Colagenul
Colagenul este prezent în toate animalele pluricelulare !i reprezint" cea mai abundent " protein " din vertebrate. Are localizare extracelular " !i este organizat în fibre cu mare rezisten#" la întindere. Este component al #esuturilor conjunctive fiind prezent în oase, din #i, cartilaje, tendoane, ligamente, tegument !i vase de sânge. În cantitate mic", se g"se!te practic în orice #esut. Mamiferele prezint" 30 de catene polipeptidice distincte din punct de vedere genetic care se asociaz" pentru a forma 16 tipuri de colagen care exist" în acela!i individ în #esuturi diferite. Aceast" protein" extracelular " este alc"tuit" dintr-un triplu helix , fiecare caten " din acesta, con#inând câte 1000 resturi de aminoacizi. Secven #a în aminoacizi este regulat", în sensul c" aproape fiecare al treilea aminoacid este reprezentat de glicin". Secven#a Gly-Pro-Hyp se repet" în mod curent Colagenul este o molecul" cu o lungime de circa 3000 Å !i un diametru de 15 Å.
Secven#a în aminoacizi la cap"tul C terminal al unui lan# de colagen $ I bovin ce apar #ine unei regiuni triplu helicale (Hyp* reprezint" 3-hidroxiprolina).
Figura 3.42
Pe lâng" 4-hidroxiprolin " (Hyp), în aceast" protein" fibroas" se mai g"sesc !i al#i aminoacizi hidroxila#i !i anume: 3-hidroxiprolina 3-hidroxiprolina !i 5-hidroxilizina, dar în cantit "#i mult mai mici. Prolina este hidroxilat" la hidroxiprolin ", sub ac#iunea prolil hidroxilazei, dup" ce catena polipeptidic polipeptid ic" a fost sintetizat". Prezen#a aminoacizilor hidroxila#i permite formarea de leg "turi de hidrogen intramoleculare care stabilizeaz" colagenul. Prolil hidroxilaza are nevoie de prezen #a acidului ascorbic (vitamina C) pentru a-!i manifesta activitatea enzimatic". Caren#a de vitamin" C din hrana oamenilor provoac " boala numit" scorbut, în care colagenul sintetizat nu poate forma fibre, ceea ce determin " apari#ia leziunilor la nivelul pielii !i fragilitate vascular ". Catenele polipeptidice individuale din colagen adopt" o structur " de helix de stânga !i se agreg" în triplul helix, r "sucindu-se una în jurul celeilalte spre dreapta. (Fig. 7-31 Voet). Caracteristicile acestui superhelix sunt n=3,3 !i p=10Å. Evident, în centrul acestui triplu helix
spa#iul disponibil pentru catenele laterale ale aminoacizilor este foarte strâmt !i a !a se explic" de ce fiecare al treilea rest este reprezentat de Gly.
Figura 3.43 Structura
triplu helix a colagenului
Leg"turile peptidice sunt astfel orientate încât hidrogenul iminic al unui rest de Gly de pe o caten " polipeptidic" formeaz" o leg"tur " de hidrogen cu oxigenul carbonilic al unui rest de alt aminoacid de pe o caten" învecinat". Resturile de Pro !i Hyp voluminoase !i relativ inflexibile, confer " rigiditate întregului ansamblu. Colagenul con#ine glucide legate covalent, care reprezint" 0,4-12% din masa total", în func #ie de #esutul de origine. Acestea sunt reprezentate în special de glucoz", galactoz" !i dizaharidele rezultate din combinarea lor !i sunt ancorate la nivelul resturilor de 5-hidroxilizin " din colagen sub influen#a unor enzime specifice. Colagenii de diferite tipuri formeaz " fibrile bandate sau agregate de tipul re#elelor. Fibrele bandate sunt alc"tuite din diferite tipuri de colagen: I, II, III, V !i IX. Aceste fibrile prezint " o peridiocitate de 680 Å !i un diametru de 100 – 2000 Å, în func #ie de tipurile de colagen pe care le con#in !i de #esutul de origine.
Figura 3.43 Tip
de structur " glucidic" ancorat" covalent de moleculele de colagen
În cadrul fibrilei, moleculele de colagen se aliniaz " cap la coad" !i interac#ioneaz" hidrofob. Zonele clare apar la nivelul discontinuit "#ilor dintre dou " triplu helixuri consecutive. Resturile glucidice sunt localizate în zonele clare, ceea ce sugereaz" c" sunt implicate în direc#ionarea asambl"rii fibrilelor.
spa#iul disponibil pentru catenele laterale ale aminoacizilor este foarte strâmt !i a !a se explic" de ce fiecare al treilea rest este reprezentat de Gly.
Figura 3.43 Structura
triplu helix a colagenului
Leg"turile peptidice sunt astfel orientate încât hidrogenul iminic al unui rest de Gly de pe o caten " polipeptidic" formeaz" o leg"tur " de hidrogen cu oxigenul carbonilic al unui rest de alt aminoacid de pe o caten" învecinat". Resturile de Pro !i Hyp voluminoase !i relativ inflexibile, confer " rigiditate întregului ansamblu. Colagenul con#ine glucide legate covalent, care reprezint" 0,4-12% din masa total", în func #ie de #esutul de origine. Acestea sunt reprezentate în special de glucoz", galactoz" !i dizaharidele rezultate din combinarea lor !i sunt ancorate la nivelul resturilor de 5-hidroxilizin " din colagen sub influen#a unor enzime specifice. Colagenii de diferite tipuri formeaz " fibrile bandate sau agregate de tipul re#elelor. Fibrele bandate sunt alc"tuite din diferite tipuri de colagen: I, II, III, V !i IX. Aceste fibrile prezint " o peridiocitate de 680 Å !i un diametru de 100 – 2000 Å, în func #ie de tipurile de colagen pe care le con#in !i de #esutul de origine.
Figura 3.43 Tip
de structur " glucidic" ancorat" covalent de moleculele de colagen
În cadrul fibrilei, moleculele de colagen se aliniaz " cap la coad" !i interac#ioneaz" hidrofob. Zonele clare apar la nivelul discontinuit "#ilor dintre dou " triplu helixuri consecutive. Resturile glucidice sunt localizate în zonele clare, ceea ce sugereaz" c" sunt implicate în direc#ionarea asambl"rii fibrilelor.
Aspectul bandat al fibrilelor de colagen a!a cum apare la microscopul electronic, se datore!te aranjamentului supraetajat al moleculelor de colagen, ceea ce confer " un aspect striat. D, reprezint " lungimea ansamblului format dintr-un disc clar !i unul întunecat (D%680 Å)
Figura 3.44
Colagenul este insolubil în solven#i polari datorit" leg"turilor covalente încruci !ate intramoleculare !i intermoleculare, care se formeaz" cu participarea catenelor laterale ale lizinei !i histidinei. Prima etap" a acestui proces de înre #elare este catalizat" de lizil oxidaz", o enzim" cu Cu2+ !i în cadrul acesteia resturile de lizin " sunt transformate în alizin ". Apoi dou " molecule de alizin" sufer " o condensare crotonic", iar produsul rezultat reac #ioneaz" cu histidina. Acest ultim produs formeaz formea z" o baz" Schiff cu 5-hidroxilizina. Astfel se pot lega pân " la patru lan#uri polipeptidice unul de altul. Aceste leg"turi încruci!ate se produc în special la capetele N- !i C- terminale ale moleculelor de colagen. Gradul de înre #elare a colagenului cre!te cu vârsta animalului.
3.3.2 Conforma!ia tridimensional" a proteinelor 3.3.2.1 Leg"tura peptidic"
Leg!tura peptidic!, plan! "i rigid!, cu pu#ine excep#ii, prezint! o conforma #ie trans, astfel încât atomii de carbon $ succesivi sunt situa #i pe p!r #ile opuse ale grup!rii peptidice care îi une "te. Conforma#ia cis este cu aproximativ 8 kcal/mol mai pu#in stabil! decât cea trans. Aceast! diferen#! de energie este mai mic ! în leg!turile peptidice urmate de resturi de prolin ! "i de aceea, circa 10% din resturile de prolin ! din proteine sunt implicate într-o astfel de leg !tur ! în conforma #ie cis. Scheletul unei proteine poate fi privit ca secven#a leg!turilor peptidice plane "i rigide legate între ele (Figura 3.17).
Figura 3.16 Conforma#iile
trans "i cis ale leg!turii peptidice
Caracterul par #ial de dubl! leg!tur ! al unit!#ii peptidice se datore"te delocaliz!rii electronilor % în cadrul sistemului reprezentat de oxigenul carbonilic, carbonul carbonilic "i atomul de azot iminic. În consecin #!, atomii implica#i în leg!tura peptidic! împreun! cu atomii ce carbon $ ai aminoacizilor care particip ! la formarea acesteia, se g !sesc în acela"i plan. Ca urmare, m !rimile geometrice ce definesc conforma#ia scheletului catenei polipeptidice sunt unghiurile formate de leg !turile covalente simple care leag! fiecare C$ de grup!rile peptidice plane adiacente. Acestea sunt unghiurile de torsiune sau diedrale referitoare la leg!turile dintre C$ – N (unghiul &) "i C$ – C (unghiul ') corespunz!toare fiec!rui rest de aminoacid (Figura 3.18). În principiu, unghiurile & "i ' pot lua valori între -180˚ "i +180˚, astfel încât toate conforma #iile posibile ale catenei polipeptidice pot fi descrise de aceste unghiuri conforma#ionale. Prin conven#ie, conforma#ia în care &=0˚ "i '=0˚ este cea în care leg!turile peptidice consecutive sunt coplanare. Varia #iile pozitive ale unghiurilor & "i ' corespund rota #iei în jurul acelor de ceasornic. Experimentele cu peptide model au dovedit c! multe combina#ii ale unghiurilor & "i ' nu sunt posibile datorit! coliziunilor sterice dintre atomii implica #i în leg!tura peptidic!, pe de o
parte, "i ace"tia "i grup!rile laterale ale aminoacizilor, pe de alt! parte. Informa #iile de acest tip sunt furnizate de diagrama Ramachandran (Figura 3.19). Glicina, care este singurul aminoacid care nu con #ine nici un atom de carbon la nivelul catenei laterale, permite existen#a mult mai multor valori posibile pentru unghiurile & "i '. Diagrama Ramachandran referitoare la resturile de glicin ! dintr-o caten! polipeptidic! dovede"te acest plus de permisivitate. De aceea acest aminoacid se g !se"te în locurile unde catena polipeptidic! face o întoarcere în scurt.
Figura 3.17 Conforma #ia
extins! a unui lan# polipeptidic
Figura 3.18 Unghiurile
de torsiune ale fiec!rei catene polipeptidice
În schimb, prolina este aminoacidul cu cele mai multe constrângeri conforma #ionale, datorit! catenei sale laterale ciclice. 3.3.2.2 Structura secundar " a proteinelor
Structura secundar ! a unei proteine poate fi definit! drept conforma #ia local! a scheletului catenei polipeptidice.
Figura 3.19 Diagrama Ramachandran ce arat! valorile unghiurilor & "i ' permise din punct de vedere steric pentru poli-L-alanin!
Figura 3.20 Diagrama
Ramachandran pentru resturile de glicin! dintr-un lan# polipeptidic
Pauling "i Corey, doi clasici ai chimiei proteinelor, au postulat un principiu structural important, conform c !ruia, în proteine trebuie s! se formeze num !rul maxim posibil de leg !turi de hidrogen între grup !rile carbonil "i imino din cadrul leg!turilor peptidice de la nivelul catenei polipeptidice. Modelele de pliere a scheletului catenei polipeptidice sunt: helixul, structurile ( pliate, care sunt structuri repetitive "i curbele (bends, loops sau turns), care sunt structuri nerepetitive. Proteinele ce pot adopta, în solu#ie, o serie de conforma#ii au o structur ! dezordonat! (random coil). 3.3.2.2 a Helixul
Prin rotirea cu acela"i unghi în jurul fiec !rui atom de carbon $, catena polipeptidic! adopt! o conforma#ie helical!. Helixul poate fi caracterizat prin: num!rul de unit!#i de aminoacizi per tur de spir ! (n), pasul spirei (p), care este proiec #ia unui tur de spir ! complet pe axa helixului cre"terea helixului pentru fiecare rest de aminoacid (d); d=p/n Helixurile pot fi de dreapta sau de stânga, deci prezint! chiralitate. De asemenea, trebuie s ! prezinte unghiuri & "i ', care s! se g!seasc! în regiunile permisive ale diagramei Ramachandran. Structura $ helix este un aranjament rigid al catenei polipeptidice, care prezint! simultan unghiuri conforma #ionale permisive "i num!rul maxim de leg !turi de hidrogen între unit !#ile peptidice. A fost descoperit! de Pauling în 1951. În cazul polipeptidelor alc !tuite din $aminoacizi din seria steric! L, $ helixul este de dreapta "i este caracterizat de n=3,6 resturi de aminocizi per tur de spir !, p=5,4Å, d=1,5 Å "i unghiurile de torsiune &=-57˚ "i '=-47˚. Leg!turile •
•
•
de hidrogen se formeaz! între oxigenul carbonilic al aminoacidului n "i hidrogenul iminic al aminoacidului n+4, ceea ce conduce la o la o distan #! N)))O de 2,8 Å care este aproape de optimumul necesar pentru formarea leg !turii de hidrogen (2,55-2,77 Å). Între atomii implica #i în leg!tura peptidic! se stabilesc "i interac#ii van de Waals, pe lâng ! cele de hidrogen, ceea ce explic! stabilitatea remarcabil! a acestui tip de structur ! secundar !.
Figura 3.21 Exemple
de helixuri. Helixul de dreapta "i stânga sunt definite cu valori n pozitive, respectiv
negative.
Teoretic, se pot forma "i $ helixuri de stânga, dar acestea nu au fost detectate pân! acum în proteine. Catenele laterale R ale aminoacizilor sunt orientate spre exteriorul cilindrului delimitat de $ helix, pentru a evita împiedic !rile sterice rezultate în urma interac#iei cu scheletul catenei polipeptidice sau cu alte resturi. Peptidele cu cel pu#in 13 resturi de aminoacizi î "i asum! spontan, în ap !, aceast! conforma #ie. De"i diferen#a între stabilitatea termodinamic! a structurii $ helix "i cea complet nepliat!, dezordonat!, numit! random coil, este mic !, poli-L-alanina adopt! o conforma#ie helical! în solu #ii apoase. O proprietate important ! ce decurge din regularitatea acestui tip de structur ! secundar !, care se aplic! "i altora este cooperativitatea în pliere. Dup! ce s-a format un singur tur de spir !, ad!ugarea succesiv! a resturilor urm !toare de aminoacizi se face mult mai rapid. Având în vedere restric #iile sterice, unghiul & este aproximativ corect pentru fiecare rest ad !ugat, iar pentru unghiul ' se ajunge la conforma #ia corect! prin formarea leg !turii de hidrogen dintre oxigenul carbonilic "i hidrogenul dintr-o grupare imino a unei leg !turi peptidice deja fixat! într-o conforma #ie helical!. Glicina dezorganizeaz! acest tip de structur ! secundar !, probabil datorit ! entropiei crescute a lan#ului polipeptidic conferite de posibilit!#ile conforma#ionale ale unghiurilor & "i ' pentru resturile glicil. Prolina dezorganizeaz ! $ helixul, datorit! valorilor restrictive ale unghiurilor & "i ', care fac ca helixul s! se torsioneze. De regul !, resturile prolil se g!sesc la sfâr "itul helixurilor. To #i ceilal#i aminoacizi se pot integra în acest element de structur ! secundar !, putând s !-l stabilizeze sau s!-l destabilizeze. În general, aminoacizii cu catene laterale ce prezint! constante dielectrice mici, stabilizeaz! $ helixul, pentru c ! favorizeaz! formarea leg!turilor de hidrogen dintre unit !#ile peptidice.
Structura $ helix prezint! un moment de dipol, pentru c ! toate leg!turile de hidrogen sunt orientate în aceea"i direc#ie "i sunt paralele cu axa structurii. Structura $ helix este un helix 3,613, adic! con #ine 3,6 resturi de aminoacizi per tur de spir ! "i 13 atomi, inclusiv atomul de hidrogen implicat în formarea leg !turii de hidrogen (Figura 3.23). Alte structuri helicale posibile sunt: 2,2 7, 310 "i 4,416. Helixul 2,27 numit "i panglic! (ribbon) nu a fost observat în natur ! niciodat!. Helixul de dreapta 310 este mai sub#ire "i mai alungit decât cel cel $ "i a fost observat ocazional în proteine, f !când leg!tura între $ helix "i o por #iune adiacent! a catenei polipeptidice. Helixul % (4,416) a fost observat rar în proteine, la cap!tul C-terminal, "i este mai scurt "i mai lat comparativ cu $ helixul.
Figura 3.22 Structura
Figura 3.23 Modelul leg!turilor
unui $-helix de dreapta
de hidrogen în mai multe tipuri de helix
Con#inutul proteinelor în $ helix variaz! de la 0 la 100%. De exemplu, mioglobina are o astfel de structur ! secundar ! în propor #ie de 75-80%, pe când chimotripsina nu o prezint! de loc. 3.3.2.2 b Structura # pliat"
Acest element de structur ! secundar ! (numit ( pentru c! a fost descoperit dup! $ helix) este stabilizat prin leg!turi de hidrogen ce se formeaz ! între lan#uri polipeptidice învecinate. *i-n acest caz, unghiurile & "i ' se g!sesc în regiunea permisiv ! a diagramei Ramachandran "i este utilizat! capacitatea maxim! de formare a leg!turilor de hidrogen. O caten! polipeptidic! ( pliat!, este numit! caten! ( "i este aproape complet extins!. Ca urmare, distan#a axial! între aminoacizii vecini este de 3,5 Å, în contrast cu 1,5 Å pentru $ helix. În conforma #ia ( leg!turile de hidrogen se pot forma intracatenar sau între catene polipeptidice adiacente. Structura ( pliat! poate exista în dou! variante: antiparalel!, în care lan#urile polipeptidice învecinate au polaritate opus!, iar leg!turile de hidrogen formate sunt paralele paralel !, în care catenele sunt orientate în aceea"i direc#ie, iar pun#ile de hidrogen constituite sunt concurente Catenele laterale ale aminoacizilor sunt orientate de o parte "i de alta a lan#ului polipeptidic. Structura ( pliat! se prezint! ca o foaie de hârtie împ!turit! în evantai. În anumite situa #ii exist! limit!ri referitoare la tipul de aminoacizi ce pot participa la formarea ( structurii. Atunci când catenele ( sunt foarte aproape una de alta într-o protein !, cum este cazul fibroinei din m !tase "i al proteinei din pânza de p !ianjen, au un con#inut foarte ridicat de resturi de glicin! "i alanin!, care au radicalii R cei mai mici. Ace "ti aminoacizi sunt preponderen#i la nivelul unei mari p!r #i din secven#a proteic! Structura ( pliat! antiparalel! apare în proteine fibrilare de tipul fibroinei, care este o ( keratin!, produs! de viermele de m !tase. Dar se g!se"te "i în aproximativ 80% din proteinele globulare analizate pân! în prezent. În multe cazuri, întreaga protein ! con#ine numai ( structur !. La nivelul proteinelor globulare, acest motiv structural const ! din 2 pân ! la 15 catene polipeptidice (media fiind 6). Catenele ( au pân! la 15 resturi de aminoacizi, prezentând în medie 6 resturi. De exemplu, lectina concanavalina A prezint ! "ase catene ( antiparalele. Arareori se întâlne"te o structur ! ( paralel! cu mai pu#in de 5 lan#uri, ceea ce sugereaz! c! aceasta este mai pu#in stabil! de cea antiparalel! •
•
Figura 3.24 Formarea
leg!turilor de hidrogen în structuri ( pliate
Este posibil ca aceasta s! se datoreze distorsion!rii leg!turilor de hidrogen comparativ cu cele din structura paralel!. De asemenea, în unele proteine, se întâlnesc "i ( structuri mixte paralel!antiparalel!. 3.3.2.2 c Structurile nerepetitive
Structurile secundare repetitive reprezentate de $ helix "i structur ! ( pliat ! reprezint! circa jum!tate dintr-o protein! globular ! medie, restul fiind reprezentat de segmente polipeptidice nerepetitive care formeaz! o conforma#ie de bucl! (coil sau loop conformation). Totu"i, aceste structuri nu sunt mai pu #in ordonate decât cele repetitive. În proteine, por #iunile de caten! polipeptidic! cu o anumit! structur ! secundar ! repetitiv! sunt legate cu fragmente care schimb! brusc direc #ia, numite reverse turns sau ( bends (numite a"a pentru de cele mai multe ori fac leg !tura între dou ! structuri ( antiparalele), care se g!sesc în general la suprafa#a proteinelor. Acestea se mai cunosc "i sub denumirea de bucle în form ! de ac de p!r (hairpin bends).
Caracteristica esen#ial! a acestor structuri este c! sunt alc!tuite din patru aminoacizi "i c ! oxigenul carbonilic al restului de aminoacid n din prima leg !tur ! peptidic! a acestui motiv formeaz! o leg!tur ! de hidrogen cu hidrogenul iminic n+4 al celei de-a treia leg!turi peptidice (ultima). Conforma #iile acestor elemente de structur ! secundar ! variaz! în func#ie de secven#a în aminoacizi. S-a constatat c! glicina "i prolina se g !sesc frecvent în ( bends, datorit ! rolului de „balama flexibil!” a glicinei între regiuni de lan # polipeptidic, pe de o parte, "i al restric#iilor conforma #ionale impuse de prolin ! pe de alta. La ora actual!, se apreciaz! c! secven#ele care con#in prolin! contribuie la constituirea ( bends. Este probabil ca formarea acestor structuri secundare nerepetitive în stadiile ini #iale ale plierii proteinelor s! determine asamblarea cooperativ! a elementelor de ( structur !. Exist! dou! tipuri de structur ! ( bends, care difer ! prin valorile unghiurilor de torsiune: Tipul I cu :
&2=- 60˚, '2= - 30˚ &3=- 90˚, '3=0˚
Tipul II cu:
&2=- 60˚, '2= 120˚ &3= 90˚, '3=0˚
Tipul I este considerat o form ! distorsionat! de helix 310, iar tipul II prezint ! adeseori glicina în pozi#ia 3. De asemenea, în ambele tipuri de ( bends, al doilea rest de aminoacid este frecvent prolina. Aproape toate proteinele cu mai mult de 60 de resturi de aminoacizi con #in elemente curbe ce con#in 6 pân! la 16 unit!#i constitutive, numite bucle + (+ loops, pentru c! au forma literei grece"ti omega), care pot con #ine ( bends "i care constituie entit!#i globulare compacte, ale c!ror cavit!#i sunt ocupate de catenele laterale ale aminoacizilor constituen#i. Acestea se g !sesc de regul! la suprafa #a proteinelor "i probabil au rol în recunoa "terea biologic!. Multe proteine prezint! regiuni dezordonate, care pot fi reprezentate de secven #e ce con#in aminoacizi cu radical ionizat la pH fiziologic, sau de capetele N- "i C-terminale, care sunt caracterizate de posibilitatea de a se mi"ca liber în solu#ie. Adeseori, aceste segmente polipeptidice au rol func #ional, respectiv, pot lega o molecul ! specific!. Astfel, ele au o structur ! dezorganizat! în absen#a ligandului "i una organizat! în prezen#a acestuia. Aceast! flexibilitate asigur ! posibilitatea proteinei de a-"i exercita func#ia biologic!.
Figura 3.25 Tipuri
de ( bends
3.3.2.3 Structura ter !iar"
Din punct de vedere al conforma #iei spa#iale, proteinele pot fi globulare sau fibrilare. Proteinele fibrilare prezint ! secven#e repetitive sau pseudorepetitive, care sunt r !spunz!toare pentru conforma #ia lor regulat!, pe când cele globulare nu au o asemenea caracteristic! a structurii primare. O structur ! primar ! unic! determin! o structur ! tridimensional! unic! care se formeaz! prin plierea în spa #iu a unei proteine. Structura ter #iar ! a unei proteine este aranjamentul tridimensional realizat prin plierea elementelor de structur ! secundar ! "i interac#iile dintre catenele laterale ale aminoacizilor constituen#i. Unitatea constitutiv! a structurii ter #iare este reprezentat! de domeniu, care con #ine combina#ii de elemente de structur ! secundar !, este alc!tuit din circa 50-200 de resturi de aminocizi "i prezint! un diametru de aproximativ 25 Å. Domeniile sunt unit !#i independente din punct de vedere structural "i au caracteristicile unei proteine globulare mici. Proteinele de mici dimensiuni pot avea unul, dou! sau trei domenii. În schimb, titina, care este o protein! enorm! din mu"chi, de 3000 kilodaltoni, prezint ! 260 de domenii. În cele mai multe proteine, catena polipeptidic! se pliaz! pentru a forma un domeniu, dup ! care trece printr-o regiune flexibil !, de tip „balama” "i apoi se organizeaz! urm !torul domeniu. Chiar când o protein ! este alc!tuit! dintrun singur domeniu, acesta con #ine adesea doi lobi între care se g !se"te o fos!. Multe proteine, de exemplu hemoglobina, constau din subunit !#i de m!rimea domeniilor globulare ale unor proteine de dimensiuni mici. Domeniile structurale ale proteinelor sunt adeseori codificate de o singur ! secven#! codant! de ADN, adic! de un exon al unei gene de la eucariote. Domeniile de acest tip pot servi ca module mobile din punct de vedere evolutiv, care apar în noi proteine "i se multiplic! în timpul evolu#iei. Astfel, de exemplu, domenii structurale din imunoglobuline se g !sesc nu numai în
anticorpi ci "i într-o serie de proteine de suprafa #! ale celulelor. La interfa#a dintre domenii se g!sesc în principal aminoacizi nepolari, dar se formeaz! "i un num !r mic de leg!turi de hidrogen. Centrul catalitic activ al enzimelor este localizat de regul! la interfa#a dintre domenii. În timpul actului catalitic pot avea loc mi"c!ri ale domeniilor "i reorganiz!ri ale leg!turilor de hidrogen de la nivelul interfe #elor. De asemenea, situsurile de legare a unor molecule mici, de tipul nicotinamid adenin dinucleotidului (NAD +), se g!sesc între dou! domenii ale unei proteine ce prezint ! mai multe astfel de unit!#i, ceea ce înseamn! c! la acest proces particip! grup!ri ale aminoacizilor prezen#i în ambele domenii. Prin studii de difrac #ie cu raze X pe proteine cristalizate, s-a putut determina structura tridimensional! a multor proteine "i s-a observat c!, în toate acestea, apar combina#ii de elemente de structur ! secundar ! cu aranjamente geometrice specifice, care se numesc superstructuri secundare sau motive. Cele mai des întâlnite motive structurale sunt: helix-loop-helix, haipin (, (-$-(.
Figura 3.26 Variante
ale motivului helix-loop-helix
Figura 3.27 Motivul
hairpin (
Figura 3.28 Motivul ($(
În figura 3.26 sunt prezentate dou ! variante ale motivului helix-loop-helix. În acest caz, dou! segmente $ sunt legate printr-o regiune loop de lungime variabil!. Varianta (a) se întâlne"te în proteinele ce se leag! la ADN (unul din segmentele helicale interac#ioneaz! cu acidul nucleic) iar varianta (b) este asociat! cu proteinele ce leag! calciu (un cation divalent de calciu se ancoreaz! în mijlocul regiunii loop). Motivul hairpin ( prezint! dou ! catene (, legate printr-o bucl ! de lungime variabil!, care pot fi antiparalele (Figura 3.27a) sau paralele (Figurile 3.27 b "i c). Conexiunea dintre catenele ( se poate face spre dreapta (Figura 3.27 b), ceea ce se întâlne "te mai frecvent, sau spre stânga (Figura 3.27 c). Al treilea motiv, (-$-(, este constituit din dou ! catene ( paralele, legate spre dreapta cu un $ helix (Figura 3.28). În $ keratin! se întîlne"te motivul $$, în care dou! $ helixuri cu polaritate diferit ! sunt legate direct. Figura 3.21 Motivul $$ din
unele proteine
În func#ie de polaritatea lor, aminoacizii au o distribu #ie spa#ial! diferit!. Astfel, aminoacizii nepolari se g !sesc în principal în interiorul proteinelor, f !r ! s! aib! contact cu solventul apos. Totu "i, în unele cazuri, ace"tia sunt prezen#i "i la suprafa#a extern!, unde sunt aglomera #i în regiuni hidrofobe, care constituie situsuri de interac #ie cu alte proteine sau lipide de la nivelul membranelor. Cei ioniza #i la pH fiziologic se g!sesc în principal la suprafa#a proteinelor "i interac#ioneaz! cu solventul apos. Dac ! ace"tia se g!sesc în interiorul proteinei, au o func #ie bine definit!, participând, de exemplu, la cataliza enzimatic! sau la legarea unui ion metalic. În sfâr "it, aminoacizii polari dar neioniza #i la pH fiziologic se g!sesc distribui#i atât la suprafa#a proteinelor cât "i în interiorul acestora, unde particip ! la formarea leg !turilor de hidrogen cu alte grup !ri din interiorul acestora.
For!ele ce stabilizeaz " structura ter !iar "
În urma plierii în spa #iu a catenelor polipeptidice, resturile de aminoacizi aflate la distan#! mare în cadrul structurii primare, devin învecinate iar catenele lor laterale interac #ioneaz!. Tipurile de interac#ii care se pot stabili sunt: Leg "turi disulfurice, care sunt leg!turi covalente, stabilite între resturi de cistein ! apropiate în urma organiz !rii spa#iale a proteinei. Acestea stabilizeaz! structura tridimensional! a catenelor polipeptidice. Interac !ii electrostatice ce se realizeaz! prin interac#ii ionice (pun#ile saline) "i prin interac#ii dipol-dipol. Interac #iile ionice se realizeaz! între radicali ai aminoacizilor de semn contrar. Un exemplu de astfel de perechi de ioni sunt: Glu )))Lys sau Asp)))Arg. Radicalii ioniza#i ai aminoacizilor, fiind expu "i la exteriorul moleculei proteice, sunt solvata#i de moleculele de ap!. Perechile de ioni de semn contrar care se g !sesc mascate în miezul proteinelor globulare, contribuie îns! la stabilizarea structurii ter #iare, de"i contribu#ia acestor interac#ii la stabilizarea structurii tridimensionale este mic!. Interac#iile dipol-dipol, care apar în dipoli indu "i "i/sau permanen#i ai unor molecule neutre din punct de vedere electric, sunt cunoscute sub denumirea de for #e van der Waals. Datorit! faptului c! grup!rile carbonil "i imino ale leg!turilor peptidice sunt dipoli permanen #i, pe lâng! leg !turile de hidrogen, datorit! câmpurilor electrice reziduale acestea interac#ioneaz! "i prin for #e van der Waals. De asemenea, dipolii permanen#i induc un moment de dipol în grup !ri vecine, ceea ce determin! apari#ia unor for #e de atrac#ie. Aceste interac#ii sunt mult mai slabe decât cele ionice, variaz! cu r -3, astfel încât diminueaz! cu cre"terea distan#ei. De altfel, orice molecul! neutr ! din punct de vedere electric are un moment de dipol mic rezultat din mi "carea rapid! a electronilor. Acest moment de dipol tranzitoriu polarizeaz ! electronii din grup!rile învecinate generând un moment de dipol (Figura 3.29 c) care determin ! atragerea grup!rilor una de c!tre cealalt!. Acestea sunt for #e de dispersie London, care sunt extrem de slabe (energia de asociere este propor #ional! cu r -6). Num!rul mare de contacte interatomice în proteine fac ca for #ele London s ! influen#eze major conforma #ia acestora. În miezul proteic cu constant! dielectric! sc!zut!, interac#iile dipol-dipol influen #eaz! semnificativ plierea proteinelor. Figura 3.29 Interac#iile dipol-dipol. Intensitatea dipolului este reprezentat ! de grosimea s!ge#ii (a) Interac#ii dipol-dipol (b) Interac#ii dipol-dipol indus (c) For #e de dispersie London
Leg!turi de hidrogen iau na "tere între un rest cu o grupare donor slab acid! (D-H) "i un alt rest cu un atom acceptor (A), care con #ine o pereche de electroni neparticipan#i. În sistemele biologice, A poate fi C, N "i S. Leg!turile de hidrogen sunt mai puternice decât cele van der Waals, dar mai slabe decât pun#ile saline "i
leg!turile covalente. Astfel de leg!turi se pot forma între resturile Ser )))Ser, Asn)))Ser, Gln)))Cys, etc. În proteine, multe leg!turi de hidrogen sunt membre ale unei re #ele în care fiecare donor formeaz! aceste leg!turi cu acceptori multipli "i fiecare acceptor formeaz! leg !turi de hidrogen cu mai mul#i donori. Leg !turile de hidrogen interne din proteine se formeaz ! astfel încât ia na "tere num!rul lor maxim posibil. În solven #i apo"i, proteinele complet nepliate formeaz! leg!turi de hidrogen cu moleculele de ap!. Leg!turile de hidrogen interne constituie o baz! structural! pentru plierea catenelor polipeptidice. For #ele hidrofobe sunt cele ce determin! substan#ele nepolare s! î "i minimizeze contactul cu apa "i moleculele amfipatice (cu o parte polar ! "i una apolar !) s! formeze micele în solu #ii apoase. Datorit! faptului c! proteinele formeaz! un fel de micele intramoleculare, în care catenele laterale ale aminoacizilor nepolari sunt departe de contactul cu moleculele de ap !, interac#iile hidrofobe sunt importante pentru structura proteinelor. De"i aceste for #e sunt mai slabe "i decât for #ele van der Waals, în ansamblurile moleculare care implic! un num!r mare de contacte nepolare, ele constituie o real ! for #! "i influen#eaz! major plierea proteinelor în conforma #ia nativ!.
Figura 3.30
Tipuri de interac#ii care stabilizeaz! structura tridimensional! a proteinelor
În interiorul moleculelor proteice, catenele laterale ale aminoacizilor sunt împachetate foarte strâns. Eventualele fose existente sunt umplute cu molecule de ap !. Densitatea de împachetare (raportul dintre volumul înveli "urilor van der Waals ale atomilor dintr-o regiune "i volumul total al regiunii) în interiorul proteinelor globulare este de aproximativ 0,75. Aceast ! valoare este de acela"i ordin de m!rime cu cea corespunz!toare cristalelor moleculare formate de molecule organice mici. De aceea s-a tras concluzia c ! interiorul unei proteine este asem !n!tor cu un cristal molecular, bine împachetat. Totu "i, regiunile cu multe leg !turi de hidrogen sunt împachetate mai lax. 3.3.2.4 Structura cuaternar " a proteinelor
De"i multe proteine globulare func #ioneaz! ca monomeri, în sistemele biologice exist! un num!r imens de exemple de ansambluri proteice complexe. Structura cuaternar ! a proteinelor reprezint ! asocierea ordonat! a subunit!#ilor globulare pentru a forma un agregat func #ional. Aceasta implic! dou! tipuri de ansambluri proteice: Primul tip, în care subunit !#ile sunt, din punct de vedere structural, foarte diferite, iar organizarea lor spa#ial! depinde de natura specific ! a interac#iilor dintre subunit !#ile diferite. În general, aceste ansambluri prezint ! forme geometrice foarte neregulate. Al doilea tip, în care agregatele moleculare sunt alc !tuite din copii multiple ale unuia sau mai multor tipuri de subunit!#i diferite. Datorit! recuren#ei interac#iilor structurale specifice dintre subunit!#i, asemenea agregate formeaz!, în general, aranjamente regulate din punct de vedere geometric. Proteinele alc!tuite din subunit!#i identice se numesc oligomere, iar subunit !#ile respective se numesc protomeri. Un protomer poate fi constituit dintr-un singur lan # polipeptidic sau din mai multe lan#uri diferite. Astfel, hemoglobina, care este alc !tuit! din dou! catene polipeptidice de $-globin! "i dou! de (-globin! ($2(2), poate fi considerat ! un dimer alc!tuit din doi protomeri $(. Leg!turile care se stabilesc între subunit!#ile dintre ambele tipuri de ansambluri proteice sunt: hidrofobe, de hidrogen "i uneori sub form ! de pun#i disulfurice. Având în vedere c ! proteinele sunt compu "i fundamental asimetrici (pentru c ! sunt alc!tuite numai din L-aminoacizi), este evident c ! cel mai simplu model de structur ! cuaternar ! este formarea agregatelor liniare (Figura 3.31 a, b). Formarea unor asemenea agregate se realizeaz! în urma repeti #iei unui singur tip de interac #ie structural! specific! dintre unit!#ile identice, adiacente ale ansamblului. O alt! modalitate de aranjare pentru acest nivel de organizare a proteinelor este simetria ciclic! sau rota#ional!. În urma asocierii subunit !#ilor rezult! structuri plate (3.32 a-e) sau poliedral ! (3.32 f, g). Moleculele simetrice cu structur ! plat! sunt de regul! dimeri sau trimeri. Agregatele mai mari, sunt în general poliedrice, ceea ce dovede "te existen#a mai multor tipuri de interac#ii intermoleculare între subunit!#ile. De asemenea, acestea încorporeaz! un num!r fix de copii ale unei subunit!#i, spre deosebire de agregatele liniare "i cu simetrie helical!.
Figura 3.31 Agregate
proteice cu structur ! cuaternar ! liniar ! sau helical!
De asemenea, destul de frecvent, se observ! "i aranjamente helicale ale subunit!#ilor moleculare identice (Figura 3.31 c, d). Agregatele moleculare helicale sunt, în general, asociate cu structurile ce au proprietatea de autoasamblare "i se întâlnesc în înveli"ul proteic al virusurilor filamentoase, unde formeaz ! un container cilindric în care este ad! postit acidul nucleic viral (Figura 3.32). Datorit ! faptului c! înveli"ul este rezultatul interac#iei a numeroase copii ale aceleia"i proteine, acest aranjament reprezint! o utilizare foarte eficient! a informa#iei con#inute în acidul nucleic viral (Figura 3.33). Structurile cuaternare helicale "i poliedriece joac! un rol central în autoasamblarea structurilor biologice de dimensiuni foarte mari pornind de la subunit!#i identice. Stabilizarea acestora se realizeaz! atunci când toate subunit !#ile interac#ioneaz! în mod similar din punct de vedere geometric, precum ionii într-un cristal de sare. Interac#iile din cadrul structurii cuaternare nu sunt simetrice sau echivalente chiar dac ! au loc între subunit!#i identice. Cel mai simplu tip de neechivalen #! se înregistreaz! la unele contacte între dimeri, unde catenele laterale ale unor aminoacizi individuali situate în apropierea axei de simetrie sunt for #ate s! adopte pozi#ii diferite pentru a evita unele suprapuneri sterice. Formarea agregatelor din subunit !#i are consecin#e func#ionale foarte importante. Interac #iile de la nivelul suprafe#elor de contact permit o modalitate de comunicare între subunit !#ile individuale. Evenimentul produs atunci când o subunitate din agregat interac #ioneaz! cu un ligand sau un substrat se propag! "i la nivelul celorlalte subunit!#i. Asemenea interac#ii constituie baza fenomenului de cooperativitate în sistemele biochimice "i permit o serie de mecanisme de control pentru reglarea proceselor biochimice.
Figura 3.32 Tipuri
de structuri cuaternare cu simetrie rota#ional! "i poliedric!
Figura 3.33 Structura
nucleocapsidei virusului mozaicului tutunului
3.3.2.5 Corela !ii între structura primar " $i conforma!ia unei proteine
Structurile secundar ! "i ter #iar ! sunt determinate de structura primar !, ceea ce este o confirmare a faptului c ! conforma#ia pliat! nativ! este structura cea mai stabil ! ce se poate forma. Pornind de la aceasta, teoretic este posibil s! se realizeze anticiparea structurii proteinei porninduse de la secven#a de aminoacizi. Practic, acest tip de predic #ie, r !mâne un deziderat înc ! greu de atins. La ora actual!, având în vedere c! un num!r mare de proteine con #in un num !r mic de tipuri de domenii, este posibil s ! se prezic! structura unora, folosind informa#iile acumulate din studiile de difrac#ie cu raze X ale proteinelor înrudite. În acest moment este clar c! unii aminoacizi tind s ! formeze structuri secundare de un anumit tip. Analizând figura 3.34 se observ! c! acidul glutamic, metionina "i alanina par s! fie cei mai importan#i formatori de $ helix, pe când valina, izoleucina "i tirozina tind s ! formeze structuri
( pliate. De asemenea, prolina, glicina, asparagina , acidul aspartic "i serina se g !sesc cel mai
frecvent în conforma #ia ( turns, care permite o schimbare în scurt a direc#iei catenei polipeptidice.
Probabilitatea relativ! a unui aminoacid de a se g!si într-un anumit element de structur ! secundar ! Figura 3.34
În 1956, Christian Anfinsen a efectuat un experiment, devenit clasic, care a dovedit existen#a rela#iei dintre secven#a de aminoacizi "i conforma#ia ribonucleazei bovine, protein!, cu activitate enzimatic!, alc!tuit! dintr-o singur ! caten! polipeptidic! format! din 124 resturi de aminoacizi, care con#ine "i patru leg!turi disulfurice. Prin tratarea acesteia cu ( mercaptoetanol, agent de scindare a leg!turilor disulfurice, solu #ie de uree 8M, care depliaz! proteina, la pH=8, s-a ob#inut o structur ! complet dezorganizat! (conforma #ia random coil), care nu mai prezint ! activitate enzimatic!.
Figura 3.35 Reducerea "i
denaturarea ribonucleazei
Enzima denaturat! în urma acestui tratament, "i-a rec! p!tat activitatea prin îndep!rtarea ( mercaptoetanolului "i ureei prin dializ!. Anfinsen a dedus c ! grup!rile sulfhidril ale enzimei denaturate sunt reoxidate în prezen #a aerului iar enzima se repliaz! spontan în forma activ ! din punct de vedere catalitic. Acest experiment a dovedit c! informa#ia con#inut! în secven#a de aminoacizi determin! structura tridimensional! complex! a ribonucleazei. Figura 3.36 Formarea
ribonucleazei native în prezen#! de urme de (-mercaptoetanol
Dac ! reoxidarea ribonucleazei reduse s-a realizat în prezen#! de uree 8M, dup ! care ulterior, agentul denaturant a fost îndep !rtat, refacerea activit!#ii a fost în jur de 1%. Motivul este c!, în acest caz, refacerea pun #ilor disulfurice s-a f !cut gre"it. Conforma#ia acestei forme enzimatice prezint! o energie liber ! mare. În prezen#a unor urme de ( mercaptoetanol în solu#ie, aceast! form! trece în una complet activ!, pentru c! agentul de reducere catalizeaz! reformarea pun#ilor disulfurice pân ! când este reconstituit! enzima nativ!. Conforma#ia nativ! este caracterizat! de cea mai mic! energie liber !, deci are cea mai mare stabilitate comparativ cu forma cu leg!turi disulfurice gre "it formate.
Proteinele globulare
Proteinele globulare se prezint! ca molecule sferice compacte "i îndeplinesc roluri de enzime, proteine transportoare sau receptori. Mioglobina
Mioglobina este o protein ! muscular ! care fixeaz! O 2. Este alc!tuit! dintr-un singur lan # polipeptidic, care con#ine 153 de aminoacizi "i are o mas! molecular ! de aproximativ 17 kDa "i o grupare prostetic!, reprezentat! de hem. În 1957, Kendrew a determinat structura tridimensional ! a mioglobinei din mu"chi scheletic de ca"alot , care este stabil !, "i serve"te ca rezerv! de oxigen în timpul scufund !rii. Aceast! protein! are o structur ! compact!, cu un procent de $-helix de aproximativ 75%. Cele opt segmente helicale, de dreapta, au fost denumite de la A la H. Primul rest de aminoacid în helixul A este desemnat A 1, al doilea A2, etc. Între helixuri exist! cinci segmente nehelicale, (numite AB, CD, etc., dac ! sunt localizate între helixurile A "i B, respectiv între C "i D).
Figura 3.46 .
Modelul tridimensional al mioglobinei
Leg!turile peptidice sunt plane, iar grup !rile carbonil "i imino sunt în conforma #ie trans.
Interiorul moleculei const! aproape în totalitate din resturi de aminoacizi nepolari: leucin!, valin!, metionin! "i fenilalanin!, iar treonina, tirozina "i triptofanul, care prezint! o parte polar ! "i una apolar ! sunt orienta #i astfel încât por #iunea polar ! protubereaz! spre interior. Unicele dou! resturi de aminoacizi polari din miezul hidrofob sunt reprezentate de histidin!, care au rol în legarea hemului. Hemul este format dintr-un derivat porfirinic "i un ion Fe (II). Derivatul porfirinic care se g!se"te în hemoglobin!, ca "i în mioglobin! este protoporfirina IX, care con #ine patru inele pirolice (notate de la A la D) legate prin pun#i metinice, substituite cu patru grup !ri metil, dou! grup!ri vinil "i dou! propionat. Gruparea hem este situat! într-o adâncitur ! în molecula de mioglobin!. Patru situsuri de coordinare sunt ocupate cu electronii atomilor de azot pirolic.
Figura 3.47 Structura
hemului
Situsurile 5 "i 6 sunt situate de o parte "i de alta a planului inelului protoporfirinic. Ionul de Fe (II) este legat de unul din resturile de histidin !, restul F8 (histidina proximal !), care ocup! a cincea pozi#ie de coordinare a ionului, iar în a "asea pozi#ie se g!se"te molecula de oxigen. Cel !lalt rest de histidin !, E7 (histidina distal !), se g !se"te între molecula de hem, dar nu este legat ! de aceasta.
Figura 3.48 Modelul
situsului de legare a mioglobinei, care prezint! gruparea hem, histidina proximal! (F8) "i distal!
(E7).
Mioglobina se poate g !si sub form ! de deoxihemoglobin! "i oxihemoglobin!, care prezint ! a "asea pozi#ie de coordinare a ionului divalent de fier liber !, respectiv ocupat! de O2 sau sub form ! de ferimioglobin!, care con#ine ionul Fe (III), în care aceast ! pozi#ie este ocupat! de o molecul! de ap!. Apoproteina din mioglobin !, mic"oreaz! susceptibilitatea ionului Fe (II) din hem la oxidare. Hemoglobina
Hemoglobina este o protein ! cu rol de transportor al oxigenului molecular de la pl !mân la #esuturile periferice.a fost prima protein ! a c!rei mas! molecular ! a fost determinat ! cu acurate#e. De asemenea este una din primele proteine a c!rei structur ! tridimensional! a fost determinat ! de c!tre Max Peruz. Este un tetramer $2%2 (sau un dimer alc !tuit din protomerii $%). Subunit!#ile $ "i % sunt înrudite între ele din punct de vedere structural "i evolutiv "i cu mioglobina. Hemoglobina transport! oxigenul molecular de la pl!mâni, branhii "i piele la capilarele din #esuturi. Animalele foarte mici nu prezint ! aceast! protein!, pentru c! respira#ia se face prin difuzia pasiv! a oxigenului. Începând de la anelide apare sistemul circulator "i deci necesitatea unui transportor de oxigen, care poate fi hemoglobina, hemocianina sau hemeritrina. Hemocianina este o hemoprotein ! care con#ine cupru "i care este albastr ! în prezen#a oxigenului "i incolor ! în absen#a acestei interac#ii iar hemeritrina este o protein ! cu fier dar f !r ! hem. Pe"tii din Antarctica au sângele incolor "i sunt unicele vertebrate adulte f !r ! hemoglobin!, pentru c! au un metabolism diminuat, iar solubilitatea oxigenului la temperatura de -1,9˚C este foarte mare. Cele patru subunit!#i ale hemoglobinei leag! necovalent câte o grupare hem. Hemul este responsabil pentru culoarea ro "ie a hemoglobinei, citocromilor "i catalazei. Oxigenarea modific! starea electronic! a complexului Hem-Fe(II), a "a cum se observ ! din schimbarea de culoare de la ro"u închis a sângelui venos la ro "u deschis a sângelui arterial. CO, NO "i H2S pot coordina a "asea pozi#ie de ligand a ionului Fe(II) cu o mai mare afinitate decât oxigenul molecular. Fe(II) poate fi oxidat la Fe(III), cu formare de methemoglobin !, care nu leag ! oxigenul molecular. Molecula de hemoglobin! este aproape sferic!, cu un diametru de 55 Å, cele patru subunit!#i fiind aranjate tetraedric. Grup !rile hem sunt situate în adânciturile aflate la exteriorul catenelor polipeptidice, câte una pentru fiecare subunitate.
Figura 3.49 Figura
Hem-Fe(II) (feroprotoporfirina IX). Ionul de fier divalent este hexacoordinat, patru situsuri fiind ocupate cu electroni neparticipan #i ai atomilor de azot pirolic, al cincilea fiind coordinat de electronii neparticipan#i ai unui atom de azot imidazolic dintr-un rest de histidin! din lan#ul globinic iar al "aselea de o molecul! de oxigen
Figura 3.50 Structura
deoxihemoglobinei (a) "i oxihemoglobinei (b)
Catena $ con #ine 141 iar catena %, 146 resturi de aminoacizi. Structurile ter #iare ale celor dou! lan#uri "i a mioglobinei sunt similare, de "i doar 18% din resturile de aminoacizi sunt identice în cazul celor trei proteine. Concluzia ce se poate trage este c ! secven#e de aminoacizi diferite pot genera structuri tridimensionale similare. La ora actual! este cunoscut! secven#a în aminoacizi a peste 60 de specii, iar în urma analizei acesteia s-a constatat c! o variabilitate semnificativ! a multor pozi#ii, cu excep#ia a 9 aminoacizi care sunt conserva#i în majoritatea speciilor "i au rol important pentru func #ionarea moleculei de hemoglobin!. Lan#urile polipeptidice ale hemoglobinei sunt aranjate astfel încât interac #iile semnificative au loc între subunit!#ile neidentice. Astfel, interac #ia $1%2 (respectiv $2%1) implic! 19 de resturi de aminoacizi, pe când la interfa#ele $1%1 respectiv $2%2 interac#ioneaz! 35 de resturi. Natura interac #iilor este predominant hidrofob !, dar exist! "i leg!turi de hidrogen "i ionice. În schimb, interac#iile $1-$2 "i %1-%2 sunt pu#ine "i au caracter polar. Oxigenarea determin! modific!ri importante de structur ! cuaternar ! a hemoglobinei, astfel c! oxi- "i deoxihemoglobina (proteina care are a "asea pozi#ie de coordinare a Fe (II) ocupat! de o molecul! de ap!, în loc de oxigen molecular) prezint! forme cristaline diferite.
Oxigenarea determin! rota#ia dimerului $1%1 cu 15˚ fa#! de dimerul $2%2. Molecula oxigenat! este mai compact!, astfel încât distan#a între ionii de Fe (II) din lan #urile % scade de la 40 (cât este în molecula de deoxihemoglobin!) la 33 Å. În oxihemoglobin!, resturile C-terminale ale celor patru lan#uri polipeptidice prezint! o libertate de rota#ie aproape complet!, pe când în deoxihemoglobin!, aceste grup!ri terminale sunt legate între ele. Grup !rile carboxil terminale "i catenele laterale ale resturilor C-terminale particip ! la interac#ii electrostatice care rigidizeaz! tetramerul. În consecin #!, structura cuaternar ! a deoxihemoglobinei este denumit! T (tensionat !) iar cea a oxihemoglobinei R (relaxat !) (Figura 3.50). Legarea O 2 la deoxihemoglobin ! modific! structura cuaternar ! a moleculei prin faptul c! determin! mi"carea în planul porfirinei. Atunci când Fe2+ se mi"c! în planul hemului, antreneaz ! în mi"care "i restul de His, ceea ce determin! modific!ri conforma #ionale la nivelul interfe#ei subunit!#ilor. Acest fapt determin ! trecerea T&R. Deci o modificare structural! la nivelul unei subunit!#i este transmis! la nivelul interfe#ei dintre subunit!#i. Legarea oxigenului la o molecul ! de hem este comunicat! la nivelul unor p!r #i din molecula de hemoglobin! aflate la distan#e mai mari. Hemoglobina nu transport! numai oxigenul molecular ci "i H+ "i CO2. Propriet!#ile de legare a oxigenului sunt reglate prin interac #ii dintre situsuri separate neadiacente. Hemoglobina este o protein ! alosteric!, în timp ce mioglobina nu este. Aceast ! diferen#! se manifest! în trei moduri: 1) Legarea oxigenului molecular la hemoglobin! favorizeaz! legarea unei alte molecule de oxigen la aceea"i molecul! de hemoglobin!. Cu alte cuvinte, oxigenul se leag! cooperativ la hemoglobin !, situa#ie care nu se întîlne"te în cazul mioglobinei 2) Afinitatea hemoglobinei pentru oxigen depinde de pH, în timp ce în cazul mioglobinei, acest parametru este independent de pH. Molecula de CO 2 afecteaz! + "i ea caracteristicile de legare a oxigenului de c !tre hemoglobin!. Atât H cât "i CO 2 favorizeaz! eliberarea O2 legat "i reciproc, O2 determin! eliberarea H+ "i CO2 lega#i. 3) Afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei este reglat ! de 2,3 bifosfoglicerat. Ca urmare hemoglobina prezint ! o afinitate mai sc!zut! pentru oxigen decât mioglobina. Dac ! se reprezint! grafic satura#ia Y (frac#ia de situsuri de legare a oxigenului ocupate) în func#ie de presiunea par #ial! a oxigenului, pO2 se ob#ine a"a numita curb! de disociere a oxigenului
Figura 3.51 .Curbele de mioglobin ! "i hemoglobin!
disociere a oxigenului pentru
Analizînd Figura 3.51 se observ! c!, la orice valoare a presiunii par #iale a oxigenului,
mioglobina prezint! o satura#ie în oxigen mai mare decât hemoglobina, ceea ce înseamn! c! mioglobina are o afinitate pentru oxigen mai mare decât hemoglobina. Curba de disociere a mioglobinei este hiperbolic !, pe când cea pentru hemoglobin ! are caracter sigmoid, ceea ce arat! c! legarea O2 la hemoglobin ! este cooperativ!, "i în consecin#!, moleculele de hem din aceea"i molecul! de hemoglobin! comunic! între ele. În condi#ii fiziologice, sc!derea pH determin! sc !derea afinit!#ii hemoglobinei pentru O 2 (Figura 3.52). De asemenea, cre "terea concentra#iei de CO2 scade afinitatea pentru oxigen.
Figura 3.52
Efectul pH asupra afinit!#ii hemoglobinei pentru oxigen
În contrac#ia muscular ! se formeaz! CO2 "i H+ "i de aceea, în capilarele din mu"chi oxihemoglobina elibereaz! O2. Astfel, se realizeaz! nivelul ridicat de O 2 necesar pentru producerea de energie în #esuturile active din punct de vedere metabolic. Acest efect a fost descoperit de Christian Bohr în 1904. Efectul invers a fost observat de Haldane, în 1914, la nivelul capilarelor alveolare din pl !mân, unde, la concentra#ia mare de O2, hemoglobina elibereaz! CO2 "i H+ "i fixeaz! O2. Rela#ia dintre legarea O2, CO 2 "i H+ se nume"te efect Bohr. Afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei din hematii este mai mic ! decât a hemoglobinei în solu#ie. Acest fapt se datoreaz ! prezen#ei 2,3-bifosfogliceratului, care este un compus intermediar în glicoliz!, în hematii la concentra #ie aproximativ egal! cu cea a hemoglobinei. Acest metabolit scade afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei de 26 ori, ceea ce permite proteinei s ! cedeze oxigen la nivelul capilarelor din #esuturile periferice. Hemoglobina fetal! sau hemoglobina F ( $2'2) manifest! o afinitate pentru oxigen mai mare în condi#ii fiziologice decât hemoglobina A ($2%2), ceea ce optimizeaz! transferul oxigenului din circula #ia matern! în cea fetal!. Hemoglobina F leag! 2, 3-bifosfogliceratul mai slab decât hemoglobina A "i de aceea are o afinitate mai mare pentru oxigen. S-a constatat c! doar o molecul! de 2, 3-bifosfoglicerat se leag ! la deoxihemoglobin !, ceea ce a sugerat c! acest compus fosforilat se leag! în cavitatea central! situat! pe axa de simetrie a moleculei proteice, unde cele patru subunit!#i devin foarte apropiate. Studii ulterioare de difrac#ie cu raze X au confirmat presupunerea ini#ial!.
Figura 3.53 Structura
2,3-bifosfogliceratului Figura 3.54 Efectul
2,3 bifosfogliceratului asupra curbei de disociere a oxigenului în hemoglobin!
Situsul de legare al 2,3-bifosfogliceratului este constituit din resturi de aminoacizi înc!rca#i pozitiv de pe fiecare lan # % "i anume: gruparea $-amino, His 2, Lys 82 "i His 143. Acestea interac#ioneaz! electrostatic cu molecula puternic negativ! la pH fiziologic a 2, 3 bifosfogliceratului. În oxihemoglobin !, cavitatea central! devine prea mic ! pentru acest compus polianionic. Practic, 2, 3-bifosfogliceratul stabilizeaz ! structura cuaternar ! a deoxihemoglobinei prin legarea încruci"at! a lan#urilor %, deci deplaseaz! echilibrul spre forma T. Prin acest mecanism scade afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei. De asemenea, CO2 diminueaz! afinitatea hemoglobinei pentru oxigen. Acesta este transportat de hemoglobin! sub form ! de carbamat, datorit! faptului c! grupare $-amino neionizat! a hemoglobinei poate reac #iona reversibil cu CO2, iar anionii carbamat formeaz! pun #i saline care stabilizeaz! forma T.
În leg!tur ! cu mecanismul alosteric s-au formulat dou ! modele: Modelul secven#ial al lui Koshland Modelul simetric, propus de Monod, Wyman, Changeux Modelul lui Koshland se bazeaz! pe trei presupuneri, "i anume: 1) Pentru fiecare subunitate sunt accesibile dou! st!ri conforma #ionale T "i R 2) Tranzi#ia T&R la nivelul unei subunit !#i este indus! de legarea ligandului la o anumit! subunitate 3) Modific!rile conforma#ionale rezultate în urma leg!rii ligandului la o subunitate pot cre "te sau descre"te afinitatea altor subunit!#i din aceea"i molecul! pentru acesta •
•
Figura 3.55.
Modelul secven#ial pentru o protein! alosteric! tetrameric!
Modelul simetric se bazeaz! pe urm !toarele ipoteze: 1) Proteina nu poate avea decât dou ! st!ri conforma #ionale R "i T. Toate subunit!#ile pot exista numai în forma T sau numai în forma R. Hibrizi de tip RT nu sunt posibili. 2) Ligandul se leag! cu afinitate sc !zut! la forma T "i cu afinitate ridicat! la forma R. 3) Legarea fiec!rui ligand cre "te probabilitatea ca toate subunit!#ile s! fie în form ! R. Aceast! tranzi#ie alosteric! este concertat!,
Figura 3.56.
Modelul simetric pentru o protein! alosteric! tetramer !
