protegidas del agua en tanto que los grupos polares hidrofílicos estLn inmersos en el medio acuoso. Como fue reconocido hace cerca de 60 aiíos por Gorter y Grendel, una capa bimolecular o doble capa también puede satisfacer los requerimientos termodinarnicos de las mol~culacanfiplticas en un medio acuoso. Una doble capa existe como una lamina en la cual las regiones hidrofóbicas de los fosfolfpidos estan protegidas del medio acuoso, en tanto que las regiones hidrofilicas están sumergidas en el agua (figura 43-5). Sólo los extremos o bordes de la hoja de doble capa estin expuestos a un ambiente desfavorable, pero aun aquellos bordes expuestos pueden eliminarse doblando la lámina sobre si misma para formar una vesícula cerrada sin bordes. La doble capa cerrada provee una de las funciones esenciales de las rnernbranas. Es impermeable a la mayor parte de las
Figura 4 3 4 . Corte transversal ecquemhtim de una micela. Los grupos polares de las cabezas esthn ballados en agua, en tanto que las colas hidrocarbonadas hrdrofbbicas estAn rcdeadas por otros grupos hidrocarburosy por consiguiente protegidas del agua. Las mlcelas con estructuras esf&icas.
moleculas solubles en agua, ya que dstas no se disolverian en el c e n m hidrofbbico de la doble capa. Inmediatamente surgen dos cuestiones. Primero, ¿cuántos materiales biolbgicos son solubles en lípidos y por tanto pueden enh-ar fácilmente en la célula? Gases como oxigeno, COI y nitrhgeno, que son moléculas pequeiías que muestran escasa interaccihn con los solventes, se difunden con facilidad a través de las regiones hidrofdbicas de la membrana. Las moléculas derivadas de Iípidos, por ejemplo, las hormonas esteroides, atraviesan con facilidad la doble capa. MolCculas orghnicas no electrolíticas exhiben velocidades de
Medio acuoso
Medio acuoso
Figura 43-5. Diagrama del corte de una membrana de dobk capa formada de mol6cufas de fosfolipidos. Las mlas de Acidos grasos insaturados estfin enroscadas y dejan un espacio mayor entre los grupos de las cabezas polares, de aqul que el movimiento es mas fácil (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacibn de Stryer L Biochemistry, 2nd ed. Freeman, 1981 )
Membranas: estrtrcturu, ensamble y&fifncihn * 567
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Coeficiente de permeabilidad (cmlseg) Bajo
Permeabilidad
AI~O,
Figura 4 3 4 . Coeficientes de permeabilidad del agua, de algunos iones y de otras rnol&culas pequeilac en las membranas de doble capa de Iípidos. Las moléculas que se mueven rapidamente, a travbc de una membrana dada, tienen un coeficiente de permeabilidad alto (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacibn de Stryer L 510chemistry, 2nd ed Freeman, 1981 )
difusión que dependen de sus coeficientes de particibn en un medio aceite-agua (figura 4 3 4 ) ; mientras mayor sea la solubilidad de una molécula en los lipidos, rnhs grande es su velocidad de difusi6n a traves de la membrana. La segunda cuestión se refiere a molkculas que no son solubles en Iípidos. ¿Como se conservan los gradientes de concentracibn transrnembrana para las rnoldculas insolubles en lipidos? La respuesta es que las membranas contienen proteínas y éstas también son moléculas anfipa~icasque pueden insertarse en la doble capa de lipidos anfipatica correspondiente. Las protcinas forman conductos para el movimiento de iones y de moléculas pequeiias y sirven como transportadores de moléculas mas grandes que de otro modo no atravesarían la doble capa. Estos procesos se describen adelante.
Las proteinas membranales se relacionan con la bicapa Iipídica Los fosfotípidos de la membrana actúan como un solvente para las proteinas de membranas y crean un medio en el cual las últimas puedan funcionar. De los 20 aminohcidos que contribuyen a la estructura primaria de proteinas, seis poseen p p o s funcionales unidos al carbono alfa que son fuertemente hidrofhbicos, unoscuantos tienen grupos débilmente hidrofbbicoc y e3 resto los poseen hidrofílicos. Como se explica en el capitulo 6 , la estructura de hélice alfa de las proteinas reduce al minimo el carácter hidrofilico de los enlaces peptidicos en ellas. Por tanto, las proteinas pueden ser anfípáticas y formar una parte integral de la membrana por medio de sus regiones hidrofilicas sobresaliendo en las caras internas y externa de la membrana, pero conectadas por una regibn hidrofbbica
que atraviesa el centro hidrofóbico de la doble capa. De hecho, las porciones de las proteinas de membrana que la atraviesan, contienen cifras sustanciales de aminoácidos hidrbfobos y un alto contenido de hélice alfa o de hoja beta plegada. El número de proteína5 diferentes en una membrana varia de 6 a S en el retículo sarcoplismico a más de 100 en la membrana plasrnatica. Las proteínas son: enzimas, proteinas transportadoras, proteinas estntcrurales, antigenos (por ejemplo, para la hictocompatibilidad) y receptores para varias moldculas. Debido a que cada membrana posee un complemento diferente de proteinas, no puede exponerse de una estructura clásica de membrana. Las propiedades enzimhtica de varias membranas diferentes sc muestran en el cuadro 43-2. Las membranas y sus componentes son ectructuras dinámicas. Los lipidos y las proteinas experimentan recambio en las membranas, del mismo modo que les sucede en otros compartimientos de la celula. 1-ípidos diferentes poseen velocidades distintas de recambio y las velocidades de recambio de especies individuales de prateinas de la membrana pueden variar ampliamente. La membrana misma puede experimentar recambio con rapidez aun mayor que cualquiera de sus constituyentes. En la secci6n de Endacitosis se describe con mfis detalle.
Las membranas son estructuras asimétricac Estas pueden atribuirse parcialmente a la distribución irregular de las proteínas en su interior. Una asimetría entre el interior y el exterior es producto de la localizaci6n externa de los carbohidratos unidos a las proteinas de la membrana. Además, enzimas específicas se localizan de modo exclusivo en el exterior o en el interior de las membranas, como sucede en las rnitocondrias y plasmaticas.
Cuadro 43-2. Marcadores enzimhtiicos dle diferentes membranas* -.
.
.
.
. ..
1tidasa Adenilatriciclasa
-
Retículo en do^
Na+/K+-A Glucosa4
Aparato dc GoIgi
Galactosili
TI,---
* I d a membranas contlencn numerosas proteinac, alg:unas dc las cualeg poseen actividad cnzimbtica. Parte de estas cmimas sc .*- -..-A-.. Incali~aiisbto en ciertas membranas y por tariiu ~ ~ U G U L ~ I
utilizarse como marcadores para ahservar fa puriticaci6n de estris rnernbrana~.
En las membranas existen asimetrias regionales. Algunas, como las que se presentan en el borde velloso de las células mucosas, son casi macroscópicamente visibles. Otras. como uniones de abertura, uniones estrechas y sinapsis, ocupan regiones mucho más pequeñas de la membrana y forman de manera correspondiente asimetrias locales más pequeñas. Hay tarnbien asimetría entre el interior y el exterior (transversal) de los fosfolipidos. Los fosfolipidos que contienen colina (focfatidiIcolina y esfingomielina) se ubican principalmente en la capa molecuIar exterior; los aminofosfolipidos (fosfatidilcerina y etanolamina) se localizan de preferencia en la capa interior. Por lo general. el coleskol abunda mas en el exterior que en el interior. Es obvio que si esta asimetría existe en todo, debe haber movilidad transversal limitada (flip-flop) de los fosfolípidos de la membrana. De los fosfolípidns en dobles capas sintéticas exhiben una velocidad extraordinariamente lenta de fltp-flo~;la vida media de la asirnerria puede medirse en diac o semanas. Sin embargo, cuando a ciertas proteínas de !a membrana, como la glucoforina del eritrocito, Se les inserta artificialmente dobles capas sintéticas, la frecuencia del flip-ílop de los fosfolipidos puede aumentar hasta 100 veces. No se comprenden los mecanismos por los que se establece la asimetría lipídica. Las enzimas irnpli-
cadas en la sintesis de fosfolípidos se encuentran en cl lado citoplásmico de las vesículas rnernbranosas microsoni icas. Por tanto, se postu la qiie existen translocasas que transfieren ciertos fosfolipidos de la hojuela interna a la externa. Tarnbien puede haber proteínas especificas que se unan de manera preferente a fosfolipidos individuales en las dos tiojuelas, lo cual contribuye a fa distribución asimdtrica de estas moléculas de lipidos.
Las proteínas membranales son integrales y periféricas (figura 43-7) La mayor parte de las proteínas de membrana son integrales de ésta (interactiian con los fosfolípidos) de hecho que se ernidiado
se extienden sobre todo el intervalo transversal de 5 a O de la doble capa. Estas integralesson por 1, y. e-, sí as, anfipáticas. ~~~á~ constituidas por dos extremos hidrofj]icoS ceparados por una regibn hidrofhbica intermedia que ,t,a,ie,a el cenrro hidrofóbjco de ]a doble Capa. Conforme se han ido identificando las estmctura de proteinas integrales de las membranas, es claro que algunas (de manera notable las moléculas transportadoras), pueden atravesar la doble capa muchas veces, como se ilustra en la figura 43-8.
,,
&,
Cadenas de carbohidratos \
Proteina
Figura 43-7. Modelo de mosaico fluido de la estructura de la membrana La membrana consiste en una capa bimotecular de Iípidoc con proteinas insertadas en ella o unidas a su superficie Las proteínas integrales de membrana están embebidas firmemente en las capas de lipidos Algunas de estas proteínas atraviesan completamente la doble capa y se llaman proteínas transmembrana, en tanto que otras están embebidas en la hojuela exterior o en la interior de la doble capa de lipidos Unidas débilmente a la superficie interna de la membrana están las proteínas perif&ricas.Muchas de las protelnas y los lipidos tienen cadenas de oligosa~ridecexpuestos en la cara externa de la membrana (Reproducida con autorización de Junqueira LC, Carneiro J. Kelly RO. Basic Histology, 7th ed. Appleton & Lange, 1992 )
Membranas:
N
estrzicfura, ensamhle y.funcihn
569
N
CARA
os transportadores ejemplo, para glucosa)
Neuraminidasadel virus de influenza Receptor para asialogluwproteina Receptor para transfernna Cadena invanante HLA-DR
Receptores para insulina y IGF-1
Receptores acoplados a la proteina G
Receptor para LDL Cadena pesada HLAA Hemaglulinina del virus de influenza
Figura 43-8. Variacrones de la forma en que las proteínas se insertan dentro de las membranas. Esta representación esquemhtica, que ilustra cierto numero de orientaciones posibles, muestra la porción del péptido en el interior de la membrana como hélices n y otras porciones como líneas El receptor de LDL, el cual cruza la membrana una vez y tiene su terminal arnino cobre el exterior se denomina una proteína transmernbrana de tipo l. El receptor de asialoglumproteina,que también cruza una vez la membrana pero tiene su terminal carboxilo en el exterior, se denomina proteína transmembrana de tipo II. Los diversos transportes que se indican (por ejemplo, glucosa) cruzan la membrana un cierto número de veces y se denominan proteínastransmembrana tipo III (N, terminal amrno. C, terminal carboxilo.) (Adaptada con autorizacibnde Widtner W,Lodish HF. Multtple mechanisms of protein insertion into and across membranes. Science 1985;230:400. Copyright O 1985 by the American Association for the Advancement of Science )
Las profeinas integrales se distribuyen de manera asimttrica a través de la doble capa de la membrana. A &as se les da su orientación asimétsica al momento de su insercibn en la doble capa de lipidos. La regihn hidrofílica exterior de una proteína anfiphtica, la cual indudablemente se sintetiza dentro de 1a célula, debe atravesar el centro hidrofiibico de la membrana y finalmente colocarse en el lado externo. Los rnecanismos moleciilares de ensamble de las membranas se explican adelante. Las proteínas perifericas no interactúan directamente con los fosfolfpidos en la doble capa y de ahí que no necesiten el usa de detergente para su liberación. Están unidas débilmente a las regiones hidrofílicas de proteinas integrales específicas y pueden Iiberarse mediante untratamiento con soluciones saIinas de alto poder iónico. Por ejemplo. la anquirina, una proteína perifdrica, esth unida a la proteína integral "banda 3" de la membrana eritrocitaria. La espectrina, una estructura del citoesqueleto dentro del eritrocito, está unida a su vez a la anquirina y por tanto desempeña una funci6n importante en el mantenimiento de la forma bicdncava de este. Las mol~culasde inmunoglobulinas en la membrana plasrnhtica de los linfocitos son psoteinas integrales de membrana y pueden libe-
rarse por el desprendimiento de pequerlos fragmentos de la membrana. Muchas moléculas receptoras de hormonas son proteínas integrales y las hormonas polipeptidicas especificas que se fijan a estas molcculas receptoras pueden, por consiguiente, considerarse proteinas periféricac. Las proteínas perifericas, tales como hormonas peptídicas, pueden inclusive organizar la distribucihn de las proteinas integrales, tales como sus receptores, dentro del plano de la doble capa (vkase adelante).
PARA ESTUDIAR LA FUNCIQN MEMBRANAL ES POSIBLE USAR MEMBRANAS ARTIFICIALES Mediante técnicas apropiadas, pueden prepararse sistemas mernbranosos artificiales. Por lo general, &tos consisten en mezclas de uno o m8s fosfolrpidos de origen natural o sintttico, que pueden tratarse (por ejemplo, mediante sonicaciiin moderada) para formar vesiculas esféricas en las cuales los lipidos forman una doble capa. Estas vesiculas, rodeadas por una doble capa de lipidos se denominan liposomas.
5 70
Bioqsthica de Harper
{Capítulo 13)
fue la redistribución rápida y al alar de proteínas integrales especificas de las especies en la membrana plasmatica de una célula hihrida de interespecies. formada por la fusirjn inducida artificialmente,'de dos 1) El contenido de lípidos de las membranas puede celulas progenitoras diferentes. Ulteriormente se ha variar lo que permite el examen sistemhtico de los demostrado que los fosfolipidos tambidn experimentan efectos de la composicibn variable de lipidos sobre una rlipida redistribución en el plano de la membrana. ciertas funciones. Por ejemplo, puede hacerse que Esta difusión dentro del plmo de la membrana, que se las vesiculas estin compuesta únicamente de fosconoce como difusion translacionat, puede ser hasfatidilcolina o, de modo alterno, de mezclas conotante rápida para un fosfolípido; en realidad, dentro cidas de fosfolipidos diferentes, gZucolipidos y del plano de Ia membrana, una moIécula de fosfolípido colesterol. Tambikn pueden variarse las fracciones puede moverse varios rnicrórnetros por segundo. de ácidos grasos de los lípidos utilizados con la Los cambios de fase y por consiguiente la fluidez utilización de lípidos sintéticos de composici6n de las membranas, dependen en alto grado de su comconocida para permitir el examen sistemdtico de posición lipídica. En una doble capa de Iípidos, lac los efectos de la composición de los acidos grasos cadenas hidrofóbicac de ácidos grasos pueden estar sobre ciertas funciones de las membranas (por perfectamente alineada u ordenadas para proporejemplo, de transporte). cionar una estructura bastante rígida. Cuando la tem2) Proteina o enzima5 de membrana purificadas, pueden peratura se eleva, las cadenas del lado hidrofclbico incorporarse a estas vesiculas para valorar qué experimentan una transicion de un estado ordenado a factores (por ejemplo, lipidos específicos o prouno desordenado, tomando una disposicibn fluida o teínas dependientes) requieren las proteínas para muy semejante a un liquido. La temperatura a la cual reconstruir sus funciones. Las investigaciones de la estructura sufre la transicibn de ordenada a desorproteínas purificadas, por ejemplo, la C ~ " / A T P ~ S ~ denada se conoce como "temperatura de transición". del reticulo sarcoplásmico, sugieren en ciertos caLas cadenas de los acidos grasos rnBs saturados y mhs sos, que sblo se necesitan una proteína y un lipido largos muestran temperaturas de transicibn mhs altas, sencillos, para reconstruir una bomba de iones. es decir, se requieren temperaturas mayores para 3) El medio de estos sistemas puede controlarse con aumentar la fluidez de la estructura. Las dobles lirigidez y modificarlo sistematicamente (por ejemgaduras que existen en la configuración cts tienden a plo, las concentraciones de iones). Además los incrementar la fluidez de una doble cepa al reducir la sistemas pueden exponerse a ligandos conocidos si, densidad del empaquetamiento de la cadena lateral sin por ejemplo, los liposomas contienen proteínas disminuir las caracteristicas hidrofobicas (figura 43-3). receptoras especificas. Los fosfolipidos de las membranas celulares, por lo 4) Cuando los liposomas se forman, pueden constituirse general, contienen al menos un hcido graso insaturado, para englobar ciertos compuestos, por ejemplo, cuando menos con una doble ligadura cis. medicamentos y genes aislados. Hay interés en El colesterol actúa en las membranas como una utilizar los liposomas para distribuir rnedicamenmolecula moderadora y produce estados intermetos a determinados tejidos, y si los componentes (por ejemplo, anticuerpos contra ciertas rnol~culas diarios de fluidez. Si las cadenas laterales acilo existen en una fase desordenada, el colesterol tendrá, un efecto de la superficie celular) pudieran incorpomrse a de condensación; si las cadenas laterales acilo están liposomas, de modo que se lec dirigiera a tejidos o ordenadas o en una fase cristalina, el colesterol inducir& tumores específicos, el impacto terapéutico podría desorden. En proporciones elevadas de colesterol/fosser considerable. Al parecer, el DNA englobado folipidos, las temperaturas de transicibn son enterapor liposomas es menos sensible al ataque de nucleasas, esta aproximacibn puede probar su utilidad mente suprimidas. en los estudios de ta terapbutica gdnica. La fluidez de una membrana tiene efectos significativos sobre sus funciones. Cuando su fluidez aumenta, también lo hace su permeabilidad al agua y a otras moléculas hidrbfobas pequeñas. La movilidad LAS MEMBRANAS FUNCIONALES lateral de las proteínas integrales aumenta al mismo CONTIENEN PROTE~NASrNTEGRALES tiempo que la fluidez. Si el sitio activo de una proteina GLOBULARES DlSPf RSAS EN UNA integral involucrada en alguna función dada, reside MATRIZ FQSFOLIP~DICAL~QUIDA exclusivamente en sus regiones hidrofilicas, el c m bío de la fluidez lipídica probablemente tendrh un Este modelo de mosaico líquido para la estructura de pequeño efecto cobre la actividad de la proteina; sin embargo, si la proteina interviene en una funcihn de la membrana fue propuesto en 1972 por Singer y transporte en la cual los componentes de transporte Nicolson (fip43-7). La primera prueba parael modelo, Algunas ventajas y usos de los sistemas membranosos artificiales en el estudio de la función de la mem bsana, se describen a continuación:
Membranas: esrrticfuru,ensamble yfinción
atraviesan la membrana, los cambios de la fase lipidica pueden alterar de modo significativo la velocidad de transporte. El receptor de insulina es un ejemplo excelente de función alterada con cambios en la fluidez (capítulo 51). A medida que la concentracibn de hcidos grasos insaturados en la membrana aumenta (por proliferación de cklulas cultivadas en un medio rico en tales moltrculas), la fliiidez tambien aumenta. Esto altera al receptor por lo que fija una cantidad mayor de insulina. Un estado de fluidez, y por tanto de movilidad translacional en una membrana, puede estar confinado a ciertas regiones de la membrana bajo ciertas circunstancias. Por ejemplo, es posible que la interaccion entre una proteina y otra tenga lugar dentro del plano de la membrana de manera tal que las proteinas integrales formen una matriz rigida, en contraposicibn a las situación más comUn en la que los lipidos actúan como la matriz. En una misma membrana pueden existir tales regiones con matriz rigida de proteínas, lado a lado junto con las habituales de matriz lipidica. Las uniones de abertura, uniones estrechas y regiones que contienen bacteriorrodopsina de las membranas p6rpura de las halobacterias son ejemplos claros de la coexistencia lado a lado, de diferentes matrices. Algunas de las interacciones proteína a proteína que tienen lugar dentro del plano de la membrana pueden ser mediadas por proteinas perifkricac de interconexibn como los anticuerpos de enlace cni;rado o las lectinm que se conocen por remendar o poner tapas cobre la superficie de las membranas. De este modo, las proteinas p e r i f d r i c ~ ,mediante sus adherencia~especificas, pueden restringir la movilidad de las proteinas integrales dentro de la membrana.
EL ENSAMBLE DE LAS MEMBRANAS ES COMPLEJO Existen muchas membranas celulares y cada una tiene caracteristicas específicas. No se tiene disponible un esquema satisfactorio del ensamble de cualquiera de las membranas. En esta secci6n se describen las ireas de mayor progreso a partir de las cuales se espera puedan surgir modelos coherentes del ensamble de la membrana. En tales modelos deben considerarse tanto a las proteinas como a los lípidos. Las menciones a estos últimos son breves ya que poco se conoce acerca de c6mo se ensamblan en el interior de las membranas.
Durante el ensamble de la membrana se conserva la asimetría tanto de proteinas como de Iípidos Sea que se retiren de manera natural o por homogeneizacion, las vesiculas que se forman a partir de las
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membranas del reticulo endoplásmico y del aparato de Golgi, muestran asirnetrías transversales tanto en lipidos como en proteinas, mismas que se conservan durante !a fusión de las vesiculas de transporte con la membrana plasmatica. Después de la fusion, la parte interna de la vesícula se convierte en la parte externa de la membrana y el lado citopl8smico de la vesícula permanece como el lado citoplAsmico de la membrana (figura 43-9). Puesto que la asimetría transversal de las membranas existe en las vesiculas del retículo endoplAsmico desde bastante antes de su fusión con la membrana plasmktica, el problema principal en el ensamble de las membranas viene a ser la comprension de cómo las proteína integmles se insertan en el interior de la bicapa de Iipidos del reticulo endoplhsmico. Los fosfolipidos son la clase principal de lípidos en las membranas. Las enzimas responsables de su sintesis residen en la superficie citoplhmica de las cisternas del retículo endop!ásmico. Toda vez que los fosfolipidos se sintetizan en este lugar, es probable su autoensamble en el interior de la bicapa que es termodinamicamente estable y de esta manera expanden la membrana y promueven el desprendimiento de las denominadas vesiculas de lipidosde ella. Se ha propuesto que estas vesiculas donan sus lipidos a otras membranas al desplazarse a otros sitios; sin embargo, poco se conme sobre esto. Se conocen bien las proteínas citosolicas que captan fosfolfpidos de una membrana y los liberan en o t a (pr ejemplo, las proteinas de recambio de lipidos); es probable que d e s e m F e n alguna funcibn como contribuyentes a la confomacion de Iípidos especificas de varias membranas.
Muchas proteínas se conducen a su destino correcto mediante secuencias de señal
Las vías de la biosintesis celular de las proteínas puede considerarse como un gran sistema clasificador. Muchas proteínas portan sehales (por lo general, pero no siempre, secuencias especificas de arninohcidos) que las conducen a su destino, con lo que se asegura lleguen a la membrana o compartimiento celular correctos; estas sefíales son el componente fundamental del sistema clasificador. La principal decisibn de clasificaci6n se efectúa temprano en la biosíntesis de la proteína, cuando se sintetizan proteinas específicas a partir de polirribosomas, ya sea libres o ligados a la membrana. Esto da lugar a dos ramas de clasificación denominadas, respectivamente, la rama citos6tica y la rama del retículo endoplasmico rugoso (figura 43-1 0). Esta clasificac i ~ nse presenta en raz6n de que las proteinas sintetizadas por los polirribosornas ligados a la membrana contienen un peptido seña[ que media su adhesi6n a la membrana del retículo endoplásmico. Mas adelante
(Capítulo 43)
Protelna membrana1 i
j:
d,''
,r
.< '
-
Superficie exterior
.....
-.
/ -L
,,
- ,--, <.-.
,-
Proteínas
(1) Citosol
Mfiocondriales Nucleares Peroxisómicas Citos6licas
(2) RE rugoso
Membrana del RE Membrana del AG Membrana piasmatica Secretorias Enzimas Iisosbmicas
-
Polirribosomas plasrnBtica Citoplasma
vesicular
Figura 43-9. La fusión de una vesícula con la membrana plasrnática conserva la orientacibn de cuarquier proteina integral embebida en la doble capa de la vesícula. Inicialmente el extremo amino-terminalde la proteina estii hacia el lumen o cavidad interior de una vesícula. Despueis de la fusibn, el extremo amino-terminal se aprecia sobre la superficie exterior de la membrana plasmática. Que la orientaci~n de la protelna no se ha invertido puede percibirse por la observacdn de que el otro extremo de la molBcula, el carboxilo-terminal, siempre estfi sumergido en el citoplasma. El lumen de una vesiwla y el exterior de la célula son topológicarnente equivalentes. (Redibujada y modificada con autorizacidn de Lodish HF, Rothman JE. The assembly of mll mernbranec Sci Am [Jan] f979,240 43.)
/ \
Figura 43-10. Representación esquemática de las dos ramas de clasificación de proteinas que acontece durante la sintesis en: 1) el citosol y 2 ) los polirribosomas enlazados a la membrana. Las proteinas mitocondriales que se listan se codifican por genes nucleares. l a s señales que se wtilizan en la clasificacibn subsecuente de la mayor parte de estas proteínas se muestra en el cuadro 43-9. (Re, retículo endoplAsrnico; AG, aparato de Golgi )
se proporcionan otros detalles sobre el peptido ceíial. Las proteínas sintetizadas en los polirribosomas libres carecen de este péptido sefial y se entregan en el citosol y se conducen a la mitocondria. el núcleo y los peroxisomas por señales especificas, o bien permanecen en el citosol si carecen de cualquier seiial. En las protehas sintetizadas y clasifícadas en la rama del retículo endoplasmico (figura 43-1 1 ) se incluyen muchas destinadas a diversas membranas (por ejemplo, del reticu!o endoplhsmico, del aparato de Golgi, lisosomas y membrana plasmhtica) y a su secreción. También se incluyen las enzimas lisosomicas. Por tanto, tales proteinas pueden residir en la membrana o en el lumen del retículo endoplásrníco o seguir la ruta principal de transporte de Ias proteínas intracelulares al aparato de Golgi. En éste se presenta en seguida la clasificacion mediada por seiIal de ciertas proteinas que resulta en su entrega a tos lisosomas, membrana del aparato de Golgi y a otros sitios. Las proteinas con destino a la membrana plasmh~icao para secrecihn, pasan al través del aparato de Golgi pero, por lo general no portan seaales de clasificaci6n especifica y alcanzan su destino por omisibn. La via completa del reticulo endoplhsmico -, aparato de Golgi + membrana plasrnAtica a menudo se denomina la vía secretora o exocit6cica. A los eventos a lo largo de ella se les da atención especial. La mayoria de las proteinas que alcanzan el aparato de Solgi o la membrana plasrnatica se llevan en vesiculas de transporte; mAs adelante se da una breve descripción de estas partículas tan importantes. Otras proteinas destinadas a la secreción se transportan en vecicu~assecretoras (figura 43-1 11,mismas que abundan en el pancreas y ciertas glhdulas. Se regulan su
nuclear
Figura 43-11. Representacibn esquem8ttca de las ramas de clasificadede proteínasdel reticulo endoptásmim. Las proteinas de reciente sintesis se insertan en la membrana o en el lumen del reticulo endoplásmiw a partir de polirribosomac enlazados a la membrana (círculos negros pequenos que tachonan la cara citocblica del reticulo endopldsmiw) Las proteínas que se transportanfuera del reticulo endoplásmica (flechas continuas)lo hacen desde los ribosomas translcionales de los ribosomas libres. Tales proteinas pueden pasar en seguida a ZravBs de diversos subcompartimientos del aparato de Gofgr hasta que llegan al TGN, el lado de salida del aparato de Golgi. En el TCN Is proteínas se secretan y clasifican Las proteinas secretoras se almacenan en los gránulos secretores desde donde se expelen como se muestra en la parte superior derecha de la figura Las proteinas con destina a la membrana plasm8tica o las que se secretan de manera constitutiva, se transportan fuera de la célula en vesiculas de transporte como se muestra en la parte media superior de la figura Algunas proteinas pueden llegar a la cuperficre celular por la vía de los endosornas temprano y tardio Otras proteinas entran a los prelisocomas (endocomas tardíos) y se transfieren selectivamente a los lisosomas. La vía endocitica que se ilustra en la parte superior izquierda de la figura se describe en este capitulo, En el esquema no se considera el regreso al reticulo endoplásmico desde el aparato de Golgi. (CGN, red c i s del aparato de Golgi, TGN, red trans del aparato de Golgi Cortesía de E Degen )
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Biquimica de Harper
movilización y descarga y a menudo se mencionan como "secrecidn regulada", en tanto que la vía secretora que implica vesiculas de transporte se denomina h'constitutiva". A continuación se describe la clasificacion de las proteínas de la rama citosólica que se menciona antes.
El mitocondrion importa y sintetiza proteínas La mitocondria contiene muchas proteínas. El genorna mitocondrial codifica 13 proteinas (cuadro 64-3) las cuales se sintetizan en dicho organelo mediante su propio sistema de síntesis proteínica. Sin embargo, la mayoría se codifican por genes nucleares y deben importarse ya que se sintetizan fuera de la rnitocondria en los poIirribosomas citoslilicos. Las células de levadura demuestran ser un sistema particularmente útil para el anilisis de los mecanismos de importacion de tales proteínas mitocondriales, en parte por su capacidad para producirmutantes que han aclarado el proceso fundamental. La mayoría del avance se ha realizado en el estudio de las proteinas presentes en la matriz mitocondrial, como son las subunidades FI de la ATPasa. Estas proteinas deben pasar a traves de las membranas interna y externa de la mitocondria para llegar a su destino y la traslocaciOn sucede en los sitios en donde estas membranas entran en contacto (sitios de contacto de traslocación). Tienen una secuencia arninoácido terminal líder (presecuencia), de hasta 70 aminohcidos de longitud, la cual no es siempre igual pero contiene muchos aminoacidos con carga positiva (por ejemplo, Lis o Arg). Esta secuencia equivale a un peptido seaal que dirige a estas proteinas al interior de la matriz; si se retira la secuencia líder las proteínas no entran. Existen receptores para estas proteínas en la superficie de la membrana externa mitocondrial y su importacibn la permiten conductos recubiertos de proteinas en ambas membranas. Las pruebas indican que las proteínas deben estar en el estado desdoblado para pasar a travds de las membranas,lo cual se posibilita por enlaces dependientes de ATP a diversas proteinas chaperonas, una de las cuales se parece a una que se encuentra en el lumen del retículo endoplasmico, BiP (vease antes). La función de las proteínas chaperonas en el doblado de las proteínas se presenta despues en este capítulo. Para ta importación se requiere una fuerza de motivo o f a c t o ~ de protdn a travks de la membrana interna; esto se logra con el potencial eléctrico a través de la membrana (interior negativo) y la gradiente del pH (capitulo 14). Es posible que la secuencia líder con carga positiva reciba la ayuda, a travds de la membrana, de la carga negativa en la matriz. La presecuencia se separa mediante una metaloproteinasa presente en la matriz. Es esencial el contacto con otras dos
chaperonas presentes en la matriz para completar todo el proceso de importación. La interaccion con hsp70 (hsp = "proteina de golpe de calor"), otra proteína semejante a BiP, asegura la irnportaci6n adecuada al interior de la matriz y evita la agregación o doblez equivocado, en tanto que la interacción con hspól) asegura el doblado correcto. Esta ultima en una proteina niuy compleja y semeja la chaperona bacteriana denominada "GroEL". Las interacciones de las proteínas importadas con ambas chaperonas requiere hidrólisis de ATP para su conducción. Para conducir proteinac a la membrana interna y al espacio intermembrana se requieren pasos adicionales. Ciertas proteinas mitocondriales no contienen presecuencias asi que emplean diversos mecanismos y rutas para introducirse a [a mitocondria.
Las proteínas nucleares y peroxisómicas también contienen secuencias de señal Los poros nucleares permiten el paso de proteínas de tamafío pequefio, pero las proteinas mas grandes (cerca de 60 kDa o más) requieren seiiales especiales denominadas seiiales de localización nuclear (SLN). Estas secuencias tienen estructuras diversas, no requieren presentarse en la terminal m i n o y no se retiran. Las proteinas nucleares interacnjan con las chaperonas del citosol antes de la interacción con los receptores de los poros nucleares. Se conoce relativamente poco de los detalles de esta importación, excepto que es dependiente de energía. Muchas protehas peroxisórnicas (capitulas 13 y 24) contienen una seKal conductora peroxisómica (SCP) en su terminal carboxilo. Una secuencia frecuente es Ser-Lis-Leu. En la membrana peroxisbmica se Iocalimn receptores de proteinas y también hay proteinas intemas implicadas en el transporte de las proteínas importadas al interior de la matriz. Los estudios del síndrome de Zellweget han aclarado esta cuestibn. Este padecimiento es aparente al nacimiento y se caracteri7a por una profunda incapacidad neuroldgica; los pacientes, por lo general, fallecen dentro del primer a80 despds del nacimiento. Mediante microscopia elec&bnica los peroxisomac se encuentran vacíos, carentes de su contenido normal en la matriz; las membranas son en apariencia normales. En el nivel bioquímico hay acumulacibn de hcidos grasos de cadena muy larga, anormatidades de la sintesis de Acidoc biliares y una notable reducción en plasmalogenos; todos ellos reflejan la incapacidad de las funciones peroxisómicas. El defecto básico es la insuficiencia para importar proteinas peroxisbmicas al interior de la matriz. Con base en estudios geneticos se sugiere que estan implicados cerca de 13 genes en la importaci6n peroxisbmica. Se ha clonado un factor de ensamble
Membranas: estruclura. ensatnbke v fur-iciún
peroxis6mico mismo que se relaciona con la glucoproteína P (capitulo 62) y es por si mismo una proteina de transporte. Están bajo investigación varios regímenes dietéticos, en los cuales la cantidad de diversos lipidos se ajustan con cuidado, como tratamiento del síndrome de Zellweger y de otras anormalidades en estrecha relación con la función peroxisórnica (pos ejemplo. suprarrrnoleucodistrofia neonatal, enfermedad infantil de Refsum y acidernia hiperpipecólica). Al parecer. la proteína afectada en la suprarrenoleucodistrofia ligada a X es el transportador responsable de la captación de la acil-COA sintasa de los bcidos grasos de cadena larga dentro de los peroxicomas. El padecimiento se caracteriza par atrofia suprarrenal y desmielinización difusa del cerebro, la que resulta en daiío neurológico ampliamente diseminado y fallecimiento en edad temprana.
La hipótesis de la señal explica cómo se enlazan los polirribosomas al retículo endoplásrnico Como se señala antes. la rama del reticulo endo~lásmico rugoso es la segunda de las dos ramas que en la ~lasificacionde las proteinas. En esta rama las proteinas se sintetizan sobre los ribosornas ligados a la membrana y se translocan al lumen del retículo endoplásrnico previo a su clasificacibn ulterior (figura 43-1 1 ). La hipótesis de la seaal se propuso por Blobel y Sabatini para explicar, al menos en parte, la distinción entre polirribosomas libres y enlazados a la membrana. Encontraron que las proteinas sintetizadas en polirribosomas ligados a la membrana contienen una extension p&ptida (péptido seííal) en sus teminalec arnino que media su adhesi6n a la membrana del reticulo endoplásm ico. Como ya se expuso, las proteinas cuya síntesis completa acontece en polirribosornas libres carecen de este péptido sefíal. Un aspecto imponante de la hipbtesis de la sefial es que sugiere, y asi resulta ser el caso, que todos los ribosomas tienen la misma estructura y que la distincibn entre los ligados a la membrana y los libres depende tan solo en que los últimos llevan proteínas que tienen pkptido seflal. Muchas pruebas confirman la hipótesis original. Ya que en los polirribosomas ligados a la membrana se sintetizan muchas proteinas de membrana, la hipótesis de la seilal desempefia una funcion importante en los conceptos sobre el ensamble de la membrana. En el cuadro 43-3 se resumen algunas caracteristicas de los pdptidos seiial. En la figura 43-1 2 se muestran las características principales en relación con el paso de las proteinas de secreción a travts de la membrana del reticulo endoplhmico. Incorpora caracteristicas de la hip6tesis de seaal original y de trabajos subsecuentes. El
5 75
Cuadro 43-3. Atgunas propiedades de péptidos sefial
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mpre. se ulaican cn N . , ., .* .,Contienen aireacaor ae I L a 33 arninoaciao! R n, inctionina es el aminoácido N C n racimo central de a1ninoicido: C orlo mcnoc un aminoácido con E ,,# su extremo arnino En gcncrai se escinden en el cxtrr:mo carboi - siduo por "- una peptidaqa sehal - .-
E
hpA,,JJu
mRNA para dicha proteina codifica un péptido sena! en la terminal arnino (tambien denominada secuencia lider, inserción transitoria de señal, secuencia de sefial o presecuencia). La hipótesis de la seflal propone que la proteína se inserta en el interior de la membrana del reticulo endoplasmico al mismo tiempo que su mRNA se traslada sobre el polirribosorna, en lo que se denomina inserción cotranslacional. Como el pkptido seiial surge de la subunidad larga del ribosoma, se reconoce por una particula de reconocimiento de seflal (PRS}, que impide la translación subsecuente hasta que se polirnerizan cerca de 70 aminoácidos (40 se queman en la subunidad rihosbmica larga y 30 expuestos). El impedimento se refiere como represión de la elongación. La PRS contiene seis proteínas y tiene un RNA 7S acompaflante que se relaciona de manera estrecha con la familia Alu de las secuencias muy repetidas del DNA (capítulo 38). El bloqueo impuesto por la PRS no se retira hasta que el complejo PRS-pkptido seaal-polirribosoma se enlaza a la proteína denominada protelna dique (un receptor para el PRS) sobre la membrana del reticulo endoplásmico; en seguida la PRS guia al péptido seiial a su receptor en la membrana del retículo endopllismico y evita el doblez prematuro y la expulsibn de la proteína que se esth sintetizando en el citosol. El receptor para la PRS es una protelna integrante de la membrana compuesta de subunidades alfa y beta. La subunidad alfa enlaza GDP.Cuando e[ complejo SRP-pdptido seaal interactúa con el receptor, se estimula el recambio de GDP por GTP. Esta modalidad del receptor (con el enlace de G W ) tiene una afinidad grande por la PRS y en seguida libera al péptido sefíal, el cual se enlazaal mecanismo detranslocaci6n, también presente en la membrana del retículo endoplismico. La subunidad alfa hidroliza entonces su enlace GTP, restaura el GDP y completa el ciclo GTP-GDP. La unidireccionaljdad de este ciclo ayuda a conducir la interacción del polirribosoma y su pkptido sefial con la membrana del reticulo endoplismico en la direccibn anterograda. El mecanismo de translocacion consta de varias proteínas de membrana que es probable formen un
3'
Codones de la sehal
Pbptido de la seilal
Pepttdasa de la señal
I Receptor ribosbmiw
A Receptor de la sefial
Figura 43-12. Diagrama de la hipbtesis de la señal para el transporte de proteínas secretadas a iravbs de la membrana del reticulo endoplásmica. Los ribosornas que sintetizan una proteína se mueven junto con el RNA mensajero que especifica la secuencia de arninoaudos de la proteína. (El mensajero se representa por la línea enire 5' y 3' ) El codon AUG marca el comienzo del mensale para la proteina, las líneas sombreadas que siguen a AUG representanloscodones para la secuencia de la seAaL Conforme la proteína crece fuera de la subunidad mayor del ribosoma, la secuencia de seilal se expone y se liga por la particula de reconocimiento de la señal (PRS). Se bloquea la traduccibn hasta que el complejo se une a la "proieina de anclaie" Irenresentada aor una barra sblida) cobre la membrana del reticulo endonlasmico. Existe tambien un recentor (barra ciaraj para el proplo rib'osoma. La interaccion del ribosoma y la cadena peptidica en crecimiento con la membrana del r~ticulo endoplásmico origina que se abra un poro a traves del cual la proteina se transporta al espacio interior del retículo endopl~smico.Durante el transporte, la secuencia de ceno! de la mayor parte de las proteínas se elimina por una enzima llamada peptidasa de la señal. Por ultimo, la proteina terminada se libera por el ribosoma, el cual entonces se separa en sus dos componentes, las subunidades mayor y menor del ribosoma. La proteina concluye en el interior del retículo endopl8smico. (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacibn de: Marx JL: Newly made proteins zip through the cell Science 1980;207:154 Copyright O 1980 by the Arnerican Association for the Advancement of Science.)
canal conductor de proteina en la membrana del reticulo endopl;ísmíco a través del cual puede pasar la proteína recikn formada. Al parecer el caria1 sólo esta abierto cuando se presenta el péptido señal, lo que evita la conductancia al través de la membrana del RE mientras permanece cerrado. La inserción del péptido señal en el interior del canal conductor, mientras la otra terminal de la proteína progenitora permanece adherida a los ribosomas, se denomina "insercion cotranslacional". El proceso de elongacidn de la porci6n remanente de la proteina es probable que facilite el paso de la proteína naciente a través de la bicapa lipidica en tanto el ribosoma permanece adherido a la membrana del retículo endoplhsmico. Por tanto, se forma el reticulo endoplásmico rugoso (o tachonado de ribosomas). Es importante que la proteína se mantenga en un estado desdoblado mientras pasa por el conducto, de lo contrario puede no hacer el cruce. Los ribosomas permanecen adheridos al retículo endoplhsmico duranle la sintesis de la proteína de membrana pero se liberan y disocian en sus dos tipos de unidades cuando se completa el proceso. El péptido sefíal se hidroliza por sefial peptidasa (figura 43-12); pero su destino preciso no está establecido.
El citocromo P450 (capitulo 61), una proteina integrante de la membrana del retículo cndoplasmico, no cruza por completo la membrana. Por el contrario, reside en la membrana con su pbptido señal intacto. Se evita su paso al través de la membrana por una secuencia de am inoacidos denominada sefíal de detencion, o de paro, de transferencia. Las psoteinas secretoras y las proteínas destinadas a membranas distantes del retículo endoplasmico atraviesan por completo la membrana bicapa y descargan en el interior del reticulo endopljcmico. Si están presentes se agregan cadenas de N-glucano (capítulo 56) conforme estas proteínas atraviesan la parte interior de la membrana del reticulo endoplismico, proceso que se denomina "glucosilación cotransIacional", Subsecuentemente las proteínas se localizan en el lumen del aparato de Golgi, en donde acontecen en seguida cambios en la cadena de glucanos [figura 56-9) previos a su distribucihn intracelular o secrecidn. Existen bastantes pruebas de que el péptido seRal participa en el proceso de insercion de la proteina en el interior de las membranas del retículo endaplhsmico. Las proceinac mutantes que contienen peptido seilal modificado a1 cual se le remplaza un aminohcido hidrofbbico por uno hidrofflico,
.Membranas: e.TtrucEura, ensamble y función
n o se insertan en el interior de las membranas del retículo endoplásmico. Las proteinas no dc mcrnbrana (por ejemplo, alfa globina) a las cuales se les adhiere un peptido señal por ingeniería genitica, piieden insertarse en el lumen del retículo endopllsmico y hasta cecretarse.
Las proteínas siguen varias rutas para su inserción en el interior de, o adhesión a, las membranas del retículo endoplasrnico Las rutas que sigiien las proteínas para su insercion dentro de las membranas del reticulo endoplásmico incluyen las siguientes:
p. Inserción cotranslacionai En la figura 43-8 se muestran diversas vías para 1s disposición de las proteínas en la membrana plasmática. En particular las terminales arnino de ciertas proteinas (por ejemplo, receptor de LDI,) puede verse que están sobre la cara extracitoplasmatica, en tanto que para otras proteínas (por ejemplo, el receptor de asialoglucoproteina), son las terminales carboxilo las que están sobre esta cara. Para explicar esta disposicibn se deben considerar los eventos del inicio de la biosíntesis en la membrana del retículo endopl6smico. El receptor de LDL entra en la membrana del retículo endoplásmico de manera análoga a una proteina secrctora (figura 43-1 2); atraviesa parcialmente la membrana, su péptido señal está unido y su terminal amino protuye al interior del lumen. Sin embargo, se retiene en la membrana porque contiene un segmento muy hidrofóbico que detiene, o para, la seRal de transferencia. Esta secuencia constituye el linico segmento transmernbrana y es su dominio de anclaje a la membrana. La pequefia porción de la membrana del retículo endoplasmico en el cual se localiza el recien sintetizado receptor de LDL en seguida brota como un componente de una vesícula de transporte, probablemente a partir de elementos transicionaies del retículo endopllisrnico (figura 43-1 1). Como se expone antes en la descripción de la asimetría de las protcinas y los lípidos en e1 ensamble de la membrana, la disposición del receptor en la membrana del reticulo endoplásmico se conserva en la vesicula, !a cual al final se funde con la membrana plasmática. En contraste, el receptor de asialo;lucoproteina posee una secuencia interna de inserción la cual se inserta dentro de la membrana pero no se separa. Esto sirve como ancla y su terminal carboxilo se expulsa al través de la membrana. La disposición rnhs compleja de los wansportadores (por ejemplo, para glucosa) puede explicarse por el hecho de que las alternancias de alfa hélices actúan, respectivamente, como secuencias de insercion no unidas y como seÍíales de paro de transfcrencia.
j77
Cada par de segmentos helicoidades ce inserta como una horquilla para el cabello. Las secuencias q ~ i c determinan la estructura de una proteina en una membrana se denominan secuencias topogenicas. Como se explica en la Ieyenda de la figura-43-8, las proteinas que se muestran son ejemplos de proteinas transmembranadetipo I. II y 111.
B. Sintesis en los polirribasomas libres y adhesión subsecuente a la membrana del retículo endoplásmico Un e,jemplo es el citocromo hs. C. Retención en la cara iuminal del retículo endoplásmico por secuencias específicas de aminoácidos Varias proteínas posccn la sccucncia de aminoácidos KDEL (Lis-Asp-Glu-Ceu) en su terminal carboxilo. Esta secuencia específica que tales proteínas deben adherirse a la rara interna del reticulo endoplAsmico de manera relativamente desligada. La chaperona RiP {véase adelante) es una de tales proteínas.
D. Transporte retrógrado desde el aparato de Golgi Ciertas proteinas con destino a la membrana del reticulo endoplasmico pueden pasar al aparato de Golgi y en seguida regresar, por transporte vesiculr retrbgrado, al retículo endoplhsrnica para su inserción en él. t o s párrafos precedentes muestran que en el ensamble de las proteinas de las membranas del retículo endoplfismico participan diversas rutas; es probable que se dk una situación similar para otras membranas (por ejemplo, membranas mitocondriales y membrana plasmhtica). Estan identificadas sólo unas pocas secuencias precisas de destino de los mecanismos descritos (por ejemplo, secuencias KDEL). Esta demostrado que la vida media de los Iípidos de las membranas del retículo endoplAcmico del higado de la rata son, por lo general, más cortas que las dc las proteinas, así que las tasas de retorno de lipidos y proteínas son independientes. De hecho, diferentes Iípidos muestran diferentes vidas medias. Mlis aún, las vidas medias de las proteinas de estas membranas varian bastante, algunas manifiestan vidas cortas (horas) y otras largas (días). Por tanto, a! parecer los lipidos y proteínas individuales de estas membranas se insertan en ella con independencia relativa.
Las proteínas se mueven a través de compartimientos celulares hacia membranas específicas En la figura 43-13 se muestra un esquema representativo del posible flujo a lo largo de la ruta retículo endoplasmico + aparato de Golgi -7 membrana plas-
578 * Bioquimica de Harper
(Capíttrlo 43)
-
RE
Goigi CIS
14
-
-3
-
Gblgi
medio
Grrlgi
mns
-
Superficie celular
0
fl)-
tS
Vesículas de almacenaje secretoras Figura 43-1 3. Flujo de las protelnas membranales del RE a la superficie celular. Las flechas horizontales indican etapas que se han propuesto para ser senaladas en forma independiente y por tanto, representan el flujo masivo. Las flechas verticales vacias en los rectángulosindicadosmuestran retención de proteínasque residen en las membranas del organeio indicado Las flechas verticales vacias en el exterior de los rectángulrw indican transporte mediado por sefial a Iisosomas y gránulos secretores de almacenaje. (Reproducidacon autoriracibn de Pfeffer SR, Rothman JE: Biosynthetrcproteintransport and sorting by the endaplasmic reticulum and Golgi. Annu Rev Biochem 1987;56:829.)
mática. Las flechas horizontales denotan pasos de t m s porte que pueden ser independientes de las seaales de destino, en tanto las flechas verticales abiertas representan pasos que dependen de señales especificas. Asi, el flujo de ciertas protelnas de membrana desde el reticulo endoplasmico a la membrana plasmitica (designado como "flujo en volumen" ya que no es selectivo) es probable que acontezca sin 1a implicacibn de secuencias de destino; por ejemplo, por omision. Por otra parte, la insercidn de proteinas residentes en e1 interior de las membranas del retícuro endoplIrsmjco y del apatnatode Golgi depende de seaales específicas (por ejemplo, KDEL o secuencias de paro de transferencia por el reticulo endoplhsmico). De manera similar, el transporte de muchas enzimas a los lisosomas depende de la señal de la Man 6-P (capitulo 56) y puede que se implique a una sefial para la entrada de las proteinas al interior de los grfinulos secretarios. El cuadro 43-4 resume la información sobre las secuencias que se conocen implicadas en el direccionamiento de diversas proteinas a sus sitios intraceluiares adecuados.
Las c haperonas son proteínas que evitan el doblez defectuoso y las interaccionec improductivas con otras proteínas La salida desde el retfculo endopEAsmico puede ser el paso limitante de la velocidad en las vías secretoras. En este contexto, se encuentra que ciertas proteinas desernpefían una función en el ensamble o doblez adecuado de otras proteinas sin que las primeras sean componentes de estas últimas. A tales proteinas se les denomina proteinas chaperonas; un grupo de propiedades importantes de éstas se muestra en el cuadro 43-5 y el nombre de algunas de particular importancia en el retículo endoplasmico se listan en el cuadro 4 3 4 . Fundamentalmente estabilizan intermedios no plegados o parcialmente plegados dándoles tiempo para su plegamiento adecuado y evitan interacciones inapropiadas, con lo que combaten la formación de es:unas propiedades de las ias chaperonas
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Cuadro 4 3 4 . Secuencias o compuestos que i protelnz1s a orgarlelos espectficos .
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n r ~ a n e l oblanco
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SÍ :ptídica de señal rrminal S St srboxilo-t~ K U t L ( L iS-Asp-Glu*Leii)
Secuencia N-terminal (rcgibn kiroconaria positiva con 70 residuos) Secuencias arninoacidicas bfisicas, cortas Manosa-6-fosfato
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uina PLIICllia gama de
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especies CILJUC
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hasta hurnanos 1Muchas tatnbitn se clenominarI proteinas e :alor (hsp) .. . ~ i g u n a se s inaucen por siruaciones que proaucen no plegamiento de 1 sproieínaqrecien formadas (por cj ern plo. temperaturas elevadas y varia
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a o compu irectrix
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Mernbranus: estrucruru, ensamble y funcrdn
Cuadro 4 3 4 . Algunas chaperonas y enzimas ; en el plegamiento que se localizan en el retículo endoplhsmico
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579
Las vesículas de transporte son participantes clave en el transito proteínico intracelulai
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Bip(protcina fijadora de inrnunoglobulina ae caaena pesada) lucosa) GRP94 (pr Calnexina PDI (proteina disulfuiu isviiiLin:;a) PPI (peptidil propil cis-írans isomcrasa)
micturas no funcionales. La mayoria de 1% chapero-
nas muestran actividad de ATPasa y enla7an ADP y ATP. Esta actividad es importante en su efecto sobre el plegamiento. El complejo ADP-chaperona con Frecuencia tiene alta afinidad por la proteína desplegada, la cual cuando se enlaza estimula la liberación de ADP con remplazo por ATP. El complejo ATP-chaperona, en su momento, libera segmentos de la protelna que se pliega adecuadamente y repite el ciclo que implica el enlace de ADP y ATP hasta que se libera la proteina plegada. Algunos ejemplos de proteínas chaperonas se describen antes cuando se presenta la clasificaci6n de las proteinas rnitocondriales. La proteina enlaadom (BiP) de inmunoglobulina de cadena pesada se localiza en el lumen del reticulo endoplasrnico. Esta proteína puede enlayar inrnunoglobulina de cadena pesada, y otras proteinas, con plegamiento anormal y evitar que abandonen el retículo endoplásrnico en donde se les degrada. Otra chaperona importante es la calnexina, que se localiza en la membrana del reticulo endoplásmico, Esta proteina enlaza a una amplia variedad de proteínas, incluso antigenos de histocompatibilidad mezclados (MHC) y diversas proteinas shricas. Como se describe en el capitulo 56 la calnexina enlala las modalidades monoglricosiladas de las glucoproteínas que se presentan durante el procesamiento de las glucoproteinas, reteniendolas en e[ reticulo endoplasmico hasta que la glucoproteína se pliega adecuadamente. Las chaperonas no son las únicas proteinas en el turnen del retículo endoplfismico implicadas en e! plegamiento adecuado de las proteinas. Esthn presentes dos enzimac que tienen una funcidn activa en el plegamiento. La proteina disulfuro isomerasa (PDI) promueve el rhpido desarreglo de los enlaces de disulfuro hasta que se consigue e l conjunto correcto; la peptidil prolil isornerasa (PPJ) acelera el plegamiento de las proteinas que contienen prolina al catalizar la isomerizacibn cis-irans de los enlaces Pro-X, en donde X e5 cualquier residuo aminoácido.
La mayor parte de las protehas que se sintetizan en los polirribosobomas enlazados a la membrana con destino para el aparato de Golgi o 3a membrana plasmáiica alcanzan tales sitios dentro de vesiculas de transporte. No se conoce como se insertan en el interior de estas vesiculas las protelnas que se sintetizan en el retículo endoplhsmico rugoso. Aquellas implicadas en el mnsporte al aparato de Golgi y desde Cste a la membrana plasmática son sobre todo libres de clatrina, excepto las vesiculas recubiertas implicadas en la endocitosis ( d a s e la presentacihn sobre el receptor de LDL en el capítulo 28). En atencibn a la claridad, las vesiculas recubiertas con no clatrina se describen en el texto como vesículas de transporte. Hay pruebas de que las proteinas con destino a las membranas de! aparato de Golgi tienen secuencias especificas de seiial. Por otra parte, la rnayoria de las proteínas con destino a la membrana placm6tica o para secreción no parece que contengan sefiales especificas y llegan a su destino por omisión.
El aparato de Golgi participa en la glucosilación y clasificado de las proteínas El aparato de Golgi desempefia dos funciones importantes en la síntesis de la membrana. Primero, participa en el procesamiento de las cadenas de oligocacaridos de membrana y otraS glucoproteinas con enlace N- y también contiene enzimas implicadas en la O-glucosilación. Segundo, participa en la clasificacibn de varias proteínas antes del reparto a su destino intracelular apropiado. Todas las partes del aparato de Solgi participan en la primera funcibn, en tanto que el rransGolgi estB en particular implicado en la segunda y es muy rico en vesículas. En virtud de su funcibn central en el transporte de proteinas, en los afioc recientes una cantidad considerable de investigaciones se encausa hacia el conocimiento de la formacion y destino de las vesicu las de transporte.
Un modelo de vesiculas recubiertas con no clatrina implica SNARE y otros factores Las vesiculas, sobre todo pero n o exclusivamente de la variedad recubierta con no clatrina, yacen en el centro del transporte intracelular de muchas proteinas. Se tienen avances recientes importantes en la comprensión de los eventos implicados en la formación y transporte vesiculares. Esto se ha logrado mediante el
Cuadro 43-7. Factores implicados en la forrnacibn de vesículas recubiertas de no clatrlna v c l r ransperti2 .
.
1ADP dc I-ibosilación, nombre cií hro original de csta familia de pi Contbmero: Crna familia dc a1 m6 iroteinas de recubsimicnto ( a , p, y, 6,E, p' 4 SNAP: Factor dc adhesión NS, S ~ U I U U I F SNARE: Rcceptor dc SNAP v-SNARI': Vcsicula SNARE t-SKAKtJ: SNAKI;( l e destino . . . .. . . Ti1'1'-y-S Análogo no hldrolizable del Ci 1 P. iitilizndo para verificar la participxi 6n de GTP NEM: .Y-Etilrnaleimi~ da, una su: e alquila lcis grupos si~lfidrilo NSI: Factor sensible a iui:ivr. uiia t x 1 r n h d * Proteinas rah. Una familia de proteinas relacionadas con por primera %el:en ccrebro de rata -.-ras.. observadas --
Ir
uso de diversos enfoques que incluyen el establecimiento de sistemas libres de céIulas con los cuales estudiar la formación de vesículas; por ejemplo, mediante microscopia electronica es posible observar la gemación de vesiculas desde preparaciones del aparato de Golgi incubada con citosol y ATF. El desarrollo de enfoques genéticos para el estudio de las veciculas
en levaduras y el uso de brefeldina A también han resultado cruciales. El cuadro es complejo, con 5u nomenclatura propia (cuadro 43-71, e implica diversas proteinas citosólicas y de membrana, GTP, ATP y factores accesorios. PrincipaImente con base en la propuesta de Rothrnm y Warren, se puede considerar que el transporte vesicular anterdgrado acontece en ocho pasos (figura 43-1 4). El concepto fundamental es que cada vesícula de transporte porta un marcador domiciliario único compiiesto de uno o mLs v-SNARE, en tanto que la membrana blanco porta uno o más t-SNARE complementarios.
Paso 1:El ensamble de la cubierta se inicia cuando se activa el ARF (factor ADP-ribosilación) por enlace con GTP,el cual se recambia por GDP. Esto lleva a la integraciiin del enlace GTP ART: con su presunto reccptor (ideado en la figura 43-14) en Iñ membrana donadora. Para que el ARF participe, dcbe modificarse primero por adicion de hcido miristico (C 14:0), con la utilización de miristoil-COA como donadora de acilo. La rniristoilación es una de varias modificaciones postranslacionates catalizadas por enzima, que implican la adición de ciertos Iípidos a residuos especificas de proteinas y facilitan el enlace de proteínas a las superficies citosólicas de membranas o vesículas. Otras son la adicibn de palmi-
Vesicula
Membrana donadora (por ejemplo, RE)
II
/ Membrana
de destino (por ejemplo, CGN)
Figura 43-44. Modelo de los pasos en un sentido del transporte anterdgrado de la vesicula. El ciclo arranca en la parte inferior izquierda de la figura en donde dos moleculacde ARF se representan como bvalos pequenos que contienen GDP. Las pasos en el ciclo se describen en el texto. Las diversas abreviaturas utilizadas se explican en el cuadro 43-7. (Adaptada de Rothman JE, Mechantsms of intracelular protein trancport. Nature 1994,372.55. Cortesía de E Degen )
Mem brunas. e.Tfrz-uclura,ensam blc y funcidn
tato, fanesil y geranilgeranilo; l a dos Últimas mol~culasson isoprenoides que contienen respectivamente, 15 y 20 carbonos. Paso 2: El ARF relacionao con la membrana recluta las proteínas del recubrimiento, que incluye la concha del coatornero y forma un brote recubierto. Paso 3: El brote se convierte en una protuberancia que implica acil-COA y es probable que ATP. para comptetar la f m a c i o n de la vesícula recubierta. Paso 4: La cubierta se desensambla (con disociación del ARF y la concha del coatornero) seguida de la hidr~lisicdel enlace GTP; es necesario retirar la cubierta para que acontezca la fusión. Paso 5: La dirección de la vesícula se adquiere por via de una familia de proteínas integradas, denominadas V-SNARE, que etiquetan la vesicula durante su gemacibn. Las V-SNA R E empatan con las t-SNARE que reconocen en la membrana de destino para anclar la vesicula. Se supone que los pasos 4 y 5 están enlazados estrechamente y que el paso 4 puede seguir al paso 5, con la disociación del ARF y la concha del coaibmero inmediatamente después del anclaje. Pase 6 : El mecanismo general de fusi6n ensambla a cont inuacibn sobre el complejo pareadode SNARE; esto incluye una ATPasa (NSF; factor sensible a NEM} y las proteinas SNAP (factor soliible de adhesi6n NSF). Las SNAP enlazan con el complejo SNARE (receptor de SNAP} y permiten el enlace de NSF. Paso 7: Para lafusibn es esencial la hidrólisis del ATP por NSF, un proceso que puede inhibírse mediante NEM (N-etilmaleimida). Tambit'n se requiere de otras proteinas y calcio. Paso 8: El transporte retrbgrado se presenta para restablecer el ciclo. Este ultimo paso puede recuperar ciertas proteínas o reciclar V-SNARE. El nwodazol, un agente disyuntor del microtúbulo, inhibe este paso.
La brefeldina A inhibe el proceso de recubrimiento Los siguientes puntos ampfim y aclaran lo anterior. 1) Ea relación entre el receptor ARF y v-SNARE en el paso 1 es especulativa, pero se requiere de algún medio para empacar v-SNARE en el interior de las gemís. Es posible que en este paso esten implicadas otras proteinas, tales como proteina rab (viase adetante) o proteinas heterotriméricas G. 2) La brefeldina A es un metabolito rnic6tico que evita al GTP enlazarse con ARF en el paso 1 y, por tanto, inhibe el proceso completo de recubrimiento. En su presencia el aparato de Golgi
581
parece desintegrarse y los fragmentos se pierden. Esto lo puede hacer mediante la inhibici6n del recambiador del nucleótido de la guanina implicado en el paso 1. 33 El GTP-gamma-S (un analogo no hidrilizable del GTP que se utiliza a menudo en las investigaciones sobre la función del GTP en los procesvs bioquimicos) bloquea el desensamble del recubrimiento en las vesículas recubiertas, lo que lleva al incremento de las vesículas recubiertas. 4) Una familia de proreínac semejantes a ras (capitulo 621, denominada la familia de proteina mb, se requiere en varios pasos del transporte intracelular de proteína, secreción regulada y endocitosis. Todas ellas son pequeiias GTPasa monoméricas que se adhieren a la cara citosólica de la membrana, por lo general vía cadenas de geranilgeranilo. En el presente no está clara su funcibn precisa en el ciclo que se describe antes; una posibilidad es que interactúen con SNARE y catalicen, o den seguimiento a, sus interacciones. 5) La fusion de vesiculac sinápticas con la membrana plasmática de las neuronas (capitulo 64) implica una serie de eventos similar a los antes descritos. Por ejemplo, una V-SNAREse designa como sinaptobrevina y dos 1-SNARE se designan como sintaxina y SNAP 25 (sinaptosoma-proteina concomitante de 25 kDa). La toxina botulinica R es una de las toxinas mas letalcs que se conocen y es la causa rnh seria de intoxicacibn alímentaria. Se sabe que uno de los componentes de esta toxina es una proteasa que parece unirse 410a sinaptobrevina,por lo que inhibe la liberacidn de acetilcolina en la unión neuromuscular y puede ser mortal, dependiendo de la dosis que se ingiere. 6) Aunque este modelo describe las vesículas recubienas con no clatrina, parece probable que se apliquen a Ia mayor parte de las eventos descritos, al menos en principio, a las vesículas recubiertas de clatrina.
La presentación anterior sobre la biogenesis de las membranas pone de manifiesto que ésta es un proceso complejo acerca del cual aún es mucho lo que se desconoce. Un indicador de la complejidad implicada es considerar el número de modificaciones postmnslacionalec de que pueden ser objeto las proteinas de membrana antes de alcanzar su estado de madurez. Tales modificaciones inciuyen prote6lisis, glucosilacibn, adicibn de una ancla de glucofosfatidilo (GPI), sulfatación en porciones de tirosina o carbohidrato, fosforilacibn, acilacibn y prenilación; lista que sin duda es incompleta. Sin embargo, se hacen progresos significativos. En cl cuadro 4 3 4 se resumen algunas de las principales características de la membrana que se presentan antes.
Cuadro 43-8. Características principales del ensamblaie de membranas .
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Cuadro 43-9. Transferencia de material e informacion a travCs de las membrana* .. ..-..--
~ I I I J L C I I I C L . ) J'lLllllll O l l I m l C 3
te pul L l C U I C I I C . 3
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rimentan recam hio independ cs distintas Las secuencias topogenicas (por ejemplo, seiiai /N-termina1 o iriternal] y a Ito-trans fe1"cncia) son es en la dcte rminacicin de la insercibn y d i s ~ otcínicas eii las mcmtranas Idas proteinas memnranaleí; englnbatlas en vesicutns brotan por gemacicin del retículo cndoptdisrnico cn !ju camino al aparato dc Golgi; la distribucibn fi nal de num erosa$ protlzinar; membranales ocurre en cl i+ron$-Golg1 . .- . >ecucncias especificas de seleccibn o ctnci!icaci0n guian las proteínas a organelos partici rlnres con.10 lisosomas, peroxisomas y mitocondrias El transporte de protelnas a través de mcIiiuiaiiu> al intcrior de miichos organelos requiere y,ue no estt:n plegadas y consume . .A'TP . -%
LA SELECTIVIDAD DE LAS MEMBRANAS LES PERMITE EFECTUAR FUNCIONES ESPECIALIZADAS Si la membrana plasmática es relativamenteimpermeabie, jcómo entran a Iacelula lamayor parte de lasmoléculas? ;Cómo se establece la selectividad de este mavimien~o? Las respuestas a estas interrogantes son importantes en la comprensihn de ciimo se adaptan las celulas a su medio extracelular en constante cambio. Tam bien los rnetazoarios deben tmer medios de cornunicaci6n entre c6Iulas adyacentes y distantes, de modo que puedan coordinarse los complejos procesos biológicos. Estas sefiales deben llegar a la membrana y transmitirse por ella, o debe11geneme como consecuencia de alguna interaccibn con la membrana. En e4 cuadro 43-9 se enumeran algunos de los mecanismos principales utiIizados para cumplir con estos objetivos diferentes.
Mecanismos pasivos mueven algunas moléculas pequeñas a través de las membranas Las moltculas pueden atravesar en forma pasiva la doble capa a favor de gradientes electroquímicos por difusión simpIe o facilitada. Este movimiento espontáneo hacia el equilibrio, contrasta con el transporte activo que requiere energia, debido a que este constituye un movimiento contra un gradiente electroquímico. La figura 43-1 5 proporciona un esquema de estos mecanismos.
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Mivimiento dc rnobtulr
ia
Difiisicin (pasiva y P ~ I Transporte --ti-.Movimiento d
s grannes a rravcs ae ia memhrana
Endocltosi Exocitusis Tr
il e travbs de las mernbranas
:riicic cclii lar e la sciial(por ejcmpllo, glucagá iiuir)
oración de la x a a l (acoplada con endocitosis, por CJIumplo, el aecepinr para 1.DL) Movirnier ito a reccritorcs ititracelulares (hurmnnas .. csterriides. una forma de difur Contacto inlercelular .i7 comunic:
Como se indicó, algunos solutos como tos gases pueden entrar a !a c&luladifundiéndose a favor de un gradiente electroquimico a travks de la membrana y no requieren energía metabblica. La difusión pasiva simple de un soluto a través de una membrana, esth limitada por la agitación térmica de esa molécula específica; por el gradiente de concentraci~na traves de la membrana y por la solubilidad de dicho soluto (el coeficiente de permeabilidad, figura 4 3 4 ) en el núcleo hidrofbbico de la doble capa de la membrana. La solubi!idad es inversamente proporcional al nrlmero de puentes de hidrbgeno que deben romperse para qiie un soluto en la fase acuosa externa se incorpore a la doble capa hidrbfoba. Los electrblitos, que se disuelven escasamente en Ilpidos, no forman puentes de hidrógeno con el agua, pero adquieren una cubierta de agua por hidratación mediante interacci6n electrostatica. EE tamailo de ta cubierta es directamente proporcional a la densidad de cargadel electrólito. Los electrblitos que poseen una gran densidad de carga tienen una cubierta mayor de hidratacihn y, por tanto, una menor velocidad de difusihn. Por ejemplo, el Na', tiene una densidad de carga mayor que el K'. Por tanto, el Na' hidratado es de mayor tamafio que el K' hidratado; de aquí, que el último tienda a moverse con m i s facilidad a travks de la membrana. En las membranas naturales, al contrario que en las dobles capas de membranas sintéticas, hay conductos transmembrana, estructuras semejantes a poros, compuestas de proteínas que forman vías selectivas conductora de iones. Los conductos conductores de cationes tienen un diámetro promedio aproximado de 5 a 8 nm y estrin cargados negativamente en su interior. La permeabilidad de un conducto depende de su tamaño, del grado de hidratacirin y de la densidad
,Zriemhrunas: estructura, ensarnhlcy Junción
553
Molkcula
transportaora
\ pmte,,,@
prote,na transportadora
Doble capa de iipidos
e I Diusion simple
Difusión facilitada
Transporte paslvo
Transporte actwo
Figura 43-15. Muchas moldculas pequefíac sin carga pasan libremente a travec de la doble capa de Iíptdos. Moléculas cargadas, mol&culasgrandes sin carga y algunas moléculas pequefíac sin carga se transfieren por canales o poros, o mediante proteinas transportadoras especificas. El transporte pasivo es siempre a favor de un gradiente electroqulmico, hacia el equilibrio. El transporte activo es contra uir gradiente electroquímico y requiere consumo de energla, en tanto que el transporte pasivo no. (Redibujada y reproducida con autorización de Alberts B et al , MolecuiarB~ologyof Zhe Cell. Garland, 1983.)
de carga en el ion. Se tienen identificados conductos específicos para Na', K' y Ca". Las membranas de las células nerviosas contienen conductos de iones bien estudiados, que son causantes de los potenciales de nccibn generados a través de la membrana. La actividad de algunos de estos conductos se controla porneurotransrnisores;de aquí que la actividad de conducto, pueda ser regulada. Un ion puede regular la actividad del conducto de otro ion. Por ejemplo, una reducción en la concentraciún de Ca" en el líquido extracelular Encrementa la pemtlabilidad de la membrana y, por tanto, la difusion del Na'. Este despolariza la membrana y desencaderia la descarga nerviosa. Así, se explica el entumecimiento, hormigueo y los calambres musculares sintoma~icosde una baja concentracibn &rica de Ca2'. LOS conductos están abiertos temporalmente y por tanto poseen compuertas, que pueden controlarse para abrirse o cerrarse. En los conductos de compuertas de ligandos una rnolkcula específica se une a un receptor y abre el conducto. Los conductos de compuerta de voltaje se abren (o cierran) en respuesta a un cambio en el potencial de la membrana. Algunos microorganismos sintetizan moléculas orgánicas pequeRac, los ionóforos, que funcionan como lanzaderas para el movimiento de iones a través de la membrana. Estos ionhforos tienen centros
hídrofílicos que se unen a iones especificos y están rodeados por regiones hidrofóbicas periferjcas; este ordenamiento permite a las nioféculas disolverse eficazmente en la membrana y difundirse en forma transversal en su interior. Otros, como el polipéptido gramicidina bien estudiado, forman conductos. Las toxinas microbianas tal como la toxina difiérica y los componentes activados del complemento sérico pueden ocasionar poros grandes en las membranas celulares y de este modo suministrar rnacromol&culascon acceso directo al medio interno. En resumen, la ditusihn neta de una sustancia depende de lo siguiente: 1) Su gradiente de concentración a itraves de la membrana. Los solutos se mueven de una concentraci6n alta a una baja. 2) El potencial elkctrico a través de la membrana. Los solutos avanzan hacia la s o l u c i ~ ncon carga opuesta. Por lo general, el interior de la célula tiene carga negativa. 3) El coeficiente de pemieabilidad de la sustancia para la membrana. 4) El gradiente de la presi6n hidrostatica a través de la membrana. Una presión elevada incrementa la velocidad y la fuerza de colisión entre las moléculas y la membrana. 5) La temperatura. Un aumento de esta incrementa el movimiento de la partícula y, por tanto, la frecuencia de colisiones entre las mold~ulasexternas y la membrana.
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* Bioquimica de Harper
(Capítulo 43)
LAS MEMBRANAS PLASMATICAS ESTAN IMPLICADAS EN LA DIFUSION FACILITABA, TRANSPORTE ACTIVO Y O f ROS PROCESOS Los sistemas de transporte pueden describirse en un sentido funcional de acuerdo al nurncro de moléciilas despIazadas y a la dirección del movimiento (figura 43-1 6) o de acuerdo a si el movimiento es hacia el equilibrio o se aleja de 61. Un sistema uniportador mueve un tipo de mol~culasen las dos direcciones. En los sistemas cotransportadores, la transferencia de un soluto depende de la estequiometria sirnultinea o de la transferencia secuencia1de otro soluto. Un sistema simpostador mueve a estos solutos en la misma direccibn. Ejemplos son el transportador protbnico de azúcar en las bacterias y los transportadores de Na'-anjcar (glucosa, manosa, galactosa, xilosa y arabinosa) y 10s transportadores de Na4-aminoácido en las celulas de mamífero. Los sistemas antiportadores mueven dos moléculas en direcciones opuestas (por ejemplo, Na' al interior y Ca" al exterior}. Las moléculas que no pueden pasar por si mismas libremente a través de la doble capa de lipidos de membrana, lo hacen acompafiadas por proteinas transponadoras. Esto implica dos procesos, difusión facilitada y transporte activo y sistemas de transporte altamente específicos. La difusi6n facilitada y el transporte activo comparten muchas caracterlsticas. Al parecer en ambos intervienen proteínas porteadoras y los dos muestran especificidad por iones, azúcares y aminohcidos. Las mutaciones en bacterias y en celutas de mamífero (incluyen aIgunas que causan enfermedad en humanos) corroboran estas conclusiones. La difusión hcilitada y el transporte activo se asemejan a una reacción de sustrato y enzima, excepto que no ocurre interaccion covalente. Estos puntos de s e m e j a n 7 ~son los siguientes: 1) Hay un sitio especifico de uni6n para el soluto. 2) El transportador es saturable, de modo que tiene
/ -
Difusibn ,SI",
Difusibn mediada por transporlador
I
Figura 43-17, Comparacibn de la cinetica de difucdn mediada por transportador (facilitada) con la difusibn pasiva La velocidad del movimiento en esta ultima es dlrectamente proporcional a la concentracibn del soluto, en tanto que el proceso se satura cuando intervienen transportadores La concentracdn a las mitad de la velocidad mhxirna es igual a la constante de fijación (ih)del transportador del soluto (Vmh,vefocidad rnaxima )
velocidad máxima de transporte (V,h) (figura 43-1 71, 3 ) Hay una constante de fijacibn para el soluto (Km) y por tanto el sistema entero tiene una K,,, (figura43-17). 4) Los inhibidores competitivos estructuratmente similares, bloquean el transporte. Las diferencias principales son: 1) La difusibn facilitada puede operar en las dos direcciones, en tanto que el transporte activo por lo común es unidireccional. 2) El transporte activo siempre opera contra un gradiente eléctrico o químico y por tanto requiere energía.
Difusión facilitada Algunos solutos especificos se difunden a favor de gradientes electroquimicos a través de las membranas
Doble capa de lipidos
Uniportador
Sirnportador
Antiportador
I
I
Cotransporte
Figura 43-1 6. Representacidn esquemática de los tipos de sistemas de transporte. Los transportadores pueden clasificarse respecto a la dirección del movimiento o de acuerdo a si mueven una o mas mokculas únicas (Redibujada y reproducida con autorizacián de Alberts 0 et al . Molecular BroEogy of the Cell Garland. 1983.)
Membranas: e.~trucruru,ensamble yfunciba
con mayor rapidez que la que podría esperarse de su tamafío, carga o coeficientes de particibn. Esta difusibn facilitada exhibe propiedades distintas de las observadas en la difusi6n simple. El índice de difusihn facilitada, un sis~ernauniportador, puede ser saturado; es decir, el numero de sitios implicados en la difusión de solutos especificos es al parecer finito. Muchos sistemas de difusión facilitada son estereoespecíficos, pero al igual que la difusibn simple, no requieren de energia metabólica. Como se describe al principio, la asimetría entre el interior y el exterior de las proteínas de membrana es estable y la movilidad de estas a mvCs (másque en el interior) de la membrana es poco frecuente; por tanto, no es probable que la movilidad transversal de proteínas transportadoras especificas se considere para los procesos dc difusibn facilitada, excepto aquéllos de los ionhforos microbianos (vease antes). Un mecanismo de "ping-pong" (figura 43-1 8) explica la difusibn facilitada. En este modelo, la proteína transportadora existe en dos conformaciones principales. En cl estado "pong" esta expuesta a concentraciones altas del soluto y las moléculas de éste se unen en sitios especificos sobre la proteína transportadora. El transporte ocurre cuando un cambio de conformación expone al transportador a una concentracibn baja de soluto (estado "ping"). Este proceso es enteramente reversible y el flujo neto a traves de la membrana depende del gradiente de concentraci6n. La velocidad a la cual los solutos entran a una célula por difusion facilitada se determina por los factores siguientes: 1) El gradiente de concentracidn a través de la membrana. 2) La cantidad de transportador disponible (este es un paso clave de control). 3 ) La rapidez de la interaccibn entre el soluto y el transportador. 4) La prontitud en el cambio de confomacion del transportador con carga y sin ella.
* 585
Las hormonas regulan la difusión facilitada al cambiar el numero de transportadores disponibles. La insulina incrementa el transporte de glucosa en el tejido adiposo y en el músculo mediante la incorporación de transportadores desde un depósito intracelular (figura 5 1-9). Adernhs, la insulina potencia el transporte de aminoácidos en el higado y otros tejidos. Una de las acciones coordinadas de las hormonas glucocorticoides ES aumentar el transporte de aminoacidos en el higado, donde sirven como sustrato para la gluconeogénesis. La hormona del crecimiento incrementa el transporte de aminoácidos en todas las células y los estrogenos 10 hacen en el útero. Hay por lo menos cinco sistemas transportadores diferentes de aminoacidos en las c&lulas animales. Cada uno es especifico de un grupo de aminoácidos estrechamente relacionados y la mayor parte operan como sistemas cimportadores de Na' (figura 43-1 63.
Transporte activo El proceso del transporte activo difiere del de difusibn en que las moléculas se transportan lejos del equilibrio temodinimico; por consiguiente, se requiere de energía. Esta energia puede provenir de la hidrblisis del ATP, del movimiento de electrones o de la luz. La conservación de gradientes electroquimicos en los sistemas biolhgicos es tan importante que consume quizá de 30 a 40% de la energia total consumida en una cdlula. En general, las ctlulas conservan una concentraciiin baja de Na' intracelular y una concenmción alta de K' intracelular (cuadro 43-l), junto con un potencial eléctrico negativo total en el interior. La bomba que mantiene estos gradientes es una ATPasa activada por el Nat y el K+(figura 43-1 9). La ATPaca es
Figura 43-18. Modelo "ping-pong"de la difusrbn facilitada. Una proteina transportadora (estructura sombreada) en la doble capa de llprdos se une al soluto que se halla en concentración alta en un lado de la membrana Sobreviene un cambio en la conformacibn de la proteína ("'pong" a "ping")y el soluto se descarga en el lado que favorece al nuevo equilibrio. El transportador vacío retorna ahora a la conformacibn original ("ping" a "pong") para completar el ciclo.
386
Bioquim ica de f h r p e r
m
cionan un aislante eléctrico que rodea a la mayor parte del newio y aceleran en pmedida la propagacion de MEMBRANA la onda (sefial) al permitir a los iones fluir dentro y fuera de la membrana siilo donde esta no se halla recubierta del aislante. La membrana de mielina está 3 Na+ compuesta de fosfolípidos (que incluye esfingomielina}, colcsterol, proteínas y gli~coesfingolipidos. Hay una cantidad relativamente escasa de proteínas 2K+ integra!es y perifbricas relacionadas con la membrana de mielina; al parecer las que existen mantienen juntas las multiples dobles capas de membrana para formar la estructura aislante hidrbfoba impermeable a los iones y al agua. Ciertas enfermedades, por ejemplo, las esclerosic mUltiples y el síndrome de Guillain-Barre, Figura 43-$9. Ectequiometria de la bomba N ~ * I K * - A T P ~ S ~ . se caracterizan por desmielinizaci6n y trastorno de Esta bomba desplaza tres iones ~ a del " interior al exterior conducción nerviosa, de la rklula y lleva dos iones K' del exterior al interior por INTERIOR
EXTERIOR
cada mol~culade ATP hidrolizado a ADP par la ATPaca lrgada a la membrana. La uabaina y otros gluoósidos cardiacos inhiben esta bomba al actuar en la superficie externa de la membrana (Cortesía de R Post )
una proteína integral de la membrana que requiere fosfolipidos para su actividad. La ATPasa tiene centros cataliticos tanto para el ATP como para el Na' sobre el lado citoplasmico de la membrana, pero el sitio de fijacibn del K' está en el lado extracelular de la membrana, La uabaina (digital) inhibe a esta ATPasa unihndose al dominio extracelular. La inhibicibn de la ATPasa por la uabaína puede antagonizarse por el K' extracelular.
La transmisión de impulsos nerviosos ocurre hacia uno y otro lado de las membranas La membrana que forma la superficie de las neuronas conserva asimetría de veltaje (potencial eléctrico) entre el interior y el exterior, y es eléctricamente excitable. Cuando es apropiadamente estimulada por una seaal química mediada por un receptor sináptico especifico de membrana (véase Transmisibn de sefiales bioquimicas, adelante), las compuertas en la membrana se abren para permitir la afluencia rápida de N a o Ca" (con o sin salida de K'), de modo que la diferencia de voltaje se pierde con rapidez y ese segmento de la membrana se despolariza. Sin embargo, como consecuencia de la acci6n de las bombas de iones de la membrana, el gradiente se restablece con prontitud. Cuando grandes heas de la membrana con despolarizadas de esta manera, la alteración electroquimica se propaga en forma de onda a lo largo de la membrana, generando un impulso nervioso. Las vainas de mielina, formadas por las células de Schwann, se enrollan aIrededor de las fibras nerviosas y propor-
El transporte de glucosa se hace por diversos mecanismos Abordar el tema del transporte de 3a glucosa resume muchos de los puntos que integran este capitulo. La glucosa debe entrar a la celula como primer paso en la utilizaci~nde la energia. En otras cklulas, en particular adipocitos y músculo, la glucosa entra por un sistema transportador especifico regulado por la insuIina. Los cambios en el transporte se deben básicamente a alteraciones de la V,,, (se presume que se deba al mayor o menor número de transportadores activos) pero también puede haber cambios en la Km. El transporte de la glucosa implica aspectos diferentes de los principios del transporte explicados antes. La glucosa y el Na' se unen en diferentes sitios cobre el transportador de gliicosa. El Na' se mueve al interior a favor de su gradiente electroquímico y "arrastra" a la gizicosa con e1 (fígura 43-20). Por tanto, mientras mayor es el gradiente del Na', mhs glucosa entra y si el Na' extracelular es escaso, el transporte de glucosa se detiene. Para conservar un gradiente en exceso de Na-, este sistema sirnportador depende de gradientes generados por una bomba Nat/K' que conserva una concentracibn intracelular baja de Na'. Mecanismos semejantes se utilizan para transportar otros aziicares asi como aminoácidos. El movimiento transcelular de azúcares posee un componente adicional, un uniportador que permite a la glucosa acumulada dentro de la cklula moverse a través de una superficie diferente hacia un nuevo equilibrio; esto ocurre, por ejemplo, en las células intestinales y renales.
Las células también transportan macromoleculaa a través de la membrana plasmatica La endocitosis es el proceso por el cual las células captan las moléculas grandes. Algunas de tstas
Membranrrs: esrrucfura,ensamble y funcicjn
LUMEN
Glucosa
Na+
\
/-
CITOSOL
Gruuisa
L¡QUIDOEXTRACELULAR
Figura 43-20. Movimiento transcelular de la glucosa en una dlula intestinal La glucosa sigue al ~ a a' travbs de la membrana del epitelio lurninal. El gradiente de ~ a que * impulsa este movimiento simportador se establece por un intercambio N ~ * I K * ,que se produce en la membrana basal que encara al mmpartimiento del Ifquido extracelular La glucosa. en concentracibn alta dentro de la célula se decplaza "colina abajo" (es decir, a favor del gradiente químico) hacia el líquido extracelular por difusión facilitada (un meranismo uniportador).
pueden ser fuente (por ejemplo, polisacaridos, protelnas y polinucleotidos) de elementos nutricionales. La endocitosis es un mecanismo que permite regular el contenido de ciertos componentes de la membrana, por ejemplo los receptores de hormonas. La endocitosis puede utilizarse para aprender más acerca del funcionamiento celular. El DNA de un tipo de c&lulapuede usarse para transferirlo a una célula diferente y alterar su función o su fenotipo. En estos experimentos. con frecuencia se utiliza un gen especifico y de este modo se logra un medio único para estudiar y anaIi7ar la regulacibn de ese gen. La transducci~ndel DNA depende de la endocitosis, la cual es responsable de la entrada del DNA a la cdlula. Por lo general, en los experimentos se utiliza fosfato de calcio, ya que el Caz' estimula la endocitosis y precipita al DNA, lo cual convierte a este último en un candidato mAs apropiado para la endocitosis. Las c6lulas también liberan macrornol~culaspor exocitosis. Tanto en la endocitosis como en la exocitosis hay fomacibn de vesícuias rodeadas de membrana plasmatica.
A. Endocifosis Todas las cklulas eucariotas ingieren en forma continua partes de sus membranas plasmaticas. Las vesículas de la endocitosis se generan cuando segrnen-
587
tos de la membrana plasmatica se invaginan y encierra un volumen diminuto de liquido extracelular y su conten ido. A continiiación la vesícula se desprende cuando la fusión de la membrana placmática sella el cuello de la vesicula en el sitio original de la invaginacihn (figura 43-21). Esta vesícula se fusiona con otras estructuras de membrana y así se logra el transporte dc su contenido a OROS compartimientos celulares o aun de regreso al exterior. La mayor parte de las vesiciiias endocitbsicas se fusionan con los lisosonias primarios para formar lisosomas secundarios, que contienen enzimas hidroiiticas y por tanto son 10s organelos especializados en eliminar los desechos intracelulares. El contenido macromolecular se digiere para producir aminolicidos, anjcares simples y nucleótidos, que se difunden fuera dc las vesicu~aspara su reutilización en el citoplasma. La endocitosis requiere: 1) energia, por lo general de la hidriilisis del ATP; 2) Ca7-en el liquido extracelular, y 3) elementos contractiles eri la cClula (probablemente el sistema de rnicrofilamentos, capitulo 58). Existen dos tipos generales de endocitosis. La fagocitosis se efectiia s61o en células fagociticas como los macrofagos y gsanulocitos. La fagocitosis implica la ingestirin de particulas grandes, tales como virus, bacterias, células o desechos. Los macrbfagos tienen una actividad notable en este aspecto y pueden ingerir 25% de su volumen por hora. Al hacerlo, un macróFago puede incorporar 3% de su membrana plasmhtica cada minuto o la membrana entera cada 30 minutos. La pinocitosis es una propiedad de la totalidad de las células y está dirigida a la captacián celular de líquidos y de solutos. Hay dos tipos. La pinocitosis de fase líquida es un proceso no selectivo en el cual, la captacion de un soluto por fermacion de vesiculas pequefías es simplemente proporcional a su concentración en el líquido extracelular circundante. La fosmacion de estas vesiculas es un proceso extremadamente activo. Por ejemplo, los fibroblastos incorporan su membrana plasmhtica en aproximadamente un tercio de la velocidad de los macrbfagos. El proceso se produce con una rapidez mayor al de la formaci6n de membranas. El área superficial y el volumen de una célula no cambian mucho, así las membranas deben reniplazarce mediante exocitosis o reciclarse a la misma velocidad en que se remueven por la endocitosis. El otro tipo de pinocitosis, la pinocitosis adsortiva, es un proceso selectivo mediado por un receptor Fundamentalmente encargado de la captacibn de macromoleculas para las que existe un número finito de sitios de fijación sobre la membrana plasmatica. Estos receptores de elevada afinidad permiten la concentraci6n selectiva de ligandos del medio, minimizan la captacidn de liquido o de macromoldculas solubles no unidas e incrementan de manera notable la velocidad a la cual, moléculas especificas entran a la célula. Las
Figura 43-21. Dos tipos de endocitosis. Una vesicula endocitbsica M se fama como resultado de la invaginacibn de una parte de la membrana plasmdtica La endoctosis de fase liquida (A) es al azar y no dirigida La endocitosis mediada por receptor(B) es selectiva y se produce en las depresiones revestidas (DR) que están alineadas con la proteína clatnna (material velloso) El blanco (sitio al que se dirigen) se proporciona por los receptores (símbolos oscuros) específicos para dtversas moleculas El resultado es la formación de una vesícula revestida (VR).
vesiculas formadas durante la pinocitosis adsortiva se derivan de invaginaciones (depresiones) que están recubiertas sobre el lado citoplásmico con un material filamentoso, En muchos sistemas este material lo constituye la ctatrina, que probablemente es una proteína periferica de la membrana. Las depresiones revestidas pueden representar hasta 2% de Ia superficie de algunas celulac. Por ejemplo, la molécula de lipoproteina de baja densidad (LDL) y su receptor (capítulo 27) se incorporan por medio de depresiones revestidas que contienen al receptor de LDC. Las vesículas endocit6sicas que contienen a la LDL y a su receptor se fusionan a los lisosomas en la d l u l a . El receptor se libera y recicla de nuevo a la superficie de la membrana celular, pero la apoproteína de la LDL se degrada y los &eres de colesterilo se metabolizan. La síntesis del receptor del LDL se regula por consecuencias secundarias o terciarias de la pinocitosis, es decir, por productos rnetab6licos tal como el colesterol, liberado durante la degradacibn de LDL. Las alteraciones del receptor de LDI, y su incorpomci6n son importantes desde el punto de vista médico y se describen en el capítulo 27. Otras macromol~ulasque incluyen varias heme Das, estan sujetas a la pinocitosis adsortiva y forman receptosomas, vesículas que evitan a Eos lisosomas y
liberan su contenido en otros sitios de la cdlula, como el aparato de Golgi. La pinocitosis adsortiva de glucoproteínas extracelulares requiere que tales glucoproteinas porten sefíales especificas de reconocimiento de carbohidratos. Estaq seiiales de reconocimiento las fijan mol6culas receptoras de membrana, las cuales desempefian una función análoga al del receptor de LDI,. Un receptor de galactosilo sobre la superficie de los hepatocitos es fundamental en la pinocitosis adsoriiva de asialoglucaproteínas de la circulación (capítulo 56). A las hidrolasac ácidas captadas por pinocitocis adsortiva en los fibroblastos se les reconoce por sus fracciones de manosa 6-fosfato. Como dato interesante, la fracción de manosa 6-focfato también parece desempefiar una función importante en el seiralamiento de objetivos o blancos de las hidrotasas ácidas para los lisosomas de las cetulas, en las cuales estas hidrolacas han sido sintetizadas (capítulo 56). El proceso de endocitosis mediado por un receptor, tiene su aspecto nocivo, ya que por este mecanismo comienzan a dañas los virus que causan enfermedades tales como hepatitis (que afecta n las celulas hepaticas), poliomielitis (con afeccibn a las neuronas motoras) y el SlDA (que afecta las células T). La intoxicación con hierro tambien se inicia con una captación excesiva por medio de endocitasis.
Mernbranns: estrucaura, ensamble y función
B. Exocitosis La mayor parte de las células liberan macromolCculas al exterior por exocitosis. Este proceso está implicado también en la remodelación de la membrana cuando los componentes sintetizados en el aparato de Golgi se transportan en vesículas hasta la membrana plasrnhtica. Con frecuencia, la señal para la exocitosis es una hormona que. cuando se une a su receptor en la superficie celiilar, induce un cambio local y transitorio en la concentración del Caz'. Este ion desencadena la exocitosis. En la figura43-22 se comparan los mecanismos de exocitosis y endocitosis. Las moléculas liberadas por exmitosis pertenecen a tres categorías: 1) Pueden adherirse a la superficie celular y convertirse en proteínas perifkricas, por ejemplo, antigenos. 2) Pueden volverse parte de la matriz extracelular, por ejemplo, colagena y glucosaminoglucanos (mucopolisacáridos). 3) Pueden pasar al liquido extsacelular y servir como seiial para otras células. L,a insulina, la hormona paratiroidea y las catecolaminas se empaquetan en grinulos y procesan dentro de las celulas para liberarse bajo una estimul a c i ~ napropiada (capítulos 47,49 y 5 1).
Algunas señales se transmiten a través de membranas Sefiales bioquimicas especificas tales como neurotransmisores, hormonas e inrnunoglobu tinas, se unen a receptores especificas (proteinas integrales) expuestos en el exterior de membranas celulares y transmiten información a travks de estas membranas al citoplasma. Este mecanismo comprende la generación de cierto número de sejiales que incluyen nuclebtidos ciclicoc, calcio, fosfoinositidos y diacilglicerol y se estudia en detalle en el capítulo 44.
La información puede comunicarse por contacto intercelular Hay muchas h e a s de contacto intercelular en un organismo metazoario. Esto hace necesario el contacto
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entre !as membranas plasrnáticas de las cklulac individuales. Las celulas han desarrollado regiones especializadas en sus membranas para la comunicacibn intracelular en estrecha proximidad, Las uniones d e abertura median y regulan el paso de iones y de moléculas pequeñas a través de un angosto poro hidrofílico, que conecta el citoplasma de las células adyacentes. Es a travis de esta abertura central que los iones y las moléciilas pequeñas pueden pasar de una cdlula a otra de manera regulada.
LAS MUTACIONES QUE AFECTAN LAS PROTE~NASDE LA MEMBRANA CAUSAN ENFERMEDADES En vista de que las membrana se IocaIizan en tantos organelos y están implicadas en tantos prmesos, no es de: sorprender quc las mutaciones que afectan sus constituyentes proteinicos pueden resultar en muchas enfermedades o trastornos. Las proteinas en las membranas pueden clasificarse como receptores, transportadores, canales iónicos, enzimas y componentes estructurales. Los miembros de todas estas clases a menudo están glucosilados, así que las mutaciones que afectan este proceso pueden alterar su funcibn. En el cuadro 43-1 0 se listan ejemplos de enfermedades o trastornos debidos a anormalidades en las proteinas de membrana; ambos se refieren principalmente a mutaciones en las proteinas de la membrana plasmAtica, con una que afecta la función lisosbmica (enfermedad de cklulas 1). Casi 30 enfermedades o trastornos geneticos se adscriben a mutaciones que afectan varias proteinas implicadas en el transporte de arninoacidos, azúcares, lipidos, urato, aniones, cationes, agua y vitaminas a través de la membrana plasmltica. Las mutaciones en genes codificadores de proteínas en otras membranas tambien pueden tener consecuencias lesivas. Por ejemplo, las mutaciones en los genes codificadores de las proteinas de la membrana mitocondrial implicadas en la fosforilaci6n oxidativa pueden dar lugar a problemas neurolbgicos o de otro tipo (capitulo 64).
Figura 43-22. Comparacton de los mecanismos de endocitosrs y exocitosis. La exocitosis implica el contado de dos monocapas de supetfrciec internas (lado citoplásmim), en tanto que la endocitosis es consecuencia del contacto de dos monocapas de superficies exteriores.
Cuadro 43-10. Algunas enfermedades o estados patoliigicos que resultan de, o se atrihu yen a, irmalidades de las membrar - - ' -
tdciiines en el gen que codillcx el receptor J del factor de crecimiciito dc los ohlastos -- .k crolemia fi taciones en i el gen qut: codifica e 1 receptor -- -E -ibrosis rliiistica T.-------taciones en el-gen que codifica 1 nsportnd . -- . --. . I los gcnes que coditic:an los can ales de iones en el coirazón C ongcniio dlr OT larga taciones cn -- - -- -- .. 1-de U'zlsor1 tüciones enIp.p el gen qut:. codifica Lina ATPasridependieiitc de- cohr --- -- ..-. . ..--- . -T -"1 Mlitaciones en ei gen que coairica ,ia b*,i c>,. ~ n crocrotransrerasa, que rcsuita cn la ;enal de Me iica de ciert 1s taciones eri el gen q iie codifica la espectrina, una prWteina e5tr s hereditar la nbrana . - ccl.ulnr Metástasis ~rmalidadesen las cadenas dc otigosacáridos de la membrana. se consideraque de importancia las glucoproteinas y los plucolípidos I Iemoglobinuria paroxistica nricturna hciones que resultan en la adhesión deficiente del aiiclrt de GPI a ciertas de la membrana eritrocitic .-.Iproteinas---,".,.,u..-
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* Los trmtornos que se l i s;tan se describen despues en otros capitulas. El cuadro muesiira ejemplos de mutacioines que afec tan recepton:S.
un. transpor . . tador, . . canalt:S ,de iones, . emimas y prowlnas estructurales. Tarnbien se p resentan ejemplob. de la . glucosilaci6n defectuosr1 0 aiteraaa Qe ias giucoproreinris. La mayor parte de las situaciones que se Iistan afectan ia mcmnrana plasmatica.
Las proteinas de membrana tambien pueden afeaarse por condiciones diferentes a las mutaciones. La fonnación de autoanticuerpas al receptor de la acetilcolina pn el muscu!o esquelético causa la miastenia grave (capimlo 63). La isquernia puede afectar con rapidez la integridad de diversos canales ibnicos en las membranas. Las anormaIidades en los constituyentes de la membrana diferentes de las proteínas también pueden resultar lesivos. Con relacibn a los lipidos, el exceso de colesterol (por ejemplo, en la hipercolesterolemia familiar), o de lisofosfolipidos (por ejemplo, despuds de la mordedura por ciertas víboras cuyo veneno contiene fosfolipasas), o de glucoecfingolipidos (por ejemplo, en la esfingolipidosis) puede afectar el funcionamiento de la membrana.
RESUMEN Las membranas son estructuras complejas compuestas de lípidos, carbohidratos y proteinas. La estructura bhsica de todas las membranas es la bicapa lipidica. Esta bicapa está constituida por dos hojas de fosfolípidos donde los grupos de cabeza polar hidrófila están orientados lejos uno de otro y se exponen al enromo acuoso en Eas superficies interna y externa de Ea membrana. Las colas no polares hidrófobas de estas moleculac se encuentran orientadas una hacia oha, en direccibn al centro de Ia membrana. Las proteínas pueden ser un componente integral de la membrana y expandirse o adherirse por carga elec-
trostitica, a las superficies interna n externa de la propia membrana. Alrededor de 70 tipos de membranas de una cClula de mamífero tienen funciones intríiisecas (por ejemplo, actividad enzimática) y definen compartimientos o ambientes especiali7ados dentro de la célula, que tienen funciones especificas (por ejemplo, lisosomas). Se considera que el ensamble de la membrana es complejo. La asimetría de Ias proteínas y de los lípidos se conserva durante el ensamble de la membrana. Muchas proteínas se dirigen a su destino por secuencias de seilal. La principal decisibn de clasificación se efectúa cuando las proteínas se reparten entre los polirribosomas citos6licos y los enlazados a la membrana, por la ausencia o presencia de un péptido sefial. Muchas de las proteínas sintetizadas en el segundo tirio de ribosomas nroceden hacia el aparato de%oigi 8 la membrana pjasrnática en vesículas de transporte. Diversas reacciones de glucosilación acontecen en compartimientos de[ aparato de Golgi, y las proteinas se clasifican en seguida en la red trans-Golgi. Al parecer la mayor parte de las proteínas con destino a la membrana plasrniitica y para secrecibn carecen de señales especificas, lo cual constituye un mecanismo por omisi6n. Se presenta la función de las proteínas chaperonas en el doblamiento de las proteinas y se resume un modelo que describe la gemación y adhesión de las vesicu2as de transporte a la membrana blanco. Ciertas moléculas se difunden en forma libre a traves de las membranas, pero el movimiento de otras esta restringido por el tamafio, carga o solubiIidad. Para conservar gradientes de estas moICculas amvds de
Membranas: estructura, ensamble y finción
la membrana se emplean varios mecanismos, pasivos y activos. Ciertos solutos, por ejemplo glucosa, entran a las cklulas por difusión facilitada, siguiendo u n gradiente de concentración alto a bajo. En estos procesos intervienen molecu las portadoras o transportadoras especificas. Para mover moltSculas cnn carga (Na-, K', Ca", etcdtera) a travks de las membranas es frecuente el uso de conductos con accesos activados por ligando o voltaje. Las moléculas grandes pueden entrar o salir de las ccluIas por mecanismos como endocitosis o exocitosis. A menudo, esfos procesos requieren el enlace de la molCcula a un receptor, que
591
le confiere especificidad al proceso. Por Ultimo, los receptores pueden ser componentes membranales (en particular de la membrana plasmhtica). Es posible que la interacción de un ligando con su receptor no signitique que los dos penetren al interior de la célula, pero si conduce a la generacihn de una seaal que influye en las actividades intracelulares. Las mutaciones que afectan la estructura de las proteinas de la membrana (receptores, transportadores, canales de i'ones, enzimas y proteínas esmicturales) puede ser causa de enfermedad; los ejemplos incluyen a la tibrosis quistica y a la hipercolesteroiemia. II
REFERENCIAS Ralch WE, Farquhar MG: Be) ond hulk flom Trends Crll BioP 1995.5: 16. Dawidowicz EA: Dynamics ormembrane lipid metabolism and iurnover. Annu Rcv Biochem 1987,56:43. Ellis RJ, van dex Vries SM: Malecular chaperones. Annu Rcv Riochem 1991,h0:32 1. Gen n i s RR: Biomernbrunes: .ZfolecuEer Structure and Function. Springer-Verla&, 1989. Gilmore R: Protein translocation across thc cndoplasmic reticulum: A tunncl with toll hooths at entry and rxit. Ccll 1993175589. Jain M K : Inboduction to B i o i o ~ ~ c.Wembranes. al 2nd ed. Wiley. 1988. J e n n i n ~ sML: Topography of membranc protcins. Annu Reu Biochem 1989:58:949. Kirchhausen T: Coated pits aiid coated vesiclec-sorting it al1 out. Curr Opin Struct Biol 1993;3:182. L i z a r o w PB, Moser HW:Disorders of pcroxisome hiogenesis. In: The :Merabolic and Wolecular Baws of hherifed Daeme, 7th ed. Scriver CR et al. (edrtors). McGraw-Hill, 1995. Pearse BMF: Clathrin. adaptors, and sorting. Annu Rev Cel l Bial 1990:6: 15 1. Rosenberp: LE, Short EM: Inherited defects of mcmbrane transport. I n Harsison 'S Principies ojlnternal Medi-
cine, 13th ed. Isselbacher KJ et al. (editors). McCirawHill. 1994. Rothman JE: Mechanisms of intraccllular protcin transpon. Nature 1994;372:55. Rothman JE, Warren G: Irnplications ef the SNARE hypothesis for intracellular membnne topology. Curr tiial 1994;4:220. Sabatini DD, Adesnick MR: The biogenesis of membranes and organelles. In: The :Weraholic and ;Woleculor Ru.res of Snherited Disease, 7th ed. Scriver C1Z et al. (editors). McGrai*-Hil!, 1995. Schatz C: l'he protein import rnachinety of mitochondria. Protein Sci 1993;2.141 Sch lesinger MJ (editor): Lipzd ,tfodzfication of Prorezns CK(: Press, 1993. Silverman M: Structure and function of hcxosc transporters. Annu Rev Riochern 1991;60:757. Smythe E, Warren C: The mechanmism of receptor-mediatcd cndocytosis. Eiir J Biochcm 1992;202:689. Stein WD: Transport ond Diffusion dcro.~sC'eli Memhranes. Academic Press, 1986. Vance DE, Vance JE (editors): Biochemisrry of Lipzds, Lipoproteins and :ifernbmnes EIsevier, 1991. Williams DR: Calnexin: A molecular chapmone with a tate fur carhhydmte. t3iochem Cell Riol 1995,73 123.
Accián de las hormonas
La acción de las hormonas a nivel celular comienza con la reunión de ésta con su receptor especifico. Las hormonas pueden clasificarse por la ubicacirin de su receptor y por la naturaleza de la serial o del segundo mensajero usado para mediar la accion hormonal dentro de la d l u l a . Se han definido cierto número de estos segundos mensajeros. Se ha avanzado bastante en la dilucidacidn de la forma en que las hormonas trabajan intracelularmente, en particular respecto a la regulación de la expresión de genes expecíficos.
El diagnhtico racional y la tmp&uticade una enfermedad dependen de la comprensibn de su fisiopatologia y de la capacidad para cuantificarla. Los padecimientos del sistema endocrino, causados, por lo general, por producción excesiva o deficiente de Ias hormonas son un ejemplo excelente de la aplicación de principios básicos a la medicina clinica. Conocer los aspectos generales de la acción hormonal y comprender los efectos fisio16gicos y bioquímicos de hormonas individuales permite reconocer los sindromes de enfermedades endocrinas causadas por su desequilibrio y aplicar el tratamiento adecuado.
LOS RECEPTORES DE HORMONAS SON FUNDAMENTALES Los receptores discriminan con precisión Las hormonas se encuentran en el líquido extracelufar en concentraciones muy bajas, por lo general, del orden de lo-" a 1 mol/L. Esta es una concentraci6n
mucho menor que la de numerosas moltculas de estructura análoga (esteroles, aminoácidos, phptidos, proteinas} y otras rnol&culas que circulan en concentraciones del orden de 10" a 10" mollL. Por tanto, las células blanco deben distinguir no sólo entre hormonas distintas presentes en cantidades pequeflas sino también entre una hormona dada y el exceso de I oha 10"eces otras moléculas. Este alto grado de discriminación se debe a moléculas de reconocimiento adheridas a las células, que se conocen como receptores. Las hormonas inician sus efectos bioliigicos por fijación a receptores específicos y dado que cualquier sistema de control eficaz debe proporcionar también un medio de detener la respuesta, las acciones inducidas por las hormonas, por lo general, terminan cuando el efector se disocia de t receptor. Una célula blanco está definida por su capacidad para fijar de manera selectiva una hormona dada por medio de un receptor, interacción que a menudo se cuantifica mediante ligandos radiactivos que imitan el enlace de la hormona. Esta interacción tiene varias características importantes: 1) la radiactividad no debe alterar la actividad biológica del ligando; 2) la fijación debe ser especifica; es decir, desplazable por un agonista o antagonista no marcado; 3) la fijacihn deber&ser saturable, y 4) ocurrir dentro de los limites de concentración de Ca respuesta biolbgica esperada.
En los receptores concurren dominios de reconocimiento y acopladores Todos tos receptores, sean para polipkptidos o . . esteroides, tienei cuando menos dos dominios h n cionales. Un dominio de reconocimento retiene a Ea hormona y una segunda región genera una seiial que acopla el reconocimiento de la hormona con alguna funcibn intracelnlar. El acoplamiento (transducción de seaal) ocurre en dos vias generales. Las hormonas
jP4
Bioqzaimica d~ Harpcr
polipeptídicas y proteinicas y las catecolaminas se unen a receptores localizador en la membrana plasrnática y con ello generan una sella1 que regula varias funciones intsacelulares, a menudo por modificación de la actividad de una enzima. Los esteroides y las hormonas tiroideas interactban con receptores iritracelulares y el complejo que se forma proporciona la sefial (véase adelante). Ya se conocen las secuencias de aminoácidos de estos dos dominios en numerosos receptores para hormonas polipeptidicas. Los receptores de hormonas tiroideas tienen varios dominios funcionales; un sitio fija la hormona, otro se une a regiones especificas del DNA, un tercero activa (o reprime) la transcripci~n genica y un cuarto puede especificar un enlace de elevada afinidad por otras proteinas. En última instancia, fa doble funcibn de fjaci6n y acoplamiento definen a iin receptor y es el acoplamiento de ta fijacihn de la hormona a la sefíal de transducción, designado como acoplamiento receptor-efector, lo que proporciona el primer paso en la amplificación de la respuesta hormonal. Este doble propósito sirve también para distinguir al receptor de c6fulas blanco de tas proteínas plasmiiticas transportadoras que retienen a la hormona pero no generan señales.
Los receptores son proteínas El receptor para acetilcolina, que fue facil de purificar, dado que existe en cantidad relativamente grande en el árgano etectrico de la anguila Torpedo culfornica, es uno de los primeros receptores estudiados en forma detallada. Este receptor está constituido por cuatro subunidades en la configuracihn al fa^, beta, gamma y delta. Las dos subunidades alfa retienen a la acetilcolina; la tkcnica de mutagénesis dirigida a un sitio se ha usado para mostrar cuales regiones de esta subunidad intervienen en la forrnacion del conducto iónico transmembrana, que realiza la fi1nci6n principal del receptor de acetilcolina. Otros receptores se encuentran en las células en cantidades muy pequeiias y por ello se dificulta su purificación y caracterización por tdcnicas clasicas. Las tecnicas del DNA recombinante permiten la obtención de cantidades adecuadas de material para estos estudios y los han convertido en un hrea activa de investigación. El receptor para insulina es un heterotetrámero (alfa2betaz) enlazado por múltiples puentes disulfuro, cuya subunidad extramembranal retiene a la insulina y la subunidad beta, expandida en la membrana, transduce la señal, quizá con ayuda del componente tirosina cinasa de la porci6n citoplasmica det heterotetrámero. En general, los receptores para el factor de crecimiento semejante a insulina 1 (IGF-1, del
(Capitulo 43)
inglés, iizsulin Iike groubth fictor), e1 factor de crecimiento epid6rmico (EGF, del inglks. epidermai groii)thfucfor) y las lipoproteina de baja densidad (LDL), son semejantes al receptor pasa insulina. Los receptores para hormonas polipeptídicas que transducen señales por alteración de la velocidad de producción de AMP ciclico se caracterizan por la presencia de siete dominios que se expanden en el cspesor de la membrana plasmática. Una comparacion de varios receptores para hormonas esternideas con los receptores para la hormona tiroidea reveló una notable conservación de la secuencia de aminoácidos en las regiones, en particiilar los dominios de enlace con el DNA. Esto condujo al punto de vista de que los receptores del tipo csteroide!tiroide constitiiyen una superfamilia grande. Muchos miembros relacionados con esta familia no tienen ligando conocido, de aquí que se nombran receptores huérfanos. Estos receptores tienen varios dominios funcionales. El receptor de glucocorticoides es un ejemplo adecuado (figura 4 8 4 ) . Esta moltcula tiene varios dominios funcionales: 1) una region fjjadora de hormona en la porcion ciirboxilo terminal; 2) una regián adyacente de enlace con DNA; 3 ) al menos las regiones de activacion de la transcripcibn gdnica; 4) al menos dos regiones responsables de la traslocaci6n del receptor desde el citoplasma al núcleo, y 5) una región que enlaza proteina de golpe de calor en ausencia de ligando.
LAS HORMONAS PUEDEN CLASIFICARSE DE DIFERENTES MANERAS Las hormonas pueden clasificarse de acuerdo a composici6n química, solubilidad, ubicación de sus receptores y naturaleza de la sefial usada para mediar su acci6n dentro de [a cklula. En el cuadro 44-1 se ilustra una clasificacién basada en las dos ultimas propiedades y en el cuadro 44-2 se muestran las características generales de cada grupo. Las hormonas del grupa I son lipofílicas y, con excepcion de TI y Tq se derivan del colesterol. Después de su secrecidn, estas hormonas se unen a las proteinas transportadoras, proceso que esquiva al problema de la solubilidad en tanto que proIonga su vida media plasmhtica. La hormona libre atraviesa con facilidad la membrana plasmhtica de todas las celulas y encuentra receptores en el citosol o en el núcleo de las células blanco. Se asume que el comple-jo ligando-receptor es el mensajero intracelular en este grupo.
Accidn de Ius hormonas * 595
Cuadro 44-1. Clasificaci6n de hormonas a partir de su mecanismo de accihn .. -
Cuadro 44-2. Caracteristicas generales de las clases de hormonas . . -- . .-
--
. .-- -
-..-
..
upo l
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Tipos
Calcitriol (1,L3[UHJz ,,, Estrogcno: Glucocorti Mineraloci
"
Frtigestina'i
m. .
tido (o arrIbos): -
Acetilcolitia (muscarinico) Hormona liberadora.de gonadoi . . Catecolaminas a l-aarcnerglcas Oxiiocina Factorde c:reciniientci derivado Lle plaquezas (PDGF) Aiigiotensina II '
D
Colccistoc:inina Hormona liberadora dc tirotropina (TRH) íjastrina tiomuna aniiuiuretica (ADt-I,vasopresina1) D. El segundo rnensajt:ro es una cinasa o laI cascada de fosfatasa: ., . (,(-,SI, Somatomamotropina corionica Factor de c~cimientosimilar a in*rulina (IGF-1, IGF-Il) Eritropoyetina (EPO) Factor de crecimiento (EFG) Factor nervioso de cre,,, . Factor de c fibroblástic Factor de c derivado dt Hormona ( nto (GFI) n .. r.
3
k i s , pro-
._,.: , .. . triol. re'tinoides teinas, c atecola.-minas . 1,iwbfílc ' Hidrblifo ._
Acido retirioico tlormonas tiroideas ( Grupo 11. H»rmonas que se jr/iin a receptori 2nd$os cn la siuperJcie c A. El segundO mensaje FP: inas a2-ad, L ~ ~ L L L ~ J I ~P-adrtiicl I I I ~ ~ ~ S t lormona adrenocotti hngiotcnsina IF 1 lomtina antidiurttic Calcrtnnin Glucagón Lipotropina (LPH) Hormona 1luteinisanti:(LH) Ilorrnana estimuladora de melanociios (M Hormona paratiroidea {PTH) Gcinadotropina ccirihnica hurnar Hormona liberadon dc corticotropina (LK Flornona 1:stimulantt: de los fol ictrlus (FSI Sornatostatina t1ormona 1:stimulado ra del tiroi,des (TSt.1) rr. LI segunao mensajero es cm.-.~ iI .P . v Factor nutriurético aiiriculrtr (A-NF) Oxido nltrico (ON) C. El segundo mensajt?roes calc
,,,L,,,L,
les. yodo-
,,
Soliihilidad Protc ínas tran: tadoras
-
A
tica ular
Mediador
Cornplr tor horr
metaboliros d e complejos fosfoinositidos. caqcudas dc cinasa
El segundo grupo principal consiste en hormonas hidrosotubles que se unen a la membrana plasrnática de la célula blanco. Las hormonas que sc fijan a la superficie celular se comunican con los procesos metabólicos intracelulares a través de moléculas intermediarias, llamadas segundos mensajeros (la hormona misma es el primer rnensa-jero), que se generan como consecuencia de la interaccion entre ligando y receptor. El concepto del segundo mensajero surgió de la obsewacion de Sutherland de que la adrenalina se une a la membrana plasrnática de los eritrocitos de pichbn e incrementa el cAMP intracelular. A esto sigui6 una serie de experimentos en los cuales se encontró que el cAMP media los efectos metabolicos de numerosas hormonas. Las hormonas que es evidente utilizan este mecanismo se muestran en el grupo 1I.A del cuadro 44-1. Hasta la fecha una hormona, factor natriurézico auricular (ANF, del inglés, alriul nairiurericfuctor), usa cGMP como segundo mensaj ero, pero otras hormonas probablemente se adicionarán al grupo 1I.B. Varias hormonas, muchas de las cuales previamente se pensó que afectaban al cAMP, al parecer usan calcio o metabolitos fosfoinosítidos (o ambos) como seAal intracelular. Éstas se muestran en el grupo 1I.C. Para el grupo 1I.D el mensajero intracelular es una proteína de la cascada de la cinasa fosfatasa. Varias de las cuales están identificadas y una hormona dada puede utilizar mLs de una cascada de cinasa. Unas cuantas hormonas encajan dentro de mkc de una categoria y las adscripciones cambian con cada información nueva.
LAS HORMONAS DEL GRUPO I TIENEN RECEPTORES lNTRACELULARES Y AFECTAN LA EXPRESIONGÉNICA
Las caracteristicas generales de Ea acción de este grupo de hormonas se ilustra en la figura 44-1. Estas mol6cuIas lipbfilas se difunden a travks de la membrana plasrnktica de todas las células pero sOlo encuentran un receptor específico, de elevada afinidad, en las células blanco. A continuación el mmplejo homonareceptor experimenta una reaccibn "activación" dependiente de la temperatura y de la composición safina, que conduce a cambios de tamaflo, confomación y carga superficial que lo vuelven capaz de unirse a la cromatina. Si esta unión y el proceso de 'hctívacibn" ocurren en el citoplasma o en el núcleo. aún está en duda, pero no es crucial para comprender el proceso completo. El complejo hermona-receptor se une a una regi6n especifica del DNA (denominada el "elemento de respuesta a Ea hormona") y activa o inactiva a genes especificas. Al afectar de manera
selectiva la iranscripción del gen y la producción de los mRNA respectivos, se cambian las cantidades de proteínas especificas y se influyen los procesos metabolicos. El efecto de cada una de las hormonas de este p p es bastante específico; por lo general, la hormona afecta a menos de 1% de las proteinas o del mRNA en una cklula blanco. Este libro se concentra en las acciones nucleares de las hormonas esteroídes debido a que están muy bien definidas. Tarnbien se describen las acciones directas en el citoplasma y en varios organelos y membranas. La mayor parte de la información sugiere que Las hormonas esteraides ejercen su efecto predominante sobre la transcripción genica, pero estas y muchas otras pertenecientes a las demás clases que se estudian adelante, pueden actuar en cualquier etapa de la "vía de informacibn", ilustrada en la figura 44-2. Aunque no se comprende bien la bioquirnica dc la transcripción gCnica en las cilulas dc los mamiferos,puede esquemati7arse un modelo general de los requerimientos estructurales para la regulación esteroide y tiroidea de esta transcripción (figura 4-4-31. Estos genes deben estar en las regiones de cromatina "abierta" o de transcripción activa (dibujada como la
MEMBRANA CELULAR
Pmtelna especifica
Figura 44-1. La hormona esteroidaa o tiroidea se une a un receptor intracelular y causa un cambio de confomacibn en el último. El complejo formado se ftja a una región especifica del DNA. el elemento sensible a hormona (HRE) y esta interacción activa o reprime un numero restringido de genes.
Acción de las horrnonu.~ 597
-----t - - - - -
Transporte Degradacion activa* inaaiva
CITOPLASMA
TRANSLACI~N
Proteína
Degradación
Figura 44-2. La "vía informativa" Las hormonas pueden afectar cualquiera de estas etapas.
burbuja en la figura 44-1). como lo indica su susceptibitidad a la digestiiin por la enzima DNasa 1. Los genes estudiados hasta la fecha tienen por lo menos dos elementos reguladores separados (sitios de control) en la secuencia del DNA 5', inmediata al sitio de inicio de la transcripción (figura 44-3). El primero de ellos, el elemento promotor (PE, del inglés,prornoter dement) es generico, puesto que está presente de una u o r a forma en todos los genes. Este elemento específica el sitio de adherencia de la RNA polimerasa 11 al DNA y por tanto la exactitud en el inicio de la transcripcion (capítulo 41). Un segundo elemento, el elemento de respuesta a hormonas (HRF,, del inglés, hormone response element), se ha identificado en numerosos genes regulados por hormonas esteroides. Se IocaIiza un poco mas lejos en direccibn 5' que el elemento pro-
motor y puede estar constituido de varios elementos discretos. Es probable que el elemento de respuesta a hormonas (HRE) module la frecuencia de inicio de la transcripción y dependa menos de la posición y la orientacion; a este respecto, se parece a los elementos amplificadores de la transcripción que se enciienimn en otros genes (capitulo 41). Generalmente, el HRE se localiza dentro de unos cuantos cientos de nuclebtidos corriente arriba del sitio de inicio dc la transcripción. pero su ubicacion precisa varia de gen a gen. En algunos casos se ubica dentro de &te. Genes controlados por varias hormonas tienen un número correspondiente de HRE. Aunque las reacciones iniciales son diferentes, las hormonas peptidicas también ejercen sus efectos sobre la transcripciiin a través del HRE. Por ejemplo, muchas de las hormonas que usan cAMP como segundo mensajero afectan la transcripción. Una proteína especial, la proteína fijadora del elemento de respuesta a cAMP (CREB. del inglés, cAMP response elemenral binding), es el factor que actúa íram (análogo al recepror de hormonas esteroides/tiroideas) en estos ejemplos. Se conocen las secuencias de consenso del DNA para varios H RE (cuadro 44-3). La identificaciún de un HRE requiere que éste se fije al complejo hormona-receptor con mayor avidez que lo hace el D N A circundante o el DNA de otra fuente. En los casos antes citados, esta fijacihn especifica se ha demostrado. Además, el H R E debe conferir sensibilidad a la hormona. La secuencia reguladora putativa del DNA puede estar ligada a genes relatores para valorar este punto. Usualmente, estos "gcnes d e fusión" contienen genes relatores que de ordinario no son influidos por la hormona y a menudo no se expresan normalmente en el tejido que se esth probando. Por lo general, los genes relatores usados son globina, tirnidincinasa y la cloranfenicol acetiltransferasa bacteriana. El "gen de fusiiin" se transfiere a una célula blanco y si ahora la hormona regula la transcripción del gen relator funcionalmentc se ha definido a un HRE. Los efectos de posicibn, orientación y sustituci6n dc bases pueden definirse con exa~titudusando esta técnica. La forma precisa en que
Elementos de respuesta a hormonas (HREj
Elemento promotor (PE)
Gen
t 1' sitio sitio de inicio de terminacron de transcnpcion
Figura 443.Requerimientos estructurales para la regulación hormonal de la transuipcibn génica.
L Regibn de DNA reguladora
1
4 Región de DNA estructural
Cuadro 44-3. Secuencias de DNA de varios elementos sensibles a varias hormonas (WRE)* - -. -.-.
u
-
inalefectoi Horrnr - .-
Glucocorticoicles Progestinas - . ,. Mincraiocortic'oiues AncIr6gcms EstrOpenos i,loímona tiroiidea Acido retinoico Vits
- -
-r--
.
.. . .--. . .-- - - --
.
H RE
G RIE PRI x IV1K E AR1E E RIE TRIE RA
GGTACA NNN .l'G7' -
u
Sr',
-
SecuenciaI de DNA
--
.-
,,,,,
- - - - -- -- --
-
1 AGGTCA
+
- -
, AGGTCA NJ,4,5 AC
VD
CRI chh ---- Tí¡ ACGT * Las ieuas rnaican nucltotiaos, N siznirica cualquiera ue IRF cua[rn que pueden uiilitaíse en esa posicion i,ac iiecnrs q u e npitnran en direcciones opuestas ilurtran palfndromos invertidos ligeramente imperfectos prescnics en muchos IIRE, en algunos casos kstos se designan como "sitios de fijaciiín media" debido a que cada uno se une a un monbmero dcl receptor. El GRE, PRE. MRE y ARE contienen lamismaseciiencia de UNA. Es posible qiic laespecificidad la confiera Taconcentracibn intracelular del ligando o del receptor de hurmona mediantc secuencia de LINA colaterales no incluidas en el conwnw n por otros elementos accesorios Un segundo p p o dc HRF incluye lar corre~pnndicnteca horniona~tiroidcas. estrhgenos, ácido retinoiw y viiamina D. Lstos HRE son mu> semejantes excepto por la orientacición \. el e~pacioentre mitades del pallndromo. El espacio determina la cfpecificidad de la hormona VDRF M = 3). '1'Kt' (N 4) y RARE (N = 5) se ligan a rcpeiiciones directas más que a rcpeticiontc inversas. Otm miembro de la ciiperfamilia del receptor de esteroides, el receptor dc cetinoide ?C (RXR), forma heterudimeros con VDR, TR y M R E . estos conformaii lo%factorcs de actuac~hritrnna. El cAMP afecta la transcripci6n del gen niediante el CRE.
la interaccibn del complejo hormona-receptor con el HRE afecta a la transcripcibn es en la acnialidad un área de investigacibn activa. El inicio de la transcripcion es un sitio probable de control, pero también podrian producirse efectos sobre el alargamiento y la terminacidn. Se proponen sitios de control más I.jos en direccihn 5' del sitio de inicio o en direccibn 3' corriente abajo, dentro o mhs aIlá del gen. Finalmente, también pueden operar las mecanismos de contro! de la acci6n iruns (por ejemplo, de otro cromosorna). Pruebas recientes sugieren que, aunque elementos de respuesta a hormonas (HRE) simples transmiten una respuesta. en numerosos genes el proceso puede ser mucha rnls complejo. Es probable que los HRE existan combinados con otros elementos (y proteinas fijadoras) para funcionar de manera óptima. Tales ensambles de elementos del DNA con acruacilin cis y factores con actuación frans se denominan unidades d e respuesta hormonal.
LAS HORMONAS DEL GRUPO FI (PEPT~DICAS)TIENEN RECEPTORES DE MEMBRANA Y USAN MENSAJEROS INTRACELWLARES La mayor parte de estas hormonas son hidrosolubles, no tienen proteinas transporiadorac (y por tanto su vida media pIasrnatica es corta) e inician una respuesta al fijarse a un receptor localizado en la membrana plasmática (cuadros 44-1 y 44-2). El mecanismo de a c c i ~ nde este grupo de hormonas puede describirse mejor cn t&-rninos de sus mensajeros intracelulares.
Muchas hormonas utilizan cAMP coma segundo mensajero El CAMP(AMP cfclico y 6cido 3',5'-adenílico; fígum 20-5), un nuclehtido ubicuo derivado del ATP a travks de la acciiin de la enzima adenilil ciclasa, desempefia una función decisiva en la actividad de cierto número de hormonas. La concentracibn intracelular del cAMP se aumenta o disminuye por varias hormonas (cuadro 4441, y este efecto varía de tejido a tejido. La adrenalina produce grandes incrementos del cAMP en el músculo y cambios relativamente pequeflos en el hígado. Lo opuesto sucede con el glucagón. Los tejidos que responden a varias Cuadro 44-4, Siibclasificacibn de Ias hormonas .'P' u-" F?rUpo I1.P .. ... -.----- .no1rmonas qiie estimuli nonas que inhiben a la ñdenilil ciclasr (H, adenilil cic:\asa (H,)
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1
Acción de las hormonas
hormonas de este grupo lo hacen a travds de receptores Unicos que convergen sobre una malécula sencilla de adenilil cictsa. EE mejor ejemplo de esto es el adipocito, en el cual, la adrenalina, ACTI-I, TSH, glucagon, MSH y vasopresina (ADH) estimulan a la adenilil ciclasa e incrementan el cAMP. Las combinaciones de concentraciones de eficacia maxima no son aditivas y los tratamientos que destruyen a un receptor no tienen efecto sobre la respuesta de la célula a otras hamonas.
A. Sistema de la adenilil ciclasa [,os componentes de este sistema en las cdlulas de los mamíferos se ilustran en la figura 4 4 4 . La interaccidn de la hormona con su receptor resulta en la activacibn o inactivacihn de la adenilil ciclasa o algún otro efector molecular. Los receptores que se enlazan a efectores mediante la protelna intermedia enla~adorade GTP, descritos previamente, de manera cllsica tienen siete dominios hidrofóbicos adscritos a la membrana. Esto se: muestra en la figura 4 4 4 . Al menos dos proteinas dependientes de GTP median la regulacion de la adeni ti1 ciclasa, y se designan G, (estimuladom) y 6, (inhibidora), cada una de las cuales se compone de tres subunidades: alfa, beta y gamma. La adenilil ciclasa, que se 1ocalij.a en la superficie interior de la membrana plasmhtica, cataliza la formación de cAMP desde la ATP en presencia de magncsio (figuras 44-4 y 35-13). Lo que originalmente se concibió como una proteína sencilla con dos dominios Funcionales, en la
\C
GDP
No hormona: efector inactivo
599
actualidad se ve como un sistema de complejidad extraordinaria. En los ÚItimos 20 afios, cierto numero de estudios ha establecido la unicidad hioquimica del receptor de la hormona, el complejo de la proteína reguladora GTP y la adeniril ciclasa, cuyo modelo reciente se ilustra en la figura 4 4 4 . Diferentes hormonas peptídicas pueden estimular (e) o inhibir (i) la producci~nde cAMP (cuadro 4 4 4 ) . Dos sistemas paralelos, uno estimulador (e) y otra inhibidor (i), convergen en una sola molecula catalirica (C). Cada uno consiste en un receptor, R, o R, y un complejo regulador, G , y G,. Estos dos últimos son trimeros compuestos de subunidades alfa, beta y gamma. Debido a que la subunidad alfa de G , difiere de la de C,,las proteínas son designadas alfa, (45 kDa) y alfa, (41 kDa). Las subunidadcs beta y gamma son proteinas de 37 y 9 kDa, respectivamente. Las subunidades beta y gamma esthn siempre vinculadas (beta gamma) y parecen funcionar como heterodimero. La fijaci6n de una hormona a R,o R, conduce a una activacibn de G mediada por un receptor lo cual acarrea la fijacion, dependiente de Mg2', de GTP por alfa y la separacibn concomitante de beta gamma de alfa. GTP
rrPy / rr*GTP + fly GTPasa
La alfa, tiene actividad intrinseca de GTPasa y la forma activa, alf&*GTP, se inactiva por hidrblicts del
'-c Hormona enlazada (H), efector activo
Figura 44-4. Componentes de! sistema efector receptor hormonal-proteína G. Los receptores que enlazan los efectores mediante proteínas G,de manera cl8cica tienen srete dominios de membrana pareados En ausencia de hormona (izquierda) el complejo heterotrimérim de proteina G ( a , p y y) esta en forma de enlace inactivo de difosfato de guanosina (GDP) y es probabre que no se relacione con el receptor. Este complejo se ancla a la membrana plasmhtica mediante grupos prenilados en las subuniidades py (lineas gruesas) y quqzái mediante grupos mrritolados en las subunidades n. Una vez que la hormona se enlata a! receptor se presume un cambio de la mnformaubn del receptor y la activacibn del complejo de la proteina G. Esta resulta del recambio de GDP y del trifosfato da guanosina (GTP) cobre la subunidad a, despues de lo cual se disocian a y By. La subunidad u se enlaza, y actwa, al efector (E) E puede ser una adenilil ciclasa (as), un canal de K+(U,,no),fosfolipasa C p (aq),U otra mol6cula. La cubunidad py tarnbrén puede dirigir acciones sobre E. (Reproducida con autorizacibn de Granner DK en. Pnnciples snd Practice of Endocrinology and Metaboiism, 2a ed. Becker KL [edrtor]. Lippinmtt, 1995.)
600 Biofluím ica de Harper
(Capirzilo 44)
GTP a GDP y se reconstniye el complejo trimerico G,. La toxina del chlera, de la que se sabe es un activador irreversible de la ciclasa, causa la ribosilación del ADP de alfa, y al hacerlo inactiva a la GTPasa; por tanto, alfa, se congela en la forma activa. La alfa, tambihn tiene actividad de GTPasa; sin embargo, el GDP no se separa esponthneamente de alfa,*GDP. La alfa, se reactiva por un intercambio de GTP por GDP. La toxina pertussis activa de manera irreversible a la adenilil ciclasa aI facilitar la ribosilación del ADP de al fa, lo cual impide que esta subunidad al fa, sea activada. N o se ha definido la función exacta de las subunidades alfa y beta-gamma en la regulacibn de la adenilil ciclasa. La alfa, puede estimular directamente a la ciclasa, y en ciertos casos la beta-gamma aumenta esta acción. La inhibición de la ciclasa es m i s compleja. Los efectos inhibitorios directos de la alfa, sobre la cicIasa resultan difíciles de detectar. Aunque algunos tipos de beta-gamma pueden inhibir ta ciclasa, una hipó~esismás aceptada es que el complejo G,de beta-al fa, el cual es mucho mhs abundante que el de G,, enlaza e inactiva a l f ~ . Ahora se sabe que hay una gran familia de proteinas G y que son parte de una superfamilia de GTPasa. La familia de proteína G puede clasificarse de acuerdo a la homologia de la secuencia en cuatro subfamilias, que se muestran en el cuadro 44-5. Hay mBs de 20 subundiades alfa. Se han identificado
cinco mol&culas solas de adenilil ciclasa. Diversas combinaciones de estas proporcionan un número grande de complejos alfa-beta-gamma posibles. Las subunidades alfa y el complejo beta-gamma tienen acciones independientes de aquellos, sobre la adenilil ciclasa. Algunos tipos de alfa, estimulan los canales de K' e inhiben los de Caz', y algunas maleculas de la familia G , inactivan al gmpo de enzimas de la fosforilasa C. Los cornplejoc beta-gamma se relacionan con la estimulación del canal de K' y activación de la fosfolipasa C. Las proteinas G están implicadas en muchos procesos biologicos importantes adicionales a la acción hormonal. Algunos de &tos se listan en el
cuadro 44-5. La importancia de estos componentes ha sido subrayada por un "experimento de la naturaleza". El seudohipopatiroidismo es un sindrome que se caracteriza por hipocalcemia e hiperfosfaternia, distintivos bioquimicos del hipoparatiroidismo y por cierto número de defectos congénitos. Las personas afectadas no tienen trastornos en la función paratiroidea; en realidad, secrctan cantidades abundantes de PTH biolbgicarnente activa. APgunos muestran resistencia del órgano blanco con base en un defecto posreceptor. Tienen deficiencia parcial de la proteína G (tal vez sólo la subunidad aIfq) y por tanto la fijacion no se acopla a la estimulación de la adenilil ciclasa. Otros al parecer generan cAMP en respuesta a la PTH, pero
luadro 411-5. CIases y funci ones medliadas de las proteínas GC,7 ..
- -....
Estimulos
--
1
-.. ..-- 7-
E fector enilil cicla!
Acettlcolina AdrenCrgicos a? Colinérgicos M, Opioidcs, endorf
1
I
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1
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GluconeogCnesis Lipblisis, glucogt Olfato i frecuenci:
t Canales de potasio
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l l -- _ I -I I * Reproducido (:on aiitorizat:i6n de Granncr DK in. I:'rinciples and i acfice afirndocrinologyand h4e~Aolrsrn,2n8d ed., Becker KL (editor) 'A
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LippincotI, 1'>95.
* Las cuatro principales cla: -. TnUCStTan
miferos (Q,, ( 1 2 )se basw en la hornologia de l a si proteínas. SI .. "- . L---L--. los -iiiieriiuruh rcprcccnwiivus Lie caaa una. iunto con esrimuios erectores y efecto biológico bien dcfiniaa. he nan identiticado
mas de 20 subunidades
(y.
Accidn de lus horrnvnus 4 601
no responden a la sefiat del cAMP. No sorprende Ia
observación de que las personas con seudohipoparatiroidismo a menudo muestran respuestas anómalas a otras hormonas, inclusive TSH, glucagón y agentes befa adrenégicos.
B. Proteina cinasa En las células procariotas, el cAMP se une a una proteina específica, denominada proteina reguladora de catabolitos (CRP, del inglés, cataholifereplatoqj protein) la cual se une directamente con el DNA e influye en laexpresionde! gen. Lamalogia deeste efecto con la acci6n descrita de las hormonas esteroides es aparente. En las dlulas eucariotas, el cAMP se une a una proteina cinasa que es una molécula heterotetrámera compuesta de dos subunidades reguladoras (R) y dos subunidades catalíticas (C). La fijación del cAMP conduce a la reacción siguiente:
El complejo RzCl no tiene actividad enzimática, pero la fijación del cAMP por R, separa a R de C, activando por consiguiente a esta última (figura 44-5). La subunidad C activa, cataliza la transferencia del fos-
fato gamma de ATP (Mg2+)a un residuo de serina o de treonina en una variedad de proteinas. Los sitios de focforilación con sentido son -Ay-Arg-X-Ser- y -LisArg-X-X-Ser-. donde X puede ser cualquier aminoácido. Las actividades de la proteina cinasa fueron en un principio descritas como "dependientes de cAMP" o "independientes de cAMP". El cuadro 44-5 muestra que esto se ha vuelto considerablemente mas complejo, ya que ahora se reconoce que la fosforilación de la proteina es un mecanismo regulador importante. Están descritas más de 100 proteínas cinasas, pero todas son moléculas unicas y muestran considerable variabilidad con respecto a la composición de la subunidad. el peso molecular, Ta autofosforilación, la Km para el ATP y la especificidad de sustrato.
C. Fosfoproteínas Se piensa que todos los efectos del cAMP en las celuEas eucariotas son mediados por fosforilación y desfosforilación de proteinas. Es posible que el control de cualquier efecto del cAMP, incluso procesos tan diversos como esteroidogénesis, secrecion, transporte de iones, metabolismo de grasas y carbohidrato~,induccibn enzimática, regulacibn de genes, crecimiento y replicacibn celular, sea conferido por
Protelncinasa inactiva
ATP
cAMP (m)
4 cAMP
Proterna -
2
Prntelna
clnasa activa
Foslopmteina
FFgura 4-46.Regulacibn hormonal de procesos celulares a travks de protelna cinacac dependientes de cAMP. El cAMP (S) generado por accibn de adenilil ciclaca (activado como se muestra en la figura 4 4 4 ) se une a la subunrdad reguladora {R) de la proteina cinasa dependiente de d M P . El resultado es la liberación y activación de la subunidad catalitica (C). (Cortesía de J Corbin.)
(Capítulo 44)
una cinasa prateinica específica, una fosfatasa especifica o por sustratos ecpecificos para la focforilacion. En algunos casos, se ha identificado a una fosfoproteína que se sabe es partícipe de una via metabdlica; sin embargo, para la mayor parte de los procesos citados antes. las fosfoproteinas que intervienen no se conocen. Estos sustratos pueden ayudar a definir un tejido blanco y ciertamente actúan en la defínicibn de lo extenso de la respuesta dentro de una célula dada. Muchas proteínas pueden ser fosforiladas, inclusive caseína, histonas y protamina; tales fosfcirilaciones pueden ser epifendmenos, aunque son utiles para analizar la actividad de la proteina cinasa. Hasta hace poco, las únicas acciones definidas del cAMP eran las que ocurren fuera del núcleo. En Ea actuatidad están descritos los efectos del cAMP sobre la transcripciiin de varios genes. Al parecer esfos efectos son mediados por la proteina CRER descrita antes.
D. Fos fodiesterasas Las acciones causadas por hormonas quc incrementan al cAMP pueden concluirse de varias maneras que incluyen la hidrólisis del cAMP por las fosfodiesterasas. La presencia de estas enzimas hidroliticas asegura un recambio rápido de la sena1 (cAMP) y por tanto la terminación rapida del proceso biológico una vez que se eliniina el estímulo hormonal. Las cAMP fosfodiesteracac existen en dos formas, con Kmbaja y Km alta, y ellas mismas est;in sujetas a regulación por las hormonas así como tarnbie'n por mensajeros intracelulares como el calcio, que probablemente actúa a través de la calmodulina. Los inhibidores de la fosfodiesterasa, más notablemente los derivados metilados de la xantina como la cafeina, incrementan el cAMP íntraceluIar e imitan o prolongan las acciones de las hormonas.
E. Fosfoproteína fosfatasa Otro medio de controlar Ea acción hormonal es la regulacibn de las reacciones de desfosforilaci6n de proteinas. Las fosfoproteína fosfatasas por sí mismas esthn sujetas a regulacibn mediante reacciones de fosforilacibn-desfosforilacion y por otros diversos mecanismos como son las interacciones proteina-proteina. De hecho, la especificidad de sustrato de las fosfoserina-fosfotrconina fosfatasas puede dictarse por distintas subunidades reguladoras, el enlace de las cuales se regula hormonalmente. La funcibn mejor estudiada de la regulación mediante la desfosforilación de proteínas es el metabolismo del glucbgeno en el músculo. En este tejido, se conocen dos tipos de fosfoproteína fosfattasas. La tipo 1 de preferencia decfosforila a la subunidad beta de la fosforilasa cinasa, en tanto que la tipo 11desfosforila a la subunidad alfa. La fosfatasa tipo 1 esta implicada en la regulaciiin de la glucógeno sintasa, fosforilasa y focforilasa cinasa.
Esta fosfatasa se regula mediante fosforilaci6n de ciertas de sus subunidades y estas reacciones se revierten por la acción de una de las fosfatasas del tipo 11. Ademas, dos inhibidores de proteinas terrnoestables regulan la actividad de la fosfatasa tipo 1. El inhibidor-I se fosforila y activa por proteína cinasas dependientes de cAMP. y el inhibidor-2, que puede ser una subunidad de fosfatasa inactiva, también se fosforila, posiblemente por la gluchgeno sintasa cinasa-3, aunque la funcibn de esta fosforilacibn permanece sin aclarar.
F. cAMP exfracelular Cierta cantidad de cAMP abandona las células y puede detectarse en los liquidos extracelulares. La acci6n del glucaghn sobre el hígado y de la vasopresina o de la PTSI sobre el riñbn, se refle-¡a por los valores altos de cAMP en plasma y orina, respectivamente; esto permite la preparacihn de pruebas de diagnostico cobre la sensibilidad de los organos blanco. El cAMF extracelular tiene escaqa actividad bioldgica en los mamíferos, si es que alguna, pero es un mensajero intercelular extremadamente importante con 10s eucariotes inferiores y en los procariotes.
Una hormona usa cGMP como segundo mensajero El GMP cíclico se forma del GTP por la enzinia guanilato ciclasa, que existe en forma soluble y unida a la membrana. Cada una de estas isoenzimas tiene propiedades cintticas, fisicoquimicas y antigénicas Gnicas. Por algun tiempo se pensó que el cGM P era la contraparte funcional del cAMP. En la actualidad se considera que el cGMP tiene su propio lugar en la actividad de las hormonas. Las auriculopeptinas, familia de péptidos producidos en los tejidos de tac aurículas, causan natriurecis, diuresis, vasodilatación e inhiben la secreción de aldosterona. Estos péptidos (por ejemplo, el factor natriurktico auricular) se unen y activan a la forma de la guanilatociclasa unida a la membrana. Esta acci6n causa un incremento del cGMP hasta de 50 veces su valor en algunos casos, que al parecer es el efector de esos síntomas. Otras pruebas ligan a! cGMP con la vasodilatacibn. Una serie de compuestos incruyen al nitroprusiato, la nitroglicerina, el nitrito de sodio y la azida sódica, causan relajacidn del músculo liso y son vasodilatadores potentes. Estos agentes incrernentan el cGMP por activacion de la forma soluble de la guanilatociclasa y los inhibidores de la cGMP fosfodiesterasa amplifican y prolongan estas respuestas. El aumento de cGMP activa a la proteina cinasa dependiente de este monofosfato, la cual a su vez fosforila a cierto número de proteínas del músculo liso, inclusive a la cadena ligera de la miosina. Es probable que esta acción cause la relajacibn del músculo liso y vasodilataci6n.
Accidn de las hormonas 603
Varias hormonas actúan a través de calcio o focfatidilinosítidos El calcio ioni~adoes un regulador importante de diversos procesos celulares que incluyen la contracción muscular, el acoplamiento de la estimulación con la secrecion, la cascada de Ia coagulaci~nmguinea, la actividad enzimatica y la excitabilidad de la membrana. Es también un mensajero intracelular de acciiin hormonal.
A. Metabolismo del calcio La concentración del calcio (Ca") extracelular es aproximadamente de 5 rnrnoVL y su control es muy rígido (capitulo 47). La concentracibn intracelular de este ion libre es mucho más baja, 0.1 a 10 pmolíL y la concentración relacionada con los organelos intracelulares como mitocondrias y retículo endoplhsmico oscila de 1 a 20 pmol/L. A pesar de este elevado gradiente de concentración de 5000 a 1 O 000 veces y un gradiente eléctrico transmembrana favorable, el Caztiene restringida Fa entrada a la ~Clula.Hay tres formas de cambiar la concenmaci~ncitosblica del Caz'. Ciertas hormonas (clase 1I.C) incrementan la permeabilidad de la membrana al Caz+ y por tanto- aumentan su entrada a la cilula. Es probable que entre en juego un mecanismo de intercambio Na+/Ca2+aue tiene elevada capacidad pero escasa afinidad por ei Ca2+.También hay una bomba Ca2'J2H+ dependiente de ATPasa que expuka al Caz' en intercambio por H'. Este rnecanisma tiene elevada afinidad por el calcio pero capacidad baja y es probable que se ocupe del ajuste fino del Ca2' citosólico. Finalmente, el Caz' puede inmovilizarse (o depositarse) de (o hacia) las reservas de las rnitocondriac v el retículo endovlAsmico. Dos 'observaciones adujeron al conocimiento actual de la forma en que el Caz' sirve como mensajero intracelular de la accion hormonal. La primera fue la posibilidad de cuantificar los cambios rápidos de la concentracibn intracelular de Caz- implicitos en su papel como segundo mensajero intracelular. Esto se logro mediante varias técnicas que incluyen el uso de Quin 2 o Fura 2, un quelante fluorescente del Ca". Los cambios rápidos del Ca2+intracelular en valores submicromolares pueden cuantificarse mediante estos Compuestos. La segunda obsewaci6n importante fue definir el obietivo intracelular de la acción del Ca2+ que liga a este ion con la acción hormonal. El descubrimiento del regulador de la actividad de la fosfodiesterasa dependiente de ca2',proporcion6 la base para comprender la manera en que el Caz' y el cAMP interactúan dentro de las cklulac.
B. Calmodulina El termino con el que se conoce ahora a la proteína reguladora dependiente del calcio es calmodul ina, una
proteina de 1 7 kDa hombloga a la proteína muscular troponina C en estructura y función. La calmodulina tiene cuatro sitios para fijaci6n del Ca2+y la ocupacidn total de estos sitios conduce a un cambio notable de la conformación, de modo que la mayor parte de la molécula asume una estructura de hélice alfa. Se presume que este cambio de conformación confiere a la calrnodulina la propiedad para activar o inactivar endmas. La interacción de Ca" con la calmodulina (con el cambio resultante de actividad de la última) es conceptualmente análoga a la fíjacion del cAMP a la proteína cinasa y la acrivación subsiguiente de esta rnolkcula. Con frecuencia, la calmodulina es una de las numerosas subunidades de proteínas complejas y está involucrada en forma particular en la regulación de varias cinasas y enzirnas de la generación y degradación de nucleótidos cíclicos. En el cuadro 44-6 aparece una lista parcial de las enzimas reguladas directa o indirectamente por el Caz', probablemente a través de la calmodulina. Ademas de sus efectos sobre [as enzimas y el transporte de iones, el complejo Ca2+icalmodulina regula la actividad de numerosos elementos estructucales en las células. Entre otros el complejo adna-miosina del músculo liso, que está bajo control beta adrenérgico, y varios procesos mediados por microfilamentos en las células no contráctiles inclusive la movilidad de la propia d l u l a , los cambios conformacionales, la mitosis, la liberacidn de gránulos y la endocitosis.
Calcio como mediador de la acción hormonal Una funci6n para el calcio ionizado en la acción hormona[ se sugiere por las observaciones de que el efecto de muchas hormonas está: i ) amortiguado en idro 4 4 4 . Enzimas regulad
por calciolcalmodulina --. .
-.-..- .---. 0
o
Adenilil c iclasa CaZ+JMgp--ATPasa Fosfolipz;a A2 . . . . ... Fosfnlipa: id Cinasa eína fosfatrisa 2B -fosfato de:shidrogenasa o sintasa iclaqa
* Miosina cinasa NAD cinasa ... " Nucle6fido ciciico-tosfodiester: * Pirukato c Piruvato c Piruvato c Proteína cirima uqieliuiernt- ut: Ca2+ Proieina cinaqa dependientede Ca2+lfosfolípido
604
Rioqirímica de Hut-per
los medios sin ca2+ o cuando el calcio intracelular se agota; 2) puede ser imitado por agentes quc incrernentan el ~ a "citos6tico. como el ionóforo dc Caz+ A23187, y 3) influye en el flujo del calcio celular. Estos procesos se han estudiado con cierto detalle en hipófisis, músculo liso. plaquetas y glándulas salivales, pero es probable que se conozca m8s acerca de la forma en que la vasopresina y las catecolaminas alfa adrenergicas regulan el metabolismo de glucogeno en el hígado. Esto se muesm de manera esquernatica en las figuras 2 0 4 y 20-7. La adición de agonista al fai o de vasopresina a hepatocítos aislados conduce a un incremento triplicado del Ca2' citosólico (de 0.2 a 0.6 pmollL) en unos segundos. Este cambio precede e iguala al incremento en la actividad de la fosforilasa alfa y las concentraciones requeridas de hormonas para los dos procesos son comparables. Este efecto sobre el Ca2+se inhibe por los antagonistas alfa, y la eliminación de fa hosmona conduce a una declinacibn rápida del Caz' y de la fosforilasa alfa. Al parecer la fuente inicial del Ca" son los reservorios de los organelos intracelulares, que en principio son suficientes para los efectos iniciales dc las hormonas. Es posible que se requiera una acción más prolongada para intensificar Ia enrrada o inhibir la salida del Caz- a través de la bomba de calcio. La ultima puede depender del incremento concomitante del cAMP. La activación de la fosfori lasa es consecuencia de la conversibn de la fosforilasa beta a fosforilasa alfa, mediante la acción de la enzima fosforilasa beta cinaca. Esta enzima contiene caErnodulina como su subunidad delta y su actividad aumenta ciiando la concentración del Caz+oscila de 0.1 a I .O prnol/L; valores a los cuales las hormonas incrementan el CaZ'en el hígdo. El enlace en Caz- y la accion de la fosforilasa es definitivo. Varias enzima5 metabólicas criticas se regulan por el Ca2', la fosforilaci6n opor ambos, e incluyen entre otras, a la glucbgeno sintasa, pinivatocinasa, piruvatocarboxilasa, glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y pusivatodeshidrogenm. No se sabe con certeza si la calrnodulina interviene directamente o si las proteína cinasas dependientes de Caz+-calmodulinao dependientes de Caz'-fosfolípido, recién descubiertas, son las responsables.
El metabolismo de fosfatidilinosítidos tiene una función en la acción hormonal que depende del calcio Alguna señal debe proporcionar la comunicación entre el receptor de la hormona sobre la membrana plasrnhtica y los reservorios intracelulares de Ca". Esto lo llevan al cabo los productos del metabolismo de los fosfatidilinosítidos. Los receptom de superficie celular,
(Capitulo 44)
como aqiiillos para acetilcolina, hormona antidiurética y catecolaminas tipo alfa: son activadores potentes de fosfolipasa C cuando están ocripados por sus respectivos ligandoc. La ocupacihn del receptor y la activacion de fosfolipasa C se acoplan por medio de una proteina G Única (figura 444). La fosfolipasa C cataliza la hidr~lisisde 4,5-bisfosfato de fosfatidilinositol a trifosfato dc inositol y 1,7-diacilglicerol (figura 44-7). El diacilglicerol mismo es capaz de activar la proteína cinasa C, actividad que tambikn depende de la presencia de iones calcio libres. El trifosfato de inositol es un liberador eficaz dc calcio desde sus sitios de almacenaje intracelular como retículo sarcoplasmico y mitocondrias. Así, la hidrblisis de 4.5-bisfosfato de fosfatidilinositol conduce a la activaciiin de proteína cinasa C y promueve un incremento del calcio iónico citoplásmico. Como se muestra en la figura 4 4 4 , el complejo de proteína G activado tambicn puede tener una accibn directa sobre los canales de Caz+. Los agentes esteroidbgenos que incluyen ACTH y cAMP en la corteza suprarrcnal; angiotensina 11, K', serotonina, ACTH y cGMP, dibutirilo en la zona glomerulosa de las suprarrenales; LH en el ovario y LH y cAMP en las dlulas de Leydig de los testículos. se han relacionado con el incremento en las concentraciones de acido fosfatídico, fosfatidilinocitol y polifosfoinositidos en los tejidos blanco respectivos. Pueden citarse varios ejemplos. Los papeles que el calcio y los productos de degradacibn de los polifosfatidilinosítidoc podrían desarrollar en !a accibn hormonal se presentan en la figura 4 4 4 . En este esquema la prbteina cinasa C activada puede fosforilar sustratos específicos, que luego alteran procesos fisiológicos. De igual modo. el complejo Ca2+-calmodulina (Cam) puede activar cinasa5 específicas. MAS adelante, &as modifican sustratos y así, alteran las respuestas fisiolbgicas.
Algunas hormonas actrjarn mediante una cascada de proteína cinasa En ediciones anteriores de esta obra, varias hormonas se listaron como "mediador intracelular desconocido". El descubrimiento de que el receptor EGE contiene una actividad específica de tirosina cínaca que se a ~ i v apor el enlace del ligando, hizo al EGF un importante punto de partida. Los receptores de IGF- 1 e insulina también contienen actividad de tirosina cinasa intrínseca activada por ligando. Varios receptores, por lo genera,l aqudllos implicados en el enlace de ligandos que participan en el control del crecimiento, diferenciacibn y la respuesta inflamatoria tienen, ya sea actividad de tirosina cinasa intrínseca o estin relacionados con proteínas que son tirosina ci-
Acciún de las hormonas
605
ca2+
Calmodulina
cinasa especifica
.
Calrncdulina
cinasa rnuttifuncional
- - - - -\ '
I 1
proteinas - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - +
/ '
Recpuestasfisiolbgicas
Figura 4 4 4 . Ciertas interacciones del receptor para hormonas activan a la fosfolipasa C. Al parecer interviene una proteína
G especifica que también puede activar un mnducto del calcio. La fosfolipasa C activa la generactbn de inositol trifocfata, que libera a l ca2+intracelular almacenado y al diacilglicerol (DAG}, que a su vez activa a proteína cinasa C. En este esquema, la proteína cinasa C activada fosforila sustratos especifico$ que luego alteran procesos fisiolbgimc. De igual modo, el complejo ca2'-calmodulina puede activar cinasas especificas. Estas acciones modifican los sustratos y se alteran las respuestas fisiológicas. (Cortesia de JH Exton.)
Fosfolioasa C
Figura 44-7. Fosfolipasa C separa PlP2 en diacilglicerol y trifosfato de inocdol. En general, RI es un estearato y R2 un araquidonato El IF3 puede desfasforilarse (al 1,4-P2 del I Inactivo) o fosforilarse (al petencialmente activo-1,3,4,5-Ps)
6 1.4-5-Trifosfatode inositol (IP3)
nasilí. Otm caracterisiica distintiva de esta c l s e de acción horiiional es que estas cinasas fosforilan de manera preferencial residuos de iimsina, y la fosforilacihn de tirosina cs infrecuente (-: 0.03% del total de la fosfori laciciii de am inoácidos) cn mamíferos. Algiinos receptores hormonales, como los de insulina, FGF y IGF-1 tienen actividad de iirosina cinasa intrínseca. La ac~ivaciónde estas cina~asresulta en Fa fosriirilnción de sustratos proteínicos sobrc residuos de tirosina. Esto produce una cascada de evenios que Fe describen en el capituIo 51 cn el contexto dc la accion de la insulina. En la figura 5 1-1 3 se muestra iiria descripción gsgfica. [,a activacihn de latirasiria cinasa tamhiéri puede ii~iciarla cascada de fo~forilacióny desfosforilacion que implica la accion de otras proteína cinasas y las accioiie~de contmbalancs dc la? fosfatasas. Para iiiiciar esta cascada se emplean dos mecanismos. Alguiias hormonas, como la hormona del creciinicnto. prolactina. eritropoyctina y las citocinas, inician su accion IXW activación de la tirtisinacinasa, pero estaactividad nci es iina partc integral del receptor hnrmonal. La interacciiin hormona-receptor activa tirosina cinasas proteinicac del citoplasma, coino son las Tyk-2. JAK1. o JAK2. Estas cinasas fosforilan una o más proteínas citoplasmfiticas, las cuales cn seguida se relacionan con otras proteínas de anclajc mediante el enlace al dominio Src de IiornoIogia 2. Estos segmentos péptidoc, de longitud aproximada de 100 aminoicidos, se conocen como dominios SH2. Una de tales interaccioiies resulta en la activacion de una familia dc proteina citosólica denominada seilal de transducción
y ac~ivadoresde trt?nscripcioti (STAT). La proteina STAT fosforilada se dimcri7a y trasloca dentro dcl núcleo, enlaza a clementes espccificos del UNA tales coma el elemento de respiiesta de interr'cróii o el eleinento de respuesta serica y activa la transcripción. Esto se muestra en la figura 44-8. Otros eventos de anclaje de SH2 pueden dar lugar a la activación de P1 3-cinasa, la via de la MAP cinasa (al travcs de SHC o GRB2),o la activacion de la fosfolipasa C mediada por proteina G (PLCgamma) con la produccióii concomitante de diacilglicerol y la activación de la proteina cinasa C. Al parecer h a y rin potencial de entrecru7amiento cuando diferentes Iiormnnas activa11 c s t a ~diversas scRnIes de transduccihn.
RESUMEN Las accíoncs celulares y subccIulares de las hormonas requieren la fijación de una hormoiin a SU receptor específico. 1 .os receptores lienen las característ~cas sigiiienres: muestran gran afinidad por la hormona, el enlace revierte con facilidad, son satiirablcs y altamente específicos. Snn re~ponsablesdc dos funciones biisicas- retiencn la hormona y acoplan esta hormona enIa7ada a la transducción de la seAaI. Las reccptore? pueden ser un componentc de la membrana plasm;itica, como en el caqo de las hormonas peptidicas o estar localizador; dentro de la cClula, como en el caso de la familia estcroidesAiroides. En la última situación, cl comple-johormona-receptor es la seaal intracelular. En general, el complejo hormonaLigando
X
= SHC GRB2
Dimer'uación y trasiocacibn
P LCy
nuclear
PI-3K GAP
Figura 44-8. Inicio de la señal de transduccion por receptores ligados a JAK cinasas Los receptores que enlazan proladina, hormona del crecrmiento, ~nterferonesy citocrnas carecen de tirosina cinasa endogena Sobre el enlace del ligando. estos receptores dimerizan y se fosforiia una proteina concomitante (JAKI , JAK2, o TYK) La JAK* P, una cinasa activa, fosforila el receptor sobre los residuos de tirosina La proteina Stat se integra con el receptor fosforilado y en seguida ambos se fosforilan por la JAK* P STATiP dimeriza, se trasloca al nuclea, enlaza elementos ecpecificos del DNA y regula la transcripcion Los residuos de fosfotirosina del receptar también se enlazan a varios dominros SH2 que contienen proternas. Esto resulta en activacion ya sea de la vía de la MAP m a s a (al travbs de SHC o GRB2), PLCgarnma o P1-3ctnasa
Accidn de las hormonas
receptor se une a regiones especificas del DNA, Ilamadas elementos de respuesta a hormona o HRE. Cada efecto hormonal, que comprende la regulación de la transcripción de genes específicos, es mediado por un HRE especifico. La interaccion de las hormonas peptídicas con sus receptores produce una variedad de efectos además de la regulación de la
607
expresihn de determinados genes. Estos efectos incluyen la regulacibn de la actividad iónica y de los conductos de la accibn de proteinas intracelulares y de la secreción de varias m o l ~ c u l a sSon . mediados por segundos mensajeros (siendo !a hormona el primer mensajero) como AMP ciclico, GMP ciclico. Ca2+,Yarim fosfatidilinositidos y cascadas de proteína cinasa.
REFERENCIAS Argetsinger L S et al.: Idcntification of JAK2 as a growth hornione receptor-associated tyrosine kinase. Ccll
1993:74-237. Berrid~eM: Inositol triphosphate and calcium signalIing. Naturc 1993:361:3 15. Chinkers M, Garbess DL: Signal transduction by giianylyl cyclases. Annu Rev t3iochem 1991;60:553. Cabb MH, Robbins DJ, Boulton TC: ERKs, eittracellular sipnal-regulated MAP-2 kinases Curr Opin Cell Biol 1991;3: 1025. DarnellJE Jr,Kerr IM,StlirkGR: Jak. STATpathways and trmscriptiond activation in response to IFNs and 0 t h e x ~ l l u l asignaling r pniteins. Science I994:2@:1415. Evans R: 'The steroid and th>raid hortnone recephr superiamily. Science 1988;240:889. Fantl WJ, Johnson DE, Wiliiams LT: Signalling by receptor tyrosine kinasec. Annu Rev Biochem 1993;62:453.
G proteins and dual control of adenylate cyclase. Cell 1984;36:577. Hepler JR, Gilman AG: G protcins. Trends Biochem Sci 1992;17"383. Hunter T: A thousand and one protein kinases. Cell 1987;50:823. Lucas P,Granner D: Hormonc rcsponse domians in gene trwscription. Annu Rev Biochem 1992,61: 1 13I . Pawson T, Shclessinger .1: SI I Z and SI-13 domains. Curr Biol 1993:3:434 Rasmussen El: The calcium mcsscngcr systern. (Two parts.) N Engl J Med 198ti;3 14: 1094, 1 E 64. Walton KM, Dixon JE: Protein tyrosine phosphatases Annu Rev Biochem 193;62:101. White MF, Kahn CR: The insulin signalling system J Rioi Chem 1994:269: 1. Gilman A:
*i. Hormonas de !hipa8~sis e FlipotáAarno
La hipiifisis anterior, bajo el control de las hormonas hipotalhmicas, secreta diversas hormonas (las hormonas tróficas) que regulan el crecimiento y la funcion de otras glhndulas endocrinas o influyen en las seacciones metabblicas de otros tejidos blanco. La hipófisis posterior produce hormonas que regulan el equilibrio de agua y el flujo de leche de las glándulas mamarias durante la lactancia.
La ptrdida de la funcibn de la hipófisis anterior (panhipopituitarisrno) conduce a atrofia de la tiroides, la corteza suprarrenal y las gbnadas. Los efectos secundarios causados por ia ausencia de las hormonas secretadas por estas glandulas blanco, afectan a la mayor parte de los brganos y tejido del organismo y a muchos procesos generales coma el metabolismo de proteínas, Ilpidos, carbohidratos, llquidos y electrblitos. La pérdida de la funcién de la hipbfisis posterior causa diabetes inslpida por incapacidad para concentrar la orina.
LAS HORMONAS HIPOTALÁMICAS REGULAN LA HIPÓ'FICISANTERIOR La liberacion (y en algunos casos la producción) de cada una de las hormonas hipofisarias enumeradas en el cuadro 45-1 esta bajo el control tónico de una hormona hipotalárnica por lo menos. Las hormonas hipotalBmicas se liberan desde las temínaciones de fibras nerviosas hipotalhmicas localizadas alrededor
ACTH ADH CG CLIP
Hormona adrenocorticotrbpica Hormona antidiuretica Gonadotropina mribnica Peptido del lbbulo intermedio anhlogo a la
CRH CS
Hormona liberadora de corlicotropina Somatomamotropina coribnica, lactbgeno
FSH GAP
Hormona estimulante de los folículos PBptdo ligado a GnRH Hormona del crecimiento GHRH o Hormona Iiberadora de la hormona del creciGRH miento GHRIH Hormona inhibidora de la liberación de la hormona de crecimiento, sornatostatina GnRH Hormona Iiberadora de gonadotropina IGF-1, -11 Factores de crecimiento I y It semejantes a la
LPH MSA MSH NGF POMC PRlH a
Hormona luteinizante Lipotropina Actividad estimulante de multiplicación Hormona estimulante de los melanocitoc Factor de creumiento newioso Familia peptidica de pro-opiomelanocortina Hormona inhibidora de la liberacibn de prolac-
PRL RIH
Prolactina Hormona inhibidora de la liberacibn de soma-
Tiroxina; ietrayodotironina Hormona Iiberadora de tirotropina Hormona estimulante de la tiroidec PolipPptido intestinalvasoactivo
Cuadro 45-1. Las hormonas hiaotal$Ímicas-hipofisarias-elhndulablanco forman circuitos :ntaci6n i 'S * . -
.-
-
--
rmona h i ~
Siglas
-
J - Ir - 1 1 - - 1
afectad
1 Iormona liberadora de corticotropinn
1
1
IKH
TS! os, estr6 rogestinas
..
Hormona iinerauora at: ia normona ae crecimiento cln ~ño GRH Hormona inh ibidora de la liberati6n de la h or- , GHRI H o SRIH mona de crecimiento; somatostallina; homcina ; inhibidora dc la l i k r ;ición de somatotropirIa
I
1-loIrmona inh ihidora de titia: doparnina y GA -
6n de prol:ac- PRIH I OPrH -"---"u
-
I
I',
y T4; otra:
Y
ionas (?)
u-".u.
Las caracterl::,ticas gmcraIcs dr: cada sistema mayiir de retroalimeniacibn puede deducirse por sustitucibn de la l , . a . , , <. a hiporíiiainica, hipofisaria o oe ia giandula hlanco cn ci stuo oc la figura 44-1. Lrt hormona hipotalkmica tiene un efecto secundario a menor sobre lai hormona
'
Llr-
indorfinas:I
Ho mona libe
*
,.mi
:TH (LPH[, MSH,
Hormona liberadora de firottropina
3
--
Hormona afectad
..e
.
de los capilares del sistema hipothtarno-hipdfisis en el tallo hipofisario y alcanzan al lóbulo anterior a través del sistema portal especial que conecta al hipotalamo y al lbbulo anterior. En el cuadro 45-2 se ilustra la estructura de varias hormonas hipotalamicas. Las hormonas hipotalhicas se liberan de manera intermitente y las células blanco aisladas de la hipófisis anterior responden mejor a la adminictracibn intermitente de estas hormonas que a una cxposiciún continua. La liberación de LH y FSEI se controla por
A
-.
- ...
la concentraciiin de una hormona liberadosa, la GnRH; ésta a su vez se regula en funcibn de las concentraciones circulantes de hormonas gonadales que alcanzan al hipotátamo. Circuitos de retroalimentacibn semejantes existen para todos los sistemas hipothlamo-hipbtisis-gllindula blanco (cuadro 45-1). La liberacion de ACTH se controla primariamente por la CRH, pero pueden intervenir varias otras hormonas que incluyen ADH, catecolaminas, Y 1P y angiotensina 11. La liberacibn de CRH es influida por
A A .
r--..w d r o 45-2. Estructuras de las hormonas liberaduras hipotalzlmicas
.
-.
Hormona
- .
..
-
Est ructura
Ala-Gli
cionaao a tinRH (GAP)
-.-
-.
--u
Ser-Glr Pro-Ilc-Ser Lcu-Tre-Fen-His-Leu. -. . Leu-Arg-tilu-Val-Leu-Cilu-Met- lre-Lis-Ala-AspGln-1,eu-! -
4RH huma
Gln-Ciln-Ala-~l~s-Ser-Asn-Arg-I~is-Leu-Leu-Asp-l~e-A~a-NI Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir-Arg-Lis-Val-LeuCili-GIn-leu-Ser-Ala-Arg-Lis-teu-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-Se laArg-Gln-Gln-Glisn-GIn-GIi Arg-Leu-NH? .
-
-
Hormonm de hipij$sis e hipotalamo
1
el cortisol, una hormona glucocorticoide secretada por las glhdulas suprarrenales. La liberación de la TSH se modifica de manera primaria por la TRH, la cual a su vez esla regulada por las hormonas tiroideas Ti; y T4; pero la liberacion de la TSH tambikn se inhibe por la somatosíatina. La liberación y produccion de la hormona del crecimiento estan bajo control t6nico de hormonas hipotalámicas tanto estimulantes como inhibidorac. Adernhs, en la regutación de la GH interviene un circuito de retroaccibn perifdrica. La IGF-l (somatornedina C), que media ;lgunos de los efectos de la GH, estimula la liberación de la somatostatina (GHRIH) mientras que inhibe la liberación de GHRH. La regulación de la sintesis y secreción de PRL esta fundamentatrnente bajo inhibicihn tónica por agentes hipotalAmicos. Es un caso único debido al enlace combinado, neural (estimulaciOn del pezbn) y neurotransmisor/neumhormna. La dopamina (cuadro 45-1) inhibe la sintesis (al reprimir la transcripción del gen PRL) y la liberacibn de PRL, pero existen pruebas de que n o controla la inhihicihn global del PRL. Recientemente se descubre un neuropeptido de 56 aminoficidos que tiene actividades de GnKH y PRIH, de modo que se le nombra pbptido ligado a GnRH (GAP). El GAP es un inhibidor potente de la liberación de PRL y puede ser el evasivo pkptido PRIH. El GAP puede explicar el curioso vinculo entre la GnRH v la secreción de PRL que es particularniente obvio en algunas especies. Muchas de las hormonas hipotalámicas, en particular TRH, CRH y somatostatina se han descubierto en otras porciones del sistema nervioso y en diversos tejidos perifhricos. Aunque originalmente se pensri que el cAMP mediaba la acci6n de las hormonas liberadoras sobre la adenohipbfisis, estudios recientes con GnRH y TRH sugieren la intervencion de un mecanismo de calcio y fosfatidilinositol, semejante al descrito antes. Se ha teorizado si las hormonas liberadoras modifican también la síntesis de la hormona hipofisaria correspondiente, pero recientemente se demuestra que la GHRH estimula la velocidad de transcripción del gen para GH y que la TRH tiene un efecto sobre el gen de la prolactina.
LA HIPOFISIS ANTERIOR PRODUCE UN GRAN NÚMERO DE HORMONAS QUE ESTIMULAN DIVERSOS PROCESOS FISIOLOGICOS Tradicionalmente, estas hormonas se describen de manera individual, pero estudios recientes que se ocupan del mecanismo de sintesis y de los mediadores intracelulares de la acci6n (cuadro 44-1) permiten
61 1
clasificar a estas hormonas en tres categorías: 1) el grupo hormona del crecimiento prolactina-somatomamotropina coriónica, 2) el grupo de hormonas glucoproteinicas y 3) la familia de péptidos de proopiomelanocortina.
Hormona del crecimiento, prolactina y somatomamotropina coriónica con un grupo de hormonas Hormona del crecimiento (GH), prolactina (PRL) y somatomamotropina coriónica son una familia de homonas proteinicas que tienen una homologia considerable en sus secuencia, GH, CS y PRL oscilan en tamaño desde 190 a 199 aminoácidos en especies diferentes. Todas tienen un solo residuo de triptófano (locus SS en GH y CS: locus 91 en PRL) y todas tienen dos enlaces disulhro homólogos. En los humanos, la homologia de aminoácidos entre hGH y hCS es de 859'0, en tanto que enm hhGH y hPRL, es de 35 por ciento. En vista de esta homología. no sorprende que compartan determinantes antigdnicos comunes y que tengan actividad promotora de crecimiento y Iactrigena. Las hormonas se producen de una manera específica en un tejido; GH y PRL lo son en la hipófisis anterior y la CS en las células del sincitíotrofoblasto de la placenta. Al parecer cada una está bajo regulación diferente (cuadro 45-1 1. Con base en estas notables semejanzas, hace varios aiios se poctulb que estas hormonas pueden proceder de la duplicación de un gen ancesml. ¿a tecnología del DNA recombinante revela que hay genes múltiples para GH y CS en los primates y el ser humano; que el gen único para PRL, aunque codifica una proteina muy semejante, es cinco veces más grande que los de GH y CS; que la hCS es una variante de hGH y que el grupo GH-CS en humanos, se localiza en su cromosoma 17, en tanto que PRL se encontró en el cromosoma 6. Hay divergencias evolutivas notables en estos genes. Los tejidos de rata y los de bovinos tienen una sola copia de GH y de PRL por cada genoma haploide y e! ser humano tiene un solo gen para PRL. Loc humanos poscen un gen funcional para G H (GH-N) y una variante (GH-V), dos genes CS que se expresa (CS-A y CC-B.) y un gen CS que no lo hace (CS-L). Varias especies de simios cuentan con por lo menos cuatro genes de la familia GH-CS. La secuencia que codifica a todos estos genes está organizada en cinco exones interrumpidos por cuatro intrones (figura 45-1). Los genes tienen gran homologia en las regiones que flanquean a 5' y en las Areas que codifican la secuencia (en las últimas una homología aproximada de 93%) y divergen en las regiones que flanquean a 3'. Las uniones de empalme se conservan al mhximo, aunque los intrones enel gen de la PUL son mucho mfis largos.
/Capitulo 43)
612 Dioqtcímica de Harper
Exbn
1
2
3
4
5
Figura 45-1. Representación esquemática,dibujada a escala de la estructura del gen de la hormona humana del crecimiento El gen tiene una longitud aproximada de 45 kb y consiste de 5 exones y 4 intrones. Las diagonales representan regiones no codificadas en los exones 1 y 5 La flecha indica la dirección de la transcripcibn
La familia del gen GH-CS humano se localiza en un grupo de enlace en la regiiin q22 a 24 del brazo
largo del cromosoma 17. La figura 45-2 indica las posiciones relativas de cada uno de estos genes en una orientacibn 5' a 3'. Todos los genes son transcritos en la direccibn 5' a 3' y el gen GH-N está separado de CS-B aproximadamente por 45 kb. La secuencia codificadora de GH-N coincide con la secuencia de arninoitcidos de la GH circulante y el gen es sensible a la DNasa 1, lo cual significa que su ubicación es en una región de la "cromatina activa". El gen GI-1-V si llegara a expresarse, codificarfa para una proteina con diferencias en 13 aminohcidos. Este gen es resistente a DNasa 1, y por tanto puede ser inactivo. El gen GH-V está presente en pacientes que carecen del gen GH-N (deficiencia hereditaria de GH), pero puesto que estas personas tienen deficiencia completa de GH, el gen GH-V es silencioso o produce una molécula inactiva de GH. Lo m8s probable es lo primero, ya que estos individuos forman anticuerpos en respuesta a la GH exhgena, una indicaci6n de que esta molécula n o ha sido identificada previamente por el sistema inmunitario. Los genes CS-A y CS-B se expresan en la placenta; el CS-L es silencioso.
Hormona del crecimiento (GH)
A. Sintesis y estructura La hormona del crecimiento se sintetiza en los somatotropos, una subclase de ctlulas acidófiIas de la hiphfisis que son las más abundantes en la glrindula. La concentracibn de GH en la hipofisis es de 5 a 1 5 mdg,
que es mucho mayor a las cantidades microgramo por gramo de otras hormonas hipofisarias. La hormona del crecimiento es un polipéptido de cadena única, con masa molecu lar de aproximadamente 22 kDa en todas las especies de mamíferos. En la figura 45-3 se muestra la estructura general de 191 aminohcidos de esta molkcula de hormona humana. Aunque el grado de homología de la secuencia es elevado entre las hormonas del crecimiento de varios mamíferos, sólo la humana o de otros prirnates superiores es activa en el ser humano. En la actualidad se dispone de GH humana preparada por tkcnicas del DNA recombinante para uso terapéutico.
B. El receptor GH t s t e receptor es un miembro de la superfamilia del receptor de citocina-hematopoyetina. El receptor GH es una proteina con masa rnolecular de 70 kDa con un solo dominio de membrana pareado. El concepto actual es que el enlace de GH causa la dimerizacion de los dos receptores GH. Esto produce la activacidn de una tírosina cinasa JAK2 concomitante con el receptor y la fosforilación del receptor y JAK2 sobre residuos de: tirosilo. Estos eventos dan lugar a la activación de diversas vlas de seflalización (figura 454), que incluyen: 1) fosforilación de proteína Stat y transcripción génica; 2) la activación de la vía de la MAP cinasa concomitante con SHC/Grb2; 3 ) la fosforilacibn de IRS con activacibn de P13 cinasa. y 4) la activación de PI,C con produccibn de diacilglicerol y activación de la proteina cinasa C. La via de la JAK cinasa es Única para esta clase de receptores, ya que las otras vias se activan por otros receptores hormonales diferentes. Por tanto, hay la posibilidad de comunicaci6n cruzada entre hormonas at nivel de las respuestas biológicas.
C. Acciones fisiológicas y bioquimicas Figura 45-2. Ubicacidn y orientacibn de la familia de genes GH-CS humanos en el cromosoma 17. Las posiciones relativas de los genes hGH y hCS se muestran en una orientacibn 5'a 3'. Las flechas indican la direccibn de la transcripción.
La G H es esencial para el crecimiento posnatal y para el metaboIismo normal de carbohiratos, lipidos. nitrógeno y minerales. Los efectos relacionados con el crecimiento con mediados primariamente por IGF-1, miembro de la familia de genes semejantes al de la
Prolactina ovina
Hormona del crecimiento humana
Figura 4 5 3 . Se comparan las estructuras de hormona del crecimiento humano (izquierda) y prolactina ovina (derecha). La primera tiene puentes disulfuro entre 53 a 165 y 182 a 189. La prolactina tiene puentes disulfuro entre los residuos 4 a 11. 58 a 7 5 y 190a 198
insuiina. Este originalmente se conocía como "factor de culfatacion" debido a su propiedad de acrecentar la incorporaci6n de sulfato al cartilago. Más adelante pasó a ser conocido como comatomedina C. Estnicturalmente es semejante a la proinsulina (capítulo 5 1 y figura 5 1-5). Otro peptido estrechamente relacionado y que se encuentra en el plasma humano, el ICF-II, tiene actividad semejante o idéntica a la que en las
ratas a menudo se le conoce como actividad estimulante de la muitiplicación (MSA). El IGF-I y el IGF-11 se unen a receptores de membranas; no obstante, pueden diferenciarse a través de radioinmunoanálicis especifico. El 1GF-1 tiene 70 arninácidos y el ISF-II tiene 67. Las concentraciones plasmaticas del IGFI I son dos veces las del IGF-1, pero es el IGF-1 el que tiene correlaci6n mas directa con los efectos de la CH.
Glucosa
Figura 4 5 4 . Vías de Zransduccibn de seAal activadas por la interaccibn de la hormona del crecimiento (GH) con su receptor (GHR). Tal como se describe en el texto, la acción de la GH puede implicar cuatro vías diferentes, cada una de las cuales se muestra en la figura. La activación de JAX2 con la activación subsecuente de Stat 1 y 3. produce el enlace de estos factores de transcripcibn a genes especificas. en este caso c-fos y Spi 2.1. Las otras vias pueden utilizarse por diferentes hormonas. (Cortesia de C Carter-Su }
614
Bioquimica de Harper
(Capítulo 45)
Cuadro 45-3. Relaciones de GH, IGF-1 e 1GF-TI en el enanismo --. . . - .
.-.
incentracii plasmatic:
Respuesta la estlmu1--:x-
Enr
Y m- Baja
-t
P~~IIILI~.S
-
Enunns tipo
31
1
!
Bajo Rajo a
normal Bajo .Ralo Bajo
---
l-
t
Laron
Los sujetos que no tienen suficiente IGF-1 pero tienen IGF-II (enanos y pigmeos deficientes en GH, cuadro 45-3) no crecen normalmente. 1. Sintesis de proteínas: La GH incrementa el trans-
porte de aminoAcidos hacia el interior de las cdlulas musculares y también la síntesis de proteínas por un mecanismo separado del efecto del transporte. Los animales tratados con GH muestran un equilibrio positivo de nitrbgeno, 10 cual refleja un incremento generalizado en la síntesis de proteinas y una disminución en los valores plasmaticos y urinarios de aminoácidos y urea. Esto se acompaila de aumento en la sintesis de RNA y DNA en algunos tejidos. A este respecto, las acciones de la GH son semejantes a algunas de las acciones de la insulina. 2. Metabolismo de carbohidratos: Por lo general, la GH antagoniza los efectos de la insulina. La hiperglucemia después de la administraciiin de hormona del crecimiento es et resultado combinado de disminución en la utilización periferica de la glucosa y de incremento en su producción hepfitica por la vía de la gluconeogénesis. En el higado, la GH incrernenta el glucógeno, probablemente por activaci6n de la gluconeogenesis a partir de arninoácidos. El trastorno de Ia glucólisis puede producirse en varias etapas y ta movilizacion de los ácidos graso5 desde las reservas de triacilglicerol puede contribuir tambien a la inhibicibn de la glucolisis en el músculo. La administraci6n prolongada de GH puede producir diabetes sacarina. 3. Metabolismo de Iipidns: La GH favorece la liberación de acidos grasos Iibres y glicerol del tejido adiposo, incrernenta los acidos grasos libres circulantes y aumenta la oxídacibn de estos en el hepatocito. Bajo condiciones de deficiencia de insulina (por ejemplo, la diabetes) puede haber incremento de la cetogénesis. Es probable que estos efectos y los del metabolismo de carbohidratos no sean mediados por 1CF-1.
4. Metabolismo de minerales: La CH. o m&. probablemente el IGF-1, promueven un equilibrio positivo de caIcio, magnesio y fosfaio y causan la retencibn de Na', K ' y CI-. El primer efecto probablemente se relaciona a la acci6n de la GH en el hueso, donde promueve el crecimiento de los huesos largos en !as placas epifisarias de los niiíos en crecimiento y el crecimiento aposlcional o acral en los adultos. Ademhs, en los nihoc la GH incrementa también la formación de cartílago. 5. Efectos análogos a la prolactina: La GH se une a los receptores del lactógeno y por tanto, tiene muchas de las propiedades de la prolactina, como estimulación de las glhdulas mamarias y lactogenesis.
Las cantidades insuficientes de GH, ya sea por panhipopituitarismo o por deficiencia aislada de GH, son m l s graves en la infancia debido a que afectan el crecimiento del niiio. Los demls efectbs metabiilicos ocasionan menos problemas. Varios tipos de enanismo ayudan a ilustrar [a importancia de las diversas etapas en la acción de la GH (cuadro 45-33. Los pacientes enanos con deficiencia de G H responden normalmente a la GH exógena. Se han descrito dos tipos de resistencia de los Drganos blanco. Los enanos tipo Laron tienen cantidades excesivas de GEI-N, carecen de receptores hephticos para CH. Los pigmeos tienen aparentemente un defecto posreceptor de la GH y es posible que se circunscriba a la accihn que ejerce G H a través del IGF-1. El exceso de hormona del crecimiento, provocado, por lo general, por un tumor acidiifilo, causa el gigantismo si ocurre antes del cierre de las placas epifisarias, puesto que se produce un crecimient&acelerado de los huesos largos. La acromegalia es la consecuencia de la liberación excesiva de G H que comienza después del cierre epifisario y del cese del crecimiento de los huesos largos. El crecimiento óseo acral produce los cambios faciales caracteristicos (mandíbula prominente, nariz ensanchada) y el crecimiento exagerado de manos, pies y cráneo. &os efectos incluyen vísceras crecidas, engrosamiento de la piel y diversos problemas rnetabólicos, inclusive diabetes sacarina. Cerca de 40% de las personas con acromegalia tienen enfermedad ligada a la proteína G. Tales personas tienen una o mas mutaciones en la subunidad alfa, que suprime Fa actividad intrínseca de la GTPasa en la proteína (capitulo 44). Una mutación en la posición de la arginina 201 afecta el sitio que se ribosila con ADP por la toxina del colera. Toda vezque alfa, con dicha mutacion tiene una constituci0n activa, hay sobreproduccibn de cAMP que da lugar a la producción y liberaci6n excesivas de GH y a un crecimiento y replicaci6n irrestrictos de las c&lulas somatotrópicas. En este sentido, alfa, es un oncogen.
pero
Hormonas de hiairfisis e hiaotiílamo 61.5
El conocimiento de la regulacibn de GH permite comprender las pruebas clinicas utilizadas para confirmar estos diagnbsticos. Los individuos con deficiencia de GH no incrementan sus concentraciones de la hormona en respuesta a hipoglucemia inducida o a la administración de arginina o levodopa. Las personas con exceso de G H por un tumor (gigantismo o acromegalia) no reprimen sus concentraciones de GH en respuesta a la administraci6n de glucosa.
Prolactina (PRL; hormona lactogena, mamotropina, hormona luteotropica)
A. Síntesis y estructura La PRL es una hormona proteinica con masa rnolecular aproximada de 23 kDa;su estructura general se compara a la de la GH en la figura 45-3. Se secreta por los lactotropos, que son células acidófilas de la hipófisis anterior. El número y tamaiIo de estas cklulas aumentan de manera impresionante durante el embarazo. Las semejanzas en la estructura y fiinción entre PRL, GH y CS se señalá.
B. El receptor de prolactina Éste es semejante en tamañoal receptor de GH. Tamb#n tiene un solo dominio membrana1 pareado y se manifiesta a través de vías similares a las que se muestran en la figura 4 5 4 .
C. Acciones fisiológicas y bioquímicas La PRL interviene en el inicio y conservación de la lactacidn en los marniferos. Las concentraciones fisiolbgicas actuan sólo sobre el tejido marnario sensibilizado por las hormonas sexuales femeninas, pero las concentraciones excesivas pueden desencadenar el desarrollo mamario en las hembras ovariectornizadas o en los machos. En los roedores, la PRL es capaz de mantener al cuerpo Iúteo, por eilo se denomina hormona luteotrópica. Moléculas relacionadas parecen ser causantes de la adaptación de los peces de agua salada al agua dulce, de la muda de los reptiles y de la producción de leche en el buche de las aves. Se desconoce al mediador intracelular de la acci6n de la PRL.
D. Flsiopatología Los tumores de dlulas secretoras de prolactina causan amenorrea (cese de la menstniaci6n) y galactorrea (descarga o escurrimiento mamario) en las mujeres. El exceso de PRL se vinculacon ginecomastia (hipertrofia marnaria) e impotencia en los varones.
Sornatomamotropina corionica (CS; lactógeno placentario) El último miembro de la familia GH-PRL-CS no tiene función definida en !os humanos. En los bioanllisis,
la C S tiene actividad lactogénica, luteotrbpica y efectos metabhlicos que son cualitativamente similares a los de la hormona del crecimiento e incluyen la inhibicidn de la captación de glucosa, la estimulacidn de la liberacihn de ricidos graso5 libres y glicerol, el aumento en la retencibn de nitrbgeno y calcio (a pesar del incremento en la excrecion urinaria de calcio) y la reduccibn de la excreción urinaria de f6sforo y potasio.
Las hormonas g lucoproteinicas son otro grupo El grupo de hormonas proteínicas mas complejo descubierto hasta ahora es el de glucoproteínas hipofisarias y placentarias: h o r m o n a estimulante del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante de los foIículos (ESH) y gonadotropina coribnica (CG).Estas hormonas afectan adiversos procesos biológicos y adema$ tienen notables semejanzas estructumles. Esta c2ase de hormonas se encuentra en todos los mamíferos. Estas moleculas, igual que otras hornionas peptidicas y proteínicas, interactúan con receptores celulares de superficie y activan la adenilil cictasa; por tanto, utilizan cAMP como su mensajero intracelular. Cada una de estas hormonas está constituida por dos subunidades, alfa y beta, unida por enlaces no covalentes. Las subunidades alfa son idénticas para todas ellas dentro de la misma especie y existe considerable homologia entre las especies. La actividad biolbgica especifica esth determinada por la subunidad beta, la cual es además altamente conservada entre hormonas, pero en menor extension que lo observado en la subunidad alfa. La subunidad beta no es activa por sí misma y el seconocimiento del receptor comprende la interacción de regiones de ambas subunidades. Moléculas híbridas de interhorrnonas e interespecies son completamente activas; por ejemplo, TSHalFaLHbeta = actividad de LH y hTSHalfamTSHbeta = actividad de TSH, de ratbn. Asl, las diferencias interespecies entre alfa y beta no afectan n la agnipacidn de subunidades o al dominio de la función biolhgica en beta. Cada subunidad se sintetiza de un solo m ñ N h a partir de genes separados. Se considera que todas las hormonas dentro de esta clase evolucionaron de un gen ancestral comun que condujo a dos moléculas, alfa y beta y que esta ultima evolucionó aun m& para proporcionar las distintas hormonas. Es bastante lo que se conoce acerca de la estnictura de estas rnolkculas. Por ejemplo, el pentapkptido carboxi-terminal de alfa es esencial para su fijaci6n al receptor pero no para la agnipacibn alfa-beta. La c m c teristica que distingue a las hormonas de este grupo glucoproteínico de las de otros grupos es su glucosilacibn. En cada hormona glucoproteínica, la subunidad alfa contiene dos oligosacBridos complejos enlazados
616 Bioquimica de Hurper
por asparagina y la subunidad beta tiene 1 o 2. La glucosilación puede ser necesaria para la interaccibn alfa-beta. La subunidad alfa tiene cinco mentes S-S y la fracción beta tiene seis. En la placenta y en la hipbfisis se han encontrado subunidades alfa libres. Este hallazgo y la observacibn de que alfa y beta se traducen a partir de mRNA independientes apoya el concepto de que la síntesis de al fa y de beta están bajo controles separados y que b ~ t a es la limitante en la produccidn de la hormona completa. Todas se sintetizan como preprohormonas y están sujetas a procesamiento postraduccional dentro de la célula para producir las proteínas glucosiladas.
A. Gonadotropinas (FSH, LH y hCG) Estas hormonas son responsables de la gametogknesis y la esteroidog&nesisen las gónadas. Todas ellas son glucoproteinas con masa molecular aproximada de 25 kDa. 1) Hormona estimulante de los foticulos (FSH): La
FSH se une a receptores especificos en las membranas plasmhticas de sus células blanco; las células foliculares en el ovario y las cklulas de Sertoli en los testículos. El resultado es la activaci~nde la adeniPil ciclasa y el incremento en la producción del cAMP. Las accionesde FSH sedescriben con m S detalle en el capitulo 50. 2) Hormona luteinizante (LH): La LH se une a 10s receptores específicos de la membrana plasrnatica y estimula la producción de progesterona en las células del cuerpo Iúteo y de testosterona en las células de Leydig. La seiial intracelular de la acci6n de LH es el cAMP. Este nucleótido imita las acciones de la LH, que incluyen la conversibn aumentada del acetato a escualeno (el precursor para la sintesis del colesterol) e incrementa la conversihn del colesterol a 2alfa-hidroxicolesterol,un paso necesario en la formación de progesterona y testosterona. Las acciones de LH se describen con m8s detalle en el capltulo 50. Hay un estrecho acoplamiento entre la fijación de la LH y la producción del cAMP, pero la esteroidogknesis ocurre cuando sc producen incrementos muy pequeííos de cAMP. La exposición prolongada a LH conduce a insensibilización, tal vez debido a una "regulacibn en baja" de los receptores de la LH. Este fenbmeno puede aprovecharse como un medio eficaz para el control de nacimientos. 3) Gonadotropina corionica humana (hCC): La hCG es una glucoproteina sintetf~adaen las células del sincitiotrofoblasto de la placenta. Tiene la estructura dimérica alfa-beta característica de esta clase de hormonas con mucha similitud a la LH. Aumenra en la sangre y la orina poco tiempo después de la implantacion (véase adelante}; por tanto, su deteccidn es la base de numerosas pruebas para el embarazo.
B. Hormona estimulante de fa tiroides La TSH es una glucoproteina de estructura dimérica alfa-beta con masa molecular aproximada de 30 kDa. Al iguai que otras hormonas de esta clase, la TSH se une a receptores de la membrana plasmatica y activa a la adenilil ciclasa. E! aumento consecuente del cAMP es responsable de la a c c i ~ nde la TSH en la biosintesis de la hormona tiroidea. Más incierta es su relacihn con los efectos troficos de la TSH sobre la tiroides. La TSH tiene, varios efectos agudos sobre la función tiroidea. Estos se producen en minutos y comprenden un incremento de todas las fases de la biosintesis de T3y T4que incluye la concentracion del yoduro, organización, acoplamiento e hidrólisic de la tiroglobulina. Adernas, la TSH tiene varios efectos crónicos sobre la tiroides. Éstos requieren varios días e incluyen incrementos en la síntesis de proteinas, fosfolípidos y iicidos nucleicos y en el tamaRo y número dc las cCIulas tiroideas. Los efectos metabblicos a largo plazo de la TSH se deben a la producción y acción de las hormonas tiroideas.
Procesos complejos generan la familia de peptidos pro-opiomelanocortina (POMC) La familia POMC esta formada de peptidos que actúan como hormonas (ACTH, LPH, MSH) y de otros que pueden servir corno neurotransmisores o neuromoduladores (endorfinas). La pro-opiomelanocortina (POMC) se sintetiza como una molécula precursora de 285 aminoácidos y es procesada de modo diferente en varias regiones de la hipbfisis.
A. Disfnblición, procesamiento y funciones de los productos del gen POMC El gen W M C se expresa en los lóbulos anterior e intermedio de la hipbfisis. Las secuencias mas conservadas entre las especies esthn dentro del fragmento aminoterminal, la regi6n de la ACTH y la regiún de la beta endofina. La POMC o los productos relacionados se encuentran en otros tejidos de los vertebrados que incluyen cerebro, placenta, vías gactrointestinales, vías reproductoras, pu!m6n y linfocitos. Presumiblemente, esto se debe a la expresión del gen en estos te-jido (m6s bien que a su absorción desde el plasma). Los peptidos relacionados también se encuentran en varias especies de invertebrados. La proteína POMC se procesa de diferente manera en el lobulo anterior y en el intermedio. El 16bulo intermedio es rudimentario en los humanos adultos, pero es activo en loc fetos humanos, en Ea mujer embarazada al final de la gestacidn y también en muchas especies animales. El procesamiento de la
proteína POMC en los tejidw periféricos (intestino, placenta, vías reproductoras masculinas) es semejante al que ocurre en el lbbulo intermedio. Hay tres grupos peptídicos básicos: 1 ) ACTH, que puede dar origen a alfa-MSH y la péptido del lobulo intermedio semejante a corticotropina (CLIP); 2 ) beta Iipotropina (beta-LPH), que puede producir gamma-Lf'H, betaMSH y beta endorfina (y por tanto, endorfinac alfa y garnma}, y 3) un peptido terminal amino grande, que genera ganma-MSH. La diversidad de estos productos se debe a los numerosos racimos de alninoácidos dibisicos que son sitios potenciales de fragmentación por las enzirnas mipsinoides. Cada uno de los peptidos descritos esta precedido por residuos Lis-Arg, ArgLis, Arg-Arg o Lis-Lis. Se escinde el segmento de la prehomona y la rnodidicaci6n por glucosi lacidn, acetilacihn y fosforilaci6n se produce despues de la traducciiin. La escisibn siguiente, en am bac lóbulos: anterior e intemedio, es entre ACTH y beta-LPH, lo cual forma un péptido terminal amino con ACTH y un segmento de beta-LPH (figura 45-5). La ACTHi.39 se escinde a continuaci6n desde el ~Cntidoterminal amino y en el Iobulo anterior yano ocurre esencialmente otra escisión. En el Iobulo intermedio, la ACTH i.30 se divide en alfa-MSH (residuos 1 a 13) y el CLIP (1 S a 39); beta-LPH (42 a 134) se convierte a gamma-CPH (42 a 10 1 $ y en beta endorfina ( 1 04 a 134). La betaMSH (84 a 101) se deriva a partir de gamrna-LPI 1. Hay modificaciones adicionales extensas de estos péptidoc. Una buena parte del péptido terminal amino y de la ACTHi.39 en la hipiifisis anterior está glucosilada. La gamma-MSH se encuentra predominantemente en forma N-acetilñda y amídica en la terminal carboxilo; la alfa-MSH desacetilada es mucho menos activa. En el lhhuto intermedio, la beta endorfina se acetila con rapidez; al contrario de la alfaMSH, la beta endorfina acetilada es 1000 veces menos activa aue la forma sin modificar. Por tanto. la beta endorfinanpuedeestar inactiva en la hipiifisis. En el hipot&lamo, estas moléculas no están acetiladas y se supone que son activas. También la beta endorfina se recorta en el extremo terminal carboxilo para formar 1
,
alfa y gamma endorfina (figura 45-5). Éstas constituyen las tres endorfinas principales en el lobulo intermedio de los roedores. Es probable que el gran fragmento terminal amino sea tarnbicn dividido exteniamente, pero aunque se encuentra gamma-MSH en la hipófisis dc rata y bovinos, menos se sabe acerca de este fragmenta. Esta información estrucfural se ha obtenido principalmente de estudios de la hipdfisis de loc roedores, peiose considera que el esquema general puede aplicarse a otras especies. Todavía no se han establecido las funciones precisas de la mayor parte de los peptidos de la POMC.
B. A ccion y regulación de peptidos especí fjcos 1) Hormona adrenocorticotrópica (ACTH); estructura y mecanismo de accibn: La ACTH,
un polipéptido de cadena sencilla formado por 39 aminohcidos (figura 4 5 4 1 , regula el crecimiento y la funcion de la corteza supramenal. Los 24 aminoAcidos a partir de la terminal amino son necesarios para su actividad biológica plena y son invariables entre las especies, en tanto que los 15 aminoAcidos a partir de la trzminal carboxilo son bastante variables. En la pruebas de diagnóstico se utilim extensamente un análogo sintético, la ACTH,.:,. La ACTH incrementa la síntesis v liberacion de los ecteroides suprarrenales al incrementar la conversión del colesterol a pregnenolona. Este paco comprende la conversihn desde un esteroide C27 a uno Cz, por eliminación de una cadena lateral de seis carbonos. Puesto que la pregnenolona es el precursor de todos los esteroides suprarenales (figura 48-3), la estimulación prolongada por la ACTH conduce a produccibn excesiva de glucocorticoides, mineralocoriicoides y dechidroepiandrosterona (un precursor de andr~genos).Sin embargo, 3a contribucion de la ACTH a las dos últimas clases de ecteroidec es mínima bajo condiciones fisiológicas. La ACTH incrementa el desa-
P-LPH (42 a 134)
ACTH (1a 39)
J
1u
-
l
- 1
a-MSH
CLIP
y-LPH
(laalg
(1Ba39)
(42 a 101)
p-Endorfina (1 04 a 134)
Figura 4 5 6 . Productos de la escisión de la pro-opiomelanocortina (POMC) (La MSH, hormona estimulante de los melanocitoc; CLIP, pbptido del lbbulo intemedio anllogo a la corticotropina: LPH, lipotropina.}
(Capitulo 453
requerida para una actividad biológica total
25
Regibn variable: no necesaria para actividad biologica
detecta. La beta-LPH sólo se encuentra en la hiphfisís, dado que en otros tqjidos se convierte con rapidez a gamma-LPH y beta-endorfina. La beta-LPH contiene una secuencia de siete aminoácidos (beta-LPH4i.ri) que es idéntica a la ACTHa.io. La beta-LPH causa lipólisis y movilizacion de ácidos grasos, pero su papel fisiológico es minimo. Es probable que sirva sólo como precursor para la beta-endorfina.
DaEndorfinas Figura 4 5 4 Estructura de la ACTH humana
rrello de la corteza suprmenal (el efecto trófico) al aumentar la síntesis de proteínas y de RNA. La ACTI-I, al igual que otras hormonas peptidicas, se une a un receptor de la membrana plasmática. En escasos segundos despues de esta interacción, las concentraciones del cAMP intracelular aumentan notablemente. Los analogos del cAMP imitan la accibn de la ACTH, pero tambien interviene el calcio. 2) Fisiopatologia de la ACTH: La producciiin excesiva de ACTH por la hipófísis o por la produccion ectbpica a partir de un tumor conducen al sindrome de Cushing. La actividad dCbil similar a MSH de la ACTH, o la liberacihn concomitante de beta-MSH o alfa-MSH produce hiperpigmentación. Las manifestaciones rnetab6licas se deben a la producción excesiva de estemides suprarrenales y comprenden: 1) equilibrio negativo de nitrógeno, potasio y fósforo; 2) retención de sodio, que puede desembocar en hipertensión, edema o ambos; 3) intolerancia a la glucosa o diabetes sacarina declarada; 4) incremento de hcidos grasos plasmáticos, y 5) disminución de eosinofilos y Iinfocitos circulantes, con incremento de leucocitos polimorfonucleares. Los pacientes con síndrome de Cushing pueden tener atrofia muscular y una redistribucidn peculiar de la grasa, esto es, obesidadtroncal. La pérdida de ACTH debida a un tumor, ínfeccibn o infarto de la hipófisis produce una constelacibn opuesta de ha1lazgos.
C . befadipotropina (beta-LPH) Este pdptido está constituido por los 91 aminohcidos del extremo carboxilo terminal de la POMC (figura 45-5). La beta-CPH contiene las secuencias de beta-MSH, gnmma-LPH, met-encefalina y beta-endorfina. De estas, beta-LPH, gamrna-LPH y beta-endorfina se encuentran en la hipofisis humana pero beta-MSH no se
La beta-endorfina esta formada por los 3 1 aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la beta-LPH (figura 45-5). Las endorfinas alfa y gamma son modificaciones de la beta-endorfina de la cual se eliminan 15 y 14 aminohcidos, respectivamente, de la terminal carboxilo. Estos péptidos se encuentran en la hip0físis, pero ahí se acetitan (vtase antes) y es probable que sean inactivos. En otros sitios (por ejemplo. las neuronas del sistema nervioso central) no se modifican y por tanto es probable que sirvan como neurotransmisores o neuromoduladores. Las endorfinas se unen a los mismos receptores del sistema nervioso central que los opiáceos de morfina y pueden intervenir en el control endógeno de la percepción del dolor. Tienen potenciales analg&sicosmayores (1 8 a 30 veces en base equimolar) que la rnofina. La secuencia de la encefalina está presente en la POMC, pero no va precedida por aminoácidos dibásicos y se presume que no se escinde ni expresa.
E. Hormona estimulante del melanocito WSH)
La MSH estimula melanogbnesis en algunas especies al causar la dispersión de los gránulos intracelulares de melanina, lo que da lugar al oscurecimiento de la piel. Tres moleculas diferentes de MSH, alfa, beta y gamma están contenidas dentro de la rnoltcula de POMC y dos de &as, alfa y beta son secretadas en algunas especies no humanas. En el ser humano la actividad real de la MSH circulante esth contenida dentro de las mol&culasmás grandes garnma-LPH o beta-LPH. La alfa-MSH contiene una secuencia de aminoácidos que es idbntica a la ACTHI-13,pero tiene un extremo amino acetilado. La alfa-MSH (y CLIP), por 10 general se encuentran en animales que tienen un Idbulo intermedio bien desarrollado. Estos péptidos no existen en el hombre despues del nacimiento. Los pacientes con produccibn insuficiente de glucocorticoides (enfermedad de Addison) tienen hiperpigmentación acompañada de un incremento de la actividad de la MSH plasmhtica. Esto podria ser causado por la ACTH pero es mhs probable que sea consecuencia de la secrecibn concomitante de beta y gamma-LPH, con su actividad combinada de MSH.
Hormonas de hipcifi.~i~ e hipotdlumo 619
LA MIPÓFISIS POSTERIOR SINTETIZA DOS HORMONAS ACTIVAS VASOPRESIUA Y OXITOCINA La vasopresina, nombrada así originalmente debido a su capacidad para incrementar la presión arteria1 cuando se administra en cantidades famacol6gicas, se denomina con m h propiedad hormona sntidfurética {ADW)debido a que su acción fisiológica más importante es promover la resorción de agua desde los túbulos renales distales. La oxitocina, se denomina así también por un efecto fisioliigico de significado dudoso, la aceleración del nacimiento por estimulación $e las contracciones del muscul;o liso uterino. Es probable que su funcibn fisiológica sea promover la expulsión de leche de la glándula mamaria. Ambas hormonas se producen en el hipotalamo y se transportan por flujo axoplasrnico a las terminaciones nerviosas en la hipbfisis posterior de donde, bajo el estimulo apropiado, se liberan a la circulacion. La razon probable para esta distribución es la de permitir que escapen de la barrera hemoencefalica. La ADH se sintetiza en forma primaria en el nricleo supraáptico y la oxitocina en el núcleo paraventricu2ar. Las dos se transportan a t r a d s de los axones en combinacibn con proteínas transportadoras específicas llamadas neurofisinas. Las neurotisinas I y 11 se sintetizan, respectivamente, con la oxitocina y la ADH, cada una como parte de una proteína simple (conocida como propresofisina) a partir de un solo gen. Las neurofisinas 1 y II son proteínas unicas con masas moleculares de 19 y 2 E kDa, respectivamente. La ADH y la oxitocina se secretan por separado al torrente sanguineo junto con sus neurofisinas apropiadas. Circulan sin unirse a proteínas y tienen vidas medias plasmaticxs muy cortas, del orden de 2 a 4 minutos. Las estructuras para ADH y oxitocina se muestran adelante:
1
I
Cis-Tir-Fen-Gln-Asn-Cis-Pro-Arg-Gli-NH2 Vasopresina arginina
Vasopresina lisina
Oxitocina
Cada una es un nonapéptido que contiene molecuias de cisteina en las posiciones 1 y 6 enlazadas por un puente S-S. La mayor parte de los animales tienen vasopresina arginina; sin embargo, la hormona en los cerdos y especies relacionadas tiene una lisina en la posicion 8. Debido a la gran semejanza estructural, no es sorprendente que la ADH y la oxitocina exhiben cada una algunos de los efectos de la otra rnolecula. Estos peptidos se rnetaboii7an bhsicamente en e! hígado, aunque la excrecihn renal de la ADH representa una parte importante de su pérdida de la sangre.
Oxitocina
A. Regulación de la secreción Los impulsos neurales que resultan de la estimulacion de los pezones son et estímulo primario para la liberacibn de oxitocina. La distensión vagina1 y uterina son los estimulos secundarios. La PRL se libera por mlichos de los estimulos que liberan oxitocina y se ha propuesto un fragmento de la oxitocina como el factor liberador de prolactina. El estrógeno estimula la producción de oxitocina y de neurofisina 1 y la progestrona la inhibe.
B. Mecanismo de acción Se desconoce el mecanismo de accibn de la oxitocina. Causa contracci~ndel músculo liso uterino y por eso se emplea en cantidades farmacologicas para inducir el parto humano. Es interesante observar que en los animales, las hembras prefiadas en las que se ha destruido la vía hipotrilamo-hipófisis no necesariamente tienen problemas para parir. La función fisio16gica mhs probable de la oxito~inaes estimular la contracción de las células mioepiteliales que rodean a los alveolos marnarios. Esto facilita @E movimiento de [a leche en el sistema de conductos alveolares y permite la expulsión de la leche. Los receptores de membrana para la oxitocina se localizan tanto en el tejido uterino como en el marnario. Estos receptores numentan en número por la presencia de estrógenos y disminuyen por la de progesterona. La elevacibn de los
estrógenos, concomitante con la caida de la progesterona, que se produce inmediatamente antes del parto, es una explicación probable para el comienzo de la secreci~n]Actea antes del nacimiento. Es común el uso de derivados de progesterona para inhibir la secreción lactea posparto en los humanos. Al parecer la oxitocina y neurofisina I son producidas en el ovario, en donde la oxitocina puede inhibir la esteroidogénesis. Los grupos químicos importantes para la acción de la oxitocina son el m i n o primario de la cisteina amino terminal: el fendlico de la tirosina; Pos tres gnipos carboxiamídicos de asparagina, glutamina y glici-
namida y el enlace disulfuro (S-S). Mediante la supresión o sustitución de estos grupos se han producido numerosos anhlogos de la oxitocina. Por ejemplo, la eliminación del grupo amino primario libre del residuo de cisteina central (posicibn 1) produce desaminooxitocina, la cual tiene una actividad antidiuretica 4 a 5 veces superior a la oxitucina.
Hormona antidiurética (ADH; vasopresina) A. Regulación de la secreción Los impulsos neurales que desencadenan la liberacibn de ADH son activados por cierto número de estimuIos diferentes. El estímulo fisiol6gico primario es la osmolalidad plasrnática. Éste es mediado por osmorreceptores localizados en el hipothlamo y por barorreceptores localizados en el corazbn y en otras regiones del sistema vascular. La hernodilucibn ( o s m e lalidad disminuida) tiene el efecto opuesto. Otros estimulos son estres emocional y fisico y agentes famacológicos, como acetilcolina, nicotina y morfina. En casi todos estos efectos interviene un aumento de la síntesis de ADH y de neurofisina 11. puesto que el agotamiento de la hormona almacenada no se relaciona con esta acción. La adrenalina y los agentes expansores del plasma inhiben la secreción de ADH, como lo hace el etanol.
B. Mecanismo de acción Las cklulas blanco fisiol6gicac mas importantes de la ADH en los marniferos, son las de los túbulos contortieados distales y las estructuras colectoras del riiíón. Estos conductos pasan a través de la rn&dularenal, en la cual el depósito metabólico común extracelular de solutos tiene un gradiente de osmolalidad cuatro tantos el del plasma Estas céluls son relativamente impermeables al agua, de modo que en ausencia de ADH, la orina no se concentra y puede excretarse en cantidades que exceden de 2, en ocasiones hasta 15 Lldia. La ADH incrementa la permeabiliad de las cdlulas e1 agua y permite el equilibrio osmótico de la orina de los túbulos colectores con el intersticio hipert~nico,lo cual hace que los volúmenes excretados de orina oscilen de 0.5 a 1 L/dia. Hay dos tipos de receptores de ADH o vasopresina: VI y V2. Los receptores V2 s61o se encuentran en la superficie de las células epitelialec renales. Estos receptores se enlazan con la adenilil ciclasa y se considera que el cAMP media los efectos de la hormona sobre el ttibulo renal. Esta acci6n fisioldgica es la base del nombre "hormona antidiurdtica". El cAMP y los inhibidores de la actividad de fosfodiesterasa (cafeína, por ejemplo) imitan las acciones de la ADH. lil vivo, una concentracibn alta de calcio en
el medio que baiia la superficie mucosa de las cklulas tubulares inhiben la acción de la ADH sobre el movimiento del agua, aparentemente al reprimir la actividad de la adenilil ciclasa, puesto que por si misma no disminuye la acción del cAMP. Esto puede explicar, en parte, los volumenes excesivos de orina característicos de los pacientes con hipercalcemia. Todos los receptores ADH extrarrenales son del tipo V I . EI enlace de ADH al receptor V1 produce activación de la fosforiIasa C, Io que, a su vez, resulta en la generaci~nde IP3 y diacilglicerol. Esto da lugar a un aumento del Ca" intracelular y activación de la proteína cinasa C. El efecto principal de los receptores V 1 es la vasoconstricción y el aumento de la resistencia vascularperifkrica, de allí el nombre de vasopresina que tambien se utiliza para denominar esta hormona.
C. Fisiopatología Las anormalidades de la secreción o la acción de la ADH conducen a la diabetes insipida, que se caracteriza por la excreción de grandes volumenes de orina diluida. La diabetes insipida primaria, causada por una cantidad insuficiente de la hormona, por lo general, se debe a la destrucciiin de la via hipotaltimica-hipofíseal por una fractura de la base del cráneo, tumor o infecciiin, pero puede ser hereditaria. En la diabetes insípida nefrogbnica hereditaria, la ADH se secreta en cantidad normal pero la cklula blanco es incapaz de responder, probablemente a causa de un defecto de los receptores. Esta lesión hereditaria se distingue de la diabetes insípida nefregkica adquirida, que con frecuencia se debe a la administración farrnacol~gica de litio para tratar padecimientos rnaniaco depresivos. La secrecibn inapropiada de ADH se presenta en combinación con la produccihn ectópica por diversos tumores (por lo general, tumores del pulmon) pero tambicn puede ocurrirjunto con trastornos cerebrales, infecciones pulmonares o hipotiroidismo. Se le llama secreción inapropiada debido a que la ADH se produce a una velocidad normal o aumentada en presencia de hipoosmolalidad para producir asi una hipona~emia por dilución persistente y progresiva, con excreción de orina hipertónica.
RESUMEN Las interacciones específicas entre hipothlamo, hip~fisisy glhndulas endocrinas blanco forman una serie de unidades reguladoras de circuito cerrado que son la base del sistema endocnno. El propbcito de este arreglo es proporcionar concentraciones diferentes de hormonas, secretadas por la glkndula blanco en respuesta a los diversos retos rnetabolico~y ambientales para asegurar un ciclo reproductivo normal. Las hormonas hipotalámicas involucradac en este tipo de
Hormonas de hrpefisis e hiporáiumo * 621
regulacidn son pdptidos Ihbiles pequefios que circulan hacia la hipofisis anterior por un sistema portal vac-
receptor-ligando directas. Además, la ACTH se sintetiza coma parte de una molécula precursora muy cular especial. Estas hormonas estimulan la sintesis y grande que se procesa a varias hormonas. liberacion de hormonas de la porción anterior de la Entre regiones específicas de hipotálamo e hipiifisis, que alcanzan las glhdulas blanco a través de hipófisis posterior se forman unidadcs funcionales Ta circulacion general. Los ejemplos de estos sistemas muy diferentes. Las células de la región de los núcIeos suacoplados incluyen a CRH-ACTH-cortisol, TRHpraoptico y paraventncularsintetim mol6culas grandes TSH-TdTd v GnRH-LHfFSH-tectosteronru'estradiol- que contienen ADH y oxitocina, respectivamente. progesterona. Las hormonas comprendidas en estos Estas mul~culasprecursoras grandes contienen tambien sistemas reguladores son péptidos y proteínas a las neurofisinas 1 y 1L cada una, que intervienen en el pequeiios y grandes, glucoproteínas heterodiméricas, transporte de ADH y oxitocina a través de los axones esteroides y derivados de aminoacidos. Todos los de las neuronas productoras a sitios de almacenaje e n mecanismos de acción bioquímicos básicos de las la hipiifisis posterior. De estos depositos, las horhormonas están representados en sus actividades; por monas se liberan por cambios en la osmolalidad skrica ejemplo, los que comprenden interacciones con (ADH) y estimulación del peziin (oxitocina). II cAMP, Caz', diacilglicerol, IP,, cascadas de cinasa y
REFERENCIAS Amselem S et al.: Laron d\+arfism and mutations of the
p r o n t h hrirmone-receptor gene. N Engl J Med 1089:32 1.9R9. Argetsingcr LS et al.: Identification of JAK2 as a growth hormone receptor-associated tyrosine kinase. Cell 1993:74:237. Rarbieri RL: Clinicai application of GnRH and its analogs 'l'rends Endocrinal Metah 1992.3.30. Chord 1T: The posterior pituitas pland. Clin Endocrino1 1975;4:89. Crowley U'F et al.: rhe physiology ol'gnnadotropin-releasing hormone secretion in rnen and womcn. Rcccnt Prog i Iorm Res 1985;4 1:473. Douglas J, Civelli O, Herbert E: Polyprozein gene expression: Gcncration of divcrsit) of ncurocndocrine p c p tidcs. Annu Rev Biochcm 1984.53:665.
nf CNS peptides on h~mpothalarnic scgiilation of pituitary sccrction. Adv Biochcm Psychopharrnacol 1981;28:557. Ketly PA et al.: The g r o ~ t hh ~ r n ~ n e / p r n l a c t receptor in family. Rcc Prop Horm Rcs 1993,411 123. Lahrie F et al.: Mechanism of action of hypothalamic homones in the adenohypoph>sis Annu Kev Physior 1979;41 555. Reichlin S: Systems for the study o f regulation of neuropeptide secretion. In: h'eurosecretion and Brain Peptides. ImpliccirionsJor nrain Function and h'eurolugical Dis~ase.Martin JB, Reichlin S, Bick KL (edit a r ~ ) Raven . Press, 198 1 . Rohertson GL: Regulation of vasopressin function in h e a l t h a n d d i s e a s e Kecent I'rop I l o r m R e s 1977;33:333. lmura H et al.: Effect
Mormonas tiroideas
SIGLAS UTILIZADAS EN ESTE CAP~TULO
Las hormonas tiroideas regulan la expresión génica, la diferenciación tisuIar y el desarrollo general. La glkdu!a tiroides produce dos hormonas yodoaminoácidas: 3,5,3'-triyodotironina (T,) y 3,5,3:5'tetrayodotironina (T1, tiroxina), cuya importancia en la regulación del metabolismo general, e l desam110 y la diferenciacibn tisular se ha reconocido desde hace tiempo. Estas hormonas, cuyas estructuras se muestran en la figura 46-1, regulan la expresidn de los genes usando mecanismos similares a los utilizados por las hormonas esteroides.
Las enfermedades del tiroides son de las más comunes del sistema endocrino. El diagnbstico y la terapéutica se basan firmemente en los principios de la físiologia y la bioquimica de las hormonas tiroideas. La disponibilidad de los radioisbtopos del yodo ha contribuido notablemente en el descubrimiento de estos principios. El yodo radiactivo, por su propiedad de acumularse en la glándula, se usa extensamente en diagnbstico y tratamiento de los trastornos tiroideos. Sin embargo, esta sustancia tiene tambidn un aspecto peligroso, dado que una exposicibn excesiva, como en los casos de precipitacibn radiactiva despues de una explosi6n nuclear, es un factor mayor de riesgo de ckncer del tiroides. Esto es cierto especialmente en nifios y adole~centescuyas ctlulas tiroideas aún se están dividiendo de manera activa.
DIT MIT T3
Ta
TBG
TBPA TRH TSH
TSI
Diyodotirosina Monoyodotirosina Triyodotironina tiroxina; tetrayodotironina Globulina fjadora d e tiroxina Prealbúmina fjadora de tiroxina Hormona tiberadora d e tirotropina Hormona estimulante del tiroides IgG estimulante del tiroides
LA BIOS~NTESISDE LA HORMONA TIROIDEA COMPRENDE EL METABOLISMO DE IA TIROGLOBULINA Y DEL YODURO Las hormonas tiroideas son las unicas en que requieren del oligoelemento yodo para su actividad biológica. En la mayor parte del mundo, &te es un componente escaso del suelo, por lo que su contenido en los alimentos es escaso. Un mecanismo complejo ha evolucionado para adquirir y retener a este elemento decisivo y convetirto en una forma adecuada para su incorporación a compuestos orghnicos. Al mismo tiempo, el tiroides debe sintetizar tironina, proceso que tiene lugar en la tiroglobulina. Aunque estos fenomenos ocurren de manera concurrente, se describirh por separado.
624 * Bioquimica de Harper
(Capítulo 46j
igual que la DIT:M!T. Esta molécula grande de 5000 aminohcidos proporciona la conformación adecuada para e! enlace de tirosilo y la organificacion del yodo necesarias en Ja formación de las hormonas tiroideas del ácido diamino. La tiroglobulina es una prohormona, la cual se sintetiza en la porción basal de la celula y se moviliza hacia el lumen, donde es almacenada en el coloide extracelular; más tarde, reingresa a la célula y se desplaza en direccion apical a basal durante su hidrólisis hacia las hormonas act ívas T; y Tq.Todos estos pasos están potenciados por la TSI? y esta hormona (o el cAMP) también incrementa la transcripción del gen de la tiroglobulina.
HOoO+HFH I
/ \ 1
-com
1
NH,
3,5.3'.5'-Tetrayodotironina (tiroxina r 4 ] )
1
f 3.3',5'-Tnyodotimnina
(T3 inversa [rT3])
Flguia 46-1. Estructura de las hormonas tiroideas y mmDuestos relacionados
La tiroglobulina es una proteína compleja
A. Biosintesis La tiroglobulina es el precursor de
T d y T1.ES una proteina glucosilada, yodada, grande, con una masa molecular de 660 kDa. El carbohidrato constituye de 8 a 10% de su peso y el yoduro aproximadamente 0.2 a 1%, dependiendo del contenido de yodo en los alimentos. La tiroglobulina se compone de dos subunidades y contiene 1 15 residuos de tirosina, cada uno de los cuales es un sitio potencial de yodación. Aproximadamente 70% del yoduro de la tiroglobulina existe en los precursores inactivos, monoyodotirosina (MlT) y diyodotirosina (DIT), en tanto que 30% se encuentra en 10s residuos yodotironilo, T4 y Tj. Cuando los aportes de yodo son suficientes, la proporción T4:T3es de 7: 1, aproximadamente. En los casos de deficiencia de yodo, esta proporción decrece, al
B. Hidroljsis
La tiroglobulina es una forma de almacenaje de TI y Ts en el coloide; en el tiroides normal existe una reserva para varias semanas de estas hormonas. En minutos, después de la estimulacibn del tiroides por la TSH (o el cAMP), hay un incremento notable de microvellosidadcs en la membrana apical. Este proceso dependiente de los microtúbulos atrapa a la tiroglobulina y la pinocitosis subsiguiente la regresa a la celula folicular. Tales fagosomas se fusionan con los lisosomas para formar fagolisosomas en los cuales varias proteasas y peptidasas ácidas, hidrolizan a la tiroglobulina en aminoácidos, incluyendo las yodotironinas. Las T4y T3son descargadas a la sangre desde la porcih basal de la cklula, tal vez por un proceso facilitado. La proporción entre T4y T, en esta sangre es menor que en la tiroglobulina, de modo que en el tiroides debe producirse alguna desyodación selectiva de T4. Aproximadamente 50 pg del yoduro de la hormona tiroidea son secretados cada dla. Con una captacidn promedio de yoduro (de 25 a 30% del ingerido), su requerimiento diario oscila entre 150 y 200 pg. Como se mencion6, la mayor parte del yoduro de la tiroglobulina no esti en la ydotironina, pues aproximadamente 70% se encuentra en los compuestos inactivos MIT y DIT. Estos aminohcidos son liberados cuando se hidroliza la tíroglobulina y el yoduro es removido por una desyodasa. En la hipbfisis, en el rifión y en el higado están presentes otras formas de esta enzima dependiente de NADPH. El yoduro removido de M1T y D1T constituyeun depdsito importante dentro del tiroides, distinguible experimentalmente del 1-.que entra desde la sangre. En condiciones de equilibrio, la cantidad de yoduro que entra al tiroides iguala a la cantidad que lo abandona. Si un tercio del yoduro de la tiroglobulina sale (corno T4y T3), se deduce que dos tercios del yoduro disponible para la biosintesis provienen de la desyodación de MTT y DIT dentro del tiroides.
Hormonas tiroideas
El metabolismo del yoduro se desarrolla en varías etapas discretas (figura 46-2) A. Concentración del yoduro (0 El tiroides. junto con varios otros tejidos epiteliates, incluyendo a la glándula marnaria, el corión, las glhn-
625
dulas salivales y el estómago, e5 capaz de concentrar 1- contra un fuerte gradiente electroquímico. Este es un proceso consumidor de energia que esth ligado a la bomba Na'K' dependiente de ATPasa. Se puede aislar la actividad de la bomba de 1- tiroidea de los pasos subsiguientes en la biosíntesis hormonal, mediante la inhibición de la arganificacion del 1- con
ESPACIO FOLICULAR
MIT MlT
1
T, MIT
DIT
Oxidación
DIT
.
4
Llsosoma secundario Tirosina
DeS@m'bn*
pEmWq
r::
Cgrrcenlmón
H~dról~s~s
T,, T.
m 1 .
Liberación
Bomba
ESPACIO EXTRACELUWR
1-
I T,, T i
Flgura 46-2. Modelo del metabolismo del yodum en el folicvlo tiroideo. Se muestra una dlula folicular que hace frente al lurnen folicular (área punteada) y al espacio extracelular (abajo) El yoduro entra al tiroides por medio de una bomba y por difusibn pasiva. La sintesis de la h o m n a tiroidea se produce en el espacio folicular a traves de una sene de reacciones, muchas de las cuales son mediadas por la peroxidasa. Las hormonas tiroideas son liberadas de la tiroglobulina por hidrblisis (Tgb, tiroglobulina; MIT, monoyodotirosina; DIT, diyodotirosina; T3, triyodotironina,T4, tetrayodotironina ) Los asteriscos indican pasos o procesos que son deficienciasenzimáticas hereditarias que causan bocio congénito y a menudo conducen a hipotiroidismo.
626 Bioquimica de Harper
tcapituko 46)
H
I
MH,
I
c=s I
NH,
S=C
8
N-C 1 \
,
17"
H
I
S-C
N-CH
I
H Tiourea
Tioumcilo
R
/" -=\
//"
\
H
I
s=c
N-C -C3Hr
N-CH
H
CH3
I
Propilticiuracilo
I
Metimazol
Figura 4 6 5 . FBrmawc antitiroideos del tipo de la tiourea.
compuestos del tipo de la tiourea (figura 46-3). La proporción entre el yoduro en el tiroides y en el suero (proporcidn TS) es un reflejo de la actividad de esta bomba o del mecanismo de concentración. Esta actividad es controlada principalmente por la TSH y oscila desde S00 en los animales estimulados de manera crónica con TSH, hasta cinco o menos en los animales hipofisectomizados. La proporcion T:S en el hombre con alimentacibn normal en yodo es de aproxirnadamente 25: 1 . También entra al tiroides una cantidad muy pequefla de yoduro mediante difusidn. Cualquier cantidad de I- intraceluIar no incorporado a M1T o DIT (por lo general menos de 10%) es libre de abandonar la glhndula por este mecanismo. El mecanismo de transporte es inhibido por dos clases de molkculas. E[ primer grupo está formado por perclorato [Tc04-), pemnato (Reos-), y pertecnetato (TcOa-), todos son aniones con similar volumen especifico parcial de 1-, los cuales compiten con el 1por su portador y son concentrados por el tiraides. En los estudios del transporte de yoduro en el ser humano se utiliza comrinniente un radioisótopo del Tc04-. El ani6n lineal tiocianato (SCN-), ejemplo de la segunda clase, es un inhibidor competitivo del transporte del 1pero no es concentrado por el tiroides.
B. Oxidacidn del r El tiroides es el único tejido que puede oxidar el 1hasta un estado de valencia superior, paso obligatorio en la organificacibn del 1- y en la biosintesis de la hormona tiroidea. Este paso comprende a una peroxidasa que contiene hem y tiene lugar en la superficie luminal de la cklula folicular. La tiroperoxidasa, protefna tetramerica con una masa molecular de 60 kDa requiere perbxido de hidrógeno como agente oxidante. El H 2 0 r es producido por una enzima dependiente de NADPH similar a la citocromoc reductasa.Cierto número de compuestos inhiben la oxidación de 1-y por tanto su incorporación subsiguiente a MIT y DIT. Clinicamente, los más importantes de ellos son los farmacos de tiourea,
algunos de los cuales se muestran en la figura 46-3. Se les conoce como filrmacos antitiroideos debido a s i l propiedad de inhibir la biosintesis de la hormona tiroidea en este paso.
C. Yodación de la tirosina El yoduro oxidado reacciona con los residuos tirosilo de la tiroglobulina en una reacción que probablemente comprende también a una tiroperoxidasa. La posición 3 del anillo aromatico es yodada primero y luego la posición 5 para formar MIT y D3T,respectivamente. Esta reaccibn algunas veces llamada organificacidn, se produce en segundos en la tiroglobulina luminal. Una vez que la yodación se ha producido, no es flicil que el yodo abandone al tiroides. La tirosina libre puede ser yodada, pero no es incorporada a las proteinas, puesto que ningún tRNA reconoce a la tirosina yodada.
D. Acoplamiento de los yodotirosilos El acoptamiento de dos moltculas de DIT para formar Tq o de una de MIT y otra de DIT para formar T3 tiene lugar dentro de la rnol~culade tiroglobulina, aunque no se ha excluido de manera definitiva la posibilidad de que una MIT o una DIT libres se unan a una DIT. No se ha descubierto una enzima acopladora separada y puesto que éste es un proceso oxidativo, se supone que la misma tiroperoxidasa cataliza esta reaccíbn estimulando la formación de radicales libres de la yodotirosina. Esta hipotesis se apoya en la observación de que los mismos medicamentos que pueden inhibir la oxidacibn de 1- tambien inhiben el acoplamiento. Las hormonas tiroideas formadas permanecen como partes integrales de la tiroglobulina hasta que esta última es degradada, como se describib. La hidrólicis de la tiroglobulina es estimulada por la TSH pero es inhibida por el 1-; este último efecto es explotado ocasionalmente por el uso de yoduro de potasio para tratar el hipertiroidisrno.
Hormonas tiroideas
LAS HORMONAS TlROlDEAS SE TRANSPORTAN MEDIANTE UNA GLOBULINA FIJADORA TIROIDEA La mitad o dos tercios de T4y T3en el cuerpo son extratiroideos y la mayor parte de esto circula en forma fija, es decir, unida a dos proteinas fijadoras especlficas, la globulina fijadora de tiroxina (TBG) y la prealbiimina fijadora de tiroxina (TBPA). La TBG, una glucoproteina cuya masa rnolecular de 50 kDa, es cuantitativamente la más irnpomte. Se une a T.,y TI con 100 veces la afinidad de la TBPA y tiene la capacidad de fijar 20 pg/dL de plasma. En condiciones normales, la TBG fija de manera no covalente, a casi la totalidad de Tq y TI pFasmBticas (cuadro 46-1). La pequefla fraccibn sin fijar (libre) es la que realiza la actividad biológica. A pesar de la gran diferencia en la cantidad total, la fraccibn libre de T, se aproxima a la de T4, pero la vida media plasmatica de T4es de 4 a 5 veces mayor que la de la primera. La TBG tambidn estB sujeta a regulacibn, una consideracibn importante en las pnrebas de diagnóstico de la funcibn tiroidea, dado que la mayoria de los anhlisis de T4O T3miden la cantidad total en el plasma mas bien que a Ia hormona libre. La TBG es producida en el higado y su síntesis es Encrementada por los estrógeno5 (embarazo y píldoras anticonceptivas). La síntesis de TBG disminuye despues de terapkutica con andrógenos o glucocortic~idesy en ciertas enfermedades hephticas. También puede haber aumento o disminucibn hereditarios de TBG. Todas estas condiciones dan lugar a cambios totales de T4 y TS sin modificacidn en la concentracibn libre. La fenitoina y 30s salicilatos compiten con TI y T4 por la fijación a la TBG,lo cual reduce la concentración total de la hormona sin cambio en la fraccion libre y debe considerarse al interpretar las pruebas de diagndstico. La desyodacibn extratiroidea convierte Tqen T3. Dado que Tj se une al receptor tiroideo en las cdlulas blanco con una afinidad 10 veces mayor que T4,se piensa que T3 es la forma preponderante de la mol~culametabólicamenteactiva. Aproximadamente
rll~iro 46-1. Comparación de T. Hormona 1 !
Porcenta del tota
T-
62 7
80% de la T4circulante se convierte en TJo T7 inversa (rT3)en la periferia y esta conversibn representa la mayor produccidn de T,. La T, inversa es un agonista muy
d6biI que se forma en cantidades relativamente mnyores en la enfemedad crónica, en la inanicibn de carbohidratos y en el feto. El propiltiouracilo y el propranolol reducen la conversion de T., en T,. Otras formas del metabolismo de la hormona tiroidea incluyen la desyodación total y la inactivacibn por desaminación o descarboxilacibn. La glucuronidacibn y la sulfatacion hepáticas producen una molécula mBs hidr6fi la que es excretada en la bilis, resorbida en el intestino, desyodada en el rifion y excretada como conjugado glucuronido en la orina.
LAS HORMONAS TIROIDEAS TIENEN UN MECANISMO NUCLEAR DE ACCIÓN Las homonas tiroideas se fijan a receptores especlficos de elevada afinidad en el núcteo de las ckIulas blanco; T3 se une con una afinidad 10 veces mayor
que T4y tiene una actividad biolbgica proporcionalmente mayor. Las hormonas tiroideas se fijan a sitios de afinidad baja en el citoplasma, pero aparentemente esta no es la misma proteína que el receptor nuclear. La fijacibn citoplhsmica puede servir para conservar a las hormonas tiroideas "en la vecindad". Otro efecto mayor de Tjy T4 es potenciar la sintesis de proteínas y producir un balance positivo de nitrógeno positivo, Las hormonas tiroideas, como los esteroides, inducen o reprimen proteinas mediante el incremento o la reduccibn de la transcripcion gknica (figura 44-1). En el caso de T, y Te,el factor de accion tram es el complejo hormona-receptor, que al parecer siempre reside en el núcleo. El elemento DNA de respuesta a hormona de acci6n cis que se une a este compleja estB constituido por Ia secuencia central que se muestra en el cuadro 44-3, AGGTCANNNNAGGTCA. Hay una relacibn curiosa entre las dos clases de hormonas que influyen en el desarrollo, las hormonas tiroideas y la hormona del crecimiento misma. La T3 y glucocorticoides potencian la trmscripcibn del gen para GH, de modo que su producción es mayor. Esto explica una observaci6n clasica en la cual las hip6fisis de animales deficientes en Tj mostraron carencia de GH y puede explicar también aIgunos de los efectos anab0licos generales de T,. Las concentraciones muy altas de T3ínhiben la síntesis de proteinas y producen nn balance de nitrógeno negativo. Se sabe que las hormonas tiroideas son moduladores importantes de los procesos del desarrollo. Esto es más evidente en la metamorfosis de anfibios, pues
(Capitulo 46)
las hormonas tiroideas son necesarias para la conversi6n de un renacuajo en rana, proceso que comprende la resorcian de la cola, la proliferacidn de las yemas de las extremidades, la conversion de la hemoglobina fetal en hemoglobina de adulto, la estimulación de las enzimas del ciclo de la urea (carbamoilfosfato sintasa) de modo que excrete urea en lugar de amoniaco, así como los cambios epidh-micos. Es probable que estos efectos se deban a la regulacibn de la expresibn de genes específicos. Las hormonas tiroideas se requieren para el desarrollo normal humano, ya que el hipotiroidismo intrauterino o neonatal conduce al cretinismo, condición que se caracteriza por defectos congénitos múltiples y retraso mental grave e irreversible.
LA FISIOPATOLOG~A DE NUMEROSAS ENFERMEDADES DEL TIROIDES SE RELACIONAN CON TSH, T3 Y T4
El bocio es el crecimiento del tiroides Cualquier crecimiento del tiroides es llamado bocio. El bocio simple representa un intento de compensar la baja producción de hormonas tiroideils; por tanto, en todos estos estados, la elevación de TSH es el denominador comun. Las causas incluyen deficiencia de yoduro; exceso del mismo cuando falla un mecanismo autorregulador y varios defectos metabolicos hereditarios poco frecuentes que muesman la importancia de los diversos pasos de la biosíntesis de la hormona tiroidea. Estos efectos incluyen: 1) defecto en el transporte de 1-; 2) defecto de la yodacidn; 3 ) defecto en el acoplamiento; 4) deficiencia de des yodinasa, y 5) producción de proteínas yodadas anormales. Las deficiencias parciales de estas funciones pueden producir bocio simple en los adultos. Cualquiera de ellas, cuando es grave, puede causar hipotiroidismo. El bocio simple se trata con hormona tiroidea exogena; mientras que el complemento o la restricción de la ingestión de yoduro son apropiados para tipos especificos del trastorno.
Cantidades insuficientes de Tj O Tq,
libres causan hipotiroidismo Por lo general, se debe a una falla del tiroides, pero puede ser causado por enfermedad de la hipofisis o del hipothlamo. En el hipotiroidismo, el índice del metabolismo basa1 es bajo, así como los demás procesos dependientes de las hormonas tiroideas. Características importantes son: frecuencia cardiaca lenta, hiperten-
sión diastblica, comportamiento abúlico, somnolencia, estreñimiento, sensibilidad al frío, piel y cabello secos y aspecto cetrino. Los demás rasgas dependen de la edad en que se inicia. Ya se mencionti el cretinismo. El hipotiroidisrno al fin de la nifiez se rnanifiesta con baja estatura pero sin retraso mental. Las diversas clases de hipotiroidismo son tratadas con restitución de la hormona tiroidea exógena.
El hipertisoidismo o tirotoxicosis se debe a la producción excesiva de hormona tiroidea Las causas pueden ser muchas, aunque casi todos los casos en EUA, se deben a la enfermedad de Graves, ocasionada por la producci6ri de IgC estimulante del tiroides (TSI) el cual activa al receptor de la TSH. La consecuencia es un crecimiento difuso del tiroides y la produccibn incontrolable de T3 y T.,, ya que la producción de TSI no esta bajo control por retroaccion. Los datos son multisistémicos e incluyen frecuencia cardiaca rápida, amplia presi6n de pulso, nerviosismo, insomnio, pkrdida de peso a pesar del apetito voraz, debilidad, diaforesis excesiva, sens ibilidad al calor y piel húmeda y enrojecida. El hipertiroidismo de la enfermedad de Graves se traía mediante el bloqueo de la producción de hormona con un antitiroideo, por ablación de la glandula con un isótopo radiactivo de yoduro (como 1'") o por una combinación de estos dos métodos. En ocasiones, la glándula se extirpa quinir,'~icamente.
RESUMEN Las hormonas tiroideas triyodotironina (T;) y tetrayodotironina (Ts)requieren el poco común elemento yodo (en forma de yoduro) para su actividad biológica. Una extensa serie de reacciones fisioliigicas y bioquimicas participan para asegurar la disposibilidad de cantidades suficientes del yoduro necesario en la biosintesis de Tj y T4. Este proceso, que utiliza tiroglobulina, una de las protefnas de mayor tamaño conocidas, incluye: 1) el transporte activo de yoduro al interior de la célula tiroidea; 2) la oxidacion del yoduro a un estado de valencia superior por medio de la acción de una peroxidasa; 3 ) la yodaci6n de la tirosina, q u i d por la misma enzima, y 4) el acoplamiento de dos residuos tirosilo yodados para formar las yodotironinas. Los ultimos pasos tienen lugar en la tiroglobulina, que debe experimentar protedlisis hasta sus componentes aminoácidos dentro de la célula, para liherar Ti y T4.La TSH estimula todas estas reacciones.
Hormonas riroideas 629
Las homonas tiroideas causan sus numerosos efectos por medio de la fijacibn a receptores de la superfamilia esteroide y tiroide intracelular especificos. El complejo ligando-receptorse fijan a elementos de respuesta a hormona tiroidea en los genes blanco
para regular la velocidad de sintesis de mRNA
específicos. Esto conduce a un cambio en la cantidad y en la actividad de la proteína codificada por ese mRNA, lo cual a su vez altera la velocidad de un proceso rnetab0lico.H
REFERENCIAS Chopra IJ et al.: Pathways of metabolism of thyroid hormones. Recent Prog Horm Res 1978;34.53 1. Larsen PR: Thyroid-pituitary interaction: Feedback regulation of thyrotropin secretion by thyroid hormones.N Engl J Med 1982.396:23.
Oppenheirner JH: Thyroid hormone action at the nuclear level. Ann lntern Med !985;102:374. Samuels H: Regulation of gene expression by thyroid hormone. J C11nInvest 1988;X1:957.
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-
Hormonas que regulan e! metabolismo del calcio Daryl K. Granner, MD
El ion calcio regula un número determinado de,procesos fisiolbgicos y bioquimicos importantes. Estos incluyen la excitabilidad neuromuscular, la coagulación sanguinea, los procesos secretorios, la integridad de las membranas y el transporte en la membrana plasmatica; las reacciones enzimáticas, la liberación de hormonas y neurotransmisores y la acción intracelular de algunas hormonas. Además, la rnineralización bsea requiere concentraciones apropiadas de Ca2' y PO:- en el líquido extracelular y perihstico. Para asegurar que estos procesos operen de modo nomal, la concentraci6n plasmática de Caz' se mantiene dentro de limites muy estrechos. El propósito de este capítulo es explicar la forma en que se consigue.
Las desviaciones del calcio ionizado de sus límites normales causa numerosos trastornos que pueden poner en peligro la vida. Hasta 3% de los pacientes que requieren hospitalizacidn pueden tener trastornos de la homeostasia del calcio.
EL CALCIO SE ENCUENTRA EN EL HUESO Y EN EL L~QUIDOEXTRACELULAR Hay aproximadamente 1 kg de calcio en el cuerpo humano. De esta cantidad, 99% se encuentra en el hueso donde, con el fosfato, forma los cristales d e hidroxiapatita que proporcionan el componente
inorglinico y estructural del esqueleto. El hueso es un tejido dinarnico que experimenta remodelacibn constante conforme cambian las tensiones; en condición estable hay un equilibrio entre la formacihn de hueso y su resorcibn. La mayor parte del calcio del hueso no se intercambia de modo libre con el calcio del Ifquido extraceluiar. Por tanto, adernh de su función mecanica, el hueso sirve como un gran reservorio de calcio. Aproximadamente 1% del Ca2' del esqueleto está en reserva de intercambio libre y éste, con otro 1% del total encontrado en el espacio peri6sIic0, constituye la reserva miscible de CG'. Las hormonas que se describen en este capitulo regulan la cantidad de calcio en el liquido extracelular al influir en su transporte a través de la membrana que separa al espacio del LEC del liquido peribstico. Este transporte es estimulado primordialmente por la hormona paratiroidea (PTH} aunque, también interviene el calcitriol. El calcio plasmatico existe en tres formas: 1) en cornple-¡o con ácidos orgánicos; 2) unido a proteínas, y 3) ionizado. Aproximadamente 6% del calcio plas-
SIGLAS UTILIZADAS EN E S f E CAP~TULO C BP
Proteina fijadora d e calcio
CT
Calcitonina
LEC
Líquido extracelular
250H-D3
Vitamina D3
1,25(OH)zD3
Calcitriol
PTH
Hormona paratiroidea
(Capitulo 4 7)
rnático totat forma complejos con citrato. fosfato y otros aniones. El resto está dividido en partes casi iguales entre la forma unida a proteinas (principalmente a albúmina) y la forma ionirada (sin unir). El calcio ionizado, que se mantiene a una concentracibn entre 1.1 y 1.3mmollL en casi todos los rnamiferos, aves y peces de agua dulce, es la fraccidn biol6gicamente activa. El cuerpo tiene muy escasa tolerancia para desviaciones significativas de estos limites normales. Si la concentraci6n de calcio ionizado desciende, el animal se vuelve hiperexcitable y puede presentar convulsiones tetánicas. Por otro lado, la etevación notable en el calcio plasmhtico puede conducir a la muerte por p d l i s i s muscular y coma. En el plasma, el ion calcio y su contraparte, el ion fosfato, se encuentran a una concentracion igual a su producto de solubilidad o cerca de el; por tanto, la fijaci6n a proteínas puede protegerlo contra la precipitación y la calclficacibn ectbpica. Una alteracidn de la concentración proteinica del plasma (principalmente albumina, aunque las globulinas tambitn fijan calcio) provoca cambios paralelos en el calcio plasmktic0 total. Por ejemplo, la hipoalbuminemia disminuye este valor de 0.8 mg/dL aproximadamente por cada g!dL que disminuya la albúmina. Cuando la albhmina piasmatica aumenta, se observa 10 contrario. La unión del calcio con las proteínas plasrnáticas depende del pH; la acidosis favorece la forma ionizada, en tanto que la alcalosis incrementa la fijación y causa una reducción concomitante del Caz+.Es probable que esto último sea la causa de[ entumecimiento y hormigueo relacionados con el slndrome de htperventilacihn, que produce una alcalosis respiratoria aguda.
DOS HORMONAS IMPORTANTES INTERVIENEN EN LA HOMEOSTASIA DEL CALCIO
La hormona paratiroidea (PTH) es un peptido de 84 aminoácidos Esta hormona (masa molecular de 9.5 kDa) que no contiene carbohidrato ni otras moltculas unidas de manera covalente (figura 47-1). Su actividad biolbgica completa reside en el tercio arnino-terminal de la molécula; la PTH1.34tiene actividad biolbgica total. La región 25 a 34 es Ia causante fundamenta! de su fijaci6n al receptor. La PTH se sintetiza como una molécula precursora de 115 aminoácidos (figura 47-1). Su precursor inmediata es la proPTH, que difiere de la hormona original en que tiene una extencion hexapeptldica amino-terminal altamente básica, cuya función no se conoce. El producto genico primario y el precursor
inmediato para la proPTH es la preproPTH. Se distingue de la proPTH en que tiene 25 aminoácidos adicionales como extensión amino-terminal que, en cornUn con las otras secuencias guía o seRa!, típicas de las proteínas secretadas, es hidrófoba. La estructura completa de preproPTH y de las secuencias de proPTH así como de PTH se muestran en la figura 47-1. La secuencia de procesos de la conversión de la preprohonnona PTH a hormona activa aparecen en el esquema de la figura 47-2. La preproPTH es transferida al espacio cisterna1 del rettculo endoplhmico, en tanto que la molécula aún esth siendo traducida por los ribosomas a partir del m R N A de la PTH. Durante su transferencia, el prepéptido de 25 aminoácidos (pkptidos guía o sefial} es eliminado para producir proPTH, la cual es entonces transportada al aparato del Golgi, donde una enzima separa la extensibn prohormona para formar la molécula de FTH madura. La PTH, liberada desde el aparato de Golgi en vesículas secretoras, tiene tres destinos posibles: 1) transporte a un depbsito de almacenaje; 2) degradacidn, o 3) secreción inmediata.
La síntesis, la secreción y el metabolismo de PTH requieren ser regulados
A. Regulación de la síntesis La velocidad de síntesis y degradacibn de la proPTH no es afectada por la concentración ambiental de Caz', aun cuando el índice de formación y secreción de la PTH siempre estB aumentando notablemente a bajas concentraciones de Ca"'. De hecho, de 80 a 90% de la proPTH sintetizada no puede dar cuenta de la PTI-I intacta en las células o en el medio de incubacibn de los sistemas experimentales. Esto condujo a la conclusibn de que la mayor parte de la proPTH sintetizada es degradada con rapidez. MQstarde se descubrib que esta velocidad de degradacibn decrece cuando las concentraciones de Ca2+son bajas y aumenta cuando son altas. Esto indica que el calcio afecta la producción de PTH por medio del control de [a degradacidny no de la síntesis, La sintesis constitutiva de la proPTH se refleja en las concentraciones del mRNA para PTH, que tampoco cambian a pesar de: las amplias fluctuaciones del Caz' extracelular. Al parecer, el único camino por el cual se puede intensificar la sintesis de PTH es mediante incremento en el tamaiio y numero de las c&lulasprincipales productoras de PTH en las gthndulas paratiroides.
B. Regulación del metabolismo La degradación de la I'TH, que comienza aproximadamente 20 minutos después de haberse sintetizado la proPTi4, no es afectada inicialmente por Ea concentración del Caz- y se produce despuds de que la hor-
Hormonas que regulan el metabolismo del calcio 633
-U
Secuencia líder (pre)
I
Secuencia de la actkidad bioUgica completa
Secuencia del fragmento C
.(S)
Figura 47-1. Estructura da la hormona preproparatiroidea bovina. Las flechas indican los sitios de particibn por enzirnas procesadoras en las glándulas paratiroidea (1 a 5) y en el hígado despues de la secrecibn de la hormona (4 a 5). La región de la mol&cula con actividad biológica está flanqueada por secuencias no requendas para la actividad cobre los receptores en el brgano blanco. (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacdn de Habener JF: Recent advances in parathyroid hormone recearch Clin Biochem 1981,14:223.)
mona se encuentre en las vesiculas secretoras. La PTH recien formada puede ser secretada de inmediato o colocada en vesiculas de almacenamiento para secreci6n subsiguiente. La degradacion se presenta tan pronto como la vesícula entra a1 compartimiento de almacenaje. Durante su digestion proteolitica se forman fragmentos muy especificas de PTH (figuras 47-1 y 47-2) y en la circulacibn se encuentran cantidades abundantes de sus fragmentos carboxilo terminales. Estas moltculas con masas moleculares de 7 kDaaproximadamente, son PTH,.i, y cantidades menores de P T H U ~La ~ .mayor parte de la PTH recién sintetizada se degrada. Por cada mol de PTH intacta se secretan 2 moles de fragmentos carboxilo terminales; de ahi que la mayor parte de la PTH circulante consiste de moltculas carboxilo terminales. No se ha definido función biolbgica alguna para el fragmento carboxilo
terminal de la PTH, pero puede prolongar la vida media de la hormona en la circulacibn. En el tejido paratiroide se han identificado muchas entimas proteolíticas, incluyendo las catepsinas B y D. La catepsina B separa a la PTH en dos fragmentos: PTH1.36 y PTH37.B4.Esta última no se degrada más; sin embargo, P T H I . es ~ ~fragmentada con rapidez y de manera progresiva en di y tripdptidos. La proPTH nunca se ha encontrado en la circulaci6n y s61o una pequefia cantidad (si es que alguna) de PTH1.34escapa de la glindula. La preproPTH fue identificada al descifrar la secuencia codificadora del gen para la PTH. La mayor parte de la proteblisis de la P W se produce dentro de la glandula; sin embargo, hay estudios que confirman que una vez secretada la PTH se degrada proteolíticamente en otros tejidos. No se ha definido Sa coniribuci6n exacta de la proteblisis extraglandular, ni esta claro si las enzimas proteolíticas
I
Pre
[Pro,
PTH
1
h\\\
84 I
I
Retículo endoplásmico rugoso paratiroideo
Síntesis
constitutiva
Aparato de Golgi paratiroideo
Granulos parati roideos (&lulas de Kupífer en el higado)
~ r n ~ a ~ u e t a i miento
'Formas circulantes
Figura 47-2. Productos precursores y del desdoblamiento de PTH y ubicacibn de estos pasos en la glándula paratiroidea y el higado. Los números entre paréntesis indican la cantidad de aminoacidos en los fragmentos pre (31) y pro (6)
en los dos sitios snn semejantes o si los patrones y lo? producto5 de la fragmcntaci
Regulación de la secrecibn secrccihn de la PTH e s t j en relación i n v e r ~ acon la concentración ambiental de calcio y magnesio ioni7ados. asi como la cifra circulante de PTH inmunomeactiva, La PTH sérica declina en una proporcion lineal en relacihn con las concentraciones del calcio sérico entre 4 y 10.5 mgldL. La deteccion se efectúa mediante un receptor de Ca" concomitante con una
proteina G especial, en las cklrila~paratiroides 1.a act ivacihn dc la protcina G estimula la fo~foIipasaCal, y esto produce la gcneracihn dc lPj. Lo ciial, a sil vez. eleva el Caz' intracelular y condiice al aumento de la secreción cAMP y, en seguida. de PTH Ivéa~e despiies). La presencia de PTH hioliigicarnente activa ciirindo la concentracihn del calcio ~ é r i c oes dc 10.5 mg1dL o mayor es una indicacirin de hiperparatiroidismo. Hay una selaci~nlineal entre la liberación de PTIJ y la concentraciiin intracelular paratiroide de cAMP. La concentración inmceliilar del Ca" puede intervenir en este procesa, dado que hay una rcPaci6n inversa entre las concentraciones intracelulares del calcio y del cAMP. El calcio puede ejercer este efecto a travts de su acción conocida sobrc la fosfodicstcrasa (via la proteína cinasa dependiente de Caz -calrnodulina) o de un mecanismo semejante por inhibición de la adenilil ciclasa. El fosfato n o tiene efecto sohm la sccrecibn de la PTH. Las glándulas paratiroides tienen relativamente pocos gránulos de almacenamiento y contienen suficiente hormona para conservar una secrecibn rnhxima por sOlo 1 .S horas. Esto hace contraste con los islotei pancreAticoc, que contienen reserva5 suficiente? de insulina para varios dias. y con el tiroides que contiene reservas de hormona adecuadas para varias semanas. Por tanto. la PTH debe ser sintetizada y sccretada en forma constante.
Hormonus que remlan el rnetaholi.~model calcio 635
La PTH actúa a través de un receptor de membrana La PTH se une a una sola proteína receptora en la membrana, con una masa molecular aproximada de 70 kDa. Este receptor parece ser idéntico al localizado en el hueso y el riflbn y no se encuentra en las cdlulac que no son blanco. La interaccibn entre la hormona y el receptor inicia una cascada tipica: activación de la adenilil ciclasa --+ incremento del cAMP intracelular + aumento del calcio intracelular + fosforiIaci6n de proteínas intracelulares especificas por cinasas + activacidn de genes específicos y de enzima5 intracelulares que finalmente median las acciones biológica de la hormona. El sistema de respuesta de la PTH, al igual que el de muchas otras hormonas peptídicas o proteinicac está sujeto a la regulacibn en baja del niimero de receptores y a la "insensibilización", en las que puede intervenir un mecanismo pos-cAMP.
La PTH afecta la homeostacia del calcio La importante funci6n de la PTH en el metabolismo del calcio se corrobora por la observaciiin de que la primera aparicibn evolutiva de esta hormona fue en animales que intentaban adaptarse a un ambiente terrestre. La conservación fisiológica del balance del calcio depende de efectos a largo plazo de la PTH que achia sobre la absorción intestinal a travks de la formación de calcitriol. Cuando, con una deficiencia dietética prolongada de Cal', la absorción intestinal det catibn es inadecuada, comienza a funcionar un sistema regulador complejo que incluye a la PTH. La PTH restablece la concentración normal de calcio en el liquido extracelular por acción directa sobre hueso y riiión y por efecto indirecto sobre la mucosa intestinal (a través de la estimulación de la sintesic de calcitriol). La PTH: 1) incrementa la velocidad de disolucibn de hueso, incluyendo las fases orghnica e inorghnica,que mueve el calcio al LEC; 2) reduce la depuracibn o la excreción renal de calcio, incrementado por ende la concentracidn plasm&ticade este catibn, y 3) aumenta la eficiencia de la absorción del calcio del intestino mediante el estímulo de la formación de calcitriol. Los cambios mAs rfipidos se producen atravks de su acción sobre el rifidn, pero el efecto mayor proviene del hueso. Así, aunque la PTH previene: la hipocalcemia en casos de deficiencia dietktica del catión, lo hace a expensas de la sustancia del hueso.
La PTH afecta la homeostasia del fosfato El ion opuesto habitual para calcio es el fosfato y los cristales de hidroxiapatita del hueso consisten en fos-
fato de calcio. Siempre que la PTH estimula la liberación de calcio del hueso por disolucion de la matriz mineral, también libera fosfato. La PTH incrementa la depuración renal de este anión; por tanto, el efecto total de la PTH sobre hueco y riR6n es el aumento de la concentraci6n plasrnhtica de calcio y la disminución de la conctntracián plasmitica de fosfato, Como efecto importante, esto impide el desarrollo de una supersaturaci6n plasmática de calcio y fosfato.
Fisiopatelogía Las cantidades insuficientes de PTH causan el hipoparatiroidismo. Los rasgos bioquimicos de esta condición son disminucibn del calcio ionizado en el suero y aumento en la concentracibn de fosfato. Los sintomas incluyen irritabilidad neuromuscular que, cuando es leve, causa calambres musculares y tetania. La hipocalcemia aguda intensa produce parálisis tethnica de los músculos respiratorios, laringospasmo, convulsiones graves y muerte.Por su parte, la hipocalcernia prolongada ocasiona cambios cutheos, cataratas y calcificacion de los ganglios basales del encéfalo. La causa usual del hipoparatiroidismo es la extirpaci~no el daflo accidental de las glándulas durante cirugia de cuello (hipoparatiroidismo secundario), pero en ocasiones el trastorno e5 consecuencia de la destruccidn autoinmunitaria de las glándulas (hipoparatiroidisrno primario). ~n et seudohipoparatiroidismo, un trastorno hereditario, se produce PTH que es bioIogicamente activa, pero el Órgano final muestra resistencia a sus efectos. Sin embargo, las consecuencias bioquimicas son las mismas. Por Eo general, en este trastorno hay anomalías en el desarrollo como ba,ja estatura, huesos metacarpianos o metatarsianos pequefios y retraso mental. El seudohipoparatiroidismo se manifiesta en varios tipos que se han atribuido a: 1) una deficiencia parcial de la proteína reguladora G, de la adenilil ciclasa y 2) un paso defectuoso posterior a la formación de cAMP. El hiperparatiroidism o, la producción excesiva de PTH, por lo general, se debe a la presencia de un adenoma paratiroide funcional, aunque su causa tambidn puede ser una hiperplasia de las paratiroides o la produccihn ecthpica de PTH o de péptido relacionado con PTH (PTHKP, del inglés PTH-relared peptide). Este último es una proteína de 141 am ínoAcidos con estructura y funcibn similares a las de PTH, en especial en su terminal amino. Al PTHRP se le encuentra en varios carcinoma v se le relaciona con la hipercalcernia de la malignidad. Las características bioquimicas del hiperparatiroidismo son concentraciones séricas elevadas de calcio ionizado y PTH y bajas de fosfato. En el hiperparatiroidismo crónico, los datos incluyen resorción extensa del hueso y di-
636 Bioquím ica de Harper
versos efectos renales. incluvendo calculos. nefrocalcinosis, infecciones fkcuenies de las vias irinarias y (en los casos graves) deficiencia de la función renal. El hiperparatiroidismo secundario, caracterizado por hiperplasia de las glándulas e hipersecrecion de PTH, puede observarse en pacientes con insuficiencia renal progresiva. Es probable que el hiperparatiroidismo de estos pacientes se deba a conversión deficiente del 250H-D; a 1,25(OH)?-D3en el parknquima renal enfermo, que conduce a absorcion ineficaz de calcio en el intestino y a la liberación secundaria de PTI-I en un intento compensatorio por mantener las concentracimes normales de caIcio en el liquido extracelular.
EL CALCITRIOL AFECTA ALGUNOS ASPECTOS DE LA HOMEOSTASIA DEL CALCIO
tracelular a pesar de las notables fluctuaciones del contenido del catión en los alimentos. Esto asegura una concentración apropiada de calcio y fosfato para ser depositados, como cristales de hidroxiapatita sobre las fibrillas de colagena en el huesa. En la deficiencia de vitarnina D (deficiencia de calcitriol), la formación de hueso nuevo es lenta y también está alterada su remodelacíon. Estos procesos tienen a la homona PTH como regulador primario que actúa sobre las dlulas óseas, pero también se requieren cantidades pequefias de calcitriol. Además, este puede aumentar las acciones de la PTH sobre la resorción renal del calcio.
La síntesis y el metabolismo del calcitriol implican diversos tejidos y son procesos muy regulados
A. Biosíntesis Perspectiva histórica El raauitismo. enfermedad de la nifíez caracterizada por mminerali7aci6ndeficiente del esqueleto y graves deformidades bsea incapacitantes, fue endemica en Nortemerica y Europa Occidental aprincipios de este siglo. Los resultados de una serie de estudios sugirieron que se debía a una deficiencia alimentaria.DespuCs del descubrimiento de que el raquitismo puede prevenirse con la ingestión de aceite de higado de bacalao y que el ingrediente activo en este agente no era la vitamina A, el factor preventivo fue denominado vitamina D liposoluble. Casi al mismo tiempo se descubrib que la luz ultravioleta, ya fuera artificial o solar, también evitaba el trastorno. Más tarde se determinó que existía un equivalente del raquitismo en los adultos: la osteomalacia, en la cual una insuficiencia para la rnineralización bsea tambitn respondía a la vitamina D. De la observacibn de que pacientes con trastornos hep6ticos o renales no respondían de modo normal a la vitamina D, se obtuvieron pistas para desarrollos ulteriores. En los últimos años se han hecho numerosos esfuerzos para dilucidar la estructura de la vitamina D y para defmir su mecanismo de acción.
El calcitriol estimula la absorcion intestinal de calcio y fosfato El calcitriol es la única hormona que puede promover esta traslocacibn del calcio contra el gradiente de concentración que existe a travks de la membrana celular intestinal. Puesto que la producción de calcitriol está estrechamente regulada (figura 47-3), existe un mecanismo fmo para controlar el Caz+del líquido ex-
El calcitriol es una hormona en todos los aspectos. Es producida por una serie compleja de reacciones enzimáticas que abarca el transporte plasmático de las mot&culasprecursoras hasta cierto número de tejidos diferentes (figura 47-3). La mol&culaactiva, el calcitriol, es transportada a otros brganos donde activa los procesos biolhgicos de manera semejante a la empleada pos las hormonas esteroides. 1) Piel: En los alimentos hay cantidades pequefias de vitamina D (aceite de higado de pescado y yema de huevo), pero la mayor parte de esta vitamina, disponible para la síntesis del calcitriol, se produce en Ea capa de Malpighi de la epidermis a partir del 7-deshidrocolesterol en una reacción fotolítica no enzimhtica, mediada por la luz ultravioleta. El grado de esta conversión se relaciona de manera directa con la intensidad de la exposición e inversamente con el grado de pigmentacibn de la piel. Con el avance de la edad hay una pdrdida de 7-deshidrocolesterol en la epidermis que puede tener relación con el balance negativo de calcio en la vejez. 2) Hígado: Una proteina transportadora especifica denominada proteina fijadora devitamina D seune a la vitamina D3 y a sus metabolitos y los transporta desde la piel o el intestina hasta el hígado donde experimentan la 25-hidroxilacion, la primera reaccion obligatoria en la produccibn de calcitriol. La 25-hidmxilacidn se realiza en el retículo endoplhsmico en una reacci~nque requiere magnesia, NADPH, oxigeno molecular y un factor ~itoplásmicono caracterizado aún. Intervienen dos enzimas, una citocromo P450 reductasa dependiente del
Hormonas que regulan el mefabdismo del calcio
7-Deshidrocolesteml
f
7-Deshidmcolesterol
637
Vitamina D3
Previtarnina 03
* (250H-03)
t ,25(OH)z-Da(~alcitrroll
Vitamina Da
Figura 47-3. Formación e hidroxilación de la vitamina 0 3 . La 25-hidroxtlación tiene lugar en el higado y las dem8s hidroxtlaciones se producen en los nñones Es probable que tarnbibn se formen 25,26(0H)2-03 y 1,25-26(0H)3-03 Se muestran las fbmulac del 7-deshidrocolesterol, la vitamina 0 3 y el 1,25(OH)2-03 (talatr~ol).(Modificada y reproducida con autorizacibn de Ganong WF: Review of Medrcat Physiology 17 th ed. Appleton and Lange, 1995, publicado por la Editorial El Manual Moderno. México.)
NADPH y un citocromo P450.Esta reaccih no es regulada y tambien se produce con baja eficiencia en el rEfí6n y el intestino. La 250M-D3entra a la circulacion, donde es la forma principal de vitamina D que se identifica en el plasma y es transportada a los riiiones por la proteina fijadora de vitamina D. 3) Rifión: La 250H-D3es un agonista débil y debe ser modificado por hidroxilación en la posicidn del CI para su actividad biológica completa. Esto ocurre en las mitocondrias del ttibulo contorneado proximal del riAón en una reacción compleja con la monooxigenasa de mes componentes, que requiere NADPH, M ~ ~oxígeno ', molecular y por lo menos tres enzirnas; 1) una flavoproteina, la ferredoxina reductasa renal; 2) una proteina con hierro y azufre, la ferredoxina renal, y 3) el citocromo P45O. Este sistema produce al 1,25(OH)1-a, que es el metabolito natural miis potente de la vitamina D.
4) Otros tejidos: Laplacentatiene una 1alfa-hidroxi-
lasa que al parecer es una fuente extrarrenal importante de calcitriol. En varios otros tejidas hay actividad enimática, incluyendo el huesa; sin embargo, su significado fisiolbgico parece ser mínimo, puesto que en los animales nefrectomizados no prefiados se encuentra muy poco calcitriol.
B. Regulación del metabolismo
y la síntesis Al igual que otras hormonas esteroides, el calcitriol esth sujeto a regulacibn estrecha por retroalimentacion (figura 47-3 y cuadro 47-1). Las dietas escasas en calcio y la hipocalcemia en los animales intactos, inducen un incremento notable de la actividad de la l alfa-hidmxilasa. Este efecto requiere PTH, que tarnbien es liberada en respuesta a la hipocalcemia. La acci6n de la PTH es todavia inexplicable, pero estimula la actividad de la 1alfa-hidroxilasa tanto en los
Cuadro 47-1. Rqylacibn de.la .1alfa-hidmxilaw renal --
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Reguledlires prima .
Flipocalccnnia (T) rj
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Prtiactina
1 Hormona tiroidea --m
--
animales deficientes en vitamina D como en los tratados con ella. Las dietas escasas en fosforo y la hipofosfatemia tambidn inducen la actividad de la lalfahidroxilasa, pero al parecer este es un estimulo más débil que el proporcionado por Ea hipocalcernia. El calcitriol es un regulador importante de su propia produccibn. Las concentraciones altas de calcitriol inhiben a la falfa-hidroxilasa renal y estimulan la fomacibn de una 24-hidroxilasa que conduce a la formacibn de 24,25(0H)2-D:, un subproductoaparentemente inactivo. Los estriigenos, progestinas y andrbgenos causan un aumento de la 1alfa-hidroxilasa en las aves en ovulación. La función que estas hormonas desempeiian en los mamíferos, con la insulina, la hormona del crecimento y la prolactina, es incierta. La moltcula esterol basica puede ser modificada por vías metabólicas alternas, es decir, mediante la hidroxilación en las posiciones 1,23,24,25 y 26 y por la formación de cierto número de lactonas. Se han identificado más de 20 metabolitos; de ninguno de los cuales se ha demostrado una inequivoca actividad biológica.
El calcitriol actúa a nivel celular de una manera análoga a las hormonas esteroides Los estudios que empleaban calcitriol radiactivo revelaron su localizaci6n en los núcleos de las células de las vellosidades intestinales y las células cripticas, osteoblastos y células de los tiibulos distales del riííbn. Tambien se acumula en los núcleos de ctlulas de las que antes no se sospechaba fueran blanco, incluyendo las de la capa de Malpighi en la piel; las cklulas de los islotes pancrekticos; algunas dlulas cerebrales; algunas de la hipofisis, ovario, testículos, placenta, útero, glhndula mamaria, timo y en precursores mieloides. Asimismo, se ha encontrado calcitriol fijado a las cklulas paratiroideas, lo cual conduce a fa interesante probabilidad de que intervengan en el metabolismo de la PTH.
A. El receptor del calcitriol El receptor del calcitriol es un miembro de la familia de receptores de esteroides (figura 48-7). El dominio de enlace a ligando de este receptor se une al calcitriol con elevada afinidad y baja capacidad. Esta forma de unibn es saturable, especifica y reversible. El receptor tiene un dominio de fijaci6n a DNA que al parecer contiene el "motivo" o factor "dedo de cinc", típico de otros receptores para esteroides. El complejo del receptor de calcitriol se une a un elemento de respuesta de la vitamina D con una secuencia AGGTCANNNAGGTCA(cuadro 44-3).
B. Productos génicos dependientes del calcitriol Dcsde hace varios años se sabe que la respuesta del transporte intestinal al calcitriol requiere de RNA y sintesis de proteinas. La observación de la unión del receptor del calcitriol a la cromatina en el nhcleo sugiere que el calcitriol estimula la transcripción de los genes y Ia formacion de mRNA específicos. Se ha informado sobre un caso de este tipo, la inducción de un mRNA que codifica para una proteina fijadora de calcio (CRP, del inglbs, calcrum-hmdingprotein). Existen varias formas citosblicas que se unen al Caz' con gran afinidad. Un grupo, que comprende varias proteinas de diferente masa rnolecular, antigenicidad y ubicacibn tisular (instestine, piel y hueso), depende del calcitriol. De estas, la CBF intestinal es la más estudiada. En las ratas deficientes en vitamina D n o se detecta cantidad alguna de CBP intestinal y la concentracihn de esta proteína tiene elevada correlación con el grado de localizacibn del: calcitriol en el núcleo.
C. Efectos del calcitriol sobre la mucosa intestinal La transferencia de Caz- o PCh3-a trav&s de la mucosa intestinal requiere: 1) la captacidn a travks del borde en cepillo y de la membrana de las microvellosidades; 2 ) el transporte a travks de la membrana de las células de la mucosa, y 3) el flujo a travCs de la membrana lateral basa1 hacia el liquido extracelular. Es claro que el calcitriol potencia a uno o m& de estos pasos, pero n o se ha establecido el mecanismo preciso. Primero se pens6 que la CBP intervenía de manera activa hasta que se observb que la traslocacibn del Ca2' tiene lugar 1 a 2 horas después de la administracibn de calcitriol, bastante antes del incremento de la CBP en respuesta al calcitriol. Es posible que esta proteina se una a Caz" y proteja a la celula mucosa contra el elevado flujo de Caz' que coincide con el proceso de transporte. Varios investigadores están buscando otras proteínas que pueden intervenir en el transporte de Caz', en tanto que otros sugieren que el proceso, en particular el
Hormonas que regulan el
incremento temprano del flujo de calcio, puede ser mediado por un cambio en la membrana. Tarnbih se ha señalado a los metabolitos de polifosfoinositidos como participantes.
D. Fisiapatologia El raquitismo es un trastorno infantil que se caracteriza por concentraciones plasmhticas bajas de calcio y de frisforo así como por una mineralización ósea deficiente con deformidades del esqueleto. Su causa más comun es la deficiencia de vitamina D. Hay dos tipos de raquitismo dependiente de la vitamina D. El tipo I es un rasgo autosomico recesivo hereditario caracterizado por un defecto en la conversión de 250I-I-Di a ca!citriol, mientras que el tipo 11 es un trastorno recesivo autosómico en donde existe cambio de un solo aminoácido en uno de los "dedos de cinc" del dominio de fijacibn a DNA. El resultado es un receptor no funcional. La deficiencia de vitamina D en el adulto conduce a osteomalacia. La absorcidn de calcio y fósforo esta disminuida y, por tanto, son bajas las concentraciones de estos iones en el liquido extracelular. En consecuencia, la mineralizacibn del osteoide para formar hueso está alterada y este hueso submineralizado es estructuralmente débil. Cuando una proporción sustancial del parénquima renal se pierde o enferma, se reduce la sintesis de calcitriol y disminuye la absorción de calcio. Cuando sobreviene la hipocalcemia, hay un incremento compensatorio de PTH, la cual actúa sobre el hueso en un intento de incrementar el Cal' del liquido extracelular. El extenso recambio oseo, los cambios estructurales y los síntomas reiacionados se conocen como osteodistrofia renal. El tratamiento temprano con vitamina D amortigua este proceso.
LA FUNCIÓN DE LA CALCITONINA EN LA HOMEOSTASIA HUMANA DEL CALCIO NO SE HA DEFINIDO La calcitonina (CT) es un pdptido de 32 aminohcidos secretado por las cdlulas parafoliculares C del tiroides humano (de modo menos comun por las paratiroides o el timo) o por celulas aniilogas localizadas en la g l h dula ultirnobra~quialde otras especies. Estas cdlulas se originan en la cresta neural y tienen semejanzas bioquímicas con células de otras glandulas endocrinas. Para la actividad bioldgica se requiere la moldcula entera de CT, incluyendo el asa amino-terminal de siete residuos formada por un puente C i s - C i c . Hay mucha variación interespecies de la secuencia de aminoácidos de la CT (la humana y la porcina com-
rnt?dabolrsmodel calcio 639
parten 5610 14 de los 32 aminoácidos}, pero a pesar de estas diferencias hay actividad biológica cruzada entre las especies. La CT natural mas potente se ha aislado del salm6n. La CT tiene una historia sin par respecto a las demas hormonas. En el lapso de siete airos (1962 a 1968). fue descubierta, aislada, determinada su secuencia y sinteti~ada;aunque todavía es incierta su funcibn en la fisiología humana.
RESUMEN Numerosos procesos fisiologicos y bioquimicos requieren calcio. En los marniferos, éste reside en su mayor parte en el hueso, pero un porcentaje muy pequeño del total se encuentra en el liquido extracelular. El calcio del LEC se distribuye por partes casi iguales entre la forma unida a proteina y la forma libre o ionizada (Ca2+). Es esta última la que tiene actividad biolbgica. Existe poca tolerancia respecta a la desviación del valor normal del Ca?', que es de 1.1 a 1.3moL"L en la mayorfa de las especies. Este rigido control se mantiene por un sistema multiorgánico (higado, piel, intestino y paratiroides), rnultihomonal (hormona paratiroidea [PTH], calcitriol y ¿calcitonina?). La PTH se sintetiza como una preprohomona de 115 arninohcidos. A continuación se desdobla de manera sucesiva en dos sitios para formar la hormona madura de 84 aminoácidos. Esta hormona es inactivada por partición entre los residuos 3 6 y 37. Este proceso que bcurre en los tejidos paratiroideos y perifkricos, se regula por el Ca2-,conforme se produce la secrecibn de la hormona desde la glhndula estos eventos se inician por un receptor de ca2' recién descubierto en la superficie de la cklula. La PTH se sintetiza de modo constitutivo, es decir, no hay regulación en su velocidad de sintesis. Es una hormona pepaidica que se fija a receptores de superficie en las celulas óseas y renales. Esta interacción conduce a la formaci6n de cAMP, que es el mensajero intracelular de la acción de la PTH. El calcitriol se sintetiza a través de una serie de reacciones que tienen lugar en la piel, el hígado y los rifiones. La más critica, una alfa,-hidroxilación se produce en el riA6n y es regulada por Caz', fosfato y el propio calcitriol. Este compuesto es una hormona de la clase esteroide-tiroide. De este modo, que acnia por medio de un enlace a un receptor intracelular y el complejo ligando-receptor se une a un especifico elemento de respuesta a vitamina $3,para modificar la transcripción génica. Los objetivos primarios de esta acción son los genes que intevienen en el transporte del calcio, dentro y fuera de las celulas epiteliales pilosas del intestino.
640 * Bioguírnica de Harper
Kapitulo 4 7)
REFERENCIAS Brown EM et al.: Calcium-ion-sensing cell-surfacc rcccptors. N Engl J Med 1995;333:234. Rurtis WF et al.: Immunochemical chamcterization of circulatin parathyroid hormone-related protcin in patients with humoral hypercalcemia of canccr. N Engl J Med 1990;332:1 106. Donahue HJ et al.: Differenrial efrects ofparathyroid and its analogues on cytosolic calcium ion and cAMP
levels in cultured rat osteoblast-like cells. J Biol Chem 1988;263: 13522. Ha bener JF et al.: Parathyroid h o m o n c biochcmical aspects of hiosynthesis. secretion, action, and metabolism. Physiol Rev 1983;64:985. Norman AW: The vitamin D endocrine system Physiologtst 1985;28:239.
Mornonas de la coriteza suprarrenal Daryl K. Granner, MD
INTRODUCCIÓN La corteza suprarrenal sintetiza docenas de molkculas esteroides diferentes, pero sólo unas cuantas tienen actividad bioldgica. Éstas se dividen en tres clases de homonas: glucocofiicoides, mineralocorticoides y andrdgenoc. Estas hormonas inician sus acciones combinándose con E e p t o m intracelulaes específicos y el complejo formade se une a regiones especificas del DNA para regular la expresión de los genes. Esto en consecuencia altera las velocidades de síntesis de un número pequefio de proteinas, lo que, a su vez, afecm a diversas procesos metabólicos, por ejemplo, la gluconeogdnesis y el equilibrio del Na' y K'.
LA CORTEZA SUPRARRENAL SINTETIZA TRES CLASES DE HORMONAS La corteza de la glándula suprnrrenal del adulto tiene tres capas o zonas. El hrea subcapsular se denomina zona glomerulosa y esth relacionada con la produc-
Hormona adrenocortic~trbpica
IMPORTANCIA BIOMÉDICA Las hormonas de la corteza suprarrenal, en particular los glucocorticoides, son componentes esenciales para la adaptación al estrés intenso. Los mineralocorticoides se requieren para el equilibrio normal de Na" y K'. En terapéutica se utilizan anhlogos sinteticos de las dos clases de hormonas. En particular, muchos analogos de los glucocorticoides son potentes antiinflamatorios. Las concentraciones plasmaticas excesivas o deficientes de cualquiera de estas tres clases de horinonas, ya sea por enfermedad o por uso terapétitico, causan complicaciones graves, que en ocasiones ponen en peligro la vida. Una serie de deficiencias enzimáticas hereditarias ayudan a determinar las etapas involucradas en Ea esteroidogénesis e ilustran la capacidad de la corteza suprarrenal para alterar las velocidades relativas de produccibn de estas diferentes hormonas.
Homona antidiurética Globulina fjadora de corticoste-
Hormona liberadora de cortic* Deshidroepiandrosterona Desoxicorticosterona Hormona del crecimiento Elemento regulador de glucocor-
30-HidroxiesteroidedeshidrogeFosfoenolpiruvatocarboxicinasa Pro-opiornelanowrtina Hormona paratiroidea Globulína fijadora de tirosina
(Capitulo 48)
cidn de los rnineralo~orticoides.La siguiente es la zona fasciculada, que con !a zona reticular, produce gIucocorticoides y andrógenos. Se han aislado y cristalizado aproximadamente 50 ecteroides del tejido suprarrenal, La mayor parte de éstos son intermedios; sólo un número pequeño se secreta en cantidades significativas y unos cuantos tienen actividad hormonal importante. La corteza suprarrenal sintetiza tres clases generales de hormonas esteroides, que se agrupan de acuerdo a su accion dominante. Hay un traslape de la actividad biotiigica, dado que todos los glucocorticoides naturales tienen actividad de minetalocortícoides y viceversa. Esto puede comprenderse ahora con base en el descubrimiento de que los elementos de respuesta a hormona que median los efectos de estas hormonas (y las progestinac) son comunes a todas a nivel génico (cuadro 44-71, Los glucocorticoidesson esteroides de2 1 carbonos con numerosas acciones, la m& importante es promover la gluconeogénesis. El cortisol es el glucocorticoide predominante en el ser humano y se sintetiza en la zona fasciculada. La corticosterona, formada en las 20nas fasciculada y glomerulosa, es menos abundante en el ser humano pero es el glucocorticoide dominante en los roedores. Los mineralocorticoides son tarnbidn esteroides de 2 1 carbonos. La acci6n principal de estas hormonas es promover la retención de Na' y la excreción de K+ e H', en particular en el riñón. La aldosterona es la hormona rnLs potente en esta clase y se sintetiza de manera exclusiva en ia zona glomerulosa. Las zonas fasciculada y reticular de la corteza suprarrenal producen también cantidades importantes del precursor androgknico deshidroepiandrosterona y del androgeno ddbil androstenediona. Estos esteroides se convierten en androgenos mhs potentes en tejidos extrasupmrrenales y se vuelven fuentes patolhgicas de andtdgenos cuando existe deficiencia de enzirnas esteroidbgenas especificas. Los estrogenos no se sintetizan en cantidades importantes en la suprarrenal normal, pero pueden producirse en ciertos
Núcleo del ciclopentanopemidrofenantreno
chnceres de la glanduIa y los andrbgenos de origen suprarrenal son precursores importantes de estrógeno (convertidos por aromatizacion perifdrica) en mujeres posmenophsicas.
UNA NOMENCLATURA ESPECIAL DESCRIBE LA QU~MICA DE LOS ESTEROIDES Todas las hormonas esteroides tienen la estructura común del ciclopcntanoperhidrofenantrenode 17 cxbonos, cuyos cuatro anillos se nombran de la A a la D (figura 48-1). Los carbonos adicionales pueden agregarse en las posiciones 10 y 13 o como una cadena lateral unida al C17 Las hormona5 esteroides y sus precursores y metabolitos difieren en el número y tipo de grupos sustituidos, en el número y ubicacion de las dobles ligaduras y en la configuración estereoquímica. Se ha ideado una nomenclatura precisa para designar estas f6rmulas químicas. Los &tornos de carbono asimetricos (sombreados en la molécula CTIen la tigura 48-1) permiten el estereoisomerismo. Los grupos metilo angulares ( C I y~C 1s) en las posiciones I O y 13 se proyectan hacia el frente del sistema de anillos y sirven como punto de referencia. Idas sustituciones nucleares en el mismo plano que estos grupos, se designan cis o "beta" y se les representa con líneas continuas en los esquemas. Las sustituciones que se proyectan atras del plano del sistema de anillos se designan trans o "alfa" y se representan con lineas punteadas. Los enlaces dobles son designados por el numero del carbono que las precede (por ejemplo, A3, A4). Las hormonas esteroides se nombran de acuerdo al número de metilos angulares que poseen: uno (estrano, 18 carbonos). dos (androszano, 19 carbonos) o dos grupos angulares mas una cadena lateral de dos carbonos en C13 (pregnano, 2 1 carbonos). Esta informacion (figura 43-21, junto con el glosario del cuadro 48-1, debe permitir la comprensión de los nombres químicos de las hormonas naturales y sinteticas enumeradas en el cuadro 48-2.
Numeracion de los átomos de carbono Los carbonos asim8tricos estan sombreados
Figura 48-1. Características estructurales
de las moléculas esteroides
Hormonas de la correza suprarrenal 643
:adena lateral del colesterol
7'
7% H
7
I
ACTH
C-C-C
II
O
Pregnenolona + isocaproaldehido
Colesterol
Estructuras básicas do las hormonas esteroldes CH,OH 1
$H3
HO
17p-Estradiol
Tectosterona
Cortisol
Grupo estrano (CM)
Grupo androstano (c14
Progesterona
G ~ p pregnano o (C21)
Figura 48-2. Separacibn de la cadena lateral del colesterol y estructuras básicas de las hormonas esteroides.
--
Cuadro 48-1. Nomenclatura de los esteroides --
--
Sufijo
Prefijo
-.
ituraleza r
-
Uibidroxr(por ejemr 90)
/ Liraenmiento de dos grupos cn cE
! mismo plano que -C-.'9-
,
-
Ordenamiento de dcis grupos e i plano opuesto al de I C10
tün DesaxiIso- o epi-
--
t
-
i
i tranc
al rr
Un gmpci cis al met Carencia ae un grupo niaroxiio Isomerismo en un enlace C 4 , C 4 H o C-H. por ejemplo, androstesona (5a)contra isoan--
Dcshidro-
-
átomos de hidr6geno parn forinar una dcible 1s
geno a UI
de das átomos de hicir6:adura - ." -
VARIAS ENZIMAS INTERVIENEN EN LA BIOS~NTESIS DE LAS HORMONAS ESTEROIDES SUPRARRENALES Las hormonas esteroides suvrarrenales se sintetizan a partir del colesterol que se deriva en su mayor parte del plasma, pero una porción pequeila lo es in situ a partir de la acetil-COA via el mevalonato y el escualeno. Gran parte del colesterol en la suprarrenal se estertfica y almacena en gotitas citoplasmicac de Iípidos. Bajo la estimulación de la suprarrenal por la ACTH (o el cAMP), se activa una esterasa y el colesterol libre formado se transporta al interior de la mitocondria donde una enzima de escisión de cadena lateral citocromo P450 (P450,,,) convierte el colesterol a pregnenolona. La separaciiin de la cadena lateral comprende hidroxilaciones en secuencia, primero en Ctz y despues en C 2 ~seguidas , por la escisidn de la cadena lateral (eliminación del fragmento de seis carbonos, isocaproaldehido) para formar un esteroide de 2 1 carbonos (figura 48-2). Una proteína dependiente de ACTH puede unirse y activar al colesterol o a la P450,,,. La arninoglutetimida es un inhibidor muy eficiente de la P450,, y de la biosintesis de esteroides. Todas las hormonas esteroides de marniferos se forman a partir del colesteroI via la pregnenolona a travCs de una serie de reacciones que ocurren ya sea
(Capitulo 48)
644 Bioquimica de Harper
Cuadro 48-2. Nombres trivial y químicos de algunos esteroides . .-.
.- -.
. .. . . .. .. .--
- -.
.-
--
-
-
. -.
. .--
mbre quírnico
Nombre t
regnen18-
--Colesterol I ,ona (compuesto B) -Corticoster -Cortisol (compuesto F' T 1 1 I U I UI'LCJ 15 "
i
ip-oi
compuestc
ona (DHL
Estriol
lona
tan- 17-ona
:otlisol Prednisolo
-
Prednisonr -Pregnaned iol
riona
A " -.-
Testostero Triamcinolona
en las rnitocondrias o en el reticulo endoplásmico de las células de la suprarrenal. Las hidroxilasas, que requieren oxígeno molecular y NADPH son esenciales y en ciertos pasos, tambien son necesarias deshidrogenasas, una isomerasa y una liasa. En la esteroidogenesis hay cierta especificidad celular. Por ejemplo, la 18-hidroxilasa y la 18-hidroxiesteroide deshidrogenasa, necesarias para la síntesis de la atdosterona, sólo se encuentran en las cdlulas glomerulares, de modo que la biosintesis de este rnineralocorticoide esta confinada a esa zona- En ]a figura 48-3 se presenta un esquema de las vias que intervienen en la síntesis de las tres clases principales de esteroides suprase muestran en los rectangulos rrenales. Las y las modificaciones en cada paso esthn sombreadas.
La síntesis de mineralocorticoides ocurre en la zona glomerulosa La síntesis de la aldosterona sigue la via de los mineralocorticoides y se realiza e-, la zona glomenilosa, La
pregnenoiona es convertida a progesterona por la accibn de dos enzimas del reticulo endoplácmico liso, la 3beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3betaOHSD) y la A " ~isomerasa. La progesterona se hidroxila en la posición C21 para formar 1 1-desoxicorticosterona (DOC) que es un rnineralocorticoide activo (retenedor del Na'). La hidroxilacidn siguiente, en Ci,,produce cariicosterona, que tiene actividad de ~lucocorticoidev es un mineralocorticoide: ddbil menos de 5% de la potencia de la a]dosterona), En algunas especies (por ejemplo, roedores}, es el potente. La hidroxilacibn de cli glucocorticojde necesaria para la actividad mineralocorticoide y glucocorticoide, pero la mayor parte de los esteroides glucocorcon un Enipo - . hidroxitoC,7tiene ticoide y menos mineralocorticoide. ~n la zona glomerulosa, donde no hay la enzima del retículo endoplhsmico liso, la 17alfa-hidroxilasa, existe una 18-hidroxilara mitocondrial. La 18-hidro~ila~a actúa sobre la corticosterona para formar 1 8-hidroxicorti-
Giene
,,
Hormonas de la corteza slrprarrenal
645
Aldosterona
Figura 48-3. Vias que intervienen en la síntesis de las tres clases principales de esteroides suprarrenales Las enzimas se muestran en rectángulos y las modtfiwciones en cada paso esthn sombreadas. (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacibn de Harding BW en. Endocrinology vol 2. DeGroot U [editor]. Grune & Ctratton, 1979.)
(Capitulo 48)
646 Bioq~rímicade Harper
costerona, que se modifica n aldosterona por la conversibn del alcohol 1 8 a un aldehido. Esta distribucidn iinica de enzima5 y la regulación especial de la zona glomenilosa (véase adelante) han conducido a algunos investigadores a sugerir que, ademLs de que la glándula suprarrenal son dos glándulas, la corteza s u p r m a l es también de hecho dos 6rganos separados,
to
Colesterol
Vacuolas de almacenamiento
Acidos
A. Sintesis de glucocorticoides La sintesis de cartisol requiere tres hidroxilasas que actuan en secuencia sobre las posiciones Cl7, C ~y IC, 1. Las dos primeras reacciones son rápidas, en tanto que la hidroxilación del CII es relativamente lenta. Si la posicidn Czi se hidroxila primero, impide la acción de la 17alfa-hidroxilasa y se sigue la vía de los mineralocorticoides (con formacion de corticosterona o aldosterona, según el tipo de dlula). La E 7alfa-hidroxilasa es una enzima del reticuto endoplasmico liso que actúa ya sea sobre lapsogesterona o, más comúnmente sobre lapregnenolona. La 17alfa-hidroxiprogesterona se hidroxila en el C?ipara formar 1 1-desoxicortisol, el cual es entonces hidroxilado en el Cii para formar corticol, la hormona glucocorticoide natural mfis potente en los humanos. La 21-hidroxilasa es una enzima del retículo endoplásmico liso, en tanto que la 11beta-hidroxilasa es una rnitocondrial. Por tanto, la esteroidogénesis comprende el movimiento de lanzadera repetido de sustratos dentro y fuera de las mitocondrias de células fasciculadas y reticulares (figura 4 8 4 ) .
B. Síntesis de andrdgenos El andrhgcno principal o precursor producido por la corteza suprarrenal es la deshidroepiandrosterona (DHEA). La mayor parte de la 17-hidroxipregnenolona sigue la vía de los glucocorticoides, pero una fraccibn pequeíia está sujeta a fisión oxidativa y a eliminación de la cadena lateral de dos carbonos a través de la acción de la 17,20-Iiasa. Esta enzima que se encuentra en las suprarrenales y en las gbnadas, actiia exclusivamente sobre las mol&culas que contienen 17alfa-hidroxi. La produccidn suprarrenal de andrógenos aumenta de manera notable si se impide la biasíntecis de glucocorticoides por la carencia de una de las hidroxilasas. La mayor parte de la DHEA se modifica con rapidez por la adici6n de sulfato, proceso que se realiza aproximadamente por partes iguales en la suprarrenal y en el hígado. El sulfato de DHEA es inactivo, pero la eliminación del sulfato reactiva al compuesto. La DHEA es en realidad una prohormona, dado que las acciones de la 3beta-OHSD y la isomerasa convierten al andrbgeno ddbil DHEA en uno mis potente, la androstenediona. De la que tambibn se forman pequefiac cantidades en la suprarrenal por acci6n de la l i s a sobre la 17alfahidroxiprogesterona. La reducción de la andros-
1
Preqnenolona
Figura 4 8 4 . Distribucion subcelular de la biosintesis de glucocorticoides La estereoidagénesis suprarrenal comprende el desplazamiento de precursores entre las mitocondrias y el retícula endoplásrnico.Lasenzimas que intervienen con. 1) C~O-22 I~ssa,2) 3P-h1droxresleroide deshrdíogenasa y isomerasa, 3) 17a-hidroxilasa, 4) 2f -hidroxilasa y 5) 11Phidroxilasa. (Ligeramente rncdificada y reproducida con autonzauónde Harding BW en: EmhmnoEogy Vor 2. DeGroot U [editor] Grune & Stratton, 1979.)
tenediona en la posición CI, produce testosterona, el andrbgeno suprarrenal más potente. Por este mecanismo se forman pequeilas cantidades de testosterona en la suprarrenal, pero la mayor parte de esta conversibn se efectúa en otros tejidos. Cantidades pequeilas de otros esteroídes pueden aislarse de la sangre venosa suprarrenal los cuales incluyen 1 1-desoxicorticosterona, progesterona, pregnenolona, 17alfa-hidroxiprogesteronay una cantidad mínima de estradiol (por aromatización de la testosterona). Sin embargo, ninguna de estas concentraciones es importante en relacibn con las producidas por otras glandulas.
EL TRANSPORTE, EL METABOLISMO Y LA SECRECION DE HORMONAS ESTEROIDES SU PRARRENALES AFECTA SU BlODlSPONlBlLlDAD
Secreción de hormonas esteroides Casi no hay almacenamiento, si lo hay, de hormonas esteroides dentro de la célula suprarrenal (o gonadal), ya que estas hormona son secretadas al plasma en
Hormonas de la corteza suprarrenal
seguida que se forman. La liberacidn de cortisol ocurre con una periodicidad que se regula por el ritmo diurno de la liberación de ACTH. En consecuencia, los valores de cortisol son mayores en la mañana,poco despues del despertar, y los menores son en la tarde y al inicio de la noche.
Transporte plasrnatico
A. GIucocorticoides El cortisol circula en el plasma unido a proteínas y en forma libre. La proteina fijadora principal es una alfa-globulina llamada transcortina o globulina fijadora de corlicosteroldes (CEG). LaCBG se produce en el higado y su sintesis, al igual que de la globulina fijadora de tirosina (TBG) se incrementa por los esmigenos. Cuando las concentraciones de corticol plasmAtico esGn dentro de los limites normales, la hormona esta unida en su mayor parte a la CBG; cantidades mucho menores de cortisol se unen a la albúmina. La avidez de la fiiacihn a w d a a deteminar la vida media biolbgica de ;arios gt;cocorlicoides. El cortisol se une íntimamente a la CRG y tiene una iin de 1.5 a 2 horas, en tanto que la corticosterona, que se une con menos fuerza, tiene una tjn de menos de una hora. La unidn a la CBG no está restringida a los glucocorticoides. La desoxicorticosterona y la progesterona interactúan con la CBG con suficiente afinidad para competir con el coriisol por la fijacibn. La fracción no unida o libre constituye aproximadamente 8% del cortisol plasmático total y representa la fracci6n biolbgicamente activa de la hormona.
B. Mjneralocorticoides Aldosterena, el m6s potente de los mineralocorticoides naturales, nu tiene una proteína transportadora plasrnática especifica, pera forma una uni6n muy débil con la albúmina. La corticosterona y la 1 l-desoxicorticosterona, otros esteroides con efectos de mineralocorticoides, se unen a la CRG. Estas observaciones son importantes en la comprensi6n del mecanismo de accibn de la aldosterona [véase adelante).
647
gensisas que requieren NADPH y a partir de la reducción del grupo cetona 3 por una reaccihn reversible de la deshidrogenasa. Cantidades sustanciales de todos estos compuestos se modifican también, por conjugaciiin en la posici~nC3con glucurbnido o, en menor extensión, con sulfato. Estas modificaciones ocurren fundamentalmente en el hlgado y vuelven a la rnolCcula esferoide lip6fila en hidrosoluble y excretable. En el ser humano, la mayor parte de los ecteroides conjugados que entran al intestino mediante la excrecibn biliar se resorben por la circulación enterohephtica. Aproximadamente 70% de los esteroides conjugados se excretan en la orina, 20% en las heces y el resto a travks de la piel.
B. Mineralocorticoides Idaaldosterona se depura del plasma con suma rapidez por el hígado, indudablemente a causa de la carencia de una proteina portadora plasrnática. El hígado forma tetrahidroaldosterona 3-glucorónido, que se excreta en la orina.
C. Androgenos Éstos se excretan como compuestos 17-ceto incluso la DHEA (como sulfato) asi como la androstenediona y sus metabolitos. La testosterona, secretada en cantidades gequeiías por la cuprarrenñl, no es un compuesto 17-ceto, pero el higado convierte alrededor de 50% de testosterona a androsterona y etiocolanolona, que son compuestos 17-ceto.
LA S~NTESISDE HORMONAS ESTEROIDEAS SUPRARRENALES SE REGULA POR MECANlSMOS DIFERENTES Hormonas glucocorticoides La secrecibn del cortisol depende de la ACTH, que a
su vez se regula por la hormona liberadora de conicotropina (CM). Estas hormonas e s h enlazadas por un circuito clásico de retroacción negativa (cuadro 45-1).
Las velocidades del metabolismo y excreción dependen de la presencia s ausencia de proteínas portadoras A. Glucocorficoides El cortisol y sus metabolitos constituyen aproxirnadamente 80% de los 17-hidroxicorticoides en el plasma, el otro 20% consiste en cortisona y 11-desoxicortisol. Cerca de la mitad del cortisol, asi como cortisona y 11-desoxicortisol, circula en forma de los metabolitos reducidos díhidro y tetrahidro que se forman por reduccihn de la doble ligadura del anillo A por deshidro-
Hormonas mineralocorticoides La producción de aldocterona por las &tulas glomemlam se regula de una manera completamente diferente. Los reguladores primarios son el sistema renina-angiotensina y el potasio. También intervienen el sodio, la ACTH y mecanismos neurales.
A. El sistema renina-angiotensina Este sistema interviene en la regulación de la presibn arteria1 y del metabolismo de los electr6litos. La hormona primaria en estos procesos es la angioten-
sina 11, octapdptido formado a partir del angiotensinúgeno (figura 48-5). El angiotensinógeno, una alfa?globulina sintetizada en el hígado. es el sustrato para la renina, enzima producida en las células yuxtaglomerulares de la artetiola aferente renal. La posición de estas cklulas las vuelve particularmente sensibles a los cambios de la presión arteria1 y muchos de los reguladores fisiologicos de la liberacibn de la renina actúan a travds de los barorreceptores renales (cuadro 48-31. Las cklulas yuxtaglomerulares son tambitn sensibles a los cambios de concentración de Na' y C1- en el liquido de los túbulos renales; por tanto, cualquier combinación de factores que reduzca el volumen del liquido (deshidratacihn, presi6n arterial baja, pkrdida de liquido o de sangre) o que disminuya la concentracibn de NaCI, estimula la liberación de renina. Los nervios simphticos renales que terminan en las celulas yuxtaglomerulares median los efectos del sistema nervioso central y los efectos postulares sobre la liberación de renina de manera independiente de los efectos salinos y de los barorreceptores, mecanismo en el que interviene el receptor beta-adrenérgico. La renina actua sobre el sustrato angiotensinbgeno para producir el decapeptido angiotensina 1. La síntesis de angiotensindgenoen el hígado se potencia por glucocosticoides y estrhgenos. La hipertensibn vinculada a estas hormonas puede deberse en parte al incremento de la concentración del angiotensinbgeno plasmático. Dado que esta proteina circula aproximadamente al valor de Kmpara su interaccidn con la
.-. .-.-.-
ores U, L b ,
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C:ambio de 1a posrcien r;u- Cambio de la po pina a la r:recta a la su[pina 1icplecion dIc saE Carga dc sal *
Agentes padrcnkgicos ProstaeIand inas
Inhibildores d e 1: dinas ' Potasi o
m
i
- -
I
Angiotensina iii
an-
Vasopresina
i Rngiotensina II
-
renina, los cambios pequefíos podrian afectar de manera notable la generación de angiotensina 11. La enzima coavertidora de angiotensina, una glucoproteina encontrada en pulmón, céluras endoteliales y plasma, elimina dos aminohcidos del extremo carboxiterminal del decapéptida angiotensina 1 para formar angiotensina II en un paso que se considera no limitante de la velocidad. Varios nonapkptidos análogos a la angiotensina 1 inhiben a la enzima convertidora y se utilizan para tratar la hipertensihn dependiente d e renina. Estos tambitn se conocen como inhibidores ACE (enzima convertidora de angiotensina). La enzima convertidora tambien degrada a la bradicínina, un vasodilatador potente; por
ENZIMA CONVERTIDORA
AMINOPEPTIDASR
recta
1 Antagonistas P-adrentrgicos
Asp-Arg-Vai-Tir-ile-His-Pro-Fen-His-Leu-I (-400 aminoácidos m8s) 4
Angiotensin6geno
1
Cuadro 48-3. Factores que influyen en Ia Iiberaci6n de renin:
1
Arg-Val-Tir-lle-His-Pm-Fen
ANGIOTENCINASAS
Prcdudos de degradación
Figura 48-5. Forrnacibn y metabolismo de las angiotensinas. Las flechas pequefiaa indican sitios de rotura
Hormonas de la corteza suprarrenal
tanto, esta enzima incrementa la presión arterial por dos vias distintas. La angiotensina 11 incrementa la presión arterial al causar vasoconstricci6n de las arteriolas y es la sustancia vasoactiva m& potente conocida. Inhibe la liberacion de renina de las cdlulas yuxtaglomerulares y es un estimulador potente de la producci6n de aldosterona. Aunque la angiotensina IE estimula directamente a la suprarrenal, no tiene efecto sobre la produccibn de cortisol. En algunas especies, la angiotensina TI se convierte al heptapéptido des-Aspi, angiotensina 111 (figura 48-51, estimulador igualmente potente de la produccibn de aldosterona. En humanos, la concentracibn plasmhtica de angiotensina 1F es cuatro veces mayor que la de angiotensina I l l,así la mayor parte de los efectos los ejerce el octapéptido. Las angiotensinas 11 y 11 I se inactivan con rapidez por las angiotensinasas. La angiotensina 11 se une a receptores específicos de las células glornenilares. La interacción de la hormona con el receptor no activa a la adenilil ciclasa y al parecer el cAMP no media la acción de esta hormona. Las acciones de la angiotensina 11, que consisten en estimular la conversibn del colestero! a pregnenolona y de la corticosterona a 18-hidroxicorticosterona y aldosterona, pueden comprender cambios en la concentracion del calcio intracelular y de los metabolitos de fosfolipidos por mecanismos semejantes a los descritos en el capitulo 44.
B. Potasio La secreción de aldosterona es sensible a los cambios en la concent~acibnplasm&ica de potasio; un incremento tan pequefio como 0.1 mEq/L estimula la producci61-1, en tanto que una reducción similar abate la producción y la secrecida de aldosterona. E! K' afecta a los mismos pasos enzimhticos que la angiotensina 11, aunque no esta claro el mecanismo de su acción. Al igual que la angiotensina 11, el K' no afecta a la biosintesis del cortisol.
C. Otros efectores En circunstancias especiales ACTH y sodio pueden intervenir en la produccibn de aldosterona en el ser
humano. LAS HORMONAS ESTEROIDES SUPRARRENALES TIENEN NUMEROSOS Y VARIADOS EFECTOS METABOLICOS La perdida de la funcibn cortical suprarrenal desemboca en la muerte a menos que se instituya una terapeutica de restituciiin. En el ser humano, el tratamiento de la insuficiencia suprarrenal con mine-
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ralocorticoides, por lo general, no es suficiente; a este parecen ser más crítirespecto, 105 glu~ocorti~oides cos. En cambio, las ratas responden bastante bien a la restitucibn de mineralocorticoides. Las concentraciones plasmáticas excesivas o deficientes de estas dos clases de hormonas, ya sean por enfermedad o uso terapéutico, causan cierto número de complicaciones graves relacionadas directamente con sus acciones tnetabólicas.
Las hormonas glucocorticoides afectan al metabolismo basat, los mecanismos de defensa del huésped, la presión arterial y la respuesta a tensión y esfueno En textos de fisiología es posible encontrar una descripcion detallada de los diversos efectos metabólicos de hormonas glucocorticoides. En el cuadro 4 8 4 se presenta una descripcidn breve d c los efectos.
Cuadro 4 8 4 h d i v e m efeEtos de g l u ~ ~ ~ ~ r t i c o i d e s -Efectos en el rnetab;l%mu intennedir 1. Aumento de la producci6n de gliic ncrcmento en la liberacibn de aminoácidos (susira,,, ,Lu,,.,,,g~nico) de tejidos pcrifcricos, 2) incremento en la velocidad de gluconeogenesis por aumento de In cantidad (y actividad) de varias entimas clave. y 3) "permitiendo" que otras reacciones rnetahhlica~criticas oneren a velocidades rnhaimas I por activac i6n 2:. Aumento del dephsitci hepático d dc glucbgeno sintetas:a n pueden callSar 3 de lipblisis en las extrcn
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UG
650 * Bioquúnrca de Harper
(Capítulo 48)
Las hormonas mineralocorticoides afectan el equilibrio electrolitico y el transporte de iones
especifico. Este paso es necesario para la entrada a1 nucleo y su fijacibn al DNA. Por lo general, hay una correlación elevada entre la combinación de un esteroide con el receptor y la provocación de una respuesta biológica dada. Esta correlacibn se considera verdadera para una amplia gama de actividades, de modo que un esteroide con un décimo de afinidad de fijacion provoca la disminución correspondiente del efecto biológico a una concentracibn dada de esteroide. El efecto biológico de un esteroide depende de su capacidad para fijarse a1 receptor y de la concentración de la hormona libre en el plasma. El cortisol, corticosterona y aldmterona se fijan c m elevada afinidad al receptor de glucocorticoides, pero en circunstancias fisiolbgicas el cortisol es el glucocorticoide dominante debido a su concentracion plasmAtica mucho mayor. La corticosterenaes un glucocorticoide importante en ciertas condiciones patológicas (deficiencias de la 17alfa-hidroxilasa), pero la aldosterona nunca alcanza una concentración plasmatica sufíciente para ejercer efectos de glucocorticoide.
Las hormonas mineralocorticoidec actúan en el rifion para estimular el transporte activo de Na' por los tlibulos contorneados distales y los túbulos colectores, y el resultado neto es la retención de Na'. Ademhs, estas hormonas inducen la secreción de K', H' y NH4' por el riiión y afectan al transporte de iones en otros tejidos epiteliales que incluyen las glandulas sudoriparas, la mucosa intestinal y las glh~~dulac salivales. La aldosterona es 30 a 50 veces más potente que la I 1-desoxicorticosterona (DOC) y 1000 veces mfis potente que el cortisol o la corticosterona. Como el mineralocorticoide natural más potente, la aldosterona realiza casi toda esta acción en los humanos. El cortisol, aunque bastante menos potente, tiene una velocidad de produccibn mucho mayor y por tanto, tiene un efecto significativo en la retencibn de Na' y en la excreción de K'. Dado que la cantidad producida de DOC es muy pequefia, es mucho menos importante a este respecto. Para la acci6n de la aldosterona se requiere la síntesis de RNA y proteínas, 10 cual parece abarcar la formacibn de productos gbnicos específicos (véase adelante).
Ya se conocen los dominios funcionales del receptor para glucocorticoides Cierta número de estudios bioquimicos, inmunolbgicos y genéticos han conducido a la formulacibn del receptor de glucocorticoides ilustrado en la figura 4 8 4 . La mitad aminoterminal contiene la mayor parte de los sitios antigknicos y tiene una region que modula la función del promotor (activacihn trans). La mitad carboxilo terminal contiene los sitios de fijacibn al DNA y a la hormona. E1 dominio de fijacibn al DNA es mis cercano al centro de la molécula, mientras aue el dominio de fijacibn a la hormona está cerca del extremo carboxilo. Los dos dominios se requieren para activación trans de la transcripcibn genética. Al
LAS HORMONAS ESTEROIPEAS SUPRARRENALES ACTÚAN POR MECANISMOS SEMEJANTES L~~ homonas glucocorlicoides inician su acci6n en una celula blanco interactuando con un
DBD
LBD 1
r1
r2
421
486 Llsll
-
II
COOH -.
777
Translocaaon nuclear Dimerizacion
lnteraccibn con hsp90
Figura 4 8 4 . Esquema del receptor humano de glucocorticoides de 777 amino8cidos. El aminoAcido con terminal MH2- se muestra como numero 1, el dominio de enlace del DNA (DBD) se localiza entre los aminoácidos 421 y 486, y el amino8udo de la terminal carboxilo está con el nomero 777. El receptor consta de varios dominios, el limite aproximado de los cuales se muestra en la figura. Todos los miembros de esta familia tienen e n l a e de ligando, transactivacibn (tau 3 y tau 2 en GR) y dominios de enlace de DNA; y muchos tienen dominios de dimerizacibn. El GR se disocia desde hsp 90 cuando enlaza al ligando y en seguida se mueve del citosol al núcleo. Tambibn se muestran las regiones del receptor necesarias para estas funciones.
Hormonas de la corteza suprurrenaI 651
parecer, en la region terminal carboxilo debe haber una secuencia deteminada de aminokidos para dimerización de las dos molécu!as de receptor, reaccion que se considera es necesaria para fijacion a cada una de las dos "mitades" de los sitos de unión en el elemento regulador de glucocorticoides (GRE}(veace las flechas en el cuadro 44-3). Es probable que se requieran dos regiones separadaspara entrada del receptor al nucleo (localizacion nuclear). La secuencia del receptor se ha deducido por análisis de moléculas de cDNA. La secuencia de aminoácidos en la region de fijación al DNA revela dos regiones con abundancia de residuos Cis-Lis-Arg. Mediante la comparacibn de estas regiones con otras de proteínas de fijacibn al DNA conocidas (por ejemplo, TFIIEA), es posible construir la hipótesis de una estructura proteinica con dos de los "dedos" (cada uno con un cinc coordinado en su centro) que se unen a un giro del DNA. Esto ya está confirmado directamente y el motivo del dedo de cinc es una de las modalidades de interaccibn proteinas y DNA que se presentan en el capítulo 4 1.
Superfamilia de receptores de esteroides-hormona tiroidea
Las hormonas esteroides y tiroides regulan diversos procesos que intervienen en desarrollo, diferenciacion, crecimiento, reproducción y adaptación a cambios ambientales. En aiíos recientes se ha vuelto evidente que un mecanismo general podria explicar la forma en que estas hormonas actúan a nivel molecular (capitulo 44). Un componente esencial en este mecanismo es el receptor de hormonas. Estas moléculas no son abundantes, de modo que su análisis estnictural tuvo que aguardar el aislamiento de clonas de cDNA para cada una. Las primeras estructuras que se dedu.jeron fueron las de receptores para glucocorticoides, estrbgeno y progesterona. La homologia en los dominios fijadores a DNA de &tos y la estrecha semejanza de cada uno a v-erh-A, una proteína oncogtnica que se une a DNA, condujo a la hipótesis de que estos receptores podrian pertenecer a una familia de supergenes. Si es así, una hipbtesis corolario era que otros receptores deberán aidarse de bibliotecas de cDNA mediante sondas dirigidas contra la regibn común (dominio DNA) bajo condiciones poco estrictas de hibridización (capitulo 42). Esta hipdtesis demostró ser verdadera. Como se ilustra en la figura 48-7, se dedujeron las estructuras de todos los receptores para esteroides, juntocon las de otros receptores que aún no se identifican. Estos se llaman receptores hutrfanos. La homologia entre los dominios de enlace a DNA de estos receptores es sorprendente y la
organización general de cada uno es la misma. Hay una variacion considerable en la longiíud total de los receptores, que en su mayor parte se debe a la mitad amino-terminal de la molécula. Esta observación ha acelerado de manera notable la comprensión de la manera en que esta clase de hormonas regula la transcripci6n gknica.
Las hormonas glucocorticoides regulan la expresión génica Las propiedades generales de la accibn de las hormonas giucocorticoides se describen en el capitulo 44 e ilustran en la figura 44-1. Numerosos ejemplos respaldan el concepto de que esta clase de hormonas afectan procesos celulares especificos al modificar la cantidad existente de proteínas criticas, por lo general, enzimas dentro de la célula. Los glucocorticoides por lo general ejercen su acción por regulacion de la velocidad de transcripción de genes específicos en la célula blanco. Dero tambihn afectan a otros pasos en el "flujo de infomaci6n'"(figura 44-2). ~ & u l a r la transcripción requiere que el complejo esteroide receptor se una a regiones específicas del DNA en la vecindad del sitio dc inicio de la transcripción y que estas regiones confieran especificidad a la respuesta. La manera en que esta interaccibn en realidad arnpIifica o inhibe la transcripci6n, el modo en que se logra la especificidad tisular y la manera en que un gen dado puede estimularse en un tejido e inhibirse en otro, son unas cuantas de las cuestiones importantes que permanecen sin respuesta. Una descripcibn breve de c6mo las hormonas glucocorticoides afectan la transcripcibn del DNA del vinis del tumor mamario del ratbn, proporciona una ilustracibn adecuada de 10 que se sabe acerca de la actividad de las homonas esteroides. El sistema del virus del tumor marnario resulta útil debido a que el efecto del esteroide es riipide e importante y la biologia molecular del virus se ha estudiado extensamente. El complejo de receptor y hormona glucocorticoide se une con gran selectividad y especificidad a una regibn, el elemento regulador del glucocorticoide (GRE) unos cuantos cientos de pares de bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripcibn. En el GRE existen secuencias que se relacionan de manera estrecha a la secuenciade consumo GGTACAmTGTTCT que se encuentra en los elementos reguladores de genes controlados por glucocorticoides. El elemento regulador del glucocorticoide cargado con el receptor intensifica e! proceso de inicio de la transcripcibn del genoma del virus del tumor marnaria del ratbn y tambidn activa a los promotores heter6logos. Este elemento de acción cis también actúa cuando se
652 Bioquimica de Hurper
(Capítulo 48)
Dornlnios:
Variable
Ligando
DNA 421 496 528
1
Receptor 777
Givcucarticoide
567
1
4 5
633 680
934
90
1 24
192
89
427
42 1
4% 169
162
Progestinas
S5
Vitamina D
456
232
Hormona tiroidea T3Rp
17 .-
4 5
45
15
I
Acido
retinoico
Figura 48-7. Comparacibn esquemAtica de la superfamilia de receptores para esteraides-hormona tiroidea. Las secuenuas de los receptores humanos (v-erb-A es aviario) se alinean por sus dominios de unibn a DNA, que muestran la semelanza mayor en amino~cidos(las cifras dentro de los rectángulos son porcentajes de analogía a la regidn correspondiente del receptor para glucocerticoides). Las cifras arriba de las líneas verticales que separan los dominios muestran las posiciones de los amrnoAcidos. La posición amino terminal se designa corno 1. Muchas otras moléculas semejantes se han aislado pero los ligando y funciones para estos no se han determinado (Modificada y reproducida con autorizaciónde Evans R The steroid and thyrold horrnone receptor superfamily Science 1988;240 889.)
mueve a regiones diferentes corriente arriba y corriente abajo y actiia ya sea en la orientación hacia adelante
o hacia atrhs. A este respecto, el GRE se califica como un amplificador de la transcripcion. Estas caracteristicas se observan tambitn en otros genes regulados por glucocorticoides y se resumen en la figura 48-8. La mayor parte de los genes regulados por glucocorticoides y otros miembros de la familia de hormonas esteroides-tiroidea-retinoides requieren DNA enlazador de proteinas adicional y reconocer elementos del DNA para activar por completo la transcripcion. Estos complejos se denominan como unidades de respuesta hormonal. El control de la velocidad de transcripción génica parece ser la accibn principal de las hormonas glucocorticoides, pero no es el único mecanismo utilizado. La capacidad de medir procesos especificas revela que estas hormonas regulan también la velocidad de degradacidn de mRNA específicas (por ejemplo, la hormona de crecimiento y la fosfoenolpirurato carboxicinasa) y el procesamineto de postraducción
(varias proteinas del virus del tumor mamario}. Podría parecer que kstas y otras clases de hormonas esteroides pueden actuar a cualquier nivel del "flujo de infonnacion" desde DNA hasta proteínas (figura 44-2) y que la importancia relativa de cada una varia de un sistema a otro.
Las características generales de la acción de hormonas rnineralocorticoides (aldosterona) son análogas a las de otras hormonas esteroidec (figuras 44-1 a 4 4 3 y cuadro 4 4 3 ) Aunque no se han aislado productos gdnicos especific o ~se , sabe que la síntesis de proteinas y de RNA es necesaria para la accion de la aldosterona y se supone que proteinas especificas ectin involucradas en la mediación de los efectos de la aldosterona sobre el transporte de iones.
Hormonas de la corteza suprarrenal
653
L.)
GRE
Promofor MTV
GemaMW -C
Ganwna M W
GRE C
-C
Pmmmr fieMr6tago
Gen heterbloga
Figura 48-8. El elemento de respuesta a glucocortiwide {GRE) es un potenciador de la transcripción. El virus del tumor marnario (MW) tipo silvestre contiene una regibn de DNA que se copia en la unidad de transcripcibn (genoma MTV), el promotor y un GRE Este ultimo está situado de manera normal dentro de unas 200 pb 5' del sitio de inicio de la transcripcibn, pero actila en cualquier orientacibn y puede localizarse abajo del sitio de rnicio de la transcnpct6n Zambien actua sobre promotores heterblogoc y unidades codrficantes. Estas observaciones signrfican que este GRE y otros arslados de diferentes genes, funcionan como amplificadores de la transcripción. El GRE a menudo actúa en conjunto con otros elementos del DNA y proteínas concornitanles para regular (aumentar o disminuir) la tranccripci6n
En el citoplasma y el núcleo de células objetivo se encuentran receptores que fijan aldosterona con elevada afinidad (Kd cercana a í nmollL) Estas celulas incluyen a las de riilbn, parbtidas y colon y de otros brganos (hipocampo y corazón) que no se pensaba fueran objetivos para la accibn de la aldosterona. Estos receptores tienen igual afinidad para aldosterona, cortisol y corticosterona y se denominan como receptores tipo 1 para distinguirlos del receptor clásico para glucocorticoides (tipo 11). Dado el hecho de que la concentración plasmática de la aldosterona es mucho menor que la de los oaos dos esteroides, podria suponerse que éstos ocuparian de manera preferente los sitios 1 y que la aldosterona ejerceria efecto escaso. Se recuerda que la DOC y la corticosterona se unen con avidez a la globulina fijadora de corticosteroides, la proteína plasmbtica de transporte de glucocorticoides, en tanto que la aldosterona no tiene protelna transportadora especifica. En consecuencia, la concentracibn efectiva "libre" de aldosterona en el plasma es mayor que la de corticosterona y DOC. Por consiguiente, la aldosterona tiene facilidad para entrar a las cdlulas y esto asegura una ventaja competitiva para ella con respecto a ocupar in vivo el receptor tipo 1. La importante accibn de la aldosterona se asegura por un me-
canismo adicional de "autoprotección". El receptor en los tejidos objetivo para mineralocorticoides tiene selectividad absoluta para aldosterona debido a la presencia de la enzima 1 lbeta-hidroxiesteroide deshidro~enasa.Esta enzima convierte cortisol y corticosteroña a sus metabolitos 11beta pero no-actiia sobre aldosterona. Estos metabolitos no pueden unirse al receptor tipo 1, de modo que la aldosterona tiene libre acceso.
La principal actividad de la aldosterona es sobre el transporte de iones No se han dilucidado, los mecansirnos moleculares de la accibn de la aldosterona sobre el transporte de Na', pero varios estudios apuntan hacia las siguientes hipótesis. El Na' desde el liquido luminal que baila la superficie apical de la célula renal entra de manera pasiva a través de los conductos del Na". Entonces, el Na' se transporta al líquido intersticial a través del lado seroso de la célula mediante la bomba de Na'lK' dependiente de ATPasa. El ATP proporciona la energía requerida para este transporte activo. La aldosterona incrementa el numero de conductos para Na' en la membrana apical y el resultado probable es un incremento del Na' intracelular. La aldosterona aumenta tarnbibn la actividad de varias enzirnas rnitocondnales y esto conduciria a la generacion
(Capítulo 18)
654 Bioquimica de Harper
del ATP requetido para impulsar la bomba de Na'K de la membrana serosa. La relacion NADH:NAD aumenta como resultado de la acción de la aldosterona, así como la actividad de varias enairnas mitocondriales que incluyen la citrato sintasa. El incremento de la actividad de la citrato sintasa implica una verdadera inducción (mediada tal vez por lo efectos de la transcripción génica, aludidas antes) y el incremento temporal de esta proteina tiene una correlación alta con el efecto de la aldosterona sobre el transporte de Na'. No se ha demostrado que la aldosterona por si misma tenga efecto sobre la bomba de Na*; por tanto, al parecer la hormona incrementa la concentraciiin intracelular de Na' y crea la fuente de energia necesaria para la remoción de este ion a travhs de la bomba de la membrana serosa. Es posible que en el manejo del K+y del H' ademiis intervengan otros mecanismos con proteínas diferentes reguladas por la aldosterona.
FISIOPATOLOG~A DE LA CORTEZA SUPRARRENAL Trastornos por deficiencia y exceso de hormonas glucocorticeides La insuficiencia suprarrenal primaria (enfermedad de Addison) produce hipoglucemia, sensibilidad extrema a la insulina, intolerancia al estrés, anorexia, p&rdida de peso, náusea y debilidad intensa. Las personas con enfermedad de Addison tienen presión arteria1 baja, disminucibn de la velocidad de filtración glomerular y capacidad reducida para excretar una carga de agua. Con frecuencia tienen como antecedente el deseo intenso de sal. Las concentraciones plasmáticas de Na' son bajas, las de Ktcon altas y las cuentas de linfocitos y eosinófilos sanguineos esthn aumentadas. Estos pacientes muestran a menudo mayor pigmentacibn de la piel y de las mucosas debido a la exagerada secreción compensatoria de ACTH y de los productos vinculados al gen POMC. La insuficiencia suprarrenal secundaria se debe a una deficiencia de ACTH resultante de un tumor, un infarto o una infeccion. El sindrome metabblico que produce es semejante pero sin hiperpigmentacibn. El exceso de glucocorticoides denominado comúnmente sindrome de Cushing, se debe habitualmente al uso farmacolhgico de esteroides, pero puede ser consecuencia de un adenoma hipofisario secretante de ACTH,de adenomas o carcinomas suprarrenales o de la produccion ectopica de ACTH por un neoplasma. Clhsicamente, los pacientes con el sindrome de Cushing pierden el pawbn diurno de la secrecion de ACTH y cortisol y tienen hiperglucemia o intolerancia a la
glucosa (oambas) debido a la gluconeogénesis acelerada. En relación con esto hay efectos catabólicos graves de las proteínas, que conducen a adelgazamiento de la piel, desgaste muscular, osteoporosis, regresión extensa del tejido linfoide y, por lo general, un balance negativo de nitrbgeno. Hay una distribuci~npeculiar de las grasas,con obesidad troncal y la típica "joroba de búfalo". La resistencia a las infecciones y las respuestas inflarnatorias están alteradas, así como la cicatrización de las heridas. Varios hallazgos, que incluyen hipernatremia, hipocalemia, alcatosis, edema e hipertensión, se deben a las acciones mineralocorticoides del cortisol.
Trastornos por exceso de mineralocorticoides Los pequefíos adenomas de las células glomerwlares producen aldosteronismo primario (sindrome de Conn), cuyas manifestaciones clAsicas incluyen hipestensihn, hipopotasemia, hipernatremia y alcalosis. Los pacientes con aldosteronismo primario no presentan seaales de exceso de glucocorticoides y las concentraciones plasmáticas de renina y angiotensina II son bajas. La estenosis de la arteria renal, cori la disminucion concomitante en la presión de riego, puede conducir a hiperptasia e hiperfuncionamiento de las células yuxtaglomerulares y causa concentraciones elevadas de renina y angiotensina 11. Esta accibn conduce a aldosteronismos secundario, que semeja la forma primaria excepto en las concentraciones altas de renina y angiotensina 11.
La hiperplasia suprarrenal congénita se debe a deficiencia enzimática Las cantidades insuficientes de enzirnas esteroidbgenas ocasionan deficiencia de los productos finales, acumulación de productos intermedios y produccibn exagerada de esteroides por vías alternas. Una característica coman de la mayor parte de estos sindromes, que se desarrollan in utera, es la produccibn deficiente de cortisot con hiperproducción de ACTH e hiperplasia suprarrenal, de aquí, el témino hiperplasia suprarrenal congénita. Otra característica comun es la hiperproducción de andr6genos suprarrenales. Este exceso hormonal conduce a incremento en el desarrollo corporal, virilizacihn y genitales externos mbiguos, de aquí, la designacibn alterna de sindrome adrenogenital. Los dos tipos de deficiencia de la 21-hidroxilasa (parcial o de virilizacion simple y completa, o con deplecion de sal) representan mis de 90% de los casos de hiperplasia suprarrenal congénita y la mayor parte del
Hormonas de la correza suprarrenal
resto se deben a deficiencia de Ia I l beta-hidroxilasa. Solo se han descrito unos cuantos casos de otras defíciencias (3beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 1 7alfa-hidroxilasa, colesterol desmolaca, I 8-hidroxilasay 1 8-deshidrogenasa). Las deficiencias de 1 8-hid roxilasa y I 8-deshidrogenasa afectan sólo la biosintesis de la aldosterona y no causan hiperplasia suprarrenal. La deficiencia de coiesteroi desrnolasa impide cualquier biosintesis de esteroidec y por tanto habitualmente es incompatible con la vida extrauterina.
RESUMEN La corteza suprarrenal tiene enzirnas que convierten el colesterol en docenas de mol~culasesteroideas diferentes. De tstas, tres clases tienen actividad hormonal: 1) glucocorticoides, 2) rnineralocorticoides y 3 ) andrógenos. Todas estas hormonas comparten la estructura bbsica de 17 carbonos del ciclopentanoperhidrofenantreno, que consiste en cuatro anillos indicados con las letras de A a D. Carbonos adicionales forman los andrbgenos C14>así como 10s glucocorticoides y mineralocorticoides C2 1. El glucocorticoide miis importante sintetizado en la corteza suprarrenal humana es el cortisol. La producción de cortisol se regula por un circuito de ~etronlimentaci6nnegativa constituido por CRH (hipotálarno) y ACTH (hipdfisis anterior). La ACTH cataliza la separacion de Ea cadena lateral del colesterol,
655
que es el paso limitante de la velocidad en la esteroidogénesis suprarrenal. Los numerosos efectos del cortisol inciuyen los del metabolismo intermedio y la supresi6n de los mecanismos de defensa del hu&spede intervienen de manera critica en la respuesta a la tensi6n. La actividad del cortisol es mediada por su interacción con un receptor especifico localizado en las células blanco. El complejo ligando-receptor se une a regiones especificas del DNA, llamadas elementos de respuesta a glucocorticoides, para modificar la velocidad de transcripción de genes específicos. Los cambios resultantes en la velocidad de sintesis de proteínas selectas median los diversos efectos de la hormona. La aldosterona, el mineralocorticoide mbs potente, se sintetiza en la zona glomerulosa de la corteza suprarrenal. Esta hormona se produce en respuesta a cambios en la concentración plasmhtica de K' y angiotensina 11. La aldosterona, que también actúa por regulacibn de la expresicin génica a travds de un mecanismo mediado por un receptor, es la hormona primaria responsable de la retencibn de Na' por el riAón. Las hormonas suprarrenates desempefían una función fundamental en la homeostasia de la glucosa, la retencibn del sodio y la regulación de la presión arteria]; tambikn en los mecanismos de defensa del h d s p e d , la respuesta a la tensión y el anabolisrno proteinico generat. En el ser humano la falta de funcionamiento suprarrenal amenaza la vida. . i
REFERENCIAS CarsonJunica MA, Schrader WT, O'Malley BW: Steroid receptor family: Stnicture and function. Endocr Rev 1990;11:201. Dallrnan MF: Stress update: Adaptation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis to chroníc stress. Trends Endocrino1 Metab 1993;4:62. Evans R: The esteroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science 1988;240:889. Freedman LP: Anatomy of the steroid receptor zinc finger region. Endocr Rev 1992;13:129. Funder JW: Target tissue specificiq of mineralcorticoids. Trends Endocr Metab 1990;1:145. Granner DK, Stsornstedt P-E: Glucocorticoid hormone actíon. In: Therapeutic Immunologq? Austen KF et al. (editors). Blackwcll. 1995.
Gustafssen et al.: Biochemistry, rnolecular biology and physiology ofthe glucocorticoid receptor. Endocr Rev 1987;8:185. Lucas PC. Granner DK: Horrnone response dornains in
gene transcription. Annu Rev Biochem 1992:61: 1131. Pearce D, Yamarnoto KR: Mineralocorticoid and gluco-
corticoid receptor aciivities disiinguished by nonreceptos factors at a composite response element. Science 1993;259:1161. Truss M, Berto M: Stcroid hormone rcceptors: Interacion
with deoxyribonucleic acid and transcription factors. Endocr Rcv 1993;14:459.
SIGLAS UTILIZADAS EN ESTE CAP~TLILO
El sistema simpaticosuprarrenal está constituido por el sistema nervioso parasimphtico con sus nervios cotinérgicos pre y posganglionares, por el sistema nervioso sirnp&ticocon los nervios colinkrgicos preganglionares y nervios adrenkrgicos posganglionares y por la médula suprarrenal. Esta última es en realidad una extensibn del sistema nervioso simpático, puesto que las fibras preganglionares del nervio esplacnico terminan en ella donde inervan a las c&lulascromafínicas que producen las hormonas catecolaminicas dopamina, noradrenalina y adrenalina. Por tanto, la médula suprarrenal es un glanglio especializado sin extensiones axonales. Sus cdlulas cromaflnicas sintetizan, almacenan y liberan productos que actuan en sitios distantes, de modo que tambidn Funciona como un brgano endocrino, ilustracibn perfecta de la interconexión de los sistemas nervioso y endocrino a laque se alude en el capitulo 44.
IMPORTANCIA BIOMEDICA Las hormonas del sistema simpaticosuprarrenal, aunque no necesarias para la vida, se requieren para la adaptacibn al estrés agudo y crónico. La adrenalina, noradrenalina y dopamina son los elementos principales en la respuesta a tensión intensa. Esta respuesta comprende un ajuste integrado e inmediato de numerosos procesos complejos en los órganos vitales para la respuesta (cerebro, muscu tos, sistema cardiopulmonar e hígado) a expensas de otros drganos que no intervienen de inmediato (piel, sistema gastmintestinal y tejido linfoide). Las cateolaminas no fa-
COMT
Catecol-O-metiltransferasa
DBH
Dopamina beta-hidraxilasa
MAO
Monoamino oxidasa
PNMT
Feniletanolamina-N-metiltransferaca
VMA
Acido vanilFilmandélico
cilitan solas la respuesta a1 estrds, sino que les ayudan los glucocorticoides, hormona del crecimiento, vasopresina, angiotensina 11 y glucagdn.
LAS HORMONAS CATECOLAMINAS SON DERIVADOS 3,4-DIHIDROXI LO DE FENILETILAMINA Estas aminas, dopamina, noradrenalina y adrenalina, se sintetizan en las células cromafines de la medula suprarrenal, llamadas aci debido a que contienen grinulos que generan un color pardo rojizo cuando se exponen al dicromato de potasio. Colecciones de esm cdlulas pueden encontrarse también en el corazbn, higado, riñón, gbnadas, neuronas adrenérgicas del sistema simpático posganglionar y sistema nervioso central. El producto principal de la mCdula suprarrenal es la adrenalina. Este compuesto constituye aproximadamente 80% de las catecolaminas de la médula y no se sintetiza en el tejido extramedular. Por el contrario, la mayor parte de la noradrenalina presente en los 6rganos inervados por los nervios simphticos se forma
(Capitulo 49)
658 Bioquímica de Harper
cerca in situ (cerca de 80% del total) y la mayor parte de la fraccibn restante se sinteti72 en otras terminaciones nerviosas y alcanza los sitios blanco por medio de la circulación. La adrenalina y noradrenalina pueden producirse y almacenarse en células diferentes en la medula cuprarrenal y otros tejidos cromafines. La conversidn de torisina a adrenalina requiere una secuencia de cuatro pasos: 1) hidroxilacibn del anillo; 2) descarbaxilaci6n;3 ) hidroxilacibn de la cadena lateral, y 4) N-metilacion. La via biosintdtica y las enzima?,involucmdas se i l u s m en la figura 49-1 y en la representacidn esquematica de la figura 49-2.
La tirosina hidroxilasa es la enzima limitante de la velocidad en la biosintesis de catecolaminas La tirosina es el precursor inmediato de las catecotaminas y la tirosina hidroxilasa en ka enzima limitante de la velocidad en su biosintesis. La tirosina hidroxilasa se encuentra en forma soluble y unida a partlculas; funciona como una oxidorreductasa, con la tetrahidropteridina como cofactor, para convertir la L-tiroxina a L-dihidroxifenilalanina (L-dopa). Como enzima limitante de la velocidad, la tirosina hidroxilasa se regula de varias maneras. El mecanismo mBs importante comprende una inhibicidn por retroalimentacion por parte de las catecolaminas, que compiten con la enzima por el factor pteridina con el que forma una base de Schiff. La tirosina hidroxilasa se inhibe tambikn en forma competitiva por una serie de derivados de la tirosina que incluyen la alfa-metiltirosina. Este compuesto se utiliza en ocasiones para tratar el exceso de catecolaminasen el feocromocitorna, pero otros agentes son más eficaces y tienen menos efectos secundarios. Un tercer grupo de compuestos inhibe a la tirosina hidroxilasa por quelacibn del hierre y por tanto eliminan al cofactor disponible. Un ejemplo ec el alfa, alfa'-dipiridilo. La catecolaminasno pueden cm7x la barrera hematoencefálica; por tanto, la noradrenalina del cerebro debe sintetizarse ahí. En ciertas enfermedades del sistema nervioso central, por ejemplo, la enfermedad de Pñrkinson, hay una deficiencia local de la sintesis de noradrenalina. La L-dopa, precursora de la noradrenalina, cruza con facilidad la barerra hematoencefhlica y por tanto es un medicamento importante en el tratamiento de dicha enfermedad (capítulo 64).
La dopa descarboxilasa existe en todos los tejidos Esta enzima soluble requiere de fosfato de piridoxal para la conversion de la bdopa a 3,4-dihidroxifeniletilamina (dopamina). Los compuestos anhlogos a la
H
II
C-OH
C-C-NH, Bopa
H
H
C-C-NH,
I
H
I
H
Adrenalina
Flgura 49-1. Biosintesis de mtecolaminas. (PNMT, feniletanalamina-Kmetiltransferasa). (Modrficada y reproducida con autorizacibn de Goldfien A: The adrenal medulla. In: Basic and Clrnkal Endocrinobgy, 3rd ed. Greenspan FS [editor]. Appleton & Lange, 1991 ; publicado por la Editorial El Manual Moderna, MBxiw.)
L-dopa,como la alfa-metildopa, son inhibidores competitivos de esta reacción. Los compuestos halogenados forman una base de Schiff con la L-dopa y también inhiben la acción de la descarboxilasa.
Hormonas de la médula suprarrenal
LEC
659
C8lula crornafin
AyNR
+
DBH
ATP
Cromogranina A Calcio
Figura 49-2. Representación ecquern8tica de la bioslntesis de catecalaminas (TH, tirosina hidroxilasa; DD, dopa descarboxilasa; PNMT, feniletanolamina-Kmetiltransferaca; DBH, dopamina P-tiidroxilasa;ATP, trifocfatode adenocina.) La biosintecrc de las catecolaminas ocurre en el citoplasma y en varios granulos de las dlulas de la medula suprarrenal. Algunos grbnvlos contienen adrenalina (A), otros tsnen noradrenalina (NA). en tanto que otros mas trenen ambas hormonas. Después de la estirnulación, todo el contenido de los grhnuloc se libera al liquido extracelular (LEC).
La affa-metildopa y otros compuestos relacionados como la 3-hidroxitirarnina (procedente de tiramina), la alfa-metiltirosina y el metaraminol, son eficaces en el tratamiento de ciertas clases de hipertensión.
sangre arteria1 general y al parecer se requiere de esta elevada concentracián intrasuprarrenal para la induccion de la PNMT.
La dopamina beta-h idroxilasa (DBM) cataliza la conversión de dopamina a noradrenalina
LAS CATECOLAMINAS SE ALMACENAN Y LIBERAN
La DBH es una oxidasa de funcidn mixta y usa ascorbato como donador de etectrones, cobre en el sitio activo y fumarato como modulador. La DBH se localiza en la fracción particulada de 1% células medulares, probablemente en los gránulos de secrecibn; por tanto, la convesibn de dopamina a noradrenalina ocurre en estos organelos. La DBH se libera de la mkdula suprarrenal o de las reminaciones nerviosas junto con la noradrenalina, pero (al contrario de ésta) no puede entrar de nuevo a las terminaciones nerviosas vía el mecanismo de recaptacibn.
Su almacenaje es en gránulos cromafinec
La feniletanolamina-N-metiltransferasa cataliza la produccibn de adrenalina
La médula suprarrenal contiene a los grAnulm cromafines, organelos capaces de la biasintesis, captaciiin, almacenamiento y secrecibn de catecolaminas. Estos gránulos contienen cierto numera de sustancias adernhs de las catecolaminas que incluyen ATP-Mg", Ca2+,DBH y la proteina cromogranina A. Las catecolaminas entran al grhnulo por un mecanismo de transporte dependiente de ATP y se unen a este nucledtido en una proporci6n de 4 a 1 (hormona:ATP). La noradrenalina se almacena en estos gránulos pero puede salir para ser N-metilada; la adrenalina formada entra entonces a una nueva poblacibn de gránulos.
La enzima soluble feniletanolamina-N-metiltransferasa (PNMT) cataíiza la N-metilacion de la noradreLa liberación depende de calcio nalina en las ctlulas fotmadoras de adrenalina de la medula suprarrnal. Dado que la PNTM es soluble, se La estimulacion neural de la midula suprarrenal conasume que la conversión de noradrenalina a adrenaduce a la fusión de las membranas de los gránulos de lina ocurre en el citoplasma. La sintesis de PNMT se almacenamiento con la membrana plasmhtica y a la induce por las hormonas glucocorticoides que alcanzan liberacion exocitdtica de noradrenalina y adrenalina. la médula vía el sictema porta-intrasupramenal. Este ~ s t es e un proceso dependiente del calcio y, al igual sistema proporciona un gradiente de concentracibn de que la mayor parte de los fenómenos exocitbticos, se esteroides 100 veces mayor que la encontrada en la
660 Bioquímica de Harper
(Capítulo 49)
estimula por agentes colinergicos y beta-adrendrgicos se inhik por agentes alfa-adrendrgicos (figura 49-2). Las catecolaminas y el ATP se liberan en la misma p d u c ci6n que esttin dentro del granulo, igual que los demás contenidos, inclusive DBH, calcio y cromogranina A. La recaptacibn neurona1 de las catecolaminas es un mecanismo importante para conservar estas hormonas y para la ripida tenninacihn de la actividad hormonal o de neurotransmisor. La medula suprarrenal, al contrario de los nervios simpAticos, no tiene un mecanismo para la recaptación y almacenamiento de las catecolarninas descargadas. La adrenalina que sale de la suprarrenal va al hígado y al musculo esquel6tico pero se metaboliza con rapidez. Muy poca noradrenalina supsarrenal alcanza los tejidos distales. las catecolaminas circulan en el plasma en una uni6n dkbil con la albúmina. Tienen una vida media biológica excesivamente corta ( 1 0 a 30 segundos).
LAS CATECOLAMINAS SE METABOLIZAN CON RAPIDEZ Una cantidad muy escasa de adrenalina (> 5% se excreta en la orina. Las catecolaminas se metabolizan con rapidez por la catecol-O-metiltransferasay M A 0 para formar los metabolitos inactivos-O-metilados y decaminados (figura 49-3). La mayor parte de las
catecolaminas son sustratos para ambas enzimas y esta reacciones pueden ocurrir en cuaPquier secuencia. La catecol-O-metfltransferasa (COMT) es una enzima c i t o s ~ l i c aencontrada en muchos tejidos. Cataliza la adicion de un grupo metilo, usualmente en la posición 3(meta) en el anillo bencknico, para una variedad de catecolaminas. La reaccihn requiere un cati6n divalente y la S-adenosilmetionina es el donador del metilo. El resultado de esta reacción, dependiendo del sustrato, es la produccion de ficido homovanillico, normetanefrina y metanefrina. La monoamino oxidasa (MAO) es una oxidorreductasa que desamina las monoaminas. Se localiza en numerosos tejidos, pero su concentración mBs alta es en higado, estbmago, riñón e intestino. Esthn descritas por lo menos dos isoenzimas de la MAO. La MAO-A se encuentra en el tejido neural y desamina la serotonina, adrenalina y noradrenalina, en tanto que la MAO-B se encuentra en tejidos extraneurales y muestra su mayor actividad contra 2-feniletilamina y bencilamina. La dopamina y la tiramina se metabolizan por ambas formas. Una abundante inventigacion se encamina a comlacionar los trastornos efectivos, con el incremento o la disminución de la actividad de estas isoenzimas. Los inhibidores de la MAO se utilizan para tratar la hipertensibn y la depresidn, pero las graves reacciones que se provocan con alimentos o
OH
NHCH,
NHz
Noradrenalina
Adrenalina
Acido drhidroximanddiiw
m
cHo .-@H HO
\
CH1
I
NHCH,
Metanefnna
3-Metoxitiramina
"".Ofi HO
1
CH,
1
NHs
Norrnetancfrina
Ácido h ~ r n ~ ~ a n i l l i ~ c i
Flgura 49-3. Metabolismo de las catecolaminas por medio de la catecol-Ometiltransferasa (COMT} y de la monaamino oxidasa (MAO) (Reproducida mn autorizacibn de Goldfien A: The adrenal rnedulla. In: Basrc and Clinical Endocrinology, 3rd ed. Greenspan FS [edbor]. Appleton & Lange, 1991; publicado por la Editorial El Manual Moderno, MBxica.)
Hormonas de la médula suprurrenal * 661
Mrmacos que contienen aminas simpaticomiméticac limitan su utilidad. Los derivados O-metoxilados se modifican m b tarde por conjugaci6n con hcido glucurónico o Sicido sulfúrico. Se forma un numero sonprendente de metabolitos de las catecolaminas. Dos clases de éstos tienen significado diagnóstico, puesto que se encuentran en cantidades fhcilmente medibles en la orina. Las metanefrinas representan los derivados metoxi de adrenalina y noradrenalina, en tanto que el producto desaminado O-metilado de éstas es el ácido 3-metaxi-4-hidroximandklico (denominado también ácido vanillilmandklico [YMA], figura 49-3). La concentración de las rnetanefrinas o del V M A en orina estit elevada en mas de 95% de los pacientes con feocromocitoma. Estas pruebas tienen una excelente precisión para diagnóstico, en particular cuando se acoplan con una medición de las catecolaminas plasrnáticas o urinarias.
LA S~NTESISDE CATECOLAMINAS SE REGULA POR IMPULSOS NERVIOSOS La estimulacibn del nervio esplacnico, que aporta las fibras preganglionares a la médula suprarrenal, conduce a la liberaci6n exocitótica de catecolaminas, la proteína transportadora de los gránulos y UBH. Esta estimulación se controla por el hipotalamo y el tallo encefklico, pero no se ha descrito el circuito de retroalimentaci6n exacto. La esthulaci6n nerviosa conduce a un incremento en la sintesis de catecolaminas. La síntesis de noradrenalina aumenta despu6s de un estrés agudo. pero la cantidad de tíroxima hidroxilasa permanece sin cambio aun cuando su actividad aumenta. Ida tirosina hidroxilasa es el sustrato para una proteina cinasa dependiente de cAMP y por tanto, esta activación puede involucrar fosforilacibn. E1 estres prolongado junto con actividad nerviosa cirnphtica crónica conduce a una inducción (aumento de la cantidad) de tirosina hidroxilasa. Tambien se ha descrito una inducci6n semejante de DBH. La induceion de estas enzimas de la vía biosintética de las catecolarnias es un medio de adaptación al estrés fisiológico y depende de factores neurales (inducción de tirosinhidroxilasa y DEH)y endrocrinoc (inducción de PNMT).
LAS CATECOLAMINAS PUEDEN CLASIFICARSE POR SU MECANISMO DE ACCION El mecanismo de accibn de las ~atecolaminacha llamado la atencibn de los investigadores por casi un
siglo, De hecho, muchos de los conceptos generales de la biología del receptor y de la acción hormonal pueden ser rastreados hasta estos estudios tempranas. La catecolaminas act$an a través de dos clases principales de receptores. Estos se designan alfa-adrendrgicos y beta-adrentrgicos y cada uno tiene dos subclases: alfa,, alfat, betal y beta~.Esta clasificación se basa en el orden relativo de fijación de diversos agonistas y antagonistas. La adrenalina se fija y activa a ambos receptores, alfa y beta, de modo que su accibn en un tejida que posee los receptores, depende de la afinidad relativa de éstos por la homona. La noradrenalina a concentraciones fisiológicas se une bhsicamente a los receptores alfa.
Se conoce la estructura del receptor
beta adrenérgico La clonacion molecular del gen y el DNA para el receptor betaadrenergico de mamífero revelaron algunas características sorprendentes. Primero, el gen no tiene intrones y por tanto, junto con los genes de la histona y del interferhn, son los linicos genes de mamífero que carecen de estas estructuras. Segundo, el receptor beta adrenérgico tiene gran homologla con la rodopsina (en tres regiones peptldicas, por lo menos), la proteina que inicia el proceso que convierte la luz en respuesta visual. Los receptores para catecolaminas con miembros de la clase de receptores que se enlazan a la protcine G. La característica más sorprendente de estos receptores es la serie de dominios que se extienden siete veces a traves de la membrana (figura 44-4). Estos dominios en el espesor de la membrana asumen la configuración de hdlices alfa.
Tres de estos subgrupos de receptores adrenergicos se acoplan al sistema de adenilil ciclasa Las hormonas que se unen a los receptores beta, y betez activan a la adenilil ciclasa, y las que se unen a los receptores alfa? inhiben a esta enzima (cuadro 4 4 4 ) . La f i j a c i ~ nde las catecolaminas induce el acoplamiento del receptor a una proteína G que entonces se une al GTP. Esto estimula (G,) o inhibe (G,)a la adenilil ciclaca, Queasi estimula o inhibe la síntesis de cAMP. La re;&esta temina cuando la GTPasa ligada a la subunidad alfa hidroliza al GTP (capítulo 44). Los receptores alfa] estSin acoplados a los procesos que alteran las concentraciones del calcio intracelular o modifican el metabolismo de los fosfatidilinositidos (O ambos). En esta respuesta esta irnplicado un complejo diferente de la proteína G.
662 * Bioquimica de Harper
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(Capítulo 49)
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-1. Acciones mediadas por varios receptores adrenkgicos .. .- - -. --
Alfa1
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ilfaz --
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3
Glucogmtilisis aumentada RElajamiento del músculo liso Est Contraccii i n del mús culo de: ... . . . liso de: Vasti s siinguinr Vías geni tourin
Vías gastr~intestina1~
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Algiinos lechas vasc InhibitiOn de
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R e l a j a i i i i ~ i ~A-1 U ~u L ~músculo -:-..&A
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. .
HAY SEMEJANZA FUNCIONAL ENf RE EL RECEPTOR PARA CATECOLAMINAS Y EL SISTEMA DE LA RESPUESTA VISUAL La estimulaci6n de la rodopsina por la luz Ia acopla a la transducina, un complejo de la proteina G cuya unidad alfa tarnbikn se une al GTP. A su vez, la proteina G activa a una fosfodiesterasa que hidroliza al cGMP. La consecuencia es el cierre de los canales para iones de la membrana celular de! bastoncillo y produce la respuesta visual. La accibn termina cuando la GTPasa ligada a la subunidad alfa hidroliza al GTP unido. En el cuadro 49-1 se proporciona una lista parcial de los efectos bioqufmicos y físiol6gicos mediados por cada uno de estos receptores. La activación de las fosfoproteínas por la proteina cinasa dependiente de cAMP (figura44-5) explica muchos de los efectos bioquimicos de la adrenalina.
LOS FEOCROMOCITOMAS SON TUMORES DE LA MÉDULASUPRARRENAL Estos tumores, por lo general, indetectables a menos que produzcan y secreten suficiente adrenalina o noradrenalina para causar un sindrome de hipertension grave. Los feocromocitomas con frecuenciaaumentan la proporcion de noradrenalina a adrenalina. Este fen6meno puede explicar las diferencias en la presentacibn cllnica, ya que se considera que la noradrenalina
Vias gcnitouri Vías gastrointestinaIcs . . --
es la responsable primaria de la hipertensibn y la adrenalina del hipermetabolismo.
RESUMEN La mtdula suprarrenal contiene enzimas capaces de convertir la tirosina en adrenalina. La enzima limitante de la velocidad en este proceso es la tirosina hidroxilasa, pero la enzima feniletanolamina-N-metiltransferasa (PNMT) tambikn interviene en forma critica. La PNMT se induce por los gtucocorticoidec, que alcanzan la médula suprarrenal desde la corteza a travts de un sistema porta especializado y aseguran asi una concentracibn local alta de cortisol. La PNMT cataliza la conversión de noradrenalina a adrenalina. Esto es importante debido a que la noradrenalina, producida también y liberada de neuronas en todo el cuerpo, activa de manera primaria al sistemaal fa-adrenkrgico, el cual media diversas actividades por inhibicion de la adenilil ciclasa y liberaci6n de Ca2+intracelular. Por el contrario, la adrenalina activa de manera primaria al sistema beta-adrendrgico, cuyos efectos son mediados por un incremento del AMP ciclico. Estos mecanismos de accibn son distintos a los de hormonas tiroideas, que tambitn derivan del aminoiicido tirosina. Las catecolaminas, que comprenden noradrenalina y adrenalina, intervienen en cierto n h e m de trastornos neuropsiquiátricasy en la hipertension. Se han d e s m llado numerosos fámacos con base en su capacidad para alterar la síntesis, metabolismo o accibn de las catecolaminas en sus respectivos receptores. II
Hormonas de la médula suprurrenal 663
-.
REFERENCIAS Dixon RAF et al.: Cloning of thc gene and cDNA ior mammalian P-adrcncrgic receptor w d hornology with rhodopsin. Naturc 1986;321:75. Dohlrnan HG et rl.: hlode! systcms for the study ofsevtntransmembrane segment receptors. Annu Rev Biuchem 1991:60:653. Kaupp UB: Mechanism of photoreception in vertebrate vision. Trends Biochem Sci 1986: 1 1 :43.
Sjbley DR, Lefkowih RJ: Moleciilar rnechanisms of re-
ccptor desensitization using the P-adrenergic rcceptorcoupled adenylate cyclase system as a model. Nature 1985;3 17.124. Stiles GL, Caron MG, LeBrowitz RK: The P-adrenergic receptor: Biochemical mechanrsms of physiolugical regulation. Physiol Rev 1984;64 661.
Y~rrnonasde Aas gónadas
Las g6nadas son rirganos bifuncionales que producen c~lwlasgerminales y hormonas sexuales. Las dos funciones se interrelacionan estrechamente, porque durante el desarrollo de las primeras se requieren altas concentraciones locales de hormonas sexuales. Los ovarios producen los óvulos y las hormonas esteroides, estrbgeno y progesterona; por su parte, los testiculos producen espermatozoides y testosterona. Al igual que en la glándula suprarrenal, se forman varios esteroides, pero sblo unos cuantos son activos come hormonas. La producción de estas hormonas esth regulada de manera estrecha por un circuito de retroalimentaciOn en el que intervienen la hipdfisis y el hipotálamo. Las hormonas de las gonadas actiian mediante un mecanismo nuclear semejante al empleado por las hormonas esteroides suprarrenales.
germinales más diferenciadas, que se localizan en los tijbulos semlníferos; 2) las células de Leydig (llamadas tambien células intersticiales), que están diseminadas en el tejido conjuntiva entre los túbulos semlníferos enrollados y que producen testosterona en respuesta a la LH, y 3) las cklulas de Sertoli, que forman la membrana basa1 de los tubulos seminiferos y proporcionan el medio necesario para la diferenciacibn y maduracibn de las células germinales. La
ACPH
Proteína fjadora de andrógenos Hormona adrenocorticotrbpica
DHEA
Globulina fjadora de corticosteroides Deshidroepiandrosterona Dihidrotestosterona
El funcionamiento correcto de las gbnadas es cruciat para la reproduccibn y, por tanto, para la supervivencia de las especies. En sentido inverso, la cornprensidn de la fisiología y la bioquimica endocrinas del proceso de la reproduccibn,es la base de muchas de las aproximaciones a la anticoncepcion. Las hormonas de las g6nadas tienen otras acciones importantes; por ejemplo, son anabblicas por lo cual se necesitan para regular el metabolismo en la piel, los huesos y los músculos.
Hormona estimulante de los foliculos GnRH
Hormona liberadora de gonadotropina Gonadotropina coribnica humana Somatomamdropina mribnim humana Hormona luteinizante Factor inhibidor de Müller
30-OHSD
BpHidroxiesteroidedeshidrogenasa
17P-OHSD 17PHidmiesteroidedeshidrogenasa
LOS TEST~CULOSPRODUCEN TESTOSTERONA Y ESPERMATOZOIDES Estas funciones son ejecutadas por tres tipos de células especializadas: 1) las espermatogonias y cklulas
Lactbgeno placentario
SHBG
Globulina fijadora de k m a s m a l = Globulina fijadora de tiroxina
666 Bioquimica de Harper
(Capitulo SO)
espermatogénesis es estimulada por la FSH y la LH de la hipófisis. Requiere un medio favorable para la diferenciacion de la cdlula germina! y una concentracibn de testosterona mayor que la que se encuentra en la circulación general; este objetivo puede lograrce ya que las cklulas de Leydig y las túbulos seminiferos se encuentran muy pr6ximos.
tanto., e5 probable que la ruta tomada dependa de la concentración del sustrato en la vecindad de las diversas enzimas. El coeficiente de partición en la membrana microsomica puede proporcionar estos gradientes.
La enzima que separa la cadena lateral del colesterol y la 3beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa cataliza los pasos críticos en la síntesis de esteroides gonadales
Los testículoc humanos secretan aproximadamente de 50 a 100 pg de DHT al dla, pero la mayor parte se deriva de la conversibn perifkrica (véase despues). Ademb, los testículos sintetizan cantidades pequeñas pero significativas de 17beta-estradiol (E?), hormona sexual femenina, aunque la mayor parte de E2 producida por el varón se deriva de la aromatización periferia de la testosterona y la androstenediona. Se considera que en la produccibn de Ezintervienen las cklulas de Sertoli, las de Leydig y los tiibulos seminiferos. La función de esta hormona en el varOn no se ha determinado, pero puede contribuir a la regulación de la FSH. Las concentraciones plasmhticas anormalmente altas de E2y los cambios en la proporción E: 1ibre:testosterona se han relacionado con ginecomastia en la pubertad o pospubertad (crecimiento de las mamas masculinas), en particular en individuos mayores y en pacientes con enfermedad hepática o hipertiroidismo.
Los andrógenos testiculares son sintetizados en el tejido íntersticial por las c&lulasde Leydig. El prccursor inmediato de los esteroides gonadales, como el de los esteroides suprarrenales, es el colesterol. Al igual que en la suprarrenal, el paso limitante es la separacibn d e Ea cadena del colesterol. La conversión del colesterol a pregnenolona es idtntica en suprarrenal, ovario y testículo. Sin embargo, en estos dos últimos tejidos, la reacci~nes propiciada por la LH mas que por la ACTH. La conversi611 de la pregnenolona en testosterona necesita la accibn de cuatro enzimas, las ciiales son: 1) 3beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3beta-OHSD) isomerasa, 2) 17alfa-hidroxilaca, 3) C17.20 liasa y y 4) 17beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (1 7betaOHSD). Esta secuencia llamada via de la progesterona (o A4}, se muestra en el lado derecho de la figura 50-1. Tambikn la pregnenolona puede ser convertida en testosterona por la vía de la deshidroepiandrosterona (o A'), que se muestra en el lado izquierdo de la figura 50-1. Al parecer, la ruta A4 es la preferida en los testiculos humanos; sin embargo, dado que rara vez se dispone de ellos para su estudio, la mayor parte de la información procede de estudios en animales y puede haber diferencias significativas entre las especies. Las cuatro enzimas se localizan en la fkaccibn microsomica de los testículos de rata y hay una relaci6n funcional estrecha entre las actividades de la 3beta-OHSD y isornerasa y entre las de la 17atfahidroxilasa y la C i ~ a oliasa. Estos pares de enzirnas se muestran en Pa secuencia de la reacción general en la figura 50-1 y en la representacibn esquemhtica de la biosintesis de androgenos en la membrana microdmica testicular en la figura 50-2. La última muestra el modo en que varios Sustratos para la biosintesis de testosterona pueden entrar al compartimiento microsbmico y como podrían proceder por la via h4 de una reacción a la siguiente. Dado que hay cuatro sustratos potenciales para los que, al parecer, hay una sola 3beta-OHSD, existen múltiples vias alternas; por
A. La dihidrofestosterona (DHV se forma a partir de la testosterona por la reducción de su anillo A
B. La producción de hormona testicular sufre cambios notables relacionados con la edad La testosterona es la hormona dominante en la rata en Eos periodos fetal y neonatal, pero poco despues del nacimiento, los testículos solo sintetizan androsterona. La capacidad para producir testosterona se restablece en la pubertad y continúa toda la vida. Se han hecho observaciones semejantes en otras especies y estos cambios relacionados con la edad pueden ocurrir tarnbikn en el ser humano. La testosterona se une a una proteína plasmática específica Casi todos los marniferos, incluido el ser humano tienen una beta-globulina plasmhtica que se une a la testosterona con especificidad, afinidad relativamente alta y capacidad limitada (cuadro 50-1). Esta proteína, denominada por lo general globulina fijadora de hormonas sexuales (SHBC), o globulina fijadora de testosterana y estrógenos (TEBG), es producida en el higado. Su producción es hcrementada por los eslrógenos (las mujeres tienen el doble de la concen-
Hormonas de las nhadas
667
Pregnenolona
17~hidroxiprogesterona
ndrosterona e
Figura 50-1. Vias de la 'bioslntesis de !a testosterona La vla de la izquierda se llama vía d5 o de deshidroepiandrosterona; la vía al lado derecha de la figura se denomina o de la pmgecterona.
~~-~ndrmten&iol
tracion de SHBG que los varones), y por ciertos tipos de enfermedades hepáticas e hipertiroidismo; disminuye en presencia de andrbgenos, en la edad avanzada y por hipotiroidisrno. Muchas de estas condiciones afectan también la produccidn de CBG (capitulo 48) y TBG (capitulo 46). Puesto que la SHBG y la albúmina retienen de 97 a 99%de la testosterona circulante, sólo una ftncción pequefia de la hormona se encuentra en la forma libre (biolhgicamente activa). La funci6n primaria de la SHRG puede ser la de restringir la con-
Andmstenediona
Testostemna
centracion libre de testosterona en el suero. La testosterona se une a la SHBG con mayor afinidad que el estradiol (cuadro 50-2). Por consiguiente, un cambio en la mncenmcion de SH BG causa una modificaci6n en la concentracion de testosterona libre mayor que en la del estradiol libre. Un incremento de la SHBG puede contribuir al aumento de la proporción b libre: testosterona observado en el envejecimiento, cirrasis e hipertiroidismo y, por ende, a los signos y sintomas concomitantes de la "estrogenización" mencionada.
17~-Hidroxiprogesterona
Pregnenolona
A
1 Capas
T
hidrbfilas
Representacibn esquemática de la biosintesis de andrbgenos en la membrana microsómica tecticular. La membrana se muestra en pocicibn horizontal, que puede ser el caso en la célula: sin embargo. en las preparaciones microsomicas forma veciculac. (A, androstenediona; T, testosterona). (Reproducida c o n autorizacibn de DeGroot LJ. Endrocrinology, vol 3 Grune 8 Stratton, 1979.) Figura 50-2.
En la sangre venosa testicuiar se encuentran varios esteroides, pero la testosterona es la secrecibn principal de los testículos adultos. El índice de secrecidn es de alrededor de 5 mg/dL en varones adultos normales. Igual que otras hormonas esteroides, la testosterona parece que se libera tan pronto como se produce.
Muchos de los metabolitos de testosterona son inactivos; otros, tienen una actividad
incrementada o distinta A. Vias metabólicas La testosterona es metabolizada por dos vias. Una comprende la oxidación en la posición 17 y en la otra hay reducción del enlace doble del ani !lo A y de la cetona 3 . E1 metabolismo por la primera via se presenta en muchos tejidos, incluyendo el higado, y produce 13cetosteroides que, por lo generai, son inactivos o menos activos que el compuesto precursor. El metabolismo por la segunda vía, que es menos eficiente, tiene lugar básicamente en tejidos blanca y produce el potente metabolito DHT.
B. Metabolitos de la testosterona EI producto mctahhlico más importante de la testosterona es la DHT, dado que es la forma activa de la hormona en numerosos tejidos, incluyendo vesiculas seminales, prbstata, genitales externos y algunas Areas de la piel. El contenido plasmtttico de DHT en el varón adulto es aproximadamente un dtcimo que el de la testosterona que se produce al día, con cerca de 400 pg de DHT comparados con aproximadamente 5 rng de testosterona. La reacci6n es catalizada por la Salfa-reductasa, enzima que depende de NADPIl [véase más adelante). Por tanto, la testosterona puede considerarse una prohormona dado que es convertida en un compuesto mucho más potente (deshidrotestosterona) y puesto que la mayor parte de esta conversibn ocurre fuera de Ios testiculos. Ademis, un porcentaje pequeflo de la testosterona se convierte en estradiol por aromatización, Cuadro 50-2. ~fi$iifa$es aproximadas de l&-
les por la
5
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Cuadro Sel. U n i b de las horrnonaS".a?aglobuline sexuales (SHBG) .
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Esteroidles sin fija 'Testostertina
narogenos conjugado
17b-Estradio1
7a-Testost~trona
Deshidrot eshidroiso:sndrosteroi &os 17P-hidroxicsteroides tortisal Progesterona Estrona
Androstenediona ---Tcstostcro Deshidrott
7
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Mogtstercina
Cortisol
00
3 -
* Adaptado de Siitcri P1C.
Febres F: Ovariw horrnone synthiesis, circulatiori and mcchaiiisms of acti on. Pftgina I 40 1 en: End,OCXI-I .. m >.L.. .... ,nnology, Vui > ucurwc 1 . (euirur). ~ Grune & Srrirron, iri9. t ~ f i n i d a dexpresada como Kd de la cantidad molar x lo9. I
h . T .
.-.
d .
7.
Hormonas de las gónadas * 669
Testosterona
K'
Estradiol
d Androstanediol
Dihidrotestosterona (DHT)
Testosterona
reaccion de importancia especial en el cerebro, donde estas hormonas ayudan a determinar la conducta sexual del animal. El androstenediol, otro androgeno potente, tarnbikn se produce a partir de la testosterona. Los principales metabolitos 17-cetosteroides, la androsterona y la etiocolanolona, son conjugados con glucurónido y sulfato en el higado para formar compuestos hidrosolubles y excretables.
La esteroidogenesis testicular es estimulada por la LH La LH estimula la esteroidog&nesisy la producción de testosterona por medio de la fijaci6n a sus receptores sobre la membrana plasmhtica de las cdlulas de Leydig (un receptor anhlogo de la LH se encuentra en lac células del cuerpo Iuteo) y por activacirjn de la adenilil ciclasa, incrementítrtdo asi al cAMP intracelular. Esta accion aumenta la velocidad de separacibn de la cadena lateral del colesterol. La semejanza entre esta accirjn de la LH y aquélla de la ACTH sobre la suprarrenal es obvia. La testosterana proporciona el control por retroalimentación en el hipotilarno a trav6 del bloqueo de lasecrecibn de GnRH, de suprodwcci6n o de ambas (figura 50-3).
La espermatogénesis es regulada por FSH y testosterona La FSH se une a las celulas de Sertoli y activa la sintesis de la proteína fijadora de andrbgenos (ABP).
Dihidrotestosterona (DHT)
Esta proteína es una glucoproteina que se une a la testosterona. Es distinta del receptor intracelular para andrbgenos pero es idéntica a SHRG. La ABP es secretada al lumen del tiibulo seminífero, en este proceso, la testosterona producida por las ctlulas de Leydig es transportada en concentracilin muy alta al sitio de la espermatog~nesis.Al parecer éste es un paso critico, puesto que las concentraciones circulantes normales de testosterona, como !as que podrían lograrse con terapkutica de restitucibn, no mantienen la espematogknesis.
Los andrógenos afectan varios procesos fisiolog icos complejos Los andrógenoc,principalmente la testosterona y la DHT, intervienen en: 1) diferenciación sexual, 2) espematogdnesis, 3) desarollo de los órganos sexuales secundarios y las estructuras ornamentales, 4) anabolismo y regulacibn gknica, y 5) modelo de conducta masculina (figura 50-3). Los numerosos tejidos blanco afectados por estos complejos procesos se definen de acuerdo a si son modificados por la testosterona o por la DHT. Las cdlulas blanco cI8sicas de la DHT (y aquellas que de maneracoincidente tienen la actividad más alta de la Salfa-reductasa) son: la próstata, las vesículas seminales, los genitalec externos y la piel genital. Los blancos para la testosterona incluyen las estnicturac embrionarias de Wolff, espermatogonias, músculo^, huesos, riflbn y cerebro. No se ha determinado el andrbgeno especifico que interviene en la regulacibn de los demhs procesos descritos.
(Capitulo j01
6 70 Bioquim ica de Harper
Plasma
CÉLULA BLANCO
Figura 5 0 3 . Mecanismos de ambn de los andrbgenm. (LH, hormona luteinizante;T, testosterona; DHT, deshidrotestostemna; R, receptor de andrógenos.) (Modificada y reproducida con autorizacidn de Wilson JD et al.: The endocrine mntrol of male phenotypic development. Aust Bioi Sci 1983,36:101.)
tos andrógenos actúan por un mecanismo nuclear análogo al utilizado por los esteroides suprarrenales El concepto actual de la acción de los andrbgenos se muestra en la figura 50-3. La testosterona libre entra en las cklulas a travts de la membrana plasmfitica por difusion pasiva o facilitada. Las cklulas blanco retienen la testosterona, debido probablemente a que la hormona se combina con un receptor especifico intracelular. Aunque hay considerable variación de tejido a tejido, la mayor parte de la hormona retenida se localiza en el núcleo. El citoplasma de muchas, aunque no de todas las c&lulas blanco contiene la enzima Salfa-reductasa, que convierte Ia testosterona a DHT. El consenso es que, aun cuando s61o hay una clase de receptores, su afinidad por la DHT excede a la de testosterona. Las mutaciones genicas sencillas en seres humanos y en ratones conducen a la perdida de fijacihn tanto de testosterona como de DHT al receptor en varios tejidos, lo cual sugiere la intervención de una sola proteína. La diferencia en afinidad, acoplada con la capacidad de un tejido blanco para formar DHT a partir de testosterona, puede determinar cuáil complejo es activo: el de testosterona y receptor o el de DTH y receptor. La localizaci6n nuckar del complejo testosteronaDI-IT-receptor es un prerrequisito para la acción androgénica. La unibn del complejo receptor-esteroide a la cromatina puede requerir un paso previo de activación y la especificidad se debe al elemtnFo de respuesta a andrbgeno (cuadro 44-3). Recientemente,se ha hecho aparente queel complejo DHT-receptor se une con mayor afmidad al eIemento de respuesta a andrógeno que el complejo testosterona-
receptor. Ademas, esto puede explicar porque DHT es el androgeno más potente en algunos tejidos. Para concordar con otras hormonas estemides (y algunas peptidicas), es probable que el receptor de testosterona-DHT active genes especificas. Los productos proteinicos de éstos median muchos (si no todos) los efectos de la hormona. La testosterona estimula la sintesis de proteinas en los organos accesorios masculinos, efecto que amenudo se relaciona con un incremento en la acumulaci6n del RNA celular total, incluyendo mRNA,tRNA y rRNA. Un ejemplo mBs especifico comprende el efecto de la testosterona cobre la sintesis de la ARP. La hormona incrementa la velocidad de transcripción del gen de ABP, lo cual lleva a un aumento en la cantidad de mRNA que cifra para esta proteína. Otro ejemplo bien estudiado es Ea globulina alfalb la proteína principal de excrecihn en la orina de la rata macho. La velocidad de síntesis de la globulina alfa2, esta en proporcibn directa con la cantidad del mRNA afin, la cual a su vez es proporcional a la velocidad de transcripcibn del gen de la globulina alfaz,. Todoc son estimulados por andriigenos. El riRón es un tejido blanco principal para los andrógenos. Estas hormonas causan un crecimiento general del riñon e inducen la sintesis de cierto número de enzimas en varias especies. Los andrógenos estimulan también la replicacion de las cklulas en algunos tejidos blanco, efecto que ahn no se comprende del todo. Al parecer, testosterona a DHT, en combinacibn con E*, están implicadas en la extensa e incontrolable división de ctlulas de la prhstata, causando una hipertrofia prosthtica benigna, estado que afecta hasta 75% de varones mayores de 60 aiios de edad, En epoca reciente se han introducido inhibidores de la Salfa-reductasa en el tratamiento de este trastorno.
Hormonas de las ~ónadus* 67 1
masculino que carecen por completo de receptores funcionales, tienen tecticulos y producen testosterona, pero muestran feminización completa de los genitales externos (el llamado sindrome de feminización tcs-
LA FISIOPATOLOG~ADEL SISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO SE RELACIONA CON DEFECTOS HORMONALES
tkular).
La ausencia de síntesis de testosterona ce denomina hipogonadismo. Si se produce antes de la pubertad, las característicassexuales secundarias no se desarrollan y, si se presenta en la edad adulta, muchas de estas características sufren regresión. El hipoganadismo primario se debe a procesos que afectan directamente a los testiculos y causan insuficiencia testicular, en tanto que el hipogonadisrno secundario se debe a un defecto en la secreción de las gonadotropinas. Las deficiencias genéticas aisladas ayudan a establecer la importancia de etapas especificas en la biosintesis y de la accibn de los andrdgenos. La figura 50-4 representa la via utilizada en la accion androgénica de la biosintesis de la testosterona a través de acciones posreceptoras de la testosterona y de la DHT. Se han descrito por lo menos cinco defectos distintos en la biosintesis de latestosterona. Ademas se conoce la deficiencia de Salfa-reductasa. Hay varios ejemplos en los que no se identifica receptor de la testosterona-DHTo el receptor es anormal de algún modo; asimismo, existe cierto tipo de pacientes en los cuales todas las entidades medibles, incluyendo al receptor, son normales, pero presentan (siempre en los que genkticamente son varones) grados variables de feminízacibn. Las personas que carecen por completo de la actividad del receptor, al parecer son femeninas por su fenotipo, pero tienen un genotipo XY (masculino), en tanto que en los casos mlis leves pueden manifestar sólo una anormalidad localizada en la uretra peneal. Por otro lado, los individuos con genotipo
LOS OVARIOS PRODUCEN HORMONAS SEXUALES Y CÉLULAS GERMINALES FEMENINAS
La biosintesis y metabolismo de las hormonas ováricas son análogos a los de las hormonas masculinas Los estrógenos con una familia de hormonas sintetizadas en una variedad de tejidos. El 17beta-estradiol es el estrógeno primario de origen ovkico. En algunas especies, la estrona, que se sintetiza en numerosos tcjidos, es mfis abundante. Durante el embarazo, hay una produccion relativa mayor de estriol y proviene de la placenla. La via general y la localización subcelular de las enzimas que actiian en las primeras etapas de la sintesis de estradiol son las mismas que aquellas que estfin incluidas en la biosintesis de andrógenos. Las características únicas para e l ovario se resumen en la figura 50-5. Los estr6genos se forman por aromatizaci6n de los andrbgenos en un proceso complejo con tres hidroxilacíones, cada una de las cuales requiere 0 2 y NADPH. Se considera que el complejo enzimático are matasa incluye una oxidasa P450 de funcibn mixta. Si el sustrato para este complejo enzimático es testosterona, se forma esrradiol; en tanto que la estrona se debe a la aromatizaciiin de la androstenediona.
C~LUCA BLANCO
Deflclenclas enzlrnatlcas (1) Desdobtamiento de la cadena lateral (2) l7a-Hidroxilasa (3) Conversibn de C21 en Clg (4) Reduccibn de La 17-cetona (5) Oxrdaubn del anillaA a b4-3-cetosteroide
1 Deficlenua de Su-reductasa
1 Trastornos del rmptor
1 Resistencia positwa al reoeptor
Figura 50-4. Desarrollo d e la resistencia a andrbgenoc. Se muestran las cuatra etapas en las que se han identificado rnutauones. (T, testosterona; DHT, dihidrotestosterona;R, receptor d e androgenos.) (Modifimda y reproducida con autorización d e Wilson JD et al.. The endouine mntrol of male phenotypic developrnent. Aust J Biol Sci 2983;36.101.)
colesterol
-
Pregnenolona
1
ProgesZerona
-
17,-Hidroxipregnenolona
1
17~-Hidroxiprcgesterona
-
Deshidmepiandrostemna
1
Androstenediona
otrns metabolitos
Figura 50-5. Biosíntecis de estrógeno$. (Ligeramente modificada y reproducida con autoriracibn de Ganong W: Review of Medical Phys!oiogy, 17th ed Appleton 8 Lange, 1991; publicado por la Editorial El Manual Mcderno, MBxico )
Ha sido dificil develar la fuente celular de los diversos esteroides ovhricos, pero ahora se supone que esta implicada la transferencia de sustratos entre dos tipos de celulas. Las ctlulas de la teca son la fuente de la androstenediona y Pa testosterona, las cuales se convierten, por accion de la enzima aromatasa en las cdlu las de la granulosa, en estrona y estradiol, respectivamente. La progesterona es producida y secretada por el cuerpo lúteo, que tambikn sintetiza un poco de estradiol. En la aromatizaci6n perifkrica de los andrógenos se producen cantidades significativas de estrdgenos. En los varones, esta aromatizacidn petifdrica de testosterona a estradiol (E21 representa 80% del índice de producción del último. En las mujeres, los andrligenos suprarrenales son sustratos importantes, ya que hasta 50% del E2producido durante el embarazo proviene de la aromatizaci6n de andrbgenos. Por último, la conversilin de androstenediona en estrona es la fuente principal de estrógenos en mujeres posmenophusicas. La actividad de la aromatasa existe en
las celulas adiposas y tarnbitn en el hlgado, la piel y otros tejidos La actividad aumentada de ésta puede contribuir a la "estrogenización" que caracteriza a enfermedades como la cirrosis hephtica, el hipertiroidisme, obesidad y el envejecimiento.
Estrb~enOs y pr0gestinas se unen a proteínas ~lasmáticasde transporte Los estrdgenos se unen a la SHBG y las progestinas a la CBG. La SHBG se fija al estradiol con una avidez cinco veces menor que a la testosterona o a la DHT, pero la progesterona y cortisol tienen poca afinidad por esta proteina (cuadro 50-2), Por el contrario, la progesterona y el cortisol se unen casi con afinidad igual a la CBG, que a su vez tiene escasa avidez por el estradiol y menos aún por la testosteronh, la DHT o la estrona. Las proteínas fijadoras constituyen un reservorio circulante de la hormona y, debido a que su capacidad
Hormonas de las gbnadas 673
170-Estradiol
de fijación es relativamente grande, sirven de amortiguador contra cambios súbitos en la conceníracibn plasmatica. La velocidad de depuracion rnetabolica de estos esteroides esti en relacibn inversa con la afinidad de su unión con la SHBG; de aqui que la estrona se depure con más rapidez que el estradiol, el cual a su vez es depurado más rhpidamente que la testosterona o la DHT. A este respecto, los derivados conjugados de estas hormonas (véase despues) no se unen a la SHRG ni a la CBG. Los factores que regulan la producción de la SHBG se describen despuks. Hay algunas pruebas de la presencia de receptores especlficos en la superficie celular para SHBG (y CBG), pero su función no se ha establecido. No hay duda de que la hormona libre e5 biolbgicamente activa. La velocidad de secreción de los esteroides ovhricos varia de manera considerable durante el ciclo de menstniacidn (o estro) y se relaciona directamente con su índice de produccibn en el ovario. Estos compuestos no se almacenan, sino que se secretan conforme se producen.
Los estrógenos y las progestinas se metabolizan de manera activa en el hígado
A. Estrógenos El higado convierte el estradiol y la estrona en estriot por las vias que se muestran en la figura 50-5. El estradiol, la estrona y el estriol son sustratos para las enzirnas hepaticas que agregan fracciones de glucurdnido o de sulfato. La actividad de estas enzimas conjugantes varia entre las especies. Los roedores tienen tales sistemas enzimáticos metabólicos activos, que los estrogenos son, casi totalmente metabalizados en el hígado, por lo cual su actividad es practicamente nula cuando se administran por via oral. Estos sistemas enzimhticos son menos activos en los primates, de modo que los estrogenos por viaoral son más eficaces. Los esteroides conjugados son hidrosolubles y no se unen a las proteínas transportadoras; por ello, se excretan con facilidad en la bilis, en las heces y en la orina.
Progesterona
B. Pregestinas Debido a que el hígado metaboliza activamente a la progesterona hasta varios compuestos, esta hormona es ineficaz cuando se administra por via oral. El pregnanediol-20-glucurdnidosbdico es el metabolito principal de las progesíinas identificado en la orina humana (figura 5 0 4 ) . Ciertos estesoides sintéticos, por ejemplo, los derivados de la 17alfa-progesterona y los compuestos 1 7alfa-alquilo sustituidos de la 19nortestosterona, tienen actividad de progesterona y evitan el metabolismo hepatico. Por tanto, se utilizan de manera extensa como anticonceptivos orales.
LA MADURACI~NY CONSERVACI~N DEL APARATO REPRODUCTOR FEMENINO ES LA PRINCIPAL FUNCION DE LAS HORMONAS OVARICAS Estas hormonas preparan a los componentes estnichirales del aparato reproductor femenino (vkase después) para su actividad mediante: 1) maduración de las cklulas germinales primordiales; 2) desarrollo de los tejidos que permitirán la implantacihn del blastocito; 3 ) constituciiin del "ritmo hormonal'>para la ovulación; 4) establecimiento del medio requerido para sostener el embarazo, y 5) suminiseo de las influencias hormonales para e1 parto y la lactancia. Los esaiigenos estimulan el desarrollode los tejidos que intervienen en la reproduccibn. En general, estas hormonas aumentan el tamaiIo y número de cilulas al incrementar la velocidad de la síntesis de proteinas, r W A , tRNA, mRNA y DNA. Bajo el estímulo estrogdnico, el epitelio vagina1 prolifera y se diferencia; el endometrio uterino prolifera y las glAndulas sufren hipertrofia y alargamiento; el miometrio desarrolla una motilidad rítmica, intrinseca y los conductos marnarios se ramifican. El estradiol tiene también efectos anab6licos sobre los huesos y los cartilagos por lo que es promotor del crecimiento. Al actuar sobre los vasos sanguíneos periféricos, los estrbgenos de manera tlpica causan vasodilatacibn y disipación del calor.
674 * Bioquimica de Harper
Acetato
1
Coiesterol
Flgura 5 0 4 . Bioslntesis de progesterona y vía principal para su metabolismo. También se muestran otros metabolitos (Ligeramente modificada y reprcducida con autorización de Ganong WF: Review of Medic~lPhycielogy, 15th ed Appleton i% tange, 1995, publicado por la Editorral El Manual Moderno, MBxim.)
Las progestinas reducen la actividad proliferativa de los estrbgenos sobre el epiteliovaginal y convierten al epitelio uterino de proliferativo en secretor (aumentan el tamaño y funci6n de las glándulas secretoras e incrementan su contenido de glucbgeno), preparándolo para la implantacibn del óvulo fecundado. Las progestinas intensifican el desarrollo de las porciones acinares de [asglhndulas mamarias despues de que los estrogenos han estimulado el desarrollo de los conductos. Además, las progestinas reducen el flujo sanguíneo periferico, disminuyendo así la perdida de calar, de modo que la temperatura corporal tiende a
(Capítulo 30)
aumentar durante la fase lútea del ciclo menstrual. cuando se producen estos esteroides. Este maximo de la temperatura, usualmente 0.5 "C, se utiliza como un indicador de la ovulacion. En general, las progestinas requieren la presencia previa o concurrente de estrbgenoc, quizá debido a que éstos estimulan la produccihn del receptor para progesterona, A menudo, las dos clases de hormonas actúan de modo sinérgico, aunque pueden ser antagonistas. El numero de ooeonias en el ovario fetal humano alcanza un máximo de 6 a 7 rniljones aproximadamente al quinto mes de la gestacidn. Este se reduce a cerca de dos millones al nacimiento y para el comienzo de la menarca se ha reducido mas de 100 000 a 200 000. MAS o menos 400 a 500 de éstos se desarrollan hasta ser oocitos maduros; el resto se pierde gradualmente a través de un proceso desconocido, aunque es posible que intervengan los andrdgenos ovhricos. La maduracibn folicular comienza en la infancia v los ovarios crecen gradualmente en los arios anteriores a la pubertad; este proceso se debe al aumento en volumen de los foliculos causado por la proliferación de las células granulosas, a la acumulación del tejido de 30s foliculos atrksicos y al incremento de la masa de tejido estrbmico medular con las celulas intersticiales y tecales que producirh los esteroides. La concentracion de las hormonas sexuales es baja en la nifiez, aunque las gonadotropinas exógenas incrementan su produccihn; por tanto, e! ovario inrnaduro tiene la capacidad para sintetizar estrogenos. Se considera que estas bajas concentraciones de ecteroides sexuales inhiben la produccibn de gonadotropinas en las niAas prephberes, mientras que en la pubertad, el sistema hipotalámico-hipofisario se vuelve menos sensible a la supresión. En la pubertad la liberación intermitente de GnRH estimula la LH y esto produce un aumento notable de la síntesis de hormonas ováricas; la FSH, principal estlmulo para la cecrecion ectrogénica, activa al folículo para que madure y sobrevenga la ovulacibn.
El ciclo menstrual depende de una interacción compleja entre tres glándulas endocrinas Las hormonas determinan la frecuencia de la ovulacion y de la receptividad al apareamiento. Las especies monoestrales ovulan y se aparean una vez al afio, en tanto que las especies poliestralec repiten este ciclo v a r i a veces al aíío. Los primates tienen ciclos mensm a l e s con muda del endometrio al final de cada ciclo y la conducta de apareamiento no tiene relacidn estrecha con la ovulación. El ciclo menstrual humano es consecuencia de una interaccibn compleja entre hipotalamo, hipófisis y ovario. El ciclo normalmente varía entre 25 y 35 días de duración (promedio, 28 dias), Puede separarse en fase folicular, fase lútea y menstruacihn (figura 50-7).
Hormonas de las gcinada.7
1
1
Fa* folicular
Fase lútea
675
1
Temperatura corporal basal
36.4
[
17a-Hidroxi-
progesterona
Ing/mL)
1T-Hidroxiprogesterona
-,,.,'i\,.*'.
Progesterona
!
Progesterona (ng/mU
Gonadotropinas (rnUI) IRP-hMGlmL
Día del ciclo
Figura 50-7. Cambios hormonales y fisiolbgicos durante un ciclo menstrwal humano tipico. (M, menstruacibn, IRP-hMG, estándar internacianal de referencia para las gonadotropinas ) (Reprcduuda con autoriracibn de Midgley AR en: Hurnan Repmducfion. Hafer ESE, Evans TN [editoa]. Harper & Row, 1973.)
A. Fase falicular
B. Fase lútea
Por razones que no están claras, un foliculo particular comienza a crecer bajo la influencia general de la FSH. Las concentraciones de Ez son bajas durante la primera semana de la fase folicular, pero comienza a elevarse progresivamente conforme el foliculo crece. El E2 alcanza su concentración máxima 24 horas antes que se produzca la LH (FSH) y sensibiliza la hipbfisis a la GnRH. La LH es liberada en respuesta a esta concentracidn alta de E2 por un sistema de "retroalimentación positiva" o en respuesta a la declinaci6n súbita del Ezdesde este valor alto. La adminismci6n continua de dosis altas de estrbgeno (como en los anticonceptivos orales) suprime la liberación de LH y FSI-T e inhibe la acción de la G n W sobre la hipbfisis. Las concentraciones de progesterona son muy bajas durante la fase folicular. El maximo de LH anuncia el fin de esta fase y precede a la ovulación por un lapso de 16 a 18 horas.
Después de la ovulacibn, las células granrilosas del folículo roto se luteinizan y forman el cuerpo Iúteo, estructura que pronto comienza a producir progestesona y un poco de estradiol. Este ultimo llega al mimimo m8s o menos a la mitad de la fase lútea y entonces declina a un valor muy bajo. La hormona principal de esta fase es la progestersoa que (como se observó) es necesaria para la preparación y conservaci6n del endometrio secsetor que proporciona nutricion temprana al blastocisto implantado. Se requiere LH para la conservación temprana del cuerpo lUteo, por lo que la hipbfisis la suministra por 10 días aproximadamente. Si la implantación se produce (días 22 a 24 del ciclo promedio), esta funcibn de la LH es asumida por la gonadotropina coribnica (hCG), hormona placentarja anhloga a la LH, sintetizada por las ctlulas citotrofoblásticas del embri6n reciCn implantado. La hCG
676 Bioquím ica de Harper
estimula la síntesis de progesterona por el cuerpo Iúteo hasta que la placenta comienza a sintetizar cantidades de este esteroide. Sin la implantación (ni la hCG), el cuerpo lúteo sufre regresión y la menstruación sobreviene; después de la muda del endometrio, comienza un nuevo ciclo. La fase lútea tiene siempre 14 I2 días de duración. Las variaciones de duración del ciclo casi siempre se deben a un trastorno de la fase folicular.
El embarazo activa las hormonas
placentarias El blastocisto implantado forma el trofoblasto, el cual es a continuación organizado en la placenta. Este ultimo organo proporciona la conexión nutricional entre el embrión y la circulaci6n materna y produce algunas hormonas.
A. Gonadotropina corEOnica humana
La función bhsica de la hormona gtucoproteínica hCG (la similitud estructural de la hCG a la LH se describiá en el capítulo 45j consiste en respaldar al cuerpo Iúteo hasta que la placenta produce cantidades suficientes de progesterona para sostener el embarazo. La hCG puede detectarse a los pocos días de la implantaci0n, por lo que es la base de las pruebas de diagnbstico temprano del embarazo. Las concenmciones máximas de hCG se alcan7~npor la mitad del primer trimestre, después del cual hay una declinacibn gradual a lo Iargo del resto del embarazo. En la figura 50-8 se rnuesmn cambios en las concentraciones de hCG y de otras homonas durante el embarazo.
B. Progestinas El cuerpo lhteo es la fuente principal de progesterona
en las primeras 6 a 8 semanas del embarazo y entonces la placenta asume esta funcibn. El cuerpo lúteo continúa funcionando, pero al final del embarazo la placenta sintetiza 30 a 40 veces mhs progesterona que el cuerpo Iúteo. La placenta no puede sintetim colesterol, por lo que depende del aporte materno.
C. Estrógenos Las concentraciones plasmhticas de estradiol, estrona y estriol, aumentan gradualmente durante el embarazo. La concentracibn mayor corresponde al ectriol y su formación refleja varias funciones fetoplacentarias. La glandula suprarrenal del feto produce DHEA y sulfato de DHEA, que son convertidos en derivados léalfa-hidroxi por el hígado fetal. La placenta convierte estos derivados en estriol; viajan a través de la circulacion placentaria al hígado materno, donde con conjugados con glucurónidos y entonces son excre-
(Capítulo 50)
tados en la orina (figura 50-9). La medición de las concentraciones urinarias de estriol se emplea para obtener informacion sobre la funcihn de cierto número de procesos de la madre y el feto. Otro intercambiointeresantede sustratos es necesario para la produccibn del cortisol fetal. Las suprarrenales fetales expresan el complejo 3beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa isomerasa a concentraciones muy bajas y esta enzima es reprimida por el esrradiol, mismo que mantiene la enzima inactiva. Asi, las suprarenales dependen de la placenta para la progesterona que se requiere para la síntesis de cortisol (figura 50-9).
D. Lactdgenos placenfarios La placenta sintetiza una h o m o n a llamada lactdgeno placentario (PL). El PL se conoce también como somatomamotropina coriónica u hormona de crecimiento placentario debido a que tiene propiedades biológicas de la prolactina y de la homona del crecimiento. La relación genktica de estas hormonas se describib en el capítulo 45. La funcibn fisiolbgica del PL es incierta, puesto que las mujeres que carecen de esta hormona parecen tener embarazos normales y dar a luz niños normales.
Se desconoce lo que desencadena el parto El embarazo dura un nUmero predeterminado de dias para cada especie, pero se desconocen los factores causantes de su terminación. Aunque se sospechan influencias hormonales, no se han comprobado. Los estrogenos y las progestinas son las hormonas probables, puesto que afectan la contractilidad uterina y hay pruebas de que las catecolaminas intervienen en la induccibn del trabajo de parto. Puesto que la oxitocina estimula la contractilidad uterina, se utiliza para facilitar el nacimiento, pero no iniciad el trabajo de parto a menos que el embarazo estk a tkrmino. En ese momento hay 100 veces m65 receptores para la oxitocina en el utero que en el inicio del embarazo. El aumento de la concentración de estrbgenos al tkrmino, puede incrementar el número de receptores para la oxitocina (capitulo 45). Una vez que comienza el parto, el cuello uterino se dilata, iniciando un reflejo neural que estimula la liberacidn de oxitocina y, por consiguiente, una mayor contraccidn uterina. Los factores mecanicoc, como la cantidad de contracci6n o fuerza al músculo, pueden ser importantes. Con el parto se produce un cambio súbito y notable en el medio hormonal tanto de la madre como del recien nacido y las concentraciones plasrnhticas de progesterona (medida como pregnanediol) y de estriol disminuyen con rapidez después de la salida de la placenta (figura 50-8).
Hormonas de las gó~adas 677
E~crecibndiaria
O
70
140
210
280
Días del embarazo
Figura 50-8. Concentracionesde las hormonas durante un embarazo normal. (hCG, gonadotropina mriónica humana; hCS, cornatomamotropina coribnica humana.) (Datos de diversos autores. Reproducida con autoriuacibn de Ganong WF: Revrew of Medrcal Physiobgy, 13th ed. Appleton & Lange, 1987; publicado por la Editorial El Manual Moderno, Mexim.)
El desarrollo de la glándula marnaria es estimulada por el estradiol y la progesterana y la lactación por la prolactina La diferenciacidn y la funcibn de las glándulas marnarias son reguladas por la accidn combinada de varias hormonas. Las hormonas sexuales femeninas inician este proceso, pues los estrtigenos son causantes del crecimiento de conductos y las progestinas estimulan la proliferacion alveolar. Durante la pubertad el tejido glandular crece un poco, junto con el depbsito de tejido adiposo, pero el desarrollo extenso se produce durante el embarazo cuando e[ tejido glandular está expuesto a concenmciones altas de estradiol y progesterona. La diferenciacidn completa, estudiada basicamente en explantes de glándulas mamarias de rata, requiere la acción adicional de la prolactina,
glucocorticoides, la insulina o un peptido del crecimiento y de un factor serico no identificado. De estas hormonas, solo la concentración de prolactina cambia en forma notable en el embarazo; aumenta desde menos de 2 ngldL hasta más de 200 ngJdL al fin del proceso. Los efectos de estas hormonas sobre la síntesis de varias proteínas de la leche, incluyendo lactoalbúmina, lactoglobulina y caseína, han sido estudiados con detalle. Estas hormonas incrernentan la velocidad de síntesis de estas proteinas al aumentar la cantidad de los mRNA específicos y, en el caso de la caseína por 10 menos, esto se debe a un incremento en la tranccripcibn de genes y la estabilizncion del mRNA. La progesterona, necesaria para la diferenciacion alveolar, inhibe la produccidn de leche y la secrecibn al fin del embarazo. La lactancia comienza cuando las concentraciones de esta hormona disminuyen de manera abrupta después del nacimiento.
678 Bioquimica de Harper
(Capitulo 50)
FEíP
PIACENTA
MADRE
Hígado
Sulfato de DHEA
Estnol íE3)
DHEA Sulfato de DHEA
t 16a-Hidr0~1-
DHEA
Hígado
DHEA 4
16a-Hidroxrlasa 16n-Hidmxi-
DHEA
-A
Epglucurbnido
0 E~-$luwrbnidO en la onna
Figura 50-9. Metabolismo de esteroides realizado por la unidad feto-materna. (DHEA, deshidroepiandrosterona.)
Las concentraciones de prolactina tambikn caen con rapidez en el posparto, pero son estimuladas con cada episodio de succibn (capitulo 45), asegurando de este modo una secrecidn lictea continua. Esta disminuye gradualmente si no se permite la succión y puede ser suspendida con rapidez mediante la adrninistracion de una dosis parenteral grande de un andrógeno antes de permitir ta succidn. Ademas, la succibn conduce a la liberaci6n de oxitocina de la hipófisis posterior, la cual estimula la concentraci6n de las ckluias rnioepiteliales que rodean a los conductos alveolares, expeliendo asl la leche de la glándula. La regulación de la sintesis y secrecibn de oxitocina se describid en el capitulo 45.
La pérdida de la producciói de estrógeno ovárico completa la menopausia Las mujeres en el hemisferio occidental cesan de tener ciclos menstruales regulares aproximadamente a los 53 airos, coincidiendo con la pérdida de todos los follculos y de la funcidn ovhrica. N o existe una fuente alterna de progesterona, pero cantidades apreciables
de un estrógeno débil, la estrona, son producidas por la aromatización de androstenediona (figura 50-5). Las concentraciones de estrona no son suficientespara suprimir el contenido de gonadotropina de la hipofísis; por tanto. los aumentos notables de LH y FSH son característicos de los años posmenopáusicos. Es probabte que la GnRH también intervenga en el comienzo de la menopausia. Esto puede deberse a cambios en la concentración absoluta de la hormona o a alteraciones en la periodicidad de su secreción. Por ejemplo, los ovarios de ratas jóvenes, que tienen numerosos foliculos, no funcionan de manera adecuada en animales viejos. De igual modo, los ovarios extraidos de animales viejos reanudarhn cierta produccibn de Ea cuando se introducen en ratas ibvenes. Las mujeres despuds de-la menopausia tienen predisposiciiin particular a dos problemas vinculados al catabolismo tisular. La estrona no siempre es capaz de impedir la atrofia de los teiidos sexuales secundarios: en particular el epitelio de lac vías urinarias inferiores y ]a vagina, La osteoporosis ,=S un problema principal de salud en las mujeres de edad y las que presentan la disminucihn mas aguda de la masa bsea, tienen concentraciones de estrona menores de lo normal.
Hormonas de las acinadas 6 79
Los agonistas y antagonistas sintéticos estimulan o previenen La concepción e inhiben el desarrollo de tumores A. Estrógenos Varios compuestos sintllticos tienen actividad estrogénica y una o mhs caracteristicas farmacolbgicas favorables. La mayor parte de las modificaciones se han hecho para retardar el metaboiismo hepatico de modo que los compuestos puedan administrarse por vla oral. Uno de los primeros en ser sintetizado fue el dietilestilbectrol. Otros ejemplos de esteroides modificados incluyen e1 17alfa-etinilestradiol y al mestranol, utilizados como anticonceptivos orales.
El citrato de clomjfeno (Clomid) tiene una afinidad particular por el receptor de estrogenos en el hipotalamo. El clomifeno fue disefiado originalmente como anticonceptivo, pero tiene el efecto opuesto. E1 clornifeno compite con el estradiol por los sitios receptores hipotalamicos; así, no se restringe la liberación de la GnRH y hay secre~ionde cantidades excesivas de LH y FSH. Con frecuencia maduran varios foliculos de modo simuItáneo en respuesta al clomifeno y pueden producirse embarazos múltiples. La nafoxidina, compiiesto no esteroide y el tarnexifeno se combinan con el receptor de estrogenos para formar complejos muy estables con la cromatina, por tanto, el receptor no puede experimentar un nuevo ciclo y estos agentes inhiben la acci6n del estradiol por periodos prolongados. Los antagonistas se utilizan en el tratamiento del cfincer mamario, que depende de estrbgenos.
Citrato de clomifeno
Se han sintetizado numerosos compuestos con actividad antiestrogenica y varios tienen aplicaci6n clinica. La mayor parte de estos antagonistas actuan de manera competitiva con el estradiol por su receptor intracelular (vCase despues).
B. Progestinas Ha sido difícil sintetizar compuestos con actividad de progestinas y que no tengan acci6n estrogénica o androgknica. Los derivados l7alfa-aquilo sustituidos de la 19-nortestosterona (por ejemplo, noretindrona) tienen mínima actividad andrógena en la mayoria de las mujeres y se utilizan como anticonceptivos orales. Otra progestina potente es el acetato de medroxiprogestemna (Provera). La medroxiprogesterona inhibe la owlacidn por varios meses cuando se administra como inyeccibn intramuscular. No obstante, dado que las progestinas impiden la prolifemcibn celular, este compuesto se usa con mayor frecuencia para tratar carcinoma endometriai diferenciado.
tos estrógenos y las progestinas regulan la expresión génica
Mestranol
Estas hormonas actúan a través de su capacidad para combinarse con los receptores intracelulares, que entonces se unen a regiones especificas de la cromatina, del DNA o de ambos para efectuar cambios en la
genes adyacentes a los elementos de respuesta a hormona. El aumento (o disminucion) de la actividad de genes especificos altera las velocidades de síntesis de proteinas especificas. Esto desemboca por último, en la modificacion de las respuestas metab6licas. Son dignos de describir algunos puntos que pueden tener aplicación en el mecanismo de acci6n de otras hormonas:
Acetato de medroxiprogestemna
PH
Noretindrona
velocidad de transcripción de genes específicos. Se ha obtenido bastante información analizando la forma en que el estradiol y la progesterona estimulan la transcripción de los genes aviarios de las proteinas de la clara de huevo, en especial ovoalbúmina y conalbumina. La determinación del modo exacto en que estas hormonas activan la transcripcihn de genes est5 bajo investigación intensa.
Los receptores para estrógeno y progesterona forman parte de una familia de genes Las secuencias de los receptores para estrógenos (RE) y progestinas (RP) se han deducido mediante el análisis de las secuencias cDNA correspondientes. Estos receptores son parte de la familia gknica de receptores para esteroides y hormona tiroidea descrita en el capítulo 48. Como se mostr6 en la figura 44-3, cada receptor tiene varios dominios funcionales. Los esteroides se unen al sitio del ligando en la porcibn carboxilo terminal de la mol&cula receptora. Esto causa un cambio confonnacional que permite al receptor unirse a DNA. El dominio de fijacion a DNA del RE reconoce la secuencia AGGTCAmTGrLCT (el elemento de respuesta a estrogeno o ERE), en tanto que el dominio analogo en RP reconoce la secuencia GGTACANNNTGTTCT,PRE. La interaccibn receptor-DNA permite que varios dominios que activan trans en cada receptor influyan en la actividad de
1) Hay considerable interferencia entre los receptores de las hormonas sexuales. La progesterona se une a! receptor de androgenos, por lo que es un andrbgeno debil; algunos andrógenos se fijan al receptor de estrdgeno e imitan la acción de este ultimo en el utero. La inopecci6n de la figura 44-3 revela que existe una estrecha analogla en las secuencias centrales de los elementos de respuesta a hormonas. De este modo podria explicarse que algunas hormonas ejerzan acciones "entrecruzadas" en ciertos casos. 2) Los estrbgenos aumentan la concentración de sus propios receptores y los de la progesterona. 3) Al parecer la progesterona potencia la velocidad de recambio de su receptor. 4) Los llamados estrógenos débiles, como el estriot, actiian como estrógenos potentes cuando se administran con frecuencia.
PARTE DE LA F~SIOPATOLOG¡ADEL APARATO REPRODUCTOR FEMENINO SE RELACIOYA CON HORMONAS La descripción de todos los trastornos que afectan al aparato reproductor femenino esta más alla del campo de este capitulo, pero se mencionarán algunos padecimientos ilustrativos. El hipogonadismo primario se debe a procesos que implican directamente a los ovarios, por lo que causan deficiencia ovkica (ovulacibn disminuida, producción hormonal escasa o arnbas), en tanto que el hipogonadismo secundario se debe a la ptrdida de la funci6n gonadotrópica de la hipófisis. La disgenesis gonada! (sindrome de Turner) es un trastorno genCtico relativamente frecuente en el cual los individuas tienen un cariotipo XO, genitales femeninos internos y externos, varias anormalidades del desarrollo y pubertad retardada. Varios cindromes se relacionan con la presencia de cantidades anormales de hormonas. El más frecuente es el sindrome de ovario poliquístico (síndrome de Stein-Leventhal), en el cual la sobreproducción de androgenos produce hirsutismo, obesidad, menstniacihn irregular y trastornos de la fertilidad. Los poco frecuentes tumores d e las cklulas de Leydig y el arrenoblastoma producen testosterona; los tumores de células granulosas y tecales producen
Hormonas de !a7gcinada.7
estrbgenoc y los restos suprarrenales Intraováricos producen cortisol. El tejido trofoblistico persistente conduce a la mala hidatiforme benigna o a una transfomaci6n maligna de ésta, el coriocarcinoma; a m h s producen cantidades enormes de hCG. La radioinmunovalor;ici6n de la hCG es una prueba de diagndstico para estas peligrosas situaciones y tambidn pueden utilizarse para verificar la eficiencia del tratamiento.
RESUMEN Las gonadas producen células germinales y hormonas sexuales. Estas dos funciones tienen una aproximación geográfica necesaria (espematogdnesic y producci6n de testosterona en los testículos y oogdnesis y produccibn de estradiol en el ovario), debido a que la maduracion de las celulas germinales requiere una concentraci6n local alta de la hormona sexual respectiva. La LH se une a su receptor de superficie en las cklutas de Leydig (testiculoc) y las celulas granulosas y tecales (ovario). E! incremento resultante de cAMP conduce de nuevo al desprendimiento de la cadena lateral del colesterol, como en el caso de la corteza suprarrenal, el paso limitante de la velocidad en la esteroidog&nesis. Una serie de reacciones enzimhti-
68 I
cas, en particular la catalizada por 3beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa, llevan a la produccion de testosterona en los testiculos. Una cantidad pequeña de testosterona es convertida por la enzima aromatasa en esíradiol. Esta seaccibn es mucho más vigorosa en el ovario, en donde el estradiol es la hormona principal producida durante la fase folicular del ciclo mensnial. Despuks que se produce la ovulacibn, las células foliculares sintetizan progesterona, que ahora constítuye el cuerpo luteo. La progesterona es la hormona principal para la sustentacibn del embarazo. Inicialmente. se fonna en et cuerno liiteo baio la influencia de LH hipofisaria y más adeiantepor ~ C de G la placenta. DespriCs del segundo mes del embarazo, la placenta produce progesterona de manera directa. La intempción de la sintesic o de la acción de Ia progesterona causa el cese del embarazo. Las hormonas sexuales, como miembros de la familia esteroideltiroidelretinoide, actúan mediante el enlace con sus receptores afínes en las cklulas blanco. Los complejos ligando-receptor se unen al elemento de respuesta a andrógeno, estrógeno o progesterona en el promotor de los genes correspondientes. El resultado es un incremento (o reducción) de la actividad de los mismos. De esta manera, se modifican numerosos procesos rnetabblicos, de crecimiento y reproductivos. M
REFERENCIAS Adler AJ, Danielsen M, Robins DM: Androgen-specifíc
gene activaiion via a consensus glucocorticoid response element is determined by interaction with nonr e c e p t o r f a c t o r s P r o c N a t l Acad Sci U S A 1992;89:13660. Chaag C et al.: Structural analysis of complementaty DNA and m i n o acid sequenccs of human and rat androgcn receptos. Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:7211. Creen S et al.: Human estrogen receptor DNA: Sequence, expression and homology to V-erb-A. Nature 1986;320: 134. Hall PF: Testiculw hormones: Synthesis and control. In: Endocrinology,vol 3. DeGroot LJ (editor). Grunc & Stratton, 1979. Huggins C: Two principlcs in endocrine therapy of cancer: Hormone deprival and homone interference. Cancer Res 1965;25:1163.
McEwen RS: Steruid hormones are multifunctional messengers to the brain. Trends Endrocrinol Metnb 1991;2:62. O'Malley RW: Steroid hormone action in eucaryotic cells. J Clin lnvest 1984;74.307. Siiteri PK, Febres F: Ovarian hormone synthesic. circulation and mechanisms of action. In: Endocrinolom, vol 3. DeGroot LJ (editor). Gnine & Stratton, 1979. Toft D, Gorski J : k receptor molecule for estrogens. Proc Natl Acad Sci USA 1966;55:1574. Wilson J: Metabolism of testicular androgens. ln: Handbook ofEndocrinology. Section 7: Endocrinology, vol S : Male Reproductive System. Hamilton DW, Greep RP (editors). American Physiological Society, Washington DC, 1975. Wilson J D et al.: The endocrine control ofmale phenotypic dcveloprnent. Aus J Biol Sci 1983;36: 10 1.
Hormonas de páncreas y Daryl K. Granner, MD
El páncreas consiste en dos órganos diferentes dentro de una estructura. La porción acinar del phncreas tiene una funcion exocrina, que secreta al lumen duodenal las enzimas y los iones utili7ados en el proceso digestivo. La porcibn endocrina está formada por los islotes de Langerhans. Los 1 a 2 millones de islotes del piincreas humano representan 1 a 2% de su peso y son colecciones de varios tipos de células que se enumeran en el cuadro 5 1-1. Los islotes pancreaticos secretan por lo menos cuatro hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y pol ipéptido pancrektico. Las hormonas se likran dentro de la vena pancreática, que vacía en la vena porta, en una disposición conveniente, puesto que el hígado es el principal sitio de acci6n de la insulina y el glucagon. Estas dos hormonas inteniienen principalmente en la regulación del metabolismo de los carbohidratos, pero afectan a otros muchos procesos. La somatostatina, identificada primero en el hipotálamo como la hormona que inhibe la secrecibn de la hormona de crecimiento, existe en concentracion mQs alta en los islotes pancrehticos que en el hipotálamo, e interviene en la regulacion 3mal de la secrecibn de insulina y glucagbn. El polipkptido afecta la secrecion gastrointestinal. Las vias gastrointestinales secretan numerosas hormonas, quih más que ningún &gano solo. El propósito del sistema gastrointestinal es impulsar los alimentos a los sitios de digestibn, proporcionar el medio apropiado (enzimas, pH, sales, etcktera) para el proceso digestivo y mover los productos digeridos a través de la mucosa intestinal hasta las cklulas de la mucosa y de ahi al espaci'o extracelular; llevarlos a células distantes por medio de la circulacibn y expulsar los productos de desecho. Las hormonas gastrointestinales colaboran en todas estas funciones.
Hormona adrenocorlicotrópica CK Colecistocinina SNlD Diabetes sacarina no insulinodependiente SID Diabetes sacarina insulinodependiente GF Factor d e crecimiento epidbrmico GF Fador d e crecimiento fibroblástico IP Polipeptido inhibidor gástrico CTH
DL DGF
Lipoproteinas d e baja densidad Factor de crecimiento derivado d e pla-
EPCK Fosfoenolpíruvato carboxicjnasa
IP
Prostaglandina F2a Polipéptido pancregtico Polipéptido intestinal vasoactivo
LDL
Lipoproteinas d e muy baja densidad
GF2a
P
IMPORTANCIA B~OMEDICA La insulina es en muchos sentidos la hormona peptidica modelo y fue la primera en ser purificada, cristalizada y sintetizada por tkcnicas quimicas y de biologia molecular. Los estudios de su biosíntesis condujeron al importante concepto del propiptido. La insulina tiene importantes implicaciones médicas. En los países en desarrollo la incidencia de diabetes es de
684 * Bioquim ica de Harper
(Capitulo j1)
f i * k i ~ p o51-1: Tipos celulares en los islotes
1
1 ipo ceiu
:
Ay
"
A
Hormona proaucida
-
Cilucagiin
-
I nsulina
---
.
,
Somatostatina
Huellas
Polipeptido pancrekico
5% y una cifra igual es susceptible de desarrollar Ia enfermedad. La diabetes sacarina se debe a la acción insuficiente de la insulina, ya sea por su carencia o por la resistencia a su accibn. El glucagdn, que actiia sin oposición, agrava esta enfermedad. Se han descrito sindromes patolbgicos debido a produccibn excesiva de varias hormonas gastrointestinales. Signos y síntomas,a menudo se observan en muchos sistemas orghicos y el diagnbstico preciso puede ser dificil a menos que el mkdico tenga conocimiento de estos sindromes. Las hormonas gastrointestinales interesan aqui debido a su estrecho nexo con los neuropdptidos.
LAS HORMONAS PANCREATICAS SON IMSULINA, GLUCAGON, SOMATOSTATINA Y POLIPÉPTIDO PANCREATICO La insulina se vinculó con la diabetes en 9921 Langerhans identificd los islotes en la ddcada de 1860 pero no comprendi6 su función, tampoco von Mering y Minkowski, quienes demostraron en EX89 que la pancreatectomía produce diabetes. El enlace entre los islotes y la diabetes fue sugerido por de Mayer en 1909 y
Cadena A
por Sharpey y Schaffer en 1917, pero fueron Banting y Best los que probaron esta relaci6n en 1921. Estos investigadores usaron acido-etanol para extraer del tejido un factor de las células de los islotes que tenia potente actividad hipoglucémica. El factor se bautiza como insutina y pronto aprendieron que los islotes de bovino y porcino contienen insulina que es activa en el ser humano. En el transcurso de un ar70, la insulina estuvo disponible para uso extenso en el tratamiento de la diabetes y prob6 que salvaba vidas. Al haber grandes cantidades de insulina bovina y porcina para estudio, se produjo un efecto espectacular en la investigacibn biomtdica. La insulina fue la primera proteína en que se comprueba la existencia de la accion hormonal, la primera proteína cristalizada (Abel, 1926), la primera proteína en que se determina la secuencia de arninoacidos (Sanger y colaboradores, 1955), la primera proteina sintetizada por técnicas químicas (Du y colaboradores; Zahn; Katsoyanis; alrededor de 19641, la primera proteina en que se demuestra su síntesis como una molecula precursora m k larga (Steiner y colaboradores, 1967)y la primera proteina preparada para uso comercial mediante la tecnología del DNA recombinante. A pesar de esta impresionante lista de '"rimeros", se sabe menos de la forma en que la insulina actúa a nivel molecular que de muchas otras hormonas.
La insulina es un polipeptido heterodirnerico La insuIina es un polipéptida constituido por dos cadenas, A y B, enlazadas por dos puentes disulfuro intercatenarios que conectan A7 a BT y A20 a B19. Un tercer puente disulfuro intracatenario conecta los residuos 6 y 11 de la cadena A. La ubicacibn de estos tres puentes disulhro es invariable y las cadenas A y B tienen 2 1 y 30 arninohcidos, respectivamente, en casi todas las especies. La estructura covalente de la insulina humana (masa molecular 5.734 kDa) se ilustra en la figura 5 1-1 y una comparacion de las sustitucio-
rS--"l 1
Gly-Ile -Val - ~ l u - ~ ~ n + ~ y s - ~ y s - ~Ile h r--~%y rs-- s e r - ~ e u - ~ y r - ~ l n - ~ e u - G I U - ~ s n - ~ v r - ~ y s - ~ r n 1 2 3 4 5 6 B 9 11) 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Cadena B
S
I
:
he-Val-Asn-Gln-His -Leu-Cva-GIv-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr -Leu-Val -Cys-Gly-Glu-Arg-G1y-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys+Thf 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ?O 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Figura 51-1. Estructura covalente de la insulina humana. (Reproducida con autorización de Ganong WF: Review of Medwl Pbysiology, 15th ed Appleton & Lange, 1997;publicado por la Editorial El Manual Moderno, Mbxico.)
Hormonas de aúncreas v vías ~asrrointestinules 685
nes de aminoAcidos en diversas especies se presenta en el cuadro 51-2. Las sustituciones existen en muchas posiciones dentro de las dos cadenas sin afectar su bioactividad y son mhs comunes en las posiciones 8, 9 y 10 de la cadena A. Por tanto, esta región no es decisiva para la actividad biolbgica. Sin embargo, varias posiciones y regiones tienen un alto grado de conservaci6n, incluso: 1 } las posiciones de los tres enlaces disulfuro, 2) los residuos hidrofdbicos en la regi6n carboxilo terminal de la cadena B y 3) las regiones m i n o y carboxilo terminales de la cadena A. La modificacibn o sustitución quimica de aminohcidos especificas en estas regiones ha permitido a los investigadores formular una regibn compuesta activa (figura 5 1-2). La región hidrofóbica carboxilo terminal de la cadena B interviene además en la dimerkacidn de la insulina.
Hay una gran analogía entre insulinas humana, porcina y bovina La insulina porcina difiere en un soto aminobcido, una alanina por treonina en B30, en tanto que la insulina bovina tiene esta modificacion más las sustituciones de alanina por treonina en A8 y valina por isoleucina en A 10 (cuadro 5 1-21, Estas modificaciones no significan un cambio apreciable en 1a actividad biolbgica y una diferencia antigénica muy escasa. Aunque todos los pacientes a los que se administra insulina heterdoga desarrollan titulos bajos de anticuerpos circulantes contra la molécula, pocos muestran títulos clínicamente importantes. Las insulinas porcina y bovina fueron la terapkutica esthndar para la diabetes sacarina hasta que se produjo insulina humana por la tecnologia del DNA recombinante. A pesar de la ex-
-
A
51-2. V ariaciones de la estructura insulina t:n especies de mamíferos * - .- .. -. . - - - - . --... . . ..- - - - T-Variaciones con xelacilin a la O
. .
cuencia hi
Posici6nen
cadena A S 9 10
tspec
aminoacidos sicián en la :adena B
-30 Tre Ala
Zonejo ;anado
Tre-Ser-lle Ala-Ser-Vr
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modificad^
.,
Ala-Gli-VL Tre-Gli-IIe Ala-Ser-Tr ,,,;ido
con autorizacibn d,
-
NF: Revieur of ,Wedicol PkyJiologv, 15th ed. Appleton & Lange, 1991; publicado por l a Editorial El Manud Moderno, Mtxico. ?
n.,,
Cadena A
Figura 51-2. Regibn de la rnol&cula de ~nsulinarequerida para la adividad biolbgica. Estructura esquemática de la insulina, seglin se determinb por cristalografía con rayos X El 6rea sombreada ilustra la porcibn de inculina que se w n sidera es la mas importante para conferir actividad biológica a la hormona. Los residuos Fen 824 y 825 con los sitios de mutaciones que afectan la bioactividad de la insulina Los extremos amino de las cadenas A y Bde la rnsulina se indican por 0 ,en tanto que los extremos carboxilo lo son por (Redibulada y reproducida con autorización de Tager HS. Abnormal products of the human insulin gene. Diabetes 1 984,33693 )
0.
tensa variación en la estnictura primaria, la actividad biológica es de aproximadamente 25 a 30 Ultmg de peso seco para todas las insulinas. La insulina forma estructuras complejas muy interesantes. El cinc existe en concentración alta en la cklula B y foma complejos con la insulina y la proinsulina. La insulina de todas las especies de vertebrados forma dimeros isólogos por medio de puentes de hidrdgeno entre los grupos peptldicoc de los residuos B24 y B26 de dos rnonbmeros y en concentraciones altas Cstos se organizan como hexheros, cada uno con dos htomos de cinc. Esta estructura de orden superior ha hecho factibles los estudios de la estructura cristalizada de la insulina. A conceniraciones TlsioIOgicas es probable que la insulina este como monómero.
La insulina se sintetiza como preprohormona
Ser
Ala
cabra Camero Caballo
n-
La insulina se sintetiza como una preprohormona (masa molecular aproximada de 1 1 500) y es el prototipo de gptidos que se procesan a partir de moldculas precursoras m i s grandes. La secuencia hidrbfoba de 23 aminoácidos pre o secuencia lider, dirige a la
ti86 Bioqziímicu de Harper
m o l ~ c u l ahacia el interior de las cisternas del reticulo endopthsmico y entonces se elimina. Esto produce la m o l ~ c u l ade proinsulina con peso molecular de 9000 que proporciona !a conformaci6n necesaria para formar los puentes disulfum apropiados. Como se muestra en la figura 5 1-3, el ordenamiento de la proinsulina, a partir del extremo arnino es: la cadena B-pdptido conector (C)-cadena A. La molecula de proinsulina experimenta una serie de divisiones peptidicas especificas de sitio que conducen a la formacibn de cantidades equimolares de insulina madura y de péptido C. Estas divisiones enzimaticas se resumen en la figura 5 1-3.
Otras hormonas de las ~ 6 l u l a sde los islotes también se sintetizan como moléculas precursoras La sintesis de éstas, también requiere el procesamiento enzimático postraduccional de las moEéculas precursoras de alto peso molecular. Las estructuras diagrarn6ticas del poliptptido pancreático, glucagón y de la somatostatina se comparan con la de insulina en la figura 5 1 4 . Intervienen varias combinaciones
(Capitulo 51)
de escision endoproteolitica (análogo a tripsina) y exoproteolitica (semejante a la de carboxipeptidasa R), ya que la secuencia de la hormona puede estar ubicada en el extremo carboxilo del precursor (somatostatina), en el extremo amino (polipdptido pancreático), en ambos extremos (insulina) o en la parte media (glucagbn).
La síntesis de insulina y la formación de gránulos ocurren en organelos subcelulares La proinsuhna se sintetimpor los ribcomas en el retículo endoplbmico rugoso y la eliminaci6n entimhtica del péptido guía (segmento pre), ta formacibn de los puentes disulfiro y el plegamiento (figura 5 1-3) ocurren en las cisternas de este organelo. La molécula de proinsulina se transporta al aparato de Golgi donde tienen lugar la proteolisis y el empaquetamiento en gránulos secretorios. Los grfinuloc continúan su maduracion en tanto que atraviesan el citoplasma hacia la membrana plasmatica. Tanto la proinsulina como la insulina se combinan con cinc para formar h e x h e r o s , peso dado que aproximadamente 95% de la proinsulina se convierte a insulina, son los cristales
Figura 51-3. Estructura de la proinsulina humana. Las moléculas de inculina y del Mptido C e ~ conectadas n en dos sitios por enlaces dipeptídicos. Una escisibn inicial por una enzima análoga a tripsina (flechas vacías) seguida por particiones por una enzima semejante a carboxipeptidasa (flechas sblidas) conduce a la produccibn de la rnoI8cuia heterodimérica (AB) de insulina y el pkptido C.
Hormonas de páncreas y vías gasrrointestinales 687
Somatostatina
Flgura 5 1 4 . Estrucluras ecquem8ticas de los precursores para los cuatro productos principales de las células endocnnas del islote pancrehtrco. Las porciones de los precursores que corresponden a las hormonas mencionadas se indican con barras gruesas, en tanto que las porciones que corres ponden a las extensiones peptidicas lo con por Iineas, los residuos de arninohcidos dibhsicos (arginina y Iisina) que corresponden a los sitios de convercidn del precursor se muestran con circulos negros. Nbtese que la proinsulina esth dibujada en una forma extendida que no muestra los puentes disutfuro; la estructura ilustrada de la proinsulina tiene la secuencia: cadena B-péptido C-cadena A. (Redibujada y reproducida con autorización de Tager HS: Abnormal products of the hurnan insulin gene. Diabetes 1984i33.693 )
de esta última los que confieren sus características morfoE6gicas a los grhnulos. Dentro de éstos hay cantidades equimolares del peptido C, pero estas moléculas no forman una estructura cristalina. Con el estímulo apropiado (vdase adelante), los grhnulos maduros se fusionan con la membrana plasmfitica y descargan su contenido en el Iiquido extracetular por emiocitosfs.
análisis para la "insulina" puede en ocasiones sobreestimar la bioactividad de la "inculina'~1asmatica. El pkptido C no tiene actividad bioIOgica conocida. En el aspecto antigenico es lrna molCcula distinta. Por tanto, los inmunoanálisis del péptido C pueden distinguir a la insulina de secrecíon endbgena de la administrada por vía exogena y cuantificar a la primera cuando los anticuerpos antiinsulína no permiten la medicion directa de la insulina. Los péptidos C de diferentes especies tienen una tasa elevada de sustitucibn de aminoticidos, observación que enfatiza el enunciado de que es probable que este fragmento no tenga actividad biológica.
Los peptidos relacionados con insulina tienen precursores El ordenamiento estructural de la mol&culaprecursora no es unico para la insulina; hormonas peptidicas estrechamente relacionadas (relaxina y los factores de crecimiento anrilogos a la insulina) lo muestran tamb i h (figura 5 1-51. Todas estas hormonas tienen gran hornologia en los extremos amino y carboxilo de las cadenas B y A de una rnolkcula precursora y éstas se unen por un segmento conector. En los precursores peptídicos de relaxina e insulina, este segmento conector está unido por ambos extremos con dos aminoacidos
Relanina
Las propiedades de la proinsulina y del péptido C difieren de las de inculina La proinsulina varla en longitud de 78 a, 86 aminohcidos, la variacidn en longitud se presenta en la región del péptido C. Laproinsulina tiene la misma solubilidad y el mismo punto isoelCctnco que la insulina; tambien forma hexámeros con los cristales de cinc y reacciona fuertemente con los antisueros para insulina. La proinsulina tiene menos de 5% de la bioactividad de la insulina, lo cual indica que la mayor parte del sitio activo de esta. última está ocluido en la moldcula precursom. Algo de proinsulina se libera con la insulina y en ciertas condiciones (tumores de células de los islotes) en cantidades mayores de lo comirn. Puesto que la vida media plasmhtica de la proinsulina es significativamente mis larga que la de la insulina y dado que la proinsulina tiene una fuerte reaccion cruzada con los sueros antiinsulina, un radioinmuno-
Flgura 5 1 3 . Estniburas diagramáticas de los precursores para los pbptidos relacionados w n la insulina. Las regiones homblogas de relaxina, insulina y el factor da crecimiento semejante a la insulina (IGF) se muestran como barras s6lidas. Las secuencias de arninoAcidos que mnectan la cadena B y la cadena A en los precursores de relaxina e insulina se muestran w n barras vacías; estas secuencias se retiran durante el procesamiento de los precursores a sus productos correspondientesde dos cadenas (flechas verticales). La secuencia de aminoacidos del factor de uecimiento semejante a la insulina que corresponde a estas cadenas peptidicas, pero que na se elimina por los fenómenos proteolitims de procesamiento, se muestra con una barra punteada;el fado?de crecimiento a la insulinaes una hormona peptidica de cadena sencilla, (Redibujada y repraduuda con aulorizacibn de Tager HS: Abnormal products of the human insulin gene. Diabetes 1984;33:695.)
688 * Bioquímica de Hurper
bhsicos. Despubs de que las cadenas A y B se enlazan con los puentes disulfuro, esta pieza se remueve por una acci6n endoproteolitica y estas mol&culasse convierten en hormonas peptídicas de dos cadenas. Los factores de crecimiento analogos a la insulina, aunque con elevada hornologia a la insulina y a la relaxina en su estructura primaria, carecen de estos sitios dibásicos de separación y por tanto se conservan como hormonas peptidicas de una sola cadena.
Se conoce el gen de la insulina humana Este gen se ubica (figura 5 14)en el brazo corto del cromosoma 11. La mayor parte de los mamiferos expresan un gen unico para insulina semejante en organi7acibn al gen humano, pero las ratas y los ratones tienen dos genes no alélicos. Cada uno codifica para una proinsulina única, que se procesa en dos moléculas distintas de insulina activa. La síntesis de insulina humana en sistemas bacterianos de expresidn, mediante la tecnología del DNA recombinante, proporciona una fuente excelente de esta hormona para personas diabkticas.
La secreción de la insulina se regula con precisión El páncreas humano secreta 40 a 50 unidades de insulina al dla, que representan aproximadamente 1S a 20% de la hormona almacenada en la glhndula. La secreciiin de insulina es un proceso que requiere energia en el que interviene el sistema de rnicrotiibulos y microfílamentos en las ctlulas B de los islotes. Cierto numero de mediadores se implican en la liberacihn de insulina.
(Capitulo 51)
A. Glucosa El regulador fisiológico m6s importante de la secreción de insulina es el aumento en la concentracion de glucosa plasmatica. El umbral de esta concentracion para la secreción es el valor de la glucosa plasmática en ayuno (S0 a 100 rngldl) y la respuesta máxima se obtiene a concentraciones de 300 a 500 mg/dL. Se proponen dos mecanismos diferentes para explicar cómo regula la glucosa la secreción de insulina. Una hipotesis sugiere que la glucosa se combina con un receptor, posiblemente localizado sobre la membrana de la cklnla B, que activa el mecanismo de liberacion. La segunda hipótesis indica que intervienen los metabolitoc intracelulares o su velocidad de flujo a travks de una vía metabiilica como la derivación de Ia pentosa fosfato, el ciclo del hcido citrico o la vía glucolítica. Hay pruebas experimentales que apoyan a las dos posiciones.
B. Factores hormonales Numerosas hormonas afectan la libemcibn de insulina. Los agonistas alfa adrenérgicos, principalmente la adrenalina, inhiben la liberacibn de insulina aun cuando este proceso se haya estimulado con glucosa. Los agonistas beta adrenérgicos estimulan la liberacion de la insulina, probablemente al incrementar el cAMP (véase adelante). La exposición crónica a concentraciones altas de hormona del crecimiento, cortisol, lactbgeno placentario, estrbgenos y progestinas, también incrementa la secrecion de insulina. Por tanto, no debe sorprender que la secrecidn de insulina aumente notablemente durante las irltimas etapas de1 embarazo.
C. Agentes farmacologicos
Figura 5 1 4 . 'Estructuradiagramhtica del gen de la insulina
Muchos medicamentos estimulan la secrecion de insulina, pero los de uso m6s frecuente en terapiutica para los humanos son los compuestos de la sulfonilurea. Los f h a c o s como la tolbutamida estimulan la liberacibn de insulina por un mecanismo diferente al utilizado por la glucosa y han logrado un uso amplio en el tratamiento de la diabetes sacarina tipo FT (no insulinodependienze). Con base en células B pancrehticas, en fecha reciente se clonó un receptor que enlaza estos fArrnacos.
humana. Las Breas con líneas diagonales corresponden a las regiones no traducidas del mRUA correspondiente; las regiones abfertas corresponden a las secuencias intercaladas y las regiones punteadas corresponden a las secuencias codificadoras. L, 6, C y A son secuencias codificadas para el pbptido guía (o sehal), la cadena B insulinba, el pbptido C y la cadena A de la insulina, respectivamente. Nbtese que la secuencia codificada para el peptido C est8 dividida por una secuencia intercalada. La estructura estl dibulada a escata. (Redibujada y reproductda con autorizacibn de Tager HS: Abnorrnal products ofthe human insulin gene. Diabetes 1984;33:693)
Tolbutamida
Hormonas de pdncreas y vias gustroinlesfi~rules 689
La insulina se metabolira con rapidez A1 contrario de los factores de crecimiento análogos a ella, la insulina no tiene proteína plasmhtica portadora; por tanto, bajo condiciones normales su vida media plasmática es menor de 3 a 5 minuta. Los principales brganos que intervienen en el metabolismo de la insulina son d hígado, los riiíones y la placenta; aproximadamente 50% de la insulina se elimina en un solo paso a travks del hlgado. Los mecanismos responsables del metabolismo de la insulina están gobernados por dos sistemas enzimáticoc. El primero comprende a una proteasa específica de insulina que se encuentra en numerosos tejidos pero en mayor concentración en los órganos antes mencionados. Esta proteasa se ha purificado a partir del músculo esquelético y se sabe que depende de radicales sulfihidrilo y es activa a pH físiológico. El segundo mecanismo comprende a una glutatióninsulina transhidrogenasa hephtica. Esta enzima reduce los enlaces disulfuro y entonces las cadenas A y B individuales se degradan con rapidez. No está claro cual de estos mecanismos es más activo bajo condiciones fisiologicas, tampoco si uno y otro proceso tiene algún sistema de regulacidn.
Deficiencia de insulina
La funci6n central de la insulina en el metabolismo de los carbohidratos, lípidos y proteínas se pueden apreciar mejor mediante et análisis de las consecuencias de su deficiencia en los humanos. La manifectacidn principal de la diabetes sacarina es la hiperglucemia, que se produce por: 1) reduccibn de la entrada de glucosa a las celulas, 2) utilizacibn disminuida de la glucosa por varios tejidos y 3) aumento de la producción de glucosa (gluconeogénesis) por el hígado (figura 5 1-7). Adelante se describir&cada uno de ellos con detalle.
+
A. Efectos sobre el transporte de membrana
Deficiencia de insulina (y exceso de giucagbn)
+
f
Captacibn Aumento en Catabolismo disminuida la produwbn proteínico aumentado de glucosa de glucOSa
Y \ +
Los síntomas principales de la deficiencia de insulina son poliuria, polidipsia y pérdida de peso a pesar de una ingestibn calórica adecuada. icorno se explica esto? El valor de Ia glucosa plasmática rara vez excede de 120 mg/dL en el humano nomal, pero se encuentran de manera constante concentraciones mucho mas altas en personas con acción deficiente de insulina. Despuds de que la glucosa pIasmAtice llega a cierto valor (por lo general > 80 rngídL en el ser Iiumano), se excede la capacidad mhxima de resorcibn de glucosa en el twbulo renal y esta se excreta en la orina (glucosuria). El volumen de orina aumenta debido a la diuresis osmbzica y la pkrdida concomitante y obligatoria de agua (poliuria) la que lleva a deshidratación (hiperosmolaridad), aumento de sed e ingestibn excesiva de agua (polidipsia). La glucosuria produce una perdida sustancial de calorías (4. E kcat por cada gramo de glucosa que se excreta); cuando esta pérdida se junta con la ptrdida de tejido muscular y adiposo resulta en una pérdida de peso severa, a pesar del aumento en el apetito (polifagia) y una ingestihn calbrica normal o aumentada. En ausencia de insulina la síntesis proteinica disminuye, en parte por la disminucibn del transporte de arninoacidos al interior del musculo (los aminoácidos sirven como sustratos de la gluconeogénesis}. Por tanto, las personas insulinodeficientes presentan balance nitrogenado negativo. Se pierde la accibn antilipolitica de la insulina, al igual que su efecto Iipogknico, de ahi que aumente la concentración plasmática de hcidos grasos. Cuando se excede la capacidad del higado para oxidar los acidos grasos a Cozse acumulan los &cidos beta hidroxibutirico y acetoacktico (cetosis). Al inicio el organismo compensa la acumulación de estos acidos orginicos con un aumento de la perdida respiratoria de COI,pero si no se corta el ciclo mediante la administración de insulina, sobreviene una acidosis metabhlica severa y el paciente fallece por coma diabético. La fisiopatología de la deficiencia de insulina se resume en la figura 5 1-7.
t
Hiperglucemia, Aminoácidos p l a ~ m d t i ~AGL s plasm~ticos elevados. glucosuna, elevados. @rdida cetogknesis, diuresis osmótica, de nitrógeno cetonuna, deplecidn eledmlitica en la orina cetonemla
Deshidrataubn, acidosis
Figura 51-7. Fisiopatologia de la deficiencia de insulina
La concentracibn intracelular de glucosa libre es muy baja en comparacion con la extracelukar.La velocidad de transporte de la glucosa a través de la membrana plasmhtica de las c4lulas musculares y adiposas determina la velocidad de fosforilacion de la glucosa y su metabolismo subsecuente cuando las concentraciones de la glucosa y la insulina son normales. Cuando las concentraciones de una u otra se elevan, como es el caso despues de una comida, la fosforilaci6n se torna limitante de la velocidad. La D-giucoca y otros azúcares con una configuración similar en las posiciones de los carbonos Ci a C3(galactosa, D-xilosa y L-arabinosa) ingresan a las células por difusión facilitada mediada
690 * Bioquímica de Harper
d
(Capitulo 5 1)
L-J.J...-L-l-....
i
400 600 800 Glucosa extracelular (rngldL)
200
Figura 51-8. Entrada de glucosa en las células muswlares.
por portador, un proceso que !a insulina refuerza en muchas células (figura 5 1-81, Este implica un efecto V m ~ x(aumento en el número de portadores) más que un efecto Km(aumento de la afinidad de enlace). La información sugiere que en la célula adiposa esto se logra mediante el reclutamiento de portadores de glucosa de una reserva inactiva en el aparato de Golgi para llevarlos a un sitio inactivo en la membrana plasrnática. Esta traslocación del transportador depende de temperatura y energía y es independiente de la sintesis de proteina (figura 5 1-9). La célula hepktica representa una notable excepcibn a este esquema. La insulina no activa la difusion facilitada de la glucosa en los hepatocitos, pero intensifica indirectamente el flujo neto de entrada al convertir la glucosa intracelular a glucosa &-fosfato a traves de la accibn de la glucocinasa, enzima inducida por insulina. Esta rhpida fosforilaci6n mantiene una concentracibn muy baja de glucosa libre en el hepatocito y favorece así la entrada por difusibn simple bajo un gradiente de concentración. La insulina también promueve la entrada de arninohcidos a la cklula, en particular en el músculo, e intensifica el movimiento de K', Caz+,nucleósidos y fosfato inorghnico. Estos efectos son independientes de la entrada de glucosa por acci6n de la insulina.
B. Efectos sobre la utilización de la glucosa La insulina influye en la utilizacibn intracelular de la glucosa en varias formas, según se ilustra:
En una persona normal, aproximadamente la mitad de la glucosa ingerida se convierte a energla mediante la vla glucolltica y casi la mitad se almacena como grasa o como glucógeno. En ausencia de insulina Ea glucblisis disminuye y se detienen los procesos anabolicos de glucogknesis y lipogknesis. De hecho, $610 5% de una carga ingerida de glucosa se convierte a grasa en un diabktico deficiente en insulina. La insulina aumenta la gIuc6lisis hephtica al incrementar la actividad y la cantidad de varias enzimas clave que incluyen glucosinasa, fosfofnictuocinasa y pinivato cinaca. El aumento de la glucólisis acelera la utilizacibn de la glucosa y así reduce indirectamente su liberación al plasma. AdemBs, la insulina disminuye la actividad de la glucosa 6-fosfatasa, enzima que existe en el hígado pero no en el miisculo. Puesto que la glucosa 6-fosfato no puede atravesar la membrana plasrnática, esta accihn de la insulina conduce a la retención de la glucosa dentro del hepatocito. En el músculo esquelético la insulina promueve el ingreso de glucosa mediante el portador y también
Fondo común intracelular
\\aFijacidn
, J Membrana plasmhtica
e
Convertida a energia (glucbIisl3)
Glucosa ingerida
Convertida a grasa
Y '
Convertida a glucbgeno
Figura 51-9. Translocación de los transportadores de glucosa por la insulina (Reproducida con autorizacibn de Karnieli E et al.: Insulin-sttmulated translocation of glucose transpori systems in the isolated rat adipoce cell. J Biol Chem 1981;256;4772. Cortesía de S Cushman )
I
Hormonas de punereas y vías gas~oinrestinales 691
aumenta la hexocinasa 11, la cual fosforila la glucosa e inicia su metabolismo. La insulina estimula la lipogénesis en el tejido adiposo al: 1) proporcionar la acetil-COAy el NADPH necesarios para la síntesis de hcidos grasos; 2) mantener una concentración normal de la enzima acetil-COA carboxilasa, que cataliza la convercibn de acetil-COA a malonil-COA, y 3) proporcionar el glicerol necesario en la síntesis de triacilgliceroles. En la deficiencia de insulina, todos ellos disminuyen; por tanta, la lipogknesis tambiin. Otra causa para esta disminticibn en la deficiencia de insulina es que los dcidos grasos, liberados en grandes cantidades por varias hormonas cuando no hay oposicibn por la insulina, inhiben por retroalimentación su propia síntesis al reprimir a la acetil-COAcasboxilasa. Por tanto, el efecto neto de la insulina sobre los lipidos es anabólico. La acci6n final de la insulina sobre la utilización de la glucosa comprende otro proceso anabólico. En el hígado y el músculo, la insuiina estimula la conversión de glucosa a glucosa 6-fosfato (por acci6n de glucocinasa y hexocinasa 11, respectivamente), que despu&sexperimenta la immeimi&na glucosa 1 -fosfao y se polimeri7a a glucbgeno por la enzima gluc6gene sintasa, cuya actividad estimula la insuljna. Esta accion es indirecta v de naturaleza dual. La insulina reduce la concenGaci6n intracelular del cAMP por activacibn de una fosfodiesterasa. Dado que la fosforilacion dependiente del cAMP inactiva a la glucógeno sintasa, las concentraciones bajas de este nucleótido permiten que la enzima permanezca en su forma activa. La insulina también estimula a una fosfatasa que desfosforila a la glucógeno sintasa, por tanto, conduce a la activación de esta enzima. Por ultimo, la insulina inhibe a la fosforilasa por un mecanismo en el que interviene el cAMP y la fosfatasa, segun se describe antes, y esto reduce la liberacion de glucosa a partir del glucbgeno. El efecto total de la insulina sobre el metabolismo del glucógeno también es anabólico.
C. Efectos sobre la producción de glucosa (gluconeogénesis) Las acciones de la insulina sobre el transporte de la glucosa, la glucólisis y la glucog6nesis ocurren en segundos a minutos, puesto que comprenden básicamente la activacion o inactivación de enzima5 por fosforilación o desfosfori!ación. Un efecto mas prolongado sobre la glucosa plasmhtica comprende la inhibici6n de la g!uconeog&nesic por la insulina. La formaci6n de glucosa a partir de varios precursores que no son carbohidratos, abarca una serie de pasos enzim(iticos, de los cuales, varios se estimulan por el glucagon (que actúa a travks del cAMP), por hormonas glucocorticoides y en menor grado por agentes alfa y be# ndrenérgicos, angiotensina TI y vasopresina. La insulina inhibe estos mismos pasos. La enzima
gluconeogénica clave en el hígado es la fosfoenolpiruvato cxboxicinasa (PEPCK) que convierte el oxalacetato a fosfoenolpiruvato. La insulina disminuye la cantidad de esta enzima al inhibir selectivamente la transcripción del gen que codifica al mRNA de la PEPCK (véase adelante).
D. Efectos sobre el metabolismo de la glucosa La acción neta de todos los efectos anteriores de la insulina es reducir la concentración sanguínea de glucosa. En esta acción, la insuf ina está sola ante una serie de hormonas que intentan contrarrestar este efecto. Esto representa sin duda una de los mecanismos más importantes de defensa del cuerpo, puesto que la hipogiucemia prolongada es una amenaza potencialmente mortal para el cerebro y debe evitarse.
E- Efectos sobre de los lipidos Las accioncs lipogtnicas de la insulina se describen en el contexto de la utilizacibn de glucosa. Ademis, la insulina es un potente inhibidor de la lipolisis en el higado y el tejido adiposo y por tanto tiene un efecto anabolico indirecto. Esta se debe en parte a la propiedad de la insulina de reducir el cAMP (cuya concentracion aumenta en estos tejidos por acción de las hormonas lipoliticas glucagbn y adrenalina) pero tambiCn al hecho de que la insulina inhibe la actividad de la lipasa sensible a hormonas. Se supone que esta inhibícibn se causa por la activacihn de una fosfatasa que desfosforila y, por consiguiente, inactiva a la lipasa o a la proteína cinasa dependiente de cAMP. Por tanto, la insulina disminuye los Iicidos grasos libres circulantes. Esto contribuye a la acción de la insulina en el metabolismo de carbohidratos, ya que los Acidos grasos inhiben laglucólisis en varias etapas y estimula la gluconeogdnesis. Asi', la regulacibn metabolica no se puede discutir en el contexto de una sola hormona o metabolito. La regulación es un proceso complejo en el cual el flujo a travds de una vía es el resultado de la interacción de varias hormonas y metabolitos. En los pacientes con deficiencia de insulina, aumenta la actividad de la lipasa, con intensificacibn de la lip6lisis e incremento de la concentracibn de ácidos grasos libres en plasma e higado. La concentracion de glucagón tambidn aumenta y esto potencia la liberación de los hcidos grasos. (El glucagón se opone a la mayor parte de las acciones de la insulina y el estado metabolico en el diabdtico es el reflejo de las concentraciones relativas de glucagrin e insulina.j Una parte de los ácidos g r a o s libres se metaboliza a acetil-COA(la inversa de la lipogénesis) y finalmente a Col y H 2 0 vfa del ciclo del ácido cítrica. En estos pacientes deficientes en insulina, la capacidad de este proceso se excede con rapidez y la acetil-COA se
(Capitulo 51)
convierte a acetoacetil-COA y de ahi a los ácidos acctoacetico y beta hidroxibutirico. La insulina revierte esta vía metabólica. Al parecer la insulina afecta la formaci6n o la depuración de las VLDL y LDL, ya que la concentracibn de estas particuIas y en consecuencia la del colesterol, a menudo estan elevadas en los diabeticos mal controlados. La aterosclerosis acelerada, problema grave en muchos diabtticos, se atribuye a este defecto metabólico. Las acciones de la insulina pueden inferirse de la figura 5 1-1 0 que esquematiza el flujo a traves de varias n i t u criticas en ausencia de la hormona.
F. Efectos sobre el metabolismo preteinico En general la insulina tiene un efecto anabblico sobre el metabolismo proteinico pues estimula la sintesis de proteinas y retrasa su degradacibn. La insulina estimula la captación de los aminoácidos neutros en el músculo, efecto que no esth ligado a la captación de glucosa o a la incorporacibn subsiguiente de los arninoácidos en proteínas. Se piensa que las acciones de la insulina sobre la síntesis proteínica global en el músculo esqueletico, en el cardiaco y en el higado se ejercen sobre la traduccibn del mRNA.
Grasa (tejido adiposo)
Glucosa (hipergiucemia)
Glucosa en orina (glucosuria)
Giuwsa 6-fosfato
t
. Derivacibn E de los mon-
\,
\
) fosfatos j d e hexosa
1
!
Tñiosa fosfato + -
/'
AGL (plasma)
u Actl-COA
Fo~fOen~lpir~~at~ I Arninohcidos I
Triaulglicerot (hiperlipidernia)
I
t Pinivato
e
incremento de giucogen6iisis
.
- - -+Alteracibn de glu&lisis.
sintesis de glucágeno y utilización de acetil-COA
'
Cuerpos cetbnrcns (hipeicetonemia)
Incrementode gtuconeogknesis
f Ciclo del ácido citrim
n
Citrato
I /'
J'
Cuerpos cetónicos en orina
(cetonurial
Figura 51-10. En deficiencia inculinica grave, la Iipblisis está acelerada, las concentraciones plasrnfiticas de tnacilglicerol se elevan (hiperlipidernia) Escaso acetil-COApuede metabolizarsepor el ciclo del ácido c~trim,de modo que el resto se convierte a cetoficidos (cetonernia) y parte se excreta (cetonuria) Dado que la glucólisis esta inhibida, el glucosa 8 focfato formado por la glumgenblisis acelerada se convierte a glucosa. Esta, combinada con el incremento en gluconeog&nesis, causa hiperglucemia (por aumento en la disponibilidad de aminoácidas y concentraciones mayores de la enzima PEPCK) En esencia, la insulina invierte todos estos procesos
En aiios recientes se demuestra que la insulina influye en la síntesis de proteínas específicas al generar cambios en los mRNA correspondientes. Esta accion, que finalmente explicaría muchos de los efectos que tiene esta hormona en la actividad o cantidad de proteínas específicas, se comenta con mayor detalie adelante. G. Efectos sobre la replicación celular La insulina estimula la prolifcmción de algunas c&lulac en cultivo y es posible que tambikn intervenga en la regulacion del crecimiento in vivo. Los cuItivos de fíbroblastos son los mas utilizados en estudios de control del crecimiento. En estas celulas, la insulina potencia la capacidad del factor fibroblástico de crecimiento (FGF), del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), del factor epidémico de crecimiento (EGF), de los dsteres de forbol que promueven tumores, de la prostaglandina Faala (PGF2,a), la vasopresina y los anhlogos del cAMP para estimular el desarrollo del ciclo celular en las cWulas detenidas en la fase Gi al haberles privado de suero. Una nueva y excitante área de experirnentacihn comprende la investigación de la actividad de la tirosina cinasa. El receptor de la insutina, junto con receptores para muchos otros pkptidos que promueven el crecimiento que incluyen a PDGF y EGF, tiene actividad de tirosina cinasa. Como dato interesante, por lo menos 10 productos de oncogenes de muchos de los cuales se sospecha que estimulan lareplicacibn de cklulas malignas, son tambien tirosina cinasas. Las celulas de mamifero contienen análogos de estos oncogenes (protooncegenes), los cuales podrian intervenir en la replicaciiin de las celulas normales. EI apoyo para esta teoria de su intervencion, proviene de observaciones recientes de que la expresion de por lo menos dos productos de los protooncogenes, c-fos y c-myc, aumentan desputfs de la adicihn de PDGF en el suero o insulina para las c&lulas cuya proliferaci6n se detiene.
Se conoce el mecanismo de acción de la insulina La acci6n de la insulina comienza cuando se une a un receptor glucoproteinico especifico en la superficie de la célula blanco. Las diversas acciones de la hormona (figura 5 1-1 1) pueden ocurrir en segundos o minutos (transporte, fosforilación proteínica, activación e inhibición enzimática, síntesis de RNA) o despues de algunas horas (sintesis de proteinas y de DNA y crecimiento celular). El receptor de la insulina se ha estudiado con gran detalle mediante técnicas bioquimicas y de recombinacibn del DNA. Es un heterodimero formado por dos
subunidades designadas alfa y beta. en la configuracion alfazbeta:, unidas por puentes disulfuro (figura 5 1-1 2). Las dos subunidades tienen abundancia de grupos glucosilo y la remocion de ácido sialico y galactosa reducen la tijacibn de la insulina y portanto, su a c c i ~ n . Cada una de estas subunidades glucoproteínicac tiene estructura y función propia. La subunidad alfa (135 kDa) es enteramente extracelular y fija a la insulina probablemente mediante un dominio rico en cisteína. La subunidad beta (95 kDa) es iina proteina transmembrana que reaIiza la segunda función principal de un receptor (capitulo 44). La porcion citoplásmica de la subunidad beta tiene actividad de tirosina cinasa y un sitio de autofosforilación. Se piensaque ambos intervienen en la transduccion de la seilal y en la acci6n de la insulina (vtase adelante). En la figura 5 1-1 2 se ilustra la sorprendente semejanza entre tres receptores con funciones muy diferentes. De hecho, varias regiones de la subunidad beta tienen secuencia homólogas con el receptor para el EGF. El receptor para insulina se sintetiza y degrada constantemente, su vida media es de 7 a 12 horas. El receptor se sintetiza como un péprido de cadena sencilla en el reticulo endoplasmico rugoso y se glucosila con rapidez en la zona del aparato de Golgi. El precursor del receptor de la insulina humana tiene 1382 arninoacidos, un peso molecular de 190 000 y se escinde para formar las subunidadcs alfa y beta maduras. El gen del receptor de la insulina humana se localiza en el cromosoma 19. Los receptores de insulina se encuentran en casi todas las células de los mamíferos, en concentraciones hasta de 20 000 por celula y a menudo en algunas que no son consideradas blanco de la hormona. La insulina tiene un conjunto de efectos bien conocidos sobre los procesos metabdlicos pero también interviene en el crecimiento y replicación de las células (véase antes), así como también en la organogdnesis, y diferenciación fetal, en la reparación y regeneracibn tisular. La estructura del receptor de la insulina y la capacidad de las diferentes insulinas para unirse a los receptores y provocar respuestas biologicas son virtualmente iddnticas en todas las celulas y todas las especies. Así, la insulina porcina es siempre 10 a 20 veces más eficaz que la proinsulina porcina, la cual a su vez es 10 a 20 veces m6s eficaz que la insulina del cobayo, aun en el propio cobayo. Al parecer, el receptor de la insulina se conserva mas que la insulina misma. Cuando la insulina se fija al receptor, ocurren varios fendmenos: 1 ) hay un cambio en la conformación del receptor; 2) los receptores se enlazan entre si y forman microagregados; 3) el receptor se introduce, y 4) se generan una o mas señales. Se desconoce el significado del cambio de conformación y es probable que la incorporacilin represente un medio de controlar la concentración del receptor y su recambio. En los trastornos en que la conccntración plasmattca de in-
694
Bioqttimica de Hurper
(Capitulo 51)
Transporte de glucosa
Crecimiento y repiicacion celular
~ ~ ~ f ~ Activacidn ~ ~ el ~ Sintesis ~ ~ óCitoplasma ~ . desfosforifacldn ~nh~blcibn de de proteinas proteínica enzima3
Figura 51-1 1. Relaci6n del receptor de insulina con la accibn de esta hormona. La insulina se une al receptor membrana1 y esta interaccidn genera una o mas celiales transmembrana. Esta(s) selial(es) modulan una extensa variedad de fenbmenos intracelulares.
sulina es alta, por ejemplo, obesidad o acrornegaIia, el niimero de receptores para hormona es menor y los tejidos blanco se vuelven menos sensibles a ella. Esta "regulacion en baja" es consecuencia de la pérdida de receptores por internalización, que es un proceso por
LDL
EGF
lnsulina NH2
NH2
NH2
EXTRACELU LAR
cOOH COOH
COOH
el cual los complejos entre el receptor y la insulina entran a la ckIula por endocitosis en las vesiculas recubiertas con clatrina (capitulo 433. La "regulación en baja" expZica parte de la resistencia a la insulina en la obesidad y en Ia diabetes sacarina tipo 11.
Figura 5l-12. Reprecentacidn esquematica de la estructura de los receptores para LDL, EGF e insulina. El extremo arntno de cada uno esta en la porcdn extracelular de la mol8cula. Los rectángulos representanregiones ricas en cicteina, que se piensa intervienen en la fijacibn del ligando Cada receptor tiene un dominio corto (cerca de 25 aminoácidos) que atraviesa la membrana plasmAtica (linea sornbreada) y un dominio intracelular de longitud variable. Los receptores del EGF y de la insulina tienen actividad de tirosina cinasa en su dominio citoplismico (representado por los circulas) y también poseen sitios de autofosforilacion en esta región El receptor de la insulina es un heterotetramero conectado por enlaces disulfuro (barras verticales)
Hormonas de páncreas y vias gustrointescstinales 695
La insulina transmite señales mediante una o mas cascadas de cinasas Los receptores de insulina e IGF-'I tienen actividad intrinseca de tirosina cinasa en sus dominios citoplasmaticos. Estas actividades se ponen en movimiento cuando el receptor enla7a al ligando. En ese momento los receptores se autofosforilan y con esto se inicia un conjunto complejo de eventos (resumidos en la figura 51 -1 3). El receptor de la insulina fosforilado en seguida fosforila el sustrato 1 del receptor de la inruli~ ~ { I R S:-de 1 igual manera se Duede afectar a otras proteína similares) sobre los residuos de tirosina. El I WS-1 fosforilado se entaza a los dominios SH2 de diversas proteinas que participan directamente en mediar los diferentes efectos de la insulina. Una de estas proteinas, la P1 3-cinasa, puede vincular la activaci6; del receDtor de insulina a la acción insulínica mediante la activación de diversas moléculas, incluso la p70 S6 cinasa. Otro domino SI12 que contiene proteina es el GRB2, el cual vincula la fosforilaciOn de la tirosina a diversas protelnas, de lo que resulta la activacibn de cinasas de Wonina o de serina. En la figura 5 1-13 se muestra cbmo la interaccibn insulinareceptor activa la vía de la proteina cinasa activada por milbgeno (PAM). Queda por establecerse la función exacta de muchas de estas proteinas de anclaje, cinasas y fosfatasas. Es en particular importante vincular estas diversas viac a las bien establecidas funciones fisiológicas y bioqulmicas de esta hormona. La insulina puede distinguirse de otras hormonas que activan tirosina cinasas, como es EGF, en que no activa la fosforilasa C y por tanto ejerce sus efectos mediante Caz' e IP3 o diacilglicerol. w
Algunas acciones de la insu'lina se vinculan a la fosforilación-desfosforilación proteínica Muchos de los efectos rnetabólicos de la incutina en particular aquellos que ocurren con rapidez, s e median por su influencia en las reacciones de fosforilación y desfosforilacilin proteinica que a su vez alteran la actividad enzimlitica de la proteina. En el cuadro 5 1-3 se presenta una lista de las enzirnas afectadas de esta manera. En algunos cacos, la insulina reduce el cAMP intracelular (por activación de una cAMP fosfodiesterasa) y reduce por tanto el estado activo de la proteína cinasa dependiente del cAMP; ejemplos de esta acción son la glucogeno sintaca y la fosforilasa. En otsos casos, este efecto es independiente del cAMP y se ejerce por activación de otras proteinas cinasas (como es el caso del receptor de la insulina, la tirosina cinasa); por inhibición de otras proteinas cinasas
(cuadro 44-5); o con mAs frecuencia, por estimulacibn de la actividad de Eas fosfoproteinfosfatacac. La desfosforilaci6n incrernenta la actividad de algunas enzimas clave (cuadro 5 1-3). Estas modificaciones covalentes permiten cambios casi inmediatos en la actividad de las enzimas.
La insulina afecta la traducción del mRNA Se sabe que la insulina afecta la actividad o la cantidad de por lo menos 50 proteinas en varios tejidos y en muchos de estos efectos hay una modificación covalente. Basándose en gran parte en los estudios de la proteina ribosomal S6, componente de la subunidad ribosómica 40S, se propone una función para la insulina en la traducción del mRNA. Este mecanismo podría explicar el efecto general que la insulina tiene sobre la síntesis de proteinas en el hígado y en los musculos esquelético y cardiaco.
La insulina afecta a la expresión génica Todas las acciones de la insulina discutidas ocurren en la membrana plasmática a en el citoplasma. Además, la insulina afecta procesos nucleares específicos, probablemente a traves de su mediador intracelular. La enzima iosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK) cataliza un paso limitante de la velocidad en la gluconeogtnesis. La sintesis de la PEPCK se disminuye por la insulina; por tanto la gluconeogénesis decrece. Estudios recientes muestran que la tasa de hanscripción del gen para la PEPCK disminuye de manera selectiva en minutos después de la adición de insulina a las ctlu tas de hepatoma en cultivo (figura 5 1-1 4). La reduccidn de la transcripción explica el indice bajo del material transcrito primario y de mRNAPLWK maduro, lo cual a su vez se relaciona directamente con la disminución en la tasa de sintesis de PEPCK. Este efecto se produce a concentraciones fisiológicas de insulina (1 O-'' a 10* molL), se media por el receptor de la insulina y aF parecer se debe a una tasa reducida en el inicio de la trancripcidn del mRNA "tpCK. Aunque los estudios de la regulación de la PEPCK proporcionan el primer ejemplo de un efecto de la insulina sobre la transcripción génica, este caso ya no es el unico. En realidad, parece ser que la regulacihn de la sintesic de mRNA es una accibn fundamental de la inculina. Más de 100 mRNA específicos se afectan por la ínculina y varios mRNA en hígado, tejido adiposo, mi~sculoesquelético y músculo cardiaco, y otros no identificados aún, se afectan tambien por la hormona. Eii varios pasos se sabe que la hormona afecta a la transcripcion genética. varios ejemplos se muestran en el cuadro 5 1 4 .
Receptor de insulina
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MEK
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Actividad enzim8tica
Transcripcibn geniw
P~~~vilo~hlárogenace AceliiCoAcarboxiiasa Gtucogeno sinlasa Fusforrlasacinasa
Fosfmlasa
tiucwhasa GAPDH P1nivat0 Clnastd
Triacilgiiceml tipesa
Figura 51-13. Vias de seiíalizacibn de la insulina. El enlace de la insulina a su receptor especifico en la membrana celular resulta en una cascada de eventos intracelularec. La estimulación de la actividad de tirosina cinaca intrinseca del receptor de insulina marca el evento inicial que resulta en el aumento de la fosfortlación de la tirosina (Y + Y-P) tanto del propio receptor como de moléculasde sefiallzacion. Este aumento en la focfotirosrna estimula la actividad de muchas moléculas intracelulares tales como GTPasa, proteina cinasas y Iípido cinasas, todas las cuales tienen una Función que desempeñar en ciertas acciones metabolicas de la insulina Se muestran las dos vias mejor descritas. Primero, la adivacibn de la Iípido cinasa, PI 3-cinasa, genera nuevos Iípidos de inositol que pueden actuar como moléculas de segundo mensajero, mismas que, a su vez, adivan diversas vias de sehalizacion escasamente descritas (por ejemplo, p70 S6 cinasa) Segundo, la activacibn de la pequefia GTPasa, p21RAC, estimula una cascada de proteina cinasa que activa las isoformac p421p44 de la PAM cinasa, proteina cinasas importantes en la regulacion de la proliferación y diferenciacibnde varios tipos de celulas (IRS-1, sustrato 1del receptor de insulina. GRB2, protelna 2 enlazadora del receptor del factor de crecimiento; rnSOS, mamifero hrjo de sin sietes, MEK, PAM cinasa y ERK cinasa, PAM cinasa, proteina cinasa activada por rnitbgeno, p90rsk,proteína 56 cinasa ribosbmim p90 PAMKAP2, proteina cinasa-2 activada por PAM ctnaca, PI 3-cinasa, fosfatidilinositol 3 anasa, p70 S6 cinasa, proteína S6 cinasa del ribosoma p70 )
Este efecto de la insulina abarca a enzirnas retenidas en las celulas, enzimas y proteinas secretadas, proteínas que intervienen en el proceso reproductor y proteinas estructurales (cuadro 5 14). Están comprendidos varios bganos o tejidos y el efecto ocurre en numerosas especies. En la actualidad esti'i bien establecida la regulacihn de la transcripción de mRNA
especificas por la insulina y como medio de rnodificación de la actividad enzimática, y equivale en importancia con la fosforilacibn y desfosforilaci6n. El efecto de la insulina sobre latranscripci6n de los genes puede explicar también sus acciones sobre la embriogénesis, la diferenciación y el crecimiento y replicacihn de las celulas.
Hormonas de puncreas y vias gasf~oi~lles(inaies69 7
Cuadro 51-3. Enzimas cuyo grado de fosforilación y actividad se alteran por la insulina* - .- ---
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En: I
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Iviezitwuiisma oe los iipiaos 'oA carbox ilasa oA reductíisa licero1 lipa' -
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Fosroriiacio Unión de las subunidades R- y" C L~~SIOSTO~~I~CIQ~ Desfosforila-:'lCLULl Ciesfosforilaicion
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Aumento
:ido con autorizaci6n de Denton RM et al.:
A
-
panim view or rne mcchanism o f insiiiin action. Liiawtoiogia
,,.h.
La fisiopatologia causada por insulina se manifiesta en su mayor parte como diabetes sacarina Transcnpcibn RNA nuclear pnrnano ------
La deficiencia de insulina o la resistencia a su accion, conduce a diabetes sacarina. Aproximadamente 90% de las personas afectadas tienen diabetes sacarina no insulinodependiente (tipo 11) (DSNtD). Estos individuos, por lo general, son obesos tienen concentraciones plasmbticas altas de insulina y sus receptores de insulina poseen regulacihn en baja. El 10%restante padece diabetes sacarina insulinodependiente(tipo 0 (DSJD). Ciertos padecimientos poco frecuentes ilustran O 0.5 1 .O 1.5 2.0 2.5 30 características esenciales acerca de la accibn de la Ttempo despues de la insulina (horas) insulina. Unas cuantas personas producen anticuerpos dirigidos contra sus receptores de insulina. Estos anFigura 51-14. Efecto de la insulina sobre la transcripcibn de ticuerpo~impiden que la insulina se fije al receptor, genes especificas. La adicibn de insulina a las dlulas del de modo que las personas desarrollan un síndrome de hepatoma H411E conduce a una dismtnucibn rápida en la tasa resistencia grave a la insulina. Los tumores originados de transcripcibn del gen para PEPCK. Esto va seguido por en las c6lulas S causan hiperinsulinismo y un sínuna reducción en la5 cantidades del RNA primario transcrito en el núcleo y del ~ R N maduro. A ~La tasa ~ de~ slntesrs ~ ~ drome caracterizado por hipoglucemia grave. La funde la proteína PEPCK declina despubs de la disminucibn del ci6n de la insulina (o q u i d del IGF-1 o del IGF-11) en ,RNAPEPCK . citopl8smica. (Reproducida con autorizaciónde la organogénesis y el desarrollo se jIustra por los casos Sasaki K et al.: Multihormonal regulation of phosphoraros de leprechaunismo. Este síndrome se caracteriza enolpyruvate carboxykinase gene transcription. J 8101Chem por peco bajo al nacer, disminución de la masamuscu1984,25915242.)
--
RNA nuclear maduro RNA citopl8smico
.*l--.--r***-*___l_.
698 Binquimica de Hurper
Cuadro 51-4. RNA mensajeros regulados r la insuli "
(Capitulo j1)
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E i iiiiu~iiuipt U~ YLL~V
cei iivniciriu
ticido gr,aso sintasa Pinivato cinasa Gliccrol-3 -fosfato dlesliidroger = Gliceraldeniuo-1-ciesiiiarogcnasa Glucocin usa Protcinas y Albiim in *
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1
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Adipsina Ami lasa Glohulina al, Hormona del crecitri-ni.. P'rateínas qlue intervi Ovoalbúimina
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structural
ina Grras proreínns Higado ( ~ 3 3etckterd) ,
insulina en 50% de sus residuos. Estas moléculas tienen sitios antigknicos únicos y se regulan de manera diferente (cuadro 5 1-5). La insulina tiene mayor potencia metabólica, en tanto que los IGF son más potentes para estimular el crecimiento. Cada hormona tiene un receptor único. El receptor de iGF-1, al igual que el de la insulina, es un heterodimero de estructura alfaz y betal y es una tirocina cinasa. Al parecer el IGF-I y la insulina utilizan la misma, o una muy similar, seiíal de transducción de la cascada. Por el contrario, el receptor de IGF-11 es un polipéptido de cadena sencilla con peso molecular de 260 000 y no es tirosina cinasa. Se relaciona de manera estrecha con el receptor de manoca 6-focfato, si no es que es idtrntico.
EL GLUCAGÓN ES UN ANTAGONISTA DE INSULINA Las primeras preparaciones comerciales de insulina incrementaron la glucosa plasmatica más que reducirla, debido a la presencia de un peptido contaminante, el glwcagón, que fue la segunda hormona de los islotes pancreaticos descubierta.
Tejido ac Mhsculo Musciilo csoueietico * Esta lista es selectiva. Se hademostrado que l a insiilina teguln a 60 mRNA diferentes, cuando menos. -
lar, disminución de la grasa subcutánea, facies de enano (duende), resistencia a la insulina con elevaciones plasmAticas notables de insulina biolbgicarnente activa y muerte temprana. En varias personas con leprechaunisrno se demuestra que carecen de receptores de insulina o que éstos son defectuosos.
Cuadri3 51-5. C omparacii6n de la insulina y los ractores d e crecimiento semejantes a Ia insulina. (Cortesia de CR Kahn)
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6 -
LOS FACTORES DE CRECIMIENTO SEMEJANTES A INSULINA (IGF-I E IFG-Il) ESTÁN RELACIONADOS CON LA INSULINA EN SU ESTRUCTURA Y FUNCIÓN Es dificil separar los efectos de la insulina sobre el crecimiento y replicación celular de acciones semejantes ejercidas por IGF-1 y 11. De hecho, la inculina y los TGF pueden interactuar en el proceso. La semejanza estructural de estas proteinas se describe antes y en la figura 5 1-5. En el cuadro 5 1-5 se presenta una comparaci6n miis detallada. Los IGF I y 11 son polipdptidos de cadena sencilla de 70 y 67 arninokcidos, respectivamente. Hay 62% de hornologia entre IGF 1 y 11 y estas dos hormonas son idbnticas a la
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en el desaxrollo embrionario
Hormonas de púncreas y vías gastrointestinules 4599
El glucagon se sintetiza también como una molécula precursora El glucagon, sintetizado en su mayor parte en las célulac A de los islotes pancrehticos, es un polipdptido de cadena sencilla (masa molecular de 3.485 kDa) formado por 29 arninohcidoc (figura 5 1-1 5). Se sintetiza como un precursor proglucag6n mucho mhs grande (cerca de 9 kDa). Se han detectado molkculas mayores que esta, pero no estl claro si representan precursores del glucagón o péptidos íntimamente relacionados. S610 30 a 40% de "gIucag6n" plasmatico inrnunorreactivo es glucagón pancrelitico; el resto consiste en moléculas mas grandes biolbgicamente inactivas. El glucagdn comparte algunas propiedades inmunol6gicas y fisiológicas con el enteroglucagon, un pdptido extraído de la mucosa duodenal; y 14 de los 27 aminoacidos de la secretina son idénticos a los del glucagón. El glucaghn circula en el plasma en forma libre. miesto que no se une con proteinas mspertadoras, su vida media plasmática es corta (cerca de cinco minutos). El glucaghn se inactiva por el higado, que posee una enzima que separa los dos primeros amino&cidos del extremo amino terminal por escisión entre Ser 2 y Gln 3. Dado que el hígado es la primera parada del glucagón despuds de su secrecion y ya que este Organo inactiva con rapidez a la hormona, la concentracidn del glucag6n en la vena porta es mucho mayor que en la circulacián periférica.
La secreción de glucagón se inhibe por glucosa, acción que enfatiza las funciones opuestas de glucagón e insulina N o se sabe si la glucosa inhibe directamente la secreci6n de glucagbn o si ksta se media por acciones de la insulina o del IGF-1, ya que estas dos hormonas de los
1
Glueag6n
NH,-
His - Ser - Gln 11
Ser - Lis
islotes pancreaticos inhiben directamente la liberacíbn de glucagón. Muchas otras sustancias que incluyen aminoacidos, ácidos grasos y cetonas, hormonas de las vías digestivas y neurotransmisores, afectan la secrecihn de glucagón.
En general, las acciones de glucagón se oponen a las de insulina En tanto que la insulina favorece el almacenaje de energía al estimular la glucogknesis, la lipogenesis y la síntesis de proteínas, el glucagón causa la movilizacion rapida de las fuentes energeticas potenciales en la glucosa, al estimular la glucogenblisis y en los ácidos grasos. at promover la lipólisis. Ademhs, el glucagon es la h o A o n a gluconeogenica mhs potente y es cetogknico. El higado es el blanco primario de la accíon del glucagón. La hormona se une a receptores especificas en la membrana plasrnhtica de Pos hepatocitos y esto activa a la adenilil ciclasa mediante un mecanismo ligado a la proteina C. El cAMP generado estimula a la fosforilasa. la cual intensifica la velocidad de degadación del glucbgeno en tanto que inhibe a la gluc& geno sintasa y por tanto la formación de glucógeno (capitulo 44). En este efecto hay especificidad de hormona y de tejido, puesto que el glucagbn no actua cobre la glucogenblisis en el mÚscuIo, en tanto que la adrenalina muestra actividad en el músculo y el hígado. La concentracibn alta de cAMP estimula la conversión de aminohcidos a glucosa al inducir un cierto número de enzimas que participan en la via gluconeogénica. La principal entre estas es la PEPCK. El glucagón, a travks del cAMP, incrementa la velocidad de transcripcibn del mRNA del gen para la PEPCK y de este modo se estimula la síntesis de más PEPCK. Este es un efecto opuesto at de insulina, la cual reduce la transcripción genica para PEPCK. En el cuadro 5 1 4 se ilustran otros ejemplos. La accibn neta del glucagbn en el hígado consiste en incrementar la producci6n de
- Gli -Tir - Fen - Tir - Ser -Asp-
- Tir - Leu -Asp-
1
somatostatlna NH,-
Ala - GIi
-
20
Ser
- Arg - Arg - Ala - Gln -
21
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10
Tir
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Val -Gln-Trp-Lsu-Met-Asn-
- Cis -.
f i r -GOOH
iP
Lis -Asn-
Fen - Fen - Trp - Lis - Tir
Figura 5 1 4 5 . Secuencias de arninoAcidos de glucagón y sornatostatina.
-
700 Aioqtcitnica de Harper
(Capítulo 51)
Cuadro 5 1 4 . Enzimas inducidas o reprimidas por la insulina o el glucagon * - -- . -.-
.-
. . --.
.
- -
- --
Enzima~inducidas por una proporción insulna-glucagón a1ta y reprimidas por una proporción insulinr: glucagón baja ~cinasa na que esciinde al citr:
1-COAcartioxilasa i-COA red^
rito cinasa ;fofYucto-l~ :fofructo-2
ctosa 2.64isfosfatasa
Enzimas inducidas por una prioporrión ii gbn baj,a y reprimidos por uina propoi glucilgiin alta
-...-.3sa 6-fosfat-.S .-,-
Gii~rr
Fosfc
ito carboxiicinasa
(PEPCK)
Fruct
isfosfatasa nte modific: ducido con autnrimcicin dc .. -Karam JH. salncr I'K, korshíini l'll Pancreatic hormones and diabetes mellitus. In: Basic undClinical Endocrrnology,3rd ed. Crreenspan FS (editor) Appleton & Lange, 1991, publicado por la Editorial El Manual Moderno, Mexicri
numerosos tejidos gastrointestinales donde se considera que regula diversas funciones; y en múltiples sitias del sistema nervioso centrat donde puede ser un neurotransmisor. La somatostatina inhibe la liberación de otras hormonas de los islotes pancrehticos por medio de una acción paracrina. En cantidades famacologicas, la somatostatina amortigua de manera significativa la cetosis ligada con la deficiencia agudade insulina. Aparentemente esta accibn se debe a su capacidad para inhibir la liberación de gIwcagón que acompaña a la insulinopenia. Tambidn reduce el paso de nutrientes desde las vias digestivas a la circulación, debido a que: 1) prolonga el vaciamiento gástrico, 2) reduce la secreción de gastrina y por tanto, la produccibn de ácido ghtrico, 3 ) abate la secrecion pancreatica exocrina (enzimas digestivas), 4) decrece la circulacibn sanguínea esplAnica y 5) hace lenta la absorcion de glucosa. Se sabe poco acerca de las acciones bioquimicas y moleculares de esta hormona.
LA F U N C I ~ NDEL POLIPEPTIDO PANCREÁTICO SE DESCONOCE glucosa; dado que la mayor parte de esta glucosa sale del higado, su concentración plasmática aumenta en respuesta al glucagón. El glucagón es un potente lipolitico: incrementa la concentración del cAMP en los adipocitos y esto activa a [a lipasa sensible a hormonas. Los ácidos grasos en exceso, pueden metabolizarse para obtener energia o convertidas a cuerpos cetónicos, acetoacetato y beta hidroxibutirato. Este es un aspecto importante del metabolismo en el diabdtico, ya que los valores del glucagón siempre son elevados en la deficiencia de insulina.
El poliptptido pancreático (PP) de 36 aminoácidos (cerca de 4.2 kDa), es un producto recién descubierto de las células F del pancreas. Su secrecibn en el ser humano se incrementa por una comida proteinica, el ayuno, el ejercicio y la hipoglucemia aguda y disminuye por la somatostatina y la glucosa intravenosa. Se desconoce la función del polipéptido pancreático, pero se propone que tiene algunos efectos sobre la concentración del glucbgeno hephtico y la secrecidn gastrointestinal.
LA SOMATOSTATINA INHIBE LA SECRECIÓN DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO
LAS HORMONAS GASTROINTESTINALES SON NUMEROSAS
La somatostatina, llamada asl porque fue aislada por primera vez del hipotálamo como el factor que inhibe la secreción de la hormona del crecimiento, es un péptido cíclico sintetizado como una prohormona somatostatina grande (cerca de l 1.5 kDa) en las celulas D de los islotes pancrehticos. La velocidad de transcripcion del gen de la prosomatostatina se incrementa notablemente por el cAMP. Primero se procesa la prohonnona como un piptido de 28 aminoácídos y finalmente como una moldcula con peso rnolecular de 1640 y que contiene 14 aminohcidos (figura 5 1-1 5). Todas las formas tienen actividad biológica. Además de existir en el hipotalamo y en los islotes pancrehticos, la somatostatina se encuentra en
La disciplina de la endocrinología comenzó con el descubrimiento de una hormona gastrointestinal En 1902, Bayliss y Starling instilaron hcido clorhídrico en una asa desnervada del yeyuno de un perro y demostraron que esto incrementa la secreci6n de liquido del pfincreas. La inytccidn 1V de ácido clorhídrico na imita ese efecto, pero la inyeccion IV de un extracto de mucosa yeyunal si lo hace. Estos investigadores postularon que la "secretina" liberada de la mucosa del intestino superior en respuesta a un estimulo, se lleva al p h c r e a s por la circulacion, donde ejerce su efecto. Bayliss y Starling fueron los primeros
Hormonas de princreas y vías gasfroinfestinales
en usar la palabra h'hormona" y secretina fue la primera hormona cuya funcion se identifico. Aunque la actividad de secretina se identifico en 1902, transcumieron 60 ailos antes de comprobar su identidad quimica. Ahora se conocen las razones para que se requiera m t o tiempo: familias de pkptidos gastrointestinales muy relacionadas con estructuras químicas y funciones bioldgicas traslapadas, y la mayor parte de estos peptidos existeen formas rntíltiples. De las hormonas gastrointestinales principales, sólo secretina existe en forma única. La presencia de formas múltiples de estos pdptidos en el tejido gastrointestinal y en la circulación ha impedido la definicion del numero y naturaleza de estas rnoldculas. El concepto de moléculas precursoras ayudó a esclarecer este problema; gran parte de la heterogeneidad tisular se debe a esta caracteristica. Las tkcnicas de aislamiento desarrolladas en este ultimo lapso tatnbikn han contribuido a lograr !a diferenciación entre los p6ptidos.
Las hormonas gastrointestinales tienen algunas características especiales Mas de una docena de pdptidos con actividades linicas se han aislado de tejidas gastrointestinales (cuadro 51-7). Una propiedad única de este grupo de hor-
701
monas es que muchas ajustan con la definicion clásica de una hormona, algunas tienen acciones paracrinas y otras actúan bajo un patrón neurocrino (como neurotransmisores o neuromoduladores locales). Otro aspecto único del sistema endocrino gastrointestinal es que sus cklulas estan dispersas por todas las vías digestivas en lugar de reunirse en 6rganoc discretos como en la mayor parte de glándulas endocrinas típicas. La distribucion de las hormonas gastrointestinales se muestra en el cuadro 5 1-7. Dado que muchos de los péptidos gastrointestinales se encuentran en nervios tisulares, no sorprende que la mayor parte de ellos también estkn presentes en el sistema nervioso central.
Las hormonas gastrointestinales se agrupan en familias Muchas de estas hormonas pueden colocarse en 1 a 2 familias basándose en la secuencia de aminoacidos y en su semejanza funcional. Éstas son la familia de la gastrina, constituida por gastrina y colecistocinina (CCK) y la familia de secretina, que incluye secretina, glucagón, polipkptido inhi bidor gistrico (GIP), polipéptido intestinal activo (VIP) y glicentina (que tiene una inmunorreactividad anhloga a glucagbn pero es un péptido distinto). Los pkptidos neurocrinos neurotensina, semejantes a bombesina, sustancia P y
-
A
--
Cuadro 51-7. Hormonas gastroint&iinales
- -
Normi. ina -,
A
-
-
A
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A
-
-
-
-
m
'
Duodeno. yeyuno uodeno, yeyuno
-
,
:16n -de bicarbonato p:
-
la liberaciónI de insul ina mediada por glucosa; inhibe la secreción a la músculo li so; estimul secrecihn de bicarrionato pt mcrehtico Inicia la motiiidadintestinal.iva Numeirosos efecl:os inhibidt menta
--l = : : F E , --
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testino del;EPdo
Inmunorrt:actividad besina (BLI)
-
6n , . princip secrecion de pepsinr1-
--
---
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Sustancia
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, Secreclon ae milasa p a n c ~
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testino dcl;
Polipeptidio inhibidor
Encefalina
-
:o, duodeni
-Secretina
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rtómago, duodeno, paincreas -"-,-
Inhibe la secreción de bicarbonato y na pancrcA -.-proteí stdrnago, duodeno, vesicula biliar Acciones anáIog . . i Acciones fisiológicas inciei >das las vías digestivas ula la libcración de giistrina y LCK mcrea?
""
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increas, intestino delgado
Acciones fisiolbgicns desccinocidas
-
somatostatina no tienen semejanza estructural con otros péptidos gastrointestinales. Una propiedad general final de este último grupo de moltculas es que sus vidas medias placmáticas son muy cortas y es posible que no desempeflen papel fisiol6gico alguno en la sangre.
Es relativamente poco lo que se sabe acerca del mecanismo de acción de las hormonas gastrointestinafes Los estudios del mecanismo de acción de las hormonas peptidicac gastrointestinales se han rezagada respecto a los de otras hormonas, sin duda debido a que se ha prestado miis atención a catalogar las diversas molCculas y a establecer su accibn fisiológica. Una excepción notable a este planteamiento es la regulaci6n de la secrecion de enzimas por la ctluIa acinar pancrefitica. Se tienen identificadas seis clases diferentes de receptores en las cClulas acinares pancreaticas. Estos son para: 1) agentes celinérgicos muscarínicos, 2) la familia gastrina-CCK, 3) bombesina y peptidos relacionados, 4) la familia fisalamina-sustancia P, 5) secretina y VIP y 6) toxina del ciilera. Al parecer Ias clases 1 a 4 actúan a través del mecanismo catciofosfoinositjdo, en tanto que los grupos 5 y 6 lo hacen a travks de cAM P.
RESUMEN Las células de los islotes pancreaticos sintetizan y secretan cuatro hormonas por lo menos: insulina, glucagiin, somatostatina y polipéptido pancreático. De éstas, insulina y glucagbn desempedan las funciones rnetabólicas mejor conocidas. La insulina, producida como una prohormona de cadena sencilla (proinsulina) con actividad biológica escasa, se procesa a un heterodímero activo de estruc-
tura al fa-beta, que se conserva unido por medio de dos puentes disulfuro intercatenarios. Las proteinas anhIogas a insulina que incluyen la relaxina y los factores insulinoides del crecimiento, comparten esta mo!ecula precursora característica. Fue este ejemplo lo que condujo al concepto mAs general de rnoldculas proteínicas precursoras y su procesamiento a moldculas activas de menor tamaiio. EI receptor de la insulina tiene actividad intrínseca de tirosina cinasa y la información actual sugiere que la autofosforilaci6n del receptor inicia unas series de interacciones proteina-proteína que resultan en la activacién de la PI 3-cinasa y la cascada de la PAM cinasa. Por el contrario, los efectos fisiolbgicos de la insuiina se conocen CDn amplitud. La insulina rnodifica el transporte iónico y de sustratos, el a s i t o celular, la actividad enzimatica, la síntesis de proteinas y la expresión genica. En un contexto mSs amplio, estos efectos interesan a numerosos aspectos de la acumulación y utílizacibn de energía y pueden intervenir en la replicación celular. El glucagón, una honnona peptídica pequefía, tambidn se sintetiza primero como una prohormona p d e . El glucagon se une a un receptor celular especifico que se enIaza al sistema de la proteina G . El AMP cíclico es el mediador intracelularde la a c c i ~ ndel glucagbn. En general, las acciones metabólicas del glucagón son opuestas a las de insulina. Las vías gastrointestinales no se consideraban como un órgano endocrino tradicional, si bien producen numerosas hormonas diferentes. Muchas de éstas se producen tambien por el cerebro y otros tejidos neuralec, donde actúan como neurotrmsmisores o neuromoduladores. Las hormonas gastrointestinales funcionan en forma local sobre diversos órganos y procesos dentro del tubo digestivo. Poco se sabe del mecanismo de accibn de gran parte de estas hormonas.
REFERENCIAS Lawrence JC Jr: Signal transduction and protein phospho-
O'Brien R, Cranner DK: Regulation of gene expression
rylation in the regulation of cellular mctabolism by insulin. Annu Rev Physiol 1992:54: 177. LeRoith I) et al.: Insulin-like growth factors and their receptors as growth regulators in normal physiology and pathologic states. Trends Endocrino1 Metab 1992;2: 134. Mmkino H, Manganiella YC, Kono T: Role of ATP in insulin actions. Ann Rev Physiol 1994;56:273.
by insulin. Rlochem J 1991;278:609. Said SI: Vasoactive intestinal polypeptide: biologic role in healrh a n d dfsease. Trens Endrocrinol Metab 1992;2:107. Steiner DF et al.: The new enqmology of precursor processing endoproteaces. J Biol Chem 1992;267:23435. White MF, Kahn CR: The insulin signalingsystem. J Biol
Chem 1994;269:1 .
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Capítulo 52 Estructura y función de las vitaminas hidrosolubtes Capitulo 53 Estructura y función de las vitaminas liposolubles Capítulo S4 Nutrición
Capítulo 55.Digestión y absorción
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Capítulo 56 Glucoproteínas
Capítulo 57 Matriz extracelular
Capitulo 58 Músculo
Capítulo 59 Proteínas plasmáticas. inmunogIobuIinas y coagulación sanguínea Capítulo 60 Eritrocitos y ~eucocitos
Capitulo 61 Metabolismo de xenobiáticos
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887
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913
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931
Capitulo 62 Cancer. oncogenes y factores de crecimiento
Capítulo 63 Bases bioquimicas y genéticas de la enfermedad
Capitulo 64 Las bases bioquimicas de algunos trastornos neuropsiquiatricos
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Capítulo 65 Historias de casos bioquímicos
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Estructura y función de Aas vitaminas hidaosollublles Peter A. Mayes, PhD, DSc
Las vitaminas son nutrientes orgltnicos que se requieren en cantidades pequeñas para diversas hnciones bioquimicas y que, en general, no puede sintetizarlas el organismo y por tanto deben recibirse dc los alimentos. Las primeras vitaminas descubiertas, A y B, sc encontraron solubles en Iípidos y agua, respectivamente. Conforme fueron descubri&ndose más vitaminas se demostró que eran solubles en lipidos o en agua y esta propiedad se us6 como base para su clasificación. Las vitaminas hidrosolubles fueron designadas todas como miembros del comple.jo B (aparte la vitamina C ) y las vitaminas liposolubles nuevas recibieron designaciones alfabkticas (por ejemplo, vitaminas D, E, K). Aparte de sus caracteristicas de soluhilidad, las vitaminas hidrocolublec tienen poco en común desde el punto de vistaquimico.
IMPORTANCIA BIOMEDICA La ausencia o deficiencia relativa de vitaminas en la dieta conduce a estados caracteristicos por defecto y a enfermedades. La deficiencia de una sola vitamina del complejo B es rara, puesto que dietas pobres por lo general producen estados deficientes múltiples. No obstante, síndromes definidos son caracteristicos de deficiencias de vitaminas específicas. Entre las vitaminas hidrosolubles, se reconocen los siguientes estados por deficiencia: beriberi (deficiencia de tiamina); queilocis, glositis, seborrea y fotofobia (deficiencia de riboflavina}; pelagra (deficiencia de
niacina); ncuritis periférica (deficiencia dc piridoxina); anemia megaloblastica, aciduria metilmalónica y anemia perniciosa (deficiencia de cobalamina); anemia megaloblástica (deficiencia de acido folico) y escorbuto (deficiencia de acido ascbrbica). Las deficiencias vitaminicas se evitan por consumo de alimentos variados en cantidades adecuadas.
LAS VITAMINAS DEL COMPLEJO B SON COFACTORES EN REACCIONES ENZIMATICAS Las vitaminas B esenciales para la nutricion humana son: 1) tiaminalvitamina BI),2) riboflavina(vitamina B?), 3) niacina (acido nicotínico, nicotinamida, vitamina B3),4) acido pantotdnico (vitamina Bs),5) vitamina Br, (piridoxina, piridoxal, piridoxamina), 6) bietina, 7 ) vitamina Blz (cobalamina) y 8) hcido f ~ l i c o(acido pteroilglutárnico). Debido a su solubilidad en agua, 10s excesos de estas vitaminas se excretan en la orina, de modo que rara vez se acumulan en concentraciones tbxicas. Por la misma razhn, su almaccna.je es limitado (aparte de cobalamina) y como consecuencia deben recibirse con regularidad.
La tiamina consiste en una pirimidina sustituida enb a d a por un puente metileno a un tiazol sustituido (fígura 52-11,
Figura 52-1. Tiamina. A: La C: Forma carbanión
vitamina libre B: En el difosfato de tiamina el grupo -OH
La forma activa es et difosfato de tiamina Una t iaminadifo~fotransferasadependiente de ATP, presente en encéfalo e hígado se ocupa de la convers i ~ dc n tiamina a su forma activa, difbsfato de tiarnina (pirofosfato) (figura 52-1).
Difosfato de tiamina sirve como coenzirna en reacciones que transfieren una unidad aldehído activada Existen dos tipos de estas reacciones: 1 ) una dcscarboxilacíón oxidativa de alfa-cetoácidoc (por ejemplo. alfa-cctoglutarato, piruvato y los anhlogos alfa-cetoácido~dc leucina, isoleucina y valina} y 2) reacciones transcetolasas (por e.j.emplo, en Iñ vía del fosfato de pentosa}. Todas estas reacciones se inhiben por la deficicncia de tiamina. En cada caso, el difosfatn de tiamina proporciona un carbono reactivo eii el tia701 que forma un carbanión (figura 52-11, el cual se libera más tarde para agregarse al grupa carbonilo de, por ejemplo, piruvato (figura 19-5). Luego, el cnin p~iesttoagrcgado se descarboxi la con eliminación de CO:. Esta reacción ocurre en iin complejo m~iltienzimaíico conocido como comple-jo de piruvato deshidrogenasa (véase capitulo 19 para mas detalles}. La dcscarboxilaciiin oxidativa de alfa-cetoglutarato a succinil-COA y Coz(capitulo 18) se cataliza por un coniplejo enzimitico muy seme-jante en su csiructura al de piruvato deshidrogenasa. 11e nuevo, cl difost'nto de tiarnina proporciona un carhanibn estable para reaccionar con el carbono al fa del alfa-cetoglutarato. IJna dcscarboxilacion oxidativa semejante de derivados del acido aria-cetocarboxilico de aminoácidos de cadena ramificada (capítulo 32) utiliza difosfato de tiainina. La actividad del difosfato de tiarnina como coenzima en reacciones transcetolasas (capitulo 22) es muy semejante al descrito para descarhoxilaciones oxidativas.
se remplaza por un pirofosfalo.
La carencia de tiamina causa beriberi y síndromes por deficiencia relacionados En la deficiencia humana de tiamina, se suspenden las reacciones que dependen de ella o se limitan en forma importante y producen acumulación de sustratos, por ejemplo, piruvato, pentoazúcares y derivados alfa-cetocarboxilados de los aminoacidos ramificados leucina. isoleucina y valina. La tiamina se distribuye en casi todos los tejidos vegetales y animales usados comúnmente como alimentos, pero su contenido por lo general es pequeño. Los cereales sin refinar y la carne son fiientes adecuadas de esta vitarnirra. El beriberi e5 causado por dietas ricas en carbohidratos/escasas en tiamina, por ejemplo, arroz descascarado u otros alimentos muy refinados como azúcar y harina blanca usados como fuente principal de nutrientes. Los sintomas tempranos son neuropatia periferica, agotamiento, anorexia, que conducen a cdema y degeneración cardiovascular, neuroIOgica y muscular. La encefalopatía de Wernicke es un estado que se vincula con deficiencia de tiamina. Se encuentra con frecuencia en alcohOlicos criinicos que consumen pocos alimentos. Algunos pescados crudos contienen una enzima tcrmolhbil (tiaminasa) que destruye la tiamina, pero éstos no se consideran críticos en nutrición humana. La actividad de la trancetorasa eritrocitaria se emplea como una medida de la deficiencia de tiamina al igual que la excrecion urinaria de tiarnina y su concentracibn sanguínea.
Consiste en un anillo isoaloxacina heterocíclico adherido al alcohol del azúcar, ribitol (figura 52-2). Es un pigmento fluorescente, coloreado y algo termoestable, pero se descompone en presencia de luz visible.
k.~rrucrura y fincibn de 107 vitaminas hidrosolubles e 707
Los FMN y FAD actúan como grupos protéticos de enrimas oxidorreductasas Estas enzimas se conocen como flavoproteinas. En general, los grupos proteticos se enlazan con fuerza pero no por covalencia a sus apoprotcínas. Muchas enzimas flavoproteínicas contienen uno o mas metales, por ejemplo, rnolibdeno y hierro, como cofactores cscncialcs y se les designa como metalofla-
H-C-OH
HLC-H
vopmteinas.
Las enziinas flavoproteínas están muy extendidas y las representan varias oxidorrcductasas importantes en el metabolismo de los marniferos, por ejemplo, alfa-arninohcido oxidasa en la desaminación de aminohcidos (figura 3 1-7), xantina oxidasa en Ia degradacilrn de purinas (capitulo 36), aldehfdo deshidrogenasa en la dcgradacion de aldehidos, glicerol-3-fnsfato deshidrogcnasa mitocondrial en la transportaciiin de equivalentes rcductores del: citosol a la mitocondria (figura 14-1 41, succinato deshidrogenasa en el ciclo del ácido cítrico (cuadro 18-l), acil-COA deshidrogenasa y la flavoproteína que transfiere electrones en Ea oxidación de hcidos grasos (capitulo 24) y dihidrolipoilde~hidrogenasacn la descarboxilación oxidativa de piruvato y alfa-cetoglutarato (capitulo 19);NADI I deshidrogenasa es un componente importante de la cadena respiratoria en la rnitocondria (capitulo 14). Todos esíos sistemas cnzimAticos se alteran en deficiencia de rihoflavina. En su papel de coenzimas, las flavoproteinas experimentan reduccion reversible dcl anillo de isoaloxacina para producir las formas reducidas FMNHz y FADFI2 (figura 13-21,
Y
Flavina Figura 52-2. Riboflavina En el fosfate de riboflavina (mononuclebtido de flavina, FMN), el -0H se rernplaza por fosfato.
La riboflavina activa es el mononucfeótido de fiavina (FMN) y el dinucleótido de flavina y adenina (FADI El FMN se forma de riboflavina por focforilacicin dependiente de ATP (figura 52-Z), en tanto que FAD se sintetiza por iina reacción adicional con ATP en donde la rraccion AMP del ATP se transfiere a FMN (figura 52-3).
P1mf0sfato
A
II
E
cH, -O - P - o - P -O-CHI I 1 o- 0H-( -0H
MC-OH/
H-C-H
H-C
1
v Adenina
NH
T
Flavina
Figura 52-3. Dinucleótido de flavina y adenina (FAD).
La carencia de ribofiavina causa un síndrome general de deficiencia no mortal En vista de sus funciones metabolicas tan amplias sorprende que la deficiencia de riboflavina no condiizca a estados patolhgicos mayores que amcnaccn 13 vida. No obstante, cuando hay deficiencia se observan varios sintomas que incluyen estomatitis angular, quei losis, seborrea y fotofobia. Riboflavina se sintetiza en vegetaIes y microorgan ismos, pero no en mamíferos. Levadura, higado y riñón son iiientes adecuadas de la vitamina, que se absorbe cii cl intcstino por una secuencia de fosfbril~ción-desfosforilaci6nen la mucosa. Hormonas (por ejcmplo, tiroides y ACTH), medicamentos (como proinacina. un inhibidor competitivo) y factores nutricionalcs afectan la conversión de riboflavina a siis forinas cofactores. Debido a su sensibilidad a la luz, puede producirse deficiencia de riboflavina en lactantes con hiperbilirrubinemia que se tratan con fototerapia. La actividad de la glutatión reductasa del eritrocito se utiliza para el análisis del estado de la riboflavina (figura 22-3).
genasas que se enciientran en el cilosol, por ~jeinplo
lactato deshidrogenasa y dentro de rnitocniidriar. como malato deshidrogenasa. Por tanto, son componentes críticos de numerosas vias rnetabvlicas que intervienen en la disposiciiin de carhohidratos, lipidos y am inoíicidos. En general. las deshidrogenasas ligadas a NAD' catalizan reacciones de oxidorreducción en vías oxidativas, (por ejemplo, ciclo del acido cítrico) en tantn que deshidrogenasas ligadas a N A D P ' o reductasas se encuentran a menudo en vias que se ocupan dc sintesis reduciivas. por e-jcmpIo, la via del fosfato de pentosa (o pentosa fosfato). El mecanismo de oxidorreducción comprende adicihn rcvcrsible de un ion hibrido (H-) al anillo de piridina mks la generación de ion hidrbgeno librc (H') (figura 13-5). por ejemplo: NAD' + AHz H NADH + H ' +A
La carencia de niacina causa el síndrome por deficiencia pelagra
Niacina es el nombre genérico de acido nicotinico y nicotinamida, que pueden actuar (uno y otro) como fuente de la vitamina en la dieta. El Acido nicatlnico es un derivado ácido monocarboxílico de piridina (figura 5 2 4 ) .
La niacina activa es el dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD') y también el fosfato de dinucleótido de adenina y nicotinamida (NADP') El nicotinato es la forma de niacina que se requiere para la síntesis de N AD' y N ADP' por enzimas presentes en el citosol de gran parte de las células. Por tanto, cualquier nicotinamida dietética debe pasar primero por desarnidaci~na nicotinato (figura 5 2 4 ) . En el citosol, el nicotinato se convierte a desamidoNAD' al reaccionar primero con 1-pirofosfato de 5-fosforribosilo (PRPP) y luego por adenilacihn con ATP. El grupo amido de glutñmina contribuye para formar la coenzima NAD-. Ésta pucdc fosforilarse m i s adelante a NADP".
Los NAO' y NADP' son coenzimas de numerosas enzimas oxidorreductasas Los nucleót-idos de nicotinamida y adenina tienen multiples actividades como coenzimas para deshidro-
Los sintomas son pérdida de peso, trastornos digestivos, dermatitis, depresión y demencia. La niacina se distribuye con amplitud en alimentos animales y vegetales. No obstante, la valoracibn de la cantidad de niacina en un alimento debe tomar en cuenta el hecho de que el aminohcido esencial triptófano puede convertirse a NAD' (figura 5 2 4 ) . Por cada 60 mg de triptófano, puede generarce el equivalente de 1 m g de niacina. Así, para que una dieta produzca deficiencia de niacina debe ser pobre en niacina y triptbfano. Este problema se presenta en poblaciones que dependen del maíz como nutriente bAsico y da lugar a pelagra. En el maíz, de hecho, si hay niacina, pero se encuentra en una forma unida no disponible, niacitina, de la cual la niacina puede liberarse por pretratamiento con BIcali. La dependencia alimentaria de sorgo también es pelagragenica, debido no a SU bajo contenido en triptófano sino a un exceso de leucina. Al parecer, el exceso dietkiico de leucina puede causar deficiencia de niacina por inhibicibn de quinolato fosforribosil-transferasa, enzima clave en la conversión de lriptbfano a NAD' (figura 5 2 4 ) . También debe observarse que el fosfata de piridoxal, forma activa de la vitamina Rh, interviene como cofactor en la vía de slntesic de NAD' a partir de triptófano (figura 5 2 4 ) y por tanto su deficiencia puede potenciar la de niacina. Otros estados que conducen a síntomas de pelagra son la administración de algunos fármacoi como isoniacida, el síndrome del carcinoidc maligno en donde el metabolismo de tripihfano se desvia a sero-
Esfrzccturay funcihvn de las vifamina.7 hid~.nsoiuhdes 709
-
C II - o Nicotinalo LlULll Id
Nicotinamida
1
I
4
N-Metilnicoiinamida (metabto principal en orina)
A
0 11
Mononuclsbtidode nimtinato (NMN)
Quinolinata
II
o 2-Amino-3-carhxirnunonoaldehido
+
+ PP,
Giutarnato
Adenina Varios pasos (figura 32-1 8 ) PRibosa
DI& Figura 5 2 4 . Biosíntesis y degradactón d e dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD*) El grupo 2'-hidroxilo (*) de la ribosa del fragmento adenosina se fosforila a fosfato d e dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP') El ser humano, pero no los gatos, puede obtener toda su requerimiento de niacina a partir de triptbfano si hay suficiente cantrdad de éste en los alimentas Normalmente, alrededor de dos terceras partes proceden de esta fuente. (PRPP, 5-focforrrbosil-1 -pirofosfato. QPRT, quinolinato fosforribosil transferasa; PLP, fosfato de piridoxal )
710 0 Bioquímica de Harper
(Capítulo 52)
tonina y la enfermedad de Hartnup, en donde la absorci6n de triptófano estl alterada. El ácido nicotinico (pero w nicotinamida) se usa en terapéutica para reducir el colesterol plasmhtico. Esto se deben bloqueo del flujo de Bcidos grasos libres desde el tejido adiposo, que reduce la formación de las lipoproteinac VLDL, IDL y LDL, transportadoras de colesterol (capitu !o 28).
La deficiencia de ácido pantoténico es rara Esto se debe a su amplia distribuciónen los alimentos pero
es en parsicular abundante en tejidos animales, cereales integrales y legumbres. No obstante, el síndrome del pie quemante se atribuye adeficienciadepantotenato en prisioneros dc guerra y acompaña a una reducción en la capacidad de acetilación.
VITAMINA 8 6 El ácido pantoténico se forma por combinacibn de acido pantoico y beta-alanina (figura 52-5).
El ácido pantoténico activo es la coentima A (COA) y también la proteína portadora de acilos (ACP) El hcido pantoténico se absorix con facilidad en el intestino y a continuacibn se fosforila por ATF para formar 4'-fo~fo~antotenato (figura 5 2 4 ) . La adicibn de cisteina y la eliminación de su grupo carboxilo conduce a adición neta de tioetanolamina, que genera 4'-fo~fo~anteteína, grupo protético de COA y ACP. Igual que las coenzimas activas de tantas otras vitaminas hidrosolubles, COA contiene un nucledtido de adenina. Por tanto, la 4'-fo~fo~anteteina se adenila por ATP pasa formar desfosfo-COA. La fosforilación final ocurre con fosfato, procedente de ATP, agregado al grupo 3'-oxihidrilo de la kacción ribosa para generar COA(figura 5 2 4 ) .
El grupo tiol actúa como portador de radicales acilo en COA y ACP Esto ocurre con COA en reacciones del ciclo del Acido cítrico (capítulo 181, oxidación y sintesis de Acidos grasos (capítulos 23 y 24), acetilaciones (por ejemplo, de fármacos) y sintesis de colesterol (capitulo 28). La ACP participa en reacciones de la síntesis de ácidos grasos. Es costumbre abreviar la estructura de COA libre (es decir, reducida) como COA-SH, en donde: el grupo reactivo SH se incluye en las siglas.
Acldo pantoico
p-Alanina
Está constituida por tres derivados de piridina estrechamente relacionados: piridoxina, piridoxal y piridoxamina (figura 52-7) y sus fosfatos correspondfentcs. De estos, piridaxina, fosfato de piridoxal y fosfato de píridoxamina son tos representantes principales de la vitamina en los alimentos. Los tres tienen la misma actividad vitaminica.
Fosfato de piridoxal es la vitamina B6activa Todas las formas de Bh se absorben del intestino pero durante la digestibn hay cierta hidrólisis de ésteres de fosfato. El fosfato de piridoxal es la forma principal transponada en el plasma. La mayor parte de los tejidos contienen la enzima piridoxal cinasa, que es capaz de catarizar 3a fosforilación por ATP de las formas desfosforiladas de la vitamina a sus ésteres de fosfato respectivos (figura 52-8). Aunque el fosfato de piridoxal es la vitamina B6 mhs activa como coenzima, tarnbiCn el fosfato de piridoxamina actúa como coenzima activa.
Fosfato de piridoxal es la coenzima para varias enzimas del metabolismo de aminoácidos Mediante una combinacibn, designada como base de Schiff, entre su grupo aldehido y el radical amino de un alfa-aminoácido (figura 52-9), el fosfato de piridoxal puede facilitar los cambios en las tres enlaces remanentes del carbono alfa-amino para permitir trancaminación (figura 3 1A$,descarboxilación (figura 33-9) o actividad de treonina aIdolasa (figura 32-1 l), respectivamente. La función del fosfato de piridoxal en la transarninación se ilustra en la figura 52-1 0.
Además, el fosfato de piridoxal actúa en la glucogenolisis Figura 52-5. Acido pantoténico.
La coenzima es parte integral del mecanismo de acci6n de la fosforilasa, cnzima que media la degradacihn de
E.~truciuray filncrcin de lus vitaminas hidrosolubles O
o.lf
Pantolenata
H3C I
O 11
OH
O
I
I I H
-0-P-O-CHp-C-CH-C-N-CHp-CH2-COOI I oH3C
4-Fosfopantotenato
Cisteina
ATP
o-
HF
O
H& 1
11
4-Fosfopantotenil clsteína
OH
O
b
I I H
O
11
H
-O-P-O-CHp-C-CH-C-N-CH2-CHP-C-N-CH,-CH,-SH-
ACP
ATP
ADP
Acido pantoico
Tioetanolamina
(I-Alanina 7
I:
l C H , - C - C H - C - N - C H , - C H ,
-
b
o II
H
-C-N-CHp-CHI-
I
6H
H3C
Adenina Coenzima A
Ribosa 3-fosfato
Figura 5 2 4 . Bioslntesis de coenzima A a partir de Bcido pantoténico. (ACP, proteína portadora de acilos.)
7 11
712 Bioquímica de Harper
(Capitulo 52)
O
4
Transaminasa
C-H
5 I '
Treonina aldolasa
2c N c D.s,*oxil.,
11
C- H
Flgura 52-9. Enlaces covakentes de un m-aminoácido que pueden volverse reactivos por su fjacibn a varias enzimas especificas de fosfato de piridoxal.
Piridoxamina
Figura 52-7. Formas presentes en la naturaleza de vitarni-
na Bs.
ha deficiencia de vitamina Bs puede presentarse en lactantes y alcohólicos y durante la terapéutica con isoniacida glucbgeno (capituto 20). En esta accibn tarnbih forma una base de Schiff inicial con un grupo epsilonamino de un residuo de Iisina de la enzima que, sin embargo, permanece intacta a travts de la fosforblisis del enlace glucosidico 1 + 4 para formar 1-fosfato de glucosa. La fosforilasa muscular utitiza hasta 70 a 80% de la vitamina B6 corporal total.
//
o
C-H I
La deficiencia por falta de vitamina B6sola es rara, de manera que cualquier problema de este tipo forma parte de una deficiencia general de vitaminas del complejo B. El higado, macarela, aguacates, plbanos, carne. verduras v huevos son fuentes adecuadas de la vitamina. En lactantes amamantados es posible reconocer deficiencia cuando las madres agotan su vitamina debido al uso prolongado de anticonceptivos orales. Los alcohblicos también pueden mostrar deficiencia debido a que el metabolismo del etanol a acetaldehido estimula la hidrhlisis de! focfato de la coenzima. Un medicamento antituberculoso usado de manera extensa, isoniacida, puede inducir deficiencia de vitamina B6 por formar una hidrazona con el piridoxa1 (figura 52-1 1).
""0 '""
H3C
H
Piridoxal
La biotina es un derivado imidazblico distribuido en forma extensa en alimentos naturales (figura 52-12). Dado que un gran porcentaje del requerimiento humano de biotina se obtiene por sintesis en bacterias intestinales, su deficiencia no se produce s61o por una ingestihn dietktica pobre sino por defectos en su utilizacibn.
Biotina es una coenzima de carboxilasas H Fosfato de piridoxal
Figura 5 2 4 , Fosforilacidn de piridoxal por accibn de piridoxalcinaca para fomaa fosfato de piridoxal
La biotina funciona como un componente de enzirnas multisubunitarias especificas (cuadro 52-1) que catalizan carboxilaciones. Cada unidad es un complejo multienzima que contiene tres componentes sobre una cadena polipdptida, que incluye una protefna por-
Estructura y funcih de las vrtaminas hidrosolubles
Fosfato de pirodoxat
713
tadora de biotina, biotina carboxilasa, y una trans-carboxilasa. Un ion carboxilato se adhiere a N' de la biotina y genera un intermedio activado, carboxibiotina adherida a una proteína portadora de biotina (figura 52-1 3). Este paso requiere HC03; ATP, ~ g ~ y acetil-COA (como efector alosterico). Luego, el grupo carboxilo activado se transfiere al sustrato de la reaccidn, por ejemplo, piruvato.
enzjma
El consumo de huevos crudos puede causar deficiencia de biotina La clara de huevo contiene a una protelna termolAbi1, avidina, que se combina en forma consistente con biotina lo que impide su absorcion e induce deficiencia. Los síntomas incluyen depresión, alucinaciones, dolor muscular y dermatitis. La ausencia de la enzima holocarboxilasa sintasa, que se adhiere la biotina al residuo de lisina de las proteinas transportadoras de biotina, es la causa de deficiencia be carboxilasa rnultiple y también de deficiencia de biotina que incluyen acumulacion de sustratos de las enzima que dependen de esta coenzima, los cualespueden detectarse en la orina. Estos metabolitos son lactato, beta-metilcrotonato, beta-hidroxiisovalerato y beta-hidroxipropionato. En algunos casos, los nifíos con esta deficiencia tienen enfermedades por inrnunodeficiencia. Existen también defectos hereditarios causados por una sola deficiencia de una icnica carboxilasa.
VITAMINA 8 1 2
a-CetOZiCklO
(producto)
1 U
a-CetoAcido (sustrato)
La vitamina Bil (cobalamina) tiene una estructura cíclica compleja (anillo corrin), semejante a las porfirinas, al cual se une un ion cobalto albergado en su centro (figura 52-14). La vitamina se sintetiza en forma exclusiva por microorganismos. Por tanto, no existe en vegetales, a menos que estCn contaminados con microorganismos, pero se conserva en animales en el higado, donde se encuentra como metilcobalamina, adenosilcobalamina e hfdroxicobalarnina.Por tanto, el hígado es fuente adecuada de la vitamina, Io mismo que las levaduras. La preparacihn comercial es cianocobalamina.
Fosfato de picidoxarnina-enzima
Figura 52-1 0. La funcibn de la coenzima fosfato de piridoxal en la transaminacibn de un a-aminoácido. La primera fase comprende la produccibn del a-oeto8cida correspondientey fosfato de piridoxamina-enzima, segurdo por inversibndel procese mediante un a-cetoAddo nuevo coma sustrato. Se observa que el fosfato de piridoxab inicial se une a su apoenzima por una base de Schiff unida entre su grupo aldehldo y un grupo amino de la enzima (un grupo €-aminode un residuo de lisina) y por media de un enlace ibnica entre su fosfato y la enzima. El grupo a-amino de un sustrato aminoacida desplaza al grupo E-amino para formar una nueva base de Schiff.
714 Broqzrimica de Harper
(Capitulo 42)
Cuadro 52-1. Enzimas que dependen de biotina
en anima1-. -.--- -.
O
CH,OH Piridoxal
(isoniacida)
-mas
-
H
Hidracina de isoniuitinato
I
-
Pimvaro carboxilasa 1 rrimera reaccion en ia uia que convic:rte precur?ore< de t carhorros a glucsusa (gluco
nogen esis) 1
n -A-.---
r i UVKI
~i.íain~crniu v a ~n ci L I C ~ O
del Bc ido citrico Dirige i~ n i d n d e sacetato a la .-~-"r---slntesi S de hcidoh a b u hpor cion dc ma
'ropionilboxilasa
Figura 52-1 1. Formacibn de piridoxal-hidrazona,de excrerapda,a de piiidoxal e hidracina de iranjcolinafo
0-Mrtilcrotonil-Coi\ tL%taholismode leucina Y cienos carboxilasa
(isen iacida).
El factor intrínseco gástrico es necesario para la absorción de vitamina 8 1 2 La absorcibn intestinal de vitamina B I es~mediada por sitios receptores en el íleo, que requietnenque est.6 unida a una glucoproteina muy especifica, el factor intrínseco, secretado por las celulas parietales de la mucosa ghtrica. Después de su absorción, la vitamina se une a una proteina plasmfitica, conocida como transcobalamina 11, para su transporte a los tejidos. Se almacena en el higado, propiedad única para una vitamina hidrosoluble, unida a transcobalamina 1.
e propionil netilmnl onil-COA de .. . convc rsion de propionato a succiriato, que luego puede cida del hcido cítrico entrar al . compuestos
isopreiioidcs
Las coenzimas BI2 activas son metilcobalamina y desoxiadenosilcobalamina Desputis de su transporte en la sangre, la cobalamina libre pasa al citosol de las cilulas como hidroxicobalamina. En el citosol se convierte ametiPcobatamina o entra a las mitocondrias para formar 5'-desoxiadenosilcobalamina.
Desoxiadenosilcobalamina es la coenzima Dara la conversión de metilmalonil-COAa sriccinil-COA (figura 52-15) ~ s t es a una reacción crítica en la via de conversion del propionato a un miembro del ciclo del Acido citrico y, por tanto, tiene importancia en el proceso de gluconeogénesis (figura 2 1-2). Es de gran significación en rumiantes, ya que propionato es el producto principal de la fermentación microbiana en el rumen.
O II
/c.
H-N N-H I I H - C C - H I I H,C, ,CM- (CH2IiCOOH
S
Figura 52-12. Biotina.
Metilcaba!amina es la coenzima en la conversión combinada de i) hornocisteína a metionina y 2) metiltetrahidrofolato a tetrahidrafolato (figura 52-1 5) En esta reaccibn, el grupo metilo unido a la cobalamina se transfiere a hornocisteha para formar metionina y
Estruciura y fiinciún de las vitaminas hidrosoluhl~~~ 7 15
Oxalacetato
o- o
'
ATP + HE),"
Q=C
,c, HN 1
btg2+
NH
I
HC-CH
T
I
HCH!
ADP
I
coo\
1
CARBOXltASA
I
coo-
A
Biotina
HC-CH
I
enzima
HC-
S'
Anhidrido fosfórico carMniui
II
Biotinaenzima
c=o
1
C=O Z Z n a -
1
portadora
Figura 52-13. Fomacibn del wmplejo COZ-biotina y su participacionen carboxilacibn del piruvato. En este ejemplo, la enzima
es piruvato carboxilaca.
(CH,),-
NH,CO
CONH, CH
GH3
-CH,
CONH,
CH-
CH2-
NH
HO - CH;
Figura 52-14. Vitamina Bi2 (cobalamina) La R puede cambiar para dar varias formas de la vitamina, por ejemplo R = CN en cianocobalamina; R = OH en hidroximbalamina: R = 5'-desoxiadenosilo en 5'-desoxiadenostlcobalarnina, y R = CH3 en metilcobalarntna.
SH l (CH,),
I H - C -NHQ I
coo-
cooMetionina
Homocistelna
Metilcobalamrna
Hidroxiwbalamina
CH3
I
H - C-COOI C- S- COA
Il O
L-Metilmalonil-COA
I
812
I
wenzima vitamina 5 1 2 La deficiencia de vitamina 8 1 2 conduce a inhibictbn de la actividad d e metiimalonil-COAmutasa y de metionina sintasa lo cual desencadena aciduria rnetilmalónica, homocistinuria y atrapamiento del folato como metil-H4 folato (la trampa de folato)
H-C-H
Bj2
Desoxiadenosilcobalamina
Figura 52-1 5. Las dos importantes reacciones catalizadas por las enzimas dependen de la
CH2-C00-
-
I
c - S - COA
oII
Succinil-COA
luego, la cobalamina remueve el grupo metilo de M-metiltetrahidrofolato para dejar tetrahidrofolato. Los beneficios metabblicos de esta reacción son que las reservas de metionina se conservan y se dispone de tetrahidrofolato para que participe en las síntesis de purina, pirimidina y 6cido nucleico.
La deficiencia de vitamina BI2 produce anemia megaloblástica Cuando la absorción se impide por carencia de factor ineinseco (o por gastrectomia) el estado se conoce como anemia perniciosa. Los vegetarianos tienen riesgo de deficiencia dietética real ya que la vitamina se encuentra sblo en alimentos de origen animal o en microorganismos; desde este punto de vista, los alimentos contaminados son benkficos. La deficiencia conduce a alteración de la reaccibn catalizada por metionina sintasa. La anemia se debe a trastorno en la , síntesis de DNA que afecta a la fortnaci6n del núcleo en eritrocitos nuevos. La causa es una disminucibn en la sintesis de purina y pirimidina por deficiencia de tetrahidrofolato debida a que el folato queda atrapado como metiltetrahidrofolato (la "trampa del folato") (figura 52-15). También ocurren homocistinuria y -. aciduria rnetilmalónica. El trastorno neurologico que * acompafia a la deficiencia de vitamina B,, puede ser secundario a una deficiencia relativa de metionina. Se conocen cuatro trastornos hereditarios del metabolismo de cobalamina. Dos afectan la sintesis de desoxiadenosilcobalamina s61o; en los otros dos, los pacientes son incapaces de sintetinr desoxiadenosilcobalamina o metilcobalamina.
Folacin es el nombre gentrico que abarca al acido folico y sustancias relacionadas que tienen actividad bioquimica de Bcido fólico. El folato o k i d o fblico, contiene la base pteridina adherida a una molécula de hcido p-aminobenzoico (PABA) y a una molCcula de Acido glutfimico (figura 52-1 6). Los animales no pueden sintetizar PARA ni adherir glutamato al ácido pteroico y, por tanto, requieren folato en su alimentacibn; levadura, higado y vegetales de hojas son las mejores fuentes. En las plantas, el ácido fólico existe como un conjugado poliglutámico que consiste en una cadena polipeptidica enlazada en posici6n gamma de siete residuos de glutamato. En el higado, el folato principal es un conjugado pentaglutamilo.
\
Y
I
ácido fóiico
Flgura 52-16. Estructura y numeracidn de los htomos del lcido fblico.
Estructura yfímciOn
de las vitaminas hidrosolubirs 717
El folato activo es tetrahidrofolato (Hdfolato)
El H,fofato es el portador de unidades de un carbono activadas
Los derivados folato de la dieta se degradan por enzimas intestinales especificas a folato de monoglutamilo para su absorcidn. La mayor parte de este se reduce a tetrahidrofolato en la célula intestinal (figura 52-1 7) por la enzima folato reductasa, que usa NADPH como donador de equivalentes reductores. Es probable que los poliglutamatos de tetrahidrofolato sean las
Las unidades de un carbono hnsportadas por Nfolato rearesentan una serie de estados de oxidación. a saber. rn'etilo, metileno, rnetil formilo y formimino. ~ h o son s interconvertibles en el metabolismo {figura 52-1 81. La serina es el proveedor prin'ciial de unidades de un carbono como grupos metileno, que se transfieren en forma reversible al Hdfolato para formar glicina y M-N'hmetilen-Hlfolato, que desempefia una funcibn importante en el metabolismo de unidades de un solo carbono. Puede reducirse a N-'-metilHJolato, con importante actividad en la metilaci0n de hornocisteína que utiliza metilcobalamina como cofactor (fi ura 52-1 5). De manera alterna puede oxidarse a N -metenil-H4folato, que luego puede hidratarse a NJ"-iormil-H4folato o a N'-formil-H4folato. Este ultimo conocido tarnbitn como hcido folínico, forma estable que puede usarse para administración oral de folato reducido. Eomiminoglutarnato (Figlu), un catabolito de histidina, transfiere su grupo formimino a Hdfolato para formar fiformirnino-Hpfolato. En la deficiencia de folato el Figlu se acumula después de una carga oral de prueba con histidina.
coenairnas funcionales en los tejidos.
E
NADPH + H+
NADP+
cl
Acido tetrahidrofbliw (Hdfolato)
Reduccidn del $cid0 fdlico a Acidos dihidrofblico y tetrahidrof6lica por la enzima folatorreductasa. El trirnetoprim es un inhibidor selectivo de la folatorreductasa e n bacterias gramnegativas y tiene escaso efecto sobre la enzima d e rnamlferos. Por tanto se usa como antibibtico. El metotrexato se une con mBs fuerza y se usa como fhmiaco antidncer. Figura 52-17.
La deficiencia de folato causa anemia megaloblastica
La explicacibn para ello es análoga a la descrita para los efectos de la deficiencia de vitamina B12: N', N'O-metilen-H~folataproporciona el grupo metilo en la formación de timidilato, un precursor necesario para la sintesis de DNA y la f m a c i b n de eritrocitos (figura 52-19). Concomitante con la reduccidn del metileno a grupo metilo, H4folato se oxida a dihidrofolato, que debe reconvertirse a Hdfolato para uso ulterior. Por tanto, las células que sintetizan timidilato (para DNA) son en particular vulnerabies a inhibidores de la folatorreductasa como el metotrexato (figuras 52-1 7 y 52-19). Las complejidades de la interacción de vitamina Bit y folato son consecuencia de su pmicipacion comun en la reacción de la metionina sintasa. Por tanto, la anemia megalobliistica causada por la deficiencia de Rit puede aliviarse con alimentación enriquecida con folato, pero este tratamiento no curara la homocistinuria, la aciduria metilmalónica ni los trastornos neurol6gicos de la deficiencia de esta vitamina. La complementacjon con 400 pg de hcido fblico al día durante el periodo previo a la concepcibn puede reducir de manera importante la incidencia de los defectos del tubo neural como es la espina bifida También es importante mantener la complementacibn con ácido f6lico en los estadios fuiales del embarazo y posteriores a él, cuando muchas mujeres en un nivel bajo de nut~ici6npresentan alteraciones megaloblhsticas.
Metionina
Homocisteína Deficienciade B12
H
Serina
Glicina
H
H
NADH 7 H+ NAD*
H
Fosfato de pindoxal
CH,
I
OH
H
-0
H,C-
N ' ~
N.!'
Ni:;]3
I
OFormato e c X H $:p+p,
..
y\ Deficienua de deB!?o folato
JSíntesis ' dJ4&*bl de DNA
dqid
'
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33"'
/"" f:; L
I
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N'O
1
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"'
o~CccH
2:x;x
CH,
I
I
CH H
1
~~,~~~-~etenil-tf~folato
;!.l
WN
Deficiencia H4foiato
1
Vkase figura 3 2 4
N'-Fomii-~,foiato (ácido folínico)
Figura 52-18. Interconverciones de unidades de un carbono adheridas a tetrahidrofolato.
Estructura y júncibn de las vitarnrnas hidrosolubles 8 7j-9
Figura 52-1 9. Transferencia de un grupo metilo de dihidrofolato (Hzfolato).
N5, ~'~-metilen-~4folato a desoxiuridilata para formar desoxitimidilato y
ÁCIDO ASCORBICO (Vitamina C ) La estructura del ficido ascbbico (figura 52-20) recuerda a la glucosa, de donde deriva en gran parte de marniferos (figura 2 2 4 ) . No obstante, en primates que incluyen el hombre, y otros animales, por ejemplo: cobayos, algunos murciélagos, aves, peces e invertebrados, la ausencia de la enzima L-gulonolactona oxidasa impide esta síntesis.
m"xl
Enzima inexistent
I
ymbayl
La vitamina C activa es el propio ácido ascórbico que dona equivalentes reductores cuando el hcido ascórbico actúa como un donador de equivalentes reductores se oxida a hcido deshidroascbrbico, que por sí mismo puede actuar como fuente de la vitamina. El acido ascbrbico es un agente reductor con un potencial de hidrogeno de +0.08 V, que le permite reducir compuestos como oxígeno molecular,
tes
=
C-OH
II C - OH*
HO-C-H
l
I H C -'
I HO-C-H
I CH OH
-- z-,
iGuionolactoria
H-C-
I HO-C-H
I CH,OH &ido ascbrbico
o
I
I
o
I
I HO-C-H
I CH,OH
bcido deshidroaccbrbku
Figura 52-20. Acrdo ascórbico, su orgen en no primates y su oxidacibn a ácido deshidroascórbica ("se ioniza en aswrbato)
(Capítulo 52)
nitrato y citocromos a y c. El mecanismo de acción de muchas de las actividades del hcido accdrbico estL lejos de conocerse, pero los siguientes con algunos de los procesos mejor documentados que requieren ácido ascórbico. En muchos de estos procesos el Acido asc6rbico no participa en f m a directa, sino que se requiere para conservar un cofactor en el estado reducido; por ejemplo, Cu' en las monooxigenasas y Fe2' en las dioxigenasas. 1) Hidroxilación de prolina en la síntesis de coliigena (capitulo 57 y figura 30-1 1). 2) En la degradación de tirosina, la oxidación de p-hidroxifenilpiruvato a hornogentisato requiere vitamina C, que puede conservar el estado reducido del cobre necesario para actividad máxima (figura 32-13}. El paso subsiguiente se cataliza por homogentisato dioxigenasa, que es una enzima que contiene ion fermso y tambikn requiere ácido ascbrbico. 3) En la síntesis de adrenalina a partir de tirmina en el paco dc doparnina beta-hidroxilasa (figura 49-1). 4) En la formacién de Acido biliar durante el paso inicial de 7-alfa-hidroxilasa (capitulo 28). 5) La corteza suprarrenal contiene grandes cantidades de vitamina C que se agota con rapidez cuando a la glkdula la estimula por la hormona suprarrenocorticotrbpica. La raz6n es oscura, pero la esteroidogknesis comprende varias síntesis reductoras. 6) La absorcihn d e hierro incrementa de manera notable en presencia de vitamina C. 7) El ácido asc6rbico puede actuar como antioxidante y puede inhibir la formacibn hidrosolubCe de nitrosaminas durante la digestibn.
La deficiencia de ácido ascórbico causa escorbuto El escorbuto es el síndrome clhsico de deficiencia de vitaminac. Se relaciona con sintesis anormal de colágena, lo cual se aprecia por hemorragias subcutáneas y en otras áreas, debilidad muscular, hinchazon de áreas blandas de encías y aflojamiento de dientes y se cura por consumo de h t a s y vegetales frescos. Las reservas normales de vitamina C son suficientes para 3 a 4 meses antes de que aparezcan signos de escorbuto.
RESUMEN 1) Todas las vitaminas son nutrientes orgánicos con
diversas funciones metab6licas esenciales, necesarias en cantidades pequeiiac en la dieta debido a que el cuerpo no puede sintetizarlas. 2) Aparte de la vitamina C, todas las vitaminas solubles en agua son miembros del complejo B y acnian como cofactores de enzimas. 3) La tiamina es un cofactor en la deccarboxilación oxidativa de los alfa-cetoácidosy de una enzima importante de la vía de pentosa fosfato, la transaetolasa. 4) La riboflavina y niacina son cofactores importantes en reacciones de oxidorreducci6n. La rihoflavina constituye un grupo protetico de las enzirnas flavoproteinicas como el mononucle6tido de flavina y el dinuclebtido de adenina y flavina, en tanto que la niacina forma parte de los cofactores dinucleótido de nicotinamida y adenina y fosfato de dinuclebtido de nicotinamida y adenina de numerosas enzimas deshidrogenasas. 5) El k i d o pantotenico se encuentra en la coenzima A y la proteína transportadorade acilo, que funcionan como transportadores de grupo acilo en numerosas reacciones importantes, en tanto que el fosfato de piridoxal es la coenzima de varias enzimas del metabolismo de arninohcidos, inclusive las transarninasas. 6) La biotina es la coenzima de varias carboxilasas que incluyen acetil-COA carboxilasa, que es la enzima conroladora de la lipogenesis y piruvato carboxilasa, importante en gluconeogknesis. 7) Aunque tienen funciones separadas, la vitamina B12y el ácido fólico tornan parte en la entrega de residuos de un carbono para la sintesis de ácidos nucleicos. 8) El hcido ascótbico es un antioxidante hidrosoluble que conserva numerosos cofactores metálicas en el estado reducido. 9) La ausencia de vitamina hidrosoluble en la alimentacion provoca estados de deficiencias múltiples. La carencia de una sola vitamina conduce a un síndrome de deficiencia característico. M
REFERENCIAS Benkovfc SJ: On the mechanism of action of folate and biopterin-requiring enzymes. h n u Rev Biochem 2 980;49:227. Dakshinamurti K, Chauhan J: Biotin. Vitam Harm 1989;45:337.
Hayashi H et al.: Recent topics in pyridoxal 5'-phocphate enzyme sfudies. Annu Rev Biochem 1990;59:87. Knowles JR: The rnechanism of biotin-dependent en-mes. Annu Rev Riochem 1989;58: 195.
Esfrucluru v función de las vitaminas hidro.~duhles 721
Olson RE et al. (editors): Present KnowIedge in Nuirition, 5th ed. T'he Nutrition Foundation, Inc, 1984. Padh H: Vitarnin C: Newer insight into its biochemical functions. Nutr Rev 1991;49.65. Passmore R, Eastwood, MA: Hurnan .Vufritionand Dieteocs. Churchill Livingstone, 1986.
Rubin RH, Swartz MN: Trimethroprim-sulfam~hoxazole. N Engl J Med 1980;303:426.
SebrelE WH Jr: History of pellagra Fed Proc t981:40:1520. Seetharam B, Alpers DH: Ahsorption and transport of cobalamin (vztamin H L ~ )Annu . Rev Nutr 1982;2.343. Shane B: Folypolyglutamate synthesis and role in the regu-
lation of one-carbon metabolism. Vitam Horm 1989;45:263.
Estructura v Función de las vitaminas liposolubnles d
- .- .- - -
- . .. .
Peter A. Mayes PhO, DSc
Las vitaminas liposolubles sm moléculas hidrófobas apolares, que derivan del isopreno (figura 53-1). N o pueden sintetizarse en el cuerpo en cantidad adecuada, por lo cual deben ser suministradas por la alimentacibn. S610 pueden absorberse con eficiencia cuando la absorcibn de lipidos es normal. Una vez absorbidas, deben transportarse en la sangre de la misma manera que cualquier lípido apolar, en lipopr* teinas o proteinas fijadoras especificas. Las vitaminas liposolubles tienen funciones variadas, por ejemplo, vitamina A, la vista; vitamina D, metabolismo de calcio y fosfato; vitamina E, antioxidante; vitamina K, coagulación sanguínea. Aunque en un tiempo se pensb que la vitamina D era exclusivamente una vitamina, en realidad es una prohormona.
vitamina A produce ceguera nocturna y xeroftatmia: la de vitamina D, raquitismo en niños pequefíos y osteomalacia en adultos; la de vitamina E, que es muy poco común, trastornos neurológicos y anemia en el recien nacido; la deficiencia de vitamina K, que tarnbien es muy rara en adultos, provoca hemorragia en el recién nacido. Debido a la capacidad del organismo para almacenar sobrantes de vitaminas liposolubles, la ingestión excesiva de vitaminas A y D pueden causar intoxicación. A la vitamina A y al beta-caroteno (provitamina A) así como a la vitamina E se les ha atribuido una accibn preventiva de chncer, debida a sus propiedades antioxidantes.
VITAMINA A
IMPORTANCIA BIOMÉDICA
La vitamina A o retinol, es un compuesto poliisoprenoide que contiene un anillo ciclohexenilo (figura 53-2). Vitamina A es un término gendrico que abarca a todos los compuestos de origen animal que presen-
Los estados que afectan la digestión y absorcibn de las vitaminas liposolubles, como la esteatorrea y los trastornos del sistema biliar, pueden conducir adeficiencias. Las carencias alirnentarias afectan las funciones de estas vitaminas; por ejemplo, la deficiencia de
tan actividad bioldgíca de vitamina A. Su almacenaje principal es como esteres de retinol en el hígado y sus funciones mas importantes son como fuente mayor de retinol y sus dos derivados retina1 y hcidn retinoico. El término retinoides se ha usado para describir tanto formas naturales como análogos sintéticos del retinol.
Figura 53-T. Dos representaciones del isopreno.
Figura 53-2. Retinol {vitamina A)
La vitamina A tiene una provitamina, el beta-caroteno En los vegetales, la vitamina A existe como provitamina, un pigmento amarillo llamado beta caroteno, constituido por dos moléculas de retinal unidas en el extremo aldehído de sus cadenas de carbonato (figura 53-3). No obstante, debido a que beta caroteno no se metaboliza con eficiencia a vitamina A, peso por peso, beta caroteno tiene sOlo un sexto de la eficiencia como fuente de vitamina A comparado con retinol. Los compuestos análogos al beta caroteno se conocen como carotenoides.
La digestibn de la vitamina A acompaña a la de lípidos, seguida de transformaciones en la mucosa intestinal Los esteres de retinol disueltos en la grasa de la dieta se dispersan en gotitas de bilis y se hidralizan en la luz intestinal, proceso seguido por la absorcibn directa en el epitelio intestinal. Los beta carotenos ingeridos pueden fraccionase mediante oxidacibn con betacaroteno dioxigenasa (figura 53-3). Ese des-
DIOXIGENASA
doblamiento, que utiliza oxigeno molecular, es incrementado por la presencia de sales biliares y genera dos moldculas de retinaldehido (renital). Esta reaccion no puede producirse en el gato, que debe recibir la mayor parte de su vitamina A en los alimentos. En la misma mucosa intestinal, el retinal se reduce a retinol por accibn de una retinaldehído reductasa específica que utiliza NADPH. Una fraccion peqwefia del retinal se oxida a hcido retinoico. La mayor parte del retinol se esterifica con ácidos g r a o s saturados y se incorpora a quiEomicrones linfáticos (capitulo 271, que entran al torrente sanguineo. Éstos se convierten en quilomicrones remanentes, que son captados por el higado junto con su contenido de retinol. Los carotenoides pueden escapar a algunos de estos procesos y pasar directamente a los quilomicrones.
La vitamina A se almacena en el hígado y se libera en la sangre unida a proteínas fijadoras En el hígado, la vitamina A se almacena como un &ter en los lipocitos, quiz8 como un complejo lipoglucoproteínico. Para su transporte a los tejidos, se hidrotiza
Sales billares
Rehnaldehldo (retinal, vitamina A l ) NADPH (NADH)
CH,
Retinaldehído
CH,
CH,OH
Retinwl (vitamina A)
h i d o retinoico (todo trans)
Figura 53-3. El beta caroteno y su desdoblamiento a retinaldehldo. Tambibn se muestran la reduccidn de retinaldehido a retinol y su oxidacibn a Acido retinoiw. Tambibn se forma ácido Pcis y 3-os-retinoico.
Esfrucfzaray funcicin de las vifaminasliposoluhles
y el retinol se une a proteína fijadora de apo retinol (RBP, del inglds, aporetinol b~ndrnl:protein).El holo RRP resultante se procesa en el aparato de Golgi y se secreta al plasma. Es captado por los tejidos mediante receptores de superficie. Por su parte, el icido retinoico es transportado en el plasma unido a la albúmina. Una vez dentro de las c6lulas tisulares (no hepáticas), el retinol se une a una proteína fijadora de retinol celular (CRBP, del inglks, cellular retinol bindiP?g prolein). La toxicidad de la vitamina A (hipervitaminosis) se produce después de haber que se excede la capacidad de RBP y de que lar cklulas queden expuestas a retinol libre. Puede presentarse por el uso excesivo de complementos de vitamina A y se ha observado en los exploradores del artico que consumen cantidades abundantes de higado de oso polar, dado que este animal es eI eslabon final de la vitamina A en la cadena alimentaria.
El retinol, el retinal y el ácido retinoico tienen sus propias funciones biológicas Unicas El retinol y el retinal se interconvierten en presencia de deshidrogenasas o reductasas que requieren NAD o NADP, presentes en numerosos tejidos. Sin tmbargo, una vez formado a partir del retinal, el Acido retinoico no puede regresar a retinal o a retinol. Asi, el hcido retinoico puede ayudar en el crecimiento y diferenciación, pero no rernplata al retinal en su finci6n en la visión ni al retinol en su apoyo al cisterna reproductor.
725
El ñetinol y el ácido retinoico actuan como hormonas esteroides Cuando el retinol es captado por la CRBP, esta lo transporta a la cdlula donde se une a proteínas nucleares y es probable que intervenga en el control de la expresión de ciertos genes. Por tanto, a este respecto, la vitamina A se comporta de modo semejante a las hormonas esteroides. Se han descrito receptores nucleares para el ácido retinoico (todo-rram) y el Acido 9-cis retinoico. Son miembros de la superfamilia de proteínas del receptor de esteroides, tiroidtos y hcido retinoico. Al k i d o retinoico se le implica en la promocibn de la regeneración de los miembros en los anfibios y en el control de la síntesis de fosfolípido surfactante pulmonar. El requerimiento de vitamina A para la reproduccibn normal puede atribuirse a esta función.
El retinal es un componente del pigmento visual rodopsina La rodopsina se encuentra en tas c&lulasen bastoncillo de la retina que se encargan de la visibn cuando la luz es escasa. El 1 1-ck-retinal, que es un isómerode retinal todo frans, se une de manera especifica a la proteina visual opsina para formar rodopsina (figura 53-4). Cuando la rodopsina se expone a la luz, se disocia conforme pierde color y forma retinal y opsina todo rram. Esta reaccibn se acompafia de un cambio de conformación que induce a un conducto del calcio iónico en la membrana celular del bastoncillo. La entrada rápida de iones calcio desencadena un impulso nervioso, permitiendo que la luz se perciba en el cerebro.
Retina! todo-trans 1 4-crs -Retina1 HC
Figura 5 3 4 . El 11-as-retinal, formado de retina todo-trans se combina con opsina para formar rodopsina en la célula bastoncillo del ojo. La abcorcibn de un fotdn de luz por rodopsina hace que pierda color, generando opcina y retina todo trans. Este ultimo se requiere para continuar con el ciclo de reacciones. El término "retinal isomerasa" denota una serie de reacciones en las cuales el retinrl éster es un intermediario.
(Capítulo 53)
726 Bioquimica u% Harper
El hcido retinoico participa en la síntesis de glucoproteínas Esta es una dc las acciones del ácido retinoico en la promoción del crecimiento y diferenciacibn de los tejidos. Se ha propuesto que el fosfato de retinoilo funciona como portador de oligosacAridos a través de la bicapa lipidica celular, por medio dc una isomerizacibn trans-cis semejante a la descrita antes para la rodopsina. L a pruebas de que el Bcido retinoico interviene en la síntesis de glucoproteinac es decisiva, ya que una deficiencia de vitamina A causa la acumulación de intermediarios oligosacáridos-lipídicos de peso moIecular anormalmente bajo de la síntesis de glucoprotelnas (capimlo 56).
La carencia de vitamina A causa los síntomas típicos de deficiencia Estos se deben a la disfunción de los diversos rnecanismos celulares en que los retinoides participan. Una de las primeras indicaciones de deficiencia de vitamina A es unavisibn nocturna defectuosa, que tiene lugar cuando las reservas hepáticas están casi agotadas. Una mayor deplecibn conduce a la queratinización de tejidos epiteliales de ojo, pulmones y vías gastrointestfnales y genitourinarias, con la reducción de la secreción mucosa. El deterioro de tejidos oculares, xeroftalmía provoca ceguera. La deficiencia de vitamina A se presenta principalmente en personas con dietas básicas pobres además de carencia de vegetales que de otro modo podrían proporcionar la provitamina betacaroteno. En particular, los alcoh6licos son susceptibles a deficiencia de vitamina A , pero tambiin esGn más predispuestos a hipervitaminosis si reciben dosis adicionales.
-
Los retinoides y los carotenoides
tienen actividad anticancerigena Niimerosos cánceres humanos surgcn en tejido^ epiteliales que dependen de los retinoides para su diferenciacibn celular normal. Algunos estudios epidemiologicos han demostrado que existe una relación inversa entre el contenido de vizamiria A de la dieta y el riesgo de cáncer y los experimentos han demostrado que la administracibn del retinoiíle disminuye c l efecto de aIgunos carcinógenos. El beta caroteno es un antioxidante que puede intervenir en el atrapamiento de radicales peróxidos libres en tejido cuando la presián parcial de oxigeno es baja. La propiedad de beta-caroteno para actuar como antioxidante 5e debe a la estabiIizacion de radicales perbxidos orgánicos libres dentro de su estructura alquilo conjugada (figura 53-5 j. Dado que beta-caroteno es eficaz a concentraciones bajas de oxígeno, complementa la propiedad antioxidante de la vitamina E, que es eficaz en concentraciones de oxígeno mayores (capitulo 16). Es probable que las actividades antioxidantes de estas dos vitaminas Iiposolubles expliqiien su potencial actividad anticáncer. Las bajas concentraciones skicas de beta caroteno se acompaiian con el desarrollo de catarata senil. La LDL es la principal portadora de beta caroteno.
VITAMINA D La vitamina D es una prohormona esteroide. Esta representada por un grupo de esteroides que existen principalmente en animales, aunque también en plants y levaduras. Mediante varios cambios rnetabólicos cn
ROO'
R-O
1
CH3
O
CH,
Figura 5 3 4 , Formaciónde un radical de carbono centrado estabilizadapor resonancia, a partir de un radical peroxilo (ROO*) y p -caroteno. (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacron de Bvrton GW, lngold KU: p-Carotene An unusual type of lipid antioxidant Science 1984,224:569 Copyright 8 1984 by the Arnerican for the Advancement of Science.)
iJsfr.uctrtray firncirjn de las viraminus linosoluh!es
el cuerpo dan origen a una hormona conocida como calcitriol, que tiene una función crítica en el rnetaholismo de calcio y fosfato (capitulo 47).
D ligada a proteína. La vitamina Dj es captada por el hígado, donde es hidroxilada en la posición 25 por la vitamina C)3-25-hidroxilasa,enzima del retículo cndoplásmico considerada como limitante de la velocidad en la via (figura 53-7). La principal forma de la vitamina D en la circulación y de almacenaje hepitico es la 25-hidroxivitamina Di. Aunque rambikn se ha informado que el tejido adiposo y el rnusc~iloesqueletic0 son sitios de almacenaje importante. Una fraccion significativa de 25-hidroxivitamina D3 experimenta circulación enterohepática y las alteraciones de ésta pueden conducir a deficiencia de vitamina D. En los túbulos renales, hueso y placenta, 25-hidroxivitamina D1 se hidroxila más en la posición 1 por 25-hidmxivihminaDs1-hidroxilasa,una enzimamito condrial. El producto es vitamina l alfa, 25-dihidroxiD, (calcitriol), el metabolito más potente de la vitamina D. Su producción es regulada por su propia concentracidn, la hormona paratiroidea y el fosfato serico. La 25-hidroxivitamina Dj también puede hidroxilarse en la posici6n 24 por una enzima mitocondrial presente en túbulos renales, cartilago, intestino y placenta. La concentración del producto 24,25-dihidroxivitarnina DI tiene una relacibn reciproca con la concentracihn de 1,25-deliidroxivitamina Di en suem. Para detalles adicionales de la regulación y la función del calcitriol en el metabolismo de calcio y fosfato. véase el capitulo 47. Se han acumulado pruebas de que la vitamina D, igual que la vitamina A, llevan
La vitamina D se forma de la provñtamina deshid rocolesterol por acción de la luz solar
El ergostero! csth presente en vegetales y el 7deshidrocolesterol en animales. El primero difiere del 7-deshidrocolesterol s61o en su cadena lateral, que es insaturada y contiene un grupo metilo extra (figura 53-6). La irradiación u ttravioleta desdobla el anillo B de ambos compuestos. De este modo, se puede obtener ergocaicifetol (vitamina D7)de las plantas, con fines comerciales; en tanto que en los animales se genera colecalciferol (vitamina D3)en la piel expuesta. Las dos vitaminas son de igual potencia y dan origen a calcitriof Dz y calcitriol D:, respectivamente. Solo se describirá la ultima vía.
Tanto el hígado como el riñón participan en la sintesis del calcitriol La vitamina DI, formada del 7-deshidrocolesterol por acción de la luzsolar y la vitamina D3 (O D?)dietetica, después de ser absorbida de las rnicelas en el intestino, seguido por el transporte en los linfaticos, circula en la sangre unida a una globulina especifica, vitamina
GH3
CHJ
I
I
H-C-
CH3
CM3
I
/
H-C-
~~S-CH-C.H-GH \
CH3
I
CH, /
CH=CH-c-CH \
GH3
CH3
HO
727
Fotblisis
HO
comerc~al Ergosterol (plantas por ejemplo. levaduras)
Ergocalciferol (vitamina 02)
CH3
CH3 t
CH3 1
/
H-c-FW;-'CH~-&,-CH
\
CH3
/ \
CH3
CH,
L Fotblisis (luz solar)
HO
7-Dechidrocolesterol (animales)
HO
Colecalciferol (vitamina Da)
Figura 53-6. Ergosterol y 7-deshidrocolesterol Su conversidn por fotblisis a ergocalciferol y colecalciferol, respectivamente.
728 Bioqzdimica de Hurper
(Capítulo 53)
Colecalcileml (vitamina Da)
Figura 53-7. El colecalciferol puede hidroxilarse en la posición de C25 por una enzima hephtica. Mas adelante, el 25-hidroximlecalciferolse metaboliza a 1 ci,25-hidroxicolecaIaferolo a 24,25-dihidroxicolecarciferol.
a cabo sus funciones por activaci6n degenes especificas. La vitamina D también participa en la diferenciacibn celular y en la función inrnunológica.
La deficiencia de vitamina D causa raquitismo y osteomalacia El raquitismo tiene lugar en niflos pequefios y la osteomalacia en adultos que no se han expuesto a la luz solar o que no reciben cantidades adecuadas de vitamina D en la dieta. Estos trastornos se deben al reblandecimiento óseo por carencia de calcio y fosfato. Los aceites de pescado, la yema de huevo y el higado son alimentos ricos en la vitamina. Por otro lado, la exposici6n individual a la luz solar, que es determinada por la latitud, la estacibn y otros factores, influye en la dependencia relativa de cada persona de la ingestiiin de nutríentes para cubrir los sequerimientos de vitamina D.
VITAMINA E (Tocoferol) Hay varios tocoferoles naturales. Todos son isoprenoides sustituidos de 6-hidroxicromanos (tocoles; figura 5 3 4 ) .
El D-alfa-tacoferol es el más abundante en la naturaleza y el de mayor actividad biológica. Otros tocoferoles con significado dietetico se indican en el cuadro 53-1.
La absorción activa de Iípidos favorece la entrada de vitamina E Los trastornos en la absorcibn de grasas provocan deficiencia de vitamina E debido a que tocoferol se encuentra disuelto en la grasa de la dieta y se libera y absorbe durante la digestión de los lipidos. Además, es transportada en la sangre por lipoproteinas; primero, mediante la incorporacion a quilomicsones, que distribuyen la vitamina a los tejidos que contienen lipoproteina lipasa y, luego, al higado en remanentes de quilomicrones; y segundo, para secrecion desde el higado en lipoproteinas de muy baja densidad. Se almacena en el tejido adiposo. Por tanto, es posible encontrar deficiencia de vitamina E en situaciones relacionadas con disfitnción de los procesos anteriores; por ejemplo, estatorrea ctonica, abetalipoproteinemia, enfermedad hepática colestásica, fibrosis quistica y en personas que se han sometido a resecci~n intestinal.
Estructura y funciirn de las vitaminas liposoluBles
729
1
Figura 53-8. a-Tocoferol.
'343
La vitamina E es uno de los antioxidantes naturales mas importantes
La vitamina E y el selenio actúan de manera sinérgica
Al parecer, la vitamina E es la primera línea de defensa contra la peroxidacidn de los hcidos grasos poliinsaturados contenidos en los fosfolípidos de las membranas plasmaticas y subcelulares (capituIa 16). Los fosfolipidos de las membranas mitocondrial, del retículo endoplásmico y plasmática poseen afinidades para alfa-tocoferol por lo que la vitamina parece concentrarse en estos sitios. Los tocoferoles actúan como antioxidantes, interrumpiendo reacciones de cadenas con radicales libres como resultado de su capacidad para transferir un hidrogeno fenblico a un radical peroxilo libre de un Acido graso paliinsaturado peroxidado (figura 53-9 y capitulo 16). El radical fenoxi libre formado puede reaccionar con la vitamina C para regenerar tocoferof (figura 53-12), o reacciona luego con otro radica2 peroxilo libre. Por tanto, el alfa-tocoferol no se acopla con facilidad a oxidaciones reversible~;el anillo crornano y la cadena lateral se oxidan hasta el producto no libre mostrado en la figura 53-10. Este producto de oxidación se conjuga con ácido glucuriinico por medio del grupo 2-oxihidrilo y se excreta en la bilis. Si la reaccibn tiene lugar de esta manera, el tocoferol no se utiliza de nuevo después de efectuar sus funciones sino que debe remplazarse totalmente para continuar su papel biologico en la célula. La accibn antioxidante del tocoferol es eficaz en concentraciones altas de oxigeno, por lo que no sorprende que tienda a concentrarse en aquellas estructuras lipídicas que esthn expuestas a las presiones parciales de 01 m& altas, por ejemplo, membranas del eritrocito y de las células del Arbol respiratorio y retina.
El glutatión peroxidasa, de la cual el selenio es un componente integral (capítulo 22), proporciona una segunda linea de defensa contra peróxidos antes que puedan propagarse en reacciones en cadena, lesionando membranas y otros componentes celulares (figura 53-1 2). Así, el íocoferol y el selenio reducen el requerimiento de uno y otro o refuerzan uno al otro las acciones contra los peróxidos de lípidos. Además, el selenio se requiere para la función pancreática normal, que a su vez es necesaria en la digestión y absoscibn de lipidos, incluyendo la vitamina E. De modo inverso, la vitamina E reduce los requerimientos de selenio al impedir su pérdida corporal o mediante la conservación de su forma activa.
La deficiencia de vitamina E puede dar origen a anemia en el recién nacido Es posible que se necesite proporcionar suplementos de tocoferol en la alimentación de mujeres durante el embarazo y lactancia, y para lactantes recikn nacidos en los cuales puede haber anemia debido a producción escasa de hemoglobina y al acortamiento en la duracibn de vida del eritrocito. El requerimiento de vitamina E aumenta cuando se consume mayor cantidad de lipidos poliinsaturados. La ingesti6n de aceites minerales, la exposicidn a oxigeno (como en tiendas de oxígeno) o las enfermedades que causan abcorcibn ineficiente de Iípidos pueden originar deficiencias de la vitamina que conducen a trastorno neurológico.
:roles aatrurales con importan dietétic a coferol
--
r---
.c
...
.-
--
ROO' + TocOH
ROO' + TOCO'
1
;-Trirnctil tocol limetil toc01 ,- 3imetil tocnl 8 - ~ c t i toco1 l
-
ROOH + TOCO'
ROOH + Producto radical
no libre
Figura 53-9. Actividad antioxidante que rompe cadenas de tacoferoles (TocOM) para formar radicales peroxtlo (ROO*).
730 Bioquímica de Harper
(Capitulo 53)
Figura 5 3 4 0 . Producto de la oxidacibn del alfa-tocoferol. LOS números permiten relacionar los Atonns d~ este compuesto con los de su precursor
La vitamina E se destruye por el cocinado comercial y el procesamiento de alimentos, incluyendo congelación intensa. El germen de: trigo y los aceites de girasol, cArtamo, maiz y soya son fuentes adecuadas de esta vitamina. Aunque los aceites de pescado son ricos en vitaminas A y D. contienen cantidades insignificantes de vitamina E.
Las especies reactivas de oxígeno pueden iniciar enfermedad Un radical libre es un átomo o molécula que tiene uno o más electrones sin neutralizar. Su tendencia natural a adquirir o ceder un electrón de otras sustancias lo vuelve sumamente reactivo. No obstante, no todas las especies reactivas de oxigeno son radicales libres; por ejemplo, el oxígeno singlete y HzOz.Cuando cl oxigcno es reducido a agua por acción de la citocromo oxidasa, adquiere cuatro electrones (figura 53-1 1). Sin embargo, los electrones pueden ser adquiridos uno por vez mediante reducci6n univalente, que puede utilizar de 1 a 5% del consumo total de oxigeno. En lareacción univalente todas las moléculac son muy reactivas y tienen potencial para dañar los tejidos. Son radical libre superdxido, peróxido de hidrógeno y el radical libre hidroxilo. Este ultimo es en exn-emo tiixico pero de
vida corta. Otras fuentes de especies reactivas son la xantina oxidasa. que genera superóxido (por ejemplo, durante lesión por reperfusihn de órganos isquernicoc) y la clclooxigenasa y lipoxigenasa (capitulo 25), que producen radicales hidroxilos y peroxilos. Los neutrbfilos estimulados generan superóxido, que constituye un mecanismo para lisis de bacterias (capitulo 61). Además, el superéxido puede ser producido tambikn durante el metabolismo de xenobióticos por el sistema citocromo P450. Debido a que estas moleculas son demasiado reactivas, actúan en un lugar muy prbxirno a aquel en que se generan. Por tanto, la mayoría de las ectructuras celulares son vulnerables, incluyendo membranas, proteínas estructurales, enzirnas y ácidos nucleicos, lo cual puede conducir a mutación y muerte celular.
Los nutrientes antioxidantes pueden prevenir enfermedades Ya se han explicado los mecanismos individuales para la defensa de los tejidos mediante la prevención del comienzo de reacciones de cadenas, con radicales libres; esto es, la superóxido dismutasa (capitulo 131, los antioxidantes de lípidos (capítulo 161, la glutatibn peroxidasa y el selenio (vease antes). la vitamina C (capítillo 52), la vitamina A y beta caroteno (vease antes} y la vitamina E (véase antes). El cuadro 53-2 es un resumen de las especies reactivas principales y de los mecanismos disponibles para su destrucción. La interaccibn de algunos de los mecanismos antioxidantec se muestra en la figura 53-1 2. Existen cada vez más pruebas de la intervencion de radicales libres y otras moléculas reactivas en los procesos patolbgicos. La principal evidencia proviene de estudios epidern io16gicoc que muestran correlaciones estadísticas entre la incidencia de patología y la presencia de concentraciones bajas de nutrientes antioxidantes en la sangre o alimentos. Este e5 el caso respecto a cáncer y el selenio, la vitamina A, beta caroteno y las vitaminas
Sistema del citocmmo oxidasa mitocondrial
Figura 53-11. Producción de especies reactivas de oxlgeno durante la reduccibn del oxigeno a agua La reduccidn de 1 m01 de 9 por la accibn del cisterna de la citocromo oxidasa de la cadena respiratoria requiere 4e-. No obstante, ciertas reacciones permiten que esta reducción tenga lugar mediante una serie de reducciones univalentes, cada una de las cuales requiere un solo e-. En esta via, las especies relativas de oxigeno se regeneran ( m , radical libre).
Es:síructtiray fincilin de las vrturninns liposoltlbies * 73 1
C y E. Tambien existe una relación inversa entre la
Cuadro 53-2. Especies reactivas de oxigeno S
antioxi~"-+*~ J~IILGB . -.
-.- . - . -
eactivas
-
1
. --
Anti --
--
i~itarnin doteno, Litamina P. Radical libre superhxido SuperOxir sa ca-
vitam rntpnii
Ko(>'
idical libre hidroxilo idical librc alcoxilv ., . ...
itamina ;i,
Hadical libre pcroxilo
hidrrjgeno Catalasa, glutatión pc:ro-
1
,
,
* Los electrones en 1ñ mi
lívidos
m
xidasa Giutatibn ..A*...,:
de energln ü l t ~ .
frecuencia de enfemedad cardiovascular y la concentracion sanguínea de vitamina E y C. Este dato concuerda con otros estudios que muestran que la LDL oxidada es captado por macrófagos y c6lulas espumosas con mas facilidad que la LDL normal y que el medicamento antioxidante probucol tienc un efecto benkfico sobre estos procesos. Hay algunos datos de que la vitamina E aplicada por vía thpica puede protcgcr la piel contra los efectos dafiinos de los rayos ultravioleta. A la fecha no se tienen estudios sobre la utilización general como complementos de ninguno de los antioxidantes mencionados y las decisiones al respecto deben esperar los resultados de los experimentos que se llevan aI cabo. Sin embargo recomienda aumentar el consumo de cereales, nue s frutas y vegetalec, todos ellos buenas fuentes de antioxidantes.
$9
Reaccibn de la cadena con radical libre
AGPI-00H
AGPI-H (en et fosfolipido)
----------
ClTOSOL
Vitamina COK, GS-SG
Vitamina C,d, GSH
AGPldOH.
GSH
PEROXIDASA
AGPI -OH
Figura 53-12. lnteraccidn y sinergismo entre los sistemas antioxidantes que operan en la fase lipidica (membranas) de la célula y en su fase acuosa {citosol) ( R i , radical libre; AGPI-004, radical libre peroxilo de dcido graso poliinsaturado en fosfolipidos membranares; AGPI-OOH, hidroperbxido de ácido graso poliinsaturado en fosfolipidos membranales, liberado como hidroperdxido de ácido graso libre en el citocol por acción de la fosfolipasa A2; AGPI-OH, hidroxilo de ácido graso poliinsaturado; TocOH, vitamina E (u-tocoferol); TcoOi; radical libre de a-tocoferol, Se, selenio: GSH, glutatibn reducido; GS-SG, glutation oxidado, que regresa a su estado reducida despubs de reamiun con NADPH catalizado por glutation reductasa: AGPI-H, Bcido graso poliinsaturado.)
732 Bioquimica de Harper
VITAMINA K Las vitaminas que pertenecen al grupo K son naftoquinonas con poliisoprenoides sustituidos (figura 53-1 3). La menadiona (K3), compuesto precursor de la serie de vitaminas K, no se encuentra en la naturaleza, pero si se administra, es alquilada iur vivo hasta una de las menaquinonas (K2).La filoquinona (K,) es la forma principal de vitamina K en los vegetales. La menaquinona-7 es una de la serie de formas insamradas poliprenoides de vitamina K encontrada en tejidos animales y sintetizada por bacterias en el intestino. La entrada al cuerpo de Ea vitamina K requiere absorción nomal de Iípidos La rnalabsorcibn de grasas es la causa mas comun de deficiencia de vitamina K. Los derivados K naturales se absorben s61o en presencia de sales biliares, igual que los demiis lípidos y se distribuyen en el torrente sanguíneo por la vía linfática en quilomicrones. La menadiona, como es soluble en agua, se absorbe aun en ausencia de sales biliares y pasa directamente a la vena porta hephtica. Aunque al principio la vitamina K se acumula en el higado, su concentracion hepática declina con rapidez y su almacenaje es limitado.
(Capif ulo j3)
La vitamina K es necesaria para la biosíntesis de los factores de la coagulación sanguínea Se ha demostrado que la vitamina K interviene en la conservación de valores normales de los factores de la coagulacióln sanguínea 11, VII, 1X y X, todos ellos sintetizados en el hígado inicialmente como proteínas precursoras inactivas (capitulo 59).
La vitamina K actúa como cofactor de la carboxilasa que forma residuos de gamma carboxiglutamato en las proteínas precursoras La generación de factores de coagulación con actividad biol6gica se logra mediante modificacibn postraslaciún de residuos de glutamato (Glu) de las proteínas precursoras a gamma carboxigIutamatos (Gla) por actividad de una carboxilasa especifica que depende de la vitamina K (figura 53-14). La proírombina (factor 11) contiene 1O de estos residuos, lo cual permite la quelación del calcio en una interacción proteínacalcio-fosfolípido especifíca, esencial para su papel biolbgico (figura 53-15). Ahora se han identificado otras proteínas que contienen residuos Gla dependientes de K en varios tejidos.
El ciclo de fa vitamina K permite que una fraccidn de ésta se regenere
Menadiona (vitamina K3)
La reaccion de la carboxilasa que dg>ende de vitamina K tiene lugar en el retículo endoplasmico de numerosos tejidos y requiere oxígeno molecular, bióxido de carbono (no HC0,-) y la forma hidroquinona (reducida) de la vitamina K. En el reticulo endoplismico hepbtico existe un ciclo de la vitamina K (figura 53-1 6 ) en donde el producto 2J-ep6xido de la reacción de carboxilación es convertido por 2,3-epoxidorreductasa en la forma quinona de la vitamina K, usando un reductor ditiol, aún no identificado. Esta reacción es sensible a la inhibicibn por el tipo 4-hidroxidicumarinicos (dicumarol) de anticoagulantes, tales corno
Filoquinona (vitamina Ki, fitonadiona, Mephyton)
cooCH,
1
co, VITAMINA K
-0OC cm-
y z
Menaqulnona-n (vitamina K2; n = 8, 7 o 9)
Figura 5 3 4 3 . Las vitamrnac K. La menadiona es la 2-metil 1 ,Cnafioquinona. Las otras vitaminas K son poliisoprenoides sustituidos.
Figura 53-14. C~rboxilacibnde un residuo de glutamato catalizado por carboxilasa dependiente de vitamina K.
Esirziciura y función de las viiuminas IiposolubIes * 733
Figura 53-17. Oicumarol (bishidroxicumarina.)
Flgura 53-15. Quelación del ion calcio por el residuo y-carboxiglutamilo en las proteinas que actuan como factores de [a coagulación.
la warfarina (figura 53-17). La reducci6n subsiguiente de la f o m a quinona a hidroquinona por NADH completa el ciclo al regenerar la forma activa de la vitamina. Un uso terapkutico importante de la vitamina K es como antidoto para la intoxicación por medicamentos tipo dicumarol. Las formas quinona de la vitamina K evitaran a la epoxidorseductasa inhibida proporcionando una fuente potencial de hidroquinona activa de la vitamina K. Información reciente seiiala hacia cierta función de la vitamina K en 3a síntesis de proteinas óseas; por ejemplo, la osteocalcina.
La enfermedad hemorñagica del recién nacido es causada por deficiencia de vitamina K La vitamina K se distribuye de manera extensa en los tejidos vegetales y animales usados como alimentos y la producción de la vitamina por Ea rnicroflora intestinal asegura virtualmente que no se produzca deficiencia diet&ticaen adultos. No obstante, los lactantes recien nacidos son vulnerables a la deficiencia, debido a que la placenta no permite el paso de la vitamina al feto de modo eficiente y el intestino infantil es estéril al nacimiento. En lactantes normales, la concentraci6n plasmhtica decrece de inmediato después del nacimiento, pero se recupera cuando comienza a absorberse el alimento. Si la concentracibn de protrombina alcanza un nivel demasiado bajo, puede presentarse el sindrome hernon;ágico, La deficiencia de vitamina K puede deberse a malabsorcion de lipidos, ta cual puede relacionarse con disfuncíon pancreática, enfermedad biliar, atrofia de la mucosa intestinal o cualquier causa dc esteatorrea. Además, la esterilización del intestino grueso por antibibticos puede conducir a deficiencia cuando la ingestión dietetica de la vitamina es limitada.
RESUMEN
Figura 53-16. Ciclo de fa vitamina K en el hlgado. Se indica el sitio de accibn de los anticoagulantes tipo dicumarol. Los detalles de algunas de las reacciones son eiln inciertos. monoxigenasa, 0 ,carboxilasa, @ 2-3-epbxido reductasa, reductasa. (Modificada y reproducida con autorizacidn de Suttie JW: The metabolic role of vitarnin K. Fed Proc 1980;39:2730 )
m,
m,
1) Las vitaminas liposolubles tienen las caracteristicac comunes de ser moleculas apolares, hidrófobas y ademis derivan del isopreno. Todas requieren que la absorcibn de lipidos sea normal para que entren a la circulacibn con eficiencia y si este mecanismo está alterado, es probable que aparezcan sintomac de deficiencia. 2) La vitamina A (retinol) esta representada en los vegetales n o sblo como tal sino también por la provitamina (beta caroteno}. Se considera que el retinol y el hcido retinoico actúan por control de la expresidn génica, en tanto que el retina1 se emplea en la visibn y desernpefla una función en la síntesis de glucoproteinas. 3) La vitamina D es una prohomona esteroide cuya actividad es realizada por su derivado hormonal, el calcitriol. Es necesaria en la regulacidn del meta-
bolismo del calcio y fosfaro y su ausencia en la alimentacion causa raquitismo y osteomalacia. 4) La vitamina E (tocoferol) es el antioxidante mas importante del cuerpo y actúa en la fase lipidica de las membranas en toda la celula. Protege contra los efectos de los radicales tóxicos tales coino el grupo libre percixilo, principalmente por interrupción de las reacciones de cadenas con radical libre. EI requerimiento de tocoferol aumenta cuando la ingestion de grasa poliinsaturada es alta.
5) La vitamina K es necesaria para la síntesis dc varios factores de la coagulación (por ejemplo, 11, VI¡, IX y X). Funciona como cofactor de una carboxilasa que actlia sobre residitos glutamato de precursores proteinicos de los factores de la coagiilación para capacitarlos para calcio, La intempción del ciclo de regeneración de la vitamina K por comp u e s t o s tipo dicumarol es la base de sus propiedades anticoagulantes.
REFERENCIAS Adams JS et al.: Vitamiii D syiithcsis and mctabolism after
ultraviolet irradialion uf normal and vitarnin D-deficien1 suhjccis N Engl J Med 1982;306:722. Duthie GG et al.: Oxtdants, antioxidants and cardiovtscuInr discase. Nutr Res Rev 1989;2:51. Farher ,lL et at.: Riology of disease: Mcchanisms of cclI in,jury by activated oxucen specics. I,hh Invest 1990,62:670. Halliwell B, Chirico S: Lipid peroxidation Its mcchanism, mcasurement, and significance. Am J Clin Nutr 1993:57:7153.
Inhibition of free radical chain oxidation by m-tocophcrol and other plasma antioxidants. Nutr Rev 1988;46 206. Jamieson D: Oxygen toxicity and rcactivc oxygen metabolites in mammals. Free Radical Riol Med 1989,7:87. Krinsky NI: Action of cmotenoids ;,I hiological ysiems Annu Rev NutrJQ93:13:561. Leo MA, tieber CS: 1 l~pervitarninosisA . A liver Iover's lament. Hepatology 1988;8:412
Olson RE et al. (editors): Presenf Knou~led~e rn n'utri!inn 5th ed. The Nutrition Foundation. 1984. Passmore R, Eastwood MA: Ifuman ,Vliiririon andDie[etics. Churchill Li\ irigsione, 198h. Reilly PM et al.: Pharmacologic approach to tissuc injury mediated by iree radicals and other reactive oxygtn metaholitcs Arn J 5urg 1991:161:488 Season, lazitude, and ahility of sunlight to promote synthesis of vitamin D3 in skin Nutr Rev 1989:47:252. Slater TF, Block G (editors): Antioxidant vitaniins and 0-carotcnc in diseasc prevention. Am J Clin Niitr 1991;53:1985. Sokol RJ: Vitamin E dcficicncy and ncurologic disease. Annu Rev Nutr 1988;8:351. Sporn MR, Roberts A&: Rolc of rctinoids in diffcrcntiation and cartiinogenesis. Canccr Res 1983,43:3034. Suttie JW: Thc mctabolic role of vitamin K. f c d Proc 1980:39:2730
Nutrición Peter A. Mayes, PhD, DSC
La ciencia de la nutricion estudia los requerimientos ciialitativos y cuantitativos de la dieta necesarios para conservar la salud. Virtualmente todos los componentes de la alimentacibn requeridos para cnnservar la vida se conocen, dado que es posible sustentar a seres humanos u otros animales con d i e t a químicas definidas. No obstante, existe a6n considerable discusiiin y controversia respecto a los requerimientos cuantitativos de cada componente de la dieta en particular debido a que fstos varían con edad, sexo y modo de vidade Ia persona. La bioqulmicametabólicacontribuye en forma amplia a la comprensirjn de los conceptos modernos de nutricibn y se estudia en las secciones íniciales de este libro. En los dos capltulos precedentes se descri ben en particular las actividades bioquimicas de las vitaminas hidrosolubles y liposolubles.
IMPORTANCIA BIQMÉDICA La deficiencia nutricional manifiesta es poca comun en las poblaciones de paises desarrollados, aunque puede encontrarse en cierto grado entre grupos de menores recursos, ancianos o personas con requerimientos nutricionales mayores, por ejemplo, nifios en crecimiento, mujeres embarazadas o en lactancia, enfermos y convalecientes, alcoholicos o individuos con dietas restringidas, voluntarias o por necesidad, por ejemplo, pacientes con alimentacion 1V o por eleccidn, coma vegetarianos. En paises en desarrollo, las deficiencias manifiestas son más comunes, por ejemplo, deficiencia de proteínas {kwashiorkor), de vitaminas (vitamina A en la xeroftalmia), de minerales (hierro, que da origen a la anemia y de energdticos inanicidn), La malabsorci6n puede conducir a deficiencia de nutrientes y causar estados patolbgicos; por
ejemplo la absorción deficiente de vitamina BIZcausa anemia. Aunque la obesidad, siempre se ha relacionado con cl exceso d e alimentos, el coticepto de ingestión excesiva dc nutrientes particulares y su relación con la frecuencia de ciertas enfermedades en las sociedades desanolladas obtiene cada vez mas reconocimientos, por ejemplo, la aterosclerosis y las enfermedades coronarias, diabetes. cáncer de mama y del colon, enfermedad cerebrovascular, apoplejía y cirrosis hepfitica.
EN LA ACTUALIDAD ES POSIBLE DEFINIR LOS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES En el cuadro 54-1 se resumen los requerimientos nutricionales.
LA ENERG~ASE REQUIERE COMO FUERZA MOTRIZ PARA TODAS LAS FUNCIONES CORPORALES El cuerpo de los marniferos requiere nutrientes suficientes para obtener energía libre con quC generar el requerimiento diario de fosfaoos de alta energía (principalmente ATP) y de equivalentes reductores [ZH), necesarios para energizar las funciones corporales (figura 17-1 ).
Carbohidratos y grasas son las fuentes energéticas principales en la dieta Los nutrientes que producen energia provienen de carbohidratos y lipidos dieteticos y, en menor grado, proteínas, en proporciones que varían en forma amplia entre poblaciones humanas diferentes. El con-
(Capitulo 5.1)
736 Bioquimica de Hurpsr
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Cuadro 54-1. kqu6rirnientos nutrichnsles esenciaIes -
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Diferenc~asseleccioiiadas en otras especies Humana linri.* isoleucina, leuc iiia, lisina, metioni- La argininat se requie re para el crecimiento de (cistaina:\. itnilalanind i,.!. ilrosina:). ratas. La gIicina se rcuuirIr: sn los pollos y ,la taiirin a cn los gatas. La mayor parte de los onina, tript am1iio6cidos no st>n esenciiilcs cn los rum iantcs: el requeritniento es e scaso en otros hevhiirr ", iros q u e tienen una poblacihn al de micrc is intestinal!cs sustanci --equerimientcr 1s linoleico (Acido araquidónico:). u- 1El Bcido 2iraquidbnic espccífic:o en los g; oltn ico* -
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Vitaminas
o ascórbic o (C). bio tina.D c o b alamina Casi todos; los mamf feros puer!en sinteti.t.ar 6cido a: ;ciirhico, piero es eselicial en la ;ili12), 6cido fblico. ni;aciiia, ácid o panto. . . . .-,., . ... m p n t r r ion de primates, cobayos y en los .-. tiamina (I3]) murcitliagos frugivoros de la India. Las vi>
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m i n a s hidrosolublcs no son esmciaies en los rumi antes, los requerimientos son meno*" *., l b 3 C11 1 1 1TOS Iicrbivoros que tienen una p b l a ción sustancial de micmrganismos ints~inaies Casi toda!i las especies pucdcn utilisar Pcaroteni2 como fuenie de la vitamina A (retinol ): dcbe s strado co rctinol e,n los gato! WI-
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Vitaminas A, : U E, KU
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Silicio, vanadio, nrquel, arsknico, fluor y estafio, han demostrado ser esenciales en
io, cobre, yodo, hie r r o , mar )libdeno, siefenio, cinc
Microm inerales (oligo eicmcntos:
varias especies y e%posible qiie tambitn el hombre 10s requiera. El cobalto es necesario para la síntesis il e cobalaimina por 10s canismos (ieI rurnen -Fibra
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erida para una salud óptima
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I compcmente inás crítico de la alin .!ación de carboIiidrato5, grasa teí nas en pro1porciories variables * ta requieren los lactantes y probablemente tarnbiin nyios ! t Puede ser parcialmente csenciul en los lactantcs. :Cistclna. tiinsina y hcido araquidbnico ahorran el requerirni ente de met ioninq Fenilalanina y ac ido linoleicíi , respectivamente. Los investigadores estin en desacuerdo respecto a si el acidlo a4inoléni esenci al en la alirrientación hu mana. . . c.o es L. . " La sintetizan los microorganismus intestinales; por tanto su requcrimIenro nurricional cs inciertO. 7 La exposición de la piel a la luz solar reduce el requerimiento nutricional.
Agua 1Energía
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sumo de alcohol puede dar tambikn una proporción significativa de la ingestión de energía. Un peso corporal constante bajo condiciones de reguerim ientos energéticos inaltemdos indica que hay energla suficiente en la dieta para las necesidades inmediatas. En el cuadro 53-2 se indica la cantidad de energia disponible en los principales alimentos. El gran contenido energktico por gramo de lípidos comparados con el de proteínas y carbohidratos y el contenido relativamente alto de energia del alcohol son dos hechos notables. En el cuadro 54-3 se muestra la ingesti6n energética recomendada por persona para grupos escogidos.
Varios factores modifican el gasta de energia En condiciones de equilibrio energético (balance de caloriac), la ingestión de energía debe igualar a su gasto. Este úhimo varia ampliamente bajo diferentes condiciones y puede medirse si se coloca a un animal dentro de una cfimara aislada y determina el rendimiento energético representado por la perdida de calor y los productos de excredtin. Por lo general, un método conveniente consiste en medir el consumo de oxigeno, ya que bajo la mayor parte de las circunstancias, un litro de Oz consumido corresponde aproximadamente a un gasto energttico de 20 kJ (4.83 kcal).
de los arincipales comnonentes de los-alimentos* Calot
veces el valor basal entre las condiciones de reposo y la actividad atlktica mhxima. 4) Cuando le temperatura ambiental es , j a , el gasto energético es mayor debido a la nccibn de tiritar y por la termogénesis sin tiritar en animales que poseen grasa parda (figura 27-10). A temperaturas ambiente superiores a la de la sangre, se gasta energía extra para enfriar al organismo.
1 lorimétrica) I Prnteínm . .......-- --rasas
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7th ed. Churi:hill Livings;tone, 1979. ' L,os factores Ile conversib.n se obtiene ido los valor es . ., n redondear < ,. ue calor ue combusti6n y corrigrenuoios segun ci calculo ae la eticiencia de absorcibn :La ovidacibn protelnica corregida rior ptrdida de los grupOS amino excretados en la orina como uTea.
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La energia utilizada por u n individuo depende de cuatro factores principales: 1) El índice rnetabólico basal es el gasto energe~ico
necesario para mantener las funciones risiol6gicas bhsicas bajo condiciones estándar; el sujeto deberá estar en reposo, despierto y en un ambiente templado; las mediciones se harán por lo menos 12 horas despds de la última comida. El Índice metabblico basal es proporcional al peso corporal magro y al área superficial. Es mayor en varones que en mujeres, en nifios pequefios y en personas con fiebre hipertiroidisho~Es m& bajo en el hipafiroidismo y en la inanición. 2) El efecto termogénico (accion dinámica especifica) del alimento equivale aproximadamente de 5 a 10% del gasto total de energia y se atribuye al gasto energbtico adicional debido a la digestidn y
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Cuadro 54-3. Tngestión energética ret para varones y mujeres* .-
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a cualquier estimulo del metabolismo causado por la afluencia de un sustrato nuevo. 3) La actividad física es Iñ variable mayor que afecta al gasto de energia; hay una diferencia hasta de 10
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10th ed Food and Nutrition Board. National Research Council-National Acadcmy of Scienws. 19XY
LAS PROTEÍNAS SON NECESARIAS PARA SUMINISTRAR AMINOACIDOS ESPEC~FICOSY M I T R ~ G E N O PARA LA S~NTESISDE COMPUESTOS NITROGENADOS CR~TICOS Normalmente las proteinas proporcionan el nitrbgeno arninoacidico requerido por el cuerpo y los propios aminohcidoc. Toda la proteha de los alimentos se digiere y entra a la circulacibn como aminoacidos simples. El cuerpo requiere de 20 aminoácidos diferentes para sintetizar proteinas especificas y otros compuestos que contienen nitrógeno coma purinas, pirimidinas y hem.
t o s aminoácidos esenciales son aquellos que el organismo no puede sintetizar y por tanto debe recibirlos de los alimentos Hay nueve aminoácidos esenciales en el ser humana: histidina, isoleucína, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptbfano y valina (cuadro 54-1). Otros dos de los aminoácidos, cisteina y tirosina, pueden formarse a partir de los aminohcidos esenciales metionina y fenilalanina, respectivamente. Si en la alimentacion es suficiente la cantidad de cisteina y tirosina ambos pueden proporcionar la cantidad de metionina y fenilalanina. En tanto que se disponga de cantidades suficitntes de arninoacidos esenciales en la alimentacidn, los nueve aminoácidos restantes, necesarios para la sintesis de proteinas y para otros prop6sitos, pueden formarse a t r a d s de reacciones de transaminaci~ny otras reacciones (figura 3 1 4 ) .
El equilibrio del nitrógeno se conserva por ingestión dietética (capitulo 31)
-,*inr rnriinrl
Un animal adulto en estado de equilibrio metabblico requiere proteína en la dieta para reponer los ami-
noácidos esenciales y nitrOgeno perdido de aminoácidos durante el recambio metabólico. El nitrógeno se pierde en orina, heces, saliva, descamación de la piel, cabello y ufias. En el cuadro 5 4 4 se indica el requerimiento diario de proteina total y de aminoacidos, esenciales pasa el ser humano. Cuando estos requerimientos se calculan can base en el peso corporal, se hacen notorias Ias necesidades adicionales para el crecimiento de lactantes y niños. El embarazo, la lactancia, la reparacibn tisular de lesiones, ta recupcraci6n de una enfermedad y la actividad fisica elevada son otras condiciones que exigen m i s proteina en la alimentación. En la mayor parte de las situaciones en humanos, es adecuada una alimcntacibn en la cual 12% de la energía se suministra por las protelnas.
La eficacia con que se utilizan las proteínas de los alimentos determina la cantidad total de proteínas requeridas Esta cantidad se afecta por tres factores principales: calidad de la proteina, ingestión de energéticos y actividad fisica.
A. Calidad de la proteína Esta calidad se mide por comparacidn de las proporciones de aminoácidos esenciales en un alimento con las proporciones necesarias para una buena nutricibn. Mientras más se aproximen estas cantidades, miis elevada es la calidad de la proteina. Las protelnas de leche y huevos son de elevada calidad y se emplean Cuadro C . .- .---.
con eficacia por el cuerpo, de modo que se utilizan como estandares de referencia c o m a los que pueden compararse otras proteinas. Las proteinas de la carne tambien san de elevada calidad; en tanto que varias proteinas de vegetales utilizados como principales fuentes de alimenzos, tienen deiiciencias relativas en ciertos aminoácidos esenciales, por ejemplo, tript6fano y lisina en el maíz; lisina en el trigo y metionina en algunos tipos de semilla. En una alimentacion mixta, la deficiencia de un aminoácido en una proteína se compensa pos SUabundancia en om;tales proteinas se describen como complementarias; por ejemplo, las proteína? combinadas del trigo y del frijol proporcionan una ingestión satisfactoria de aminoácidos. En ciertas circunstancias, debe consumirse una cantidad total mayor de proteinas para satisfacer los reqiierinientos. Los aminoicidoc que n o se incorporan a una proteína nueva y son innecesarios para los requerimientos inmediatos, no pueden almacenarse y se degradan con rapidez; el nitrbgeiio se excreta como urea y otros productos.
B. Ingestión de energéticos La energia derivada de crirbohidratos y grasas afecta los requerimientos proteínicos porque ahorra la utilizacibn de las proteinas como fuentes de energía. Para emplear con eficacia las costosas protcrinas de los alimentos (proteinas de calidad elevada) y reducir su requerimiento al mínimo, es necesario asegurar un aprovisionamiento adecuado de energia de fuentes no proteinicas, algunas de las cuales deben ser carbohidrato~para ahorrar proteínas de la gluconeogénesis.
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Datas tomnclos del Recoi -* . UT aciences, IY89.
Dntns tomados del Munm km,Crim M: The p~ Diseme, 6th ed. IdeaR: Febigcr. 1980.
d. Food and
iwd, Nation;
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C. Actividad fisica La actividad fisica incrementa la retención de! nitrogeno de las proteínas de los alimentos.
La desnutrición proteínico-energética causa marasmo y kwashiorkor La desnutrición proteinica y energdtica (DPE) incluye una serie de trastornos de inanición y alimentaciiin deficiente, que abarcan a otros nutrientes como vitaminas y minerales, además de la deficiencia proteínica. La modalidad grave ocurre en los niiIos cn crecimiento, por lo general, menores de cinco años de edad, en areas indigentes de Asia, Africa y Sudamérica. S e reconocen dos formas extremas, el marasmo y el kwashiorkor (capítulo65). En el marasmo, hay desgaste generalizado debido a la deticiencia tanto de energéticos como de proteinas, en tanto en el kwashiorkor, que se caracterim por edema, hay deficiencia en la cantidad y la calidad de la proteína, aunque la ingestión energética puede ser adecuada. Con frecuencia se encuentran estados intermedios entre marasmo y kwashiorkor clásicos. De manera clara, los dos trastornos se agravan por deficiencia grave de otros nutrientes esenciales como las vitarninas y los minerales.
LOS REQUERIMIENTOS DE GLUCOSA PUEDEN CUBRIRSE CON NUMEROSOS CARBOHIDRATOS
La glucosa la requieren en forma especifica nume;osos tejidos, pero no tiene que proporcionarse como tal en la alimentaciiin, ya que otros carbohidratos en esta, se convierten con facilidad a glucosa, ya sea durante la digestión (por ejemplo, almidbn) o mas tarde en el hígado (por ejemplo, fructosa, galactosa; cspitiilo 22). La glucosa se forma también a partir del glicerol de lar grasas y de Ios aminoácidos glucogknicos mediante la gluconeogénesis (capitulo 2 1). Sin embargo, en el ser humano se recomienda una ingestibn diaria minima de carbohidratos (50 a 100 g) para evitar la cetosis (capitulo 29) y la pérdida de proteína muscular, una dieta balanceada deberk contener mhs polisacásido para reducir la cantidad de grasas que de otro modo podrían requerirse para energia. En el capitulo 15 se describen los principales alimentos que contienen carbohidratos. LA FIBRA ES NECESARIA PARA SALUD ÓPTIMA La fibra dietbtica esthrepresentada por los componentes de la pared celular de los vegetales, que no pueden digerirse por las enzirnas del ser humano y de los
animales; por ejemplo, celulosa, hemicelulosa, lignina, gomas, pectinas y pentosanas. En los herbívoros. como los rumiantes, la fibra (principalmente como celulosa) es una fuente principal de energia después de su digestión por microorganismos a acetato, propionato y butirato, que se absorben a la vena porta. Además, la fermentación colónica puede contribuir en parte a requerimientos enetgeticos humanos (2 a 7% en ingestibn baja de fibra). I'ambién se producen gases como COZ,HI y algunas veces CHs. En el ser hiimano una alimentación rica en fibra ejerce efectos beneficos porque ayuda a la retención de agua durante el paso de los alimentos por el intestino y en consecuencia produce heces mas grandes y blandas. La alimentacion rica en fibras se relaciona con una menor frecuencia de diverticulosis, cLncer del colon, enfermedad cardiovascular y diabetes sacarina. Las fibras mas insolubles como la celulosa y la lignina encontradas en el salvado de trigo, son benéficas para la funci6n dcl colon, en tanto que las fibras mas solubles como las que se encuentran en legumbres y frutas, por ejemplo, gomas y pectina, reducen el colesterol sanguíneo, posiblemente por fíjación de tos Bcidos biliares y del colesterol de los alimentos. AdemAs, ias fibras solubles hacen más lenta la evacuaciiin del estómago, retardan y atenúan la elevación posprandial de la glucosa canguinea. con la reducción consecuente en la secrecihn de insulina. Este efecto es benefico para los diabéticos y los que siguen dietas reductoras, debido a que disminuye la caída de rebote de la glucosa sanguinea que estimula al apetito.
LOS L~PIDOSSE REQUIEREN COMO VEH~CULOPARA VITAMINAS LIPOSOLUBLES Y PARA SUMINISTRAR ÁCIDOS GRASOS ESENCIALES Aunque los Sipidos con frecuencia constituyen una proporci6n significativa del requerimiento dietetico de energia, esta. no es su función esencial. Aparte de incrementar el sabor agradable del alimento y de producir una sensación de saciedad, los lípidos de los alimentos tienen dos funciones esenciales en la nutrición de los mamíferos. Actuan como vehículo alimentario de las vitaminas liposolubles y suministran ácidos grasos poliinsaturados esenciales que el cuerpo es incapaz de sintetizar. Tres hcidos gi-asos poliinsaturados por lo menos, se han reconocido como esenciales en la alimentacion de algunos animales; el ácido linoleico (016. I8:7), el ácido alfa linolénico (cu3, 18:3) y el ácido araquidónico (o6,20:4). Estos acidoc se encuentran en los lipidos dc los alimentos vegetales y animales (cuadro 16-2). Su metabolismo se describe en el capitulo 25.
740 Bioquímica de Harper
En el ser humano, el ficido araquidónico se sintetiza por 10 general, apartirdel hcido linoleico y no es esencial si hay suficiente cantidad de hcido Pinoleico en la dieta. Los debates continúan acerca de si el hcido alfa linoIdnico es en verdad esencial en el hombre. Ladeficiencia de hcido linoleico es rara pero puede ocurrir en lactantes con dietas de leche descremada y en pacientes con alimentacidn parenteral libre de lipidos. Una función primordial de los ácidos grasos esenciales consiste en servir como precursores de leucotrienos, prostaglandinas y tromboxanos (figura 2541, que actúan como "hormonas locales". Una ingestión dietttica en la cual 1 a 2% del requerimiento energktico total se suministra por hcidos grasos ecencia2es evita una deficiencia clínica manifiesta.
Existe una relación entre consumo de grasas y enfermedad Numerosos estudios demuestran una correlación entre coronariopatía, colesterol sangulneo y el consumo de grasas, en particular de grasas saturadas (capítulo 28). Adernh, el consumo elevado de éstas se relaciona con el cáncer del colon y de la mama. En la alimentacidn del hombre, la fuente mayor de grasas saturadas es la carne de rumiantes, los productos lácteos y la margarina sólida. El colesterol se encuentra únicamente en alimentos de origen animal, en particular, en la yema de huevo.
LAS VITAMINAS LLEVAN A CABO DIVERSAS FUNCIONES BIOQU~MICAS Las vitaminas son nutrientes organicos requeridos en cantidades pequeih para numerosas funciones bioquimicas diferentes y, en general, no pueden sintetizarse en el cuerpo y, por tanto3 deben recibirse en los alirnentos. El ser humano requiere diariamente vitaminas en cantidades de rniligmmos o microgramos. Las vitaminas se clasifican en dos grupos principales: hidrosoluhles descritas con m& detalle en el capitulo 52, y liposolubles, que se describen en el capítulo 53 con m6s detalle. Las vitaminas h idrosolubles incluyen el complejo vitamínico B (tiamina, siboflavina, niacina, hcido pantoténico, vitamina Bs,biotina, vitamina Bt2 y ácido fcilico) y el hcido ascórbico (vitamina C). Se absorben hacia la vena porta y cualquier excedente se exa t a en la orina. Por tanto la vitamina libre se almacena en cantidad pequeña y en la mayor parte de los casos es necesario su suministro continuo en la alimentacion. Puede haber cierto almacenamiento de dcido
(Capitvlo 54)
folico en el hígado. El hcido ascórbico se agota en varios meses y la vitamina BLItiene reservas que duran algunos ailos (también se almacena en el hígado). Por [o general, se tolera su ingestibn excesiva excepto por los efectos secundarios que se producen con dosis altas de niacina (en forma de Iicido nicotinico), ácido ascorbico o piridoxina (vitamina B6). Las vitaminas liposolubles (A, D, E y K) se encuentran en alimentos lipídicos de Tos dos origenes: vegetal y animal. Se digieren con las grasas y absorbidas por el intestino para incorporarlas a los quilomicrones. Mas adelante se transportan principalmente en los quilomicrones remanentes, en un principio al hígado, que es el sitio principal de almacenamiento de las vitaminas A, D y K. El tejido adiposo es la fuente principal de almacenamiento de la vitamina E. Las vitaminas liposolubles no se excretan en la orina y, si se ingieren en exceso, son tlixicas (en particular las vitaminas A y D). Algunas enfermedades vinculadas al metabolismo cofactor que responden al tratamiento con vitaminas específicas, se muestran en el cuadro 54-5. La falta de disponibilidad de vitaminas, sea por escasez dietética o por otras razones (por ejemplo, defectos en la absorción) conduce a sindromes por deficiencia característicos. En los capítulos 52 y 53 se estudian en forma completa.
Cuadro 5 4 5 . Sindromes sensibles a vitaminas. Ejemplos de defectos especificas en el metabolismo de cofactores vitaminicos que pueden corregirse 1ior tcrapléuticn de restitucii5n que, pi ral, en dosis Inuy gran -..
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De: IlermaZH. Stifel EB y G w n c HI. Vitarn in-deticienttitate ,*A .*l aiiu viiiki ~elated diseases in. Di.rnrders ofrhe u u--,~i,v~riir~iinal Troct. Djsorders of !he livrr; ,\'utritional D~sorder.~. Dietschy JM (editor) h n e & Stratton, 1976
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LOS MINERALES SON NECESARIOS PARA FUNCIONES BIOQU~MICAS Y FISIOL~GICAS
REQUERIMIENTOS DIETÉTICOS RECOMENDADOS (RDA)
Los minerales pueden dividirse de manera arbitraria en dos grupos: 1) macrominerales, que se requieren en cantidades mayores de 100 mg al día y 2) microminerales (oligoelementos), que se requieren en cantidades menores de 100 mg al día. El cuadro 5 4 4 es un resumen dc las propiedades de los macrominerales y el cuadro 54-7, de microminerales.
de investigación Nacional én EUA publica una lista dc las necesidades diarias de nutrientes esenciales como requerimientos diet6ticos recomendados (cuadro 5 4 4 ) . Los requerimientos indicados incluyen variaciones individuales entre la mayoria de personas normales cuando viven bajo SUS condiciones ambientales habituales. Aqui no ce considzran [os
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*
742 Bioquímica de Hurper
(Capitulo 54)
Cuadro 54-7. Microminerales (oligoelerni?ntos)esenciales. Resumen de sus principales caracteristicas .-
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Nutrición
743
Cuadro 54-7. Microminerales {oligoelernentos) esenciales. Resumen de sus principales mracteristicas '*qntinuaci6-' JII) - --. . -.- ----.--.- . -
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;Is dental
t Agua d
* La ingestibn excesiva de minerales produce sintomas de intcixicacibn. A menos que se indique otra cosa los sintomm 1n'
diarrea e irritabilidad, no especllícas. t Los requerimientos de minerales se alcan7an cori una ingestii5n variada de cantidades adecuadas (l e cereales de grano entc verduras, carne y p d u c t n ~lácteos $ Aijn no FC hia demo~tradoque sea esencial en el ser humano, pero e5 necesario en varios animales. I El fluoruro es esencial para el crecimiento de las ratac. Aunque no se ha comprobado que sea estrictamentt ira la nutricihn humana, lo!; fluomros tienen una funcihn en la prevención y tratamiento de la caries dental.
requerimientos adicionales exigidos en trastornos patoliigicos o ejercicio extenuante. L a alimentacibn deber6 basarse en muy diversos nutrientes, para proporcionar los requerimientos conocidos y en otros menos definidos. El cuadro 54-8 comprende proteina, 10 vitaminas y seis minerales. Se dispone de muy pocos datos para atribuir RDA a las vitaminas y minerales restantes. No obstante, limites de ingestibn de estos nutrientes, que al parecer son seguros y adecuados se dan en el cuadro 54-9. Todos los requerimientos nutricionales deben cubrirse para evitar las enfermedades por deficiencia y la pbrdida de la salud. La ignorancia o la mala situación economica, son casi siempre la causa subyacente de la incompetencia para satisfacer los requerimientos nutricionales. Por otra parte, ciertas enfermedades comunes se relacionan con la ingestibn excesiva de nutrientes. La obesidad, por lo general, se debe a ingestiiin excesiva de energkticos y a menudo conlleva al desarrollo de diabetes sacarina no insulinodependiente. La aterosclerosis y las coronsriopatias, tienen relacibn con dietas ricas en grasa total y grasa saturada. El chncer de mama, colon y prbstata se correlaciona con la ingestión e l e v d a de grasas. Una frecuencia alta de enfermedades cerebrovasculares e hipertension, se relacionan con la ingestibn excesiva de sal. Numerosos cornitds en todo el mundo, han investigado la composición de las dietas humanas y hecho
recomendaciones para mejorarlas. Estas pueden resumirse en: 1) Si hay sobrepeso, deberá reducirse la ingestión calbrica total para lograr el peso 6ptimo. 2) Deberá haber un cambio general, con reduccidn del consumo de grasas, por uno mayor de carbohidratos. 3) Se debe ingerir una proporcibn mayor de carbohidrato~complejos y menos anicares. 4) Una proporcidn mayor de las grasas de los alimentos debe ser en f m a insaturada y menor como grasas saniradas. 5) Se debe reducir el consumo de sal y colesterol. 6) Debe incrementarse el de la fibra dietdtica, 7) Debe incrementarse el consumo de h t a s y vegetales, particularmente por sus nutrientes antioxidantes.
RESUMEN 1) La nutrición se ocupa de los requerimientos cualitativos y cuantitativos de alimentos. En la actualidad se conocen vimalmente todos los requerimientos cualitativos, pero existen aun dudas considerables acerca de las cantidades necesarias de cada nutriente para una salud óptima. 2) La dieta debe suministrar energía suficiente para todas las funciones corporales. E1 requerimiento energético vana con la edad, sexo, actividad física y temperatura del ambiente.
746 Bioquimica de Harper
3) Para la síntesis de proteínas se requieren 20 aminoácidos de los cuales nueve, los aminoácidos esenciales en la nutricibn, deben suministrarse en la dieta humana. La cantidad de proteína necesaria se afecta por la calidad de la proteína, la ingestiiin de energia y la actividad Bsica. 4) Los requerimientos de glucosa pueden ser surninistrados por otros carbohidratos, en particular almidbn, pero los requerimientos de lipidos son más específicos, dado que ciertos icidos graso5 poliinsaturados de las familias n-3 y n-6 no los sintetiza el cuerpo y deben ingerirse en los alimentos. 5) Las vitaminas son también requerimientos dietkticos esenciales. Las del grupo B hidrosolubles son
(Capitulo 54)
en su mayor parte cofactores enzimaticos, en tanto que el acido asc6rbico (vitamina C), tarnbitn soSuble en agua es un antioxidantc necesario para conservar los metales cofactores en estado ieducido. Las vitaminas liposolubles tienen diversas funciones desde visión (vitamina A), metabolismo de calcio y fosfato (vitamina D) y propiedades coagulantes (vitamina K) a antioxidantes (vitarninas E y A). 6) La nutrición moderna también se interesa en los excesos de alimentos, dado que se relacionan con trastornos como obesidad, diabetes sacarina no insulinodependiente, aterosclerosis, cáncer e hipertension.
REFERENCIAS Burk RF, Hill KE: Regulation of selenoproteins. Annu
Nielsen FH: Nutritiunal significance of the ultratrace ele-
Rev Nutr 1993; 13:65. Curnmings JH: Dietary Fibre. Br Med Bull 1981;37:65. Forbes JM: Metabolic aspects of the regulation orvoluntary f w d intake md appetite. Nutr Res Rev 1988:1:145. Fuller MF, Garlick PJ: Human arnino acid rcquirements. Annu Rev Nutr 1994;14:217. Kritchevsky D: Dietary Fiber. Annu Rev Nutr l9RX;8:301. National hcademy o€ Sciences report on diet and health. Nutr Rev 1989:47: 142. Nestle M: .liutrition in Clinicai Practice. Jones Medical Publications, 1985.
ments. Nutr Rev 1988;46:337. Olson RE et al. (editors): Present Knowledge rn Nutrition, 5th ed. The Nutrition Foundation, 1984. Passmore R, Eastwood MA: Hirrnnn :VutritionandDietetics, 8th ed. Churchill Livingstone, 1986, Stadtman TC: Selenium biochemistry. Annu Rcv Biochcm 1990;59:1 1 1 . Taylor A: Associations betiveen nutrition and cataract. Nutr Rev 1919;47:225. Woo R, Daniels-Kush R, Horton ES: Regulation of energy balance. Annu Rev Nwtr IYX5;5:411.
PeterA. Mayes, PhD, DSc
La mayor parte de los alimentos son ingeridos en una forma inadecuada para poder ser utilizados por el organismo, puesto que no pueden ser absorbidos en el aparato digestivo hasta que son reducidos a moléculas pequefias. Esta desintegración de los alimentos que se encuentran de manera natural hasta formas acimilables constituye el proceso de la digestión. Los cambios quirnicos de [a digestidn, se llevan a cabo con la ayuda de las enzirnas hidrolasas del aparato digestivo las cuales catalizan la hidr~lisisde las proteínas originales a arninoacidos, de los almidones a monosacáridos y de los triacilgliceroles a monoacilgliceroles, glicerol y Iicidos grasos. En el curso de estas reacciones digestivas también se vuelven más asimilables los minerales y las vitaminas de los alimentos. Una explicaci6n sistemática de la naturaleza y de las funciones de las hormonas gastrointestinales se encuentra en el capítulo 5 1.
Los defectos en los procesos digestivos se manifiestan en situaciones clínicas como ulceraci6n por exceso de HCl gástrico o aclorhidria por disminucibn o ausencia de secrecibn de HCI. Los trastornos en la secrecibn biliar conducen a cálculos biliares a quizá a alteraciones en la digestibn de los lípidos. La incuficiencia pancreática exocrina en fibmsis quística causa esteatorrea. La malabsorción de nutrientes se debe a una extensa variedad de defectos que con frecuencia causan deficiencia nutricional, por ejemplo, la absorcidn inadecuada de vitamina Biz y folato provoca anemia; los defectos en calcio y magnesio conducen
a tetania y la malabsorci6n de vitamina D conduce a raquitismo y osteomalacia; ademhs un sindrome general de malabsorcibn incluye estas y otras deficiencias. La falta de Iactasa da origen a intolerancia a la leche y los defectos en la absorcibn de aminoácidos neutros producen la enfermedad d e Hartnup.
LA DIGESTIÓN COMIENZA EN LA BOCA La saliva, secretada por las glándulas salivales, esti constituida por aproximadamente 99.5% de agua. Actúa como un lubricante para la rnasticaci61-1y para la deglución. Agrega agua a la comida seca para proporcionarun medio en el cual puedan disolverse las molkulas de alimento y en el que las hidrolasas puedan iniciar la digestión. La masticación subdivide al alimento, incrementando su solubilidad y el hrea superficial para el ataque de las enzimas. Asimismo, la saliva puede servir de vehículo para la excreción de ciertas sustancias (por ejemplo, el alcohol y la morfina), de iones inorgánicos, como el K', Ca2', HCOT-,el yodo, el tiocianato (SCN-) y de las inrnunoglobulinas (IgA). El pH de la saliva es, por 10 general, alrededor de 6.8, aunque puede variar hacia ambos lados de la neutralidad.
La saliva contiene una amilasa La amilasa saliva1 es capaz de hidrolizar la moltcula de almidón y de glucbgeno hasta maltosa; sin embargo, esto es de poca importancia en el cuerpo debido al corto tiempo que actiia sobre los alimentos. La amilaca salíval es fhciimente inactivada a pH 4.0 o menos,de manera que la acción digestiva sobre los alimentos en la boca, cesa pronto en el medio k i d o del estdrnago. Muchos animales carecen de la arnilasa salival. La
748 * Bioquímica de Harper
(Capítulo 55)
superficie dorsal de la lengua (glándutas de Ebner) secreta una lipasa lingual, pero las investigaciones indican que esta enzima no tiene importancia en el ser humano comparado con la rata o el raton, en los que es la única lipasa preduodenal.
LA DIGESTION DE LAS PROTEÍNAS COMIENZA EN EL ESTOMAGO La secrecién gástrica se conoce corno jugo ghstrico. Es un líquido claro de color amarillo pAlido, que contiene de 0.2 a 0.5% de HCI, con un pH aproximado de 1.O. El jugo gástrico contiene de 97 a 99% de agua. EI resto consiste en mucina y sales inorgánicas, las enzimas digestivas (pepsina y renina) y una lipasa.
El ácido clorhídrico desnaturaliza las proteínas y destruye a las bacterias Las células parietales (oxínticas) constituyen la fuente de HCI gástrico, el cual se origina de acuerdo con las reacciones que se muestran en la figura 55-1. El proceso es semejante al "desplazamiento de los cloniros" descrito para los entrocitos. Asimismo, hay una semejanza con el mecanismo de los níbulos renales para la secrecion de H', en el cual la fuente de H' es también la fomacibn de HzC03 catalizada por la anhidrasa carbónira a partir de HzO y de Coz. Después de la ingestibn de una comida, a menudo se observa una orina alcalina ("marea alcalina") como resultado de la formación de bicarbonato en el proceso de secrecibn de hcido clorhídrico. La secrecibn de H'
CBlula ~arretal
Plasma
estbmago
hacia el interior del lumen es un proceso activo impulsado por una H+-K' ATPasa de la membrana que, a diferencia de la Na'-K' ATPasa. es insensible a la uabaina. Las células parietales contienen numerosas mitocondriac necesarias en la producci6n del ATP usado para hacer funcionar [a H'/K'-ATPasa. El HCOJ-pasa al plasma en intercambio por C1-, que se acoda a la secrecibn de H' en el lumen. Como consecuencia del contacto con el HCI gástrico, las proteínas son desnaturalizadas, es decir, se pierde la estructura terciaria como resultado de la destnicci6n de los puentes de hidrbgeno. Esto permite a las cadenas polipeptidicas desdoblarse, haciéndolas más accesiblcs a las acciones de las enzirnas proteoliticas (proteasas). E! pH bajo tambikn sirve para destruir a la mayor parte de los microorganismos que entran al aparato gastmintestinal.
,
La pepsina inicia la digestión Ésta es la principal funcion digestiva del estómago. La pepsina se produce en Ias células principales como el cimágeno inactivo, pepsinógeno. Este es activado a pepsina por H', que rompe a u n polipéptido protector para exponer a la pepsina activa y por la propia pepsina, que acelera la activación ulterior de moKculas de pepsindgeno (autocat8lisis). La pepsina desdobla a la proteina desnaturalizada hasta derivados polipeptidicos grandes. Esta enzima es una endopeptidasa, puesto que hidroliza los enlaces peptidicoc dentro de la estructura polipeptidica principal más que a los residuos adyacentes amino terminal o carboxilo terminal, lo cual es característico de las exopeptidasas. Es especifica para los enlaces peptldicos formados por aminoacidos ararndticos (como la tirosina) o por aminoácidos dicarboxilicos (por ejemplo, el glutamato).
La renina (quirnosina, renet o cuajo) coagula la-leche La renina es importante en los procesos digestivos de los lactantes, debido a que evita el tránsito rápido de la leche por el estbmago. En presencia de calcio, la renina transforma de modo kversible a la caseha de la leche en una paracasetna, sobre la cual actúa después la pepsina. Se dice que la renina no está presente en el
t \
c1-
CI-
estómago de los adultos. Se utiliza en la elaboracion de quesos (renet o cuajo).
Las lipasas continúan la digestión de los triacilglicercrles Produccrbn de H+-K+-ATP~S~.)
clomidrico gactrico,
(0,El calor del estbmago es importante en la licuefaccibn
de la masa de lipidos de los alimentos; la emusifica-
Dige-~iihny ahsorciún
ción se efectiia ayudada por contracciones peristAfticas. El estbmago secreta una lipasa gástrica que en el ser humano es la principal Iipasapreduodenal. Las lipasas lingual y gástrica inician Ea digestibn de los lipidos mediante la hidrólisis de triacilgliceroles que contienen ácidos grasos de cadena corta, media y larga (estos últimos, por lo general, insaturadoc) para formar principalmente &cidos grasos libres y 1,2-diacilgliceroles, siendo el enlace &ter sn-3 el sitio primario de rotura. Las enzimas son destruidas a pH bajo, pero logmn ser activas en el estornago despuds de la ingestidn de alimentos, debido a la acción amortiguadora de las proteínas diethticas. Su pH 6ptimo es amplio, de 3.0 a 6.0, aproximadamente. Al parecer, las lipasas preduodenales tienen importancia particular durante el periodo neonatal cuando la lipasa pancreática puede tener actividad escasa y es necesaria la digestión de la grasa láctea. Debido a que el tiempo de retención en el estbmago es de 2 a 4 horas, 30% de los wiacilgliceroles dietkticos pueden digerirse en este lapso, la mayoría durante la primera hora. La grasa de la leche contiene $cidos grasos de cadenacorta y mediana, que tienden a estar esterificados en la posici6n sn-3. Por tanto, dichagrasa parece ser un buen sustrato para esta enzima. Los ácidos grasos hidrofilos de cadena corza y media liberados, son absorbidos a travts de la pared estomacal y pasan a la vena porta, en tanto que los ácidos grasos de cadena más larga se disuelven en las gotitas de grasa y pasan al duodeno. El anhlisis del cDNA de la lipasa lingual de rata y lipasa gistnca humana indica una hornologia de 78% en la secuencia de aminohcidos entre las dos enzimas.
749
vesícula biliar se contrae y vierte la bilis rápidamente al duodeno por medio del conducto coledoco. Las secreciones pancreáticas se mezclan con la bilis, puesto que son vaciadas a dicho conducto comun poco antes de su entrada al duodeno.
A. Composición de la bilis La composicion de la bilis hephtica difiere de la vesicula biliar. Como se muestra en el cuadro 55-1, esta última es más concentrada.
B. Propiedades de la bilis 1 ) Emulsificación: Las sales biliares tienen una considerable capacidad para disminuir la tensidn su-
perficial. Esto les permite emulsionar las grasas en el intestino y disolver los hcídos grasos y los jabones insolubles en agua. La presencia de Ia bilis en el intestino es un auxiliar importante para llevar a cabo la digestibn y absorci6n de 1% grasas, as1 como la absorción de las vitaminas liposolubles A, D, E y K. Cuando se altera la digestión de las grasas, también son mal digeridos otros alimentos, pues la grasa cubre las partículas de &os y evita que l~ enzimas actúen sobre ellas. En tales condicíones, la actividad de las bacterias intestinales provoca considerable putrefaccibn y producción de gases. 2) Neutralización de hcidos: Ademác de sus funciones en la digestibn, la bilis, que tiene un pN ligera-
Cuidro 5 5 1 . Comnosición de la bilis he~títica de la bilis1 de la ves,icuia bili: ..- .- ." ..
T El contenido del estomago o quirno, pasa intermitentemente durante la digestibn hacia el duodeno a través de ta vhlvula pil6rica. El contenido alcalino de las secreciones pancrehticas y biIiares neutraliza el ácido del quimo y hace variar el pH de este material hacia la alcalinidad. Este cambio en el pH es necesario para la actividad de las enzimas contenidas en los jugos pancreáticos e intestinales, pero inhibe la accián ulterior de la pepsina.
La bilis ernulsifica, neutraliza y excreta colesterol y pigrnentos bíliares Ademhs de las múltiples funciones que tiene el higado en el metabolismo intermedio, al producir bilis tiene una función importante en la digestibn. La vesícula biliar almacena la bilis producida por el higado entre comidas. Durante la digestibn, 1a
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750
Bioquimica de Hurper
mente superior a 7, neutrali~aal quimo ácido del estómago y lo prepara para la digestidn intestinal. 3) Excreción: La bilis es un vehículo importante para la excreción de ácidos biliares y colesterol, aunque también elimina numerocos fármacos, toxinas, pigmentos biliares y diversas sustancias inorghnicas como cobre, cinc y mercurio. El origen de los pigmentos biliares apartir de hemoglobina se expuso en el capitulo 34.
La secreción pancreatica contiene enzimas que atacan a todos los principales alimentos La secreción pancreática es un liquido acuoso no viscoso, que tiene un contenido de agua semejante al de la saliva y que lleva cierta cantidad de proteínas y otros compuestos orghicos e inorganicos, principalmente Ni,K+,HC0,-y CI-, aunque Ca2+,Zn2',HPO4'y s0p2-estan presentes en pequeñas cantidades. El pH del jugo pancrehtico es claramente alcalino, de 3.5 a 8.0 o mayor. En la secrecibn pancrehtica se encuentran numerosas enzirnas; algunas son secretadas en forma de cimbgenos. La tripsina, la quimotripsina y la elastasa son endopeptidasas: La accihn pr3teolltica de la secrecibn pancreatica se debe a tres endopeptidasas: tripsina, quimotripsina y elastasa, que atacan a las proteínas y polipkptidos liberados del estómago para producir poli@ptidos, péptidos o ambos. La tripsina es especifica para enlaces peptídicos de aminoácidos basicos y la quimotripsina para los enlaces peptldicos contenidos en residuos aminoacidicos sin carga, como los aminoácidos aromáticos. La elastass, pese a su nombre, tiene una especificidad mas bien amplia para atacar enlaces pr~ximosa residuos aminoac idicos pequefios, como la glicina, alanina y serina. Las tres enzimas son secretadas como cim6genos. La activacibn del tripsinógeno se produce por otra enzima proteolit!ca, la enterocinasa,secretada por la mucosa intestinal. Esta hidroliza un enlace peptidico de Iisina en el cimbgeno, liberando un polipeptido pequeilo, que permite a la rnol~culadesdoblarse en tripsina activa. Una vez que se forma Ia tripsina, atacara no sólo mBs molkculas de tripsinbgeno sino también otros cimdgenos en la secrecibn pancrehtica, enee ellos el quimotripsinbgenn, la proelastasa y la procarboxipeptidasa, liberando qnirnotripsina, elastasa y carboxipeptidasa, respectivamente. La carboxipeptidasa es una exopeptidasa: El siguiente ataque a los polip4ptidos producidos por la accidn de las endopeptidasas lo lleva acabo laexopeptidasa, carboxipeptidasn, que ataca al enlace peptidico carboxilo terminal, con liberaci6n de aminoiicidos simples.
(Capitulo 55)
La amilasa ataca al almid6n y al glucdgno: La acción de la secreción pancreática que desdobla al almidón se debe a alfa-amilasa pancreática. Su acción es analoga a la de la arnilasa salival, hidrolizando el almid6n y el glucógeno hasta maltosa, maltotriosa (tres residuos de alfa-glucosa unidos por enlaces alfa[l-+4]) y una mezcla de oligosacáridos mmificados (1 +6) (dextrinas alfa restringidas) no ramificado5 y algo de glucosa. La lipasa ataca el enlace éster primario de los triacilgliceroles: La tipasa pancrehtica actúa en la interfase aceite-agua de las gotitas finamente emulsificadas de los Iípidos, formadas por la agitación mecánica en el intestino en presencia de los productos de la actividad de la lipasa lingual, sales biliares, colipasa (una proteina presente en la secreción pand t i c a ) , fosfolípidos y fosiolipasa A2 (también presente en la secreción pancreática). La presencia de los hcidos grasos libres a partir de la accicin de las lipasas linguales y ghstricas facilita la hidrólisis con la participacibn de la lipasa pancrehtica, en particular de los triacilgliceroles de la leche. La fosfolipasa A2 y la colipasa son secretadas en fonna de cirnógenos y requieren activación por hidrhlisis triptica de enlaces peptidicos específicos. La activación de la prolipasa implica la remoción de un pentapéptido a partir del extremo amino terminal. Dicho pentapéptido actúa como seflal para los lipidos y se le ha denominado enterostatina. Sin embargo, su estado fisiológico todavia no se ha confirmado. El Ca2' es necesario para la actividad de la fosfolipasa Az. Una hidrblisic limitada del enlace ester en la posición 2 del focfolípido por la fosfolipasa Az (figura 2 6 4 ) fija la lipasa a la interfase del sustrato y acelera la hidrolisis del triacilglicerol. Al parecer, la lipasa pancreAtica en realidad se inhibe con las sales biliares. La funci6n de la colipasa es la de sobrepasar esta inhibicibn mediante la fijacibn, en una proporción molar de 1: 1 a la lipasa y tambihn por medio de la fijacibn a la interfase del triacilglicerol recubierto con sales biliares. De este modo, la lipasa se ancla a su sustrato de triacilglicerol. La hidrólisis completa de los triacilgliceroles produce glicerol y ácidos grasos. Sin embargo, los segundos y terceros Lidos grasoc de los triacilgliceroles son hidrolizados con dificultad creciente. La Iipasa pancrehtica es virtualmente especifica para la hidrblisis de enlaces ester primarios, es decir, en las posiciones 1 y 3 de las triacilgliceroles. Durante la digestión de las grasas, la "fase micelar" o acuosa contiene una mezcla de micelas en forma de disco y liposomas de sales biliares saturadas con productos lipollticos (figura 16-29). La presencia de una lipasa activada por sales biliares en la leche humana es un factor agregado que asegura la digestidn completa de la leche cuando se
pone en contacto con las sales biliares en el duodeno. Tiene importancia particular en lactante5 prematuros cuyas secreciones pancreáticas no operan del todo y su espectro de especificidad respecto a sus sustratos hlacilgliceroles es amplio. Recientemente se demostró que esta enzima es idéntica a la lipasa pancreatica activada por sates biliares, tambikn de amplia especificidad. A causa de la dificultad para la hidrólisis del enlace dster secundario en el triacilglicerol, por parte de la lipasa pancrefitica, es probable que la digestidn de estos lípidos continúe mediante la remocion de los ácidos grasos terminales para producir Z-monoacilgliceroles. Puesto que este ultimo ácido graso esth unido por un enlace ester secundario, su remoción necesita isomerizacidn a un enlace ester primario, para alcanzar una hidrólisis completa. Este proceso es relativamente lento; como consecuencia, los 2rnonoacilgliceroles son los principales productos finales de la digestion de triacilgliceroles y menos de una cuarta parte de los triacilgliceroles ingeridos es degradada de modo completo hasta glicerol y kcidos grasos (figura 55-2). Los ésteres de colesterilo san degradados por una hidrolasa específica: En las condiciones propias de la luz intestinal. la éster de colestcrilo hidrolasa (colesterol ecteraca} cataliza la hidrblisis de los &eres de colesterilo, que son así absorbidos en el intestino en una forma libre no esterificada. Ribonucleasa ( m a s a ) y desoxirribonucleasa (DNasa) se encargan de la digestión de hcidos nucleicos dieteticos (capitulas 38 y 39). La fosfolipasa Al hidroliza el enlace éster en la posicibn 2 de los glicerofosfalipidos de ambos orígenes, biliar y dietktico, para formar lisofosfolipidos, cuyas propiedades detergentes ayudan a ernulsificar y digerir lipidos.
Las secreciones intestinales c~mpletanel proceso digestivo El jugo intestinal secretado por las glindulas de Brunner y de LieberkUhn contiene enzimas digestivas, incluyendo las siguientes: Las aminopeptidasa, una exopeptidasa que destruye los enlaces peptldicos próximos a los aminoácidos amino terminal de polipkptidos y oligopptidos; y las dipeptidasas de diversas especificidades, algunas de las cuales pueden estar dentro del epitelio intestinal. L a últimas complatan la digestibn de dipdptidos a aminoBcidos libres. Las disacaridsisasy oligosacaridasas específicas, es decir, alfa glucosidasa {maltasa), la cual separa residuos sencillos de glucosa de 30s oligosacaridos y disachidos con enlace alfa (1+4), comenzando por los extremos no reductores; complejo sacarosa-isomaItasa, que se encuentra como proenzima en una
cadena polipeptidica, pero como una enzima activa en polipéptidos separados e hidroli7-a a la sacarosa y los enlaces 1 +6 en dextrina5 límite alfa; beta giucosidasa (lactasa) para separar la galactosa de la lactosa pero dsta también ataca a la celobiosa y otros beta glucósidos y además de tener un segundo lugar catalitico que desdobla las glucosilceramidas y la trehalasa para hidrolizar la trehalosa. Muchas de estas hidrolasas permanecen adheridas al borde en cepillo.de1 enterocito, en tanto que los dominios cataliticos en el lumen están libres para reaccionar con el sustrato. Una fosfatasa,,que remueve el radical fosfato de ciertos fosfatoc organices tales como tos hexosafosfatos, los glicerofosfatos y los nucleotidos que provienen de la alirnentacilin y la digestilin de acidos nucleicos por las nucleasas. Las polin ucleotidasas que fragmentan los acidos nucleicos en nucleotidos. Las nucleosidasas (nucleosido fosforilasas), las cuales catalizan la fosforblisis de los nucleósidos para producir las bases nitrogenadas libres más un fosfato de pentosa. Por ultimo, la fosfolipasa que actúa sobre los fosfolípidos para producir glicerol, ácidos grasos, Bcido fosfhrico y bases como la colina.
Los productos principales de la digestión se asimilan El resultado final de la acci6n de las enzimas digestivas es la transformación de los alimentos en compuestos que puedan ser absorbidos y asimilados. Estos productos son, para los carbohidratos, los monosacáridos (principalmente la glucosa); para [as proteínas, los aminoacidos; para el triacilglicerol, los acidos grasas, el glicerol y los rnonoacilgliceroles; y para los ácidos nucleicos, las nucleobasec, los nucleósidos y las pentosas. Los polisacAridos de las paredes celulares de los vegetales y la Iígnina de los alimentos que no pueden ser digeridos por las enzimas de los mamíferos, constituyen la fibra dietctica y forman la masa principal de los residuos de la digeszibn. La fibra tiene una función importante al agregar volumen a Fa racion de alimentos, la cual ya se estudi6 en el capitulo anterior. El cuadro 55-2 resume los procesos digestivos mhs importantes.
LA ABSORCIQN A PARTIR DE LAS V ~ A S GASTROINTESTIMALES RESULTA EN EL PASO DE NUTRIENTES A LA VENA PORTA HEPATICA O LOS L~NFATICOS En el estbmago se lleva a cabo poca absorcibn, aparte de la de hcidos graos de cadena corta a media y de etanol.
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A
Cuadro 55-2. Resumen de los procesos digestivos
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o de activi
Fuente y estimulo de la siecreción r
diciones 61 .a su activi
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Produc tos finales
Sust rato
O 1icciDn
ES necesario el ion cloniro pH 6.6 a
tan saliva como respu refleja alapre~enciade mentos en la boca
-
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-
e
E
-
30aó0
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1
as ceiuias parietales rscretan cl jugo (pilon ghtrico en respuesta r estimulo rcflcjo y a la ciún de la ga~trina -
---
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i Igual qur:la lipasa lirigual
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de Vu'x"<
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-
L -1 E
la lipasa liiI-
CoagulaciiSn de )a leche
-. --
El tripsinógeno se convierte en
mipsina activa por la enteroci- Pkptidos nasa del intestino a pH 5.2 a 6 U Conversihn autcicatal ítica
a pIi 7.9
--
Es secretaua como quimotrip- Proteinas ~inbgenoy convertida a la for- Pepiidos rna miva por la rripina pH 8.0
Mayor porier de coagi1lacion parr I la leche
...
ripeptidasa
Poliptptidi Dipéptidos
S e c r e t a d ;1 c o m o Polipkptidos . boxipepidha .v -a -.'. u i v a u a wr iii ' de la cadena fripsina
ienores
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1-
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10s lihres +
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tica
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.--
--
.
ActivadaI por las sales biliares. t fosfniipii305, col ipassc p N 8 . 0 ( "
-
".u.--
Secretada w m o proela~tasay converrida a la fonna activa por la tripsilíIB
hmila
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I
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: El calcio cs necesario para su C a ~ c í n de a la leche ! actividad. pH 4.0
7-
PiBncreas: Lt3 presencia dcl Tripsir . . .. . . , qulrno aciuo del estom activa al duodeno paral ducir: 1) secretinn que timula hormonalrnentr flujo del jugo pancrát itrinsina scinina, que esproducciún
2-
' Ptptidos
El pepsi,nbgeno es c onvertido Pmieínas . ..-. en pepsina activa por el HCI pH 1 .O a
ga: Pcpsin a A (fondo) . principales y repsin m R
G
tniace ester primario cn Ácidos gr: sn-3 de triacilglicemles diacilglice
Límites c
iguales
1:r primarias ~ o s 2-monr , acilgliceroIcs, glicerol :eral
...
presente en la Ieche)
NucIeOtidos
sa Coles drnlas;
I
-
Eosfol "-
-"
Higado y veslcula bili ar: (Sater; bitiares y Colecistncinin& una 1m- glcalis 1 mona de la mucosa inte:stinal, y p i h l c m e n t e también las gastrina y la secretina, estimulan l a veslciila biiiar y la wcreciún de bilis por el higado
-* Tal vez sea la misma enzima.
Activada por las sale
Secretada como pr activada por la trivsir
Estcres de ccilesterilo
Colestero1 1 libre m4IS hcidos gras:os
--
-
;ras 4amliitn neutra- Compleios de Bcidos I iza el quimcI ácido grasos con sales biliares, micelas, finamente emusionada, de grasz neutras corI sales biliarr y liposomaS
(Capitulo 55)
754 0 Bioquimica de Harpr
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Cuadro 55-2. Resumen de los - .- -. -- . - -- . ..
Fuente y estimuli
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Enzimas
de La secrecibn
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Intestino delgado: Sccrccio- 1 Aminopeptrdasa~ nes de 1as glhndulr Brunner del duode de las glhndulas de ptidasas 1 :*L~-l...lL-
--
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do de actii mdiciones 4íptimas ira su a c t ividad ~
Sus
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El intestino delgado constituye el principal brgano de absorción. Aproximadamente 90% de los alimentos ingeridos se absorbe durante su paso a travks de él y el agua es absorbida al mismo tiempo. Por otro lado, en el intestino grueso se absorbe una cantidad considerablemente mayor de agua, lo que hace que el contenido, que era liquido en el intestino delgado, gradualmente se solidifique en el colon. Existen dos vias para el transporte de materiales absorbidos desde el intestino: el sistema portal hephtico, que conduce directamente al hígado, transportando nutrientes hidrosolubles y los vasos linfhticos, que van a la sangre a havds del conducto torhcico y transportan nutrientes liposolubles.
Los carbohidratos se absorben como rnonosac~ñidos Los productos de la digestibn de los carbohidratos se absorben en el yeyuno y pasan a la sangre del sistema portal en la forma de monosacáridoc, principalmente hexosas (glucosa, fructosa, manosa y galactosa), y pentosas (ribosas). Los oligosacáridos (compuestos derivados de los almidones que dan de 3 a 10 unidades de rnonosac8ridos por hidrólisis) y los disaclídos, son hidrolizados por enzirnas apropiadas provenientes de la superficie mucosa del intestino delgado, las cuales pueden incluir la amilasa pancrehtica adsorbida sobre la mucosa. Hay poca actividad de disacaridasa libre en el lumen del intestino. La mayor parte de la actividad se relaciona con pequeilos "botones" sobre el borde en cepillo de las cklulas del epitelio intestinal.
Acido nucl Nucleósidris uc
o pirimidir
30s -
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n a e s purínicas u pirimidinicai, pentnsa fosfato
Dos mecanismos son causantes de la absorcion de monosacáridoc: el transporte activa contra un gradiente de concentracion y la difusibn simple. Las configuraciones moleculares que parecen necesarias para el transporte activo, presentes en la glucosa y en la galactosa, son Ias siguientes: El OH en el carbono 2 debe tener la misma configuracibn que en la glucosa, debe estar presente un anillo piranosa y tiene que haber un grupo metilo o metilo sustituido en el carbono 5. La fructosa se absorbe más lentamente que la glucosa y la galactosa. Su absorcibn al parecer se lleva a cabo por difüsibn a favor del gradiente de concentracibn mediante un transportador facilitador independiente de sodio (GLUT5). La glucosa favorece la absorción de mictosa. En condiciones normales, circula poca fructosa en la sangre aparte de la que proviene de la dieta.
La absorción activa de la glucosa obtiene la energía requerida de la bomba de sodio El borde en cepillo de los enterocitos contiene varios sistemas transportadores, algunos muy similares a los bordes en cepillo de las membranas renales, especíali7ados en la captacidn de los diferentes aminoácidos y azúcares. Un transportador de glucosa dependiente de codio (SLGT l), se enlaza tanto con la glucosa como con el Na' en sitios separados y los transporta a travds de la membrana plasmática de la célula intestinal. Se contempla que tanto la glucosa como el Na' son
D i p t i d n y absorción 755
liberados en el cítosol, permitiendo que el transportador tome mas "carga". El Na' es transportado siguiendo su gradiente de concentración y al mismo tiempo hace que el transportador lleve la glucosa contra su gradiente de concentraci6n. La energía libre requerida para este transporte activo se obtiene de la hidrblisis del ATP vinculado a una bomba de sodio que expulsa Na' de la célula en intercambio con el K' (figura 55-31. El transporte activo de la glucosa es inhibido por l a uabatna (glucósido cardiaco), un inhibido~de la bomba de sodio, y por la floricina, un conocido inhibidor de la resorcihn de la ~ l u c o s aen el túbulo renal. También existe un transportador de glucosa independiente del sodio. La hidrblisis de polisackidos, oligosacáridos y disacáridos es un proceso rapido; por tanto, los mecanismos de absorcibn para la glucosa y la fructosa se saturan con rapidez. Una excepciiin conspicua es la hidrblisis de la lactosa, que procede a s61o la mitad de la velocidad para la sacarosa, lo cual expIica el hecho de que la digestibn de lactosa no conduzca a la saturacihn de los mecanismos de transporte de la glucosa y de la galactosa. La adaptacidn al incremento en la ingestión de cabohidra~osse logra mediante un aumento en el numero de portadores en el borde en cepillo. w
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R tos capilares Figura 55-3. Transporte de glucosa a través del epitelio intestinal. El transporte activa esta acoplado a la bomba ' 5), K+, 1 , o a un sistema independien del ~ a (GLUT La difusibn esta representada por
&:
8.
Los productos de la digestiiin de los lipidos se absorben de !as micelas de sales biliares Los 2-monoacilgliceroles, acidos grasos y cantidades pequeiias de 1-rnonoacilgliceroles dejan la fase de aceite de la emulsión de lipidos y difunden entre las micelas mixtas y liposomas consistentes de sales biliares, fosfatidilcolina y colesterol, proporcionadas por la bilis (figura 554). Debido a que las micelas son solubles, permiten que los productos de las digestiiin sean transportados a traves del medio acuoso de la luz intestinal, hasta el borde en cepillo de las células de la mucosa donde son absorbidos al interior del epitelio intestinal. Las sales biliat-es pasan al íleon, donde son absorbidas en su mayor parte, penetrando a ta circulacion enterohephtica (capitulo 27). Los fosfolípidos de origen aIimentario y biliar (por ejemplo, la fosfatidilcolina} son hidrolizados por la fosfolipasa A2 de la secreción pancreática hasta acidos grasos y lisofosfolipidos, los cuales también son absorbidos desde las micelas. Los esteres de colesterilo son hidrolizados por la ester de colesterilo hidrolasa del jugo pancreatico, mientras que el colestero~libre, junto con [a mayor parte del colesterol biliar, se absorben a través del borde en cepillo despuCs de su transporte en las micelas. Normalmente se absorbe mBs de 98% de les lípidos de la alimentacibn. En el interior de la pared intestinal, los 1monoacilgliceroles son hidrolizados aun mas para producir glicerol libre y Acidos grasos por una lipasa intestinal (glicerol ester hidrolasa), que es distinta de la lipasa pancreática. Los 2-monoacílgliceroles pueden convertirse de nuevo en triacilgticeroles a traves de la vía del monoacilglicerol (figura 55-2). La utilización de los ácidos grasos para nueva síntesis de acilgliceroles requiere primero su conversihn a acil-COA por la acii-COA sintetasa. Los triacilgl iceroles de cadena corta y media pueden absorberse en esa forma y luego ser hidrolizados por la glicerol ester hidrolasa. Esta mzirna adquiere mayor importancia en personas que sufren deficiencia de lipasa pancreAtica, alimentados con triacilgliceroles de cadena media. Es probable que la sintesis de triacilgliceroles procedaen la mucosa intestinal de manera semejante a la que se Ileva a cabo en otros tejidos, como se describe en el capitulo 26. Los lisofosfolipidos junto con gran parte del colesterol, ya absorbidos, tarnbien son reacilados con acil-COA para regenerar fosfolipidos y esteres de colesterilo. El glicerol libre liberado en la luz intestinal no se reutiliza, sino que pasa directamente a la vena porta. Sin embargo, el glicerol liberado dentro de las celutas de la pared intestinal puede ser reutilizado en la síntesis de triacilgliceroles mediante su activación con ATP para dar glicerol 3-fosfato. Por tanto, todos los ácidos graso5 de cadena larga absorbidos en las chlu-
756 Bioquim ica de Harpes
como ácidos grasos no esterificados (libres}. Una razon de ello e5 que la acil-COAsintetasa es especifica para hcidos grasos de 12 o mas atomos de carbono. Algunos Acidos grasos de cadena corta y mediana presentes en mezclas de triacilgliceroles pueden ser absorbidos como 2-monoacilgliceroles y entrar al conducto torácico por la via del monoacilglicerol. Ninguno de los esteroles de los vegetales (fitosteroles) es absorbido en el intestino excepto el ergosterol activado (provitamina D).
Los productos de la digestión de las proteínas se absorben corno aminoacidos individuales y liquido micelar)
100
- y
80
40 % de sal biliar
60
20
O
Flgura 5 5 4 . Método de presentar tres componentes principales de Ea bilis (sales billares, fosfatidilcolina y colesterol) sobre coordenadas triangulares Cada componente está expresado como porcentaje en mol de la cal biliar total, fasfatidilcotina y colesterel La línea ABC representa la mAxima solubilidad del mlesterol en mezclas variadas de sal biliar y fosfatidilmlina El punto A representa la cornposicion de la bilis conteniendo 5% de mlesterol. 15% de fosfatidilwlina y 80% de sal biliar, que cae dentro de la zona de fase única del líquido micelar La bilis de una composicibn que se encuentre por arriba de la linea, contendria exceso de colesterol, ya sea en forma sobresaturada o precipitada (cristales o cristales líquidos). (Reproducida con autorización de Redinger RN, Small DM: Bile composition bile salt metabolism and gallstones Arch lntern Med 1972;130:620. Copyright 8 1972. American Medical Association.)
las de la mucosa de la pared intestinal, son utilizados en la nueva forrnacibn de acilgliceroles, en particular,
triacilgliceroles. Los triacilgliceroles sintetizados en la mucosa intestinal no son transportados de modo alguno en la sangre venosa portal. En su lugar, la mayor parte de los lipidos absorbidos, incluyendo los fosfolipidos, ésteres de colesterilo, colesterol y vitaminas liposolubles, generan quilomicrones que f m a n un liquido turbio, el quilo, que es recolectado por los vasos linfhticoc de la región abdominal y llevado al torrente sanguineo general por el conducto torácico. Casi todos los Bcidos grasos absorbidos de más de 10 atomos de carbono, sin considerar la forma en que se absorben, se encuentran en la linfa del conducto torácico como ácidos grasos esterificados. Los hcidos grasos con cadenas de menos de 10 a 12 carbonos son transportados por la sangre venosa de la porta
En condiciones normales, las psoteinas de la. alimentación son casi completamente digeridas hasta sus aminoácidos constituyentes y, entonces, estos productos finales de la digestion proteinica se absorben con rapidez, desde eI intestino a la sangre de la vena porta. Es posible que parte de la hidrhlísis, por ejemplo, de los dipéptidos, se complete en la pared intestinal. E1 icbmero natural (L), pero no el D, de un aminoácido, es transportado activamente a través del intestino desde la mucosa hasta la serosa, proceso en el que participa la vitamina B6 (fosfato de piridoxal). Este transporte activo de los L-aminoLcidos requiere energía, como lo prueba el hecho de que el 2,4-dinitrofenol, el desacoplador de la fosforilaci6n oxidativa (figura 14-9). inhibe el proceso. Los aminoacidos se transportan a travks del borde en cepillo por multiples portadores (transportadores), muchos con mecanismos dependientes de Na" semejantes al sistema transportador d e la glucosa (figura 55-31, De los transportadores dependientes del Na", hay uno para aminoácidos neutros, otro para fenilalanina y metionina y, un tercero, específico para aminoácidos, como prolina e hidroxiprolina. Asimismo, se han identificado transportadores independientes de Na' especializados cn aminohcidos neutros y liphfilos (fenilalanina y leucina), o catihnicos (lisina). E! cuadro 55-3 resume los sitios de absorción intestinal de algunos nutrientes comunes. cuadro 55-3. Lugar de absorcibn de nutrientes --
-Lagar -Yeyuno
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Glucosa :y otros m idos: algui disackririos ! MonoacilgI , Bcidos giasos. gl icerol.
l! Vitaminas,
colesterol hrninohcido
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-L! Electrblito " -?L.u "A"-
i Ácidos bil
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alcio, agua -.
LAS BACTERIAS DEL INTESTINO GRUESO CAUSAN FERMENTACION Y PUTREFACCI~N
El aminoácido cisteina que contiene azufre, experimenta una serie de transformaciones para formar merc a p t a n o s tales c o m o el e t i l m e r c a p t a n o y el metilmercaptano, as1 como H2S.
La mayor parte de los alimentos se absorben en el intestino delgado y sus residuos pasan al intestino grueso. Aquí tiene lugar una considerable absorción de agua, por fo que el contenido intestinal semilíquido gradualmente se solidifica. Durante este periodo se produce una considerable actividad bacteriana. Por medio de la fennentacicin y la putrefaccion, las bacterias producen diversos gases, como Coz, metano, hidrógeno, nitrógeno y ácido sulthidrico, así como hcidos acktico, IActico, propi~nicoy butirico. La descomposicibn bacteriana de la fosfatidi lcolina puede producir colina y aminas toxicas relacionadas, como Ea neurina.
Neurina
Colina
Muchos amino8cidos experimentan descarboxilacibn, convirtidndose en aminas tbxicas (ptomainas}.
Ir
H
Ptomaina A
COZ
Tales reacciones de descarboxilacibn producen: cadaverina a partir de la lisina; agmatina a partir de la arginina; tiramina, de la tirosina; putrescina, de [a ornitina; e hictamina, de la histidina. Muchas de estas aminas son sustancias vasopresoras poderosas. El aminohcido triptbfano pasa por una serie de reacciones para formar indol y metilindol (eccatol), que son las sustancias especialmente causantes del olor de las materias fecalec.
lndol
Escatol
Metilmercaptano
Etilmercaptano
Metilmercaptano
Metano y ácido sulfhídrico
En el intestino grueso se producen cantidades considerables de amoniaco, un producto de la actividad bacteriana sobre sustratos nitrogenados. Este amoniaco es absorbido, pasa a la circulaci6n portal y en condiciones normales, es rápidamente eliminado de la sangre por el hígado. Sin embargo, en las enfermedades hepáticas, esta función puede estar alterada, por lo que la concentracibn de amoniaco en la sangre periferica se elevara hasta niveles tbxicos. Se considera que la intoxicacion por amoniaco puede intervenir en la g h e s i s del coma hephtico en algunos pacientes. Asimismo, se ha demostrado que !a administracibn oral de neomicina reduce la cantidad de amoniaco que pasa de8 intestino a la sangre, debido a la accibn antibacteriana del medicamento. El suministro de dictas ricas en proteínas a enfermos con padecimientos hepáticos avanndos, o las h e r n o q i a s gastrointectinales en tales enfermos, pueden contribuir al desarrollo de la intoxicación por arnoniaco. La neomicina también tiene una accion benéfica en estas circunstancias.
Las bacterias intestinales también son benéficas
La flora intestinal puede llegar a constituir hasta 25% del pesa seco de las heces. En los herbívoros, cuya alimentación está formada en gran parte de celulosa, las bacterias intestinales o bacterias de los rumiantes son elementos esenciales para la digestidn, puesto que ellas descomponen a este polisac5rido y hacen que pueda ser absorbido. Adernhs, estas bacterias simbioticas pueden llevar a cabo la sintecis de aminoácidos esenciales y vitaminas. En el ser humano, aunque la flora intestinal no es tan importante como en los herbívoros, la actividad bacteriana siempre tiene cierto beneficio para la nutricion que se deriva de la síntesis de ciertas vitaminas, especialmente de las vitaminas K, R 1 2 y probablemente de otros componentes del complejo R (pos ejemplo, biotina) de los que puede disponer el cuerpo.
7j8 Bioquím ica dc Hurper
(Capitulo 5.5)
Los defectos en las enrimas La solubilidad limitada del colesterol en la bilis produce cálculos biliares El colesterol libre es insoluble en agua; consccuentemente, se incorpora a una micela dc fosfatidilcolina y sales biliares (figura 16-29). De hecho, la fosfatidilcolina, el fosfolipido predominante de la bilis, es de por sí insoluble en sistemas acuosos, pero puede ser disuelta por las sales biliares en las micclas. Las grandes cantidades de colesterol presentes en la bilis del Ser humano son solubilizadas en estas micelas mixtas hidrosolubles, permitiendo al colesterol ser transportado en la bilis a través del conducto biliar hasta el intestino. Sin embargo, la solubiiidad real del colesterol en la bilis depende de las proporciones relativas de sal biliar, fosfatidilcolina y colesterol. La solubilidad tarnbien depende del contenido de agua de la bilis. Esto es especialmente importante en la bilis hepática diluida. Redinger y Small, utilizando coordenadas triangulares (figura 55-41, pudieron determinar la maxima solubilidad del cotesterol en la bilis vesici!lar humana. Para la soluhilidad del colesterol, la referencia a la figura indica que cualquier punto en el triángulo que caiga por arriba de la línea ABC representa una bilis cuya composicion es tal que el colesteroe esta, ya sea sobresaturado o precipitado. Se considera que en algún momento durante la vida de un paciente con cálculm bilims se formó una bilis anomal que se ha sobresaturado con colesterol. Con el tiempo, varios factores como la infeccilin, por ejemplo, sirven como agentes de siembra haciendo que en la bilis sobresaturada precipite el exceso de colesterol en forma de cristales. A menos que los cristales apenas formados se excreten con prontitud en la bilis hacia el intestino, crecerán y formarán chlculos. Cuando se midieron las actividades de las enzimas claves para la formación de ácidos biliares en los hígados de pacientes con cálculos, ta sintesis de colesterol estaba elevada pero la de hcidcis reducida, aumentando así el colecterol hephtico. A! parecer, el decremento en la actividad de 7alfa-hidroxilasa disminuye el depósito enteroliepitico de iicidos biliares, lo cual activa al hígado para que produzca más colesterol. Entonces, la bilis s e sobrecarga de colestesol y n o logra disolverlo completamente en las micelas mezcladas. Esta infomacion concerniente a la solubilidad del cotesterol se ha utilizado en intentos para disolver los c8lculos biliares o impedir su formacibn ulterior. El ácido quenodesoxicólico ofrece, a! parecer, un tratamiento médico especifico de los calclilos biliares radiolúcidos asintomaticos de las vesiculas biliares activas, debido a su inhibición específica de la HMGCOA reductaca en el hígado, con la reducción consecuente en la síntesis de colesterol.
de la digestión de los carbohidratos causan trastornos específicos A. Tolerancia a la Iactosa La intolerancia a la lactosa, el azucar de
la leche, puede atribuirse a una deficiencia de lactasa. Debido a que la actividad de la lactasa es de velocidad lirnitante para la absorción de lactosa, cualquier deficiencia en la emiina se ve, de manera directa, reflejada en la disrninucibn de la velocidad de absorcibn del azúcar. El síndrome no se debe confundir con la intolerancia a la leche resultante de una sensibilidad a las proteinas lácteas. por lo general, a la betñ lactoglobulina. Los signos y sintomas de la intoierancia a la lactosa son los mismos. independientemente de lacausa; incluyen calambres en el abdomen, diarrea y flanilencia. Se atribuyen a la acumulaci0n de lactosa no digerida, la cual tiene actividad osrnotica, por lo que retiene agua, y a la accirjn fermentadorade las bacterias intestinales sobre el azúcar, que producen gases y otros productos que funcionan como írriiantes in~estinales. Hay tres tipos de deficiencia de lactasa(hiplactasia):
1) Dcficiencia hereditaria de lactasa: En este sindrorne, relativamente raro, los síntomas de intolerancia se desarrollan muy pronto después del nacimiento. La administracihn de una dieta libre de lactosa hace que los síntomas desaparezcan. La ingesridn de yogurt de cultivo vivo proporciona no solamente la beta galactosidasa activa para atacar cualquier pequeha cantidad de lactosa en la dieta, sino que también aporta calcio y energía, elementos que se encuentran en la leche. Ademas. se dispone de preparaciones comerciales de beta galactosidasa. 2) Actividad secundaria baja de l a lactasa: Debido a que la digesti~nde la lactosa es limitada aun en los individuos normales, la intolerancia a la leche es frecuente como consecuencia de enfermedades intestinales. Ejemplos son el esprue tropical y no tropical (celiaco), el kwashiorkor, la colitis y la gastroenteritis. El trastorno tambien se puede observar después de las intervenciones quinirgicas para eliminar la ÚIcera pdptica. 3) Actividad primaria baja de la lactasa: Este es un síndrome rclativarnente comiin, en particular entre las poblaciones no caucásicas. Dado que la intolerancia no fue una característica de la vida temprana de los adultos con este trastorno, se presume que representa una declinación gradual en la actividad de la lactasa en individuos susceptibles debido a escasa expresión de la enzima. No obstante, no se debe a la ausencia de mRN A para lactasa y una deficiencia en la traslación parece ser la causa más probable del trastorno.
B. Deficiencia de sacarasa
Hay un padecimiento congénito, atribuible a una sola m u t a c i ~ nen , el cual la glucosa y la galactosa s61o se absorben Pentamente debido a un defecto en el mecanismo del cotransportador de Nat-glucosa. Debido a que la fnictosa no es absorbida mediante este transportador, su absorción es normal. En algunos nirios y adultos, la malabsorcidn de fructosa-sorbitol causa heces acuosas, malestar abdominal y producción de: gases debido a fermentación bacteriana.
dad de absorber cierta cantidad de proteinas no hidrolizada, puesto que !a proteína digerida no es antigenica. Este hecho no se ha documentado del todo, dado que se sabe que en el calostro hay anticuerpos disponibles para el recien nacido. Hay información creciente para apoyar la hipótesis de que el defecto básico en el esprae no tropical se localiza en las células mucosas intestinales y ocasiona que los polipéptidos resultantes de la digestion peptica y triptíca del gluten, proteína principal del trigo, ejerzan no s61o un efecto nocivo local en el intestino sino tambiCn sean absorbidos a la circulación y de ese modo esrimulen Ea produccibn de anticuerpos. Se ha establecido que en pacientes con esprue no tropical es frecuente la presencia de anticuerpos circulantes al gluten o a sus fracciones. La entidad nociva es un peptido compuesto de 6 a 7 arninoacidos. Estas observaciones sobre una entidad patolbgica, que es sin duda el análogo en el adulto de la enfermedad celiaca infantil, adelanta la posibilidad de que fragmentos proteínicos de peso molecular mayor que aminoacidos sean absorbidos del intestino en ciertas circunstancias. EE cuadro 5 5 4 resume algunos trastornos causados por malabsorcion.
En la quiluria, hay quilomicrones en la orina
RESUMEN
Existe una deficiencia hereditaria de las disacaridasas sacarasa e isomaltasa. Estas dos deficiencias coexisten porque tales disacaridasas se presentan juntas como un complejo enzirnático. Los síntomas tienen lugar en la niñez temprana y son Eos mismos que aquellos descritos para la deficiencia de lactasa.
C. Disacariduria Se puede observar un incremento en la excreción de disachidos en algunos pacientes con deficiencia de disacaridasa. Hasta 300 rng o más de disacarido pueden ser excretados en la orina de estas personas y en los pacientes con daAo intestinal (par ejemplo, con espnie).
D. Malabsorción de monosacaridos
La quiluria es una anormalidad en la cual los pacientes excretan orina lechosa debido a la presencia de una conexión anormal entre las vías urinarias y el sistema de drenaje linfático del intestino, la llamada fístula quifosa. En una anormalidad semejante, eI quilotórax, hay una conexibn anormal entre e[ espacio pleural y el drenaje linfático del intestino delgado que causa acumulación de liauido oleural lechoso. La ingestión de triacilgiiceroies de hcidos grasos de cadena media (menos de 12 carbonos) en lugar de los lípidos normales de la alimentación elimina la quiluria. En el quilotórax, el consumo de triacilgliceroles con ficidos grasos de cadena corta hace que el liquido pleural aparezcaclaro. Ambos efectos se deben al hecho de que los acidos grasos de cadena media son absorbidos a la vena porta en lugar de aparecer como quilomicrones en el conducto torácico. En la deficiencia de colipasm los pacientes manifiestan esteatorrea producida por la actividad defectuosa de la lipasa pancrehtica.
La absorción de polipéptidos no digeridos puede causar reacciones antigénicas Los individuos que tienen una respuesta inmunologica a la proteina ingerida deben poseer ta capaci-
1) La digestibn consiste en el desdoblamiento por hidrólisis de moléculas de nutrientes en otras más pequefías que pueden absorberse a travbs del epitelio de las vias gastrointestinales.
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2) Los carbohiJratos como el almidón y el glucógeno son atacados inicialmente por !a amilasa saliva1 seguida por la amilasa pancreática en el intestino. Los oligosac8ridos y la maltosa resultantes, junto con otros disacáridos de los alimentos, son atacados por hidrolasas intestinales especificas para formar monosacaridos, en su mayor parte glucosa, fructosa y galactosa. 3) La digestión de las proteinas es iniciada por la endopeptidasa pepsina, en el medio Qcido del estbmago y continuada por otras endopeptidasas de Pa secreción pancreAtica (por ejemplo, tripsina, quimotripsina y elastaca) junto con la exopeptidasa, carboxipeptidasa, que desprende aminoácidos sucesivos del carboxilo terminal. La digestihn de las proteinas concluye con ayuda de secreciones intestinales incluyendo la exopeptidasa, la aminopeptidaca, m& dipeptidasas con diversas especificidades, dando como producto final aminoacidos libres. 4) Las l i p ~ a lingual s y gástrica inician la hídrhlisis de los triacilgliceroles en el estómago, después de lo cual, los productos son emulsificados con sales biliares en ei duodeno y atacados por ultimo por !a lipasa pancseática.
5) Los productos de la digestion, es decir, los monosacáridos. aminoácidos y algunos dipEptidos junto con glicerol. ácidos grasos libres y 2rnonoacilgliceroles de la degradacidn de triacilgIiceroles, son absorbidos del intestino. Los monosacáridos hidrosolubles, aminoácidos, glicerol y acidos graso5 de cadena corta y media son transportados al hígado en la sangre venosa portal hepática. En el epitelio intestinal, los triacilgliceroles son sintetizados de nuevo a partir de acidos grasos de cadena larga y monoacilgliceroles para fonnar quilomicrones. Estos son secretados a la circulación a través del conducto toracico. 6 ) Las enfermedades digestivas incluyen a las causadas por deficiencia de enzimas como lactasa y sacarasa. Otros se deben a malabsorcion, por ejemplo, a defectos cn e1 c ~ t r a n s ~ o r t a d~o ra + - ~ l u cosa (SG1,T 1 ) que conducen a malabsorción de glucosa y galactosa. Otras mhs pueden originarse en respuestas inrnunológicas a la absorción de polipbptidos no hidrolizados, como en el esprue no tropical. Los cálculos biliares son causados por el colesterol que, debido a su baja solubilidad, precipita en la bilis, formando cristales y calculos.
REFERENCIAS Borgstrom B: The micellar hypothesis of fat absorption:
Must it bc rcvisited? Scand 3 Gaqtrtienterol 1985,20:389 Büller HA, Grand RJ: Lactose intolerancc. Annu Rev Mcd 1990:41:141. Eggerrnont E: Problems of transfer orcarhohydrates at the leve1 or the intestinal mucosa. In: Inhnrn f h o r s of ,Ií'eiabolism. Schaub I et al. (editors) Ravcn Press. 1991. Ertanson-AlbertssonC: Pancreatic colipa?~.Structureand physiological aspects Biochim Biophys Acta 1993:1125.1 Foltrnann B: Gastric proteinases. Essays Biochcm 1881;17 52. llarnosh M: Lingual B C;a.rtric1,zpases. Their Role in Fat Digestion. CRC Press. 1990. Holdsworth CD: In vitro studics of svgar absorption in hurnans In: Sugors in hrltirition.Graceq M et al. (edit o r ~ )Kaven . Press. 1991.
Kuksis A (editor): Fat A hsorl>tznn CKC I'resq, 1987 Tso P: Gastrointestinal digcstion and absorption of lipid. Adv Lipid Kes 1985;21.143. Wnng CS, Hartsuck JA: Bile salt-actii.atcd lipasc: A miiltiplc fiinction Iipolytic cnzymc. Bicchim Biophys Acta 1993: 1 166: l. Wolfe MM, Soll AH: 'I'he phtsiology of gastric acid secretion. N Engl J Med l9X8;3 19: 1707 Würsch P: Dictary fíbcr and unabsorbcd carbohydrates. In: Szigars in :tufrihnn Ciraccy M et al (ediiors) Knven Press, 1 99 1 Y a n g LY, Kuksis A : Apparent convergence (at 2rnonoacyIglyccrol Icvcl} of phosphatidic acid and 2mononcylglycerol p a t h w a q s of synthesis of c h y l n m i c r o n tri;icylgl>ccrols. J L i p i d Res 1991;32:1 173.
Roberf K. Murray, MD, PhD
Las glucoproteínas son protehas que tienen cadenas de oligosacai-idos (glucanos) unidas por covalencia a sus esqueletos polipeptidicos. Las gliicoproteinas son una clase dc glucoconjugado o carbohidratos complejos. Estos terminos equivalentes se utilizan para referirse a moléculas que contienen más de una cadena dc carbohidratos unidas covalentemente a proteínas (para formar glucoproteínas o proteoglucanos) o lipidos (para formar glucolípidos). El tema de los ~iroteoglucanos se trata en el capitulo 57 y los glucolípidos cri el 16.
LAS GLUCOPROYE~NASESTÁN AMPLIAMENTE DISTRIBUIDAS Y EFECTÚAN GRAN NUMERO DE FUNCIONES Las glucoproteínac existen en la mayor parte de los sistemas biologicos, desde las bacterias Iiasta cl ser humano. Muchos virus animales m b i é n las contienen; algunas de éstas han sido investigadas, en parte debido a que resultan adecuadas para estudios biosintéticos. Numerosas proteinas con funciones diversas son glucoproteinas (cuadro 56-1 3; su contenido de carbohidratos oscila de 1 a m i s de 85% de su peso.
-Cuadro 56-1. Algunas funciones desarrolladas as glucop roteínas .-. Casi todas las proteinas plasmáticas de los seres humanos, excepto la albúmina. son glucoproteinas. Asimismo, muchas proteinas de las membranas celulares (capítulo 43) contienen cantidades sustanciales de carbohidrato. Cierto número de las sustancias de los grupos sanguineos son glucoproteinas. en tanto que otras son glucoesfingolipidos. Algunas hormonas (como le gonadotropina cori6nica) son glucoproteínas. Cada vez se reconoce mhs al chncer como un trastorno que resulta de la segulacihn genética anormal (capitula 62). El problema principal en el chncer es la methstasis, fenomeno por el cual las cglulas cancerosas abandonan su tejida de origen (por ejemplo, la mama), emigran por el torrente sanguineo a un sitio distante en el cuerpo (por ejemplo, al cerebro) y proliferan ahí en absoluto sin regulacibn, con resuEtados catastriificos para el individuo afectado. Muchos investigadores del chncerpiensan que las alteraciones en las estructuras de las glucoproteinas y otros glucoconjugados sobre la superficie de las células cancerosas son importantes en el fenbmeno de la metgstasis.
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762 Bioqulmica de Harper
Se han realizado muchos estudios para definir la funcibn precisa de las cadenas de oIigosacLridos en las funciones de las glucoproteinas. El cuadra 56-2 resume sus resultados; algunas de las funciones que se enumeran e s t h establecidas con certe~a,mientras que otras se encuentran aún baje investigación.
LAS CADENAS DE OLIG~SAGÁRIDOC CQNTIEVEN i a [ ~ ~ q n f l g ~ * e r l Slla'_@GC'C;A Un numero enorme de enlaces glucosídicos pueden generarse entre azúcares. Por ejemplo, tres hext~sas diferentes pueden enlazarse una con otra para formar mis de 1000 trisaciiridos diferentes. Las conformaciones de los azúcares en las cadenas de oligosacáridos varían dependiendo de sus enlaces y de la proximidad de otras molkculas con las que puedan interactuar. Una creencia sustentada ampliamente es que las cadenas de oligosackidos codifican una considerable infarmación biologica y que esta depende de los anjcares que los constituyen. de sus secuencias y de sus c m formaciones. Por ejemplo, los residuos de manosa 6-fosfaio conducen a las enzimas IisosOmicas objetivo recién sintetizadas a ese organelo (vdase después).
SE DISPONE DE-TÉCNICAS P ~ DE A T E C C ~ ~ poi~!F~caeiQu N, A W ~ ~ C %ESFUCTIJSAL S~$ DE efis Gr,eicvvxm ??S En el cuadro 56-3 se enumeran los diversos métodos que se utilizan en la detección, purificaci6n y análisis estructural de las glucoproteinas. Los metodos con-
wencionales utilizados para la purificación de proteínas y cnzimas (capitulo S) también se aplican en la de glucoproteínas. Una vez que se realiza este proceso, la cspectrometría d e masa y la espectroscopia de alta resolución por resonancia nuclear magnética, con frecuencia pueden identificar las estructuras de los glucanos presentes en una glucoprozeina. El análisis de las glucoproteinas puedc complicarse por el hecho de que a menudo se presentan como glucoformas; las cuales son glucoproteinas con secuencias idénticas de aminoácidos, pero diferente composición de oligosacáridos. Aunque los detalles de las vinculaciones no se revisan en este capítulo es muy importante darse cuenta que la naturaleza precisa de los enlaces entre azúcares de las glucoproteinas son de importancia fundamental en la determinacibn dc las estructuras y funciones de estas moléculas.
OCHO AZUCARES PREDOMINAN EN LAS GLUCOPROTE~NASHUMANAS Aunque en la naturaleza existen aproximadamente 200 rnonosac8ridos, sólo ocho estin presentes en las cadenas de oligosacaridos de las glucoproteínas (cuadro 5ó-4). La mayor parte de estos azhcases se describieron en el capitulo 15. El ácidoA7-acetilneuraminico (NeuAc) se encuentra en las terminales de los oligosadridos, adherido, por lo general, a los residuos subterminales de la galactosa (Gal) o deN-acetilgalactosamina (GaIWAc). Los demás anjcares enumerados, por lo general, se encuentran en posiciones más internas. Con frecuencia se encuentra al sulfate en las glucoproteinas, comúnmente adherido a Cal, GalNAc o GlcNAc.
Cuadro 56-2. Algunas funciones de las caderias de oligosac8ridris de las glucopro6-'---*
.--.-.--.Modulan propiedades fisiccquimicas; por c. Ubilidad, viscnsrdad, carga y desnaturnli7ac Protegen contra la proteolicis. tanto en el ,,&,no en el cxterior de la ctlula Intervienen en el procesamient~ o proteolltiico de p ~ :urc sores proteinicos a p~roductosniás pequefí OS a .. .>. Esthn implicadas en ia acriviaaa oioiogica; por qemplo. de la gonadotropina coriiinica humana (h(3G) !ntervienen cn la inserción dentro dc las membranas. en la migración celular, en la distribución y cin Ia secrec Iion Intervienen en el desarrollo embrionarioy en la dlfércn-
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ciacibn Pucden in i los sitios c '18dos par las cklulas cancerosas * Adaptado de Schachter H Biosynth~etic conbols that determ i ne the hranching and hetcrogeneity of 13rotein-bourid oligosacch a-
rides. Biochem Cell Biol 1986.64.11 53.
El primer azúcar de nuclebtido que se reconoció fue el difosfato de uridina y glucosa (UDPGlc); su estmctura se muestra en la figura 20-2. Los azucares de nucleótidos comunes, implicados en la biosintesis de las glucoproteinas se enumeran en el cuadro 5 6 4 ; no se definen aun las razones por las que algunos contienen UDP y otros difosfato de guanosina (GDP}ornonofosfato de citidina (CMP). Muchas, aunque no todas las reacciones de gtucosilación implicadas en la biosintesis de las glucoproteinas utilizan estos compuestos (véase después). La naniraleza anhidra del enlace entre el grupo fosfato y los azucarec, es de alta energía, del tipo con potencial energético transferible (capitulo 12). Por tanto,
c u a d r o 56-3. Algunos metodos importantes qiie se utilizan en el estudio de las gl"coproteinas ............. -
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Traramienro con utia giucesidasa o fosfolipasa 1 Las desviaciones quc rcsuiran cn ia migración clcctrofo~dticaayudan a adecuada iir cntrc la:j proteinas con cnlaci:S ;V-glucaino, O-gluc ano o GPT Y i cntrc mariosa alta v .V-glucano:i complcjoi5 -- , -.
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Es el aziic:ar adherido a la cadena polipe Ftídica ~ . . . metliante . . .Asn en g l u c oiroteínns .ci.3n iV-enlace: tambien se encuentra en otros sitios en los ol&osacAridos de estas pi La Xil está. unida al OH de Ser en much os proteogiucanos. A su vez, Xil se une a dOS
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estos azúcares estin "activados" y pueden ser transferidos a aceptores adecuados siempre que existan en el medio las transferasas correspondientes. Los sacaridos de nucle6tidos se forman en el citosol, por lo general, mediante reacciones en las que interviene el trifosfato de nucleósido correspondiente. La sintesis d e dífosfato de uridina y galactosa (UDPGal) requiere las dos reacciones siguientes:
UTP + Glucosa 1-fosfato
+--+
UDPGlc + Pirofosfato
Debido a que miichas reacciones de glucosilación tienen lugar en el lumen del aparato de Golgi, los sistemas portadores (permeasas, transportadores) son necesarios para llevar los azúcares de nucle6tidos a travbs de la membrana de Golgi. Se sabe de sistemas transportadores de UPDGal, GDP-Man y CPMNeuAc localizados en las cisternas del aparato de Golgi. Son sistemas antiportadores; es decir, la entrada de una molécula de azúcar de nucleotido es equilibrada por lasalida deuna mol~culadel nucleotido correspondiente (por ejemplo, UMP, GMP o CMP) formado de los anícares de nuclebtidos. Este mecanismo asegura una concentración adecuada de cada anjcar de nucle6tido dentro del Golgi. El UMP es formado a partir de UDPGal en el proceso siguiente:
UDPGal + Protelna
+
ProteínaGal + UDP
LAS EXOGLUCOSIDASAS Y LAS ENDOGLUCOSIDASAS FACILITAN EL ESTUD10 DE LAS GLUCOPROTE~NAS Se ha comprobado que algunas glucosidasas de especificidad definida son Útiles para examinar los aspectos estructurales y funcionales de las glucoproteInas (cuadro 56-5). Estas enzimas actúan tanto en la posicion exterior (exoglucosidasas) como en la interior (endoglucosidasas} de las cadenas de oligosacáridos. Ejemplos de exoglucosidasas son !as neuraminidasas y las galactosidasas; su uso secuencia1 remueve los residuos NeuAc terminal y Cal subterminal de casi todar las glucoproteinas. Las endoglucosidasas E y H ejemplifican a la segunda clase; estas enzima dividen a las cadenas de oligosacaridos en residuos GIcNAc especificas, cercanos al esqueleto polipeptídico (es decir, en sitios interiores; figura 56-5) por lo que son útiles para producir cadenas grandes de oligosac~iridos para su analisis estructural. Una glucoproteína puede ser tratada con una o m l s de las glucosidasas anteriores para analizar los efectos sobre su comportamiento biolbgico al remover determinados anjfcares.
EL RECEPTOR DE ASIALOGLUCOPROTE~NA EN LOS MAM~FEROSINTERVIENE EN LA DEPURACION POR LOS HEPATOCIITOS DE CIERTAS GLUCOPROTE~NASPLASMATICAS Los experimentos efectuados por Ashwell y sus colaboradores en el inicio del decenio de 1970 fueron importantes para llamar la atención sobre el significado funcional de las cadenas de oligosachridos de las glucoproteinas. Al principio, los autores estudiaron el
Cuadro S M . Algunas giucosldabas utilizadas para estudiar Ia estructura y funcianes de las glucoproteinas. Las enzimas proceden Ide diversas fuentes y con frecuencia son especifiicas de ciertos tipos de enlaces glucosidicos y también de sus natui*mlezas anoméiricas. En la figura 56-5 se muestran los sitios de acción de las endoglucosid :asas F y R. La F actiigI en oligosachridos rir:OSen minlosa Y tam bicn en los cemrilejos; en tanto que II actúa en los primeros
ieurminid ialactosidasas UDP
+ LlMP + Pi
' + . # l ~ " l > . ;An-" " ~ ~ l? Eiiuuai uLuaiuasa i
Endvaiu~u3iudsa
Endoglucosidasa H
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efecto sobre la depuracibn en la circulaci6n de los conejos, de la rernocidn de residuos NcuAc (er decir, desialilacihn) de la proteina plamhtica ceruloplasmina (capítulo 59) mediante tratamiento in virro con neurarninidasa. Con este procedimiento expusieron los residuos Gal subteminales que normalmente quedan encubiertos por los residuos NeuAc terminales. Encontraron que la ceruloplasrn ina radiaczivatratada con neusaminidasa desaparecería con rapidez de la circulacion, en contraste con la proteína sin tratamiento. Estudios posteriores demostraron que las células hepAticñs contienen un receptor de asialoglucoproteina de mamífero que reconoce la fracción galactosilo de muchas proteínas desialilatadas plasmhticas y las conduce a su endocitosis. Este trabajo. indica claramente que un azúcar individua!, como la galactosa puede tener una funci6n importante al determinar por lo menos una de las propiedades biol~gicas(esto es, el tiempo de permanencia en la circulación) de ciertas glucoproteínas.
Cuadro.56-6. Algunas lecti& . .
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LAS LECTINAS PUEDEN USARSE PARA PURIFICAR GLUCOPROTE~NAS Y PROBAR SUS FUNCIONES
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Las lectinas son proteinas fijadoras de sacáridos que aglutinan células o precipitan glucoconjugados; algiinas son por sí mismas glucoproteinas. No se consideran lectinas a las inmunoglobulinas que reaccionan con azúcares. Las lectinas contienen, por menos dos sitios de fijación para aziicar, pues las proteínas con $610 un sitio de fijacibn no aglutinan ctlulas ni precipitan glucoconjugados. Por lo común, la especificidad de una lectina se define por los azúcares que mejor inhiben su capacidad para producir aglutinación o precipitacion. Se puede clasificar como lectinas a enzimas, toxinas y proteínas de transporte si tienen sitios de fijaci6n múltiples. Al principio, las lecitinas se descubrieron en las plantas y microbios, pero en la actualidad se conwen muchas lectinas de origen animal. La proteína del receptor de asialoglucopi.oteina de los marniferos descrita antes es un ejemplo importante de una lectina animal. En el cuadro 5 6 6 se enumeran algunas lectinas importantes. Mucha de la investigacion actual se concentra en las funciones de varias lectinas animales (por ejemplo, las selectinas) en las interacciones cklula-cilula que acontecen en situaciones patolbgicas como son la inflamacidn y las methstasis del cáncer (vkase después). Numerosas lectinas se han purificado y están disponibles en el mercado; en el cuadro 56-7 se enumeran tres lectinas vegetales de amplio uso en la experimentacibn. Los siguientes son tres d e los usos bioquimicos de las lectinas purificadas:
L-ectinas tipi .-- --.-L.ectinas tipi
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Miemhrcir. de la su:perfamilia de . . . , por ejcni' las inniunogioouiinas. plo, la sialoadhesrxI que media1 la adhesi6n agos a var E B S _ k é ~ i i ~..as
1) La purificacibn y análisis de glucoproteínas: Lectinas como la concanavalina A (ConA) pueden adherirse de manera covalente a medios de sostdn inertes como Sepharoce. El complejo SepharoseConA, puede utilizarse para la purificación de
glucoproteinac que contengan cadenas de oligosacáridos que interactiien con ConA. 2) Como instrumentos para probar las superficies celulares: Dado que las lectinas reconmen a azilcares especlficos, pueden utilizarse para analizar, a un nivel general, los residuos de los azúcares expuestos en la superficie de las membranas celulares. Se han efectuado numerosos estudios en los que se emplean lectinas para comparar las superficies de cblulas normales y de dlulas cancerosas (capítulo 62). Un dato general ha sido el descubrimiento de que se requieren menores cantidades de ciertas lectinas para aglutinar dlulas cancerosas, que para las cklulas normales. Esto indica que la organización o la estructura de algunas glucoproteinas
(Capitulo 56)
766 Bioquímica de H q e r
de lasuperficie de las células tumorales pueden ser diferentes de las encontradas en las celuIas nomales. 3) Para generar células mutantes que carezcan de ciertas cnzimas para la síntesis de oligosacáridos: Cuando Ias cclulas de mamífero en los cultivos de tejido son expuestas a concentraciones apropiadas de ciertas lectinas (por ejemplo, ConA), la mayor parte de ellas muere, pero unas cuantas c61ulas resistentes sobreviven. Con frecuencia se ha observado que estas ultimas carecen de ciertas enzirnas que intervienen en la síntesis de oligosadridos. Las celulas resisten debido a que no producen cadenas de pollsacáridos, que interactiren con la lectina utilizada. El uso de estas células mutantes ha permitido dilucidar aspectos de la biosintesis de las glucoproteinas.
HAY TRES CLASES PRINCIPALES DE GLUCOPROTE~NAS Con base en la naturaleza del enlace entre sus cadenas polipeptidica y oligosacáridas, las glucoproteinas pueden dividirse en tres clases principales (figura 56-3): 1) las que contienen un enlace O-glucosidico (es decir, enlace O ) implicado en la cadena lateral de hidroxilo de la serina o treonina y un azúcar como es la N-acelilgalactosamina (GalNAc-Ser[Tre]); 2 ) las que contienen un enlace I\T-glucosidico (es decir, enlace N) implicado en el nitrógeno de la amida de la asparagina y la N-acetilglucosamina (GlcNAc-Asn}, y 3 ) Las unidas al aminokido carboxilo terniinal de una proteina por la vía de una porci6n fosforiletanolamina fijada a un oligosacárido (glucano} el cual, a su vez, se enlaza a traves de la glucosarnina al fosfatidilinositol (PI). Esta ultima clase se designa como glucoproteina de anclaje a glucosilfosfatidilinesitol (anclaje GPI, o enlace GPI). Existen otras clases de glucoproteinas de menor importancia. El numero de cadenas de oligosac8ridos adheridas a una proteinapuede variar desde 1 hasta 30 o mas, mientras que la longitud de sus cadenas de azúcar va desde 1 o 2 residuos hasta estructuras mucho m&
Cuadro 56-7. Tres Iectinas vegetales y los azúcares i:on los que interactúan. En muchos casos, las lectinas muestiran especificidad para la naturareza anornbri ca del enlaice glucosidico (ao P); esto no se indica en el cuaoro
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C'oncanavaliina A Lectina de frijol de soya -.Agiutinina de g m m de irigo WGi
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Gal y GalNac
largas. Algunas proteínas pueden contener m8s de un tipo de enlace; por ejemplo, !a glucoforina, una glucoproteina importante de la membrana eritrocítica (capítulo 60), contiene oligosacasidos con enlaces tanto O can10 !V.
LAS GLUCOPROTE~NASCONTIENEN DIVERSOS TlPQS DE ENLACES O-GLUCOS~DI~OS Al menos cuatro subctases de enlaces O-gliicosidicas se encuentran en las glucoproteínas humanas: 1 ) El enlace GalNAc-Ser(Tre) que se muestra en la figura 56-1 es el predominante. En la figura 56-2 se muestran dos cadenas de oligosacáridoc clasicas que se encuentran en los inte~rantesde esta subclase. Es frecuente que una Gal o ;n residuo NeuAc se una al GalNac, aunque se encuentran muchas variaciones en la composici6n de azucar y la longitud de tales cadenas o!igosacfiridas. Este tipo de enlace se encuentra en las mucinas (vdace después). 2) Los proteogiucanos contienen el trisaciirido Gal-Cal-Xil-Ser (que tambidn se llama enlace trisacárido}. 3) Las colagenas contienen un enlace Gal-hidmxilisina(Hil).(Las subclases [Z] y [3] se presentan en el capítulo 57). 4) Muchas proteínas nucleares (par ejemplo, ciertos factores de transcripcidn) y proteinas citosólicas contienen cadenas laterales que constan de un solo GlcNAc adherido a la serina o al residuo de treonina (GalcNAc-Ser [Tre]).
Las mucinas tienen un alto contenido de oligosacárldos con enlace O y muestran secuencias de aminoácidos repetidas Las rnucinas son glucoproteinas con dos características principales: 1) un alto contenido de aligosadridos con enlace O (el contenido de carbohidratos de Ias mucinas es casi siempre mayor a 50%)- y 2) la presencia de secuencias de aminoácidos repetidas (repeticiones en thndem) en el centro de los polipéptidos del esqueleto posterior, a las cuales se adhieren las cadenas de O-glucanos en racimos (figura 56-3). Estas secuencias son ricas en serina, treonina y prolina. Si bien predominan los O-glucanos, las micinac con frecuencia contienen varias cadenas de N-glucanos. Existen mucinas secretarasy fijadas a membrana. A las primeras se les encuentra en el moco presente en las secreciones de los aparatos gastrointestinal, respiratorio y reproductor. Este moco se compone de aproximadamente 94% de agua y 5% de mucinas, mientras que el resto es una mezcla de moléculas celulares, electr6litos y remanentes celulares. Las mucinas secretoras, por lo general, tienen una e s t i c tura oligomkrica por lo que su masa molecuIar es muy
C-c
I
H
Ser
46
1
Giicina Etanolamina
I
H-N
I
Manosa
lnositil PI-PLC
I
H
t- ~cido graso adicional
1
Asn
C-G
by
l
H-N
I c=o
Figura 56-1. Representaciones de & un enlace O (Kacetilgalactosamina a serina); B un enlace # (N-aoetiigluwcamina a asparagina) y C un enlace de glucosilfosfatidilinocitol (GPI). La estructura de GPI que se muestra en la que enlaza la acetilcolinesterasa a la membrana plasmBtica de 10s erttrocitos humanos. Et arninoacido de la terminal carboxilo es glicina unida, en un enlace amida a través de su grupo COOH, al grupo NH2 de la fosforiletanolamina la cual, a su vez, se une a un residuo de rnanosa. El glucano central contiene tres residuos de manosa y uno de glucosamina La glucosamina se une a inositol, el cual se adhwre al audo fosfatídico. Se señala el sitio de acción de la PI-fosfolipasa C (PI-PLC). La estructura del glucano central se muestra en el texto Este GPI en particular contiene un acido graso adicional unido al inositol y también una porcibn extra de fosforiletanolamina adherida al residuo medio de las tres manosas Las variaciones que se encuentran entre lasestructurasdelGP1 incluyen la identididaddel aminoácido,carboxilo terminal de las moléculas ad heridasa los residuos de manosa y la naturaleza precisa de la porción lipida
A
a2 6
NeuAc -t GalNAc
-
Ser (Tre)
Tandem de secuencia repetida
NeuAc
t
a 2.6 NeuAc
Figura 56-2. Estructura de dos oligosadridos con enlaces O, encontrados en (A) las mucinas submaxilares y (B) la feturna y la sialoglucoproteinade la membrana de los eritrocitos humanos. (Modificada y reproducida con autorizacibn de Lennan WJ: The B~ochemistiyof glycopmte~nsand Proteoglycans. Plenum Press, 1980.)
1 1
Flgura 56-3. Diagrama de una muctna. Las cadenas de O-glucanoc se muestran adheridas a la regibn central de la cadena extendida del polip8ptido y las cadenas de N-glucanos a la regidn de la terminal carboxilo. Los recthngulos angostos representan una serie de repeticiones en tandem de secuencias de aminoácidos Muchas rnucinas contienen residuos de cisteina que forma enlaces intercadenaswn sus grupos SH;Bstos no se muestran en la figura. (Adaptada de Strous GJ, Dekker J Mucin-type glywproteins Crit Rev Biochem Mol Biol 2992,27:57.)
grande. Los oligómeros se componcn de monómeros unidos por enlaces disulfiro. El moco presenta una gran viscosidad y a menudo forma un gel. Sus cuaiidades dependen del contenido de las mucinas. El gran contenido de O-glucanos confiere una esmi&-a plana a las mucinas, lo cual se explica de modo parcial por las interacciones estbricas entre las proteinas GalNAc y los aminoácidos adyacentes que producen tal efecto de rigidez de la cadena, que las con~ormaciones de las mucinas a menudo llegan a ser las de rodillos rigidos. Las interacciones íntemoleculares no covalentes entre varios azúcares sobre las cadenas vecinas de glucanos contribuyen a la conformacirin de gel. Por otro lado, en el gran contenido de NevAc y de residuos sulfato que se encuentra en muchas mucinas les confiere carga negativa. Respecto a su funcibn, las rnucinas a y d a n a lubricary forman una barrera física protectora sobre las superficies epiteliales. Las mucinas ligadas a membrana participan en diversas interacciones c6lula-célula (por ejemplo, con selectinas, véase despuks). La densidad de las cadenas de oligosacaridos dificulta que las proteasas se acerquen a los polipeptidos del esqueleto posterior por lo cual, es frecuente que las miicinas sean resistentes a la accion de estas. Las mucinas tambien tienden a "enmascarar" determinados antigenos de superficie. Muchas cclIulas cancerosas forman grandes cantidades de mucinas que enmascaran ciertos antigenos superficiales en ellas y, de este modo las protegen de la vigilancia inmunotogica. Se han estudiado los genes que codifican los esqueletos polipeptídicos de diversas mucinas. A l menos siete genes humanos (MUC1 a 7) se han clonado y secuenciado, incluso les que codifican las mucinas pancregticas, intestinales, traqueobronquiales, gastricas y salivales. Estas investigaciones revelan nueva información acerca de los esqueletos polipepíidicos de las mucinas (tamafio de las repeticiones en tándem, sitios posibles de gIucositación N, etcdtera) y en fechas recientes podrían mostrar aspectos de su control gendtico. En el cuadro 56-8 se resumen algunas propiedades importantes de las rnucinas.
Cuadro 563; ~ l-gunas i prop--..---- . -
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1 Suestnictura plan;
An
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Estaclase se distingue por la presencia del enlace entre Asn y GlcNAc (figura 56-1). Es la clase principal de glucoproteinas y ha sido muy estudiada, ya que las "
"
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A-
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e a su alta 1riscoelastic:idad Lloras sobrit las superficies
Formani barreras fi .. ,. -. . ,. , epireiiaies, participan en las interacciones ceiuia-cciuia y uiieden enmascarar ciertos antígenos de superficie 3
Las glucoproteínas con enlace-N contienen un enlace Asn-GlcNAc
inas
-.- Se encuentran en IrIS secreciones de los aparatos gast:roint-tina1 respiratorio y reproauctor.y tambien en las n brancts (i e varias ctlulas Muesttzm un contenido alto de cadcnas r por lo CIomhn de NeuAc y su1l fato
- serina, bvlk~~biken seciicncias repetid-, reonina y 1
Las cadenas polipeptídicas de Cstas y de otras glucoproteínas, son codificadas por especies de mFWA; debido a que Ia mayor parte de las glucoproteinas e s t h fijadas a membrana o son seci-etorias, por lo general. son trasladadas en polirribosomas fijados a membrana (capitulo 40). Las cadenas de oligosacárido de las gIucoproteínas O-glucosidicas, son formadas por donaciún escalonada de azúcares procedentes de saciiridos de nuclehtidos tales como UDPGalNAc, UDPGaI y CMP-NeuAc. Las enzimas qiie catalizan este ~ i p ode reaccihn son glucoproteinas glucosiltransferasas fijadas a las membranas. La sintesis de cada una de tales enzimas es controlada por un gen especifico. De ordinario, la fomacibn de un tipo especifico de enlace requiere la actividad de la transferasa particular correspondiente (es decir, la hipotesis de un enlace, una gIiicosiltransferasa1. Las enzimas que catalimn la adición de los azticares interiores se localizan en el reticulo endoplasmico y los primeros azúcares son enlazados durante la traslacibn (es decir, se produce una modificación de cotraslacional de la proteína). Los factores que deteminan los residuos especificas de serina y treonina que ser;in glucosilados, no se han identificado. Las enzimas que agregan los azúcares terminales (como NeuAc) se localizan en el aparato de Golgi. En el cuadro 56-9 se resumen las caracteristicas más importantes de la biostntesis de las glucoproteinas con enlace O.
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La biosíntesis de glucoproteínas con enlace O utiliza sacaridos de nucleótidoc
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La giucosiiacion u nene lugar ae manera posrrasiacional .o
en ciertos residuos Ser v Tre
mas accesibles (por qjemplo, las proteinac plasmaticas) pertetiecen a este grupo. Incluye glucoproteinas fijadas a membrana y circulantes. La principal diferencia con las de la clase anterior, aparte de la naturaleza del aminohcido al cual se adhiere la cadena de oligosachrido (Asn en lugar de Ser o Tre), concierne a su biosintesis.
Las tres clases principales de glucoproteinas son las complejas, las híbridas y las ricas en rnanosa Hay tres grupos principales: complejas, hibridas y ricas en manosa (figura 5 6 4 ) . Cada tipo comparte un pentasachrido común (ManlCi lcNAc2, mostrado dentro de un area rectangular en la figura 56-4 y tambidn en la figura 56-5), pero difieren en sus ramas exteriores. La presencia del pentasacbtido común es explicada por el hecho de que las tres comparten un mismo mecanismo inicial dc biosintesis. Las glucoproteínas del tipo complejo, de ordinario contienen residuos terminales WeuAc y residuos subyacentes Cal y GlcNAc; el último, a menudo constituye al disacarido lactosamina. (La presencia de unidades repetidas de lactrisarnina [GalkalllGlcNAcbeta 1-3],, caracteriza a una cuarta clase de glucoproteinas con enlaceN, la clase polilactosarnina; ésta es importante porque las sustancias del grupo sanguíneo I/i pertenecen a ella.) La mayor parte de los oligosachridos del tipo complejo contienen 2 (figura 56-41, 3 o 4 ramas
[
exteriores, pero también se han descrito estructuras que contienen cinco ramas. Las ramificaciones de oligosaciridoc con frecuencia se denominan antenas, de modo que pueden encontrarse estnicturas bi-, tri-, tetra- y penta-antenariac. Exisfe un numero asombroso de cadenas Q del tipo complejo y la indicada en la figura 5 6 4 e5 sólo una de tantas. Otras cadenas del tipo complejo pueden terminar en Gal o Fuc. Los oligosacáridos ricos en manosa tienen típicamente de 2 a 6 residuos Man adicionales enlazados al núcleo pentasachrido. Las rnol&culashibridas poseen características de las otras dos clases.
La biosíntesis de g lucoproteínas con enlaces N implica al oligosacarido-P-P-dolicol Leloir y sus colaboradores describieron la existencia de un oligosac~rid~pirofosforil~oiiml (oligosaciridoP-P-Dol), que desempeiia una funci6n clave en la biosintesis de las glucoproteinas con enlace N, según mostró la investigación subsiguiente. La cadena de oligosacáridos de este compuesto, por lo general, tiene la estructura GlcirMansGlcNAcz-R (R = P-P-Dol). Sus azúcares se ensamblan primero solire el esqueleto pirofosforildolicol y entonces, la cadena completa es transferida a residuos adecuados Asn de las apoglucoproteinas aceptaras durante su sinresic en 10s polirribosomas fijados a membrana.
Acido siáliw
Ácido siattco a2,3o6/
~2.306
Gal ,?,
Gal
GICNAC
GICNA~
"'yl GlcNAc
Man
01,2L Man
Man
Man
a1,4
Man
a1,21
MJ~
M&
G Ic INAc
fFuc
$.
Asn Compleja
+
Asn Hibrida
jl Asn
High-mannose
Figura 5 6 4 . Estructuras de los tipos principales de oligosacáridos ligados a la asparagina El área rectangular encierra al núclea pentasacárido común a todas las glucoproteinas con enlace N. (Reproducida con autorizaciónde Kornfeld R. Kornfeld S. Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Anu Rev Biochem 1985,54.631)
770 Bioqtcímica de Harper
(Capitulo 56)
Man
--e ." 'Iu4
dolicol, que es, junto con el hule, el hidrocarburo más largo que existe en la naturaleza, construido mediante una sola unidad repetida. El dolicol contiene de 17 a 20 unidades isoprenoides repetidas (figura 56-63.. Antes de participar en la biosíntesis del oligosachrido-P-P-Dol, el dolfcol primero debe ser fosforilado para formar fosfato de dolicol (Dol-P) en una reacción catalizada por la dolictll cinasa que utiliza ATP como donador del focfato. El GlcNAc-pirofosfaril-dolicol (GlcNAc-P-PDol) es el lipido clave que actúa como aceptnr de otros azúcares durante el ensamble del 01igosacárido-P-PDoI. Su síntesis se efectúa en las membranas del r e t i c u l o e n d o p l a c m i c o a partir de Do!-P y UDPGlcNAc en la reaccion siguiente:
Endogluuisidasa F
* GlcNAc
* GIcNAc
rM ""
/
1 1
Man
Endo@ucosidasaH
Figura 56-5. Diagrama del núcleo pentasacSirido común para todas las glucoproteinas con enlace N y en el que pueden adherirse varias cadenas exteriores de oligosadridos. También se observan los sitias de acción de las endoglumsidasas F y H.
Para formar una cadena de oligosac8ridos del tipo complejo, los residuos Glc y seis dc los residuos Man, son removidos por enzimas para formar el núcleo pentasacarido MantGlcNAcl (figura 56-5). Más tarde, los anjcares tipicos de las cadenas complejas (GlcNAc, Gal, NcuAc) son agregados por ta accidn de glucosiltranferasas individuales, la mayoria localizadas en el aparato de Golgi. Para formar las cadenas ricas en manosa, sólo son removidos los residuos Glc sobrantes y m& o menos algunos residuos Man perifbricos. El fenómeno por el cual, las cadenas glucano de las glucoprotelnas con enlace N son primero parcialmente degradadas y despuCs reconstruidas, se conoce como procesamiento de oligosaciiridos. De este modo, los pasos iniciales de la biosíntesis de las glucoproteinas conenlace N difieren notablemente de los correspondientes a la biosíntesis de las que tienen enlace O. En la primera interviene el oligosacárido-P-P-Dol; no así en l a última. El proceso de glucosilacibn Npuede ser dividido en dos etapas: 1) ensamble y transferencia del oligosacirido-P-P-dolicol y 2) procesamiento de la cadena
Dol-P + UDP-GIcNAc + GIcNAc-P-P-DOI + UMP
La reacci6n anterior, que es el primer paso para ensamblar el oligosacasido-P-P-Dol, asi como las reacciones que le siguen, se resumen en la figura 56-7. Las características esenciales de los pasos subsiguientes en la formación del oligosachrido-P-P-Do1 son: 1) Un segundo residuo GlcNac es agregado al primero, utilizando de nuevo UDPGlcNAc como donador. 2) Se agregan cinco residuos Man, utilizando GDPmanosa como donador. 3) MAS tarde se agregan cuatro residuos de manosa adicionales, usando Dol-P-Man como donador. El Dol-P-Man se forma por la reaccion siguiente: Dol-P + GDP-Man + Dol-P-Man * GDP
A. Ensamble y transferencia del oligosacárido-P-P-dolicol
4) Finalmente, los tres residuos perifericos de glucosa son donados por el Dol-P-Glc, que se obtiene por una r e a c c i ~ nanáloga a la recién presentada, excepto que los sustratos son Dol-P- y UDPGlc. Debe hacerse notar que los siete primeros residuos de azúcares (dos GlcNAc y cinco Man)
Los compuestos polii~oprenolesexisten tanto en bacteriac como en lor tejidos eucarioticos. Participan en la síntesis de las paredes celulares bacterianas y en la biosíntesis de las glucoproteinas con enlace N . El poliisoprenol utilizado en tos tejidos eucarioticos es el
HO
! t
t
CH,
I
CH,-CH~
Figura 56-6. Estructura del dolicol. El fosfato en el doticol focfato está unido al grupo alcohol primario en el extremo izquierdo de lamolecula La porción entre paréntesis es una unidad isopreno (n = 17 a 20 unidades isopranoides).
4-0-
U DPGlcNAc
Dol-P
Tunicamicina
UMP
GlcNAc-P-PUDPGtcNAc UDP
M-M
Dol
=M
=i
0
M-M
G-G-G-M-M-M
\
M -4GlcNAc)l-P-P-
Do1
I
4
GlcNAc-GlcNAc- P-P-Dol
G DP-M GDP
M -GICNAC-GICNAC- P- P- Dol
/
M-M-M
Figura 56-7. Vía de la biosintesis del oligosac~rido-P-P-dolicolLos enlaces especificas que se forman están indicados en la figura 54-8 Ndtese que los residuos interiores de manosa son donados por la GDF-manosa en tanto que los residuos de manosa que estan mas al exterior, provienen del dolicol-P-rnanosa y del doiicol-F-glucosa (UDP, difosfato de uridina; Dol, dolicol. P, fosfato. UMP, monofosfato de uridina. GOP, difosfato de guanosina: M, manosa: G.glucosa.)
oligosachrido:prnteína transferasa, enzima ligada a Ia membrana. La transferasa reconoced y utilizara cualquier glucolipido con la estructura general R-(GlcNAc):-P-P-Dol, La giucosilacibn ocurre en el residuo Asn de una secuencia tripeptidica Asn-X-SerITre, donde X es un aminoacido cualquiera, excepto prolina, ácido aspartico o ácido g l u t h i c o . Es favorecido un conjunto tripeptídico enclavado en un giro heta. De hecho, sólo aproximadamente un tercio de los residiios Asn que son aceptores potenciales, están realmente glucosilados. Lac proteínas aceptaras son de las dos
son donados por nucle~tidos,en tanto que los siete hltimos (cuatro Man y tres Glc} provienen de anicares del dolicol. El resultado netoes el ensamble del compuesto mostrado en la figura 56-8 y referido de manera abreviada como Glc3Man&lcNac~-P-
P-Dol. El oligosachrido unido al dolicol-P-P, es transferido en bloqueo para formar un enlace Nglucosidico con uno o mas residuos Asn especificos de una proteína aceptora que esta surgiendo de la superficie lurninal de la membrana del retículo endoplasrnico. La reacción es catalizada por una
--- Man
Man
Glc
n1.2
Glc
n1.3
Glc
01.3
Man
n1.2
M 1.2
Q 1.2
Man
Man
a
1.2
GlcNAc
GlcNAc - P - P - Dolicol
u /:
Man & Man
Figura 5 6 4 . Estructura del oligosacArido P-Pdoliml. (Reproducida con autorización de Lennan WJ. The B~ochernistryof Giycoproteins and Pmteglycans. Plenum Presc, 1980.)
772 Rioqlaim ica de Harper.
clases, secretoras e integrales de las membranas. Las proteinas citosólicas rara vez están glucosiladas. La reaccion de transferencia y los procesos subsiguientes en la glucosilacidn de Pas glucoproteínas con enlace N, junto con sus ubicaciones subcelulares, se muestran en la figura 56-9. E1 otro producto de la reaccidn de la oligosacarido:proteina transferasa es el dolicol-P-P, que más tarde es convertido a dolicol-P por una fosfathsa. El dolicol-P puede servir otra vez como aceptor para la síntesis de una nueva molecula de ol igosacárido-P-P-do1icol.
B. Procesamiento de la cadena de oligosacáridos 1) Fase temprana: k.n la figura 56-9 sc muestran las
diversas reacciones implicada^. La oligasaciirido:proteína transferasa cataliza la reacción 1 (véase antes). Las reacciones 2 y 3 comprenden la eliminación del residuo Glc terminal por la glucosidasa 1 y, los dos residuos Glc siguientes, por la glucosidasa II. En el caso de las glucoproteinac ricas en manosa, el proceso puede detenerse aquí o pueden removerse hasta cuatro residuos de ma-
RET~CULOE N D O P I ~ M I C ORUGOSO
Figura 56-4. Vía esquemática del procesamiento de los oligosadridos Las reacciones son catalizadac por las enzimas oligosacarido:proteína transferasa, a-glucosidaca 1, a-glucocidasa 11; @, a-1,2-mano~¡dasadel siguientes N-acetilgluwcamina-l-fosfodiester a-N-acetilglucoretículo endoplasrnico; (I)
m,
0,
m,
0,
0,
sialiltransferasa (U,Nacetilgluwcarnina, , manosa, , glucosa, , fructuosa, , galactosa. , acido sialico (Reproducida con autorizacdn de Kornfeld R, Kornfeld S Assembly of asparaglne-linked oiigosaccharides Annu Rev Biochem 198534 631 )
nosa. Sin embargo, para formar cadenas complejas sc necesitan pasos adicionaIes, como sigue. Cuatro residuos Man exteriores son removidos en las reacciones 4 y 5 por dos manosidasas diferentes. En la reacci6n 6 , se agrega un residuo GlcNAc a uno de los residuos Man por la GlcNAc m s f e m 1. La acción de esta última enzima permite que se produ7ca la reacción 7 que es catafizada por otra manosidasa (Golgi alfa-manosidasa 11) y reduce a tres los residuos Man en el núcleo (figura 56-5). Una vía adicional importante está indicada en 3% reacciones I y II de la figura 56-9. Esta vía ocupa enzímas destinadas a los lisosomas. Las enzímas son conducidas al organeIo por un marcador químico especifico. En la reacción 1, un residuo GlcNAc-1-P es agregado al carbono 6 de uno o m8s residuos Man específicos de estas enzimas. La reaccihn es caíalizada por una GlcNAc fosfotransferasa, que utiliza UDPGlcNAc como donador y genera UMP corno otro producto:
UDPGleNkc + Man-Proteína
t
GleNAc-1-P-6-Man-Proteina
+ UMP
En la reacci6n II la GlcNAc es removida por la acci6n de una fosfodiestcrasa, de.jando a los residuos Man focforilados en la posición 6:
1
FOSFODIESTERASA
1
P-6-Man-Proteína
+ GlcNAc
Un receptor para Man-6-P, localizado en el aparato de Golgi, fija al residuo Man-6-P de estas enzimas y las dirige a los lisosomas. Los fibroblastos de pacientes con la enfermedad de c4lulas 1 (vkase después) tienen deficiencia grave de la actividad de la GlcNAc fosfott-ansferasa. 2) Fase tardía: Para ensamblar una típica cadena oligosachrida compleja, deben agregarse mtis anícares a la estructura formada en la reaccibn 7 . Por tanto, en la reaccihn 8, se une un segundo GlcNAc al residuo Man perifkrico del otro brazo de la estructura diantenaria mostrada en la figura 56-9; la enzima que cataliza este paso es la GlcNAc transferasa II. En las reacciones 9, 10 y 1 1 se realiza la adición de residuos Fuc, Cal y NeuAc en los sitios indicados; en reacciones catalizadas por las fucosil, gatactosil y sjalil trancferasas, respectivamente.
El retículo endoplasmico y el aparato de Golgi son los sitios principales de gtucosilacion Como se observa en la figura 56-9, e1 reticulo endoplasmico y el aparato de Ciolgi son los sitios principales que intervienen en el proceso de glucosilaciiin. La adición de oligosacáridos se realiza en el retículo endoplásmico rugoso durante, o después de latraslacibn. La remocion de los residuos Glc y de algunos residuos Man periféricos, se produce también en el reticulo endoplásmico. El aparato de Golgi esth compuesto de cisternas cis, nedial y branr; &stas pueden separarse por procedimientos apropiados de centrifugacibn. Al parecer, las vesiculas que contienen glucoproteinas son expulsadas por gernación del retículo endoplásmico y se despIazan hacia la porcibn cis del Golgi. Varios estudios han mostrado que las enzimas que intervienen en el procesamiento de las glucoproteinas presentan ubicaciones diferenciales en las cisternas de Golgi. Como se indica en la figura 56-9, la Golgi alfa manosidasa 1(que catalizalareacción 5) se localira principalmente en la porción cis, en tanto que la GlcNAc transferasa I (que cataliza la reaccibn 6) parece localimrse en el Golgi medial; las fucosil, galactosil y sialiltransfem (que catalim 1% reacciones 9. 10 y 1 1 ) se encuentran en el Golgi fraw. En el cuadro 56-10 se resiirnen las caracteristicas más importantes de la biosíntesis de las glucoproteinas con enlace N y deben compararse con las de lista previa (cuadro 56-9) de las glucoproteínas con enlace O.
Cuadro 56-10. Resumen de las principales -caracteristicas de la glucosilaciE .. - . --.- --.. -... ..
.
.-.--p.
5El oligosachridoGlciMan9(Glf NAc)?se tr de el oligosacárido-1'-l'-dolicol en utia rcz irada por oligosachrido:proteina transrerasa. ia cual sc inhibe con la tunicamicina La transfcrcncia sc cfcctua a resil :n CXEla sccuencin Asn-X-Sermre, en uonue A es Cualquier residuo excepto Pro, h s p o Glu La triinsferenc~ase cla de mane :I rctic~iloendoplásmici3 i En seguida. el oligosac8rido L'ijador de proteinasc procesa parciaimente por glucosidasas y nlanosidasa S, si no se agr,egan más a~zúcares.eslo resulta e n una cadcria rica en ma nosa .. . . ... . Si el procesümienru se eieciua n a x a ei Ccniru uci ~ ~ 1 1 tasacárido (Man3[CilcNAc],!), se sintctizan caden;1s cornplgjas mediante la adicicin e scalonadn de múcari:S por transfcrasi1s individuales en reacciones cata.lizadas . . . especificas (por ejemplo, GlcNAc. Cial, NeiiAc transferasa) que eniplean los anicares del nuclebtido apropiado 8
-
Algunos intermedios de los glucanos formados durante la glucosilacion N tienen funciones especificas
11. En esta via, la calnexina retiene ciertas glucoproteinas parcialmente (o mal) dobladas y las !ibera cuando completan el plegamiento correcto.
En seguida se presentan algunas de las funciones
Varios factores regulan la glucosilacion de las glucoproteínas
específicas de las cadenas dc los N-glucanos ya establecidas o en investigación. 1) Es clara la participación de la sefial del dP de manosa en la conducción de ciertas enzimas lisodmicas (vehnse los párrafos anteriores, así como la explicación sobrc la enfermedad de ce!ulas 1, después). Es posible que otras secuencias específicas de cadenas de N-glucanos tengan funciones en la conducción de glucoproteinac especificas a otros organelos. 2) Es probable que las cadenas largas de IV-glucanos presentes en las glucoproteínas de reciente síntesis ayuden a mantenerlas en estado soluble en el interior dcl reticulo endoplasrnico. 3) Se ha demostrado que unas variedades de cadenas de N-glucanos desempeiian una función en el pleganiiento y retencibn de ciertas glucoproteinas en el lumen del reticulo endoplAsmico. La calnexina presente en el reticulo endoplásmico, actúa como "chaperona" (capítulo 431, la cual es una proteína que sc fija a otra de reciente formación y ayuda en su plegamiento adecuado. Se sabe que la calnexina se enlaza de manera especifica a ciertas glucoproteinas (por c,jemplo, la hemaglutinina del virus de la influenza [HA]) que poseen la estructura central mt~noglucosilada.Esta especie es el producto de la reacción que se muestra en la figura 56-9 pero de la cual se retira el residuo de glucosa terminal, para dejar adherida s61o la glucosa más interior. La liberación de HA completamente plegado a partir de la calnexina requiere la remocion enzimática de este último residuo glucocilo por alfa glucosidasa
Es notorio que la gli~cosilaciónde Ias glucoproteínas es un proceso complejo en el que actúan un gran número de enzimas. Un índice de su complejidad es el hecho de que se ha informado de siete GlcNAc transferasas distintas implicadas en la biosintesis de glucoproteínas y, en teoría, son posibles otras mas. También existen mlltiples especies de otras glucosiltransferasas @or ejemplo, sialilmnsfer;isas). Loc factores que controlan el paso inicial (esto es, ensamblar y transferir al oligosacarido) de la biosíntesis de gfucoproteinas con enlace N, incluyen: 1j la presencia de adecuados sitios aceptores en las proteínas, 2) Ea concentración tisufar de Dol-P y 3) la actividad de las aligosacLrido transferasas. En el cuadro 56-1 1 se enumeran algunos factores que, se sabe, estan implicados en la regulaciiin del procesamiento de oligosacáridos. Dos de ellos merecen comentarios adicionales. En primer lugar, la variacihn d e las especies entre enzimas de procesamiento adquiere importancia en relación a la producciiin de glucoproteínas dc uso terapkutico por medio de la tecnología del DNA recombinante. Por ejemplo, la eritrepoyetina recombinante (EPO) se administra en ocasiones a pacientes con ciertos tipos de anemia crónica, para estimular la eritropoyesis. La vida media de la EPO en el plasma es influida por la naturaleza del patrón de g!ucosilación, con determinados patrones
unos factcires que a fwtan las actividacles de las enzimas F
Cuadro 5 . ---
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1
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.-. ...- . . ------- . .-
ras de glu ..
C'omentaricI --. Factoi . .. ceiuia 1 Ulferentes tipos de celulaq- -contienen dlterentes pertiles de enziinas procesador -'1 ipo de -. . -1Knzima prc -tas glucosi úan sobre L cáridn si C: ipreviamente otra enzim lerril celular oe las enzimas procesatioras pueae cambiar dirrante c1 desarrollo ya sea que sus gcncs o apaguen - nciendan .-- .- --idocnlizaciiin in- Por ejemplo. si una enírii ina para in el interior nbrana del RE (corno la . . enzimas procesaaoras . .localimaas ,. . cn el tracelulau 1IMG-COArcductasa), es posinie que nunca sea contraparte ue -ato de Gol giConforma difcrencia:S en la con de diferen les prutein facilitar o impedir el las ....., mas proce:sadoras a c i idénticas -- -" -Especies 1 Algunas ceIulas (por ejemipio, los fíbroblasios) (ie diferentt:S especies, i de e n/irnas procesadoras .--AI Ida? ckliilas cancerosas Imuestran f acesadorar; diferente ientes cElulas -.iiur lnaZes . "* Por ejemplo. se requiere la accihn previa de CJcNAc transfcrasa para In nccion de ia u-manosidmisa il del aparato de Cio --m
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relacionados con vida media corta lo cual limita considerablemente su periodo de efectividad terapéiitica. Por tanto, es importante obtener EPO de cdlulas hospederas que confieran un patron de glucosilaci6n consistente con una normal vida media en plasma. En segundo lugar, existen gran interés en el anhlisis de las enzimas de procesamiento dc las glucoproteinas en varios tipos de células cancerosas. Se encuentra con frecuencia que estas células sintetizan diferentes cadenas de oligosacáridos (por ejemplo, con Frecuencia muestran mayor número de ramas} que las elaboradas en las cClulas control. Esto puede deberse a que las cklulas cancerosas contienen patrones de glucosiltransferasas diferentes de los de las células nomales equivalentes, debido a activación o represión génicta especifica. Las diferencias en las cadenas de oligosaddos pueden afectar lac interacciones adherentes entre las células cancerosas y sus progenitoras normales, y contribuir así a las metástasis. Es importante encontrar una correlación entre la actividad de enzimas de procesamiento particulares y las propiedades metastfisicas de las ~Plulascancerosas (capitulo ,62) ya que esto permitiría la síntesis de f h a c o s para inhibir estas enzirnas y, en consecuencia, las metlstasis. En el nivel gknico se han clonado muchas glucosiltransferasas y otras se encuentran en estudio. La clonacibn revela nueva inforrnacihn tanto en la estructura de la proteina como en la del gen. Esto ultimo puede aportar luz sobre los mecanismos implicados en su control amscripcional, por loque se utilizanestudiosde genes nocaut para evaluar la importancia biológica de diversas glucosiltransferasas.
La tunicamicina inhibe la gluccisilación N, pero no la O Se sabe de varios compuestos que inhiben diversas reacciones implicadas en la gliicosilaciiin, entre los que se encuentra la tunicamicina, la desoxinojirrimicina y la swainsenina. En el cuadro 56-12 se indican las reacciones que éstos inhiben. Los agentes pueden ser utilizados experimentalmente para bloquear varias etapas de la biosíntesis de las glucoproteinas y para estudiar !os efectos de alteraciones especificas en el proceso. Por ejemplo, si las células crecen en presencia de tunicamicina, no se producirá la glucosilacion de sus glucoproteínas con enlaces N. En ciertos casos. se ha mostrado que asi se incrementa la susceptibilidad de estas proteínas a la prote6lisis. Al parecer, el bloqueo de la glucosilación no tiene un efecto consistente sobre la secreción de las glucoproteinas que estrin norntalmentz destinadas a este propósito. Los inhibidores del procesamiento de las glucoproteínas, incluyendo los enumerados en el cuadro 56-12, no afectan a la biosintesis de glucoproteinas con enlace U.
Cuadro 56-12. Tres inhibidores de las enzimas que catalimn la glacosilacidn de las glucoproteinas sitios de acción --
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Sd i o de accibn
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Tunicarnicina
-
1[nhibc a la e n ~ i m aque cataliza la ixliciún de GIcNAc a1 dolicol-P, 1pasa inicií11 cn la biosíntesis de ofigosacarido-tl-P-doli-ni ..- -
rimicinw , Jnhihidnr d e las gliico -
bnhibidord e la manos
ALGUNAS PROTE~NASSE ANCLAN A LA MEMBRANA PLASMÁTICA MEDIANTE ESTRUCTURAS DE GtUCOSILFOSFATlDlLINOSlTOL Las glucoproteinas ligadas al glucosilfosfatidiIinosito! (GPI) comprenden la tercera de las principales clases de glucoproteínas. En la figurii 56-1 se muestra la estructura del GPI (a reces denominado "pie pegajoso") implicada en el enlace de la enzima aceti lcolinesterasa (ACh esterasa) a la rncmbrana plasrna~icade los eritrocitos. Las proteinac ligadas a GPI se anclan a la capa exterior de la membrana plasrnlitica por los ácidos graso5 del fosfatidilinositol (PI), El PI se e n l m a través de la porción G1cNH2a una cadena glucano que contiene varios azúcares (por ejemplo, Man, GlcNH:). A su vez, la cadena oligosadrida se fija por la wia de la fosforiletanolamina en un enlace amida al carboxilo del aminoácido terminal de la proteína adherida. El centro de !a mayor pitrte de las estructuras GPI contiene una moMcula de fosforiletanolamina, tres residuos Man, una molécula de GlcNH?, y una rnolecula de fosfatidilinositol en la forma que sigue:
6Manal folípido
-, GlcNal
t
6-mio-inositol-1-fos-
Se encuentran constituyentes adicionales en muchas estructuras GPI; por ejemplo, la que se muestra en la figura 56-1 contiene una fosforiletanolamina adicional adherida a la manosa intermedia de las tres que constituyen la porcibn Man del glucano y un hcido graso adicional adherido a GlcNH2. Se desconoce el significado funcional de estas variaciones en las estructuras. Este tipu de enlace se detectó por primera vez mediante el uso de fosfolipasa C específica de PI bacteriano (PI-PLC), cuando se encontr6 que éste liberaba ciertas proteínas de la membrana plasrnatica de las células por divisidn del enlace que se indica en la figura 56-1.
En el cuadro 56-13 se dan ejemplos de algunas proteínas ancladas por este tipo de enlace. Se sugieren al menos tres clases de funciones msibles del mismo: 1 )El ancla,je GP1 puede permitir un gran aumento en la movilidad de una proteina en la membrana plasmhtica comparada con la de una proteína que con~iene secuencias transrnembrana. Esto quii-a no sea sorprendente, pues el ancla GPI se une sólo a la secciiin externa dc la bicapa lipídica. por lo que es más libre para difundir que una proteína anclada a las dos sccciones de la bicapa. La mayor movilidad puede ser importante para facilitar la respuesta rápida al estimulo apropiado. 2) Algunas anclas GPI pueden conecrar con vías de seiiales de transduccion. 3) Se observa que las estructuras GPI pueden dirigir a ciertas proteinas hasta los dominios apicalcs de la membrana plasmhtica de algunas células epiteliales. La biosintesis de las anclas de GPI es complqa y comienza en el reticulo endoplAsmico. El ancla GPl se ensambla de modo independiente por una serie de reacciones calalizadas por enzima y en seguida se transfiere al extremo del carboxilo terminal dc su proteina aceptara, con separación del péptido hidrhfobo preexistente, de la terminal carboxilo de tal proteina. Este proceso a veces se denomina glupiación. En las causas de la beinoglobinuria pararística nocturna participa un defecto adquirido cn un estadio temprano de la biosíntesis de la estructura del GPI (véase después).
Las glucoproteinas son importantes
en la fecundación Para llegar a la membrana plasmhtica de un oocito, un espermatozoide debe atravesar la zona pelucida (ZP), envoltura no celular gruesa y transparente que rodea al oocito. Esta zona contiene tres glucoproteínas, de ZP 1 a ZP3. La liltima tiene interes particular, pues es una glucoproteina con enlace O que funciona como receptor del espermatozoide. Una proteína en la superficie del espermatozoide, posiblemente galactosil transferasa, interactba de manera específica con las cadenas de oligosacáridos de ZP3; por lo menos en algunas especies (como el ratbn), csta interaccidn induce la reaccihn acrosórnica mediante sefializacion transmembrana en la cual se liberan del acrosoma del espermatozoide, enzimas tales como proteasas y hialuronidasa. Estc proceso ayuda al espermatozoide a traspasar Ia zonci pelúcida y alcanzar la membrana plasmhtica del oocito. En los cricetos se observa que otras glucoproteina, la PH-30, es importante en la unión de las membranas plasmaticas del espermatozoide y del oocito para su fusibn subsecuente. Estas interacciones capacitan al espermatozoide para penetrar y fecundar el oocito. Es posible inhibir la fecundación con el desarrollo de fánnacos o anticuerpos que interfieran las funciones de ZP3 y PH-30, los cuales actuarian como anticonceptivos.
LAS GLUCOPROTE~NASPARTICIPAN EN MUCHOS PROCESOS BIOLÓGICOS Y EN MUCHAS ENFERMEDADES
Las selectinas desempeñan funciones clave en la inflamación y en el direccionamiento de los linfocitos
Como se enumera en el cuadro 56-1, las glucoproteínas tienen muchas funciones diferentes, algunas de las cuales se describen en este capitirlo y otras en diversas partes de esta obra (por ejemplo, la moléculas de transporte, la inmunologicas y las hormonas). Aquí se describe brevemente su participación en dos procesos especificos: la fecundacibn y la inflamación. Tanbien se resumen las bases de ciertas enfermedades que se deben a anormalidades en la síntesis y degradación de glucoproteinas.
Los linfocitos tienen funciones importantes en muchos fenbmenos inflarnatorios e inrnunologicos. Los primeras pacos en muchos de tales proce~&son las interacciones entre los Ieucocitos circulantes y las células endoteliales antes de que aqueIlos salgan de la circulación. El trabajo heclio para identificar las rnol6culas específicas en la superficie de las celulas implicadas en tales interacciones, revela que las superficies de ambos tienen lectinas especificas denominadas selectinas, que participan en su adhesión intracelular. En el cuadro 56-14 se resumen las características pr,incipale de las tres clases principales de celectinas. Estas son proteinas transmembrana de cadena única de enlace Caz' (figura 56-1 0). Su porción terminal amino contiene al dominio lectina mismo que participa en el enlace a ligandos de carbohidratos específicos. Puede considerarse aue la adhesi6n de neutrofilos a las cclulas endoteliales de las venulas poscapilares tiene lugar en cuatro etapas, tal como se muestra en la figura 56-1 1. La etapa basal inicial se logra mediante celectinas, a travks de la disminucibn de la velocidad
Cuadro 56-13. Algunas proteínas ligadas a GPI -
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AcetilcoIinesterasa(membrana eritrocitic; Fosfataa alcalina (intestinal. placentarja) Facrur de acclcramienio de la declinnci6n (memorana eritrocitir 5'-Nucleo Antigcno
"ocitos T, o (cerebro, , r . ~ ~ , ~ -c-;-l-p ~ ~ .,<~ ~ , S
S
célula endotelial* .,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,., .. .,electinas l.-celectir ..- ..,., ,
3. linfociio CE, piarlucias
". . . r-sciectin
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y otros
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Superfamili 1 , l l l focitns. (:E . -. Lin focltor, CL 1 CE. PMN. li~ifi
ICAM-1 ICAM-2 - , -PECAM- 1
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ias plaquetr . .
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de ~iiociuitsivi. 'irnirn L n , n wu VA: Adhcsion rniiiccuics and inflamirialury iiilury I'AsER 1994.8 5m. Estos soti li!:ando< para 1--sclectina Iinfocitnrin: aunno se identifican lus Iigandos píira la1 -wleclina neutrnfilica. (:lave: P? p l iniorfoniucleares, CE. crlula endotelial. C'D. grupos de dilcrenciación, ICAM. mnlCcula dc adhesióii inter celular. LFP
& , S
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L 1 m- l . I Y I I C - 1
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relacivnatlu con la iuncibn dcl linfiicilo; PFCAM-1, moleculri-1 dc adhesiiin celiilar plsqiiera-ckliiTa cndiitelial.
o rodamiento de los neutr6filos. Estan implicadas interacciones entre la L-selectina de la superficie de los neutrófilos y CD34 y GliCAM-1 de la superficie endotelial. Estas interacciones particulares al principio son de corta duracirin y el enlace global es de relativamente baja afinidad lo que permite el rodamiento. Sin embargo, durante esta etapa se presenta la activaci~n de los neutrófilos por inedio de varios mediadores químicos (descritos después), lo que resulta en un cambio cn la f o m a de los neutrófilos y su firme adhesión al endotelio. Un conjunto adicional de molCculas de adhesión participa en la fimem de la adhesibn: LFA-1 y M ac- l en los neutrdfi los, asl como ICAM- 1 e ICAM-2 en las crllulas endoteliales. La LFA- 1 y la Mac- 1 son i n t e ~ n a CDI s lJCDI8 (véase capitulo 60 para comentari& sobre kctac), en tanto que ICAM-1 e ICAM-2
Llnea Dasa
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Rodamiento
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Y adhes16nfirme
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Transmigraci4n L-Selectina COOH
Flgura 5 6 1 0 . Diagrama de la L-selectina humana. La porción extracelular contiene un dominio amino terminal homblogo a las lectinas de tipo C y un dominio adyacente del factor semejante al de crecimiento epidbrmico. 6stos se regulan por un numero variable de nódulos semejantes a los reguladores del complemento (círculos numerados) y una secuencia transmembrana (rombo negro) En la terminal carboxilo hay una secuencia citoplasmdtica Corta (w'tángulo en blanca). Las estructuras de las selectinas P y E son similares a las que se muestran, excepto que contienen mhs módulos reguladores del complemento. El numero de aminocidoc en las selectinas L, P y E, según se deduce de las secuencias del cDNA, es de 385, 789 y 589, respectivamente (Reproducida con autorización de Bevilaequa MP, Nelson RM. Selectins. J Clin lnvest 1993;91.370.)
Figura 56-1 1. Diagrama de las interacciones neutrofilocélula endotelial. A: Condiciones basales: los neutrofilos no se adhieren a las paredes de los vasos E!: El primer suceso es la lentitud o et rodamiento de los neutrbfilos dentro de los vasos (vénutas) mediado por selectinas C: Se produce la activacibn, que resulta en la adhesión fime de los neutrbfilos a la superficie de las células endoteliales al tiempo que asumen una conformaabn plana. Este requiere la interaccibn de integrrnas CD18 adtvadas sobre el neutrófilo con ICAM-1 sobre el endotelio. D: En seguida, los neutrófilosmigran entre las uniones de las céluras endoteliales hacia el telido intersticial, esto requiere la participación de PECAM-1. En este último paso tarnbibn se implica la quimiotaxic. (Reproducida con autorización de Atbelda CM, Smith CW, Ward P k Adhesion molecules and inflarnatory injury. FASEB J 1944;8,504 )
778 Bioaziim icu de Harner
son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. La cuarta etapa es la migración de los neutr~filos a travks de la pared endotelial. Para que tenga lugar, los neutrófilos insertan seudbpodos en las uniones de las celdas endoteliales, se escurren entre las uniones y cruzan la membrana basa1 para quedar así libres de migrar en el espacio extravascular. Se ha demostrado que la mol~cula-lde la adhesitin plaqueta-célula endotelial (PECAM-1) se localiza en l a uniones de las celulas endoteliales, por lo que puede tener alguna funcibn en la transmigracihn. Asimismo, se sabe que participan diversas molkculas en la activación de los neutrófilos y las celuIas endoteliales entre las que se incluyen: el factor de necrosis tumoral alfa, varias interleucinas, factor activador de las plaqiietas (PAF), ieucohieno 3 4 y ciertos fragmentos del complemento. Estos compuestos estimulan diversas vías de seflalimcibn y algunos tambien son quimiotacticos. Un cambio funcional importante es el reclutamiento de selectinas en la superficie celular, como en algunos casos en que las selectinas se almacenan en gránulos (por ejemplo, en las células endoteliales y en las plaquetas). Se conoce la naturaleza química precisa de algunos de los ligandos implicados en las interacciones selectina-ligando. Las tres clases de selectinas -jan oligosaciiridos sialilados y fucosilados y, en particular, todas enlazan sialilo Lewis" (figura 36-1 2) que es una estructura presente tanto en glucoproteinas como en glucolipidos. No está establecido si este es el ligando real implicado in vivo. En ciertos casos las moleeulas sulfatadas, como las sulfhtides (capítulo 161, pueden ser ligandos. Este conocimiento basico se utiliza en los intentos para sintetizar compuestos que bloqueen las interacciones selectina-ligando y, de este modo, puedan inhibir la respuesta inflamatoria. Las modalidades incluyen la administración de anticuerpos moncxlonales especificas o de anatogos del sialilo Cewisx obtenidos por sintesis química, ambos fijadores de selecrinas.
En ciertas enfermedades subyacen anormalidades en la síntesis de glucoproteinas
(Capitulo 56j
de oligosacaridos en la superficie, algunas de las cuales pueden contribuir a la metástasis. Tanto en el síndrome de glucoprateina deficiente en carbohidrato (SGDC) c o m o en la multinuclearidad eritroblástica hereditaria con prueba de lisis acidificada positiva (MEHPLAP) -anemia diseritropoyetica tipo 11- se han descubierto anormalidades en enzimas procesadoras especificas. La enfermedad de células 1se expondridespuis. La hernoglobinuria paroxística nocturna cs una anemia adquirida leve que se caracteriza por la presencia de hemoglobina en la orina debida a la hemdlisis de eritrocitos, en particular durante el sueñe. Este ultimo fenhmeno puede reflejar una ligera caída en el pH plasmB€ico cuando se duerme, lo cual incrementa-la susceptibilidad a la
Cuadro 56-15. Algunas enfermedades debidas a anormalidades en la biosíntesis dc ~iucoriroteínas 0 9ue las irn rmednd
1 t l UU1nenio e n '
-
rami~icaciiin
hinrirome de giucoprotcínn deficiente en carbohidrato (SGDC) por ejemplo, debid;] a dcficicncin dc GlcNAc transfer:asa II*
Defectos
MEHPAD
nalidad en In biosint esis de iL:-glucanos (por ejcmplo, posibl ernente de manosidasa 11) que aiectan en particular a la memtirana celiilar dc los eritro-
eii la biosintcsrs dc cndenaq d e .l.?-glucanos (por
ejcmplo, dcbidos a dcfictencia de GlcNAc transferasa 11) que afectan en panicular a Ia memcelular de 10s eritrocitos -
-A--
-t 1 citos
Hemoglobinurfa paro- Defec to adquiridlo en labiosinxística nocmrna tesis ile la estrui:tura del I:it'I2 ,lnl, En ..t, A, . ,LLI~CIEI ,i*:,1,., UFI I ~ L L U I us ~JIIIGIILO de la dec )AF) y CD59
Enfermcde
-t is 1 La dr
fosfot, ,,,,,,,,
El cuadro 56-1 5 enumera diversas condiciones en las que son importantes las anormalidades en la sintesis de glucoproteínac. Como se expíic6, muchas cilulas cancerosas muestran diferentes perfiles de cadenas
iii
dc los glucnnos t:n la superficie r puede Ser' inlportanbe el1 áslns~s .-
de la GlcNAc , , , rcsulta enrtac la
condu
mal de cie
icas * Se han reconuciao ues subiipos (1 aI111).de.este :sindrome. EiIlos enzim
tres sc afecta al sicterna nervioso central, lo que pone en eviden-
cia la importancia de varias glut normal de estc sistem~ t
-0110
' La multinucleartdad e ritroblástica hereditaria :on prueba 1mi, .. i
..m tiva de lisis en suero aciairicaao (anemta aiseriuopoytiica congknita tipo 11), Esta es una variedad relativamente leve de anemia. Refleja, al menos de manera parcial, la presencia en la membrana de los eritmitos de varias glucoproteinas con cadenas de 1%'-glucanos anormales, les cuales contribuyen a la susceptibilidad a la lisis. :Glucosilfosfatidilinosi 4
Flgura 56-12. Esquema de la estructura del sialilo Lewicx.
0
4
0.
lisis por el sistema del complemento (capitulo 59). El defecto basico en la hemoglobinuria paroxistica nocturna es la adquisicibn de mutaciones sornaticas en el gen PlG-A (de glucanas de focfatidilinositil clase A) de ciertas cilulas hematopoyéticas. Al parecer, el producto de este gen es la enzima que une la porción GlcNAc al fosfatidilinositol en la estructura del GPI (figura 56-11. Por tanto, hay deficiencia de las proteinac que se anclan por un enlace GPI, en la membrana del eritrocito. De particular interhs son dos proteinas: el factor de aceleramiento de la declinacihn P A F ) y otra proteina designada CD59. En condiciones normales ambas interactúan con ciertos componentes del sistema del complemento (capítulo 58) para evitar las acciones hemolíticas de este Ultimo. Sin embargo. cuando son deficientes, el sistema del complemento puede actuar sobre la membrana del eritrocito y producir hemolisis. La HPN puede diagnosticarse con relativa simplicidad ya que los eritrocitos son mucho más sensibles a la hemhlisic en suero normal acidificado a un pH de 6.2 (prueba de Harn); en estas condiciones el sistema del complemento se activa, pero las células normales no se afectan. Se dispone de diversas modalidades terapeuticas pasa el trastorno (transfusión, esteroides, trasplante de medula ósea). La figura 56-1 3 resumen la etiología de la hemoglobinuria paroxistica noctura.
La enfermedad de células I resulta de fallas en el direccionamiento de las enzirnas lisosómicas Como se expuso, manosa-6-fosfato sirve como marcador químico para conducir ciertas enzimas lisosómicas a dicho organelo. El anhlisis de cultivos de fibroblastos derivados de pacientes con enfer-
Mutaciones adquiridas en el gen PIG-A de ciertas ciSlulas hematopoybticas
L Síntesis defectuosa del enlaw GlcNHpPl de las anclas de GPI
L Cantidades disminuidas en la membrana de los eritrocitos de proteinas GPI de anclaje, con especial importancia en el factor de aceleramiento de la dedinación (DAF) y de CD59
.1 Ciertos componentes del sistema del complemento no tienen la oposicibn de DAF y CD59 lo que resulta en lisis de los eritrocitos mediada por el complemento
Figura 56-1 3. Esquema de las causas de la hemoglobinuria paroxistica nocturna.
medad de celulas I (células de inclusión) tuvo mucho que ver para descubrir la función mencionada de manosa-6-foshto. La enfermedad de células de inclusion es un padecimiento poco frecuente que se caractesi7a por retardo psicomo~orprogresivo y diversos signos físicos, con muerte en el transcurso del primer decenio de vida. Se ha enconmdo que los cultivos de células de los pacientes con enfermedad de c6lulas 1 carecen de casi todas las enzimas lisosbmícas nomales; por lo que 10s lisosomas acumulan moléculas n o degradadas de tipos muy diferentes; lo cual da lugar a la forrnacion de granuloc de inclusihn. Asimismo, se observa que las muestras de plasma de los pacientes con l a enfermedad manifiestan actividades muy altas de enzimas lisosómicas; esto sugiere que las eiizimas se sintetizan, pero fallan en alcanzar los sitios intracelulares de destino adecuados por lo que se secretan. Los cultivos celulares de estos enfermos pueden captar las cnzirnas lisosómicas procedentes de individuos normales agregadas de manera ex6gena al medio, indicando que SUS células poseen los receptores normales en sus superficies para permitir la captacihn endocítica de las enzimas lisosómicas. Adernh, esto sugiere que las enzima IisosOmicas de las células 1de estos enfermos. podrian carecer de un marcador de reconocimiento. bstudius ulteriores han revelado que las enzimas lisos6micas de individuos normales transportan el marcador de reconocimiento Man 6-P descrito antes. Más tarde, se descubrió que las céluias cultivadas de personas con enfermedad de células 1, mostraban una actividad deficiente de la GlcNAc fosfotransferasa localizada en la porción cis de Golgi, lo cual explica por q u e sus enzimas lisosiimicas no pueden adquirir al marcador Man 6-P. Ahora se sabe que hay dos proteinas receptoras de Man 6-fosfato, una ec de masa molecular grande (275 kQa) y la otra de pequeiia (46 kDa).Ambas son lectinas que reconocen a Man 6-fosfato. Ida primera es independiente de catibn y tambien fija IGF-11(por lo que se denomina receptor Man 6-P-IGF-11), en tanto que la segunda, en algunas especies, es dependiente de cation y no fija IGF-11. Al parecer, ambos receptores tienen funciones en la ordenación intracelular de las enzimas lisosómicas al interior de las vesiculas recubiertas de clatrina, lo cual tiene lugar en la porcibn tram del aparato de Golgi, subsecuente a la adici6n de Man 6-fosfato en Ia porci6n cis de dicho aparato. En seguida, estas vesiculas dejan el aparato de Golgi y se funden con un compartimiento prelisosómico. El pH bajo en este compartimiento hace que las enzimas se separen de sus receptores y, a continuacibn, penetren en los lisosomas. Los receptores se reciclan y reutilizan. El receptor de menor tamat70 es el único que funciona en la endocitocis de las enzirnas lisos6rnicas extracelulares y es una Y ia menor para la localizacibn lisosbrnica. No todas las cklulas emplean el receptor del Man 6-fosfato para conducir sus enzimas lisosómicas (por ejemplo, los hepatocitos
utilizan una via diferente aún n o identificada): además, no todas las enzimas lisocomicas se dirigen mediante este mecanismo. Así, las investigaciones bioquimicas de la enfermedad de células 1 no solo condu.ieron a dilucidar su base, sino que también contribuyeron de manera significativa al conocimiento del proceso por el cual las proteínas recir5n sintetizadas son dirigidas a organelos específicos, en este caso el lisosorna. La figura 56-14 resume las causas de la enfermedad de celulas 1. La polidistrofia seudoHurler es otra enfermedad genética intimamente relacionada con la enfermedad de células 1. El padecimiento es mas leve y los pacientes pueden sobrevivir hasta la edad adulta. La información sugiere que la GlcNAc fosfotransferasa implicada en la enfermedad de d l u l a s 1 tiene varios dominios uno de los cuales, de manera especifica, reconoce e interactiia con enzimas lisosórnicas. Se propone que el defecto en la polidistrofia seudoHurler radica en el último dominio y que el padecimiento es más leve, debido a que se conserva cierta actividad catalítica.
Las deficiencias geneticas de las glucoproteínas hidrolasas lisosómicac causan enfermedades coma alfa manosidosic Las glucoproteínas, igual que gran parte de las biomoltSculas, experimentan tanto síntesis como degradacidn (es decir, recambio). La degradacibn de cadenas oligosacAridac de glucoproteínas, requiere toda una bateria de hidrolasas lisosórnicas incluyendo al fa neuraminidasa, beta-galactosidasa, betaexoaminidasa, alfa y befa manosidasas, alfa-N-acetil-
galactosidasa, alfa fucosidasa, endo-beta-h'acetilplucosam inadasa y aspartiglucosam inidasa. Los sitios de accion de las dos u l t i m a enzimas se indican en la leyenda de la figura 56-5. Pueden producirse defectos determinados por errores genéticos en la actividad de estas enzimas, los cuales conducen a degradación anormal de las glucoproteinas. La acumulación tisular de metabolitos de ese proceso anomalo causa varias enfermedades, Entre las mejor conocidas de éstas se encuentran: manosidosis, fucosidosis, sialidosis, aspartilglucosaminuria y la enfermedad de Schindler, debidas a deficiencia de alfa manosidasa, alfa fucosidasa, alfa neuraminidasa, aspartilglucosaminidaca y alfa-N-acetilgalactosaminidasa.Estos trastornos, que son en cierto modo poco comunes, tienen diversas manifestaciones; algunas de sus caracteristicas principales se enumeran en el cuadro 56-16. El hecho de todos los pacientes afectados por estos trastornos muestren signos en el sistema nervioso central indica la importancia de las gIucoproteinas en el desarrollo y funcionamiento normal de ese sistema. Con lo expuesto puede verse que las glucoproteinas están implicadas en una amplia variedad de procesos biológicos y enfermedades. Tienen una funcion directa o indirecta en varias enfermedades más, como se muestra en los e.jeemplos siguientes: 1) El virus de la influenza tiene una neuraminidasa Que desem~eha una funciiin clave en la elución de la re&n sintetiada progenie. a partir de las celulas infectadas. 2) El H1V-1, que muchos consideran el agente causal del SIDA, ataca a Ea célula a traves de una de sus glucoproteínas
C*;;$d"r56-16. Principales características de algunas enfermcdrdes (por ejemplo, a-rnanosidosis, fi-mao r i d o s i s , f u c o s i d o s i s , s i a l i d o s i s , aspartilgluisaminuri a y enfermedad de Schindler) debidas a defit:iencias de glucoprotelna hidrolasas
.. ". Es frecuente que miiestren retairdo mental, u otras anl malidade!;neuroliigicas y, en a Igiinos trastornos. cari terísticas generales. visceromej:alia . o amk . )as .. . . Yanaciones en la gravedad desde Ieve hasta la woluci6n rápida A A A A . -
Mutaciones en DNA
L GlcNAc fosfotransferasa mutante
L Ausencia de transferencia normal de GlcNAc 1-P a residuos espeúficosde manosadeciertasenzimasdestinadas a los lisosornas
4 En consecuencia, estas enzimas carecen de Man 6-P y son secretadas de las dlulas (por ejemplo. al plasma) en lugar de dirigirlas a los lisosomas J.
De este modo, los lisosomas carecen de esas hidrolasas, no funcionan de manera apropiada y acumulan material celular digerido de manera parcial, mostrando cuerpos de indusion
Figura 56-14. Resumen de la causa de la enfermedad de eélulas l.
*
Hcre~lcia Pueden mtistrar riistrinucion ttnica (por eyempro, ia aspattilgliucosam ini~ tia es f r z cicntc ~ en Fiiilaiid ia) En algunt3s trastorn os, al m i croscopio, S:e observa iacuoli/.acicin celular ,l --,.A .... ~ i ia l'reiencia ric vr uuu~iuh c ucgiaufi~iuiidiiuiiiiai i ~lor ejemplo, a idos que S:e acurnulrm por la .fi-
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ciencia de CCF y ca
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de superficie, la gp 120. 3 ) La artritis reumatoidc se vincula con una alteracihn en la glucosilación de las moleculas de inmunoglobulina gamma (IgG) circulante (capítulo 59),como las que carecen de galactosa en sus regiones Fc y terminan en GlcNAc. La proteína fijadora de manosa (no debe confundirse con el receptor de manosa 6-fosfate, es una lectina C sintetizada por las celulas del higado y secretadñ a la circulación, la cual enlaza manosa, GlcNAc y algunos otros azúcares; por tanto, tambiCn puede enlazar las moleculas de agalactosil IgG con la activacihn subsecuente del sistema del compIernento y contribuir a la inflamacicin cr6nica en las membranas sinoviales de las articulaciones. Esta proteína tambien puede unirse con los anicares mencionados cuando estan presentes en la superficie de ciertas bacterias, hongos y virus, con lo que se lec prepara para opsonizaciqn o para dectrucción por el sistema del complemento. Este es un ejemplo de inmunidad innata que no implica inmunoglobulinas. La deficiencia de esta proteína en lactantes pequeños, debida a una mutacion, los hace muy susceptibles a infecciones recurrentes, Se espera que los estudios básicos de las glucoproteínas y otros glucoconjugados (es decir, el campo de la glucobiología) conduzca a tratamientos efectivos para las enfermedadesen las que están implicadasestasrnolkculas.
RESUMEN Las glucoproteinas son compuestos de distribucion amplia, con diversas funciones, los cuales contienen una o más cadenas de carbohidratos unidas por enlaces covalentes. El componente carbohidrato de una glucoproteína oscila desde 1 hasta más de 85% de su peso y su estructura puede ser simple o muy complicada. Las cadenas oligosaclidas de las glucoproteinas codifican información genbtica e intervienen de manera importante en lamodulacion de su solubilidad y viscosidad, en protegerlas contra la protedlisis, en su actividad biolhgica y en su participación en interacciones célula-célula normales y anormales (por ejemplo, interaccibn espermatozoide-bvulo, desarrollo y chncer, respectivamente). Es posible dilucidar la estructura de numerosas cadenas de oligosacáridos por cromatografia gas-líquido, espectrometria de masa y espectrometría RNM de alta resolución. Las endo y exoglucosidasas hidrolizan enlaces específicos en oligosacáridos y se utilizan para explorar estructura y funcidn de las glucoproteinas. Las iectinas son proteínas que se unen a uno o más azúcares específicos de las cadenas de oligosacMdos. Las clases principales de glucoproteinac son: las que se unen con enlaces O (donde interviene un OH de serina o treonina), las que se unen por un enlace N (donde interviene el iV del grupo amida de asparagina) y las que tienen un enlace glucosilfosfatidilinositol (GP1). Las mucinas
son una clase de glucoproteinas de enlace O que se distribuyen sobre la superficie de las células epiteliales de los aparatos respiratorio, gastrointestinal y reproductor. El aparato de Golgi tiene una funcion importante en las reacciones de glucosilaciCin necesarias para la biosíntesis de las glucoproteinas. Los oligosacáridos de las glucoproteinas con enlace O se sintetizan por adición sucesiva de azúcares cedidos por nucleótidos en reacciones catalizadas por glucoprote inas gl ucosiltransferasas especificas individuales. La biosintesis de glucoproteinas con enlace N e5 mas compleja. La cadena proteinica recibe un oligosacárido cedido por dolicol-pirofosfato-oligosacáridoconforme atraviesa la membrana del retículo endoplhsmico. Luego, esta cadena se reduce y se reconstmye en el aparato de Golgi, pero se agregan azúcares externos diferentes. Dependiendo de las enzimas y proteínas precursoras sintetizadas por un tejido, pueden formarse oligosachridos de enlace fi de tipo complejo, híbrido o rico en manosa. Las glucoproteínas están implicadas en muchos procesos biol0gicos. Por ejemplo, la glucoproteina ZP3 que se encuentra en la 7 ~ n pelúcida, a participa en la interacción de los espematozoides con el ovulo. Tambien se ha encontrado que un grupo de lectinas denominadas lecitinas, desempefian funciones importantes en las interacciones de los neutrbfilos y los linfocitos con las células endoteliales. tal como tiene lugar en la inflamación. El ligando de carbohidrato denominado sialilo Lew isx participa en algunas de estas interacciones; de estos hallazgos pueden surgir nuevos enfoques respecto a los anticonceptivos y nuevas terapiuticas para la inflamación. Se hañ reconocido diversas enfermedades que implican anormalidades en la síntesis y degradacibn de las glucoproteinas. Las glucoproteinas de la superficie celular de las celulas cancerosas muestran diferencias en la estructura de sus oligosacáridos cuando éstos se comparan con los de celulas normales. Al parecer, estitn implicados defectos en la síntesis de las glucoproteinas en el síndrome de g3ucoproteina defic i e n t e en carbohidrato (SGDC), enfermedad MEHPLAP y hernoglobinuria paroxistica nocturna. En la enfermedad de células 1, las proteinas de la membrana lisosomica no son dirigidas de modo apropiado hacia el lisosoma debido a que no hay señal de reconocimiento de su Man 6-P a causa de una deficiencia determinada geneticamente de GtcNAc fosfotransferasa. Algunas otras enfermedades n o comunes se deben a deficiencias genéticas en la actividad de las glucoproteinas hidrolasas lisos6micas específicas. Entre o m s trastornos se mencionan alfa y beta manosidosis, fucosidosis, sialidosis; aspartilglucosaminuria y la enfermedad de Shindler. Las glucoproteinas también están implicadas en muchas otras enfermedades que incluyen la influenza, el SlDA y la artritis reumatoide.
REFERENCIAS Beaudet AL, Thomas GH: Disordcrs of glycnprotein deg-
rridation: Mannosidosis, fucosidosis, sialidosis and asparty lglycosaminuria Chapter 63 in: The ~24ttabolic Basis oflnherited Disease. 6th ed. Scriver CR ct al. (editors). McGraw-Hill, 1989. Brockbausen 1: Clinical aspects of glycoprotein biosynthesis. Crit Rev Clin Lab Sci 1993;30.65 Charuk JHM et al.: Carbohydrate-deficicnt glycoprotein syndrome type 11. An autosomal recessive N-acetylglucosaminyl-transferasc11 dcficicncy differeni rrom typical hereditary eryrhroblastic multrnuclearity, with a positivc acidified-serum lysk test (HEMPAS) Eur J Biochem 1995. 1995;230:797. Drickamer K, Taylor ME: Riology of animal lectins. Annu Rev Cell Biol 1993;9:237. Elbein AD: Glycosidase inhibitors: Inhibitors of the ,t7Iinked oligosaccharide. FASEB J 1991.5:3055. Englund PT: The structure and hiosynthesis af glycosq.1 phosphatidyl-inositol protein anchors. Annu Rev Riochem 1903;62:291. Fiedler K, Sirnons K: The rale of,V-glycans in thc sccrctory pathway. Cell 1995;81 309. Jentoft N: Why are prutcins O-glycosylated? Trends Riochem Sci 1990;15:291.
Kornfeld R, Kornfeld S: Assemhly of asparapine linked oligosaccharides. Annu Rev Blochem E 985;54:63 1. Kornfeld S, Sly WS: I-cell disease and pseudo-Hurler polydystrophy: Disorders nf lysn.;ornal enqrne phosphorylation. 111: The ,Mciabolic and mWokcrrlarHases oflnheriiedDiseasc. 7th ed. Scriver CK et al. (editors). McGraw-Hill, 1995. Lasky LA: Selectin-carhohydratc interacttons and the initiatiori of the inflammatory response. Annu Kev Riochem 1995,64:113. Rini JM: Lcctin struciure. Annu Rev Riophys Biomol Struct 1995;24:55 1. Srhachter H: Enzymcs associated with glycoqylatinn Curr Opin Struct Riol 199 1 :1 :755. Strous CJ, Dekker J: Mucin-iype glycoproteins. CRC Crit Rcv Bioshem Mol Riol 1992;27.57. Takeda J et al.: Dcfícicncy of the GP1 anchor caused hy a somatic mutation of the PJF-A genc in paroxysmal nocturna1 hemoglobinuria. Cell 1993;73:703. Ware FE et al.: Thc rnolecular chaperone calnexin binds GlcMansGlcNAc2 as an initial stcp in rccognizing unfolded proteins. J Biul Chem 1995;270:4697.
Matriz extraceAuAañ Robert K. Murray,
MD,PhD y Frederic W. Keeley, PhD*
Las células son las unidades bksicas de la vida. La mayor parte de las celulas de mamífero se agrupan en tejidos, donde se encuentran rodeadas por una matriz extracelular compleja, llamada a menudo tejido conjuntivo. Esta matriz tiene diversas funciones, que se describen a contínuacion, aparte de actuar como mdamiaje de sostén para las celulas que rodea. La matriz extracelular contiene tres clases principales de biomoléculas: 1 ) las pmteinas estructurales,colhgena, elastina y fibrillina; 2) ciertas proteinas especializadas, como fibrillina, fibronectina y laminina, que tienen funciones especificas en la matriz; y 3) proteoglucanos, constituidos por cadenas largas de disacáridos repetidos (glucosaminogliicanos [GAG], llamados en un principio mucopolisacáridos) adheridos a proteinas centrales especificas. Este capitulo describe la bioquimica básica de las tres clases de biomoléculas y muestra su significado biornédico. Asimismo, se describen de manera breve las principales caracteristicas de dos formas especializadas de matriz extracelular: el hueso y el cartílago; y de diversas enfermedades en las que éstos participan.
La atencibn a la matriz extracelular aumenta conforme crece la apreciacibn de sus numerosas actividades en procesos normales y patolrigicos. Durante el desarrollo, ciertas cdlulas embrionariac deben emigrar a distancias considerables a travks del liquido extracelular para encontrar sus destinos finales. Los estados inflamatorio~,tanto agudo como crbnico, comprenden
* Research Institute, Hospital for Sick Children, Taronto y Department of Biochemistty, Universidad de Toronto.
numerosas alteraciones en la bioquímica de la matriz. P m que las células canceros= experimenten metástasis, primero deben adherirse a su organo o tejido de origen, emigrar a través de la matriz extracelular y Suego entrar a vasos sanguineos o linfhticos pequeiios. Hay abundantes prucbasde la intervencidn demoléculas de la matriz tanto en la artritis reurnatoide como en la osteoartritis, dos de lu enfermedades más importantes que afectan a la humanidad. Diversas enfermedades (como la osteogénesis imperfecta y varios tipos del síndrome de Ehlers-Danlos) se deben a perturbaciones genéticas de la sínksis de colagena. Las deficiencias geneticas de las hidrolasas lisostimicas que intervienen en la degradacihn de GAG ocasionan cierto nwmero de enfermedades (designadas mucopolisacmiridosis, con base en el nombre inicial de los GAG), cuya causa es la degradacion anormal de GAG y su acumulacion subsiguiente en varios tejidos. Por ultimo, es aparente que durante el proceso de envejecimiento se producen numerosos cambios en la matriz extracelular. N o se ha comprobado la afirmaciiin de la industria respecto a cosmeticos de que ciertos productos tienen efectos antienvejecimiento sobre la colágena y otros constituyentes de la matriz extracelular.
LA COLAGENA ES LA PROTE~NAMAS ABUNDANTE EN EL MUNDO ANIMAL La colhgena principal componente de gran parte de los tejidos conjuntivos constituye alrededor de 25% de la proteina de los marniferos. Proporciona un soporte extracelular en todos los metazoarios y existe virtualmente en todos los tejidos animales. En los tejidos humanos se han identificado cerca de 19 tipos diferentes de coldgena hechos con cerca de 30 cadenas poliptptidas distintas (codificadas por el mismo numero de genes de colágena). Aunque algunas de elias estan presentes s610 en pequeflas proporciones, pueden desempeiiar funciones importantes en la detemina-
ción de las propiedades físicas de los tejidos. Adernhs, diversas proteinas (por ejemplo, el componente C 1q del sistema del complemento y las proteínas surfactantes pulmonares SP-A y SP-D) que no se clasifican como colhgenas tienen dominios tipo colágena en sus estructuras; alguna veces se les denomina colágena "no coligena".
6 a d i - o 57-1. Tipos de colágena y sus geries47T .
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El cuadro 57-1 resume los tipos de colagenas que se encuentran en los tejidos humanos; en la leyenda se indica la nomenclatura que se utiliza para designar los tipos de colagena y sus genes. Los 19 tipos de colagena mencionados pueden subdividirse en varias clases con base principalmente en las ecúucturas que forman (cuadro 57-2). En este capitulo se describen sobre todo las colhgenas I y 11 formadoras de fibrina. que son las principales colagenas del hueso y del cargilago, respectivamente. Sin embargo, cuando es apropiado se describirán otras colágenas.
LA COLAGENA T1PO I SE COMPONE DE ESTRUCTURAS DE TRIPLE HÉLICE Y FORMA FIBRILLAS
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Todos los tipos de coligena tienen una estructura de triple hélice. En algunos, toda la molécula es de tres hdlices, mientras que en otros, las tres hélices afectan sólo una porción de la estructura. La colagena tipo 1 madura que contiene cerca de 1000 aminohcidos pertenece al primer tipo; en ella cada subunidad polipeptidica o cadena alfa se tuerce hacia la derecha en una helice de mes residuos por cada giro (figura 57-1). Tres de estas cadenas se deforman hasta dar una hblice con giro a la derecha formando una molécula de 1.4 nm de diámetro y alrededor de 300 nm de longitud. Una característica sorprendente de la colhgena es la presencia de residuos de glicina cada tercer posición de la p o r c i ~ nhelicoidal triple de la cadena alfa. Esto es necesario debido a que la glicina es el único aminodcido suficientemente pequeiio para acomodarse en el limitado espacio disponible bajo el nccleo central de la triple helice. Esta estructura repetida, repre-
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luchos tejidos (por qjcnnplo, higado y el riilbn) rmñ klulas dcl rabdomiusarc~ I * Con ligera adiiptacibn de Prockop 1DJ. K ivirriklco Kl: Colla!gens: "
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lnnu Molecular biology, di seases. and potcntiaIs ft Ker Bioclicm l995,@1:403. El tipo de colhgcna se designa c,,. ..Y...,.& romanos. cadenas constituyentes del procolhgcna, clennminadas cadena? pro*, se riurneran con arhhigori segurdos deT t i p de colhgena entre parcniesis Pur ejemplo, la procolggena tipo 1 se ensambla a nartir de dos cridcnm pronl(l) 1 una procr2(S) por lo que es un heterotrimcro, e11taiitri que la pmofAgenii tipo 11 se ensambla a partir de Ires cadenas proa I(I) por lo que es uii homotrimcro lios gmcs de la col6gena se denominan de acuerdo con el tipo escrito cn níírnerw ardhigoi para el símboIo del gen, ~eguidode una nero de las cadenas p m1 que codific an. Por tanti1, los L l A l 4 COl,lA2 codlfii:nn respectij/amente las iradede la colhgcna tipo 1
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-Otros -
' H a d o en Prockop D i
Matriz exbrace/u/ar 785
sentada como (Gli-X-Y},, es un requerimiento absoluto para la fomaci6n de la triple hdlice. Aunque X y Y pueden ser cualquier aminohcido, alrededor de 100 de las posiciones X son prolina y alrededor de 100 de las posiciones Y son hidroxiprolina. La prolina y la hidroxiprolina confieren rigidez a la moldcula de colhgena. Esta ultima se forma por hidroxilación postraslacional de residuos de prolina unidos al pkptido, catalizada por la enzima prolil hidroxilasa cuyos cofaciores son ácido ascórbico (vitamina C) y alfa cetoglutarato. Las lisinas en la posición Y tarnbidn se modifican despuks de la traslación hasta hidroxilisina por accibn de la lisil hidroxilasa, una enzima con cofactorec semejantes. Algunas de las hidroxilisinas después pueden modificarse mcdiante la adición de galactosa o gaPactosilglucosa a través de un enlace O-glucosidico, un sitio de glucosilacion que es único para la colfigena. Los tipos de colágena que forman fibrillas largas como bactoncillos en los tejidos, se ensamblan mediante uniiin lateral de estas unidades helicoidales triples en un alineamiento "desfasado en cuartos", de modo que cada una se desplaza Eongitudinalmente de su vecina por afgo menos de un cuarto de su longitud (figura 57-1, parte superior). A este ordenamiento se debe el aspecto de bandas de estas f i b r a en los tejidos conjuntivos. Las fibras de colfigena se estabilizan aún mas por enlaces covalentcs cruzados, dentro y entre las
triples hklices. Estos enlaces cnizados se forman por acción de la lisil oxidasa, una enzimaque depende del cobre y que desamina por oxidación los grupos 6psilon amino de ciertos residuos de lisina e hidroxilisina, generando aldehídos reactivos. Estos aldehidos forman productos de condensación aldblicos con otros aldehidoc derivados de lisina o de hidroxilisina o forman bases de Schiff con los grupos epsilon amino de lisinas o hidroxilisinas no oxidados. Estas reacciones, después de reordenamientos quimicos adicionales, producen enlaces covalentes cnizados estables que son importantes para la fuerza tensil de l a fibras. Algunos tipos de colagena no forman fibras en los tejidos (cuadro 57-2). A nivel rnolecular, estas colagenas se caracterizan por las interrupciones de la triple hélice con extensiones de proteína que carece de secuencias repetidas GIi-X-Y. Estas secuencias no Gli-X-Y producen áreas de estructura globular intercaladas en la triple hklice. La colfigcna ripo IV, el ejemplo mejor caracterizado de colágenas con triples hélices discontinuas, es un componente importante de las membranas basales, donde forma un entramado.
La colagena experimenta extensas modificaciones después de su traslación La coligena recién producida se modifica de manera extensa antes de convertirse en parte de la fibra extracelular madura (cuadro 57-3). Igual que lamayoría de las proteínas secretadas, la colágena se sintetiza en los ribosomas como un precursor, preprocolágena,
hadro 57-3. Ordent y ubhcidn del prc r de Ia colhgena fibi dell precurso .. Inrraceiuiai Molécula
Triple helice
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rto Figura 57-1. Rasgos moleculares de la estructura de la colagena desde la secuencia primaria hasta la fibrilla. (tigeramente modificada y reproducida con autorizacián de Eyre DR: Collagen: Molecular diversity in the body's protein scaffold Science 1980.207:1315. Copyright0 1980 by the American Ascociation for the Advancement of Science.)
. Desamin:~icibnoxid aiva de grupos kpsilon amino de ia hasta alr residuos i3c lisina e . 'n de enlac is intra e iiatercatenar ias
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(Capitulo j7)
que contiene una secuencia líder o sefial que dirige a la cadena polipeptidica hacia el espacio vesicular del retículo endoplhico. Confonne entra aéste, la secuencia líder es removida por una enzima. En este sitio tambidn tiene lugar la hidroxilacibn de residuos de prolina y lisina y la g!uco~ilación de hidrolisinas de esta procolhgena. La molécula de procolagena contiene extensiones polipeptidicas (peptidos de extensión) de 20 a 35 kDa en los dos extremos m i n o y catboxilo terminales, ninguno de los cuales permanece en la colágena madura. Ambos péptidos de extensihn contienen residuos de cisteína. En tanto que el propéptido amino terminal forma solo puentes disulfuro intracatenarios, los prop&ptidos del extremo carbaxito tienen enlaces disulfuro tntra e intercatenarios. La fomacibn de estos puentes disulfuro colabora en la preparacibn de las tres moldculas de colfigena para crear la triple hélice, al hacer que giren desde el extremo carboxilo terminal. Después de la fomacibn de la triple helice, no se produce ninguna reacción de hidroxilacibn ni de glucosilacihn. El autoensamble es un principio cardinal en la biosíntesis de la col6gena. Después de su secrecidn a partir de la célula a travds del aparato de Golgi, enzimas extracelulares llamadas procolilgena arninoproteinasa y procoligena carboxiproteinasa desprenden los péptidoc de extensión de los extremos amino y carboxilo terminal, respectivamente. El desdoblamiento de estos propeptidos puede tener lugar dentro de criptas o pliegues de la mernbrana celular. Una vez removidos los propkptldos, las moléculas de colAgena de triple hélice, que contienen alrededor de 1000 aminoacidos por cadena, se ensarnblan de manera espontknea en fibras de coliigena, que mas adelante se estabilizan con la formación de enlaces cruzados intra o entercatenarios por accion de la lisiloxidasa descrita antes. Las mismas cklulas que secretan colágena también secretan Fibranectina, una g l u ~ o ~ r o t e i ngrande a que existen en las superficies celulares, en la matriz extracelular y en la sangre. La fibronectina se une a fibras de procolágena que se esthn reuniendo y altera la cinética de fomacion de fibras en la matriz pericelular. Vinculados a la fibronectina y la procolágena en esta matriz están los psoteoglucanos, sulfato de heparán y sulfato de ~ o ~ d r o i t i n(véase a despucs). De hecho, la colhgena tipo IX, de contenido bajo en el cartílago, posee cadenas de proteoglucano adheridas. Estac interacciones pueden servir para regular la formación de fibras de colágena y determinar su arientaci6n en los tejidos. Una vez que se forma, la colagena tiene una estabilidad metabblica relativa. Sin embargo, su desdoblamiento aumenta durante tos estados de inanición y en algunos inflarnatorios. Hay producci6n excesiva de colágena en varios estados patológicos (por ejemplo, en la cirrosis hephtica).
De las anormalidades en la síntesis de colágena resultan ciertas enfermedades genéticas Cerca de 30 genes codifican la colagena y su vía de biosinzesis es compleja, ya que implica al menos ocho pasos postraslacionales catalizados por enzimas. Por tanto, no es sorprendente que diversas enfermedades (cuadro 57-4) se deban a mutaciones en los genes de la colhgena o en los que codifican alguna de las enzimas implicadas en sus modificaciones postraslacionalec. Las enfermedades que afectan el hueso y el cartílago se presentan despuds en este capítulo. El sindrome de Ehlers-Danlos comprende un grupo de trastornos hereditarios cuyas caracteristicas clínicas principales son la hiperextensibilidad de la piel, la fragilidad anormal del te.jido y el aumento de la movitidad articular. El cuadro clinico es variable y refleja la extensión subyacente de la heterogeneidad genktica. Se reconocen cuando menos 11 tipos y la mayoría refleja diversas lesiones en la síntesis de la colagena. El m6s serio es el tipo IV, en virtud de su Cuadro 574. &krtt&dades causadas por mutaciones en los eenes dr?tr colAg.ena n nor deficiencias en Ins actividades postr n Ir les de las e ;Cntesis de
Gen o er A-
! .--
cta
1 Síndrome
i-Danlos tipo
Condrodis~ iIrisias scvr OsteoartritilS: Slndrome ae cniers-tianios IV . . rino - Sindrome de Alport (incluye l a7 ~wiedadesautosbmic:a y ligada aX ) . . t..l^^ :-2r?-:>--xv .-... 0
~ p i u e r i i i u ~ iuuuuha. ~i~ vni it-uddeq
distréfícas
-
Condrodi splasia m ietnfiseal de )aiilos tipo >
Síndrome VIIC
,isil hidros
i
Adaptado de P m k o p U hiology, diseases. and
. chem
,-Danlos tipo
.. f W?
enes: Molecular Annu kv Bia-
;h4:4U3.
t Se obscwa vinculacibn geneiica con los genes a algunos irastornos más que no se enumerm viqi En cl momr:n10 actual. S;e aplica sblo a un numei pequeao de tales pncier capitulo 59) 8 Sccundaio :a dcficienci
tendencia a la rotura espontánea de las arterias o de la vejiga, lo cual refleja anormalidades en la colagena de tipo 111. Los pacientes con sindrome tipo IV, debido a deficiencia de lisil hidroxilasa, muestran una notable hipemovilidad articular y tendencia a la rotura ocular. El tipo VIlC del sindrome se debe a una deficiencia de procolhgena N-proteinasa que causa la formaci6n de fibrillas de colagena anormalmente delgadas e irregulares, que se manifiesta en notable hiperrnovilidad articular y piel blanca. Por otro lado, el síndrome de AIpori se refiere a varios trastornos genéticos (autosómicos y ligados a X) que afectan la estructura de las fibras de colagena tipo IV, la principal colágena que se encuentra en las membranas basales de los glornérulos renales (vease después la explicación sobre laminina). Se han demostrado mutaciones en diversos genes que codifican las fibras de colhgena tipo IV. El signo de presentaci6n es la hematuria, y los pacientes pueden al final desarrollar enfermedad renal terminal. La microscopia electrónica pone de manifiesto las anomalidades tipicas de la estructura de la membrana basal y de la lfrrnina densa. En la epidenn6lisic buIoca, la piel se rompe y ampolla con el más leve traumatismo. La variedad distrofjca se debe a mutaciones en COL7A 1 que afecta la estructura de la cotagena tipo VlI, el cual forma fibrillas delicadas que anclan la lámina basal a las fibras de colhgena en la d e m i s . En esta enfermedad se observa que d i c h a fibrillas disminuyen considerablemente, lo cual probablemente produce las ampollas. La epidermóIisis bulosa simple, otra variedad, se debe a mutaciones en la queratina 5 (capitulo 58). EE escorbuto afecta la estructura de la colhgena. Sin embargo, esto se debe a una deficiencia de ácido asc6rbíco (capitulo 52) y no es una enfermedad genktica. Sus signos principales son las encías sangrantes, hemorragias subcutáneas y curacihn deficiente de las heridas. Estos signos reflejan deterioro de la siatesis de colágena por actividad anormal de prolil y licil hidrolasas, que requieren ácido ascorbico como cofactor.
LA ELASTENA PROPORCIONA EXTENSIBILIDAD Y RETROCESO A LOS PULMONES, VASOS SANGU~NEOSY LIGAMENTOS
en la piel, el cartílago de la oreja y otros tejidos. Al contrario de la colagena, al parecer s61o hay un tipo genetico de elastina, aunque surgen variantes por procesamiento diferencial del hnRNA para esta proteína (capítulo 39). La elastina se sintetiza como un monhmcro soluble de 70 kDa, llamado tropoelastina. Alguna de las prolinas de este mon6mero se hidroxilan hasta hid roxiprolina por la acción de la prolihidroxilasa, aunque no contiene hidroxilisina ni hidroxilisina glucosilasa. Al contrario de la colagena, la tropoelastina no se sintetiza en forma "pro" con pkptidos de extension. Además, la elastina no contiene secuencias Gli-X-Y repetidas, estructura de hélice triple ni fragmentos de carbohidratos. Despuks de ser secretados de la ctlula, ciertos residuos Iisilo de la tropoelastina se desarninan por la vía oxidativa hasta aldehidos por la acción de la licil oxidaca, la misma enzima que efectiia este proceso en lacolagena. No obstante, los principales enlaces cruzados en la elastina son los desmasines, formados por la condensaci0n de tres de estos aldehidos derivados de lisinac con una lisina no modificada para crear un enlace cruzado tetrafüncional unico para elastina. Una vez que se encuentra con su enlace cruzado, en sii forma madura extracelular, la elastína es sumamente insoluble y en extremo estable, con un índice muy lento de recambio. La etastina exhibe diversas conformaciones enrolladas a1 azar que permiten a Ia proteína tensarse y retroceder a continuación durante la ejecucibn de sus funciones fisiológicas. El cuadro 57-5 resume las diferencias principales entre colagena y elastina.
57-5, Diferencias 1 colágena y elas .........
A
A
Col4ge- ,na
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1 Muchoi t ipos gc. Un tipo gel
néticos difFrentes 2. Triple h k l i ~ ~
5.
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Sin htlice L J ~ L Luiii~rmación L. de enrollaniientos dedtcirios que permiierI estiramiento (tensibn) . sin estructura (GIL-X-Y), reh .
petida Sin hidroxiilisina !J . .
.
IUTAIO
La elastina es la proteína del tejido conjuntiva causante de las propiedades de extensibilidad y retroceso elbtico de los tejidos. Aunque no tan extendida como la colágena, la elastina existe en grandes cantidades, sobre todo en tejidos que requieren estas propiedades fisicas, por ejemplo, pulmon, los vasos sanguineos arteriales grandes y algunos ligamentos elásticos. Cantidades menores de elastina tambikn se e n c u e n m
hidrato
Enlaces cr uzados de desmosinas intramoleculares lcciilarcs Presencia
i s de cxtcn:
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788 Oioquímicu de Harper
Se han encontrado deleciones en el gen de la elastina (localizado en 7ql1.23) en cerca de 90% de los sujetos con sindrome de Williams, un trastorno del desarrollo que afecta el tejido conjuntivo y el sistema nervioso central. Al afectar Ea síntesis de elastina, es probable que las mutaciones desempeñen alguna funci6n causal en la estenosis aortica supravalvular que se encuentra con frecuencia en esta enfermedad. Algunas enfermedades cutáneas (por ejemplo, esclerodemia) se relacionan con la acumulaciOn de elastina. En tractornos como enfisema pulmonar, cutis laxo y envejecimiento de la piel se ha encontrado fragmentación o, de manera alterna. una reduccihn de elastina.
EL SÍNDROME DE MARFAN SE DEBE A MUTACIONES EN EL GEN PARA FIBRILLINA, PROTE~NA PRESENTE EN LAS MlCROFlBRlLLAS El sindrome de Marfan es una enfermedad hereditaria, relativamente frecuente, causada por alteracidn del tejido conjuntivo; se hereda como un rasgo dominante autodmico. Afecta a los ojos (por ejemplo, causa una dislocaci~ndel cristalino, conocida como ectopia lentis), al sistema esqueletico (la mayosia de los pacientes son altos y muestran dedos largos [aracnodactilia] e hiperextensibilidad de articulaciones) y al sistema cardiovascular (por ejemplo, debilidad de la media aórtica, que conduce a dilatacion de la aorta asccndente). Abraham Lincoln pudo haher padecido este trastorno. La mayor parte de los casos son causados por mutaciones en el gen (del cromosoma 15) para fibrillina; en varios pacientes con sindrome de Marfan se han detectado mutaciones sin sentido. La fibrillina es una glucoproteina grande (aproximadamente 350 kDa),componente estructural de las microfibrillas, que son fibras de 10 a 12 nrn que se encuentran en numerosos tejidos. La fibrillina es secretada (despds de desdoblamiento proteolitico) a la matriz extracelular por fibroblastos para ser incorporada a microfibrillas insolubles, lo cual al parecer proporciona un soporte para el dep6sito de elastina. La distribución tisular de fibriIlina puede estudiarse por mCtodos inmunohistoquimicos. De importancia especial para el sindrome de Marfan, es que la fibrillina se encuentra en las fibras zonulares de los cristalínos, el periosteo y unida a fibras de elastina en la aorta (y en otras partes); estas ubicaciones justifican respectivamente la ectopia lentic, la aracnodactilia y los problema vasculares observados en el síndrome de Marfan. Las microfibrillas contienen además otras proteínas y es probable que las anormalidades de éstas causen tambikn trastornos del tejido conjuntivo. En el
(Capitulo j7)
cromosoma 5 existe otro gen para fibrillina, cuyas mutaciones se relacionan con la causa de la aracnodactilia contractual congénita, pero no con el sindrome de Marfan. En la figiira 57-2 se resume la secuencia probable de succsos que conducen al síndrome de Marfan .
LA FIBRONECTFNA ES UNA GLUCOPROTE~NAIMPORTANTE QUE INTERVIENE EN LA ADHESIÓN Y M~GRACIÓNCELULAR La fibronectina es una glucoproteina abundante en la matriz extracelular, que se encuentra también en forma solubEe en el plasma. Consiste en dos subunidades identicas, cada una aproximadamente 230 kDa, unidas por dos puentes disulfuro prbximoc a su terminal carboxilo. El gen que codifica la fibronectina es inuy grande, pues contiene alrededor de 50 exones; el RNA producido por su transcripcidn esth sujeto a numerosos empalmes alternos y en varios tejidos se han identificado hasta 20 RNA diferentes. La fibmnectina contiene tres tipos de "motivos" repetidos (1, 11 y III), que se organizan en dominios fiincionales (por lo menos siete) cuyasactividades incluyen fijacibn de heparina (véase después), fibrina, colagena, DNA y superficies celulares (figura 57-3). Ya se conoce la secuencia de aminoácidos del receptor para fibronectina y es un miembro de la clase de proteínas integrina transmembrana (caplmlo 60). Las integrinas son heterodimeros que contienen varios tipos de cadenas polipeptidicas alfa y beta. La fibronectina posee una secuencia ArgGli-Asp (RGD)que es el sitio de unión con el receptor. La secuencia RGD es compartida por varias otras proteinas de ta matriz extracelular que se unen a intcgrinas constituyenzes de superficies celulares. Los peptidos sintbticos que contiene la secuencia RGD inhiben la
Mutaciones en el gen (del mornosoma 15) para fibrillina, una glucopmteinagrande presente en rnrcmfibrillas relacionadas con elastina
L Anormalidades en la estructura de fibrillina
L Se afectan las estructuras del ligamento suspencor del ojo, el periosteo y las medias de la aorta
1 Ectopia lentis. aracnodactilia y dilatacion de la aorta ascendente
Figura 57-2. Secuencia probable de sucesos en la causalidad de los signos principales mostrados por pacientes con el sindrome de Marfan
Figura 5 7 3 . 'Representacibn esquem8tica de la fibronectina. Están representados los siete dominios funcionales de la proteína, se muestran dos tipos diferentes de dominio para heparina, fijación a las dlulas y fibrina Los dominios estáln compuestos de varias combinaciones de tres motivos estructurales (1, tl y III) que no se dibujaron en la figura. Tampoco se observa el hecho de que la fibronectina es un dimero unido por puentes disulfuro próximos a las terminales carboxilo de los monbmeros. La ubicacibn aproximada de la secuencia RGD de la fibronectina, que interactuan con diversas receptores de integrina para esa proteína en la superficies celulares, esta indicada por la flecha. (Redibujada después del estudio de Yamada KM,Adhesive remgnttion sequences. J Biol Chem 1991,266.12809.)
fijación de fibronectina a las células. La figura 5 7 4 muestra la interacción de colágena, fibronectina y laminina, todas proteinas principales de la matriz extracelular, con una célula tipica (por ejemplo, fibroblastoj presente en la matriz. El receptor de fibronectina interactúa de manera indirecta con microfilamentos de actina (capitulo 58) existentes en el citosol (figura 57-51, Ciertas protelnas, conocidas de modo colectivo como proteinas de adherencia, intervienen en el proceso. Incluyen a la talina, vincutina, una proteina de remate del filamento de actina y alfa actintna. La talina interactúa con el rcceptor y con la vinculina, en tanto que las dos Uttimas se conectan con la actina. La interaccibn de la fibronectina con su receptor proporciona una vía de comunicaci6n entre el exterior de la cdlula interior, para modificar su comportamiento. Mediante la interaccibn con su receptor celular, la fibronectina desempefiauna funcion importante en la adhesíon de las celulas a la matriz extracelular. TambiCn interviene en la migración celular, ya que proporciona un sitio de fijación para
las cklulas lo que las ayuda a orientar su camino a travks de la matriz. En numerosas células transformadas, la cantidad de fibronectina que las rodea está notablemente reducida, lo cual explica en parte su interaccilrn deficiente con la matriz extracelular (capitula 62).
/
/
EXTERIOR
INTERIOR
Figura 5 7 4 . Representacibn esquem8tica de una célula que interactúa a través de varios receptores integrinas con coldgena, fibronectina y Faminina presentes en la matriz extracelular. (Las cubunidades especificas no se indican). (Dibujada de nueva después del estudio de Yamada K M Adhesive reqnition sequences J Biol Chem 1991,266 12809.)
Figura 57-5. Representación esquernatica de fibronectina interactuandocon un receptor de integrina para esa proteína, situado en el exterior de la membrana plasmática de una célula de la matriz y de varias proteinas de adherencia que se conectan de manera indirecta o directa con un microfilamento de actina en el citosol Por simplicidad, las proteinas de adherencia estan representadas como un complejo.
(Capítulo 57)
LA LAMININA ES UN COMPONENTE PROTElNlCO PRINCIPAL DE LA LÁMINA GLOMERULAR RENAL Y DE OTRAS LÁMINAS BASALES Las laminas basales son áreas especializadas de la matriz extracelular que rodean a las cClulas epiteliales y a algunas otras (corno a las células musculares): aquí se estudiará so10 la lámina que se encuentra en el glomérulo renal. En esta estructura, la lamina basal está complementada por dos capas separadas de células (una endotelial y otra epitelial), cada una dispuesta en lados opuestos de la l h i n a ; las tres capas constituyen la membrana glomerular. Las componentes primarios de la Ihrnina hasal son tres proteinas: laminina, entactina y colhgena tipo IV así como los GAG heparina o sulfato de heparán. Estos componentes son sintetizados por las células subyacentes. La laminina (alrededor dc 850 kDa, 70 nm de longitud) consiste en tres distintas cadenas polipeptidicas largas (A, Bi y BZ)reunidas en una estructura cmciforme alargada. Tiene sitios de fijación para colágena tipo IV, heparina c integrinas de la superficie celular. La coliigena interachia con la laminina (en lugar de hacerlo de manera directa con la superficie celular), que a su vez se conecta con integrinas o con otras proteínas receptoras de laminina, anclando asi Ea lamina a las células. La entactina, conocida tambien como "nide geno", es una glucoproteina que contiene una secuencia RGD; se une a la laminina y es un factor celular principal de adherencia. La lamina basal relativamente gruesa del glomérulo renal tiene una funci6n importante en la filtración glomerular, ya que regula e[ paso de moléculas grandes (proteinas ptasmáticas la mayor parte) a través del glomerulo hacia el njbulo renal. La membrana glomerular permite a las moléculas pequefias, como la inulina (5.2 kDa), pasar a travt's de ella con tanta facilidad como el agua. Por otraparte, sOlo una cantidad pequefia de albumina (69 kDa), la proteina plasmhtica más abundante, pasa a través del glomérulo noma!. La explicación se encuentra en dos circunstancias: 1) Los poros en la membrana glomerular son lo bastante grandes para dejar pasar rnoleculas hasta de alrededor de 8 nm. 2) Aunque la albumina tiene un diámetro menor que los poros, no pasa con facilidad debido a lar cargas negativas del sulfato de heparán y de ciertas glucoproteinas que contienen ácido sihlico, presentes en la l h i n a . Estas cargas negativas repelen a la albumina y a gran parte de las proteínas plasmhticas, las cuales poseen carga negativa al pH sanguineo. En ciertos tipos de glomerulonefritis (por ejemplo, la causada por anticuerpos dirigidos contra varios componentes de la membrana glomerular), la estructura normal del glom&rulopuede sufrir daiío grave. Esto altera los poros y el número y disposicion
de las macromoléculas con carga negativa mencionadas antes por lo que cantidades relativamente masivas de albúmina (y de ciertas otras proteinas plasmáticas) pueden pasar a la orina, conduciendo a albuminuria grave.
LOS PROTEOGLUCANOS Y LOS GPUCOSAMINOGLUCAWS
Los glucosaminoglucanos encontrados en los proteoglucanos están formados de disacaridos repetidos Los proteoglucanos son proteinas que contienen glucosaminoglucanos unidos de manera covalente. Se sabe las caracteristicas de algunos de ellos y se les han dado nombres como sindecano, betaglucano, serglucina, perlecano, agrecano, versicano, decorina, biglucano y fibrornodulina. Varían en su distribucihn en los teiidos, en la naturaleza de la psoteina centra[, en los glucosaminoglucanos adheridos y en su función. Las proteinas que se unen también por covalencia a GAG se llaman proteínas basales: han sido difíciles de aislar y caracteri~ar,pero el uso de la tecnologia del DNA recombinante esta comenzando a proporcionar información importante acercade sus estructuras. En general, la cantidad de carbohidratos en un proteoglucano es mucho mayor que en una glucoproteina y puede constituir hasta 95% dc su peso. En las figuras 5 7 4 y 57-7 se muestra la estructura general de un proteoglucano en particular. el agrecano, que es el tipo principal que se encuentra en el cartílago. Es muy grande (cerca de 2 x 1 O' kQa), y su estructura global semeja a un escobillón. Contiene una larga cadena de hcida hialurbnico (un tipo de GAG) al cual se adhieren protelnas con enlace n o covalente. A su vez, estas interactúan de manera no covalente con las moléculas de la proteína central desde donde se proyectan cadenas de otros GAG (en esre caso sulfato de quemtán y sulfato de controitina). Posteriormente, cuando se presenta el cartílago, se proporcionan más detalies sobre esta macromolecula. Hay siete ~lucosaminoglucanos(GAG} por lo menos: ácido hialurbnico, suIfñto de condroitina, sulfatos de queratán 1 y 11, heparína, sulfato de heparhn y sulfato de dermathn. Un GAG es un polisacárido no ramificado formado de unidades de disachridos repetidas, un componente que siempre esta es un amino azúcar (de aqui el nombre GAG), sea D-glucosarnina o ~ ~ a l a c t o s & i n aOtro . componente dis&áricto repetido (excepto en el caso del sulfato de queratan) es un ácido urónico, sea hcido 1.-glucor6nico (GlcUA) o su 5-epimero, ácido L-idurdnico (1dUA). Excepto el acido hialurbnico, todos los GAG contienen g h p o s sulfato, como O-6s~ereso como N-sulfato (en heparina y sulfato de heparán). Al acido hialurónico se le
Acido hialurónico Prntelna de enlace
-Sulfato de queratán -Sulfato de
mndroitina
Proteina central
Subunidades
Figura 57-7. Representación esqvem8tica del proteoglucano agrecano (Reproducida con autorización de Lennarz WJ The Biochemistry of Glymproterns and Proteoglycans Plenurn Press. 1980 ) Figura 57-6. Micrografía electrbnica en campo oscuro de un agregado de proteoglucano de tamafio mediano, e n el cual las subunidades de proteoglucanoy el esqueleto filamentoso ectan particularmente bien extendidos. (Reproducida con autorizaudn de Rosenberg L, Hellman W, Kleinschmidt AK: Electron microscopic studies of proteoglycan aggregates from bavine articular cartilage. J Biol Chem 1975;250:1877.)
atribuye otra excepción, ya que no se sabe con certeza si se une por covalencia a la proteina, coma especifica la definición dada antes respecto a un proteoglucano. En el pasado, los GAG y los proteoglucanos demostraron ser difíciles de investigar, en parte debido a su complejidad. Sin embargo, son los componentes principales de la sustancia basal, tienen varias funciones bioliigicas importantes e intervienen cn cierto número de procesos patolbgicoc, por lo que el intcrks en eltos ha ido en aumento.
La biosintesis de glucosaminoglucanos comprende la adherencia a las proteínas centrales o basalec, alargamiento de la cadena y su terminación
A. Adherencia a las proteínas basales E! enlace entre GAG y sus proteínas basales pertenece, en general, a 1 de 3 tipos:
1) Un enlace U-glucosidico entre xilosa (Xil) y Ser, enlace que es único para proteoglucanos. Esta unión se forma por transferencia de un residuo Xil a Ser, procedente de UBP-xilosa. Luego se agregan dos residuos Cal para formar un enlace trisacárido, Gal-Gal-Xil-Ser. El crecimiento ulterior del GAG se produce en la terminal Cal. 2) Entre GalNAc y Ser (Tre) se forma un enlace O-glucosidico (figura 56-1 [A]), presente en el sulfato de quemt6n II. Este enlace se forma por la donación de un residuo GalNAc a Ser (o Trc), usando UDP-GalNAc como donador. 3) Un enlace N-glucosilamina entre GalNAc N-acetilglucosamina y el nitrbgcrio amídico de Asn, como se encuentra en las glucoproteinas con enlaces N (figura 56-IR). Se cree que su síntesis emplea
dolicol-P-P-oligosachido. La síntesis de las proteínas basales tiene lugar en el reticulo endoplhsmico, donde también se forman por lo menos algunos de los enlaces anteriores. La mayor parte de las Ultimas etapas en la biosíntesis de cadenas de GAG y las modificaciones subsiguientes se producen en el aparato de Golgí.
B. Alargamiento de la cadena
enzimas localizadas en el aparato de Golgi. son muy especificas, por lo que son otras distintas las que catalizan la sulfatacibn en posiciones diferentes (por ejemplo, carbono 2,3,4 y 6 )en los azúcares aceptores. Una epimerasa cataliza las conversiones de gIucuronilo a residuos iduronilo.
Para sinicrizar cadenas oligosacáridas de GAG se utilizan azúcares de nuclehtidos apropiados y glucosiltransferasas muy especificas localizadas en el aparato de Goigi. Al parecer aqui se sostiene la relacion "una enzima, un enlace", como en el caso de ciertos tipos de uniones encontradas en giucoproteinas. Los sistemas enzimaticos que intervienen en el alargamiento de la cadena tienen la propiedad de reproducir con alta fidelidad los complejos GAG.
Los glucosaminoglucanos muestran diferencias sutiles en estructura y tienen distribuciones típicas
C. Terminación de la cadena
Los siete GAG mencionados antes difieren entre si en algunas de las siguientes propiedades: composici6n del aminoazúcar, composicion del ácido urbnico, enlaces entre estos componentes, longitud de la cadena de disacaridos, presencia o ausencia de grupos suifato y sus posiciones de unión a componentes carbohidms, naturaleza de las proteínas basales a las que están adheridas, naturaleza del enlace a proteinas basales, su distribución tisular y subcelular y sus funciones biolbgicas. Por ahora, se estudiarán brevemente las estructuras (figura 57-8) y las distribuciones de cada uno de los GAG. Las caracteristicas principales de estos siete GAG se resumen en el cuadro 5 7 4 .
Se considera que esta se debe a: 1) sulfatación, en particular en ciertas posiciones de azúcares y 2) el progreso de la cadena creciente GAG lejos del sitio de la membrana donde la acción catalitica se produce.
D. Modificaciones ulteriores Después de la fomacion de la cadena de GAG, tienen lupar numerosas modificaciones quimicas, como la introduccibn de grupos sulfato en Eas fi-accionesGalNAc y la epimerizaci6n de GlcUA hasta IdUA. Las enzimas que catalizan la sulfatacibn se designan sulfotransf e r asas y usan 3'-fosfoadenosina-5'-fosfocutfato (PAPS, sulfato activo) como donador de sulfato. Estas Acido hialurbnico
01 4
Sulfatos de
GICUA
81 3
-
81,4
81 3
GlcNAc -GlcUA
B1,4
GlcNAc 4
-
81,s 61.3 GlcUA -,GalNAc ~ G I C U A Gal 81.3 Gal +
condroitina,
1
- 81,4
I
Xyl
Ser
4- o 6-sulfato
Sulfatos de queraMn
B
GICNAC
2
GIcNAC -
,u?"
Asn (svlfatode querathn 1)
'
al ZGICNA~ -.Gal:-, $1.3
I
1
' f
~ . ~ ~ l f +j.sulrato ~ t ~
-'.
' G ~ I N A CTre(Ser)(sulfato ~ de querathn II)
I Gel-NeuAc
Sutfato de heparina y de heparán.
6-sutfato
so>-
2-sulfato Sulfato de dermatan
el +
01 3
IdUA --.GalNAc
I
1
AC
bl.4
81.3
GlclJA-
01~4
81 3
GalNAc .GlcUA -' Gal
81,9
81 4
Gal+
xylL
Ser
Figura 57-8. Resumen de estructuras de proteoglucanosy gluoosaminoglucanos (GlcUA, ficido o-glucurbnico, tdUA, Bcido L-idurónico, GlcN, o-gluwsamina, GalN, o-galactosamina, Ac, acetil; Gal, ngaladosa; Xil, o-x~losa;Ser, L-serina; Tre, L-treonina;Asn, L-asparagina;Man, o-manosa, NeuAc, Acido N-acetilneuramínico.)Las estructuras resumidas son únicamente representauones cualitativas y no reflejan, por ejemplo, la composición de! ácido uronico de híbridos, tales m m o los sulfatos de heparina y de dermatan, los cuales contienen tanto al audo L-iduronicocomo el ~glucurónico.Tampoco deberá asumir* que los sustituyentes indrcados siempre se encuentran presentes, por ejemplo, en tanto que la mayor parte de los residuos de Sicido idurbnico de la heparina acarrean un grupo sulfato-2, una proporcibn mfis pequeña de estos residuos est8 sulfatada en el sulfato de dermathn. Se muestra la presencia de enlaces trisacAridos (Gal-Gal-XiI) en los sulfatos de condroitina, de heparina, heparan y dermatdn. (Ligeramente modificada y reproducida con autorización de Lenan WJ The Brochemistry of Glicoprofeinsand Profeoglycans Plenum Press, 1980.)
1
Cuadro 576. Gobiedades principales de las glucosamino .-- .-. . -. .-.--. --
--
----. f -
res
.
.A
...
Ubicaciibn
nlace a pri A
-
A
-
Sin cvich c i a firrr
;IcUA Ni
,
Liquido sinovial. krumor vitre . . . , conjuntivis laxa o. hueso! c4mea S
HCparlna Sulfato de heparfin
i
GlcNAc, ( GlcNAc, ( GlcN, IdL
por medio de proteln as de enlac ; unido coxi HA
GaINac, C '
CN
Cdmea
GlcNAsc-Asn GalNR,c-Tre Ser
Tejido conjuntivo lavo Cellila~cebadas
JA
GlcN, Glc
. . Fihrobli eos. pared de la aor ici6n ampl
Xil-Ser
cN
Sulfato de
Xil-Scr :stá unido a varias posiciones en el a
A. Ácido hialurónico
ción 6' de GicNAc o en ocasiones de Cal. E! tipo 1 abunda en la córnea y el tipo II se encuentra junto con sulfazo de condroitina adherido al acido hialuránico en tejido conjuntivo laxo. Los tipos 1 y II tienen enlaces diferentes a proteínas (figura 57-8).
Este compuesto consiste en una cadena no ramificada de unidades disacarido repetidas que cantienen GlcUA y GlcNAc. El ficido hialurónico existe en las bacterias y se distribuye en forma extensa entre varios animales y tejidos, incluyendo líquido sinovial, humor vítreo del ojo, cartílago y tejido conjuntivo laxo.
D. Heparina El disacárido repetido contiene glucosamina (GlcN) y uno de los dos ácidos urónicos (figura 57-9). La mayor parte de los grupos arnino de residuos GlcN son N-sulfatados, pero unos cuantos estin acetilados. Tambien GlcN porta un ester sulfato Ca. Alrededor de 90% de tos residuos de iicido uronico son 1dUA. En un principio, todos los ácidos urónicos son GlcUA, pero una 5'-epimerasa convierte más o menos 90% de residuos a IdUA después que la cadena de polisaclrido se ha formado. La molécula proteinica del proteoglucano heparina es única ya que consiste de manera exclusiva de residuos de serina y glicina. Alrededor de dos tercios de residuos de serina tienen adheridas cadenas GAG, en general de 5 a 1 5 kDa, aunque en ocasiones son mucho mas grandes. La heparina se encuentra en gránulos en las ctlulas cebadas y también en hígado, pulm6n y piel.
B. Sulfato de condroitina (condmiñ'&hto y condroifin-&sulfato) Los proteoglucanos unidos a sulfato de condroitina por el enlace Xil-Ser-O-glucosidico son componentes muy conspicuos del cartflago (vease después). El disa&do repetido es análogo al encontrado en el ácido hialurtinico, que contiene GlcUA pero con GalNAc en lugar de GlcNAc. La GalNAc tiene sulfatos sustituidos en posicibn 4 3 6', habiendo un radical sulfato por cada unidad de disacarido, aproximadamente.
C. Sulfatos de queratán 1 y 11 Como se muestra en la figura 57-8 los sulfatos de queratán consisten en unidades disacáridas repetidas Gal-GlcNAc que contienen sulfato adherido a la posi-
C%m%
CH,090;
CM#-
4 ~ o ~ ~ o & p ~ HNSO;
OSO,
HMSO;
OH
OH
twhc
HHWi
GlcH
ldUA
GlcN
ldUA
GlcN
GkUA
GtcNAc
Figura 57-9. Estructura de la heparina. La seccidn del polímero muestra las características estructurales tipicas de la heparina, sin embargo, las secuencias de unidades repetidasdedisac8ridos diversamente sustituidos han sido seleccionadas de manera arbitraria. AdernBs, tambibn pueden existir residuos de glucosamina que no sean O-sulfatados o que estCn 3-Osulfatados. (Modificada, redibulada y reproducida con autonzacibn de Linhahl U et al : Strueture and biocynthecis of haparin-like polysaccharidec. Fed Proc 19?7,36:19.)
(Capitulo 5 7)
794 Bioguimica de Hurper
sintetizadas y degradadas. En tejidos adultos. GAG en general exhiben un recambio relativamente lento, siendo sus vidas medias del orden de días a semanas. La comprensiiin de las vías degradativas de los GAG, como las de las glucoproteinas (capíturo 56) y los glucoesfingol ípidos (capítulo 26) ha aumentado de manera considerable con los descubrimientos de deficiencias enzimáticas especificas de mores congdnitos del metabolismo. Cuando los GAG están implicados, tales errores innatos se denominan mucopolisacaridosis (cuadro 57-7). La degradación de los GAG se lleva al cabo por una batería de hidrolasas lisosómicas que incluyen ciertas glucosidasas, varias exoglucosidasas y sulfatasas, las cuales actúan en secuencia para degradar varios. En el cuadro 57-7 se muestran algunas de ellas. Como se muestra en la figura 57-1 0, las mucopolisacaridosis comparten un mecanismo causal, pues se heredan de manera autosómica recesiva; la de Hurler y los síndromes de Hunter tal vez son las que se han estudiado con mayor cuidado. Ninguna es frecuente. En algunos casos se obtiene una historia familiar de mucopolisacaridosis. Las investigaciones de lahoratorio especificas que ayudan en su diagnbstica con: el análisis de orina, para detectar la presencia de cantidades aumentadas de GAG y el anfilisis de las enzimas
E, Sulfato de h e p a r ~ n Esta molécula existe en numerosas superficies celulares como un proteog!ucano y es extracelular. Contiene GlcN con menos N-sulfatos que la heparina y, al contrario de &a, el ácido urónico predominante es GlcUA.
F. Sulfafo de dermatán Se distribuye con amplitud en tejidos animales. Su estructura es semejante a sutfatos de condroitina, excepto en que en lugar de un GlcUA en enlace beta- 1,3 a GalNAc, contiene un IdUA en enlace alfa-1,3 a GalNAc. La formacíbn de IdUA se produce de la misma manera que en heparina y sulfato de heparan por 5'-epimerizacibn de GlcUA. Debido a que este proceso se regula por el grado de sulfatñcibn y ésta es incompleta, el sulfato de dermatan contiene los dos disachridos, IdUA-GalNAc y GlcUA-GalN Ac.
Las deficiencias de enzimas que degradan a los glucosaminoglucanos producen mucopolisacaridosis Tanto las exoglucosidasas como las endoglucosidasas degradan GAG: Igual que muchas de las demhs biomoléculas, GAG están sujetos arecambio y por tanto, son
Cuadre 57-7. D6feZfos bioqulmicos y pruebas--¿liapnósticns en las rnucnpoliSacaridosisy rnucoEipidosis* --. ...
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%lucopolisi ITH 0
E: ' MI'S
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SanfiIippo 1 Sanfitippo C Morquio A Morquio R Maroteatix-Lamy
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1
SuIfato de dermatfm, suIidto de kparám
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I Sulf~ao h clmatán, su
fatasa (sulfamidasa)
a-h-Acct~igiumsaminidasa
;;dxz' ' Aciitiltran!
MPS V I
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4 - ~ 1 ~ 1 f ~t,iii o a t-n
Sirlfalo de heparin Sulfato de heparan Sulfato de hepar611 SulCaio de queratán, C Sulfato de queratán S"ht0 de dermatán
ufm
: dermatán, sulfato dc hc-
MPS
4 y C6-$04
MUCOIIpIUOIS
Sialidosis
I
Enfermedai
-roiiaismiria .. .. ,-
! MI,
F
Slalidasa (neuraminidasa) I-mgmctitosde glucop 1s de glucop UDP .V-acctilglucosamina:gIticop~telnaF i h:.acetilglucosarnin1di1fosfotransfcrasa (hidrolasas ácidas que carecen del residuo fosfomanosilnj Similar a M L 11, pero la deficie Fragmenius de gIucoproteinas ,
!
seudo1 Iurler , completa --L ---* Modincado y reprodiicidii con Butorizacibn de DiNatale P. Neufel d EF: The hiochemicaI diagnosis of mucopolysnccharidoses, h,, inrin xnirnlrnn n i .7 i, rn InherrtedMerab,,., ,JL,, ,, i r,,,. , C1. . a B y colaboradores(editores).Ediciones m~colipidosi~ and relaicu '4:**-.40*~ U13VI UIil , . C.,.,.,DcrJFcti~,es Ermes (Milb}, 1979. Nota: Ya nlD se condmitina MPS, mucopolicacarii utiliza en tkrrninos MF A- M----: : Se pueden utilizar fibrnniastos, icucociros, rejiaos, ceiuias aei iiquiao amnioucu. u sueru para ei anaiisis ur iriucrim uc i d s cnrimas anteriores Lo5 pacientes con estos trastornos muestran diversos datos clinicos que pueden incluir: opacidad comeal. retardo mental, rigidez nrticular, anormal idades cardiaciis. hepatosplenomegalia y estatura corta, segdn la enfermedad especifica y su gravcdad hh.4
in
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Mutacionesen la codificacióngenica de una hidrolasa tisosómica implicada en la degradacion de uno o más GAG
.1 Hidrolasa lisosomica defectuosa
4 Acumulacion de sustrato en varios tejidos incluyendo hígado, bazo, hueso, piel y sistema nervioso central
Figura 57-10. Esquema simplificado de causas de una mucopolisacaridosis tal como el cindrome de Hurler, en el cual la enzima afectada es la a-L-iduronidasa. La acurnulación excesiva de GAG en los tejidos mencionados en la figura puede onginar respectivamente hepatomegalia, esplenomegalia, trastornos del creumiento, facie tosca y retardo mental
sospechosas en leucocitos, fibroblastos o, algunas veces. en el suero. En determinados casos se practica biopsia de tejido y, mediante electroforesis, determina el GAG acumulado. Cada vez se dispone de mBs pruebas con DNA. Asimismo, se puede efectuar un diagnóstico prenatal mediante células amnióticas o biposia de las vellosidades coriónicas. El ttrmino "mucolipidosis" se introdu-jo para denotar a las enfermedades que combinan caracteristicas tanto de las mucopolisacaridosis como de las esfingolipidosis (capitulo 26). En el cuadro 57-7 se enlistan tres mucolipidosis. En la cialidosis (mucolipidosis 1, ML- I), los tejidos pueden acumular diversos oligosackidos que derivan de glucoproteinas así como ciertos gangliósidos. La enfermedad de cClulas 1 (ML-11) y la polidistrofia seudoHurler (ML-111) se describen en el capitulo 56. El término "mucolipidosis" se conserva ya que todaviaes de amplio uso en lacllnica, pero no es apropiado para las dos últimas enfermedades puesto que su mecanismo causal implica localización inadecuada de ciertas enzimas lisosbmicas. En el capitulo 56 se describen también los defectos genbticos del catítbolismo de las cadenas de oligosachridos (por ejemplo, manosidosis y fucosidosis). La mayor parte de ellos se caracterizan por el aumento en la excreción urinaria de varios fragmentos de glucoproteinas, los cuales se acumulan a consecuencia del bloqueo metabolico, como en el caso de las mucolipidosis. La hialuronidasa es una enzima importante que participa en el catabolisrno de ciertos GAG, pero que no esta implicada en ninguna mucopolisacaridosis. Es una endoglucosidasa de dictribuci6n muy amplia que rompe lo enlaces hexosaminidicos. A partir de! Qcido hialurbnico, la enzima genera un tetrasachrido con la estructura (GluA-beta- l,3-GlcNAc-beta- l,4)2. La hialuronidasa actúa tanto en el acido hialurbnico corno en e3 sulfato de condroitina. El tetrasachrido descrito antes puede degradarse despues por la accibn de una beta glucuronidasa y de una beta N-acetilhexosaminidasa,
Los proteoglucanos tienen numerosas funciones Como SE indicó, los proteoglucanos son moléculas notablemente complejas que se encuentran en todos los tejidos del cuerpo, con predominio en la matriz extracelular o "'sustancia basa]". Se enlazan unas con otras y también con otros componentes esmeturales mayores de la matriz, la colhpena y la elastina, de manera bastante especificas. Algunos proteoglucanos se enlazan la colagena y otros a elastina. Estas interacciones tienen importancia en la determinación del ordenamiento estructural de la matriz. Además, algunos de ellos interactiian con ciertas protclnas adhesivas, como la fibronectina y la larninina (véase después) que tarnbikn se encuentran en la matriz. Los glucosarninaglucanos (GAG) presentes en los proteoglucanos son polianiones por lo cual se unen a policationes y cationes como Na- y K'. Esta ultima propiedad atrae agua por presihn osmótica a la matriz extracelular y contribuye a su turgencia. Además, los GAG se convierten en gel a concentraciones relativas bajas. Debido a la estructura extendida de las cadenas polisacaridas y a su propiedad de convertirse en gel, los proteoglucanos pueden servir como filtros, restringiendo el paso de macromoléculas grandes a la matriz extracelular, pero permitiendo la difusihn relativamente libre de moléculas pequefías. De nuevo. por sus estructuras extendidas y los gigantescos agregados macromoleculares que a menudo forman, ocupan un volumen muy grande de la matriz en relaciiin a las proteínas.
A. AIgunas funciones de los proteoglucanos y GAG específicos Los tejidos embrionicos son en particular ricos en ácidos hialurbnico y se considera que este tiene una funci6n importante en permitir la migración celular durante la morfogénesis y reparacihn de heridas. Su capacidad para atraer agua hacia la matriz extracelular y asl "aflojarla" puede ser importante en este respecto. Por otro lado, las concentraciones altas de acido hialurónico y sulfatos de condroitina presentes en el cartílago contribuyen a su comprensibilidad (véase después). Los sulfatos de condroitina se local izan en sitios de calcificación en los huesos endocondriales y en el cartílago. Tarnbikn se encuentra en el interior de ciertas neurona5 y puede proporcionar una estructura endoesgueletica, ayudhndolas a mantener su forma. Tanto el sulfato de querathn 1 como el sulfato de dermathn son constituyentes de la córnea. Se ubican entre fibrillac de col8gena y desernpefian una función critica en la transparencia comeal. En las cicatrices corneales se observan cambios en la composición de proteoglucanos, que desaparecen cuando
(Capítulo j7)
la córnea sana. La ~resenciade sulfato de dennatin en la ecclerbtica puede intervenir tambidn para mantener la forma global del ojo. El sulfato de queratán 1tambien existe en el cartílago. La heparina es un anticoagulante importante. Se une con los factores TX y X1, pero su acci6n mas importante es sobre la antitrombina III plasmatica (capitulo 59). La fijaci6n 1:1 de heparina a esta prateina plasmática acelera de modo notable la propiedad de esta última para inactivar serina proteasas, en particular, trombina. AI parecer, la fijacidn de heparina a residuos de lisha en la antitrombina 111 induce un cambio de conformación en ésta, el cual favorece su enlace a las serina proteasas. Ademhs, la heparina puede unirse de manera especifica a una fipoproteina lipasa presente en las paredes de los capilares, causando la liberación de esta enzima a la clrculaci6n. Ciertos proteoglucanos (por ejemplo, sulfato de heparán) se unen a las membranas plasmáticas, con sus proteínas basales extendiendose realmente en el espesor de esa membrana. En ella pueden actuar corno receptores y tambikn participar en la actividad del crecimiento celular y en la comunicación celula-acélula. Laadherenciade células a su sustrato en el cultivo sedebe, por lo menos en parte, al sulfato de heparh. Este proteoglucano se encuentra también en la membrana basa1 del riflbn, junto con colkgena y la laminina tipo IV (véase antes}-donde lleva a cabo una función importante para determinar la selectividad de la carga eléctrica del filtrado glomenilar. Los proteoglucanos se encuentran también en ubicaciones intracelulares tales como el nílcleo; su funcibn en este organelo no se ha dilucidado. Además, se ha encontrado en algunos grhnulos de atmacenaje o secretores, como los granulos cromatinicos de la médula suprarrenal. Se ha postulado que intervienen en la liberación del contenido de esos gránulos. En el cuadro 57-8 se resumen varias funciones de los GAG.
B. Relaciones con enfermedades importantes y con el envejecimiento El ácido hialurónico puede ser importante para pemitira las ct5lulastumorales emigrar a través de la matriz extracelular. Es probable que las células tumorales induzcan a los fibroblastos a sintetizar cantidades masivas de este glucosaminoglucano, lo cual tal vez facilite su propia dicpersibn. Algunas d h l a s tumorales poseen menos sulfato de heparhn en sus superficies y es probable que a esto se deba la falta de adhesividad que los tumores muestran. La íntima de la pared arteria1 contiene hcido hialurbnico y sulfatos de condroitina, deirmatán y hepnrán. De estos proteoglucanos, el sulfato de dermatán se une a lipoproteinas plasmAticas de muy baja densidad. Además, es probable que ése sea el GAG
Cuadro 5 7 4Algunas funcion~delos glurosaminoglucanos, de los proteoglucanos o de amh***
--
-
olicationeS y catione S ai Contrfbuiyen a la tu rgencia tip ica de varii3s tcjidos 1i Actuw c:omo filtros en la rnat riz EC ., raciiiian ra migración celular (1 1A) * Intervienen en la ccimpresihiliidad del cartílago cuando soporia peso (HA, ies) Contribuye a la traiI spmencia :a (KS 1 y DS) Ii Tiene unia fiincibn Iestructural rbtica (135) UB Anticoag;iilante (heparina) ai Carnponentes de m.emfiranas iuedpn a r t i i : como receptores y participar en Ea adherencia ..-.-dr celular y las interaw :cClulas (pcir ejemplo, 1HS) 1i Determiina la select 3 carga elCc:frica en el f -10rntSrulo rlenal (HS)
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* ~breviaturas: HA. Acid KS 1. culfaito de querati
o;CS, sulfat1ci de condroii.ina, :ato de rlerm;a t h ; WS. su1fato
de heparhn.
que se sintetiza con mayor abundancia en las células del músculo liso arterial. Debido a que estas células proliferan en las lesiones ateroscler6ticas en las arterias, el sulfato de dermatán puede tener una hncion importante en el desarrollo de la placa aterosclerótica. En varios tipos de artritis, los proteoglucanos pueden actuar como autoantígenos, contribuyendo a la patologia de estos trastornos. La cantidad de sulfato de condroitina en el cartílago disminuye con la edad, en tanto que las cantidades de sulfato de queratan y hcido hialurónico aumentan. Estos cambios pueden contribuir al desarrollo de asteoastritis. Además, en personas mayores se observan variaciones en los valores de ciertos GAG de la piel las cuales explican en parte las modificaciones cutdeas características del envejecimiento.
EL HUESO fS UN TEJlDO CONJUNTlVO MINERALIZADO El hueso contiene tanto material orginico como inorghnico, La materia orghnica es, sobre todo, proteina. Las principales proteínas óseas se enumeran en el cuadro 57-9; la colágena tipo 1es la principal proteina, pues comprende 90 a 95% del material orgánico. También esiá presente la colágena tipo V en cantidades pequeñas, al igual que varias proteinas no colágena, algunas de las cuales son relativamente especificas del hueso. El componente inorgánico o mineral es principalmente hidroxiapatita cristalina (Calo[P04]6[0H]2),con sodio,
Matriz cxtrucelular 797
1
Cuadra 57-9. Principales protehas que se encuenthn.en eI hueso* -- - - .....--. - - -..- .. --. ---- .-
Protein
-
C:olhgenas ColágcneI tipo 1 L
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tipo 11
ProteCnas n
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I'roteina~i~in>iriari~as Pmteogli1cm0sf CS-PGi l (bipluca CS-PGi Il (decorii
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una Ir'! (1) menor
-
MLLLILI uc vni la> wzuiciria~tilasmaticas rntiene dos cadenas dm E GAG; se encuentra en otros rejiaos intiene una1 cadena de GAG; se t:ncuenhit ein otros tejidos
." ar. Especirica sea (osteonectina) Nc [ica de huehu. ina GIa 6sea) s y-carboxiglutamato (jue se unen con la hi droxiapatita. intiene res, ~ d u ade EspccIfica de hueso. !-..!,"' c h p c ~ ~ f i cde a hueso Glucosilada y fosioriiiiua I Y I1 Sialoproteina 6sea ~r pecífica de hueso. Fuertementc ,glucosidada y sulfatada sobre latirosina - CS-PT; -- - ; 111
ProteEna : Osteocali VJibiipVLLLL,14
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J-
Sc atribuyen varia< runt irotelnas no culkgena, incliisive fiinc iones en la 11iineralizaci6n, sin embargo, la maycir p&e toda1ila son especulaciones Se L,,,,,,,,, .,,,probable qule las proielnac no wlágena que no son especificas de hueso. desernpeilenalguna función -"-" -... -.!clave en la minerali7acibn. Tambitii- ~-..*Ah i a tv i ~sentes en el hueso aleunas u -u-a. -viutetnas. incluvendo una ~roteinarica cri tiruhiria de matriz k i d a CTMMP), alguiios facitores de crecirniento (poi wr naq que panicipan en la síntesis de Ir cjmplo. la lisil owidmnj. CS-PG, suirato-proteogliicano de crindroitina; k stos son sen go anos de sulfato de dermatan (DS-PC A A
'
57-12). ' {cuadro SPAKC,
protelna secretada Acida y
A
.
&:LL
rica en clstelna
rnagnesio, carbonato y flúor; cerca de 99% del calcio corporal se encuentra en et hueso (capítulo 47). La hidroxiapatita confiere al hueso la fuerza y resistencia requeridas por sus funciones fisiolbgicas. El hueso es una esmm dinimica que experimenta ciclos continuos de remodetamiento, lo cuales consisten en resorcidn seguida de depósito de nuevo tejido óseo. Este remodelamiento permite al hueso adaptarse tanto a las seflales fisicas (por ejemplo, al aumento en la carga de peso) como a las hormonas. Los principales tipos de células que participan en la resorcibn y deposito son, respectivamente, los osteoclastos y los osteoblastos (figura 57-1 1). Los osteocitos descienden de los osteoblastos; al parecer, tambih participan en el mantenimiento de la matriz óseq pero esto no se describirá más en este momento. Los osteoclastos son células multinucleadas que provienen de las células pluripotentes hematopoyéticas precursoras. Poseen un dominio apical de membrana que muestra un borde ondulado y desempeflan una funcibn importante en la resorción ósea (figura 57-12). Una ATPasa traslocadora de protones, expele protones a travks de este borde hacia el interior del área de resorcibn, la cual es el rnicroambiente de bajo pH mostrado en la figura. Esto abate el pH local a 4.0 o menos; en consecuencia aumenta la solubilidad de la hidroxiapatita y permite que tenga lugar la desmineralizacibn. Se liberan proteasas $cidas lisosbmicas que digieren las proteínas de la matriz, ahora accesible. Los osteoblastos, cdlulas mononucleares derivadas de
precursores mesmquimatosos pluripotentes, sintetizan la mayor parte de las proteinas que se encuentran en el hueso (cuadro 57-9) así como varios factores de crecimientoy citminas. Se ocupan del depósito denueva matriz bsea (osteoíde) y su mineralizacibn subsecuente. Asimismo, controlan laminerali~acidnmediante laregulaci6n del paso de iones calcio y fosfato a través de sus membranas superficiales. Estas liltimas contienen fosfatasa alcalina, la cual se utilim para generar iones fosfato a partir de fosfatos orgánicos. Los mecanismos implicados en la mineralización no se comprenden por completo, pero se sabe que están implicados algunos factores. La fosfatasa alcal ina contribuye a la mineralizacibn, pero no es suficiente por sí misma. Se han descrito pequeilas veslculas (vesículas de lamatriz) en los sitios de mineralización, las cuales contienen calcio y fosfato, pero su función no es clara. Al parecer es necesaria la colhgena tipo 1 con la primera evidencia de la mineralizacibn entre los espacios de moléculas sucesivas. En fechas recientes, el interks se centra en las fosfoprotelnas ácidas, tales como la sialoproteina bsea, que actúan como sitios de nucleación. Estas proteinas contienen motivos [por ejemplo, dilataciones poli-Asp y poli-Glu) que fijan calcio y pueden proporcionar un andamio inicial para la m ineralizacibn. Algunas macromoldculas, como ciertos proteoglucanos y glucoproteInas, también pueden actuar como inhibidores de la nucleacibn. Se estima que cerca de 4% del hueso compacto se renueva cada año en un adulto saludable promedio,
OSteOClaStO
Mesenquima
Matriz ósea recihn formada (osteoide)
Figura 57-11. Esquema de las principales &lulas del hueso membranoco Los osteoblastos (colorclaro) sintetizan colágena tipo I que forma una matriz que atrapa las dlulas. Conforme esto sucede, los osteoblastos se diferencian gradualmente hasta ser osteocitos. (Reproducida con autorizacibn de Junqueira LC, Carneiro J, Kelley RO: Basic Histoiogy, 8th ed. Appleton & Lange, 1995.)
f Matrr bsea
Capilar sanguíneo
y enzimas Iisosbmicas
Figura 57-1 2. Esquema de algunos aspectos de la funeibn del os!eoclasto en la resorcibn dsea. Se liberan tanto enzirnas fisosbmicas como iones hidrbgeno en el interior de microambientes creados por la adhesidn entre la matriz bsea y la zona periférica libre del osteoclasto. La acidificac~ónde estos espacios canfinados facrlita la disolucibn del fosfato de calcio 6seo y proporciona el pH 6ptimo para la acción de las hidrofasas Iisosbmicas. Con esto ce remueve la matriz 6sea; los productos de ta resorción se introducen al citoplasma del osteoclasto, con probable digestidn posterior, y se transfieren dentro de los capilares. La ecuacibn química que se observa en la frgura se refiere a la acción de la anhidrasa carbbnica II descrita en el texto (Reproducida con permrso de Junqueira LC, Carneiro J, Kelley RO. Basic Histoiogy, 8th ed. bppleton & Lange, 1995.)
Matriz extracelillar
en tanto que se remplaza cerca de 20% del hueso trabecuf ar. En la regulación del rnetablismo óseo estan implicados muchos factores (cuadro 57-10); algunos estimulan o inhiben a los osteoblastos y otros hacen lo mismo con los osteoclastos. Las funciones en el metablismo óseo de la hormona del crecimiento y de los factores de crecimiento similares a insulina se presentan en los capítulos 45 y 5 1 y los de la hormona paratiroidea y el calcitriol(1,25[OH], vitamina D) en el capítulo 47.
* 799
Cuadro 57-1 1. Algunas enfermedades metabdlicas
v geneticas que afectan el hueso v el cartilaeo ..
--
..
.
ios
eficienciat A menudo norrnona aei crecimienra. pero -
Debido a deficiencia de vitamirla 1) durante la infancia a Debida a 4Miciencia de vitamit la D durante la vida adi~ l f a kiiperparariroidismo ci cxceco ac norrnona parariroidca resorción . causa . - - ósea O steogenesi Se debe a diversas mutaciones en los genes COL I A 1 y COL 1A2 que fecta afectan la sintesis y estructuras dc la colágena tipo 1 -t Con frec~tenciaOstcoporosis es r ui sica o, ei1 otros ca as . . . . i gradual y se relaciona con ia edad; algunos casos se deben a mutaciiinrsmInsgenmCOLIA1 . yCOLIA2 O > L C los genes ( n mutacioncri en las genes COL2A 1 indrome de :S en el gein codiflcm del receptor I del far:tor de crct:I, m i e n t o de los f i broblasti3 5 Raquitismo
A
r.1
MUCHOS TRASTORNOS METABOLICOS Y GENETICOS AFECTAN AL HUESO En el cuadro 57-1 1 se enumeran varios de los ejemplos mas importantes de trastornos metab6licos y genéticos que afectan al hueso. El enanismo se presenta en el capítulo 45 y el raquitismo, la osteomalacia y el hiperparatiroidismo en el 47. La asteogCnesis imperfecta (huesos frágiles) se caracteriza por una fragilidad anormal de los huesos. La esclerbtica es con frecuencia anorrnalmente delgada y traslúcida y puede parecer azul a consecuencia de la deficiencia de tejido conjuntivo. Se reconocen
? + .
~ u & ' O " ' f l - Y i iPrictores . a ue afectan a los osteoblaistos y osti
- -..--. . --- -
:stimulan,a los osteoblastos PTH
e Jackson-
1 Y;;'"
Los sindromcs de Pfeiffcr. Jackson-Weiss y Cnjuzon Con si drornc~de craneosinostosis, un tCrmino que si gnifica fusi prematura de Ixs sutiirds del crhneo.
' La displasia ianatof61-i~ llcvar) cs la in&itiecueni
nosI
la cual mani fiesta carñci
nhiben a 1,os osteobl:
.
cuatro tipos de esta enfermedad (leve, extenso, severo
y variable), de los cuales el tipo extenso que se presenta en el recien nacido es el peor. Los lactantes afectados pueden nacer con múltiples fracturas y no sobrevivir. Más de 90%de los pacientes con osteogknesis imperfecta tienen mutaciones en los genes COClAl y
"3
11,- 1. I L-
TNF TGEa Inhiben ri lus usrevcii Calciton ina Estrbgenos (mediar
de
IL-6)
-
nuerte; fore in: squelttica niionatal monal: iilates n las de la acondiY>CI 1UI1UII1A. 1
plasia hornocigota.
. .., ....',..
.cruiues :stirnulan a los osteo PTH 1 '25-Dih m.
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3
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es en el genI que codifica
Irouzon sia y dis-
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idroxicolec
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* Keproauctao con aurorizacion oe cranong NF:RevieirofMedi-
calPhisiologv. 17th cd. Appleton k i.ar~ge~ 1995; publicado por la Editorial El Manual Mdcrno, MCxico.
COLlA2 que codifican, respectivamente, las cadenas proalfal(1) y proalfaZ(I}. Se tiene informaci6n sobre más de 100 mutaciones en estos dos genes e incluyen :leciones parciales del gen y duplicaciones. Otras utaciones afectan la separacidn del RNA, el tipo más ..ecuente resulta en el kmplazo de glicina pos otro aminoácido valuminoso, En general, estas mutaciones resultan en la disminucibn de la expresidn de
(Capítulo 5 7)
800 Bioquimica de Harper
colhgena o en cadenas proalfa anormales que se ensamblan dentro de las fibrillas normales y debilitan la totalidad dc la esmctura del hueso. Cuando existe una cadena anormal, dsta puede interactuar con dos cadenas normales, pero puede evitar el plegamiento, lo que produce la degradacián enzimática de la totalidad de las cadenas. Esto se denomina "suicidio de procolágena" y es un ejemplo de una mutación dominante negativa. resultado que se observa con frecuencia cuando una proteha consta de múltiples subunidades diferentes. La osteopetrosis (enfermedad de los huesos de r n h o l ) se caracteriza por el aumento de la densidad bsea y se debe a una incapacidad para resorber hueso. Una modalidad se presenta junto con acidosis tubular renal y calcificacidn cerebral. Se debe a mutaciones en el gen (localizado en el cromosoma 8q22) que codifica la anhidrasa carbbníca 11 (LA II), una de las cuatro isoenzirnas de la anhidrasa carbbníca presente en los tejidos humanos. La reaccibn catalizada por la anhidrasa carbbnica se muestra a continuación:
La reaccion 11 es esponthnea. En los osteoclastos implicados en la resorción &ea, al parecer la CA 11 proporciona protones para neutralizar los ionec 013-que se dejan en et interior de la célula cuando los iones H' se bombean a travks de sus bordes ondulados (vkase antes). Por tanto, si en los osteoclastos la CA 11 tiene actividad deficiente, no se produce la tesolucion normal del hueso y se desarrolla osteopetrosis. El mecanismo de la calcificación cerebral no está claro, en tanto que la acidosis tubular renal refleja actividad deficiente de CA 11 en los túbulos renales. La osteoporosis es una reduccion generalizada y progresiva de la masa de tejido óseo por unidad de volumen, lo cual causa debilidad del esqueleto. La proporción entre elementos orghicos y minerales se mantiene inalterada en el resto del hueso normal. Las fracturas de diversos huesos, como la cabeza del fémur, se presentan con mucha facilidad y representan una carga muy pesada tanto para el paciente afectado como para el presupuesto de atención a la salud de la sociedad. Al parecer algunos de los factores que se enumeran en el cuadro 57-1 0, como los estrbgenos y las interleucina 1 y 6, e s t h íntimamente implicadas cn las causas de la osteoporosis.
LOS PRINCIPALES COMPONENTES DEL CART~LAGOSON LA COLÁGENA TIPO II Y CIERTOS PROTEOGLUCAFIOS Las proteínas principales del cartilago hialino (el tipo principal de cartílago) se enumeran en el cuadro 57-12.
La colhgena tipo 11 es la proteína principal (figura 57-13) y también esthn presentes varios tipos menores de colágena. Ademis de estos componentes, el cartilago elAstíco contiene elastina mientras que el fibroelastico posee colhgena tipo I. Asimismo. incluye varios proteoglucanos que desempeñan una función importante en su comprensibilidad. El agrecano (cerca de 2 x 1O3küa) es el proteoglucano principal. Como se muestra en la figura 57-14, tiene una estructura muy compleja que contiene algunos GAG (hcido hialurbnico, sulfato de condroitina y sulfato de queratán) que enlazan o encierran proteínas. La proteina central contiene tres dominios: A, B y C. El hcido hialurbnico se une de manera no covalente al dominio A de la proteina central así como a la proteina de enlace, lo cual estabiliza las interacciones entre el hialuronato y la proteha central. Las cadenas de sulfato de queratán se localizan en el dominio B, en tanto que las de sulfato de condroitina estan en el dominio C; ambos tipos de GAG se unen con enlaces covalentes a la proteina central. Esta también contiene cadenas oligosacásidas con enlaces tanto O como P. Los otros proteoglucanos que se encuentran en el cartilago tienen estructuras mAs simples que el agrecano.
Caadro 57-12. Las proteinas principales del mrtilago -,
. ..
--
. -
.
.-
roteinas
--
.-
de colh~en: ia tipo 11
:W a YKYodel total de la co16ena del cairtilag mticular.
e compone dc tres cadenas ia
:i (11)
tipos V, 1
i tipo 1X SE une de mamera , .. .. . cmzaaa con ia iipo 11. idatipo XI puede ayudar en el control del diametro de las iibrillas tipo 11 "-
1
principal pt-oreogiucanode! E! artiIago sg~uc-eiii~3 f;iandes Se ciruraiua 2n algunos tipos de cartilage agregantes Siinilar a CS-PG 1 6seo C; I (bigluct G 11 (dewri Siinilar a CS-PG 11 bseo " ., en Pu ede tener alguna nuicion lectina el enlace de la oolagena tipo 11 a la superficie del cartílago Puede fijar colhgena tipo 11 a Ancorin la superficie del condrocrto * Las proteinas cenkales de DS-PG Iy DS-PG 1 1 son homblogac de las de CS-PG 1 y CS-PG 11 q iie se encueritran en el hueso
1 .,, -
(cuadro 57-9). Una explicacihn prisihle e5 que los osteublastos carecen de la epimerasa requerida n m - m ,I n ,,,,versibn del Acicido glucurónico en hcido idurdniw, e l último (1.5 los cualc:S se encuentra en el sulfato de dermatiin. Cnnl
Matriz extracelulap. 801
Proteinas de enlace
Sulfato de mndroitina
Colagena (tipo II)
': '
:"-
."
Proteína central
I)'
i
Figura 57-13. Esquema de la organización molecular de la matriz del cartílaga. Proteínas de enlace no mvalente se unen a la proteína central (color claro) de los proteoglucanos en las mol8culas lineales de ácido hialuronico (color mas oscuro). Las cadenas laterales de sulfato de mndroitina de las proteoglucanosse enlazan electrostaticamentea las fibrillas de la colágena, y forman una matriz de enlaces cruzados El ávalo señala la porcibn ampliada en la parte inferior de la figura. (Reproducida con permiso de Junqueira LC. Carneiro J, Kelley RO. Basic Histoiogy, 8th ed. Appleton B Lange, 1995 }
Dominio A
Dominio C
Dominio 8
+ Acido hialurbnico
Sulfato de
querathn
Sulfato de condroitina
Oligosacáridos con enlaces O
Figura 57-14. Esquema del agrecano del cartllago nasal bovina. A la ixquierda se muestra una tira de ácido hialuronico. La proteína central (cerca de 210 kDa) tiene tres dominios principales. El dominio A, en su porcibn terminal amino, interactúa con aproximadamente cinco repetiuones disadridas en el hialuronato La proteina de enlace interactúa tanto con el hialuronato como con el dominio A y estabiltza sus interacciones Cerca de 30 cadenas de sulfato de queratán se adhieren, a través de las enlaces GalNAc-Ser, al dominio 0 El dominio C contiene cerca de $00 cadenas de sulfato de mndroitina adheridas por la via de los enlaces Gal-Gal-XiI-Sery cerca de 40 cadenas de oligosacáiridos con enlaces 0.También se encuentran una o más cadenas de glucanos con enlaces N cerca del carboxilo terminal de la proteína central. (Reproducida con autoriracidn de Moran LA y colaboradores Biochemistry, 2th ed. Neil Patterson Publishers, 1994.)
802 0 Bioqltimica de Harper
La condronectina interviene en Fa adhesión de :a colágena tipo II a los condrocítos. El cartílago es un tejido avascular que obtiene la mayor parte de sus nutrientes del liquido sinovial.Muesm una renovación lenta, pero continua. Diversas proteasas (como las colagenasas y la estromatisina) sintetizadas por los condrocitos pueden degradar la colagena y otras proteínas que se encuentran en el cartílago. Al parecer, la IL- 1 y el TNFalfa estimulan la producción de tales proteasas, en tanto el TGFbeta a el IGF- 1 por lo general ejercen una influencia anabdlica sobre el cartitago. LAS BASES MOLECULARES DE LAS CONDROD1SPLASIAS INCLUYEN MUTACIONES EN GENES QUE CODIFICAN LA COLÁGENA TIPO II Y LOS RECEPTORES DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE LOS FIBROBLASTOS Las condrodisplasias son un grupo mixto de trastornos hereditarios que afectan el cartilago y que se manifiestan por enanismo con acortamiento de los miembros y numerosas deformidades esqueleticas. Varias se deben a diversas mutaciones en el gen COLSAI que lleva a variedades anormales de la colagena tipo 11. Un ejemplo es el síndrome de Stickber que se manifiesta por degeneracibn del cartílago articular del cuerpo vitreo del ojo. La mejor conocida de las condrodisplasias es la acondroplasia, la causa más frecuente de enanismo. Los individuos afectados por esta condicibn tienen miembros cortos, tamafio normal del tronco, macrocefalia y diversas anomaIidades esqueléticas. El padecimiento a menudo se hereda como rasgo autosomico dominante, pero muchos casos se deben a mutaciones nuevas. Las bases moleculares de ta acondroplasia recientemente descubiertas se muestran en la figura 57-1 5. Esta enfermedad no es un trastorno de la colhgena, aunque se debe a mutaciones muy especificas en el gen que codifica el receptor 3 del factor de crecimiento de los fibroblastos (FGFIU). Los factores de crecimiento de los fibroblastos son una familia de por lo menos, siete proteínas que afectan el crecimiento y la diferenciacion de las células de origen mesenquimatoso y neuroectodérmico. Sus receptores son proteínas transmembrana y constituyen un subgrupo de la familia de los receptores de las tirosina cinasas. El FGFR3 es un miembro de este grupo y media las acciones de FGF3 sobre el cartílago. En todos tos casos de acondroplasia investigados se encuentra que las mutaciones implican el nucleótido 1138 y resultan en la sustitución de la arginina por glicina (residuo número 380) en el dominio trans-
(Capítulo j7)
membrana de la proteina, lo que lo toma inactivo. En Pos individuos sin la afección no se encuentra tal mutación. Como se indica en el cuadro 57-1 1, otras displasias esqueléticas (que incluyen ciertos sindromes de craneosinoctosis) también se deben a mutaciones en los genes que codifican los receptores FGF. Además, otro tipo de displasia esquel6tica (displasia diastrhfica) se debe a mutaciones del transportador de sulfato. De este moda, la tecnología del DNA recombinante comienza una nueva era en la comprensión de las displasias esqueléticas.
RESUMEN Los componentes principales de Fa matriz extracelular son las proteinas estructurales colágena, elastina y fibrillina, cierto número de proteinas especializadas (por ejemplo, la fibronectina y la laminina) asi como varios proteoglucanos. La colhgena es la proteína mQsabundante en el reino animal. Se han aislado cerca de 19 tipos y 30 genes codifican los polipéptidos procolagena. Todas las colágenas contienen dilataciones de triple hélice de mayor o menor tamaño. Además, en todas ellas existe la estructura repetida (Gli-X-Y),. Con frecuencia X y Y son prolina c hidroxiptolina. También hay hidroxilisina y es un sitio potencial de glucosilaci0n. La biosíntesis de la colágena es compleja, destacando sus numerosos procesos postraclación, que inciuyen hidroxilación de prolina y lisina. Las enfermedades relacionadas con trastornos en la sintesis de colfigena son: escorbuto, osteogénsis imperfecta, sindrome de Ehlers-Danlos (muchos tipos) y el sindrome de Menkes. La elastina confiere extensibilidad y retracción elástica a los tejidos. En el ser humano se ha detectado
Mutaciones del nuclebtida 1138 en el gen codificante de FGFRS en el cromosoma 4
J Remplazo en FGFR3 de una G1k (residuo niirnero 380) por Arg
1 Función defectuosa de FGFR3
1 Desarrollo y crecimiento anormales del cartilago que lleva a enanismo de miembros cortos y otras caracteristicas Figura 57-f 5. Esquema cimplrficado de las causas de ta awndrdicplasia. En la mayor parte de los casos estudiados hasta ahora, la rnutacibn es una transiabn de G a Aen el nucJebtido 1138 En pocos casos la rnutacidn es una transversibn de G a C en el mismo nuclebtido. Este nuclebtido particular es una "sefial caliente" real para la mutación. Ambas mutaciones producen el remplazo de un residuo de Gli por uno de Arg en el segmento transmembrana del receptor.
Matriz extracelular
sólo un gen para esta proteína. La elastina contiene hidroxiprolina, pero carece de hidroxilisina, secuencias Gli-X-Y, estructura helicoidal triple y azúcares. En cambio, posee tos enlaces cruzados desmosina e isodesmosina no encontrados en la colágena. La fibrillina se locali7.a en microfibrillas relacionadas con la elastina. Las mutaciones en el gen de la fibrillina causan el sindrome de Marfan. La fibronectina es una glucoproteína importante en la adhesi6n y migración celular. La laminina es un componente importante de las Ihminas basales, como la que existe en el glorné.nilo renal. Los glucosaminoglucanos (GAG) esthn constituidos por dicachridos repetidos que contienen un ácido usónico (glucurónico o idurónico) o una hexosa (galactosa) y una hexosamina (galactosamina o glucocamina). Con frecuencia también contienen sulfato. Los GAG principales son ácido hialurbnico, 4- y 6-suffatos de condroitina, sulfatos de queratán 1 y 11, heparina, sulfato de heparAn y sulfato del derrnathn. ~ 6 GAG s con sintetizados por las actividades en secuencia de un conjunto de enzimas especificas (glucosiltransferasas, epimerasas, sulfotransferacas, etcktera) y son degradados por la acción secuencia1 de
803
las hidrolasas lisos6micas. Las deficiencias genéticas de estas iiltirnas causan mucopolisacaridosis (por ejemplo. sindrome de Hurler). En los tejidos, los GAG se encuentran unidos a varias proteínas (proteinas de enlace y proteinas centrales), formando proteoglucanos. A menudo, estas estructuras tienen pesos rnoleculares muy altos y realizan numerosas funciones tisulares. Muchos componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, ciertos GAG y proteinas como fihronectina y laminina) se enlazan con proteinas de la superficie celular denominadas integrinas; de este modo se organiza una via por la cual el exterior de las cClulas puede comunicarse con su interior. El hueso y el cartílago son variedades especializadas de la matriz extracelular. La colágena 1 y la hiclroxiapatita son los constituyentes principales del hueso, que tambien contiene varias proteinas menores que pueden cumplir funciones importantes. La colágena II y ciertos proteoglucanos son los constituyentes principales del cartílago. Las causas rnoleculares de diversas enfermedades hereditarias de los huesos (por ejemplo, la osteogénesis imperfecta) y del cartilago (como las condrodistrofias) empiezan a conocerse con la aplicacibn de la tecnología del DNA recombinante. U
REFERENCIAS A n w a r R: Elastin: A brief rebiew. Biochcm Educ
1990;18:162. Ryers PH: Disordcrs of collagen biosynthesis and structurc. En: The Metabolic Rasis ofInheri!edDisease,7th cd. Scriver CR et al. (editors) McGraw-Hill, 1995. Caplan A: Cartilage. Sci A m (Oct) 1984;250:84. G h r k EA, Brugge JS: Integrins and signal transdiiction pathways: The road taken. Science 1995;268:233. Francomano CA: The genetic basis of dwarfism. N Engl .IMed 1995;332:58. Hardingham TE, Fosang AJ: Proteoglycans: Many forms and many functions. FASEB J F992:6:861. Hay E D (editor): CeII Riology of the ExtraceIIular Watrix, 2nd ed. Plenum l'ress, 1993. Monolagas SC, dilka RL: Bone marrow, cytokines, and hone remodcling: Emerging insights into thc pathop h y s i o l o ~of ostcoporosis. N Engl .l Med 1995:332:305. Neufeld EF, Muenzer J:The mucopolysaccharidoses. En: The iMeiaboirc Basis af Inherited Diseuse, 7th ed. Scriver CR et al. (editors). McGraw-Hill, 1985. Prockop DJ, Kivirikko KI: Collagens: Molccular biolom, discascs, and potential therapy. Annu Rev Riochem 1993:ú4:403.
Raghow U: The rolc of extracellular matrix in posinflammatory wound healing and fibrosis. FASEB J IBY4;X:823. Ramircx F et al.: Marfan syndrome and rclated disorders. In: The ;MetahoIrc and ,Molecular Bases of lnherrred, Dzsease, 71h ed. Scriver Cr et al. (editors). McGraw-
Hill, 1995. Rosenbloom J, Abrams WR, M e ~ h a mR: Extracellular matríx 4: The elastic fiber. FASER J 1993;7:1208. Royce PM, Steinmrnn B (editars): CoPlnective Tissue and I#.THeritahIe Disorders, Wiley-Liss, 1993.
Sakai LY: Thc extracellular matrix. Sci Am Sci Med May-June 1995;58. Schumacher HR, Klippel JH, Koopman W.J (editors): Primer on rhe Rl~eumatrcDiseases. I Oih ed. Anhritis Foundation, 1993. (Contiene secciones accrca de cartílago articular, hueso, coliigena y elastina, proteoglucanos, trastornos heredables de tejido conjuntiva y enfcrmcdades óseas metahhlicas.) Tilstra DJ, Byers PH: Molecular basis of heredftary disorders of connectlve tissue. Annu Rcv Med 1994;45:149. Yamada KM: Adhesive recognition sequences. I BioI Chern 1991;266: 12809.
Músculo Roberf K. Murray, MD, PhD
Las moléculas proteínicas en los sistemas bioEógicas pueden servir para funciones primarias diferentes de la catálisis. Las funciones de transmisión de señales, funciones reguladoras y de reconocimiento de las rnolkculas proteinicas, han sido descritas en capítiilos anteriores. Las proteítis desempeñan una funcihn importante en el movimiento, tanto a nivel orglinico (por ejemplo, músculo esquel&tico,corazón e inzestino) como en el celular. En este capizulo se describen las funciones de proteínas específicas y de otras moléculas claves (por ejemplo, Caz') en la contraccion muscular.
La cornprensibn de la base molecular de las principales enfermedades genéticas recibib un ímpetu notable en 1986 con la clonaciún exitosa del gen de la distrofia musciilar tipo Duchenne, logro que encierra grandes promesas para la terapkutica d e esta enfermedad (véase caso No. 6 en el capitulo 65). TarnbiCn se ha avanzado de manera significativaen la comprensión de la base molecular de la hipertermia maligna, complicación grave en algunos pacientes que se someten a ciertos tipos de anestesia. Se ha demostrado que este trastorno se debe a la acumulación anormal de Ca" en el citoplasma de las d l u l a s del músculo esqueldtico, lo que causa rigidez y generación de calor excesivo. La elevación del Ca" se debe, por lo menos en ciertos casos, a rnutacibn en el gen estructural para el conducto liberador de esfe catibn del retículo endoplAsmico. El trastorno tiene tarnbidn implicaciones financieras graves para la industria del cerdo, dado que una pertiirbación semejante tiene lugar en estos animales, cuando esthn sujetos a tension. La insufi-
ciencia cardiaca es un problemarncdico muy comun que tiene diversas causas; cu terapéutica racional requiere la comprensiiin dc la bioquimica del músculo cardiaco. Un grupo de trastornos que causan insuficiencia cardiaca son las cardiomiopatias, algunas de ellas determinadas por alteraciones genéticas. Estudios recientes han mostrado que las mutaciones en el gen de la cadena pesada de la bera rniosina cardiaca causan la cardiomiopatia hipertrbfica familiar. Un descubrimiento reciente sorprendente es que el factnr rclajaqte derivado del endotelío, compuesto sintetizado por 1% ct'lulas endoteliales que regulan el tono del mucculo liso, es cl gas áxido nítrico (ON). Muchos vasodilatadores comunes, como la nitroglicerina, usados en el tratamiento de la angina de pecho, actuan por incremento de la formacirin de este compuesto. Igualmente sorprendente es el deccubrirnierito de que al parecer ON es un neurotransmisor. EI infarto del miocardio es en extremo común y en el caso No. 4 (capítulo 65) se describen ciertos aspectos bioquimicos de este trastorno.
EL MUSCULO TRANSDUCE LA ENERG~A QUIMICA EN ENERG~AMECÁNICA El músculo es e! principal transductor (máquina) bioquímico que convierte la energía (química} poterrcial en energía cindtica (mecanica). El miisculo es el tejido único más largo de! cuerpo humano, que comprende un poco menos de 25% de la masa corporal al nacer, mAs de 40% de la masa corporal en el adulto joven y casi 30% en el anciano. Un transductor químico-mecanico eficaz debe satisfacer varios requerimientos: 1) Debe existir un suministro constante de energfa química. En el músculo de los vertebrados, el ATP y el fosfato de creatina son las formas de energía quimica. 2) Debe haber un
medio para regular la actividad mecanica, es decir, la velocidad, dumciiin y fuerza de la contraccion en el caso del músculo. 3 ) La maquina necesita estar conectada a un operador, un requerimiento cubierto en los sistemas biológicos por el sistema nervioso. 4) Debe haber una forma de que la maquina retorne a su estado original. El musculo es una rnhquina de jatar no una máquinade empujar. Por consiguiente, un mbcculo dado debe ser antagoni7ado por otro grup de músculos, por otra fuerza como la gravedad o por un retroceso elástico. En los vertebrados, los requerimientos anteriores y las necesidades especificas del cuerpo SE satisfacen mediante la existencia de tres tipos de rnusculos: el esqueletico, el cardiaco y el liso. Tanto el múscula esquelético como el cardiaco aparecen estriados a la observacibn microscópica. en tanto que el músculo liso no es estriado. Aunque el musculo esquelético esti ba,jo control nervioso voluntario. el del músculo cardiaco y del liso es involuntario.
El sarcoplacrna de las células musculares contiene ATP, fosfscreatina y enzimas glucolíticas El músculo estriado esth compuesto de celulas rnultinucleadas que constituyen la fibra muscular, rodeadas
por una membrana plasrnhtica eléctricamente excitable, el sarcolema. Una fibra muscular individual la cual puede extenderse en la longitud total del músculo, contiene un hazde numerosas miofibrillas, ordenadas en paralelo; ademas, se encuentran embebidas en un tipo de liquido intracelular denominado sarcoplasma. En este liquido esta contenido el gluc6gen0, los compuestos de alta energía ATP, la fosfocreatina y las enzimas de la glucólisis,
El sarcómero es la unidad funcional del músculo En la figura 58-1 se muestra una vision general del músculo esquelético a varios niveles de organización. Cuando la miufibrilla se examina al microscopio electrónico se observan bandas oscuras y claras alternantes (bandas anisotrópicas es decir birrefringentes con la luz polarizada y bandas isotrbpicas, o sea sin alteración con la luz polarizada). Éstas se conocen como bandas A e 1, respectivamente. La regi6n cenbal de la banda A (la banda H o zona H) se muestra menos densa que el resto de el la. Por su parte, la banda 1 está dividida en dos por una linea 2 angosta y muy densa (figura 58-2).
Figura 58-1. La estructura del músculo voluntario. El sarcómero es la r e g i ~ nentre las líneas Z.(Redibulada por Sylvia Colard Keene. Reproducida con autorizacibn de Bloom W, Fawcett DW: A Textbook of Histology, lOth ed Saunderc, 1975 )
Banda H A. Extendido
Banda l
Banda A
Línea Z
A
!
a-Actinin
Filamentos de actina 6 nm de diarnetro
Filamentos de miosina 1s nrn de diarnetro
Cortes transversales,
.-..'.'. .. :. ..... ... .
.:m:*:m:m m:#;#:.
m....
., , *
l
. . . m .
B. Contraído
Filamento
, ,
6 nrn de di8rnetm
delgado
Filamenta grueso
--
16 nrn de dihmetm
Figura 58-2. Acomodo de los filamentos en el músculo estriado. A: Extendido. Se muestran la posicion de las bandas l. A y H en el estado de extensión tos filamentos delgados se traslapan en parte a las teminales de los filamentos gruesos y los filamentos delgados se muestran anclados en las lineas Z (con frecuencia se denominan discos Z) En la parte inferior de la figura, se muestran puntas de flecha que señalan en direcciones opuestas y salen de los filamentos de miosina (gruesos). Hay cuatro filamentos de actina (delgados) adheridos a dos líneas Z vía u-actinina. La región central de los tres filamentos de miosina, libre de puntas de flecha, se denomina la banda M (no sehalada) Se muestran los cortes transversales a travbs de las bandas M, de una zona donde se traslapan los filamentos de miosina y actina y a través de otra en que sblo hay filamentos de actina. B: Contraido. Los filamentos de actina se muestran deslizados a lo largo de los lados de las fibras de miosina. No hay cambto en fas longitudes de los filamentos gruesos (indicadas por las bandas A) y de los filamentos delgados (distancia entre las lineas Z y las porciones adyacentes de las bandas H) Sin embargo, se reduce la longitud de los sarcomeros (de 2300 a 1500 nm) y tarnbiPn se reducen las longitudes de las bandas H e I debido a que se traslapan los filamentos grueso y delgado Estas observaciones morfologicas proporcionan parte de las bases del modelo del filamento deslizante de la contraccibn muscular
El sarcómero se define como la regibn entre dos llneas Z (figuras 58-1 y 58-2) y se repite a lo largo del e+jede la fibrilla a distancias de t 500 a 2300 nrn según el estado de contraccihn. La apariencia estriada del mljsculo voluntario y del cardiaco, en estudios hechos en microscopio, es consecuencia de su alto grado de organizacion en el cual, la mayor parte de las cklulas de la fibra muscular están alineadas de modo que sus sarc6meros estkn en registros paralelos (figura 58-1).
Los filamentos gruesos contienen miosina, mientras que los delgados contienen actina, trepomiosina y troponina Cuando se examinan las miofibrillas a travks de un microscopio electrónico parece que cada una está constituida por dos tipos dc filamentos longitudinales. Un tipo el filamento grueso, confinado a la banda A, consta principalmente de la proteina miosína. Estos filamentos tienen un diámetro aproximado de 16 nrn
808
Bioquirnica de Harprr
(Capitulo 58)
y están ordenados en el corte transversal como un hexágono (figura 58-2, centro). E1 otro filamento, el delgado, descansa en la banda 1 y se extiende tambikn a la banda A pero no dcntro de su zona i-t (figura 58-2). Estos filamentos contienen las proteínas actina, tropomiosina y troponina (figura 58-3). En la banda A, los filamentos delgados se ordenan alrededor del filamento p e s o (miosina) corno una estructura hexagonal secundaria. Cada filamento delgado descansa de manera simétrica entre tres filamentos gruesos (figura 58-2, centro, corte seccional central\ v cada uno de los cuales está rodeado simetricamente por seis filamentos delgados. 1
,
Tropmiosina
Los filamentos gruesos y delgados interacnian por medio de puentes transversales que emergen a intervalos de 14 nm a lo largo de los filamentos gruesos. Como se muestra en la figura 58-2, los puente$ cruzados (dibujados como puntas de flechas en cada terminal de los filamentos de miosina, pero sin extenderse por completo a traves de los filamentos delgados) tienen polaridades opuestas en las dos terminales de los filamentos gruesos. Los dos polos de los ultimos se encuentran separados por un segmento de 150 nm (la banda M, sin especificar en la figura), el cual carece de proyecciones.
Troponina
A
35.5 nrn
El filamento delgado ensamblado
Figura 58-3. Esquema de filamentos delgados que muestra la configuracibn espaual de sus tres principales proteínas constituyetes. actina, rnlosina y tropomisina. La porción superior muestra rnol8culac individualesde G-actina La porción media presenta rnonómeros de actina ensamblados dentra de F-actina.Tambrén se muestran moUculas indwrduales de tropomiosina (dos tiras enrolladas entre si) y de troponina (construida de sus tres subunidades). La porcibn inferior muestra el filamento delgado ensamblado consistente en F-actina, tropomiosina y las tres subunidades de troponina (TpC. Tpl y TpT).
El modelo de puente cruzado del filamento lateral es el fundamento sobre el que se construye el pensamiento actual acerca de la contracción muscular Este modelo se propuso de manera independiente por Henry y' Andrew Husley y SU colaboradores, en el decenio de 1950. Se basa en gran medida en cuidadosas observaciones morfologicas del músculo en reposo, extendido y contraído. Básicamente, cuando el músculo se contrae, no hay cambio cn las longitudes de los filamtntos gruesos o de los delgados, pero la mna H y las bandas 1se acortan (veaqc leyendas de figura 58-2). Así, los ordenamientos de los filamentos entrela7ados deben deslizarse pasando uno sobre otro durante la contracción muscular. Los puentes crri7ados que unen los filamentos delgados y gruesos en ciertas etapas del ciclo de contraccion, generan y sustentan la tensión. La tensión desarrollada durante Ea contracción muscular es proporcional al traslape del filamento y al número de puentes cruzados. Cada cabeza dc puente cruzado está conectada al filamento grueso por medio de un segmento fíbroso flexible, que puede doblarse hacia afuera desde el filamento grueso. Este segmento flexible facilita el contacto de la cabeza con el filamento delgado, pero es también lo suficientemente flexible para acomodarse en el espacio interfilamentoso.
LA ACTlNA Y LA MlOSlNA SON LAS PRINCIPALES PROTEINAS MUSCULARES La masa de un músculo fresco esta constituida por 75% de agua y mas de 20% de proteína. Las dos proteinac musculares principales son la actina y la miosina. La G-actina monom6rica (43 kDa; G, globular) representa 25% en peso de la proteína muscular. A la fuerza ibnica fisiolbgica y en presencia de Mg2-, la G-actina se polimeriza de manera no covalente para formar un filamento de doble hélice, insoluble Hamado F-actina (figura 58-3). La fibra de F-acrina es de 6 a 7 nrn de gruesa y tiene un avance de rosca o estructura repetida cada 35.5 nm. Las miosinas constituyen una familia de protehas de la que se han identificado cerca de 10 miembros. La que se presenta en este capítulo e5 la miosina 11 y cuando se describe la miosina, es a esta variedad a la que se hace referencia a menos que se indique otra cosa. La miosina 1es una variedad monomhica que une a las membranas celulares. Puede servir como enlace entre microfilarnentos y la membrana celular en ciertas ubicaciones.
La miosina contribuye con 55% del peso de la proteína muscular y forma los filamentos gruesos. Es un hexámero asimétrico con masa molecular aproximada de 460 kDa y tiene una cola fibrosa que consta de dos hélices intercaladas. Cada hélice cuenta con una porción cefálica globular adherida a una de las terminales (figura 5 8 4 ) . E1 hexamero consta de un par de cadenas pesadas (H), cada una con masa molecular de cerca de 200 kDa, y dos cadenas ligeras (L), cada una con masa molecular de 20 kDa. Estas últimas son diferentes entre si, a una se le denomina la cadena ligera esencial y, a la otra, ligera reguladora. La miosina del miisculo esquelético fija actina para formar actomiosina (actina-miosina) y su actividad intrínseca de ATPasa se aumenta bastante en este complejo. Existen isofomas de la miosina cuyas cantidades pueden variar en diferentes situaciones anatómicas, físiológicas y patológicas. Se han determinado las estructuras cristalogrrificas de la actina y las de la cabeza de miosina; estos estudios confirman diversos hallazgos iniciales relativos a sus estructuras y también han dado lugar a mucha información nueva.
La digestibn limitada de miosina con proteasas ha ayudado a dilucidar su estructura y función Cuando la miosina es digerida con tripsina. se forman dos liagmentos de miosina (merorniosinas).La meromi* sina ligera (MML) estñ formada de fihm ara helicoidales agregadas insolubles (figura 5 8 4 ) . Esta meromiosina ligera no muestra actividad de ATFasa y no se une a la F-actina. La meromiosina pesada (MMP; masa molecr~lar aproximada de 340 kDa) es una proteína soluble que tiene tanto una porcibn fibrosa como una porción globular (figura 58-4). Exhibe actividad de ATPasa y se une a la F-actina. La digestibn de MMP con papaina genera dos subfragmentos, S-1 y S-2. El S-2 es de caracter fibroso y no muestra actividad de ATPasa ni se une a la F-actina. El S-l (masa molecular de 1 15 kDa) exhibe actividad de ATPasa, se une a cadenas L y en ausencia de ATP se fijad y decorarCi a la actina con '"untas de flecha" (figura 58-51, Tanto el subfi-agmento S- 1 como lamerorniosina pesada tiene actividad de ATPaca, la cual es acelerada de 100 a 200 veces por la adicibn de F-actina. Como se vera despubs, la F-actina incrementa grandemente la velocidad a la cual Ea ATPasa de la miosina libera sus productos, ADP y P,. Por tanto, aunque la F-actina no afecta al paso de la hidrblisis per se, su capacidad para promover la liberacibn de los productos de la ATPasa acelera poderosamente la velocidad global de la catálisis.
HMM S-1
Figura 5 8 4 . Diagrama de una molécula de miosina mostrando las dos h4ltcec-U entrelazadas (porción fibrosa), la regrbn globular (G), las cadenas ligeras (L) y los efectos de la escision proteolitica por tripsina y papaina. La regibn globular (cabeza de la miosina) contiene un sitio fijador de actina y un sitio fijador de cadena L y tarnbtbn se adhiere al resto de la moltScula de miosina.
LOS CAMBIOS EN LA CONFORMACIÓN DE LA CABEZA DE LA MlOSlNA DIRIGEN LA CONTRACCIQN MUSCULAR
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Figura 58-5. La decoración de los filamentos de actina con S-l de miosrnapara fomar de (Cortesía de JA Spudich.)
iC6rno puede producir movimientos macroscópicoc la hidrblisis del ATP? La contraccihn muscular consiste en lo esencial en la adheci6n y desprendimiento ciclicos de la cabeza S-1 de la miosina de los filamentos de F-actina. Este proceso tambitn puede designarse como la hechura y rompimiento de puentes cruzados. La adhesión de la actina a la miosina se continua por cambios en la conformaci6n los cuales son de particular importancia en la cabeza S-1y dependen del nuclebtido que este presente (ADP o ATP). Tales modificaciones producen el golpe de fuerza que lleva movimiento a los filamentos de actina sobre los filamentos de miosina. La energía para el mismo se suministra al final por ATP que se hidroliza a ADP v P,. Sin embargo. el golpe de fuerza como tal es re<ado de los caibios en la confomaci6n de la cabeza de la miocina cuando la abandona el ADP.
El proceso bioquimico principal que tiene lugar durante un ciclo de contracción y relajamiento muscular puede representarse con los cinco pasos que se muestran en la figura 5 8 4 :
1) En la f a ~ derelajamientode e lacontracción muscular, la cabeza S-1 de la miosina hidroliza ATP hasta ADP y P,, pero estos productos permanecen unidos. El cornplqio ADP-P,-miosina resultante se ha energiíado y se encuentra en unaconfonnacion que se denomina de alta energia. 2) Cuando se estimula la contracción muscular (a travks de procesos en los que intervienen c a z ' , troponina, tropomiosina y actina, los cuales ya se describieron); la actina se vuelve accesible y la cabe72 S-1 de la miosina la encuentra, se une a ella y forma el complejo de actina-miosina-ADP-P, descrito. 3) La formación de este complejo promueve la liberación de P,, lo que inicia el golpe de fuerza a lo cual sigue la liberacidn de ADP, acompañada de un gran alargamiento en la conformación de Ia cabeza de la rniosina en relación a su cola (figura 58-7); esto que coloca a la actina cerca de 10 nm hacia el centro del sarclimero. Esto es el golpe de fuerza. La miosinase encuentra ahora en un estado denominado de baja energía, y se indica como actina-miosina. 4) Otra rnol~culade ATP se une a la cabeza S-1 y forma un complejo actina-miosina- ATP, 5) La miosina-ATP tiene una afinidad reducida por la actina, por lo que Csta se libera. Este liltimo paso es un componente crítico del relajamiento y depende del enlace de ATP al complejo actina-miosina. Entonces empieza otro ciclo con la hidrólisis del ATP (paso [ l ] de la figura 5 8 4 ) para rehacer la configuración de alta energía. Por tanto, la hidrólisis del ATP se utiliza para conducir el ciclo, con el golpe de fuerza real como
Figura 58-6. La hidrblisis del ATP impulse la adhesibn y la separacibn clclicas de actina y rniosina en cinco reacciones expltcadas en el texto. (Modificada de Stryer L: Biochemlstry, 2nd ed Freeman, 1981.)
el cambio en la can formación de la cabeza S- l que se produce sobre la liberacíbn de ADP. Las regiones de bisagra de la miosina (descritas como los puntos flexibles de cada terminal de la S-2 en la leyenda de la figura 58-7) permiten la amplia variacihn d e movimientos de S-1 y el encuentro de S-1 con los filamentos de actina. Si caen los niveles intracelulares de ATP (por ejemplo, después de Ea muerte). no hay ATP disponible para unirse a la cabeza S-1 (paso 4 anterior), la actina no se disocia y, como consecuencia. no se presenta el relajamiento (paso 5). Esta cs la explicación para el rigor murtis que es el endurecimiento o rigidez del cuerpo que ce presentadespues de la muerte. Los cálculos señalan que la eficiencia de la contracción es cercana a 50%, cn tanto quc la de una máquina de combusti6n interna es menor de 20 por ciento.
Filamento grueso ? .< . t:.%.
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Figura 58-7. Representacion de los puentes cruzados entre los filamentos gruesos y delgados, Este diagrama es una adaptacibn de A F Huxley al de H E Huxley The mechanism af muscular contraction Sctence 1969,164:1356 Propone que la fuerza implicada en la contraccion muscular se origina en una tendencia de la cabeza de miosina (S-1) para rotar con relación al filamento delgado, la cual se transmite al filamento grueso por la porcion S-2de la molécula de miosina que adua como enlace no extensible Los puntos flexibles en cada extremo de S-2permiten la rotauon de S-1 , así como las variaciones en la separacibn entre los filamentos La presente figura se basa en la propuesta de H E. Huxley, pero tambibn incorpora elernentoselhsticos (los enrollamientosen la poruón S-2) y de disminuuon de pasos (reprecentadocen la figura como cuatro lugares de interacciónentre la porcibn S-1 y el filamento delgado Véase Huxley AF, Simmonc RM. Praposed mechanism of force generation in striated muscle Nature [Lond] 1971;233.533) La fuerza del enlace de los sitios de adhesibn es mayor en la pocicrbn 2 que en la 1 y mayor en la posicibn 3 que en la 2. La cabeza de miosina puede desprenderse de la posicibn 3 con la utiliracibnde una mol&cula de ATP; éste es el proceso dominante durante el acortamiento. Se observa que la cabeza de miosina cambia en su posicibn de cerca de 90 grados a cerca de 45 grados, como se indica en el texto (S-1, cabeza de miosina, S-2, porción de la molécula de miosina, MML, meromiosina Irgera) (Véase leyenda de la figura 58-4) (Reproducido de Huxley AF: Muscular contraction. J Phisiol 1974,243:l Con la amable autorización del autor y del Joumal of Phys~oIogy.)
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Bioquimica de Hurper
Los complejos de tropomiosina y troponina presentes en 10s filamentos efectúan a cabo funciones claves en el músculo estriado En el músculo estriado hay otras cuatro proteinas que se consideran menores en terminos de su contribucibn a la masa, pero importantes en términos de su funcion. La troporniosina es una molécula fibroca que consta de dos cadenas, alfa y beta, que se adhiere a la F-actina en el surco entre los dos polímeros (figura 58-3). La tropomiosina está presente en todos los músculos y estructuras similares. El complejo de: la troponina es exclusivo del músculo estriado y está constituido por tres proteinas separadas. La troponina T (TpT) se une a la tropomiosina así como a los otros dos componentes trop6nicos. La troponina I (Tpl) inhibe la intesacción F-actina mincina y también se une a los otros dos componentes de t;oponina. La troponina C (TpC) es una proteína fijadora de calcio que tiene estructura primaria y secundaria así como una función bastante parecida a la dc ta calmodulina, proteína ampliamente esparcida en la naturaleza. Por cada molécula de troponina C o de calmodulina, se fijan cuatro moléculas de! ion calcio, y ambas moldculas proteinicas tienen una masa molecular de 17 kDa.
El Ca2+tiene una función esencial en la regulación de la contracción muscular La conmccibn muscular de todos los origenes se produce por el mecanismo general que se acaba de explicar. Los mucculos de diferentes organismos y de las distintas ctlulas y tejidos dentro del mismo organismo, pueden tener diferentes mecanismos moleculares que se ocupen de regular su contracción y su relajación. En todos los sistemas, el ion CaZ'tiene una función reguladora de la contracción muscular: uno basado en la actina y otro en la miosina.
La regulación basada en la actina tiene lugar en el músculo estriado Esta regulacibn se presenta en los músculos esqueleticos y cardiaco de los vertebrados, ambos estriados. En el mecanismo general anres descrito (figura 58-6), el unico factor potencialmente limitante en el ciclo de la contracci6n muscular podría ser el ATP. El sistema muscular esquelético esta inhibido en reposo y es desinhibido para la contraccidn activa. El inhibidor del musculo estriado es el sistema de la troponina, el cual se une a la tropomiosina y a la F-actina en el filamento delgado (figura 58-3). En el músculo estriado, no hay control de la contraccion, amenos que
(Cupitdo 58)
los sistemas troporniosina-troponina estén presentes junto con los filamentos de actina y rniosina. Como se indicó, la tropomiosina yace a 10 largo del surco de la E-actina y los tres componentes de la troponina -TpT, Tpl y 'FpC- cssan unidos al complejo F-actina troporniosina. La TpI impide la fijacidn de la cabeza de rniosina a su sitio de adherencia en la F-actina ya sea por alterar la conformación de ksta con aquda de las moléculas de troporn iosina, o simplemente por cnrollamiento de la tropomiosina en una posición que bloquea directamente las sitios en la F-actina a los cuales se adhieren las cabezas de miosina. Cualquiera de las formas impide la aceleración de la ATPasa de la miosina que es mediada por la fijación de la cabeza de rniosina a la F-actina. Por tanto. el sistema TpI blaquea el ciclo de la contracción en el paso 2 de la figura 5 8 4 . Esto da r a z ~ ndel estado inhibido del mUsculo estriado rela,jado.
El retículo sarcoplasmico regula las concentraciones intracelulares de CaZ4en el músculo esquelético En el sarcoplasma del musculo en reposo, la concentracibn de Ca2+es de 1 a lo4 moW. El estado de reposo se alcanza debido a que el Ca2' se bombea hacia el retículo sarcoplAsmico a travks de la acci6n de un sistema de transporte activo denominado Caz' ATPasa (figura 58-81 lo que inicia la relajación. El retículo sarcoplásmico es una red de sacos de membrana fina; en su interior. el Ca2' se fiia a una ~ r o t e i n aespecífica fijadora de ci2+ llamada &lsecueskina. El sakórnero esta rodeado por una membrana excitable (el sistema del túbulo T) compuesto de conductos transversos (T) estrechamente relacionados con el retículo sarcoplasmico. Cuando el sarcolema se excita por un impulso nervioso, la sefial se transmite hacia el sistema del túbulo T y el conducto liberador dc Caz', localizado cerca del retículo sarcopI~smicodentro del sarcoolasrna. La concentración de Caz' en éste se eleva Pronto a lo-' mol/L. Los sitios de fijación de Caz' en la TpC del filamento delgado son rápidamente ocupados por este ion. El complejo TpC*4Ca2' interactúa con la TpF y la TpT para alterar su relación con la tropomiosina. En c~nsecuencia,la tropomiosina simpIemente se retira de su lugar o modifica la confomaci~n de la F-actina permitiendo que el ADP y P, de las cabezas de miosina (figura 5 8 6 ) interacthen con la F-actina para iniciar el ciclo de la contracción. El conducto liberador del Ca2' se conoce también como el receptor de rianodina (RYR). Hay dos icoformas de este receptor, RYRl y RYR2; el primero está presente en el músculo esquelético y el segundo, en el musculo cardiaco y encefalo. La rianodina es un alcaloide vegetal que se une a RYRl y RYR2 de
Músculo
Túbulo T Sarmlema dihidropindina Calsecuestrina h
Cisterna
Figura 58-8. Diagrama de las relaciones entre el csrcolerna (membrana plasrnAtica), un tubulo T y dos cisternas del retículo sarcoptasmico del músculo esquelético (no están a escala) El túbulo T se extiende hacia el interior desde eE sarcolema Una onda de despolartzact6n, iniciada por un impulso nervioso, se transmite desde el sarmlema hacia abajo del túbulo T Luego se transfiere al conducto liberador del ca2* (receptor de rianodina), quizá por interacción entre éste y el receptor de dihidropiridina (conducto de voltaje lento del ca2+), el cual se encuentra en proximidad estrecha. La salida de ca2+por su conducto hacia el citosol inicia la contracción A continuacidn, el catión es bombeado de regreso a las cisternas del reticulo carcoplasmrco por la ca2* ATPasa (bomba del ca2+)y alli se almacena, en parte unido a calsecuestrina.
manera especifica y modula sus actividades. E1 conducto liberador del Ca2+es un homoteúamero constituido por cuatro subunidades de 565 kDa. Tiene secuencias transrnembrana en su terminal carboxilo y es probable que tsstas formen el conducto para Caz-. El resro de la proteina se proyecta en el citosol, formando un puente que salva el espacio entre el retículo sarcoplasmico y la membrana tubular transversa. El paso del conducto es accionado por Caz+y ATP que actúan de modo sinkrgico in vitro, aunque la manera en que operan in vivo no está clara. En la figura 58-9 se muestra una secuencia posible de fenbmenos que conducen a la apertura del conducto. Este se ubica muy próximo al receptor para dihidropiridina (conductos del Caz+Ientos) del sistema tubular transverso (figura 5 8 4 ) ; es posible que las dos proteínas se acoplen. La relajación tiene lugar cuando: 1) el Caz+del m o l k debido a su sarcoplasrna baja a menos de secuestro en el reticulo sarcoplásmico por la caz" ATPasa; 2) la TpCa4Ca2+pierde su Ca2'; 3) la troponina, por medio de su interaccibn con latropomiosina,
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inhibe ulteriormente la relacibn entre la cabeza de miosina y la F-actina, y 4) en presencia de ATP. la cabeza de miosina se desprende de la F-actfna para inducir la selajacion. Así. el Caz' controla la contracción muscular por un mecanismo alostCrico mediado en el músculo por TpC. TpI, TpT, troporniosina y F-actina. El decremento en la concentraci6n de ATP en el sarcoplasma (por ejemplo, por el uso excesivo durante el ciclo de contracci6n-relajación o por sintesis escasa, como podria ocurrir en la isquemia) tiene dos efectos principales: 1) La Ca2' A'I'Pasa (bomba de calcio) en el retículo sarcoplasrnico cesa de conscrvar Ia concentración baja sarcoplásrnica de Ca2'. Por tanto se promueve la interacción de las cabezas de miosina con la F-actina. 2) La separacion dependiente de ATP de las cabezas de miosina de la F-actina, no puede tener lugar y se presenta la rigidez. (contracción). El rigor rnortis, que sigue a la muerte, es una extensibn de estos procesos. La contracción muscular es u n equilibrio dinñmico delicada de adhesibn y separacion de las cabezas de miosina a la F-actina. El sistema esth su-jeto a una regulación fina por medio del sistema nervioso.
Las mutaciones en el gen que codifica al conducto liberador del Ca2+son una de las causas de la hipertermia maligna humana Algunas personas con predisposicibn gendtica experimentan una reacción grave, llamada hipertermia maligna, en la exposicion a ciertos anestksicos (como el halotano) y a relajantes despolarizantes del músculo esguelktico (por ejemplo, la succinifcolina). La reacci6n consiste de manera primaria en rigidez de los músculos esgueIéticos, hipermetabolismo y fiebre alta. Una concentraci6n elevada de Caz+en el músculo esquelético es factor importante de su causalidad. A menos que la
Despolarizacibndel nervio
1 Despolarizaciondel músculo esqueletico
1 Despolarizacibnde la membrana tubular transversal
1 Movimiento de carga del conducto de voltaje lento del caz+(el receptor para dihidropiridina) de la membrana tubulsr transversal
J Apertura del conducto liberador del caz+
Figura 58-9. Cadena de sueecos posibles que llevan a la apertura del conducto liberador del ca2'.
hipertermia maligna se reconozca y trate de inmediato, el paciente puede morir de manera súbita por fibrilación ventricular o sobrevive para sucumbir después por otras complicaciones graves. El tratamiento apropiado es suspender el anestésico y administrar el medicamento dantroleno por vía intravenosa. El dantroleno (un derivado de hidantoina) es un relajante muscular cuya acci6n consiste en inhibir la liberacion de Ca2' del tetículo sarcoplásrnico al citosol, lo cual tireviene el incremento cíiosolico de este c a t i ~ n ob, servado en la hipertermia maligna. Esta enfermedad tambidn se presenta en el cerdo. Los hornocigotos animales susceptibles para hiperterm ía maligna, responden a la tensión con una reacción mortal (sindrome de tensi6n porcino) semejante a lamostrada por el ser humano. Si la reaccibn tiene lugar inmediatamente antes de sacrificar al animal, su calidad es afectada de manera adversa dando un producto inferior. Tanto la muerte intempestiva como la reacción previa al sacrificio pueden ocasionar grandes pérdidas financieras en la industria del cerdo. El ha1lazgo de una concentración citosolica elevada de Ca2' en el músculo en la hipertermia maligna sugiri6 que el trastorno podna ser causada por anormalidades de la bomba de Caz' o de su conducto liberador. No se han encontrado alteraciones de la primera, pero Ea secuenciaci6n de los cDNA para la proteina del conducto liberador ha dado pistas, en particuIar en el cerdo. Todos los CONA de cerdos con la enfermedad examinados hasta ahora, han mostrado una sustituci6n de T para C1843, que causa el cambio de Cis por Arghi5en el conducto liberador de Caz+.La mutación afecta a ta funcidn del conducto, de modo que se abre con m6s facilidad y permanece abierto más tiempo; et resultado total es la salida masiva de Cazal citosol. con el efecto último de una contracción muscular sostenida. En el ser humano, el cuadro es m6s complejo, dado que la hipertermia maligna muestra considerable heterogeneidad genética. Los miembros de cierto número de familias con el padecimiento, no tienen nexo genetico del gen RYRI . Se sabe que algunas personas susce~tiblesa esta enfermedad muestran la misma mutación que se produce en el cerdo. Sin embargo, es probable que otros individuos padezcan mutaciones en loci diferentes del gen RYRl y, algunos mas, podrian tener mutaciones en genes para otras proteinas expresadas en el músculo y que intervienen en otros aspectos del metabolismo del Caz+o de procesos medabblicos muy relacionados. La figura 58-1 0 resume la cadena probable de fenbmenos en la hipertermia maligna. La promesa principal de estos descubrimientos es que, una vez que se hayan identificado mutaciones adicionales, seráposible detectar, usando probadores DNA apropiados, a individuos en riesgo de desarrollar hipertermia maligna durante la anestesia. Las pruebas
actuales de identificación de personas susceptibles (por ejemplo, la prueba rn vitro de cafeina-halotano) son relativamente poco confiables. Luego, los individuos afectados podrían recibir otros anest6sicos que no sean un peligro para sus vidas. Tambien deberá ser posible. si se desea, eliminar la enfermedad de las poblaciones de cerdo mediante prkticas adecuadas de celeccion de razas.
LA TITINA ES LA PROTE~NAMÁS LARGA QUE SE CONOCE Y JUNTO CON OTRAS PROTE~NAS ACCESORIAS ES IMPORTANTE EN LA ESTRUCTURA Y FUNCIÓN MUSCULARES Varias proteínas accesorias desernpefian diversas funciones en la estructura y funcidn musculares (cuadro 58-1). La titina forma un sistema de tercer filamento, quizá para permitir al muscuIo,que regrese a su forma original despues de estirarse. Este llega de la línea Z a la línea M en un soio filamento que mide cerca de 1 mrn de longitud. Parte de la mol&culase traslapa a la banda A (donde se traslapan la actina y la miosina) y parte, a la banda Y (sobre todo actina). La titina es la proteina más larga que se conoce, la isoforma cardiaca humana incluye 26 926 aminoácidos con una masa molecular de 2993 kDa. Más de 90% de esta masa se construyecon una estmcturarepetitiva de 244 copias de 100residuos repetidos. Estas repeticiones constan de 112 dominios semejantes a inmunoglobulinas y de 132 semejantes a tibronectina (similar a FN-3). Al parecer, la titina estli implicada en el ensamble del músculo y actúa como modelo para la insercibn de otras proteínas accesorias de la banda A. La fosforilacibn de residuos de Ser específicos localizados en los extremos opuestos de la
Mutaciones en el gen para RYRl (o quizB en genes para otras proteinas que intervienen en ciertos aspectos del metabolismo musailar) &
Proteína (RYRI) del conducto liberador del calcio anormal (por ejemplo, sustitucibn de Cis por~rg''?
1 El conducto mutado se abre mn mayor facilidad y errnanece ab~erto rn6s tiempo, con lo cual el utosol se inunda de CaF+
J La elevada uincentraciónde~a~+intracelular estimula la contracadn muscular sostenida (rigidez); además. activa la degradación de glucbgeno, la gluc~lisisy el metabolismo aerobio (conduciendo a una producci6n excesiva de calor)
Figura 58-10. Esquema sirnplifimdo de la causa de la hipertemia maligna.
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Cuadro 58-1. Algunas protefnas musculara
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titina, pueden ayudar a controlar su insercion correcta durante la miogenesis. La titina también participa en la regulación de la tensión en repoco. Una regi6n central contiene repeticiones PEVK (Pro. Glu, Val, Lis) y los dominios de las inmunoglobulinas en tándem, los cuales pueden actuar en paralelo, como do series de resortes. En apoyo a la funcibn de la regibn de las PEVK en la detemiinación del relajamiento, se encuenm que mide 163 aminohcidos de largo en el musculo cardiaco contraeraldo y cerca de 2000 aminohcidos en el tejido muscular m& el&im. Mediante laseparación diferencial se pueden generar isofomas de titina; ksias, con longitudes variables de las zonas elkticas, puedenexplicar la diversidad en la longitud de los sarcómeros de los miisculos estriados de los vertebrados y las variaciones en la tensión en reposo. La nebulina es otra proteína gigante que se extiende desde la línea Z junto con un filamento de actina, quizá para el control de la longitud y delgadez de éste. En gran parte se constituye de unidades repetidas de 35 aminoácidos que conforman los dominios de enlace de la actina. Asimismo, la alfa actina desempefia una función importante en el múscula mediante el anclaje de la actina a las líneas Z (discos 2). Otra proteína accesoria relevante es la desmina, un filamento intermedio (vbase despuks}. Estos filamentos unen lado a lado las miofibrillals y participan en su adhesibn a la superficie celular. Otra proteína que participa en la adhesi6n al plasmalema es la distrofina, cuyas mutaciones en su gen son las causas fundamentales de la distrofia muscular de Duchenne (caso No. 6, capltulo 65).
EL MÚSCULO CARDIACO ES SIMILAR AL MUSCULO ESQUELÉTICO EN NUMEROSOS ASPECTOS El cuadro general de la contracción muscular en el corazbn es semejante al del músculo esquel6tico. Igual que éste, el músculo cardiaco es estriado y usa el sistema actina-miosina-tropomiosina descrito antes; por el contrario, el musculo cardiaco exhibe ritmicidad intrinseca y cada miocito se comunica con los demás debido a su naturaleza sincitial. El sistema tubular T está mhs desarsollado en el músculo cardiaco, en tanto que el retícnlo sarcoplásmico es menos extenso y, en consecuencia, el suministro intracelular de Caz' para la concentracibn es menor. De este modo, el mfisculo cardiaco se apoya en el Caz+ extracelular para la contracci6n. Si se priva de Ca2' al rnlisculo cardiaco aislado, cesa de latir aproximadamente en un minuto, en tanto que el esqueletico puede continuarcontrayendose sin una fuente extracelular del catión. El AMP cíclico tiene una funciiin más importante en el músculo cardiaco que en el esquelktico. Modula la concentracibn intraceluIar del Caz' mediante la activación de las proteinas cinasas; estas enzimas fosforilan varias proteínas de transporte en el sarcolema y el retículo endoplásm ico y tambien en el complejo regulador troponina-tropomiosina, lo cual afecta la concentracibn intracelular de Ca" 0 las respuestas a ésta. Hay una correlación de analogia entre la fosforilación de TpI y el aumento en la contracción rniorcárdica inducida por las catecotaminas. Esto puede expiicar Ios efectos inotrópicos (incremento de la contractilidad) de los compuestos beta adrenhgicos sobre el cosazbn. El cuadro 58-2 resume algunas diferencias enwe los músculos esquel&tico,cardiaco y liso.
El Caz+ingresa al miocito a través de los conductos del Ca2+y lo abandona por la vía del intercambiador Na+-Caz+ y la Ca2+ATPasa Como se describe antes, el Caz' extracelular decempeña una función importante en la contraccibn del músculo cardiaco pero no en el esquelktico. Esto significa que el CaZ+entray sale de1rniocito de manera regulada. Se describen brevemente tres proteinas transmembrana que tienen funciones en este proceso.
A. Conductos del caz* El Caz- ingresa a los miocitos a travks de estos conductos que permiten el ingreso de s61o iones Ca2'. La principal entrada es el tipo L (corriente de larga duracion, conductancia larga) o conductos de calcio lentos que tienen compuertas de voltaje que se abren durante la despolarizaciiin, inducida por la dispersibn
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Cart:ce oei sistcma ac troponina: usa CIjbeza de miosina regulatlora :aldesmona es iina proteína regulaora iniuurtiante iclo lento de los puentes crufatlos e m i t e prolongar la i:ontraccihr 1 y *;1;70.1 os ATP mnn
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A
RS. reticulo sarcopl kmico; LEC, liquido extracelular
del potencial de acción cardiaco y se cierran cuando dect ina este potencial. Estos conductos equivalen a los receptores de dihidropiridina del músculo esguelktico (figura 58-81, Los conductos del Ca2' lentos se regulan por proteina cinasas dependientes de cAMP (estimulantes) y por proteina cinasac de cGMP (inhibidores); se bloquean con los denominados bloqueadores de los conductos del calcio (como el verapamil). Los conductos del Caz' rfipidos (o T, transizorios} tarnbikn es& presentes en el plasmalema, aunque en numero mucho menor; es probable que contribuyan a la fase inicial de aumento del Caz' mioplfismico. El aumento resultante en el Ca" en el mioptasma actúa sobre el conducto de salida del Ca" del reticulo sarcoplásmico para abrirlo. Esto se denomina liberacibn de ca2' inducida por Caz' (CJCR, del inglés, Cd+-inducedCd' release). Se estima que casi 10% del Caz' que participa en la contracci6n, ingresa el citosol desde el liquido extracelular y 90% desde el retículo sarcoplismico. Sin embargo, el primer porcentaje es importante ya que la velocidad de aumento del Ca2+en el miopfasma es importante y la entrada por la vía de los conductos del Caz' contribuye de manera apreciable a esto.
B. Intercambiador ca2+-h(a+ Es la principal vía de salida del Ca2+del miocito. En los miocitos en reposo contribuye a mantener una concentracibn baja de Ca2*libre intracelular mediante
el intercambio de un caz' por tres N i . La energía para el movimiento ascendente del gradiente del Ca" proviene del movimiento descendente del gradiente del Nadcl plasma hacia el interior de lacélula. Este intercambio contribuye al relajamiento, pero puede efectuarse en sentido inverso durante la excitación. En virtud del intercambiador Ca2'-N$, cualquier cosa que aumente también incrernenta de modo el Na' intracelular va',) secundario el Caz', y produce una contraccidn m6s poderosa. Esto se designa como efecto inotrbpico positivo. Un ejemplo es eE empleo del famaco digital para tratar la insuficiencia cardiaca. El fármaco inhibe la Na'-K+ ATPasa, lo que disminuye la salida de Na' e incrementa el Na',; 10 cual, a su vez, eleva el Caz' por la via del intercambiador Caz'-Na'. El aumento del Ca2+,resulta en aumento en la fuerza de la contraccidn cardiaca, benefica en la insuficiencia.
C. ca2+A TPasa Esta bomba de Ca2+situada en el sarcolema también contribuye a la salida de cal', aunque se cree que desernpefia una funcibn relativamente menor comparada con el intercambiador Caz--Na+. Debe hacerse notar que en la mayor parte de las c&lulasexisten varios conductos iónicos (capitulo 43) para Na', K', Caz', etcétera. Muchos de ellos han sido clonados en afios recientes y se ha trabajado sobre sus dicposiciones en las respectivas membranas (numero de veces que cada uno cruza su membrana, locali-
zacihn del sitio real de transporte de ioncs en la proteína, etcktera). Se pueden clsificar del modo indicado en el cuadro 58-3. El musculo cardiaco es rico en conductos iónicos y también son importantes en el músculo esquelé~ico.Sc observa que las mutaciones en los genes que codifican estos conductos ocasi~nan un número relativamente pequefio de afecciones raras del músculo, tales como la parálisis periódica tiiperpotasémica (conductos del sodio), la miotomía congénita (un conducto del cloro, el CIC-I), y la parálisis peribdica hipopotaskrnica (el receptor de dihidropiridina).
Las rniocardiopatias hereditarias se deben a trastornos del metabolismo de la energía cardiaca o a proteínas miocárdicas anormales Una rniocardiopatia es cualquier anormalidad estructural o funcional del miocardio ventricular debido a una causa heredada. Existen tipos de miocardiopatias no hereditarias, pero no se describen aqui. Como se observa en el cuadro 5 8 4 , las causas de las miocardiopatias hereditarias se ordenan en dos grandes clases: 1) trastornos del metabolismo de la energia cardiaca, que reflejan principalmente mutaciones en los genes que ceditican enzimas o proteinas participantes en la oxidaciún de los Iicidos graos (la principal fuente de energia para el miocardio) y la fosforilaci6n oxidativa; y 2) mutaciones en los genes que codifican las protelnas que participan o tienen efccios en la contracción del rniocardio, tales como miosina, tropomiosina, troponina y distrofina. Las mutaciones en los genes que codifican estas uItirnas proteinas causan rniocardiopatia hipertriifica familiar, la que se presenta a continuación.
Cuadro 58-3. Princinales tipos de conductos r que se e ncuentrain-en las ci
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CuatIro 5 8 4 . Causas bioquirnic de m iiocardiopatías hereditarias
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Errores innatos de la oxidación de iicidns girases i r de las ck. Quc afectan el ingresr Iiilas y rnitocondria Que afectan ciertas enzimas d e la oxidacibn de acicios istornos de la fosfor ilación oxiidrtivri miltocondrial 3ruteinas cedificadas por gcnes Irnitocondri ales '>..4*:-nn.> * . 4 : c * , , A - ~
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do interna
La cardiomiopatía hipertr6fica familiar es una de las enfermedades cardiacas hereditarias mfis frecucntcs. Los pacientes muestran hipertrofia (a menudo masiva) de uno o de ambos ventriculos, de comienzo temprano en la vida y no relacionada con causa cxtrinscca alguna, como la hipertensión. Gran parte de los casos son hansrnitidos de manera dominante aiitosómica; el resto es esporhdico. Hasta hace poco, su causa no se había definido. El principio de la comprensión rnolecular de la enfermedad surgió en 1989 cuando se encontrb el nexo genktico del trastorno con un polimorfismo en el bram l a g o del cromosoma 14 en una familiaafectada, mediante el uso de un conjunto de marcadores RFLP. Estudios previos habían mostrado que dos genes que codifican las isoformas alfa y beta de las cadenas pesadas de la miosina cardiaca estaban situados en tándem cerca del sitio del polimofismo, indicando así que eran gcnes candidatos. En el músculo ventricular humano predomina la isofonna beta. Investigaciones subsiguientes revelaron que la causa probable de la cardiomiopatia hipertrhfica familiar estudiada era una mutaci6n sin sentido (es decir. la sustitucion de un aminoficido por otro) en el gen de la cadena pesada de la beta miosina. Estudios adicionates indican un cierto numero de mutacioncs sin sentido en el gen, todas
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impucria c do cxtcrna
Las mutaciones en el gen de la cadena pesada de la beta miosina cardiaca causan cardiomiopatia hipertrófica familiar
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N Fngl J Med 1994;3309 1 mutaciuncs (como la5 mutaciones de punro o. en HIgiinOS sos. dclccinnes) en los gm e s (iiuclea res o rnitow ndrialcs) que tdifican diversa< protein:S, enzimas ri mol~culrisdc R N A son F causas fuiidamentales de las miot:artliopiiiias hereditarrai. pueden rer parte de un sindrome que afccta otros ejemplo, MELAS. capítulo M).
r
(Capítulo 58)
codificadas por residuos altamente conservados. AIgunos individuos exhiben otras mutaciones, como la fomacion de un gen híbrido para cadena pesada de alfa o beta rniosina. Las personas con la enfermedad pueden mostrar gran variación en su cuadro clinico. Esto refleja en parte la heterogeneidad genPtica; es decir, que la mutación en algunos otros genes también puede causar e! padecimiento. Adernh, las mutaciones en sitios diferentes del gen para la cadena pesada de la beta miosina puede afectar la función de la proteína en mayor o menor grado. Las mutaciones sin sentido se agrupan en la región de la cabeza o de la cabeza del bastón de la cadena pesada de miosina. Una hiphtesis es que los polipéptidos mutantes ("polipéptidos venenosos") son causa de la formacilin de miofibrillas anormales, con el resultado final de una hipertrofia compensatoria. Como dato interesante, ninguna de las mutaciones afecta los tres dominios funcionales principales de la proteína (actividad de ATPasa, fijaci~n a actina y unión de la cadena ligera), qui7A debido a que éstas podrían ser mortales. Algunas mutaciones alreran ta carga del aminoacido (por ejemplo, sustitucion de arginina por glutamina), lo cual es probable que afecte la conformaciiin de la proteína en un grado más importante y, por ende, su funci6n. Los pacientes con estas mutaciones tienen una expectativa de vida mhs corta que aqrikllos cuya mutación no modifica la carga. Por tanto, es probable que la definición de las mutaciones precisas invoIucradas en la generacibn de CHF demuestre tener un valor pronbstico decisivo. Esta definición puede lograrse mediante el uso apropiado de la reaccion de lapolimerasa de la cadena sobre el DNA genómico obtenido de una muestra de linfocitos sanguineos. La figura 58-1 1 es un esquema simplificado de los procesos que causan cardiomiopatia hipertrófica familiar.
Mutaciones sin sentido. que predominan en el gen de la cadena pesada de p-miosina del cromocoma 14
1 Cadenas polipeptidicas rnutantes ("poirpeptidos venenosos") quemnducen a la formacibn de rniofibriiias defectuosas
1 Hipertrofia compensatoria de uno o los dos ventrículos cardiacos
El Caz+regula también la contracción del músculo liso Aunque los miisculos contienen actina, miosina y tropomiosina, únicamente los m ~ s c u l o sestriados de los vertebrados contienen el sistema de la tropina. De ahí que el mecanismo que regula Ia contraccibn debe diferir en varios sistemas de contracci6n. Los músciilos lisos tienen estruczuras moleculares muy semejantes a los del músculo estriado, pero los sarcbmeros no estBn alineados de la manera en que estiin los de la apariencia estriada. Los musculos lisos contienen mol&culasde alfaactina y tropomiosina, como el músculo esquelético. No tienen el sistema de troponina y las cadenas ligeras de las moléculas de miosina difieren de las de la miosina del músculo estriado. No obstante, al igual queen elm~sculoestriado, la contracción del músculo liso es regulada por el Caz+.
La fosforilacidn de las cadenas p ligeras de miosina inicia la contracción del músculo liso Cuando la miosina del rnuscule liso se une a Iñ E-actina en ausencia de amas proteínas musculares como la troporniosina, no se detecta actividad de la ATPasa. Esta ausencia de ATPasa hace bastante diferente la situaciiin en relaci6n a la descrita para la miosina y la F-actina del musculo estriado que tienen una abundante actividad de ATPasa. La miosina de! músculo liso contiene una cadena ligera (cadena ligera p) que impide la fijación de la c a k m de rniosina a la F-actina. La cadena ligera p debe ser fosforiIada antes de permitir a la F-actina que active a la miosina ATPasa. La actividad que se obtiene de ATPasa hidroliza el ATP alrededor de 10 veces mis lenta que la actividad correspondiente en el músculo esquelttico. El fosfato de la miosina de la cadena ligera puede quelarse con el Caz' fijado al complejo tropomiosina TpC-acrina, lo cual incrementa la velocidad de la formacion de puentes ~ miosina y actina. La fosfocruzados entre las c a b e 7 de rilación de la cadena ligera p inicia el ciclo de la contracción de adherencia y separación del rnusculo liso.
1 Cadiomegalia y varios signos y sintomas wrdiaws. que incluye rn'uerte súbita
Figura 58-11. Esquema simplificado de la causas de la mrocardiopatía hipertrbfica familiar debida a mutaciones en los genes que codifican la cadena pesada de p-mrosina. Las mutaciones en tos genes que codrfican otras proteínas, como son la troponina, la tropamiosina y la distrofina también pueden causar este trastorno
La miosina cinasa de cadena ligera es activada por la catrnodulina*4Ca2* y fosforila la cadena p ligera En el sarcoplasrna del músculo liso, existe una cinasa de la cadena ligera de miosina. La actividad de la cinasa de la cadena ligera de miosina depende del
1
C
rnoltt Ca2+ 1
calcio. La activacilin de la cinasa de la cadena ligera de miosina por el calcio, requiere la fijación de calmodulina~4Cs2+ a una subunidad de la cinasa de 105 000 de PM (figura 58-12). La cinaca de la cadena ligera activada por calmodulina*4Ca2' fosforila la cadena ligera p, la cual entonces cesa de inhibir la interacción miosina-f-actina. El ciclo de contracción comienza entonces.
Miosincinasa (inactiva)
rnoFlL ca2'
t
El músculo liso se relaja cuando la concentración de Ca2+disminuye por abajo de 1 molar Cadena Lp de la miosina (inhibe la interaccibn miosina-actina)
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HPO4-Cadena Lp de la rniosina (no inhibe la interaccibn miosinaactina)
b
H,PO,-
m
Figura 59-12. Regulacidn de la contraccibn del músculo liso por el Ca '. (Adaptada de Adelctein RS, Eisenberg R: Regulation and kinetics of actin-myosin ATP interaction.Annu Rev Biochem 1980,49.921.)
-5. Intcracciones a -...-.
--- -
La relajacihn del músculo liso ocurre cuando: 1) el Caz+del carcoplacrna baja de menos de lo-' rnokZ. El ion calcio se desprende de la calmodulina, la cual a su vez se separa de la cinasa de la cadena ligera de miosina, 2 ) inactivando a la cinasa, 3) ningún focfato nuevo se adhiere a la cadena ligera p y la cadena ligera proteina fosfatasa, la cual continuamente es activa e independiente del calcio, elimina los grupos focfato existentes en la cadena ligera p, 4) entonces, la cadena ligera p de miosina desfosforilada inhibe la fijación de las cahe;ías de miosina a Ia actina F v !a actividad de la ATPasa, 5) la cabeza de rniosina se 5epara de la F-actina en presencia de ATP, pero no puede adherirse nuevamente debido a la presencia de cadenas ligeras p desfosforiladas; por ende, la relajacibn se produce. El cuadro 58-5 resume y compara la regulacibn de las interacciones entre actina y miosina (activación de la miosina ATPasa) en los músculos estriado y liso.
isina en e l mBsculc1 estriado ymdmiúsculo li! . .. . .- . .. . . -
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Miosi Tropc Interaccibn í:cponthea de F-actinr miosina sola (activa,ción espon de-miosfn a ATPaqa 17or la F-aci Inhi bidor de la interaccihn 1:-actina Siqtema de la troponina ( miosina (inhibidor de ATPasa que dependr Contraccrón actlvada V I " Efccto dircct-.u ULLC'-2+ L a ,mpo 4Ca2 --E al- unido ri proteína ornplejo TI inhi biciún de Ir .A
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:n los rnúscuIos ectriados y en lus lisos
La cadena ligera de miosina no e5 afectada o activada directamente por el cAMP. Sin embargo. la proteina cinasa activada por cAMP habitual (capitulo 44) puede fosforilar a la cinasa de la cadena ligera de miosina (no a la cadena ligera p misma). La cinasa fosforilada, de la cadena ligera de miosina, muestra una menor afinidad por la caImodulína Ca2', bastante significativa, y por consiguiente es menos sensible a la activación. De acuerdo con esto, un incremento en el cAMP amortigua la respuesta contrhctil del músculo liso para una elevación dada del Caz- sarcoplásmico. Este mecanismo molecular puede explicar el efecto relajante de la estimulación beta adrenérgica sobre el músculo lisa. Otra proteina que al parecer tiene una función dependientede Ca" en la replacihn de Ea conbacci6n del músculo liso es Ea llamada caldesmona (87 kDa). Esta proteina es ubicua en el músculo liso y tambikn se encuentra en el tejido no muscular. A bajas concentraciones de Cal', se une a la tropomiosina y a la actina. Esto evita interacciones de la actina con Ia miosi ia y mantiene el rnuscuEo en estado relajado. A concentraciones de Caz+mayores, la calmodulina del Caz+enlata la caldesmona y la libera de la actina con 10 que esta es libre para unirse a la miosina y puede producirse la contracción. Lacaldesmona también experimenta fosforilación-desfosforilacion; cuando se fosforila no puede enlazar acrina, liberfindola de nuevo para interactuar con la miosina. Caldesmona puede participar tambikn en la organización de la estructura del aparato contrhcril en el músculo liso. Muchos de sus efectos se han demostrado in virro y su significado fisiológico esta aún bajo investigación.
E! óxido nitrico relaja el músculo liso de los vasos sanguíneos y también tiene otras funciones importantes La acetilcolina es un vasodilatador que relaja al múscuIo liso de los vasos sanguineos. Sin embargo, no actúa de manera directa sobre el músculo liso. Una observación fundamental fue que, si se retiraban las células endoteliales de las células del músculo liso subyacentes, la acetilcolina ya no podía ejercer sus efectos vasodilatadorec. Este hallazgo indica que los vasodilatadores como la acetilcolina interactúan al principio, con las celulas del cndotelio de los vasos sanguíneos pequeños, a travds de receptores. Los receptores están vinculados al ciclo de ta fosfoinositida (capitulo 44) y conducen a la liberacion intracelular de Ca". mediante la accihn del trifosfato de inositol. A su vez, el aumento del Ca2+,lleva a la liberacion de factor relajante derivado del endotelio [EDRF) que se difunde
al interior del músculo liso adyacente. Allí el EDRF reacciona con la porcion hem de una guanilil ciclasa, lo cual resuIta en la activación muscular, con el consecuente aumento de las concentraciones intracelulares de cGMP (figura 58-13). A su vez, esto estimula las actividades de ciertas proteinas cinasas dependientes de cGMP, las que probablemente fosforilan proteínas musculares específicas y producen relajamiento; sin embargo, los detalles no están claros. La nitroglicerina, un imponante vasodilatador de la arteria coronaria de amplia utilizacibn para aliviar la angina de pecho, actúa al incrementar la liberación intracelular de EDRF y por tanto, de cGMP. De modo inesperado, se encontró que el LDRF es el gas &ido nitrica (ON) que se forma por la acción de la enzima citosóIica ON sintasa. El Cal' activa las variantes endotelial y neurona1 de la ON sintasa
Trinitrato de glicerilo
I
Acetilcolina I
I
Nitrato ---m
I
NO + citrulina
Nitnto
- - .t
Guanilato
cGMP
proteinacinasas
Relajacibn
C ~ L U L AMUSCULAR LISA
1
Figura 58-13. Diagrama que muestra la forrnacibn en una dlula endotelial de dxido nitrico (ON) a partir de arginina en una reaccibn cataltzada por ON sintasa E$ probable que la interaccion de un agonista (por ejemplo, acetilwlrna) con un receptor (R). conduzca a liberación intracelular de caz+por media del trifosfato de inositol generado por la vía del fosfoinosítido, conduciendo a activacibn de la ON sintasa A mntinuacion, el bxido nitrico difunde al músculo Iiso adyacente, donde dirige la activacian de la guanilil ciclasa, la formacibn de cGMP, la estimulacibn de cGMP-proteina cinasa y por última la relalacidn Se muestra al vasodilatador trintrato de glicerilo entrando a la célula del rnusculo Iiso, donde su metabolismo también conduce a la formacibn de ON
(cuadro 58-61, El sustrato es arginina y los productos citnilina y ON:
1O
N X
Arginina A Citrulina + ON
las localizaciones cromosómicas de sus genes en los seres humanos. Se han realizado experimentos de genes nocaut mediante recombinación homóloga (capitulo 42) en cada una de las tres isofomas, lo cual ayudo a establecer algunas de las funciones del ON aronuectas. En resumen la investigacibn en el decenio pasado muestra que el ON tiene una funcibn importante en muchos procesos fisiol6gicos y patolbgicos. A
La ON sintasa cataliza la oxidacibn con cinco electrones de un nitrhgeno de la amidina de la arginina. La 1.-hidroxiarginina es un intermedioque permanece fuertemente unido a la enzima. La ON sintasa es una enzima muy compleja que utiliza cinco cofactores redox: NADPH, FAD, FMN, hem y tetrahidrobiopterina. El ON tambien se puede formar del nitrito, derivado de vasodilatadores tales como el gliceriltrinitrato durante su metabolismo. Tiene una vida media muy corta(aproximadarnente de 3 a 4 segundos) en los tejidos porque reacciona con el oxigeno y el superoxido. El producto de la reaccihn Con este Ultimo es el peroxinitrito (ON00-1 que se descompone para formar el radical OH; que es a l m e n t e reactivo. La hemoglobina y otras protefnas hem inhiben al ON al enlazarse Fuertemente con él. En la actualidad, se dispone de inhibidores químicos de la ON sintasa que pueden reducir considerablemente la formación de ON. La administración de tales inhibidores a animales y seres humanos lleva a la vasoconstriccibn y a un aumento considerable de la presion arterial, 10 que indica que el ON es de gran importancia en el mantenimiento de esta última, rn vivo. Otro efecto cardiovascular importante es que, al aumentar la cintesis de cGMP, actúa como inhibidor de la agregacion plaquetaria (capitulo 59). Desde el descubrimiento de la función del ON como vasodilatador, existe un gran inteds experimental en esta sustancia. Se ha establecido que tiene diversas funciones fisioló~icasen prácticamente todos los teiidos del cuerpo (cuairo 58-?). Asimismo, están ideñti ficadas tres isofomas principales de la ON sintasa, cada una de las cuales se ha clonado y se han determinado
.
VARIOS MECANISMOS REABASTECEN LAS RESERVAS DE ATP EN EL MUSCULO El ATP requerido como fuente energetica constante para el ciclo contraccidn-relajacibn muscular puede producirse: 1) por glucólisis, que usa glucosa sanguínea o gluc6geno muscular, 2) por fosforilación oxidativa, 3) a partir de fosfato de creatina y 4) de dos moleculas de A D P en la reaccibn catalizada por adenilil cinasa (figura 58-1 4). La cantidad de ATP en el rnusculo esqueletico solo es suficiente para proporcionar energia para la contracción por un segundo o dos, de modo que el ATP debe ser renovado de una o más de las fuentes anteriores, dependiendo de la situación metah62ica. Como se vera adelante, hay por lo menos dos tipos distintos de fibrac en el múscula esqueletico, unas que son activas de modo predominante en condiciones aerobias y las o t m en condiciones waerobias; como puede esperarse, usan cada una de las fuentcs cnergkticas anteriores en grados diferentes.
músculo esquelético contiene abundante resewa de glucógeno El sarcoplasma del músculo esquelético contiene grandes reservas de glucdgeno localizadas en granu-
Cuadro 5 8 4 . Resumen de la nomenclatura-de las ON sintasas y de los efectos-.de-genes nocaut en el rat0n* -. S
I
esultrdo dle los gene
Coirnentarios
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enosis pili la apoplejia, La activid depend . .. .,lad . . . e del aumeinto del Ca . 1 les identif ic6 primero en las neuronns. Activada compondrniento sexual agresivo (marnns 1 por calmoldul ina -d a cicrti3s tipos ( iyor susci ente del aumento del i:a2+. Abur hrrihn en rnacrbf,,,,R U n C la presibn arterial promedio ' Su actividad deoende del aumento del Ca >
1
* {iuiiprauu ur .iriyuct
identificó primero en las cClulas endotelia 31d'
NOendnthelial NO Nature 1995.377.196.
n. neumnal: i, inducihle: e, enduteti. se canicterizan corno neuronalr:S, :Los genes nocaut se apIicaron mediante recombiii x i b n homt: 1 4 ~~ 1 n s e n!¡mas r -. inducibles (macrhfagos) y endoteliales en virtudI dc que tale: iitios en que se idcntific:von por prirnera vez. biin embargo, 1a5 --A--iicuii~riai 3 tres se encuentran en otros lugares !rd crix.iiii4 imiivirii ~3 r i i u u ~ i b lCada ~ cnzfma se ha, ?l-..,.A- ...u localizaci~,,,., I n c .,,es 1"
humanos se ha determinado. 5 lONS es independinte del Caz+perc
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(Capítulo 58)
822 Rioquimica de Harper
adrenalina, a su vez, activa la glucogenólisis en el rnusculo. El AMP producido por degradaci~ndel ADP durante el ejercicio muscular, también puede activar la fosforilasa b sin causar fosforilaci~n.La glucógeno fosforilasa b del músculo esth inactiva en la enfermedad de McArdle, una de las enfermedades por almacenamiento de gluchgeno (capítulo 20).
Cuadro 58-7. Algunas funciones fisiolúgicas y participaciones patológicas del 6xido nitrica (ON)
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I de la presiOn Vasodilat ador, impo arteria1 d .. - nenean Participa en ia ereccinn r * Neurotransmisor en el cerebro y en el sistcma ncrvic130 autónomo periféricc1 a leirgo plazo FunciOn en la poteni:iación . .. . Función en la neurotoxicidad El bajo nivel de ON se implica en las causas del pilorospasmo en Ia estenosis pi Iórica hipertrúfica inrantil Puede tener alguna firnciún en el rel-iamiento del múscui
i
En condiciones aerobias, el músculo genera ATP por fosforilación oxidatíva
lo esquelético stema inmi Puedc coinstituir pai ~rimitivn Inhibe la adhesibn, la ~ L L Ivaciuii ..1"in n g i L g e L i v i i pequt--
-
nnr*r
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los pr6ximos a las bandas 1. La liberacibn de glucosa del gluc6geno depende de una glucogeno fosforilasa muscular especffíca (capítulo 20), la cual puede ser activada por Caz-, adrenalina y AMP. Para generar glucosa 6-fosfato para la glucolisis en el músculo esquelktico, la glucógeno fosforilasa b debe ser activada hasta fosforilasa a. Este proceso requiere la fosforilación de la fosforilasa b por la enzima fosforilasa b cinasa (capitulo 20). El La" promueve la activación de la fosforilasa b cinasa, también por fosforilacibn. Asi, el Ca'.' no s61o activa la contracción muscular sino que, ademhs, activa una vía para proporcionar la fuente necesaria de energía. La hormona
La sintesis de ATP por medio de la fosforilacibn oxidativa requiere del suministro de oxigeno. Loc músculos que tienen demandas altas de oxigeno como consecuencia de una contracci6n sostenida (por ejemplo, para conservar la postura) tienen la capacidad de almacenar oxígeno en la mioglobina (capitulo 7 ) . Debido a su fracción hémica, los músculos que contienen rnioglobina son rojos, en tanto que aquellos con mioglobina escasa o sin ella son blancos. La glucosa, derivada de la glucosa sanguínea o del glucógeno endbgeno, y los ácidos gtasos derivados de los triacilgliceroles del tejido adiposo, son los sustratos principales usados para el metabolismo aerobio en el músculo.
El fosfato de creatina constituye la principal reserva de energia en el mijsculo El fosfato de creatina previene el rapido agotamiento de ATP al proporcionar fosfatos de alta energía, dis-
+I
Fosfato de creatina
Glucb$sno muscular
1
-
\
-. .. MUSCULAR
c .
1 \
Creatina
Glucosa-6-P
OXIDATIVA
ADP + Pi
Figura 58-14. Las múltiples fuentes de ATP en el muscula.
pon jbles con rapidez, los cuales pueden ser utilizados para regenerar ATP a partir de ADP. El fosfato de creatina se forma a partir de ATP y creatina (figura 58-14) en el momento que el músculo esta relajado y la demanda de ATP no es muy grande. La enzima que cataliza la fosforilación de la creatina es la creatina fosfocinasa (CK), una enzima especifica muscular con utilidad clínica en la detección de enfermedades musculares agudas o cr6nicas.
La adenilil cinasa interconvierte los mono, di y trifosfatos de adenosina La adenilil cinasa calaliza la formaci6n de una molécula de ATP y una de AMP a partir de dos moléculas de ATP. Esta reacción (figura 58-14) se acopla con la hidriilisis de ATP por la miosina ATPasa durante la contmcciiin muscular. El AMP producido antes puede ser desaminado por la AMP desaminasa, formando IMP y amoniaco:
Asi, el músculo es una fuente de amoniaco (producido tarnbikn en la reacci6n catalizada por adenosina desaminasa, descrita después) que es eliminado por el ciclo de la urea en el higado (capitulo 31). El AMP tarnbien puede ser degradado poruna 5'-nucleotidasa, que hidroliza al fosfato y produce adenosina: AMP + HzO
-+ Adenosina + PI
La adenosina actúa como un vasodilatador, incrementando el flujo sanguineo y el suministro de nutrientes al músculo. A su vez, [a adenosina es un sustrato para la adenosina desaminasa, con produccibn de inosina y amoniaco: Adenosina + HzO
+ Adenosina + NHi
El AMP, P;y NH, formados en varias de las reacciones anteriores activan la fosfofmctocinasa- l (PFK-1 ), incrementando asf la velocidad de la glucblisis en el músculo en ejercicio rapido, como durante una carrera de velocidad.
rápida}. Para simplificar, se consideraran sólo dos tipos: tipo 1 (contraccibn oxidativa lenta) y tipo 11 (contracción glucolitica rapida) (cuadro 58-8). Las fibras tipo I son rojas debido a que contienen mioglobina y rnitocondrias; su metabolismo es aerobio y mantienen contracciones relativamente sostenidas. Las fibras tipo 11, que carecen de mioglobina y contienen pocas mitocondrias, son blancas: obtienen su energia de glucólisis anaerobia y la duraciiin de sus contracciones es relativamente corta. La proporcihn de estos dos tipos de fibras varía entre: los músculos corporales, dependiendo de su funcibn (por ejemplo si eI músculo interviene o no en contracción sostenida, como mantener la postura). La proporcibn varia también con el entrenamiento; por ejemplo, el nuntero de fibras tipo I en ciertos músculos de las piernas aumenta en atletas entrenados para maratones, en tanto que el número de fibra? tipo 11 es mayor en relocistas.
Un velocista usa fosfato de creatina y glucólisis anaerobia para generar ATP, en tanto que un corredor de maratón emplea la fosforilación oxidativa En vista de la existencia de dos tipos de fibras en el músculo esquelético y de las diversas fuentes energéticas descritas antes, ec interesante comparar su intervención en un velocista (por ejemplo, 100 metros} y en el maratonista (alrededor de 42 kil6meti.o~) {cuadro 58-9). Las fuentes principales de energía en el velocista son el fosfato de creatina (los primeros 4 a 5 cegundos) y luego glucblisis anaesobia, que usa glucogeno muscular como fuente de glucosa. Los dos sitios principales de control metabólico están en la glucógeno fosforilasa y en PFK-l. Como se expuso antes, la primera es activada por Ca2"1ikrado del reticulo sacroplásmico durante la contraccibn }, adrenalina y AMP. La PW- I es activada por AMP, Pi y NI?,. Atestiguando la eficiencia de estos procesos, la velocidad de la glucolisis puede aumentar hasta 1000 veces durante una carrera corta.
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EL MUSCULO ESQUEL~TICO CONTIENE FIBRAS DE CONTRACCIQN LENTA (ROJAS) Y RAPIDA (BLANCAS) En el músculo esquelitico se han identificado diferentes tipos de fibras. Una clasificación las subdivide en tipo 1 (contraccibn lenta), tipo IIA jcontracción
oxidativa rhpida) y tipo 1IB (contracción glucolitica
-S. ~aracteristicasde las fibrms tipo5 y 11 del múscitlo esqueleticO
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824 * Bioquimicu de Harper
Cuadro 58-9. Tipos de fibras musculares y fuentes t i s principiales osadas por un veiocista y uni maratoriistá .
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glucosa1 derivada d e l s n n la glucas;i sanguíne;a Y glucógerlo muscular, me- los ácidos gra!;os Iibrcs tabolizatla por glucblisis .. anacrobi no muscii lar se El giucogeno muscular se n rapidez i o -.. n,sume con lentitud
Por el contrario, en el maratón, el metabolismo aerobio es la fuente energética principal de ATP. Loc principales combustibles son glucosa sanguinea y los hcidos grasos libres, que derivan en gran parte de la degradación de triacilgliceroles del tejido adiposo, la cual e5 estimulada por la adrenalina. El glucogeno hepático cs degradado para conservar la concentracihn de glucosa.sanguinea. El glucógeno muscular es tambien una fuente de combustible, pero se degrada de manera mucho más gradual que en una carrera corta. Se ha calculado que las cantidades de glucosa en la sangre, de glucógeno en el higado y el músculo, así como de triaci lgl icerol en el tejido adiposo, son suficientes para surtir al músculo de energia en un maratón durante 4, 18,70 y, aproximadamente, 4000 minutos, respectivamente. Sin embargo, la velocidad de oxidaci6n de hcidos g a s o s por et músculo es más lenta que la de la glucosa, de modo que en e! maratón, la oxidacibn de ambos, glucosa y de ácidos grasos, es la principal fiiente de energía.
La fatiga muscular, la carga de carbohidratos, la carga de bicarbonato y la práctica ilegal de transfusión previa tienen explicaciones bioquímicas La fatiga muscular durante el ejercicio es un fenomeno que casi todos los seres humanos han experimentado. ¿CuBl es su causa? La razón primaria es la acurnulacion en el tejido muscular, no de lactato (generado en la glucOlisis anaerobia) sino mas bien de protones. Este hecho se ha demostrado por inyección de lactato y la observación de que no siempre sobreviene la fatiga. El aumento de protones (disminución del pH) puede afectar la funcihn del musculo de diversas maneras,
incluyendo las siguientes; 1) abatimiento de V,,, de PFK-1, 2) reducción de la liberación de Ca7' del retículo sarcoplacmico, 3) reducción de la actividad de Za actomiosina ATPasa, 4) qui& afectando la confomacibn de laq pmteinas musculares que intervienen en la contraccibn. La carga de carbohidratos (conocida m b i e n como "despojamiento de glucogeno" y "descarga-carga") ha sido popular entre corredores de distancias largas. El objetivo es rellenar los músculos con la cantidad máxima posible de gIucbgeno antes de una carrera. Una manera probable de lograrlo es ingerir una cantidad muy pequefia de carbohidratos en la dieta durante tres días, reduciendo aún mas las reservas de glucógeno con una carrera hasta el agotamiento, para luego, ingerir una alimentación muy rica en carbohidratos los tres días anteriores a la competencia. Otra estrategia es la carga de bicarbonato, consiste en la ingestión de bicarbonato de sodio en un intento por amortiguar la generación de protanes durante el ejercicio. Es p o probable que tengaefecto en el "sprint" dado que la rnayoria de los protones producidos en esa situacidn permanecen en el múscrilo. Sin embargo, puede significar cierto beneficio en e! corredor de 800 m, dado que los protones pueden pasar del musculo a ta sangre durante el recorrido. A t parecer seria de escaso beneficio mi corredores de distancias largas, que utilizan de manera predominante el metabolismo aerobio, con menor produccibn de lactato y protones. La técnica de uso ilegal de transfusión (dopaje) consiste en administrar transfiisionec de sus propios eritrocitoc a los atletasjusto antes de una competencia; la sangre (aproximadamente 1 L) se extrae alrededor de cinco semanas antes de una competencia y se preserva congelada. Existen algunas pruebas de que puede ser benkfico para corredores de grandes distancias, !o cual sugiere que el rendimiento está limitado por la disponibilidad de oxígeno.
EL MÚSCULO ESQUELÉTICO CONSTITUYE LA MAYOR RESERVA PRO'FE~NICADEL CUERPO En el ser humano, la proteína del músculo esquel~ticoes la principal fuente no grasa de energia almacenada. Esto explica las pérdidas tan grandes de masa muscular, particularmente en los adultos, que resultan de una prolongada desnutrición calórica. El estudio de la degradacibn protelnica de los tejidos in vivo es difícil, debido a que los aminoácidos liberados durante la degradación intracelular de las proteinac, pueden ser extensamente reutiliados para la sintesis de proteínas dentro de la dlula, o transponados a otros 6rganos donde entran a las vias anab6licas. Sin
Músculo
embargo, la actina y la miosina son metiladas despuds de la síntesis de sus enlaces peptidicos, lo que produce 3-metilhistidina. Durante la degradacidn intracelular de actina y miosina, se libera 3-metilhistidina la cual se excreta en la orina. La excrecion urinaria del aminohcido metilado proporciona un índice confiable de la velocidad de degadación de proteína miofibrilar en la musculatura de los seres humanos. El músculo esquelético degrada en forma activa ciertos aminoácidos y también sintetiza otros de manera continua. En los mamíferos, el músculo parece ser el sitio primario del catabolisrno de los aminoácidos de cadena ramificada. Oxida la leucina a CO: y convierte los esqueletos dc carbono de aspartato, asparagina, glutamato. isolcucina y valina, en intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. La capacidad de los músculos para degradar arninoácidos ramificadosaurncnta de 3 a 5 veces durante el ayuno y en la diabetes. El músculo también sinteti7a y libera grandes cantidades de alanina y de glutamina. Estos compuestos se sintetizan utilizando los grupos amino que se generan durante la degradaciiin de los aminoácidos de cadena ramificada; entonces, el nitrógeno amfnico es transferido al alfa cetoglutarato y al piruvato por transaminación. La glucólisis de la glucosa ex6gena es la fuente de casi todo el piruvato para la sintesis de alanina. Estas reacciones constituyen el llamado ciclo glucosa-alanina, en donde la alanina procedente del musculo es empleada en la gluconeogenesis hepitica, en tanto que simultáneamente se hacen llegar grupos amino al hígado para ser eliminados como urea. Las características del metabolismo del músculo se resumen en el cuadro 58-1 0.
Cuadro 58-10. Resumen de las características alesdelabioquimicadelm' ' L :o relacio nadas coin su meta -
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Las cdlulas no musculares efectiian trabajo mecánico, a
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La proteólisis del músculo durmite la inanicion suministra aminoicidos para 1a gluconeolgtnesis , .. Los principales aminoacioos que emanan del músculo son la alanina (destin ada en su tnayor partle a la gluctIneogenesis hephtica y que forma parte del ci clo glucos;1alanina) y la glutarninri (destinad;3 en gran p arte al inte:jtino y el riÍion)
Las células no musculares contienen
que en todas, las cklulas del cuerpo. En presencia de
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actina que forma microfilamentos La G-actina se encuentra en la mayor parte, si no es
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inuscuio ~ S ~ U C I C I I Crunciona O tanlo en siruaciiineí ierobias (rt:poso} corrIU en anaer obias (por cjcrnplo, c;8I-rcra de vcl ocidad), pr,r tanto opt:ra la gluccilisis aerobia v. anaerobii1, dependiendo dc las condiciont :S -. , . . .., t i musculo esquelético contiene mioglvbinacomo rescrvorio de oxígcno El músculo esqueltticc1 contiene tipos difercntes de fibr:a .- -.. - - - A : - : - - adecuadas cn forma vi"iiiidr ia n ~ i i r i u i ~ i c i i driHeIuiiiaF ic~ 1'fibras de camhio ráp ido) o aerl bias (tibr; io 1'ento) En relaciór I a la contrzicción. sus elementos 1. . tes son actina. miosina, rropomlosina, el complejo rroponina (TpT. l'pl y TpC). A'I'P ! Ca2+ATPasa,la bomba de Ca2'y 3tcínas qtic intcnicnen en dikersos aspectos del metabulisrno del Ca24 en el n1úsculo La insuIina incremenita la capta ucosa por I:I músciiIo esqueleitico DespuCs d e la ingeaLIlll1 ub (IIIIIILLIIV3i I C T ~ ~ U Csc ~ ~ tlcupa en sinteti~arglucbgcno, que actua corno un rcservorio de glucosa para usarse cn cl ejercicio; algunos atletas de distancias largas ingieren una "precarga" de glui:osa para aumentar suIS reservas dc glucogc:no La adrcnali.na cstiiniil.a la glucog enblisis en mUscuIa e.$(quclCtico, .cn tanto q ue el gluc cipenti no, debido a la . ac . sus recepr nrr9 ausencia .---E1 rnúscuto esqiicli.tic o no pucde contribuir en forma di!Teta a la gl ucosa san€:ulnea dehi do a que carece de gluL:osa h-ros[atwa -. . . .. LI iactalo prodiicrdo por el metabolismo anaerobio en el miisculo esqu~ldticopNasa al híga do. que lo Iusa para sir1teiizar glucova, la cualI puede retcirnar lucgc al miisciilo (ciclo de Clori) El rniisculo esqueIkticl3 contiene fosfocreatina, que actiia como reserva de ener gia para demandas por un breve lapso (segundos) -----Los ficidos griuuh piasmáticos son una fuente mavor de t particular Ien compett 1) ! iiin prolong;ada . . . burante ia inanicibn, el musculo esqueiético puede utiliiar cuerpos cctonicos 1El rni4sculo1 esqueldtico es el sitici principal del metabc>I ismo d e aniinokcidos de cadena rarnilicad; el cual lc)S CI
LOS CITOESQUELETOS EFECTÚAN FUNCIONES CELULARES MÚLTIPLES incluyendo autopropulsidn, rnorfogdnesis, division, endocitosis, exocitosis, transporte inbzceluIar y cambios de forma. Estas funciones celulares son ejecutadas por una extensa red intracelular de estructuras filamentosas que constituyen el citoesqueleto. El citoplasma celular no es un saco con liquido, como se considerd. En esencia, todas la c6Iulas eucariotas contienen tres tipos de estructuras filamentosas: filamentos de actina (7 a 9.5 nm de diámetro), microtúbulos (25 nrn) y filamentos intermedios (10 a 12 nm). Cada uno de estos tipos pueden distinguirse por su bioquimica y en el microscopio electrbnico.
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* E5te cuadro rerine material de varios capítulos de c:ste libro.
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Bioquimica de Harper
adecuadas concentraciones de magnesio y de cloruro de potasio, esta actina se polimerizara espontineamente para formar filamentos dihelicoidales de F-actina corno los obsevados en el mhsculo. Existen, cuando menos, dos tipos de actina en las células no musculares: beta actina y gamma actina. Ambos pueden coexistir en la misma c6lula y probablemente aun copolimerizar en elmismo filamento. Enel citoplasmacelular, laactina forma microfilamentos de 7 a 9.5 nm que con frecuenciaexisten en forma de manojos de redes de apariencia enmarafiada; &tos destacan justamente en posición subyacente a la membrana plasmática de las celulas en reposo y se les conoce como fibras de tensih. Estas fibras desaparecen cuando la movilidad celular aumenta o en la transfomación maligna de Ea celula por compuestos químicos o por virus oncdgenos. Aunque no se organizan como en el musculo, los filamentos de actina en las c6lulas no musculares interactiian con la miosina para dar lugar al movimiento celular.
Los microtubulos contienen alfa y beta tubulinas Los microtubulos, un componente integral del citoesqueleto, consiste en tubos citopIásmicos de 25 nm de diámetro y, con frecuencia, de longitud extrema. Son necesarios para la formación del huso mitótico, por lo cual existen en todas las células eucariotas. Se ocupan tembikn del movimiento intracelular de vesiculas endocitbticas y exocitbticas. Forman el principal componente estmctural de cilios y flagelos. Asimismo, son un componente proteinico importante de axones y dendritas, donde mantienen la estructura y participan en el flujo axoplásmico de material a lo largo de estos procesos neuronales. Los microtiibulos son cilindros de 13 protofilamentos arreglados en sentido longitudinal, cada uno de los cuales consta de dimeros de las proteinas estrechamente relacionadac alfa tubulina y beta tubulina; cada una tiene una masa molecular de 50 kDa aproximadamente. Los dimeros de la tubulina se ensamblan en protofilamentos, después en hojas y luego en cilindros. Un centro organizador del microtlibulo, localizado alrededor de un par de centriolos, nuclea el desarrollo de nuevos microt~bulos.La garnma tubulina es una tercera variedad de tubulina que parece desernpefiar una finción importante en este ensamble, para el cual se requiere GTP. Diversas proteinas se vinculan con los microhíbulos (proteinas relacionadas con rnicrotúbulos [MAP], una de las cuales es tau) y desernperian funciones importantes de ensamble y ectabilizaci6n. Los rnicrotubulos se encuentran en una cituacion de inestabilidad dinámica, en constante ensamble y desensamble; muestran polaridad (terminales positivas y
(Capítuio 38)
negativas) lo que es importante en su crecimiento a partir de los centriolos y en su capacidad para dirigir los movimientos intracelulares. Por ejemplo, en el transportt axonal la proteína cinesina que tiene actividad ATPaca similar a la miosina, utiliza la hidrof isis del ATP para mover vesículas bajo el axón hacia la terminal positiva de la formación microtubular. La energía para el flujo de materiales en la direccion opuesta, hacia la terminal negativa, la proporciona la dineina citosblica, otra proteina con actividad de ATPasa. De manera similar, las dinefnas axonbmicas potencian los movimientos ciliares y flagelares. Otra proteína. la dinamina, utiliza GTP y participa en la endocitosis. Las cinesinas, dineinas, dinamina y miosinas se conocen como motores moleculares. La ausencia de dineina en los cilios y flagelos provoca su inmovilidad y lleva a la esterilidad masculina y a la infecci~nrespiratoria crdnica, la cual se conoce como sindrome de Kariagener. Ciertos f h a c o s se fijan a los microtúbulos, por lo que interfieren con su ensamble y desensamble. En elfos se incluye la colchicina (utilizada para el tratamiento de la artritis gotosa aguda), la vinblastina (un alcaloide de la Vinca que se usa para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer), el paclitaxel (Taxol, eficaz contra el chncer ovhrico) y la griseofulvina (un antimicbtico).
Los filamentos intermedios difieren de los rnicrofilamentos y los tnicrotúbuloc Existe un sistema fibrosis intracelular de filamentos con una periodicidad axiat de 2 1 nm y un dihmetro de 8 a 10 nm, el cual es intermedio entre el de microfilamenlos (6 nm) y microtúbulos (23 nm). Como se indica en el cuadro 58-1 1, se encuentran cuatro clases de filamentos intermedios; todos son moléculas elongadas y fibrosac con un dominio de rodi tlo central, una cabeza de terminal amino y una cola de terminal carboxilo. Forman una estructura semejante a una soga y los filamentos maduros se componen de tetthmeros empacados juntos de manera helicoidal. Son componentes estructurales importantes de las cdlulas; además, lamayor parte fama parte relativamenteestable del citoesqueleto. Por otro lado, no estin sujetos a ensamble y desensamble rápidos y no desaparecen durante Ea mitosis, como ocurre con la actina y muchos filamentos microtubulares. Una excepcirin importante en este aspecto, son las larnininas, que se desensamblan en la mitosis decpuis de la fosforilación y reaparecen cuando tsta termina. Las queratinas constituyen una gran familia en la que se distinguen cerca de 30 miembros. Como se muestra en el cuadro 58-1 1 , hay dos tipos principales de queratinas; todas las queratinas individuales son
Músculo 82 7
heterodimeros constituidos por un miembro de cada clase. Las vimentinas. estan ampliamente distribuidas en las células rnesod~micac;tanto la desmina, una proteína glial &ida fíbrilar, como la periferina se relacionan con ellas. Todos los miembros de la familia similar a vimentina pueden copolimerizar entre sí. Las filamentos intermedios son muy abundantes en las células nerviosas; por su parte, los neurofilamentos se clasifican en bajo, medio o alto, de acuerdo a su masa molecular. Las laminas forman una malla en aposicion a la membrana nuclear interior. La distribución de Ios filamentos intermedios en las células normales y anormales (como en las cancerosas) se puede estudiar mediante técnicas de inmunofluorescencia con anticuerpos de las especificidades apropiadas. Estos anticuerpos a filamentos intermedios específicos tarnbitn pueden utilizarse por los patblogos para decidir el origen de ciertos tumores malignos diferenciados, los que pueden retener todavía el tipo de filamentos intermedios que se encontraban en sus cilulas de origen. Se ha encontrado que tres enfermedades de la piel (epidennólisis bulosa simple, hiperqueratosis epidermolitica y queratoderrna epidemolitico palmoplantar) caracterizadas por ampollas, las cuales se deben a mutaciones de genes que codifican varias queratinas. Es probable que las ampollas reflejen una disminucibn de la capacidad de varias capas de la piel para resistir el esfuerzo mecánico, debido a las anormalidades en la estructura de los filamentos.
RESUMEN Las miofibrillas de! músculo esquelético contienen filamentos gruesos y delgados. Los primeros est8n
-
fonnados de miosina, en tanto que los delgados contienen actina, tropomiosina y el complejo troponina (troponinas T, i C). La actina se une a la miosina. mientras que la tropomiosina se enlaza con laactina; por su parte, la troponina T se fija a la tropomiosina; de las demis tro~oninas:la tro~onina1inhibe la interaccion inctina-mi'osina, y 1atroGnina c se unc al calcio, que es una pieza clave en el proceso global de la contracción. El modelo de puentes cruzados entre filamentos deslizantes es la base del pensamiento actual acerca de la contracción muscular. El fundamento del modelo consiste en que filamentos interdigitados se deslizan uno adelante del otro durante la contraccidn y que puentes cruzados entre miosina y actina generan y sostienen la tensi6n. La hidrolísis de ATP se usa para conducir el movimiento de los filamentos. El ATP se une a las cabezas de miosina y es hidroIizado hasta ADP y P, por la actividad de ATPasa del complejo actomiosina. El Ca" interviene en forma clave en la iniciación de la contracci6n muscufar al unirse a la troponina C. En el músculo esquelético, el reticulo sarcoplásmico regula la distribución de Ca2+a los sarcbmeros, en tanto que la entrada del cation a través de 30s conductos específicos en el sarcolema es de importancia mayor en los musculos cardiaco y liso. Las proteínas del reticulo sarcoplhsmico que poseen funciones especializadas en el metabolismo del Ca" incluyen a Ca2' ATPasa, calsecuestrina y conducto liberador de! Caz+.Cienos casos de hipertermia maligna humana se deben a mutaciones en el gen que codifica al conducto de liberacidn de3 Ca2+.Entre el miisculo esquelético y el cardiaco existe cierto número de diferencias; en particular, este último posee una diversidad de receptores en su superficie. Algunos casos de cardiomiopatia hipertrofica familiar son causadas por mutaciones sin sentido en el gen que codifica la beta rniosina de cadena pesada. El mucculo liso, al contrario del esquelético y el cardiaco, no contiene el sistema troponina; en su lugar, la fosforilación de las cadenas
y
r m . h l r58-11. ~ Clases de filamentos intermedios de las c&lulaseucariotas y SUS distribupinnpc -
Prati
Tipo 1 (Acidas) Tipo 11 (básicas) limilar a vi mentina \/;mnnt;.-.o " Desmina Proteína J,,,,,,,,,,
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ceiuilis epiieliaies, caneiio. un
Liiversas ctlulas mesenquirnatl Músculo CClulas g
Periferin Neurofílamentos Rajo (B), medio (hiI)y alto -(A
Láminas ARYC
* Se refiere a
1 Lamina riuclear
(Capitulo 58)
828 Bioquimica de Harper
ligeras p de miosina inicia la contracci6n. Un regulador reciCn descubierto del musculo liso vascular es el bxido nítrico. El bloqueo de su fomaci6n a partir de la arginina causa una elevacidn aguda d e la p r e s i ~ n arteria], lo cual indica que esta regulaciiin es una de sus muchas funciones. La distrofia muscular tipo Duchenne se debe a mutaciones en el gen, localizado en el cromosoma X,que codifica a la proteína distrofina. En el ser humano existen dos tipos principales de fibras musculares: blancas (anaerobias) y rojas (aerobias). Las primeras se emplean en particular durante esfuerzos cortos y las últimas en el ejercicio aerobio prolongado. En el "sprint" el miisculo usa fosfato d e
creatina y glucólicis como fuentes de energía; en el maratón, la oxidación de hcidos grasos tienen importancia máxima durante las últimas faces. Las células n o musculares realizan varios tipos de trabajo mecánico ejecutado por las estructuras que constituyen el citoesqueleto. Estas estructuras incluyen filamentos de actina (microfilamentos), microt~bulos(compuestos de manera primaria de alfa y beta tubulina) y filamentos intermedios. Los últimos i n c l u y e n queratinas, p r o t e í n a s s e m e j a n t e s a vimentina, neurofilarnentos y láminas.
REFERENCIAS Bredt DS, Snyder SH: Nitric nxide: A physiologic mcs-
senper rnolecule. Annu Rev Hiochem 1994;63:175. Cooke R: Thc actomyosln enpine. FASE0 J 1995:9:636. Fuchs E, Weber K: Intermediate filarncnts: Stnicture, dynamics, function, and disease. Annu Rcv Biachem 1994:63345. Aaffman EP,Lehmann-Horn F, Rudel R Overexcitcd or inactii7e:Ion channels in muscle disease. Cell 1995;80:681. Huxley AF: Crossbrldge tilting confirmed. Naturc 1995:375:63 1. Muxley HE: Sliding filarnents and molecular motile systcms. J Biol Chem 1990;265.8347. Labeit S, Kolmerer R: Titins: Giant proteins in chnrge of micjcle uh&-ucture and elasticily. Science 1995;270:293. Langer GA: Calcium and the htart. Exchange at thc tissuc, ccll and organelle levels. FASE13 J 1992;6:893. Loscalzo J: Nitric oxide and vascular diseme. N Engl J Med 1995:333:251. MacLennan DH, Phillips, MS: Malignant hyperthermia Science 1992;256:789. McPherson PS, Campbell W:The ryanodine receptorlca2+ release channel. J Biol Chem 1993;329:2002. Mongada S, Higgs A: '['he L-arginine nitric oxide: pathway. N Cngl J Med 1993;329.2002.
RA: What is special about smooth muscle? Thc significance of covalent crossbridge regulation. EASEB J 1994:8:31 1. Rayment Y et al.: Structure of the actin-myosin complex and its implications for muscle contraction. Science 1993;261:5&. Snyder SH: No endothelial NO. Nnture 1995;477:196. Sobue K, Sellers m Caldesmon: A novel repulatory protein in smooth muscle and nonmuscle actomyosin systems. J Biol Chem 1991:266:12115. Somlyo AP, Somlyo AV: Signal transduction and regulation in smaoth musclc. Nature 1994;372:23E . Spudich JA: How molecular motors work Natuac 1994;372:515. Walker RA, Sheetz MP: Cytoplasmic microtubule-associated motors. Annu Rcv Biochcm 1993;62:429. Worton RG, Rrooke MH: The X-linded muqcular dystrophies. In: The Aietubolicand Molecular Rases of lnheriled Disease. 7th ed. Scriver CR et al. (editors). McGraw-Hill, 3 995. Murphy
Proteínas pAasrnáticas, inrnunoalobulinas y coaqulación sanguínea w
Margaret L. Rand, PhD, * Elizabeth J. Harfenist, PhD" y Robert K. Murray, MD, PhD
La sangre es un tejido que circula dentro del sistema casi cerrado de los vasos sanguíneos. La sangre se compone de elementos sólidos, eritrocitos, leucocitos y plaquetas, suspendidosenun medio liquido, el plasma. Como se indica despuhs, la sangre y en particular el plasma, desempeñan varias funciones que son absolutamente criticas para la conservación de la salud. Una vez que la sangre se ha coagulado (cuajado), como se describe despu&s,la fase liquida remanente (el suero) carece de factores de coagiilacilin (incluyendo el fibrindgeno) que normalmente estan presentes en el plasma, pero que han sido consumidos durante el proceso de coagulación. El sumo contiene algunos p d u c t o s de la degradación de los factores de coagulaci6r1, los cuales se han formado durante el proceso y, por tanto, no cstin nonralmente presentes en el plasma.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA La funcion fundamental de la sangre en el mantenimiento de la homeostasia y la facilidad con la que pueden obtenme muestras de ella han permitido que el estudio de sus constituyentes sea uno de los pilares miis importantes en el desarrollo de la bioquímica en
* Departamento Toronío.
de Rioquímica de: la Universidad de
general y de la clínica en particular. La hemoglobina, la albúmina, las inmunoglobulinas y tos factores de la coagulación están entre las proteinas más estudiadas. En numerosas enfermedades se producen cambios notorios de diversac proteínas plasmAticas, que pueden valorarse por electroforesis. Las alteraciones en la actividad de ciertas enzimas plasmáticas se utilizan en el diagnbstico de algunos estados patol6gicos. Los trastornos hemorrhgico y trombotico pueden constituir urgencias mkdicas importantes y las trombosis en amrias coronarias y cerebrales son causas importantes de muerte en numerosas partes del miindo. El manejo racional de estas condiciones requiere una comprensión clara de las bases de coagulación sanguinea y fibrinólisis.
LA SANGRE TIENE NUMEROSAS FUNCIONES Todas las funciones de la sangre, excepto las celulares especificas como el transporte de oxígeno y la defensa inmunitaria mediada por células, son reali~adaspor el plasma y sus constituyentes. Se enumeran en el cuadro 59-1. El plasma consiste en agua, electrólitos, metabolitos, nubientes, proteínas y hormonas. La compsicibn de agua y electrólitos del plasma es la misma que la de todos Tos liquidos extracelulares. Las deteminaciones de laboratorio de los valores séricos de Na', K', Ca2+, Cl-y bi6xido de carbono asi como del pFT sanguíneo son muy importantes como auxiliares en el manejo de muchos pacientes.
Cuadro 59-1. Funciones principales de la sangre -. - -
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ación: tmn5,porte dc ox ígeno de los pulmones a los y de C(32 de los tchjidus a los pulmones L) Nutricibn: transpone ae alimentos aast3TblaOS
3) Excreci6n: transportc de desechos metsibblicos a I. mones, rifinnes. p¡el e intesti nos para si:I eliminacii .
.. . . .
4) Mantcr cn el ci
:un equilitirio acidobAsico normal
51 Regulai
ecuilibrio hit -1 , ;ni*,,,,L;csmh~ode af ua entrc el
,, ,,,,, liquido circulante 6) Regular:iiinde late inri
rln l
L t I J U& 1
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iediante lariis-
tribiiciiin del caloi 7) Uetensa contra in fcccion medlante IcuCOCiloS y anticuerpo:3 circulante:S
8) Transpo~ir; uL iiui monas y regulacibn del metabolismo iarte de mi
ilación
EL PLASMA CONTIENE UNA MEZCLA MUY COMPLEJA DE PROTE~MAS La concentración de proteina total en el plasma humano es de alrededor de 7 a 7.5 g!dL y engloba la porcibn mayor de soIidos plasmáticos. En realidad, las proteínas del plasma son una mezcla muy compleja que incluye no s61o proteinas simples, sino también proteínas conjugadas como gIucoprotcinas y varias tipos de lipoproteinas. Asimismo. el plasma humano contiene miles de moteculas de anticuerpos, aunque, por lo comun, la cantidad de uno cualquiera de estos en circunstancias normales es bastante baja. En la figura 59-1 se muestran las dimensiones y masas relativas de algunas de las proteinas plasmáticas mas importantes. La separaci61-1de las diferentes proteínas de una mezcla compleja frecuentemente se lleva a cabo utilizando diversos solventes y electrótitos (o ambos) para separar diferentes fracciones proteinicas de acuerdo con sus características de solubilidad. Esto constituye la base de tos métodos llamados de "precipitacibn salina" (salting-out), los cuales se utilizan comúnmente en la determinación de fracciones proteinicas en el laboratorio clínico. Así, se puede separar a las proteínas del plasma en tres grupos principales (fibrinógeno, albiimina y globulina) mediante el uso de distintas concentraciones de sulfato de sodio o de amonio. El método más corniin para analizar proteinas plasmáticas es la electroforesis. Existen muchos tipos de electroforesis y cada uno emplea un medio de
soporte diferente, En los laboratorios clínicos. el acctato de celulosa es uno de los soportes más populares. Su uso permite, después de tefíir, la resolución de cinco bandas de proteinas plasmaticas, designadas albiimina, fracciones al fai,alfaz,bera y gamma (figura 59-2). La tira teaida de acetato de celulosa (o de otro medio de soporte) se conoce como un electroforetograma. Las cantidades de estas cinco bandas pueden cuantificarse en forma conveniente mediante el uso de aparatos de barrido dencitomCtrico. En numerosas enfermedades se encuentran cambios característicos de una o más de estas cinco bandas.
La concentración de proteína en el plasma es importante para la distribución de líquido entre la sangre y los tejidos En las arteriolas, la presibn hidrostatica es de alrededor de 37 mm Hg con la oposicion de una presión intersticial (tejido) de I mm Hg. La presibn osmótica (presibn oncbtica) ejercida por las proteinas plasmaticas es de aproximadamente 25 rnm Hg. Por tanto, una fuerza neta de cerca de 1 1 mm Hg conduce líquido hacia afuera, al interior de los espacios intersticiales. En las vdnulas, la presión hidrostAtica es de cerca de
Escala 1O
nm Na* Ci- Glucosa
Hemoglobina
Albumrna 69 000
64 450
Fibnnogeno 340 000
Figura 59-1. Dimensionesy masas rnoleculares relativasde las moléculas proteinicas de la sangre (Oncley).
Figura 59-2. Técnica de electroforesis de zona en acetato de celulosa. A: Una pequeiia cantidad de suero o de otro llquido se aplica a la tira de acetato de celulosa. B: Se realiza la electroforesis de la muestra en una solucibn amortiguadora. C: Las bandas de las proteínas separadas se hamn visibles en su pocicibn tipica después de haber side teiiidas. D: La exploracibn de la tira de acetato de celulosa en un densitbmetro convierte las bandas a los picos caracterlsticos de albúmina, a~-globulina, az-globulina, p-globulina y y-globulina (Reproducida con autorizacibn de Stites DP, Terr Al, Parslow TG [editor$] Besic & C!rnical Immunoiogy, 8th @d.Appleton & Lange, 1994; publicado por la Editorial El Manual Moderno, MBxico.)
17 rnm Hg con la presión oncotica y la intersticial descritas antes; así, una fuerza neta de cerca de 9 mm Hg atrae agua de regrese al interior de la circulacibn. Las presiones anteriores a menudo se denominan fuerzas de Starling. Si la concentracibn de proteínas plasmáticas disminuye de manera significativa (por ejemplo, en desnutricidn proteínica grave), el liquido no es atraido de regreso al compartimiento intravascular y se acumula en los espacios tisulares extravasculares, estado que se conoce wmo edema. Este tiene numerosos origenes; la deficiencia proteínica es uno de ellos.
Las proteinas plasmáticas se han estudiado de manera extensa Debido a la facilidad relativa con que pueden obtenerse, las proteínas plasmáticas han sido muy estudiadas tanto en el ser humano como en animales. Se dispone de considerable información acerca de la biosintesis, el recambio, laestructura y las funciones de las proteinas plasmhticas importantes. TarnbiCn se han investigado las alteraciones en su concenwación y metabolismo en numerosos estados patológicoc. En afios recientes, se han determinado las estructuras y clonado muchos de Jos genes para proteínas plasm8ticas. Gran parte de las preparaciones nombradas en el cuadro 2-3 se usan en el estudia de las proteinas plasmáticas. La obtencibn de anticuerpos especificas para proteínas plasmhticas individuales ha facilitado
de modo notable su estudio, permitiendo la precipitación y aislamiento de proteinas puras de la compleja mezcla presente en los tejidos o el plasma. Aderniis, el empleo de jsétops ha hecho posible la detertninacirin de sus vías de biosintesis y sus índices de recambio en plasma. Las siguientes generalizaciones han surgido de! estudio de las proteínas plasm6ticas.
A. La mayor parfe de las proteínas plasmáticas se sintetizan en el higado Esto se ha establecido con experimentos a nivel de animal intacto (por ejemplo, hepatectomia) y con el uso de la preparacibn aislada de higado irrigado, de cortes de tejido hepático, de homogenados de higado y de sistemas de translacibn in vitro que usan preparaciones de mRNA extraido del higado. No obstante, las g a m a globulinas se sintetizan en células plasmáticas y ciertas proteinas plasmhticas se forman en otros sitios, como las células endoteliales.
B. En general, las proteínas plasmáticas se sintetizan en polirribosomas unidos a membranas Luego, recorren la via secretoria principal de la cdlula (membrana rugosa endoplásmica membrana adoplásmica lisa -+ aparato de Golgi + vesículas secretorias) antes de pasar al plasma. Por tanto,la mayor parte de las proteinas plasmhticas se sintetizan como preproteínas y, en un principio, poseen péptidos señal en el
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Bioquímica de Harper
extremo arnino terminal (capitulo 43). Por lo común, estan sujetas a varias modificaciones postraslacionrilec (proteolisis, glucosilacion, fosforilación, etcétera) conforme viajan a través de la célula. Los tiempos de transito por el hepatocito desde su sitio de síntesis hasta el plasma varian de 30 minutos a varias horas o más, según la proteína.
C. Casi todas las proteínas plasmaticas son glucoproteínas En concordancia, contienen cadenas de oligosachridos en enlaces O o N o los dos (capítulo 56). La albúmina es una excepcibn importante, pues no contiene residuos de carbohidratos. Las cadenas oligosacáridas tienen varias funciones (cuadro 56-2). Un dato importante es que la eliminacidn de residuos terminales de ácido sialico de ciertas proteínas plasmAticas (por ejemplo, la ceruloplasmina) mediante la exposición a neuraminidasa pueden acortar de manera notable sus vidas medias plasmaticas (capitulo 56).
D. Muchas de las pmteínas plasmáticas son polirnórficas El polirnorfismo es un rasgo rnendeliano o monogénico
que existe en Ea poblacibn en dos fenotipos, por lo menos, ninguno de los cuales es raro (es decir, que se observan en una frecuencia de 1 a 2% mínimo). Las sustancias de grupo sanguíneo ARO (capítulo 60) son los ejemplos mejor conocidos de polimorfismos humanos. Las proteinas plasmaticas humanas que muestran poiimarfismo incluyen a alfal-antitripsina, haptoglobulina, transferrina, ceruloplasmina e inmunoglobuIinas. A menudo, el polimorfismo de estas proteínas se reconocio por primera vez por medio del uso de electroforesis en gel de almidbn, en donde es posible que cada forma polimorfica muestre una migración tipica. Los análisis de estos polirnorfismos humanos han probado ser importantes en genética y antropología, así como en ciertos casos (por ejemplo, alfa,-antitripsina, véase despuks), de interds clínico.
E. Cada proteína plasmática tiene una vida media tipica en la circulación La vida media plasmktica de una proteína puede determinarse marcando la proteina pura aislada con rE3' en condiciones suaves, que no la desnaturalizan. Este isótopo se une por covalencia a residuos de tirosina en la proteína. La proteína marcada se lava para eliminar el F I 3 ' no unido y se determina su actividad especifica Cdpm por rng de proteina). Luego, una cantidad conocida de la proteína radiactiva se inyecta en un paciente adulto normal y se toman muestras a intervalos para determinar su radiactividad. Los valores obtenidos se grafican contra el tiempo; entonces, la vida media de la proteína (tiempo de declinacibn de la radiactividad desde su valor mhximo hasta la m i ~ dde ese valor mixirno) puede calcularse de la gráfica resultante,
{Capítulo 59)
descontando el tiempo empleado para que !a protefna inyectada se equilibre (mezcle) en la sangre y los espacios extravasculares. Las vidas medias obtenidas para albumina y haptoglobina en adultos nomales sanos son de alrededor de 20 y 5 días, respectivamente. En ciertas enfermedades, la vida media de una proteina puede alterarse de modo notable. Por ejemplo, en algunos trastornos intestinales, como en la ileitis regional (enfermedad de Crohn), cantidades muy considerables de proteinas plasmltticas, incluyendo albúmina, pueden perderse: a travks de la mucosa intestinal inflamada. Personas con este trastomo tienen una gastroenteropatia con pCrdida de proteína y la vida media de Ia albumina yodada que se inyecta en ellos puede reducirse hasta sólo un día.
F. Las concentraciones plasmaticas de ciertas protehas aumentan durante estados inflamatorios agudos o secundaríos a cíerfos tipos de Iesjón tisular Estas proteínas se designan como proteinas de fase aguda (o reactantes) e incluyen proteina C-reactiva (CRP, llamada así debido a que reacciona con el polisacárido C de los neumococos), alfa,-antitripsina, haptoglobina. glucoproteina alfal-acida y fibrinbgeno. Las elevaciones en la concentración de estas proteinas oscilan desde sólo 50% de su valor original hasta 1000 veces su valor en el caso de CRP. Aumentan también, en general, durante estados inflarnatoríos crdnicoc y en cáncer. Se considera que intervienen en la respuesta del hutsped a la inflarnacidn.Por ejemplo, la proteina C-reactiva puede estimular la via clhsica del complemento y alfa,-antitripsina puede neutralim c i e m proteasas liberadasd m t e estados de inflamacibn aguda. Trabajos recientes indican que la interleucina 1 (IL-1 ), un polipéptido liberado de c&tulasfagociticas mononucleares, es el principal, pero no el Único, activador de la síntesis de gran parte de los reactantes de fase aguda por los hepatocitos. TarnbiCn intervienen otras moleculas como IL-6, la cual, lo mismo que FL-1 al parecer actúan a nivel de la transcripción gknica. El cuadro 59-2 resume las funciones de muchas de las proteinas plasm8ticas. La sección siguiente describe información básica respecto a la albúmina, haptoglobina, la transferrina, la ceruloplasmina, la alfai-antitripsina, la alfa*-macroglobulina, las inmunogiobulinas y el sistema del complemento. Las lipoproteinas se presentaron en el capitulo 27.
La albúmina es la proteína más abundante en el plasma humano La albúmina (69 kDa) es la principal protelna del plasma humano (3.4 a 4.7 g/dL) y comprende cerca
Proteínas plasmá f icas, inmunoglobulina.~ y cnaplación sanguinea
833
de 60% de la proteína plasmáticatotal. De la albúmina corporal extracelular 40Yo esta en el plasma y 60% en plasmátic'as .los espacios extracelulares. El higado produce alrededor de 12 g de albumina por día, lo cual representa inas plasm alrededor de 25% de la sintesic proteinica hepática itiquirnotripsina total y la mitad de toda su proteína secretada. Al -Antitripsina {al-antiprotcinasa) principio, la albúmina se sintetiza como una pre-Macroglohulina proteina. Su pkptido seiial se desprende conforme pasa a las cisternas del reticulo endoplAsmico rugoso y, a continuaci011, se separa un hexapéptido del extremo coagulaci loagulació n san- Diversos fac . . arnineiterminal en tanto recom el camino secretor. La guinea : fik síntesis de albúmina se deprime en diversas enfermedades, en particular las hepáticas. El plasma de los pacientes la sangre, por ejemplo, Enzimas a coagulación, colinescon enfermedad hephticn, a menudo muestra una proporción baja de albúmina a globulinas (disminución iiaa oe lar c:Clulaso teji dos, por ejc:mde la relación a1búmina:globulina). La sintesis de io, aminotiansftrasas - albúmina se reduce pronto en estados con desnutrición proteinica, como kwashiorkor (véase caso No. 2 en el f-wiiiiuiia> capitulo 65). t imuni- Ininunoglobi:ilinas. proteínas del comLa albúmina humana madura consiste en una lemento, p2-microglohuliiia cadena polipeptidica de 585 aminokidos y contiene - . 17 enlaces disulfuro. Mediante el uso de proteasas, la Participaci 6n cn Prloteinas de respiiesta de fase agiida albúmina puede subdividirse en tres dominios, que la respuf :Sta in- (1 3or ejernp lo, protei~ na C-rcactiva, tienen funciones diversas. La fonna de la mol&cula flmiatoria (X ~telnahcicla [orosumIUcompteta es elipsoidal, 10 cual significa que no aumenta la viscosidad del plasma tanto como lo hace la moC ina (AFP) Ikcula alargada del fibrinógeno. Debido a su masa -molecular relativamente baja (alrededor de 69 kDa) y 1 iuiisvrii LG U L I I I U~-~ i b ú m i n(varios a liaandos, inclusive a su elevada concenaacibn, se considera que la album ina cc ;le prr ilinubina ;iicidos ~ t ~ irs ilibra, iones es responsable de 75 a 80% de la presión osmótica -a2+1, metr11cs [por e,icmplo, CuZT, del plasma humano. Estudios electroforéticos han n2+, metenio, estcroirIcs, otras hormostrado que el plasma de algunas personas carece de lanas y diversos ramacos rulopIasmina (que contiene CuZf; albúmina. Se dice que estos pacientes presentan analIhúmina, quiA m& impoduite en ct buminemia. Una causa de este estado es una mutación ,anspane fisiolligico del ~ i i ~ + ) que afecta a la partición. Los anatbuminém icos muestran 1 Cilobiilinn fijadorn de corticnsteroides sólo edema moderado, a pesar de la creencia de que 1) (fija cort isol) la atbumina e5 el determinante principal de la presión la (fija hcnnoglobina t osmótica del plasma. Es probable que la cantidad de ; (quilomic otras proteínas plasmAticas aumenten para compensar la falta de albúmina. Hemopcxina (fija hem) Otra función i m p o m t e de la albúminaes su capaci-e;*. Protcii~afijadbla A," UL ~ L L I I I UtIi i l a IGLIIIOI) dad para unirse a varios ligandos. Éstos incluyen , Globulina fi,jadora de hormonas.seAcidos grasos libres (AGL), calcio, ciertas hormonas xuales (fija Itcstostcrona, estradiol1 esteroideas, bilimibina y parte del triptófano plasi GlobuIinafíjridora de hlormonatir oimhtico. Ademas, la albúmina fija alrededor de 10% dea (fija T4, TA . Tsansferrina (transporta hierre) del cobre en plasma, en tanto que el resto se une a la Transtiretina (antes prcalbíimina; fija ceruloplasmina (véase despu&s). Varios rnedicamenT4 y forma un cornple.jo con la protos, incluyendo las sulfonarnidas, la penicilina G, el teína fíiadora de retino'\ dicumarol y la aspirina, se unen a la albúmina y esto tiene implicaciones farmacol6gicas importantes. Otras, pmtclnas de horrnonas circulan en la sangre. pero no x designan porto común (:omo protcltlas plasrnhti~cas. Dc manera Las preparaciones de albirnina humana se usan ., se encuentra en ei plasma en sirniinr, la ferritina tamnien en el tratamiento de choque hemorrágico y de que:riza como una pequefias cantidades. pero tampoco maduras. protelnd plamhiica
Cuadro 59-2. Algunas funciones d e las proteinas
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La haptoglobina fija hemoglobina extracorpuscular, evitando que ta hemoglobina libre penetre al riñón
de cinco días, la del complejo Hb-Hp es sólo de 90 minutos m65 o menos, ya que es retirado con rapidez del plasma por los hepatocitos. Por tanto, cuando la haptoglobina se une a la hemoglobina, es depurada del La haptoglobina (Hp) es una glucoproteinaplasm~~ica plasma a una velocidad alrededor de 80 veces mayor que la normal. En concordancia, el nivel de Hp cae que 5e une a la hemoglobina (Hh} extracorpuscular en pronto en situaciones donde Hb se esta liberando de un complejo no covalente firme (Hb-Hp). La concenmodo constante de los eritrocitos, como sucede en las tración de haptoglobina en el plasma humano varía de anemias hemoliticas. La Hp es una proteina de fase 40 a 1SO mg de capacidad fijadora de Hb por decilitro. y su concentración plasrnhtica se eleva en diaguda Alrededor de 10% de la hemoglobina que se degrada versos estados inflarnatorios. cada día es liberada a la circulación y por tanto, es extraOtras proteinas plasm61icas fijan hern, pero no corpuscular; mientra que el 90% resrante se encuentra hemoglobina. La hernopexina es una betal-globulina dentro de eritrocitos senescentes, lesionados, que son que se une a hem libre. La albumina se une a metahem degradados por el sistema histiocitario. La masa mo(hern fzrrico), para formar metahemalbúmina, que lecular de Hb es de alrededor de 65 kDa, en tanto que luego transfiere el metahem a la hemopexina. la de la forma polimórfica más simple de Hp (Hp 1- 1) encontrada en el ser humano es de alrededor de 90 kDa. La transferrina transporta el hierro Así, et complejo Hb-Hp tiene una masa molecular a los sitios donde se requiere aproximada de 155 kDa. La hemoglobina libre pasa a traves del glomérulo renal, entra a los túbulos y tiende d. Transferrina a precipitar ahí (como puede ocurrir después de una Es una betal-globulina con masa rnolecular aproxitransfusión masiva de sangre incompatible, cuando la mada de 80 kDa. Es una glucoproteína y se sintetiza capacidad de haptoglobina para fijar H b se excede en el hígado. Se han encontrado miis de 20 formas bastante) (figura 59-3). Sin embargo, el complejo polirnorficas de transferrina. Esta tiene una función Hb-Hp es demasiado grande para pasar a través del critica en el metabolismo del hierro debido a que lo glomérulo. Al parecer, la función de la Hp es impedir transporta (dos moles de Fe" por m01 de transferrina) Ia pérdida de Hb libre por el riii6n. De esta manera, se en la circulacibn hasta los sitios donde se le requiere, conserva el valioso hierro que contiene la hemoglopor ejemplo, del intestino a la médula 6sea y a otros bina que, de otro modo, saldria del cuerpo. brganos. El hierro es muy importante en el cuerpo La haptoglobina humana existe en tres formas humano, ya que forma parte de numerosas hernoproteínaq, polimórficas, conocidas como Hp 1-1, Hp 2-1 y Hp 2-2. como la hemoglobina, la rnioglobina y los citocromos. La primera emigra en la electroforesis en gel de El hierro se ingiere en la dieta y su absorción como almidón como una banda sencilla, en tanto que Hp 2- 1 Fe2' se regula de manera estricta a nive! de la mucosa y Hp 2-2 muestran bandas de patrones mas complejos. intestinal. En circunstancias normales, el cuerpo Dos genes, designados Hp' y Hp: dirigen estos tres guarda celosamente su contenido de hierro, de modo que fenotipos, siendo Hp 2- 1 el fenotipo heterocigoto. No un varón adulto sano pierde alrededor de 1 rng al día, se han establecido diferencias funcionales significatique se r e m p l m por absorci6n. Idas mujeres adultas vas entre las fomas polimbrficas de Hp. tienen mayor predisposición a trastornos por deficiencia Las concentraciones de haptoglobina en el de hierro, debido a que algunas pueden perder una plasma humano varían y tienen cierto uso diagnóstico. cantidad excesiva de sangre durante la menstruación. En pacientes con anemias hemoliticas se encuentran En el cuadro 59-3 se muestran las cantidades de hierro valores bajos de Hp. Esto se explica por el hecho de que, en la transferrina y en varios otros compartimientos mientras la vida media de la haptoglobina es de alrededor corporales.
A. Hb + Rifibn -t Se excreta en orina o precipita en tubulos, (PM 65 000)
el cuerpo pierde hierro
B. Hb + Hp + Complejo Hb Hp -+ Ainbn (PM 65 000) (PM 90 000) (PM 155 000)
J
Catabolizado por ctlulas hepáticas; el hierro se conserva y utiliza de nuevo
Figura 59-3. Destinos diferentes d e la hemoglobina libre y del ~ornplejohemoglobina-haptoglobina.
Proteínas ~lasmái
Cuadra 59-3. Distribución de hierro en un idulto de 7" Gm* Ti H, En miogiobinas y varias enzirnas
IUU rng
000 mg A bsorción . mgídia PtJrdidas . mg/dia * En una rnu,jer adulta con un peso semejante, la reservas en eeneral son menores (por ejcrnpla, 100 a 4W mg)y lar pérdidas bdrian ser mayores (por cjemplo, 1.5 a 2 rnddia). El
Cada día se catabolizan casi 200 mil millones de eritrocitos contenidos en alrededor de 20 mL de sangre, liberando cerca de 25 mg de hierro al cuerpo. El hierro libre es tóxico, pero su fijacidn a transferrina disminuye su toxicidad potencial y ademis 10 transporta a donde se requiere. En la superficie de numerosos tipos de células hay receptores para transferrina, los cuales la fijan y la internan por endocitosis (compiirese el destino de las LDL, capitulo 27). El pH icido dentro del lisosoma hace que el hierro se disocie: de la proteina (transferrina). N o obstante, al contrario del componente proteinico de LDL, apotransferrina no se degrada dentro del lisosoma. En su lugar, se conserva unida a su receptor, retorna a la mernbranapIasmática, se disocia de su receptor, entra de nuevo al plasma, capta mhs hierro y lo libera otra vez en las cklulas que lo requieran.
B. Problemas del metabolrisma del hierro La atención al metabolismo del hierro tiene importancia particular en las mujeres, por la raz6n antes descrita. Ademas, durante el embarazo deben cubrirse los requerimientos del feto en crecimiento. Las personas mayores con hibitos dieteticos deficientes ("té y tostadas") pueden desarrollar deficiencia de hierro. La anemia por deficiencia de hierro debida a la ingesti6n inadecuada, utilizacibn impropia o pCrdida excesiva del catión es uno de los trastornos más comunes en la práctica médica. La concentracibn de transferrina en el plasma es de alrededor de 300 mg/dL. Esta cantidad puede unirse a cerca de 300 pg de hierro por decilitro, que representa la capacidad total de fijacibn de hierro del plasma. Sin embargo, en condiciones nomales, la transferrina se satura solo en un tercio con hierro. Cuando hay anemia por deficiencia de hierro, la proteina está aun menos saturada con hierro, en tanto que en estados de almacenaje de exceso de hierro corporal (por ejernplo, en hemacromatosis), la saturación es mucho mayor de un tercio.
C. Ferritina Es otra proteína importante en el metabolismo del hierro. En condiciones normales almacena a[ hierre
de modo que pueda liberarse para uso cuando la situacion lo requiera. En estados de exceso de hierro (por ejemplo. hemocromatosis), su reserva corporal aumenta de manera notable y mucha mfis ferritina se encuentra en tejidos como hígado y bazo. La ferritina contiene alrededor de 23% de hierro y la apofesritina (fiaccibn proteinica libre de hierro) tiene una masa molecular aproximada de 440 kDa. La ferritina esta constituida por 24 subunidades de 18.5 kDa que rodean en forma micelar entre 3000 y 4500 átomos ferricos. En condiciones normales, el plasma contiene escasa ferritina. No obstante, en pacientes con exceso de hierro, la cantidad de ferritina plasrnfitica aumenta bastante. La concenrracibn plasmática de ferritina puede medirse por una radioinmunovaloración sensible y específica y sirve como indice adecuado de las reservas corporales de hierro. La síntesis del receptor de transferrina (TfR) y del de ferritina se vinculan recíprocamente al contenido de hierro intracelular. secuencias especificas no trasladadas del mRNA de ambas proteínas (denominados elementos de respuestas del hierro) interactúan con una proteina citosblica sensible a las variaciones en las concentraciones celulares del catibn. Cuando &as son aItas, las células utilizan el mRNA de la ferritina almacenado para sintetizar ferritina y se degrada el mRNA de la TfR. En contraste, cuando disminuyen las concentraciones de hierro, el mRNA de la TfR se estabiliza y aumenta la síntesis de los receptores, en tanto que el mRNA de la ferritina al parecer se almacena en una variante inactiva. Esto es un ejemplo importante del control de la expresi~n de proteínas en el nivel traslacional.
D. Hemosiderina Es una rnolecula que no se ha definido del todo; al parecer es una forma degradada parcial de ferritina, pero que aún contiene hierro. Puede detectarse por tinción histol6gica (por ejemplo, azul de Prusia) para hierro y de este modo verificar su presencia en los tejidos durante almacenaje excesivo.
E. Hemocromatosis primaria Éste es un trastorno genetico caracterizado por el almacenaje excesivo de hierro en los tejidos, que conduce a lesión. La causa parece ser una absorción exagerada de hierro en la mucosa intestinal, aunque se sabe p o de la natumleía molecular de la anormalidad. Los órganos mas afectados son el higado, la piel y el phncreas; personas con este trastorno por lo común desarrollan cirrocis hephtica. Además, la piel puede pigmentarse y se manifiesta diabetes sacarina (diabetes bronceada). El trastorno puede controlarse por extracciones periódicas de sangre (Rebotomías). El cuadro 5 9 4 resume las pruebas de laboratorio útiles en la valoración de pacientes con anormalidades del metabolismo del hierro.
Cuadra 59-2. Pniebas de laboratorio a valorar pacientes con tras del metabolfsmo del hierr .-
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* Cuenta e ritrocitaria y clilculo c
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Cuaiitific ación de 111icrre pIasmático. cap;lcidad de f yación totn1 de hierro y % dc saturaci6n dc transferrina Cuantific aci6n de fe:rritina e n el plasma yior radiointnunovaioración Tinciiin íle ctirtes ti: azul oc rrusia Cuaniific:ación de 1 dc hierro (pglg) en una biopsia t isular --
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La ceruloplasmina fija cobre, y los bajos valores de esta proteína plasrnática se relacionan con la enfermedad de Wilson La cemloplasmina (alrededor de 160 kDa) es una gtobulina alfal. Tiene color azul debido a su alto contenido de cobre y transporta 90% del metal presente en el plasma. Cada molécula de ~emloplasmina fija seis Iitornos de cobre con mucha firmeza, de modo que no se intercambia con facilidad. La albumina transporta el 10% restante del cobre plasmhtico, aunque fija el metal con menos fuerza que la ceruloplasmina. En consecuencia, la albúmina cede su cobre a los tejidos con más facilidad y al parecer es mhs importante que la ceruloplasmina en el transporte del cobre en el cuerpo humano. La ceruloplasmina tiene una actividad de oxidasa dependiente de cobre, pero su significado no está claro. Lacantidad de: ceruloplasmina en plasma decrece en la enfermedad hepltica. Las concentraciones disminuidas de ceruloplasmina se encuentran en particular en la enfermedad de Wilson (degeneracibn hepatolenticular) que es un padecimiento debido al metabolismo anormal del cobre. Con el propbsito de hacer más clara la dcscripcidn de la enfermedad de Wilson, se considera primero el metabolismo del cobre en el cuerpo humano y en seguida la enfermedad de Menke, otro padecimiento que implica el m e ~ b o lismo anormal del cobre.
El cobre es un cofactor para ciertas enzimas El cobre es un oligoelemento esencial. Se requiere en !a dieta ya que es el cofactor metalico de diversas enzimas (cuadro 59-5). Acepta y dona electrones y participa en reacciones que implican dismutacibn, hidroxilacibn y oxigenación. Sin embargo, el exceso de cobre puede provocar problema^ ya que oxida proteínas y lipidos, enlaza a acidos nucleicos e incrernenta
la producción de radicales libres. Por lo anterior, resulta importante disponer de mecantsmos que mantengan el cobre dentro de los limites normales. El cuerpo del aduito normal contiene cerca de 100 mg de cobre localizado, en su mayar parte, en el hueso, hígado, rifl6n y músculo. La ingestión diaria del metal es de 2 a 4 mg, aproximadamente, con absorcibn de casi 50% en el estomago y porción alta del intestino delgado; el resto se excreta en las heces. El cobre se transporta al higado unido a la albúmina, se toma por los hepatocitos y una parte se excreta en la bilis. Asimismo, abandona el higado adherido a la ceruloplasmina que se sintetiza en este Órgano.
Las concentraciones tisulares de cobre y de algunos metales se regula parcialmente por las rnetalotioneínas Las metalotioneínas son un grupo de proteinas pequeflas (cerca de 6.5 kDa) que se encuentran en el citosol de las células, en particular, las de higado, riiión e intestino que tiene un elevado contenido de cisteína y pueden fijar cobre, cinc, cadmio y mercurio. Los grupos SH de la cisteina participan en el enlace de los metales. La ingestihn aguda de cobre (por ejemplo, mediante inyección) y otros metales aumenta la cantidad (inducción) de estas proteinas en los tejidos, tal como lo hace la administración de ciertas hormonas y citocinas. Estas proteína pueden funciona como almacenes del metal en modalidades no tóxicas y participan en su metabolismo general en el cuerpo. El secuestro del cobre tambitn disminuye la cantidad de este metal disponible para generar radicales libres.
La enfermedad de Menke se debe a mutaciones en el gen de una ATPaca de tipo P fijadora de cobre La enfermedad de Menke (enfermedad del cabello torcido o acerino) es un trastorno del metabolismo del cobre ligado a X que afecta sblo a tactantes masculinos; ataca el sistema nervioso, el tejido canjuntivo y la vasculatura y, por lo general, es mortaI durante la infancia (capitulo 57). Un padecimiento similar se observó en Australia en orejas alimentadas con una
Cuadro 59-5. ~ l ~ u i enzimas as importantes ..-. ..
que c*entienencobre .
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dieta deficiente en cobre; se observ6 que el cabello de los pacientes con la enfermedad de Menke era semejante a la lana anormal de estos animales. Esto sugirió que la enferrnedad se debia a una anormalidad en el metabolismo del cobre. En 1993 se informó que la base de la enferrnedad son mutaciones en el gen de una ATPasa de tipo P fuadora de cobre. Es interesante que la enzima muestra semejanza ectructural con ciertas proieinas fijadoms de metales en los microorganismos. Se considera que esta ATPasa se encarga de la conducci6n del flujo de cobre desde las células. Cuando esta se altera por una mutacidn, el cobre no se moviliza de manera normal desde e! intestino en donde tiende a acumularse, al igual que en otras células y tejidos desde [os que no puede salir. A pesar de la acumulacicín de cobre, disminuyen las actividades de muchas enzimas dependientes del mismo, quizá por un defecto en la incorporación del metal en el interior de las apoenzimas. El higado normal expresa una cantidad muy pequeiia de ATPasa, lo cual explica la ausencia de participación hephtica en la enfermedad de Menke. Este trabajo llevo a considerar que el hígado podría contener una di ferente ATPasa fijadora de cobre, la cual fomaria parte de las causas de la enfermedad de Wilson. Tal como se describe antes, este resultó ser el caso. El cuadro 5 9 4 compara características importantes de las enfermedades de Menke y de Wilson.
La enfermedad de Wilson también se debe a mutaciones en un gen que codifica una ATPasa de tipo P fijadara de cobre La enfermedad de Wilson es una enfermedad gendtica en la que se p d u c e una falla en la excreción del cobre en la bilis, por lo que se acumula en el hígado, cerebro, rifihn y eritrocitos. Puede decirse que es la incapacidad para mantener el balance del cobre casi en cero, lo cual rcsulta en cuprotoxicosis. Al parecer el aumento del metal en los hepatocitos inhibe el enlace del cobre a la apoceruloptasmina y lleva a concentraciones bajas de ceruloplasmina en el plasma. Conforme se acumula el cobre, los pacientes pueden desarrollar anemia hemolitica, enfermedad hepática crónica (cirrosis, hepatitis) y un síndrome neurolbgico por la acumulación de cobre en Ios ganglios basales y otros centros. Un dato clinico frecuente cs el anillo de Kayser-Fleiccher que consiste en un anillo de pigmento verde o dorado alrededor de la córnea por la deposición del cobre en la mernbrana de Deccement. En el cuadro 59-7 se enumeran los principales estudios de laboratoriopamel metabolismo del cobre. Cuando se sospechaenfermedad de Wilson, debe practicarse biopsia hephtica; el diagnbstico se hace si los valores hepaticos son de 250 pg/g de peso seco junto con niveles pIasrnliticos de ceruloplasmina inferiores a 20 mg/dL.
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Cuadro 5 9 4 . Comparación de [as enfermedades de Menke y de Wilson*
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La causa de la enfermedad de Wilson tarnbiin se descubrió en 1993. Después del descubrimiento del gen causante de la enfermedad de Menke. se encontró que diversas mutaciones en un gen que codifica una ATPaca de tipo P fijadora de cobre ocasionaba este padecimiento, similar a la de Menke. Se estima que el gen codifica una proteína de 14 1 1 aminoacidos bastante hombloga al producto del gen de la enfermedad de Menke. De una manera que no se han explicado por completo, una ATPasa no funcional causa la excrecibn defectuosa del cobre en la bilis. una reduccibn de la incorporaci6n de cobre en la apoceniloplasmina, y su acurnutacion hephtica y la subsecuente en otros 6rganos como el cerebro. El tratamiento de la enfermedad de Wilson consiste en una dieta baja en cobre, junto con la administración de por vida de penicilamina, la cual es quelante del cobre y se excreta en la orina, y, por tanto, disminuye el exceso de este mineral en el cuerpo.
La deficiencia de affal-antiproteinasa (alfa,-antitripsina) acompaña al enfisema y a un tipo de enfermedad hepática La alfal-antiproteinasa (aproximadamente 52 kDa} recibió originalmente el nombre de alfai-antitripsina (alfal-AT) y es con el que se designa aquí. Es una cadena proteinica simple formada de 394 aminoacidos, contiene tres cadenas de oligosaciridos y es el principal componente (> 90%) de la fracci~nalfa, del
plasma humano. Se sintetiza por los hepatocitos y macrófagos, ademhs de ser el principal inhibidor de la serina proteasa (serina o Pi) del plasma humano. Inhibe a tripsina, elastasa y algunas otras proteasas mediante la formaci6n de complejos con ellas. Esta proteina es muy polimórfica; las rnultiples formas pueden separarse por electroforesis. EI genotipo mayor es MM y su producto fenotipico es PiM. Hay otras dos áreas de interés clinico respecto a alfa,-antitripsina. Una deficiencia de esta proteína interviene en cierias casos (alrededor de 5%) de enfisema. Esto ocurre de manera preferenteen personas con genotipo=. que sintetiza PiZ. Se secrcta una cantidad mucho menor de la proteína en cornparacibn con personas PiM. Cuando Ia cantidad de alfai-antitripsina es deficiente y los leucocitos polimorfonuclearcs se acumulan en el pulmón (por ejemplo, durante neumonía), la persona afectada carece de algo que contrarreste la lesibn proteolítica del pulmón por proteasas como elastasa (figura 5 9 4 ) . De intcrCs considerable es que una metionina particitlar (residuo 35R) de una al fa,-antitripsina se ocupe de la fijación a proteasas. Fumar oxida esta metionina a culfoxido de metionina y, por tanto, la inactiva. El resultado es que las moleculac de alfal-antitripsina alteradas ya no neiitralizan las proteasas. Esto es devastador en particular en pacientes (fenotipo PiZZ) que ya tienen de suyo concentraciones bajas de la proteina. Una disminución ulterior en alfa,-antitripsina originada por fumar incrementa la destrucci~nproteolítica de tejido pu lmonar, acelerando cl desarrollo de enfisema. Se ha propuesto la administración intravenosa de alfar-AT como auxiliar en el tratamiento de pacientes con enfisema causado por deficiencia de la proteina. Se está intentando, mediante el uso de ingenieria proteínica (capitulo 421, sustituir la metionina 358 por otro residuo que no este sujeto a oxidación. Así, el "mutante" obtenido de alfai-antitripsina podria dar la protección necesaria contra lar proteasas por un periodo mucho mas largo que la proteina original. También se intenta desarrollar una terapéutica génica pasa este trastorno. Un enfoque es el uso de un adenovirus modificado (un patogeno de las vías mspiratorias) al cual se ha insertada el gen para alfa,-antitripsina. Luego, el virus podria inmducirsc a las vlacrespiratonas (por ejemplo, con un atomizador). La esperanzaes que
A. Elastasa activa + aq-AT- Complqo elastasa inactiva.01-complejo AT 4 Sin proteblisis puimonar -i Sin dafio ?¡sular
B. Eiastasa activa + 1 o si mi-ATO + Elastasa activa + Proteblists!pulmonar -* Daño tisular
Figura 5 9 4 . Esquema que muestra ( A ) la inactivacibn normal de elastasa por ni-antitripsina y (B) situacibn donde la cantidad de al-antitripsina está reducida en forma sustancial, lo cual conduce a proteólisis por elastasas que ocasiona lesión tisular.
.as, inrniinoglohlllrnu.~y c o u ~ l a c i d nsanguínea
las células del epitelio respiratorio expresen el gen y secreten alfa,-antitripsina de modo local. Los experimentos en animales han indicado la factibilidad de este planteamiento. La deficiencia de alfal-antitripsina tarnbikn está implicada en un tipo de enfermedad hepática (enfermedad hepática por deficiencia de alfa,-antitripsina). En este trastorno, moléculas del fenotipo ZZ se acumulan en las cisternas del RE de los hepatocitos. Trabajos recientes han mostrado que la agregación se d e k a la formación de polimeros de mutantes alfa,-antitripsina. formados por medio de fuertes interacciones entre un asa especifica en una molécula y un prominente hoja plegada beta en otro (polimerizacibn de hoja en asa). Por mecanismos que no se comprenden, se presenta la hepatitis y la consiguiente cirrosis (una acurnulación masiva de cantidades de cotkgena, originando fibrosis) en el hígado, Es posible que la administración de un péptido sintético, semejante a la secuencia del asa podria inhibir la polimeri7ación del asa de la hoja. En Ea actualidad, Ia enfermedad hepatica por deficiencia grave de alfal-antitripsina puede tratarse con éxito mediante el trasplante de hígado. En el futxro, será posible la introducción del gen para alfa,antitripsina normal en los hepatocitos. La figura 59-5 e5 un esquema de la causa de esta enfermedad.
La alfa>-macroglobulina neutraliza muchas proteasas y conduce ciertas citocinas a los tejidos La alfaz-macroglobulina es una gran glucoproteina plasrnatica (720 kDa) que consta de cuatro subunidades idhnticns de 180 kDa. Su gen se localiza en el cromosorna humano 12p 12- 1 3. La alfa?-macroglobulina representa de X a 10% del total de las proteinas plasmAticas en el ser humano. Cerca de 10% del cinc plasmatico se transporta por esta proteina y el resto
Mutacibn GAG a AAG en el exbn 5 del gen para ni-AAT en el clornosorna 14 6
Causa la sustitucibn de G ~ u ~ ~ ~~ p i s o r~ a~r - eM Tn
3al-AAT se acumula en las cisternas del retlculo endoplásmiw y se agrega por polimerizac16nde hqa en asa
Conduce a hepatitis (mecanismo desconocido) y a menudo cirrosis en 10% de homocigotos ZZ
Figura 59-5. Esquema de las causas de disfuncibn hepAtica por deficiencia de al-antitripsina (ATT, al-antitripcina.)
839
por albúmina. La proteína se sintetiza por diversos tipos de células, inclusive mucocitos, hepatocitos y astrocitos. Es el miembro principal de un grupo de proteínas plasmaticas ,que incluye las proteinas C3 y C4 del complemento. Estas contienen un enlace ciclico interno único de ester ti01 (formado entre una cisteina y un residuo glutamina) y por esta razbn se les designa como la familia de proteínas plasrniticasde &ter tiol. La alfa:-macroglobulina fija r n u c h ~proteina~as,por lo que es un inhibidor d e panproteinasas importante. Los comple,iosalfat-macroglobulina-proteinasa se retiran con rapidez del plasma, mediante un receptor específico que se localiza en muchos tipos de celulas y es idéntico al receptor de la proteína relacionada con la lipoproteína de baja densidad (LRP). El LRP puede ser el gen ancestral del que evolucion6 el gen del receptor de LDL. Además la alfaz-macroglobulina fija muchas citocinas (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de pl aquetas, factor beta transformador del crecimiento, etcétera); al parecer, participa en su conducción hacia tqjidos o cklulas particulares. Una vez captadas por las celulas, las citocinas pueden disociarse de la alfaz-macroglobulina y en seguida ejerce diversos efectos sobre el crecimiento y la funcibn celulares. El enlace de proteinasas y citocinas por la alfa?-mactcroglobulina implica diferentes mecanismos que no se consideran aquí.
La amiloídosis se presenta por la deposición de fragmentos de diversas proteínas plasmaticas en los tejidos La amiloidosis es la acumulaci6n de diversas proteinas fibrilares en las cdlulas de los tejidos en tal medida que afecta su funcion. Las fibrillas. por lo general, son fragmentos proteoliticos de diversas proteínas pIacmatícas, no ramificados y que poseen una estructura de hoja beta plegada. El termino amiloidosic es equivoco ya que, al principio se consideraba que las fibrillas eran de naturaleza similar al almidón. Entre las proteinas precursoras mBs frecuentes estan las cadenas ligeras de inmunoglobulinas (vkase despues), proteina acompañante amiloide que derivade la proteina acompaiiante sérica (una glucoprozeina plasmática) y la transtiretina (cuadro 59-2). Las proteínas precursoras plasmaticas se generan ya sea por aumento de la cantidad (como las cadenas ligem de inmunoglobulinas en el mieloma múltiple o betal-rnicroglobuiina en pacientes que se mantienen bajo diálisis cronica) o por variantes mutantes (por ejemplo, de transtiretina en las neuropatlas amiloideas familiares). EE factor preciso que determina la deposición de los fragmentos proteoliticos aun no esta claro. En lar fibrillas se encuentran otras proteínas tales como la calcitonina y la proteina amiloidea beta (que no deriva de una proteina plasmatica) en la
enfermedad de Alzheimer (capítulo 64); se han determinado un total de cerca de 15 diferentes proteínas. Todas las fibrillas tienen un componente P acompafiante que proviene del componente amiloideo P del suero, el cual es una proteína placmatica en relacidn estrecha con la proteina C reactiva. Los cortes de tejido que contienen fibrillas amiloideas interactuan con el colorante rojo congo y manifiestan una birrefringencia verde impresionante cuando se observan al microscopio de luz polarizada. La deposición de amiloides tiene lugar principalmente en: 1) pacientes con proliferacibn de cdlulas B monoclonales (amiloidosis primaria); 2) pacientes con procesos inflarnatorios tales como artritis reumatoide (amiloidosis secundaria); 3 ) circunstancias hereditarias (por ejemplo, en las neuropatias que se describen antes); 4) pacientes que se mantienen bajo diálisis cr6nica; y 5) pacientes con enfermedad de Alzheimer. Si es posible debe darse tratamiento de los trastornos subyacentes.
LAS INMUNOGLOBULINAS PLASMÁTICAS CONSTITUYEN UN MECANISMO IMPORTANTE ENLADEFENSADELHUESPEQ El sistema inrnunitario esti formado por dos componeiites principales: linfocitos R y Iinfocitos T. Los primeros derivan en gran parte de la mkdula osea en los animales superiores y de la bolsa de Fabricio en las aves. Las células B sintetizan los anticuerpos humorales circulantes, conocidos también como inrnunoglohulinas. Por su parte, las dlulas T intervienen en diversos proceses inmunolbgicos mediados por cklulas, como el rechazo de injertos, reacciones de hipersensibilidad y lisis de d l u l a s malignas y de numerosos virus. Esta seccibn considera 5610 las inmunoglobulinas plasmáticas, que se sintetizan principalmente en las cilulas plasrnhticas que son cdlulas del linaje B las cuales producen y secretan inmunoglobulinas al plasma.
Todas las inrnunoglobulinas tienen por lo menos dos cadenas ligeras y dos pesadas Todas las moMculas de inmunoglobulina constan de dos cadenas ligeras (L) identicas (23 kDa) y dos cadenas pesadas (H) iddnticas (de 35 a 75 kDa) que se sostienen juntas como un tetrámero (LiH?) por enlaces disulfuro (figura 594). Cada cadena puede ser dividida de modo conceptual en dominios o regiones especificas que tienen significado estructural y funcional. La mitad de la cadena ligera (L) hacia el extremo carboxilo se menciona como la región constante (Ct), la mitad amino terminal es la región variable de la cadena ligera (VL).
Aproximadamente una cuarta parte de la cadena pesada (H) en el extremo amino se conoce como su regi6n variable (VH) y las tres cuartas partes restantes de la cadena pesada con las regiones constantes [CII1, C H ~ , C H ~de ) esa cadena H. La porción de la molecula de inmunoglobulina que se une al antigeno específico está formada por las fracciones amino terminales (regiones variables) de ambas cadenas, H y L,es decir, los dominios VHy VL.LOSdominios de las cadenas proteinicas no existen simplemente como secuencias lineales de arninoacidos, sino que forman regiones globulares con estructuras secundaria y terciaria para lograr asi la fijaci6n de antígenos especlfícos. Como se representa en la figura 59-6, la digestibn de una inmunoglobulina por la enzima papaina, produce dos fragmentos fijadores de antigeno (Fab) y un fragmento cristalizable (Fc). El área en la cual la papaína divide a la molécula de inmunoglobulina, es decir, la regi6n entre los dominios CH1 y C H ~se, conoce como la regibn de la bisagra.
Todas las cadenas ligeras son del tipo kappa (K) o lambda (h! Hay dos tipos generales de cadenas ligeras, kappa (K) y lambda (A), que pueden distinguirse con base en diferencias estructurales en sus regiones CL(cuadros 5 9 4 y 59-5).Una molecula inmunogl~bulinica siempre contiene dos cadenas ligeras kappa o dos lambda, nunca una mezcla de kappa y lambda. En el ser humano, son mas frecuentes las cadenas kappa que las lambda en sus rnolt5culas de inmunoglobulinas.
Los cinco tipos de cadenas pesadas deteminan fa clase de la inmunoglobulina Se han encontrado cinco clases de cadenas H en los humanos y estas clases pueden identificarse por diferencias en sus regiones (cuadros 59-4 y 59-5). Estas se designan gamma, alfa, mu, delta y kpsilon, y varían en masa molecular de 50 a 70 kDa (cuadro 594). Cada una de las cadenas mu y Cpsilon tiene cuatro dominios CH en lugar de los tres usuales. El tipo de cadena H determina la clase de la inmunoglobulina y por tanto 5u funci6n efectora. Hay cinco clases de inmunoglobuiinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Como se observa en el cuadro 59-4, muchas de las clases de cadenas H pueden ser divididas ulteriormente en subclases en base a diferencias estructurales sutiles en las regiones CH.
No hay dos regiones variables idénticas Las regiones variables de las mol&culasde inmunoglobulinas constan de los dominios VL y VH y son bastante heterogeneas. En realidad, no se han encon-
Regibn de la bisagra
COO COO -
Sitios de escisi6n
Figura 5 9 4 . Modelo simplificado de una mokcula de anticuerpo lgGl (ir) humana, mostrando las estructuras de cuatro cadenas y los dominios (Vn, Cnl, etdtera) La V indica la región variable, C, la regibn mnstante. Se muestran los sitios de desdoblamiento enzirnático por pepsina y papaina. Nbtense las posiciones de enlaces disulfuro inter e intracatenarioc. (Reproducida con autorizacibn de Stites DP, Terr Al, Parslow TG [editores] Basic & Cfmical Imrnunology, 8th ed., Appleton & 1-ange, 1994, publicado por la Editorial El Manual Moderno, México )
trado dos regiones variables, de personas diferentes, que tengan idknticas secuencias aminoacídicas. No obstante, existen patrones discemibles entre las regiones de individuos diferentes y estos patrones compartidos se han clasificado en tres grupos principales con base en el grado de hornologia de la secuencia de aminoácidos. Hay un grupo V, para las cadenas L kappa, un grupo VApara las cadenas L larnbda y un grupo VH para las cadenas H. Con una resolucion mayor, es posible identificar subgmpos dentro de cada uno de estos tres grupos (cuadro 5943. Así, dentro de las regiones variables hay algunas posiciones relativamente invariables que justifican los grupos y los subgmpos. En la comparacidn de regiones variables de cadenas ligeras diferentes, del mismo grupo o subgrupo, o de cadenas pesadas diferentes del mismo grupo o subgrupo, se hace aparente
el hecho de que hay regiones hipervariables intercaladas entre posiciones relativamente invariables (determinantes de subgrupo) (figura 59-71, Las cadenas L tienen tres regíones hipewariables (en VL) y las cadenas H tienen cuatro (en VH).
Las regiones constantes determinan funciones efectoras específicas de clase Las regiones constantes de las moléculas de inmunoglobulinas, en particular la C Hy~la C H(y~ Cri4 de IgM e IgE), las cuaIes constituyen el fragmento Fc, son causantes de las funciones efectoras específicas de clase, de las diferentes mol~culasinmuno;lobul inicas (cuadro 59-9, parte inferior), por ejemplo, fíjacibn del complemento o transferencia placentaria.
842 Bioauím rca de Harner
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Cuadro 5 9 4 , Propiedades de las cadenas de las inmvnoglobulinas humanas* -
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Algunas inmunoglobulinas como la IgG inmunitaria existen solo en la estructura tetramérica bhca, en tanto que otras romo IgA e FgM pueden existir como polimeros de orden superior, de dos, rres(1gA) o cinco (IgM) unidades tetraméricas (figura 59-8). Las cadenas L y las cadenas H son sintetizadas como moltculas separadas y ensambladas posteriormente dentro de la célula B o en las células plasmátic a en moléculas inmunoglobulinica maduras, siendo todas ellas glucoproteinas (cuadro 594). Regiones hipervariables de la cadena
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Regiones hipervanables de la cadena
Enlaces
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N~m>deoligosamilor 1 2o 3 5 Reproducido con ñutori;?aciónde Stites DP, Terr Al, Parsloiv 1991; publir:ado por la Iiditorial El lblaniial Morlemo. Mkxic Inicialmentt:Inv ( 1 ) a (: 1). :60 000 para v3 -
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Las cadenas ligeras y las pesadas
son productos de genes mUltiples Cada cadena ligera de inrnunoglobutina es el producto de cuando menos tres genes estructurales diferentes: un gen para la regibn variable (VL), uno para la región de enlace (1) (que no guarda relación con la cadena J de IgA o de IgM) y uno más para la región constante (CL). Cada cadena pesada es el producto de por lo menos cuatro genes diferentes: un gen para la región variable (VH),uno para la regibn de enlace (J), otro para la regi6n de la diversidad (D) y uno más para la región constante (CH).De este modo se invalida el concepto de "un gen, una proteína". Los mecanismos moleculares que se encargan de la síntesis de las cadenas inmunoglobulínicas sencillas a partir de genes esmcturales múltiples se explicaron en los capitulas 38 y 41.
La diversidad de los anticuerpos depende del reordenamiento genetico Cada persona es capaz de generar anticuerpos dirigidos tal vea contra un millón de antigenos diferentes. La produccion de esa inmensa diversidad de anticuerpos parece depender de las combinaciones de los diversos genes estructurales que contribuyen a la formacidn de cada cadena inmunoglobulinica y de una elevada frecuencia de los fen6menos rnutacionales sornAticos en los genes para VH y VL reordenados.
Durante las respuestas inmunitarias,
Figura 59-7. Modelo esquemático de una mol&wla de IgG las inmunoglobu'inas cambian de 'lase que muestra las ~ocicionecariroxirnadac de las reaiones hioervariables en ¡as cadenas besada v liaera. (~odifi&dav reproducida con autoritaubn de stites'op, ~ e i r ~~ la.r s l o i En la mayor parte de las respuestas inmunitarias huTG [editors].~ a s i and c Clinicallmmunolog~,8th ed. A ~ ~ l e t o n morales, se producen anticuerpos con especificidad 8 Lange, 1944, publicado por la Editorial El Manual Moderno, iddntica, pero de clases diferentes, en un orden croMBxtco.)
Cuadro 59-9. Propiedades de las inmunoglohulinas humanas* - . .-. -. . .-
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6 Compnnente secretorio. Para IgA secretaria
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nologico especifico en respuesta al inmunogeno (antigeno inmunizante). Por ejemplo, las anticuerpos de la clase IgM normalmente anteceden a moMculas de la clase IgG. El camhiode unaclaseaotrase desima cambio de clase, y sus bases rnoleculares se han investigado de manera extensa. Un solo tipo de cadena ligera de inmunoglobulina se puede combinar con una cadena rnu especifica de antigeno para formar una molécula específica IgM. Después, la misma cadena ligera puede combinarse con una cadena pesada gamma, que contiene de nuevo la region Vrf idhtica, para formar una moldcula de 1gG con idéntica especificidad de antígeno. A continuacidn, la misma cadena ligera especifica de antigeno se combina con una cadena aIfa con una regjon WH identica para generar una mol&cula de IgA con especificidad de antigeno tambikn id&tica. Estas tres clases (IgM, IgG e IgA) de moléculas inmuno~lobulínicascontra el mismo antigeno tienen dominios variables identicos de ambas c&nn ligeras (VL) y ambas cadenas pesadas (VH) y se dice que cornnarten un idiotino. Los isotonos de clases di ferentes están determinados por las ;egionec CHcornbinadas con la m i m a regibn VHespecifica de antígeno. En el capítulo 41 se describió un aspecto de los mecanismos genéticos regulatorios responsables del cambio del gen de la regibn CH.
Tanto la sobreproducción como la deficiencia de inmunoglobulinas pueden conducir a estados patológicos Los trastornos de las inmunoglobulinas incluyen la producción aumentada de clases específicas de inmunoglobulinas o aun de molkculas inmunoglobulinicas específicas, esto ultimo por tumores clonales de las cklulas plasmaticas a los que se denomina rnielomas. La hipogammaglobulinemia puede estar restringida a una sola clase de moléculas de inmunogtobulina (por ejemplo, IgA o IgG) o puede comprender la subproducción de todas lec clases de inmunoglobulinas (IgA, IgD, IgE, IgG e TgM). Las alteraciones en sus valores se deben casi sin excepcibn a mornos en el indice de produccibn o de secrecion, para lo cual puede haber numerosas causas.
LOS hibridomas proporcionan prolongadas &? anticuer~os m ~ n ~ c l o n amuy l e ~ útiles Cuando un antigeno es inyectado en un animal, los anticuerpos resultantes son policlonales, ya que son sintetizados por una mezcla de d l u l a s B. Estos estiin
844 * Bioquimica de Harper
(Capitulo j9)
Componente secretorio
L
C IgM (PentArnero]
Figura 59-8. Ilustracibn sumamente esquematizada de las inmunoglobulinas poliméricas humanas. Las cadenas polipeptidicas están representadas por lineas gruesas;los enlaces disulturo que unen a las diferentes cadenas polrpeptidicas están representados por líneas delgadas. (Reproducida con autorización de Stites DP, Terr Al, Parslow TG [edtors]:Basrc & Clrnical Immunology, 8th ed. Appleton & Lange, 1994: publicado por la Editorial El Manual Moderno, Méxiw.)
dirigidos contra cierto número de sitios diferentes (epítopes o determinantes) del antigeno, por lo que no son monaespecificos. Sin embargo, mediante una t h i c a desarrollada por Kohler y Mi tstein, pueden obtenerse grandes cantidades de un anticuerpo monoclonal cenci [le, especifico para un solo epitope. El método incluye la fusibn celular y la lfnea celular permanente resultante se denomina hibridoma. De modo típico, las ctlulas B se obtienen de bazo de rat6n (o de otro animal adecuado), inyectado previamente con un antigeno o una mezcla de antígenos (por ejemplo, cdlulas extraflas). Estas células B se mezclan con ctlulas de mieloma de raton y se expo-
nen a polietilenglicol, que causa fusién celular. La figura 59-9 es un resumen de 30s principios que intervienen en la gerieración de células de hibridomas. Bajo las condiciones usadas, sblo las celulas del hibridoma se multiplican m el cultivo. Esto implica sembrar las celulas hibridas en un medio que contiene hipoxantinaaminopterina-tim idina (HAT) a una concentración tal que cada placa contenga alrededor de una ct'lula. De este modo, en la placa se multiplica una clona de c6lulas de hibridorna. El medio de cultivo se incuba y se observa en busca de anzicuerpes que reaccionen con el antigeno o antígenos originales. Si el inmunbgeno es una mezcla de numerosos antígenos (por ejemplo, una
Proteínas plasrnáticas, inmunog~obuirnusy coclgulación sanguinea
Celula de rnieloma
tumorales (por e.jemplo, las células leuc6micas). Ademas, se esthn usando como f5mtacos directos contra células tumorales y para acelerar la eliminacihn de medicamentos de la circulaciiin cuando alcanzan concentraciones t6xicac (como la digoxina).
C6iuia 0
1
Fusibn en presencia
845
PEG
Célula de hibridoma Crecimienio en medio con HAT El hibndoma ss multiplica oeluias B y de mieloma mueren
El sistema del complemento comprende alrededor de 20 proteínas plasmaticas e interviene en lisis celular, inflamación y otros procesas
El plasma contiene alrededor de 20 proteinas que son miembros del sistema del complemento. Este sistema Célula de hibridoma h e descubierto cuando se observó que la adici6n de suero fresco que contenia anticuerpos dirigidos a una Figura 59-9. Esquema de la produccibn de una dlula de bacteria causaba su licis. Pero, al contrario de los hibridoma. Las Células de mieloma están inmortalizadas, no anticuerpos, e! factor era lábil cuaiido se calentaba a producen anticuerpos y son HGPRT- (volviendo ~nactivala 56 "C. Estudios subsecuentec han categorirado las vía de salvamento de la sintesis de purina [capitulo 361). Las proteinas del sistema y la forma en que funcionan; la dlulas B no son ~nrnorfales,cada una produce un anticuerpo especifica y son HGPRT* El polntilengliwl (PEG) estimula la mayor parte: se ha clonado y obtenido su secuencia. fusibn celular. Las células de hibrtdoma resultante están Los componentes proteinicos principales se designan inmortalizadas (por las células de mieloma progendoras}, C 1 a C9; este ijltimo, con el complejo C5 a 8 (unidos producen anticuerpos y son HGPRT'. (Las dos ultimas constituyen el complejo de ataque de la membrana) se propiedades heredadas de las dlulac E precursoras ) Las ocupa de la formación de un poro lipocoluble en la células B morirán en el medio debido a que no con irnrnortales En presencia de HAT, las dlulas de mieloma tarnbibn membrana celular que causa lisis osrn~tica. mueren, dado que la aminopterina que contiene, suprime la Los pormenores de este sistema sun relatisíntesis de purina por la vía de novo al inhibir la reutilizaubri vamente complejos, por lo que debed consultarse un de tetrahidrofolato (capitulo 36) Sin embargo, las células de hibridoma sobreviven, proliferan (debidos que son HGPRT') texto de inmunologia. El concepto basico es que las proteínas del sistema, normalmente inactivas, al ser y, si se donan, producen anticuerpo monoclonal. (HAT, desencadenadas por un estimulo, se vuelven activas hipoxantina, aminopterina y timidtna; HGPRT, hipoxantinaguanina-fosforribosiRran~fera~a.) por proteólisis e interactúan en una secuencia especifica con una o más de las proteinas restantes del sistema. El resultado es la lisis celular y generacion de tos hgmentos que participan en varios aspectos de la ínflamacibn (quimiotaxis, fagocitosis, etcétera). El preparacibn de membrana celular), el cultivo de una sistema tiene otras funciones, como la depuración de placa particular contendrh una clona de c&luIas de complejos antigeno-anticuerpo de la circulación. La hibridoma que sintetiza un anticuerpo monoclonal a activacibn del sistema del complemento es decencadeun determinante antigenico especifico de la mezcla. Cosenada por 1 de 2 vias, llamadas clhsica y alterna. La chando los medios de numerosas placas de cultivo, puede primera comprende la interacción de C 1 con los comobtenerse un conjunto de anticuerpos rnonoctonales, plejos antigeno-anticuerpo y la segunda (que no muchos de ellos especificas para componentes indiutiliza anticuerpo) comprende la interaccion directa viduales de la mezcla inrnunogknica. Las células de de la superficie celular bactenana o de su5 polisacaridos con un componente designado C3b. hibridoma pueden congelarse y almacenarse, para El sistema del complemento es semejante a la descongelarse cuando se requiera una porci6n del cascada de la coagulación sanguinea (veme despues), anticuerpo, lo cual asegura un suministro prolongado. ya que emplea tanto la conversión de precursores Las ctlulas de hibridoma pueden multiplicarse íambikn inactivos a productos activos por la acci6n de las en e1 abdomen de ratones, que proporcionan cantiy una cascada con amplificaci6n. proteasas dades relativamente elevadas de anticuerpos. Por su espwificidad, los anticuerpos mont-icIonales se han convertido en reactivos Utiles en numerosas LA HEMOSTASIA Y LA TROMBOSIS áreas de la biologia y la medicina. Por ejemplo, pueden TIENEN CUATRO FASES usarse para medir la concentración de numerosas proteínas individuales (como las proteínas plasmálicas), para determinar la naturaleza de microorganismos infecLa hemostasia es el cese del sangrado de un vaso ciosos (por ejemplo, los tipos de bacterias) y para cortado o lesionado, en tanto la trombosis tiene lugar cuando el endotelio que recubre los vasos sanguíneos subclasificar cblulas normales (como los linfocitos) y
se daiia o quita. Estos procesos incluyen la formaci6n del cohgulo sanguíneo (coagiilacihn) e implican a los vasos sanguineos, la agregaci6n plaquetaria y las proteínas plasmáticac que causan tanto la formación como la disolución de los agregados plaquetarios. Existen cuatro fases para la hemostasia y Ia trombosis:
Tanto la vía intrínseca como la extrinseca conducen a la formación de fibrina
Existen tres tipos de trombos
Dos vías dan lugar a la formacihn del coágulo de fibrina: la intrinseca y la extrínseca. Estas vías no son independientes, como previamente se considerh. Sin embargo, esta diferencia artificial no se maneja en el siguiente texto para facilitar su descripción. La iniciación del trombo rojo en un área de circulación sanguinea restringida o en respuesta a una pared vascular anormal sin daño tisular se lleva a cabo por la vía intrinseca. La iniciaci6n del coágulo de fibrina en respuesta a la lesión tisular sigue la via extrinseca. Estas convergen en una vía final comun en donde la protrombina es activada a trornbina y sc produce el desdoblamiento catalitico del fibrinbgeno por la trombina para formar el coáguIo de fibrina. Las vías intrínseca, extrínseca y final comun son complejas y comprenden muchas protehas diferentes (figura 59-1 0, cuadro 59-1 0). En general, como se muestra en el cuadro 59-1 1, estas proteínas pueden clasificarse en cuatro tipos: 1) cimógenos de proteasas que dependen de serina, activados durante el desarrollo de la coagulacibn; 2) cofactores; 3 ) fibrinógeno; 4) una transglutarninasa que ectabiliza el coagulo de fibrina, y 5) proteínas regulatorias y otras.
Se distinguen tres tipos de trombos o coágulos y todos contienen fibrina en variables proporciones.
La vía intrínseca conduce a la activación del factor X
1) La constricción del vaso dañado con el objeto de
disminiiir el flujo dista1 de sangre a la herida. 2) La formación de un tapón plaquetario laxo temporal en el sitio del daao. Las plaquetas ce unen a la colágena en e3 sitio lesionado de la pared vascular y son activadas por la trombina (el mecanismo de activación de las plaquetas se describe después), formada por la cascada de la coagulación en el mismo sitio o por el ADP liberado de otras plaquetas activadas. Por la activación, las plaqueta cambian de forma y, en presencia de fibrinhgeno, se agregan para formar el tapón plaquetario (en hemostasia) o el trombo (en trombosis). 3) La formación de una malla de fibrina que se fija a un agregado plaquetario crcando un trombo o tapón hemosthtico más estable. 4) La disolución parcial o completa del coágulo o tapón hemostatico por la plasmina.
1) El trombo blanco esta compuesto de plaquetas y fibrina y es relativamente pobre en eritrocitos. Se f o m a e n el sitio de una herida o de una pared vaccular anormal, particularmente en las áreas de circulación sanguinea rfipida (arterias). 2) El trombo rojo consiste de manera. primaria en eritrocitos y fibrina. Su morfologia es semejante a la del coágulo formado en un tubo de ensayo y puede producirse in vivo en áreas de circulación sanguinea lenta o estasis (como en las venas) con o sin IesE6n vasnilar, o en un sitio de daño o en un vaso anormal junto con un tapdn plaquetario iniciador. 3) Un tercer tipo de coágulo es un depbsito de frbrina diseminado que se forma en vasos sanguineos muy delgados o en capilares. Primero se estudiará la via de coagulaci6n que conduce a la formaci6n de fibrina. Posteriormente, se describirán de modo breve algunos aspectos de Ea función de plaquetas y paredes vasculares en el proceso global de la coagulaci6n. Esta separación entre factores de la coagulacibn y plaquetas es artificial, ya que desempeilan actividades intimas y, a menudo, mutuamente interdependientes en la coagulacihn, pero facilita la descripci6n de los procesos de manera global.
La via intrínseca (figura 59-10) implica los factores XII, X1, IX, VIII, X y t a m b i h precalicreina, cininógeno de peso molecular elevado CaZ',y focfolipidos plaquetarios. El resultado es la produccibn de factor Xa (por convencihn, los factores de coagulación activados se refjeren usando el sufijo a). Esta via comienza con la "fasc de contacto": donde la precalicreina, cininógeno de PM elevado, factor XI1 y factor XI se exponen a una superficie activante con carga negativa. La colágena expuesta en una supeficie vascular, probablemente proporciona este sitiiin vivo en tanto que el vidrio o el caolín pueden usarse para pruebas iri vifro de la vía intrínseca.~uandolos cornponentes de la fase de contacto se ensamblan en la superficie activante, el factor XII se activa a factor X1Ia durante prote6Iisis por calicreina. Este factor XlIa, generado por la calicreina, ataca la precalicreina para formar más calicreína, estableciendo una activacidn reciproca. El factor XEla, una vez formado, activa al factor XI a XIa y ademhs libera bradicinina (un nonapéptido con potente accibn vasodilatadora) a partir de¡cininbgeno de PM elevado. El factor Xla en presencia de Cd2+activa al factor IX (55 kDa, cirnbgeno que contiene residuos de gamrna carboxiglutarnato [Gla] que depende de vitamina K), a la serina proteasa, factor IXa. Esta a su vez rompe
Proteínas plaspnliticas, inrnunogIobulinasy coagulacrrin sanguínea
837
Vla Intrinseca PK HK
n
XII
Xlla
Vía extrínseca
Xla
XI
'e.
m
--
.. .
IX
VIII
VI1 f
IXa
\
Vllalfactor tisular
1
I
I
VHla
I
Protrombina
frombtna
1 -* -m)
Retroalimentacidn positiva (hiptetica) Activación extrinseca a intrinseca
Polímero de fibrina
Polimero de fibrina
establlizado por enlaces cmzados
Figura 53-10. Vías de la coagulacibn sangulnea. Se indican las vías-intrlnsecay extrfnseca.Los procesos descritos por abajo del factor Xa se designan corno vía final común, que culmina con la fomaci6n de fibrrna con enlaces cmzados. Las observaciones nuevas (flechas con puntas) incluyen el hallazga de que los cornple~osde factor tisular y factor Vlla activan no s61o al factor X (de la vía extrínseca clAsica) sino tambihn al factor 3X en la via intrinseca Ademfts, la retroalimentacdn entre trombina y factor Xa es activa en los dos sitios indicados (flechas oscuras); (PK, precalicreina, HK, cininbgeno de peso rnolecular elevado; PL, fosfolipidos.) (Reproducida con autor!zacibn de Roberts HR, Lozier JN: New perspectives on the magulation cascade. Hosp Pract [Off Ed] enero 1992:27:97,)
Rioquímrca de Harper
848
(Capítulo 59)
Cuadro 5940. Sistema numkrh en la nomenclatura de los factores de la coagulación sanguínea. Los narneros; indican el orden en que 1
\,
.
- - -
- --
I
ribrinógeno " ' rl-otrr>rnhina ictor tisula ,2 -,
.-
-.
Cuadro 59-1 1. Funciones de Iris proteínas que acibn san r d e las ser 1
'actor nii
Se uní:a ia coiagcna cxpuesio m strios de IcsilÓn dc la pared vascular: activado p r cini nbgcno dc PM clci.ado y por cali-
1 t
Activrrdo por ci ictor XlIa Activiirlo por e1 f actor XIa en presrncia
1'"t'r
C dt Activado por l a trombinn en prescncra de
Nom brc(S) común ictores en gtneral se n DO^. SUS nombres ctimiJ l l C 6 or lo gener a l no se I;nen:amo ractores de laco:agu-
oaccieritia. ractor iaaii, gionuiina nccieraonrn
creina
Ca2
(Ac-)
versibn de 1srooconvcrtin a, aceleradi &rica(Sl'C Roplmtina ctor A aiiti hcmofílico.globulina Eica
I
Activ; do en la si :pIaquetas timidadas por 3 protombina'.,7+ E..,..,.. -*-i sa (Cd. I P b I I I I F D Y I L lid ). lV..\. IAQJ pll. iacmcia de factor tisular? LaZ4 tor ! Activ; iperficic dc plaqiietas escl cornplc,jo protrombii ( ~ a ~ ' , r a c t o r e c Vna a) y' " actores 11. VII, I X \. X son cir;ntios quc con I (G la = y-c iglutamato m
(AIIG) ctor R ant de Christn .. componente de tromboplastiria pl=niatica (1' X Factor dc 'stiiart-Prower X I Antecedente de trombol>lastinapla smhtica (P' X1 I , Factor de t Iageman XIII-- actor estabilizante de fibsina (FSF,,\ cl..-;.,*l:~ 1 IUI i i i u i r b - " * No hay factor vi-
f
ido par la t romhina: el {actor VJIIa es un coracror cn la activactbn del factor x Por el factor Activ;ido por la t I factor Va es U11 C rifactor en in de protrum.. hin;L por el h c tor Xa Protcína expucsl:a en la su perficir de [as celuilas endoteliales estirnuladas, que , ., reqiiiere fosfolipiaos para actuar como ra cl factor 1 uní P
un enlace Arg-lle en el factor X (56 kDa) para producir !a serina proteasa de dos cadenas, factor Xa. Esta ultima reaccion requiere el ensamblaje de componentes, Ilamado el complejo tenasa, en la superficie de plaquetac activadas: Caz' y factor VIIIa, asi como los factores IXa y X. Deberá observarse que en todas las reacciones en que intervienen cimbgenos con residuos Gla (factores 11, VII, IX y X), estos residuos en las regio-
---
.-
Factor v
.
nes amino terminales de las mot&culassirven como sitios de tijacibn de elevada afinidad para Ca"'. Para el ensamblaje del complejo tenasa. primero deben activarse las plaquetas para exponer los fosfolipidos ácidos (anidnicos), fosfatidilserina y fosfatidilinositol, que por lo comUn están en el lado interno de la membrana plasmatica de las plaquetas no activadas, en reposo. El factor VI11 (330 kDa), una glucoproteina, no es precursor de una proteasa, sino un cofactor que sirve como receptor para los factores IXa y X en la superficie plaquetaria. El factor VllT es activada por cantidades mínimas de trombina para formar factor VIIIa, que a su vez es inactivado al degradarse más por la accibn de la trombina.
Acriva da ham. . PP hin? unida a trombomodulinn: entonces ada los fac;toresY11l;i y Va
La vía extrinseca también conduce a activación de! factor X, pero el mecanismo utilizado es diferente
Actúa como coiactor de 1a proteína C; .. a m Cias proteinas que contienen residtros (y-carboxi;
El factor Xa tiene lugar en el sitio donde las vías intrinsecas y extrinseca convergen (figura 59-1 0) y continúan con la via común final de la coagulación
lnraao por rromoina para rormar el
rina
mo por ia rromoina en presencia oe '; estabiliza el coigulo de fibrina enlaces cruzados covalentcs
proteinas
de las ceEu 1% .LL1ILlLdUV d. *M*-L;-n L I U ~ ~ ~ I X I I ~la , cual entonces activa la protcína C . -.. .. .nas en las n+nt:ntnr.
CIIU\~LCII~~L>,
Proteínas plusrnÚ~icas,inrnunoglobulinasy coa,quluciÓn sanguinea
Pretrombina
<
Figura 59-11. Esquema (no a escala) de la fijación de los factores Va, Xa. c a 2 + y protrombina a la membrana plasm8tica de la plaqueta activada Los sitios de desdoblamiento de la protrombina por ef factor Xa se indican w n dos flechas La parte de la protrombina destinada a formar trombina se designa pretrombina. El ion calcio se une a fosfolipidos anibnicos de la membrana plasrnática plaquetarta activada.
849
*
NHT
sanguínea. La via extrinseca utiliza el factor tisular, factores VI1 y X y Caz' y conduce a la produccihn dc factor Xa. Comienza en e1 sitio de la lesión con la expresibn de factor tisular (figura 59-10), que actiia como un cofactor en la activacihn del factor X catalizada por el factor VIIa. Este último rompe el mismo enlace Arg-l le en el factor X que es desdoblado por el complejo tenasa de la via intrinseca. El factor VI I(53 kDa), glucoproteina circulante que contiene Gla sintetizada por el hígado, es un cimhgeno, pero tiene una actividad endógena bastante elevada que aumenta aun m& por conversión en la serina proteaca activa, factor VIIa (catalitada por la trombina o factor Xa). La activación del factor X proporciona un enlace importante entre las vias intrínseca y extrínseca. Una interacción importante entre las vías extrinseca e intrínseca es que los complejos de factor tisular y factor VIIa también activan al factor IX en la vía intrinseca. De hecho, la formación de complejos entre el factor tisular y el factor VIIa puede ser el proceso clave que interviene en la iniciacidn de la coagulacion sanguínea in vivo. La importancia fisiolbgica de los pasos iniciares de Ea vía intrinseca, donde intervicnen el factor XII, la precalicreína y el cininógeno de peco molecular elevado, se ha puesto en duda debido a que personas con una deficiencia hereditaria de estos componentes no tienen problemas de hemorragias. De igual modo, es posible que individuos con deficiencia de factor XI no muestren problemas de hemorragias.
<@cOQ Ca!+-ba2. -
Membrana
plasrnAtica - -
plaqueiaria
Indica las cargas negativas a las cuales se fija ei ca2+
hígado, bazo y rifí6n y se encuentra en las plaquetas v en el plasma. Funciona como cofactor de manera h l o g a al factor VI11 en el complejo tenasa, Cuando se activa a factor Va por acci6n de oligocantidades de trombina, se une a receptores especificas en la membrana plaquetaria (figura 59-1 1) y forma un complejo EOn el factor Xa y protrombina. Más adelante es inactivado por acción ulterior de la trombina, proceso que e5 un medio de limitar la activacíbn de laprotrombina a bombina. La protrombina (72 kBa; figura 59-1 2) es una glucoproteina de cadena sencilla sintetizada en el higado. Su regi6n amino terminal contiene 10 residuos Gla ( 1 en figura 59-12) y el sitio proteasa activo dependiente de serina (indicado por la flecha) estB en su región carboxilo terminal. Cuando se fija al complejo de factores Va y Xa sobre la membrana plaquetaria, la protrombina es dividida por el factor Xa en dos sitios. para generar la molkcuia de dos cadenas, trombina, que luego se desprende de la superficie plaquetaria. Las cadenas A y B de trombina se conservan unidas por un enlace disulfuro.
En la vía común final de la coagulación, la protrombina es activada a trombina El factor Xa, producido en las dos vias estudiadas, activa la protrornbina (factor 11) a trornhina (factor Ila), que luego convierte el fibriniigeno en fíbrina (figura 59-10) en la visi comUn final. La activacíbn de protrornbina, igual que la del factor X tiene lugar en la superficie de plaquetas activadas y requiere el ensamblaje de un complejo protrombinasa, constituido por fosfolípidoc plaquetarios anibnicos, Caz', factor Va, factor Xa y protrombina. El factor V (330 kDa), unaglucoproteina homóloga al factor Y111 y a la ceruloplasmina, se sintetiza en el
L
A
F-1-2
J
Pretrombina (antes de degradación por Xa) Tmmbina (despues de la escisión Xa)
Figura 59-1 2. Esquema de la protrombina (noa escala) El extremo amtno esta a la izquierda: la región 1 contiene los 10 residuos de Gla. Se muestran los sitios de desdobtamiento por el factor Xa y se nombran los productos El lugar del residuo serina catalitimmente activo está indicado con Las cadenas A y 6 de la trombina activa (sombreadas) se conservan juntas por el puente disulfuro.
La conversión de fibrinogeno a fibrina es catajisada por la trombina EI fibrinógeno (factor 1,340 kDa; figuras 59-1 1,59-12; cuadros 59-10 y 59-1 1) es unaglucoproteinaplasm~tica soluble de 47.5 nm de longitud que consiste de tres pares no idknticos de cadenas polipeptídicas (AalfaBbeta,gamma)z unidades de manera covafente por puentes disulfuro, Las cadenas Bbeta y gamma contienen oligosaciridos complejos unidos a asparagina. Las tres cadenas son sintetizadas en el hígado; los tres genes estructurales que participan están localizados cn el mismo cromosoma, y su expresión está coordinadamente regulada en los seres humanos. Las regiones amino terminal de las seis cadenas se mantienen muy pr~ximas,gracias a varios enlaces disulfuro, en tanto que sus extremos carboxilo esthn dispersos, dando origen a una molécula alargada muy asimétrica (figura 59-13). Las porciones A y B de las cadenas Aalfa; y Bbeta de los extremos m i n o de las cadenas designadas fibrinopéptidos A (FPA) y R (FPE) respectivamente, contienen un exceso de cargas negativas debido a la presencia de residuos aspartato y glutamato y también, en FPB, un residuo tirosina O-sulfate poco comun. Estas cargas negativas contribuyen a la solubilidad del fibrinbgenn en el plasma y además sirven para prevenir agregación a que causan repulsi6n electrostatica entre molkculas de fibrinógeno. La trombina (34 kDa} es una serina proteasa plasmatica que hidroliza los cuatro enlaces Arg-Gli entre fíbrinopdptidos y las porciones alfa y beta de las cadenas Aalfa y Bbeta del fi brinógeno (figura 59-1 4A). La liberacibn de fibrinopkptidos por acción de latrombina generamonómero de fibrina, que tiene la estructura subunitaria (alfa, beta, gamma),. Dado que FPA y FPB contienen sólo 16 y 14 residuos, respectivamente, la molécula de fibrina retiene 98% de los residuos presentes en el fibrinbgeno. El desprendimiento de los fibrinopéptidos expone sitios de feación que permiten que las moléculac de mon6meros de fibrina se agregen de manera espontánea en un ordenamiento regular que
forma un cohgulo de fibrina insoluble. En esta red de polimcro insoluble quedan atrapados plaquetas. eritrocitos y otros componentes, para formar tromhos blancos o rojos. El coligulo inicial de fibrina es un poco débil y se conserva unido sólo por enlaces no covaIentes entre las fibrillas. La trombina, adernhs de convertir e! fibrinbgeno en fibrina, tarnbibn transforma el factor Xl il en factor Xllla. Este ultimo es una transglutaminaca que se une a enlaces covalentes cmzados, moléculas de fibrina mediante enlaces peptídicos entre grupos gamma-carboxilo de glutarnina y kpsilon-amino de lisina (figura 59-1 4 R ) lo cual produce un coágulo de fibrina mas estable, con mayor resistencia a la proteólisis.
La concentracibn de la trombina circulante debe controlarse con cuidado o pueden formarse coágulos Una vez que en el curso de la hornenstasia o la trombosis se forma trombina activa, su concentración se debe controlar cuidadosamente para evitar mayor fomaci6n de fibrina o la activacibn plaquetaria. Esto se logra de dos maneras. La trombina circula como su precursor inactivo, protrombina, que se activa como resultado de una cascada de reacciones enzirnaticac, cada una convirtiendo un cimógeno inactivo a una enzima activa y llegando por ultimo a la conversión de protrombina a trombina (figura 59-1 0). En cada punto de la cascada, los mecanismos de retroalimentación producen un balance delicado de activacibn e inhibicibn. La concentración del factor XI1 en el plasma es alrededor de 30 pdmL en tanto que la de fibrinógeno es 3 mg/rnL, con factores intermedios que aumentan en concentracion conforme procede la cascada, mostrando que la cascada de la coagulacibn proporciona ampli ficacihn. El segundo medio para controlar Ea actividad de la trornbina e5 el bloqueo de cualquiera forniada por inhibidores circu tantes, de los cuales el mhs importante es la antitrombina 111 (véase despuf S).
FPA
COo
-
-NH 47 5
, nm
Figura 59-13. Esquema (no a escala) del fibrinbgeno, mostrando los pares de cadenas dcr, 60 y 7 unidas por puentes disulfure (FPA, fibrinopéptido A; FPB, fibrinop8ptido B.)
Prob~inusplasmú[rcas, ~ntrzuno~lobirl~nus y coaplacirín sanguínea m 85 1
Trombina
A
Cadena de fibrina (a0 fi)
B Fibrina
- CH,
- CH, - CH,
- CH,
o
+
- CH,
- CH,
H2N - C - CH, - CH, - Fibrina
1
I'-Y~Y~)
Fibrin - CH, - CH,
II
- NH,
4 ;
(Glutamil)I
- NH - C - CH, - CH, -
Fibrina
Figura 59-14. Formación de un cohgulo defibrina A: Desdoblamiento inducido por trombina de enlaces Arg-GIi de las cadenas Aa y Bp del fibrinogeno para producir fibrinopeptidos (lado izquierdo) y las cadenas u y P de monomero de fibrina (lado derecho). B: Enlaces cruzados de moléculas de fibrina por el factor XIII activado (factor Xllla).
La actividad de la antitrombina lll, inhibidor potente de trombina, es incrementada par la heparina En el plasma normal circulan cuatro inhibidores de trombina naturales. El más importante es la antitrombina 111, que contribuye con cerca de 75% de la actividad antitrombínica. La antitrombina 111 también puede inhibir la actividad de los factores IXa, Xa, XIa y XIIa. La alfa>-macroglobulinaefectiia casi toda la actividad de antitrombina restante, con el cofactor II heparina y alfal-antitripcina (alfa,-proteinasa) actuando como inhibidores menores bajo condiciones fisioló,'oicas. La actividad end6gena de la antitrombina 111 aumenta de manera notable con la presencia de poteoglucanos Bcidos como la heparina (capítulo 57). Estos se unen a un sitio catiíinico especifico de la antitrombina 111, induciendo un cambio de confomaci6n y facilitando su fijacidn a trombina y también a otros sustratos. Tal es la base del empleo de la heparina en medicina para inhibir la coagulación. Ademas, dosis bajas de hepariaa al parecer recubren el revestimiento endotelial de los vasos sanguíneos. quizá reduciendo de este modo la activación de la via intrínseca.Los efectos anticoagulantes de la heparina pueden ser antagonizados por polipéptidos fuertemente catihicos como protarnina, que se une con firmeza a la primera y así inhibe su fijacidn a la antitrombina 111. Los individuos con deficiencias hereditarias de antitrornbina 111están
predispuestos a desarrollar coágulos frecuentes y diseminados, lo cual prueba que el inhibidor tiene una función fisiologica y que el sistema de coagulacibn en el hombre ect8 normalmente en un estado dinámico. La trornbina participa en un mecanismo regulador adicional que opera en la coagutaciiin. Se combina con tromhomodulina, una glucoproteina presente en la superficie de las c6Iula.s endoteliales. El complejo convierte Ta proteina C en proteína Ca. En combinación con la proteina S, un cofactor, la proteína Ca degrada los factores Va y VIlla, limitando sus acciones en la coagulaci6n. Una deficiencia genktica de protclnas C o S puede causar episodios trombóticos graves.
Los anticoagulantes cumarinicos bloquean fa carboxilación dependiente de vitamina K de los factores II, VII, IX y X Los cumarlnicos (como el dicumarolj, que se utilizan como anticoagulantes, inhiben la carboxilación dependiente de vitamina K de los residuos Glu y Gla (capitulo 53) en las regiones amino terminales de los factores II, VII, IX y X y tarnbidn en proteínas C y S. Estos factores, que se sintetizan en el hígado, dependen de las propiedades de fijación de Caz- sobre tos residuos Gla, para su funcionamiento normal en las vias de la coagulaciQn. Los cumarlnicos inhiben la reducción de los derivados quinona de vitamina
852 Biaquimica de Harper
K hasta sus formas hidroquinonas activas (capítulo 53). Así, la administración de vitamina K anulara el bloqueo inducido por cumarina y permitirá l a maduracibn de factores que contienen Gla. La inversibn del efecto curnarinico sobre la vitamina K requiere de 12 a 24 horas. en tanto que la regresiún de los efectos anzicoagulantes de la heparina por medio de la protamina es casi instantánea. La heparina y la warfarina tienen amplio uso en el tratamiento de trastornos trombóticos y tromboembblicos, como en la trombosis venosa profunda y embolia pulmonas. Primero se administra heparina debido a la rapidez de su comienzo de acci6n; por su parte, la warfarina tarda varios días para alcanzar efecto completo. Su actividad se vigila de manera estrecha por el empleo de pruebas apropiadas de coagulacihn (v6as.e después), dado el riesgo de producir hemorragia.
La hemofilia A se debe a una deficiencia de factor Vlll determinada genéticamente Zas deficiencias hereditarias de los sistemx de coagulaci6n se encuentran en los seres humanos. La deficiencia más comUn es la del factor VI11 que causa hemofilia A, una enfermedad ligada al cromosoma X, que ha desempeiiado un papel importante en la historia de las familias reales de Europa. La hemofília B se debe a una deficiencia del factor IX;su cuadro clínico es casi identico al de la hemofilia A, pero los dos trastornos pueden separarse con base en anhlisis específicos que distinguen entre [os dos factores. El gen para el factor VI11 humano se ha clonado y es uno de los que más se han estudiado hasta ahora, midiendo 186 k b con 26 exones. Se han reconocido diversas mutaciones que causan disminucién de la actividad del factor VII1; istas incluyen deleciones gknicas parciales y mutaciones en un punto que conducen a terminación prematura de la cadena. En la actualidad es posible el diagnbstico prenatal por análisis de DNA, mediante el muestre0 del vello coridnico, En arlo5 recientes. el tratamiento de pacientes con hemofilia A ha consistido en la administración de crioprecipitados (enriquecidos con factnr VI1l)preparados a partir de donadores individuales o de concentrados de factor VI11 liofilizados obtenidos de me;.clac de plasma hasta de 5000 donadores. Se espera producir en un futuro próximo suficiente factor VllI por tecnología del DNA recombinante. Estas preparaciones estin exentas de los virus contaminantes (por ejemplo, el HlV-1) que se encuentran en el plasma humano, pero en la actualidad son costosas; su uso puede aumentar si el costo de producci~nse abate.
(Capitulo 39)
La plasmina disuelve los coágulos de fibrina Como se estableció, el sistema de la coagulaciún en condiciones normales esta en una situacidn de equilibrio dinámico en la cual [os coigulos de fibrina se forman y disuelven de manera consrante. La plasrnina. serina proteasa que se ocupa de gran parte de la degradación de la fibrina y dcl fibrindgeno, circula en formade su cimógeno inactivo, plasrninbgeno (90 Wa); cualquier cantidad pequeña de plasmina que se forme en la fase tiquida bajo condiciones fisiol6gicas es inactivada con rapidez por el inhibidor de piasmina de acci6n rápida, la a!faz-antiplasrnina. El plasmin6geno se une tanto a la fibrina como al fibrinbgeno, por lo cual se incorpora al colgulo conforme se forma; de este modo, la pIasmina formada, cuando esta unida a fibrina se haya protegida de la alfaz-antiplasmina y permanece activa. En la mayor parie de los tejidos corporales, se encuentran activadores de plasrninbgeno de varios tipos y todos escinden el mismo enlace Arg-Val en el plasminbgeno para producir la proteasa de dos cadenas, plasmina (figura 59-1 5). El activador del plasminbgeno tisular (alteplasa, tPA) es una serina proteasa que se libera a la circulación desde el endotelio vascular en situaciones de lesibn o tensibn y cuya funcibn catalitica se inactiva a menos que esté unida a fibrina. Al fijarse a Csta, tPA desdobla e3 plasmin6geno dentro del coágulo con el fin de generar plasmina, que a su vez digiere [a fibrina para formar productos de degradacibn solubles y asi disolver el cohgulo. Ni la plasmina ni el activador del plasrninbgeno pueden permanecer unidos a estos productos de degradacibn y así estos pueden liberarse a
Activadores de plasminogeno
NH;
-arg
'a 9 -v
COO-
S-S
Figura 59-15. Activacibn del plasrninbgeno. T d o s los activadores de plasminbgeno escinden el mismo enlace Arg-Val para dar Fa mol&cual de dos cadenas de plasmina. Aindica el residuo de serina del sitio activo Las dos cadenas de plasmina se conservan juntas por un puente disulfuro.
Proteínas plasmáticas, inmunoglobzrlinasy coagulación sangi~iiineu 853
n
PEasminógeno
I
-
Comple)o estreptocinasa
plasminbgeno I
Inhibidor del
activador del plasminógeno
Fibrina
-
Productos de degradacibn de fibrina
Figura 59-16. Esquema de los sitios de acción de estreptocinasa, actwadordel plasminógeno tisular (tPA), urocinasa, in hibrdor del activadar del plasminbgeno tisular y uz-antiplasmina. Las dos ultimas proteinas ejercen acuones inhibidoras La estreptocinasa forma un complejo con el plasrninbgeno. que tiene actividad proteolitica; el complejo desdobla cierta cantidad de plasminbgeno a plasrnina, iniciando la fibrrnbltsis
la fase liquida donde son inactivados por sus inhibidores naturales. La prourocinasa es el precursor de un segundo activador de plasminbgeno, urocinasa, que no exhibe el mismo alto grado de selectividad por fibrina. La urocinasa, que se secreta de ciertas ckluIas epiteliales que recubren los conductos excretores (como los túbulos renales), interviene quizá en la lisis de cualquier cantidad dc fíbrina depositada en esos conductos. En la figura 59-16 se indican los sitios de acción de cinco proteínas que influyen en la formacibn y acci6n de plasmina.
La tPA y la estreptocinasa recombinantes se utilizan como cazadores de coágulos
La alteplasa (tPA) producida mediante tecnología de] DNA recombinante se utiliza terapkuticarnenie como fibrtnolltico, al igual que taestreptocinasa. Sin embargo, la última es menos selectiva que tPA, activante del plasminógeno en la fase líquida (donde puede: degradar fibrinógeno circulante) y tambikn del plasminógeno que se une a un coágulo de fibrina. La cantidad de plasmina producida por dosis terapéuticas de estreptocinasa puede exceder la capacidad de la alfaz-antiplasmina circulante, permitiendo que se degrade fibrinbgeno adernhs de piasmina y causando hemorragia que a menudo tiene lugar durante laterapéutica fibrinolitica. Debido a su selectividad para degradar fibrina, existe considerable interés terapkutico en el uso de tPA recombinante para restablecer la permeabilidad de arterias coronarias después de la trombosis. Si se administra con suficiente prontitud, antes de que se produzca un dafio irreversible del musculo cardiaco (aproximadamente seis horas despues de iniciada la trombosis), la tPA podria reducir de manera signifi-
cativa el indice de mortalidad por Icsi6n miocBrdica después de trombosis coronaria. Hasta ahora falta detenhnar si la tPA recombinante prueba ser superior a la estreptocinasa, miicho más econbmica, en el tralamiento de la trombosis coronaria aguda. El cuadro 59-12 compara algunas características trombolíticac de estreprocinasa y tPA. Hay varios trastornos, incluyendo cáncer y choque, en donde las concentraciones de activadores del plasminógeno aumentan. Además, las actividades antiplasmina apoyadas por la alfai-antitripsina y la al fazantiplasmina, pueden deteriorarse en enfermedades como la cirrosis. Dado que, ciertos productos bacterianos, como estreptocinasa, son capaces de activar el plasminbgeno, pueden ser la causa de la hemorragia difusa que en se observa en pacientes con bacterianas diseminadas.
Cuadro 3 - 1 2, Comparación de algunas propiedades dr :inasa (SK:)y activa~ dor del pl:asrnindgeno ti L) respectiO a su uso como tra mbolíticos* -
- .- ..- -.-.
-... .
--
Sc:lectiva par.a CI coigul PI.aduce plasminemia Ri:duce la m1cirtnlidad , .. . Causa reaccian aierglca Causa hipote:nsibn Costo por tratamiento ( r .-* Datos de Wruu Jx . 1 rriiiriFi5iin L , . , . L
' " . , A .
I
SK
-
L
$2900 1 nrurnnwlyblb reir acute myo.
eardial infarciion. Can kam Physician lW2;38:141 5. El costo dcl tratamiento es en dblares canadienses.
(Capítulo 59)
854 Bioqtiímica de Harper
Las plaquetas circulan normalmente en un estado no estimulado. Sin embargo, durante la hemostasia y la trombosis, las plaquctas participantes se tornan activas. Esta activaci6n es un fendmeno complejo que incluye cambios en la forma, secreción de los contenidos de sus gránulos y agregacidn. La trombina formada durante la cascada de la coagulación, inicia la activacibn plaquetaria in vivo mediante la interacción con su receptor en la membrana plasmatica (figura 59-1 7), Los sucesos ulteriores que conducen al estado activado son un ejemplo de señalización transmembrana, en donde un mensajero químico del exterior de la cklula genera molkculas efectoras en el interior. En este caco, la trombina actiia como el mensajero externo (estímulo o agonista). La interaccibn de la trornbina con su receptor estimula la actividad de una fosfolipasa C en la membrana plaquetaria. Esta enzima hidroliza a 4,s-bisfosfato de fosfatidilinositol (PIP2, un polifosfoinosítido) para formar las dos moléculas efectoras internas, 1,2diacilglicerol y l,4,5-trifosfato de inositol. En la accihn de numerosas hormonas tambien se produce hidrólisis de P ~ P (capítulo I 44), lo mismo que
La activación de las plaquetas comprende estirnulación de la vía de polifosfoinosítidos En la formación de un tap6n o r o m b o hemostático, las plaquetas deben experimentar tres procesos para que la hernostasia ocurra: 1) adhesidn a la colágena expuesta en los vasos sanguíneos; 2) liberación del contenido de sus grhnulos, y 3) agregacibn. Las plaquetas se adhieren a la colágena a través de receptores especiflcoc sobre la superficie de las plaquetas, que incluyen el complejo de glucoproteinas GPIa-IIa (integrina alfa~betai;capitulo 60), en una reaccibn que implica al factor von Willebrand. Éste es una glucoproteína secretada por las células endoteliales hacia el plasma, el cual estabiliza al factor VI11 y une la colhgena y el subendotelio. Las plaquetas fijan al factor von Willebrand por medio de un complejo de glucoproteínas (GPI1i-V-IX)sobre la superficie plaquetaria; esta interacción es en especial importante para la adherencia plaquetaria al subendotelio bajo las condiciones de elevada tensión de rasgado que se presentan en los vasos pequefíos y arterias estenosadas.
PLC
Acido araquidbnico
h 1 \,
-
plasmática
PIP,
-
J
Agregacibn
,IP,
DAG
':\ / '
,' Fosforilacibn
- - _ _ /
Membrana
de la cadena ligera de miosina
de
Liberación del contenido de gránulos plaquetanos (lisosomas, densos y alfa). incluyendo ADP
\ Actomiosina
\t Movimiento, cambia de forma
Figura 59-17. Esquema de la activacibn plaquetaria De arriba a abajo se describen el ambiente exterior, la membrana plasrnAtica y el interior de una plaqueta La trombina y la colágena son los dos mas importantes activadores plaquetarros. E l ADP se considera un agonista débil; causa agregacibn pero no liberacidnde granubo (GP, glucoproteina;RI-R~, varios receptores, AC, adenrlil ciclasa; P&, fosfolipasa A2, PL, fosfolípidos; PLC, fosfolipasa C; PIP2,4-5 bisfosfato de fosfalidifinositol,d M P , AMP ciclico, PKC, proteína cinasa, bXA2,tromboxano &, IP3, 1,4,5-trifosfato de inositot DAG, 1,2diacilglicerol. No se muestran las proteinas G que participan.)
:as, inmuno~lobulinasy coaplaci0n sanguinea
con medicamentos. El diacilglicerol estimula a la proteina cinasa C, que fosforíla a una proteína plaquetaria, la pleckstrina (47 kDa). La fosforilación de esta proteina causa la liberacibn del contenido de varios tipos de gránulos plaquetarios (lisosomas, gsanulos densos y gránulos alfa, cuadro 59-13). El ADP liberado de los gránulos densos tambikn puede activar plaquetas, conduciendo a estimulo de plaquetas extras. IP7 provoca la liberación de Caz- al citosol principalmente del sistema modular denso o los residuos interactúan con la calmodulina y con una cinasa de la cadena ligera de rniosina, conduciendo a la fosforilacibn de las cadenas ligeras de miosina. Mas adelante, estas cadenas interactiian con ta actina, acelerando el movimiento y causando el cambio en la figura plaquetaria. La colágena induce la activacibn de una fosfolipasa Az de la plaqueta mediante el aumento del Caz+,lo que causa liberacibn de ácido araquidónico a partir de fosfollpidos plaquetarios, con formacidn de trornboxano Az (capítulo 25), que a su vez, activa aún mlis a la fosfolipasa C, promoviendo la agregacibn plaquetaria. Además de la formación del agregado plaquetario, las plaquetas activadas se requieren, atravds de SUS recien expresados fosfolipidos ibnicos, para la aceleracibn de la activacibn de los factores X y II en la cascada de la coagulación (figura 59-1 0). Todos los agregantes, inclusive la trornbina, la colágena, el ADP y otros como el factor actívador de las plaquetas, modifican la superficie plaquetaria de manera que el fibrinógeno pueda adherirse al complejo de glucoproteinas GPllbIIIa (integrina alfalb-kta~;capitulo 60) de la superficie plaquetaria activada. En seguida, las mol~culasde fibrinógeno unen entre sí a las plaquetas activadas adyacentes para formar el agregado plaquetario. Algunos agentes que incluyen a la adrenatina, la seratonina y la vasopresina ejercen efectos sinérgicos con los agregantes. Cuadra 59-13. Algunos cornaonentes de los grhnulos pl -
1
L 1
. .
-
Con
-. -
ADP, ATP. Ca2+. ci i r. scruv,nItlra
1 Factor plaquetaric
S,*p-troml
tor del c regloblulina. (p-T . .--, cimiente derivado de plaquetas (ruc;F) (no son protclnas pl S).
Albbmrna, fibrinógcna. f factor de von Willebrar iialir;m) plfin-"'---' Licosbrnicot Varias E:nzirnas hirlroliticas
Y ias t
1
* f
PF-4 y B-TG son protelnas plaquctarias que rijan neparina. PDGF es un factor de irirri;m;~ntn El contenido se libera solo parcialmente por eievadas concenbaciones de agonistac fuertes
855
La activación de una fosfolipasa A, inducida por lacolhgena, mediante el aumento de las concentraciones de Caz' resulta en liberación de ácido araquidbnico a partir de los fosfolipidos plaquetarios, lo que lleva a la formación de tromboxano A2 (capitulo 25) mismo que a su vez puede activar la fosfolipasa C y promover la agregacibn plaquetaria, Las plaquetas activadas se requieren, a través de sus recién expresados fosfolípidos, independientemente de que formen el agregado plaquetario.
Las células endoteliales sintetizan prostaciclina y otros compuestos que afectan la coagulación y la trombosis Las células endoteliales en la pat-ed vascular contribuyen de manera importante a la regulación gtobal de la coagulación y la trombosis. Como se describio en el capitulo 25, estas células sintetizan prostaciclinas (PGT2), que son inhibidores potentes de la agregacibn plaquetaria, oponiéndose a la a c c i ~ nde los tromboxanos. Es probable que las prostaciclinais actúen estimulando la actividad de la adenilil ciclasa en Ia superficie membrana1 plaquetaria, El incremento resultante de cAMP intraplaquetario se opone al aumento de las concentraciones intracelulares, de Caz+,producido por IP3 y así inhibe la activación de las plaquetas (figura 59-17). Zas células endoteliales tienen otras funciones en la regulacibn de la trombosis. Por qjernplo, estas celulas poseen ADPasa, la cual hidroliza el ADP, y as[ se opone a su efecto como agregante plaquetario. Además, es probable que estas células sinteticen sulfato de hepmh, el cual se une avarios factores de la coagulacibn y también sintetizan activadores de plasmin6gen0, que contribuye a la disolución de co6gulos. El cuadro 59-14 enumera algunos compuestos producidos por las cklulas endoteliales, que afectan a trombosis y fibrin6lisis. El factor relajante del endotelio (bxido nítrico) se describió en el capitulo 58. El analisis de los mecanismos de captación de lipoproteínas aterogdnicas como LDL, por células endoteliales, de músculo liso y monociticas de las arterias, junto con estudios detallados de fa forma en que estas lipoproteinas lesionan esas cklulas es un hrea crítica de investigacibn en la bUsqueda de los mecanismos de la aterosclerosic (capitulo 28).
La aspirina es un medicamento antiplaquetario eficaz Ciertos fármacos (antiplaquetarios) modifican el comportamiento de las plaquetas. El m& importante es la aspirina (acido acetilsalicílico), que acetila de modo irreversible y, por tanto, inhibe al sistema de la cicIoox igenasa plaquetaria que interviene en la formaci6n de tromboxano A2 (capítulo 16), un potente agregador de plaquetas y tambien vasoconstrictor.
856
Bioquimica de Harper
Cuadra 59-14. Moléculas sintetizadas por dRlas endoteliales, que intervienen en 1a regulacihn de trombosis y fihrinhlisis -
- -
kcula
-
Acció
t
-
AIlPasa (1 una ectuer1- Degrada ADP (un activridor de plaquetas) hasta AMP t.P, - .-71ma3 Factor re1ajante der. i- Inhibe la adhesihn plaquetarin J . . vado dcl cndotcl~o, la activación al elevar la con(6xido n ítrico) ;MP ciclict1:combina i:(m 111 nara
S~ilfatode
inhibidora la trt Prostncic lina. (PCi1 ..
Inhil-ie la agsegaci
irin
plaquetas, tiempo de hemorragia, tiempo de tromboplastina parcial (TPP), tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), tiempo de protrombina (TP), tiempo de trombina, concentracion de fibrinógeno, estabilidad del coagulo de fibrina y medición de los productos de la degradaciiin de fibrina. La cuenta de plaquetac cuantifica su numero y el tiempo de sangrado es una prueba global de la función plaquetaria. La TPP es una medida de la vía intnnseca y el TP dc la extrínseca. Este ultimo se usa para medir la eficacia de anticoagulantes orales como warfarina y el TTPA sirve para vigilar la terapéutica con heparina. Se remite al lector a un libro sobre fisiología o hematologia para una descripción de estas pruebas.
una pro:
.
.
.
Troinboincidiilina (ur glucciprciieinii)
a C. que Iiii:go lor la trombsina . , C pareL g e n e r a r proreina activ adit: ésta. cnmbinada con protí:ha S. degrada los faclore5 V:i y VTIIa, limitando su S
activ
'
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--.
el plasmin cigeno a pllas4 la cual di;giee la fibri na: . .. . . . . . . iinn nrntrqqrrl ~1 ... -. inhib~dordel nctivador d d plnsininhgenti- 1 (YA[-1) se ie a l a acciiin de tI1A - - .i ~. Adaptado d :ndothelial cclls in hcmcis t a c ~ lhromho. . ,. $13 Una iniiamririon iiusp rract (RDrIij IYYL,L 1 : 145. ..>
Las plaquetas son muy sensibles a la aspirina; una cantidad tan pequeña como 30 mg/dia (una tableta de aspirina contiene por lo general 325 mg) elimina de manera eficaz la síntesis de tromboxano A*. La aspirina inhibe tambien la produccion de ptostaciclina (PG12, que se opone a la agregacibn plaquetaria y es vasodiIatador) en las cClulas endoteliales, pero al contrario de las plaquetas, estas células regeneran su ciclooxigenasa en pocas horas. De este modo, el equi2ibrio global entre tromboxano Az y prostaciclina puede desplazarse en favor de la última, oponiéndose a la agregación plaquetaría Por esta razón, las indicacionesde tratamiento con aspirina incluyen terapdutica de angina y evolución de infarto del rniocardio, además de prevención de ataque de apoplejía y muene en pacientes con ataques isqukmicoc cerebrales transitorios.
Se dispone de pruebas de laboratorio para la coagulación sanguinea y trombolisis Existen diversos análisis para medir las cuatro fases de la hernostasia descritas antes. incluyen cuenta de
RESUMEN El plasma contiene numerosas proteínas con diversas funciones. La mayor parte e5 sintetizada por el hígado y muchas están glucosiladas. La albúmina, que no está glucosilada, es la proteína más abundante y el determinanle principal de la presión osmótica intravascular; se une a muchos ligandos, como los fármacos y la hilimibina. La haptoglobina se une a la hemoglobina extracorpuscular, impide su pbrdida en el riñón y la orina, con lo cual preserva su hierro para nueva utilización. La transferrina fija hierro y lo transporta a los sitios donde se requiere. La ferritina es un reservorio intracelular de hierro. La anemia por deficiencia de hierro es un trastorno que se presenta con frecuencia. La ceruloplasmina contiene cantidades sustanciales dc cobre, pero al parecer la albúmina es m&. importante respecto al transporte de este metal. Se ha demostrado que tanto la enfermedad de Wilson como la de Men ke, mismas que reflejan anomalidadec del metabolismo del cobre, se deben a mutaciones en los genes que codifican una ATPasa tipo P fijadora de cobre. La alfa,-antitripsina es el principal inhibidw plasmático de la serina proteasa, en particular al inhibir la elastasa de los neutrbfilos. La deficiencia genética de esta proteína es una causa del enfisema y tambitn puede llevar a enfermedad hepática. La alfa?-macroglobulina es la principal proteina plasmhtica que neun-aliza muchas proteasas y conduce a ciertas citocinas hasta 6rganos ecpecificos. Las inmunoglobulinas desernpefian una funcibn clave en los mecanismos de defensa del cuerpo, al igual que las proteínas del sistema del complemento; se describen algunas de las características principales de estas proteínas. La coagulacion sanguinea es un proceso complejo que incluye factores de coagulacion, plaquetas y vasos sanguíneos. Muchos dc esos factores son cimógenos de serina proteacas, que se activan durante el proceso global. Existen dos vías de coagulación,
intrínseca y extrínseca; la primera sc inicia por exposicion de la colágena subendotelial y la última por el factor tisular. Las vías convergen en e l factor Xa, punto del que parte la vía final común que culmina en la conversión, catalizada por trombina, de fibrinógeno en fibrina, la cual es fortalecida por enlaces cru;lados, catalizados por el factor XIII. Existen defectos genéticos de factores de la coagulación y los dos mas importantes son los que alteran los factores VI11 (hemofilia A) y 1X (hemofilia B}. Entre los inhibidores naturales de la ~oagulación,el mas importante es la antitrombina 111; la deficiencia genetica de esta proteína puede producir trombosis. Para ser activos, los factores 11, VlI, IX y X y las proteínas C y S requieren la carboxilación, dependiente de vitamina K. de ciertos residuos
de glutarnato, proceso que es inhibido por el anticoagulante warfarina. La fibrina es disuelta por placmina; esta ultima se encuentra como un precursor inactivo, el plasminogeno, que puede ser activado por el activador del piasminogeno (tPA). Tanto el tPA como la esireptocinasa se utilizan extensamente para tratar trombosis incipientes en las arterias coronarias. La trombina y otros compuestos causan activaciiin plaquetaria, que comprende diversos procesos bioquimicos y morfológicos. La estimulación de la fosfolipasa C y la via del polifosfoinosítido es un suceso clavc en la activacion plaquetaria, aunque tambikn intervienen otros procesos. La aspirina es un medicamento antiplaquetaria importante que actúa por inhibición de la producción de tromboxano A:. H
REFERENCIAS Austen DEG: Clinical c h e m i s t ~of hlond coagulation. In: Scienti$c Foundatiom of Bzochcmistty in Clinical pracrice, 2nd ed. Williams DL. Marks V (editors). Ruttenvorth 1 Ieinemann, 1994.
Reiner AP, Davie EW: Iniroduction to hemostasis and thc vitamina K-dcpcndcnt coagulation factors In. Harrison's principl~sof Infern~iim~dicine,13th ed. Issel-
Bennett JS: Mcchanisms of platclct adhcsion and aggregation: An iipdate. Hosp Pract (Apr) 1992:27: 124. Rroze GJ: Tissue factor pathnay ihihitor and the revised thcory of coagulation Annu Rcl Mcd 1995.46: 103. Collen D, Lijnen HR: Basic nnd cl~nicalaspects of fibrinolysis and thrombolysic. Blood 1991;78:3 1 14. Crystal RG: al-Antitvpsin deficrcncy Pathogcncsis and treatment. Hosp Pract (Peh) 1991;26:X 1 . Furie B, Furie BC: Molecularandcellular biology ofblood coagulation. N Engl J Med 1992;326:800 Handlin RI: Anticoagulant, fíbrinolytic, and antipiafelet therapy. In: Harrison 'S Princzples of Interna! Medicrne, 13th ed. Isselbacher KJ et al. (editors). McGrawHill. 1994. Handlin RI: Disorders o f coagulation and thrombosis. In: Harrison S Principles of Interna1 medicine, 13th e d . Isselbacher KJ et al (editors). McGraw-Hill. 1994. Handlin RI: Disorders ofíhc platclct and vcssel ivall. In: f-larrison 'S Principles o/ Infernal Medicine, 13th ed. Isselbacher KJ et al. (edirors). McGraw-Hill, 1994. Kroll MH, Schafer Al: Biochernical mechanisms of platelet activation. Blmd 1989;74:1181. Lomas DA et al.: The mechanism of Z al-antitrypsin accumulation in the liver. Nature 1992;357:605.
Roberts WR, Loaier JN: Ncw pcrspectives on the coaglilation cascadc. Hosp Pract (Off Ed) Jan t 992;27:97.
bacher KJ et al. (editors). McGraw-HiI1. 1994. Rotb GJ, Calverley DC: Aspirin. platelets. and thrombosis: Thcory and practicc. Blood 1994.83.885 Sifers RN: Z and tlie insoluble ansmcr Nmrc 1992:357:541. Stites DP, T e r r AI, Parslow TG (editors): Rusis le Clinical Jmmunology 8th cd. AppIctoti & Lange, 1994, publicado por la fditorial T,I Manual Moderno. Mkxico. Venable ME et al.: Platclct-activaling factor. A phospholipid autacuid with diverse actions. J Lipid Res 1993;34:691. Whicher JT. Abnormalitics of plasma proteins. In: Scient fic F~nundationsof Raochemistty in Clinical Practice, 2nd ed. Williams DI,, Marks V (editors). Buttenvorth Heinemann, 1994. Worwood M: Disorders of iron metabolism. In: Scienfific Foundations ofBrochemisty zn Clinical Practice, 2nd ed. Williams DL. Marks V (editors). Buttcrworth Heinemann, 1994. Wu KK: Endothelial cells in hemostasis, thrombosis and inflarnrnation. Hosp Pract (Off Ed) Apr t 992;27:145,
Robert K Murray, MD, PhD
La sangre se compone de plasma y de diversas células. Algunas proteínas plasmaticas se describieron en el capitulo 59. Aqui se estudian las características bioquímicas principales de eritrocitos y de una clase de leucocitos, esto es, los neutr~fi!os.Los leucocitoc se clasifican en tres grupos: granulocitos, monocitos y Iinfocitos. Los pnmeros (conocidos tambien como leuc o c i t o ~polimorfonucleares [PMN] debido a sus nucleos multilobulados) contienen numerosos lisosomas y gránulos (vesiculas secretorias) y se dividen en tres clases (neutrófi!os, basofilos y eosinófilos) los cuales se distinguen una de otro por su morfología y las propiedades de tinción de sus grhulos. Los ncutrbfilos fagocitan bacterias y tienen una función importante en la inflarnacibn aguda. Los basófilos, semejantes a las células cebadas, contienen histamina y heparina e intervienen en algunos tipos de reacciones de hipersensibilidad inmunoliigica. Por su parte, los eosinófilos actúan en ciertas reacciones alirgicas y en infecciones parasitarias. Los monocitos son precursores de los macrófagos, cuya función en la fagocitosis, igual que la de los neutrófilos, es muy importante. Los linfocitos se clasifican corno ckhlas B o T. Los lhfocitos B sintetizan anticuerpo5 (capítulo 591, mientras que los T tienen funciones importantes en varios mecanismos de inmunidad celular, como lisar células infectadas por virus y algunas celulas cancerosas; el lector deber6 consultar un texto de inmunologia para una descripción detallada. Los neutrdfilos y los linfocitos son, respecto a la cantidad, las dos clases principales de leucocitos en la sangre normal. La función de las plaquetas en la coagulacibn se estudi6 en el capitulo 59 y no se describirá aquí. La diferenciacidn de las cklulas sanguíneas a partir de sus precursores es un tema importante que sólo se tratara de manera breve en este capítulo; los lectores deberan dirigirse a textos de histologia, biología celular o hematologia para una cobertura mas amplia.
Las células sanguíneas se han estudiado en profundidad debido a que se obtienen con facilidad, a su importancia funcional y a sil intervención en numerosos procesos patológicos. En capihilos previos se han descrito la estructura. y füncibn de la hemoglobina (Hb), las porfirias, la ictericia y los aspectos del metabolismo del hierro. La reduccion del numero de eritrocitos y de su contenido de Hb causa las anemias, grupo variado e importante de trastornos muy comunes en la practica cl inica. Ciertos sistemas, conocidos como gmpoc sanguineos, que existen en las membranas de los eritrocitos y otras células sanguíneas, tienen suma importancia en relación con latransfusibn sanguínea y el trasplante de tejido. El cuadro 60-1 resume las causas de ciertas enfermedades importantes que afectan a los eritrocitos; algunas se describen en este capitulo y las demás se estudian en otras secciones de este texto. Todos los 6rganos del cuerpo pueden ser afectados por la inflamacidn; los neutrbfilos desempefian una funci6n fundamental en la inflamación aguda, mientras que otros leucocitos, como los linfocitos, intervienen de manera decisiva en la inflamacion cronica. Las leucemias, definidas como neoplasmas malignos de tejidos formadores de sangre, pueden afectar a celulas precursoras de cualquier clase de leucocjtos; los tipos comunes de Peucemia son la mielocítica aguda y la crónica, que afectan a precursores de neutrófilos y la Iinfocitica aguda y crónica. La quimioterapia combinada, que emplea grupos de medicamentos, los cuales actUan en uno o m8s loci bioqulmicos, ha sido notablemente eficaz en el tratamiento de ciertas leucemias. La comprensión de la función de eritrocitos y Ieucocitos en la salud y la enfermedad exige el conocimiento de ciertos aspectos fundamentales de su bioquimica.
Cuadro 60-1. Resumen de las causas de algunos t rastornos importanites qiie alFectan a Iris eritrocilos .-
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Ingesliún excesiva de oxidantec (va-
cnmipuestos q u imicos y mt,dicamentn:,:I Bet~cienciagenetica en el sistema rnetahenioglobina reductwa dcpcndiente de YAD11 Mctahcmoglohina hrreditatia Sccucncia para e1 ctidón 6 de la cadcna j3 cambiada desde GAG en el gen normal Iiñsta Ci'i'l; en el gen para cl eritrocito ialcifurme, qiic conduce acustitur:ibn de valin a por ácido 6:IuXIUS
Anemia ae ceiuias taiciformes
tamice C
p-l'dñsemia~
Mutacion,es en los getles para a-e:1 Oj bina, en su mayor riarte entrecru. . . zamiento desigual y delecinnes grandes y menos común. sin sentido j1 dcsplazam rcn de referencia Z n A -..., *.. Una varieuou l i i p l C A L C i 1 5 1 uc ~ ~ ~ ~ ciones en el en p,ara 0-giohin% incluyendo delccion~ es, muiacioiles sin sentido y por des]~lwamien~ci de marco de referencias y otras cliie afectan cada aspccre de sus eslruct um iplo. sitios dt:empalme, rnu(por e~err iantec de I promotor)
Absorcibn escnsn de E112debida a deficiencia dcl factor in trínseco. sec.rttado nor malmente 1por las ctlui l a ~ parietale:;giisiricos vciIciciicrnuc ~ G I W10- , Ingestión pnre. an9arcion acriciente o incremento en la demanda de folaro ( p r ejemplo, en mbarazo) E hereditaria Deficiencim en la cmtidad o en lacstructura de la espectrina Deficiencia de glucom- Diversas mutaciones en CI gen (ligado 6-fosfato deshidroge- ni cromosoma X) para G6PD, en su nasa (GóPD) mayor parte mutaciones en un punto Deficiencia de piruvato OuizA diversas mutaciones en el gen de
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causan anemia hemol Itica, igtial (
aigunor ae ios cierna?uaqtomos cnumirirndn~ .. ---u.
EL GLOBULO ROJO ES SENCILLO EN TÉRMINOS DE SU ESTRUCTURA Y FUNCIÓN Las funciones principales de tos eritrocitos son relativamente simples y consisten tanto en transportar y ceder oxigeno a los tejidos como en ayudar a la ellminacidn de bidxido de carbono y protones formados por el metabolismo celular. Por tanto, tiene una estructura mucho más sencilla que gran parte de las
células humanas, pues se compone, en esencia. de una membrana que circunda una solución de Hb (esta constituye alrededor de 95% de la proteína intracelular del eritrocito). No hay organelos intracelulares, como mitocondias, lisosomas o aparato de Golgi. El eritrocito humano, igual que la mayor parte de los globulos rojos de animales, no tiene núcleo. Sin ern bargo, no e5 inerte en cuanto a metabolismo. Hay sintesis de ATP por glucblisis, ya que este es necesario para conservar su forma bioconcava y tambidn en la regulacion del transporte de iones (por ejemplo, gracias a la acción y de la proteina de intercambio de N$-K'-ATPasa anionico [vease despuds]) y de agua hacia el interior y el exterior de la célula. La forma bic6ncava incrementa la proporción superficie-a-volumen del eritrocito, facilitando el intercambio de gases. t o s glóbulos rojos contienen componentes citoesqueleticos (véase despuks) que desempefian una función importante en la determinaci6n de su forma.
Alrededor de dos millones de eritrocitos entran a la circulación l t a por segundo La cantidad normal de eritrocitos en varones adultos es de 4.6 a 6.2 millones/pL y la cifra correspondiente en mujeres es de 4.2 a 5.4 millones/pL. Su número total en la circulación es de alrededor de 2.5 x 10 13. Por otro lado, la concentracibn normal de Hb en varones es de 14a 18 d d L y en mujeres es de 12 a 16gldL. Los valores del hematbcrito (volumen de eritrocitos compactos) para varones y mujeres son de 42 a 52% y de 37 a 47%, respectivamente. La duración de la vida de eritrocitos normales es de 120 días; esto significa que al día se remplaza un poco menos de 1% de la poblacidn de glbbulos rojos (200 mil millones de ~ H u l a so dos millones por segundo). Los eritrocitos nuevos recién lanzados a la circutacj6n aiin contienen ribosomas y elementos del reticuIo endoplásmico. El RNA de los ribosomas puede identificarse con colorantes apropiados (como azul de crecilo} y los g/bbulos rojos que aun lo contienen se denominan reticulocitos; alrededor de 1% es su numero normal en una cuenta total de eritrocitos. La duraci6n de la vida de un eritrocito puede acortarse de modo impresionante en diversas anemias hemolfticas. El numero de reticulocitos aumenta de manera notable en estos trastornos, ya que la medula dsea intenta compensar la rkpida degradacibn de los g1óbulos rojos, incrementando la cantidad de: eritrocitos nuevos, j6venes en la circulación.
La eritropoyetina regula la producción de glóbulos rojos
La eritropoyetina humana es una glucoproteina de 166 aminohcidos (masarnolecular aproximada de 34 kDa).
Su concentración en plasma puede medirse por Tadioinmunovaloracion. Es el regulador principal de la eritropoyesis. Se ha aislado y obtenido la secuencia de un cDNA para eritropoyetina, la cual es sintetizada en su mayor parte por el riñbn y secretada en respuesta a hipoxia al torrente sanguíneo. que la transporta a la médula osea. Alli interactúa con los precursores de eritrocitos por medio de un receptor específico, que es una proteína transmembrana formada por dos subunidades diferentes y posee varios dominios. Piiede ser una tirosina cinasa, pero esto no se ha establecido de manera definitiva. Tampoco se conoce la identidad del segundo mensajero y de los genes específicos en las cklulas blanco afectadas. La eritropoyetina se relaciona con un precursor eritrocitario, conocido como unidad eritroide causante del estallido (BFU-E), ocasionando su prolifcración y diferenciacion. Además, interactúa con precursor tardío de eritrocitos, llamado midad eritroide formadora de colonia (CFU-E), causando también su proliferaciún y diferenciación ulterior. Para lograr estos efectos, la eritropoyetina requiere la cooperación de otros factores (por ejemplo, la interleucina-3 y un factor de crecimiento insulinoide; figura 60-1). La disponibilidad de un cDNA para la eritropoyetina ha hecho posible la producción de esta hormona en cantidades sustanciales para anhlisis y propbsitos terapduticos; antes de la preparacibn de este cDNA, el aislamiento de la eritropoyetina a partir de la orina humana, producía cantidades muy pequeaas de la protefna. El uso principal de la eritropoyetina humana recombinante, ha sido el tratamiento de unos cuantos estados anémicos, como el causado por insuficiencia renal.
NW MEROSOS F A C fORES DEL CRECIMIENTO REGULAN LA PRODUCCIÓN DE LEUCOCITOS Además de la eritropoyetina, en años recientes se han identificado numerosos factores del crecimiento etitropoydtico. Esta área de estudio, unida al conocimiento sobre diferenciacidn de ctlulas sanguineas, s pueden ser útiles en terapéutica proporciona f a c t o ~que y que tienen implicaciones en la comprensilin de la
proliferación anormal de las cdlulas sanguineas (por ejemplo, las leucemias). Igual que la eritropoyetina, la mayor parte de los factores de crecimiento aislados son glucoproteinas, muy activas in vivo e in vitp-o,que interactúan con sus celulas blanco a través de receptores de superficie específicos y, por último (por medio de seirales intracelulares), afectan la expresión ginica, promoviendo la diferenciacidn. Muchos se han donado, lo cual permite su produccibn en cantidades relativamente grandes. Dos que interesan en xiarticular son los factores estimulantes de colonia de granulocitos y de granulocitos-macrófagos (G-CSF y G M X S F , respectivamente). El G-CSI' es bastante especifico, induciendo principalmente a granulocitos. Por su parte, el G M X S F afecta a diversas células precursoras e induce a granulocitos, macr6fagos y eosin~filos.A la produccion de neutrofilos muy deprimida, se le llama neutropenia. En particular, es posible que este trastorno se desarrolle en pacientes tratados con ciertos regímenes quirniaterap&uticosy después de trasplante de mkdula osea, situación en la cuat están expuestos a contraer infecciones abrumadoras. Algunos estudios han mostrado la utilidad de la administración de G-CSF a estas personas para estimular la producción de neutrófilos. Sin embargo, ha sido preocupante la duda de que administrar G X S F a personas con neutropenia grave durante tratamiento de leucemia podría estimular tambjen la proliferaciiin de las ctlulas leucémicas. Investigaciones recientes indican que este problema no se presenta si la dosificación de G-CSF se mantiene baja, pero debe tenerse precaución.
EL ERITROCITO TIENE UN METABOLISMO ONICO Y RELATIVAMENTE SIMPLE
En el cuadro 60-2 se resumen vatjos aspectos del metabolismo en los eritrocitos, muchos de los cuales se han descrito ya en otros capitulas de este texto.
eritrocito posee un transpodad0r de glucosa en su membrana
La velocidad de entrada de la glucosa a Ios eritrocitos bastante más elevada de la que podria justificarse
-- _ EPO GM-CSF
Cbiula p ~ c u ~ o r a pluripotencial
BFU-E IL.3
CFU-E
Precursores eritndes
_
Erltroutos maduros
Figura 60-1. Esquema muy simplificado de la diferenciaclbn de EBlulas precursoras a eritrocitos (BFU-E, unidad eritrolde causante del estallido; CFU-E, unidad eritroide formadora de colonia; Epo, eritropoyetina: GM-CSF, factor estimulante de granulocitos-maudfagos;lM, interleucina-3.)
Bioqzsímica de Harper
86.2
(Capítulo 60)
Cuadro 63-2. Resumen de aspectos importantes del metabolismo del- -eritrocit.-. . . --. C
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E1 eritrocitci dcpcndc fuertemente de la g fuente di: energía; su membrana contií &-a--?.-
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LULIUIC~ LIL KIULUM
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de clctada afinidad
u forma de producc
uctirlsis, que genera tactato . Leniao a que no nay rniroconarim en ei eritrocito. no se produce,4TP por fa~sforilacrbn i oxidativa E.l eritrocitci tiene un2i variedad de transpc iie mantienen el equilitirio hidricci y el iiinicr A? L:-dk--r*l:--"-&-.~ L UICULLIUIICC La p i u u i r ~:*A ~ i uUE ~ i L , J ~ I ~ I V ~ L U Y L I L T ; I VUI . que se relacionan ein forma estrecha con la glucólisis. es irnprinante en la reguIaciúnI de la cap;icidad de I3b para transportar oxi;peno En el eritrocito opera la vía del fosfato pentosa fquc inetaboliza 5 a 10% dcl suministro total de glucosa) y produce NADPH: es cornfin la anemia hemoIítica causada por deficiencia de la actividad de glucosa-ófosfato drishidrogen asa El glutation reducido (CISH) es ir :n el metak10limo del eritrocito, cn partc pai :star la acci fin ;,4r,t. +. .iiAn..;.il n r * Aa 1l riurtrci6n de perbx,,,,, cuit k i L i r c i i L i e i t r o i e ILg) oxidado ( G Y S Y ? ~ )a1 estado reducido El hierro es rcducido al estado ferroso pcir accibn (le1 sistema de la metahemoglobina reductasa aepenaiente de NADI 1 que incli :rolno bs r,eductasa y cl citocrornt3 b5 En cl erítrot:ito no hay i glucbgenti , ácidos giat . . :*:., , , SOS. proteina ni aciucis nucieicos; pero algunos iipianq (por ejem plo. el colesterol) de 1:3 mernbran pueden iritercambia:rsc con los lípidos pl; rrespondi entes El eritrocito conriene cierras enzlmas aei meraooiismo nucleótidos (por ejemplo, adenosinn desamina: pirimidina nucleotidasay adcnilato cinasa;las deficie cias de esra enzima causan algunos de los casos nnemia hemolltica Cuando el erirrocito a Icanza el f iración de vida, la globina es (iegradada ; dos (que sl utilizados de nuevo e--i i e-1 i L U C ~ ~ I UCI~ ,I I I C I11) se libera c hem y también se utiliza dc nucvo y el componerite tetrapirrhlico del hem se convierte en bilirrubina que excreta--en gran parte medio dc la bil - -al intestino.por --.I
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tes; al contrario de1 transportador de glucosa del eritrocito, algunos de ellos dependen de insulina (por ejemplo, en el miisculo y el tejido adiposo). Estos Últimos tipos de transportadores despiertan un gran interés debido a que su reclutamiento desde sitios intracelulares hasta la superficie de las celulas del músculo esquelético pueden ayudar a explicar la resistencia a insulina exhibida por algunos pacientes con diabetes no insulinodependiente (capitulo 5 1).
,os reticulocitos sintetizan sroteína de manera activa El eritrocito maduro no puede sintetizar proteina. En cambio, los reticulocitos si realizan este proceso. Una vez que los reticulocitos entran a la circulacion, pierden sus organeEos (ribosomas, mitocondrias, etcktera) en el trariscurso de 24 horas, convietiéndose en e r i m i tos jbvenes y, por consiguiente, se anula su capacidad de sintetizar proteína. Extractos de reticulocitos de conejo (obtenidos por inyeccibn al conejo de un compuesto quirnico -fenilhidracinaque causa anemia hemolitica intensa, de modo que los eritrocitos son remplaziidos casi en su totalidad por reticulocitos) se emplean de manera extensa como un sistema in virro para sintesis de proteína. Los mRNA endbgenos, presentes en estos reticulocitos, son destruidos mediante
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ladra 603. Algunas phpiedaT~del =$&ador
de gIucosa de la membrana del eritrocito
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eritrocito uestra esliecificidad. para glu cosa y Dlacionada:3 (Ias L-he: Y O S no ~ SI in transpor .. ' . . , inciona a aireaeaor ae 1 >-/O ac si1 v , ,a ia concenracion fisiolhgica de la glucosa sanguínea es satut.abrey puerle scr inhibido por ciertos anilogos de pluco,sa asta la fecha se han identificadocinco transpvl Lriuul de gIucosa. SI iero distintos, en los tc:¡idos dc ni;amifcros, s ansportadcir del eritrticito uno cle el los . II
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I
correspondiente en n inado su sc por difusi6n simple. En realidad, es un ejemplo de difusión facilitada (capitulo 43). En el proceso interviene una proteína especifica llamada transportador d e glucosa o glucosa permeasa. Algunas de sus propiedades se enumeran en el cuadro 60-3. La entrada de glucosa al eritrocito es de rnfucima importancia debido a que es el energCtico principal de estas cilulas. A partir de varios tejidos, se han aislado cinco transportadores de glucosa relacionados pero diferen-
-
3nstituye alrededor de: 2% de la protcina membrana1 del
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rjido adipciso smpleta de ;aminoácfdc
Transportaglucosticuando se inserta en Iiposomas amnciaies Se estima que contiene 12 segmentos helicoidalcs transmembrana FLincionx por formaci6R de un pcx o regula~Jo por con1puerta en l a membraria para perrnitir el pasr)de glucos:8. La conforrnaciiin delI poro dcpc:tide de la 1presencia . . cle glucosa y puede oscilar con rapidez (aproximadamente 900 vecesfseg) .-
tiene varios destinos. La enzima cataIasa, presente en muchos tipos celulares, lo convierte a HzOy O: (reacci6n 4). Los neutrofilos poseen una enzima única, la mieloperoxidasa, que usa HIOl y haluros para producir hcidos hipohalosos (reaccibn 5); este tema se estudiar5 más adelante. La enzima que contiene selenio, la glutati6n peroxidasa (capitulo 22) actuará tambidn sobre glutatión reducido (GSM) y Hz02 para generar glutatión oxidado (GSSG)y HzO (reaccibn 6);esta enzima puede usar tambikn otros peróxidos como sustratos. Los OH' y OH-pueden formarse a partir de HtOl en una reacción no entimdtica catalizada por Fe2+(reacci6n de Fenton; reacción 7). El Oi y HzOzson los sustratos en la reaccibn de Haber-Weiss catali7ada por hierro (reacción S), que también produce OH' y OH-. El superóxido puede liberar los iones hierro a partir de ferritina. Por tanto, la producción de OHm puede ser de uno de tos mecanismos que conducen a lesión tisular debido a sobrecarga de hierro (por ejemplo, hemocromatosis; capítulo 59). Los compuestos químicos y las reacciones capaces de generar especies de oxígeno con potencial tóxico pueden reconocerse como prooxidantes. Por otra parte, los compuestos y reacciones que eliminan estas especies, disponen de ellas, suprimen su formaciOn o se oponen zt sus acciones son antioxidantes e incluye a compuestos como NADPH, GSH, ácido ascórbico y vitamina E. En una célula normal existe un equilibrio apropiado pro0xidante:antioxidante.No obstante, este balance puede desplazarse hacia los prooxidantes cuando la producci~nde especies de oxigeno aumenta de modo considerabIe (por ejemplo, despues de la ingestibn de ciertos compuestos quimicos o medicamentos) o cuando la concentracidn de antioxidantes disminuye (cuando hay inactivación de las enzimas que intervienen en la eliminacibn de las especies de oxígeno y condiciones que reducen la concentración de los antioxidantes antes mencionados). Este estado se llama, tensihn oxidativa y puede conducir a lesi6n grave si la tensibn es masiva o prolongada.
el uso de una nucleasa, cuya actividad puede inhibirse por adici6n de Caz'. Luego, el sistema se programa de nuevo mediante la adición de mRNA purificado o de extractos de mRNA de células enteras y, en presencia de S"L-metionina u otros aminoácidos radiomarcados, se sintetizan proteínas radiactivas. Éstas se separan aor EGPA-SDS y se detectan por radioautografía.
La superóxido dismutasa, catalasa y glutatión protegen a loa eritrocitos de la tensión y daño oxidativos Durante el curso del metabolismo se producen oxidantes potentes, tanto en los eritrocitos como en gran parte de las celulas corporales restantes. Los oxidantes son superóxido (O-.?, perbxido de hidrógeno ( H 2 0 1 ) , radicales peroxilo (ROO') y radicales hidroxilo (OH'). El Último es una molécula muy reactiva y puede reaccionar con proteínas, ácidos nucleicos, lipidos y otras mol&culas para alterar su estructura y producir daRo tisular. Las reacciones enumeradas en el cuadro 6 0 4 intervienen de manera importante en la formación de estos oxidantes y en su eliminacibn; todas se consideraran aqui. El superbxido se forma (reacción 1) en el eritrocito por medio de la autooxidacibn de hemoglobina hasta metahemoglobina (se calcula que alrededor de 3% de Hb se autooxida al día en los eritrocitoshumanos); en otros tejidos, se forma por la accibn de enzimas como citocromo P450 reductasa y xantinaoxidasa. Cuando son estimulados por contacto con bacterias, los neutrbfilos muestran un estallido respiratorio (vkase despuhs) y generan superbxido en una reacción catalizada por NADPH4xidasa (reaccion 2). El superóxido se transforma esponthneamente en HzOz y 02; sin embargo, la velocidad de esta misma reaccion se acelera de modo úwnendo porta acci6n de la enzima superdxido dismutasa (reaccibn 3). El peróxido de hidrbgeno experimenta diversos cambios; esto es,
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Cuadro 604.Kiitciones de importanicia en relaci6n con la ten&& lulas sang;uineas y de varios tejidos .. . .
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e varias rca cciones)
(2) NADPI,-v,,uma (3) Superáiridp dismutasa (4) Catalasi1
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(7) Rexcibn de Fentoin (8) Reacciún de Habc r-Wcíss caltalizada por hierro (9) G t ucosa-&Tosfato deshidrogenasa (G6PD)
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(5) Mieloperoxioasa (6) Glutatibn peroxidrisa (deptnclicnte de Si2)
(10) Glutatión reductas
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2 GSH + R-O-OFlj GSSG + Ii2U f KIIt FeZt+ H 2 0 + Fe3' .+ OH'+ OH02'1. H202 -+ O2 + OH' + OH ..--. . G6P + NADP + 6 Fo~iugrucun~to + NADF-n r n Tr-S-S-G + NN)PH + H+ + 2 GSW + NADF
864
Bioquímica de Harper
En la actualidad se considera que las especies de oxigeno tienen un papel importante en numerosos tipos de daño celular (por ejemplo, debido a la administración de diversos compuestos quimicos o por isquemia), algunos de los cuales pueden desembocar en muerte celular. La prueba indirecta que respalda la funcirin de estas especies en la lesión celular es que la administración de una enzima como superhxidu disrnutasa o catalasa protege contra daiio celular en la situacihn bajo estudio.
La deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa es frecuente en cierkas regiones y es causa importante de anemia hemolitica El NADPH, producido en la reacción catalizada por la glucosad-fosfato deshidrogenasa (cuadro 6 0 4 ; reacciiin 9) en la via de la pentosa fosfato (capítulo 221, tiene una funciún cIave en el suministro de equivalentes reductores cn el eritrocito y otras ctlulas, como el hepatocito. Debido a que la vía de la pentosa fosfato es su Iúnico medio de producir NADPH, el gl6hulo ro-io es muy sensible e1 dafío oxidativo si la función de esta vía se altera (por ejemplo, por deficiencia enzirnática). Una función de NADPW consiste en reducir GSSG a GSH, reacción catalizada por la glutatibn reductasa (reacción 10). La reducción en la actividad de la glucosa4-fosfato deshidrogenasa, debidaamutaciiin, es en extremo frecuente en algunas regiones del mundo (como en AFnca tropical, cuenca del Mediterráneo, ciertas partes de Asia y en Norteamkrica en individuos de raza negra). Es la mAs común de todas las enzimopatias (enfermedades causadas por momiatidades de enzimas) y se han distinguido m& de 300 variantes gendticas de la enzima; por lo menos 100 millones de personas padecen deficiencia de esta enzima, debido a esas variantes. El trastorno originado por la deficiencia de glucosa4-fosfato deshidrogenasa es la anemia hemolítica. EI consumo de habas (Vicia faba) por individuos con esta deficiencia puede precipitar un ataque de la enfermedad ( q u i d debido a que las habas contienen oxidantes potenciales). Además, cierto número de medicamentos (como el antipalúdico primaquina [el trastorno causado por su ingestibn se conoce como anemia bemolttica sensibles primaquina] y sulfonarnidas) y de compuestos quimicos (por ejemplo, el naftaleno} precipitan un ataque, debido a que su ingestidn conduce a la produccibn de H202 o Ozl. Normalmente, H201es degradado por catalasa y glutatibn pperoxidasa (cuadro 60-4, reacciones 4 y 6); la última de ellas produce un aumento en la producci6n de GSSG. De este compuesto se regenera GSH mediante la accibn de la enzima glutatión reductasa,
la cual depende de la disponibilidad de NADPH (reacción 10). Los eritrocitos deficientes en actividad de la glucosa4-fosfato deshidrogenasa no puedcn generar suficiente NADPH para regenerar GSH a partir de GSSG, lo que, a su vez, trastorna su capacidad para eliminar H202y radicales de oxigeno. Estos compuestos pueden causar la oxidacihn de grupos SH críticos en las proteínas y qui7A la peroxidación de lípidos en la membrana del eritrocito. causando su lisis. Algunos de los grupos SH de la hemoglobina se oxidan y !a proteína precipita dentro del eritrocito, formando los Ilamadoc cuerpos de Heinz, que se tiñen de púrpura con violeta de cresilo. La presencia de cuerpos de Heinz indica que los eritrocitos han estado sujetos a tensibn oxidativa. La figura 50-2 resume la cadena posible de procesos en la anemia hemoIitica causada por deficiencia de glucosad-fosfato deshidrogenasa.
La metahemoglobina es inútil para transportar oxigeno El hierro ferroso de hemoglobina es susceptible de oxidación por superoxido y otras sustancias oxidantes, con forrnacibn de metahemoglobinq que no puede transportar oxigeno. En la sangre normal s61o hay cantidades muy pequefias de ésta, ya que sus eritrocitos poseen un sistema (el sistema de la NADH
Mutaciones en el gen para GGPD
Disminución de los valores de NADPH
Disminucibn de la regeneracidndeGSH a partir de GSSG porglutatibn reductasa (que usa NADPH)
Oxidacbn, causada por concentración baja de GSH y elevada d.e oxidantes intraaelulares (por qemplo, 029,de grupos SH de Hb (que forman cuerpos de Heinz) y de protelnas membranales, que alteran la estructura de la membrana e incrementan la susceptibilidad del eritrocito a ser ingeridos por macróiagos (también es posible la iesibn penoxidatrva a Ilprdos membranales)
Figura 60-2. Resumen de proceso probables que causen anemia hernolltica causada por deficiencia de la actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (GGPD)
hérnico de regreso al estado FeZ'. Este sistema esta constituido por NADH (generado por glucolisis). una flavoproteína llamada citocromo 65 reductasa (conocida tarnbi6n como metahemoglobina reductasa) y citocromo hs. El Fe3' de metahemoglobina es reducido al estado Fe2+por accí6n de citocromo hs reducido: ~ b - ~ e* Cit -
+~
b - ~ +eCit ~ b5., '
Luego, el citocromo bs seducido se regenera por acción de la citocromo bs reductasa: Cit bgox + NADH -+ Cit b 5 d
+
NAD
La rnetahemoglobinemia es hereditaria o adquirida La metohemoglobinemia puede clasificarse como hereditaria o adquirida mediante la ingestión de ciertos medicamentos o compuestos químicos. Ninguno de los dos tipos se presenta con frecuencia, pero los mkdicos deben estar conscientes de su existencia. Por lo general, la forma hereditaria se debe a la acrividad deficiente de la metahemoglobina reductasa, transmitida de una manera autosómica recesiva. Ciertas hemoglobinas anormales (Hb M) son también causas poco frecuentes de rnetahemoglobinemia. En la Hb M, la mutación cambia el residuo aminoacidico al cual se adhiere el hem, lo que altera su afinidad por el oxígeno y favorece su oxidacihn. La ingestibn de ciertos medicamentos (como Eas sulfonamidas) o compuestos químicos (por ejempio, la aniIina) pueden causar metahemoglobinernia adquirida. Por lo general, la cianosis (color azuIoso de la piel y las membranas debido a un incremento en ta cantidad de hemoglobina desoxigenada en la sangre arteria1 o en este caso por aumento de metahernoglobina) es el signo de presentacibn en ambos tipos y se hace evidente cuando mbs del 10% de Hb está en la forma meta. El diagnhstico se logra mediante el aniilisis espectrosc6pico de la sangre, el cual revela el espectro de absorcibn tipico de la metahemoglobina. Ademh, una muestra de sangre que contiene metaHb no puede oxigenarse a 1OQO/o cuando se burbujea oxígeno a tLavks de ella, en tanto que la sangre normal desoxigenada si [o logra. Puede usarse electroforesis para confirmar la presenciade una hemoglobina anormal. La ingestión de azul de metileno o de ácido ascbrbico (agentes reductores) se emplean para tratar metahemoglobinemia leve causada por deficiencia enzimática. La metahemoglobinemia masiva aguda (causada por ingestidn de compuestos quimicos) debera tratarse por in yeccidn intravenosa de azul de metileno.
SE SABE MAS ACERCA DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO HUMANO QUE DE LA MEMBRANA DE SUPERFICIE DE CUALQUIER OTRA CÉLULA HUMANA Para estudiar la membrana eritrocitaria se han empleado diversos enfoques bioquimicos (capitulo 43). Incluyen anhlisis de proteinas membranales por EGPASDS, cl uso de enzimas especificas (proteinacas, glucosidasas y otras) para determinar la ubicación de proteinas y glucoproteínas en la membrana y varias tecnicas para estudiar tanto la composición lipídica como la disposicion de lípidos individuales. También se han usado de manera extensa tkcnicas morfol6gicas (por ejemplo, microscopio electrónico, congelaciónfractura y microccopio electrónico) y otras (como el empleo dc anticuerpos a componentes especificos). Cuando los eritrocitos se Iisan bajo condiciones específicas, sus membranas se sueldan en su orientacion original para formar fantasmas ("fantasmas con el Iado correcto al exterior"). Alterando las condiciones es posible hacer que su lado citosólico quede hacia el exterior al momento de sellarse de nuevo ("fantasmas con el interior hacia afuera"), Los dos tipos de fantasmas han sido útiles en el anhlisis de la disposici6n de proteinas y Iípidos específicos en la membrana. En años recientes, se ha logrado preparar cDNA para numerosas proteinas de esta membrana, permitiendo la deduccihn dc sus secuencias aminoacidicas y sus dominios. En resumen, la membrana eritsocitaria es la más conocida de las ctilulas humanas (cuadro 60-5). Cuadro 6&S. Resumen de informacidn bioquírnica la membi-ana del e a 1.a es una bical 8 50% de pn
. .
Las clases iipiciicas pnncrpaies son tostoiipirios y coipsteroi: ros foslolípiclor;mayores st colina (X'C) i, fosfatidiletatinlarninn (PE) y fns i (PS)junbo con csfin goniielina (Slih) t o s fosfolipidos que contienen coiina. r L y spn,predominan eri la capa exterior y los fosfolipidc,S que co*ti enen aminri (PEy PS), cn la capa intcrior Los gtucoesfingol ípidos (GSI,) (GSLneutros. 68nglirisidos ;ir cspccies complejas. ~ncluyendosustancia de grupo sangiiineo AUO) constituyen entre 5 y 10% del total de Eipidos El mAlisis por EGI'AS-DS indicn qiie la membrana contiene ~proximadamentc10pmtcina mayores y m& de 100 cspccles mentin Las proteínas 1 :que incluyt:n cspectrina. anquirinzt. proteina de u anihnico,. actina g b anda 4.1) s.e , han estudiauo intensamenre y se conocen las caraL7enstica de su iibicacion {por ejemplo, integral o perilerica), estnictiira y fiinci Muchas de las S glucoforinas) quc contrcnen caaenas ae ohgosacanuos enImridos p r O o por N, localizadas hcie exterior de la menibrana
.
El análisis por EGPA-SDS define las proteínas de la membrana eritrocitaria Cuando las membranas se analizan por EGPA-SDS, se identifican aproximadamente 10 proteínas principales (figura 60-3) y se ha demostrado que varias son glucoproteinas mediante el uso del rcactivo ácido peryódicdchiff (PAS; capitulo 56). Su migracibn en EGPA-SDS se us6 para designarlas, de modo que la más lenta (y por consiguiente la de masa molecular más elevada) se conoce como banda 1 o espectrina. Todas estas proteinas se han aislado, muchas se han identificado y se ha obtenido abundante informacion sobre sus funciones (cuadro 60-6). También se conocen muchas de las secuencia? de sus arnino5cidos. Además, se ha determinado que éstas son proteínas membranales integraIes o periféricas; están situadas en la superficie exterior, en la superficie citocblica y se expanden a través del grosor de la membrana (figura 6 0 4 ) .Tambidn se han detectado numerosos componentes rnembranales menores mediante el uso de metodos de tincibn sensibles o por etectroforesis bidimensional en gel. Uno de estos componentes es el transportador de glucosa descrito antes.
Las proteinas integrales principales de la membrana eritrocitaria son la proteína de intercambio aniónico y las glucoforinac La proteína de intercambio aniónico (banda 3) es una glucoprotetna transrnembmna, con su terminal carboxilo en la superficie exterior y su extremo arnino terminal en la supeficie citoplhsmica. Es ejemplo de una proteína membrana1 d e paso mihtiple, que se
Pmtelna de intercambio anibntco 4.2
Actina
S
G3PD 6 7
Ttncibn con azul de Coomassie
Tincidn m n PAS
Figura 60-3. Diagrama de las principales proteínas rnembranales del erlrocito humano, separadas por EGPA-SDS. Las bandas identificadas por tinedn con azul d e Coomassie se muestran en los dos canales de la izquierda y las glucoproteinas detectadas por tincibn con ácido perjbdicoreactlvo de Schiff se muestran en el lado derecho. (Reproducida con permiso d e Beck WS y Tepper RI: Hemolytic anemias III. Membrane disorderc In Hernatoiogy, 5th ed. Beck WS [eddorj.The MIT Press, 1991.)
-uadro 6 0 4 . Proteinas principaleidb+lamembrana del eritrociti3* p .
.-
--
tegcai (1) o -ifErica (P;
Pro
p .
' Espectrinr Espectrin; Anquirina Anquirina hquirina Anquaina Proteína d bio aniónico lnnominat Actina Gliceraldeihído-3-fos fato deshic Tropomiosina . Innominw1ia las A, R y C Gluceforii --
* 4daptñdo dc Lux SE y Diecker 1'5. D isordcrs of t he red cell n
P P P P P P
-
a
p .
A
75
1
15 10
P
10
P
P P P 1
-
eletnn Hereditaty spher I hercditaty el liotocytosi1s. ICap. 95 en: 7he Melabo,lic Bosrs of l 'nherited Di: iease, 6th eo. scrrver t iiy colab. (editores). Mcbrnw-kiiii, I1989. . .. . . . . -. , LI numero ac baJIUnX refiere a laposicion al emigrar en EGPA-SDS (figura 60-3). l.= glucoproteinas se detectan por tincih con kido peryódico-rcactivo de Schiff. Existen otros componentes (por ejemplo 4 2 y 4.9) no enlisiadoc. La espectrina original es atPr
1
'
I
-
Masa m# aproxima
INTERACC~~~N ESPECTRINAANQUIRINA3
lnteraccibn Espectrinaactjna4.l
AUTOASOCIACI~N DE ESPECTRINA
Figura 6 0 4 . Esquema de la interacción de proteínas citoesqueléticas entre si y con ciertas proteinas integrales de la membrana del entrocito. (Reproduadacon avtorizaudn de Beck WS y Tepper R I Hemolytic anemias III, Membrane disorders. In Hernaiology, 5th ed Be& WS [edtor]. The MtT Press. 1991 .)
extiende a través de la bicapa, donde da por 10 menos 10 vueltas. Es probable que sea un dimero en el cual se f o m a un túnel, en el cual pennite el intercambio de cloniro por bicarbonato. E[ bióxido de carbono, formado en los tejidos, entra al eritrocito como bicarbonato, que es intercambiado por cloruro en las pukmones, de donde el bibxido de carbono es exhalado. La terminal amino se une a numerosas psotelnas, incluyendo hemoglobina, proteinas 4.1 y 4.2, anquirina y varias enzimas glucoliticas. La banda 3 purificada se ha agregado a vesículas de lipidos in viiro y se ha demostrado que realiza sus funciones de transportador en este sistema reconstmido. Las glucoforinas A, B y C son también glucoproteinas @asmembrana,pero del tipo de un solo paso, que se extienden sólo una vez a traves de Ea membrana. La glucoforina A es abundante, la constituyen 13 1 aminoacidos y su glucoci lacion es masiva (aproximadamente 60% de su masa). Su extremo amino terminal, que contiene 16 cadenas de oligosacáridos (1 5 de los cuales son O-glucanos}, se proyecta de la superficie del eritrocito. Alrededor de 90% del acido sihlico de la membrana eritrocitaria se encuentra en esta protelna, Su segmento transrnembranal (23 arninoiicidos) es alfa-helicoidal. El extremo carboxilo terminal se extiende en el citosol y se une a [a proteina 4.1, que a su vez se une a la espectrina. El polirnorfisrno de esta proteina es la base del sistema de los grupos sanguíneos MN (véase después). La glucoproteina A tiene sitios de fijaci6n para el virus de influenza y Plmrnodiurnfalctparum, una causa del paludismo. Un dato intrigante es que, al parecer, la funcion eritrocitaria no se afecta en los individuos que carecen de glucoprotelna A.
La espectrina, la anquirina y otras proteinas membranales perifericas ayudan a determinar la forma y flexibilidad del eritrocito El gE6bu90 rojo debe tener la propiedad de cornprirnirse y deformarse para pasar a través de lugares estrechos de la microcirculacibn, durante sus numerosos seconidos alrededor del cuerpo; los sinusoides del bazo tienen importancia especial a este respecto. Para que los eritrocitos se deformen de manera facil y reversible, su membrana debe ser fluida y flexible; también debera preservar su forma biconcava, dado que esta facilita el intercambio gaseoso. Los lipidos membranales ayudan a determinar la fluidez. Adheridas al lado interior de la membrana eritrocitaria hav cierto numero de proteinas citoesqueléticas periféricac (cuadro 6 0 4 ) que tienen funciones importantes en la preservación de la forma y en la flexibilidad; se describen a continuaci6n. La espectrina es la proteina principal del citoesqueleto. Se compone de dos polipéptidos: espemna I (o cadena alfa) y espectrina 2 (cadena beta). Estas cadenas, que miden alrededor de 100 nm de longitud, se aIinean de manera antiparalela y esthn entrelazadas de manera laxa, para formar un dimero. Ambas cadenas están compuestas de segmentos de 106 aminohcidos que parecen plegarse en Mlices alfa de triple tira, unidas por segmentos no helicaidales. Un dimcro interactiia con otro para formar un t e t r h e r o cabeza+i
Las anormalidades en la cantidad o estructura de la espectrina causan esferocitosis y eliptocitosis hereditarias
La esferocitosis hereditaria es una enfermedad genktica, transmitida como rasgo dominante autosdmlco, que afecta a alrededor de 1 :5000 estadounidenses. Se caracteriza por la presencia de esferocitos (eritrocitos esféricos, con proporción superficie-a-volumen baja) en la sangre pesiférica, por anemia hemolitica y por esplenomegalia. Los esferocitos no se deforman con tanta faci t idad como los eritrocitos normales y experimentan destrucción en el bazo por [o cual su vida en la circulación se acorta de manera notable. La esferocitosis hereditaria se cura con ecplenectomía debido a que los esferocitos pueden persistir en la circulación si no hay bazo. Los esferocitos son mucho mBs susceptibles a licis osmotica que los eritrocitos normales. Esto se valora en la prueba de fragilidad osmótica, donde los eritrocitos se exponen in vrlro a concentraciones decrecientes de NaC l. La concentración fisiológica de NaCl es 0.85 @dL. Cuando se exponen a una concentracibn salinade 0.5 SJdL, se hemoliza un número muy bajo de eritrocitos normales, en tanto que bajo estas condiciones podría Eisarse alrededor de 50% de los esferocitos. La explicacibn es que estos últimos, siendo casi circulantes, tienen escaso potencial de volumen adicional para acomodar el exceso de agua por lo cual estallan con facilidad cuando se exponen a una presibn osmbtica algo menor a la normal. La causa de la esferocitosis hereditaria (figura 60-5) es una deficiencia de espectrina o anormalidades en su estructura, de modo que ya no se une fuertemente a otras proteínas con las que de manera Mutaciones en el DNA que afectan la cantidad o la estructura de espectrina o de ciertas otras proteinas cd~esquelBtims(por ejemplo. anquinna)
.1 Debilidad de las interaccones entre proteínas penfbrrcas e integrales de la membrana eritrocitana
normal interacnja. La membrana se debilita y permite la forma esférica. Algunos pacientes manifiestan también anormalidades en algunas otras proteinas (por ejemplo, la anquirina). La eliptocitosis hereditaria es una enfermedad genética semejante a esferocitosis excepto que los eritrocitos afectados asumen una forma discoidal, elíptica reconocible en el microscopio. Se debe también a anormalidades en espectrina; algunos cacos reflejan defectos de banda 4.1 o de glucoforina C.
EXISTEN NUMEROSOS SISTEMAS DE GRUPOS SANGU~NEOS, INCLUYENDO LOS SISTEMAS ABO, Rh Y MN Se han reconocido por lo menos 2 1 sistemas de grupos sanguíneos humanos, siendo los mejor conocidos ABO, Rh (Rhesus) y MN. El tdrmino grupo sanguíneo se aplica a un sistema definido de antigenos eritrocitarios (sustancias de grupo sanguíneo) controlados por un locus genético que tiene un número variable de atelos (por ejemplo, A, B y O en el sistema ARO). El tkrmino tipo sanguineo se refiere al fenotipo antigenico, reconocido en general por el uso de anticuerpos apropiados. Con propositos de transfusión sanguinea, es importante conocer el fundamento de los sistemas ABO y Rh. Sin embargo, el conocimiento de tos sistemas de grupos sanguíneos es también de interés bioqulmico, genktico, inmunolbgico, antropológico, obstétrico, patológico y forense. Aquí se describirlin de manera breve algunas caracteristicas esenciales del cisterna ABO y se mencionarii la naturaleza bioquimica de los sistemas Rh y m. Desde un punto de vista bioquímico, el intéres principal en las suctanciñs ABO ha sido el aislamiento y la deteminacihn de sus estructuras, así como aclarar sus vías de biosintesis y descubrir la naturaleza de los productos de los genes A, B y O.
El sistema A 6 0 tiene importancia critica en la transfusión sanguínea
1 Debilidad de la estructura de la membrana entrocitarla
1 El eritrocito adopta la forma esférica y esta sujeto a destniccibn en el Bazo
.! Anemia hemolitica
Figura 60-5. Resumen de la etiologla de la esferocitosis hereditaria
Este sistema fue descubierto primero por Landsteíner en 1900, cuando investigaba la base de las transfusiones sanguíneas compatibles e incompatibles en los seres humanos. Las membranas dc los eritrocitos de la mayoría de las personas contienen una sustancia de grupo sanguíneo tipo A, B, AB o O. Las personas de tipo A tienen anticuerpos anti-B en su plasma por lo cual aglutinarán sangre tipo R o tipo AB. Los individuos de tipo B tienen anticuerpos anti-A y aglutinaran sangre tipo A o tipo AB. La sangre tipo AB no tiene anticuerpos anti-A ni anti-B y sus poseedores se
designan receptores universales. La sangre tipo O no ticnc sustancias A ni B y los individuos con este tipo se han designado donadorcs universales. La expIicacion de estos datos se relaciona con el hecho de que el cuerpo, por lo general, no produce anticuerpos contra sus propios constituyentes. Por tanto, los individuos tipo A no producen anticuerpos a su propia sustancia de grupo sanguíneo, pero poseen anticuerpos a la sustancia del gmpo sanguíneo extrafio, B, quizá debido a que el cuerpo se expone pronto en la vida a rnicroorganismos que contienen estructuras semejantes. Dado sue los individuos tino O no tienen sustancias A ni E, poseen anticuerpos a ambas sustancias extrañas. La descripcibn anterior se ha simplificado de modo considerable; por ejemplo hay dos subgrupos del tipo A, A, y A?. Los genes que se ocupan de la produccion de sustancias A i 3 0 se encuentran en el brazo largo del cromosoma 9. Existen tres alelos, dos de los cuales son codominantcs (A y B) y el tercero (O) es recesivo; en último caso, éstos determinan los cuatro productos fenotipicos: sustancias A, B, AB y O.
Las sustancias ABO son glucoesfingolipidos y glucoproteínas que comparten cadenas oligosacáridac comunes Las sustancias ABO son oligosacáridos complejos que existen en la mayoría de las células corporales y en ciertas secreciones. Al parecer, en las membranas eritrocitarias, los oligosacáridos que determinan la naturaleza especifica de las sustancias ABO se encuentran principalmente en forma de glucoesfingolipidos; en tanto que en las secreciones, los mismas oligosacáridos estan en glucoproteinas. Su presencia
Fucal
4
2GaIr31 -i 4GlcNAc
-R
en secreciones se determina por un gen designado Se (por secretar), que codifica a una fucosil (Fue) transferasa especifica en órganos secretores, como las glAndulas exocrinas, pero que no es activa en los eritrocitos. Los individuos con genotipos SeSe o Sese secretan antigenos A, B oambos,en tantoque individuos con genotipo sese no secretan ninguno de los dos, pero sus eritrocitos pueden expresar los antigenos A y B.
La sustancia H es el precursor biosintético de las sustancias A y B Se han aislado los mtígenos ABO, se han dfleminado sus estructuras; en la figura 6 0 4 se observan versiones simplificadas que muestran solo sus extremos no reductores. Es importante apreciar primero la estmctura de la sustancia H, dado que es precursora de las A y B y es el antigeno de grupo sanguíneo encontrado en personas tipo 0.El antigeno H mismo se forma por acción de una fucosiltransferasa que cataliza la adicibn de la fucosa terminal en el enlace alfal + 2 al residuo Gal terminal de su precursor: GDP-Fuc + Gal-p-R t F u c a - l , 2 G a l - ~ R + GDP
Precursor
Sustancia H
El locu~H codifica a esta fucosilmsferasa. El alelo h del Iocus H codifica a una fucosi!transferasa inactiva; por unto, los individuos con genotipo hh no pueden generar sustancia H, precursora de los antígenos A y B; de este modo, tendrán eritrocitos tipo O aun cuando pueden poseer las enzimas necesarias para sintetizar sustancias A o B (véase después).
GalNAc Sustancia A
Sustancia H (u O)
Gat Sustancla B
Figura 6 0 6 . Esquema de las estructuras de las sustancias (antigenos) H, A y B de grupa sanguíneo La R representa una cadena oligosacárida compleja larga, unida a oeramida donde las sustandas son glucoesfingolipidos o al esqueleto polipeptídica de una proteína por medio de residuos senna o treonina donde los antígenos son glucoproteinas Ndtese que las sustancias de grupo sanguineo son biantenarias; es decir, tienen dos brazos, que nacen en un punto de ramificación (no indicado) entre GlcNAc-R y sblo se muestra un brazo de la ramiftcacián. Asi, cada uno de lec antigenos H, A y 0 contienen dos de las cadenas oligocadridas cortas respectivas mostradas arriba. El antígeno AB contiene un tipo de cadena A y un tipo de cadena B
870 * Bioquimica de Harper
EL GEN A CODIFICA UNA GalNAc TRANSFERASA; EL 8, UNA Gal TRANSFERASA Y EL O, UN PRODUCTO INACTIVO En comparación con el antigeno H {figura 6 0 4 ) , la sustancia A contiene una GalNAc adicional y la sustancia B una Gal extra, enlazados como se indica. Los anticuerpos anti-A se dirigen a[ residuo GalNac adicional encontrado en la sustancia A, mientras que los anticuerpos anti-B se dirigen al residuo Gal adicional de la sustancia B. De este modo, GalNAc es el azúcar inmunodominante (es decir, el que determina la especificidad del anticuerpo formado) del antigeno A de grupo sanguíneo, en tanto que Gal es el azúcar inmunodominante de la sustancia B. En vistade las estnicturas descubiertas, no sorprende que la sustancia A pueda sintetizarse in vitro a partir de la sustancia O en una reacción catalizada por una GalNAc transferasa, empleando a U D P 4 a l N A c como donador de azúcar. De igual modo, el grupo sanguineo B puede sintetizarse del antígeno O por medio de la acción de una Gal transferasa, empleando UDP4al. Es esencial apreciar que el producto del gen A es la GalNac transferasa que agrega GalNAc terminal a la sustancia O. De igual modo, el producto del gen B es la Gal transferasa que adiciona Gal terminal a la sustancia O. Los individuos tipo AB poseen ambas enzima lo cual tienen dos cadenas de oligosacáridos (figura 6 0 4 ) ,una terminada en GalNAc y la otra en Gal. Al parecer, los individuos tipo O sintetizan una enzima inactiva, detectable por medios inmunolbgicos; por tanto, el antígeno H es su sustancia de grupo sanguineo ABO. En 1990, un estudio que empleb tecnología de clonacion y secwenciación, describió la naturaleza de la diferencias entre los productos glucosiltranferasas de !os genes A, B y O. Al parecer, una diferencia de cuabo nucleótidos produce las distintas especificidades de las glucosiltransferasas A y B. Por otra parte, el alelo O tiene una rnutacibn de un solo par de bases, que genera un mutante con desplazamiento del marco de referencia, lo cual conduce a la síntesis de una proteina carente de actividad de transferasa.
El factor Rh (antigeno D) es una proteina integral de la membrana eritrocitaria y puede causar problemas graves en las transfusiones El sistema Rh es complejo y ni su base genética ni la naturaleza bioquimica de sus productos se han explicado de manera contundente. AF parecer, intervienen tres genes enlazados de modo intimo, los cuales se localizan en el cromosoma 1. En una nomenclatura, los productos de estos alelos se designan C o c , E o e y D o d; aún
(Capitulo 60)
no se ha identificado producto alguno que corresponda a d. El antigeno D(Rh,) es el de mayor interes y también se designa como factor Rh. Al parecer, es una proteina integral de la membrana eritrocitaria con masa molecular de ariroximadamente 30 kDa: su interacción con fosfolip~dosde la membrana p i d e tener importancia en su antigenicidad. Alrededor de 15% de los individuos de raza cauchica carecen de este antígeno y se designan Rh negativos. Si tstos reciben aunque sea una sola transfusibn de sangre Rh positiva, es probable que formen anticuerpos al antigeno D(Rh,). Asi, es importante que se transfundan solo con sangre Rh negativa y esto es esencial si se trata de una mujer premenopaúsica que puede embarazarse. Si una mujer en esta situacibn ha recibido transfusiones descuidadas con sangre Rh positiva, es muy probable que su sangre contenga enticuerpos antiD(Iüb). En su momento, si su hijo es Rh positivo, los anticuerpos pueden causar la lisis de los eritrocitos del lactante, trastorno conocido como enfermedad hemolítiea del recién nacido. Después de un nacimiento o un aborto, las mujeres R h negativas d e b e r h recibir de manera rutinaria Enmunoglobulina Rh(D,), que es eficaz para prevenir la formacibn activa de anticuerpos por la madre a cualquier antigeno Rho (D) al cual se haya expuesto.
El sistema de grupo sanguíneo MNS comprende formas poiimórficas de las glucoforinas A y B Los grupos sanguineos MN se reconocen mediante antisueros que distinguen entre formas distintas de glucoforinas A. A nivel genhtico, hay dos alelos codominantes, M y N, con tres genotipos posibles, M M , M/N y N/N. En correspondencia, hay tres fenotipos, M, N y N. Aunque la glucoforina A está fuertemente gtucosilada, el polimorfismo no comprende heterogeneidad de oligosacaridos sino que, en su lugar, hay diferencias en la secuencia aminoacidica en el extremo arnino terminal de Ia proteina, como sigue:
M N
Residuo 1
Residuo 5
Ser
Gli
Leu
Giu
Et sistema SS es una subclase del glupo MN y comprende formas polirnérficas de glucoforina B. Las formas S y s difieren en un aminoácido. El sistema MNS no interviene con frecuencia en reacciones a la transfusión, pero sus miembros son marcadores geneticos útiles, ya que sus genes están estrechamente ligados en el cromosoma 4.
LAS ANEMIAS HEMOL~TICASSON CAUSADAS POR ANORMALIDADES FUERA, EN O DENTRO DE LA MEMBRANA ERlTROClTARlA Las causas exteriores a la membrana incluyen hiperesplenismo, trastorno donde el bazo esth crecido por diversas razones y los eritrocitos quedan secuestrados en él. Las anormalidades imunológicas (por ejemplo, las reacciones trrtnshsionales, la presencia en plasma de mticuerpos calientes y fríos que lisan eritrocitos y una sensibilidad exagerada al complemento) tambikn pertenecen a esta clase, lo mismo que las toxinas liberadas por diversos microorganismos infecciosos, como ciertas bacterias (como Clostridiumj. Algunas serpientes segregan venenos que lisan la membrana eritrocitaria (por ejemplo, por accibn de fosfolipasas o proteinasas). Las causas de la membrana en sí comprenden anormalidades de sus proteínas. Los trastornos mas importantes son la esferocitosis y la eliptocitosis hereditarias, causadas en gran parte por defectos en la cantidad o estructura de la espectrina (vCase antes). Las causas del interior de[ eritrocito incluyen hemoglobinopatías y enzimopatias. L a anemia de cklulas falcifonnes es la hernoglobinopatia más importante. Las anormalidades de las entimas eB la vía de la pentosa fosfato y en la glucólisis son las enzimopatias más frecuentes implicadas, en particular la primera. La deficiencia de la glucosad-fosfato deshidrogenasa prevalece en ciertas partes del mundo y es una causa comUn de anemia hemolitica (vCase antes). La deficiencia de pinivato cinasa no es frecuente, pero es la segunda deficiencia enzimhtica m& común que conduce a anemia hemolitica; al parecer, el mecanismo consiste en una alteración de la gtucólisis, que desemboca en la f m a c i ó n insuficiente de A V , lo cual afecta varios aspectos de la integridad de la membrana. En el cuadro 60-7 se enumeran las investigaciones de laboratorio que colaboran en el diagnbstico de la anemia hemolítica.
LOS NEUTR~FILOSTIENEN UN METABOLISMO ACTIVO Y CONTIENEN VARIAS ENZIMAS Y PROTE~NASÚNICAS
Cuadro 60-7. Tnvestígaciones de laboratorio que ayudan en el diagnóstico de anemia hemolítica --.
s . " -
1
1
son importantes también en el metabolismo oxidativo de los neutrofilos (vease después). El cuadro 60-9 resume las funciones de algunas proteinas que, en gran medida, son exclusivas de los neutrofilos.
,os neutrófilos son esenciales 3ara la defensa del cuerpo contra a infección bacteriana Los neutrófilos son celulas fagmiticas móviles que desempefian funciones claves en la inflamacibn aguda. Cuando las bacterias penetran a tos tejidos, se producen algunos de fendmenos que se conocen de manera colectiva como respuesta inflamatoriaaguda. Son: 1 ) aumento de la permeabilidad vascular, 2) entrada de neutrófilos activados a los tejidos, 3 j activacibn de pEaquetas y 4) aquietamiento espontrineo (resoluci6n) si los microorganismos invasores han sido destruidos con éxito.
-
cuadro 6í 1-8, Resu men de 1:is eahctt bioquim icas prin cipates di:los neut -- .p.--- - .
GIucolisis activa
Vir
Las caracteristicas bioquímicas principales de los neukbfilos se resumen en el cuadro 6 0 4 . Las propiedades más destacadas son glucólisis aerobia, vía de la pentosa fosfato activa, fosforilacibn oxidativa moderadamente activa (debido a que las mitocondrias son escasas) y alto contenido de enzirnas lisosbmicas. Muchas de las enzimas enumeradas en el cuadro 60-4
.-.--
:enerales Ini e bilimbiria ElectroForesis de I Ib (por ejcmno conjugada (indirw- 1 plo, HbS), de enzrrnas eritrotal; tiempo corto de su- 1 citarias (por ejemplo, dcfipervivencia del tritro- ciencia de Gbf' deshidrogecito. según lo mide la nasa o de piruvatci cinasa), inqeccibnde eritrocitos frrigilíldad osmhtiia: (por ejen 1autblogos rndiomar- plo. ec;fkrocitosis heredftwia:1, cados con CS'; reticu- prueb;as de Coo mbs. aglut ilucitosis: hemoelohi- ninas fria in La prut:ba directa de Coombs nemia: co baja de h ia dctecta la presencia de antiplasmáiicii cuerpc1s sobre los eritroc~tos, ' P ,..n t...n ia t o que l a indirecta identifica Ia presencia dcanticiicrpos circulantes a antige-_L:os presentes - en los eritrocitos
--. .-.- . .-. .-
-
a instato activa
oxidativa moderada R ~ c Cv L~113~3ornas ~ Y en sus enzimas degrada€'-,-IVüb COntienen cie is (por ejernplo, miel(ipcroxidas:1 y NADPHpxoleinas Iúnicas Fo:
-
^-
1-
8 72
(Capítulo 60)
Bioquimica de Hurper
Cuadra 60-9. Algunas enzimas y proteinas importantes de aeutrbfilos. La exprcsibn de estas rnol6culas ha sido estudiada durante las diversas etapas de la diferenciacibn de neutrbfilos normales y trmbicn de las c&lulasleuctmicas ~ mediciones de sus mRNA). El cDNA de c'orresponclientes em pleando tiicnitas de biologb n!iolecular (por e j e m110, rnuchas de ellas se hr1 aislado y secuenciado, se hrn reducido SUS secuericias aminoacidicas, localizado sus genes en Libicricione S cromosbimicas específicas y d4:finido sus secuencia:5 de cxone!r e introncs. En el cuadro 60-12 se enumeran ..... ... i ~ u n.a nroteinasas s. irnnuriiinrr m.
1. . . L .
icibn catal
Enzima o prote Mieloyieroxidasa (Mr
n 7 ~ 7
nción
,í-(halide)+ ri = LI,
-t
-
nentario
r-r3X + H70 i Causa del color verde del pus
HOX Comporlente clave del estallido respiratorio Deficierites en enfc:medad gr~aniilomatoca , . :a
iDPH "42
ntes en ma, IIidrolira rl enlace entre lcido V-acetilm u rfimi c o y ,\~-a~etil-~-plii~~~amina cornnnneiitesde ciertas paredes celulíires
Lisozimn
;
5 i A1 paret:er lisan ha cterias par lesidn de sus
básicos r
memlbranas
1,actol'crrina
Mol6ciilas dc adhercncia (mien familia de integrinas)
1
n ~ c c ~ i i u ~i ica~ ai
*
Puede i nhibir la prnliferricicSn de ciertas bactemrias por fíjacibn de hierro y es probrible que 1nten)engaen la regulaci t5n .. rl'h lo >multiplicaci6n de ci4lulasrnieloides.
Proteitin fijadora de hierro
icia de la sdhesirin leiicociraria
3
~ ~ ~ ~ ~ n eI ilair n f~ i n g i i i ~ i i Ii uc ~uc. i i i u i ~ ~ u i auc. 3 igu
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1 - r ,.*-..Ir .;*o M.+;*,"' .mn .inr:n-n ijcii 1 ~ L 3U I I I ~ I I L J . J V C *LII I L I L U C I ~ I J - ~ L L L ~ L L I V
hacia cClulai microides y linfoides, tstimula1ndo la fagocitosis y otras respuestas . " .- --.. ..-. .. . Se refiere a un sistcma uniiome ae nomenclatura que .na sioe adoptado parira nombrar marcndores de CD=g Unaprciteinadesupe r f i c i e e s ~ ificñ c (marcador) que ideiitificaaun linaje oeiapadedifewnciacibn particular superficie di: los lcucnc de los leucocitos y que I:5 reconocid apot un g l uio~ de anticuerpus rnonocl onalesse dcijigna como I~nmicmhro del grupo de bn. El sistema tiene uiilid.i d particulat, en la c l a i licacibn dc s ubclascs de lintocitos. IVluclios mtígenos CU iiitervienen e ?es ctlula-ctlulas. adherenicia y seAal ii:ación transi nembranñ.8
Durante la inflamación aguda, diversos agentes son liberados de las células y proteínas plasmlticas cuyo efecto global total es aumentar la permeabilidad vascular, lo cual conduce a edema tisular (cuadro 60-10). Los neutrófilos son reclutdos del torrente sanguineo a los tejidos para ayudar a la eliminación de los invasores extrafios. Los neutrbfilos son atraídos a los tejidos por factores quimiotácticos, incluyendo
Cuadri
ras en la i 3rigenes de las biomolécula s con propiedades vasoacti~ 1
- .. ..
í - .Cklulas -- -- - -
al fragmento C5a del complemento, a peptidos pequefíos derivados de bacterias (por ejemplo, N-formil-metionil-leucil-fenilalanina) y a algunos leucotrienos. Para alcanzar los tejidos, tos neutriifilos circutantes deben pasar a travds de las paredes de los capilares. Para lograrlo, se marginan a lo largo de las paredes vasculares y luego se adhieren a las cClulas endoteliales (revestimiento) de los capilares.
basófilos
1
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NeutrBfilo
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bn aguda
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tivador de: plaquetas / C3a C4a y CSa dc:1 sistcma ile1 lemento
1Histamina
Eicosano idcs (vari as prosta - Bradici nina y p -I,.-A:-
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Las integrinas median la adherencia de neutrófilos a las células endoteliales
La adhesión de los neutrofilos a las células endoteliales vasculares emplean proteinas adhesivas especificas (integrinas) localizadas en sil superficie y también proteinas receptoras especificas en las c6lulas endoteliales (capítulo 56). Las integrinas son una superfamilia de proteinas de superficie presentes en una extensa variedad de células. Intervienen en la adherencia de una céIula a otra o a componentes específicos de la matriz extracelular. Son heterodimeros. que contienen una subunidad alfa y una beta unidas de manera no covalente. Las subunidades contienen segmentos extracelulares, transmembrana e intracelulares. El segmento extracelular se une a diversos ligandos como proteínas especificas de la matriz extracelular y de las superficies de otras ct5lulas. Estos Iigandos a menudo contienen secuencias ArgGli-Asp ( R e - D ) . El dominio intracelular se une a varias proteina del citoesqueleto, como actina y vinculina. Las integrinas son proteinas que unen el exterior de las c6lulas con su interior, ayudando asi a integrar las respuestas celulares (por ejemplo, movimiento y fagocitosis) a cambios en el ambiente. En un principio, se reconocieron tres subfamilias de integrinas. Los miembros de cada familia se distinguieron por contener una subunidad beta común, pero diferir en sus subunidades alfa. No obstante, en la actualidad se han identificado mhs de tres subunidades beta y la clasificacibn de las integrinas se ha vyelto compleja. En el cuadro 60-1 1 se enumeran algunas integrinas de interbs específico respecto a los neutrbfilos. Un defecto en la subunidad beta2 (designada tambikn CCD18) de LFA-I y de otras dos integrinas relacionadas, que se encuentran en neutrbfilos y
-
Los mecanismos de activacidn de plaquetas se describieron en el capítulo 59 (figura 59-17). El proceso comprende la interaccibn del estímulo (por ejemplo, trombina) con un receptor, la activación de proteinas G, la estimulaciiin de la fosfolipasa C y la liberacibn de bisfosfato de fosfatidílinositol a partir de trifosfato de inositol y diacilglicerol. Estos dos segundos mensajeros elevan el Ca2+intracelular y activan la proteína cinasa C. Ademh, la activacihn de la fosfolipasa A 2 produce ácido araquiddnico que puede convertirse en diversos eicosanoides con actividad biologica. En esencia, el proceso de tos neub-bfilos es semejante. Son activados por medio de receptores especificos, al interactuar con bacterias, por fijacibn de factores quimiotácticoc o por complejos anticuerpo-antígeno. La elevacibn de Ca2+intracelular resultante afecta a numerosos procesos en los neutrbfilos, como el en1 de
los ni
itms leucocitos y d
=
Leucoi:Itos, otros Leucoi:itos, otros a-,,L ~ U C*:**A O L I*urius LU~. IlalCDIB). Leucoi nas IIbflIla Plaque
*
La activación de los neutrofilos es semejante a la de las plaquetas y requiere la hidrólisis del bisfosfato de fosfatidilinositol
i s import
Zuadro 60-11, Eje - ..-.. .-- -
macrófagos, Mac-1 ( C D l 1bCD 18) y p 150,95 (CD 1 1cCD18), causa deficiencia de la adhesión leucocitaria, enfermedad caracterizada por recurrentes infecciones bacterianas y micoticas. Entre varios resultados de esta deficiencia, la adhesion de los leuc o c i t o ~afectados a celulas endoteliales es escasa por lo cual un número menor de neutrófilos pasa a los tejidos para combatir la infección. Una vez que han pasado a través de las paredes de vasos sanguineos pequeños, los neutrófilos emigran hacia los sitios de concentraciones altas de factores quirniotácticos, encuentran las bacterias invasoras e intentan atacarlas y destruirlas. Los neutrófilos deben ser activados, para que realicen muchos de los procesos rnetab~licosde la fagocitosis y lisis de bacterias.
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Adherencia ctl Adherencia ctl A d h ***..A!* c l ~ l l ~*LA~Gl IaU I ~ - I V I L L
ICAM- 1, ICAM-2 Adherencia de leucocitos Fibrinbgeno, fibronectinq ' Adherencia y ngregación : factor de von Willebrand ~laauetarias . .
LFA-l. antt~enorelacionado con la funci6n linfociraria 1; VLA anligeno muy twdlo; CD. grupo de diferenciación;ICAM, molkula de adherencia &tercelular, MEC,rnatriz extracelular. En la deficienciade adheSi6n ieucocit&a Se observa falta de LFA-1 y de integrinas relacionadas. El complejo piaquetar io de gIucoproteinas IIbnIIa es deficiente en bombastenia de Glanzmann, trstorno caracterizado . -. . ~uentaplaquetaria normal, pero reaaccibn anormal del cohgulo. Gstos m u e s m la forma en que el por antecedentes de hcniurrogim, conocimiento fundamental de las proteinm adhesivw de la superficie celular esid esclareciendo la etiologla de cierto número de enfermedades.
samblaje de rnicrotúbulos y el sistema actina-miosina. Estos procesos intervienen, respectivamente, en la secreción del contenido de los grhnulos y en la motilidad, que permite a los neutr6filos buscar a los invasores. De este modo. esthn preparados para lisar microorganismos mediante la producción de derivados activos de oxigeno.
El estallido respiratorio de las células fagocíticas utiliza NABPH-oxidasa y colabora en la lisis de bacterias Cuando los neutrofilos y otras cClulas especifícas fagocitan bacterias, muestran un incremento rápido del consumo de oxlgeno conocido como estallido respiratorio. Este fenómeno refleja la utilización inmediata de oxigeno (despues de un intervalo de 15 a 60 segundos) y la fomacibn, a partir de 4 , de cantidades elevadas de derivados reactivos, como H102, OH' y OC t- (ion hipoclorito). Algunos de estos productos son microbicidas potentes. La cadena de transporte de electrones que se ocupa del estatlido respiratorio se compone de varios elementos, incluyendo una flavoproteína NADPH:02+xidorreductasa (a menudo llamada NADPH-xidasa) y un citocromo tipo b (denominado citoctnornobssgdebido a su pico espectroscópico caracteristico en esta Iongitud de onda o, en forma alterna, citocromo b245 debido a que el punto medio de su potencial de oxidorreducción es de 245 mY, el mlis bajo entre los citocromos h, que le permite reducir oxigeno a superóxido). Este sistema cataliza la reducción de un electrbn del oxígeno que lo transforma a ani6n superdxido (cuadro 6 0 4 , reaccion 2). La oxidorreductasa es reducida por NADPH y el citocromo realiza la eliminacibn de un electrdn del oxigeno para formar superóxido. El sistema se encuentra en la membrana plasmática de los neu&ófifos y otras células fagocitarias. El NADPH se forma en el ciclo del fosfato pentosa, cuya actividad aumenta de manera notable durante la fagocitosis. A la reaccibn anterior sigue la producción espont h e a (por disminucibn) de perdxido de hidrógeno a s superhxido: utilizando dos m o l ~ ~ u lde
El ion superbxido es secretado al exterior de las c6lula.s o a los fagolisosomas, donde encuentra las bacterias ingeridas. Al parecer, la lisis de bacterias dentro de los fagolisosomas depende de la acci6n combinada de pH elevado, ion superóxido o derivados de oxigeno adicionales (HzOz, OH' y HOCl [hcido hipocloroso; vkase despu&s])y de la actividad de ciertos péptidos bactericidac (defensinas) y otras proteinas (por ejem-
plo, la catepsina G y ciertas proteínas catiónicas) presentes en las células fagociticas. Cualquier superóxido que entra al citosol de la cirlula fagocitica es conveflido en HzOzpor acción de la superóxido dismutasa, que cataliza la misma reaccibn de disrnutación ecpontanea mostrada antes. A su vez, HzO2 es usado por una rnieloperoxidasa (viase después) o eliminado por acción de la glutatión peroxidasa o de catalasa. La NADPH-oxidasa permanece inactiva en los fagocitos en reposo y se vuelve activa al contacto con varios ligandos (fragmento C5a del complemento, péptidos quimiothcticos, etcétera) que poseen receptores para ellos en la membrana plasmática. Los procesos resultantes de la activacibn del sistema de oxidasas se ha estudiado bastante -aunque no se ha resuelto del todo- y son semejantes a los descritos antes para el proceso de activación de los neutrbfilos; esto es 16gic0, dado que el estallido respiratorio es un componenie integral de la activación. Intervienen las proteínas G , la estimulacibn de fosfolipasa C y la generación de 1,4,5-trifasfato de inositol (IP3). Este último se ocupa del incremento transitorio de la concentracibn del Cal' citosÓIico, esencial para la induccion del estallido respiratorio. Tambitrn se genera diacilglicerol y se induce la traslacion de la proteina cinasa C del citosol a la membrana plasmAtica, donde cataliza la fosforilación de varias proteínas, algunas de las cuales pertenecen probablemente al sistema de la oxidasa. El cuadro se complica aun más por datos que indican que la activación de! sistema de oxidasas depende de una vía dual, que tambikn comprende una secuencia de transducción independiente de Caz+. Ademhs, se ha demostrado que dos polipéptidos citosolicos san componentes importantes del sistema total NADPH-xidasa, mismos que son reclutados, durante la activación, a la membrana plasmhtica para formar el sistema activo.
Las mutaciones en los genes para componentes del sistema NADPH+xidasa ocasionan fa enfemedad granulomatosa crónica La importancia del sistema NADPH4xidasa se reconocid con claridad cuando se observó que el estallido respiratorio era defectuoso en la enfermedad granulomatosa crdnica, trastorno relativamente frecuente caracterizado por infecciones recurrentes y grmulomas dispersos (lesiones inflamatorias cr6nicas} en la piel, los pulmones y los ganglios linfhticos. Los granulomas se forman en un intento de "emparedar" a las bacterias que no han sido lisadas debido a deficiencias gendticas del sistema NADPH-oxidasa. La mayoria de los pacientes son varones y el trastorno está ligado al cromosoma X. Las causas fundamentales de la
enfermedad en ellos con mutaciones en el gen para el citocromo h. En otros individuos, Fa enfermedad es recesiva autosomica y la causa son mutaciones en uno u otro gen estmctural para los dos polipkptidos citos6licos. Algunos pacientes han respondido al tratamiento con interferón gamma, que al parecer incrementa la cantidad de c i t m m o b, afectando la transcripci6n de su gen. La figura 60-7 muestra la secuencia probable de procesos que intervienen en la etiología de la enfemiedad granulornatoca crdnica.
Los neutrófilos contienen mieloperoxidasa, que cataliza la produccibn de oxidantes clorados La enzima mieloperoxidasa, presente en abundancia en tos gránulos de los neutrofilos y causa del color verdoso del pus, puede catalizar la transfonnacibn del H2Q2 en acidos hipohalosos:
H202+ X- + H-*
HOX + HzO
(X-= CI-, B f , 1-0 SCN-: HOCl = dcido hipocloroso)
El HlOl usado como sustrato es generado por el sistemaNADPH-oxidasa. EI CE-es el haluro habitual, dado que existe en concentracibn relativamente alta en el plasma y los líquidos corporales. El HOCE, ingrediente activo de los blanqueadores domésticos, es un oxidante potente y un microbicida eficaz. Cuando se aplica a tejidos normales, su potencial para causar
daho es bajo, debido a que reacciona con aminas
primarias o secundarias presentes en neutrofilos y tejidos para producir varios derivados nitrógenoclorados; estas clorarninas también son oxidantes, pero menos potentes que HOCl y actúan como microbicidas (por ejemplo, esterilizando heridas) sin cziisar dafío tisular.
Las proteinasas de los neutriifilos pueden causar lesión tisular grave si sus acciones no son reprimidas Los neutr6filos contienen cierto número de proteinasas (cuadro 60-1 2) que pueden hidrolitar eIastina, varios tipos de colhgenas y otras proteinas presentes en la matriz extracel~lar.Si se permite que esta ncci6n enzimfitica prosiga sin oposici6n, puede conducir a d&o tisular grave. La mayor parte de la proteinasas son enzimas tisosbmicas y en los neutrbfilos normales se encuentran principalmente como precursores inactivos. Estas enzimas son liberadas en cantidades pequeiías de los tejidos normales, pero durante inflamaci6n la secreción aumenta de manera considerable. En el tejido normal, las actividades de la elastasa y de otras proteinasas son reprimida? o "conservadas a raya" por algunas antiproteinasrts(enumeradas también en
<
cuadro 60-12: ~roteinasasde neiitrbfilos n m + i p r ~ t e i n ade ~ aplasma ~ y teiiA--* -I J
aiii
- - ---
Proteina
-
itiproteina
!-Macroglcibulina hibidor de lla lcucoproteínara secretora Mutaciones en genea para los componentes pmteiniws (es decir, citomma bsss[ltamadotamb&n bz44 y dos polip4phdos citos6liws) del sistema de NADPH-oxidasa
Pmducci6n escasa de bn superóxMo y de otros derivados adimsdel
oxígeno
L Dismlnucibnde la llsis de ciertas bacterias
L Infecciones recurrentes y formacbn da granulornas tisulares para emparedar a las bacterias supervivientes
Figura 60-7. Esquema simplificado de la secuencia de procesos que intervienen en la etiologla de la enfermedad granulomatosa crbnica.
Cetepsina ci A
1
...
.
-iinriqulmorripsina hibidor-1 del activad,
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hibidor tisiular de la t
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nógeno * , , . . , u
* El cuadro enumera algunas de las proteinasas imporlantes que de los neukófilos y de lai pmtelna? que pucden inhibir sus acciones. La mayor parte de estas proteinaa~cxistcn cn cl + .. *--* .<. intdor de los neutrófitus WIIIU pizcursores El activador del plasminbgeno noes una proteinasa, pero se incluye- debidoa que influye en la actividad de la placmina que sí es una proteinasa. Estaspueden digerir numerosasprotelnac de lamattiz extraceIular. causando dafio tisular. El equilibrio gIobal de la acciba proteinasa.antiproteinasa puede ser alterado por activaci6n de los precursore? dc las proteinxas o por inactivacibn de 1% antiproteinasas. Esta última puede ser causada por degradacíbn proteolltica o por modificación quimica, p r ejemplo, Met-358 del:inbibidor de la ni-antiproteina~aes oxidado le1 cigarrillo.
el cuadro 60-1 1) presentes en el plasma y líquido extracelular. Cada una de ellas puede combinarse - p o r lo general, formando un complejo no covalente-con una o mas proteinasas específicas y causar inhibicihn. En el capítulo 59 se observo que una deficiencia genética del inhibidor alfa,-antiproteinasa permite a la elastasa actuar sin oposición y digerir tejido pulmonar, participando así en la etiologia del enfisema. La alfaz-rnacroglobulina es una proteina plasmh~icaque tiene una rÚnci6n importante en la defensa corporal contra la accibn excesiva de las proreasas; se combina con ellas con lo cuat neutraliza la actividad de algunas proteasas importantes (capitulo 59). Cuando se forman cantidades elevadas de oxidantes clorados durante la inflamación, se altera el equilibrio proteinasa:antiproteinasa, inclinándose a favor de la primera. Por ejemplo, ciertas proteinasas enumeradas en el cuadro 60-1 1 son activadas por HOCI, en tanto que algunas antiproteinasas son inactivadas por el mismo, y el inhibidor alfai-antiproteinasa puede ser hidrolizado por colagenasa y gelatinasa activadas. En muchas circunstancias, se logra el equilibrio de proteinasas y antiproteinasas. Sin embargo, en ciertos casos, como en el pulrnbn cuando hay defícienciadel inhibidor atfai-antiproteinasa o cuando se acumulan cantidades masivas de newtrbfilos en los tejidos debido a un drenaje inadecuado, ta accion sin oponente de las proteinasas puede causar drdo tisutar considerable.
LA TECNOLOG~ADEL DNA RECOMBINANTE HA TENIDO UN GRAN IMPACTO EN LA HEMATOLOG~A La tecnología del DNA recombinante ha modificado muchos aspectos de la hematologia. Con investigaciones que usan tdcnicas de clonacibn y secuenciacirjn se han esclarecido de manera notable las bases de las talasemias (capitulo 42) y de numerosos trastornos de la coagulacibn (capitulo 59). El estudio de oncogenes y de traslocaciones cromos6micas ha permitido avanzar en la comprensión de las leucemias (capitulo 62). Como se describid, las técnicas de clonacibn han permitido disponer de cantidades terapéuticas de eritropoyetina y de otros factores del crecimiento. La deficiencia de adenosina desaminasa, que afecta en particular a los linfocitos, es la primera enfermedad que se ha tratado con terapkutica gtnica (vdase caso No. 8 en capitulo 65). IguaI que muchas otras Breas de la biología y la medicina, la hematologia continuar& siendo revolucionada por esta tecnologia.
RESUMEN
El eritrocito es una célula sencilla en t&nninosde: su estructura y h n c i ~ n la, cual consiste principalmente en una solución concentrada de hemoglobina rodeada por una membrana. La producción de eritrocitos es regulada por la hormona erivopoyetina; en tanto que otros factores del crecimiento (como los factores estimulantes de colonia de granulocitos y de granulocitosmacrbfagos) regulan la producción de leucocitos. El eritrocito contiene un conjunto de enzimas citosólicas, como superiixido dismutasa, catalasa y giutation peroxidasas, para eliminar los poderosos oxidmtes generados durante su metabolismo. Determinada por genes, la deficiencia de la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que produce NADPH, es una causa importante de anemia hemolltica. La metahemogfobina no puede transportar oxigeno; se han reconocido causas genbticas y adquiridas de metahemoglobinemia. Tambitn se tiene una cantidad considerable de información respecte a l a proteinas y lípidos de la pared celular. Cierto número de proreinas citoesqueleticas, como la espectnna, la anquirina y la actina interactúan con proteinas integrales específicas de la membrana para ayudarla a regular su forma y flexibilidad. La deficiencia de espectrina conduce a esferocitosis y eliptocitosis hereditarias, otras causas importantes de anemia h e m e lítica Las sustancias de grupo sanguíneo ABO, presentes en los eritrocitos, son glucoesfingolípidos complejos; el azúcar inmunodominante del antigeno A es Nacetilgalactosamina, en tanto que del antigeno B es galactosa. Al parecer, los antigenos Rh son proteínas integrales de la membrana y las sustancias MN son presentaciones polimórficas de glucoforina A. Los neutrdfilos tienen una funcibn importante en los mecanismos de defensa del cuerpo. Las integinas, presentes en lasmembranas plasmfiticas, determinan interacciones especificas con varios componentes celulares y tisulares. Al exponerse a bacterias y otros antigenos, se activan los leucocitos; la NADPH-oxidasa desempefla una funci6n clave en el proceso de activacidn (estallido respiratorio). Las mutaciones en esta enzima y en proteinas relacionadas causa enfermedad ganulomatosacrbnica. Las proteinasas de los neutrbfilos pueden digerir numerosas proteinas tisulares; en condiciones normales, &as son controladas por un conjunto de antiproteinasas. Sin embargo, este mecanismo de defensa puede ser superado en ciertas circunstancias, conduciendo a dano tisular extenso. La aplicacibn de la tecnologia del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de la hematologia.
REFERENCIAS DC, Kishimoto TK, Smith CW: Leukocyte adhesion deficiency and motility. In: ]'he .Wetabollc and iI4oleculnr Bases nf Inherited Brsease. 7th cd. Scriver CR et al. (editors). McGraw-Hill, 1995. Beck WS (editor). Hemaiology, 5th ed. MIT Press, 1991. Recker PS, Lux SE: Bcrcditary spherocytosis and hereditary elliptocytosis. In: The .WL-taholic and ,Wolecular Bmes oflnherited Disease. 7th ed. Scriver CR et al. (editors). McGraw-HiII, P 995. Chanock SFJ et al.: The respiratoty burst oxidase. J Riol Chem 1994;269:24519. Forehand J R et al.: Inherited disorders of phagocyte killing. In: I'lie iMetaholic and Molecular Bases of Inherited Dzsense, 7th ed Scriver CR et al. (editors). McGraw-Hili, Anderson
1995. Jaffe ER, Hultquist DE: Cytochrome b5 reductase deficiency and enzymopenic hereditary methernuglobinemia. En: The Meinbolic and .h'olecular Rases of
Inherired Disease, 7th ed. Scriver CR et al. (editors). McGraw-Hill, 1995. Krantz SE: Erythropoietin. Blood 1991:77:419. Lienhard GE et al.: How cells absorb uglucose. Sci Am (Jan) 1991;266:86.
Luhbert M, Herrmrnn F, Koeffler HP: Expression and regulalion of myeloid-spccific genes in nnrmal and
leukemic myeloid cells. Rlood 1991;77:909. Luzzato L, Mehta A: Glucose4-phosphatc dehydrogenase deficiency. In: The :VefabolicBasis of Inhevrted Bisease, 7th cd. Scriver CR et al. (editors)
McGraiv-Hi ll . 1995. Rosen G M et al.: Free radicals and phagocytic cells.
FASEB J 1995;9:20. Spitznagel JK: Antibiotic proteins of human neutrophils.
J Clin Invest 1990;86: 1381. Tanaka KR, Paglia DE: Pyruvate kiriase and other enzymopathies of the erythrocytc. In: The ~tretaholicand ,Wolecuiar Bases of lnherited Disease, 7th cd. Scriver
CR et al. (editors). McGraw-Hill, 1995. Weatherilll D J et al.: The hemoglobinopathies. In. The .kíelabolic Basis oflnherited Uisease. 7th ed Scrivcr CR et al. (editors). McGraw4ill, 1995. Yamamoto P et al.: Molecular genetic basis of the histoblood group ABO system. Nature 1990;345:229.
Roberi K. Murray, MQ PhQ
Cada vez m&, et ser humano esta sujeto a la exposicion de diversas sustancias quimicas extrailas (xenobióticos), sean medicamentos, aditivos en alimentos o contaminantes ambientales, etcktera. La situación se resume de manera adecuada en [a siguiente cita de Rachel Carson: "Tan cruda como un a m a , como la lanza del hombre de las cavernas, la artillería quimica ha sido lanzada contra las estructuras vitales". El conocimiento de la forma en que se manejan los xenobióticos a nivel celular es un aspecto importante en el aprendizaje de c6mo enfrentar el ataque quimico.
Conocer el metabolismo de xenobióticos es bhico para una comprensión racional de la famacología y la terapdutica, farmaceútica, toxicologla, investigación del cáncer y toxicomania. En todas estas hreas se estudia la administración de xenobidticos o la exposicibn a ellos.
EL SER HUMANO ENCUENTRA NUMEROSOS XENOBIÓTICOS QUE DEBEN METABOLIZARSE PARA SER EXCRETADOS Un xenobibtico (del griego, xenos, extraño) es un compuesto ajeno al cuerpo. Las principales clases de xenobi6ticos de importancia médica son los fánnacos,
carcinbgenos químicos y varios compuestas que han llegado a nuestro ambiente de una y otra manera, como bifenilos polictorinados (PCB) y ciertos insecticidas. Existen mas de 200 000 compuestos químicos ambientales fabricados por el ser humano.Gran parte de estos compuestos esth sujeto a metabolismo (alteración química) en el cuerpo humano. siendo el higado el órgano principal en que esto ocurre; en ocasiones, un xenobiútico puede excretarse sin cambio. Cerca de 30 enzimas catalizan las reacciones que participan en el metabolismo de los xenobibticos;sin embargo, en este capítulo se incluye sblo un grupo selecto. El metabolismo de xenobibticos puede dividirse en dos fases. En la fase 1, la reacción m b comim es una hidroxi[ación, catalizada por miembros de una clase de enzimas denominadas monmxigenasas o citocromo P450. La hidroxilaci6n puede terminar la acción de un fármaco, aunque éste no es siempre el caso. Además de la hidroxiPacion, estas enzima cataliHn una variedad asombrosamente amplia de reacciones, inclusive las que implican desaminacibn, deshalogenación, disulfuración, epoxidacibn, peroxigenacibn y reducción. También se presentan en la fase 1 reacciones que implican hidrblisis (por ejemplo, catalizadas por esterasas) y algunas otras reacciones catalizadas por no-P450. En la fase 2, los compuestos hidroxilados u otros producidos en la fase 1 se convierten por acción de enzimas especificas a varios metabolitos polares por conj ugacibn con 6cido glucuriinico, su1fato, acetato, glutatidn o ciertos aminoácidos o por metilacibn. El prop6sito globaI de las dos fases del metabolismo de xenobi&ticoc es incrementar su solubilidad en agua (polaridad) y aci facilitar su excrecidn del cuerpo. Los xenobibticos muy hidrófobos persistirían en el tejido adiposo casi de manera indefinida si no se
880
-
B f oquim ica de Hurper
convirtieran a formas mas polares. En ciertos casos, las reacciones rnetab6lica.s de la fase 1 convierten xenobibticos inactivos a compuestos biológicamente activos. En este caso, Ios xenobióticos originales se denominan "profAmacos" o "procarcinógenos". En otros ejemplos, reacciones fase 1 adicionales (como reacciones de hidroxilación ulteriores) convierten los compuestos activos a otros menos reactivos o a formas inactivas, antes de la conjugacion. Aún en otros casos, son las propias reacciones de conjugación las que convierten los productos activos de las reacciones de fase 1 a especies menos activas o inactivas, que a continuación se excretan en la orina o bilis. En muy pocos casos, la conjugación puede de hecho incrementar la actividad biológica de un xenobiótico. El ?&mino"destoxificacibn" se usa en ocasiones para referirse a muchas de las reacciones que ocurren en el metabolismo de xenobióticos. Sin embargo, no es siempre un tkrmino apropiado debido a que, como se describió, en algunos casos las reacciones a las que se sujetan los xenobióticos en realidad incremenian su actividad biolhgica y su toxicidad.
LAS ISOFORMAS DEL CITOCROMO P450 HEDROXILAN A MIRÍADAS DE XENOBIQTICOS EN LA FASE 1 DE SU METABOLISMO La hidroxilacibn es la reaccibn principal que ocurre en la fase l . Las enzimas responsables se llaman monooxigenasas o citocromo P450; el genoma humano contiene cuando menos 11 familias de estas enzimas. La reaccidn catalizada por una monooxigenasa citocromo P450 es: RH + 0
2
+ NADPH + H* -+ R 4 H + H20 + NADP
En donde R H representauna amplia variedad de xenobióticos que incluye: fármacos, carcin6genos, plaguicidas, derivados del petróleo y polutos (como es una mezcla de bifenilos policrorinados). Ademfis, también son sustratos los compuestos endbgenos tales como ciertos esteroidec, eico&noides, hcidos grasos y retinoides. Los susvatos, por lo común, son lipofilicos y mediante la hidroxilacibn se convierten en mfis hidrofllicos. Al citocromo P450 se le considera el biocatalizador m8s versAtil conocido. El mecanismo real de reacción es complejo y se describe previamente con brevedad y en la figura 13-8. Mediante el uso de Olla, se sabe que un 62omo de oxígeno entra a R 4 H y el otro al agÜa. Este destino doble del 0 2 explica el nombre original de las monooxigenasas que se designaban
oxidasas de función mixta. La reacción por citocromo P450 puede representarse también como: Cit P45O reducido
Cit P450 oxidado
u
Las monooxigenasas principales en el reticulo endoplbrnico son citocromos P450. Su nombre deriva del hecho de que la enzima se descubri6 al observar que las preparaciones de microcomas que habian sido reducidas por procesos qutmicos y luego expuestas a mon~xidode carbono exhibian un máximo definido a 450 nm. Esta enzima es en extremo importante debido pues a que se calcula que alrededor de 50% de todos los famiacos ingeridos por pacientes se metabolizan por acción de isofotmas de citocromo P450.Además, la misma enzima actúa sobre varios cascinhgenos y contaminantes ambientales. Las isofomas del citocromo P450 constituyen una superfamilia de enzimas que contienen hem A continuaci6n se presentan puntos importantes acerca del citocromo P450 y sus isofomas. 1) En virtud de la gran cantidad de isofomas (cerca de 150) descubiertas resulta importante tener una nomenclatura sistemátjca para las isofomas del P450 y para sus genes. Esta se encuentra disponible y es de uso amplio y se basa en la homologia esúuctural. El simbolo raíz CYP denota al citocromo P450. Éste es seguido por un número mkbigo que designa 1a familia; los cjtocromos P450 se incluyen en la misma familia si muestran 40% o mAs de secuencia idéntica. Al numero ariibigo sigue una letra mayirscula que indica la subfamilia; los citocromos P450 quedan en la misma subfamilia si muestran mhs de 55% de secuencia idkntica. En seguida se asignan arbitrariamente números arhbigos a cada citocromo P450 individual. Por tanto, CYPAl denota un citocromo P450 que es miembro de la familia 1 y subfamilia A y es el primer miembro de tal subfamilia. La nomenclatura de los gtnes que codifican los citocromos P450 es idhtica a la descrita pero se utilizan itiilicas; por tanto, el gen codificante de CYP 1A l es CYPIAI. 2) Al igual que la hemoglobina, existen hemoprotefnas.
3) Tienen una distribución muy amplia en= las especies biolbgicas. Las bacterias tienen citocromos P45O y la estructura cristalina del P450,, (par-
ticipante en el metabolismo del alcanfor) de Pseudnmonas pudrda es la única establecida de una isoforma del P450. 4) Se les encuentra en grandes cantidades en el hígado. Tanto en éste como en la mayor parte de otros tejidos se les encuentra sobre todo en las membranas de reticuio endoplhsmico liso, el cual constituye parte: de la fracción micros6mica cuando el tejido es objeto de fraccionamiento subcelular (capitulo 2). En los microsomas heph~icosel citocromo P450 puede abarcar tanto como 20% del total de la proteina. Los citocromos P450 se encuentran en la mayor parte de los tejidos, aunque a menudo en cantidades menores comparadas con las hepAticas. En las glándulas suprarrenales, se encuentran en rnitocondrias y también en el retículo endoplásmico; varias hidro2asas que existen en ese 6rgano desempefian un papel importante en la biosintesis de esteroides (capitulo 48). El sisternacitmmo P450 mitocondrial difiere del sistema microsémico en que usa flavoproteína ligada a NADPH, adrenodoxina reductasa y una proteína que contiene azufre y no requiere hierro hémico, la adrenodoxina. AdernBs, las isoformas especificas del citocromo P450 implicadas en la biosíntesis de esteroides, por lo general, estan mucho más restringidas en su especificidad de sustrato. 5) Hay por lo menos seis isoformas estrechamente relacionadas de citocromos P450 presentes en el retículo endoplisrnico hepático, cada una con especialidades amplias y algo trastapadas de sustratos, que actúan sobre una variedad muy extensa de medicamentos, carcinógenos y otros xenobibticos, ademLs de compuestos endbgenos. Los genes para muchas isoformas de citocromo P450 (tanto para humanos y animales como la rata) se han aislado y estudiado con detalle en aiios recientes. 6 ) El NADPH, no NADH, colabora en el mecanismo de reacción de citocromo P450.Idaenzima que usa NADPH para producir citocromo P450 reducido, mostrada en el lado izquierdo de la ecuacibn anterior, se designa NADPH
colina, misma que es el lípido principal localizado en la membrana del reticulo endoplismico. 8) La mayor parte de las isofomas del citocromo P450 pueden inducirce. Por ejemplo, la administracion de fenobarbital o de muchos otros f h a c o s produce, en un plazo de 4 a 5 dias, hipertrofia del reticulo endoplismico liso y un aumento de 3 a 4 veces en la cantidad de citocromo P450.Este mecanismo de inducción está ampliamente estudiado y en la mayor parte de los cacos implica aumento en la transcripción de mRNA para el citocromo P450. Sin embargo, ciertos casos de inducción implican estabilización del mRNA, estabilizacibn enzimhtica u otro mecanismo (por ejemplo, un efecto en la traducción). La induccibn de e s a enzima tiene impf icaciones clínicas importantes, ya que es uno de tos mecanismos bioquimicos de interacción farmacologica. Esta ultima ocurre cuando los efectos de un medicamento se alteran por la administracibn previa o concurrente de otro. Para ilustrar esto supbngase que un paciente toma el anticoagulante warfarina para evitar la coagulacion sanguinea. Este f h a c o se metaboliza por el CYP2C4. Concomitantemente, el paciente recibe fenobarbital para tratar cierto tipo de epilepsia, pero no se modifica la dosis de warfarina. Alrededor del dia cinco, la concmtracibn hephtica de CYP2C9 en el paciente ce incrernenta de 3 a 4 veces. Esto significa que la warfarina sera metabolizada mucho mAs aprisa que antes y su dosificación serl inadecuada. Por tanto, la dosis debe incrementarse para que estC en un nivel terapbutico. Para seguir con este ejemplo, un problema surgiría más tarde si el fenobarbital se suspende y la dosificacibn elevada de warfarina continúa. El paciente tendra riesgo de hemorragia dado que estavez la warfarina sera más activa al conservarse por mas tiempo en la circulacibn antes de su depuracíén ya que citocromo P450 declinará una vez retirado el fenobarbital. Otro ejemplo de induccion enzimatica implica al C W E I ,que se induce por el consumo de etanol. Esto es motivo de preocupación ya que este citocromo metaboliza ciertos solventes de amplio uso y también componentes que se encuentran en el humo del tabaco, muchos de ellos carcinógenos comprobados. Por tanto, si la actividad del CYP2El se eleva mediante inducción, se puede aumentar el riesgo de carcinogdnesis desarrollada por la exposición a tales compuestos. 9) Ciertas isoformas del citocromo P450 (por ejemplo, el CY P 1A 1) están implicadas en particular en el metabolismo de hidrocarburos aromaticos policiclicos (PAH) y moléculas relacionadas; por e s t a r a z 6 n s e c o n o c e c o m o hidrocarburo
882 BIoquh Ica de Harper
(Capítulo 4 I )
aromhtico hidroxilasa (AMH). Esta enzima es muy importante en el metabolismo de PAH y en la carcinogénesis producida por estos agentes. Por ejemplo, en el pulmón puede intervenir en la conversión de PAH inactivos (procarcinogenos), inhalados al fumar, a carcinógenosactivos por reacciones de hidroxilacion. Los fumadores muestran concentraciones mhs altas de esta enzima en algunas de sus dlulas y tejidos que los no fumadores. Algunos estudios sugieren que la actividad de esta enzima puede elevarse (inducirse) en la placenta de mujeres fumadoras, y alterar así las posibles cantidades de metabolitos de PAH (algunos de los cuales podrian ser nocivos) a los que se expone el feto. 10)Datosrecientes demuestran que ciertos citocromos P450 existen con fkuencia en formas polimórficas, algunas de ellas con escasa actividad catalítica. Estas observaciones son una explicación importante de las variaciones en la respuesta a medicamentos notada entre pacientes. Un citocromo que muestra polimorfismo es el CYP2D6 implicado en el rnetabolismo del debrisoquin (un fkrnaco hipertensor; cuadra 61-2) y la asparteína (un fármaco antiarritmico y oxitdxico). Ciertos polirnorfismos del CYP2D6 dan lugar a un metabolismo deficiente de estos y otros diversos f h a c e s por lo que pueden acumularse en el organismo y resultar consecuencias impredecibles. El cuadro 61-1 resume algunas de las c m c teristicas principales de los citocromos P450.
LAS REACCIONES DE CONJUGACION PREPARAN LOS XENOBIÓTICOS PARA EXCRECIIÓNEN LA FASE 2 DE SU METABOLISMO En general, en las reacciones fase 1, los xewbióticos se convierten a derivados hidroxilados, m8s polares.
En las reacciones fase 2, estas derivados se conjugan con moléculas como acido glucuronico, sulfato o glutatibn. Esto los hace aún más solubles en agua y por último se excretan en orina o bilis.
Cinco tipos de reacciones de fase 2 se describen a continuación
A. Glucuronidación La gtucuronidación de bilimbina se estudib en el capítulo 34. Las reacciones usadas para glucuronidación de xenobi6ticos son en esencia anhlogas. El hcido glucurónico-UDP es el donador glucuroniloy los catalizadores son varias glucuronosil h-ansferasas, presentes en el retículo endoplBrnico y el citosol. Moléculas wmo 2+cetilarninofluoreno (un ~arcinbgeno),anilina, ácido benzoico, meprobarnato (un tranquilizante), fenol y muchos esteroides se excretan como glucurónidos. El radical glucurbnico puede adherirse a oxígeno, ni@& geno o grupos sulfuro de los sustratos. Es probable que la glucuronidaci6n sea la reacción de conjugacibn mls frecuente.
B. SuIfataci6n
Cuadm 61-1. Algunas propiedades de 1m citocromos P450----A
bolismo dc muchos xi ;Y mmolcn ae compuestos endógenvs como los esteroiues
Algunos alcoholes, ari1aminas y fenoles se sulfatan. El donador de sulfato en éstas y otras reacciones biotogicas de sulfatacibn (por ejemplo, sulfatación de esteroides, glucosaminoglucanos, glucolipidos y glucoproteínas) es el 3'-fosfato-5'-fosfosulfato de adenosina (PAPS) (capítulo 26); este compuesto se conoce como "sulfato activo".
e
11iaespecifi cidad de aISl,,mfl;A-
A-
>
h r n o de,oitigeno al sustrato y uno dentro del agua • Sus produictos hidroxilados coin más hidrrisolubles q ue sus sustral:os, por lo ;peneral, Iiplofilicos . , .. .., , CI nigaao contiene las mayores canriaaaes, pero se encuentran e:R la mayo1- patzc de 113s tcjidos • Se IocaIinm en el retiini10 cndoplIásmico lisc Dcondria (enzirnas est,eroidogtni -1
3
1
Cn olniinn
nogknicos Lamayor parte tiene!n masa mol ecular cerc la Muchos SSon inducib les " Algunos presentan poiimorrismo que pueae aar lugar a metabolismo f m a c o l o ~ i c oatípico l.
C. Conjugación con glutatjon Glutatibn es un tripéptido (garnma-glutamilcisteinilglicina) que consiste en Acido glutámico, cisteina y glicina (figura 5-4). Su abreviatura común es GSH (SH indica el grupo sulfhidrilo de su cisteína) y es la parte activa de la mol6cula. Cierto número de xenobibticos electrbfilos tbxicos (como algunos carcinógenos) se conjugan al GSH nucleofilo, en reacciones que pueden representarse: R + GSH + R
C
4
donde R = un xenobi6tico electtdfilo. Las enzima que catalizan estas reacciones se llaman glutati6nStransferasas y existen en cantidades elevadas en el citosol de hepatocitos y menores en otros tejidos. En
Metabolismo de xenobid~icos 883
el hombre, hay diversas glutati6nS-transferasas. Exhiben especificidades diferentes de sustratos y pueden separarse por electroforesis y otras técnicas. Si los xenobidticos con potencial tbxico no fueran conjugados a GSH, quedarian Iibres para combinarse por covalencia con DNA, RNA o psoteina celular y así causar un dafio grave a la celulas. Por tanto, GSH es un mecanismo importante de defensa contra ciertos compuestos tóxicos, como algunos medicamentos y carcinogenos. Si la concentracion de GSH en un tejido como el hephtico se reduce (lo que puede ocurrir por administración a las ratas de ciertos compuestos que reaccionan con GSH), entonces puede demostrarse que ese tejido es más susceptible a lesibn por varios compuestos quimicos que en forma normal se conjugarían con GSH. Los conjugados con glutation están sujetos a metabolismo adicional antes de su excrecion. Los grupos glutamilo y glicinjlo que pertenecen al glutatibn se retiran por enzimas especificas y se agrega un grupo acetito (donado por acetil-CoA) al radical amino remanente de la porción cisteinil. El compuesto resultante es el acido mercaptúrico, un conjugado de ~-acetilcisteinaque a continuacibn se excreta en la orina. El glutatión tiene otras funciones importantes en las ctlulas humanas, aparte de su función en el metabolismo de xenobióticos. l. Participa en la descomposicibn de perbxido de hidrdgeno potencialmente tóxico en la reacción catalizada por glutatión peroxidasa (capitulo 22). 2. Es un reductor intracelular importante, que ayuda a conservar los gmpos SH esenciales de las enzirnas en su estado reducido. Esta accion se estudia en el capitulo 22 y su intervención en la anemia hemolftica causada por deficiencia de glucosa-ó-osf fato deshidrogenasa se describe en los capítulos 22 y 60. 3. Se ha implicado al GSH en un ciclo metab6lico como portador en el transporte de ciertos aminoácidos que cruzan las membranas de los rifiones. La primera reacción del ciclo es: Amino6eido + GSH + arninoAcido-yglutamilo Cisteinilglicina
*
Esta reaccibn ayuda a transferir ciertos aminoácidos
a travks de la membrana plasmática; mhs adelante el aminoácido se hidroliza de su complejo con GSH y éste se resinteti. a partir de cisteinglicina. La enzima que cataliza la reacción anterior es gamma-glutarniltransferasa (GGT). Se encuentra en la membrana plasmhtica de cdlulas de los túbulos renales y en el reticulo endoplhsmico de hepatocitos. La enzima tiene valor diagn6stic0, debido a que es secretada a la sangre desde los hepatoc itos en varias enferrnedades hepatobiliares.
D. Otras reacciones Las dos más importantes son acetilacibn y metilacibn. 1. La acetilación se representa por:
donde X es un xenobiótico. Igual que en otras reacciones de acetilación, acetil-CoA (acetato activo) es el donador de acetilo. Estas reacciones se catalizan por acetiltransferasas presentes en el citoso1 de varios tejidos, en particular hepAtico. El medicamento isoniacida, usado en el tratamiento de tuberculosis, est8 sujeto a acetilación. Existen tipos polimóficos de las acetiltransferasas y, por tanto, hay personas que se clasifican como acetiladores lentos o rápidos e influyen en el indice de depuracibn de fiimiacos coma Esoniacida de la sangre.Los acetiladores lentos están m& sujetos a ciertos efectos tóxicos de la isoniacida debido a que el fhmaco persiste por más tiempo en ellos. 2. Metilación: Algunos xenobióticos se depuran por metilacibn con metiltransferasas como catalizadores y con el empleo de S-adenosilrnetionina (figura 32-2 1) como donador del grupo metilo.
LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS METABOLIZADORAS DE XENOBI~TIGOS SE AFECTAN POR EDAD, SEXO Y OTROS FACTORES Varios factores modifican las actividades de las enzimas que metabolizan xenobibticos. La accibn de las enzimas puede diferir de manera sustancial entre especies. Esto es importante ya que significa que los resultados, por ejemplo, de la posible toxicidad o carcinogenicidad de los xenobibticos no pueden extrapolarse libremente de una especie a otra. Hay también diferencias significativas entre personas, muchas de las cuales al parecer se deben a factores genéticos. Las actividades de algunas de estas enzimas varfan de acuerdo a edad y sexo. La ingestidn de varios xenobibticos como fenobarbital, PCB o ciertos hidrocarburos puede causar inducción enzimhtica. Por tanto, interesa conocer si una persona se ha expuesto o no a estos agentes inductores en la valoración de respuestas bioquimicas a xenobióticos. Los metabolitos de ciertos xenobibticos pueden inhibir o estimular las actividades de enzimas metabolizantes de xenobibticos. De nueve, esto puede afectar la dosis de ciertos fármacos administrados a1 paciente.
884 Bioquímicu de Hurpr
(Capitulo 661)
LAS RESPUESTAS A XENOBIÓTICOS INCLUYEN EFECTOS FARMACOL&ICOS, TÓXICOS, INMUNOL~GICOS Y CARCIN~GENOS Los xenobibticos se metabolizan en el cuerpo por las reacciones descritas antes. Cuando el xenobiotico es un fhrmaco, las reacciones de la fase 1 pueden producir su forma activa o disminuir o terminar su accibn si es farmacol6gicamente activo en el cuerpo antes de su metabolismo. Los diversos efectos producidos por medicamentos en el cuerpo corresponden al área de estudio de la farmacología; aquí es importante apreciar que los f h a c o s actúan principalmente a través de mecanismos bioquímicos. El cuadro 61-2 resume tres reacciones importantes a los fámiacos que reflejan diferencias entre los individuos determinados geneticamente en la estructura enzirnBtica y proteínica, parte del campo de estudio de lo que se conoce como "famacogenttica". Ciertos xenobi0ticoc son muy toxicos, inclusive a concentraciones bajas (por ejemplo, cianuro). Por otra parte, hay algunos, incluso fhrmacos, que no ejercen efecto t ~ x i c aalguno si se administran en la cantidad adecuada. Por tanto, los efectos tóxicos de xenobióticos cubren una variedad en extremo amplia. Sin embargo hay tres tipos generales de acciones [figura 6 1-1) que se describen aqui de manera breve, debido a su relaci6n con el metabolismo de xenobióticos. El primero de &tos es la lesi6n celular, que puede ser lo bastante grave para causar la muerte de la cClula. Son muchos los mecanismos mediante los cuales los
cuadra 81-2. Aigunnis reacciones importantes a fhrrnacos que se deben enzimas o protctnas ---
--
rnutantcfi o polimt . .-
- -- -. :-- --
-p.--
Enzima o proteinaI
rfectada
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+
:shi- Anemia hemolitica desyiuks 1 ingestihn de f&rnacos o la primaquina
Canal liberal30r de C$-' (receptor de rianodina) en el reticulo sarcoplas~ nico lrnutaciorles1
C
os]
1 Hiptrtermia
nialigna tfc Spues de la admi nistración (le ciertos anestlisicos (pi3r
eiernnlo, haloui "".* . "2-.L-..L Abatimienfo (iel metnh~ Dlism o de ciertos fhrmaci3s (por ejemplo, debrisoqullque result uicihn
* La deficienci
xenobibticos lesionan las células. Uno considerado aqui es la fijacibn covalente de rnacromolkculas celularec a especies reactivas de xenobíóticos producidos por el metabolismo. Estos blancos macromoleculares incluyen DNA, RNA v proteína. Si la macromoiecula dondé el xenobibticós'e une es esencial para la supervivencia a corto plazo de la célula, por ejemplo, una proteína o una enzima que se ocupa de alguna funcibn celular critica como fosforilación oxidativa o regulacion de la permeabilidad de la membrana plasmatica, el deterioro de la funcion celular podría hacerse evidente con bastante rapidez. Segundo, la especie reactiva de un xenobiótico puede unirse a una proteína, modificándola y altera su antigenicidad. Se dice que el xenobiótico acttia como un hapteno, es decir, una mol6cula pequefia que por si misma no estimula la sintesis de anticuerpo pero se combinara con éste una vez formado. Luego, los anticuerpos resultantes pueden lesionar la célula por varios mecanismos inmunológicoc que perturban en forma masiva los procesos bioquímicos normales. Tercero, se considera que las reacciones de especies activadas de carcinógenos químicos con DNA tienen gran importancia en la carcinogenesis quimica (capitulo 62). Algunos compuestos quirnicos requieren (por ejemplo, benzo[alfa]pireno) activacion por monooxigenasac en el retículo endoplásmico para convertirse en carcinogenos (por tanto, se designan carcinógenos indirectos). Así, las actividades de monooxigenasas y otras enzimas metabolimntes de xenobibticos presentes en el reticulo endoplhsmico ayudan a deteminar si estos compuestos se vuelven ciircinógenos o son "destoxificados". Otras sustancias quimicas (par ejemplo, varios agentes alquilantes) pueden reaccionar de manera directa (carclnbgenos directos) con DNA, sin experimentar activacibn química intracelular. La enzima epúxido hidrolasa interesa debido a que puede ejercer un efecto protector contra ciertos carcinogenos. Los productos de la accián de ciertas monooxigenasas sobre sustratos procarcinógenos son ephxidos. Estas sustancias son sumamente reactivas y mutágenas, carcinógenas o ambas. La e p h i d o hidro[asa, igual que citocromo P450 tambidn presente en las membranas del reticulo endoplásmico, actúa sobre estos compuestos, convirtiéndoloc en dihidrodioles mucho menos reactivos. La reaccidn catalizada por epdxido hidrolasa puede representarse como sigue:
-
;e presenta e n los capltul la - 1 nl-:i..ln hipertermia iririirgiin GII ci Lupiruiv 58. Se tienti1 uispuriivies muchos otms ejemplos de reacciones a F h a c o s que tienen como base mutacicinrs o polimor8smo.
Epoxido
Dihidrodiol
Metabolismo de xenobi&icos
+
t
Producción de anticu
r
CBncar
585
J
I
Lesibn Celular
Figura 61-1. Esquema simplificado que muestra odmo el metabolismo de un xenobiotico puede causar lesibn celular, daho inrnunológim o ~Ancer.En este ejemplo, la conversibn del xenobiótico a un metabolito reactivo se cataliza por un citocromo P450 y la conversibn del metabolito reactivo (por ejemplo, un epbxido) a un metabolito no tbxico se debe a la acubn de GSH-S transferasa o epbxido hidrolasa.
Se espera que el conocimiento subsecuente de los citocromos P450 y de otras enzimas pariicipantes en el metabolismo de los xenobióticos de como resultado el mejoramiento de los metodos para establecer la seguridad de los fhrrnacos, coadyuve para evitar los efectos indeseables de los fhmacos, y coadyuve a la disposicihn final de los contaminantes ambientales potencialmente tóxicos. Es probable que las pruebas basadas en DNA se desarrollen para ayudar a detectar personas con mutaciones que dan lugar a reacciones severas a algitnos famiacos.
RESUMEN Los xenobióticos con compuestos químicos extraños al cuerpo, como medicamentos, aditivos de alimentos y contaminantes ambientales; se han identificado mlis de 200 000. Los xenobióticos se metaboli7an por el organismo en dos faces. La reacciiin principal de Sa fase 1 es la hidroxilación catalizada por diversas monooxigenasas, conocidas también como citocromos P450. En la fase 2, los xenobióticos hidroxilados se conjugan con diversos compuestos hidrófilos como ficido glucuronido, suffato o glutatibn. La operacion combinada de estas dos fases convierte a los compuestos lipofílicos en sustancias solubles en agua que pueden eliminarse del cuerpo. Los citocromos P450 catalizan reacciones que introducen un átomo de oxígeno derivado del oxigeno molecular al sustrato para generar un producto hidroxilado. En et compleja mecanismo de reaccibn inter-
vienen NADPH y NADPH-citocromo P450 reductasa. Todos los citocromos P450 son hemoproteínas y tienen una amplia especificidad de sustrato ya que actúan sobre numerosos compuestos exógenos y endbgenos. Representan el biocatalizador más versátil conocido. En los tejidos humanos se encuentran miembros de 1 1 familias del citocromo P450. En general, los citocromos P450 se locali7m en el reticulo endopl8cmico celular y los hepatocitos son en especial ricos en ellos. Numerosos citocromos P450 son indiicibles. Esta propiedad tiene implicaciones considerables en fenómenos como interacción fmacológica También existen los citocromos P450 mitocondriales y actúan como catalizadores en la biosintesis de colesterol y esteroides. Usan una proteina que contiene azufre v no q u i e r e hierro htmi&, la adfwi0doxina que no requi'eren las isofomas mitocondriales. Debido a sus actividades catalíticas, los citocromos P450 desempefian funciones importantes en las reacciones celulares a compuestos quirnicos y en la carcinogénesis quimica. Las reacciones de la fase 2 se catalizan por enzimac como glucuroniltransfemsas,sulfatmnsferasasy glutatión S-transferasas, que utilizan UDP-ácido glucurónico, PAPS (su1fato activo) y glutation, respect ivarnente, como donadoses. El glutatión no sólo tiene una acción destacada en las reacciones de la face 2 sino que es tambien un compuesto reductor intra~elulare interviene en el transporte de ciertos aminohcidos al interior de las cktulas. Los xenobióticos pueden producir diversos efectos biológicos que incluyen respuestas farmacológicas, toxicidad, reacciones inrnunol0gicas y cancer. I
886
Bioquimica de Hurper
(Capitulo 61)
REFERENCIAS Ceon MJ et al.: Cytochrome P450:Progress and predic-
tions. FASER J 1992;6:669. Gelboin HV: Cytochrome P450 and rnonoclonal antibodies. Pharmacol Rev 1993:45:413. Guengerich FP: Characterization of humm cytochrome P450 enzymes. PASBB J 1992;6:745. Jakoby WB, Ziegler DM: 'The enzymes of detoxication. J t3rol Chem 1990:265:20715. Kalow W, Crant DM: I'harmacogenetics. I n The iWetoholic and ,Wolecular Bases oJInheriied Disease, 7th ed. Scrivcr CR ct al. (cditors). McGraw-Hill, 1995. Katzung BG (editor): Busic & Clinical Phurrnacolo~,6th ed. Appleton & Lange. 1994; publicado por 1aEditorial El Manual Moderno, Mkxico.
Nebert DW et al.: The P450 superfamily: Update on new sequences, gene mapping and recommended nornencIarure. DNA Cell bioI 1991; 10:1 Pacifici GM, Fracchia GN (editors): Advances in Dmg ,2rietabolism in hfan. Office for Of'ficial publications of thc Europcan Communities, 1995. (Los diversos capítulos contienen descripción actualizada de 1s ptincipales cntimas implicadas en el metabolismo de l'ámacos en tejidos humanos,) Porter TD, Coon Md: Cytochrome P450:Multipliciv of isoforms, substrates and catalytic and regulatory mcchanims. J BioI Chem 1991;266: 13469. Rushmore TA, Pickett CB: Glutathionc S-transferascs, structure, regulation, and therapeutic irnplications. J Biol Chem 19933268:1 1475.
-
Cáncea, oncoaiewes v factores de crecimiento
Las d l u l a s cancerosas tienen tres propiedades caracteristicas: 1) disrninucibn o ausencia de control del crecimiento; 2 ) invasividad de tos tejidos IocaIes, y 3) dispersibn o metástasis a otras partes del cuerpo. Las cklirlas de los tumores benignos muestran tambitn disminución del control del crecimiento pero no invaden el tejido local ni se diseminan a otras regiones del cuerpo. En este capitulo se estudian algunos aspectos bioquimicos del cáncer. Los objetivos priicipales son: explicar en términos bioquimicos la proliferación incontrotable de las cdtulas cancerosas y su capacidad para invadir y causar metktasis. Aparentemente, ciertos genes que controlan el crecimiento y las interacciones de las c4lulas cancerosas con las células sanas, son anormales en su estructura o en su regulaci6n. La infomacibn sobre el crecimiento celular, tanto normal como patológico, es limitada y el conocimiento de los genes específicos que intervienen en su regulacibn es aún más magro, Poco se sabe acerca de la base bioquimica de la metástasis, de modo que este tema es breve. Sin embargo, por lo menos algunos tipos de chncer (por ejemplo, ciertas leucernias) pueden considerarse como ejemplos de diferenciación anormal. De nuevo, es asombrosamente escaso el conocimiento de la base molecular de la diferenciacidn. No obstante, muchos investigadores de esta Area consideran que estudios futuros sobre oncogenes, genes supresores de tumores, factores de crecimiento y sus receptores, sistemas de reparación del DNA, y la regulacion del ciclo celular, proporcionarh una pers-
d
pectiva de la naturaleza de la perturbación del control de la proliferacibn, de la diferenciacibn (donde sea aplicable) y de la interaccibn de celula a célula que muestran las c&lulascancerosas. Recientemente surge el interés por elucidar la base molecular de la susceptibilidad genética al cáncer. Un ejemplo es el aisl a m i e n t o del gen BRCAI q u e i n c r e m e n t a l a susceptibilidad al ciincer de la mama y ovhico. Por tanto, estos tbpicos se e x p o n d h con cierto detalle.
El cáncer es la segunda causa de muerte en EUA después de las enfermedades cardiovasculares. El c h c e r afecta a los humanos de todas las edades y a una extensa variedad de órganos. La frecuencia de muchos de los cancerec aumenta con la edad, de modo que conforme la gente sea m& longeva, un numero mayor desarroilará la enfermedad. Aparte del sufiimiento humano, la carga econbmica para la sociedad es inmensa.
AGENTES F ~ S ~ C O QU~MICOS S, Y BIOLQGICOS PUEDEN CAUSAR CANCER Los agentes que causan cfincer se clasifican en tres amplios grupos: energia radiante, compuestos químicos y virus. En este capítulo se presentan tres causas geneticas del cances.
(Capítulo 62)
La energía radiante puede ser carcinógena Los rayos ultravioleta, los rayos X y los rayos gamma con rnuthgenos y carcinógenos. Estas radiaciones lesionan al DNA de varias maneras. La radiación ultravioleta puede causar la formacibn de dimeros de pirimidina. Pueden crearse sitios apurinicos o apirimidinicos por eliminacibn de las bases correspondientes. Pueden producirse roturas en las tiras sencillas o dobles, o entrecmzamiento de ellas. Se presume que la lesi6n del DNA es el mecanismo básico de carcinogenesis de la energía radiante, pero los detalles no están claros. La reparacibn del DNA se explica en el capitulo 38. Aparte de los efectos directos sobre el DNA, Los rayos X y gamma provocan la formación de radicales libres en los tejidos. Los radicales resultantes OH, superbxido y otros, pueden interactuar con el DNA y algunas rnacromoléculas y conducir a alteraciones moleculares y, por tanto, es probable que contribuyan a los efectos carcinógenos de la energia radiante.
Muchos compuestos químicos
son carcinógenos Una extensa variedad de compuestos quimicos son carcinbgenos (cuadro 62-1); en la figura 62-1 se muestran las estructuras de tres de [os más estudiados. La mayor parte de los compuestos enumerados en el cuadro 62-1 se han verificado por administracién a roedores o a otros animales, Sin embargo, muchas sustancias se relacionan con el desarrollo de cáncer en el ser humano. Se calcula que hasta SO% de los cánceres humanos se producen por factores ambientales, principalmente por compuestos quimicos. La exposición a esas sustancias puede deberse a la ocupaci6n de La persona (por ejemplo, benceno, asbesto); la alimen-
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Cuadro 4
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taci6n (por ejemplo, aflatoxina Bi, que es producida por el moho Aspergilli~flai>z1~ y en ocaiiones se encuentia como contaminante de los cacahuates y otros alimentos}; el estiro de vida (por ejemplo, consumo de cigarrillos) o a otros factores (por ejemplo, ciertos agentes famacológicos pueden ser carcin~genos).Aquí se presentarán solamente algunas generalizaciones importantes que surgen del estudio de la cat-cinogénesis química.
A. Estrucf ura Tanto mol~culasorgánicas como inorgánicas pueden ser carcinógenas (cuadro 62-1 ). La diversidad de estos compuestos indica que no poseen una característica estructural comhn que les confiera carcinogenicidad.
B. Acción Los carcinhgenos orghnicos son los estudiados con mhs minuciosidad. Se ha encontrado que algunos, como la mostaza nitrogenada y la beta-propiolactona, interactúan directamente con las moléculas blanco (carcinógenos directos), pero oims requieren m e t a b tizarse primero para ser carcinégenos (procarcinógenos; capítulo 6 1). El proceso por el cual, una o más reacciones catalizadas por enzimas convierten a tos procarcinogenos en carcinbgenos activos se llama activaci6n metabblica. Cualquier compuesto intermedio formado se conoce como carcinbgeno aproximado y el compuesto final que reacciona con las componentes celulares (por ejemplo, DNA) es el carcinbgeno finaI. La secuencia es: Procarcinbgeno + Carcinógeno aproximado -+ Carcinbgeno final
El procarcindgeno no es en si una variedad químicamente reactiva, en tanto que el carcinógeno final es con frecuencia altamente reactivo. Se requieren, por lo menos, dos reacciones para convertir el procarcinúgeno 2-acetilaminofluoreno (2-AAF) al carcinógeno final, e[ tster sulfato de N-hidroxi-AAF. Una generalización importante es que los carcinógenos finales son, por lo general, electrhfilos (es decir, molkculas deficientes en electrones), que con facilidad atacan a los gmpos nucleófilos (ricos en electrones} en el DNA, el RNA y las protelnas.
C. Metabolismo de carcinógenos quimicos En el metabolismo de procarcinógenos y otros xenobiriticos intervienen monooxigenasas y transferasas (capitulo 61). Las enzimas causantes d e la activación metab6lica de los carcinógenos son principalmente monooxigenasas que contienen hem, del tipo del ci-
Cancer, oncogene.7 y faciorcs de crecimiento 889
Figura 62-1. Estructuras de tres carcinbgenos quirnicos importantes utilizados en la invectigacibn
tocmmo P450,localizadas en el retículo endoplásmico.
F. Mutágenos
Son las mismas enzimas implicadas en el metabolismo de otros xenobióticos como los medicamentos y tos contaminantes ambientales (por ejemplo, difenilos policlorinados [PCB]). Numerosos factores, como espcie, consideraciones genéticas, edad o sexo, alteran las actividades de las enzimas rnetabolizantes de carcEn6genos qulmicos. Las variaciones eo su acción pueden explicar las, a menudo, apreciables diferencias en la carcinogenicidad de compuestos químicos entre especies diferentes e individuos distintos de la misma especie. Muchos de Ios puntos anteriores se describen con detalle en el capitulo 6 1.
La mayor parte de los carcin6genos químicos son mutagenos. Esto se demuestra mediante el análisis de Ames (véase adelante) y otras pruebas. A nivel molecular, se sabe que ocurren transiciones, transversiones y otros tipos de mutación (capítulos 38 y 40) despuks de exponer ciertas bacterias a carcinógenos finales. Se presume que ciertos tipos de chncer se deben a mutaciones en células somaticas que afectan a procesos reguladores importantes en tales células. En la actualidad se tienen pruebas directas de estas alteraciones (vdase adelante oncogenec y gen supresor de tumores). Dado que probar la carcinogenicidad de las sustancias químicas en animales es lento y costoso, se han desarrollado anlilisis de laboratorio para detectar su potencial carcinbgeno. Muchos se basan en la deteccidn de la mutagenicidad de los compuestos. Estos análisis son mas rápidos y menos costosos que la búsqueda de tumores en los animales. No es lo ideal, dado que la prueba fehaciente de que un compuesto quimico es carcinbgeno es demostrar que causa tumores en animales. Sin embargo, un anatisis basado en la identificación de mutagenicidad, el análisis de Ames, ha probado su utilidad en la deteccihn de carcinégenos potenciales. Este análisis emplea una cepa especialmente modificada de Salmonelia ~phirnuruimque tiene una mutacibn (His-) en un gen que codifica a una de las enzimas implicadas en la síntesis de histidina. Por tanto, estas salmonelas particulares no pueden sintetizar este aminoacido, que debe existir en el medio para que la proliferacibn bacteriana se produzca. Cuando un carcinbgeno causa una rnutacibn en el sitio donde est8 la mutacidn original His; esta última puede desaparecer y restablecerse su secuencia de lectura, que la convierte en Hic'. La progenie de la bacteria que contiene tal inversion de la mutacibn, puede ahora sintetizar histidina y, por tanto, proliferar en un medio que carece del minoácido. Estas salmonelas pueden ser observables y cuantificables con facilidad, como colonias que crecen en las placas de agar. Un problema que existe con el uso de bacterias en el anhlisis de mutagenicidad, deriva del hecho de que no contienen la variedad de monooxigenasas que
D. Unión covalente Cuando los carcinógenos químicos se administran a animales o se colocan en c&tulas cultivadas, puede demostrarse (por ejemplo, utilizando carcinbgenos radiactivos) que ellos o sus derivados se unen generalmente por covalenciaa las macromolkulas celulses, incluyendo DNA, RNA y proteínas. Se conoce la naturaleza quimica de los complejos formados por la interaccion de ciertos carcinbgenos con sus rnol~culac blanco. El mayor interés se ha enfocado sobre los productos formados con el DNA. Se observa que los carcinbgenos finales se combinan con las bases purínicas y pirimidfnicas y los grupos fosfodiéster del DNA. El sitio mhs común de ataque es la guanina y la unión de los carcinógenos puede hacerse en los Atarnos Nz,N3, NI, O6y Osde esta base.
E. Lesidn al DNA La interacción covalente de carcinbgenos directos o finales con el DNA puede causar varios tipos de lesiones; el daíío puede ser reparado, como se describe en el capitulo 38. Apesarde laexistenciade tos sistemas reparadores, ciertas modificaciones del DNA por carcinógenos químicos persisten por periodos relativamente largos. Es posible que esta persistencia de lesiones sin reparar tenga importancia especial en la generacibn de mutaciones, críticas para la carcinoginesis.
890 Bioquímica de Harper
poseen los animales superiores.Asi, cuando un compuesto requiere activacion para convertirse en mutageno o carcinógeno, esta no puede ocurrir si se usan bacterias. Ames ha liberado este escollo incubando los agentes que van a probarse en un sobrenadanteposmitocondnal de hígado de rata (la fracción S-9, que es el sobrenadante despuds de centriftigar un hornogeneizado de hígado de rata a 9000 g por un periodo adecuado). La fracción S-9 contiene fragmentos del retículo endoplásmico y, por tanto, la mayor parte de las monooxigenasas y otras enzimas requeridas para activar rnutágenos y carcinogeneticos potenciales. El análisis de Ames identifica aproximadamente a 90% de los carcinógenos conocidos. Se esth convirtiendo en prueba de rutina para compuestos quimicos de sintesis reciente, en particular si van a introducirse en el comercio o utilizarse extensamente en la industria. Los compuestos que dan reacción positiva deben experimentar otras pruebas que incluyen la valoracidn de su carcinogenicidad en animales.
G. Iniciación y promocjón Se sabe que en ciertos órganos como la piel y el higado, la carcinogenesis puede dividirse en por los menos dos etapas. El ejemplo clasico es la piel. En una prueba clásica, áreas idknticas de la piel de un grupo de ratones se pintan una sola vez con benzo[alfa]pireno. Si a continuación no se emplea otro tratamiento, no se desarrollan tumores cutáneos (figura 62-2). Sin embargo, si a la aplicacibn del knzo[alfa]pireno siguen varias otras de aceite de crotbn. se desarrollan numerosos
tumores. Las aplicaciones de aceite de wotbn (sin pretratamiento con benzo[alfa]pireno) no conducen a la formacibn de hirnores cutAneos. Se han ejecutdo muchas otras variantes de este protocolo bhsico que permite las conclusiones siguientes: 1) La etapa de carcinogénesiscausada por la aplicación del bem[alfa]pireno se conoce como iniciación; al parecer esta etapa es rapida e irreversible. Se considera que comprende una rnodificacion perdurable del DNA, quiza aconsmencia de una o más mutaciones. Portanto, al benzo[alfa]pireno se le llama "agente iniciador". 21 La segunda y mucho más lenta etapa (es decir, meses o aiios) de la carcinogknesis, que resulta de la aplicación del aceite de cratón, se llama "promoción". Por tanto, el aceite de crotón es un agente de promoción o promotor. Los promotores no tienen capacidad para dar inicio. 3 ) La mayor parte de los carcinogenos pueden actuar como iniciadores y como promotores. Un gran núrnetnode compuestos que incluyen al fenobarbitai y la sacarina pueden actuar como promotores en varios organos. El agente activo del aceite de crotbn es una mezcla de dsterec de forbol. El Cster de fortiol más activo e s el 12-Q-tetradecanoilforbol-13acetato (VA), que produce numerosos efectos. El hallazgo más interesante ha sido que la proteina cinasa C puede actuar como receptor para el TPA. La estirnulacibn de la actividad de esta enzima por interacción con el TPA, puede conducir a la fosforilación de cierto número de protehas de las membranas, con modificación del transporte y de otras funciones. Este importante resultado une la accihn de ciertos promotores de tumores al campo de la sefialización transmembrana (vtase adelante, factores de crecimiento). Al parecer, muchos promotores de tumores actúan mediante la alteracibn de la expresión gknica, pero aún no se determina eI mecanismo preciso por el cual los promotores influyen en una célula para que se convierta en tumoral.
El DNA es la macromolécula crítica en carcinogénesic
f Tiempo
Sfiturnores
Figura 62-2. Representaubn esquemltia de las etapas de iniuaubn y promocibn de la carcinwbnecis químia en la piel. A: Una aplicadbn del iniciador (por ejemplo, benzo[ajpireno) se hace a la piel de varios ratones. 0 : A la aplicacion del iniaador siguen varias pinceladasen un promotor [porejemplo, aceite de crotbn) a intervalos semanarios, por ejemplo. C: Se aplican primero varias pinceladas del promotor y decpukc el iniciador Aproximadamente, en 100 días aparecen tumores cutaneos benignos (papilomas), los tumores malignos (carcinoma$) aparecen m8s o menos en un ano. Se han realizado muchas otras variantes ilustrativas de este protocolo y todas han confirmado los conceptos básicos de inicio y promoción. (1, iniciador, P, promotor.)
Los hechos siguientes respaldan esta conclusibn: 1) Las cklulas cancerosas engendran células cancerosas, es decir, los cambios esenciales responsables del cáncer se transmiten a las c6lulas hijas. Esto es consistente con el comportamiento del DNA. 2) Tanto la radiacibn como los carcinbgenos qulmicos lesionan al DNA y son capaces de causar mutaciones en 61. 3) Muchas células tumorales muestran cromosornas anormales. 4) Los experimentos de transferencia (vdase adelante) indican que el DNA purificado (oncogenes) de células cancerosas puede transformar cklulas norrnaIes en cdlulas cancerosas (potenciales). Sin embargo, factores epigeneticos pueden intervenir también en la carcinogenesis.
Cáncer, oncogenes y frrctores de crecimiento
Algunos DNA y RNA virales son carcinógenos Los virus oncbgenos contienen DNA a RNA como genoma (cuadro 62-2). Aquí se describirán shlo algunas caracteristicas importantes de los miembros principales de estas dos clases. Los poEiomavirus y los virus SV40 desernpeiian un papel importante en el desarrollo de las ideas actuales sobre la oncogénesis viral. Los dos son pequefios (contienen un genoma de aproximadamente 5 kb) y sus genomas circulares codifican sólo 5 o 6 proteínas. Bajo ciertas circunstancias, la infeccidn con estos virus de células apropiadas puede causar transformacibn maligna. Se sabe que proteinac virales específicas son factores causales. En el caso del SY40, estas proteínas (con frecuencia llamadas antigenos porque fueron detectadas por mktodos inrnunológicos) se conocen como T ("T mayiscula") y t ("t minúscula") y en el caso del poliornavims, se designan, T, T media y t. (La T se refiere al hecho de que la primera de estas proteínas fue identificada en un tumor.) Aún esta en estudio la forma en que estas protelnas causan la transformación maligna; se sabe que 10s antigenos T se unen fuertemente al DNA y alteran la expresibn génica. Estas proteinas muestran efectos cooperativos los cuales sugieren, que es necesario modificar más de una reacción o un proceso para la transfonnacibn. Es un hecha conocido que algunos tipos de adenovirus causan la transformación de ciertas cklulas animales. Hay interks considerable en el virus de Epstein-Barr, dado que en el ser humano se relaciona
* 891
con el linfoma de Burkitt y con el carcinoma nasofaríngeo. El virus de la hepatitis B puede estar relacionado con algunos casos de cáncer hephtico en el hombre. Dado que una buena parte del conocimiento de los oncogenes, obtenido en afioc recientes surge del estudio de virus tumorales que contienen RNA (retrovims, véase despuds), la informacion siguiente sobre oncogenes contiene referencias frecuentes a estos vinis.
Ebi LA TRANSFORMACION MALIGNA OCURREN CAMBIOS MORFO~OGICOS Y BIOQUIMICOS Cuando las cdlulas cultivadas se infectan con ciertos vims oncógenos, pueden experimentar transformación maligna. Los cambios morfológicoc y bioquímicos mBs importantes que ocurren en la transformación se enumeran en el cuadro 62-3. Estos cambios afectan la forma, movilidad, adhesividad a la placa de cultivo, proliferacibn y un cierto numero de procesos bioquímicos de las celulas. Se interpretan como reflejo de los procesos primarios que causan, y de los cambios
Cuadro 62-3. Algunos cambios mostrados por céhlas cultivadas los cuales sugieren que ha ocurrido una transfcirmación n~alignri(por ejemplo después de infeccibn 1Por U n virus onicbgeno). Sin embarga, la pruekia crucial r i ridica la mr ilignidad es la habilidad de la:s c~lulaxp;ara .. . !cea dentro de un tumor in viw
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cuadro 62-2, ~lgungvirusturn~ril&~&~ortantw* PP.,-.'. Miern br, p .
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Adcnovims Herpcsvírus
Hepadnavirus Virus de F
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Potirnavi rus, viru! IomavirUS . - .Adenovirus 12, 15 y 31 Virus de Epstein-Rarr Virus de la hepatitis -- B
1
mi Virus del :sarcoma y 7d murinor i, virus del . . . . . ia ieucemia aviarios, virus i y L. de la leu,cmia humauia de céluk Retrovims tipo B Virus del tumor maniario -del-- ra causa * Los principales viras considerados como ... de . tumores . - c el ser humano son e l vims de Epciein-Harr (Iintoma de Uurtin .., chcer nwofarlngo, linfomas de dlulai; R),el vims de hepatitis B (carcincima hcpatocelular), papilomavirus humanos (varios tumores, i ncluyendo ckceres anogenitales) y el virus de Icu.. . : ,...L cemia-iln~oma de células T humano tipo I (leucemia de dlular T del adulto) Se estimaque los chnceres humanos relacionados con v i w representan 15% de la incidencia total de cáncer
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ieAlteraciones de moirrologla: C 01 nen una f orma m& iredondeada que las ct ..... rncremenro en ia ucnsidad celular tnerdida uc in iiriiibici6n de C( mtncto de cmrecimientc1 ) : Cilulas transfomat ias por lo gericral forman rnuliicnp as, mientras que las ct lui t e forman una mono(zapa las contrciI. usuaimer . . . . . . ,. La pErdid a de una dependencia de anclaje: as celuias transformadaspueden crecer sin adherirsea Ia superficie del plato de cultivo y, por lo general, crecen en agar La pkrdida de la inhibición de contacto del movimiento: Las cCtulas transformadas creicen una sol>re otra mii:ntraq que 1% ctlulas normales clejan de mtiverse cuarido están en contacto u n a con otrr1s Una variedad de cambios bioq,,,,,,,,, ni, .de incluyen un incrementoen lavelocidad de :lucblisis.~ lteraciones de la superficie celular (por ejeniplo, carnbios en la composicibn d e glucoproteinas o glucoesfinlzolipidos) 2 la secrecihn de ciertas proteasa7 Alteracio,nes de la e:stnictura citoesquelética como las iibras de ai:tina Uisminui:ión dc los requerimiemtos para los factores de .*,. ., *M.&rnl r crecímierilu, Y -*- 1 ,,. ELIIbLal, dna secrecion incrementada de ciertos factores de crecimiento denwo dc su rnetlio 1-3..
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secundarios que resultan de la conversión del estado normal al maligno. La capacidad para equiparar aproximadamente la transformación, con la adquisición de propiedades malignas, ha tenido una importancia tremenda en la investigacirin del c h c e r . No obstante, el hecho de que las células adquieran los cambios conocidos colectivamente como transformacion, no significa de manera obligada que tales cklulas mostrarán las mismas propiedades biológicas que las cdlulas tumorales in vrvo; las células deben producir tumores cuando se inyectan en un huésped animal adecuado.
LOS ONCOGENES DESEMPEÑAH UNA FUNCION CRUCIAL EN CARCINOGENESIS Los oncogenes son genes capaces de causar cáncer. Su descubrimiento ha tenido un gran impacto en la investigación de los mecanismos fundamentales de la carcinogknesis. Originalmente fueron reconocidos como genes únicos de los virus causantes de tumores, que ocasionan el proceso de la transfomacibn (oncogenes virales). 1) Oncogenes del virus del sarcoma de Rous: El
análisis del oncogen del virus del sarcoma de Rous y su producto, es particularmente revelador. El genoma de este retrovirus contiene cuatro genes d'esignado gag, poi, env y src. En f o r m a esquemática pueden mostrarse como sigue:
Et gen gag codifica para los antfgenos específicos de grupo del virus, pol para la transcriptasa inversa que caracteriza a los retrovirus y env para ciertas glucoproteínas de la envoltura viral. Una proteintirosina cinasa mostrb ser el producto desrc (es decir, el gen causante del sarcoma) que causa la transfomacibn. Este hallazgo tiene importancia capital. Revelb un mecanismo bioquimico específico (es decir, la fosforilaci6n anormal de varias proteinas) que podria explicar, por lo menos en parte, la forma en que un virus tumoral puede causar los efectos pleiotr6picos (es decir, diversos) de la transfonnacion. Aun no se han definido las protelnas celulares criticas, cuya fosforilación anormal presuntamente conduce a la transformación. Uno de los candidatos es Ea vinculina, proteina encontrada en las placas de adherencia foca1 (estructuras que intervienen en la adhesibn intercelular). La fosforilación anormal de la vinculina
en las placas de adherencia foca], explicaría la confomacion esférica de las células, la disminución de su adherencia al sustrato y entre una y otra, que se observa durante la transformación (cuadra 62-3). Al parecer, ciertac enzima glwcolíticas son proteínas blanco para la proteintirosina cinasa de src; esto concuerda con la observación de que las cdlulas transformadas a menudo muestran velocidades altas, de glucólisis. El producto de src puede catalizas también la fosforilación del fosfatidilinositoI a monofosfato y difosfato de fosfatidilinositol. Cuando el 4,5-bifosfato de fosfatililinositoI se hidroliza por la accihn de la fosfolipasa C, se liberan dos segundos mensajeros: el trifosfato de inocitol y diaciFglicero1 (capituIo 44 El primer compuesto media la Iiberacion de Ca 'de los sitios intracelulares de almacenamiento (por ejemplo, del retículo endoplhsmico). El diacilglicerol estimula la actividad de la proteína cinasa C unida a la membrana plasmática, la cual a su vez fosforila a cierto número de protelnas; algunas de éstas pueden ser componentes de bombas de iones. Especificamente, se propone que Ea alcalinizacibn leve de la cklula, originada por la activación de un sistema Na'lH' antiportador (capitulo 431, podría estimular la mitosis. Por tanto, el producto de src puede afectar a un gran número de procesos celulares por su propiedad de fosforilar diversas proteinas y enzimas blanco y por estimular la vía de síntesis de los ~olífosfoinositidos. 2) broteintirosina cinasas en las células normales y transformadas: La observacihn de que el virus del sarcoma de Rous contenía una proteintirosina cinasa estimulo una abundante investigación sobre la fosforilación de la tirosina. Ahora se sabe que muchas, si no es que todas, las células normales poseen actividad de proteintirosina cinasa. La cantidad de fosfotirosina en numerosas ctlulas normales es baja, pero de ordinario se eleva en las células transfomadas por un virus oncógeno que contenga una proteintirosina cinasa aunque la cantidad es todavla relativamente pequefía (cerca de 1% de los fosfoaminoiicidos totales [principalmente fosfoserina, fosfotreonima y fosfotirosina] en tales d l u las). Ciwtos receptores (por ejemplo, para el factor e p i d h i c o de crecimiento, la insulina y e[ factor de crecimiento derivado de las plaquetas) encontrados en células normales y en cétrilas transformadas, tienen actividad de proteintirocina cinasa, que se estimula en la interacción con sus ligandos (vkase adelante, factores de crecimiento). Por tanto, la enzima es importante en las células normales y en las mnsfomadas. 3) Oncogenes de otros retrovirus: Además de los oncogenes del virus del sarcoma de Rous, se han reconocido aproximadamente 20 oncogenes de otros retrovirus. Más o menos la mitad de los
2-
Cdncer, oncogenes y fac f ores de crecimiento 893
También se observa que las secuencias celulares se conservan en una extensa gama de cdlulas eu-
productos de estos oncogenes visales son proteínas cinasas, en su mayor parte de! tipo de tirosina. En el cuadro 6 2 4 se enumeran algunos de los oncogenes virales conmidos, junto con sus productos. En tanto que parte de los enumerados codifican para proteína cinasa los restantes lo hacen para om proteínas con actividad biologica de inteks. El producto del gen erb-B de la eritroblastosis aviar, es una forma m n c a del receptor para el factor epidémico de crecimiento y el del oncogen sis del virus del sarcoma del simio, es una cadena B trunca del factor de crecimiento derivado de las plaquetas. El producto del oncogen 0de un tipo de aislado vira1 del sarcoma del felino, es un factor estimulador decol* nias de rnacrófagm. Por otra parte, el producto del oncogen myc, descubierto originalmente en los virus del mielocitomade los poilos, es una proteina fijadora de DNA que puede afectar al control de la mitosis. El producto del oncogen ras de los virus del sarcornamurino se une al GTP,tiene actividad de GTPasa y, al parecer, se relaciona con l a proteinas que regulan la actividad de la adenilil ciclasa, enzima importante de la membrana plasmatica (capítulo 44). 4) Pretooncogenes: Un tema de interes, que surgid por el descubrimiento de los oncogenes vírales, se relaciona con su origen. El uso de la hibridacihn de hcidos nucleicos (capitulo 42) revela que las cklulas normales contienen secuencias semejantes de DNA, si no es que idénticas, a las de los oncogenes virates. Así, en apariencia, los virus incorporan genes celulares en sus genomas durante su paso a través de las cklulas. La retencibn de esos genes en sus genomas indica que deben conferirle una ventaja selectiva sobre los virus afectados, relacionada probablemente con la alteracibn de las propiedades de crecimiento de las d l u l a s transfoGadas.
..
Cuadro 62-4. Algunos oncogenes de los retrovirus*
_ Retroviru!
'irus Abelsc
, _ Orige roducto del
'irus del sal
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$1
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I
:emia muriila Rntdn
irus de la t sis aviar irus del sarcoma felino irus del sarcoma murino
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cariotas lo cual sugiere que constituyen componentes importantes de las c6lulas normales. Ademhs, Irtc especies de RNA y las proteínas derivadas de estas secuencias normales, pueden detectarse en variasetapas de su desarrollo o de su ciclo vital. Por tanto, los genes presentes en las células normales fueron denominados protmncagcnes y se considera que sus productos efecnían actividad importante en la diferenciacibn normal y en otros procesos celulares. 5) Oncogenes de células tu morales: Los experimentos que utilizan DNA extraido de tumores tambien proporcionan pruebas de ta existencia de oncogenes. El m&todousado para la identificacidn de esos oncogenes celulares se llama transferencia ghnica o transferencia de DNA Depende del hecho de que ciertos genes presentes en tumores pueden causar la transformaci6n de cilu tas "normales" cultivadas, El DNA se aisla de cklulas tumorales y se agrega a las ctlulas receptoras, a menudo una línea de fibroblastos de ratón conccida como células NlH13T3. El DNA extraído de !as c&lulastumoraIes se precipita con fosfato de calcio (para facilitar la endocitosis) y se agrega a las celufas NIH/3T3 en el cultivo de tejido. Las céluias se observan al microscopio por un periodo de 1 a 2 semanas en espera de la forrnacibn de focos de cklulas transformadas. Si la transformación se produjo, l a c&lulasNM/3T3 cambian su morfología de una forma aplanada a esfbrica y proliferan en focos característicos. El procedimiento se repite varias veces utilizando DNA de las células transformadas para reducir la cantidad de DNA que se transfiere y no interviene en la transfomación y facilita su identificación (por ejemplo, por la técnica de la
irus 29 del irus del sarcoma del simio irus del sarcoma de Rous
Pollo
1
Pollo
Pollo . Mono
r. .. - 2-.
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A
A
..
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oncogen
na tirosina
tor trunco ,para el EG
ibrana nlas ibrana plurnhtica
cornplejos con jun Factor de transcr e,jos confo 'S na fijadora del DNA ' trunco (ca dena B) na tirosina cinasa m
ractor ae c~rcimientoepidkrmico; PDGF, factor ae crecirnienio oenvaao ae piaquetac.
* Modificadoy reproducido con autorizacicín de Franks LM,Teich NM (~ditors).Jntri Cancet. Oxford Univ Press, 1986.
su bcelular
'he Cellular
-
mancha de Southern, con una sonda adecuada [capituko 421) del gen especifico implicado. Por este rn&todose han reconocido m8s o menos 20 oncogenes celulares diferentes y varios de ellos están relacionados con el oncogen ras del virus del sarcoma murino. Los oncogenes celulares son iddnticos a los genes normales o muestran variaciones estructurales muy pequefias en relaci6n a sus contrapartes normales (vdase adelante). En el primer caso, la regulación de su expresión, puede ser normal en las células cancerosas. 6) Abreviaturas de los oncogenes celulares y virates: La abreviatura c-om (oncogen celular, por ejemplo, c-ras) se utiliza para designar a un oncogen presente en cklulas tumorales. La especie que existe en las células normales, es decir su protooncogen, puede referirse de manera conveniente como el protooncogen c-onc correspondiente (pos ejemplo, el protooncogen c-ras). De igual modo, un oncogen viral se designa v-nc (oncogen viral, por ejemplo v-ras) y su protooncogen será, protooncogen v-om (en el ejemplo, et protooncogen v-rm}*. Los protooncogenes se activan a oncogenes por diversos mecanismos Aquf se describen cinco de los mecanismos que alteran la expresión o la estructura de los protoncogenes y participan en su conversibn a oncogenes. Por conveniencia, el proceso en el que la transcripcion de un gen se incrementa (de cero a un valor relativamente bajo) se desiganara como activaciún. Es importante familiarizarse con los mecanismo implicados en la activacibn para comprender el pensamiento contemporáneo acerca de la carcinogénesis. 1) Insercidn del promotor: Ciertos retrovims carecen de oncogenes (por ejemplo, el virus de la leucemia aviar) pero pueden causar cáncer después de un periodo mas largo, meses en lugar de dlas, que el
empleado por aquellos que si contienen oncogenes. Al igual que los demás retrovims, cuando estos virus particuIares infectan a las dlulas, su transcriptasa inversa dirige ta sintesis de una copia de DNA (cDNA) a partir de su genoma de RNA y el cDNA se integra en el genoma del hospedero.El cDNA de doble tira integrado se designa como un provirus. Las copias de cDNA están flanqueadas en ambos extremos por secuencias llamadas repeticiones terminales largas, semejantes a ciertos transposones ("genes saltadores") encontrados en bacterias y en vegetales (capítulo 38). Las secuencias repetidas terminales largas al parecer tienen
*
Donde ras = a un gen existente en ciertos virus, y que
origina sarcomas en ratas.
una funci6n imaortante en el mecanismo de intep c i 6 n del provi& y pueden actuar como promotores de la transcripción (capitulo 39). Por ejemplo, desp d s de Ia infección de los linfocitos B de pollo por ciertos virus de la leucemia,aviar, sus provirus se integran cerca del gen myc. Este se activa corriente arriba por una repeticidn terminal larga viral adyacente, que actúa como promotor y conduce a la mscripcion del mRNA myc correspondiente y a la trasducción a su producto en esas cklulas (figura 62-3). Se desarrolla un tumor de células E, aunque no se conoce la función precisa de los productos del gen myc en et proceso global. Fenb menos semejantes ocurren después de la infección de diversas c&lulascon otros retrovims. 2) Inserción de un amplificador: En algunos casos el provirus se insertacorriente abajo del gen myc o arriba de B pero orientado en direccián contraria; de una u otra manera, el gen myc se hace activo (figura 62-4). La activación no puede deberse a la insercibn de un promotor, dado que la secuencia de este debe quedar corriente arriba del gen cuya transcripcibn va a incrementar y ademh, la secuencia necesita estar en la direccion correcta 5' a 3'. Por consiguiente, se infiere que las secuencias repetidas terminales largas de los retrovims implicados están actuando como secuencias amplificadoras (capitulas 39 y 4 1). Los dos mecanismos anteriores, insercion del promotor y de un amplificador, operan comúnmente en la carcinogt5nesis viral. Ellos pueden clasificarse como ejemplos de mutag&nesisde insercibn. Es probable que también otros protooncogenes ademss de myc e s t h implicados. 3) Transtomcionescromosdrnirias: Como se describe al principio, muchas células tumorales muestran anormalidades cromosómicas. Un tipo de cambio cromosbmico observado en las cklnlas cancerosas es la translocacibn. La base de una translocación es que una fracción de un cromosoma se desprende y a continuación se une a otro cromosoma. si a su vez el segundo cromosorna cede material al primero se dice que la translocación es 'hcíproca". Se han encontrado translmaciones características en diversas dlulas tumoralec. Una importante es la del cmmosoma Filadelfia,en laque intervienen los cromosornas 9 y 22 y se presentan en la leucemia granulocitica cr6nica. El linfoma de Rurkitt es un cáncer de rápido desarrollo de los linfocitoc B humanos. En ciertos casos se encuentra un ejemplo de translocacion reciproca (figura62-5) que esclarece los mecanismos de activacibn de oncogenes celulares potenciales. Intervienen los cromosomas 8 y 14. El segmento del crornosoma S que se desprende y se mueve hacia el cromosoma 14 contiene el gen myc. Como se muestra en la figura 6 2 4 , la transposicibn coloca al gen myc previamente inactivo, bajo la
Cáncer, oncogenes y.faclores de crecimiento 895
Figura 62-3. Esquema de la foma en que la incercibn de un promotor puede activar a un protooncogen. A: Cromosoma normal de pollo, mostrando un gen myc inactivo. B: El virus de la leucemia aviar se ha integrado en el cromosoma en su foma proviral, adyacente al gen myc. Su repeticrdnterminal larga (RTL) a la derecha, que contiene un promotor potente, se encuentra en posicibn corriente arriba del gen rnyc y lo activa, haciendo que se iniue la transcripcibn del mRNA myc. Para simplificar, $&lose ha dibujado una tira de DNA y se han omnido otros detalles.
influencia de las secuencias amplificadoras en los genes que codifican para las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas. Esta yuxtaposicibn activa la mccripcibn del gen myc. En apariencia, la sintesis de cantidades abundantes de la proteina fijadora del DNA codificada por el gen myc, actúa como "conductora" o "forzadora" de la conversión de la células a maligna, quizl por una modificación en la regulacibn de la mitosis. Este mecanismo es análogo a la inserción de un amptificador, excepto que la translocaciljn cromosrimica (y no la integracidn de un provims) es causa de la colocaci6n del protooncogen (es decir, myc) bajo la influencia de un amplificador. 4) Amplificación génica: En cierto número de nimores se observa un efecto de arnplificacibn de ciertos genes (capítulo 41). Un método para conseguir esto en tos tumores, es por administración del medicamento anticanceroso rnetotrexato, inhibi-
dor de la enzima dihidrofolato reductasa. Las cklulas tumorales pueden volverse resistentes a este fármaco. La base del fenomeno es que el gen para la dihidrofolato reductasa experimenta una amplifícacibn que conduce aun incremento de la actividad de la enzima (hasta 400 veces). Los genes amplificados, que miden hasta 1000 kb de longitud o más, pueden detectarse como regiones teiiidas homogéneamente en un cromosoma especifico. De manera alterna, son detecbdos como cromosomas diminutos dobles, que son minicromosomas que carecen de centrómeros. La relaci6n precisa de lrts regiones refiidas de manera homogénea con los cromosomas diminutos dobles está en investigacibn. Ciertos oncogenes celulares pueden ampl ificarse tambidn de la misma forma y por tanto quedan activados. Existen datos que sugieren que el incremento en cantidad de los productos de ciertos oncogenes (como c q m ) causado por la amplifica-
V e-rnyc
v
mRNA
v Flgura 6 2 4 . Esquema que muestra la forma en que la insercibn de un amplificador puede activar a un protoonwgen. A: Cromosoma normal de pollo, mostrando un gen mycinaciivo. B: Un virusde la leucemia aviar se ha integrado en el cromosoma en su forma proviral, adyacente al gen myc. Sin embargo, en este caso el sitro de integraubn es justo corriente abajo del gen rnyc que no puede actuar como promotor (figura 626).En su lugar, parte de la secuencia del provirus actúa como elemento arnplficador, causando la activacibn del gen myc que estA corriente arriba y su transcripcibn. Para simplificar, sblo se ha dibujado una tira del DNR y se han omitida otros detalles.
896 Oioquimica de Harper
(Cupítulo 62)
... . .-. .'
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.. .. G~~~~ de la .. ,+cadena H ... .C. Rotura t myc ..
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cibn de genes puede tomar parte en el avance de las células tumoralec a un estado de mayor malignidad (vkase adelante, progreso de tumores). S) Mutación en un punto: El oncagen v-ras se identificó originalmente en ciertos retrovirus murinos (es decir, de rata y de ratón). Su producto, una proteina (p21) con masa molecular de 21 kDa, parece relacionarse con las proteinas G que modulan la actividad de la adenilil ciclasa (vkase antes, y capitulo 44) y por tanto, actija de manera clave en las respuestas celulares a numerosas hormonas y medicamentos. Los análisis mediante secuenciacibn del protooncogen C-ras de células normales humanas y del oncogen c-rm de un cAncer humano de vejiga, muestran que difieren únicamente en una base, lo cual conduce a la sustitucion de un arninoacido en la duodkcima posicibn de p21. Este fascinante resultado se confirma por anhlisis de genes c+us de otros tumores humanos. En cada
Genes de la cadena H
Figura 62-5. Esquema de la translo~ción reciproca implicada en el linfoma de Burkitt. Los cromocomas involucrados son el 8 y el 14. Un segmento del extremo del brazo q del cromosoma 8 se desprende y se desplaza hacia el cromosoma 14. E¡ proceso inverso lleva a un ~eauefiofraamento del brazo q del uomosoma 74 al 8 . ki gen myc esta contenido en el pequefio segmento del cromosoma 8 que ha sido transferido al crcmosorna 14, por tanto, queda colocado prbximo a los genes que transcriben las cadenas pesadas de las mo&culas de inmunoglobulinas y él misma se torna activado
caso los resultados heron consistentes; el gen aislado del tumor, mostró mutacibn s61o en un punto, comparado con el protoancogen c-ra.7 de [as células normales. La posición de la mutación varía algo. de modo que se observaron sustituciones de otros aminoacidoc. Al parecer, estas mutaciones en p2 1 afectan su conformación y disminuyen su actividad como GTPasa. La menor actividad de la GTPasa causara estimulacibn crónica de la actividad de ta adenilil ciclasa que normalmente es baja cuando el GDP se forma a partir del GTP (capitulo 44). Esta estimulacibn continua de la actividad de la adenilil ciclasa causa diversos efectos sobre el metabolismo celular, ejercidos por el incremento en la cantidad de cAMP que afecta las acciones de varias proteinas cinasas dependientes del cAMP. Estos fenhmenos pueden inclinar el equilibrio del metabolismo celular hacia un estado que favorezca la transformación o la conserve.
Genes de la cadena H myc
Flgura 6 2 4 . Esquema que muestra la forma en que la translocacidn que interviene en el linfoma de Burktt puede activar al protooncogen myc. A: Segmento pequeho del uomosoma f 4 antes de la translo~acibn.Este segmento contiene los genes que cifran para las regiones de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas. B: DespuQs de la traslocacibn, el gen myc previamente inactivo, se coloca bajo la influencia de las secuencias amplificadoras en los genes que codifican las cadenas pesadas y por tanto se activa, verificándose la transcripcidn. Para simplificar, sblo se ha dibujado una de las tiras del DNA y se han omittdo otros detalles,
C&cer, oncogenes yJacfores de crecimiento
Comentarios generales sobre la activación de los oncogenes De los cinco mecanismos descritos antes, los cuatro primeros (insercihn del promotor, insercibn de un amplificador, translocaci6n cromos6mica y amplificacibn génica) comprenden un incremento en la cantidad del producto de un oncogen por una transcripción mayor; pero no hay alteracidn en la estructura de su producto. Por tanto, es posible que la presencia de una cantidad mayor del producto de un oncogen sea suficiente para inducir a una cdlula hacia lamalignidad. El quinto mecanismo, mutacion de un solo punto, implica un cambio en la estructura del producto del oncogen, pero no en forma obligada, un cambio en su cantidad. Estos datos sugieren que la presencia de una psoteina reguladora clave, estructuralmente anormal, en una célula puede ser también suficiente para inclinar la balanza hacia el cfincer. Cuando se considera el papel de los oncogenes en el cáncer, es importante considerar que la activ a c i ~ nde oncogenes no es la iinica vía de malignidad. Es probable que su activación, por lo menos en algunos casos, sea s61o un efecto secundario relacionado con la transformaci6n, rnhs que un fen6meno causal. Los cambios epigenéticos también pueden estar involucrados en ciertas instancias ya que algunos quimicos que aparentemente no alteran al DNA, ahora se sabe que son carcin0genos. Sin embargo, los estudios recientes muestran que la activacibn de c-ras en cánceres mamarios de rata, inducidos por nitrosometilurea, se debe aparentemente a un tipo de mutacibn de transición G -,A especifica, lo cual demuestra que e5 probable la intervención de los oncogenes en la carcinogénesis química. Ademas, dado que s61o se administrh una dosis de nitrosometilurea (sin promotor), la mutaci6n anterior puede ser un suceso importante en la etapa inicial de la carcinogknesis química. Se requiere mhs investigacion para examinar la posible intervención de los oncogenes en los fenbmenos de iniciacibn, prornocibn, progreso del tumor y metástasis.
Mecanismos de acción de las oncogenes Hay tres mecanismos cuando menos por los que los productos de los oncogenes pueden estimular la proliferación (figura 62-71. Pueden actuar sobre vias intracelulares clave implicadas en el control de crecimiento, desacoptándolas de la necesidad de un estimulo exbgeno. Ejemplo relevantes (descritos antes) son: el producto de src que actúa como una proteina tirosina cinasa, el producto de rus que estimula la actividad de la adenilil ciclasa y el producto de myc que actúa como una proteína
897
fijadora de DNA. Cada uno de ellos podría afectar el control de la mitosis; los dos primeros por fenhrnenos en los que interviene la fosforilación de proteínas reguladoras. Una falla importante en el conocimiento de la proliferaci6n celular es lo muy poco que se sabe acerca de los aspectos moleculares de la reguiacidn de la mitosis, inclusive en cdlulas normales. En esta situacidn, los adelantos en el conocimiento de los genes de ciclina y cdc (ciclo de divisibn celular) están cambiando con rapidez (capitulo 38). Un área importante de investigación en la actualidad es el anhlísis de interacciones entre los productos de ciertos oncogenes (y de gcncs supresores de tumor) con ciclina y proteínas relacionadas. Los productos de los oncogenes (por ejemplo, el oncogen sis) pueden imitar la acci6n de un factor polipeptldico de crecimiento o imitar a un receptor ocupado por un factor de crecimiento (por ejemplo el oncogen erB-B) (véase adelante). En la actualidad se estfin definiendo otros mecanismos utilizados por oncogenes para estimular la prolifetacibn.
LOS FACTORES POLIPEPT~DICOS DEL CRECIMIENTO SON M~TOGENOS El estudio de los factores de crecimiento adquiere cada día mayor interks. Se han aislado y caracterizado parcialmente varios de ellos (cuadro 62-5). Hasta hace poco, sólo se disponía de cantidades muy pequeiías de la mayor parte de !os factores de crecimiento para su estudio. Sin embargo, en la actualidad se han clonado los genes de cierto número de factores, confirmando sus identidades separadas y haciendo posible disponer de cantidades adecuadas por medio de la tecnología del DNA recombinante. Loc factores de crecimiento conocidos hasta la fecha actúan sobre muchos tipos diferentes de célulac; por ejemplo, las cklulas sanguíneas, las del sistema nervioso, de los tejidos mesenquimatoco y epitelial. Causan una respuesta mítbgena en sus células blanco; aunque es posible que se requieran condiciones especiales para demostrarlo, como células privadas de alimento en cultivos de suero, de modo que pasen a un estado de reposo antes de ser expuestas a un factor de crecimiento. E[ factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDC F), liberado de los gránulos alfa de las plaquetas, parece intervenir en la cicatrimcibn normal de la herida. Es probable que sean varios los factores de crecimiento los implicados en la regdacibn de Ea diferenciacion de las celulas precursoras para formar las diversas clases de células hematopoyéticas maduras. Tambidn existen factores inhibidorec de crecimiento (por ejemplo, el factor transformador de crecimiento [TGFbeta] puede ejercer efectos blo-
898 0 Bioauim ica de Haraer
(Capítulo 62)
Clquido extracelular Factor de crecimiento IPDGF)
er&B Rtnirica de EGF 1
\ I Seaal I rnitbgena
l
Membrana piasmAibca Vanos
objetivos
CICLO DEL
ras
src
+ L a A
/
',
Araquidonato
I
Varios
1
Ob~etivOS
Prostaglandinas,
I
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C
I ~uchos -
ca2+
efectos
Nueiea
Proteínas fijadoras de DNA
Figura 62-7. Esquema de los mecantsmos por los cuales los productos de ciertos oncogenes pueden alterar el metabolismo celular y así estimular la proliferación.Se muestran los productosde los cinco oncogenes siguientes: sis (que codifica la cadena B de PDGF), erb-B (que codifica una forma truncada del receptor para EGF), ras (que codifica una proteína tipo G), src (que codifica una proteina tirosrna cinasa) y rnyc (que codifica una proteina fijadora de DNA). El producto de sis estimula el ciclo PI, el producto de erb-B estimula la mitosis, el producto de ras estimula a la adenilil ciclasa, el producto de src fosforila varias proteínas blanco en residuos de tirosina y myc altera la expresión ghnica. El AMP cicliw puede afectar cierto número de procesos celulares por activacibn de proteinas cinasas dependientes de GMP. La proteína unasa C modifica las actividades de varias proteínas blanco. El caz+tiene numerosos efectos, igual que las prostaglandinas y leucotrienoc sintetizados a partir de araquidonato. (PDGF, factor de crecimiento derivado de plaquetas; R, receptor, EGF, factor de crecimiento epid6mtui, E, proteina G; AC, adenilil diclasa, cAMP, monofosfato de adenosina ciciico; PI, fosfatidilinositol, PKC, proteina cinasa C, PTK, proteina tirosina cinasa; IPs, trifosfato de inositol, QGA, diacrlglicerol, RE, retículo endoplásmica )
Cáncer, nncogene.7 y factores
Cuadro 62-5. Algunos fac
o polipeptidicos*
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rcproauciao con autori7acion ac rranks 1.M, 1
~ductioionto the Cellular and Molecurar Lliotom
of
Concer Oxford Univ Press, 1986.
queadores de la proliferación de ciertas células). Por tanto, la exposicibn cronica a cantidades elevadas de un factor de crecimiento o a cantidades pequefias de un factor inhibidor del mismo podrían alterar el equilibrio de la proliferación celular.
Los factores del crecimiento actúan pos medio de procesos endocrinos, paracrinos y autocrinos
(capjtulo 44) Los factores de crecimiento pueden operar en tres formas generales: Sus efectos pueden ser endocrinos; es decir, como las hormonas, pueden sintetime en cualquier parte del cuerpo y pasar a la circulacibn para alcanzar a sus cdlulas blanco. Pueden ser paracrinos, es decir, sintetizados en ciertas cdlulas y secretados para afectar células vecinas, aunque las cklulas sintetizadoras no se afectan porque carecen de los receptores adecuados. Algunos factores de crecimiento pueden afectar a las celulas que los sintetizan en un modo de accibn que se conoce como autocrino. Por ejemplo, un factor puede secretarse y a continuación se adhiere a su dlula de origen, siempre que dicha dlula posea los receptores correctos. Como alternativa, si cierta cantidad del factor no se secreta, su presencia dentro de las cklulas puede estimular directamente varios procesos.
Los factores del crecimiento actúan sobre la mitosis por transducción de la señal transmembrana Se sabe relativamente poco acerca de la forma en que operan los factores de crecimiento a nivel molecular. A l igual que las hormonas polipeptídicas (capitulo 441, deben transmitir un mensaje a través de la mernbrana plasmhtica al interior de [a ctlula (transducci6n transmembrana de la seiiat). En el caso de los factores de crecimiento, el mensaje afecta en ultima instancia a uno o miic procesos de la mitosis. La mayor parte de los factores tienen receptores proteinicos de elevada afinidad en la membrana plasrnatica de las cClulas blanco. Los genes para los receptores de muchos factores de crecimiento esthn clonados y se tienen construidos modelos de [as estructuras de los receptores. Éstos tienen segmentos cortos extendidos en la membrana y dominios exteriores y citoplásmicos de longitudes variables. Los ligandos se unen a los dominios exteriores. Se encuentra que algunos receptoses (por ejemplo, para el EGF, la insulina y el PDGF)muestran actividad de proteína tirosina cinasa, reminiscencia del producto del gen v-rsc (véase antes). Esta actividad de cinasa, localizada en los dominios citoptasmfiticos, causa autofosforilaciOn de la proteína receptora y también fosforila a otras proteínas blanco. Los complejos de receptor y ligando esthn
sujetos a endocitosis en vesiculas revestidas (viase receptor de LDL, capitulo 27); aUn no se define si los receptores recirculan a la superficie celular, Esthn en estudio los sucesos precisos que resultan de la señalizacibn transmembrana y difíeren entre los diversos factores. El caso de PDGF se describe como ejemplo. Despuds de la exposición de las células al PDGF, Fa fosfolipasa C se estimula y causa la hidrólisis de 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol para formar trifosfato de inositol y diacilglicerol (vbase antes, v-src y figura 444). Estos dos segundos mensajeros pueden afectuar la liberación intracelular de Ca" y estimular la actividad de la proteina cinasa C, respectivamente y afectar asi a un gran número de reacciones celulares. La hidrólisis subsiguiente del diacilglicerol por la fosfolipasa AI, que libera acido araquidónico, puede conducir tambien a la producción de prostaglandinas y leucotrienos, que por si mismos pueden ejercer numerosas actividades bioldgicas (capitulo 25). La exposición de las células al PDGF puede activar con rapidez (minutos a 1 a 2 horas) a ciertos protooncogenes (por ejernpto, myc y fos). Parece probable que la activaci6n de los genes, sea de protooncogenes o de genes normales, está implicada en la accibn de muchos de los factores de crecimiento.
Factores del crecimiento y oncogenes interactúan de diversas maneras Los productos de varios oncogenes son factores de crecimiento o porciones de los receptores para tos factores de crecimiento (cuadro 6 2 4 ) . La cadena B del PDGF contiene 109 aminohcidos. Es probable que sea biolbgicarnente activa como un hornodimero, sin que intervenga la cadena A. El descubrimiento de que el gen v s i s codifica para 100 de los 109 aminoácidos de la cadena R del PDGF revela una relacibn directa entre los oncogenes y los factores de crecimiento. Tambitn sugiere que la estimulacibn autocrina por PDGF, en sustitución a un estimulo rnitbgeno crónico, podría ser un factor importante en el mecanismo de transformación de las c6lulas por v-sis. De hecho, se sabe que muchas cdlulas tumorales cu ttivadas secretan factores de crecimiento en sus medios circundantes y que tarnbikn poseen receptores para estas moldcuIas. El anhlisis de la secuencia de v-erb-B indica que codifica para una forma trunca del receptor para el EGF, en la que se desprende gran parte del dominio exterior del receptor, pero retiene su actividad de proteína tirosina cinasa. Se consideraque la forma anormal del receptor para EGF codificada por v-erb-B puede ser activa de manera continua cuando está presente en las células, simulando un receptor mupado. Como en el caso de la estimulacibn autocrina del PDGF, esto
produciría una seiíal rnitógena crónica, que "conduce" a las celulas hacia el estado transformado. Originalmente se consideró que el factor transformador de crecimiento (TGFbeta) era un factor de crecimiento positivo, puesto que hacia que los fibroblastos se comportaran como si estuvieran transformados. En la actualidad se sabe que el TGFbeta inhibe la proEiferaci~nde muchos tipos de cklulas, excepto los fibroblastos. Inhibe la pro1jferacibn de las células renales de mono que los sintetizan. El TGFbeta puede activar al gen sis de los fibroblastos lo que quixi explique su efecto estimulante del crecimiento en estas. No se ha establecido la forma m que produce sus efectos inhibidores sobre otras celulas (vkase desputs genes de reparación de pareados erroneoc). Hay otros datos de que ciertos genes implicados en las neoplasias codifican para productos que hacen lenta la proliferacion celular y en consecuencia se denominan genes supresores de los tumores. Por tanto, el control del crecimiento celular es muy complejo y están implicados factores reguladores positivos y negativos.
RBI, UN GEN SUPRESOR DE TUMORES ESTA IMVOLUCRADO EN LA GÉNESIS DE RETINOBLASTOMA En epoca reciente, se han reconocido genes diferentes a los oncogenes que intervienen de manera importante en el desarrollo de algunos tipos de cánceres. Éstos son los genes supresores de tumor, llamados en ocasiones oncogenes recesivos o antioncogenes. Operan de forma muy distinta a oncogenes (cuadro 62-61 en el hecho que su inactivación (opuesto a la activación) anula ciertos mecanismos de control de la proliferación. Para comprender la funci6n de estos genes se dispone de un modelo importante que es un tumor conocido como retinoblastoma. Éste es un tumor maligno de los btastos de la retina que son células preculsom de los fotorreceptores de la retina. En 1971, Knudson sugirih quer el desarrollo de los retinoblastomas dependía de dos mutaciones. PostulG que en casos hereditarios de retinoblastoma, la primera mutación se encontraba en la línea germina1y la segundaocurria en los retinoblastos. En los casos esporádicos (no hereditarios), se considerb que en los retinoblastos ocurrían ambas mutaciones. Estas ideas se han verificado por estudios subsiguientes. El gen que interviene en la formación de retinoblastomas (RBJ) se ha aislado y secuenciado y su producto proteinico (pRB) también se ha caracterizado en forma parcial (cuadro 62-71, Los anhlisis mediante RFLP y mancha Southem revelan que los especimenes de control apropiados de los individuos con retinoblastomas hereditarios son homocigotos en la región del gen RBI (que refleja un
Cáncer, oncogenesy factores de crecimiento 901
alelo normal y otro anormal), en tanto que todos los especímenes de tumor examinados son homocigotos en esta regibn. Este fenbmeno se denomina pérdida de heterocigocidad y refleja el hecho de que el tumor tiene ambos alelos rnutados y se encuentra con frecuencia al examinar los genes supresores de tumor. La pRB es una proteína nuclear cuyo estado de fosforilacibn es al parecer importante respecto de su función. Durante Go o G I la proteína se hipofosforila, en tanto que la fosforilación aumenta en las fases G i tardía y las S temprana, para regresar a un nivel bajo de fosforilación en Go a GI. La variante hipofosforilada de pRB forma complejos con ciertas protehas vírales, como el antigeno T largo SV40; Ia pRB es inactiva en tales complejos, con abolición de sus efectos reguladores negativos sobre la división celular, lo que ayuda a explicar el aumento de la multipticación que se observaen las cklulas transformadas por tales virus. En los casos que no existe participacibn de virus oncogknicos parece Funcionar mediante el enlace a un conjunto de proteínas durante GdGl,algunas de las cuales son factores de tsanccripcibn activos en Ea fase S del ciclo y, por tanto, hacen mhs lento el ciclo celular. Los principales tumores en los cuales la inactivación de pRB es un factor importante incluyen los cánceres pulmonares de cklulas pequefias, adenocarcinomas prostAticos, y tumores originados de la retina, hueso y tejidos conjuntivos.
4.Algunlas diferericias intri t genes su presores ..
-
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El gen se local iza en el cromosi3ma 13q14 Los retino blastomas Itienen mut;xiones id6 .,.,.. > . , mis i i i e i u ~(perdida de ncrcroci?kocidad) El prcducto proteinico (pRR) dc rnasn molw:dar 1 10 kDa se zyiresa en numerosas ctliila5 pRB es una fosfoproteína nuck:ar cuya fo!iforilacihn es rcguladn en forma regurosa durante c1 cicl o celular pRB fija ciertas protehas virales (por cjcrriplo, aniigeino T .gmndc de SV40), formando ccmplejos inactivos ti1 pKt3 puede rcgular la proliferación celular mediante enlace ncic :S de transciipci6n celular (por eje1nplo, E2F) rlue están a(:tivos cn la fase S, por lo que haci:n más lcnto el ciclo cel ular L..
*
A
.
EL GEN SUPRESOR DE TUMOR p53 ACTÚA COMO GVARDIÁM DEL GENOMA Otro gen supresor de tumor en extremo importante es el p53, que codifica una proteina (denominada p53) de masa molecular de 53 kDa. En el cuadro 62-8 se resumen algunas de las principales características de este gen y su producto. El producto proteínico, al igual que pRB, es de localizacion nuclear, sujeto a fosforilación-desfosforilacibn y enlaza ciertas proteinas virales. Al parecer p53 tiene al menos tres efectos principales: 1) Actúa como activador de transcripcion para regular ciertos genes implicados en la division celular. 2) Actua como un punto de verificacibn para el control del daño a! DNA durante Gi. Si acontece un exceso de dafio al DNA, por ejemplo, despues de radiacibn uttravioleta, aumenta la actividad de p53 lo que produce inhibicibn de la divisibn celular y concede tiempo para la reparación. Si la divisibn celular prosigue sin la verificación, el daiío al DNA puede replicarse e introducir mutaciones perrnanentes en el genoma. Por otra parte, si p53 se inactiva,
l segundo
1
. .
"Ganancia en la func:i6nM Ptrdlida de la fuincién de una d e u n a proteina q u e ! p:rotcína
sefíala división celullar
1
Ln mutacionI surge en t8 somático,, no heredit
1
mutacibn aparece t SluIa gerniind (puet :r heredada) o en cklu t irnhticas
Preterencia por algun tiejido Pie*krencia ti sular tuer ior cjemplin, efecto d :n RBI en la retina)
*
Adaptado de Levine Al: r ne. ~ r J* .nimorsupressoi J r gene. (Edit rial). N Engl J Medical 1992;326:1350. T,
Cuadro 6 2 4 . ~ l g u m propiedades s del gen p53 y de su producto proteínico --. ..... -.-- - .- .
O CO rto del
-
cro:mosoma 1: ? El producto (p53) es una Eosfoprciteina nuclear de 53 kEla m El p53 ?e une a secuencias espei:ificas en eil dsDNA .-,- . uizEl p53 acrlia como regulador dr;- U U I I ~ L :I V L I U J ,~ >G . sume que mediante la 1 de los pcncs quc pairticipan en la división celular El p53 enlwa varias iroteinas viiralcs (por i 1.. tígeno T grande de SV4u) para tomar compicjos otigo-
-
&U-----
*>
miricos innctivcis
902
(Capitulo 62)
Bioquímica de Hurper
como en muchos tumores (véase adelante}, puede no completar su funcidn, el daRu al DNA se acumula en la cdlula y esta se vuelve más inestable desde el punto de vista genhtico. Por tanto, se propone que p53 actua como "guardián del genoma" o como "policía molecular". 3) Una tercera función de p53, que m e considerable atención experimental, es que participa en el inicio de la apoptosis (del griego "caer de"). En la mayor parte de los tejidos adultos la hemeostasia es un equilibrio entre el crecimiento y la muerte celular. La apoptosis puede definirse como la muerte celular programada, controlada por eventos regurados por genes especficos, que se presenta en muchos casos fisiológicos (por ejemplo, crecimiento embrionario y remodelado tisular} y patol6gicos (por ejemplo, deprivaciiin hornonal y q u i d la muerte celular que se observa en las enfermedades de Alzheirner, de Huntington y de Paskinson [capítulo 641). Las células en acortamiento por apoptosis condensan su cromatina, fragmentan su DNA y su membrana muestra arnpollamiento. Un evento clave en la apoptmis es la activacibn de una endonucleasa dependiente de Calt-Mg2' que escinde el DNA internuc~eosómico.Están identificados diversos genes que participan en la apoptosis; algunos son oncogenes come myc (estimulante) y bcl-2 (inhibidor). Otro gen que participa en la apoptosis de ciertas c&lulas, como las de origen linfocítico, es A P O I (o Fm) que c d i f i m un receptor para un ligando que parece ser miembro de la familia del factor de necrosis tumoral de los factores del crecimiento. La interaccidn del Iígmdo con el receptor desencadena la apoptosis en celulas susceptibles. En el nematodo Caenorhubditis eleguns un gen clave pro-apoptosis es el ced-3 codificante de una cisteína proteasa putativa, relacionada con la enzima convertidora de interleucina- 1 -beta (ICE) de los mamíferos. Cuando se suprime el ced-3 en C. eleguns se evita la apoptosis de las células bIanco. Las hidrolasas (por ejemplo, nucleasac, proteasas) desempefian funciones clave en la apoptosis sin importar su localizacion, ya que producen degradación de biomoleculas vitales. Se encuentra en examen c6mo participa p53 en la apoptosis. Por ejemplo, puede activar genes clave implicados en [a apoptosis, reprimir genes necesarios para que la célula sobreviva o ser un integrante de la series bioquimicas de eventos que dan lugar a la apoptosis. El propósito de esta funci6n de p53 es acelerar la muerte de cClulas peligrosas, por ejemplo, dailadas por radiación ultravioleta, que pueden convertirse en malignas. En esta funci6n a p53 se le denomina como "guardián de los tejidos". Desde otro punto de vista, si la apoptosis pudiera desencadenarse en las células tumorales (por ejemplo, mediante la introducción de un gen p53 funcional s61o en ellas), esto tendria grandes posibilidaddes zerapéuticas.
En numerosos tumores humanos
ocurren con frecuencia mutaciones en el gen p53 Debido a los numerosos estudios de los Últimos aRos, se conoce mis acerca de la ocurrencia de mutaciones en este gen en cbnceres humanas que acerca de mutaciones en cualquier otro gen. Algunos de los hallazgos principales se resumen en el cuadro 62-9. Sblo se comenbrin aquí algunos adicionales.
1) Es evidente que en el chncer humano ocurre una extensa variedad de mutaciones en el gen pj3. 2) Los dinucle6tidos CpG son puntos calientes para mutaciones esponthneas, que reflejan tna tendencia de sus residuos 5-metilcitosina a desaminme de manera también espontánea. 3) Aflatoxina Bi es un hepatocarcinhgeno potente y muchos individuos, por ejemplo en ciertas partes de China y Afnca, están expuestos a ella. Por experimentos de mutagénesis ira vitro, se ha encontrado que causa en particular cambios transversales ("transversiones") G por T. Por tanto, tiene interés considerable haber encontrado que los cáinceres hepaticos extraídos de pacientes en regiones donde hay exposición elevada a este carcínbgeno, muestran las mismas "transversiones".
Cuadro 6 2 4 . Resumen de las caracteristicas mes del g.en p53 principales di contrada,5 en tumcires humrinos* en, .. - . . -- ... -
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c ~ amuta s iciones en e:I gen p53 si3n las aitcrriciones genéti.. cas mas cornuncs en ci cancer numano y son rrecuentes en clinccres dc colo,n, mama y pulm6n Alrededrirde 100 niutaciones diferentes :re han deteiztado en est,e gen Hn general, las mut:~cioncsse t:ncuentrm en codones altnmentc conscwadc1s ntes El espectro de m u t a:iones diíierE enm cánt Las transcripciones que ocurrcn cn dinuclcotidos CpG (un puntlo caliente) son frccuentes en netiplsias: de COIon, cerebro y tcjidc3 linfoide b Las tran!~vcrsiones son frscutiItes en chn cer de pulnn6n . ..v hevfitic:O y sc c n c i r ~ ~ cri i,.~--ri i~a ~ i i .ivui LG EII 1111 W L I U espccífico 1(rnutacionr:S G por 'l' e n el codbn '249) cn cicirtos carcinonias hepatoc:elulares,qrle ocurren4:n regiones del mundo d onde la explosicihn a aiíiatoxina Bl1 y virus dc henntitix n ..e
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Cáncer. oncownes v factores de crecirnrento
4) Un cambio semejante se ha encontrado con frecuencia en cánceres pulmonares que ce relacionan con el consumo de cigarrillos y por exposición al compuesto químico benzo~alfalpireno.Los datos de los dos últimos incisoc y de otros de clase similar indican que la determinación de tipos especificas de mutaciones (transversiones, transiciones en los dinucleótidos CpG, etdtera) en genes de tumores humanos puede ayudar a revelar sus causas (por ejemplo, exposición a compuestos químicos ambientales o mutaciones espontheas). Este es un ejemplo del uso de la epidemiología molecular para señalar la causa del cáncer y contribuir a su prevencidn.
UN MODELO GENETICO PARA CANCER COLORRECTAL SUGIERE LA PROBABILIDAD DE QUE SE REQUIERAN MUTACIONES DE 5 o 6 GENES PARA SU DESARROLLO El cáncer colorrectal es una neoplasia frecuente; en EUA ocurren alrededor de 150 000 al aflo. Junto con cáncer pulmonar y marnario, constituye cerca de 40% de todas las neoplasias humanas. A l parecer, la mayor parte de los cánceres colorrectales surge de tumores benignos llamados adenomas. Es posible obtener espechenes de personas con tejido colorrectal nonnal, de adenomas de tamaño variable, de &cer colorrectal y de cáncer colorrectal rnetastásico; tstos pueden compararse en cuanto a parámetros como cariotipos
Cromosorna 5q Akeracibn Mutaciones o pérdida Gen FAP
cromosomicos, oncogenes, genes supresores de tumor y grado de metilación del DNA. Eearon y Vogelstein han propuesto un modelo genético para explicar el desarrollo del cáncer colorrectal (figura 62-8). Las características principales de este modelo son las siguientes: 1) Se requieren varios pasos, lo cual esta de acuerdo con una serie de conocimientos que indican que el cáncer es un proceso de etapas múltiples. 2) Interviene una mutación de genes supresores de tumor en los cromosomas 5, 18 y 17 (el iiliirno se conoce como p53). Tarnbien participa la mutación y activación consecuente del oncogen ras en el cromosoma 12.3) Por tanto, por lo menas cuatro genes y es probable que 5 o 6 están implicados. Se afectan m3s genes supresores de tumor que oncogenes. 4) El orden preciso de cambios no es tan imporiante como la acumulaci6n de estos. 5) Son necesarias mutaciones adicionales para permitir la dispersión y metástasis. Es probable que otras neoplasias, el espectro de oncogenes y genes supresores de tumor afectados difiera de los implicados en este modelo. El modelo anterior es muy estimulante y se uti tiza como base de investigaciones futuras, pero quizh es demasiado simplista. Se están obteniendo datos semejantes de otros tumores frecuentes. Se espera que los hallazgos anteriores sean útiles en términos de prevencibn, diagnóstico, predicción del pronostico y tratamiento. Por ejemplo, respecto al tratamiento, podría lograrse lapreparacibn de fhrmacos para inactivar oncogenes (por ejemplo, oligodesoxinucl~otidosde contrasentido) o quizá sea posible remplazar, mediante terapia gtnica, a genes supresores de tumor mutantes por sus equivalentes nativos.
IW
17P
1 2 ~ Mutacibn
Perdida
K-ras
DCC?
Pérdida
~ 5 3
Hrpometiiacibn del DNA
Epitelio normal
EpRelb hiperprollferativa
-
1
Adsnama temprano
903
Otras alteraciones
Adenorna intermedia
Adenma
tardle
Carciríc~ia
Maiástasb
J
Figura 62-8. Representacidnde un modelo genbtiw para cáncer colorrectal. Los genes supresores de tumor implicados se localizan en los cromosornas 5, 17 (p53) y 18. El gen del cromosoma 5 es mutante en pacientes con poliposis adenomatosa familiar y se designa FAP, en tanto que el gen del cromosoma 18 con frecuencra falta en dnceres colorrectales y por tanto se designa DCC. El orden de cambios mostrados tienen menos importancia que la acurnulacdn total de cambios. Se ha demostrado que la hipometilaubn del DMA ocurre pronto en el desarrollo del cáncer colorrectal y puede tener una función significativa en la inestabilidad genética exhibida por los tumores. Los adenomas se clasificaron de acuerdo a su tarnafio, siendo los tempranoc menores de 1.0 cm;los intermedios y los tardioc exceden este tamaño, pera los últimas contienen ademfis focos de células cancerosas (Reproducida con autorizacibn de Fearon ER y Vogelstein 0 : A genetic rnodel for colorrectal tumorigenesrs. Cell 1990;6?:759Copyright O Cell Press.)
(Capítulo 62)
904 Bioquimica de Harper
EN EL DESARROLLO DEL CANCER COLÓNICO NO POLIPOSO HEREDITARIO PARTICIPAN GENES DE REPARACIÓN DE PAREADOS ERRONEOS Los dos principales sistemas de reparacibn del DNA en humanos son e3 sistema de reparacibn de errores de pareado y el sistema de reparacibn por escisirin de nucleótido. Ambos atraen bastante la atencidn en virtud de que al primero se le implica en el desarrollo del c h c e r colónico no poliposo hereditario (CCNPH) y al segundo en las causales de la xerodermia pipentosa (véase caso No. 1, capitlllo 6 5 ) . El sistema de reparación de errores de pareado corrige los que se producen durante la copia del DNA, por ejemplo, insercihn de un nuclelitido incorrecto. Es un sistema relativamente simple que implica seis proteínas. Como en la mayor parte de los sistemas de reparación (capítulo 38), estas proteinas reconocen en conjunto el sitio anormal, lo cortan y rernplazan con la secuencia correcta. En Escherrchia coli participan productos de tres genes (mutS, MutL y MutJfl en los pasos iniciales de la reparacibn de errores de pareado. Los componentes clave de este sistema se muestran en la figura 62-9. En contraste, el sistema de reparación por escisibn de nucledtido retira áreas grandes de DNA dafiado por sustancias químicas o irradiación. Implica al menos 12 productos génicos y es m8s complejo que el sistema de reparación de errores de pareado (capitulo 65). El cáncer colbnico no poliposo hereditario (CCNPH) es un síndrome relativamente frecuente caracterizado por la aparición temprana de cancer colónico y de tumores en ciertos brganos. Se observa que las c&lulas de este cáncer muestran inestabilidad rnicrosatelital. Los microsat4lites son secuencias conas de DNA que se repiten muchas veces. Comparadas con el DNA de los tejidos normales, las secuenciar microsatelitales de las células cancerosas de los pacientes con CCNPH varían en longitud, lo cual indica que los tumores lo mismo ganan que pierden secuencias, Esto puede suceder si dos tiras de DNA se deslizan entre si durante la replicación. Según la dirección del deslizamiento la nueva tira puede ser m8s coria o mhs larga que la tira progenitora y, por tanto, el nuevo dsDNA contiene un asa pequeña de DNA no pareado que en los tejidos normales debe corregirse mediante el sistema de reparación de errores de pareado. La anormalidad que se observa sugiere que el sistema de reparación de errores de pareado no funciona apropiadamente en estos tumores y es probable que fuera alterado. Se observa que el CCNPH se vincu [a a un gen en e[ cromosoma 2, el cual una vez aislado y desactivado es el equiva-
lente de MutS, por lo que se designa como hMSH2; al parecer este gen aporta 60% de los casos de CCNPH. Se tienen aislados tres genes humanos adicionales (hMLH1, hPMSI y hPMSZ), todos hom6logos de genes especificos de Escherichia coli implicados en la reparacidn de errores de pareado. El hiMLHI, equivalente del MurL d e Escherrchia coli, parece aportar la mayor parte del restante 40% de casos de CCNPH. Las células tumorales con inestabilidad microsatelital son incapaces de llevar a cabo la reparacidn de errores de pareado, lo que indica que se presentan mutaciones en los genes implicados en este proceso (por ejemplo, kMSH2 y hMLHI). Se tiene establecida una conexión importante entre la inestabilidad microsatelital y la falta de respuesta a un factor de crecimiento especifíco. Normalmente el TGFbeta tiene un efecto inhibidor sobre el crecimiento de cdlulas epiteliales. Esto se media por receptores de TGFbeta que son heteromeros consistentes de una mezcla de moléculas receptoras R de tipo I y tipo 11. En las células que derivan de cánceres colbnicos humanos con indices grandes de inestabilidad rnicrosatelital, se
1
Corte inicial C"3
3'
1
Retiro del defecto CH3
3'
Nueva síntesis
l
MutS MutL, ATP
CH3 5'
Ewonucleasa, II. ATP CH3
5'
ONA
Flgura 62-9. Representaeibn simplificada de la reparacibn por errores de pareado en Escherrchia col¡ Un DNA con error de pareado (indicado por el pliegue) puede repararse a partir del lado 5 , como se muestra, o desde el lado 3'. Se requiere la DNA Iigasa para cerrar la brecha que llena la DNA polimerasa (III). Los grupos metilo (CH3} en la tira superior se adhieren a ba adenina en secuencias GATC: su ausencia transitoria en la tira reckn sintetizada dirige la reparacion hacia esa tira. t o s detalles de cbmo opera el sistema en los humanos se encuentran en investigacion (Reproducida con autoruacibn de Marx J: DNA repairs comes into itc own. Scrence 1994,226.728.)
Cáncer, .r,anco,qenesy-factores de crecimiento
observa ausencia o considerable disminucibn del mRNA transcrito para el tipo 11. Para confirmarlo se observa que las mismas lineac celulares muestran poco o ningún enlace con el TGFbeta radiomarcado, lo cual indica que sus receptores de TGFbeta son defectuosos. Se conocen diversos tipos de mutaciones en el gen codificante de MI. Por tanto, en esta situación, la reparación defectuosa (manifiesta por inestabilidad microsatelital) parece estar vinculada s el gen directamente con el desarrollo de m u ~ c i o n e en codificante de un receptor de factor de crecimiento mismo que, una vez inactivado, permite que el crecimiento normal escape de control (figura 62-10). El defecto en la reparación también puede contribuir a algunos de los efectos mostrados en la figura 62-8. Al parecer la reparación de los errores de pareado defectuosa puede ser un evento critico en al menos cierto tipo de tumores. Los defectos en la reparacidn de errores de pareado también se encuentran en algunos clnceres colónicos no hereditarios. Esto puede ser importante para establecer la prevalencia de los defectos de la reparación de errores de pareado en diferentes chnceres. La incapacidad para reparar el daílo puede llevar a la activacibn o inactivación de varios genes en los tumores y permitirles divergir con rapidez de sus genes progenitores normales. Esto puede resuttar importante en el fenbrneno de la progresión tumoral (vCase adelante). La identificacibn de estos genes también permite que se realicen pruebas, tales como la detección de genes anormales para kMSHZ y kMLHI en las familias de atto riesgo.
Mutaciones en genes (por ejernpb. hMSH2, hMCHl) que codirican proteinas del sistema de r e p a r a u ~ npor errores de pareado
L Sistema defectuoso de reparacibn por errores de copiado
L Las mutacionessin reparacibn dan lugar a inestabilidad micmsatelial. que afectan el gen Rii. entre otros
i Receptor defectuoso TGFP
1 Las dlulas pierden la respuesta inhibitoria del creamiento a TGFP
Figura 62-10. Esquema de una cadena de eventos que puede llevar a la perdida del control del crecimiento celular en el cáncer coldnico no poliposo hereditario (CCNPH).
905
SE TIENEN AISLADOS VARIOS GENES QUE AUMENTAN LA SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER Es bien conocido que ciertos tipos de cáncer (por ejemplo, de la mama) manifiestan una incidencia familiar aumentada. Existe a la fecha un progreso considerable en el aislamiento de genes que aumentan la susceptibilidad al cáncer. En el cuadro 62-1 0 se listan varios de estos genes y los trastornos a los que se vinculan; incluyen RBI y p53. Un triunfo reciente es el aislamiento de BRCAI, un gen que influencia la susceptibilidad a chnceres de la mama y ovárico de aparici6n temprana. Los factores genkticos contribuyen con cerca de 5% de todos los casas de c h c e r de la mama, pero wn casi 30% de los casos diagnosticados antes de los 30 aaos de edad. E! BRCA J especifica una proteína de 1 863 aminoácidos que contiene un dominio de anillo de cinc en la región de su terminal amino. Su función no está establecida pero puede ser un factor de transcripción. En el gen se encuentran diversas mutaciones de la línea germina1 al parecer predisponentes del desarrollo de clincer. Se tienen mapas de la localización cromosbmica especifica de alrededor de otros 12 genes vinculados con tipos familiares de cincer y está por llegar en corto plazo su aislamiento. Uno de ellos es un segundo gen que se vincula con aumento de la susceptibilidad al cáncer de la mama (pero no al clncer ovárico), el BRCA2, mapeado en e[ cromosoma 1 3q 12-13. La identificación y estudio subsecuente de estos genes (por ejemplo, para determinar si actúan como genes supresores de tumor o mediante otros mecanismos) puede facilitar el diagnbstico precoz de diferentes tipo de chncer familiar y proporcionar indicios de los mecanismos del desarrollo de c h c e r en diversos tejidos.
LA MALIGNIDAD DE LAS CÉLULAS TUMORALES TIENDE A PROGRESAR Una vez que una célula se convierte en ~Wulaturnoral, la composición y el comportamiento de su progenie no permanecen esthticos. En vez de ello, tienden al aumento de su maIignidad. Esta se manifiesta por incremento anormal de los cariotipos, aumento de las velocidades de crecimiento e incremento de la tendencia a invadir y formar metástasis. Al parecer, el importante fenómeno de progresidn refleja una inestabilidad fundamental del genoma de las cklulas tumorales. Parece probable que las mutaciones en los genes de reparación del DNA participan en este fendmeno mediante la creacibn de un fenotipo mutador. Puede haber activación de oncogenes adicionales. Las células con la velocidad mas alta de prolifemci6n tienen una ventaja selectiva.
906 Bioqzaimica de Harper
(Capítulo 62)
Cuadro 62-10. Algunos g n e s-ya donados que aumentan la susceptibilidad al chncer*** ...
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para la neoplasia cndocrina inultiple t i p 2A y para el síndrome de von Hippel-Lindau).
Es importante distinguir los perfiles bioquimicos de las células recikn transformadas, de aquellas d l u las tumorales altamente malignas de crecimiento ripido. Las primeras pueden mostrar escasas diferencias de las células normales, aparte de los cambios especificas que conducen al cancer (por ejemplo, activacibn de uno o mas oncogenes) y de aquellos que generaimente se relacionan con la transformaci6n (cuadro 62-3). Los anhlisis de estas c6lulas pueden revelar alteraciones bioquimicas criticas que desembocan en la transformación. El perfil bioquímico de las cklulas altamente malignas puede ser muy diferente del de las cdlulas normales. Han ocurrido muchos cambios en el perfil enzimático y en otros parámetros bioquímicos (cuadro 62-1 11, algunos de ellos son secundarios a la velocidad rhpida de proliferación y otros que se deben probablemente a inestabilidad cromosómica. Estas cdlulas de crecimiento rápido tienden a optimizar los procesos anabdlicos implicados en la proliferacidn (por ejemplo, sintesis de DNA y RNA), economía de las funciones catabblicas (por ejemplo, el catabolismo de las pirimidinas) y omisión de las funciones diferenciadas que muestran sus ancestros normales. En otras palabras, se concentran casi exclusivamente en la proliferación. Tarnbikn muestran cambios bioquírnicos que reflejan una regulación genica alterada, como la síntesis de ciertas proteínas fetales (algunas de las cuales pueden utilizarse corno marcadores tumorales; véase adelante) y la fa=
bricacibn inapropiada de factores de crecimiento o de hormonas. Es poco probable que los análisis de tales c&lutas revelen los fenbmenos críticos iniciales causantes de la transformacibn, en parte debido a que esos sucesos son oscurecidos por la miríada de cambios secundarios a la progresión. Sin embargo, et conocimiento del perfil bioquimico de esas cklulas es extremadamente importante en la elección de la quimioterapia, ya que este es el tipo de d l u l a s exacto que los oncblogos necesitan tratar.
Cuadro 82-1 l. Cambios bbioquimicos frecuentr!S 3
rápido
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Aurnciiío en la síntesis de RNA y DNA
Disminución del catabolisrno de les pirirnidinas Tasas altas de glucblisis aerobia y anaerobia Alteraciones en 30s perfiIes de le1s isotnzimas, a rnenuclo tienen un patrbn feta1 Sintesis de protelnas fetales (por ejemplo, antigeno czrcinoembrinfi-*;-\ . Pérdida dlt funciona:S nioquimicasairerenciaoasZpor ejemplo, dlisminucibn de la slntesis de proteínas especializadas 1 .. ..'.,.. * Sintesis inapropiaw~ de ciertos factores de crecimiento y de hormonas m
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Cáncer, oncogenes y factores de crecimiento 907
células que están en reposo en la fase Godel ciclo. Es útil clasificar los medicamentos anticancerígenos como específicos del ciclo celular (CCS) o no especificos del cicla celular (CCNS). Los primeros (que inchyen metotrexato, fluorouracilo y citarabina) actúan sobre ce!ulas en multipticacion, en tanto que los iiltimos (por ejemplo, agentes alquilantes y cicplatino) actuan sin relación con el estado de proliferación. Los fámiacos CCS pueden subdividirse en específicos d e fase (por ejemplo, medicamentos que actúan en la fase S del ciclo [citarabina] o en la fase Gi-M [bleomicina]). En toda terapéutica de cancer, es vital diagnosticar y tratar el tumor pronto; de otro modo, la masa tumoral puede ser demasiado grande para que el tratamiento tenga kxito. Durante la teraphutica, es deseable eliminar todas las células clonogenicas ("células precursoras de tumor"), dado que tienen el potencial para multiplicarse en forma ilimitada. En general, la terapkutica de dosis altas intermitentes tiene rnhs probabilidad de lograr esto que un tratamiento continuo con dosis bajas, debido a que expone las células tumorales a concentraciones mlis altas del f h a c o usado la quimioterapia combinada (combinación de 3 o 4 medicamentos) ha probado su kxito en varios cánceres, debido a que los compuestos actúan en forma sinérgica, el comienzo de la resistencia puede retardarse y con frecuencia su toxicidad es menor.
LOS MEDICAMENTOS USADOS EN QUIMIOTERAPIA DEL ~ Á N C E R ACTÚAN EN NUMEROSOS SITIOS BIOQU~MICOS La cirugía, radioterapia y quimioterapia son las modalidades principales usadas para tratar pacientes con cáncer. El desarrollo de fárrnacos anticáncer es de muchas maneras, igual que en otras numerosas breas de la medicina, un ejercicio de bioquírnica aplicada. El problema consiste en preparar medicamentos (psoductos naturales o sintéticos) que destruyan células cancerosas en forma eficaz, pero no demasiado toxicos para las cdlulas normales. E1 cuadro 62-12 enumera las siete clases principales de compuestos de uso extenso en el tratamiento del cáncer. Dado que, Ea divisibn celular incontenible es una característica que tipifica a numerosos tumores malignos. muchos de estos f h a cos se usan debido a que inhiben la sintesis de DNA. Por esta razbn, tienen tarnbikn probabilidad de lesionar tejidos normales cuyas células se dividen en forma continua (por ejemplo, intestino y médula ósea). La fraccidn proliferante (porcentaje de células de un tumor que esti de manera constante en ciclo) es un concepto importante en la quimioterapia del chncer; tumores con fiacci6n pro1iferante eIevada son, por lo general, más sensibles a quimioterapia que las
Cuadro 62-12. Algunos medic .-.
-
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A
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Clase de compuesto
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imioterapia del chncer
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Ejemplo
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la al DNA y otras rno
A A
. en. un nuciesrida . .,. Se conviene . . "fmudu. . . . 1 ixucemia mierocirica aguaa lento" e inhihe la sintesis de purinr Se convierte m un nuclebt ido "fraudi colorrecta ... lento" e inhibe a la timidiia~osintew
tintagonrsw ue purina 1 inercapropurina
Antagoni dina A
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rirni- Flua
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Antibibticos Rros f h a
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Dox orruhicina Cisp(latino
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DNA y estabiliza edad de Hodgkin complejo I3NA-topoisonlerasa Ii . . rotura de 1las tiras dc Carcincima pulmo nar Inhibr ucléotido rseductasa Leuceniia mielocíiica crónici Se unea Ia tubuiinae ínhibe laformacibn 1 Sarcoma de Kapo! m
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i Bloquea los efet:los de los E
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1 Inhibr
nfocitos ia Los numerosos fármacos enumerados se usan junto con otros en quimiotera on de manera obligada . .. . pia comhir el tratamiento de elecci6n actual para los trastornos indicados. 3 m b i t n existen otras clases de quimioteraptuticos, como modificadores de la respuesta biolúgica (por e,jemplo, interferones). Corticosteroides
Prednisoma
I
LA GLUCOPROTE~NAP TIENE UNA F U F E C I ~IMPORTANTE N EN LA RESISTENCIA A MULTIMEDICAMENTOS EN LA QUIMIOTERAPIA DEL CANCER Un probjema mayor en la quimioterapia de! cáncer es el desarrallo de resistencia a los fármacos usados. Aunque en un principio los medicamentos son eficaces, a menudo después de un tiempo (por ejemplo, varios meses), las células tumorales desarrollan mecanismos que los vuelve ineficaces (resistencia adquirida). La resistencia puede ser tarnbidn intrhseca; es decir, un medicamento determinado nunca es eficaz sobre las células objetivo. Por ejemplo, varias bacterias son sensibles a penicilina debido a que ésta inhibe reacciones bioquimicas especificas de la sintesis de sus paredes celulares. En cambio, la penicilina no tiene efecto sobre células eucariotas debido a queno sintetizan paredes celulares; por tanto, estas cdlulas carecen del sitio blanco de la acción de la penicilina. Otras explicaciones de la resistencia intrinseca de las células incluyen una capacidad elevada para inactivación metabdlica del fhrmaco administrado, mediada por lo general por citocromo P450 (capítulo 6 1 ). Se considera que la resistencia adquirida de las células cancerosas a los quimioterapéuticos refleja una velocidad alta de rnutaciiin esaontanea de estas células. Es probable que sean resistentes no s61o al medicamento sino tambikn a otros compuestos anticancerosos cuya estructura no se relaciona: Por ejemplo, si las cklulas tumorales desarrollan resistencia a metotrexato, se encuentra que también lo son a antibióticos antitumorales como doxombicina y a compuestos vegetales como vincristina. Esto se conoce como resistencia multifarmacolbgica y tiene importancia extrema debido a que su desarrollo es causa frecuente del fracaso de la quimioterapia, de manera común durante el tratamiento del chncer. La base molecular de la resistencia multifarmacologica ha sido esclarecida por el descubrimiento de que las celulas cancerosas que muestran esta resistencia tienen a menudo concentraciones elevadas de una proteha designada glucoproteina P (P = permeabilidad) en sus membranas plasmáticas. Esta proteína actúa como una bomba dependiente de energía, que expulsa a una extensa variedad de anticancerigenos y disminuye asi su eficacia. Debido a su importancia en terapdutica, la glucoproteina P ha estado sujeta a investigacibn masiva y se dispone de una cantidad considerable de informacibn (cuadro 62-1 3). En las cdlulas cultivados, se han encontrado amplificación génica y mutaciones en un punto (que quizá afectan la regulacidn) en cClulas cancerosas resistentes que muestran ctincentracidn alta de glucoproteina P; aún no se han establecido tos mecanismos que regulan este
-
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Cuadro 63-13. Algunas propiedades de la glucoprot*"- "
. .-. . .-. - eina fusfonlad~dc 1 70 mmhtica. 1280 aminoar K~ ~ ~m,+~ fiiticibn ~ t l de " 2~ATP plbgauu>, vi c > b i i i a iiviriologia con la hemolisiina R bncte . -
ia. Actuaconio una bomiba de flu,jo expulsanrlo una var iedad de fa do , s.> la KMr Miembro de un multil:en familia mdrl y m&) Ampliamente distrib uido y alta rervado a travts dc cspccics Pmscnte ein algunas icilulas no] riílbn, intcstinos. etcitr:ra :uItivadw i-eUna cantildad increm . . entada en 1 sistentes, y e n celulas tumorales resistentesznvzvo; aumento i,n vivo corrt:lacionado con un pob re pronostico También puede ser inducido 130r Otros c:stimulosp'or e-jemplo c hoque iém11CO ! * -.+..+1:c * *.+.l.* ~ . ~ ~ ~ ~ ~del~ ~..-~L I ~I U , miiriua, ~ c a tiuiiiuh c i h UG n JIIUL~~LIULI~S involucratlas con IU;4F cn ctlulas cultivad.as Cuando sa:transfiere a las ~Clulasproduce,I1MF Puedc ser inhibida pcir quimioscnsibilizadrircs como i'e. rapamil (un niuqueador riel calcio1 o ciclrisnorina e..
*
I I . .
RMF. resistencia multifmactilhgica.
incremento de glucoproteina P in vivo. Se estB haciendo un esfuerzo importante por preparar inhibidores de glucoproteina P; el uso de medicamentos como verapamil y ciclosporina (quirniosensibilizadorec) promete. La glucoproteina P debe tener funciones fisiolbgicas, dado que existe en órganos normales como riiión e intestino; es posible que intervenga en la excreción de compuestos con potencial tclxico de las cklulas de esos brganos. Se ha demostrado que otros mecanismos intervienen en la resistencia de células cancerosas a ciertas clases de fhmacos (cuadro 62-1 4).
LA METASTASIS ES LA PROPIEDAD MAS PELIGROSA DE LAS CELULAS TUMORALES La metdstasis es la diseminacMn de las cklulas cancerosas desde un sitio primario de origen a otros tejidos donde proliferan como tumores secundarios y &te es el principal problema presentado por la enfermedad. La rnethtasis es un fenómeno complejo para ser analizado en el ser humano y el conocimiento de sus bases bioquímicas está bastante restringuido. Debido a que refleja una falla en la interaccidn de cblula a célula, gran parte de la atención se enfoca naturalmente a comparar la bioquimica de las superficies de cklulas normales y de las malignas. En la superficie
Cáncer, oncogenes y facf ores de crecimiento
* 909
Ctaadro 62-14. Algunos mecanismos bioquirnicos de resistencia f8ki&lógica encontrados - .-
" las cance
-. -.... ... .. -- .
. .
Metianismo gt
" specifico
¡=====
tema de transporte mijtante
Captación disminuida E: imcntada Ciertos rarmacos anricancc A nsuficiente Ciclofosfamida A innctivacicin del farinaco Citarabina
diada por :lucoprotetei na v.i-
minucidn d8e especies Fiiwrorno p450 activmtes mento d e ¿ictividad dle desarninasas que achan sobre (:itesina
Secuestro de medicme Mutación en enzima bl: Aumento de enzima hlí Mecanismos de reparacion rLpidoc
Cispli Metoi Metoi ri~dqs tbrmaco4 metilantec
06-alquilg i
I
-
Au mento dc uin tipo de nnetalotione M u!tanteDHFR: A rriplificaciiir . .i del gen p:ara DHFR~ Allrnento de la enzima reparadora especifica
Datos de Hays I D y Wo;If CR: Molei:ular mechanisrna of dni . Riochem 1 1990;21:28 1Las metalotioneinas son metaloprott citosbl icas de pesc bajo, ricas en cisteina p , .higaao y rrnon y que se unen a varios meraies y por tanto, ios eriminan (aestoxirican) (por ejemplo, m,LU,
.
.
xnsferasa) .n
ng y ta). m n inoucinicq en
la exposición a esos metales (capltuli
: DHRF, dchidrofolato reductasa. de estas últimas se han documentado numerosos cambios (cuadro 62-1 5), aunque no todos se relacionan en forma directa con el problema de las metistasis. En el presente, muchos estudios se dirigen al desarrollo de sistemas adecuados de modelos animales para el esclarecimiento de la metáctasis. También se realizan investigaciones para descubrir las posibles funciones de cierta proteasas (por ejemplo, colagenasa tipo 4) y de ciertas glucoproteinas y glucoesfingo típidos de la superficie celular en este fenómeno. Por ejemplo, es posible que los cambios en las cadenas de oligosacáridos de las glucoproteinas (secundarios a alteraciones en la actividad de glucoproteína glucosiltransferasas especificas) actúen permitiendo la ocurrencia de las methstasis. La búsqueda de alteraciones en las proteínas implicadas en las interacciones celu!ar-
Cuadro 62-15. Algunos cambios detectados Inn a raa v uperficies de las cklulas maM:--a-* ."L. . - - -. - ..-- - ...---• Alteraciories de la permeabilida
tejido y aula-célula (por ejemplo, integrinas, cadherinas y otras moléculas de adhesión celular tales como las de l a células neurales m-CAM]), tambien constituye un área de investigación. Dihcidir los mecanismos bioquimicos que operan en tsta, podría ser la base para el desarrollo racional de terapeúticas anticancerosas mas eficaces. Otra Area relacionada con metistasis se refiere al suministro de sangre a los m o r e s . F o l h a n demostró que el crecimiento tumoral progresivo depende de la angiogbnesis. Las cdlulas tumorales pueden secretar factores de crecimiento angiogdnicos, como factor basico de proliferacion de fíbroblastos (bFGF) y FGF lcido (aFGF), que promueven la multiplicacion de células cndoteliales y la fomaci6n de capilares nuevos. Esto hace surgir la fascinante posibilidad de idear medicamentos que destruyan Ios tumores por inhibicibn específica del crecimiento de sus vasos sanguíneos, sin afectar a sus equivalentes normales.
A* CII
A-
-
en las propicdadcs d tiisminucibn de ta adhesividad
• Trastorno:3
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.
aglutinacibn por varias
o 1 de
las actividades di:diversas enzima (por
: _ d . . *
CJClllpLV, c . L C I l ~ plulI
*
LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE LABORATORIO SON ESENCIALES EN EL TRATAMIENTO DE PACIENTES CON CANCER
;-u>)
AIteracibn de.1a cruga de superficie Aparición de antigenOS nuevos Pérdida de ciertos antigenos .. . .. . . Modificaci6n de las cadenas de oligosac8ridos de las glucoprote Cambios (le sus cons -LL:-^ Adaptado de n~uuuiiis JL, ruiwisvir UL. ~ u i i a u s w~ iiuiriiai aiid transfaned cells. En: Cuncer. ,4 Comprhenswe fi~ a i i s eVol . 4, Becker FF [editor) Plenum Press, 1975. ,P
m
Las pruebas bioqufmicas de laboratorio colaboran al manejo de pacientes con chcer. Muchos chnceres se relacionan con la produccidn anormal de enzimas, proteínas y hormonas (vkase la descripcibn del progreso de tumores, despuds), que puede medirse en plasma o suero. Estas rnolkculas se conocen como marcadores tumorales. La medicibn de algunos marcadores tumorales es ahora una parte integral del tratamiento de ciertos tipos de cdncer (cuadro 62-16). Las aplicacio-
910 Bioquimica de Hurpes
(Capíf u10 62)
RESUMEN
Cuadro 62-16. Marcadores de turnos iitiles en clínica
-
-.
lacionado
-
-.
-
A l l L ~ ~ baJLtltublllbribb~t,~ C o l u l l , p u ~ l l l ~ Ll L~ ~, ~ nico (AC creas
*
I Higado, cClula
a-Fetoprote-ina (AFP) .
I ~ I ~
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Ceiuia germi-
humana (
iides (carc intima meriustata
(PAP)'
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* Adaptado, con autorimcihn, de Mcllntire KR: T'umor markt:rs : .\
1 n o ,
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How useful are thev? tiosa Pract IDic 1 i r a + . i: ':>>. , La medicibn de antigerlo especlficti de prbstat;a (PSA) cs ijtil para v~gilarrecidiva o pi:rsistencia de chcer prosthtico despi11.4s de cirugía. FI incremento de PAP, por lo genera1, indica exbensi6n local o inetktasis.
+
1
nec de los marcadores tumorales en el diagnbstico y tratamiento del cáncer se enumeran en el cuadro 62-1 7. Del estudio de los marcadores han surgido tres conclusiones importantes (McIntine, 1984): 1) Ningún marcador único es útil para todos los tipos de chncer o para todos los pacientes con un tipo dado de chcer. Por esta razón, en ocasiones es ventajoso el uso de una panoplia de marcadotnestumorales. 2) Los marcadores se detectan con mas frecuencia en las etapas avanzadas de c h c e r más que en etapas incipientes, cuando podrían ser m l s útiles. 3 ) De los usos de marcadores enumerados en el cuadro 62-17, el kxito mayor se obtiene en el seguimiento de las respuestas a la terapeutica y en la deteccibn temprana de recidivas.
Cuadro 62-17." AplicicfÓnes de marcadores
"umorales*
--
D
A
-
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- ..- - -
tnvestigaciiin en pcrsi
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trastornos
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de
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del efecto de! tratamiento y detecivante . ... Clasificacibn: Eleccibn de la terapéutica y prediccibn de la conduc?a tumoral (pronbstio ,tapa: Defi nición del grado de 12i enfermed. r.. L O C ~ I I- Z, ~ C Expioracion I O R : . nuclear ae amicuerpos raaiac'igilancia: cibn de ci
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:S * Aaaptaoo, con autorizacih, de McInrire hit: i umor rnaraers:
How useful are the? Hosp Pract (Dic.) 1984;19:55.
Las celulas cancerosas (malignas) se caracterizan por pérdida del control de proliferacidn, invasividad y , methtasis. Las células tumorales benigna han perdido el control de proliferacibn, pero n o forman methtasis. El &cer puede ser causado por agentes físicos, químicos y biológicos. Estos agentes lesionan o alteran el DNA, de modo que el chncer es una verdadera enfermedad del genoma. El inicio y prornoci6n son fenómenos establecidos en forma rotunda en carcinogénesis química. Es probable que el inicio sea el daño en el DNA, pero los mecanismos requeridos para la promocibn no se han esclarecido. Los ksteres de forbol son los agentes promotores mAs estudiados; activan a la proteina cinasa C, que ejerce diversos efectos. Gran parte del interés actual en el cáncer se enfoca al estudio de oncogenes y de genes supresores de tumor. El concepto de oncogenes surgió de estudios de virus oncogénicos. Las c&lulasnormales contienen precursores potenciales de oncogenes, designados protooncogenes. La activación de protooncogenes a oncogenes se logra por cinco mecanismos cuando menos (insercion de promotor y de amplificador, traslocación cromosomica, amplificacibn genica y mutacibn en un punto). Los oncogenes activados influyen en la multiplicación celular por perturbación de sus mecanismos normales de control de proliferacibn, por actuar como factores de crecimiento o receptores y q u i d por tambien por otros medios. La acción de los factores de crecimiento puede ser de manera endocrina, paracrina o autocrina. Afectan la divlsibn celular y algunos pueden ejercer efectos negativos (por ejemplo, TGFbeta). Los productos de algunos oncogenes (por ejemplo, de sis) funcionan como factores de crecimiento. En la actualidad se reconoce a los genes supresores de tumor como piezas claves en la génesis del chcer. El efecto de los oncogenes sobre la proliferacibn celular se ha comparado con poner el pie en el acelerador de un automóvil, en tanto que la acción de inactiva, los genes supresores de tumor es semejante a quitar el pie del freno. Los genes supresores de tumor irnportantes son R ü I yp53, ambos codifican a fosfoprotehas nucleares y es probable que estos productos génicos afecten la transcripción de genes que intervienen en eventos reguladores del ciclo celular. Un modelo genttico importante para cáncer colorrectal invoca la interrelación de genes supresores de m o r y el oncogen ras. Las mutaciones en los genes de la reparacibn de errores de pareado se encuentran vinculadas con el cáncer colbnico no poliposo hereditario y la perdida de la capacidad de respuesta al efecto inhibitorio del crecimiento del TGFbeta parece importante en el desarrollo de este tipo de tumor. Se conocen varios genes de susceptibilidad al chncer que incluyen RBJ, p53 y
Cúi~cer.oncoaenes v factores de crecimiento 9 J 1
BRCAI. La progesibn tumoral refleja una inestabilidad del genomatumoral que es posible se deba, al menos en parte, a defectos en 30s sistemas de reparacidn del DNA y a la activacidn de oncogenes adicionales. El progreso del tumor refleja una inestabilidad del genoma tumoral. El fenómeno de la methstasis se esta investigando en forma intensa y es posible que comprenda cambios en glucoconjugados de superficie, alteracibn de las actividades de proteasas y trastornos en moléculas de adhesividad celular.
Los f h a c o s usados en quimioterapia de ckcer actúan en diversos ioci bioquimicos, La resistencia a medicamentos antichncer es un fenbmeno importante; un mecanismo de resistencia multifarmacologica depende de la glucoproteina P. Las células tumorales secretan a la sangre ciertas enzirnas y proteínas que son usadas como marcadores de tumor en el diagn~sticoy para vigilar la terapeutica y la recidiva del cáncer.
REFERENCIAS Cavenee WK, White R t : The genctic basis of cancer. Sci
Arn (Mar) 1995;272:72. Fearon ER, Vogelstein B: A genetic modcl for colorectal tumorlgcncsis. Cell 1990;61:759. Franks LM, Teich NM (editors): Jntroductrnn io ihe Cellular and ,lfoleciilar Biology of Cuncer, 2nd ed. Oxford Univ Press. 1991. Gottesman MM, Pastan 1: Riochemistry of multidrug resistance rncdiatcd by the rnultidrug transporter. Annu Rev Biochem 1993:62:385. Hamel PA et al.: Speculations on the roles o f RRI in tissue-specific diffcrcntiation, tumor initiation, and tumor progression. FASCB J 1993:7:846. Hollstein M et al.: p53 mutations in human cancers. Science I1B1;253:49. Knudsoa AG: All in the (cancer) family. Nature Genetics 1993;5: 103. Kohn EC, Liottli LA: MolecuIar insights into cancer invasicin: Strategies for prevention and intervention, Cancer Res 1 '395;55:1856. Levine AJ: Tumor suppressor genes. Sci Am Science and Medicine (JanlFeb) 1995;2:29.
Loeb LA: Mutator phcnotypc may be required for multistage carcinogenesis. Cancer Res 1991;5 1 :3075. Markowitz S et al.: Inactivation of thc typc 11 TGF-beta receptor in colon canccr cclls mith microsatellite instability. Science 1995;2hX:1336. Mam J: DNA repair comcs into ih own. SEimce 1994:266:728. M a r x 9: O n c o g e n e s reach a milestone. Science 1994;266: 1942 Miki Y et al.: A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BR64I. Science 1994;266:66. Modrich P: Mismatch repair, genetic stability, and cancer. Scicncc 1994;266: 1959. Sancir A: Mechanisms of DNA excision repair. Science 1994;266: 1954. Tanno~kIF, Hill RP (editors): The Bmic Science of Oncology, 2nd ed. Pergamon Press, 1992. Thompson CB: Apo~tosisin the pathagencsis and treatmcnt of disease. Science 1995;267:1456. Weinberg RA: The retinoblastoma pratcin and cell cycle control. CeIl 1995:81:323.
