BAB I PENDAHULUAN
Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena portein berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh, zat pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur unsur-unsur C, H O sama seperti karbohidrat dan lemak. Namun selain ketiga unsur-unsur tersebut protein juga mengandung N, fosfor, belerang dan juga unsur-unsur logam lainnya. Struktur protein dapat dibagi menjadi empat bentuk antara lain primer, sekunder, tersier dan juga kwartener.Struktur primer merupakan srtuktur linier asam amino dalam protein. Susunan tersebut akan menentukan sifat dasar protein dan bentuk struktur berikutnya. Dalam struktur protein terdapat ikatan-ikatan yang mempengaruhi kestabilan struktur tersebut. Ikatan-ikatan ini menyebabkan terjadinya interaksi antar molekul dalam protein dan mempengaruhi sifat protein. Protein dapat berinterkasi dengan protein lain karena adanya ikatan hidrogen dan perubahan gugus sulfuhidril dan disulfida. Interaksi molekuler tersebut membentuk suatu jaringan tiga dimensi yang mengakibatkan tekstur protein menjadi kompak, dan dengan struktur tiga dimensi tersebut maka protein dapat memerangkap sejumlah air. Dengan terperangkapanya air dapat terjadi peristiwa gelasi protein yang dibantu dengan adanya denaturasi parsial terlebih dahulu. Suatu protein dapat dikatakan terdenaturasi apabila susunan ruang atau rantai polipeptida suatu molekul protein mengalami perubahan. Sebagian Sebagian besar protein globuler globuler mudah mengalami denaturasi. Jika ikatanikatan yang membentuk konfigurasi molekul tersebut rusak, maka molekul tersebut akan mengembang. Ada dua macam denaturasi, yaitu pengembangan rantai peptida dan pemecahan protein menjadi unit yang lebih kecil tanpa disertai pengembangan pengembangan molekul. Terjadinya kedua jenis denaturasi ini tergantung pada keadaan molekul. Ikatan-ikatan yang mempengaruhi denaturasi protein antara lain ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik, ikatan ionik antar gugus yang bermuatan positif dan negatif serta ikatan intramolekuler. Denaturasi dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tersier, dan kwartener terhadap molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Oleh sebab itu, denaturasi dapat pula diartikan sebagi suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan molekul. Pemekaran atau pengembangan molekul protein yang 1
terdenaturasi aka membuka gugus reaktif yang ada pada rantai polipeptida. Selanjutnya kan terjadi pengikatan kembali pada gugus reaktif yang sama atau yang berdekatan. Bila unit ikatan yang terbentuk cukup banyak sehingga protein tidak lagi terdispersi sebagai suatu koloid, maka protein tersebut akan mengalami koagulasi. Apabila ikatan-ikatan antara gugus-gugus reaktif protein tersebut menahan selruh cairan, maka akan terbentuklah gel. Sedangkan bila cairan terpisah dari protein yang terkoagulasi itu, maka protein akan mengendap. Dari hasil rumusan di atas, maka praktikum ini dilaksanakan bertujuan untuk mengetahui bagaimana pegaruh faktor-faktor dari panas, enzim maupun kation divalen terhadap proses gelasi protein.
2
BAB II PENGERTIAN PROTEIN
Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus. Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh, karena zat ini disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof). Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jöns Jakob Berzelius pada tahun 1838. Biosintesis protein alami sama dengan ekspresi genetik. Kode genetik yang dibawa DNA ditranskripsi menjadi RNA, yang berperan sebagai cetakan bagi translasi yang dilakukan ribosom. Sampai tahap ini, protein masih "mentah", hanya tersusun dari asam amino proteinogenik. Melalui mekanisme pascatranslasi, terbentuklah protein yang memiliki fungsi penuh secara biologi.
3
BAB III STRUKTUR KIMIA
Protein adalah molekul makro yang mempunyai berat molekul antara lima ribu sampai beberapa juta. Protein terdiri atas rantai-rantai panjang asam amino, yang terikat satu sama lain dalam ikatan peptida. Asam amino terdiri atas unsur-unsur karbon, hidrogen, oksigen dan nitrogen; beberapa asam amino di samping itu mengandung unsur-unsur fosfor, besi, iodium, dan kobalt. Unsur nitrogen merupakan 16% dari berat protein. Terdapat dua puluh jenis asam amino yang diketahui sampai sekarang yang terdiri atas sembilan asam amino esensial (asam amino yang tidak dapat dibuat tubuh dan harus didatangkan dari makanan) dan sebelas asam amino nonesensial. Asam amino terdiri atas atom karbon yang terikat pada satu gugus karboksil (- COOH), satu gugus amino (- NH2), satu atom hidrogen (- H) dan satu gugus radikal (- R) atau rantai cabang. t.a.atom karbon yang terikat pada satu gugus karboksil (-COOH), satu gugus amino (- NH2), satu atom hidrogen (- H) dan satu gugus radikal (- R) atau rantai cabang.
Protein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai macam struktur yang khas pada masing-masing protein. Karena protein disusun oleh asam amino yang berbeda secara kimiawinya, maka suatu protein akan terangkai melalui ikatan peptida dan bahkan terkadang dihubungkan oleh ikatan sulfida. Selanjutnya protein bisa mengalami pelipatan-pelipatan membentuk struktur yang bermacam4
macam. Adapun struktur protein meliputi struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier, dan struktur kuartener (Gambar 2).
Gambar 3. Reaksi pembentukan peptida melalui reaksi dehidrasi (Voet & Judith, 2009).
Gambar 4. Struktur primer dari protein (Campbell et al., 2009).
Struktur primer merupakan struktur yang sederhana dengan urutan-urutan asam
amino yang tersusun secara linear yang mirip seperti tatanan huruf dalam sebuah kata dan tidak terjadi percabangan rantai (Gambar 4). Struktur primer terbentuk melalui
5
ikatan antara gugus α–amino dengan gugus α– karboksil (Gambar 3). Ikatan tersebut
dinamakan ikatan peptida atau ikatan amida (Berg et al., 2006; Lodish et al., 2003). Struktur ini dapat menentukan urutan suatu asam amino dari suatu polipeptida (Voet & Judith, 2009). Struktur
sekunder merupakan
kombinasi antara struktur primer yang
linear distabilkan oleh ikatan hidrogen antara gugus =CO dan =NH di sepanjang tulang belakang polipeptida. Salah satu contoh struktur sekunder adalah α -heliks dan β-pleated (Gambar 5 dan 6). Struktur ini memiliki segmen-segmen dalam
polipeptida yang terlilit atau terlipat secara berulang. (Campbell et al ., 2009; Conn, 2008).
Gambar 5. Struktur sekunder α-heliks (Murray et al , 2009).
Gambar 6. Struktur sekunder β -pleated (Campbell et al ., 2009).
6
Struktur α-heliks terbentuk antara masing-masing atom oksigen karbonil pada
suatu ikatan peptida dengan hidrogen yang melekat ke gugus amida pada suatu ikatan peptida empat residu asam amino di sepanjang rantai polipeptida (Murray et al , 2009). Pada struktur sekunder β -pleated terbentuk melalui ikatan hidrogen antara daerah linear rantai polipeptida. β-pleated ditemukan dua macam bentuk, yakni antipararel
dan pararel (Gambar 7 dan 8). Keduanya berbeda dalam hal pola ikatan hidrogennya. Pada bentuk konformasi antipararel memiliki konformasi ikatan sebesar 7 Å, sementara konformasi pada bentuk pararel lebih pendek yaitu 6,5 Å (Lehninger et al , 2004). Jika ikatan hidrogen ini dapat terbentuk antara dua rantai polipeptida yang terpisah atau antara dua daerah pada sebuah rantai tunggal yang melipat sendiri yang melibatkan empat struktur asam amino, maka dikenal dengan istilah β turn yang
ditunjukkan dalam Gambar 9 (Murray et al , 2009).
Gambar 7. Bentuk konformasi antipararel (Berg, 2006).
Gambar 8. Bentuk konformasi pararel (Berg, 2006).
7
Gambar 9. Bentuk konformasi β turn yang melibatkan empat residu asam amino
(Lehninger et al., 2004). Struktur tersier dari suatu protein adalah lapisan yang tumpang tindih di atas
pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak beraturan dari ikatan antara rantai samping (gugus R) berbagai asam amino (Gambar 10). Struktur ini merupakan konformasi tiga dimensi yang mengacu pada hubungan spasial antar struktur sekunder. Struktur ini distabilkan oleh empat macam ikatan, yakni ikatan hidrogen, ikatan ionik, ikatan kovalen, dan ikatan hidrofobik. Dalam struktur ini, ikatan hidrofobik sangat penting bagi protein. Asam amino yang memiliki sifat hidrofobik akan berikatan di bagian dalam protein globuler yang tidak berikatan dengan air, sementara asam amino yang bersifat hodrofilik secara umum akan berada di sisi permukaan luar yang berikatan dengan air di sekelilingnya (Murray et al , 2009; Lehninger et al , 2004).
8
Gambar 10. Bentuk struktur tersier dari protein denitrificans cytochrome C550
pada bakteri Paracoccus denitrificans (Timkovich and Dickerson, 1976). Struktur kuarterner adalah gambaran dari pengaturan sub-unit atau promoter
protein dalam ruang. Struktur ini memiliki dua atau lebih dari sub-unit protein dengan struktur tersier yang akan membentuk protein kompleks yang fungsional. ikatan yang berperan dalam struktur ini adalah ikatan nonkovalen, yakni interaksi elektrostatis, hidrogen, dan hidrofobik. Protein dengan struktur kuarterner sering disebut juga dengan protein multimerik. Jika protein yang tersusun dari dua sub-unit disebut dengan protein dimerik dan jika tersusun dari empat sub-unit disebut dengan protein tetramerik (Gambar 11) (Lodish et al ., 2003; Murray et al , 2009).
Gambar 11. Beberapa contoh bentuk struktur kuartener.
9
BAB IV PRINSIP ANALISIS
Analisis berasal dari kata “analusis” dari bahasa Yunani. Istilah tersebut kemudian
diserap ke bahasa Latin yang mempunyai arti yaitu: Ana = kembali, dan Luein = melepas. Berdasarkan asal kata itulah analisis kini diartikan sebagai upaya pemisahan atau penguraian suatu kesatuan materi bahan menjadi komponen senyawa-senyawa penyusunnya, sehingga hasil (data) yang diperoleh dapat dikaji lebih lanjut. Pada umumnya, prinsip analisis protein mencakup beberapa hal, antara lain menera jumlah atau kandungan protein dalam bahan pangan, menentukan tingkat kualitas protein dari sudut gizi, serta menelaah protein sebagai suatu bahan kimia misalnya secara biokimiawi, fisiologis, reologis, dan lain-lain.
BAB V ANALISIS
Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu ; Secara kualitatif terdiri atas ; reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Secara kuantitatif terdiri dari ; metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV. 5.1 Kualitatif
1. Reaksi Xantoprotein Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan. 2. Reaksi Hopkins-Cole Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat
10
dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut. 3. Reaksi Millon Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. 4. Reaksi Natriumnitroprusida Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna merah dengan protein yang mempunyai gugus – SH bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat memberikan hasil positif. 5. Reaksi Sakaguchi Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah. 6. Metode Biuret Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet. 5.2 Kuantitatif
Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu: metode konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari destruksi, destilasi, titrasi), titrasi formol. Digunakan untuk menghitung kadar protein tidak terlarut. Metode modern, yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri visible, metode spektrofotometri UV dengan menggunakan alat dan digunakan untuk menghitung kadar protein terlarut. 1. Metode Kjeldahl Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. 2. Metode Titrasi Formol 11
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik. 3. Metode Lowry Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). 4. Metode Spektrofotometri UV Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin mempunyai absorbsi maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang lebih pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi protein dalam larutan. Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan pengukuran absorpsi pada 260 nm. Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada dalam suatu tabel.
12
BAB VI Sumber Kesalahan dalam Analisis
1. Kesalahan sistematis
Kesalahan sistematis merupakan jenis kesalahan yang mempengaruhi hasil pengukuran dan terjadi secara pasti dan berulang-ulang. Kesalahan jenis ini akan tetap terjadi meski di dalam praktek kita telah melaksanakan prosedur dengan tingkat ketelitian tinggi. Kesalahan sistematis tidak bias dieliminasi dengan cara replikasi(mengulang percobaan secara duplo atau riplo). Kalibrasi dengan menggunakan bahan standar yang sudah diketahui dengan pasti kadarnya, merupakan syarat mutlak untuk mengurangi kesalahan pengukuran jenis ini diantaranya adalah : o
Penerapan Metode Analisis yang kurang sesuai. Pada analisis kimia pemilihan metode yang kurang tetap akan mempengaruhi hasil pengukuran, karena metode yang tidak sesuai dengan bahan yang dianalisis sering menimbulkan reaksi samping yan tidak diinginkan, contoh: pada penetapan kadar protein dengan metode biuret. Metode ini kurang dapat menggambarkan kandungan protein yang sebenarnya, karena disamping bereaksi dengan protein, reagen biuret juga bereaksi dengan karbohidrat.
o
Penanganan Reagen yang Tidak Sesuai dengan Prosedur. Kesalahan pada hasil pengukuran juga dapat terjadi karena kita menyimpan reagen pereaksi pada kondisi yang tidak semestinya da melampaui batas kadaluarsa sehingga ada kemugkinan peraki yang digunakan sudah berkurang baik konsentrasi maupun aktifitasnya,Contoh : penyimpanan larutan NaOH terlalu lama akan menyebabkan konsentrasinya berubah jauh, dikarenakan NaOH bersifat higroskopis dan mudah mengikat gas CO2.
o
Pemakaian Perlatan yang Kurang Memenuhi Syarat Analisis. Peralatan yang kotor dan kurang terawat, jelas akan mengakibatkan kesalahan negatif pada hasil pengukuran, karena kemungkinan masih ada zat yang tertinggal pada alat tersebut waktu digunakan kembali. Oleh karena itu dilaboratorium kimia, penanganan dan pemeliharaan peralatan perlu dilakukan ekstra ketat agar memperkecil kemungkinan terjadi kesalahan sistematis.
2. Kesalahan Acak
Kesalahan acak adalah kesalaha hasil pengukuran yang terjadi sewatu-waktu, tergantung pada tingkat ketelitian praktikan dalam mengerjakan suatu prosedur 13
analisis. Kesaahan jenis ini tidak selalu terjadi pada setiap kegiatan analisis di laboratorium, dan kemungkinan
terjadinya perbandingan terbalik dengan
tigkat ketelitian dan tanggung jawab praktikan. Percobaan duplo dan tripl merupakan syarat mutlak untuk memperkecil keslahan hasil pengukuran yang bersumber pada kesalahan acak. Yang termasuk kesalahan jenis, diantaranya : o
Kesalahan dalam pengambilan contoh dan persiapan sampel. Kejadian dimana pada saat praktek, praktikan sering kali tidak mengikuti prosedur yang benar sehingga sampel yang dianalisis tidak homogen atau masih banyak mengandung komponen yang dapat mengganggu jalannya reaksi yang kita inginkan.
o
Kesalahan Pembaca Skala pada Alat Ukur. Penempatan batas miniskus pada alat ukur sangat tergantung pada ketajaman mata pengamat.Perubahan kondisi lingkungan yang sangat drastis, misalnya naiknya suhu kamar, akan menyebabkan hasil pengukuran menyimpang
dari
kondisi
yang sebenarnya.Contoh:
pembacaan skala absorbance pada ruangan yang berAC akan mendatangkan hasilyang berbeda jika dibandingkan dengan skala diruang non AC. o
Kesalahan dalam Pengerjaan Prosedur. Sebagai contoh pada penetapan kadar karotene pada bahan makanan.
Pemaparan jenis-jenis kesalahan pada bagian ini, dimaksudkan agar kita lebih berhatihati dalam melakukan analisis.
14
BAB VII KESIMPULAN
Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena portein berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh, zat pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H O sama seperti karbohidrat dan lemak. Namun selain ketiga unsur-unsur tersebut protein juga mengandung N, fosfor, belerang dan juga unsur-unsur logam lainnya. Struktur protein dapat dibagi menjadi empat bentuk antara lain primer, sekunder, tersier dan juga kwartener. Struktur primer merupakan srtuktur linier asam amino dalam protein. Susunan tersebut akan menentukan sifat dasar protein dan bentuk struktur berikutnya. Prinsip analisis protein mencakup beberapa hal, antara lain menera jumlah atau kandungan protein dalam bahan pangan, menentukan tingkat kualitas protein dari sudut gizi, serta menelaah protein sebagai suatu bahan kimia misalnya secara biokimiawi, fisiologis, reologis, dan lain-lain. Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu ; Secara kualitatif dan kuantitatif. Dalam melakukan analisis terdapat sumber kesalahan, yang di bagi menjadi kesalahan sistematis dan acak. Agar tidak terjadi kesalahan dalam menganalisis protein maka perlu ketelitian.
15
DAFTAR PUSTAKA
Anonim.
2011.
“struktur
dasar
dan
sifat
kimia
protein”
http://gz203pdg.blogspot.com/2011/05/struktur-dasar-dan-sifat-kimia-protein.html (diakses pada 02 maret 2013) http://biologycommunity.blogspot.com/2012/09/struktur-dan-fungsi-protein.html (diakses pada 02 maret 2013).
Anonim.
2012.
”Struktur
dan
Fungsi
Protein”
Dr. Ir. Anang Mohamad Legowo, MSc., 2004. Analisis Pangan. Universitas Diponegoro: Semarang. Dwijazz.
2010.
“Praktikum
Kimia
Pangan”
.http://dwijazz.wordpress.com/2010/04/28/praktikum-kimia-pangan/ (diakses pada 02 maret 2013) Reaksi Analisis Protein. Luryyonna. 2011. Tersedia online: http://zahirrazuka.wordpress.com/2011/01/24/reaksi-analisis-protein/ (03 Maret 2013)
Ni Putu Agustini, SKM., M.Si., dkk. 2010. Penuntun Praktikum Kimia Makanan . Denpasar: Jurusan Gizi, Poltekkes Kemenkes Denpasar. Winarno, F.G. 2002. “Kimia Pangan dan Gizi”. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama
Wikipedia. 2013. “Protein” http://id.wikipedia.org/wiki/Protein . (diakses pada 02 maret 2013).
16
